WO2022127739A1 - 特异性结合SARS-CoV-2的抗原结合蛋白 - Google Patents
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Abstract
提供一种特异性结合SARS-CoV-2的分离的抗原结合蛋白、所述抗原结合蛋白的制备方法及其制药用途，所述抗原结合蛋白包含轻链可变区VL中的至少一个CDR，其中所述CDR包含SEQ ID NO:95所示的氨基酸序列。
Description
本申请涉及生物医药领域，具体的涉及一种特异性结合SARS-CoV-2的抗原结合蛋白。
由SARS-Cov-2引起的COVID-19的爆发已成为全球重大公共卫生事件。COVID-19的预防和治疗策略正在临床前和临床研究中制定，目前并没有非常强有力的药物用于治疗COVID-19。
基于抗体的治疗是一种可行的治疗选择。中和抗体是宿主对病原体免疫应答的重要组成部分，中和单克隆抗体已被开发用于RSV、流感、埃博拉、HIV、HCMV和狂犬病等病毒感染的治疗。目前单克隆抗体制备技术有杂交瘤技术、EBV转化B淋巴细胞技术、噬菌体展示技术、转基因小鼠技术以及单个B细胞抗体制备技术等。
发明内容
本申请提供了一种特异性结合SARS-CoV-2的分离的抗原结合蛋白。本申请所述的分离的抗原结合蛋白至少具备以下的有益效果：1)特异性结合SARS-CoV-2；2)具有中和SARS-CoV-2的活性；3)对SARS-CoV-2的感染有良好的预防、治疗和/或缓解效果。本申请还提供了所述特异性结合SARS-CoV-2的分离的抗原结合蛋白的制备方法，以及所述特异性结合SARS-CoV-2的分离的抗原结合蛋白的制药用途。
一方面，本申请提供了一种特异性结合SARS-CoV-2的分离的抗原结合蛋白，其包含轻链可变区VL中的至少一个CDR，其中所述CDR包含SEQ ID NO:95所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述VL包含LCDR1，所述LCDR1包含SEQ ID NO:95所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述VL包含LCDR1，所述LCDR1包含SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述VL包含LCDR2，所述LCDR2包含SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述VL包含LCDR3，所述LCDR3包含SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:61中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述VL包含LCDR1和LCDR2，所述LCDR1包含SEQ ID NO:95所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述VL包含LCDR1和LCDR3，所述LCDR1包含SEQ ID NO:95所示的氨基酸序列，所述LCDR3包含SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:61中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包含SEQ ID NO:95所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54中任一项所示的氨基酸序列；所述LCDR3包含SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:61中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述VL包括框架区L-FR1，L-FR2，L-FR3和L-FR4，其中所述L-FR1的C末端与所述LCDR1的N末端直接或间接相连，且所述L-FR1包含SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:64中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述L-FR2位于所述LCDR1与所述LCDR2之间，且所述L-FR2包含SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70和SEQ ID NO:71中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述L-FR3位于所述LCDR2与所述LCDR3之间，且所述L-FR3包含SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:78中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述L-FR4的N末端与所述LCDR3的C末端直接或间接相连，且所述L-FR4包含SEQ ID NO:79和SEQ ID NO:80中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述VL包含SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93和SEQ ID NO:94中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述的分离的抗原结合蛋白包括抗体轻链恒定区。
在某些实施方式中，所述的分离的抗原结合蛋白，包含重链可变区VH，所述VH包含 HCDR1，所述HCDR1包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述VH包含HCDR2，所述HCDR2包含SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述VH包含HCDR3，所述HCDR3包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述的分离的抗原结合蛋白包含重链可变区VH，所述VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7中任一项所示的氨基酸序列；所述HCDR2包含SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14中任一项所示的氨基酸序列；所述HCDR3包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述VH包括框架区H-FR1，H-FR2，H-FR3和H-FR4，其中所述H-FR1的C末端与所述HCDR1的N末端直接或间接相连，且所述H-FR1包含SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述H-FR2位于所述HCDR1与所述HCDR2之间，且所述H-FR2包含SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述H-FR3位于所述HCDR2与所述HCDR3之间，且所述H-FR3包含SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:41中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述H-FR4的N末端与所述HCDR3的C末端直接或间接相连，且所述H-FR4包含SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述VH包含SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86和SEQ ID NO:87中任一项所示的氨基酸序 列。
在某些实施方式中，所述的分离的抗原结合蛋白包括抗体重链恒定区。
在某些实施方式中，所述的分离的抗原结合蛋白具有中和SARS-CoV-2的活性。
在某些实施方式中，所述的分离的抗原结合蛋白包括抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方式中，所述抗原结合片段包括Fab，Fab’，F(ab)2，Fv片段，F(ab’)2，scFv，di-scFv和/或dAb。
在某些实施方式中，所述抗体为全人源抗体。
另一方面，本申请提供了分离的一种或多种核酸分子，其编码本申请所述的分离的抗原结合蛋白中的所述VL。
另一方面，本申请提供了分离的一种或多种核酸分子，其编码本申请所述的分离的抗原结合蛋白中的所述VH。
另一方面，本申请提供了分离的一种或多种核酸分子，其编码本申请所述的分离的抗原结合蛋白。
另一方面，本申请提供了一种载体，其包含本申请所述的核酸分子。
另一方面，本申请提供了一种细胞，其包含本申请所述的核酸分子或本申请所述的载体。
在某些实施方式中，所述的细胞表达本申请所述的分离的抗原结合蛋白。
另一方面，本申请提供了一种制备本申请所述的分离的抗原结合蛋白的方法，所述方法包括在使得本申请所述的分离的抗原结合蛋白表达的条件下，培养根据本申请所述的细胞。
另一方面，本申请提供了一种药物组合物，其包含本申请所述的分离的抗原结合蛋白、本申请所述的核酸分子、本申请所述的载体和/或本申请所述的细胞，以及任选地药学上可接受的佐剂。
另一方面，本申请提供了本申请所述的分离的抗原结合蛋白、本申请所述的核酸分子、本申请所述的载体、本申请所述的细胞和/或本申请所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防、缓解和/或治疗冠状病毒的感染。
在某些实施方式中，所述冠状病毒的感染包括COVID-19。
另一方面，本申请提供了一种预防、缓解和/或治疗冠状病毒的感染的方法，其包括施用本申请所述的分离的抗原结合蛋白、本申请所述的核酸分子、本申请所述的载体、本申请所述的细胞和/或本申请所述的药物组合物。
另一方面，本申请提供了本申请所述的分离的抗原结合蛋白、本申请所述的核酸分子、本申请所述的载体、本申请所述的细胞和/或本申请所述的药物组合物，其在预防、缓解和/或 治疗冠状病毒的感染中的应用。
另一方面，本申请提供了检测SARS-CoV-2的方法，其包括以下的步骤，施用本申请所述的分离的抗原结合蛋白、本申请所述的核酸分子、本申请所述的载体、本申请所述的细胞和/或本申请所述的药物组合物。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明书如下：
图1显示的是本申请所述分离的抗原结合蛋白特异性结合SARS-CoV-2 S蛋白三聚体的结果。
图2显示的是本申请所述分离的抗原结合蛋白对SARS-CoV-2假病毒的中和活性。
图3显示的是本申请所述分离的抗原结合蛋白对SARS-CoV-2假病毒的中和活性。
图4显示的是小鼠感染模型的构建方法。
图5显示的是本申请所述分离的抗原结合蛋白对小鼠感染模型的体重的影响。
图6显示的是本申请所述分离的抗原结合蛋白对小鼠感染模型的临床评分结果。
图7显示的是本申请所述分离的抗原结合蛋白对小鼠感染模型的生存曲线的影响。
图8显示的是恒河猴感染模型的构建方法。
图9显示的是本申请所述分离的抗原结合蛋白对恒河猴感染模型中病毒RNA含量的影响(咽拭子检测)。
图10显示的是本申请所述分离的抗原结合蛋白对恒河猴感染模型中病毒RNA含量的影响(肛拭子检测)
图11显示的是本申请所述分离的抗原结合蛋白对恒河猴感染模型中各组织器官中病毒RNA含量的影响。
图12a-12g显示的是本申请所述分离的抗原结合蛋白与S蛋白复合物的冷冻电镜分析结 果。
图13a-13b显示的是本申请所述分离的抗原结合蛋白与S蛋白复合物的冷冻电镜处理流程。
图14显示的是本申请所述分离的抗原结合蛋白与S蛋白复合物的数据收集、3D模型重构和模型统计参数。
图15a-15e显示的是本申请所述分离的抗原结合蛋白与S蛋白复合物的冷冻电镜结构。
图16a-16c显示的是本申请所述分离的抗原结合蛋白与S蛋白复合物的结合模式分析。
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
术语定义
在本申请中，术语“SARS-CoV-2”通常是指严重急性呼吸道综合征冠状病毒2型，英文全称为Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2。SARS-CoV-2属于冠状病毒科(Coronaviridae)乙型冠状病毒属(Betacoronavirus)沙贝病毒亚属(Sarbecovirus)。SARS-CoV-2是一种具有包膜的、不分节段的正链单股RNA病毒。SARS-CoV-2可以引发新型冠状病毒肺炎(COVID-19)。在本申请中，所述SARS-CoV-2可以包括S蛋白(刺突蛋白，spike蛋白)。
在本申请中，术语“COVID-19”通常是指新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019)，或2019冠状病毒病，其是由SARS-CoV-2病毒引起的呼吸道疾病。COVID-19的常见症状可以包括发烧，咳嗽，疲劳，呼吸急促以及气味和味觉丧失，某些症状会发展为病毒性肺炎，多器官功能衰竭或细胞因子风暴。该疾病主要在人与人之间密切接触时传播，例如可以通过咳嗽，打喷嚏和说话产生的小液滴传播。世界卫生组织于2020年3月11日宣布COVID-19的爆发是大流行病(pandemic)。目前没有针对COVID-19的可用的疫苗或特异性的治疗方法。
在本申请中，术语“冠状病毒的S蛋白”通常是指冠状蛋白的刺突蛋白(spike蛋白)。所述S蛋白可以组合成三聚体(即S蛋白三聚体)，其约含有1300个氨基酸。所述S蛋白可以属于第一类膜融合蛋白(Class I viral fusion protein)。所述S蛋白通常可以含有两个亚基(subunit)，S1和S2。S1主要包含有受体结合区(receptor binding domain RBD)，其可以 负责识别细胞的受体。S2含有膜融合过程所需的基本元件，包括一个内在的膜融合肽(fusion peptide)，两个7肽重复序列(heptad repeat，HR)，一个富含芳香族氨基酸的膜临近区域(membrane proximal external region，MPER)，以及跨膜区(transmembrane，TM)。S1蛋白可进一步分成两个区域(domain)，即N-端区域(N-terminal domain，NTD)和C-端区域(C-terminal domain，CTD)。S蛋白可以决定病毒(例如冠状病毒SARS-CoV-2)的宿主范围和特异性，也可以为宿主中和抗体的而重要作用位点，和/或疫苗设计的关键靶点。所述S蛋白可以为SARS-CoV-2的S蛋白，例如，其结构可以参见Daniel Wrapp等，Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation,Science。
在本申请中，术语“ACE2”通常是指血管紧张素转化酶II(Angiotensin-converting enzyme 2)或其功能片段。所述血管紧张素转化酶II可以催化血管紧张素I转化为血管紧张素-(1-9)或血管紧张素II转化为血管紧张素-(1-7)的外肽酶。所述ACE2可以包括N端的PD区(peptidase domain，肽酶结构域)和C端CLD区(Collectrin-like domain)。所述血管紧张素转化酶II可以为SARS-CoV-2的受体，例如，所述ACE2的胞外结构域(例如，所述ACE2的PD区)可以结合SARS-CoV-2的S蛋白的RBD。人血管紧张素转化酶II在UniProt数据库的登录号为Q9BYF1。人ACE2基因可以包含18个外显子，参见Tipnis,S.R.,Hooper,N.M.,Hyde,R.,Karran,E.,Christie,G.,Turner,A.J.A human homolog of angiotensin-converting enzyme:cloning and functional expression as a captopril-insensitive carboxypeptidase.J.Biol.Chem.275:33238-33243,2000的表1。在本申请中，所述ACE2可以包括所述完整ACE2蛋白的截短体或变体，只要所述功能性片段仍具备作为冠状病毒(例如SARS-CoV和/或SARS-CoV-2)受体的功能。
在本申请中，术语“冠状病毒的感染”通常是指由冠状病毒感染引起的疾病和/或症状。所述冠状病毒属于属套式病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)。所述冠状病毒可以为单链RNA病毒。所述冠状病毒的感染可以包括呼吸道感染，例如上呼吸道感染。所述冠状病毒的感染可以包括发热、流涕、寒战、呕吐和/或疲劳等症状。
在本申请中，术语“中和”通常是指抗原结合蛋白的中和活性，即抗原结合蛋白可以阻止和/或中和其对应的抗原的生化活性。在某些情况下，具备所述中和活性的抗原结合蛋白可以抵抗攻击免疫系统的抗原(例如逆转录病毒，例如所述抗原可以为SARS-CoV-2)，并使其失去活性。在某些情况下，具备所述中和活性的抗原结合蛋白在中和其对应的抗原的生化活性时，不需要白细胞的参与。
在本申请中，术语“抗原结合蛋白”通常是指包含结合抗原的部分的蛋白质，以及任选地允许结合抗原的部分采用促进抗原结合蛋白与抗原结合的构象的支架或骨架部分。抗原结合蛋白的实例包括但不限于抗体、抗原结合片段(Fab，Fab’，F(ab)2，Fv片段，F(ab’)2，scFv，di-scFv和/或dAb)、免疫缀合物、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、抗体片段、抗体衍生物、抗体类似物或融合蛋白等，只要它们显示出所需的抗原结合活性即可。
在本申请中，术语“Fab”通常是指含有重链可变结构域和轻链可变结构域的片段，并且还含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)；术语“Fab’”通常是指在重链CH1结构域的羧基端添加少量残基(包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸)而不同于Fab的片段；术语“F(ab')2”通常是指Fab’的二聚体，包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的抗体片段。术语“Fv”通常是指含有完整抗原识别与结合位点的最小抗体片段。在某些情形中，该片段可以由一个重链可变区和一个轻链可变区以紧密非共价结合的二聚体组成；术语“dsFv”通常是指二硫键稳定的Fv片段，其单个轻链可变区与单个重链可变区之间的键是二硫键。术语“dAb片段”通常是指由VH结构域组成的抗体片段。在本申请中，术语“scFv”通常是指抗体的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域通过柔性肽连接子共价连接配对形成的单价分子；此类scFv分子可具有一般结构：NH
2-VL-连接子-VH-COOH或NH
2-VH-连接子-VL-COOH。
在本申请中，术语“抗体”通常是指可以与相应抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白。所述抗体可以由免疫细胞(例如效应B细胞)分泌。所述抗体可以为单克隆抗体(包括包含两条轻链和两条重链的全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人源化抗体、完全人类抗体、嵌合抗体和/或骆驼化单结构域抗体。“抗体”通常可以包含通过二硫键互相连接的至少两条重链(HC)和两条轻链(LC)的蛋白，或其抗原结合片段。每条重链包含重链可变区(VH)和重链恒定区。在某些天然存在的IgG、IgD和IgA抗体中，重链恒定区包含三个结构域，CH1、CH2和CH3。在某些天然存在的抗体中，各轻链包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域，CL。VH和VL区可进一步细分为超变性的区域，称为互补决定区(CDR)，其与称为框架区(FR)的较保守的区域交替。各VH和VL包含三个CDR和四个框架区(FR)，从氨基端至羧基端按以下顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3和FR4。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR区(H-FR1，H-FR2，H-FR3，H-FR4，L-FR1，L-FR2，L-FR3，L-FR4)，大部分采用β-折叠构型，通过三个CDRs连接，形成环连接，并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的CDRs通过FR区紧密靠近在一起，并与来自另一条链的CDR一起形成抗体的抗原 结合位点。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)结合。
在本申请中，术语“可变”通常是指这样的事实，即抗体的可变结构域的序列的某些部分变化强烈，它形成各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，变异性并非均匀地分布在抗体的整个可变区中。它集中在轻链和重链可变区中的三个区段，被称为互补决定区(CDR)或高变区(HVR)。可变域中更高度保守的部分被称为框架(FR)。在本领域中，可以通过多种方法来定义抗体的CDR，例如基于序列可变性的Kabat定义规则(参见，Kabat等人，免疫学的蛋白质序列，第五版，美国国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州(1991))、基于结构环区域位置的Chothia定义规则(参见，A1-Lazikani等人，JMol Biol 273:927-48,1997)和基于IMGT本体论(IMGT-ONTOLOGY)的概念和IMGT Scientific图表规则的KABAT定义规则。IMGT指国际ImMunoGeneTics信息系统，一种免疫遗传学和免疫信息学的全球参考数据库(http://www.imgt.org)。IMGT专门研究来自人类和其他脊椎动物的免疫球蛋白(IG)或抗体、T细胞受体(TR)、主要组织相容性(MH)，以及来自脊椎动物和非脊椎动物的免疫球蛋白超家族(IgSF)、MH超家族(MhSF)和免疫系统相关蛋白(RPI)。
在本申请中，术语“分离的”抗原结合蛋白通常是指已经从其产生环境(例如，天然的或重组的)的组分中识别，分离和/或回收的抗原结合蛋白。其产生环境的污染组分通常是干扰其研究、诊断或治疗用途的物质，可以包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质溶质。分离的抗原结合蛋白或抗体通常将通过至少一个纯化步骤来制备。
在本申请中，术语“单克隆抗体”通常是指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即集群中的个别抗体是相同的，除了可能存在的少量的自然突变。单克隆抗体通常针对单个抗原位点具有高度特异性。而且，与常规多克隆抗体制剂(通常具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体的优点在于它们可以通过杂交瘤培养合成，不受其他免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示从基本上同质的抗体群体获得的抗体的特征，并且不被解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，本申请使用的单克隆抗体可以在杂交瘤细胞中制备，或者可以通过重组DNA方法制备。
在本申请中，术语“全人源抗体”通常是指将人类编码抗体的基因转移至基因工程改造的抗体基因缺失动物中，使动物表达的抗体。抗体所有部分(包括抗体的可变区和恒定区)均由人类来源的基因所编码。全人源抗体可以大大减少异源抗体对人体造成的免疫副反应。本 领域获得全人源抗体的方法可以有噬菌体展示技术、转基因小鼠技术、核糖体展示技术和RNA-多肽技术等。
在本申请中，术语“结合”、“特异性结合”或“对…特异性的”通常是指可测量且可再现的相互作用，诸如抗原和抗体之间的结合，其可以确定在存在分子(包括生物学分子)的异质群体的情况中靶物的存在。例如，抗体通过其抗原结合域与表位结合，并且该结合需要抗原结合域和表位之间的一些互补性。例如，特异性结合靶物(其可以是表位)的抗体是以比其结合其它靶物更大的亲和力、亲合力、更容易和/或以更大的持续时间结合此靶物的抗体。当抗体相比于其将结合随机的、不相关的表位而言更容易通过其抗原结合域与表位结合时，抗体被称为“特异性结合”该抗原。“表位”是指抗原上与抗原结合蛋白(如抗体)结合的特定的原子单击或点击此处输入文字。单击或点击此处输入文字。单击或点击此处输入文字。基团(例如，糖侧链、磷酰基、磺酰基)或氨基酸。
在本申请中，术语“参比抗体”通常是指本申请所述抗原结合蛋白与之竞争结合抗原(例如SARS-CoV-2的S蛋白的RBD)的抗体。
在本申请中，术语“在……之间”通常是指某种氨基酸片段的C端与第一氨基酸片段的N端直接或间接连接，并且其N端与第二氨基酸片段的C端直接或间接连接。在轻链中，例如，所述L-FR2的N末端与所述LCDR1的C末端直接或间接相连，且所述L-FR2的C末端与所述LCDR2的N末端直接或间接相连。又例如，所述L-FR3的N末端与所述LCDR2的C末端直接或间接相连，且所述L-FR3的C末端与所述LCDR3的N末端直接或间接相连。在重链中，例如，所述H-FR2的N末端与所述HCDR1的C末端直接或间接相连，且所述H-FR2的C末端与所述HCDR2的N末端直接或间接相连。又例如，所述H-FR3的N末端与所述HCDR2的C末端直接或间接相连，且所述H-FR3的C末端与所述HCDR3的N末端直接或间接相连。在本申请中，“第一氨基酸片段”和“第二氨基酸片段”可以为相同或不同的任意一段氨基酸片段。
在本申请中，术语“分离的核酸分子”或“分离的多核苷酸”通产是指基因组、mRNA、cDNA或合成来源的DNA或RNA或其一定组合。所述分离的核酸分子可以不与在自然界中发现的多核苷酸的全部或一部分缔合，或连接至其在自然界中不连接的多核苷酸。
在本申请中，术语“载体”通常是指能够在合适的宿主中自我复制的核酸分子，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。所述载体可包括主要用于将DNA或RNA插入细胞中的载体、主要用于复制DNA或RNA的载体，以及主要用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达的载体。所述载体还包括具有多种上述功能的载体。所述载体可以是当引入 合适的宿主细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常，通过培养包含所述载体的合适的宿主细胞，所述载体可以产生期望的表达产物。
在本申请中，术语“细胞”通常是指可以或已经含有包括本申请所述的核酸分子的质粒或载体，或者能够表达本申请所述的抗体或其抗原结合片段的个体细胞、细胞系或细胞培养物。所述细胞可以包括单个宿主细胞的子代。由于天然的、意外的或故意的突变，子代细胞与原始亲本细胞在形态上或在基因组上可能不一定完全相同，但能够表达本申请所述的抗体或其抗原结合片段即可。所述细胞可以通过使用本申请所述的载体体外转染细胞而得到。所述细胞可以是原核细胞(例如大肠杆菌)，也可以是真核细胞(例如酵母细胞，例如COS细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，HeLa细胞，HEK293细胞，COS-1细胞，NS0细胞或骨髓瘤细胞)。在本申请中，所述细胞可以包括在其中引入了所述载体的细胞。所述细胞不仅包括某种特定的细胞，还可以包括这些细胞的后代。
在本申请中，术语“药学上可接受的佐剂”通常包括药剂学可接受的载体、赋形剂或稳定剂，它们在所采用的剂量和浓度对暴露于其的细胞或哺乳动物是无毒的。通常，生理学可接受的载体是pH缓冲水溶液。
如本文所用，术语“施用”通常是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物应用于动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体。“施用”可以指治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理可以包括试剂(例如包含所述分离的抗原结合蛋白的试剂)与细胞的接触、以及试剂与流体的接触、流体与细胞的接触。“施用”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理。“处理”当应用于人、动物或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊断；例如可以包括所述分离的抗原结合蛋白与人或动物、受试者、细胞、组织、生理区室或生理流体的接触。
如本文所用，术语“治疗”指给予患者内用或外用治疗剂，例如包含本申请的任何一种所述分离的抗原结合蛋白，和/或包含所述分离的抗原结合蛋白的药物组合物，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，以有效缓解一种或多种疾病症状的治疗剂的量(治疗有效量)给予患者。治疗的期望效果包括降低疾病进展速率，改善或减轻疾病状态，和消退或改善的预后。例如，若一种或多种与癌症有关的症状是减轻或消除的，包括但不限于，降低(或破坏)癌细胞增殖，减少源自疾病的症状，提高那些患有疾病的个体的生命质量，降低治疗疾病需要的其它药物的剂量，延迟疾病的进展，和/或延长个体存活，则个体得到成功“治疗”。
在本申请中，术语“包括”通常是指包含、总括、含有或包涵的含义。在某些情况下，也表示“为”、“由……组成”的含义。
在本申请中，术语“约”通常是指在指定数值以上或以下0.5％-10％的范围内变动，例如在指定数值以上或以下0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、或10％的范围内变动。
发明详述
抗原结合蛋白
一方面，本申请提供一种特异性结合SARS-CoV-2的分离的抗原结合蛋白，其包含轻链可变区VL中的至少一个CDR，其中所述CDR包含SEQ ID NO:95所示的氨基酸序列。例如，所述CDR可以包含SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98或SEQ ID NO:99所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述VL可以包含LCDR1，所述LCDR1可以包含SEQ ID NO:95所示的氨基酸序列：TG X
3SS X
6 X
7G X
9 X
10 X
11 X
12V X
14，其中，X
3为Ser或Thr；X
6为Asp或Asn，X
7为Ile或Val，X
9为Ala、Gly或Ser；X
10为Gly、Ser或Tyr；X
11为Asp、Phe、Asn或Tyr；X
12为Asp、Leu或Tyr；X
14为His或Ser。例如，该序列可以是根据KABAT定义规则确定的序列。
在本申请中，所述VL可以包含LCDR1，所述LCDR1可以包含SEQ ID NO:96所示的氨基酸序列：TG X
3SSDVGX
9X
10X
11X
12VS，其中，X
3为Ser或Thr；X
9为Gly或Ser；X
10为Ser或Tyr；X
11为Asp或Asn；X
12为Leu或Tyr。例如，该序列可以是根据KABAT定义规则确定的序列。
在本申请中，所述VL可以包含LCDR1，所述LCDR1可以包含SEQ ID NO:97所示的氨基酸序列：TGTSSDVGX
9X
10NX
12VS，其中，X
9为Gly或Ser；X
10为Ser或Tyr；X
12为Leu或Tyr。例如，该序列可以是根据KABAT定义规则确定的序列。
在本申请中，所述VL可以包含LCDR1，所述LCDR1可以包含SEQ ID NO:98所示的氨基酸序列：TGTSSDVGGX
10NYVS，其中，X
10为Ser或Tyr。例如，该序列可以是根据KABAT定义规则确定的序列。
在本申请中，所述VL可以包含LCDR1，所述LCDR1可以包含SEQ ID NO:99所示的氨基酸序列：TGSSSNIGAG X
11DVH，其中，X
11为Phe或Tyr。例如，该序列可以是根据KABAT定义规则确定的序列。
例如，所述VL可以包含LCDR1，所述LCDR1可以包含SEQ ID NO:45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述VL可以包含LCDR2，所述LCDR2可以包含SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述VL可以包含LCDR3，所述LCDR3可以包含SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:61中任一项所示的氨基酸序列。
例如，所述VL可以包含LCDR1和LCDR2，所述LCDR1可以包含SEQ ID NO:95所示的氨基酸序列，所述LCDR2可以包含SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54中任一项所示的氨基酸序列。
例如，所述VL可以包含LCDR1和LCDR3，所述LCDR1可以包含SEQ ID NO:95所示的氨基酸序列，所述LCDR3可以包含SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:61中任一项所示的氨基酸序列。
例如，所述VL可以包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1可以包含SEQ ID NO:95所示的氨基酸序列，所述LCDR2可以包含SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54中任一项所示的氨基酸序列；所述LCDR3可以包含SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:61中任一项所示的氨基酸序列。
例如，所述VL可以包含SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93和SEQ ID NO:94中任一项所示的氨基酸序列。
例如，所述的分离的抗原结合蛋白，可以包含重链可变区VH，所述VH可以包含HCDR1，所述HCDR1可以包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7中任一项所示的氨基酸序列。
例如，所述VH可以包含HCDR2，所述HCDR2可以包含SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14中任一项所示的氨基酸序列。
例如，所述VH可以包含HCDR3，所述HCDR3可以包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21中任一项所示的氨基酸序列。
例如，所述的分离的抗原结合蛋白可以包含重链可变区VH，所述VH可以包含HCDR1、 HCDR2和HCDR3，所述HCDR1可以包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7中任一项所示的氨基酸序列；所述HCDR2可以包含SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14中任一项所示的氨基酸序列；所述HCDR3可以包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21中任一项所示的氨基酸序列。
例如，所述VH可以包含SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86和SEQ ID NO:87中任一项所示的氨基酸序列。
本申请所述的分离的抗原结合蛋白，能够与参比抗体竞争结合SARS-CoV-2的S蛋白的RBD，其中所述参比抗体可以包含重链可变区和轻链可变区，所述参比抗体的重链可变区可以包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1可以包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，所述HCDR2可以包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，且所述HCDR3可以包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，所述LCDR1可以包含SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列，所述LCDR2可以包含SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列，且所述LCDR3可以包含SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列。
本申请所述的分离的抗原结合蛋白，能够与参比抗体竞争结合SARS-CoV-2的S蛋白的RBD，其中所述参比抗体可以包含重链可变区和轻链可变区，所述参比抗体的重链可变区可以包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1可以包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述HCDR2可以包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，且所述HCDR3可以包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列，所述LCDR1可以包含SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列，所述LCDR2可以包含SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列，且所述LCDR3可以包含SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列。
本申请所述的分离的抗原结合蛋白，能够与参比抗体竞争结合SARS-CoV-2的S蛋白的RBD，其中所述参比抗体可以包含重链可变区和轻链可变区，所述参比抗体的重链可变区可以包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1可以包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，所述HCDR2可以包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，且所述HCDR3可以包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列，所述LCDR1可以包含SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列，所述LCDR2可以包含SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列，且所述LCDR3可以包含SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列。
本申请所述的分离的抗原结合蛋白，能够与参比抗体竞争结合SARS-CoV-2的S蛋白的 RBD，其中所述参比抗体可以包含重链可变区和轻链可变区，所述参比抗体的重链可变区可以包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1可以包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，所述HCDR2可以包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，且所述HCDR3可以包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列，所述LCDR1可以包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列，所述LCDR2可以包含SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列，且所述LCDR3可以包含SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列。
本申请所述的分离的抗原结合蛋白，能够与参比抗体竞争结合SARS-CoV-2的S蛋白的RBD，其中所述参比抗体可以包含重链可变区和轻链可变区，所述参比抗体的重链可变区可以包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1可以包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，所述HCDR2可以包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，且所述HCDR3可以包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，所述LCDR1可以包含SEQ ID NO:64所示的氨基酸序列，所述LCDR2可以包含SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列，且所述LCDR3可以包含SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列。
本申请所述的分离的抗原结合蛋白，能够与参比抗体竞争结合SARS-CoV-2的S蛋白的RBD，其中所述参比抗体可以包含重链可变区和轻链可变区，所述参比抗体的重链可变区可以包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1可以包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，所述HCDR2可以包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列，且所述HCDR3可以包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列，所述LCDR1可以包含SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列，所述LCDR2可以包含SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列，且所述LCDR3可以包含SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列。
本申请所述的分离的抗原结合蛋白，能够与参比抗体竞争结合SARS-CoV-2的S蛋白的RBD，其中所述参比抗体可以包含重链可变区和轻链可变区，所述参比抗体的重链可变区可以包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1可以包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，所述HCDR2可以包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，且所述HCDR3可以包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列，所述LCDR1可以包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列，所述LCDR2可以包含SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列，且所述LCDR3可以包含SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可包含抗体轻链可变区CDR——LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1可包含SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列，所述LCDR2可包含SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列，且所述LCDR3可包含SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可包含抗体轻链可变区CDR——LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1可包含SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列，所述LCDR2可包含SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列，且所述LCDR3可包含SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可包含抗体轻链可变区CDR——LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1可包含SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列，所述LCDR2可包含SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列，且所述LCDR3可包含SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可包含抗体轻链可变区CDR——LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1可包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列，所述LCDR2可包含SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列，且所述LCDR3可包含SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可包含抗体轻链可变区CDR——LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1可包含SEQ ID NO:64所示的氨基酸序列，所述LCDR2可包含SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列，且所述LCDR3可包含SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可包含抗体轻链可变区CDR——LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1可包含SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列，所述LCDR2可包含SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列，且所述LCDR3可包含SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可包含抗体轻链可变区CDR——LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1可包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列，所述LCDR2可包含SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列，且所述LCDR3可包含SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可包含抗体重链可变区CDR——HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，所述HCDR2可包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可包含抗体重链可变区CDR——HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述HCDR2可包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可包含抗体重链可变区CDR——HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，所述HCDR2可包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可包含抗体重链可变区CDR——HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，所述HCDR2可包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可包含抗体重链可变区CDR——HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，所述HCDR2可包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可包含抗体重链可变区CDR——HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，所述HCDR2可包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列，且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可包含抗体重链可变区CDR——HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，所述HCDR2可包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1可包含所示的氨基酸序列，所述HCDR2可包含所示的氨基酸序列，且所述HCDR3可包含所示的氨基酸序列，所述LCDR1可包含所示的氨基酸序列，所述LCDR2可包含所示的氨基酸序列，且所述LCDR3可包含所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1可包含所示的氨基酸序列，所述HCDR2可包含所示的氨基酸序列，且所述HCDR3可包含所示的氨基酸序列，所述LCDR1可包含所示的氨基酸序列，所述LCDR2可包含所示的氨基酸序列，且所述LCDR3可包含所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1可包含所示的氨基酸序列，所述HCDR2可包含所示的氨基酸序列，且所述HCDR3可包含所示的氨基酸序列，所述LCDR1可包含所示的氨基酸序列，所述LCDR2可包含所示的氨基酸序列，且所述LCDR3可包含所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1可包含所示的氨基酸序列，所述HCDR2可包含所示的氨基酸序列，且所述HCDR3可包含所示的氨基酸序列，所述LCDR1可包含所示的氨基酸序列，所述LCDR2可包含所示的氨基酸序列，且所述LCDR3可包含所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1可包含所示的氨基酸序列，所述HCDR2可包含所示的氨基酸序列，且所述HCDR3可包含所示的氨基酸序列，所述LCDR1可包含所示的氨基酸序列，所述LCDR2可包含所示的氨基酸序列，且所述LCDR3可包含所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2 和LCDR3，所述HCDR1可包含所示的氨基酸序列，所述HCDR2可包含所示的氨基酸序列，且所述HCDR3可包含所示的氨基酸序列，所述LCDR1可包含所示的氨基酸序列，所述LCDR2可包含所示的氨基酸序列，且所述LCDR3可包含所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1可包含所示的氨基酸序列，所述HCDR2可包含所示的氨基酸序列，且所述HCDR3可包含所示的氨基酸序列，所述LCDR1可包含所示的氨基酸序列，所述LCDR2可包含所示的氨基酸序列，且所述LCDR3可包含所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1可包含所示的氨基酸序列，所述HCDR2可包含所示的氨基酸序列，且所述HCDR3可包含所示的氨基酸序列，所述LCDR1可包含所示的氨基酸序列，所述LCDR2可包含所示的氨基酸序列，且所述LCDR3可包含所示的氨基酸序列。
例如，所述VL可以包括框架区L-FR1，L-FR2，L-FR3，和L-FR4。
例如，所述L-FR1的C末端可以与所述LCDR1的N末端直接或间接相连，且所述L-FR1可以包含SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:64中任一项所示的氨基酸序列。
例如，所述L-FR2可以位于所述LCDR1与所述LCDR2之间，且所述L-FR2可以包含SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70和SEQ ID NO:71中任一项所示的氨基酸序列。
例如，所述L-FR3可以位于所述LCDR2与所述LCDR3之间，且所述L-FR3可以包含SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:78中任一项所示的氨基酸序列。
例如，所述L-FR4的N末端可以与所述LCDR3的C末端直接或间接相连，且所述L-FR4可以包含SEQ ID NO:79和SEQ ID NO:80中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述VL可以包含SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93和SEQ ID NO:94所示的氨基酸序列。
例如，所述分离的抗原结合蛋白可以包括抗体轻链恒定区，且所述抗体轻链恒定区包括人Igκ恒定区或人Igλ恒定区。
在本申请中，编码所述人Igκ恒定区的基因可以如NCBI数据库的GenBank登录号50802所示；编码所述人Igλ恒定区的基因可以如NCBI数据库的GenBank登录号3535所示。
例如，所述VH可以包括框架区H-FR1，H-FR2，H-FR3，和H-FR4。
例如，所述H-FR1的C末端可以与所述HCDR1的N末端直接或间接相连，且所述H-FR1可以包含SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28中任一项所示的氨基酸序列。
例如，所述H-FR2可以位于所述HCDR1与所述HCDR2之间，且所述H-FR2可以包含SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34中任一项所示的氨基酸序列。
例如，所述H-FR3可以位于所述HCDR2与所述HCDR3之间，且所述H-FR3可以包含SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:41中任一项所示的氨基酸序列。
例如，所述H-FR4的N末端可以与所述HCDR3的C末端直接或间接相连，且所述H-FR4可以包含SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44中任一项所示的氨基酸序列。
例如，所述VH可以包含SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86和SEQ ID NO:87中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可包含轻链可变区VL和重链可变区VH，所述VL可包含SEQ ID NO:88所示的氨基酸序列，所述VH可包含SEQ ID NO:81所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可包含轻链可变区VL和重链可变区VH，所述VL可包含SEQ ID NO:89所示的氨基酸序列，所述VH可包含SEQ ID NO:82所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可包含轻链可变区VL和重链可变区VH，所述VL可包含SEQ ID NO:90所示的氨基酸序列，所述VH可包含SEQ ID NO:83所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可包含轻链可变区VL和重链可变区VH，所述VL可包含SEQ ID NO:91所示的氨基酸序列，所述VH可包含SEQ ID NO:84所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可包含轻链可变区VL和重链可变区VH，所述VL可包含SEQ ID NO:92所示的氨基酸序列，所述VH可包含SEQ ID NO:85所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可包含轻链可变区VL和重链可变区VH，所述VL可包含SEQ ID NO:93所示的氨基酸序列，所述VH可包含SEQ ID NO:87所示的氨基酸 序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可包含轻链可变区VL和重链可变区VH，所述VL可包含SEQ ID NO:94所示的氨基酸序列，所述VH可包含SEQ ID NO:86所示的氨基酸序列。
本申请中涉及的蛋白质、多肽和/或氨基酸序列，还应理解为至少包含以下的范围：与该所述蛋白质或多肽具备相同或类似功能的变体或同源物。
在本申请中，所述变体可以为，在所述蛋白质和/或所述多肽(例如，本申请所述的抗原结合蛋白)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸的蛋白质或多肽。例如，所述功能性变体可包含已经通过至少1个，例如1-30个、1-20个或1-10个，又例如1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代、缺失和/或插入而具有氨基酸改变的蛋白质或多肽。所述功能性变体可基本上保持改变(例如取代、缺失或添加)之前的所述蛋白质或所述多肽的生物学特性。例如，所述功能性变体可保持改变之前的所述蛋白质或所述多肽的至少60％，70％，80％，90％，或100％的生物学活性(例如抗原结合能力)。例如，所述取代可以为保守取代。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的氨基酸序列的一部分可以与来自特定物种的抗体中相应的氨基酸序列同源，或者属于特定的类别。例如，所述抗原结合蛋白的可变区及恒定部分均可以来自一个动物物种(如人)的抗体的可变区及恒定区。在本申请中，所述同源物可以为，与所述蛋白质和/或所述多肽(例如，本申请所述的抗原结合蛋白)的氨基酸序列具有至少约85％(例如，具有至少约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高的)序列同源性的蛋白质或多肽。
在本申请中，所述同源性通常是指两个或多个序列之间的相似性、类似或关联。可以通过以下方式计算“序列同源性百分比”：将两条待比对的序列在比较窗中进行比较，确定两条序列中存在相同核酸碱基(例如，A、T、C、G)或相同氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置的数目以得到匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中的总位置数(即，窗大小)，并且将结果乘以100，以产生序列同源性百分比。为了确定序列同源性百分数而进行的比对，可以按本领域已知的多种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适宜参数，包括为实现正在比较的全长序列范围内或目标序列区域内最大比对所需要的任何算法。所述同源性也可以通过以下的方法测定：FASTA和BLAST。对FASTA算法的描述可以参见W.R.Pearson和D.J.Lipman的“用于生物学序列比较的改进的工具”，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)，85：2444-2448，1988；和D.J.Lipman和 W.R.Pearson的“快速灵敏的蛋白质相似性搜索”，Science，227：1435-1441，1989。对BLAST算法的描述可参见S.Altschul、W.Gish、W.Miller、E.W.Myers和D.Lipman的“一种基本的局部对比(alignment)搜索工具”，分子生物学杂志，215：403-410，1990。
例如，所述分离的抗原结合蛋白可以包括抗体重链恒定区，且所述抗体重链恒定区包括人IgG恒定区。
例如，所述分离的抗原结合蛋白可以包括抗体重链恒定区，且所述抗体重链恒定区包括人IgG1恒定区。
在本申请中，编码所述人IgG1恒定区的基因可以如NCBI数据库的GenBank登录号3500所示。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包括抗体或其抗原结合片段。例如，本申请所述的分离的抗原结合蛋白可以包括但不限于重组抗体、单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、单链抗体、双抗体、三抗体、四抗体、Fv片段、scFv片段、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段和骆驼化单结构域抗体。
人源化抗体可以选自任何种类的免疫球蛋白，包括IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在本申请中，抗体是IgG抗体，使用IgG1亚型。同样，任一类轻链都可以在本文的化合物和方法中使用。例如，κ、λ链或其变体在本申请中是适用的。
在本申请中，所述抗原结合片段可以包括Fab，Fab’，F(ab)2、Fv片段、F(ab’)2，scFv，di-scFv和/或dAb。
本申请所述的抗原结合蛋白(例如，SARS-CoV-2抗体)能够特异性结合SARS-CoV-2的S蛋白的RBD。“特异性结合”SARS-CoV-2抗原(例如SARS-CoV-2的S蛋白的RBD)的抗原结合蛋白(例如，抗体)通常可以以约的EC50值或更高亲和力(例如，约)结合SARS-CoV-2的S蛋白的RBD，但不结合缺乏SARS-CoV-2序列的其它蛋白。抗原结合蛋白(例如，抗体)是否结合SARS-CoV-2抗原(例如SARS-CoV-2的S蛋白的RBD)可使用本领域中已知的任何测定法确定。例如，通过流式分析技术和酶联免疫反应所检测的。
本申请所述的抗原结合蛋白(例如，SARS-CoV-2抗体；例如单克隆抗体2G1)能够特异性结合WA1/2020，Alpha，Beta，Gamma，Kappa，和Delta的S蛋白三聚体。本申请所述的抗原结合蛋白(例如，SARS-CoV-2抗体；例如单克隆抗体2G1)能够对WA1/2020，Alpha，Beta，Gamma，Kappa，和Delta假病毒具有中和能力。申请所述的抗原结合蛋白(例如，SARS-CoV-2抗体；例如单克隆抗体2G1)能够对ARS-CoV-2 WA1/2020(US_WA-1/2020分离株)、Alpha(B.1.1.7/UK，菌株：SARS-CoV-2/human/USA/CA_CDC_5574/2020),Beta(B.1.351/SA,Strain:hCoV-19/USA/MD-HP01542/2021),Gamma(P.1/Brazil,Strain:SARS-CoV- 2/human/USA/MD-MDH-0841/2021)和Delta变体(B.1.617.2/Indian，菌株：GNL-751)突变体真病毒具有中和能力。
本申请所述的抗原结合蛋白(例如，SARS-CoV-2抗体；例如单克隆抗体2G1)能够治疗感染SARS-CoV-2(US_WA-1/2020分离株)、Beta-(B.1.351/SA，菌株：hCoV-19/USA/MD-HP01542/2021)或Delta变体的动物模型(例如小鼠动物模型；和/或，恒河猴模型)。
本申请所述的抗原结合蛋白(例如，SARS-CoV-2抗体)能够阻断SARS-CoV-2的S蛋白的RBD或其功能片段与人ACE2的结合。阻断实验可以使用竞争法进行检测，例如，将所述的抗原结合蛋白(例如，SARS-CoV-2抗体)与抗原(或，可表达抗原的细胞)和抗原的配体(或，表达配体的细胞)混合，根据可检测标记的强度(例如，荧光强度或浓度)反应抗原结合蛋白与抗原的配体竞争性结合抗原的能力。
本申请中涉及的蛋白质和/或氨基酸序列，还应理解为至少包含以下的范围：与该所述蛋白质具备相同或类似功能的变体或同源物。
在本申请中，所述变体可以为，在所述蛋白质(例如，本申请所述的抗原结合蛋白)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸的蛋白质或多肽。例如，所述功能性变体可包含已经通过至少1个，例如1-30个、1-20个或1-10个，又例如1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代、缺失和/或插入而具有氨基酸改变的蛋白质或多肽。所述功能性变体可基本上保持改变(例如取代、缺失或添加)之前的所述蛋白质或所述多肽的生物学特性。例如，所述功能性变体可保持改变之前的所述蛋白质或所述多肽的至少60％，70％，80％，90％，或100％的生物学活性(例如抗原结合能力)。例如，所述取代可以为保守取代。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的氨基酸序列的一部分可以与来自特定物种的抗体中相应的氨基酸序列同源，或者属于特定的类别。例如，抗体的可变区及恒定部分均可以来自一个动物物种(如人)的抗体的可变区及恒定区。在本申请中，所述同源物可以为，与所述蛋白质和/或所述多肽(例如，本申请所述的抗原结合蛋白)的氨基酸序列具有至少约85％(例如，具有至少约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高的)序列同源性的蛋白质或多肽。
在本申请中，所述同源性通常是指两个或多个序列之间的相似性、类似或关联。可以通过以下方式计算“序列同源性百分比”：将两条待比对的序列在比较窗中进行比较，确定两条序列中存在相同核酸碱基(例如，A、T、C、G)或相同氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置的数目以得到匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中的总位置数(即，窗大小)，并且将结果乘以100，以产生序列同源性百分比。为了确定序列同源性百分数而进行 的比对，可以按本领域已知的多种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适宜参数，包括为实现正在比较的全长序列范围内或目标序列区域内最大比对所需要的任何算法。所述同源性也可以通过以下的方法测定：FASTA和BLAST。对FASTA算法的描述可以参见W.R.Pearson和D.J.Lipman的“用于生物学序列比较的改进的工具”，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)，85：2444-2448，1988；和D.J.Lipman和W.R.Pearson的“快速灵敏的蛋白质相似性搜索”，Science，227：1435-1441，1989。对BLAST算法的描述可参见S.Altschul、W.Gish、W.Miller、E.W.Myers和D.Lipman的“一种基本的局部对比(alignment)搜索工具”，分子生物学杂志，215：403-410，1990。
药物组合物
另一方面，本申请提供一种药物组合物，其可以包含本申请所述的分离的抗原结合蛋白、、本申请所述的核酸分子、本申请所述的载体和/或本申请所述的细胞，以及任选地药学上可接受的佐剂。
本申请所述的药物组合物可直接用于结合SARS-CoV-2的S蛋白，因而可用于预防和治疗冠状病毒感染相关的疾病(例如，COVID-19)。此外，还可同时使用其他治疗剂。
本申请的药物组合物可以含有安全有效量(如0.001-99wt％)的本申请所述的抗原结合蛋白以及药学上可接受的佐剂(可包括载体或赋形剂)。药物制剂应与给药方式相匹配。本申请所述的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。此外，本申请所述的抗原结合蛋白还可与其他治疗剂一起使用。
本文所述的抗原结合蛋白或药物组合物可以符合良好医疗实践的方式配制、给药和施用。在此情形下的考虑因素包括所治疗的特定病症、所治疗的特定哺乳动物、单个患者的临床病状、病症的病因、药剂递送部位、施用方法和医学从业者已知的其他因素。治疗剂(例如，本申请所述的抗原结合蛋白和/或所述的药物组合物)无需但任选地与一种或多种当前用来预防或治疗所考虑的病症的药剂一起配制和/或同时施用。此类其他药剂的有效量取决于制剂中存在的治疗剂(例如，本申请所述的抗原结合蛋白和/或所述的药物组合物)的量、病症或治疗的类型以及以上论述的其他因素。这些药剂通常可以凭经验/临床上确定为适当的任何剂量且通过凭经验/临床上确定为适当的任何途径加以使用。与单个治疗相比，可减少组合治疗中施用的抗体的剂量。通过常规技术易于监测此疗法的进展。
用途
另一方面，本申请提供一种本申请所述的分离的抗原结合蛋白、本申请所述的核酸分子、 本申请所述的载体、本申请所述的细胞和/或本申请所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防、缓解和/或治疗冠状病毒的感染。
本申请提供一种预防、缓解和/或治疗冠状病毒的感染的方法，其包括向有需要的受试者施用本申请所述的分离的抗原结合蛋白、本申请所述的核酸分子、本申请所述的载体、本申请所述的细胞和/或本申请所述的药物组合物。
本申请提供了分离的抗原结合蛋白、本申请所述的核酸分子、本申请所述的载体、本申请所述的细胞和/或本申请所述的药物组合物，其可以预防、缓解和/或治疗冠状病毒的感染。
在本申请中，所述冠状病毒的感染可以包括COVID-19。
在本申请中，施用本申请所述的分离的抗原结合蛋白、本申请所述的核酸分子、本申请所述的载体、本申请所述的细胞和/或本申请所述的药物组合物可以对COVID-19的假病毒(例如对WA1/2020，Alpha，Beta，Gamma，Kappa，和Delta的S蛋白三聚体(Spike trimer)制备的假病毒)具有有效的中和能力。
在本申请中，施用本申请所述的分离的抗原结合蛋白、本申请所述的核酸分子、本申请所述的载体、本申请所述的细胞和/或本申请所述的药物组合物可以对COVID-19的不同毒株(例如SARS-CoV-2 WA1/2020(US_WA-1/2020分离株)、Alpha(B.1.1.7/UK，菌株：SARS-CoV-2/human/USA/CA_CDC_5574/2020),Beta(B.1.351/SA,Strain:hCoV-19/USA/MD-HP01542/2021),Gamma(P.1/Brazil,Strain:SARS-CoV-2/human/USA/MD-MDH-0841/2021)和Delta变体(B.1.617.2/Indian，菌株：GNL-751))具有有效的中和能力。
在本申请中，施用本申请所述的分离的抗原结合蛋白、本申请所述的核酸分子、本申请所述的载体、本申请所述的细胞和/或本申请所述的药物组合物可以对已感染COVID-19的不同毒株(例如SARS-CoV-2 WA1/2020(US_WA-1/2020分离株)、Alpha(B.1.1.7/UK，菌株：SARS-CoV-2/human/USA/CA_CDC_5574/2020),Beta(B.1.351/SA,Strain:hCoV-19/USA/MD-HP01542/2021),Gamma(P.1/Brazil,Strain:SARS-CoV-2/human/USA/MD-MDH-0841/2021)和Delta变体(B.1.617.2/Indian，菌株：GNL-751))的动物模型(例如小鼠模型、恒河猴模型)具有良好的治疗效果。
另一方面，本申请提供一种检测SARS-CoV-2的方法，其包括以下的步骤，施用本申请所述的分离的抗原结合蛋白、本申请所述的核酸分子、本申请所述的载体、本申请所述的细胞和/或本申请所述的药物组合物。在本申请中，所述的分离的抗原结合蛋白、本申请所述的核酸分子、本申请所述的载体、本申请所述的细胞和/或本申请所述的药物组合物能够特异性地和/或高亲和力地结合SARS-CoV-2，例如结合菌株WA1/2020，Alpha，Beta，Gamma，Kappa，和Delta的S蛋白三聚体(Spike trimer)。
本申请的抗原结合蛋白可用于检测应用，例如用于检测样本，从而提供诊断信息。例如，本申请所述的抗体和/或方法，可以用于对受试者(例如疑似被SARS-CoV-2感染，或已经被SARS-CoV-2感染的患者)的标本(例如，咽拭子检测样品，例如血清、全血、痰液、口腔/鼻咽分泌物或洗液、尿液、粪便、胸腹腔积液、脑脊液和组织标本)进行检测，作为疗效观察的指标及是否具有传染性和是否需要隔离的指标。例如，本申请所述的抗体和/或方法，可以为治疗性干预提供监测方案。
在本申请中，所采用的样本(样品)包括细胞、组织样本和活检标本。本申请使用的术语“活检”应包括本领域技术人员已知的所有种类的活检。因此本申请中使用的活检可以包括例如通过内窥镜方法或器官的穿刺或针刺活检制备的组织样本。例如，所述样本可以包括固定的或保存的细胞或组织样本。
本申请还提供了一种指含有本申请的抗原结合蛋白的试剂盒。在某些情形中，所述的试剂盒还可以包括容器、使用说明书、缓冲剂等。例如，本申请的原结合蛋白可以固定于检测板。
不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的分离的抗原结合蛋白、制备方法和用途等，而不用于限制本申请发明的范围。
实施例
实施例1候选抗体的制备
从COVID-19康复患者外周血中，流式细胞术分离获得可以识别SARS-CoV-2 RBD的记忆B细胞，对这些分离的记忆B细胞进行单个B细胞分选。通过单细胞PCR的方法，克隆获得抗体V区基因，重构IgG型抗体。
所得的候选抗体包含如表1所示的氨基酸序列：
表1
| 序号 | 克隆号 | VH | VL |
| 1 | 13H8 | SEQ ID NO：81 | SEQ ID NO：88 |
| 2 | 2G1 | SEQ ID NO：82 | SEQ ID NO：89 |
| 3 | 5H10 | SEQ ID NO：83 | SEQ ID NO：90 |
| 4 | 7G10 | SEQ ID NO：84 | SEQ ID NO：91 |
| 5 | 8G4 | SEQ ID NO：85 | SEQ ID NO：92 |
| 6 | 8G9 | SEQ ID NO：87 | SEQ ID NO：93 |
| 7 | 6F12 | SEQ ID NO：86 | SEQ ID NO：94 |
实施例2候选抗体结合SARS-CoV-2 S三聚体蛋白的亲和力测定
实验前一天，向包被缓冲液(pH 9.6，0.05M碳酸盐缓冲液)，加入抗原SARS-CoV-2 Spike trimer蛋白(即S蛋白三聚体)至终浓度为2μg/mL。每孔加入100μL,轻微震荡至每孔液体均匀铺在底部。将含有抗原的酶标板，置入密封袋中，密封放入4℃冰箱抗原吸附过夜；
次日，弃上清，于干净吸水纸上拍干，加入250μL/孔洗涤液(pH 7.4PBST)，每次保持5min，弃上清于干净吸水纸上拍干，重复3次。加入250μL/孔封闭液(PBST+3％脱脂奶粉)，置入新的封口袋中，37℃封闭1h。弃上清，于干净吸水纸上拍干，250μL/孔洗涤液洗涤，每次保持5min，弃上清于干净吸水纸上拍干，重复3次。
使用抗体稀释液(pH7.4 PBS)将实施例1制备的候选抗体进行梯度稀释。
以100μL/孔吸取稀释后的候选抗体样品加入处理完成的酶标板中，置入新的封口袋中，37℃孵育1h。弃上清，于干净吸水纸上拍干，250μL/孔洗涤液洗涤，每次保持5min，弃上清于干净吸水纸上拍干，重复3次。按照100μL/孔，加入1:5000稀释的anti-human IgG HRP二抗，置入新的封口袋中，37℃孵育1h。弃上清，于干净吸水纸上拍干，250μL/孔洗涤液洗涤，每次保持5min，弃上清于干净吸水纸上拍干，重复3次。以100μL/孔加入TMB显色液，锡纸包裹避光室温显色15min，观察蓝色反应，以50μL/孔加入终止液(2M H
2SO
4)，混匀后立即酶标仪450nm读数。其中对照为人ACE2-Fc融合蛋白(其包含如SEQ ID NO：100所示的氨基酸序列)。
结果如图1和表2所示。结果可知候选抗体均对S三聚体蛋白有较高的亲和力。
表2
| 序号 | 克隆号 | EC50(μg/ml) | 序号 | 克隆号 | EC50(μg/ml) |
| 1 | 13H8 | 0.013 | 5 | 8G4 | 0.014 |
| 2 | 2G1 | 0.135 | 6 | 8G9 | 0.088 |
| 3 | 5H10 | 0.020 | 7 | 6F12 | 0.012 |
| 4 | 7G10 | 0.011 | 8 | 对照 | 1.065 |
实施例3候选抗体假SARS-CoV-2病毒的中和活性测定
实验前一天，将待感染HEK293T-ACE2细胞接种于96孔细胞培养板中，接种量约为1×10
4个细胞/孔，5％CO
2培养箱37℃培养过夜。第二日，待细胞密度在30％左右时进行病毒感染，取出冻存的假病毒置于冰上融化或4℃条件下待其完全融化后，病毒使用量为0.25μL/ 孔，分别于不同稀释浓度的实施例1制备的候选抗体混合37℃孵育30min，将混合物加入细胞培养体系中感染目的细胞。病毒感染后6h后，吸去上清液，加入100μL完全培养基继续培养48小时。细胞感染假病毒换液后48h,通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达和检测荧光素酶的活性判定感染效率。向每孔中加入100μL的One-Glo荧光素酶，震荡混匀，3min后酶标仪读数。
结果如图2和表3所示。结果可知候选抗体均对假SARS-CoV-2病毒具有良好的中和活性，能够有效抑制SARS-CoV-2病毒的继续扩增。其中对照为人ACE2-Fc融合蛋白(其包含如SEQ ID NO：100所示的氨基酸序列)。
表3
| 序号 | 克隆号 | EC50(μg/ml) | 序号 | 克隆号 | IC50(μg/ml) |
| 1 | 13H8 | 0.013 | 5 | 8G4 | 0.061 |
| 2 | 2G1 | 0.011 | 6 | 8G9 | 0.042 |
| 3 | 5H10 | 0.058 | 7 | 6F12 | 0.100 |
| 4 | 7G10 | 0.322 | 8 | 对照 | 0.404 |
实施例4候选抗体真SARS-CoV-2病毒的中和活性测定
实验前一天，将待感染Vero-E6细胞接种于细胞培养板中，培养过夜。第二日，进行病毒感染，取出冻存的病毒融化后，分别于不同稀释浓度的候选抗体混合孵育，将混合物加入细胞培养体系中感染目的细胞。病毒感染后，吸去上清液，加入完全培养基继续培养。3到5天观察细胞病变，判断中和活性。
具体的步骤如下，以下实验操作均在BSL-3实验室内完成：
(1)样品用MEM培养基(含1％双抗)配制成200μg/ml的溶液，然后10倍系列稀释，200μg/ml，20μg/ml，2μg/ml，0.2μg/ml，0.02μg/ml，0.002μg/ml共6个稀释度，每个浓度2个复孔，每孔50μl，然后每孔再加入等体积100TCID
50病毒，37℃，5％CO
2孵箱作用1.5h；
(2)1.5h后，96孔培养板中加入细胞培养液，每孔加入100μl浓度为1×10
5个细胞/mL Vero细胞悬液；
(3)同时设立细胞对照及病毒回滴对照；
细胞对照：每孔100μL MEM培养基(含1％双抗)加入100μL的Vero细胞悬液到96孔培养板中，共4个复孔；
病毒回滴对照：将100TCID
50病毒用MEM培养基(含1％双抗)连续10倍稀释3次， 得到10TCID
50，1TCID
50，0.1TCID
50。96孔培养板中每孔加入50μL MEM培养基(含1％双抗)，然后每孔再加入等体积100TCID
50，10TCID
50，1TCID
50，0.1TCID
50病毒，每个稀释度4个复孔，37℃，5％CO
2孵箱作用1.5h，1.5h后，每孔加入100μL浓度为1×10
5个细胞/mL Vero细胞悬液。病毒回滴对照结果在32-320TCID50/50μl范围内，实验有效。
(4)细胞37℃，5％CO
2孵箱孵育3-5天；
(5)光学显微镜下观察细胞病变(CPE)，细胞有CPE变化记为“+”，细胞无CPE变化或正常细胞形态记为“-”。
抑制效果计算：抑制病毒半数有效浓度(EC
50)
表4
| 克隆号 | IC 50(μg/ml) |
| 9E12 | 0.03 |
| 9D11 | 0.3 |
| 5B2 | 0.3 |
| 13A12 | 0.03 |
| 2G1 | 0.003 |
| 3A4 | 0.03 |
| 10D4 | 0.03 |
| 9A6 | 3.16 |
| 8G9 | 31.6 |
表4的结果说明，上述抗体对SARS-CoV-2真病毒均可实现有效中和。SARS-CoV-2真病毒的中和IC
50结果为，9E12为0.03μg/mL，9D11为0.3μg/mL，5B2为0.3μg/mL，13A12为0.03μg/mL，2G1为0.003μg/mL，3A4为0.03μg/mL，10D4为0.03μg/mL，9A6为3.16μg/mL，8G9为31.6μg/mL。上述抗体均实现了对SARS-CoV-2病毒的中和作用。
由此可见候选抗体均对真SARS-CoV-2病毒具有良好的中和活性，能够有效抑制SARS-CoV-2病毒的继续扩增。
实施例5候选抗体在动物体内的SARS-CoV-2病毒的中和活性测定
将实施例1制备的候选抗体施用于感染了SARS-CoV-2病毒的动物模型。通过定量PCR检测病毒含量的方法测定施用后所述候选抗体对SARS-CoV-2病毒的中和活性。结果发现，候选抗体均对动物体内的候选抗体均对具有良好的中和活性。
实施例6候选抗体对SARS-CoV-2结合动力学检测
采用CM5芯片(Cytiva 29149603)使用WA-1S1-His或者S蛋白三聚体(Spike trimer)作为抗原，检测单克隆抗体的结合动力学性质。
一、抗原偶联
缓冲液：PBS(Cytiva BR100672)
流速：10μL/min
抗原稀释液：Acetate pH 5.0(Cytiva BR100351)
抗原浓度：1μg/mL
氨基偶联试剂盒(Cytiva BR100050)：活化剂EDC+NHS 1∶1混合，封闭剂乙醇胺
将芯片活化700s，将稀释后的抗原偶联至约70RU水平，封闭多余未反应位点。
二、抗体结合
缓冲液：HBS-EP(Cytiva BR100669)
流速：30μL/min
抗体浓度：0.2μg/mL 2倍稀释至0.0125μg/mL
再生缓冲液：Glycine pH 1.5(Cytiva BR100354)
根据设置好的浓度排布，将稀释后的每种浓度的抗体分别加入对应的96孔板孔中，以结合120s，解离120s，再生洗脱30s为一个循环，从低浓度到高浓度依次上样。
亲和力结果如表5所示，IgG型单抗均可以高效与S蛋白三聚体结合，亲和力达到-10至-15M。
表5
实施例7候选抗体对Spike蛋白的亲和力研究
为避免“舞蹈效应”的影响，单克隆抗体2G1经过木瓜蛋白酶酶解后获得Fab片段，检测单价Fab与WA1/2020，Alpha，Beta，Gamma，Kappa，和Delta的S蛋白三聚体(Spike trimer)的结合动力学。
采用CM5芯片(Cytiva 29149603)使用WA1/2020，Alpha，Beta，Gamma，Kappa，和Delta的S蛋白三聚体作为抗原，检测单克隆抗体的结合动力学性质。
一、抗原偶联
缓冲液：PBS(Cytiva BR100672)
流速：10μL/min
抗原稀释液：Acetate pH 5.0(Cytiva BR100351)
抗原浓度：1μg/mL
氨基偶联试剂盒(Cytiva BR100050)：活化剂EDC+NHS 1：1混合，封闭剂乙醇胺将芯片活化700s，将稀释后的抗原偶联至约70RU水平，封闭多余未反应位点。
二、抗体结合
缓冲液：HBS-EP(Cytiva BR100669)
流速：30μL/min
抗体浓度：0.2μg/mL 2倍稀释至0.0125μg/mL
再生缓冲液：Glycine pH 1.5(Cytiva BR100354)
根据设置好的浓度排布，将稀释后的每种浓度的抗体分别加入对应的96孔板孔中，以结合120s，解离120s，再生洗脱30s为一个循环，从低浓度到高浓度依次上样。
结果如表6所示。
表6
| SARS-CoV-2 S蛋白三聚体 | K a(Ms -1) | K d(s -1) | K D(nM) |
| WA1/2020 | 1.03×10 6 | 1.05×10 -3 | 1.02 |
| Alpha | 8.72×10 5 | 7.55×10 -4 | 0.86 |
| Beta | 7.96×10 5 | 2.20×10 -3 | 2.77 |
| Gamma | 8.73×10 5 | 2.01×10 -3 | 2.30 |
| Kappa | 8.22×10 5 | 8.53×10 -4 | 1.04 |
| Delta | 2.80×10 6 | 4.27×10 -2 | 15.30 |
实施例8候选抗体对假病毒的中和能力检测
假病毒含有SARS-CoV-2表面Spike蛋白，可特异性侵染ACE2阳性的细胞，选择WA1/2020，D614G，Cluster 5，Alpha，Beta，Gamma和Delta的Spike蛋白制备的假病毒，根据以下步骤进行假病毒中和测活实验。
1.将处于对数生长期的ACE2-293T细胞以1×10
4/孔铺板到白色透底96孔板(Corning，3903)中；
2.第二天，用DMEM培养基(Gibco，C11995500BT)+10％FBS(Gibco，10270-106)稀释不同浓度的中和抗体(20，2，0.2，0.02，0.002，0.0002，0.00002μg/mL)；并在P2实验室中稀释适量体积的0.2μL/100μL的COV2-S蛋白假病毒(Yeasen，11903ES50)。
3.分别吸取55μL不同浓度的抗体和55μL稀释的假病毒混匀，并设置阴性对照和阳性对照孔，37℃孵育30min；
4.吸去96孔板中的培养基，加入100μL含有相应抗体-病毒混合液的培养基，在CO
2培养箱中继续培养；
5. 6h后，将含有病毒的培养基吸入含有84消毒液的废液缸中，84消毒液的比例不少于30％。然后加入100μL新鲜培养基，继续在CO
2培养箱中培养48h；
6.用封口膜在生物安全柜中将96孔板密封，并用75％酒精消毒96孔板外表面，然后取出，向每孔中加入90μL荧光素酶底物(Promega，E6120)，孵育3-5min后使用酶标仪读取各孔的荧光值。
7.根据荧光值计算各浓度下的抑制率。
结果如图3所示，图3的结果说明，单克隆抗体2G1可以有效中和各种假病毒。中和IC50为WA1/2020 0.0032μg/ml，D614G 0.0038μg/ml，Cluster 5 0.0002μg/ml，Alpha 0.0013μg/ml，Beta 0.0028μg/ml，Gamma 0.0005μg/mL，Delta 0.0082μg/ml。
实施例9候选抗体对真病毒的中和能力检测
2G1对突变株真病毒中和能力的研究。
使用SARS-CoV-2 WA1/2020(US_WA-1/2020分离株)、Alpha(B.1.1.7/UK，菌株：SARS-CoV-2/human/USA/CA_CDC_5574/2020),Beta(B.1.351/SA,Strain:hCoV-19/USA/MD-HP01542/2021),Gamma(P.1/Brazil,Strain:SARS-CoV-2/human/USA/MD-MDH-0841/2021)和Delta变体(B.1.617.2/Indian，菌株：GNL-751)突变体真病毒，进行病毒中和实验。简要方法包括：抗体在MEM培养基(Gibco)中以20μg/mL的浓度连续稀释3倍，以制备工作溶液。将稀释液加入等体积的100TCID50病毒中，并在室温下孵育1小时。将混合物加入具有汇合的Vero细胞的96孔板中。同时设置细胞空白对照和病毒感染对照。37℃、5％CO
2培养3天后，显微镜下观察细胞病变效应(CPE)，计数菌斑进行疗效评价。具有CPE变化的孔记录为“+”，否则记录为“-”。
根据以下等式计算IC50值：IC50＝Antilog(D-C×(50-B)/(A-B))。其中A表示大于50％的抑制率，B表示小于50％的抑制率，C为lg(稀释因子)，D为lg(抑制率小于50％时的样品浓度)。所有实验均在生物安全3级实验室进行。如表7所示，2G1对WA1/2020，Alpha，Beta，Gamma，Delta均具有高效的病毒中和能力。
表7
| 真病毒中和能力 | IC 50(μg/ml) | IC 100(μg/ml) |
| WA1/2020 | 0.0240 | 0.0411 |
| Alpha | 0.0138 | 0.0411 |
| Beta | 0.0046 | 0.0137 |
| Gamma | 0.0079 | 0.0137 |
| Delta | 0.0079 | 0.0411 |
实施例10候选抗体的体内生物学活性研究
10.1小鼠模型
AC70是人ACE2转基因小鼠(Taconic Biosciences，Cat#18222)，将AC70小鼠分为三组，对照组(PBS)、低剂量(2.2mg/mL单克隆抗体2G1)中剂量组(6.7mg/mL单克隆抗体 2G1)和高剂量(20mg/kg单克隆抗体2G1)，每组14只小鼠。所有小鼠均用100LD50的进行感染。感染后4小时给予第一剂单克隆抗体2G1和PBS；第二个和第三个分别在感染后第2天和第4天给药。每天至少对小鼠进行一次临床观察，并根据临床健康状况的描述。按1至4的等级评分，在标准化的1到4级评分系统中，1分是健康；2分是有竖起的皮毛和昏昏欲睡；3分是有额外的临床症状，如驼背姿势、眼眶收紧、呼吸频率增加和/或体重减轻>15％；4分是表示呼吸困难和/或紫绀、受刺激时不愿移动，或体重减轻≥20％需要立即安乐死。每组中的四只小鼠在感染后第4天被安乐死以评估病毒载量和肺和脑的组织病理学。在感染后长达14天，继续监测其余小鼠的发病率和活动力。
小鼠感染模型的构建方法参见图4。
检测感染后小鼠的体重，结果如图5所示。图5的结果说明，对于WA1/2020和Beta感染的小鼠，高中低三种剂量均无明显的体重降低，说明即使2.2mg/mL低剂量的单克隆抗体2G1足以中和病毒。Delta感染组，20mg/kg高剂量组动物体重无明显降低，6.7mg/kg剂量和2.2mg/kg剂量出现体重降低现象。
观察并对WA1/2020、Beta和Delta小鼠感染模型进行临床评分，结果如图6所示。图6的结果说明，即使2.2mg/kg的低剂量的单克隆抗体2G1，WA1/2020、Beta模型也没有明显的临床病症。而落在Delta模型中，20mg/kg高剂量下无临床病症出现，中低剂量出现临床反应。
根据小鼠安乐死原则，发生呼吸困难和/或紫绀、受刺激时不愿移动，或体重减轻≥20％需要立即安乐死，认为小鼠死亡，绘制生存曲线。观察并绘制WA1/2020、Beta和Delta小鼠感染模型的生存曲线，结果如图7所示。图7的结果说明，在WA1/2020和Beta感染模型中，高中低剂量均可以治疗小鼠不出现死亡，小鼠存活率达到100％，均可恢复健康状态。在Delta感染模型中，低剂量小鼠生存率为10％小鼠恢复至健康状态，中剂量55.6％的小鼠可以存活恢复至健康状态，高剂量组100％小鼠存活可恢复至健康状态。
10.2恒河猴模型
6-7岁恒河猴随机分为对照组，低剂量(10mg/kg)和高剂量(50mg/kg)组，每组一只雄性和一只雌性。每只动物用4mL 1×10
5TCID50病毒通过气管插管感染动物。感染后24小时静脉内给予抗体2G1抗体和PBS。持续监测恒河猴的疾病相关变化，每天测量体重和体温，采集咽拭子和肛门拭子样本进行病毒滴定。恒河猴感染模型的构建方法参见图8。
在感染后第7天，将动物安乐死并收集组织样本。使用QIAamp Viral RNA Mini Kit(Qiagen)提取病毒RNA。根据供应商的说明(
II One Step qRT-PCR
Green Kit，Vazyme Biotech Co.,Ltd)使用一步实时定量PCR以及RBD基因的引物对病毒RNA 进行定量，使用定量引物为：RBD-qF1：5'-CAATGGTTAAGGCAGG-3'(SEQ ID NO.101)；RBD-qR1：5'-CTCAAGGTCTGGATCACG-3'(SEQ ID NO.102)。
咽拭子检测恒河猴感染模型中的病毒RNA的含量，结果如图9所示。图9的结果说明，对照组动物病毒RNA载量仅在攻毒后第3,4和5天被检测出，病毒RNA载量范围处于10e3-10e7拷贝/mL之间，病毒复制高峰期在攻毒后第2天，略有波动。总体来看，病毒载量变化规律显示病毒在体内的增殖过程。高剂量组2只实验动物病毒RNA载量一直处于下降的趋势，从10e6拷贝/mL降至10e3拷贝/mL分别在攻毒后第3和第4天降至检测阈值以下检测不到病毒，低剂量组2只实验动物病毒RNA载量一直处于下降的趋势，从10e6拷贝/mL降至10e3拷贝/mL，并在攻毒后第4天降至检测阈值以下，检测不到病毒。
肛拭子检测恒河猴模型中的病毒RNA的含量，结果如图10所示。图10的结果说明，对照组的动物在第4，5和7天可以检测出病毒RNA在10e3-10e5拷贝/mL之间，而高剂量和低剂量均没有检测出病毒。
为了进一步了解病毒在上呼吸道和肺部不同组织中的分布，于攻毒后第7天采集了对照组和低、高剂量组动物气管、支气管、肺部不同部位的组织，测定了不同器官和组织中的病毒载量。结果如11所示，图11的结果表明：在感染后第7天，在对照组动物的气管和左右支气管中都检测到约1×10e5～1×10e7拷贝/g的病毒RNA。在高剂量组右中肺，左中肺，左下肺和左侧支气管可以检测到病毒，低剂量组仅在气管中发现病毒。
实施例11候选抗体的体内生物学活性研究
为了分析Spike(S)蛋白与2G1抗体的抗原抗体相互作用模式及结合位点，使用冷冻电镜单颗粒重构技术解析出新型冠状病毒(SARS-CoV-2)WA-1毒株三聚体S蛋白胞外区与2G1抗体复合物的三维结构，并确认在S蛋白上抗体结合的位点。
试验过程
1.三聚体S蛋白的表达与纯化
1.1三聚体S蛋白重组表达质粒的构建
使用一种改造过的S蛋白以提高此蛋白的稳定性，具体方案是：在S蛋白胞外区(1-1208位氨基酸，Genbank ID:QHD43416.1)的817位、892位、899位、942位、986位和987位引入脯氨酸突变；同时突变682到685位的furin酶切位点“RRAR”为“GSAS”；在S蛋白胞外区的C端融合T4 fibritin foldon辅助S蛋白胞外区形成三聚体；最后在C末端带1xFlag标签克隆到pCAG载体中。
1.2 S蛋白的表达纯化
使用HEK 293F细胞瞬时转染重组表达质粒来分泌表达S蛋白。当悬浮培养的HEK 293F细胞密度达到2.0×10
6/mL时进行转染。在1L HEK 293F细胞中，使用1mg S质粒与3mg PEI 4000混合孵育15min后加入到细胞当中，继续培养60h后收集细胞上清液用于纯化。
把转染得到的上清液过滤，使用缓冲液(25mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH8.0)进行浓缩置换去除细胞培养基。使用Anti-Fag M2树脂进行纯化，缓冲液(25mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH8.0)60mL洗去杂蛋白，然后用1×Flag peptide进行洗脱。洗脱液浓缩到2mL，使用分子筛层析柱(Superose 6 Increase 10/300GL，GE公司)进一步纯化得到三聚体S蛋白。
把所得S蛋白与2G1抗体以摩尔比1:5共同孵育1h后，浓缩后使用分子筛柱层析进一步纯化，去除过量的2G1抗体，得到S-2G1复合物用于冷冻电镜样品的制备。
2.冷冻样品的制备、数据收集以及单颗粒法三维重构
S-2G1复合物浓缩至2.5mg/mL，滴加3.3μL到经过亲水化处理的载网(Quantifoil Au R1.2/1.3)上，使用Vitrobot(Mark IV,Thermo Scientific)制样机器人，经历样品吸附、多余样品的吸去和样品液态乙烷中速冻等三个步骤制备冷冻电镜样品。
使用Titan Krios(FEI)300kV电镜配备Gatan K3相机进行数据收集。将制作好的冷冻电镜样品转移进电镜镜筒中，调试电镜至最佳状态，使用AutoEmation软件自动采集Movie stacks数据。设置离焦范围1.2μm-2.2μm，K3相机放大倍数81000倍，对应pixel size为
收集的每张图片有32帧，每帧曝光0.08s，总曝光时间2.56s。拍照总电子剂量约为
使用MotionCor2对收集到的原始图片进行漂移校正，之后对校正过的照片进行人工筛选，手动选择均匀清晰的电镜照片，去除质量不好或污染严重的图片。利用Relion 3.0.6自动挑选S蛋白和2G1复合物的颗粒。对所有颗粒进行二维分类后，选择匹配的颗粒进行三维模型重构。首先通过cryoSPARC进行两轮的三维分类，再选择适合的颗粒进行3D重塑，之后再利用Relion进行修正，得到S蛋白和2G1复合物的三维模型。为了进一步提高S蛋白和2G1的相互作用界面的分辨率，针对这一局部区域进行模型较正和优化，得到了RBD和2G1部分的三维模型。使用黄金标准的傅里叶壳层关联函数曲线来判定分辨率，判定的阈值设置为0.143。复合物纯化、数据收集以及单颗粒法三维重构的详细过程以及各项参数见图12-13和图14。其中图12a显示,分子筛层析纯化2G1与S蛋白复合物；图12b显示,S-2G1复合物最终3D模型的EμLer angle分布；图12c-12d显示，S-2G1复合体整体结构(c)和局部RBD-2G1结构(d)的局部分辨率；图12e显示,S-2G1(蓝色)和RBD-2G1(橙色)复合物分辨率的FSC曲线图；图12f，12g显示,优化后的S-2G1复合物模型FSC曲线。图13a显示S-2G1复合物代表性的冷冻电镜micrograph以及2D分类，2D分类中标尺为 10nm；图13b显示数据处理步骤。
g，RBD-2G1复合体精修模型的FSC曲线与f相同。
为了搭建SARS-CoV-2的S蛋白与2G1复合物的原子模型，以4A8(PDB ID：7C2L)为模板，以分子动力学柔性匹配把对应的原子模型叠合到上一步单颗粒重构方法得到的整体S-2G1和局部RBD-2G1的冷冻电镜密度文件当中。首先以抗体4A8为模板，得到2G1了Chainsaw模型；以局部优化的RBD-2G1密度文件为标准，使用Coot软件进一步对原子模型做手动调整，原则是使每个氨基酸残基的化学特征复合周围的密度云；最后使用Phenix软件优化整个原子模型，使用二级结构和几何约束进行校正，防止过度拟合。数据收集、3D模型重构和原子模型搭建的详细数据见图14。
试验结果
为了研究2G1抗体与S蛋白的结合模式，揭示2G1抗体的表位，使用冷冻电镜的方法解析了S-2G1复合物
分辨率结构(图15a，图15-16)。图15a为正交方向显示的S-2G1复合物的冷冻电镜密度图。2G1的重链和轻链分别为蓝色和青色。三聚体S蛋白的每个单体结构分别为灰色、橙色和粉红色。图15b-e显示2G1和RBD以及相邻RBD'之间的相互作用。RBD和2G1主要通过疏水相互作用(图15c和图15d)。2G1重链(CDRH3和CDRH1)位于相邻的RBD'(图15e)上方。
图16a分别用不同的颜色显示三种类似抗体(S2E12、B1-182.1和REGN10933)的表位边界，S2E12、B1-182.1和REGN10933的表位分别为红色、橙色和绿色。图16b显示2G1、S2E12、B1-182.1和REGN10933结合角度比较。2G1表位边界为蓝色。ACE2结合位点、2G1、S2E12、B1-182.1和REGN10933的表位边界叠合到RBD上，分别用黑色、蓝色、红色、橙色和绿色显示。以2G1抗体Fab中心点与RBD中心的连线为中心轴，S2E12、B1-182.1与中心轴的角度约为6°，REGN10933与主轴的角度约为13°。图16c显示2G1、ACE2、S2E12、B1-182.1和REGN10933在RBD上表位的氨基酸位置统计。
然而在此整体结构中，位于RBD和2G1相互作用界面的结构密度不清晰，因此采用局部优化的计算方法解析出2G1抗体与RBD结合域的亚复合物
分辨率结构，为准确分析2G1与RBD的相互作用提供结构基础(图15b)。在S-2G1复合物结构中，三个可溶的2G1抗体Fab区分别结合到三聚体S刺突蛋白的三个RBD结构域上面。同时此结构中，所有RBD处于“向下”构象，三聚体S蛋白整体处于一种锁定的构象(图15a)。除此之外，还发现在S蛋白中存在一个额外密度为脂肪酸亚油酸(LA)，这与文献报道的锁定构象S三聚体结构中LA的结合口袋位置一致。
通过对2G1和RBD结合界面的详细分析，发现抗体2G1结合在RBD尖端的loop区，此区域与ACE2受体结合位点存在部分重叠，并且不属于VOCs的突变热点区。2G1的重链主要通过CDRH1(氨基酸残基30至35位)、CDRH2(氨基酸残基50至65位)和CDRH3(氨基酸残基98至111位)三个互补决定区(CDR)参与RBD的相互作用；轻链主要通过CDRL1(氨基酸残基23至36位)和CDRL3(氨基酸残基91至100位)两个CDR区参与相互作用(图15b-e)。RBD和2G1之间结合界面主要由广泛疏水相互作用网络稳定，其中比较重要的相互作用有：RBD顶部loop区的Phe486与重链上的Tyr33、Tyr52和轻链上的Tyr34、Tyr93、Trp99通过疏水和/或-相互作用结合(图15c)。2G1重链的CDRH1和CDRH3处于相邻RBD’中LA结合口袋的正上方(图15b和15e)。把2G1与具有相似表位的三种抗体(S2E12、B1-182.1和REGN10933)进行比较(图16a-c)。结构比较分析表明，2G1的抗体表位与这三种抗体(S2E12、B1-182.1和REGN10933)有部分重叠，但它们具有不同的结合方向(图16b)。此外，2G1具有相对较窄的结合表位(F456、A475、G476、S477、T478、E484、G485、F486、N487、Y489)，这种较窄的表位可能具有不易被病毒突变所影响的优点，从而实现广谱的病毒中和能力(图16c)。
通过解析了S蛋白与2G1的复合物冷冻电镜结构，揭示出2G1能够结合锁定构象的S蛋白，在此结构中位于S三聚体的每个单体中RBD结构域都处于一种“向下”的构象。目前未发现结构数据库中有其他抗体可以结合这种锁定的构象。尽管2G1、S2E12和B1-182.1的表位比较相似，并且有部分重叠，但根据报道S2E12和B1-182.1在结构中与“向上”构象的RBD结合，而2G1能够结合锁定构象的S蛋白，这可能是由于2G1抗体结合的角度特殊导致的。在目前研究阶段，可以推测2G1产生中和活性的原因不仅是阻断ACE2与RBD的结合，也可能是通过与锁定构象的S蛋白结合阻止融合状态的S发生构象的变化。此外，位于RBD尖端特定位置的2G1抗体表位的氨基酸偏离了VOCs的突变热点，可能增加此抗体的广谱中和活性。因此，S-2G1的复合结构可能为开发疫苗和优化最佳联合疗法提供良好的参考。
以上详细描述了本申请的实施方式，但是，本申请并不限于上述实施方式中的具体细节，在本申请的技术构思范围内，可以对本申请的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本申请的保护范围。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本申请对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本申请的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本申请的思想，其同样应当视为本申请所公开的内容。
Claims (41)
- 特异性结合SARS-CoV-2的分离的抗原结合蛋白，其包含轻链可变区VL中的至少一个CDR，其中所述CDR包含SEQ ID NO:95所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述VL包含LCDR1，所述LCDR1包含SEQ ID NO:95所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-2中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述VL包含LCDR1，所述LCDR1包含SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-3中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述VL包含LCDR2，所述LCDR2包含SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-4中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述VL包含LCDR3，所述LCDR3包含SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:61中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-5中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述VL包含LCDR1和LCDR2，所述LCDR1包含SEQ ID NO:95所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-6中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述VL包含LCDR1和LCDR3，所述LCDR1包含SEQ ID NO:95所示的氨基酸序列，所述LCDR3包含SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:61中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-7中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包含SEQ ID NO:95所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54中任一项所示的氨基酸序列；所述LCDR3包含SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:61中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-8中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述VL包括框架区L-FR1，L-FR2，L-FR3和L-FR4，其中所述L-FR1的C末端与所述LCDR1的N末端直接或间接相连，且所述L-FR1包含SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:64中任一项 所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求9中所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述L-FR2位于所述LCDR1与所述LCDR2之间，且所述L-FR2包含SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70和SEQ ID NO:71中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求9-10中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述L-FR3位于所述LCDR2与所述LCDR3之间，且所述L-FR3包含SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:78中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求9-11中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述L-FR4的N末端与所述LCDR3的C末端直接或间接相连，且所述L-FR4包含SEQ ID NO:79和SEQ ID NO:80中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-12中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述VL包含SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93和SEQ ID NO:94中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-13中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包括抗体轻链恒定区。
- 根据权利要求1-14中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含重链可变区VH，所述VH包含HCDR1，所述HCDR1包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-15中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含重链可变区VH，所述VH包含HCDR2，所述HCDR2包含SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-16中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含重链可变区VH，所述VH包含HCDR3，所述HCDR3包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-17中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含重链可变区VH，所述VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7中任一项 所示的氨基酸序列；所述HCDR2包含SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14中任一项所示的氨基酸序列；所述HCDR3包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-18中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述VH包括框架区H-FR1，H-FR2，H-FR3和H-FR4，其中所述H-FR1的C末端与所述HCDR1的N末端直接或间接相连，且所述H-FR1包含SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求19中所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述H-FR2位于所述HCDR1与所述HCDR2之间，且所述H-FR2包含SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求19-20中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述H-FR3位于所述HCDR2与所述HCDR3之间，且所述H-FR3包含SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:41中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求19-21中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述H-FR4的N末端与所述HCDR3的C末端直接或间接相连，且所述H-FR4包含SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求19-22中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述VH包含SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86和SEQ ID NO:87中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-23中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包括抗体重链恒定区。
- 根据权利要求1-24中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其具有中和SARS-CoV-2的活性。
- 根据权利要求1-25中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包括抗体或其抗原结合片段。
- 根据权利要求26所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合片段包括Fab，Fab’，F(ab)2，Fv片段，F(ab’)2，scFv，di-scFv和/或dAb。
- 根据权利要求26-27中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗体为全人源抗体。
- 分离的一种或多种核酸分子，其编码权利要求1-28中任一项所述的分离的抗原结合蛋白中的所述VL。
- 分离的一种或多种核酸分子，其编码权利要求1-28中任一项所述的分离的抗原结合蛋白中的所述VH。
- 分离的一种或多种核酸分子，其编码权利要求1-28中任一项所述的分离的抗原结合蛋白。
- 载体，其包含根据权利要求29-31中任一项所述的核酸分子。
- 细胞，其包含根据权利要求29-31中任一项所述的核酸分子或根据权利要求32所述的载体。
- 根据权利要求33所述的细胞，其表达权利要求1-28中任一项所述的分离的抗原结合蛋白。
- 制备权利要求1-28中任一项所述的分离的抗原结合蛋白的方法，所述方法包括在使得权利要求1-28中任一项所述的分离的抗原结合蛋白表达的条件下，培养根据权利要求33所述的细胞。
- 药物组合物，其包含权利要求1-28中任一项所述的分离的抗原结合蛋白、权利要求29-31中任一项所述的核酸分子、权利要求32所述的载体和/或权利要求33-34中任一项所述的细胞，以及任选地药学上可接受的佐剂。
- 权利要求1-28中任一项所述的分离的抗原结合蛋白、权利要求29-31中任一项所述的核酸分子、权利要求32所述的载体、权利要求33-34中任一项所述的细胞和/或权利要求36所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防、缓解和/或治疗冠状病毒的感染。
- 根据权利要求37所述的用途，其中所述冠状病毒的感染包括COVID-19。
- 一种预防、缓解和/或治疗冠状病毒的感染的方法，其包括施用权利要求1-28中任一项所述的分离的抗原结合蛋白、权利要求29-31中任一项所述的核酸分子、权利要求32所述的载体、权利要求33-34中任一项所述的细胞和/或权利要求36所述的药物组合物。
- 权利要求1-28中任一项所述的分离的抗原结合蛋白、权利要求29-31中任一项所述的核酸分子、权利要求32所述的载体、权利要求33-34中任一项所述的细胞和/或权利要求36所述的药物组合物，其在预防、缓解和/或治疗冠状病毒的感染中的应用。
- 检测SARS-CoV-2的方法，其包括以下的步骤，施用权利要求1-28中任一项所述的分离的抗原结合蛋白、权利要求29-31中任一项所述的核酸分子、权利要求32所述的载体、权利要求33-34中任一项所述的细胞和/或权利要求36所述的药物组合物。
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