TW202229330A - 特異性結合ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２的抗原結合蛋白 - Google Patents
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Abstract
本申請係關於一種特異性結合SARS-CoV-2的分離的抗原結合蛋白，其包含輕鏈可變區VL中的至少一個CDR，其中該CDR包含SEQ ID NO：95所示的胺基酸序列。本申請還係關於了該抗原結合蛋白的製備方法及其製藥用途。
Description
本申請係關於生物醫藥領域，具體的係關於一種特異性結合SARS-CoV-2的抗原結合蛋白。
由SARS-Cov-2引起的COVID-19的爆發已成為全球重大公共衛生事件。COVID-19的預防和治療策略正在臨床前和臨床研究中制定，目前並沒有非常強有力的藥物用於治療COVID-19。
基於抗體的治療是一種可行的治療選擇。中和抗體是宿主對病原體免疫應答的重要組成部分，中和單株抗體已被開發用於RSV、流感、埃博拉、HIV、HCMV和狂犬病等病毒感染的治療。目前單株抗體製備技術有融合瘤技術、EBV轉化B淋巴細胞技術、噬菌體展示技術、轉基因小鼠技術以及單個B細胞抗體製備技術等。
本申請提供了一種特異性結合SARS-CoV-2的分離的抗原結合蛋白。本申請所述的分離的抗原結合蛋白至少具備以下的有益效果：1)特異性
結合SARS-CoV-2；2)具有中和SARS-CoV-2的活性；3)對SARS-CoV-2的感染有良好的預防、治療和/或緩解效果。本申請還提供了該特異性結合SARS-CoV-2的分離的抗原結合蛋白的製備方法，以及該特異性結合SARS-CoV-2的分離的抗原結合蛋白的製藥用途。
一方面，本申請提供了一種特異性結合SARS-CoV-2的分離的抗原結合蛋白，其包含輕鏈可變區VL中的至少一個CDR，其中該CDR包含SEQ ID NO：95所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該VL包含LCDR1，該LCDR1包含SEQ ID NO：95所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該VL包含LCDR1，該LCDR1包含SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：50中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該VL包含LCDR2，該LCDR2包含SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：54中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該VL包含LCDR3，該LCDR3包含SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：61中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該VL包含LCDR1和LCDR2，該LCDR1包含SEQ ID NO：95所示的胺基酸序列，該LCDR2包含SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：54中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該VL包含LCDR1和LCDR3，該LCDR1包含SEQ ID NO：95所示的胺基酸序列，該LCDR3包含SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：61中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，該LCDR1包含SEQ ID NO：95所示的胺基酸序列，該LCDR2包含SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：54中任一項所示的胺基酸序列；該LCDR3包含SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：61中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該VL包括框架區L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4，其中該L-FR1的C末端與該LCDR1的N末端直接或間接相連，且該L-FR1包含SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：64中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該L-FR2位於該LCDR1與該LCDR2之間，且該L-FR2包含SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70和SEQ ID NO：71中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該L-FR3位於該LCDR2與該LCDR3之間，且該L-FR3包含SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：77和SEQ ID NO：78中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該L-FR4的N末端與該LCDR3的C末端直接或間接相連，且該L-FR4包含SEQ ID NO：79和SEQ ID NO：80中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該VL包含SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93和SEQ ID NO：94中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包括抗體輕鏈恆定區。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白，包含重鏈可變區VH，該VH包含HCDR1，該HCDR1包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該VH包含HCDR2，該HCDR2包含SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該VH包含HCDR3，該HCDR3包含SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包含重鏈可變區VH，該VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：
6和SEQ ID NO：7中任一項所示的胺基酸序列；該HCDR2包含SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14中任一項所示的胺基酸序列；該HCDR3包含SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該VH包括框架區H-FR1，H-FR2，H-FR3和H-FR4，其中該H-FR1的C末端與該HCDR1的N末端直接或間接相連，且該H-FR1包含SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該H-FR2位於該HCDR1與該HCDR2之間，且該H-FR2包含SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該H-FR3位於該HCDR2與該HCDR3之間，且該H-FR3包含SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該H-FR4的N末端與該HCDR3的C末端直接或間接相連，且該H-FR4包含SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該VH包含SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：86和SEQ ID NO：87中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包括抗體重鏈恆定區。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白具有中和SARS-CoV-2的活性。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包括抗體或其抗原結合片段。
在某些實施方式中，該抗原結合片段包括Fab，Fab’，F(ab)2，Fv片段，F(ab’)2，scFv，di-scFv和/或dAb。
在某些實施方式中，該抗體為全人源抗體。
另一方面，本申請提供了分離的一種或多種核酸分子，其編碼本申請所述的分離的抗原結合蛋白中的該VL。
另一方面，本申請提供了分離的一種或多種核酸分子，其編碼本申請所述的分離的抗原結合蛋白中的該VH。
另一方面，本申請提供了分離的一種或多種核酸分子，其編碼本申請所述的分離的抗原結合蛋白。
另一方面，本申請提供了一種載體，其包含本申請所述的核酸分子。
另一方面，本申請提供了一種細胞，其包含本申請所述的核酸分子或本申請所述的載體。
在某些實施方式中，該細胞表達本申請所述的分離的抗原結合蛋白。
另一方面，本申請提供了一種製備本申請所述的分離的抗原結合蛋白的方法，該方法包括在使得本申請所述的分離的抗原結合蛋白表達的條件下，培養根據本申請所述的細胞。
另一方面，本申請提供了一種醫藥組成物，其包含本申請所述的分離的抗原結合蛋白、本申請所述的核酸分子、本申請所述的載體和/或本申請所述的細胞，以及視需要地藥學上可接受的佐劑。
另一方面，本申請提供了本申請所述的分離的抗原結合蛋白、本申請所述的核酸分子、本申請所述的載體、本申請所述的細胞和/或本申請所述的醫藥組成物在製備藥物中的用途，該藥物用於預防、緩解和/或治療冠狀病毒的感染。
在某些實施方式中，該冠狀病毒的感染包括COVID-19。
另一方面，本申請提供了一種預防、緩解和/或治療冠狀病毒的感染的方法，其包括施用本申請所述的分離的抗原結合蛋白、本申請所述的核酸分子、本申請所述的載體、本申請所述的細胞和/或本申請所述的醫藥組成物。
另一方面，本申請提供了本申請所述的分離的抗原結合蛋白、本申請所述的核酸分子、本申請所述的載體、本申請所述的細胞和/或本申請所述的醫藥組成物，其在預防、緩解和/或治療冠狀病毒的感染中的應用。
另一方面，本申請提供了檢測SARS-CoV-2的方法，其包括以下的步驟，施用本申請所述的分離的抗原結合蛋白、本申請所述的核酸分子、本申請所述的載體、本申請所述的細胞和/或本申請所述的醫藥組成物。
所屬技術領域具有通常知識者能夠從下文的詳細描述中容易地洞察到本申請的其它方面和優勢。下文的詳細描述中僅顯示和描述了本申請的示例性實施方式。如所屬技術領域具有通常知識者將認識到的，本申請的內容使得所屬技術領域具有通常知識者能夠對所公開的實施方式進行改動而不脫離本申請所係關於發明的精神和範圍。相應地，本申請的圖式和說明書中的描述僅僅是示例性的，而非為限制性的。
本申請所係關於的發明的具體特徵如所附申請專利範圍所顯示。藉由參考下文中詳細描述的示例性實施方式和圖式能夠更好地理解本申請所係關於發明的特點和優勢。對圖式簡要說明書如下：
圖1顯示的是本申請所述的分離的抗原結合蛋白特異性結合SARS-CoV-2 S蛋白三聚體的結果。
圖2顯示的是本申請所述的分離的抗原結合蛋白對SARS-CoV-2假病毒的中和活性。
圖3顯示的是本申請所述的分離的抗原結合蛋白對SARS-CoV-2假病毒的中和活性。
圖4顯示的是小鼠感染模型的構建方法。
圖5顯示的是本申請所述的分離的抗原結合蛋白對小鼠感染模型的體重的影響。
圖6顯示的是本申請所述的分離的抗原結合蛋白對小鼠感染模型的臨床評分結果。
圖7顯示的是本申請所述的分離的抗原結合蛋白對小鼠感染模型的生存曲線的影響。
圖8顯示的是恆河猴感染模型的構建方法。
圖9顯示的是本申請所述的分離的抗原結合蛋白對恆河猴感染模型中病毒RNA含量的影響(咽拭子檢測)。
圖10顯示的是本申請所述的分離的抗原結合蛋白對恆河猴感染模型中病毒RNA含量的影響(肛拭子檢測)
圖11顯示的是本申請所述的分離的抗原結合蛋白對恆河猴感染模型中各組織器官中病毒RNA含量的影響。
圖12a至圖12g顯示的是本申請所述的分離的抗原結合蛋白與S蛋白複合物的冷凍電鏡分析結果。
圖13a及圖13b顯示的是本申請所述的分離的抗原結合蛋白與S蛋白複合物的冷凍電鏡處理流程。
圖14顯示的是本申請所述的分離的抗原結合蛋白與S蛋白複合物的資料收集、3D模型重構和模型統計參數。
圖15a至圖15e顯示的是本申請所述的分離的抗原結合蛋白與S蛋白複合物的冷凍電鏡結構。
圖16a至圖16c顯示的是本申請所述的分離的抗原結合蛋白與S蛋白複合物的結合模式分析。
以下由特定的具體實施例說明本申請發明的實施方式，熟悉此技術的人士可由本說明書所公開的內容容易地瞭解本申請發明的其他優點及效果。
術語定義
在本申請中，術語“SARS-CoV-2”通常是指嚴重急性呼吸道綜合症冠狀病毒2型，英文全稱為Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2。SARS-CoV-2屬於冠狀病毒科(Coronaviridae)乙型冠狀病毒屬(Betacoronavirus)沙貝病毒亞屬(Sarbecovirus)。SARS-CoV-2是一種具有包膜的、不分節段的正鏈單股RNA病毒。SARS-CoV-2可以引發新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)。在本申請中，該SARS-CoV-2可以包括S蛋白(刺突蛋白，spike蛋白)。
在本申請中，術語“COVID-19”通常是指新型冠狀病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019)，或2019冠狀病毒病，其是由SARS-CoV-2病毒引起的呼吸道疾病。COVID-19的常見症狀可以包括發燒，咳嗽，疲勞，呼吸急促以及氣味和味覺喪失，某些症狀會發展為病毒性肺炎，多器官功能衰竭或細胞因子風暴。該疾病主要在人與人之間密切接觸時傳播，例如可以藉由咳嗽，打噴嚏和說話產生的小液滴傳播。世界衛生組織於2020年3月11日宣佈
COVID-19的爆發是大流行病(pandemic)。目前沒有針對COVID-19的可用的疫苗或特異性的治療方法。
在本申請中，術語“冠狀病毒的S蛋白”通常是指冠狀蛋白的刺突蛋白(spike蛋白)。該S蛋白可以組合成三聚體(即S蛋白三聚體)，其約含有1300個胺基酸。該S蛋白可以屬於第一類膜融合蛋白(Class I viral fusion protein)。該S蛋白通常可以含有兩個亞基(subunit)，S1和S2。S1主要包含有受體結合區(receptor binding domain RBD)，其可以負責識別細胞的受體。S2含有膜融合過程所需的基本元件，包括一個內在的膜融合肽(fusion peptide)，兩個7肽重複序列(heptad repeat，HR)，一個富含芳香族胺基酸的膜臨近區域(membrane proximal external region，MPER)，以及跨膜區(transmembrane，TM)。S1蛋白可進一步分成兩個區域(domain)，即N-端區域(N-terminal domain，NTD)和C-端區域(C-terminal domain，CTD)。S蛋白可以決定病毒(例如冠狀病毒SARS-CoV-2)的宿主範圍和特異性，也可以為宿主中和抗體的而重要作用位點，和/或疫苗設計的關鍵靶點。該S蛋白可以為SARS-CoV-2的S蛋白，例如，其結構可以參見Daniel Wrapp等，Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation,Science。
在本申請中，術語“ACE2”通常是指血管緊張素轉化酶II(Angiotensin-converting enzyme 2)或其功能片段。該血管緊張素轉化酶II可以催化血管緊張素I轉化為血管緊張素-(1-9)或血管緊張素II轉化為血管緊張素-(1-7)的外肽酶。該ACE2可以包括N端的PD區(peptidase domain，肽酶結構域)和C端CLD區(Collectrin-like domain)。該血管緊張素轉化酶II可以為SARS-CoV-2的受體，例如，該ACE2的胞外結構域(例如，該
ACE2的PD區)可以結合SARS-CoV-2的S蛋白的RBD。人血管緊張素轉化酶II在UniProt資料庫的登錄號為Q9BYF1。人ACE2基因可以包含18個外顯子，參見Tipnis,S.R.,Hooper,N.M.,Hyde,R.,Karran,E.,Christie,G.,Turner,A.J.A human homolog of angiotensin-converting enzyme：cloning and functional expression as a captopril-insensitive carboxypeptidase.J.Biol.Chem.275：33238-33243,2000的表1。在本申請中，該ACE2可以包括該完整ACE2蛋白的截短體或變體，只要該功能性片段仍具備作為冠狀病毒(例如SARS-CoV和/或SARS-CoV-2)受體的功能。
在本申請中，術語“冠狀病毒的感染”通常是指由冠狀病毒感染引起的疾病和/或症狀。該冠狀病毒屬於屬模式病毒目(Nidovirales)冠狀病毒科(Coronaviridae)冠狀病毒屬(Coronavirus)。該冠狀病毒可以為單鏈RNA病毒。該冠狀病毒的感染可以包括呼吸道感染，例如上呼吸道感染。該冠狀病毒的感染可以包括發熱、流涕、寒戰、嘔吐和/或疲勞等症狀。
在本申請中，術語“中和”通常是指抗原結合蛋白的中和活性，即抗原結合蛋白可以阻止和/或中和其對應的抗原的生化活性。在某些情況下，具備該中和活性的抗原結合蛋白可以抵抗攻擊免疫系統的抗原(例如逆轉錄病毒，例如該抗原可以為SARS-CoV-2)，並使其失去活性。在某些情況下，具備該中和活性的抗原結合蛋白在中和其對應的抗原的生化活性時，不需要白細胞的參與。
在本申請中，術語“抗原結合蛋白”通常是指包含結合抗原的部分的蛋白質，以及視需要地允許結合抗原的部分採用促進抗原結合蛋白與抗原結合的構象的支架或骨架部分。抗原結合蛋白的實例包括但不限於抗體、抗原結
合片段(Fab、Fab’、F(ab)2、Fv片段、F(ab’)2、scFv、di-scFv和/或dAb)、免疫綴合物、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、抗體片段、抗體衍生物、抗體類似物或融合蛋白等，只要它們顯示出所需的抗原結合活性即可。
在本申請中，術語“Fab”通常是指含有重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域的片段，並且還含有輕鏈的恆定結構域和重鏈的第一恆定結構域(CH1)；術語“Fab'''通常是指在重鏈CH1結構域的羧基端添加少量殘基(包括一個或多個來自抗體鉸鏈區的半胱胺酸)而不同於Fab的片段；術語“F(ab')2”通常是指Fab’的二聚體，包含藉由鉸鏈區上的二硫橋連接的兩個Fab片段的抗體片段。術語“Fv”通常是指含有完整抗原識別與結合位點的最小抗體片段。在某些情形中，該片段可以由一個重鏈可變區和一個輕鏈可變區以緊密非共價結合的二聚體組成；術語“dsFv”通常是指二硫鍵穩定的Fv片段，其單個輕鏈可變區與單個重鏈可變區之間的鍵是二硫鍵。術語“dAb片段”通常是指由VH結構域組成的抗體片段。在本申請中，術語“scFv”通常是指抗體的一個重鏈可變結構域和一個輕鏈可變結構域藉由柔性肽連接子共價連接配對形成的單價分子；此類scFv分子可具有一般結構：NH2-VL-連接子-VH-COOH或NH2-VH-連接子-VL-COOH。
在本申請中，術語“抗體”通常是指可以與相應抗原發生特異性結合反應的免疫球蛋白。該抗體可以由免疫細胞(例如效應B細胞)分泌。該抗體可以為單株抗體(包括包含兩條輕鏈和兩條重鏈的全長單株抗體)、多選殖抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、人源化抗體、完全人類抗體、嵌合抗體和/或駱駝化單結構域抗體。“抗體”通常可以包含藉由二硫鍵互相連接的至少兩條重鏈(HC)和兩條輕鏈(LC)的蛋白，或其抗原結合片段。每條重
鏈包含重鏈可變區(VH)和重鏈恆定區。在某些天然存在的IgG、IgD和IgA抗體中，重鏈恆定區包含三個結構域，CH1、CH2和CH3。在某些天然存在的抗體中，各輕鏈包含輕鏈可變區(VL)和輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包含一個結構域，CL。VH和VL區可進一步細分為超變性的區域，稱為互補決定區(CDR)，其與稱為框架區(FR)的較保守的區域交替。各VH和VL包含三個CDR和四個框架區(FR)，從胺基端至羧基端按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。天然重鏈和輕鏈的可變結構域各自包含四個FR區(H-FR1、H-FR2、H-FR3、H-FR4、L-FR1、L-FR2、L-FR3、L-FR4)，大部分採用β-折疊構型，藉由三個CDRs連接，形成環連接，並且在一些情況下形成β-折疊結構的一部分。每條鏈中的CDRs藉由FR區緊密靠近在一起，並與來自另一條鏈的CDR一起形成抗體的抗原結合位點。抗體的恆定區可介導免疫球蛋白與宿主組織或因數，包括免疫系統的各種細胞(例如，效應細胞)和經典補體系統的第一組分(Clq)結合。
在本申請中，術語“可變”通常是指這樣的事實，即抗體的可變結構域的序列的某些部分變化強烈，它形成各種特定抗體對其特定抗原的結合和特異性。然而，變異性並非均勻地分佈在抗體的整個可變區中。它集中在輕鏈和重鏈可變區中的三個區段，被稱為互補決定區(CDR)或高變區(HVR)。可變域中更高度保守的部分被稱為框架(FR)。在本領域中，可以藉由多種方法來定義抗體的CDR，例如基於序列可變性的Kabat定義規則(參見，Kabat等人，免疫學的蛋白質序列，第五版，美國國立衛生研究院，貝塞斯達，馬里蘭州(1991))、基於結構環區域位置的Chothia定義規則(參見，A1-Lazikani等人，JMol Biol 273：927-48,1997)和基於IMGT本體論(IMGT-
ONTOLOGY)的概念和IMGT Scientific圖表規則的KABAT定義規則。IMGT指國際ImMunoGeneTics資訊系統，一種免疫遺傳學和免疫資訊學的全球參考資料庫(http：//www.imgt.org)。IMGT專門研究來自人類和其他脊椎動物的免疫球蛋白(IG)或抗體、T細胞受體(TR)、主要組織相容性(MH)，以及來自脊椎動物和非脊椎動物的免疫球蛋白超家族(IgSF)、MH超家族(MhSF)和免疫系統相關蛋白(RPI)。
在本申請中，術語“分離的”抗原結合蛋白通常是指已經從其產生環境(例如，天然的或重組的)的組分中識別，分離和/或回收的抗原結合蛋白。其產生環境的污染組分通常是干擾其研究、診斷或治療用途的物質，可以包括酶、激素和其他蛋白質或非蛋白質溶質。分離的抗原結合蛋白或抗體通常將藉由至少一個純化步驟來製備。
在本申請中，術語“單株抗體”通常是指從一群基本上同質的抗體獲得的抗體，即集群中的個別抗體是相同的，除了可能存在的少量的自然突變。單株抗體通常針對單個抗原位點具有高度特異性。而且，與常規多選殖抗體製劑(通常具有針對不同決定簇的不同抗體)不同，各單株抗體是針對抗原上的單個決定簇。除了它們的特異性之外，單株抗體的優點在於它們可以藉由融合瘤培養合成，不受其他免疫球蛋白污染。修飾語“單株”表示從基本上同質的抗體群體獲得的抗體的特徵，並且不被解釋為需要藉由任何特定方法產生抗體。例如，本申請使用的單株抗體可以在融合瘤細胞中製備，或者可以藉由重組DNA方法製備。
在本申請中，術語“全人源抗體”通常是指將人類編碼抗體的基因轉移至基因工程改造的抗體基因缺失動物中，使動物表達的抗體。抗體所有部
分(包括抗體的可變區和恆定區)均由人類來源的基因所編碼。全人源抗體可以大大減少異源抗體對人體造成的免疫副反應。本領域獲得全人源抗體的方法可以有噬菌體展示技術、轉基因小鼠技術、核糖體展示技術和RNA-多肽技術等。
在本申請中，術語“結合”、“特異性結合”或“對...特異性的”通常是指可測量且可再現的相互作用，諸如抗原和抗體之間的結合，其可以確定在存在分子(包括生物學分子)的異質群體的情況中靶物的存在。例如，抗體藉由其抗原結合域與表位結合，並且該結合需要抗原結合域和表位之間的一些互補性。例如，特異性結合靶物(其可以是表位)的抗體是以比其結合其它靶物更大的親和力、親合力、更容易和/或以更大的持續時間結合此靶物的抗體。當抗體相比於其將結合隨機的、不相關的表位而言更容易藉由其抗原結合域與表位結合時，抗體被稱為“特異性結合”該抗原。“表位”是指抗原上與抗原結合蛋白(如抗體)結合的特定的原子、基團(例如，糖側鏈、磷醯基、磺醯基)或胺基酸。
在本申請中，術語“參比抗體”通常是指本申請該抗原結合蛋白與之競爭結合抗原(例如SARS-CoV-2的S蛋白的RBD)的抗體。
在本申請中，術語“在……之間”通常是指某種胺基酸片段的C端與第一胺基酸片段的N端直接或間接連接，並且其N端與第二胺基酸片段的C端直接或間接連接。在輕鏈中，例如，該L-FR2的N末端與該LCDR1的C末端直接或間接相連，且該L-FR2的C末端與該LCDR2的N末端直接或間接相連。又例如，該L-FR3的N末端與該LCDR2的C末端直接或間接相連，且該L-FR3的C末端與該LCDR3的N末端直接或間接相連。在重鏈中，例如，該
H-FR2的N末端與該HCDR1的C末端直接或間接相連，且該H-FR2的C末端與該HCDR2的N末端直接或間接相連。又例如，該H-FR3的N末端與該HCDR2的C末端直接或間接相連，且該H-FR3的C末端與該HCDR3的N末端直接或間接相連。在本申請中，“第一胺基酸片段”和“第二胺基酸片段”可以為相同或不同的任意一段胺基酸片段。
在本申請中，術語“分離的核酸分子”或“分離的多核苷酸”通產是指基因組、mRNA、cDNA或合成來源的DNA或RNA或其一定組合。該分離的核酸分子可以不與在自然界中發現的多核苷酸的全部或一部分締合，或連接至其在自然界中不連接的多核苷酸。
在本申請中，術語“載體”通常是指能夠在合適的宿主中自我複製的核酸分子，其將插入的核酸分子轉移到宿主細胞中和/或宿主細胞之間。該載體可包括主要用於將DNA或RNA插入細胞中的載體、主要用於複製DNA或RNA的載體，以及主要用於DNA或RNA的轉錄和/或翻譯的表達的載體。該載體還包括具有多種上述功能的載體。該載體可以是當引入合適的宿主細胞時能夠轉錄並翻譯成多肽的多核苷酸。通常，藉由培養包含該載體的合適的宿主細胞，該載體可以產生期望的表達產物。
在本申請中，術語“細胞”通常是指可以或已經含有包括本申請所述的核酸分子的質粒或載體，或者能夠表達本申請所述的抗體或其抗原結合片段的個體細胞、細胞系或細胞培養物。該細胞可以包括單個宿主細胞的子代。由於天然的、意外的或故意的突變，子代細胞與原始親本細胞在形態上或在基因組上可能不一定完全相同，但能夠表達本申請所述的抗體或其抗原結合片段即可。該細胞可以藉由使用本申請所述的載體體外轉染細胞而得到。該細胞可
以是原核細胞(例如大腸桿菌)，也可以是真核細胞(例如酵母細胞，例如COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、HeLa細胞、HEK293細胞、COS-1細胞、NS0細胞或骨髓瘤細胞)。在本申請中，該細胞可以包括在其中引入了該載體的細胞。該細胞不僅包括某種特定的細胞，還可以包括這些細胞的後代。
在本申請中，術語“藥學上可接受的佐劑”通常包括藥劑學可接受的載體、賦形劑或穩定劑，它們在所採用的劑量和濃度對暴露於其的細胞或哺乳動物是無毒的。通常，生理學可接受的載體是pH緩衝水溶液。
如本文所用，術語“施用”通常是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組成物應用於動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體。“施用”可以指治療、藥物代謝動力學、診斷、研究和實驗方法。細胞的處理可以包括試劑(例如包含該分離的抗原結合蛋白的試劑)與細胞的接觸、以及試劑與流體的接觸、流體與細胞的接觸。“施用”還意指藉由試劑、診斷、結合組成物或藉由另一種細胞體外和離體處理。“處理”當應用於人、動物或研究受試者時，是指治療處理、預防或預防性措施，研究和診斷；例如可以包括該分離的抗原結合蛋白與人或動物、受試者、細胞、組織、生理區室或生理流體的接觸。
如本文所用，術語“治療”指給予患者內用或外用治療劑，例如包含本申請的任何一種該分離的抗原結合蛋白，和/或包含該分離的抗原結合蛋白的醫藥組成物，該患者具有一種或多種疾病症狀，而已知該治療劑對這些症狀具有治療作用。通常，以有效緩解一種或多種疾病症狀的治療劑的量(治療有效量)給予患者。治療的期望效果包括降低疾病進展速率，改善或減輕疾病狀態，和消退或改善的預後。例如，若一種或多種與癌症有關的症狀是減輕或消除的，包括但不限於，降低(或破壞)癌細胞增殖，減少源自疾病的症狀，提
高那些患有疾病的個體的生命品質，降低治療疾病需要的其它藥物的劑量，延遲疾病的進展，和/或延長個體存活，則個體得到成功“治療”。
在本申請中，術語“包括”通常是指包含、總括、含有或包涵的含義。在某些情況下，也表示“為”、“由......組成”的含義。
在本申請中，術語“約”通常是指在指定數值以上或以下0.5%-10%的範圍內變動，例如在指定數值以上或以下0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%、或10%的範圍內變動。
發明詳述
抗原結合蛋白
一方面，本申請提供一種特異性結合SARS-CoV-2的分離的抗原結合蛋白，其包含輕鏈可變區VL中的至少一個CDR，其中該CDR包含SEQ ID NO：95所示的胺基酸序列。例如，該CDR可以包含SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：98或SEQ ID NO：99所示的胺基酸序列。
在本申請中，該VL可以包含LCDR1，該LCDR1可以包含SEQ ID NO：95所示的胺基酸序列：TG X3SS X6 X7G X9 X10 X11 X12V X14，其中，X3為Ser或Thr；X6為Asp或Asn，X7為Ile或Val，X9為Ala、Gly或Ser；X10為Gly、Ser或Tyr；X11為Asp、Phe、Asn或Tyr；X12為Asp、Leu或Tyr；X14為His或Ser。例如，該序列可以是根據KABAT定義規則確定的序列。
在本申請中，該VL可以包含LCDR1，該LCDR1可以包含SEQ ID NO：96所示的胺基酸序列：TG X3SSDVGX9X10X11X12VS，其中，X3為Ser
或Thr；X9為Gly或Ser；X10為Ser或Tyr；X11為Asp或Asn；X12為Leu或Tyr。例如，該序列可以是根據KABAT定義規則確定的序列。
在本申請中，該VL可以包含LCDR1，該LCDR1可以包含SEQ ID NO：97所示的胺基酸序列：TGTSSDVGX9X10NX12VS，其中，X9為Gly或Ser；X10為Ser或Tyr；X12為Leu或Tyr。例如，該序列可以是根據KABAT定義規則確定的序列。
在本申請中，該VL可以包含LCDR1，該LCDR1可以包含SEQ ID NO：98所示的胺基酸序列：TGTSSDVGGX10NYVS，其中，X10為Ser或Tyr。例如，該序列可以是根據KABAT定義規則確定的序列。
在本申請中，該VL可以包含LCDR1，該LCDR1可以包含SEQ ID NO：99所示的胺基酸序列：TGSSSNIGAG X11DVH，其中，X11為Phe或Tyr。例如，該序列可以是根據KABAT定義規則確定的序列。
例如，該VL可以包含LCDR1，該LCDR1可以包含SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：50中任一項所示的胺基酸序列。
在本申請中，該VL可以包含LCDR2，該LCDR2可以包含SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：54中任一項所示的胺基酸序列。
在本申請中，該VL可以包含LCDR3，該LCDR3可以包含SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：61中任一項所示的胺基酸序列。
例如，該VL可以包含LCDR1和LCDR2，該LCDR1可以包含SEQ ID NO：95所示的胺基酸序列，該LCDR2可以包含SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：54中任一項所示的胺基酸序列。
例如，該VL可以包含LCDR1和LCDR3，該LCDR1可以包含SEQ ID NO：95所示的胺基酸序列，該LCDR3可以包含SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：61中任一項所示的胺基酸序列。
例如，該VL可以包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，該LCDR1可以包含SEQ ID NO：95所示的胺基酸序列，該LCDR2可以包含SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：54中任一項所示的胺基酸序列；該LCDR3可以包含SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：61中任一項所示的胺基酸序列。
例如，該VL可以包含SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93和SEQ ID NO：94中任一項所示的胺基酸序列。
例如，該分離的抗原結合蛋白，可以包含重鏈可變區VH，該VH可以包含HCDR1，該HCDR1可以包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7中任一項所示的胺基酸序列。
例如，該VH可以包含HCDR2，該HCDR2可以包含SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、
SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14中任一項所示的胺基酸序列。
例如，該VH可以包含HCDR3，該HCDR3可以包含SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21中任一項所示的胺基酸序列。
例如，該分離的抗原結合蛋白可以包含重鏈可變區VH，該VH可以包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可以包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7中任一項所示的胺基酸序列；該HCDR2可以包含SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14中任一項所示的胺基酸序列；該HCDR3可以包含SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21中任一項所示的胺基酸序列。
例如，該VH可以包含SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：86和SEQ ID NO：87中任一項所示的胺基酸序列。
本申請所述的分離的抗原結合蛋白，能夠與參比抗體競爭結合SARS-CoV-2的S蛋白的RBD，其中該參比抗體可以包含重鏈可變區和輕鏈可變區，該參比抗體的重鏈可變區可以包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可以包含SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列，該HCDR2可以包含SEQ ID NO：8所示的胺基酸序列，且該HCDR3可以包含SEQ ID NO：15所示的胺基
酸序列，該LCDR1可以包含SEQ ID NO：45所示的胺基酸序列，該LCDR2可以包含SEQ ID NO：51所示的胺基酸序列，且該LCDR3可以包含SEQ ID NO：55所示的胺基酸序列。
本申請所述的分離的抗原結合蛋白，能夠與參比抗體競爭結合SARS-CoV-2的S蛋白的RBD，其中該參比抗體可以包含重鏈可變區和輕鏈可變區，該參比抗體的重鏈可變區可以包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可以包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列，該HCDR2可以包含SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列，且該HCDR3可以包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列，該LCDR1可以包含SEQ ID NO：46所示的胺基酸序列，該LCDR2可以包含SEQ ID NO：51所示的胺基酸序列，且該LCDR3可以包含SEQ ID NO：56所示的胺基酸序列。
本申請所述的分離的抗原結合蛋白，能夠與參比抗體競爭結合SARS-CoV-2的S蛋白的RBD，其中該參比抗體可以包含重鏈可變區和輕鏈可變區，該參比抗體的重鏈可變區可以包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可以包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列，該HCDR2可以包含SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列，且該HCDR3可以包含SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列，該LCDR1可以包含SEQ ID NO：47所示的胺基酸序列，該LCDR2可以包含SEQ ID NO：52所示的胺基酸序列，且該LCDR3可以包含SEQ ID NO：57所示的胺基酸序列。
本申請所述的分離的抗原結合蛋白，能夠與參比抗體競爭結合SARS-CoV-2的S蛋白的RBD，其中該參比抗體可以包含重鏈可變區和輕鏈可變區，該參比抗體的重鏈可變區可以包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該
HCDR1可以包含SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列，該HCDR2可以包含SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列，且該HCDR3可以包含SEQ ID NO：18所示的胺基酸序列，該LCDR1可以包含SEQ ID NO：48所示的胺基酸序列，該LCDR2可以包含SEQ ID NO：53所示的胺基酸序列，且該LCDR3可以包含SEQ ID NO：58所示的胺基酸序列。
本申請所述的分離的抗原結合蛋白，能夠與參比抗體競爭結合SARS-CoV-2的S蛋白的RBD，其中該參比抗體可以包含重鏈可變區和輕鏈可變區，該參比抗體的重鏈可變區可以包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可以包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，該HCDR2可以包含SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列，且該HCDR3可以包含SEQ ID NO：19所示的胺基酸序列，該LCDR1可以包含SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列，該LCDR2可以包含SEQ ID NO：53所示的胺基酸序列，且該LCDR3可以包含SEQ ID NO：59所示的胺基酸序列。
本申請所述的分離的抗原結合蛋白，能夠與參比抗體競爭結合SARS-CoV-2的S蛋白的RBD，其中該參比抗體可以包含重鏈可變區和輕鏈可變區，該參比抗體的重鏈可變區可以包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可以包含SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列，該HCDR2可以包含SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列，且該HCDR3可以包含SEQ ID NO：21所示的胺基酸序列，該LCDR1可以包含SEQ ID NO：49所示的胺基酸序列，該LCDR2可以包含SEQ ID NO：54所示的胺基酸序列，且該LCDR3可以包含SEQ ID NO：60所示的胺基酸序列。
本申請所述的分離的抗原結合蛋白，能夠與參比抗體競爭結合SARS-CoV-2的S蛋白的RBD，其中該參比抗體可以包含重鏈可變區和輕鏈可變區，該參比抗體的重鏈可變區可以包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可以包含SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列，該HCDR2可以包含SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列，且該HCDR3可以包含SEQ ID NO：20所示的胺基酸序列，該LCDR1可以包含SEQ ID NO：50所示的胺基酸序列，該LCDR2可以包含SEQ ID NO：51所示的胺基酸序列，且該LCDR3可以包含SEQ ID NO：61所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含抗體輕鏈可變區CDR--LCDR1、LCDR2和LCDR3，該LCDR1可包含SEQ ID NO：45所示的胺基酸序列，該LCDR2可包含SEQ ID NO：51所示的胺基酸序列，且該LCDR3可包含SEQ ID NO：55所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含抗體輕鏈可變區CDR--LCDR1、LCDR2和LCDR3，該LCDR1可包含SEQ ID NO：46所示的胺基酸序列，該LCDR2可包含SEQ ID NO：51所示的胺基酸序列，且該LCDR3可包含SEQ ID NO：56所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含抗體輕鏈可變區CDR--LCDR1、LCDR2和LCDR3，該LCDR1可包含SEQ ID NO：47所示的胺基酸序列，該LCDR2可包含SEQ ID NO：52所示的胺基酸序列，且該LCDR3可包含SEQ ID NO：57所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含抗體輕鏈可變區CDR--LCDR1、LCDR2和LCDR3，該LCDR1可包含SEQ ID NO：48所示的
胺基酸序列，該LCDR2可包含SEQ ID NO：53所示的胺基酸序列，且該LCDR3可包含SEQ ID NO：58所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含抗體輕鏈可變區CDR--LCDR1、LCDR2和LCDR3，該LCDR1可包含SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列，該LCDR2可包含SEQ ID NO：53所示的胺基酸序列，且該LCDR3可包含SEQ ID NO：59所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含抗體輕鏈可變區CDR--LCDR1、LCDR2和LCDR3，該LCDR1可包含SEQ ID NO：49所示的胺基酸序列，該LCDR2可包含SEQ ID NO：54所示的胺基酸序列，且該LCDR3可包含SEQ ID NO：60所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含抗體輕鏈可變區CDR--LCDR1、LCDR2和LCDR3，該LCDR1可包含SEQ ID NO：50所示的胺基酸序列，該LCDR2可包含SEQ ID NO：51所示的胺基酸序列，且該LCDR3可包含SEQ ID NO：61所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含抗體重鏈可變區CDR--HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：8所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含抗體重鏈可變區CDR--HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含抗體重鏈可變區CDR--HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含抗體重鏈可變區CDR--HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：18所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含抗體重鏈可變區CDR--HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：19所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含抗體重鏈可變區CDR--HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：21所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含抗體重鏈可變區CDR--HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：20所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，該HCDR1可包含所示的胺基酸序列，
該HCDR2可包含所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含所示的胺基酸序列，該LCDR1可包含所示的胺基酸序列，該LCDR2可包含所示的胺基酸序列，且該LCDR3可包含所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，該HCDR1可包含所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含所示的胺基酸序列，該LCDR1可包含所示的胺基酸序列，該LCDR2可包含所示的胺基酸序列，且該LCDR3可包含所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，該HCDR1可包含所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含所示的胺基酸序列，該LCDR1可包含所示的胺基酸序列，該LCDR2可包含所示的胺基酸序列，且該LCDR3可包含所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，該HCDR1可包含所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含所示的胺基酸序列，該LCDR1可包含所示的胺基酸序列，該LCDR2可包含所示的胺基酸序列，且該LCDR3可包含所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，該HCDR1可包含所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含所示的胺基酸序
列，該LCDR1可包含所示的胺基酸序列，該LCDR2可包含所示的胺基酸序列，且該LCDR3可包含所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，該HCDR1可包含所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含所示的胺基酸序列，該LCDR1可包含所示的胺基酸序列，該LCDR2可包含所示的胺基酸序列，且該LCDR3可包含所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，該HCDR1可包含所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含所示的胺基酸序列，該LCDR1可包含所示的胺基酸序列，該LCDR2可包含所示的胺基酸序列，且該LCDR3可包含所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，該HCDR1可包含所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含所示的胺基酸序列，該LCDR1可包含所示的胺基酸序列，該LCDR2可包含所示的胺基酸序列，且該LCDR3可包含所示的胺基酸序列。
例如，該VL可以包括框架區L-FR1，L-FR2，L-FR3，和L-FR4。
例如，該L-FR1的C末端可以與該LCDR1的N末端直接或間接相連，且該L-FR1可以包含SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：64中任一項所示的胺基酸序列。
例如，該L-FR2可以位於該LCDR1與該LCDR2之間，且該L-FR2可以包含SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70和SEQ ID NO：71中任一項所示的胺基酸序列。
例如，該L-FR3可以位於該LCDR2與該LCDR3之間，且該L-FR3可以包含SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：77和SEQ ID NO：78中任一項所示的胺基酸序列。
例如，該L-FR4的N末端可以與該LCDR3的C末端直接或間接相連，且該L-FR4可以包含SEQ ID NO：79和SEQ ID NO：80中任一項所示的胺基酸序列。
在本申請中，該VL可以包含SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93和SEQ ID NO：94所示的胺基酸序列。
例如，該分離的抗原結合蛋白可以包括抗體輕鏈恆定區，且該抗體輕鏈恆定區包括人Igκ恆定區或人Igλ恆定區。
在本申請中，編碼該人Igκ恆定區的基因可以如NCBI資料庫的GenBank登錄號50802所示；編碼該人Igλ恆定區的基因可以如NCBI資料庫的GenBank登錄號3535所示。
例如，該VH可以包括框架區H-FR1，H-FR2，H-FR3，和H-FR4。
例如，該H-FR1的C末端可以與該HCDR1的N末端直接或間接相連，且該H-FR1可以包含SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28中任一項所示的胺基酸序列。
例如，該H-FR2可以位於該HCDR1與該HCDR2之間，且該H-FR2可以包含SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34中任一項所示的胺基酸序列。
例如，該H-FR3可以位於該HCDR2與該HCDR3之間，且該H-FR3可以包含SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41中任一項所示的胺基酸序列。
例如，該H-FR4的N末端可以與該HCDR3的C末端直接或間接相連，且該H-FR4可以包含SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44中任一項所示的胺基酸序列。
例如，該VH可以包含SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：86和SEQ ID NO：87中任一項所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含輕鏈可變區VL和重鏈可變區VH，該VL可包含SEQ ID NO：88所示的胺基酸序列，該VH可包含SEQ ID NO：81所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含輕鏈可變區VL和重鏈可變區VH，該VL可包含SEQ ID NO：89所示的胺基酸序列，該VH可包含SEQ ID NO：82所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含輕鏈可變區VL和重鏈可變區VH，該VL可包含SEQ ID NO：90所示的胺基酸序列，該VH可包含SEQ ID NO：83所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含輕鏈可變區VL和重鏈可變區VH，該VL可包含SEQ ID NO：91所示的胺基酸序列，該VH可包含SEQ ID NO：84所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含輕鏈可變區VL和重鏈可變區VH，該VL可包含SEQ ID NO：92所示的胺基酸序列，該VH可包含SEQ ID NO：85所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含輕鏈可變區VL和重鏈可變區VH，該VL可包含SEQ ID NO：93所示的胺基酸序列，該VH可包含SEQ ID NO：87所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含輕鏈可變區VL和重鏈可變區VH，該VL可包含SEQ ID NO：94所示的胺基酸序列，該VH可包含SEQ ID NO：86所示的胺基酸序列。
本申請中係關於的蛋白質、多肽和/或胺基酸序列，還應理解為至少包含以下的範圍：與該蛋白質或多肽具備相同或類似功能的變體或同源物。
在本申請中，該變體可以為，在該蛋白質和/或該多肽(例如，本申請所述的抗原結合蛋白)的胺基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或多個胺基酸的蛋白質或多肽。例如，該功能性變體可包含已經藉由至少1個，例如1-30個、1-20個或1-10個，又例如1個、2個、3個、4個或5個胺基酸取代、缺失和/或插入而具有胺基酸改變的蛋白質或多肽。該功能性變體可基本上保持改變(例如取代、缺失或添加)之前的該蛋白質或該多肽的生物學特性。例如，該功能性變體可保持改變之前的該蛋白質或該多肽的至少60%、70%、80%、90%、或100%的生物學活性(例如抗原結合能力)。例如，該取代可以為保守取代。
在本申請中，該抗原結合蛋白的胺基酸序列的一部分可以與來自特定物種的抗體中相應的胺基酸序列同源，或者屬於特定的類別。例如，該抗原結合蛋白的可變區及恆定部分均可以來自一個動物物種(如人)的抗體的可變區及恆定區。在本申請中，該同源物可以為，與該蛋白質和/或該多肽(例如，本申請所述的抗原結合蛋白)的胺基酸序列具有至少約85%(例如，具有至少約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更高的)序列同源性的蛋白質或多肽。
在本申請中，該同源性通常是指兩個或多個序列之間的相似性、類似或關聯。可以藉由以下方式計算“序列同源性百分比”：將兩條待比對的序列在比較窗中進行比較，確定兩條序列中存在相同核酸鹼基(例如，A、T、C、G)或相同胺基酸殘基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置的數目以得到匹配位置的數目，將匹配位置的數目除以比較窗中的總位置
數(即，窗大小)，並且將結果乘以100，以產生序列同源性百分比。為了確定序列同源性百分數而進行的比對，可以按本領域已知的多種方式實現，例如，使用可公開獲得的電腦軟體如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。所屬技術領域具有通常知識者可以確定用於比對序列的適宜參數，包括為實現正在比較的全長序列範圍內或目標序列區域內最大比對所需要的任何演算法。該同源性也可以藉由以下的方法測定：FASTA和BLAST。對FASTA演算法的描述可以參見W．R．Pearson和D．J．Lipman的“用於生物學序列比較的改進的工具”，美國國家科學院院刊(Proc．Natl．Acad．Sci．)，85：2444-2448，1988；和D．J．Lipman和W．R．Pearson的“快速靈敏的蛋白質相似性搜索”，Science，227：1435-1441，1989。對BLAST演算法的描述可參見S．Altschul、W．Gish、W．Miller、E．W．Myers和D．Lipman的“一種基本的局部對比(alignment)搜索工具”，分子生物學雜誌，215：403-410，1990。
例如，該分離的抗原結合蛋白可以包括抗體重鏈恆定區，且該抗體重鏈恆定區包括人IgG恆定區。
例如，該分離的抗原結合蛋白可以包括抗體重鏈恆定區，且該抗體重鏈恆定區包括人IgG1恆定區。
在本申請中，編碼該人IgG1恆定區的基因可以如NCBI資料庫的GenBank登錄號3500所示。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可以包括抗體或其抗原結合片段。例如，本申請所述的分離的抗原結合蛋白可以包括但不限於重組抗體、單株抗體、人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、雙特異性抗體、單鏈抗體、雙抗
體、三抗體、四抗體、Fv片段、scFv片段、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段和駱駝化單結構域抗體。
人源化抗體可以選自任何種類的免疫球蛋白，包括IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在本申請中，抗體是IgG抗體，使用IgG1亞型。同樣，任一類輕鏈都可以在本文的化合物和方法中使用。例如，κ、λ鏈或其變體在本申請中是適用的。
在本申請中，該抗原結合片段可以包括Fab，Fab’，F(ab)2、Fv片段、F(ab’)2，scFv，di-scFv和/或dAb。
本申請所述的抗原結合蛋白(例如，SARS-CoV-2抗體)能夠特異性結合SARS-CoV-2的S蛋白的RBD。“特異性結合”SARS-CoV-2抗原(例如SARS-CoV-2的S蛋白的RBD)的抗原結合蛋白(例如，抗體)通常可以以約的EC50值或更高親和力(例如，約)結合SARS-CoV-2的S蛋白的RBD，但不結合缺乏SARS-CoV-2序列的其它蛋白。抗原結合蛋白(例如，抗體)是否結合SARS-CoV-2抗原(例如SARS-CoV-2的S蛋白的RBD)可使用本領域中已知的任何測定法確定。例如，藉由流式分析技術和酶聯免疫反應所檢測的。
本申請所述的抗原結合蛋白(例如，SARS-CoV-2抗體；例如單株抗體2G1)能夠特異性結合WA1/2020，Alpha，Beta，Gamma，Kappa，和Delta的S蛋白三聚體。本申請所述的抗原結合蛋白(例如，SARS-CoV-2抗體；例如單株抗體2G1)能夠對WA1/2020，Alpha，Beta，Gamma，Kappa，和Delta假病毒具有中和能力。申請所述的抗原結合蛋白(例如，SARS-CoV-2抗體；例如單株抗體2G1)能夠對ARS-CoV-2 WA1/2020(US_WA-1/2020分
離株)、Alpha(B.1.1.7/UK，菌株：SARS-CoV-2/human/USA/CA_CDC_5574/2020)、Beta(B.1.351/SA,Strain：hCoV-19/USA/MD-HP01542/2021)、Gamma(P.1/Brazil,Strain：SARS-CoV-2/human/USA/MD-MDH-0841/2021)和Delta變體(B.1.617.2/Indian，菌株：GNL-751)突變體真病毒具有中和能力。
本申請所述的抗原結合蛋白(例如，SARS-CoV-2抗體；例如單株抗體2G1)能夠治療感染SARS-CoV-2(US_WA-1/2020分離株)、Beta-(B.1.351/SA，菌株：hCoV-19/USA/MD-HP01542/2021)或Delta變體的動物模型(例如小鼠動物模型；和/或，恆河猴模型)。
本申請所述的抗原結合蛋白(例如，SARS-CoV-2抗體)能夠阻斷SARS-CoV-2的S蛋白的RBD或其功能片段與人ACE2的結合。阻斷實驗可以使用競爭法進行檢測，例如，將該抗原結合蛋白(例如，SARS-CoV-2抗體)與抗原(或，可表達抗原的細胞)和抗原的配體(或，表達配體的細胞)混合，根據可檢測標記的強度(例如，螢光強度或濃度)反應抗原結合蛋白與抗原的配體競爭性結合抗原的能力。
本申請中係關於的蛋白質和/或胺基酸序列，還應理解為至少包含以下的範圍：與該蛋白質具備相同或類似功能的變體或同源物。
在本申請中，該變體可以為，在該蛋白質(例如，本申請所述的抗原結合蛋白)的胺基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或多個胺基酸的蛋白質或多肽。例如，該功能性變體可包含已經藉由至少1個，例如1-30個、1-20個或1-10個，又例如1個、2個、3個、4個或5個胺基酸取代、缺失和/或插入而具有胺基酸改變的蛋白質或多肽。該功能性變體可基本上保持改變(例
如取代、缺失或添加)之前的該蛋白質或該多肽的生物學特性。例如，該功能性變體可保持改變之前的該蛋白質或該多肽的至少60%、70%、80%、90%、或100%的生物學活性(例如抗原結合能力)。例如，該取代可以為保守取代。
在本申請中，該抗原結合蛋白的胺基酸序列的一部分可以與來自特定物種的抗體中相應的胺基酸序列同源，或者屬於特定的類別。例如，抗體的可變區及恆定部分均可以來自一個動物物種(如人)的抗體的可變區及恆定區。在本申請中，該同源物可以為，與該蛋白質和/或該多肽(例如，本申請所述的抗原結合蛋白)的胺基酸序列具有至少約85%(例如，具有至少約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更高的)序列同源性的蛋白質或多肽。
在本申請中，該同源性通常是指兩個或多個序列之間的相似性、類似或關聯。可以藉由以下方式計算“序列同源性百分比”：將兩條待比對的序列在比較窗中進行比較，確定兩條序列中存在相同核酸鹼基(例如，A、T、C、G)或相同胺基酸殘基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置的數目以得到匹配位置的數目，將匹配位置的數目除以比較窗中的總位置數(即，窗大小)，並且將結果乘以100，以產生序列同源性百分比。為了確定序列同源性百分數而進行的比對，可以按本領域已知的多種方式實現，例如，使用可公開獲得的電腦軟體如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。所屬技術領域具有通常知識者可以確定用於比對序列的適宜參數，包括為實現正在比較的全長序列範圍內或目標序列區域內最大比對
所需要的任何演算法。該同源性也可以藉由以下的方法測定：FASTA和BLAST。對FASTA演算法的描述可以參見W．R．Pearson和D．J．Lipman的“用於生物學序列比較的改進的工具”，美國國家科學院院刊(Proc．Natl．Acad．Sci．)，85：2444-2448，1988；和D．J．Lipman和W．R．Pearson的“快速靈敏的蛋白質相似性搜索”，Science，227：1435-1441，1989。對BLAST演算法的描述可參見S．Altschul、W．Gish、W．Miller、E．W．Myers和D．Lipman的“一種基本的局部對比(alignment)搜索工具”，分子生物學雜誌，215：403-410，1990。
醫藥組成物
另一方面，本申請提供一種醫藥組成物，其可以包含本申請所述的分離的抗原結合蛋白、、本申請所述的核酸分子、本申請所述的載體和/或本申請所述的細胞，以及視需要地藥學上可接受的佐劑。
本申請所述的醫藥組成物可直接用於結合SARS-CoV-2的S蛋白，因而可用於預防和治療冠狀病毒感染相關的疾病(例如，COVID-19)。此外，還可同時使用其他治療劑。
本申請的醫藥組成物可以含有安全有效量(如0.001-99wt%)的本申請所述的抗原結合蛋白以及藥學上可接受的佐劑(可包括載體或賦形劑)。藥物製劑應與給藥方式相匹配。本申請所述的醫藥組成物可以被製成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液藉由常規方法進行製備。醫藥組成物如針劑、溶液宜在無菌條件下製造。活性成分的給藥量是治療有效量。此外，本申請所述的抗原結合蛋白還可與其他治療劑一起使用。
本文所述的抗原結合蛋白或醫藥組成物可以符合良好醫療實踐的方式配製、給藥和施用。在此情形下的考慮因素包括所治療的特定病症、所治療的特定哺乳動物、單個患者的臨床病狀、病症的病因、藥劑遞送部位、施用方法和醫學從業者已知的其他因素。治療劑(例如，本申請所述的抗原結合蛋白和/或所述的醫藥組成物)無需但視需要地與一種或多種當前用來預防或治療所考慮的病症的藥劑一起配製和/或同時施用。此類其他藥劑的有效量取決於製劑中存在的治療劑(例如，本申請所述的抗原結合蛋白和/或所述的醫藥組成物)的量、病症或治療的類型以及以上論述的其他因素。這些藥劑通常可以憑經驗/臨床上確定為適當的任何劑量且藉由憑經驗/臨床上確定為適當的任何途徑加以使用。與單個治療相比，可減少組合治療中施用的抗體的劑量。藉由常規技術易於監測此療法的進展。
用途
另一方面，本申請提供一種本申請所述的分離的抗原結合蛋白、本申請所述的核酸分子、本申請所述的載體、本申請所述的細胞和/或本申請所述的醫藥組成物在製備藥物中的用途，該藥物用於預防、緩解和/或治療冠狀病毒的感染。
本申請提供一種預防、緩解和/或治療冠狀病毒的感染的方法，其包括向有需要的受試者施用本申請所述的分離的抗原結合蛋白、本申請所述的核酸分子、本申請所述的載體、本申請所述的細胞和/或本申請所述的醫藥組成物。
本申請提供了分離的抗原結合蛋白、本申請所述的核酸分子、本申請所述的載體、本申請所述的細胞和/或本申請所述的醫藥組成物，其可以預防、緩解和/或治療冠狀病毒的感染。
在本申請中，該冠狀病毒的感染可以包括COVID-19。
在本申請中，施用本申請所述的分離的抗原結合蛋白、本申請所述的核酸分子、本申請所述的載體、本申請所述的細胞和/或本申請所述的醫藥組成物可以對COVID-19的假病毒(例如對WA1/2020、Alpha、Beta、Gamma、Kappa、和Delta的S蛋白三聚體(Spike trimer)製備的假病毒)具有有效的中和能力。
在本申請中，施用本申請所述的分離的抗原結合蛋白、本申請所述的核酸分子、本申請所述的載體、本申請所述的細胞和/或本申請所述的醫藥組成物可以對COVID-19的不同毒株(例如SARS-CoV-2 WA1/2020(US_WA-1/2020分離株)、Alpha(B.1.1.7/UK，菌株：SARS-CoV-2/human/USA/CA_CDC_5574/2020)、Beta(B.1.351/SA,Strain：hCoV-19/USA/MD-HP01542/2021)、Gamma(P.1/Brazil,Strain：SARS-CoV-2/human/USA/MD-MDH-0841/2021)和Delta變體(B.1.617.2/Indian，菌株：GNL-751))具有有效的中和能力。
在本申請中，施用本申請所述的分離的抗原結合蛋白、本申請所述的核酸分子、本申請所述的載體、本申請所述的細胞和/或本申請所述的醫藥組成物可以對已感染COVID-19的不同毒株(例如SARS-CoV-2 WA1/2020(US_WA-1/2020分離株)、Alpha(B.1.1.7/UK，菌株：SARS-CoV-2/human/USA/CA_CDC_5574/2020)、Beta(B.1.351/SA,Strain：hCoV-
19/USA/MD-HP01542/2021)、Gamma(P.1/Brazil,Strain：SARS-CoV-2/human/USA/MD-MDH-0841/2021)和Delta變體(B.1.617.2/Indian，菌株：GNL-751))的動物模型(例如小鼠模型、恆河猴模型)具有良好的治療效果。
另一方面，本申請提供一種檢測SARS-CoV-2的方法，其包括以下的步驟，施用本申請所述的分離的抗原結合蛋白、本申請所述的核酸分子、本申請所述的載體、本申請所述的細胞和/或本申請所述的醫藥組成物。在本申請中，該分離的抗原結合蛋白、本申請所述的核酸分子、本申請所述的載體、本申請所述的細胞和/或本申請所述的醫藥組成物能夠特異性地和/或高親和力地結合SARS-CoV-2，例如結合菌株WA1/2020，Alpha，Beta，Gamma，Kappa，和Delta的S蛋白三聚體(Spike trimer)。
本申請的抗原結合蛋白可用於檢測應用，例如用於檢測樣本，從而提供診斷資訊。例如，本申請所述的抗體和/或方法，可以用於對受試者(例如疑似被SARS-CoV-2感染，或已經被SARS-CoV-2感染的患者)的標本(例如，咽拭子檢測樣品，例如血清、全血、痰液、口腔/鼻咽分泌物或洗液、尿液、糞便、胸腹腔積液、腦脊液和組織標本)進行檢測，作為療效觀察的指標及是否具有傳染性和是否需要隔離的指標。例如，本申請碩的抗體和/或方法，可以為治療性干預提供監測方案。
在本申請中，所採用的樣本(樣品)包括細胞、組織樣本和活檢標本。本申請使用的術語“活檢”應包括所屬技術領域具有通常知識者已知的所有種類的活檢。因此本申請中使用的活檢可以包括例如藉由內窺鏡方法或器
官的穿刺或針刺活檢製備的組織樣本。例如，該樣本可以包括固定的或保存的細胞或組織樣本。
本申請還提供了一種指含有本申請的抗原結合蛋白的試劑盒。在某些情形中，該試劑盒還可以包括容器、使用說明書、緩衝劑等。例如，本申請的原結合蛋白可以固定於檢測板。
不欲被任何理論所限，下文中的實施例僅僅是為了闡釋本申請的分離的抗原結合蛋白、製備方法和用途等，而不用於限制本申請發明的範圍。
實施例
實施例1候選抗體的製備
從COVID-19康復患者外周血中，流式細胞術分離獲得可以識別SARS-CoV-2 RBD的記憶B細胞，對這些分離的記憶B細胞進行單個B細胞分選。藉由單細胞PCR的方法，選殖獲得抗體V區基因，重構IgG型抗體。
所得的候選抗體包含如表1所示的胺基酸序列：
表1
實施例2候選抗體結合SARS-CoV-2 S三聚體蛋白的親和力測定
實驗前一天，向包被緩衝液(pH 9.6，0.05M碳酸鹽緩衝液)，加入抗原SARS-CoV-2 Spike trimer蛋白(即S蛋白三聚體)至終濃度為2μg/mL。每孔加入100μL，輕微震盪至每孔液體均勻鋪在底部。將含有抗原的酶標板，置入密封袋中，密封放入4℃冰箱抗原吸附過夜；
次日，棄上清，於乾淨吸水紙上拍乾，加入250μL/孔洗滌液(pH 7.4 PBST)，每次保持5min，棄上清於乾淨吸水紙上拍乾，重複3次。加入250μL/孔封閉液(PBST+3%脫脂奶粉)，置入新的封口袋中，37℃封閉1h。棄上清，於乾淨吸水紙上拍乾，250μL/孔洗滌液洗滌，每次保持5min，棄上清於乾淨吸水紙上拍乾，重複3次。
使用抗體稀釋液(pH7.4 PBS)將實施例1製備的候選抗體進行梯度稀釋。
以100μL/孔吸取稀釋後的候選抗體樣品加入處理完成的酶標板中，置入新的封口袋中，37℃孵育1h。棄上清，於乾淨吸水紙上拍乾，250μL/孔洗滌液洗滌，每次保持5min，棄上清於乾淨吸水紙上拍乾，重複3次。按照100μL/孔，加入1：5000稀釋的anti-human IgG HRP二抗，置入新的封口袋中，37℃孵育1h。棄上清，於乾淨吸水紙上拍乾，250μL/孔洗滌液洗滌，每次保持5min，棄上清於乾淨吸水紙上拍乾，重複3次。以100μL/孔加入TMB顯色液，錫紙包裹避光室溫顯色15min，觀察藍色反應，以50μL/孔
加入終止液(2M H2SO4)，混勻後立即酶標儀450nm讀數。其中對照為人ACE2-Fc融合蛋白(其包含如SEQ ID NO：100所示的胺基酸序列)。
結果如圖1和表2所示。結果可知候選抗體均對S三聚體蛋白有較高的親和力。
表2
實施例3候選抗體假SARS-CoV-2病毒的中和活性測定
實驗前一天，將待感染HEK293T-ACE2細胞接種於96孔細胞培養板中，接種量約為1×104個細胞/孔，5% CO2培養箱37℃培養過夜。第二日，待細胞密度在30%左右時進行病毒感染，取出凍存的假病毒置於冰上融化或4℃條件下待其完全融化後，病毒使用量為0.25μL/孔，分別於不同稀釋濃度的實施例1製備的候選抗體混合37℃孵育30min，將混合物加入細胞培養體系中感染目的細胞。病毒感染後6h後，吸去上清液，加入100μL完全培養基繼續培養48小時。細胞感染假病毒換液後48h，藉由螢光顯微鏡觀察綠色螢光蛋白表達和檢測螢光素酶的活性判定感染效率。向每孔中加入100μL的One-Glo螢光素酶，震盪混勻，3min後酶標儀讀數。
結果如圖2和表3所示。結果可知候選抗體均對假SARS-CoV-2病毒具有良好的中和活性，能夠有效抑制SARS-CoV-2病毒的繼續擴增。其中對照為人ACE2-Fc融合蛋白(其包含如SEQ ID NO：100所示的胺基酸序列)。
表3
實施例4候選抗體真SARS-CoV-2病毒的中和活性測定
實驗前一天，將待感染Vero-E6細胞接種於細胞培養板中，培養過夜。第二日，進行病毒感染，取出凍存的病毒融化後，分別於不同稀釋濃度的候選抗體混合孵育，將混合物加入細胞培養體系中感染目的細胞。病毒感染後，吸去上清液，加入完全培養基繼續培養。3到5天觀察細胞病變，判斷中和活性。
具體的步驟如下，以下實驗操作均在BSL-3實驗室內完成：
(1)樣品用MEM培養基(含1%雙抗)配製成200μg/ml的溶液，然後10倍系列稀釋，200μg/ml、20μg/ml、2μg/ml、0.2μg/ml、0.02μg/ml、0.002μg/ml共6個稀釋度，每個濃度2個複孔，每孔50μl，然後每孔再加入等體積100 TCID50病毒，37℃，5% CO2孵箱作用1.5h；
(2)1.5h後，96孔培養板中加入細胞培養液，每孔加入100μl濃度為1×105個細胞/mL Vero細胞懸液；
(3)同時設立細胞對照及病毒回滴對照；
細胞對照：每孔100μL MEM培養基(含1%雙抗)加入100μL的Vero細胞懸液到96孔培養板中，共4個複孔；
病毒回滴對照：將100 TCID50病毒用MEM培養基(含1%雙抗)連續10倍稀釋3次，得到10 TCID50，1 TCID50，0.1 TCID50。96孔培養板中每孔加入50μL MEM培養基(含1%雙抗)，然後每孔再加入等體積100 TCID50，10 TCID50，1 TCID50，0.1 TCID50病毒，每個稀釋度4個複孔，37℃，5% CO2孵箱作用1.5h，1.5h後，每孔加入100μL濃度為1×105個細胞/mL Vero細胞懸液。病毒回滴對照結果在32-320TCID50/50μl範圍內，實驗有效。
(4)細胞37℃，5% CO2孵箱孵育3-5天；
(5)光學顯微鏡下觀察細胞病變(CPE)，細胞有CPE變化記為“+”，細胞無CPE變化或正常細胞形態記為“-”。
抑制效果計算：抑制病毒半數有效濃度(EC50)
表4
表4的結果說明，上述抗體對SARS-CoV-2真病毒均可實現有效中和。SARS-CoV-2真病毒的中和IC50結果為，9E12為0.03μg/mL，9D11為0.3μg/mL，5B2為0.3μg/mL，13A12為0.03μg/mL，2G1為0.003μg/mL，3A4為0.03μg/mL，10D4為0.03μg/mL，9A6為3.16μg/mL，8G9為31.6μg/mL。上述抗體均實現了對SARS-CoV-2病毒的中和作用。
由此可見候選抗體均對真SARS-CoV-2病毒具有良好的中和活性，能夠有效抑制SARS-CoV-2病毒的繼續擴增。
實施例5候選抗體在動物體內的SARS-CoV-2病毒的中和活性測定
將實施例1製備的候選抗體施用於感染了SARS-CoV-2病毒的動物模型。藉由定量PCR檢測病毒含量的方法測定施用後該候選抗體對SARS-CoV-2病毒的中和活性。結果發現，候選抗體均對動物體內的候選抗體均對具有良好的中和活性。
實施例6候選抗體對SARS-CoV-2結合動力學檢測
採用CM5晶片(Cytiva 29149603)使用WA-1 S1-His或者S蛋白三聚體(Spike trimer)作為抗原，檢測單株抗體的結合動力學性質。
一、抗原偶聯
緩衝液：PBS(Cytiva BR100672)
流速：10μL/min
抗原稀釋液：Acetate pH 5.0(Cytiva BR100351)
抗原濃度：1μg/mL
胺基偶聯試劑盒(Cytiva BR100050)：活化劑EDC+NHS 1：1混合，封閉劑乙醇胺
將晶片活化700s，將稀釋後的抗原偶聯至約70 RU水準，封閉多餘未反應位點。
二、抗體結合
緩衝液：HBS-EP(Cytiva BR100669)
流速：30μL/min
抗體濃度：0.2μg/mL 2倍稀釋至0.0125μg/mL
再生緩衝液：Glycine pH 1.5(Cytiva BR100354)
根據設置好的濃度排布，將稀釋後的每種濃度的抗體分別加入對應的96孔板孔中，以結合120s，解離120s，再生沖提30s為一個迴圈，從低濃度到高濃度依次上樣。
親和力結果如表5所示，IgG型單抗均可以高效與S蛋白三聚體結合，親和力達到-10至-15M。
表5
實施例7候選抗體對Spike蛋白的親和力研究
為避免“舞蹈效應”的影響，單株抗體2G1經過木瓜蛋白酶酶解後獲得Fab片段，檢測單價Fab與WA1/2020，Alpha，Beta，Gamma，Kappa，和Delta的S蛋白三聚體(Spike trimer)的結合動力學。
採用CM5晶片(Cytiva 29149603)使用WA1/2020、Alpha、Beta、Gamma、Kappa、和Delta的S蛋白三聚體作為抗原，檢測單株抗體的結合動力學性質。
一、抗原偶聯
緩衝液：PBS(Cytiva BR100672)
流速：10μL/min
抗原稀釋液：Acetate pH 5.0(Cytiva BR100351)
抗原濃度：1μg/mL
胺基偶聯試劑盒(Cytiva BR100050)：活化劑EDC+NHS 1：1混合，封閉劑乙醇胺
將晶片活化700s，將稀釋後的抗原偶聯至約70 RU水準，封閉多餘未反應位點。
二、抗體結合
緩衝液：HBS-EP(Cytiva BR100669)
流速：30μL/min
抗體濃度：0.2μg/mL 2倍稀釋至0.0125μg/mL
再生緩衝液：Glycine pH 1.5(Cytiva BR100354)
根據設置好的濃度排布，將稀釋後的每種濃度的抗體分別加入對應的96孔板孔中，以結合120s，解離120s，再生沖提30s為一個迴圈，從低濃度到高濃度依次上樣。
結果如表6所示。
表6
實施例8候選抗體對假病毒的中和能力檢測
假病毒含有SARS-CoV-2表面Spike蛋白，可特異性侵染ACE2陽性的細胞，選擇WA1/2020、D614G、Cluster 5、Alpha、Beta、Gamma和Delta的Spike蛋白製備的假病毒，根據以下步驟進行假病毒中和測活實驗。
1.將處於對數生長期的ACE2-293T細胞以1×104/孔鋪板到白色透底96孔板(Corning，3903)中；
2.第二天，用DMEM培養基(Gibco，C11995500BT)+10% FBS(Gibco，10270-106)稀釋不同濃度的中和抗體(20、2、0.2、0.02、
0.002、0.0002、0.00002μg/mL)；並在P2實驗室中稀釋適量體積的0.2μL/100μL的COV2-S蛋白假病毒(Yeasen，11903ES50)。
3.分別吸取55μL不同濃度的抗體和55μL稀釋的假病毒混勻，並設置陰性對照和陽性對照孔，37℃孵育30min；
4.吸去96孔板中的培養基，加入100μL含有相應抗體-病毒混合液的培養基，在CO2培養箱中繼續培養；
5.6h後，將含有病毒的培養基吸入含有84消毒液的廢液缸中，84消毒液的比例不少於30%。然後加入100μL新鮮培養基，繼續在CO2培養箱中培養48h；
6.用封口膜在生物安全櫃中將96孔板密封，並用75%酒精消毒96孔板外表面，然後取出，向每孔中加入90μL螢光素酶受質(Promega，E6120)，孵育3-5min後使用酶標儀讀取各孔的螢光值。
7.根據螢光值計算各濃度下的抑制率。
結果如圖3所示，圖3的結果說明，單株抗體2G1可以有效中和各種假病毒。中和IC50為WA1/2020 0.0032μg/ml，D614G 0.0038μg/ml，Cluster 5 0.0002μg/ml，Alpha 0.0013μg/ml，Beta 0.0028μg/ml，Gamma 0.0005μg/mL，Delta 0.0082μg/ml。
實施例9候選抗體對真病毒的中和能力檢測
2G1對突變株真病毒中和能力的研究。
使用SARS-CoV-2 WA1/2020(US_WA-1/2020分離株)、Alpha(B.1.1.7/UK，菌株：SARS-CoV-2/human/USA/CA_CDC_5574/2020)、Beta
(B.1.351/SA,Strain：hCoV-19/USA/MD-HP01542/2021)、Gamma(P.1/Brazil,Strain：SARS-CoV-2/human/USA/MD-MDH-0841/2021)和Delta變體(B.1.617.2/Indian，菌株：GNL-751)突變體真病毒，進行病毒中和實驗。簡要方法包括：抗體在MEM培養基(Gibco)中以20μg/mL的濃度連續稀釋3倍，以製備工作溶液。將稀釋液加入等體積的100 TCID50病毒中，並在室溫下孵育1小時。將混合物加入具有匯合的Vero細胞的96孔板中。同時設置細胞空白對照和病毒感染對照。37℃、5% CO2培養3天後，顯微鏡下觀察細胞病變效應(CPE)，計數菌斑進行療效評價。具有CPE變化的孔記錄為“+”，否則記錄為“-”。
根據以下等式計算IC50值：IC50=Antilog(D-C×(50-B)/(A-B))。其中A表示大於50%的抑制率，B表示小於50%的抑制率，C為lg(稀釋因子)，D為lg(抑制率小於50%時的樣品濃度)。所有實驗均在生物安全3級實驗室進行。如表7所示，2G1對WA1/2020，Alpha，Beta，Gamma，Delta均具有高效的病毒中和能力。
表7
實施例10候選抗體的體內生物學活性研究
10.1 小鼠模型
AC70是人ACE2轉基因小鼠(Taconic Biosciences，Cat #18222)，將AC70小鼠分為三組，對照組(PBS)、低劑量(2.2mg/mL單株抗體2G1)中劑量組(6.7mg/mL單株抗體2G1)和高劑量(20mg/kg單株抗體2G1)，每組14隻小鼠。所有小鼠均用100 LD50的進行感染。感染後4小時給予第一劑單株抗體2G1和PBS；第二個和第三個分別在感染後第2天和第4天給藥。每天至少對小鼠進行一次臨床觀察，並根據臨床健康狀況的描述。按1至4的等級評分，在標準化的1到4級評分系統中，1分是健康；2分是有豎起的皮毛和昏昏欲睡；3分是有額外的臨床症狀，如駝背姿勢、眼眶收緊、呼吸頻率增加和/或體重減輕>15%；4分是表示呼吸困難和/或紫紺、受刺激時不願移動，或體重減輕
20%需要立即安樂死。每組中的四隻小鼠在感染後第4天被安樂死以評估病毒載量和肺和腦的組織病理學。在感染後長達14天，繼續監測其餘小鼠的發病率和活動力。
小鼠感染模型的構建方法參見圖4。
檢測感染後小鼠的體重，結果如圖5所示。圖5的結果說明，對於WA1/2020和Beta感染的小鼠，高中低三種劑量均無明顯的體重降低，說明即使2.2mg/mL低劑量的單株抗體2G1足以中和病毒。Delta感染組，20mg/kg高劑量組動物體重無明顯降低，6.7mg/kg劑量和2.2mg/kg劑量出現體重降低現象。
觀察並對WA1/2020、Beta和Delta小鼠感染模型進行臨床評分，結果如圖6所示。圖6的結果說明，即使2.2mg/kg的低劑量的單株抗體
2G1，WA1/2020、Beta模型也沒有明顯的臨床病症。而落在Delta模型中，20mg/kg高劑量下無臨床病症出現，中低劑量出現臨床反應。
根據小鼠安樂死原則，發生呼吸困難和/或紫紺、受刺激時不願移動，或體重減輕
20%需要立即安樂死，認為小鼠死亡，繪製生存曲線。觀察並繪製WA1/2020、Beta和Delta小鼠感染模型的生存曲線，結果如圖7所示。圖7的結果說明，在WA1/2020和Beta感染模型中，高中低劑量均可以治療小鼠不出現死亡，小鼠存活率達到100%，均可恢復健康狀態。在Delta感染模型中，低劑量小鼠生存率為10%小鼠恢復至健康狀態，中劑量55.6%的小鼠可以存活恢復至健康狀態，高劑量組100%小鼠存活可恢復至健康狀態。
10.2 恆河猴模型
6-7歲恆河猴隨機分為對照組，低劑量(10mg/kg)和高劑量(50mg/kg)組，每組一隻雄性和一隻雌性。每隻動物用4mL 1×105 TCID50病毒藉由氣管插管感染動物。感染後24小時靜脈內給予抗體2G1抗體和PBS。持續監測恆河猴的疾病相關變化，每天測量體重和體溫，採集咽拭子和肛門拭子樣本進行病毒滴定。恆河猴感染模型的構建方法參見圖8。
在感染後第7天，將動物安樂死並收集組織樣本。使用QIAamp Viral RNA Mini Kit(Qiagen)提取病毒RNA。根據供應商的說明(HiScript® II One Step qRT-PCR SYBR® Green Kit，Vazyme Biotech Co.,Ltd)使用一步即時定量PCR以及RBD基因的引子對病毒RNA進行定量，使用定量引子為：RBD-qF1：5'-CAATGGTTAAGGCAGG-3'(SEQ ID NO.101)；RBD-qR1：5'-CTCAAGGTCTGGATCACG-3'(SEQ ID NO.102)。
咽拭子檢測恆河猴感染模型中的病毒RNA的含量，結果如圖9所示。圖9的結果說明，對照組動物病毒RNA載量僅在攻毒後第3、4和5天被檢測出，病毒RNA載量範圍處於10e3-10e7拷貝/mL之間，病毒複製高峰期在攻毒後第2天，略有波動。總體來看，病毒載量變化規律顯示病毒在體內的增殖過程。高劑量組2隻實驗動物病毒RNA載量一直處於下降的趨勢，從10e6拷貝/mL降至10e3拷貝/mL分別在攻毒後第3和第4天降至檢測閾值以下檢測不到病毒，低劑量組2隻實驗動物病毒RNA載量一直處於下降的趨勢，從10e6拷貝/mL降至10e3拷貝/mL，並在攻毒後第4天降至檢測閾值以下，檢測不到病毒。
肛拭子檢測恆河猴模型中的病毒RNA的含量，結果如圖10所示。圖10的結果說明，對照組的動物在第4、5和7天可以檢測出病毒RNA在10e3-10e5拷貝/mL之間，而高劑量和低劑量均沒有檢測出病毒。
為了進一步瞭解病毒在上呼吸道和肺部不同組織中的分佈，於攻毒後第7天採集了對照組和低、高劑量組動物氣管、支氣管、肺部不同部位的組織，測定了不同器官和組織中的病毒載量。結果如11所示，圖11的結果表明：在感染後第7天，在對照組動物的氣管和左右支氣管中都檢測到約1×10e5~1×10e7拷貝/g的病毒RNA。在高劑量組右中肺，左中肺，左下肺和左側支氣管可以檢測到病毒，低劑量組僅在氣管中發現病毒。
實施例11候選抗體的體內生物學活性研究
為了分析Spike(S)蛋白與2G1抗體的抗原抗體相互作用模式及結合位元點，使用冷凍電鏡單顆粒重構技術解析出新型冠狀病毒(SARS-
CoV-2)WA-1毒株三聚體S蛋白胞外區與2G1抗體複合物的三維結構，並確認在S蛋白上抗體結合的位點。
試驗過程
1.三聚體S蛋白的表達與純化
1.1 三聚體S蛋白重組表達質粒的構建
使用一種改造過的S蛋白以提高此蛋白的穩定性，具體方案是：在S蛋白胞外區(1-1208位胺基酸，Genbank ID：QHD43416.1)的817位、892位、899位、942位、986位和987位引入脯胺酸突變；同時突變682到685位的furin酶切位點“RRAR”為“GSAS”；在S蛋白胞外區的C端融合T4 fibritin foldon輔助S蛋白胞外區形成三聚體；最後在C末端帶1xFlag標籤選殖到pCAG載體中。
1.2 S蛋白的表達純化
使用HEK 293F細胞暫態轉染重組表達質粒來分泌表達S蛋白。當懸浮培養的HEK 293F細胞密度達到2.0×106/mL時進行轉染。在1L HEK 293F細胞中，使用1mg S質粒與3mg PEI 4000混合孵育15min後加入到細胞當中，繼續培養60h後收集細胞上清液用於純化。
把轉染得到的上清液過濾，使用緩衝液(25mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH8.0)進行濃縮置換去除細胞培養基。使用Anti-Fag M2樹脂進行純化，緩衝液(25mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH8.0)60mL洗去雜蛋白，然後用1×Flag peptide進行沖提。沖提液濃縮到2mL，使用分子篩層析管柱(Superose 6 Increase 10/300GL，GE公司)進一步純化得到三聚體S蛋白。
把所得S蛋白與2G1抗體以莫耳比1：5共同孵育1h後，濃縮後使用分子篩管柱層析進一步純化，去除過量的2G1抗體，得到S-2G1複合物用於冷凍電鏡樣品的製備。
2.冷凍樣品的製備、資料收集以及單顆粒法三維重構
S-2G1複合物濃縮至2.5mg/mL，滴加3.3μL到經過親水化處理的載網(Quantifoil Au R1.2/1.3)上，使用Vitrobot(Mark IV,Thermo Scientific)製樣機器人，經歷樣品吸附、多餘樣品的吸去和樣品液態乙烷中速凍等三個步驟製備冷凍電鏡樣品。
使用Titan Krios(FEI)300kV電鏡配備Gatan K3相機進行資料收集。將製作好的冷凍電鏡樣品轉移進電鏡鏡筒中，調試電鏡至最佳狀態，使用AutoEmation軟體自動採集Movie stacks資料。設置離焦範圍1.2μm-2.2μm，K3相機放大倍數81000倍，對應pixel size為1.087Å，收集的每張圖片有32幀，每幀曝光0.08s，總曝光時間2.56s。拍照總電子劑量約為50e-/Å。
使用MotionCor2對收集到的原始圖片進行漂移校正，之後對校正過的照片進行人工篩選，手動選擇均勻清晰的電鏡照片，去除品質不好或污染嚴重的圖片。利用Relion 3.0.6自動挑選S蛋白和2G1複合物的顆粒。對所有顆粒進行二維分類後，選擇匹配的顆粒進行三維模型重構。首先藉由cryoSPARC進行兩輪的三維分類，再選擇適合的顆粒進行3D重塑，之後再利用Relion進行修正，得到S蛋白和2G1複合物的三維模型。為了進一步提高S蛋白和2G1的相互作用介面的解析度，針對這一局部區域進行模型較正和優化，得到了RBD和2G1部分的三維模型。使用黃金標準的傅裡葉殼層關聯函數曲線來判定解析度，判定的閾值設置為0.143。複合物純化、資料收集以及
單顆粒法三維重構的詳細過程以及各項參數見圖12、圖13和圖14。其中圖12a顯示，分子篩層析純化2G1與S蛋白複合物；圖12b顯示，S-2G1複合物最終3D模型的EμLer angle分佈；圖12c及圖12d顯示，S-2G1複合體整體結構(c)和局部RBD-2G1結構(d)的局部解析度；圖12e顯示，S-2G1(藍色)和RBD-2G1(橙色)複合物解析度的FSC曲線圖；圖12f、12g顯示，優化後的S-2G1複合物模型FSC曲線。圖13a顯示S-2G1複合物代表性的冷凍電鏡micrograph以及2D分類，2D分類中尺規為10nm；圖13b顯示資料處理步驟。
G、RBD-2G1複合體精修模型的FSC曲線與f相同。
為了搭建SARS-CoV-2的S蛋白與2G1複合物的原子模型，以4A8(PDB ID：7C2L)為範本，以分子動力學柔性匹配把對應的原子模型疊合到上一步單顆粒重構方法得到的整體S-2G1和局部RBD-2G1的冷凍電鏡密度檔當中。首先以抗體4A8為範本，得到2G1了Chainsaw模型；以局部優化的RBD-2G1密度檔為標準，使用Coot軟體進一步對原子模型做手動調整，原則是使每個胺基酸殘基的化學特徵複合柱圍的密度雲；最後使用Phenix軟體優化整個原子模型，使用二級結構和幾何約束進行校正，防止過度擬合。資料收集、3D模型重構和原子模型搭建的詳細資料見圖14。
試驗結果
為了研究2G1抗體與S蛋白的結合模式，揭示2G1抗體的表位，使用冷凍電鏡的方法解析了S-2G1複合物2.7Å解析度結構(圖15a、圖15及圖16)。圖15a為正交方向顯示的S-2G1複合物的冷凍電鏡密度圖。2G1的重鏈和輕鏈分別為藍色和青色。三聚體S蛋白的每個單體結構分別為灰色、橙色和粉紅色。圖15b-e顯示2G1和RBD以及相鄰RBD'之間的相互作用。
RBD和2G1主要藉由疏水相互作用(圖15c和圖15d)。2G1重鏈(CDRH3和CDRH1)位於相鄰的RBD'(圖15e)上方。
圖16a分別用不同的顏色顯示三種類似抗體(S2E12、B1-182.1和REGN10933)的表位邊界，S2E12、B1-182.1和REGN10933的表位分別為紅色、橙色和綠色。圖16b顯示2G1、S2E12、B1-182.1和REGN10933結合角度比較。2G1表位邊界為藍色。ACE2結合位點、2G1、S2E12、B1-182.1和REGN10933的表位邊界疊合到RBD上，分別用黑色、藍色、紅色、橙色和綠色顯示。以2G1抗體Fab中心點與RBD中心的連線為中心軸，S2E12、B1-182.1與中心軸的角度約為6°，REGN10933與主軸的角度約為13°。圖16c顯示2G1、ACE2、S2E12、B1-182.1和REGN10933在RBD上表位的胺基酸位置統計。
然而在此整體結構中，位於RBD和2G1相互作用介面的結構密度不清晰，因此採用局部優化的計算方法解析出2G1抗體與RBD結合域的亞複合物3.2Å解析度結構，為準確分析2G1與RBD的相互作用提供結構基礎(圖15b)。在S-2G1複合物結構中，三個可溶的2G1抗體Fab區分別結合到三聚體S刺突蛋白的三個RBD結構域上面。同時此結構中，所有RBD處於“向下”構象，三聚體S蛋白整體處於一種鎖定的構象(圖15a)。除此之外，還發現在S蛋白中存在一個額外密度為脂肪酸亞油酸(LA)，這與文獻報導的鎖定構象S三聚體結構中LA的結合口袋位置一致。
藉由對2G1和RBD結合介面的詳細分析，發現抗體2G1結合在RBD尖端的loop區，此區域與ACE2受體結合位元點存在部分重疊，並且不屬於VOCs的突變熱點區。2G1的重鏈主要藉由CDRH1(胺基酸殘基30至35
位)、CDRH2(胺基酸殘基50至65位)和CDRH3(胺基酸殘基98至111位)三個互補決定區(CDR)參與RBD的相互作用；輕鏈主要藉由CDRL1(胺基酸殘基23至36位)和CDRL3(胺基酸殘基91至100位)兩個CDR區參與相互作用(圖15b至圖15e)。RBD和2G1之間結合介面主要由廣泛疏水相互作用網路穩定，其中比較重要的相互作用有：RBD頂部loop區的Phe486與重鏈上的Tyr33、Tyr52和輕鏈上的Tyr34、Tyr93、Trp99藉由疏水和/或-相互作用結合(圖15c)。2G1重鏈的CDRH1和CDRH3處於相鄰RBD’中LA結合口袋的正上方(圖15b和15e)。把2G1與具有相似表位的三種抗體(S2E12、B1-182.1和REGN10933)進行比較(圖16a-c)。結構比較分析表明，2G1的抗體表位與這三種抗體(S2E12、B1-182.1和REGN10933)有部分重疊，但它們具有不同的結合方向(圖16b)。此外，2G1具有相對較窄的結合表位(F456、A475、G476、S477、T478、E484、G485、F486、N487、Y489)，這種較窄的表位元可能具有不易被病毒突變所影響的優點，從而實現廣譜的病毒中和能力(圖16c)。
藉由解析了S蛋白與2G1的複合物冷凍電鏡結構，揭示出2G1能夠結合鎖定構象的S蛋白，在此結構中位於S三聚體的每個單體中RBD結構域都處於一種“向下”的構象。目前未發現結構資料庫中有其他抗體可以結合這種鎖定的構象。儘管2G1、S2E12和B1-182.1的表位比較相似，並且有部分重疊，但根據報導S2E12和B1-182.1在結構中與“向上”構象的RBD結合，而2G1能夠結合鎖定構象的S蛋白，這可能是由於2G1抗體結合的角度特殊導致的。在目前研究階段，可以推測2G1產生中和活性的原因不僅是阻斷ACE2與RBD的結合，也可能是藉由與鎖定構象的S蛋白結合阻止融合狀態的
S發生構象的變化。此外，位於RBD尖端特定位置的2G1抗體表位的胺基酸偏離了VOCs的突變熱點，可能增加此抗體的廣譜中和活性。因此，S-2G1的複合結構可能為開發疫苗和優化最佳聯合療法提供良好的參考。
以上詳細描述了本申請的實施方式，但是，本申請並不限於上述實施方式中的具體細節，在本申請的技術構思範圍內，可以對本申請的技術方案進行多種簡單變型，這些簡單變型均屬於本申請的保護範圍。另外需要說明的是，在上述實施方式中所描述的各個具體技術特徵，在不矛盾的情況下，可以藉由任何合適的方式進行組合，為了避免不必要的重複，本申請對各種可能的組合方式不再另行說明。此外，本申請的各種不同的實施方式之間也可以進行任意組合，只要其不違背本申請的思想，其同樣應當視為本申請所公開的內容。
Claims (41)
- 一種特異性結合SARS-CoV-2的分離的抗原結合蛋白，其包含輕鏈可變區VL中的至少一個CDR，其中該CDR包含SEQ ID NO：95所示的胺基酸序列。
- 如請求項1所述的分離的抗原結合蛋白，其中該VL包含LCDR1，該LCDR1包含SEQ ID NO：95所示的胺基酸序列。
- 如請求項1或2所述的分離的抗原結合蛋白，其中該VL包含LCDR1，該LCDR1包含SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：50中任一項所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至3中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該VL包含LCDR2，該LCDR2包含SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：54中任一項所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至4中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該VL包含LCDR3，該LCDR3包含SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：61中任一項所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至5中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該VL包含LCDR1和LCDR2，該LCDR1包含SEQ ID NO：95所示的胺基酸序列，該LCDR2包含SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：54中任一項所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至6中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該VL包含LCDR1和LCDR3，該LCDR1包含SEQ ID NO：95所示的胺基酸序 列，該LCDR3包含SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：61中任一項所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至7中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，該LCDR1包含SEQ ID NO：95所示的胺基酸序列，該LCDR2包含SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：54中任一項所示的胺基酸序列；該LCDR3包含SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：61中任一項所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至8中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該VL包括框架區L-FR1，L-FR2，L-FR3和L-FR4，其中該L-FR1的C末端與該LCDR1的N末端直接或間接相連，且該L-FR1包含SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：64中任一項所示的胺基酸序列。
- 如請求項9所述的分離的抗原結合蛋白，其中該L-FR2位於該LCDR1與該LCDR2之間，且該L-FR2包含SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70和SEQ ID NO：71中任一項所示的胺基酸序列。
- 如請求項9或10所述的分離的抗原結合蛋白，其中該L-FR3位於該LCDR2與該LCDR3之間，且該L-FR3包含SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：77和SEQ ID NO：78中任一項所示的胺基酸序列。
- 如請求項9至11中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中 該L-FR4的N末端與該LCDR3的C末端直接或間接相連，且該L-FR4包含SEQ ID NO：79和SEQ ID NO：80中任一項所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至12中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該VL包含SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93和SEQ ID NO：94中任一項所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至13中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其包括抗體輕鏈恆定區。
- 如請求項1至14中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其包含重鏈可變區VH，該VH包含HCDR1，該HCDR1包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7中任一項所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至15中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其包含重鏈可變區VH，該VH包含HCDR2，該HCDR2包含SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14中任一項所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至16中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其包含重鏈可變區VH，該VH包含HCDR3，該HCDR3包含SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21中任一項所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至17中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其包含重鏈可變區VH，該VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、 SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7中任一項所示的胺基酸序列；該HCDR2包含SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14中任一項所示的胺基酸序列；該HCDR3包含SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21中任一項所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至18中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該VH包括框架區H-FR1，H-FR2，H-FR3和H-FR4，其中該H-FR1的C末端與該HCDR1的N末端直接或間接相連，且該H-FR1包含SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28中任一項所示的胺基酸序列。
- 如請求項19所述的分離的抗原結合蛋白，其中該H-FR2位於該HCDR1與該HCDR2之間，且該H-FR2包含SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34中任一項所示的胺基酸序列。
- 如請求項19或20所述的分離的抗原結合蛋白，其中該H-FR3位於該HCDR2與該HCDR3之間，且該H-FR3包含SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41中任一項所示的胺基酸序列。
- 如請求項19至21中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該H-FR4的N末端與該HCDR3的C末端直接或間接相連，且該H-FR4包含SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44中任一項所示的胺基酸序列。
- 如請求項19至22中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其中該VH包含SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：86和SEQ ID NO：87中任一項所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至23中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其包括抗體重鏈恆定區。
- 如請求項1至24中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其具有中和SARS-CoV-2的活性。
- 如請求項1至25中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其包括抗體或其抗原結合片段。
- 如請求項26所述的分離的抗原結合蛋白，其中該抗原結合片段包括Fab、Fab’、F(ab)2、Fv片段、F(ab’)2、scFv、di-scFv和/或dAb。
- 如請求項26或27所述的分離的抗原結合蛋白，其中該抗體為全人源抗體。
- 一種分離的核酸分子，其編碼如請求項1至28中任一項所述的分離的抗原結合蛋白中的該VL。
- 一種分離的核酸分子，其編碼如請求項1至28中任一項所述的分離的抗原結合蛋白中的該VH。
- 一種分離的核酸分子，其編碼如請求項1至28中任一項所述的分離的抗原結合蛋白。
- 一種載體，其包含如請求項29至31中任一項所述的核酸分子。
- 一種細胞，其包含如請求項29至31中任一項所述的核酸分 子或如請求項32所述的載體。
- 如請求項33所述的細胞，其表達如請求項1至28中任一項所述的分離的抗原結合蛋白。
- 一種製備如請求項1至28中任一項所述的分離的抗原結合蛋白的方法，該方法包括在使得如請求項1至28中任一項所述的分離的抗原結合蛋白表達的條件下，培養如請求項33所述的細胞。
- 一種醫藥組成物，其包含如請求項1至28中任一項所述的分離的抗原結合蛋白、如請求項29至31中任一項所述的核酸分子、如請求項32所述的載體和/或如請求項33或34所述的細胞，以及視需要地藥學上可接受的佐劑。
- 一種如請求項1至28中任一項所述的分離的抗原結合蛋白、如請求項29至31中任一項所述的核酸分子、如請求項32所述的載體、如請求項33或34所述的細胞和/或如請求項36所述的醫藥組成物在製備藥物中的用途，該藥物用於預防、緩解和/或治療冠狀病毒的感染。
- 如請求項37所述的用途，其中該冠狀病毒的感染包括COVID-19。
- 一種預防、緩解和/或治療冠狀病毒的感染的方法，其包括施用如請求項1至28中任一項所述的分離的抗原結合蛋白、如請求項29至31中任一項所述的核酸分子、如請求項32所述的載體、如請求項33或34所述的細胞和/或如請求項36所述的醫藥組成物。
- 如請求項1至28中任一項所述的分離的抗原結合蛋白、如請求項29至31中任一項所述的核酸分子、如請求項32所述的載體、如請求項33 或34所述的細胞和/或如請求項36所述的醫藥組成物，其在預防、緩解和/或治療冠狀病毒的感染中的應用。
- 一種檢測SARS-CoV-2的方法，其包括以下的步驟，施用如請求項1至28中任一項所述的分離的抗原結合蛋白、如請求項29至31中任一項所述的核酸分子、如請求項32所述的載體、如請求項33或34所述的細胞和/或如請求項36所述的醫藥組成物。
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