JP2010505876A - ヒトメタニューモウイルスを中和するヒト抗体 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ヒトメタニューモウイルス(HMPV)ポリペプチドに対する抗体(HMPV−Fタンパク質に免疫特異的に結合する抗体を含む)を産生させるための方法を開示する。本発明は、HMPV感染に随伴する症状を予防、治療または改善するための方法も開示する。
Description
本発明は、一般的には抗体、より具体的には、ヒトメタニューモウイルス(human metapneumovirus:HMPV)に特異的に結合する抗体またはそれらのフラグメント、ならびにHMPV感染に随伴する症状を予防、治療または改善するための方法に関する。
ヒトメタニューモウイルス(HMPV)は、最近発見された呼吸器病原体であり、今では幼児、老人および免疫不全の個体における重症呼吸器疾患の世界的主因であることがわかっている。臨床的に、HMPV呼吸器疾患は、ヒト呼吸器合包体ウイルス(human respiraory syncytial virus:HRSV)によって引き起こされるものに非常に類似し、これら2つの病原体は近縁である。
ヒトメタニューモウイルスは、病因不明の急性呼吸器疾患の症状を呈している小児から単離され、2001年に初めて記載された。アーカイブ患者サンプルでのオランダにおける血清学的研究は、このウイルスが、少なくとも50年前からヒトの間で流行してきたことを示している。さらに、血清有病率分析は、2歳までの乳児の50%より多くがこのウイルスに感染し、ほぼすべての子供が5歳の年齢になる前に1回以上このウイルスに感染することを示している。その発見以来、徹底した研究により、世界中の患者サンプルにおいてHMPVが検出され、この病原体が幼児および成人における急性呼吸器疾患の(HRSVに次ぐ)主因として同定された。HRSVでの場合と同様に、HMPV感染率は、温帯気候では季節によって異なり、初冬から冬半ばの月の間にピークに達し、早春まで続く。
HMPV感染によって発現される疾患負荷の完全な範囲はまだ正式に決定されていないが、HMPVが入院幼児における呼吸器疾患のおよそ5%から15%を占めると推定される。この群の中で、2歳未満の年齢の小児は、HMPV感染後の重症疾患の危険度が最も高いようである。成人集団では、HMPV感染後、老人および免疫不全の人に、特に問題が起こりやすい。例えば、HMPVは、他の既知病原体がない状態の慢性閉塞性肺疾患(COPD)を有する老人個体において見つかった。HMPVは、血液学的悪性病変を有する成人および小児において重症および時として致死性の呼吸器疾患を引き起こすことも明らかになった。HMPV感染が喘息状態を招くまたは悪化させることがあるという証拠もある。さらに、HMPVは、SARSコロナウイルスによって引き起こされる重症急性呼吸器症候群のサブセットにおいて共通病原体(co−pathogen)として、および致死性脳炎の症例では病因の補助因子として提案されている。
一般に、HMPVは、HRSV感染に伴って観察されるものに非常に類似した疾病スペクトルを呈する患者を感染させるが、もたらされる症状の観察頻度は、個々のHMPV患者集団間で異なる。小児の下気道と上気道の両方のHMPV感染は、発病率12から50%の随伴性中耳炎も伴う。著しく重症の呼吸器疾患に至る悪化は、HMPVとHRSVに同時感染している一部の小児において観察されたが、他ではされなかった。したがって、HMPVとHRSVへの同時感染は、それらの有病率およびオーバーラップする冬季流行からして珍しいことではなさそうだが、これら2つのウイルス間で相互依存的な病理が発生し得るか否かは、今のところ、不明のままである。重要なこととして、急性HMPV感染症のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)に基づく診断により、このウイルスは、呼吸器疾患を示す症状を有さない乳児または成人には滅多に存在しないと判定された。これは、これら2つの群における無症候性または非顕性HMPV感染症の不在を示唆している。
HMPVは、モノネガウイルス(Mononegavirales)目、パラミクソウイルス(Paramyxoviridae)科、ニューモウイルス(Pneumoviriniae)亜科のメタニューモウイルス(Metapneumovirus)属に割り当てられている。このウイルスは、シチメンチョウにおける重症鼻気管炎の原因因子であるがニワトリおよびキジも感染させるトリメタニューモウイルス(AMPV)(メタニューモウイルス属の唯一の他の構成員)、および肺炎ウイルス(Pneumovirus)属(ニューモウイルス科の他の属)に割り当てられているHRSVと、最も近縁である。
他のニューモウイルスと同じように、Gタンパク質およびFタンパク質が感染プロセスを支配する。II型ムチン様分子の特徴を有するが、そのHRSVおよびAMPV相同体において見出されるシステイン残基のクラスターがないGタンパク質は、ターゲット細胞受容体のウイルス付着を媒介するのに役立ち、F糖タンパク質は、ウイルスエンベロープ膜と宿主細胞膜の融合を促進し、したがって、ウイルスRNAのターゲット細胞原形質への到達を助長する。しかし、Gタンパク質および表面タンパク質遺伝子(SH)タンパク質のないHMPVは、アフリカミドリザル(非ヒト霊長類宿主)において首尾よく複製する。これは、そのウイルス付着機能が、最終的には別のウイルスタンパク質によって遂行され得ることを示唆している。
ヒトメタニューモウイルス(HMPV)Fタンパク質は、HMPV感染症に対する有効な中和および防御を媒介する主要な抗原決定基であると考えられる。HMPV−Fタンパク質は、系統を超えた広範な中和および防御を媒介できる主要な抗原決定子である。HMPV−Fタンパク質に対するMAbの生産は、診断技術の開発、ワクチン研究、およびウイルス病原性に関する研究にとって重要である。
本発明は、ヒトメタニューモウイルス(HMPV)Fタンパク質抗原に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントの開発に基づく。
1つの実施形態において、ヒトメタニューモウイルス(HMPV)融合糖タンパク質(Fタンパク質)に特異的に結合する、単離されたヒト抗体を開示する。1つの態様において、前記Fタンパク質は、配列番号30、配列番号32、配列番号34、および配列番号36に記載のアミノ酸配列から成る群より選択される。関連態様において、前記抗体は、HMPVジェノグループA1、A2、B1およびB2を中和する。
もう1つの態様において、前記抗体は、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、または配列番号28に記載のHCDR3アミノ酸配列を含む。
もう1つの実施形態において、中和抗体の同定方法を開示し、この方法は、組換、未成熟および成熟形態の融合タンパク質(Fタンパク質)に対する抗体のパネルを作成するステップと、競合分析によりそれぞれの形態のFタンパク質への抗体の結合を比較するステップと、それぞれの形態のFタンパク質に対するパネル内のそれぞれの抗体についてのKdを決定するステップと、組換または未成熟形態のFタンパク質のKdが成熟形態のFタンパク質より1桁以上高い1つ以上の抗体をパネル内で同定するステップと、同定された1つ以上の抗体の中和効率を決定するステップとを含む(この場合、中和抗体は、非中和抗体より低い、成熟形態のFタンパク質に対する結合定数を有する)。関連態様において、前記方法は、マイクロ中和アッセイによって同定された1つ以上の抗体の分析を含む。1つの実施形態において、ヒトメタニューモウイルス(HMPV)感染によって引き起こされる呼吸状態を被験者において治療する方法を開示し、この方法は、HMPVを中和する抗体を被験者に投与することを含む。
もう1つの実施形態において、ヒトメタニューモウイルス(HMPV)融合糖タンパク質(Fタンパク質)に特異的に結合する1つ以上のヒト抗体を含むワクチンを開示する。関連態様において、前記ワクチンは、HMPVジェノグループA1、A2、B1およびB2を中和する。
1つの実施形態において、メタニューモウイルス(HMPV)感染を診断する方法を開示し、この方法は、被験者からのサンプルと、HMPV融合糖タンパク質(Fタンパク質)に特異的に結合するヒト抗体とを、抗体/Fタンパク質複合体の形成を可能にする条件下で接触させるステップと、そのサンプルと、その抗体と相互作用する試薬とを接触させるステップと、その試薬とその抗体の相互作用を検出するステップとを含み、この場合、その試薬−抗体相互作用が、被験者におけるHMPV感染の存在を示す。関連態様において、前記被験者は、ヒトである。もう1つの関連態様において、前記試薬は、HMPV−Fタンパク質に特異的に結合するヒト抗体に対する抗体である。
もう1つの実施形態において、サンプル中のヒトメタニューモウイルス(HMPV)の存在を判定するための診断用キットを開示し、このキットは、1つ以上のHMPV融合糖タンパク質(Fタンパク質)に特異的に結合する1つ以上のヒト抗体と生体サンプルを、1つ以上の抗体と1つ以上のHMPV−Fタンパク質との複合体の形成を可能にする条件下で接触させるための装置と、複合体を形成していない抗体を除去する1つ以上の試薬と、抗体を認識する1つ以上の試薬と、抗体および試薬の使用に関する手順を提供する指示書と、1つ以上の抗体、試薬および指示書を収容する容器とを含む。
上述の実施形態の様々な組み合わせが本発明により考えられ、下に列挙する他の態様を含む実施形態もまた考えられる。
本組成物および方法を記載する前に、記載する特定の組成物、方法および実験条件に本発明が限定されないことを理解しなければならない。そのような組成物、方法および条件は、変わることがあるからである。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書において用いる専門用語は、特定の実施形態の説明のみを目的とし、限定するためのものでないことも理解しなければならない。
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いる場合、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」および「その(the)」は、その文脈が明確に別様に示していない限り、複数形の言及を含む。したがって、例えば、「その(the)方法」への言及は、本開示などを読むことによって当業者に明らかとなる、ここに記載するタイプの1つ以上の方法および/またはステップを含む。
別様に定義されていない限り、ここで用いるすべての技術用語および科学用語は、当分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。ここに記載するものと同様のまたは等価の任意の方法および材料を、本発明の実施または試験において用いることができるが、ここでは例示的な方法および材料を記載する。
「1本鎖抗原結合タンパク質」は、VL配列のカルボキシル末端をVH配列のアミノ末端に連結させるペプチドによって免疫グロブリン重鎖可変領域アミノ酸配列(VH)につなぎ留められた免疫グロブリン軽鎖可変領域アミノ酸配列(VL)からなるポリペプチドを指す。
「1本鎖抗原結合タンパク質コード化遺伝子」は、1本鎖抗原結合タンパク質をコードする組換遺伝子を指す。
「ポリペプチドおよびペプチド」は、隣接残基のアルファ−アミノ基とカルボキシ基の間のペプチド結合によって互いに接続しているアミノ酸残基の線形配列を指す。
「タンパク質」は、ポリペプチドの場合のような互いに接続された約50個より多くのアミノ酸残基の線形配列を指す。
「免疫グロブリン産物」は、免疫グロブリン重鎖の少なくとも免疫活性部分を含有し、したがって、抗原と特異的に化合することができる、ポリペプチド、タンパク質または多量体タンパク質を指す。例示的免疫グロブリン産物は、免疫グロブリン重鎖、免疫グロブリン分子、実質的にインタクトの免疫グロブリン分子、ならびにパラトープを含有する免疫グロブリンの任意の部分(Fabフラグメント、Fab’フラグメント、Fab2’フラグメントおよびFvフラグメントとして当該技術分野において公知の部分を含む)である。
「免疫グロブリン分子」は、互いに共有結合し、抗原と特異的に化合することができる免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖の免疫活性部分を含有する、多量体タンパク質を指す。
「Fabフラグメント」は、互いに共有結合し、抗原と特異的に化合することができる免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖の免疫活性部分を含有する免疫グロブリン分子の一部からなる多量体タンパク質を指す。Fabフラグメントは、一般に、当分野において周知の方法を用いて、実質的に無損傷の免疫グロブリン分子をパパインで加水分解消化することによって作製される。しかし、Fabフラグメントは、当分野において周知の方法を用いて、適する宿主細胞において免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖の所望の部分を発現させることによって作製することもできる。
「Fvフラグメント」は、互いに共有結合し、抗原と特異的に化合することができる免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域の免疫活性部分からなる多量体タンパク質を指す。Fvフラグメントは、一般に、当分野において周知の方法を用いて、適する宿主細胞において免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域の所望の部分を発現させることによって作製される。
「免疫グロブリンスーパーファミリー分子」は、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン関連ドメインに有意に類似しているドメインサイズおよびアミノ酸残基配列を有する分子を指す。類似性の有意性は、Dayhoff et al.,Meth Enzymol.91:524−545(1983)によって記載されたアラインプログラムなどのコンピュータプログラムを用いて統計学的に決定される。3未満の代表的なアラインスコアは、試験した分子が免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのメンバーであることを示す。
「エピトープ」は、免疫グロブリン産物によって特異的に認識される分子の部分を指す。決定基または抗原決定基と呼ばれることもある。
「中和する」は、ウイルスの感染性または毒素分子の毒性を阻害することができる抗体の活性を指す。
「ジェノグループ」は、同じまたは類似したタンパク質をコードする1セットの近縁遺伝子を含む、ウイルスの株を指す。
HRSVおよびAMPVと同様に、HMPVは、マイナス鎖RNAからなる約13キロ塩基のゲノムを含有するエンベロープウイルスである。機構はコンパクトであり、そのゲノムの約95%が、予測されるオープンリーディングフレーム内に表される。3’から5’の方向の以下の順序で発生する8つの遺伝子があると考えられる。ヌクレオカプシドRNA結合タンパク質遺伝子((N)、例えば、Genbankアクセッション番号841210;DQ841209;DQ841208;DQ841207;DQ834376)、ヌクレオカプシドリンタンパク質遺伝子((P):例えば、Genbankアクセッション番号DQ112319;DQ112318;DQ112317;DQ112316;DQ112315;DQ112314)、非グリコシル化マトリックスタンパク質遺伝子((M):例えば、Genbankアクセッション番号DQ439961;DQ439960;DQ439959;DQ439958;DQ439957)、融合糖タンパク質遺伝子((F):例えば、配列番号30;配列番号32;配列番号34;配列番号36が挙げられるが、これらに限定されない)、転写延長因子遺伝子((M2−1):例えば、Genbankアクセッション番号AAS22126;AAS22086;AAS22118;AAS22110;AAS22102)、小型疎水性表面タンパク質遺伝子((SH):例えば、Genbankアクセッション番号AAS22088;AAS22128;AA22120;AAS22112;AAS22104)、大型付着タンパク質遺伝子((G):例えば、Genbankアクセッション番号AAS22129;AAS22121;AAS22113;AAS22105;AAS22097)、および大型ポリメラーゼサブユニット遺伝子((L):例えば、Genbankアクセッション番号AY550173;AY550172;AY550171;AY550170;AY550169)である。9番目のタンパク質、RNA合成調節因子((M2−2)、例えば、Genbankアクセッション番号AAS22095;AAS22103;AAS22111;AAS22119;AAS22127)は、HRSVの場合のようにM2遺伝子配列内の第二オーバーラッピングオープンリーディングフレームから生じると予測される(van den Hoogen et al.,Nat Med(2001)7:719−724)。II型糖タンパク質であると予想されるSH分子も、そのアミノ末端の近くに位置する疎水性シグナルアンカー配列によって、ウイルスエンベロープに挿入される。
広い地理および温度分布を有する単離された多数のHMPVからのF−、G−、SH−、N−、P−、M−、M−2−およびL−遺伝子のうちの1つ以上についての部分または完全配列の系統発生的精査が行われた(Bastien et al.,J Clin Microbiol(2004)42:3532−3537;Biacchesi et al.,Virol(2003)315:1−9;Ishiguro et al.,J Clin Microbiol(2004)42:3406−3414)。これらの分析からのデータセットによって、2つのHMPV遺伝子系統が矛盾なく同定され、これらはAおよびBと呼ばれている(これは、HRSVの分離集団についてのグループ分けに類似している)。グループAおよびB内のHMPV遺伝子配列は、グループごとにさらに2つのクレードに分けることができ、これらは、A1およびA2、ならびにB1およびB2と表される。これら4つのHMPVサブタイプが、同じ地理領域内で同時に循環し得ること、およびそれぞれのサブタイプの相対比率が、季節によって変わり得ることは、明らかである。グループAまたはグループBに割り当てられたHMPV分離集団間で予測アミノ酸配列を比較すると、G−およびSH−タンパク質は、低いアミノ酸同一性(それぞれ、33%および58%の同一性)を有した。対照的に、他のHMPV遺伝子産物は、高度に保存された次のもの、すなわち、Fタンパク質:94〜95%のアミノ酸同一性、Nタンパク質:95〜96%の同一性、Pタンパク質:85%の同一性、Mタンパク質:97%の同一性、M2−1:95〜96%の同一性、M2−2タンパク質:89〜90%の同一性、およびLタンパク質:94%の同一性である。Fおよび非エンベロープウイルスタンパク質についてのより多くの保存配列のHMPVグループ間のこの明らかなパターン、ならびにG−およびSH−タンパク質のより大きな多様性は、一般に、HRSVにおける同等の分析で見られるものとよく似ている。M2−2タンパク質は例外であり、これは、HRSV株間よりHMPV株間のほうが著しく保存される。さらに、アミノ酸レベルでは、HMPVのFタンパク質は、HRSV−Fタンパク質より系統発生グループ間での違いが6%少なかった。
1つの実施形態において、コットンラットにおいて高免疫原性であり、中和抗体を誘導する可溶性形態のHMPVFタンパク質(FΔTM)を産生させるための哺乳動物タンパク質発現方法を開示する。この構築物を使用して、コンビナトリアルファージディスプレイライブラリから完全ヒトMabを選択した。1つの態様において、このアプローチは、HMPV感染細胞に結合する非常に多数のヒトFabを単離する際に有効である。もう1つの態様において、前記FΔTMタンパク質は、天然Fタンパク質上に存在する中和エピトープを保持する。
個々のHMPV株、特に、3つのエンベロープ糖タンパク質をコードする遺伝子、の間の遺伝的変異度は、感染した宿主における抗原の多様性に直接影響を及ぼす。HRSVに類似して、HMPVのFタンパク質に対する抗体応答は、系統発生グループAとBの間で交差反応性および交差防御性であるが、Gタンパク質に対する免疫応答は、特異的であり、一般に、クレードを超えた中和および防御をもたらすことができない。理論に拘束されないが、HMPV単離集団の系統学的研究から、グループAおよびグループBのウイルス分離集団は異なる抗原分類をも示すことができ、遺伝的多様性のような抗原多様性の大部分がGタンパク質およびSHタンパク質から生じ得ると結論付けるのが妥当であると考えられる。
ヒトにおいて、パラミクソウイルス(HMPVを含む)による再感染は、遺伝子的に同種のウイルスによっても、生涯を通じて発生する。したがって、これらの環境下で、HMPVにおける遺伝的多様性および抗原多様性の最も有意な帰結、すなわち、1つの遺伝子グループのウイルスが、異種株ではなく、同種株による感染に対してより大きな免疫防御を誘導するかどうか、を有意義に決定することは難しい。しかし、HMPVサブグループ間および内のGタンパク質の高い分岐度は、Gタンパク質に対する制限された交差中和および交差防御抗体応答の一因となり、したがって、インバリアントFタンパク質は、当然、HMPV中和抗体の主要オペレーションターゲットとしての意味をもつ。
1つの実施形態において、ヒトメタニューモウイルス(HMPV)融合糖タンパク質(Fタンパク質)に特異的に結合する、単離された抗体を開示する。1つの態様において、前記Fタンパク質は、配列番号30、配列番号32、配列番号34、および配列番号36に記載のアミノ酸配列から成る群より選択される。関連態様において、前記抗体は、HMPVジェノグループA1、A2、B1およびB2を中和する。
抗原多様性は、病原体に対する戦術上の利点をもたらす。HMPVの系統発生グループ間でGタンパク質について観察される配列多様性は、分子の細胞外部分に主として限定される。これは、HRSVのGタンパク質における類似の変化について仮定されるように、この現象が免疫学的圧力に対する進化の応答であることを示唆している。この特性は、1つのHMPVサブグループのGタンパク質に対する抗体が他のサブグループに属するウイルスを交差中和する確率を、低下させる可能性が高いだろう。併せると、これらの要因のため、Gタンパク質は、HMPV感染の抗体予防においてターゲットにするには魅力のない分子となる。これは、Fタンパク質にはありそうもないケースである。
Fタンパク質はHMPV分離集団全体にわたって高度に保存され、経時的な抗原変異の徴候は殆どなく、これは、ことによると、Gタンパク質におけるよりこの分子におけるほうが大きな機能的および構造的制約がアミノ酸置換にかかることを表している。HRSVに言及して、Fタンパク質は、株間交差中和および防御抗体についての主要ターゲットである。したがって、HMPVのFタンパク質は、抗体予防のための非常に好適なターゲットと言え、候補ワクチンの成分とも言える。
前記Fタンパク質は、最初は不活性単量体前駆体F0として合成され、該タンパク質は、ジスルフィド結合によって共有結合で連結される2つのサブユニット(F1およびF2)に分割される。前記F1−F2分子の4個が、F1サブユニットを介して相互作用して、成熟ウイルス粒子スパイクを形成する。
1つの実施形態において、本発明は、HMPVのFタンパク質に対する中和抗体を同定するための方法を開示し、この方法は、組換え、未成熟および成熟形態の融合タンパク質(Fタンパク質)に対する抗体のパネルを作成するステップと、競合分析によりそれぞれの形態のFタンパク質への抗体の結合を比較するステップと、それぞれの形態のFタンパク質に対するパネル内のそれぞれの抗体についてのKdを決定するステップと、組換えまたは未成熟形態のFタンパク質のKdが成熟形態のFタンパク質より1桁以上高い1つ以上の抗体をパネル内で同定するステップと、同定された1つ以上の抗体の中和効率を決定するステップとを含む(この場合、中和抗体は、非中和抗体より低い、成熟形態のFタンパク質に対する結合定数を有する)。関連態様において、前記Fタンパク質は、オリゴマー形態のものである。
「オリゴマー」は、繰り返される共有結合性または非共有結合性連鎖の中に少数の、典型的には2から約10の、構造ユニットを含有する分子からなる任意の物質または物質の種類を指し、前記ユニットは、1種類のユニットである場合もあり、1つより多くの種類のユニットである場合もある。
機能性ポリペプチド(機能性タンパク質複合体を含む)を生産するための本発明の方法の有用性を、本明細書では、機能性抗体の生産によって例示する。用語「抗体」は、本明細書では、抗原のエピトープに特異的に結合することができるポリペプチドまたはタンパク質複合体を指すために広く用いている。一般に、抗体は、重鎖可変領域ドメインおよび軽鎖可変領域ドメイン、特に超可変領域、の会合によって形成される、少なくとも1つの抗原結合ドメインを含有する。
糸状バクテリオファージの表面で発現される抗体分子のフラグメントのライブラリの構築、および抗原への結合によるファージ抗体の選択は、研究および臨床用途のための新たなツールを生じさせる強力な手段とみなされている。しかし、この技術は、固相依存性選択手順に十分な量で利用することができる精製抗原に特異的なファージ抗体を産生させるために主として用いられている。生化学的および機能性アッセイにおけるそのようなファージ抗体の有効性はまちまちであり、一般に、選択に用いられる手順によってそれらの有用性が決まる。
一般に、対象となる多数の抗原を純粋な形態で非常に大量に入手することはできない。このことは、研究および臨床用途のためにそのような抗原材料と結合させるにあたりファージ抗体の有用性を制限し得る。さらに、そのような用途におけるファージ抗体の有用性は、抗原の純度、および単離されたファージ抗体の特異性を評価するための精製法に正比例する。天然細胞表面構造に結合するヒトモノクローナル抗体は、治療および診断手順に関する幅広い用途を有すると予想される。ファージ抗体ディスプレイ技術の重要な拡張は、異種混合物中に存在する細胞の亜集団の表面で発現される抗原に対する特異的抗体を直接選択する戦略である。そのような抗体は、単一の高多様性ディスプレイライブラリから誘導することができる(例えば、米国特許第6,265,150号を参照のこと。この特許は、本明細書に参照することによって取り入れられている)。
ディスプレイライブラリ(すなわち、バクテリオファージ、特に糸状ファージ、および具体的には、ファージM13、FdおよびF1からのもの)は、融合タンパク質を形成するこれらのファージのgIIIまたはgVIIIのいずれかに提示されるポリペプチドをコードする挿入ライブラリを含む。例えば、Dower、WO 91/19818;Devlin、WO 91/18989;MacCafferty、WO 92/01047(遺伝子III);Huse、WO 92/06204;Kang、WO 92/18619(遺伝子VIII)を参照のこと。そのような融合タンパク質は、通常はファージコートタンパク質以外の分泌タンパク質、提示されるポリペプチド、および遺伝子IIIもしくは遺伝子VIIIタンパク質のいずれかまたはそれらのフラグメントからの、シグナル配列を含む。外因性コード化配列は、多くの場合、遺伝子IIIまたは遺伝子VIIIのN末端またはその付近に挿入されるが、他の挿入部位も可能である。幾つかの糸状ファージベクターが、遺伝子IIIまたは遺伝子VIIIのいずれかの二次コピーを生産するように遺伝子操作された。そのようなベクターでは、外因性配列が2つのコピーのうちの一方にしか挿入されない。他方のコピーは、ファージ粒子に組み込まれる融合タンパク質の比率を有効に薄め、ならびにファージ増殖に有害なポリペプチドに対する選択を減少させる点で有利であり得る。もう1つの変形では、ファージコートタンパク質およびファージパッケージング配列をコードするが、複製することができないファージミドベクターに、外因性ポリペプチド配列がクローニングされる。ファージミドは、細胞にトランスフェクトされ、ヘルパーファージでの感染によってパッケージングされる。ファージミド系の使用は、コートタンパク質とヘルパー細胞から発現されるコートタンパク質の野生型コピーを有する提示されるポリペプチドからなる融合タンパク質を希釈する効果も有する。例えば、Garrard、WO 92/09690を参照のこと。真核細胞を使用して、類似の方法でポリペプチドを提示することができる。
胞子もディスプレイパッケージとして使用することができる。この場合、ポリペプチドは、胞子の外面から提示される。例えば、枯草菌(B.subtilis)からの胞子が好適であると報告されている。これらの胞子のコートタンパク質の配列は、当分野において公知である。細胞もディスプレイパッケージとして使用することができる。提示されるポリペプチドは、細胞表面で発現される細胞タンパク質をコードする遺伝子に挿入される。細菌細胞としては、鼠チフス菌、枯草菌、緑膿菌、ビブリオコレラ、クレブシエラ肺炎杆菌(Klebsiella pneumonia)、淋菌、髄膜炎菌、バクテロイデス・ノドサス、牛モラクセラ菌および大腸菌が挙げられるが、これらに限定されない。他の外面タンパク質の詳細は、当分野において周知である(例えば、Ladner et al.,米国特許第5,571,698号を参照のこと)。例えば、大腸菌のlamBタンパク質が好適である。
抗体鎖は、1本鎖形で提示される場合もあり、または2本鎖形で提示される場合もある。1本鎖抗体ライブラリは、抗体の重鎖または軽鎖を単独で含む場合もあり、またはそれらの可変ドメインを含む場合もある。しかし、より一般的には、1本鎖抗体ライブラリの構成員は、単一の隣接タンパク質中のペプチドスペーサーによって隔てられた重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインの融合体から形成される。例えば、Ladner et al.,WO 88/06630;McCaffertyet al.,WO 92/01047を参照のこと。2本鎖抗体は、重鎖と軽鎖またはそれらの結合フラグメントの非共有結合性会合によって形成される。2本鎖抗体は、2つの1本鎖抗体(それぞれの1本鎖抗体は、重鎖可変ドメイン、リンカーおよび軽鎖可変ドメインを含む)の会合によっても形成される。ダイアボディーとして公知である、そのような抗体では、1本鎖抗体の重鎖は他方の軽鎖に結合し、軽鎖は他方の重鎖に結合し、このようにして、2つの全く同じ抗原結合部位を形成する。したがって、1本鎖抗体を提示するファージは、ダイアボディーとしての2つの1本鎖抗体の会合により、ダイアボディーを形成することができる。
抗体ライブラリの多様性は、免疫処置を受けたまたは受けていないB細胞のモノクローナル集団などの天然源から抗体コード配列を得ることから生ずる。あるいは、または加えて、多様性は、ディスプレイベクターへの導入前または後、抗体鎖をコードする核酸の人工的突然変異誘発によって導入することができる。そのような突然変異誘発は、PCRの過程で行うことができ、またはPCR前もしくは後に誘導することもできる。
場合によってはスペーサーに隣接して提示される抗体鎖をコードする核酸を、標準的な組換えDNA技術(一般に、Sambrook et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2d ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989を参照のこと。これは、本明細書に参照によって取り入れられている)によって、上で論じたようなファージのゲノムに挿入する。最終的に、核酸を(スペーサーまたはフレームワーク残基を有するまたは有さない)抗体鎖として発現させる。ファージ、細菌および胞子ベクターにおいて、複製可能なパッケージの外表面タンパク質のすべてまたは一部に抗体鎖を融合させる。ライブラリは、多くの場合、構成員数約103、104、106、107、108のまたはそれより大きいサイズを有する。
用語「ポリヌクレオチド」または「ヌクレオチド配列」または「核酸分子」は、本明細書では、ホスホジエステル結合によって互いに連結されている2つ以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの配列を意味するために広く用いている。したがって、これらの用語は、RNAおよびDNA(これらは、遺伝子またはその一部、cDNA、合成ポリデオキシリボ核酸配列などである場合があり、および1本鎖である場合もあり、または2本鎖である場合もある)、ならびにDNA/RNAハイブリッドを包含する。さらに、これらの用語は、本明細書において用いる場合、細胞から単離することができる天然核酸分子、ならびに例えば化学合成法によってまたは酵素的方法よって(例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって)作製することができる合成ポリヌクレオチドを包含する。
一般に、ポリヌクレオチドを含むヌクレオチドは、天然デオキシリボヌクレオチド、例えば、2’デオキシリボースに連結されたアデニン、シトシン、グアニンもしくはチミン、またはリボヌクレオチド、例えば、リボースに連結されたアデニン、シトシン、グアニンもしくはウラシルである。しかし、用途に依存して、ポリヌクレオチドは、非天然合成ヌクレオチドまたは修飾天然ヌクレオチドをはじめとする、核酸類似体も含有することがある。ヌクレオチド類似体は、当分野において周知であり、市販され(例えば、Ambion,Inc.;Austin TX)、そのようなヌクレオチド類似体を含有するポリヌクレオチドも同様である。ポリヌクレオチドのヌクレオチドを連結する共有結合は、一般に、ホスホジエステル結合である。しかし、そのポリヌクレオチドを使用することとなる目的に依存して、この二重結合は、チオジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ペプチド様結合または当業者に合成ポリヌクレオチドを生成するためのヌクレオチドの連結に有用であると知られている任意の他の結合をはじめとする、他の種々の結合のいずれであってもよい。
天然ヌクレオチドおよびホスホジエステル結合を含むポリヌクレオチドは、化学合成することができ、または組換えDNA法を用い、適切なポリヌクレオチドをテンプレートとして使用して生成することができる。一方、ヌクレオチド類似体を含むポリヌクレオチド、またはホスホジエステル結合以外の共有結合は、一般に化学合成されるが、T7ポリメラーゼなどの酵素は、一定のタイプのヌクレオチド類似体をポリヌクレオチドに組み込むことができ、したがって、そのようなポリヌクレオチドを適切なテンプレートから組換え生産するために使用することができる。
用語「組換え核酸分子」は、本明細書では、人間の介入によって操作されるポリヌクレオチドを指すために用いている。組換え核酸分子は、その生成物が細胞内のどこにも存在しないような様式で連結されている、2つ以上のヌクレオチド配列を含有し得る。特に、それら2つ以上のヌクレオチド配列は、動作可能に連結させることができ、ならびに例えば、融合ポリペプチドをコードすることができ、またはコードヌクレオチド配列および調節要素を含むことができる。組換え核酸分子はまた、天然ポリヌクレオチドに基づくが、天然ポリヌクレオチドとは異なるように操作されている場合もあり、例えば、第一コドン(これは、通常、ポリヌクレオチドにおいて見出される)または対象となる配列(例えば、制限エンドヌクレアーゼ認識部位またはスプライス部位、プロモーター、DNA複製起点など)がポリヌクレオチドに導入されるような1つ以上のヌクレオチド変化を有する、ポリヌクレオチドである場合もある。
本明細書において用いる場合、用語「動作可能に連結される」は、2つ以上の分子が、それらが単一ユニットとして動作し、一方もしくは両方の分子またはそれらの組み合わせに帰する機能を果たすように、互いに対して配置されることを意味する。例えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、転写または翻訳調節要素に動作可能に連結させることができ、この場合、その要素は、その調節要素が、細胞内で通常それが会合しているポリヌクレオチド配列に作用するのと同様に、ポリヌクレオチドに対してその調節効果をもたらす。
本発明のポリヌクレオチドは、第一クローニング部位および第二クローニング部位に隣接させることができ、したがって、第二ポリヌクレオチドに容易に挿入または連結することができるカセットをもたらすことができる。そのような隣接する第一および第二クローニング部位は、同じ場合もあり、または異なる場合もあり、ならびに一方または両方が、独立して、複数のクローニング部位、すなわち多数のクローニング部位、のうちの1つである場合もある。本発明のベクターは、そのベクターに望ましい特性を付与する1つ以上の追加のヌクレオチド配列、例えばそのベクターの操作を助長する配列、を含有する場合もある。したがって、前記ベクターは、例えば、1つ以上のクローニング部位、例えば、異種ポリヌクレオチドをそのベクターに挿入し、第一プロモーターに動作可能に連結させることができるような位置にあるクローニング部位(多数のクローニング部位であってもよい)、を含有する場合がある。前記ベクターは、原核細胞の複製起点(ori)、例えば、大腸菌oriまたはコスミドoriも含有する場合があり、したがって、DNA増幅のために原核宿主細胞において継代することができるベクターを提供することができる。
2本鎖抗ディスプレイライブラリは、上で論じたディスプレイライブラリの一種を意味する。そのようなライブラリの生産は、当分野において周知である。例えば、2本鎖抗体ファージディスプレイライブラリでは、1本鎖ライブラリの場合と同様に、1本の抗体鎖がファージコートタンパク質に融合する。そのパートナー抗体鎖は、第一抗体鎖と複合しているが、そのパートナーは、ファージコートタンパク質に直接連結していない。重鎖または軽鎖のいずれかが、コートタンパク質に融合した鎖であり得る。コートタンパク質に融合していないもう一方の鎖が、パートナー鎖である。この配置は、一般に、1つの抗体鎖遺伝子をコードする核酸セグメントをファージディスプレイベクターのgIIIまたはgVIIIに組み込んで、シグナル配列と抗体鎖とファージコートタンパク質とを含む融合タンパク質を形成することによって達成される。パートナー抗体鎖をコードする核酸セグメントは、第一抗体鎖をコードするものと同じベクターに挿入することができる。場合によっては、重鎖および軽鎖を、同じプロモーターに連結された同じディスプレイベクターに挿入し、ポリシストロン性メッセンジャーとして転写することができる。あるいは、パートナー抗体鎖をコードする核酸を別のベクター(ファージベクターであってもよいし、またはなくてもよい)に挿入することができる。この場合、それら2つのベクターを同じ細胞において発現させる(WO 92/20791参照)。パートナー鎖をコードする配列は、そのパートナー鎖をシグナル配列に連結するが、ファージコートタンパク質には融合しないように、挿入する。両方の抗体鎖を発現させ、細胞のペリプラズムにエクスポートし、そこでそれらは集合し、ファージ粒子に組み込まれる。
前記ディスプレイベクターは、重鎖および軽鎖定常領域またはそれらのフラグメントを、挿入配列から発現される重鎖および軽鎖可変領域と共にインフレームで発現するように、設計することができる。一般に、前記定常領域は、天然ヒト定常領域であり、少数の保存的置換は許容され得る。Fabフラグメントでは、通常、重鎖定常領域は、CH1領域、および場合によっては、ヒンジ領域の一部またはすべてを含み、ならびに軽鎖定常領域は、無損傷軽鎖定常領域、例えば、CκまたはCλである。定常領域アイソタイプの選択は、補体依存性細胞毒性を最終的に必要するかどうかに、一部、依存する。例えば、ヒトアイソタイプIgG1およびIgG4は、そのような細胞毒性を支持するが、IgG2およびIgG3は支持しない。あるいは、前記ディスプレイベクターは、非ヒト定常領域を生じさせることができる。そのような状況では、一般に、その後、抗体鎖の可変領域のみをディスプレイベクターからサブクローニングし、ヒト定常領域は、挿入された抗体配列と共にインフレームで発現ベクターによって生じさせる。
抗体コード配列は、ヒトのリンパ細胞から得ることができる(下の実施例を参照のこと)。本発明の方法の実施に有用なポリヌクレオチドは、対象となる抗体を生産する細胞、例えば、免疫処置された被験者から、または特定の抗原に暴露された個体からのB細胞から単離することができ、周知のポリヌクレオチド合成法を用いて新たに合成することができ、または組換え生産することができる。1つの態様において、本発明の抗体ライブラリは、生涯の中で少なくとも1回はHMPVに暴露またはHMPVに感染したことがある、異なる成人ドナーの骨髄リンパ球から作製さる。もう1つの態様では、免疫されたヒトのリンパ球をエプスタイン−バールウイルスの感染により不死化して、モノクローナル抗体分泌性培養物を作製することができる。
再配列された免疫グロブリン遺伝子をゲノムDNAまたはmRNAからクローニングすることができる。後者の場合、mRNAは、細胞から抽出し、cDNAは、逆転写およびポリdTオリゴヌクレオチドプライマーを用いて作製する。そのような配列をコードする抗体をクローニングするためのプライマーは、当分野において周知である。
増幅させたVHおよびVL配列を幾つかの方法で互いに結合させることによって、抗体フラグメントのレパートリーが構築された。軽鎖および重鎖を異なるベクターに挿入し、それらのベクターをインビトロまたはインビボで結合させることができる。あるいは、軽鎖および重鎖を同じベクターに逐次的にクローニングすることができ、またはPCRによって一緒に組み立て、その後、ベクターに挿入することができる。重鎖のレパートリーを単一の軽鎖と化合させることもでき、または軽鎖のレパートリーを単一の重鎖と結合させることもできる。
一般に、抗体重鎖および軽鎖をコードするセグメントを重鎖および軽鎖の別個の集団からサブクローニングし、その結果、それぞれのベクターにおいて前記集団から重鎖と軽鎖のペアをランダムに会合させる。したがって、修飾されたベクターは、一般に、天然抗体では見出すことができない重鎖可変領域と軽鎖可変領域の組み合わせを含有する。これらの組み合わせの一部は、一般に、選択プロセスを生き残り、ポリクローナルライブラリの中にも存在する。
重鎖および軽鎖コード配列の集団をクローニングするための一部の例示的ベクターおよび手順は、Huse(WO 92/06204)によって記載されている。Hcポリペプチドをコードする配列の多様な集団をM13IX30にクローニングし、Lcポリペプチドをコードする配列をM13IX11にクローニングする。それらの集団は、M13IX30の場合はXhoI−SeeIまたはStuI制限酵素部位間、およびM13IX11の場合はSacI−XbaIまたはEcoRV部位間に挿入される(それぞれ、Huseの図1AおよびB)。両方のベクターは、HcおよびLcコード配列とそれらの関連ベクター配列を互いに連結させるために、MluI−HindIII制限酵素部位の2つのペア(Huseの図1AおよびB)を含有する。これら2つのペアは、発現させる配列を含有するベクタータンパク質のみが単一のベクターに正確に結合するように、クローニング部位を中心に対称に配向している。
抗体鎖を糸状ファージにクローニングするための他の例示的ベクターおよび手順は、米国特許第6,794,132号(本明細書に参照によって取り入れられている)に記載されている。一般に、本発明のベクターは、環状ベクターであってもよいし、または第一末端と第二末端を有する線状ベクターであってもよい。本発明の線状ベクターは、一方の末端または両末端に1つ以上のクローニング部位を有することができ、したがって、そのベクターを環状にする手段、またはそのベクターを第二のポリヌクレオチド(これは、本発明のベクターと同じまたは異なる第二のベクターであり得る)に連結させる手段を提供する。前記クローニング部位としては、制限エンドヌクレアーゼ認識部位(もしくはその分解産物)、リコンビナーゼ部位、またはそのような部位の組み合わせを挙げることができる。
前記ベクターは、1つ以上の発現制御要素、例えば、転写調節要素、追加の翻訳要素などをさらに含有することがある。1つの実施形態において、前記ベクターは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを開始ATGコドンに隣接して動作可能に連結させることができるように、プロモーターをコードする配列に動作可能に連結された開始ATGコドンを含有する。したがって、前記ベクターは、そのようなATGコドンに少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドを動作可能に連結させることができるような位置にあるクローニング部位も含有することがある。本発明のベクターは、第一のプロモーターに作動可能に連結された第一のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も含有することがあり、この場合、コードするヌクレオチド配列は、例えばATGコドンの上流およびその付近、ATGコドンの下流およびその付近、ならびに/またはコードされるポリペプチドのC末端またはその付近をはじめとする、1つ以上のクローニング部位を含有するように修飾される。そのようなベクターは、第一ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の置換により、または第一および第二ポリペプチドを含む融合タンパク質を発現することができるようなコードされたポリペプチドのN末端もしくはC末端付近での動作可能な連結で、第二ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をその中に挿入するための適便な手段を提供する。
抗体生産のために組換え発現系を使用する最も有用な側面としては、分子工学によって抗体を作製することができる容易さがある。これによって、抗体フラグメントおよび1本鎖分子の生産、ならびに完全長抗体の操作が可能となる。例えば、機能性組換え型抗体フラグメントのサイドレンジ、例えば、Fab、Fv、一本鎖および単一ドメイン抗体を作製することができる。これは、個々のドメインを遺伝子レベルで「切断し、スプライスする」ことができる、免疫グロブリン鎖のドメイン構造によって容易になる。
ヒト化モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドは、例えば、マウス免疫グロブリン遺伝子の可変重鎖および可変軽鎖由来のマウス相補性決定領域をコードするヌクレオチド配列をヒト可変ドメイン遺伝子に移入し、その後、マウス相対物のフレームワーク領域内のヒト残基を置換することによって、得ることができる。マウス免疫グロブリン可変ドメインの一般的なクローニング技術は、当分野において公知である。
本発明の方法は、コンビナトリアル免疫グロブリンライブラリから単離されたヒト抗体フラグメントをコードするポリヌクレオチドを使用して実施することもできる。ヒト免疫グロブリンファージライブラリを生産するために有用であるクローニングおよび発現ベクターは、例えば、Stratagene Cloning System(カリフォルニア州、ラ・ホーヤ)から入手することができる。
ヒトモノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドは、例えば、抗原チャレンジに応答して特異的ヒト抗体を生産するように遺伝子操作されたトランスジェニックマウスから得ることもできる。この技法では、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子座の要素を、外因性重鎖および軽鎖遺伝子座の部位特異的破壊(targeted disruption)を含む胚性幹細胞系統から採取したマウス株に導入する。そのトランスジェニックマウスは、ヒト抗原に特異的なヒト抗体を合成することができ、そのマウスを使用して、ヒト抗体分泌性ハイブリドーマを生産することができ、そこから、本発明の方法を実施するために有用なポリヌクレオチドを得ることができる。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得るための方法は、当分野において公知である。
前記ポリヌクレオチドは、抗体の抗原結合フラグメントをコードするものである場合もある。例えば、Fv、Fab、Fab’、FcおよびF(ab’)2フラグメントを含む、抗原結合抗体フラグメントは、当分野において周知であり、当初、抗体のタンパク質加水分解によって同定された。例えば、抗体フラグメントは、従来の方法による全抗体のペプシンまたはパパイン消化によって得ることができる。ペプシンでの抗体の酵素的開裂によって生成された抗体フラグメントは、F(ab’)2を示す5Sフラグメントを生じさせる。このフラグメントは、チオール還元剤を使用して、および場合によってはスルフヒドリル基のためのブロッキング基を使用して(ジスルフィド結合を開裂させる結果となる)さらに開裂させて、3.5S Fab’一価フラグメントを生成することができる。あるいは、ぺプチンを使用する酵素的開裂により、直接、2つの一価Fab’フラグメントと1つのFcフラグメントが生成される(例えば、Goldenberg、米国特許第4,036,945号および米国特許第4,331,647号を参照のこと。前記特許のそれぞれは参照により取り入れられている)。
抗体フラグメントのもう1つの形態は、単一相補性決定領域(CDR)をコードするペプチドである。CDRペプチドは、対象となる抗体のCDRをコードするポリヌクレオチドを構築することにより、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて抗体生産細胞のRNAから可変領域を合成することにより、得ることができる(例えば、Larrick et al.,Methods:A Companion to Methods in Enzymology 2:106,1991を参照のこと。これは、本明細書に参照として取り入れられている)。そのような抗体フラグメント(そのようなフラグメントのサブユニットを含む)と例えば重鎖可変領域および軽鎖可変領域を連結させるペプチドリンカーとをコードするポリヌクレオチドは、化学合成法によって、または上で説明したようにして得ることができる完全長重鎖および軽鎖をコードするポリヌクレオチドではじめる常用の組換えDNA法(ファージディスプレイを含む)を用いて、作製することができる。1つの態様において、本発明の抗体は、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、または配列番号28に記載のHCDR3アミノ酸配列を含む。
1つの実施形態において、多量体タンパク質は、免疫グロブリン重鎖の一部および免疫グロブリン軽鎖の一部からなるFabフラグメントである。前記免疫グロブリン重鎖および軽鎖は、互いに会合し、ならびに予め選択されたまたは予め決められた抗原に特異的な抗原結合部位を有する配座を呈する。Fabフラグメント上の抗原結合部位は、免疫グロブリン分子上の抗原結合部位に類似した結合親和性またはアビディティーを有する。
本発明の実施に有用な遺伝子としては、免疫グロブリン生成物、免疫グロブリン分子、FabフラグメントおよびFvフラグメントに含まれているポリペプチドをコードする遺伝子が挙げられる。これらは、免疫グロブリン重鎖および軽鎖可変領域をコードする遺伝子を含む。一般に、予め選択された抗原に結合することができる免疫グロブリンの免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードする遺伝子を使用する。
これらの遺伝子は、活性が求められる抗原性リガンド(抗原)すなわち予め選択された抗原により免疫された哺乳動物(1つの態様ではヒト)から得た細胞から単離する。免疫処置は、従来どおり行うことができ、ならびに非ヒト動物における抗体力価をモニターして、所望の親和性またはアビディティーに対応する所望の免疫処置段階を決定することができる。軽度免疫非ヒト動物は、1回の免疫処置しか受けず、応答検出直後にそこから細胞を回収する。完全免疫非ヒト動物はピーク力価を提示し、これは、宿主非ヒト動物への抗原の注射を、1回以上、通常は2または3週間間隔で、繰り返すことで達成される。
VHおよびVLポリペプチドをコードする遺伝子は、IgA、IgD、IgE、IgGまたはIgMを生産する細胞から採取することができる。免疫グロブリン可変領域遺伝子をクローニングすることができるゲノムDNAのフラグメントの作製方法は、当分野において周知である。
本明細書において用いる場合、用語「特異的に会合する」または「特異的に相互作用する」または「特異的に結合する」は、生理条件下で比較的安定である複合体を形成する2つ以上のポリペプチドを指す。これらの用語は、本明細書では、例えば、機能性タンパク質複合体を形成するための第一ポリペプチドサブユニットと第二ポリペプチドサブユニットの相互作用をはじめとする様々な相互作用、ならびに抗体とその抗原の相互作用に関して用いている。特異的相互作用は、少なくとも約1×10−6M、一般には少なくとも約1×10−7M、通常は少なくとも約1×10−8M、および特に、少なくとも約1×10−9M、または約1×10−10M以上の解離定数によって特徴付けることができる。特異的相互作用は、一般に、例えば、生きている被験者(脊椎動物であってもよいし、または非脊椎動物であってもよい)の細胞または細胞内コンパートメントにおいて発生する条件ならびに細胞培養の際に発生する条件、例えば生物の細胞または組織を維持するために用いられる条件、をはじめとする生理条件下で安定である。2つの分子が特異的に相互作用するかどうかを判定する方法は周知であり、それらとしては、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴、ゲルシフト分析などが挙げられる。
1つの態様では、インビボで惹起される抗体を発展させて、インビトロでの抗体親和性を強化することができる。例えば、オーバーラッピングPCRおよびNNKドーピング戦略を用いてサチュレーション変異誘発により抗体重鎖および軽鎖の個々のまたは多数のCDR領域を逐次的にランダム化するCDRウォーキングを用いてもよい。このようにして作ったFab抗体配列変異体のライブラリを、ファージ表面に提示させ、最高親和性Fabクローンを確実に回収するためにストリンジェントな競合パンニング環境を用いて対象となる抗原(例えば、HMPVのFタンパク質)に関して再び選択する。その後、当分野において公知のアプローチ(例えば、平衡ディスプレイ、表面プラズモン共鳴、ゲルシフト分析などを含むが、これらに限定されない)によってその親和性を判定することができる。この方法を用いて、Kd値を10倍、100倍または1000倍強化することができる。
1つの実施形態では、HMPV−Fタンパク質に対して産生させた抗体のパネルを用いて、様々な形態のFタンパク質抗原に対する抗体の中和特性を判定する。理論に拘束されないが、概念上、Fタンパク質は、多数の抗原および免疫原形態で発生し得る。未成熟および成熟形態のFタンパク質のそれぞれが、自然感染中に宿主免疫系にもたらされる可能性は高く、異なる抗体プロフィールを惹起し得ること、オーバーラップする交差反応性の幾分かがそれらの様々な形態のうちの1つより多くに共通する抗原決定基に由来する可能性が高いことは、非現実的なことではない。
関連態様では、バキュロウイルス系を含む(しかし、これに限定されない)様々な系において発現させることができるHMPV−Fタンパク質の組換え融合体に関するスクリーニングによって回収された中和抗体をはじめとするHMPV特異的抗体のパネルの抗原結合部分を調査した。さらなる関連態様では、ファージ抗体ライブラリをはじめとする(しかし、これに限定されない)様々な源から得られた他の非中和Fabが、前記パネルを構成し得る。前記非中和抗体を、適切な宿主細胞(例えば、CHO細胞)において発現された精製組換えHMPV−Fタンパク質に関して選択することができる。1つの態様において、前記抗体は、インビトロで中和活性を示す。
例えば、上の選択アッセイ行った後、HRSVに対する抗体(すなわち、RSV19)を使用する競合試験は、非中和抗体が、RSV19抗体によって認識されるもの以外のエピトープに結合することを示した。より顕著なこととして、前記中和抗体は、前記非中和抗体より、組換えHRSV−Fタンパク質に約1000倍よく結合した(Kd=6nM)。しかし、ウイルス粒子上のスパイクへと組み立てられたFタンパク質に対する抗体の結合に先行しなければならないメカニズムを介してRSRV19がインビトロでウイルスを中和した効率(4nMで50%プラーク減)は、成熟状態のFタンパク質についての全結合定数が、組換えタンパク質についてのものより3桁高いことを暗示している。実際、RSV19は、非中和抗体パネルよりはるかに効率的に、HRSV感染細胞表面に結合した(この場合、前記タンパク質は、出芽ウイルス粒子のエンベロープにいつでも組み込める状態の成熟したオリゴマー構造に配列される可能性が高い)。重ねて、理論に拘束されないが、これらのデータは、この特定の中和抗体は、未成熟形態より成熟形態のFタンパク質に良好に結合するが、非中和抗体では反対の結合パターンが観察されるという仮説を支持している。
1つの実施形態において、本発明のHMPV−F−特異的Fabは、VHおよびVL遺伝子セグメントの様々な使用量を表す。1つの態様において、抗体可変抗体遺伝子セグメントは、ランダムに選択された成熟B細胞のレパートリーの中で共通していないセグメントである。例えば、1つ以上の中和クローンには異なる軽鎖が利用されるが、ほぼ同一の重鎖が利用される。理論に拘束されないが、これは、そのようなクローンの場合、重鎖がFΔTM結合についての主決定子を媒介することを示唆している。もう1つの態様において、最大インビトロ中和活性には、ヌクレオチドおよびアミノ酸レベルで異なるVHおよびJHセグメントが利用される(この場合、そのようなFabは、異なるドナーから採取したものであり得る)。関連態様において、HCDR3ループは、重要な決定子抗原結合部位である。
本発明の方法の実施に有用なポリヌクレオチドは、対象となる抗体を生産する細胞、例えば、免疫された被験者もしくは特定の抗原に暴露された個体からのB細胞から単離することができ、周知のポリヌクレオチド合成法を用いて新たに合成することができ、組換え生産することができ、または例えば、可変重鎖および可変軽鎖をコードするポリヌクレオチドのコンビナトリアルライブラリをスクリーニングすることによって、得ることができる。例えばキメラ、ヒト化、CDR移植、一本鎖および二機能性抗体をコードするポリヌクレオチドのこれらおよび他の作製方法は、当業者に公知である。
当業者に公知の技法(例えば、米国特許第6,818,216号を参照のこと。前記特許は、本明細書に参照によって取り入れられている)を用いて、本発明の抗体またはそれらのフラグメントを、HMPV複製を阻害するまたはダウンレギュレートするそれらの能力について、アッセイすることもできる。例えば、HMPV複製は、プラークアッセイによってアッセイすることができる。本発明の抗体またはそれらのフラグメントを、HMPVポリペプチドの発現を阻害するまたはダウンレギュレートするそれらの能力について、アッセイすることもできる。ELISA、ウエスタンブロット分析、ノーザンブロット分析およびRT−PCRをはじめとする(しかし、これらに限定されない)当業者に公知の技法を用いて、HMPVポリペプチドの発現を直接または間接的に測定することもできる。さらに、本発明の抗体またはそれらのフラグメントを、抱合体の形成を防止するそれらの能力についてアッセイすることができる。
本発明の抗体またはそれらのフラグメントは、ヒトにおいて使用する前に、インビトロで試験し、その後、所望の治療または予防活性についてインビボで試験する。例えば、本発明の特異的抗体または組成物の投与を指示するかどうか決定するために用いることができるインビトロアッセイとしては、被験者組織サンプルを培養で増殖させ、本発明の抗体または組成物に暴露するか、本発明の抗体または組成物を別様に投与し、その組織サンプルに対する本発明のそのような抗体または組成物の効果を観察する、インビトロ細胞培養アッセイが挙げられる。様々な実施形態において、HMPV感染に関与する細胞タイプの代表的な細胞(例えば、LLC−MK2細胞)を用いてインビトロアッセイを行って、本発明の抗体または組成物が、HMPVに対して所望の効果を有するかどうかを判定することができる。1つの態様では、ヒトに投与する前に、本発明の抗体または組成物をインビトロアッセイおよび動物モデル系においても試験する。具体的な実施形態では、コットンラットに本発明の抗体もしくはそのフラグメント、または本発明の組成物を投与し、105pfuのHMPVでチャレンジし、4日以上後にそれらのラットを犠牲にし、HMPV力価および抗HMPV抗体血清力価を判定する。さらに、この実施形態に従って、それらの犠牲にしたラットからの組織(例えば、肺組織)を組織変化について検査することができる。
本発明によると、本発明の抗体またはそれらのフラグメントの予防的および/または治療的有効度を立証するために、ヒト被験者での臨床試験を行う必要がない。抗体またはそれらのフラグメントを使用するインビトロおよび動物モデル研究をヒトにあてはめることができ、それらは、前記抗体またはそれらのフラグメントの予防的および/または治療的有用性を立証するために十分である。
治療に使用するための本発明の抗体または組成物は、ラット、マウス、ウシ、サルおよびウサギをはじめとする(しかし、これらに限定されない)好適な動物モデル系において、それらの毒性について試験することができる。抗体または組成物の毒性のインビボ試験には、当分野において公知の任意の動物モデル系を使用することができる。
ウイルス感染の治療または予防の有効度は、ウイルスの複製を阻害する、伝染を抑制するまたはウイルスのその宿主における樹立を予防する、HMPV感染の発生率を低下させる、またはHMPV感染に随伴する1つ以上の症状を予防、改善もしくは軽減する本発明の抗体または組成物の能力を検出することによって、立証することができる。前記治療は、例えば、本発明の抗体または組成物の投与後にウイルス量の減少、1つ以上の症状の改善、HMPV感染期間の減少、または死亡率および/もしくは罹患率の減少があった場合、治療とみなす。さらに前記治療は、1つ以上のHMPV抗原に免疫特異的に結合する1つ以上の抗体またはそれらのフラグメントの投与後に免疫応答の増加があった場合、治療とみなす。
本発明の抗体についての好適な標識を以下に提供する。好適な酵素標識の例としては、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌のヌクレアーゼ、デルタ−5−ステロイドイソメラーゼ、酵母−アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ−グリセロールリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。
好適な放射性同位元素標識の例としては、3H、111In、125I、131I、32P、35S、14C、51Cr、57To、58Co、59Fe、75Se、152Eu、90Y、67Cu、217Ci、211At、212Pb、47SC、109Pdなどが挙げられる。
好適な非放射性同位元素標識の例としては、157Gd、55Mn、162Dy、52Trおよび56Feが挙げられる。
好適な蛍光標識の例としては、152Eu標識、フルオロセイン標識、イソチオシアネート標識、ローダミン標識、フィコエリスリン標識、フィコシアニン標識、アロフィコシアニン標識、o−フタルデヒド標識、およびフロレスカミン標識が挙げられる。
好適な毒素標識の例としては、ジフテリア毒素、リシンおよびコレラ毒素が挙げられる。
化学発光標識の例としては、ルミナール標識、イソルミナール標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム塩標識、シュウ酸エステル標識、 ルシフェリン標識、ルシフェラーゼ標識、エクオリン標識が挙げられる。
核磁気共鳴造影剤の例としては、重金属核、例えば、Gd、Mnおよび鉄が挙げられる。
上に記載した標識を抗体に連結させるための代表的な技法としては、当分野において公知である、グルタルアルデヒド、過ヨウ素酸塩、ジマレイミド、m−マレイミドベンジル−N−ヒドロキシ−スクシンイミドエステルの使用が挙げられる。
1つの実施形態において、メタニューモウイルス(HMPV)感染を診断する方法を開示し、この方法は、被験者からのサンプルと、HMPV融合糖タンパク質(Fタンパク質)に特異的に結合するヒト抗体とを、抗体/Fタンパク質複合体の形成を可能にする条件下で接触させるステップと、そのサンプルと、その抗体/Fタンパク質複合体と相互作用する試薬とを接触させるステップと、その試薬とその抗体の相互作用を検出するステップとを含み、この場合、その試薬−抗体相互作用が、被験者におけるMHPV感染の存在を示す。1つの態様において、抗体/Fタンパク質複合体形成は、抗体−抗原相互作用を指す。もう1つの態様において、試薬相互作用は、HMPV Fタンパク質に特異的に結合するヒト抗体を認識する抗体の結合を含むが、これに限定されない。試薬相互作用は、抗体に共有結合または非共有結合している部分を認識するリガンドをさらに含む。例えば、抗体をビオチン部分で標識することができ、その後、その試薬は、ストレプトアビジンを含むこととなろう。この目的に有用な他のリガンドは、当分野において公知であり、上で略述したような標識を含む。
もう1つの実施形態において、1つ以上のHMPV融合糖タンパク質(Fタンパク質)に特異的に結合する1つ以上のヒト抗体と生体サンプルを、1つ以上の抗体と1つ以上のHMPV−Fタンパク質との複合体の形成を可能にする条件下で接触させるための装置と、複合体を形成していない抗体を除去する1つ以上の試薬と、抗体を認識する1つ以上の試薬と、抗体および試薬の使用に関する手順を提供する指示書と、1つ以上の抗体、試薬および指示書を収容する容器とを含むキットを開示する。1つの態様において、装置としては、ウィック、スワブ、多孔質媒体(例えば、ビーズ、ゲル)、毛管、注射器、ピペットなどが挙げられるが、これらに限定されない。関連態様において、前記装置は、固定相を備えることがあり、これは、サンプルが、そのような装置によって濾過される移動相としての役割を果たす。
1つの態様において、診断キットの種々の構成要素は、用いられる実際の診断方法に依存するであろう。
診断キットの上に挙げた可能な構成要素に加えて、このキットは、陽性参照サンプル、陰性参照サンプル、希釈液、洗浄溶液およびバッファを、適宜、含むことができる。
1つの態様において、診断は、免疫診断法、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、放射免疫アッセイ(RIA)または免疫蛍光アッセイ(IFA)を含むことができる。
ELISAの場合、標識としてポリペプチドに連結させる、一般に使用される酵素としては、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなどが挙げられる。これらの酵素のそれぞれを、それぞれ、発色剤または試薬(基質)、例えば過酸化水素およびo−フェニレンジアミン;ならびにp−ニトロフェニルホスフェートと共に使用する。あるいは、ポリペプチドに連結されたビオチンは、ホースラディッシュペルオキシダーゼなどのシグナル手段にそれ自体が連結しているアビジンと併用で、免疫反応体の存在を示すラベルとして使用することができる。
1つの態様において、Fタンパク質は、生体液および組織中に存在するときに本発明の方法によって検出することができる。検出可能な量のそのような抗原を含有する任意の検体を使用することができる。サンプルは、尿、唾液、脳脊髄液、血液、血清などの液体である場合もあり、または組織、糞便などの固体もしくは半固体である場合もあり、あるいは組織診断において一般に用いられるものなどの固体組織である場合もある。1つの態様において、前記サンプルは、血清を含む血液である。関連態様において、前記検体は、ヒト血液または血清サンプルである。
前記抗体および抗原の具体的な濃度、インキュベーション温度および時間、ならびに他のアッセイ条件は、サンプル中の抗原の濃度、サンプルの性質などのような因子に依存して変えることができる。当業者は、常用の実験を用いることによってそれぞれの判定のための効果のある最適なアッセイ条件を決定することができるであろう。一般に、反応条件の所定のセットについての期間は、そのアッセイを行う前に、周知の方法によって予め決定しておく。
生物学的アッセイ条件下、その持続期間は、通常、数分から数時間、例えば、30分から2時間から一晩であるが、これらの期間は様々である。もちろん、特定の状況のために所望されるまたは必要な場合があるような、抗原の洗浄、攪拌、振盪、濾過またはアッセイ前抽出などのような他の段階を、そのアッセイに加えてもよい。その後、形成された複合体を、本明細書に記載する手段によって検出することができる。
上で述べた診断方法のすべては、当分野において周知であり、当業者は、用いる診断方法に関連して診断キットの有用な構成要素を容易に選択できる。
本発明の組成物は、生きている被験者、例えば脊椎動物または他の哺乳動物(飼育された動物もしくはペットである場合もあり、またはヒトであってもよい)への投与に適する形態であるように調合することができる。例えば、適する形態は、コードされた抗体、またはその抗原結合部位を含む組成物であり得、この組成物は、HMPVに暴露された固体などの被験者の受動免疫に有用であり得る。したがって、本発明は、HMPVによって引き起こされたまたは悪化された呼吸器感染などの病的状態の改善に有用な薬物を提供する。
1つの実施形態では、HMPVに対する予防接種をしたときに遭遇する自然免疫応答の予測のつかない変化に依存するのではなく、受動免疫によって一定の防御濃度で抗ウイルス抗体を被験者に送達することができる。関連態様では、特異性の異なる小数の異なる抗体の単回投与によって、幾つかのウイルス呼吸器病原体による感染から被験者を守る。
1つの実施形態において、ヒトメタニューモウイルス(HMPV)融合糖タンパク質(Fタンパク質)に特異的に結合する1つ以上のヒト抗体を含むワクチンを開示する。
1つの態様において、前記ワクチンは、アジュバントをさらに含むことがある。そのようなアジュバントは、もちろん、ペットの病気治療のまたは人間用の医薬品に責任を負う管轄官庁によってワクチンでの使用が認可されているアジュバントでなければならない。
個々の抗体または抗体を含有するワクチン製剤を、診断または治療用の組成物に組み込むことができる。その形態は、指定された投与方式および診断または治療用途に依存する。前記組成物は、所望される調合に依存して、医薬的に許容される非毒性担体または希釈剤(動物またはヒトに投与するための医薬組成物を調合するために一般に使用されるビヒクルとして定義される)も含むことがある。前記希釈液は、その併用物の生物活性に影響を及ぼさないように選択される。そのような希釈液の例は、蒸留水、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、ブドウ糖溶液、およびハンクス溶液である。加えて、前記医薬組成物または調合物は、他の担体、アジュバントまたは非毒性、非治療用、非免疫原性安定剤なども含むことがある。Remington’s Pharmaceutical Science(15th ed.,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,1980)を参照のこと。インビボでの使用を目的とする組成物は、通常、無菌である。非経口投与用の組成物は、無菌であり、実質的に等張性であり、ならびにGMP条件下で作られる。
前記調合物は、前記抗体での治療が必要な哺乳動物(ヒトを含む)に、公知の方法に従って、例えば、ボーラスとしての静脈内投与、または一定期間にわたる持続点滴により、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液包内、くも膜下、経口、局所もしくは吸入経路により、投与される。1つの実施形態において、前記調合物は、静脈内投与によって前記哺乳動物に投与される。このような目的のために、前記調合物は、例えば、注射器を使用してまたは静脈ラインによって注射することができる。
前記抗体の適切な用量(「治療有効量」)は、例えば、治療すべき状態、その状態の重症度および経過、その抗体を予防目的で投与するのか、または治療目的で投与するのか、前治療、その患者の臨床履歴、およびその抗体への応答、使用する抗体のタイプ、ならびに担当医の判断に依存するであろう。前記抗体は、1回でまたは一連の治療にわたって患者に適切に投与し、診断以降、いつまで投与してもよい。前記抗体は、単独治療薬として投与してもよいし、または問題の状態の治療に有用な他の薬物もしくは療法と共に施与してもよい。
一般的な提案として、投与する抗体の治療有効量は、1回の投与によろうと、それより多くの投与によろうと、約0.1から約50mg/(患者の体重1kg)の範囲であるし、使用する抗体の典型的な範囲は、例えば、1日1回の投与で、約0.3から約20mg/kg、および/または約0.3から約15mg/kgであろう。しかし、他の薬剤投与計画が有用である場合もある。この療法の進行は、従来の技術によって容易にモニターすることができる。
以下の実施例は、本発明の範囲を説明するためのものであり、限定するためのものではない。
材料および方法
<哺乳動物細胞におけるHMPV−F細胞外ドメイン発現>
RT−PCRを用いて、推奨命名法(van den Hoogen et al.,Nat Med(2001)7:719−724)によるとTN/92−4、原型ジェノグループA2株、と称する病原性臨床分離株から完全長F配列を増幅した。その完全TN/92−4F配列は、商品供給業者(Aptgen)によって、哺乳動物tRNAの偏りのための最適でないコドン使用量を変え、二次mRNA構造を改善し、ATリッチ領域を除去してmRNA安定性を増大させるように最適化された配列であった。次に、膜貫通(TM)ドメインのないHMPV−F細胞外ドメイン構築物をコードする発現ベクター(pcDNA3.1−FΔTM)を作製した。そのF遺伝子の最適化完全長cDNAを、プライマー5’−GGAGGTACCATGAGCTGGAAG−3’および5’−GAAGCGGCCGCTGCCCTTCTC−3’でPCR増幅し、PCR産物を消化し、ベクターpcDNA3.1/myc−HisB(Invitrogen)のKpnI/NotI部位(前記プライマー配列において下線を引いた位置に限定)にライゲートした。そのpcDNA3.1−FΔTM組換えプラスミドを293−F細胞懸濁液(Freestyle 293 Expression System、Invitrogen)にトランスフェクトした。トランスフェクション後96時間の時点で、細胞を5分間、100xgで室温で遠心分離し、上清を回収した。上清を0.2μmフィルターによって濾過した後、精製した。
<哺乳動物細胞におけるHMPV−F細胞外ドメイン発現>
RT−PCRを用いて、推奨命名法(van den Hoogen et al.,Nat Med(2001)7:719−724)によるとTN/92−4、原型ジェノグループA2株、と称する病原性臨床分離株から完全長F配列を増幅した。その完全TN/92−4F配列は、商品供給業者(Aptgen)によって、哺乳動物tRNAの偏りのための最適でないコドン使用量を変え、二次mRNA構造を改善し、ATリッチ領域を除去してmRNA安定性を増大させるように最適化された配列であった。次に、膜貫通(TM)ドメインのないHMPV−F細胞外ドメイン構築物をコードする発現ベクター(pcDNA3.1−FΔTM)を作製した。そのF遺伝子の最適化完全長cDNAを、プライマー5’−GGAGGTACCATGAGCTGGAAG−3’および5’−GAAGCGGCCGCTGCCCTTCTC−3’でPCR増幅し、PCR産物を消化し、ベクターpcDNA3.1/myc−HisB(Invitrogen)のKpnI/NotI部位(前記プライマー配列において下線を引いた位置に限定)にライゲートした。そのpcDNA3.1−FΔTM組換えプラスミドを293−F細胞懸濁液(Freestyle 293 Expression System、Invitrogen)にトランスフェクトした。トランスフェクション後96時間の時点で、細胞を5分間、100xgで室温で遠心分離し、上清を回収した。上清を0.2μmフィルターによって濾過した後、精製した。
<6xHis標識F細胞外ドメインの精製>
UNICORN 4.12ソフトウェア(GE Healthcare)によって制御されたAKTA FPLCシステムを用いて、タンパク質精製を行った。充填済HisTrap Ni−Sepharoseカラム(GE Healthcare)を使用して、金属イオン固定化クロマトグラフィーにより、His標識F細胞外ドメインFΔTMを精製した。精製前に、濃縮結合バッファーストックでサンプルを希釈して、pH、塩およびイミダゾール濃度を調整した。タンパク質は、5.9mL/分の負荷流量で5mLのHisTrapカラムに負荷し、結合バッファは、20mMのリン酸ナトリウム、0.5MのNaCl、30mMのイミダゾール(pH7.4)を含有した。溶出段階1において4カラム量の8%溶出バッファを使用して無関係なタンパク質を溶出し、溶出段階2において4カラム量の25%溶出バッファで6xHis標識Fタンパク質を溶出した。この溶出バッファは、20mMのリン酸ナトリウム、0.5MのNaCl、500mMのイミダゾール(pH7.4)を含有した。精製されたタンパク質を濃縮し、30,000および100,000分子量カットオフを有するAmicon Ultra遠心濾過機(MWCO、Millipore)によりPBS(Invitrogen)に対して透析した。
UNICORN 4.12ソフトウェア(GE Healthcare)によって制御されたAKTA FPLCシステムを用いて、タンパク質精製を行った。充填済HisTrap Ni−Sepharoseカラム(GE Healthcare)を使用して、金属イオン固定化クロマトグラフィーにより、His標識F細胞外ドメインFΔTMを精製した。精製前に、濃縮結合バッファーストックでサンプルを希釈して、pH、塩およびイミダゾール濃度を調整した。タンパク質は、5.9mL/分の負荷流量で5mLのHisTrapカラムに負荷し、結合バッファは、20mMのリン酸ナトリウム、0.5MのNaCl、30mMのイミダゾール(pH7.4)を含有した。溶出段階1において4カラム量の8%溶出バッファを使用して無関係なタンパク質を溶出し、溶出段階2において4カラム量の25%溶出バッファで6xHis標識Fタンパク質を溶出した。この溶出バッファは、20mMのリン酸ナトリウム、0.5MのNaCl、500mMのイミダゾール(pH7.4)を含有した。精製されたタンパク質を濃縮し、30,000および100,000分子量カットオフを有するAmicon Ultra遠心濾過機(MWCO、Millipore)によりPBS(Invitrogen)に対して透析した。
<抗体ファージディスプレイライブラリの構築および選択>
抗体Fab免疫グロブリンG1(IgG1)(KおよびまたはX鎖)ファージディスプレイライブラリを、記載されているとおり(Barbas et al.,Proc Natl Acad Sci USA(1992)89:10164−10168,Williamson et al.,Proc Natl Acad Sci USA(1993)90:4141−4145)、12のドナーの骨髄組織からクローニングした。ライブラリのサイズは、構成員数3×103から5×107の範囲であった。記載されているようなバイオパンニング手順(Barbas et al.(1992))を用いて、酵素結合イムノソルベントアッセイ(ELISA)ウェルに結合した組換えHMPVFタンパク質に関して、ライブラリを個々に選択した。パンニングの第4または第5ラウンドから回収した選択されたファージを可溶性Fab発現系に転換し(Barbas et al.(1992))、クローンを、組換えHMPVFタンパク質選択抗原との反応性について、個々に試験した。選択されたHMPVFタンパク質反応性Fabクローンを免疫アフィニティークロマトグラフィー(Williamson et al.(1993))によって精製した。HMPV反応性抗体Fabクローンの軽鎖および重鎖可変領域配列を、記載されているように決定した(Williamson et al.(1993))。Junction Analysisプログラムを使用し、最近まとめられた(Giudicelli et al.,Nucleic Acid Res(2006)34:D781−784,Ruiz et al.,Nucleic Acids Res(2000)28:219−221)最新のヒトIg遺伝子名により結果を報告する、インターナショナルImMunoGeneTicsデータベース(フランス、モンペリエのCentre Informatique National de L’Enseignment Superieurがホストである)で、VHまたはVL領域の配列を分析した。手作業での点検により、すべてのVHおよびVL割当てを再調査し、確認した。連結領域での突然変異を手作業で確認し、残りの領域での突然変異を手作業で採点し、表にした。
抗体Fab免疫グロブリンG1(IgG1)(KおよびまたはX鎖)ファージディスプレイライブラリを、記載されているとおり(Barbas et al.,Proc Natl Acad Sci USA(1992)89:10164−10168,Williamson et al.,Proc Natl Acad Sci USA(1993)90:4141−4145)、12のドナーの骨髄組織からクローニングした。ライブラリのサイズは、構成員数3×103から5×107の範囲であった。記載されているようなバイオパンニング手順(Barbas et al.(1992))を用いて、酵素結合イムノソルベントアッセイ(ELISA)ウェルに結合した組換えHMPVFタンパク質に関して、ライブラリを個々に選択した。パンニングの第4または第5ラウンドから回収した選択されたファージを可溶性Fab発現系に転換し(Barbas et al.(1992))、クローンを、組換えHMPVFタンパク質選択抗原との反応性について、個々に試験した。選択されたHMPVFタンパク質反応性Fabクローンを免疫アフィニティークロマトグラフィー(Williamson et al.(1993))によって精製した。HMPV反応性抗体Fabクローンの軽鎖および重鎖可変領域配列を、記載されているように決定した(Williamson et al.(1993))。Junction Analysisプログラムを使用し、最近まとめられた(Giudicelli et al.,Nucleic Acid Res(2006)34:D781−784,Ruiz et al.,Nucleic Acids Res(2000)28:219−221)最新のヒトIg遺伝子名により結果を報告する、インターナショナルImMunoGeneTicsデータベース(フランス、モンペリエのCentre Informatique National de L’Enseignment Superieurがホストである)で、VHまたはVL領域の配列を分析した。手作業での点検により、すべてのVHおよびVL割当てを再調査し、確認した。連結領域での突然変異を手作業で確認し、残りの領域での突然変異を手作業で採点し、表にした。
<免疫蛍光アッセイ>
LLC−MK2細胞培養単層を1のMOIのHMPVで感染させた。感染後34時間の時点で、細胞を10%緩衝ホルマリンで固定し、PBS−Tで洗浄し、その後、PBS−T/ミルク中のFabまたは抗HMPV血清(1:500希釈)のいずれかと共に1時間、37℃でインキュベートした。PBS−Tでの洗浄後、PBS−T/ミルク中で1:1000希釈したAlexaFluor586コンジュゲート型ヤギ抗モルモットIgまたはAlexaFluor586コンジュゲート型マウス抗Fab抗体(Molecular Probe)で、1時間、37℃で細胞を染色した。Nikon Diaphot倒立顕微鏡で細胞単層を検査し、Nikon D100デジタルカメラで画像を獲得した。画像をデジタル調整および再加工せずに、Adobe PhotoshopおよびIllusratorを使用して画像をトリミングし、図を作成した。
LLC−MK2細胞培養単層を1のMOIのHMPVで感染させた。感染後34時間の時点で、細胞を10%緩衝ホルマリンで固定し、PBS−Tで洗浄し、その後、PBS−T/ミルク中のFabまたは抗HMPV血清(1:500希釈)のいずれかと共に1時間、37℃でインキュベートした。PBS−Tでの洗浄後、PBS−T/ミルク中で1:1000希釈したAlexaFluor586コンジュゲート型ヤギ抗モルモットIgまたはAlexaFluor586コンジュゲート型マウス抗Fab抗体(Molecular Probe)で、1時間、37℃で細胞を染色した。Nikon Diaphot倒立顕微鏡で細胞単層を検査し、Nikon D100デジタルカメラで画像を獲得した。画像をデジタル調整および再加工せずに、Adobe PhotoshopおよびIllusratorを使用して画像をトリミングし、図を作成した。
<インビトロ中和アッセイ>
以下の修正を施した、記載されている(Williams et al.,J Virol(2005)79:10944−10951)ようなプラーク減少アッセイによって、HMPV中和力価を決定した。未希釈で開始する4倍系列希釈でのFab懸濁液を、24ウェルプレートにおいて1ウェルにつき50のプラークを生じるように希釈したHMPVの作業用ストックと共にインキュベートした。そのFabとウイルスの混合物を1時間、37℃で回転させながらインキュベートした。その後、Fab/ウイルス混合物を24ウェル培養プレート内のLLC−MK2単層の上に三重反復でプレーティングし、室温で1時間、吸着させた。その後、トリプシンを補足したOptiMEM中の0.755 メチルセルロースをかぶせ、CO2インキュベーターにおいて37℃で4日間、インキュベートした。単層をすすぎ、ホルマリン固定し、記載されている(Williams et al.(2005))ようにモルモット抗HMPV血清およびペルオキシダーゼ標識ヤギ抗モルモットIgで染色した。プラークをカウントし、60%プラーク減少力価を計算した。HMPV陽性ヒト血清を陽性対照として使用した。
以下の修正を施した、記載されている(Williams et al.,J Virol(2005)79:10944−10951)ようなプラーク減少アッセイによって、HMPV中和力価を決定した。未希釈で開始する4倍系列希釈でのFab懸濁液を、24ウェルプレートにおいて1ウェルにつき50のプラークを生じるように希釈したHMPVの作業用ストックと共にインキュベートした。そのFabとウイルスの混合物を1時間、37℃で回転させながらインキュベートした。その後、Fab/ウイルス混合物を24ウェル培養プレート内のLLC−MK2単層の上に三重反復でプレーティングし、室温で1時間、吸着させた。その後、トリプシンを補足したOptiMEM中の0.755 メチルセルロースをかぶせ、CO2インキュベーターにおいて37℃で4日間、インキュベートした。単層をすすぎ、ホルマリン固定し、記載されている(Williams et al.(2005))ようにモルモット抗HMPV血清およびペルオキシダーゼ標識ヤギ抗モルモットIgで染色した。プラークをカウントし、60%プラーク減少力価を計算した。HMPV陽性ヒト血清を陽性対照として使用した。
<表面プラズモン共鳴>
BIAcore2000での表面プラズモン共鳴を用いて、HMPV−F特異的MabとHMPV−Fタンパク質の相互作用を遂行した。精製された組換えHMPV FまたはRSVFタンパク質を10mM酢酸ナトリウム(pH4.5)中、30μg/mLに希釈し、ターゲットRU密度が1200のCM5センサーチップ(BIAcore Life Sciences)のデキストランマトリックスに結合しているアミンによって45℃μL/mLで共有結合的に固定化した。未反応活性エステル基を1Mのエタノールアミンでブロックした。リファレンスとして用いるために、タンパク質を含有しないブランク表面を、全く同じ固定化条件下で作製した。HBS/Tween−20バッファ(BIAcore Life Sciences)中5から500nMの範囲にわたる様々な濃度の精製HMPV−F抗体およびRSV特異的MAb(パリビツマブ)を、固定化HMPVFタンパク質上、RSVFタンパク質上、リファレンス細胞表面に注入した。180秒間、30μL/分の流量で抗体結合を測定し、さらに360秒間、解離をモニターした。100μL/分で30秒間、50mMのHClをパルシングすることによって、残留結合抗体をセンサーチップから除去した。BIAevaluationソフトウェアを使用して、結合曲線を全体にわたって1:1ラングミュア結合モデルに合うようにアラインすることにより、Ka、KdおよびKDを決定した。
BIAcore2000での表面プラズモン共鳴を用いて、HMPV−F特異的MabとHMPV−Fタンパク質の相互作用を遂行した。精製された組換えHMPV FまたはRSVFタンパク質を10mM酢酸ナトリウム(pH4.5)中、30μg/mLに希釈し、ターゲットRU密度が1200のCM5センサーチップ(BIAcore Life Sciences)のデキストランマトリックスに結合しているアミンによって45℃μL/mLで共有結合的に固定化した。未反応活性エステル基を1Mのエタノールアミンでブロックした。リファレンスとして用いるために、タンパク質を含有しないブランク表面を、全く同じ固定化条件下で作製した。HBS/Tween−20バッファ(BIAcore Life Sciences)中5から500nMの範囲にわたる様々な濃度の精製HMPV−F抗体およびRSV特異的MAb(パリビツマブ)を、固定化HMPVFタンパク質上、RSVFタンパク質上、リファレンス細胞表面に注入した。180秒間、30μL/分の流量で抗体結合を測定し、さらに360秒間、解離をモニターした。100μL/分で30秒間、50mMのHClをパルシングすることによって、残留結合抗体をセンサーチップから除去した。BIAevaluationソフトウェアを使用して、結合曲線を全体にわたって1:1ラングミュア結合モデルに合うようにアラインすることにより、Ka、KdおよびKDを決定した。
<インビボ感染およびFab治療>
商業ブリーダー(インディアナ州、インディアナポリスのHarlan)から週齢5〜6週のコットンラットを購入し、基準食および水を自由に与え、マイクロアイソレーターケージで飼育した。ウイルスまたはFab接種前にイソフランによって動物に麻酔した。使用したウイルス株は、推奨命名法(van den Hoogen et al.,(2004))によるとhMPV株TN/94−49、ジェノグループA2ウイルス、と称する、病原性臨床分離株であった。このウイルス株は、LLC−MK2細胞単層培養物でのプラーク力価測定によって、3.5×106pfu/mLの力価を有すると判定された。第0日に、5−1の群内のコットンラットに100μLの量の3.5×105pfuを鼻腔内接種した。感染後第3日に、Fabの溶液を鼻腔内滴下した。B12と称する無関係の同様に作製したFabを、1または4mg/(体重1kg)で使用した。HMPV−F特異的DSλ7は、0.06、0.25、1または4mg/(体重1kg)で使用した。より低い濃度のために225μL量で与えたB12の4mg/kg用量を除いて、すべてのFab濃度を一律100μL量に調整した。感染後第4日(Fab投与の24時間後)に、CO2窒息によってそれらの動物を犠牲にし、全血を採取した。鼻および肺組織を別々に回収し、それぞれの動物について個々に計量し、直ちにホモジネートした。肺は、氷冷ガラスホモジナイザーで粉砕し、鼻甲介は、冷たい磁製乳鉢の中の無菌砂および乳棒を用いて、3mLの氷冷ハンクス緩衝塩類溶液中で粉砕した。組織ホモジネートを4℃で10分間、300xgで遠心分離し、上清を回収し、クリオバイアルに分取し、液体窒素で急速冷凍した。この研究は、The Vanderbilt Institutional Animal Care and Use Committeeによって認可された。
商業ブリーダー(インディアナ州、インディアナポリスのHarlan)から週齢5〜6週のコットンラットを購入し、基準食および水を自由に与え、マイクロアイソレーターケージで飼育した。ウイルスまたはFab接種前にイソフランによって動物に麻酔した。使用したウイルス株は、推奨命名法(van den Hoogen et al.,(2004))によるとhMPV株TN/94−49、ジェノグループA2ウイルス、と称する、病原性臨床分離株であった。このウイルス株は、LLC−MK2細胞単層培養物でのプラーク力価測定によって、3.5×106pfu/mLの力価を有すると判定された。第0日に、5−1の群内のコットンラットに100μLの量の3.5×105pfuを鼻腔内接種した。感染後第3日に、Fabの溶液を鼻腔内滴下した。B12と称する無関係の同様に作製したFabを、1または4mg/(体重1kg)で使用した。HMPV−F特異的DSλ7は、0.06、0.25、1または4mg/(体重1kg)で使用した。より低い濃度のために225μL量で与えたB12の4mg/kg用量を除いて、すべてのFab濃度を一律100μL量に調整した。感染後第4日(Fab投与の24時間後)に、CO2窒息によってそれらの動物を犠牲にし、全血を採取した。鼻および肺組織を別々に回収し、それぞれの動物について個々に計量し、直ちにホモジネートした。肺は、氷冷ガラスホモジナイザーで粉砕し、鼻甲介は、冷たい磁製乳鉢の中の無菌砂および乳棒を用いて、3mLの氷冷ハンクス緩衝塩類溶液中で粉砕した。組織ホモジネートを4℃で10分間、300xgで遠心分離し、上清を回収し、クリオバイアルに分取し、液体窒素で急速冷凍した。この研究は、The Vanderbilt Institutional Animal Care and Use Committeeによって認可された。
<統計的分析>
対照群間のウイルス力価をKrustal−Wallis検定で比較した。ウィルコクソン順位和検定を用いて、HMPV−F特異的Fab DSλ7治療群のそれぞれにおけるウイルス力価を、併せた対照群におけるウイルス量と比較した。線形回帰を用いて、用量−応答分析を考察した。用量をlog2変換した。非正規分布の影響を最小にするために用量2−4、2−2、20、および22mg/kgならびに組織ウイルス力価を対数変換したからである。プラークが検出されなかったウイルスアッセイを、log10変換前に、5 PFU/gの検出限界の力価に割り当てた。たった4つの離れた用量レベルでデータに自由に曲がる曲線を適合させるモデルは、データへの過剰適合となり得るという理由から、このモデルでは、データに直線を適合させた。実験群の力価を幾何平均力価として表示した。
対照群間のウイルス力価をKrustal−Wallis検定で比較した。ウィルコクソン順位和検定を用いて、HMPV−F特異的Fab DSλ7治療群のそれぞれにおけるウイルス力価を、併せた対照群におけるウイルス量と比較した。線形回帰を用いて、用量−応答分析を考察した。用量をlog2変換した。非正規分布の影響を最小にするために用量2−4、2−2、20、および22mg/kgならびに組織ウイルス力価を対数変換したからである。プラークが検出されなかったウイルスアッセイを、log10変換前に、5 PFU/gの検出限界の力価に割り当てた。たった4つの離れた用量レベルでデータに自由に曲がる曲線を適合させるモデルは、データへの過剰適合となり得るという理由から、このモデルでは、データに直線を適合させた。実験群の力価を幾何平均力価として表示した。
ファージライブラリパンニングによるHMPV−F特異的モノクローナルFabフラグメントの回収。12のドナーの骨髄組織から作製したファージ抗体Fabディスプレイライブラリを、ELISAウェルに結合した組換えHMPV−Fタンパク質に関して個々に選択した。ファージパンニングの第4または第5ラウンド後に存在した20または30の抗体Fabクローンを、ELISAで、選択抗原に対する反応性について評価した。抗原特異的クローンを、12のドナーライブラリのうちの5つから単離した。特異的FabのFab軽鎖および重鎖DNA配列の分析によって、別個の配列を有する14の異なるクローンが同定された(表1)。
分子の膜貫通部分を欠失した(ΔTM)アフィニティー精製Fタンパク質(Vanderbilt UniversityのJohn Williamsにより提供されたもの)に関して、HMPVについての選択実験を行った。前記選択実験の結果、重鎖の塩基配列決定によって判定して、表1に示すとおりの14の異なるHMPV反応性抗体のパネルを得た。
これらの実験において、6のファージ抗体のうちの1つだけは、1回のパンニング後にHMPV特異的抗体を生じることができなかった。可溶性Fabフラグメントとして、表1に記載した抗体は、ELISA形式で組換えFタンパク質と陽性反応するが、対照抗原とは反応しないことが確認された。
それらの反応性をさらに調査するために、ELISA陽性Fab抗体を、免疫組織化学アッセイで、HMPV感染LLC−MK2細胞に関して評価した。ELISAスクリーニングによりHMPV−Fタンパク質に特異的に結合した14のFabクローンからの細菌上清を試験した。試験した14のFab抗体のうち、2つを除くすべてが、HMPV感染細胞への特異的結合を阻害した(図2A、B)。幾つかのFabは、インビトロで中和活性を示し、それらを細菌上清から精製した。これらの精製Fabは、HMPV感染細胞にも結合した(図2C、D)。F特異的Fabは、抱合体と単個感染細胞の両方からFタンパク質の予想局在と一致する膜分布パターンで検出された。蛍光パターンは、ポリクローナル血清でのHMPV感染細胞またはHMPV−FのみをコードするcDNAをトランスフェクトした細胞の染色結果として、以前に観察されたものに類似していた。免疫蛍光法によってHMPVを検出したFabクローンを、インビトロ中和能力についてさらに試験した。
HMPV特異的Fabの機能性を判定するために、マイクロ中和プラークアッセイを利用した。まず、可溶性Fタンパク質反応性Fabクローンを含有する粗細菌上清をスクリーニングした。プラーク数の60%減少を達成するために必要な細菌上清の希釈度を、それぞれの場合に記録した。HIV−1を認識する組換えFabおよび高いHMPV中和力価を有するヒト血清を、それぞれ、陰性対照および陽性対照としてこの実験に組み入れた。これらの実験は、約4つの個々のFabクローン、DSλ1、DSλ6、DSλ7およびACN044、が、HMPVのA2株に関するHMPV中和活性を有することを示した。これらの抗体のそれぞれを、非中和HMPV−Fタンパク質特異的抗体Hanκ9、およびFab b12と一緒に、アフィニティークロマトグラフィーによって精製し、前記HMPV中和実験を繰り返した。これらの実験結果を表2に示す。
データは、FabクローンDSλ1、DSλ6、DSλ7およびACN044が、インビトロでHMPVのA2株を妥当な効率(1.1から3.2μg/mL)で中和することを示している。その後、FabパネルがA2以外のHMPVの株も中和するか否かを判定した(表3)。A2は、臨床上、最も有力なHMPVジェノグループであると考えられるが、他のジェノグループ、特にB2にも遭遇することがある。
データは、すべての選択抗体がHMPV−A2ジェノグループを中和したことを裏付けたが、DSλ7−Fabクローンだけは、A1およびB1ジェノグループに対する中和活性を一切提示しなかった。これらのデータは、A2ジェノグループを代表する組換えFタンパク質に関する選択によって回収した抗体が、A2ウイルスを中和する抗体の選択に有利であることを示唆している。このタイプのジェノグループ特異的中和は、異なるHMPVジェノグループと会合しているFタンパク質間の高いアミノ酸同一性からすると予想外であり、ならびに中和抗体応答によって発揮される選択圧力が、パラミクソウイルス科の中でのエンベロープタンパク質の異質性を形づくる上で重要な役割を果たし得るという主張に重みを付ける。
下記は、アーカイブ臨床サンプルにおいて遭遇するような、例えば30(A1);配列番号32(A2);配列番号34(B1)および配列番号36(B2)によって例示される、4つのHMPVジェノグループにわたるおよびそれらの中でのFタンパク質配列の総合的比較である。
HMPV−FΔTM特異的Fabには、多数のVH遺伝子セグメントが用いられていた(表5)。
VH3−23は、成熟ランダム循環B細胞レパートリーにおいて最も一般に用いられているVHセグメントであるにもかかわらず、1つのクローンにしか存在しなかった(Brezinchek et al.,J Immunol(1995)155:190−202、Corbett et al.,J MoI Biol(1997)270:587−597、Weitkamp et al.,J Immunol(2003)171:4580−4688)。5%より少ないランダム循環B細胞に用いられているVH1−03は、4つのクローンに用いられていた。VH4−59は、3つのクローンで用いられ、そのうち2つは1ドナーからのクローン的に関連したものである可能性が高く、1つは別のドナーからのものであった。ウイルス中和活性を有する4つのFabクローンのうち、単一ドナーからの2つ(DSλ1およびDSλ6)は、非常に類似したVHセグメントおよび全く同じHCDR3領域を有する(表1)が、異なる軽鎖を有した。最も高い中和活性を有する2つのクローン(ACN044およびDSλ7)は、ヌクレオチドおよびアミノ酸レベルで異なっているVH、JHおよび軽鎖を含むが、非常に類似したHCDR3ループを有した(表1)。体細胞突然変異の分析により、Fabクローンの大部分が高度に突然変異し、フレームワークの突然変異が最も多いことが判明した(表6Aおよび6B)。
しかし、突然変異の数と中和活性の明らかな相関はなかった。
SPR研究は、HMPV特異的FabはHMPV−FΔTMに高い親和性で結合するが、予想どおり、RSV−F特異的MAbパリビツマブはしないことを示した。500nMから5NMの範囲にわたる濃度の抗HMPV−Fab DSλ7の結合曲線は、HMPV FΔTMへの特異的結合パターンを示した(図3)。対照的に、図3は、パリビツマブが100nMの濃度の時でさえHMPVFΔTMに結合しなかったことを示している。本発明者らは、パリビツマブのRSV−FΔTMへの結合能力を試験したところ、強い、特異的な結合を示した。これは、HMPV−FΔTMへの結合の欠如が、特異性の結果であり、抗体の量とは関係ないことを示している。ヒトFab DSλ7のHMPV−FΔTMに対する親和性は高く、Ka=3.54×105(1/ミリ秒)、Kd=3.48×10−5(1/秒)、およびKD=9.84×10−10(M)であった。これらの値は、強い、特異的な抗体−抗原結合を示唆している。結合Fab DSλ7は、HMPV−FΔTMへの特異的結合を示したが、RSV−FΔTMタンパク質に対する検出可能な親和性は有さなかった(図3)。
ハムスター、モルモット、コットンラット、および9つのマウス近交系に麻酔下で105pfuのHMPVを鼻腔内接種した。感染から4日後、それらの動物を犠牲にし、鼻および肺組織のHMPV力価をプラーク力価測定によって決定した。パラミクソウイルス感染の齧歯動物モデルでは一般的である呼吸器症候群を示した動物は全くいなかった。マウスにおけるRSV感染の研究により、108pfuの非常に高い接種量の場合にのみ、マウスは体を丸める(huddling)および毛を逆立たせる(ruffled fur)などの症状を示すことが証明された。鼻組織に存在したウイルスの量は、4.6×102pfu/(組織1g)(C3Hマウス)から、105pfu/(組織1g)より多い(ハムスター)の範囲にわたった(図4、上)。したがって、すべての動物は、鼻甲介におけるHMPV複製をやや許容した。肺力価の判定は、相当異なる結果をもたらした(図4、下)。肺組織におけるHMPV複製の量は、検出可能未満(<5pfu/g;モルモットおよびSJLマウス)から、平均で1.8×105pfu/g(コットンラット)の範囲にわたった。
これらのデータは、試験した齧歯動物の中で、コットンラットがHMPV感染を最も高く許容したことを示している。したがって、105pfuのHMPVで動物を鼻腔内感染させ、感染後2、4、6、8、10または14日の時点でそれらを犠牲にすることによって、コットンラットにおけるHMPV複製の動態を判定した。図5に示すように、鼻甲介におけるHMPV複製は、5.6×104pfu/gの平均力価で第2日にピークに達し、第4日を過ぎると低下し、第6日の後は鼻甲介において検出されなかった。肺組織におけるHMPVの複製は、1.8×105pfu/gの平均力価で感染後第4日にピークに達し、急速に低下し、第6日の後は肺においてウイルスは検出されなかった。これは、ヒトにおけるHMPV排出期間に関するデータ(Ebihara et al.,J Clin Microbiol(2004)42:126−132;van den Hoogen et al.,J Infect Dis(2003)188:1571−1577;Williams et al.,J Infect Dis(2006)193:387−395)と類似している。
次に、感染4日後に回収した未感染および感染動物からの病理検体を検査した。HMPV感染動物の鼻の上皮は、軽度の上皮下リンパ球様浸潤を示した。最も目を引く発見は、感染動物の肺にあった(図6B、D)。HMPV感染コットンラットの肺は、気管支周囲のリンパ形質細胞浸潤および気管支粘膜下組織の浮腫性肥厚を示した。加えて、単核細胞浸潤および浮腫に起因して肺胞間質のびまん性で軽度の拡大があった。脱落上皮細胞、好中球、マクロファージおよび無定形の残屑が、気管支腔に見えた。肺病変の分布は多病巣性であり、それらは位置的に広範囲にわたっていた。未感染動物の肺は正常であった(図6A、C)。いずれの動物においても、脳、心臓、胸腺、肺、脾臓または肝臓における病変は見られなかった。
未感染動物からの肺をはじめとする組織切片は、抗HMPV血清との反応性を示さなかった(図7A)。HMPV感染コットンラットからの脳、心臓、胸腺、脾臓および肝臓の免疫染色切片は、陰性であった。HMPV感染コットンラットからの切片における呼吸上皮組織では、呼吸上皮細胞の内腔表面でのみ、HMPV抗原が検出された(図7B)。鼻組織から細気管支の呼吸上皮細胞では、形態学的に正常な上皮細胞と変性した上皮細胞の両方においてHMPV抗原染色が観察された。これは、呼吸上皮でのウイルス複製を示している。脱落上皮細胞とマクロファージの両方を含む内腔細胞残屑は、HMPV抗原に対して陽性に染まった。CD3の免疫組織化学は、T細胞の実質的流入を示した。これは、細胞性免疫がウイルスのクリアランスに関与することを示唆している。組織病理学データと免疫組織化学データの両方が、気道以外の組織においてHMPVを確認できなかったヒトおよび霊長類の研究を反映していた。
防御免疫および抗体応答を判定するために、コットンラットの2つの群に、スクロース(模擬)または105pfuのスクロース精製HMPVのいずれかを鼻腔内接種した。両方の群を、21日後、105pfuのスクロース精製HMPVで鼻腔内チャレンジした。4日後、コットンラットを犠牲にし、鼻および肺組織におけるウイルス力価を判定した。前に感染していた動物は、わずかだが有意な鼻での力価減少を示し、ならびに肺での高い防御度を示した(図8、左)。前に感染させたラット6匹のうち4匹は、肺において検出可能なウイルス力価を排出しなかった。これらの動物におけるウイルス複製の不在を免疫組織化学によって確認した。前に感染させた動物は、平均1:174(1:17〜1:256の範囲)の有意な血清中和抗体力価も示した(図8、右)。
これらのデータは、コットンラットが鼻および肺においてHMPV複製を許容すること(病理が気管支炎と一致する)が証明されたことを示している。さらに、HMPV感染は、コットンラットにおいて防御免疫を誘発する。したがって、コットンラットは、HMPV感染の丈夫で扱いやすい動物モデルとなる。
インビボでのHMPV特異的Fabの機能性を判定するために、コットンラットの7つの群(6〜7匹/群、合計43匹)を選択した。4群に0.06mg/kg、0.25mg/kg、1mg/kgおよび4mg/kgのFab DSλ7を鼻腔内投与した。対照として、2群にそれぞれ4mg/kgおよび1mg/kgのFab b12(非中和抗体)を鼻腔内投与した。翌日、それらの動物に105pfuのスクロース精製HMPVを鼻腔内接種した。4日後、それらの動物を犠牲にし、鼻および肺組織におけるウイルス力価を判定した。試験および対照動物のそれぞれのセットを、HMPVのみを受けた動物群と比較した。結果を表7に示す。
肺組織について表からわかるように、DSλ7を受けたラットは、試験したすべての濃度のB12と比較して低減されたウイルス力価を示し、力価は、一般に鼻組織におけるより低く、特に、最高濃度のDSλ7のときに低かった。これらのデータは、上の防御免疫および抗体応答データ(すなわち、図8)とよく相関している。
これらのデータは、鼻および肺においてHMPV複製を許容する動物を用いてインビボ中和の模擬実験を行うことができることを示し、ならびに開示する方法によって得られるFabクローン(例えば、DSλ7)が、これらの動物の肺におけるウイルス量を減少させることができることを示している。
もう1つの実験セットにおいて、コットンラットをHMPVで鼻腔内感染させ、第4日に、HMPV複製のピークより前の日に、Fabを鼻腔内投与した(Williamson et al.,J Virol(2005)79:10944−10951)。第4日に動物を犠牲にして組織を回収し、鼻および肺のウイルス力価を判定した。鼻甲介におけるウイルス力価は、Fab DSλ7治療によってほんのわずかしか減少されなかった(図9A)。対照群間にはウイルス力価の有意な差(p=0.025)があり、未治療対照群は、2つのFab B12治療対照群よりわずかに高い鼻の幾何平均力価を有した(1.9×104PFU/g,HMPV;1.2×104PFU/g,B12 4mg/kg;1.7×104PFU/g,B12 1mg/kg)。対照群と比較したDSλ7治療群のうち、4mg/kg DSλ7用量のみが、鼻のウイルス力価の有意な減少を伴った(4.9×103PFU/g対1.8 104PFU/g、p=0.0005)(図9)。用量と応答の間には統計学的に有意な関係があった(p=0.0002):用量が4倍になるごとに、期待ウイルス量は、約−0.20 log10−PFU/g(−0.29、−0.11の95%CI)減少した(図10A)。
DSλ7は、肺におけるウイルス力価減少に非常に有効であった(図9B)。対照群(未治療のもの、またはFab B12で治療したもののいずれか)は、9.6×103PFU/gの肺の平均ウイルス力価を有した。肺のウイルス力価は、3つの対照間で差がなかった(p=0.38)。DSλ7治療群のそれぞれは、対照より低い肺のウイルス力価を有した(対照と比較してそれぞれの群について、p<0.0002)。DSλ7治療動物の肺における平均ウイルス力価は、1.1×102(0.06mg/kg用量)から6.2×100(4mg/kg用量)の範囲にわたった。DSλ7 4mg/kg群における7匹の動物のうちの1匹のみが、肺において検出可能なウイルスを有した。これは、対照と比較して、4mg/kg治療コットンマウスにおける1500倍より大きな減少を表していた。用量が高いほど、肺において低いウイルス力価が得られるという証拠があった(p=0.013;傾き 用量が4倍になるごとに−0.36 log10−PFU/g[−0.62、−0.10の95%CI])(図10B)。しかし、この結果は、4mg/kg用量から得たものであった。肺のウイルス力価が0.06、0.25および1.0mg/kgの用量の間で異なることを示唆する証拠はなかった(p=0.37)。用量をlog2変換しない線形回帰分析も行ったが、鼻組織と肺組織の両方についてのウイルス力価の減少は、尚、有意であった(両方についてp<0.0001、肺について−0.62 log10−PFU/g[−0.82、−0.43の95%CI]、および鼻甲介について−0.14 log10−PFU/g[−0.20、−0.09の95%CI]。
上の実施例に関して本発明を説明したが、変更および変形が本発明の精神および範囲に包含されることは理解されるであろう。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
Claims (25)
- ヒトメタニューモウイルス(HMPV)融合糖タンパク質(Fタンパク質)に特異的に結合する、単離されたヒト抗体。
- 前記Fタンパク質が、配列番号30、配列番号32、配列番号34、および配列番号36に記載のアミノ酸配列から成る群より選択される、請求項1に記載の単離された抗体。
- 配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、または配列番号28に記載のHCDR3アミノ酸配列を含む、請求項1に記載の単離された抗体。
- HMPVジェノグループA1、A2、B1およびB2を中和する、請求項1に記載の単離された抗体。
- HMPVジェノグループA2を中和する、請求項1に記載の単離された抗体。
- 配列番号12に記載のHCRD3アミノ酸配列を含む、請求項3に記載の単離された抗体。
- 検出可能な標識をさらに含む、請求項1に記載の単離された抗体。
- ヒト化抗体である、請求項1に記載の単離された抗体。
- CDR移植抗体である、請求項1に記載の単離された抗体。
- 抗体フラグメントである、請求項1に記載の単離された抗体。
- 前記抗体フラグメントが、Fab、Fab’、F(ab’)2またはFcフラグメントである、請求項10に記載の単離された抗体。
- モノクローナル抗体である、請求項1に記載の単離された抗体。
- i)組換え、未成熟および成熟形態の融合タンパク質(Fタンパク質)に対する抗体のパネルを作成するステップと、
ii)競合分析によりそれぞれの形態のFタンパク質に対する抗体の結合を比較するステップと、
iii)それぞれの形態のFタンパク質に対するパネル内のそれぞれの抗体についてのKdを決定する段階と、
iv)組換えまたは未成熟形態のFタンパク質のKdが成熟形態のFタンパク質より1桁以上高い1つ以上の抗体をパネル内で同定するステップと、
v)ステップ(iv)において同定された1つ以上の抗体の中和効率を決定するステップと
を含み、
中和抗体は、非中和抗体より低い、成熟形態のFタンパク質に対する結合定数を有する、中和抗体の同定方法。 - 前記Fタンパク質が、配列番号30、配列番号32、配列番号34、および配列番号36に記載のアミノ酸配列から成る群より選択される、請求項13に記載の方法。
- 前記抗体が、HMPVジェノグループA2を中和する、請求項13に記載の方法。
- 前記抗体が、HMPVジェノグループA1またはB1を中和する、請求項15に記載の方法。
- HMPVを中和する抗体を被験者に投与することを含む、ヒトメタニューモウイルス(HMPV)感染によって引き起こされる被験者の呼吸状態を治療する方法。
- 前記抗体が、HMPVジェノグループA1、A2、B1およびB2を中和する、請求項17に記載の方法。
- 前記抗体が、HMPVジェノグループA2を中和する、請求項18に記載の方法。
- 前記抗体が、配列番号12に記載のHCRD3アミノ酸配列を含む、請求項19に記載の方法。
- 前記被験者が、哺乳動物である、請求項17に記載の方法。
- 前記哺乳動物が、ヒトである、請求項21に記載の方法。
- ヒトメタニューモウイルス(HMPV)融合糖タンパク質(Fタンパク質)に特異的に結合する1つ以上のヒト抗体を含むワクチン。
- 前記1つ以上の抗体が、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、または配列番号28に記載のHCDR3アミノ酸配列を含む、請求項23に記載のワクチン。
- a)1つ以上のHMPV融合糖タンパク質(Fタンパク質)に特異的に結合する1つ以上のヒト抗体と生体サンプルを、1つ以上の抗体と1つ以上のHMPV−Fタンパク質との複合体の形成を可能にする条件下で接触させるための装置と、
b)複合体を形成していない抗体を除去する1つ以上の試薬と、
c)抗体を認識する1つ以上の試薬と、
d)抗体および試薬の使用に関する手順を提供する指示書と、
e)1つ以上の抗体、試薬および指示書を収容する容器と
を含む、サンプル中のヒトメタニューモウイルス(HMPV)の存在を判定するための診断用キット。
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