CN116514960A - 一种呼吸道合胞病毒的全人源单克隆抗体及其应用 - Google Patents

一种呼吸道合胞病毒的全人源单克隆抗体及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116514960A
CN116514960A CN202210113540.5A CN202210113540A CN116514960A CN 116514960 A CN116514960 A CN 116514960A CN 202210113540 A CN202210113540 A CN 202210113540A CN 116514960 A CN116514960 A CN 116514960A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
amino acid
antibody
acid sequence
protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210113540.5A
Other languages
English (en)
Inventor
高福
王奇慧
戴连攀
崔庆为
尚桂军
马东礼
麻晓鹏
尚子方
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanxi Institute Of Higher Innovation
Institute of Microbiology of CAS
Shenzhen Childrens Hospital
Original Assignee
Shanxi Institute Of Higher Innovation
Institute of Microbiology of CAS
Shenzhen Childrens Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanxi Institute Of Higher Innovation, Institute of Microbiology of CAS, Shenzhen Childrens Hospital filed Critical Shanxi Institute Of Higher Innovation
Priority to CN202210113540.5A priority Critical patent/CN116514960A/zh
Publication of CN116514960A publication Critical patent/CN116514960A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1027—Paramyxoviridae, e.g. respiratory syncytial virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/115—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • G01N2333/135—Respiratory syncytial virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/10—Detection of antigens from microorganism in sample from host

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)

Abstract

本文提供了结合呼吸道合胞病毒(RSV)F蛋白的人源抗体(hAb)或其抗原结合片段。本文还提供了该人源抗体(hAb)或其抗原结合片段在防治及检测RSV感染方面的用途。

Description

一种呼吸道合胞病毒的全人源单克隆抗体及其应用
技术领域
本文涉及结合呼吸道合胞病毒(RSV)F蛋白的人源抗体(hAb)或其抗原结合片段。本文还涉及该抗体或其抗原结合片段在防治及检测RSV感染方面的用途。
背景技术
呼吸道合胞病毒(RSV)是常见的呼吸道感染病原体。免疫力低下人群，包括老年人及婴幼儿为主要易感人群。它是世界上婴儿住院的主要原因，也是仅次于疟疾的婴儿死亡的第二大原因。RSV是一种丝状包膜、反义、单链RNA病毒，隶属于单核病毒目(Mononegavirales)、肺炎病毒科、正肺病毒属。这个家族还包括人偏肺病毒(hMPV)，它属于偏肺病毒属，和RSV一样，是感染儿童的主要病原体。RSV和hMPV感染的症状很难区分，虽然它们可以通过雾化飞沫传播，但它们通常都是通过密切接触传播的。在鼻咽和上呼吸道的上皮细胞复制一段短时间后，呼吸道合胞病毒感染可能会扩散到下呼吸道的小细支气管或肺泡。宿主对RSV感染的免疫反应增加了粘液的产生和炎症，导致气道变窄，导致幼儿患支气管炎。
RSV基因组全长15.2kb，包含10个基因，编码11个蛋白。RSV病毒粒子含有一个脂质双层，表达有融合蛋白(F)、附着蛋白(G)和小分子疏水蛋白(SH)。F和G蛋白比SH蛋白要丰富得多，SH蛋白是一种五聚体离子通道，被认为与延缓感染细胞的凋亡有关。其中，F蛋白(I型整合膜融合蛋白)在介导RSV病毒与宿主细胞膜的融合以及致病过程中起关键作用。F蛋白呈现两种不同的构象，一种是“棒棒糖”形状的预融合(pre-F)状态，在病毒与细胞相互作用之前存在于病毒表面；另一种是“拐杖状”的融合后状态(post-F)，它是在病毒与细胞膜融合后获得的，或者是由未知的机制自发地从高度稳定的pre-F重排到能量有利的post-F构象。这两种形式在抗原性上是截然不同的，都被认为是潜在的候选疫苗。然而，前一种形式已被证明能在自然感染或免疫后诱导大多数高度中和抗体，使其成为疫苗开发的首选抗原。事实上，F蛋白免疫原性最强的两个位点，命名为位点和位点V，只存在于pre-F构象上，而免疫原性较低的位点(位点I、位点II、位点III和位点IV)在该抗原的pre-F形式和post-F形式之间共享。
最早用于预防RSV感染的是Medimmune开发的RespiGam，这是一种混合人静脉免疫球蛋白(IVIG)，含有高浓度的RSV保护性抗体。它在高危婴儿中预防由RSV感染导致的严重下呼吸道感染具有明显的疗效。随着Palivizumab(Synagis)的推出，Medimmune于2003年自愿停止使用RespiGam。Palivizumab是一种能与RSV F蛋白结合的人源的鼠源性单克隆抗体。它也是第一个、也是唯一被批准用于人类治疗的抗病毒单克隆抗体。对于妊娠小于32周的高危早产儿在出院后前6个月内，palivizumab预防可以有效地减少RSV住院时间。这一批准为被动免疫预防提供了概念证明。但因其成本和效果有限，与RespiGam一样，目前也仅被批准用于早产儿和出生时患有心肺疾病的婴儿预防RSV。
开发可供所有新生儿注射的更有效的RSV抗体，将有利于直接保护这一脆弱群体免受RSV感染。因此，筛选广谱高中和活性的RSV抗体，对于临床预防RSV疾病具有重要的现实意义。同时，通过生物结构功能分析抗体与RSV F蛋白结合的保守表位，对于亚单位疫苗的设计及开发也具有潜在的指导作用。
发明内容
一方面，本文提供了结合呼吸道合胞病毒F蛋白的人源抗体或其抗原结合片段，所述人源抗体包括重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:2或4所示的重链可变区包含的HCDR1，HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:3所示的轻链可变区包含的LCDR1，LCDR2和LCDR3；优选地，按照IMGT编号系统，所述重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3选自如下组合之一：
(1)HCDR1的氨基酸序列为:GFLFSSYS(SEQ ID NO：10)；
HCDR2的氨基酸序列为:ISFDGSER(SEQ ID NO：11)；
HCDR3的氨基酸序列为:AKTWVDRTLSLDS(SEQ ID NO：12)；
(2)HCDR1的氨基酸序列为:GFLFSCYS(SEQ ID NO：13)；
HCDR2的氨基酸序列为:MSFDGSEI(SEQ ID NO：14)；
HCDR3的氨基酸序列为:ARTWVDRTLSLDH(SEQ ID NO：15)；优选地，按照IMGT编号系统，所述轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3如下所示：
LCDR1的氨基酸序列为:QGIKNA(SEQ ID NO：16)，
LCDR2的氨基酸序列为:AAS(SEQ ID NO：17)，
LCDR3的氨基酸序列为:LQDYSYPWT(SEQ ID NO：18)；
更优选地，按照IMGT编号系统，所述人源抗体的LCDR1-LCDR3和HCDR1-HCDR3的序列如下所示：
(1)LCDR1的氨基酸序列为:QGIKNA(SEQ ID NO：16)；
LCDR2的氨基酸序列为:AAS(SEQ ID NO：17)；
LCDR3的氨基酸序列为:LQDYSYPWT(SEQ ID NO：18)；
HCDR1的氨基酸序列为:GFLFSSYS(SEQ ID NO：10)；
HCDR2的氨基酸序列为:ISFDGSER(SEQ ID NO：11)；
HCDR3的氨基酸序列为:AKTWVDRTLSLDS(SEQ ID NO：12)；或
(2)LCDR1的氨基酸序列为:QGIKNA(SEQ ID NO：16)；
LCDR2的氨基酸序列为:AAS(SEQ ID NO：17)；
LCDR3的氨基酸序列为:LQDYSYPWT(SEQ ID NO：18)；
HCDR1的氨基酸序列为:GFLFSCYS(SEQ ID NO：13)；
HCDR2的氨基酸序列为:MSFDGSEI(SEQ ID NO：14)；
HCDR3的氨基酸序列为:ARTWVDRTLSLDH(SEQ ID NO：15)。
在一些实施方案中，所述重链可变区包括SEQ ID NO：2、4所示的序列或由其组成，或者包括与SEQ ID NO：2、4所示序列有至少85％(例如，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列一致性的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，所述重链可变区包括SEQ ID NO：2所示的序列或由其组成，或者包括与SEQ ID NO：2所示序列具有至少85％(例如，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列一致性的氨基酸序列或由其组合成；所述轻链可变区包括SEQ ID NO：3所示的序列或由其组成，或者包括与SEQ ID NO：3所示序列具有至少85％(例如，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列一致性的氨基酸序列或由其组成；或者
所述重链可变区包括SEQ ID NO：4所示的序列或由其组成，或者包括与SEQ IDNO：4所示序列具有至少85％(例如，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列一致性的氨基酸序列或由其组成，所述轻链可变区包括SEQ ID NO：5所示的序列或由其组成，或者包括与SEQ ID NO：5所示序列具有至少85％(例如，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列一致性的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，所述抗体还包含重链可变区和轻链可变区，优选地，所述重链恒定区包括SEQ ID NO：6所示的序列或由其组成，或者包括与SEQ ID NO：6有至少85％(例如，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列一致性的氨基酸序列或由其组成；所述抗体的轻链恒定区包括SEQ ID NO：7所示的序列或由其组成，或者包括与SEQ ID NO：7有至少85％(例如，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列一致性的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，所述抗原结合片段包括但不限于，F(ab')2、F(ab)2、Fab'、Fab、Fv、Fd、dAb、Fab/c、互补决定区(CDR)片段、单链Fvs(ScFv)、二硫键稳定性Fv(Disulfide-stabilized Fv fragment,dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv')、双链抗体(Diabody)、二硫键稳定的双链抗体(ds-Diabody)、ScFv多聚体(如ScFv二聚体、ScFv三聚体)、由包含一个或多个CDR的抗体的一部分形成的多特异性抗体、纳米抗体、单域抗体(sdAb)、结构域抗体、二价结构域抗体，或任何其他与抗原结合但不包含完整的抗体结构的抗体片段。不管结构如何，抗原结合片段包括任何能够与亲本抗体或亲本抗体片段结合的相同抗原结合的多肽或多肽复合体。
在一些实施方案中，所述抗体为人源抗体。
在一些实施方案中，所述F蛋白为融合前构象。
在一些实施方案中，所述呼吸道合胞病毒为A或B型呼吸道合胞病毒。
另一方面，本文提供了核酸分子，其编码上述抗体的轻链、重链、轻链可变区或重链可变区。
另一方面，本文提供了包括上述核酸分子的表达载体。
另一方面，本文提供了宿主细胞，其表达上述抗体或其抗原结合片段，或者包括上述核酸分子或者表达载体。
另一方面，本文提供了药物组合物，其包括上述抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载体。
另一方面，本文提供了上述抗体或其抗原结合片段在制备治疗或预防呼吸道合胞病毒相关疾病的药物中的用途。
另一方面，本文提供了在受试者中治疗或预防呼吸道合胞病毒相关疾病的方法，其包括以有效量向所述受试者给药上述抗体或其抗原结合片段、上述药物组合物、融合蛋白或多特异性抗体。
另一方面，本文提供了检测样品中是否存在呼吸道合胞病毒或其含量的方法，包括让所述样品与上述抗体或其抗原结合片段接触，并检测是否形成了抗原抗体复合物或形成的抗原抗体复合物的量。
另一方面，本发明提供了偶联物，其包含上述抗体或其抗原结合片段以及偶联部分，其中，所述偶联部分为纯化标签(如His标签)，可检测的标记或小分子药物；优选地，所述偶联部分为荧光物质、化学发光物质、有色物质、聚乙二醇或酶，优选地，所述小分子药物选自呼吸道合胞病毒的核酸或F蛋白抑制剂。
另一方面，本发明涉及融合蛋白或多特异性抗体(优选双特异性抗体)，其包含上述抗体或其抗原结合片段。
另一方面，本发明涉及试剂盒，其包括上述抗体或其抗原结合片段、所述的偶联物或所述的融合蛋白或多特异性抗体；优选地，所述试剂盒还包括第二抗体，所述第二抗体特异性识别所述抗体；任选地，所述第二抗体还包括可检测的标记，例如放射性同位素、荧光物质、化学发光物质、有色物质或酶；优选地，所述试剂盒用于检测RSV在样品中的存在或其水平。
附图说明
图1显示了表达和纯化的RSV-preF(DS-Cav1)蛋白的凝胶柱层析和SDS-PAGE检测结果。
具体实施方式
除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员所通常理解的含义。
“抗体”指由浆细胞(效应B细胞)分泌、被机体免疫系统用来中和外来物质(多肽、病毒、细菌等)的免疫球蛋白。该外来物质相应地称作抗原。经典或普通抗体分子的基本结构是由2个相同重链和2个相同轻链组成的4聚体。根据氨基酸序列的保守性差异，将重链和轻链分为位于氨基端的可变区(V)和位于羧基端的恒定区(C)。一条重链和一条轻链的可变区相互作用形成了抗原结合部位(Fv)。在可变区中，某些区域氨基酸残基的组成和排列次序比可变区内的其它区域(骨架区，FR)更易变化，称为高变区(HVR)，高变区实际上是抗体与抗原结合的关键部位。由于这些高变区序列与抗原决定簇互补，故又称为互补决定区(complementarity-determining region,CDR)。重链和轻链均具有三个互补决定区，分别称为HCDR1、HCDR2、HCDR3和LCDR1、LCDR2、LCDR3。每个VH和VL可由三个CDR和四个FR区构成，它们从氨基端至羧基端可按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。
在已知抗体互补决定区序列的情况下，本领域技术人员可容易地例如通过DNA重组技术将抗体分子的部分序列(例如恒定区或骨架区)替换为来自其他物种的序列，形成嵌合抗体，而该嵌合抗体可基本上保留其来源抗体的结合特异性。例如，在来源抗体为鼠抗体时，可将其恒定区替换为人抗体恒定区，或者相反，在来源抗体为人抗体时，可将其恒定区替换为鼠抗体恒定区，以减弱抗体在不同物种中使用时的免疫原性或者利用恒定区的特定功能，例如ADCC相关活性。出于进一步降低抗体免疫原性或其他目的，可将抗体分子中除CDR序列之外的其他序列都用另一抗体分子(来自相同或不同物种)的对应序列(视情况可包括一个或数个氨基酸突变)替换，同时基本上保留其来源抗体的结合特异性。在一个具体实例中，本领域技术人员经常采用CDR移植来将鼠源抗体人源。
本领域技术人员还可以理解的是，在本文提供的具体抗体序列基础上，可以通过对少数氨基酸进行保守替换、删除、添加并验证或筛选所得产物与相应抗原(F蛋白)的结合能力或生物学活性，从而获得本发明提供的抗F蛋白抗体分子的相应变体，这些变体也应包括在本发明的范围内。
本发明的抗体可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6His标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
“保守氨基酸替换”是其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基替换。具有类似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中定义，其包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性侧链(例如天冬氨酸，谷氨酸)，不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)，β-支链的侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，免疫球蛋白多肽的非必需氨基酸残基优选被来自相同侧链家族的其他氨基酸残基替换。在另一些实施方案中，一串氨基酸可被结构上类似的氨基酸串替换，后者在顺序上和/或侧链家族的组成上不同。
在下表中提供了保守性氨基酸替换的非限制性实例，其中相似性得分为0或更高表示在这两个氨基酸之间有保守替换。
C G P S A T D E N Q H K R V M I L F Y W
W -8 -7 -6 -2 -6 -5 -7 -7 -4 -5 -3 -3 2 -6 -4 -5 -2 0 0 17
Y 0 -5 -5 -3 -3 -3 -4 -4 -2 -4 0 -4 -5 -2 -2 -1 -1 7 10
F -4 -5 -5 -3 -4 -3 -6 -5 -4 -5 -2 -5 -4 -1 0 1 2 9
L -6 -4 -3 -3 -2 -2 -4 -3 -3 -2 -2 -3 -3 2 4 2 6
I -2 -3 -2 -1 -1 0 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 4 2 5
M -5 -3 -2 -2 -1 -1 -3 -2 0 -1 -2 0 0 2 6
V -2 -1 -1 -1 0 0 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 4
R -4 -3 0 0 -2 -1 -1 -1 0 1 2 3 6
K -5 -2 -1 0 -1 0 0 0 1 1 0 5
H -3 -2 0 -1 -1 -1 1 1 2 3 6
Q -5 -1 0 -1 0 -1 2 2 1 4
N -4 0 -1 1 0 0 2 1 2
E -5 0 -1 0 0 0 3 4
D -5 1 -1 0 0 0 4
T -2 0 0 1 1 3
A -2 1 1 1 2
S 0 1 1 1
P -3 -1 6
G -3 5
C 12
在一些实施方案中，所述保守替换优选地是这样的替换，即，其中下列组(a)–(e)内的一个氨基酸被同组内的另一氨基酸残基替换：(a)小的脂肪族、非极性或弱极性的残基：Ala,Ser,Thr,Pro和Gly；(b)极性、带负电荷的残基及其(不带电荷的)酰胺：Asp,Asn,Glu和Gln；(c)极性、带正电荷的残基:His,Arg和Lys；(d)大的脂肪族、非极性残基:Met,Leu,Ile,Val和Cys；以及(e)芳族残基:Phe,Tyr和Trp。
特别优选的保守替换如下：Ala替换成Gly或替换成Ser；Arg替换成Lys；Asn替换成Gln或替换成His；Asp替换成Glu；Cys替换成Ser；Gln替换成Asn；Glu替换成Asp；Gly替换成Ala或替换成Pro；His替换成Asn或替换成Gln；Ile替换成Leu或替换成Val；Leu替换成Ile或替换成Val；Lys替换成Arg,替换成Gln或替换成Glu；Met替换成Leu,替换成Tyr或替换成Ile；Phe替换成Met,替换成Leu或替换成Tyr；Ser替换成Thr；Thr替换成Ser；Trp替换成Tyr；Tyr替换成Trp；和/或Phe替换成Val,替换成Ile或替换成Leu。
抗体的“抗原结合片段”指包括了来源抗体的部分序列(尤其是CDR序列)并且同时具有来源抗体结合特异性的多肽。该抗原结合片段通常包括来源抗体的轻链可变区和重链可变区，从而具备抗原结合能力。抗原结合片段的形式有多种，例如Fab、F(ab’)2、单链抗体(scFv)、单域抗体(sdAb)等。scFv是由抗体重链可变区和轻链可变区通过短肽连接成一条肽链而构成。通过正确折叠，来自重链和轻链的可变区通过非共价键相互作用形成Fv段，因而scFv能较好地保留其对抗原的亲和活性。sdAb最早在驼类动物中发现，其天然缺乏轻链，但依然具有抗原结合能力。sdAb相对于普通的抗体分子具有一些优点，例如具有更佳的稳定性(耐pH、热、蛋白酶)，可以靶向并结合抗原分子上普通抗体分子难以接触到的抗原表位等。
抗体“特异结合抗原”或抗体的“抗原结合特异性”指该抗体相对于其他抗原，能够以更高或较高结合亲和力结合靶抗原。抗体与靶抗原的结合能力可通过各种方法进行定性或定量鉴定，例如通过测定抗体与靶抗原结合的KD值，测定抗体与其他抗体竞争结合靶抗原的能力等。这里Kd为平衡解离常数，可用于衡量抗体和其抗原之间的结合亲和力强弱。KD值越小，表明亲和力越强。
用在本文时，“抗体”可包括完整抗体或其抗原结合片段，并且可以是人抗体、鼠抗体、人源抗体、嵌合抗体等。抗体可以为任何类型的，例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY)，或者任何亚类，例如IgG 1、lgG2、IgG 3、lgG4、IgA1或lgA2等。
制备抗体的方法在本领域内是已知的，包括但不限于利于抗原免疫动物后分离表达特定抗体的细胞(例如通过杂交瘤技术来制备抗体)、利用噬菌体抗体库的筛选抗体技术、通过基因工程技术转化细胞并使其表达抗体分子等。在一个具体实例中，提供了通过向293F细胞中引入编码抗体重链和轻链的重组表达载体来制备抗体分子的方法。
本领域已知还可以对抗体分子进行多种修饰，例如PEG化、糖基化、形成抗体分子偶联物(例如ADC)、加纯化标签、或者与其他蛋白融合，例如形成双特异性抗体。在本文提供的抗体分子基础上进行修饰获得的这些抗体衍生物也应涵盖在本发明的范围内。
提及氨基酸序列时，术语“序列一致性(Sequence identity)”(也称为“序列同一性”)指两氨基酸序列(例如查询序列和参照序列)之间一致性程度的量，一般以百分比表示。通常，在计算两氨基酸序列之间的一致性百分比之前，先进行序列比对(alignment)并引入缺口(gap)(如果有的话)。如果在某个比对位置，两序列中的氨基酸残基相同，则认为两序列在该位置一致或匹配；两序列中的氨基酸残基不同，则认为在该位置不一致或错配。在一些算法中，用匹配位置数除以比对窗口中的位置总数以获得序列一致性。在另一些算法中，还将缺口数量和/或缺口长度考虑在内。出于本发明的目的，可以采用公开的比对软件BLAST(可在网页ncbi.nlm.nih.gov找到)，通过使用缺省设置来获得最佳序列比对并计算出两氨基酸序列之间的序列一致性。
“表达载体”，也可称为“重组表达载体”，指包含各种表达元件以用于在宿主细胞中表达目的蛋白(例如抗体分子的轻链和/或重链)的核酸分子。对于用于在真核细胞(哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等)中表达目的蛋白的表达载体，这些表达元件通常包括启动子、增强子、多腺苷酸化信号序列等。为了方便在大肠杆菌中扩增，表达载体通常还可包括大肠杆菌复制子序列。表达载体还可包括用于筛选的抗生素抗性基因或选择标记基因(例如氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、胸苷激酶基因(TK)等)和用于目的蛋白编码序列插入的多克隆位点(MCS)。表达载体可以为质粒载体或病毒载体。
本文提供的表达载体适合于在多种宿主细胞中表达本文提供的抗体分子或其片段，尤其适合于在哺乳动物细胞(例如小鼠、大鼠、猪、羊、猴、猩猩、或人细胞)中表达。在一些实施方案中，所述哺乳动物细胞可选自CHO细胞、HEK293细胞或BHK细胞。
本发明使用RSV融合前构象的F蛋白DS-Cav1为诱饵，利用单细胞测序技术从健康成人外周血淋巴细胞(PBMCs)中分离到了2株人源单克隆抗体，分别命名为RD1、RD4。2株均能够结合RSV F蛋白：RD1和RD4既结合融合前F蛋白又结合融合后F蛋白。这2株单克隆抗体可用于RSV的诊断和抗原定量。此外，2株RD1和RD4对RSV A型和B型都有中和活性，可用于RSV的预防和治疗。
本文中提供的抗体或其抗原结合片段可特异结合呼吸道合胞病毒F蛋白(融合前构象和/或融合后构象)，即呼吸道合胞病毒F蛋白作为该抗体的靶抗原。在该抗体与呼吸道合胞病毒F蛋白结合后，通过中和活性抑制RSV的细胞感染能力。因此，本文提供的抗体或其抗原结合片段可用于预防或治疗RSV感染。另一方面，由于本文提供的抗体的抗原结合特异性，可将该抗体用于检测来自受试者的样品(如血液)中是否存在RSV病毒。相应地，本文提供可包括本文提供的抗体或其抗原结合片段的RSV检测试剂盒。
提及药物组合物，所使用的“药学上可接受的载体”指可以安全地进行施用的固体或液体稀释剂、填充剂、抗氧化剂、稳定剂等物质，这些物质适合于人和/或动物给药而无过度的不良副反应，同时适合于维持位于其中的药物或活性剂的活力。
提及治疗或预防RSV感染时，“有效量”指足以在受试者体内引起临床医师所期望的生物学或医学反应的活性化合物(如抗体)的量。本文提供的抗体给药时的“有效量”可由本领域技术人员根据给药途径、受试者的体重、年龄、病情等因素而确定。例如，典型的日剂量范围可以为每kg体重0.01mg至100mg活性成分。
以下通过具体实施例来进一步阐述本发明。
实施例1：RSV病毒融合前F蛋白(DS-Cav1)的表达与纯化
将编码RSV A2毒株的融合前F蛋白DS-Cav1蛋白的C端加上Thrombin酶切位点，6个组氨酸序列，1个GS[甘氨酸-丝氨酸]连接序列，1个编码Strep II标签的序列以及1个终止密码子(氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)，插入到哺乳表达载体pCAGGS的EcoR I和XhoI酶切位点中。将连接产物转化到DH5α大肠杆菌感受态细胞中。然后，挑取单克隆，接种到4mLLB培养基中，培养6-8小时；然后再转接种到300mL的LB培养基中，培养12-16小时，收集菌体，用无内毒素大提质粒试剂盒(TIANGEN)提取质粒，得到pCAGGS-RSV-F(DS-Cav1)。
将提取的质粒pCAGGS-RSV-F(DS-Cav1)转染293F细胞表达F蛋白。转染后5-7天，将含有目的蛋白的293F细胞培养上清通过离心和过滤(0.22μm)去除细胞碎片后，与HisTrapHP(GE healthcare)镍螯合柱结合，再以不同浓度的咪唑洗脱层析柱，分别收集洗脱蛋白，通过SDS-PAGE结果判断含有目的蛋白的样品。
收集含有目的蛋白的洗脱峰，浓缩后，进行分子筛层析，根据蛋白的出峰位置和SDS-PAGE的结果确定目的蛋白的大小和纯度(分子筛及SDS-PAGE结果见图1)。分子筛结果显示，蛋白出峰位置在60-70mL，与F蛋白三聚体理论分子量180kDa吻合。SDS-PAGE结果显示，在还原(+DTT)与非还原(-DTT)条件下，F蛋白都在～60kDa左右，提示F蛋白亚基通过非共价形成三聚体。SDS-PAGE的T编号样品对于分子筛的T编号收集管。
实施例2：RSV F(DS-Cav1)蛋白特异性记忆B细胞的分离
在感染RSV病毒且痊愈出院的人员知情同意下，采集3-10mL的血液，分离PBMCs。将分离到的PBMCs(107/mL)与200nM DS-Cav1蛋白(实施例1中制备)在冰上孵育结合半小时；然后用PBS洗2次，再与下列抗体(均购自BD)混合：anti-human CD3/PE-Cy5，anti-humanCD16/PE-Cy5，anti-human CD235a/PE-Cy5，anti-human CD19/APC-Cy7，anti-human CD27/Pacific Blue，anti-human CD38/APC，anti-human IgG/FITC，以及anti-His/PE。在冰上孵育半小时后，用PBS洗2次。随后，用FACSAria III分选PBMCs，收集PE-Cy5-APC-APC-Cy7+Pacific Blue+FITC+PE+的细胞(即记忆B细胞)，直接将其收集到96孔板内，1细胞/孔。
实施例3：单一B细胞PCR及人源单克隆抗体IgG1的克隆
将实施例2获得的细胞通过Superscript III reverse transcriptase(Invitrogen)逆转录，反应条件为55℃，60min。将此逆转录产物作为模板，用HotStar TapPlus酶(QIAgen)进行PCR，扩增抗体可变区序列(PCRa)，反应条件如下：95℃，5min；95℃，30s，55℃(重链/κ链)/50℃(λ链)，30s，72℃，90s，35个循环，72℃，7min。将此作为模板再进行1轮PCR(PCRb)，条件如下：95℃，5min；95℃，30s，58℃(重链)/60℃(κ链)/64℃(λ链)，30s，72℃，90s，35个循环，72℃，7min。1.2％的琼脂糖凝胶电泳，分离PCR产物，将400-500bp的条带切胶回收后送测序公司测序。测序结果在IGBLAST网站上进行序列分析。分析结果如下:
总共得到了2个配对抗体：RD1、RD4。根据测序结果，RD1的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:2，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:3；RD4的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:4，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:5。分别将2个抗体的轻链测序结果与胚系基因进行比对，确定RD1与RD4均使用CLκ。
为了获得人源抗体进行后续评价，我们设计了全抗IgG1构建。策略如下：
重链：CMV promoter-HindIII-信号肽(SP)-重链可变区(VH)-重链恒定区(CH)-NotⅠ；
轻链κ：CMV promoter-HindIII-信号肽(SP)-轻链可变区(VK)-轻链恒定区(CLκ)-NotⅠ；
分析正确的可变区序列与相应的重链CH和轻链CLκ的恒定区通过搭桥PCR连接，克隆至表达载体pCAGGS中，得到含有特定抗体轻、重链编码基因的重组质粒；其中，使用酶切位点HindIII和NotⅠ将轻重链可变区连入含有恒定区的载体中。其中重链恒定区CH的氨基酸序列如SEQ ID NO:6；轻链恒定区CLκ的氨基酸序列如SEQ ID NO:7，信号肽(SP)的氨基酸序列如SEQ ID NO:8。
实施例4：单克隆抗体的表达与纯化
将含有重链和轻链编码序列的pCAGGS质粒共转染293F细胞。转染24h后加入220mMVPA，继续培养5天。收获细胞，离心收集上清，用0.22μm滤膜过滤后，以2mL/min的速度通过HiTrap Protein A HP(5ml，GE Healthcare)色谱柱。
按照该亲和柱的操作说明，完成抗体的初步洗脱纯化。再用凝胶过滤层析柱(superdex 200PG，GE Healthcare)进一步纯化，得到高纯度的抗体。按照木瓜蛋白酶(Thermo)的商品说明书对纯化的单抗酶切，Fab片段经HiTrap Protein A HP和凝胶过滤层析柱纯化，最后浓缩并储存在-80℃备用。
实施例5：抗体的结合性能检测
(1)RSV融合后F蛋白(FΔFP)的构建表达
将编码RSV A2毒株的融合后F蛋白(FΔFP)的C端加上Thrombin酶切位点，6个组氨酸序列，1个GS[甘氨酸-丝氨酸]连接序列，1个编码Strep II标签的序列以及1个终止密码子(氨基酸序列如SEQ ID NO:9)，插入到哺乳表达载体pCAGGS的NdeI和XhoI酶切位点中。将连接产物转化到DH5α大肠杆菌感受态细胞中。然后，挑取单克隆，接种到4mL LB培养基中，培养6-8小时；然后再转接种到300mL的LB培养基中，培养12-16小时，收集菌体，用无内毒素大提质粒试剂盒(TIANGEN)提取质粒，得到pCAGGS-RSV-FΔFP。
将提取的质粒pCAGGS-RSV-FΔFP转染293F细胞表达F蛋白。转染后4-5天，将含有目的蛋白的293F细胞培养上清通过离心和过滤(0.22μm)去除细胞碎片后，与HisTrap HP(GE healthcare)镍螯合柱结合，再以不同浓度的咪唑洗脱层析柱，分别收集洗脱蛋白，通过SDS-PAGE结果判断含有目的蛋白的样品。
收集含有目的蛋白的洗脱峰，浓缩后，进行分子筛层析，根据蛋白的出峰位置和SDS-PAGE的结果判断的蛋白的大小和纯度。
(2)单克隆抗体Fab全段的制备和纯化
A、准备样品：
将全抗蛋白浓缩到10mg/ml以上，浓缩换液(200倍)为sample buffer(20mMNa3PO4,10mM EDTA,pH7.0)；将换液后的抗体浓缩到20mg/ml以上，加入一定量的digestionbuffer(向sample buffer中加入cysteine·HCl至20mM,pH7.0)稀释，终浓度≥10mg/ml。
B、准备酶：
用剪去尖的枪头吸取0.5mL充分混匀的偶联酶beans(Thermo，Prod#20341)到反应容器中，1000g/min离心2min除去保存液；用3mL digestion buffer清洗beans 3次，弃去洗脱。然后加入0.5mL digestion buffer，温和颠倒混匀。
C、酶切：
给反应管加上堵头，加入浓缩好的抗体(约10mg)，拧紧盖子，用封口膜封住空隙；将反应管固定到旋转混合仪，37℃孵育过夜；
D、Fab回收：
酶切过夜后，1000g/min离心5min，保留下液；用1mL Protein A binding buffer(20mM Na3PO4,pH7.0)清洗beans两次，回收下液；将以上2个步骤的下液混合后测浓度；浓缩下液过Protein A；将目的蛋白洗脱液浓缩换液至1×PBS缓冲液，通过分子筛进一步纯化。
(3)单克隆抗体与F蛋白的结合能力评估
使用Biacore 3000系统(GE Healthcare)，通过表面等离子体共振(SPR)检测纯化抗体与pre-F/postF的相互作用。将融合前F蛋白DS-Cav1和融合后F蛋白FΔFP以氨基偶联的方式分别固定在CM5芯片的Fc2和Fc4通道上(flow cell,Fc)。然后，以抗体捕获的方式，结合纯化的RD1、RD4抗体的Fab蛋白。Palivizumab(购自Synagis)、D25(WO2015108967A2，由金斯瑞合成，序列参见SEQ ID NO:19和20)作为阳性对照。实验中使用的所有蛋白质都被交换到由10mM HEPES、pH 7.4、150mM NaCl和0.005％v/v吐温20组成的缓冲液中，测定pre-F的结合情况。固定化抗人抗体用3M氯化镁再生，抗鼠抗体用10mM甘氨酸，pH 1.7再生。使用Biacore 3000评估软件计算每个pre-F/postF与抗体相互作用的表观平衡解离常数(Kd值)。
表1抗体Fab片段与融合前F蛋白DS-Cav1和融合后F蛋白FΔFP的结合常数
结果分析：RD1与RD4均能够结合RSV融合前F蛋白，也结合RSV融合后F蛋白。RD1结合RSV融合前F蛋白(KD＝0.06nM)，结合融合后F蛋白(KD＝30nM)；RD4结合RSV融合前F蛋白(KD＝0.008nM)，结合融合后F蛋白(KD＝1.26nM)；RD1和RD4在与融合前F蛋白结合方面展现出比D25高出1-2个数量级的亲和力，比Palivizumab高出2-3个数量级的亲和力；RD1和RD4在与融合后F蛋白结合方面展现出比D25高出1-2个数量级的亲和力，与Palivizumab具有相同数量级的亲和力。
实施例6：抗体的中和活性检测
我们采用微量中和的方法检测抗体的中和活性，详细步骤如下：
1.细胞准备
(1).提前12-16小时铺Hep2细胞于24孔板中放10％DMEM培养基中培养，待次日长至70％以上后做抗体中和实验。
(2).稀释抗体：RD1、RD4、Palivizumab、D25共4种抗体，每种抗体纯化后过滤为无菌条件，将抗体加入96孔板中3倍梯度稀释，每孔至少150μL用2％FBS DMEM培养基稀释。
(3).稀释病毒：将病毒从-80％冰箱取出解冻，按照适宜的病毒稀释倍数用2％FBSDMEM培养基稀释病毒，然后加入到抗体的48孔板中，300μL/孔。(RSV_A2或者RSV-Long或者RSV-B(购自ATCC)：450μL稀释到40mL，最终滴度：1.2×104TCID50/100μL)。
(4).病毒与抗体孵育：
(5).将稀释好的病毒与抗体摩尔比1:1混匀，放于37℃CO2培养箱中孵育1小时。
(6).加病毒抗体混合液：将细胞中的PBS吸出，将病毒与细胞上清混合物每孔300μL加入细胞中，37℃孵育1小时。(一个梯度两个孔，各11个梯度，每个板子两孔病毒孔对照)，放入培养箱培养细胞96小时左右。
2.ELISA检测
(1).Hep2细胞移除培养基，不用洗，直接加入150μL孵育后的血清病毒混合液，培养3h后补加50μL含2％FBS的DMEM。细胞在培养箱中培养4天。
(2).提前将纯甲醇置于冰箱-20度预冷。提前将palivizumab抗体置于冰上融化，从培养箱取出细胞，倒去上清，每孔用200μL的PBS洗一遍，加入和倒出液体时要轻缓，以免细胞脱落，洗后每孔加入150μL预冷的甲醇，置于冰箱-20度固定通透15到20分钟，倒去甲醇，每孔用200μL的PBS洗两遍。
(3).洗后每孔加入100μL的5％脱脂牛奶(溶解于PBS)，室温封闭30分钟；
(4).倒去封闭液，不用洗，直接加入一抗palivizumab，使用5％脱脂牛奶稀释到5μg/mL的工作浓度，抗体充分稀释混匀后，每孔加入100μL室温孵育2小时。
(5).倒去一抗，用PBST洗3遍，每遍5min，加入山羊抗人IgG偶联HRP的二抗(金普来生物科技有限公司)(用5％脱脂牛奶按1:1500稀释)，室温孵育2小时。
(6).倒去二抗，用PBST洗4遍，每遍5min。之后每孔加入TMB显色液60μL室温反应约1min，观察颜色变化，每孔加入2M盐酸60μL终止显色反应，使用酶标仪用OD450，0.1s读值，保存并导出数据。
结果：
对于RSV A型A2毒株，抗体的半数抑制浓度(IC50)分别为RD1 0.16μg/mL和RD40.68μg/mL，二者均好于已上市的palivizumab的1.63μg/mL，其中和活性比palivizumab强一个数量级。数据见表2。
表2抗体对RSV A型A2毒株的中和活性
注：D25(WO2015108967A2，由金斯瑞合成，序列参见SEQ ID NO:21和22)
对于RSV B型临床分离毒株，抗体的半数抑制浓度(IC50)分别为：RD1(0.13μg/mL),RD4(0.11μg/mL)二者均具有与已上市的palivizumab(IC50＝0.38μg/mL)相当的中和活性。数据见表3。
表3抗体对RSV A型Long毒株的中和活性
序列表：
SEQ ID NO:1(RSV融合前F蛋白序列)
SEQ ID NO:2(抗体1重链可变区)
SEQ ID NO:3(抗体1轻链可变区)
SEQ ID NO:4(抗体2重链可变区)
SEQ ID NO:5(抗体2轻链可变区)
SEQ ID NO:6(抗体重链恒定区)
SEQ ID NO:7(抗体轻链恒定区)
SEQ ID NO:8(信号肽序列)
SEQ ID NO:9(RSV融合后F蛋白序列)
SEQ ID NO:10(抗体1的HCDR1氨基酸序列)
SEQ ID NO:11(抗体1的HCDR2氨基酸序列)
SEQ ID NO:12(抗体1的HCDR3氨基酸序列)
SEQ ID NO:13(抗体2的HCDR1氨基酸序列)
SEQ ID NO:14(抗体2的HCDR2氨基酸序列)
SEQ ID NO:15(抗体1的HCDR3氨基酸序列)
SEQ ID NO:16(抗体1、2轻链HCDR1氨基酸序列)
SEQ ID NO:17(抗体1、2轻链HCDR2氨基酸序列)
SEQ ID NO:18(抗体1、2轻链HCDR3氨基酸序列)
SEQ ID NO:19D25轻链可变区序列
SEQ ID NO:20D25重链可变区序列：
SEQ ID NO:21D25轻链全长序列：
SEQ ID NO:22D25重链全长序列：

Claims (18)

1.结合呼吸道合胞病毒F蛋白的人源抗体或其抗原结合片段，所述人源抗体包括重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:2或4所示的重链可变区包含的HCDR1，HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:3所示的轻链可变区包含的LCDR1，LCDR2和LCDR3；优选地，按照IMGT编号系统，所述重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3选自如下组合之一：
(1)HCDR1的氨基酸序列为:GFLFSSYS(SEQ ID NO：10)；
HCDR2的氨基酸序列为:ISFDGSER(SEQ ID NO：11)；
HCDR3的氨基酸序列为:AKTWVDRTLSLDS(SEQ ID NO：12)；
(2)HCDR1的氨基酸序列为:GFLFSCYS(SEQ ID NO：13)；
HCDR2的氨基酸序列为:MSFDGSEI(SEQ ID NO：14)；
HCDR3的氨基酸序列为:ARTWVDRTLSLDH(SEQ ID NO：15)；
优选地，按照IMGT编号系统，所述轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3如下所示：
LCDR1的氨基酸序列为:QGIKNA(SEQ ID NO：16)，
LCDR2的氨基酸序列为:AAS(SEQ ID NO：17)，
LCDR3的氨基酸序列为:LQDYSYPWT(SEQ ID NO：18)；
更优选地，按照IMGT编号系统，所述人源抗体的LCDR1-LCDR3和HCDR1-HCDR3的序列如下所示：
(1)LCDR1的氨基酸序列为:QGIKNA(SEQ ID NO：16)；
LCDR2的氨基酸序列为:AAS(SEQ ID NO：17)；
LCDR3的氨基酸序列为:LQDYSYPWT(SEQ ID NO：18)；
HCDR1的氨基酸序列为:GFLFSSYS(SEQ ID NO：10)；
HCDR2的氨基酸序列为:ISFDGSER(SEQ ID NO：11)；
HCDR3的氨基酸序列为:AKTWVDRTLSLDS(SEQ ID NO：12)；或
(2)LCDR1的氨基酸序列为:QGIKNA(SEQ ID NO：16)；
LCDR2的氨基酸序列为:AAS(SEQ ID NO：17)；
LCDR3的氨基酸序列为:LQDYSYPWT(SEQ ID NO：18)；
HCDR1的氨基酸序列为:GFLFSCYS(SEQ ID NO：13)；
HCDR2的氨基酸序列为:MSFDGSEI(SEQ ID NO：14)；
HCDR3的氨基酸序列为:ARTWVDRTLSLDH(SEQ ID NO：15)。
2.权利要求1所述的结合呼吸道合胞病毒F蛋白的人源抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区包括SEQ ID NO：2、4所示的序列或由其组成，或者包括与SEQ ID NO：2、4所示序列有至少85％(例如，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列一致性的氨基酸序列或由其组成。
3.权利要求1或2所述的结合呼吸道合胞病毒F蛋白的人源抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区包括SEQ ID NO：2所示的序列或由其组成，或者包括与SEQ ID NO：2所示序列具有至少85％(例如，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列一致性的氨基酸序列或由其组合成；所述轻链可变区包括SEQ IDNO：3所示的序列或由其组成，或者包括与SEQ ID NO：3所示序列具有至少85％(例如，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列一致性的氨基酸序列或由其组成；或者
所述重链可变区包括SEQ ID NO：4所示的序列或由其组成，或者包括与SEQ ID NO：4所示序列具有至少85％(例如，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列一致性的氨基酸序列或由其组成，所述轻链可变区包括SEQ IDNO：5所示的序列或由其组成，或者包括与SEQ ID NO：5所示序列具有至少85％(例如，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列一致性的氨基酸序列或由其组成。
4.权利要求1-3任一项所述的结合呼吸道合胞病毒F蛋白的人源抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体还包含重链恒定区和轻链恒定区，优选地，所述重链恒定区包括SEQ IDNO：6所示的序列或由其组成，或者包括与SEQ ID NO：6有至少85％(例如，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列一致性的氨基酸序列或由其组成；所述抗体的轻链恒定区包括SEQ ID NO：7所示的序列或由其组成，或者包括与SEQ ID NO：7有至少85％(例如，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列一致性的氨基酸序列或由其组成。
5.权利要求1-4任一项所述的结合呼吸道合胞病毒F蛋白的人源抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段包括但不限于，F(ab′)2、F(ab)2、Fab′、Fab、Fv、Fd、dAb、Fab/c、互补决定区(CDR)片段、单链Fvs(ScFv)、二硫键稳定性Fv(Disulfide-stabilized Fvfragment,dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv′)、双链抗体(Diabody)、二硫键稳定的双链抗体(ds-Diabody)、ScFv多聚体(如ScFv二聚体、ScFv三聚体)、由包含一个或多个CDR的抗体的一部分形成的多特异性抗体、纳米抗体、单域抗体(sdAb)、结构域抗体、二价结构域抗体，或任何其他与抗原结合但不包含完整的抗体结构的抗体片段。
6.权利要求1-5任一项所述的结合呼吸道合胞病毒F蛋白的人源抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体为人源抗体。
7.权利要求1-6任一项所述的结合呼吸道合胞病毒F蛋白的人源抗体或其抗原结合片段，其中所述F蛋白为融合前构象。
8.权利要求1-6任一项所述的结合呼吸道合胞病毒F蛋白的人源抗体或其抗原结合片段，其中所述呼吸道合胞病毒为A或B型呼吸道合胞病毒。
9.核酸分子，其编码权利要求1-5任一项所述的结合呼吸道合胞病毒F蛋白的人源抗体或其抗原结合片段，或所述抗体的轻链、重链、轻链可变区或重链可变区。
10.表达载体，其包含权利要求9所述的核酸分子。
11.宿主细胞，其表达权利要求1-6任一项所述的结合呼吸道合胞病毒F蛋白的人源抗体或其抗原结合片段，或者包括权利要求9所述的核酸分子或者权利要求10所述的表达载体。
12.药物组合物，其包括权利要求1-6任一项所述的结合呼吸道合胞病毒F蛋白的人源抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体。
13.偶联物，其包含权利要求1-6任一项所述的结合呼吸道合胞病毒F蛋白的人源抗体或其抗原结合片段，以及偶联部分，其中，所述偶联部分为纯化标签(如His标签)，可检测的标记或小分子药物；优选地，所述偶联部分为荧光物质、化学发光物质、有色物质、聚乙二醇或酶，优选地，所述小分子药物选自呼吸道合胞病毒的核酸或F蛋白抑制剂。
14.融合蛋白或多特异性抗体(优选双特异性抗体)，其包含权利要求1-6任一项所述的结合呼吸道合胞病毒F蛋白的人源抗体或其抗原结合片段。
15.权利要求1-6任一项所述的结合呼吸道合胞病毒F蛋白的人源抗体或其抗原结合片段，权利要求13的偶联物，权利要求14的融合蛋白或多特异性抗体在制备治疗或预防呼吸道合胞病毒相关疾病的药物中的用途。
16.在受试者中治疗或预防呼吸道合胞病毒相关疾病的方法，其包括以有效量向所述受试者给药权利要求1-6任一项所述的结合呼吸道合胞病毒F蛋白的人源抗体或其抗原结合片段，权利要求12所述的药物组合物，权利要求13的偶联物或权利要求14的融合蛋白或多特异性抗体。
17.检测样品中是否存在呼吸道合胞病毒或其含量的方法，包括让所述样品与权利要求1-6任一项所述的结合呼吸道合胞病毒F蛋白的人源抗体或其抗原结合片段接触，并检测是否形成了抗原抗体复合物或形成的抗原抗体复合物的量。
18.试剂盒，其包括权利要求1-6任一项所述的结合呼吸道合胞病毒F蛋白的人源抗体或其抗原结合片段、权利要求13的偶联物，权利要求14的融合蛋白或多特异性抗体；优选地，所述试剂盒还包括第二抗体，所述第二抗体特异性识别所述抗体；任选地，所述第二抗体还包括可检测的标记，例如放射性同位素、荧光物质、化学发光物质、有色物质或酶；优选地，所述试剂盒用于检测RSV在样品中的存在或其水平。
CN202210113540.5A 2022-01-30 2022-01-30 一种呼吸道合胞病毒的全人源单克隆抗体及其应用 Pending CN116514960A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210113540.5A CN116514960A (zh) 2022-01-30 2022-01-30 一种呼吸道合胞病毒的全人源单克隆抗体及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210113540.5A CN116514960A (zh) 2022-01-30 2022-01-30 一种呼吸道合胞病毒的全人源单克隆抗体及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116514960A true CN116514960A (zh) 2023-08-01

Family

ID=87399924

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210113540.5A Pending CN116514960A (zh) 2022-01-30 2022-01-30 一种呼吸道合胞病毒的全人源单克隆抗体及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116514960A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117310163A (zh) * 2023-11-23 2023-12-29 北京贝思泰生物科技有限公司 一种基于重组抗体的呼吸道合胞病毒检测方法
CN118005783A (zh) * 2024-04-08 2024-05-10 南京医科大学 一种抗呼吸道合胞病毒抗体及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130323249A1 (en) * 2012-05-31 2013-12-05 Sorrento Therapeutics Inc. Antigen Binding Proteins that Bind PD-L1
CN111606993A (zh) * 2019-02-26 2020-09-01 中国科学院上海生命科学研究院 抗呼吸道合胞病毒的全人广谱中和抗体4f1及其应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130323249A1 (en) * 2012-05-31 2013-12-05 Sorrento Therapeutics Inc. Antigen Binding Proteins that Bind PD-L1
CN104736168A (zh) * 2012-05-31 2015-06-24 索伦托治疗有限公司 与pd-l1结合的抗原结合蛋白
CN111606993A (zh) * 2019-02-26 2020-09-01 中国科学院上海生命科学研究院 抗呼吸道合胞病毒的全人广谱中和抗体4f1及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GENBANK: "immunoglobulin heavy chain variable region, partial [Homo sapiens]", GENBANK, 13 April 2020 (2020-04-13), pages 65612 *
黄升海等: "抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体的制备及其鉴定", 安徽医科大学学报, vol. 34, no. 3, 31 December 1999 (1999-12-31), pages 1 - 4 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117310163A (zh) * 2023-11-23 2023-12-29 北京贝思泰生物科技有限公司 一种基于重组抗体的呼吸道合胞病毒检测方法
CN117310163B (zh) * 2023-11-23 2024-02-13 北京贝思泰生物科技有限公司 一种基于重组抗体的呼吸道合胞病毒检测方法
CN118005783A (zh) * 2024-04-08 2024-05-10 南京医科大学 一种抗呼吸道合胞病毒抗体及其应用
CN118005783B (zh) * 2024-04-08 2024-06-11 南京医科大学 一种抗呼吸道合胞病毒抗体及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10149903B2 (en) Fully human antibody against respiratory syncytical virus
CN113929771B (zh) 多瘤病毒中和抗体
CN110016079B (zh) 抗呼吸道合胞病毒的中和抗体及其应用
WO2021174595A1 (zh) 一种抗新型冠状病毒的单克隆抗体及其应用
CN111333723B (zh) 针对狂犬病病毒g蛋白的单克隆抗体及其用途
CN114644708B (zh) 呼吸道合胞病毒特异性结合分子
WO2014170258A1 (en) Human antibodies binding to rsv g proteins
CN116514960A (zh) 一种呼吸道合胞病毒的全人源单克隆抗体及其应用
JP2010505876A (ja) ヒトメタニューモウイルスを中和するヒト抗体
KR20190044006A (ko) 중동호흡기증후군 코로나바이러스에 대한 항체 및 이를 이용한 항체역가 측정방법
US20240262894A1 (en) Antibody against respiratory syncytial virus and use thereof
WO2023179716A1 (zh) 一种抗cd3抗体、其制备方法及应用
CN114805579B (zh) 一种抗人ace2蛋白单克隆抗体、核酸分子及应用
WO2019165019A1 (en) Antibodies to human respiratory syncytial virus protein f pre-fusion conformation and methods of use therefor
CN115087667A (zh) 特异性结合SARS-CoV-2的抗原结合蛋白
CN111606992B (zh) 一种抗呼吸道合胞病毒的全人源抗体
TW202204395A (zh) 抗sars-cov-2之抗體及使用其之方法
CN114933649A (zh) 抗水痘-带状疱疹病毒的抗体及其用途
CN114805570B (zh) 一种抗人ace2单克隆抗体及其应用
WO2022143815A1 (zh) 抗新冠病毒受体结合区域表位中和抗体及其应用
WO2018140242A1 (en) Structural basis for antibody cross-neutralization of respiratory syncytial virus and human metapneumovirus
RU2824390C2 (ru) Фармацевтическая композиция, содержащая антитело против il-5, и ее применение
WO2023025253A1 (zh) 抗rsv病毒抗体及其应用
CN117683123A (zh) 抗狂犬病毒人源化抗体和抗体组合及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination