EA030319B1

EA030319B1 - Антитела, нейтрализующие rsv, mpv и pvm, и их применения

Info

Publication number: EA030319B1
Application number: EA201491724A
Authority: EA
Inventors: Давиде Корти
Original assignee: Хумабс Биомед Са
Priority date: 2012-03-20
Filing date: 2013-03-14
Publication date: 2018-07-31
Also published as: US20210115114A1; US11421020B2; JP6445423B2; NZ630920A; CN107880121A; CA2865856C; ES2657470T3; IN2014DN07299A; US10072071B2; JP2022132244A; JP2019076091A; EP2828293A1; KR102149069B1; CN104350069B; US20190153073A1; KR20140135259A; EP2828293B1; JP6722264B2; PL2828293T3; AU2013237087B2

Abstract

Изобретение относится к антителам и их антигенсвязывающих фрагментам, которые нейтрализуют инфекцию RSV, MPV и PVM. Изобретение также относится к нуклеиновым кислотам, которые кодируют, иммортализованным В-клеткам и культивируемым плазматическим клеткам, которые продуцируют, и к полипептидам, которые связываются с такими антителами и фрагментами антител. Кроме того, изобретение относится к применению антител, фрагментов антител и полипептидов, распознаваемых антителами по изобретению в способах скрининга, а также в диагностике, лечении и профилактике инфекции RSV или MPV и смешанной инфекции RSV и MPV.

Description

Изобретение относится к антителам и их антигенсвязывающих фрагментам, которые нейтрализуют инфекцию Ρδν, ΜΡν и ΡνΜ. Изобретение также относится к нуклеиновым кислотам, которые кодируют, иммортализованным В-клеткам и культивируемым плазматическим клеткам, которые продуцируют, и к полипептидам, которые связываются с такими антителами и фрагментами антител. Кроме того, изобретение относится к применению антител, фрагментов антител и полипептидов, распознаваемых антителами по изобретению в способах скрининга, а также в диагностике, лечении и профилактике инфекции Ρδν или ΜΡν и смешанной инфекции Ρδν и ΜΡν.

По настоящей заявке испрашивается преимущество приоритета предварительной заявки США № 61/613197, зарегистрированной 20 марта 2012 года, и предварительной заявки США № 61/655310, зарегистрированной 4 июня 2012 года, описания которых, таким образом, включены посредством ссылки, как если бы они были полностью описаны в настоящем описании.

Предшествующий уровень техники

Респираторно-синцитиальный вирус (К8У), метапневмовирус (МРУ) и вирус пневмонии мышей представляют собой вирусы вирусной инфекции верхних дыхательных путей, принадлежащие к семейству парамиксовирусов, которые поражают общую целевую популяцию и представляют собой основное нарушение здоровья у новорожденных и пациентов с иммунной недостаточностью.

К8У представляет собой основную причину острого заболевания дыхательных путей у детей и взрослых во всем мире. Для 0,5-3,2% детей с инфекцией К8У необходима госпитализация (ТЬотрзоп ^.^. е! а1., 2003, .ТАМА: ТЬе 1опгпа1 о! 1Ье Атепсаи Мейюа1 АззоааЬоп, 289:179-186), и от 5 до 10% детей страдают хронической тяжелой инфекцией, фактор, для которого полагают, что он провоцирует бронхиальную обструкцию и астмаподобные симптомы позже в детстве. Иммунитет к К8У по-видимому является непродолжительным, таким образом, реинфекции являются частыми (Одга, 2003, РаеФаЬгс Кезр1га1огу Ре\ае\\ь 5 8ирр1 А:8119-126).

МРУ человека впервые выделили в 2001 году, и в настоящее время признано, что он является второй основной причиной острого заболевания дыхательных путей у детей и взрослых; оценивают, что он инфицирует более 50% детей в возрасте двух лет и практически всех детей в возрасте пять лет. МРУ является причиной приблизительно от 5 до 15% случаев респираторного заболевания у госпитализированных детей младшего возраста (А1!о, 2004, ТЬе 1опгпа1 о! !Ье Атепсап Воагй о! РатЪу РгасОсе/Атепсап Воагй о! РатЪу РгасЬсе, 17:466-469; ^ЪЬатз е! а1., 2004, N. Еи§1. I. Мей., 350:443-450). Инфекция МРУ представляет собой значительное бремя заболевания у находящихся в группе риска недоношенных детей, хронического заболевания легких недоношенных детей, застойное заболевание сердца и иммунодефицита (Магйпо е! а1., 2005, Вю1оду о! В1оой апй Магго\у Тгап8р1ап1аЬоп: 1опгпа1 о! !Ье Атепсап 8ос1е1у Гог В1оой апй Магготе ТгашркпИаЬоп. 11:781-796).

Смешанные инфекции МРУ и К8У могут являться общими, учитывая их распространенность и перекрывающиеся зимние эпидемии. Хотя остается неясным, может ли возникать синергическая патология между этими двумя вирусами, в частности, у некоторых детей со смешанной инфекцией МРУ и К8У наблюдали обострения, приводящие к тяжелому заболеванию дыхательных путей (ОгееизЫ, 2003, Етегщпд [пШсНот-. ЭНеа^е 9:372).

К8У, который принадлежит к роду Рпешпоутв подсемейства Рпеитоутшае, и МРУ, который принадлежит к роду Ме1арпептоу|гп5 подсемейства Рпеитоутшае, обладают некоторыми сходствами в своей генетической структуре, несмотря на то что МРУ не содержит неструктурные гены N81 и N82, встречающиеся у К8У. Оболочки К8У и МРУ содержат три вирусных кодируемых трансмембранных поверхностных гликопротеина: основной белок присоединения О, слитый белок Р и малый гидрофобный белок 8Н. Несмотря на то что оболочки К8У и МРУ содержат белки, которые являются функционально сходными, тем не менее, следует отметить, что Р-белки К8У и МРУ обладают только 33% идентичностью аминокислотных последовательностей. Кроме того, антисыворотка, образуемая против К8У или МРУ, не дает нейтрализующей перекрестной реакции для обоих вирусов (\Ууйе е! а1., 2003, АпЬупа1 КезеагсЬ, 60:51-59), и к настоящему времени не выделили моноклональные антитела, которые способны давать нейтрализующую перекрестную реакцию для обоих К8У и МРУ.

Р-гликопротеины К8У и МРУ контролируют проникновение вируса в результате слияния оболочки вириона и плазматической мембраны клетки-хозяина. В дальнейшем при инфекции Р-белок, экспрессируемый на клеточной поверхности, может опосредовать слияние с соседними клетками с образованием синцитиев (СоШпз е! а1., 1984 РNА8, 81:7683-7687). В обоих случаях Ν-конец Р-субъединицы, который получают протеолитическим расщеплением и который содержит гидрофобный фрагмент аминокислот, называемый пептидом слияния, встраивается непосредственно в мембрану-мишень для инициации слияния. После связывания с клеткой-мишенью и последующей активацией метастабильный Р-белок до слияния претерпевает серию структурных перестроек, которые приводят к встраиванию пептида слияния в мембрану клетки-мишени с последующим образованием стабильного спирального тяжа, который образует по мере того, как вирусная и клеточная мембраны сближаются. Такие структурные изменения приводят к образованию стабильного Р-белка после слияния.

В настоящее время вакцины против инфекции К8У или МРУ являются недоступными. Было обнаружено, что вакцины с инактивированным формалином К8У и с добавлением алюминия в качестве адъюванта (Р1-К8У), тестируемые в 1960 гг., провоцируют у детей развернутое заболевание после естественной инфекции К8У, приводя к сильной лихорадке и тяжелой пневмонии, что приводит к высоким коэффициентам госпитализации и даже некоторым случаям со смертельным исходом (Ри1дтЪт е! а1., 1969, Атепсап 1опгпа1 о! Ер1йетю1оду, 89:435-448; Кар1к1ап е! а1., 1969, Атепсап 1опгпа1 о! Ер1йетю1оду, 89:405-421; К1т е! а1., 1969, Атепсап 1опгпа1 о! Ер1йетю1оду, 89:422-434). Аналогично, для вакцин с инактивированным формалином МРУ продемонстрировали иммуноопосредованное развернутое заболевание у молодых яванских макак (йе 8\уаг1 е! а1., 2007, Уассше, 25:8518-8528). Кроме того,

- 1 030319 не было доказано, что противовирусные терапии, такие как рибавирин, являются эффективными при инфекции К§У или МРУ.

Из эпидемиологических исследований, а также из исследований на животных было получено доказательство роли антител в сыворотке в защите против вируса К§У. У детей титры материнских антител коррелируют с устойчивостью к серьезному заболеванию (С1е/еп с( а1., 1981, ТЬе 1оигпа1 оГ Реб1аЬтс8, 98:708-715), и у взрослых частота возникновения и тяжесть поражения нижних дыхательных путей снижается в присутствии высоких уровней нейтрализующих антитела против К8У в сыворотке (МсШокЬ е( а1., 1978, ТЬе 1оигпа1 оГ 1пГесЬои8 О18еа8е8, 138:24-32). Для профилактики инфекции К8У у недоношенных новорожденных детей зарегистрировано моноклональное антитело паливизумаб (синагис). Однако паливизумаб не всегда является эффективным для профилактики инфекции К8У и не является терапевтически эффективным. Кроме того, длительная репликация в легких К8У в присутствии паливизумаба у животных сопровождается появлением устойчивых штаммов вируса (йЬао апб §и11епбег, 2005, 1оита1 оГ Уно1о§у, 79:3962-3968). В настоящее время не существует моноклональных антител для лечения или профилактики инфекции МРУ.

Отсутствие хорошо работающей модели на животных для наиболее тяжелых форм инфекции К8У обусловлено тем фактом, что К8У и МРУ представляют собой патогены Рпеитоу1ги8 определенного хозяина. Разработка новых лекарственных средств для терапии инфекций К8У и МРУ была затруднена отсутствием модели на животных, способной воспроизводить все симптомы и тяжесть заболевания человека. Фактически, К8У и МРУ не являются природным патогеном мыши и индуцируют только ограниченную минимально симптоматическую и быстро прекращающуюся первичную инфекцию в ответ на массивный нефизиологический инокулят вируса. Вирус пневмонии мышей (РУМ) представляет собой природный патоген Рпеитоунц8 грызунов, который принадлежит к тому же семейству, подсемейству и роду (Рпеитоу1ги8) К8У человека и крупнорогатого скота. Р-белок РУМ обладает только 40% идентичностью аминокислот с Р-белком К8У человека, но обладает такой же генетической организацией, за исключением перекрытия М2-Ь, которое присутствует в К8У, но отсутствует в РУМ. Инфекция природным патогеном РУМ мыши воспроизводит многие признаки и симптомы наиболее тяжелых форм Κδ У, как это проявляется у являющихся человеком детей. Инфекция РУМ характеризуется быстрой репликацией вируса, сопровождающейся массивным воспалительным ответом, который приводит к дыхательной недостаточности и смерти (Ко8етЬег§ апб ИотасЬо№8ке, 2008, 1ттипо1оду ЬеЬег, 118:6-12). Таким образом, считают, что инфекция РУМ у мышей представляет собой наиболее релевантную модель на животных тяжелых инфекций ΚδΥ и МРУ людей.

Отсутствие профилактического лечения инфекции МРУ и вакцин против инфекций ΚδΥ и МРУ, а также терапевтической эффективности паливизумаба указывает на потребность новых профилактических и терапевтических средств против таких значимых патогенов человека. Учитывая широкую распространенность и вероятность смешанной инфекции, весьма желательным является наличие одного средства, которое способно обеспечивать профилактику, а также лечение или уменьшение инфекции ΚδΥ и МРУ, и наличие модели на животных, на которой можно тестировать средство. Таким образом, существует необходимость в перекрестно реагирующих нейтрализующих антителах широкого спектра, которые защищают от широкого спектра парамиксовирусов, например, по меньшей мере, ΚδΥ и МРУ и предпочтительно ΚδΥ, МРУ и РУМ.

Сущность изобретения

Изобретение частично основано на открытии нейтрализующих антител широкого спектра, которые нейтрализуют инфекцию ΚδΥ, МРУ и РУМ, а также полипептидов, с которыми связываются антитела по изобретению. Таким образом, в одном из аспектов изобретения изобретение содержит выделенное антитело, например моноклональное антитело, антитело человека, моноклональное антитело человека, вариант антитела или антигенсвязывающий фрагмент, которые дают перекрестную реакцию нейтрализации инфекции ΚδΥ, МРУ, и РУМ.

В одном из вариантов осуществления изобретение содержит выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который нейтрализует инфекцию ΚδΥ и МРУ. В другом варианте осуществления изобретения изобретение содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который нейтрализует инфекцию ΚδΥ, МРУ и РУМ.

В другом варианте осуществления изобретение содержит выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с Р-белком ΚδΥ до слияния и не связывается с Р-белком ΚδΥ после слияния. В еще одном варианте осуществления изобретение содержит выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с Р-белком ΚδΥ и МРУ до слияния и не связывается с Р-белком ΚδΥ и МРУ после слияния. В еще одном варианте осуществления изобретение содержит выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с Р-белком ΚδΥ, МРУ и РУМ до слияния и не связывается с Р-белок ΚδΥ и МРУ после слияния.

В другом варианте осуществления изобретение содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий по меньшей мере одну последовательность определяющей комплементарность области (СИК), обладающей по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с любой одной

- 2 030319 из 8ЕО ΙΌ N0:1-6, 19-23, 35, 39-42 или 53-54, где антитело нейтрализует инфекцию Р8У, МРУ и РУМ.

В другом варианте осуществления изобретение содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий тяжелую цепь 0ΌΡ1 с аминокислотной последовательностью 8Е0 ГО N0:1 или 8Е0 ГО N0:19, тяжелую цепь 0ΌΡ2 с аминокислотной последовательностью 8Е0 ГО N0:2, 8Е0 ГО N0:20 или 8Е0 ГО N0:39 и тяжелую цепь 0ΌΡ3 с аминокислотной последовательностью 8Е0 ГО N0:3, 8Е0 ГО N0:21, 8Е0 ГО N0:40 или 8Е0 ГО N0:53, где антитело нейтрализует инфекцию Р8У, МРУ и РУМ. В другом варианте осуществления изобретения изобретение содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий легкую цепь 0ΌΡ1 с аминокислотной последовательностью 8Е0 ГО N0:4, легкую цепь 0ΌΡ2 с аминокислотной последовательностью 8Е0 ГО N0:5, 8Е0 ГО N0:22 или 8Е0 ГО N0:41 и легкую цепь 0ΌΡ3 с аминокислотной последовательностью 8Е0 ГО N0:6, 8Е0 ГО N0:23, 8Е0 ГО N0:35, 8Е0 ГО N0:42 или 8Е0 ГО N0:54, где антитело нейтрализует инфекцию Р8У, МРУ и РУМ.

В еще одном варианте осуществления изобретение содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, где антитело содержит: (ί) последовательности 0ΌΡ1, 0ΌΡ2 и 0ΌΡ3 тяжелой цепи, как указано в 8Е0 ГО N0:1, 8Е0 ГО N0:2 и 8Е0 ГО N0:3 соответственно, и последовательности 0ΌΡ1, 0ΌΡ2 и 0ΌΡ3 легкой цепи, как указано в 8Е0 ГО N0:4, 8Е0 ГО N0:5 и 8Е0 ГО N0:35 соответственно; (ίί) последовательности 0ΌΡ1, 0ΌΡ2 и 0ΌΡ3 тяжелой цепи, как указано в 8Е0 ГО N0:1, 8Е0 ГО N0:2 и 8Е0 ГО N0:3 соответственно, и последовательности 0ΌΡ1, 0ΌΡ2 и 0ΌΡ3 легкой цепи, как указано в 8Е0 ГО N0:4, 8Е0 ГО N0:5 и 8Е0 ГО N0:6 соответственно; (ίίί) последовательности 0ΌΡ1, 0ΌΡ2 и 0ΌΡ3 тяжелой цепи, как указано в 8Е0 ГО N0:1, 8Е0 ГО N0:39 и 8Е0 ГО N0:40 соответственно, и последовательности 0ΌΡ1, 0ΌΡ2 и 0ΌΡ3 легкой цепи, как указано в 8Е0 ГО N0:4, 8Е0 ГО N0:41 и 8Е0 ГО N0:42 соответственно (ίν) последовательности 0ΌΡ1, 0ΌΡ2 и 0ΌΡ3 тяжелой цепи, как указано в 8Е0 ГО N0:1, 8Е0 ГО N0:39 и 8Е0 ГО N0:40 соответственно, и последовательности 0ΌΡ1, 0ΌΡ2 и 0ΌΡ3 легкой цепи, как указано в 8Е0 ГО N0:4, 8Е0 ГО N0:5 и 8Е0 ГО N0:6 соответственно; (ν) последовательности 0ΌΡ1, 0ΌΡ2 и 0ΌΡ3 тяжелой цепи, как указано в 8Е0 ГО N0:1, 8Е0 ГО N0:2 и 8Е0 ГО N0:3 соответственно, и последовательности 0ΌΡ1, 0ΌΡ2 и 0ΌΡ3 легкой цепи, как указано в 8Е0 ГО N0:4, 8Е0 ГО N0:41 и 8Е0 ГО N0:42 соответственно, и где антитело нейтрализует инфекцию Р8У, МРУ и РУМ.

В еще одном варианте осуществления изобретения изобретение содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, где антитело содержит: (ί) последовательности 0ΌΡ1, 0ΌΡ2 и 0ΌΡ3 тяжелой цепи, как указано в 8Е0 ГО N0:19, 8Е0 ГО N0:20 и 8Е0 ГО N0:21 соответственно, и последовательности 0ΌΡ1, 0ΌΡ2 и 0ΌΡ3 легкой цепи, как указано в 8Е0 ГО N0:4, 8Е0 ГО N0:22 и 8Е0 ГО N0:23 соответственно; (ίί) последовательности 0ΌΡ1, 0ΌΡ2 и 0ΌΡ3 тяжелой цепи, как указано в 8Е0 ГО N0:1, 8Е0 ГО N0:39 и 8Е0 ГО N0:53 соответственно, и последовательности 0ΌΡ1, 0ΌΡ2 и 0ΌΡ3 легкой цепи, как указано в 8Е0 ГО N0:4, 8Е0 ГО N0:41 и 8Е0 ГО N0:54 соответственно; (ίίί) последовательности 0ΌΡ1, 0ΌΡ2 и 0ΌΡ3 тяжелой цепи, как указано в 8Е0 ГО N0:1, 8Е0 ГО N0:39 и 8Е0 ГО N0:53 соответственно, и последовательности 0ΌΡ1, 0ΌΡ2 и 0ΌΡ3 легкой цепи, как указано в 8Е0 ГО N0:4, 8Е0 ГО N0:22 и 8Е0ГО N0:23 соответственно, или (ίν) последовательности 0ΌΡ1, 0ΌΡ2 и 0ΌΡ3 тяжелой цепи, как указано в 8Е0 ГО N0:19, 8Е0 ГО N0:20 и 8Е0 ГО N0:21 соответственно, и последовательности 0ΌΡ1, 0ΌΡ2 и 0ΌΡ3 легкой цепи, как указано в 8Е0 ГО N0:4, 8Е0 ГО N0:41 и 8Е0 ГО N0:54 соответственно, и где антитело нейтрализует инфекцию Р8У, МРУ и РУМ.

В еще одном варианте осуществления изобретения изобретение содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, где антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:17, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:37; или вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:13, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:14; или вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:17, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:14; или вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:49, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:50; или вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:49, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:14; или вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:17, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:50, и где антитело нейтрализует инфекцию Р8У, МРУ и РУМ.

В еще одном варианте осуществления изобретения изобретение содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, где антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:29, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:30; или вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:33, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:30; или вариабельную область тяжелой це- 3 030319 пи, содержащую аминокислотную последовательность §ЕЦ ГО N0:59, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность §ЕЦ ГО N0:60; или вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность §ЕЦ ГО N0:59, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность §ЕЦ ГО N0:30; или вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность §ЕЦ ГО N0:33, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность §ЕЦ ГО N0:60, и где антитело нейтрализует инфекцию К8У, МРУ и РУМ.

Изобретение дополнительно содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описываемый в настоящем описании как НМВ3210 (или 3210) или НМВ2430 (или 2430). В другом варианте осуществления изобретение содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который нейтрализует инфекцию К8У, МРУ и РУМ, где антитело или его фрагмент экспрессируется клоном иммортализованных В-клеток, который продуцирует НМВ3210 или НМВ2430.

В другом аспекте изобретение содержит молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую полинуклеотид, кодирующий антитело или фрагмент антитела по изобретению. В еще одном аспекте изобретение содержит вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по изобретению. Изобретение также содержит клетку, которая экспрессирует антитело по изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент. В другом аспекте изобретение содержит выделенный или очищенный иммуногенный полипептид, содержащий эпитоп, который связывается с антителом или антигенсвязывающим фрагментом по изобретению.

Изобретение дополнительно содержит фармацевтическую композицию, содержащую антитело по изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент, молекулу нуклеиновой кислоты по изобретению, вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по изобретению, клетку, экспрессирующую антитело или фрагмент антитела по изобретению, или иммуногенный полипептид по изобретению и фармацевтически приемлемый разбавитель или носитель. Изобретение также содержат фармацевтическую композицию, содержащую первое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент и второе антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, где первое антитело представляет собой антитело по изобретению, и второе антитело представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который нейтрализует инфекцию К8У, или МРУ, или К8У и МРУ, или все три К8У, МРУ и РУМ.

Также предусматривают, что в объем изобретения входит применение антитела по изобретению или его антигенсвязывающего фрагмента, нуклеиновой кислоты по изобретению, вектора, содержащего нуклеиновую кислоту по изобретению, клетки, экспрессирующей вектор по изобретению, выделенного или очищенного иммуногенного полипептида, содержащего эпитоп, который связывается с антителом или фрагментом антитела по изобретению, или фармацевтической композиции по изобретению (ί) в производстве лекарственного средства для лечения или ослабления смешанной инфекции К8У или МРУ или К8У и МРУ, (ίί) в вакцине или (ίίί) при диагностике инфекции вируса К8У и/или МРУ. Кроме того, также предусматривают, что в объем изобретения входит применение антитела по изобретению или его антигенсвязывающего фрагмента для мониторинга качества вакцины против К8У, или МРУ, или К8У и МРУ, посредством проверки того, что антиген указанной вакцины содержит специфический эпитоп в правильной конформации.

В другом аспекте изобретение включает способ лечения или ослабления инфекции К8У и МРУ или снижения риска развития инфекции К8У и МРУ, включающий введение нуждающемуся в этом индивидууму терапевтически эффективного количества антитела или антигенсвязывающего фрагмента антитела по изобретению.

В дополнительном аспекте изобретение содержит полипептид, который специфически связывается с антителом по изобретению или его антигенсвязывающим фрагментом, для использования (ί) в терапии, (ίί) для производства лекарственного средства для лечения или ослабления инфекции К8У, или МРУ, или К8У и МРУ, (ίίί) в качестве вакцины или (ίν) при скрининге лигандов, способных нейтрализовать инфекцию К8У, или МРУ, или К8У и МРУ.

Описание чертежей

На фиг. 1 представлены результаты скрининга моноклональных антител, продуцируемых иммортализованными ЕВУ В-клетками памяти от 7 доноров (доноры 1-7), на их способность нейтрализовать инфекцию вируса К8У или МРУ ίη νίίτο.

На фиг. 2 представлены результаты нейтрализации К8У и МРУ моноклональными антителами НМВ2430, НМВ3210, шЛЬ 234 и паливизумабом.

На фиг. 3 представлено связывание Р-белка К8У или белка токсина столбняка моноклональными антителами мотавизумаб, тАЬ 234, НМВ2430 и НМВ3210, как измеряют ЕЬКА.

На фиг. 4 представлено связывание меченых моноклональных антител с инфицированными К8У клетками Нер-2 в присутствии большого избытка указанных немеченых антител.

На фиг. 5 представлено связывание моноклональных антител НМВ2430, НМВ3210, тАЬ 234 и мотавизумаба с Р-белком К8У из лизатов инфицированных К8У клеток Нер-2 в восстановительных или невосстановительных условиях, как измеряют анализом вестерн-блоттинга.

На фиг. 6 представлено связывание моноклональных антител НМВ3210 и тАЬ 234 с Р-белком МРУ

- 4 030319 из лизатов инфицированных МРУ клеток ЬЬС-МК2 в восстановительных или невосстановительных условиях, как измеряют анализом вестерн-блоттинга.

На фиг. 7 представлены результаты нейтрализации длинного штамма К8У и изолята ΡΖ-ΜΑΚΜ6 моноклональными антителами НМВ2430, НМВ3210, шАЬ234 и паливизумабом.

На фиг. 8 представлены результаты анализа ΗΜΒ3210ν2 в геле δΌδ-ΡΑΟΕ в восстановительных условиях после инкубации в присутствии (+) или отсутствие (-)й-гликозидазы ΡΝΟ-азы Р. Черной рамкой выделена минорная фракция легкой цепи НМВ3210, которая является гликозилированной.

На фиг. 9 представлены результаты нейтрализации 1-РУ 03/01-6621 МРУ и А2 К8У моноклональными антителами ΗΜΒ3210ν2 и ΗΜΒ3210ν3.

На фиг. 10 представлены результаты нейтрализации панели штаммов МРУ и К8У моноклональными антителами ΗΜΒ3210ν2 и ΗΜΒ3210ν3.

На фиг. 11 представлены результаты нейтрализации 1-РУ 03/01-6621 МРУ и А2 К8У вариантами моноклональных антител НМВ3210 и НМВ2430, подвергшихся модификации на уровне генов зародышевого типа.

На фиг. 12 представлены результаты анализа эксклюзионной хроматографии рекомбинантного Рбелка К8У после слияния, инкубируемого совместно с НМВ3210 или паливизумабом или без них.

На фиг. 13 представлены результаты анализа эксклюзионной хроматографии рекомбинантного Рбелка К8У до слияния, инкубируемого совместно с НМВ3210 или паливизумабом или без них.

На фиг. 14 представлено связывание ΗΜΒ3210ν3 или паливизумаба (ΡУΖ) с Р-белками К8У до слияния и после слияния, как измеряют поверхностным плазмонным резонансом (§РК).

На фиг. 15 представлена нейтрализация вируса и ингибирование распространения вируса моноклональными антителами человека ΗΜΒ3210ν3 и Ό25.

На фиг. 16 представлена профилактическая эффективность ΗΜΒ3210ν3 и паливизумаба при инфекции К8У или МРУ.

На фиг. 17 представлена терапевтическая эффективность НМВ3210 у мышей с недостаточностью 8ТАТ1, инфицированных К8У.

На фиг. 18 представлена профилактическая и терапевтическая эффективность НМВ3210 у мышей, инфицированных летальной дозой РУМ.

На фиг. 19 представлено блокирование повышения титров вируса в легких у мышей, обрабатываемых ΗΜΒ3210ν3 на сутки 3, 4 или 5 после летальной инфекции РУМ.

На фиг. 20 представлена профилактическая и терапевтическая эффективность вариантов ΗΜΒ3210ν3, несущих Рс дикого типа или мутацию ЬАЬА, у мышей, инфицированных летальной дозой РУМ.

На фиг. 21 представлено выравнивание, указывающее на высокую консервативность пептида УЪ§АЬК, распознаваемого НМВ3210 в последовательностях К8У, ВК8У, РУМ и МРУ, по сравнению с вирусов парагриппа 5 (Р1У5).

На фиг. 22 представлены модель Р-белка К8У до слияния, демонстрирующая расположение пептида УЪ§АРК и ближайшего участка паливизумаба (ΡУΖ), и ленточные диаграммы, указывающие на перегруппировку участков ΡУΖ и ΗΜΒ3210ν3 Р-белка К8У в конформации до и после слияния.

На фиг. 23 продемонстрирована высокая степень консервативности корового эпитопа НМВ3210 в штаммах 364 К8У, 162 МРУ, 8 ВК8У и 5 РУМ.

На фиг. 24А, 24В и 24С представлены последовательности различных вариантов тяжелых и легких цепей НМВ3210.

На фиг. 25А и 25В представлены последовательности различных вариантов тяжелых и легких цепей НМВ2430.

Подробное описание

Изобретение частично основано на открытии и выделении антител, которые дают перекрестную реакцию нейтрализации с К8У и МРУ или К8У, МРУ и РУМ, а также эпитопов, с которыми связываются антитела по изобретению. Такие антитела являются желательными, вследствие того, что для нейтрализации К8У и МРУ или К8У, МРУ и РУМ необходимыми являются только одно или несколько антител. Кроме того, для снижения затрат на получение лекарственных средств, содержащих антитела, для лечения инфекции К8У и/или МРУ перекрестно нейтрализующие антитела получают в высоких титрах. Кроме того, эпитопы, распознаваемые такими антителами, могут представлять собой часть вакцины, способной индуцировать широкий спектр защиты от К8У и МРУ.

Несмотря на то что антитела по изобретению нейтрализуют К8У, МРУ и РУМ, в некоторых вариантах осуществления изобретения, например, таких, которые относятся к лечению заболевания, разработке вакцин и т.д., настоящее описание относится только к К8У и МРУ, т.к. эти вирусы представляют собой патогены человека, тогда как РУМ представляет собой патоген мыши. Как используют в настоящем описании, термины К8У и МРУ и К8У, МРУ и РУМ используют взаимозаменяемо в зависимости от контекста.

Таким образом, в одном из аспектов изобретение относится к выделенному антителу, вариантам антител и их антигенсвязывающим фрагментам, которые нейтрализуют К8У и МРУ или К8У, МРУ и РУМ.

- 5 030319

В одном из вариантов осуществления К8У представляет собой К8У человека. В другом варианте осуществления К8У представляет собой К8У крупного рогатого скота. Антитела по изобретению нейтрализуют К8У человека (НК8У) и К8У крупного рогатого скота (ЬК8У). В другом варианте осуществления МРУ представляет собой МРУ человека.

В одном из вариантов осуществления изобретение также относится к выделенному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, который нейтрализует инфекцию К8У группы А и группы В. В другом варианте осуществления изобретение относится к выделенному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, который нейтрализует инфекцию МРУ группы А и группы В. В еще одном варианте осуществления изобретение относится к выделенному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, который нейтрализует инфекцию К8У группы А и группы В, а также МРУ группы А и группы В.

Как указано выше, К8У, МРУ и РУМ обладают некоторыми сходствами в своей генетической структуре. Аминокислотные последовательности О- и Р-белков классифицируют на группы А и В в К8У и МРУ; МРУ дополнительно разделяют на 4 подгруппы: А1, А2, В1 и В2. РУМ не подразделяют на группы или подгруппы. Р-белок К8У, МРУ или РУМ представляет собой трансмембранный поверхностный белок I типа, который содержит отщепляемый с Ν-конца сигнальный пептид и мембранный якорь около С-конца. Р-белки К8У и МРУ синтезируются в виде неактивных предшественников Р0, которые собираются в гомотримеры и активируются расщеплением. Р-белок образован тремя доменами (ΌΙ-ΌΙΙΙ), пептидом слияния (РР) и тремя областями, образованными семью повторами (НК-А, -В и -С). Ргликопротеины К8У и МРУ регулируют проникновение вируса посредством слияния оболочки вируса и плазматической мембраны клетки-хозяина. В обоих случаях Ν-конец Р-субъединицы, который образуется в результате протеолитического расщепления и содержит пептид слияния, встраивается непосредственно в мембрану-мишень для инициации слияния. После связывания с клеткой-мишенью и последующей активацией метастабильный Р-белок до слияния претерпевает серию структурных перестроек, которые приводят к встраиванию пептида слияния в мембрану клетки-мишени с последующим образованием стабильного спирального тяжа, который образует по мере того, как вирусная и клеточная мембраны сближаются. Такие структурные изменения приводят к образованию стабильного Р-белка после слияния. На более поздней стадии инфекции Р-белок, экспрессируемый на клеточной поверхности инфицированных клеток, может опосредовать слияние с соседними неинфицированными клетками и образование крупных синцитиев.

Эпитопы для паливизумаба и мотавизумаба картировали на антигенном участке II Р-белка К8У после слияния (также называемом участком А), образованном остатками 255-275. МАВ19 и 101Р направлено воздействуют на антигенный участок 1У Р-белка К8У после слияния (также называемом участком С) К8У, образованный остатками 422-438. МАВ19 тестировали в клиническом испытании, но не удалось продемонстрировать значительную эффективность (1оЬи8ои с1 а1., 1999, ТНе 1оигиа1 оГ 1пГсс1юи5 ОЪсахсх. 180:35-40; Мс188исг с! а1., 1999, Апйш1сгоЫа1 АдеШз апб СЬетоХЪегару, 43:1183-1188).

Для того чтобы являться эффективными, антитела должны распознавать Р-белок до слияния, конформация которого является подходящей для блокирования вхождения вируса, и предпочтительно не допускать распознавания содержащегося в избытке Р-белка после слияния, который может действовать как ловушка, таким образом, расходуя антитело и снижая его эффективность. До настоящего времени не выделили антитела, распознающие Р-белок К8У до слияния, но не распознающие Р-белок К8У после слияния.

В одном из вариантов осуществления изобретение содержит выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с Р-белком К8У до слияния и не связывается с Р-белком К8У после слияния. В другом варианте осуществления изобретение содержит выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с Р-белком К8У и МРУ до слияния и не Р-белком К8У и МРУ после слияния. В другом варианте осуществления изобретение относится к антителам, которые специфически связываются с Р-белком К8У, МРУ и РУМ до слияния, но не связываются с Р-белком К8У, МРУ и РУМ после слияния.

Изобретение относится к антителам, которые связываются с Р-белком К8У, МРУ и РУМ. Несмотря на то, что существует только приблизительно 33 и 40% идентичность аминокислотных последовательностей между Р-белками К8У и МРУ или К8У и РУМ соответственно, антитела по изобретению распознают общий эпитоп, процентируемый на Р-белках К8У, МРУ и РУМ. Этот эпитоп отличается от всех эпитопов, распознаваемых известными в настоящее время антителами, такими как паливизумаб, мотавизумаб, тАЬ 101Р и т. д. Антитела по изобретению, например, не связываются с антигенным участком ΙΙ (распознаваемым мотавизумабом и паливизумабом), ни с антигенным участком 1У (распознаваемым тАЬ 101Р), ни с антигенным участком I (связывающимся тАЬ 131-2А). Эпитопы на Р-белке К8У, распознаваемые антителами по изобретению, также отличаются от эпитопов, распознаваемых тАЬ Ό25, антителом, специфичным только к К8У. Кроме того, эпитопы на Р-белке МРУ, распознаваемые антителами по изобретению, отличаются от эпитопов, распознаваемых тАЬ 234 (которое распознает эпитоп на Рбелке МРУ, который соответствует антигенному участку II на Р-белке К8У). В основном антитела по изобретению распознают конформационный эпитоп. В одном из вариантов осуществления конформационный эпитоп презентируется только в невосстановительных условиях. В другом варианте осуществле- 6 030319 ния конформационный эпитоп обусловлен наличием дисульфидных связей между аминокислотными остатками в Р-белке.

Как продемонстрировано в настоящем описании, антитела или антигенсвязывающие фрагменты по изобретению специфически связываются с несколькими различными штаммами К8У и МРУ и нейтрализуют К8У и МРУ. Кроме того, антитела или антигенсвязывающие фрагменты по изобретению специфически связываются и перекрестно нейтрализуют К8У группы А и группы В, а также МРУ группы А и группы В, включая все соответствующие подгруппы МРУ (например, А1, А2, В1 и В2).

Антитело и антигенсвязывающий фрагмент по изобретению обладают высокой нейтрализующей активностью. Концентрация антител по изобретению, необходимая для нейтрализации 50% К8У, МРУ и РУМ, составляет, например, приблизительно 500 нг/мл или менее. В одном из вариантов осуществления концентрация антитела по изобретению, необходимая для 50% нейтрализации К8У, МРУ и РУМ, составляет приблизительно 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 175, 150, 125, 100, 90, 80, 70, 60 или приблизительно 50 нг/мл или менее. Это означает, что для 50% нейтрализации К8У, МРУ и РУМ необходимы только низкие концентрации антитела. Специфичность и активность можно измерять стандартными анализами, как известно специалисту в данной области.

Антитела по изобретению могут представлять собой антитела человека, моноклональные антитела, моноклональные антитела человека, рекомбинантные антитела или очищенные антитела. Изобретение также относится к фрагментам антител по изобретению, в частности к фрагментам, которые сохраняют антигенсвязывающую активность антител. Такие фрагменты включают, но не ограничиваются ими, одноцепочечные антитела, РаЬ, РаЬ', Р(аЬ')2, Ρν или §еРу. Хотя описание, включая формулу изобретения, в некоторых местах может явно ссылаться на антигенсвязывающий фрагмент(ы), фрагмент(ы) антител, вариант(ы) и/или производное(ые) антител, следует понимать, что термин антитело или антитело по изобретению включает все категории антител, а именно антигенсвязывающий фрагмент(ы), фрагмент(ы) антител, вариант(ы) и производное(ые) антител.

Были определены последовательности тяжелых цепей и легких цепей нескольких антител по изобретению, где каждая последовательность содержит три СЭИ на тяжелой цепи и три СЭК на легкой цепи. Положение аминокислот СЭК определяют в соответствии с системой нумерации 1МСТ. Последовательности СЭК, тяжелых цепей, легких цепей, а также последовательности молекул нуклеиновой кислоты, кодирующей СЭК, тяжелые цепи, легкие цепи антител по изобретению описаны в списке последовательностей. СЭК тяжелых цепей антитела обозначают как СЭКН1 (или НСЭК1), СЭКН2 (или НСЭК2) и СЭКН3 (или НСЭК3) соответственно. Аналогично, СЭК легких цепей антитела обозначают как СЭКЭ1 (или ЕСЭК1), СЭКЕ2 (или ЕСЭК2) и СЭКЭ3 (или ЬСЭКЗ) соответственно. В табл. 1 приведены номера 8Ε^ 1Э для аминокислотных последовательностей шести СЭК тяжелых и легких цепей соответственно иллюстративных антител по изобретению.

Таблица 1

Номера 8ЕС) 1Э для полипептидов СЭК антител, которые нейтрализуют К8У, МРУ и РУМ

	ЗЕО Ю ΝΟ. для полипептидов СЭК
	СЭКН1	СЭКН2	СЭКНЗ	СЭКЫ	СОКЬ2	СЭКЬЗ
вариант 1 3210	1	2	3	4	5	6
вариант 2 3210	1	2	3	4	5	6
вариант 3 3210	1	2	3	4	5	35
вариант 4 3210	1	39	40	4	41	42
вариант 5 3210	1	39	40	4	5	6
вариант 6 3210	1	2	3	4	41	42
вариант 1 2430	19	20	21	4	22	23
вариант 2 2430	19	20	21	4	22	23
вариант 3 2430	1	39	53	4	41	54
вариант 4 2430	1	39	53	4	22	23
вариант 5 2430	19	20	21	4	41	54

В одном из вариантов осуществления антитело или фрагмент антитела по изобретению содержит по меньшей мере одну СЭК с последовательностью, которая обладает по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с любой одной 8Ε^ 1Э N0:1-6, 19-23, 35, 39-42 или 53-54. СЭК вариантов антитела 3210 и антитела 2430 представлены на фиг. 24 и 25 соответственно (СЭК выделены полужирным шрифтом).

В другом варианте осуществления изобретение относится к антителу или антигенсвязывающему фрагменту, содержащему тяжелую цепь, содержащую одну или более (т.е. одну, две или все три) СЭК тяжелой цепи из варианта 1 3210, варианта 2 3210, варианта 3 3210, варианта 4 3210, варианта 5 3210, бварианта 2410, варианта 1 2430, варианта 2 2430, варианта 3 2430, варианта 4 или варианта 5 2430.

В еще одном варианте осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент по изобрете- 7 030319 нию содержит СОИ1 тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью 8ЕЦ ГО N0:1 или 8ЕЦ ГО N0:19; С0И2 тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью 8ЕЦ ГО N0:2, 8ЕЦ ГО N0:20 или 8ЕЦ ГО N0:39 и СОИ3 тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью 8ЕЦ ГО N0:3, 8ЕЦ ГО N0:21, 8ЕЦ ГО N0:40 или 8ЕЦ ГО N0:53. В определенных вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела, как предоставлено в настоящем описании, содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность (ί) 8ЕЦ ГО N0:1 для СГОИНЕ 8ЕЦ ГО N0:2 для СОИН2 и 8ЕЦ ГО N0:3 для С0ИН3, (ίί) 5ЕС ГО N0:1 для СПИНЕ 5ЕС ГО N0:39 для С1ЖН2 и 5ЕС ГО N0:40 для С1ЖНТ (ίίί) 5ЕС ΙΌ N0:19 для С1Ж111, 5ЕС ΙΌ N0:20 для С1Ж112 и 5ЕС ΙΌ N0:21 для С0ИН3 или (ίν) 5ЕС ΙΌ N0:1 для СОИН1, 8ЕЦ ΙΌ N0:39 для СОИН2 и 8ЕЦ ГО N0:53 для СОИН3.

Также предоставлено антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащий легкую цепь, содержащую одну или более (т.е. одну, две или все три) СЭИ легкой цепи из варианта 1 3210, варианта 2 3210, варианта 3 3210, варианта 4 3210, варианта 5 3210, варианта 6 2430, варианта 1 2430, варианта 2 2430, варианта 3 2430, варианта 4 2430 или варианта 5 2430. В одном из вариантов осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержит СОИ1 легкой цепи с аминокислотной последовательностью 8ЕЦ ГО N0:4, С0И2 легкой цепи с аминокислотной последовательностью 8ЕЦ ГО N0:5, 8ЕЦ ГО N0:22 или 8ЕЦ ГО N0:41 и СГОИ3 легкой цепи с аминокислотной последовательностью 5ЕС ГО N0:6, 5ЕС ГО N0:23, 5ЕС ГО N0:35, 5ЕС ГО N0:42 или 5ЕС ГО N0:54. В определенных вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела, как предоставлено в настоящем описании, содержит легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность (ί) 8ЕЦ ГО N0:4 для СОИТО, 8ЕЦ ГО N0:5 для С0ИЕ2 и 5ЕС ГО N0:6 для С0ИЕ3; (ίί) 5ЕС ΙΌ N0:4 для СОИТО, 5ЕС ГО N0:5 для СОИЕ2 и 5ЕС ГО N0:35 для СОИЕ3; (ίίί) 5ЕС ΙΌ N0:4 для СОИТО, 5ЕС ГО N0:41 для С0ИЕ2 и 5ЕС ГО N0:42 для СОИЪ3; (ίν) 5ЕС ГО N0:4 для СОИТО, 5ЕС ГО N0; 22 для С0ИЕ2 и 5ЕС ГО N0:23 для СОИЕ3 или (ν) 5ЕС ГО N0:4 для СОИТО, 5ЕС ГО N0:41 для С0ИЕ2 и 5ЕС ГО N0:54 для С0ИЕ3.

В одном из вариантов осуществления антитело по изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент содержит все СОИ варианта 1 антитела 3210, такие как перечисленные в табл. 1, и нейтрализует инфекцию И8У, МРУ и РУМ. В другом варианте осуществления антитело по изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент содержит все СОИ варианта 2 антитела 3210, такие как перечисленные в табл. 1, и нейтрализует инфекцию И8У, МРУ и РУМ. В другом варианте осуществления антитело по изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент содержит все СОИ варианта 3 антитела 3210, такие как перечисленные в табл. 1, и нейтрализует инфекцию И8У, МРУ и РУМ. В другом варианте осуществления антитело по изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент содержит все СОИ варианта 4 антитела 3210, такие как перечисленные в табл. 1, и нейтрализует инфекцию И8У, МРУ и РУМ. В другом варианте осуществления антитело по изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент содержит все СОИ варианта 5 антитела 3210, такие как перечисленные в табл. 1, и нейтрализует инфекцию И8У, МРУ и РУМ. В другом варианте осуществления антитело по изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент содержит все СОИ варианта 6 антитела 3210, такие как перечисленные в табл. 1, и нейтрализует инфекцию И8У, МРУ и РУМ.

В еще одном варианте осуществления антитело по изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент содержит все СОИ варианта 1 антитела 2430, такие как перечисленные в табл. 1, и нейтрализует инфекцию И8У, МРУ и РУМ. В другом варианте осуществления антитело по изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент содержит все СОИ варианта 2 антитела 2430, такие как перечисленные в табл. 1, и нейтрализует инфекцию И8У, МРУ и РУМ. В другом варианте осуществления антитело по изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент содержит все СОИ варианта 3 антитела 2430, такие как перечисленные в табл. 1, и нейтрализует инфекцию И8У, МРУ и РУМ. В другом варианте осуществления антитело по изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент содержит все СОИ варианта 4 антитела 2430, такие как перечисленные в табл. 1, и нейтрализует инфекцию И8У, МРУ и РУМ. В другом варианте осуществления антитело по изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент содержит все СОИ варианта 5 антитела 2430, такие как перечисленные в табл. 1, и нейтрализует инфекцию И8У, МРУ и РУМ.

Номера 8ЕЦ ГО для аминокислотной последовательности для вариабельной области тяжелой цепи (УН) и вариабельной области легкой цепи (УЪ) иллюстративных антител по изобретению, а также номера 8ЕЦ ГО для последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих их, перечислены в табл. 2.

- 8 030319

Таблица 2

Номера δΕρ ΙΌ для остатков аминокислот и нуклеиновой кислоты ν_Η и для антител, которые нейтрализуют Ηδν, ΜΡν и ΡνΜ

			5Ε<2 Ιϋ ΝΟ.	для ν_Η и остатков аминокислот и
нуклеиновое	1 кислоты
	п,епь	Η,βΠΒ	Аминокислота	Аминокислота	нуклеиновая	нуклеиновая
	ν_Η		ν_Η		кислота ν_Η	кислота
вариант 1 3210	νΗ. 1	νΐι	13	14	15	16
вариант 2 3210	νΗ. 2	νΐι	17	14	18	16
вариант 3 3210	УН. 2	νΐι. 3	17	37	18	38
вариант 4 3210	УН. 3	νπ . 4	49	50	51	52
вариант 5 3210	УН. 3	νΐι	49	14	51	16
вариант б 3210	УН. 2	νΐι. 4	17	50	18	52
вариант 1 2430	УН. 1	νΐι	29	30	31	32
вариант 2 2430	УН. 2	νΐι	33	30	34	32
вариант 3 2430	УН. 3	УЬ.2	59	60	61	62
вариант 4 2430	νΗ. 3	νΐι	59	30	61	32
вариант 5 2430	УН. 2	νΐι. 2	33	60	34	62

В одном из вариантов осуществления антитело или фрагмент антитела по изобретению содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, которая является приблизительно на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 или 100% идентичной последовательности, описанной в любой δΕρ П) N0:13, 17, 29, 33, 49 или 59. В другом варианте осуществления антитело или фрагмент антитела по изобретению содержит вариабельную область легкой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, которая является приблизительно на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 или 100% идентичной последовательности, описанной в δΕρ П) N0:14, 30, 37, 50 или 60. В еще одном варианте осуществления антитело или фрагмент антитела по изобретению содержит вариабельную область тяжелой цепи или легкой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, которая является приблизительно на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 или 100% идентичной последовательностям, приведенным на фиг. 24 и 25.

В другом варианте осуществления изобретения изобретение содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который нейтрализует инфекцию Κδν, ΜΡν и ΡνΜ и содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность δΕρ П) N0:13, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность δΕρ П) N0:14; или вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность δΕρ П) N0:13, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность δΕρ П) N0:37; или вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность УХ) П) N0:13, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность δΕρ П) N0:50; или вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность УХ) П) N0:17, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность δΕρ П) N0:14; или вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность δΕρ П) N0:17, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность δΕρ П) N0:37; или вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность δΕρ П) N0:49, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность δΕρ П) N0:50; или вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность δΕρ П) N0:49, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность δΕρ П) N0:14; или вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность δΕρ П) N0:49, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность δΕρ П) N0:37; или вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность δΕρ П) N0:17, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность δΕρ П) N0:50.

- 9 030319

В еще одном варианте осуществления изобретения изобретение содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который нейтрализует инфекцию К8У, МРУ и РУМ и содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕС ГО N0:29, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕС ГО N0:30; или вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:29, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:60; или вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:33, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:30; или вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:59, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:60; или вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:59, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:30; или вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:33, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:60.

Примеры антител по изобретению включают, но не ограничиваются ими, вариант 1 НМВ3210, вариант 2 НМВ3210, вариант 3 НМВ3210, вариант 4 НМВ3210, вариант 5 НМВ3210, вариант 6 НМВ3210, вариант 1 НМВ2430, вариант 2 НМВ2430, вариант 3 НМВ2430, вариант 4 НМВ2430 или вариант 5 НМВ2430.

Изобретение дополнительно содержит антитело или его фрагмент, который связывается с таким же эпитопом, что и антитело или антигенсвязывающий фрагмент по изобретению, или антитело, которое конкурирует с антителом или антигенсвязывающим фрагментом по изобретению.

Как можно видеть из табл. 1 и 2, СОК, тяжелые цепи и легкие цепи раскрытых антител можно взаимно заменять, получая новые антитела, которые сохраняют их связывающие и нейтрализующие способности. Таким образом, антитела по изобретению включают антитела и антигенсвязывающие фрагменты, содержащие любую комбинацию СИК, приведенных в табл. 1, или тяжелых и легких цепей, приведенных в табл. 2.

Антитела по изобретению также включают гибридные молекулы антител, которые содержат одну или более СИК из антитела по изобретению и одну или более СОК из другого антитела в том же эпитопе. В одном из вариантов осуществления такие гибридные антитела содержат три СОК из антитела по изобретению и три СОК из другого антитела в том же эпитопе. Иллюстративные гибридные антитела содержат (ί) три СОК легкой цепи из антитела по изобретению и три СОК тяжелой цепи из другого антитела в том же эпитопе или (ίί) три СОК тяжелой цепи из антитела по изобретению и три СОК легкой цепи из другого антитела в том же эпитопе.

Варианты антител также входят в объем изобретения. Таким образом, варианты последовательностей, перечисленных в заявке, также входят в объем изобретения. Такие варианты включают природные варианты, образуемые в результате соматической мутации ίη νίνο во время иммунного ответа, или ίη νίϊγο при культивировании клонов иммортализованных В-клеток.

Альтернативно, варианты могут возникать вследствие вырожденности генетического кода или могут образовываться в результате ошибок при транскрипции или трансляции.

Дополнительные варианты последовательностей антител, обладающих улучшенной аффинностью и/или активностью, можно получать известными в данной области способами, и они входят в объем изобретения. Например, замены аминокислот можно использовать для получения антител с дополнительно улучшенной аффинностью. Альтернативно, для улучшения эффективности трансляции в экспрессирующих системах для продукции антитела можно использовать оптимизацию кодона нуклеотидной последовательности. Кроме того, полинуклеотиды, содержащие последовательность, оптимизированную в отношении специфичности или нейтрализующей активности антитела способом направленной эволюции в отношении любых последовательностей нуклеиновой кислоты по изобретению, также входят в объем изобретения.

В одном из вариантов осуществления вариант последовательности антител может обладать 70% или более (т.е. 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99% или более) идентичностью аминокислотных последовательностей с последовательностями, перечисленными в заявке. В некоторых вариантах осуществления такую идентичность последовательности рассчитывают относительно полной длины эталонной последовательности (т.е. последовательности, перечисленной в заявке). В некоторых дополнительных вариантах осуществления процентная идентичность, как указано в настоящем описании, является такой как определяют с использованием ВЬЛ§Т версии 2.1.3 с использованием параметров по умолчанию, установленных N001 (1Нс №0опа1 СсШсг Гог В|о1ссНпо1оду Шогшайоп; 1ιΙΙρ://\γ\γ\γ.ηοΕί.η1ιη.ηί1ι.8θγ/) [матрица В1о8иш 62, штраф за создание пропуска=11 и штраф за продление пропуска=1].

В другом аспекте изобретение также включает последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие часть или все легкие и тяжелые цепи и СОК антител по настоящему изобретению. В настоящем описании раскрыты последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие часть или все легкие и тяжелые цепи и СОК иллюстративных антител по изобретению. В табл. 2 приведены номера 8ЕС ГО для

- 10 030319 последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих вариабельные области тяжелых цепей и легких цепей некоторых примерных антител по изобретению. В табл.3 приведены номера 8ЕС) ΙΌ для последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих СОИ иллюстративных антител по изобретению. Вследствие избыточности генетического кода существуют варианты этих последовательностей нуклеиновой кислоты, которые кодируют одни и те же аминокислотные последовательности.

Таблица 3

Номера 8ЕС) II) для полинуклеотидов СОИ антител, которые нейтрализуют К8У, МРУ и РУМ

	ЗЕО Ю ΝΟ. для полинуклеотидов ΟϋΚ
	ΟϋΚΗΙ	ΟϋΚΗ2	ΟϋΚΗ3	СОКЫ	СОКЬ2	СОКЬЗ
вариант 1 3210	7	8	9	10	11	12
вариант 2 3210	7	8	9	10	11	12
вариант 3 3210	7	8	9	10	11	36
вариант 4 3210	43	44	45	46	47	48
вариант 5 3210	43	44	45	10	11	12
вариант 6 3210	7	8	9	46	47	48
вариант 1 2430	24	25	26	10	27	28
вариант 2 2430	24	25	26	10	27	28
вариант 3 2430	55	44	56	57	47	58
вариант 4 2430	55	44	56	10	27	28
вариант 5 2430	24	25	26	57	47	58

В одном из вариантов осуществления последовательности нуклеиновой кислоты по изобретению включают последовательности нуклеиновой кислоты, обладающие по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью с нуклеиновой кислотой, кодирующей тяжелую или легкую цепь антитела по изобретению. В другом варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты по изобретению содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую СОИ тяжелой или легкой цепи антитела по изобретению. Например, последовательность нуклеиновой кислоты по изобретению содержит последовательность, которая является по меньшей мере на 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичной последовательностям нуклеиновой кислоты 8ЕО ΙΌ N0:7-12, 15, 16, 18, 24-28, 31-32, 34, 36, 38, 43-48, 51-52, 55-58 или 61-62.

В еще одном варианте осуществления последовательности нуклеиновой кислоты по изобретению включают последовательности нуклеиновой кислоты, обладающие по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью с нуклеиновой кислотой, кодирующей тяжелую или легкую цепь антитела по изобретению, как представлено на фиг. 24 и 25.

Кроме того, в объем изобретения входят векторы, например экспрессирующие векторы, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты по изобретению. Клетки, трансформированные такими векторами, также входят в объем изобретения. Примеры таких клеток включают, но не ограничиваются ими, эукариотические клетки, например дрожжевые клетки, животные клетки или растительные клетки. В одном из вариантов осуществления клетки представляют собой клетки млекопитающего, например человека, СНО, НЕК293Т, РЕК.С6, N80, миеломные или гибридомные клетки.

Изобретение также относится к моноклональным антителам, которые связываются с эпитопом, способным связываться с антителами или антигенсвязывающими фрагментами по изобретению.

Моноклональные и рекомбинантные антитела являются особенно пригодными для идентификации и очистки отдельных полипептидов или других антигенов, против которых они направлены. Антитела по изобретению обладают дополнительным полезным свойством, которое заключается в том, что их можно применять в качестве реагентов в иммунологических анализах, радиоиммунологических анализах (ΚΙΆ) или твердофазных иммуноферментных анализах (ΕΕΙ8Ά). В таких применениях антитела можно метить аналитически детектируемым реагентом, таким как радиоактивный изотоп, флуоресцентная молекула или фермент. Антитела также можно использовать для молекулярной идентификации и характеризации (картирование эпитопов) антигенов.

Антитела по изобретению можно связывать с лекарственным средством для доставки в участок лечения или связывать с детектируемой меткой для облегчения визуализации участка, содержащего представляющие интерес клетки, такие как клетки, инфицированные К8У, или МРУ, или К8У и МРУ. Способы связывания антител с лекарственными средствами и детектируемыми метками хорошо известны в данной области, так же как и способы визуализации с использованием детектируемых меток. Меченые антитела можно применять в широком спектре анализов, применяя широких спектр меток. Детекцию образования комплекса антитело-антиген между антителом по изобретению и представляющим интерес

- 11 030319 эпитопом (эпитоп или К8У, или МРУ, или тот и другой) можно облегчать путем присоединения детектируемого вещества к антителу. Подходящие способы детекции включают использование меток, таких как радионуклиды, ферменты, коферменты, флуоресцирующие вещества, хемилюминесцирующие вещества, хромогены, субстраты или кофакторы ферментов, ингибиторы ферментов, комплексы простетической группы, свободные радикалы, частицы, красители и т.п. Примеры подходящих ферментов включают пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, β-галактозидазу или ацетилхолинэстеразу; примеры подходящих комплексов простетической группы включают стрептавидин/биотин и авидин/биотин; примеры подходящих флуоресцентных веществ включают умбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеинизотиоцианат, родамин, дихлортриазиниламин флуоресцеин, дансил хлорид или фикоэритрин; пример люминесцентного вещества представляет собой люминол; примеры биолюминесцентных веществ включают люциферазу, люциферин и экворин, и примеры подходящего радиоактивного вещества включают 1251, 1311, 358 или 3Н. Такие меченые реагенты можно использовать в ряде хорошо известных анализов, таких как радиоиммунологические анализы, иммуноферментные анализы, например ЕЫ§Л, флуоресцентные иммунологические анализы и т.п. (см., например, И8 3766162, И8 3791932, И8 3817837 и И8 4233402).

Антитело по изобретению можно конъюгировать с терапевтической молекулой, такой как цитотоксин, терапевтическое средство или радиоактивный ион металла или радиоактивный изотоп. Примеры радиоактивных изотопов включают, но не ограничиваются ими, 1-131, 1-123, 1-125, Υ-90, Ке-188, Ке-186, Αΐ-211, Си-67, Βί-212, Βί-213, Рй-109, Тс-99, 1п-111 и т.п. Такие конъюгаты антител можно использовать для модификации данного биологического ответа; подразумевают, что молекула лекарственного средства не ограничена классическими химическими терапевтическими средствами. Например, молекула лекарственного средства может представлять собой белок или полипептид, обладающий желаемой биологической активностью. Такие белки могут включать, например, токсин, такой как абрин, рицин А, экзотоксин синегнойной палочки или дифтерийный токсин.

Способы конъюгации такой терапевтической молекулы с антителами хорошо известны (см., например, Агпоп е! а1. (1985) Мопос1опа1 АпйЬой1е8 ίοτ 1ттипо1атдейпд οί Итидз ίη Сапсег ТЬегару в Мопос1опа1 АпйЬоФек апб Сапсег ТЬегару, ей. Ке^8ίе1й е! а1. (А1ап К. Ызз, 1пс.), рр. 243-256; ей. Нейзйот е! а1., (1987) АпйЬоЙ1е8 &т Эгид ИеОуегу в Соп1то11ей Итид ИеОуету, ей. КоЬшзоп е! а1. (2й ей; Магсе1 Эеккег. 1пс.), рр. 623-653; ТЬогре (1985) АпйЬойу Сатетз οί СуЮЮхю АдеШз ш Сапсег ТЬегару: А Ке\зе\у в Мопос1опа1 АпйЬоФез '84: Вю1одюа1 апй С1ннса1 Аррйсайопз, ей. РшсЬета е! а1., рр. 475-506 (Еййпсе Кигίίδ, Мйапо, Иа1у, 1985); Апа1у818, КезиНз апй Ри1ите Ртозресйуе οί Ше ТЬетареийс Иве οί Кайю1аЬе1ей АпйЬойу ш Сапсег ТЬегару в Мопос1опа1 АпйЬоФез &т Сапсег ЭеЮсйоп апй ТЬегару, ей. Ва1й\ут е! а1. (Асайетю Ргезз, №\у Υο^к, 1985), рр. 303-316 и ТЬогре е! а1., (1982) 1ттипо1. Кеу., 62:119-158.

Альтернативно, антитело или его фрагмент антитела можно конъюгировать со вторым антителом или его фрагментом антитела с получением гетероконъюгата антитела, как описано в И8 4676980. Кроме того, можно использовать линкеры между метками и антителами по изобретению (например, и 8 4831175). Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты можно непосредственно метить радиоактивным йодом, индием, иттрием или другой известной в данной области радиоактивной частицей (например, и8 5595721). Лечение может состоять из комбинации лечения конъюгированными и неконъюгированными антителами, вводимыми одновременно или последовательно (например, \νϋ 00/52031, \νϋ 00/52473).

Антитела по изобретению также можно прикреплять к твердой подложке. Кроме того, антитела по изобретению или их функциональные фрагменты антител можно химически модифицировать посредством ковалентной конъюгации с полимером, например, для увеличения их времени полужизни в кровотоке. Примеры полимеров и способов их прикрепления к пептидам представлены в И8 4766106, И8 4179337, и8 4495285 и И8 4609546. В некоторых вариантах осуществления полимеры можно выбирать из полиоксиэтилированных полиолов и полиэтиленгликоля (РЕС). РЕС является растворимым в воде при комнатной температуре и имеет общую формулу К(О-СН₂-СН₂)_пО-К, где К может представлять собой водород или защитную группу, такую как алкил или алканольную группу. В одном из вариантов осуществления защитная группа может содержать от 1 до 8 атомов углерода. В дополнительном варианте осуществления защитная группа представляет собой метил. Символ п представляет собой положительное целое число. В одном из вариантов осуществления п составляет от 1 до 1000. В другом варианте осуществления п составляет от 2 до 500. В одном из вариантов осуществления средняя молекулярная масса РЕС составляет от 1000 до 40000. В дополнительном варианте осуществления молекулярная масса РЕС составляет от 2000 до 20000. В еще одном дополнительном варианте осуществления молекулярная масса РЕС составляет от 3000 до 12000. В одном из вариантов осуществления РЕС содержит по меньшей мере одну гидроксигруппу. В другом варианте осуществления РЕС содержит концевую гидроксигруппу. В еще одном варианте осуществления он представляет собой концевую гидроксигруппу, которая активируется для взаимодействия со свободной аминогруппой на ингибиторе. Однако следует понимать, что тип и количество реакционноспособных группы можно изменять, чтобы получать ковалентно конъюгированное РЕС/антитело по настоящему изобретению.

В настоящем изобретении пригодными также являются водорастворимые полиоксиэтилированные полиолы. Они включают полиоксиэтилированный сорбит, полиоксиэтилированную глюкозу, полиокси- 12 030319 этилированный глицерин (РОО) и т.п. В одном из вариантов осуществления используют ΡΘΟ. Без связи с какой-либо теорией, вследствие того, что глицериновый остов полиоксиэтилированного глицерина является аналогичным природному остову, встречающемуся, например, в моно-, ди-, триглицеридах животных и людей, поэтому такая разветвленная цепь необязательно распознается в организме как чужеродный агент. В некоторых вариантах осуществления РОО имеет молекулярную массу в таком же в диапазоне, что и РЕО. Другая система доставки лекарственного средства, которую можно использовать для увеличения времени полужизни в кровообращении представляет собой липосому. Способы получения систем доставки на основе липосом известны специалисту в данной области. Другие системы доставки лекарственного средства являются известными в данной области и описаны, например, в публикациях Ро/папзку е! а1., (1980) и Ро/папзку (1984).

Антитела по изобретению можно предоставлять в очищенной форме. Как правило, антитело содержится в композиции, которая, по существу, не содержит другие полипептиды, например, где другие полипептиды составляют менее 90 мас.%, как правило, менее 60 мас.% и более, как правило, менее 50 мас.% композиции.

Антитела по изобретению могут являться иммуногенными у не являющегося человеком (или гетерологичных) хозяев, например у мышей. В частности, антитела могут содержать идиотоп, который является иммуногенным у не принадлежащих человеку хозяев, но не у являющегося человеком хозяина. Антитела по изобретению для применения у человека включают антитела, которые невозможно легко выделять у хозяев, таких как мыши, козы, кролики, крысы, не являющиеся приматами млекопитающие и т.д., и, как правило, невозможно получать гуманизацией или от ксеномышей.

Антитела по изобретению могут являться любого изотипа (например, 1дА, 1§О, 1дМ, т.е. с тяжелой цепью α, γ или μ), но, как правило, представляют собой 1§О. В изотипе 1дО антитела могут представить собой подкласс 1дО1, 1дО2, 1дО3 или 1дО4.

Антитела по изобретению могут содержать легкую цепь к или λ.

Получение антител.

Антитела по изобретению можно получать любым известным в данной области способом. Например, основная методология получения моноклональных антител с использованием гибридомной технологии является хорошо известной (КоЫет О. аиб МЙ81еш С,. 1975; Ко/Ьаг е! а1., 1983). В одном из вариантов осуществления используют альтернативный способ иммортализации ЕВУ, описанный в XVО 2004/076677.

Способом, описанным в νθ 2004/076677, В-клетки, продуцирующие антитело по изобретению, можно трансформировать ЕВУ и поликлональным активатором В-клеток. Для дополнительного повышения эффективности во время этапа трансформация необязательно можно добавлять дополнительные стимуляторы роста и дифференцировки клеток. Такие стимуляторы могут представлять собой цитокины, такие как 1Ь-2 и 1Ь-15. В одном из аспектов 1Ь-2 добавляют во время этапа иммортализации для дополнительного улучшения эффективности иммортализации, но его использование не является обязательным. Иммортализованные В-клетки, получаемые такими способами, можно затем культивировать известными в данной области способами и выделять из них антитела.

Способом, описанным в νθ 2010/046775, можно культивировать плазматические клетки в ограниченных количествах или в виде отдельных плазматических клеток в культуральных планшетах с микролунками. Антитела можно выделять из культуры плазматических клеток. Кроме того, из культуры плазматических клеток можно экстрагировать РНК и можно проводить ПЦР известными в данной области способами. Области УН и УЪ антител можно амплифицировать ПЦР с обратной транскрипцией, секвенировать и клонировать в экспрессирующий вектор, который затем трансфицируют в клетки НЕК293Т или другие клетки-хозяева. Клонирование нуклеиновой кислоты в экспрессирующие векторы, трансфекцию клеток-хозяев, культивирование трансфицированных клеток-хозяев и выделение продуцируемого антитела можно проводить любыми способами, известными специалисту в данной области.

При желании антитела можно дополнительно очищать с использованием фильтрования, центрифугирования и различными хроматографическими способами, такими как ВЭЖХ или аффинная хроматография. Способы очистки антител, например моноклональных антител, включая способы получения антител фармацевтической степени чистоты, хорошо известны в данной области.

Фрагменты антител по изобретению можно получать из антител способами, которые включают расщепление ферментами, такими как пепсин или папаин, и/или расщеплением дисульфидных связей химическим восстановлением. Альтернативно, фрагменты антител можно получать клонированием и экспрессией части последовательностей тяжелых или легких цепи. Фрагменты антитела включают фрагменты РаЬ, РаЬ', Р(аЬ')2 и Ρν. Изобретение также относится к одноцепочечным фрагментам Ρν (δεΡν), получаемым из тяжелых и легких цепей антитела по изобретению. Например, изобретение содержит δεΡν, содержащий СОК из антитела по изобретению. Также включены мономеры и димеры тяжелых или легких цепей, однодоменные антитела с тяжелой цепью, однодоменные антитела с легкой цепью, а также одноцепочечные антитела, например одноцепочечный Ρν, в котором вариабельные домены тяжелых и легких цепей соединены пептидым линкером.

- 13 030319

Фрагменты антител по изобретению могут обеспечивать моновалентные или поливалентные взаимодействия и могут содержаться в ряде структур, как описано выше. Например, для получения трехвалентного триотела или четырехвалентного тетратела можно синтезировать молекулы 8сРу. Молекулы 8сРу могут содержать домен Рс-области, приводящие к двухвалентным миниантителам. Кроме того, последовательности по изобретению могут представлять собой компонент мультиспецифических молекул, в которых последовательности по изобретению направлены на эпитопы по изобретению, а другие области молекул связываются с другими мишенями. Иллюстративные молекулы включают, но не ограничиваются ими, биспецифические РаЬ2, триспецифические РаЬЗ, биспецифические 8сРу и диатела (НоШдег апй Нийкои, 2005, Иа1иге Вю1есйпо1оду, 9:1126-1136).

Для подготовки последовательностей ДНК, кодирующих антитела или фрагменты антител по настоящему изобретению, можно использовать стандартные способы молекулярной биологии. Желаемые последовательности ДНК можно полностью или частично синтезировать использованием способов синтеза олигонуклеотидов. В качестве подходящих можно использовать способы сайт-специфического мутагенеза и полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Для экспрессии последовательностей ДНК, кодирующих молекулы антител по настоящему изобретению или их фрагменты, можно использовать любую подходящую систему клетка-хозяин/вектор. Бактериальные, например Е. сой, и другие системы на основе микроорганизмов можно частично использовать для экспрессии фрагментов антител, таких как фрагменты РаЬ и Р(аЬ')2 и, в частности, фрагментов Ρν и фрагментов одноцепочечных антител, например одноцепочечные Ρν.

Экспрессирующие системы на основе эукариотических клеток-хозяев, например, млекопитающих, можно использовать для получения более крупных молекул антител, включая полные молекулы антител. Подходящие клетки-хозяева млекопитающих включают, но не ограничиваются ими, СНО, НЕК293Т, РЕК.С6, N80. миеломные или гибридомные клетки.

Настоящее изобретение также относится к способу получения молекулы антитела по настоящему изобретению, включающему культивирование клетки-хозяина, содержащей вектор, кодирующий нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению в условиях, подходящих для экспрессии белка из ДНК, кодирующей молекулу антитела по настоящему изобретению, и выделение молекулы антитела.

Молекула антитела может содержать полипептид только тяжелой или легкой цепи, в случае чего для тансфекции клеток-хозяев необходимо использовать только последовательность, кодирующую полипептид тяжелой цепи или легкой цепи. Для получения продуктов, содержащих как тяжелые, так и легкие цепи, линию клеток можно трансфицировать двумя векторами, где первый вектор кодирует полипептид легкой цепи, и второй вектор кодирует полипептид тяжелой цепи. Альтернативно, можно использовать один вектор, где вектор содержит последовательности, кодирующие полипептиды легкой цепи и тяжелой цепи.

Альтернативно, антитела по изобретению можно получать (ί) экспрессией последовательности нуклеиновой кислоты по изобретению в клетке-хозяине и (ίί) выделением экспрессируемого продукта антитела. Кроме того, способ может включать (ίίί) очистку выделенного антитела.

Можно проводить скрининг трансформированных В-клеток и культивируемых плазматических клеток в отношении клеток, продуцирующих антитела желаемой специфичности или функции.

Этап скрининга можно проводить любым иммунологическим анализом, например ЕЬ18Л, окрашивая ткани или клетки (включая трансфицированные клетки), анализом нейтрализации или одним из ряда других известных в данной области способов идентификации желаемой специфичности или функции. Анализ можно выбирать на основе простого распознавания одного или более антигенов или можно выбирать на дополнительной основе желаемой функции, например, для выбора нейтрализующих антител, а не только антигенсвязывающих антител, для выбора антител, которые могут изменять характеристики клеток-мишеней, такие как их сигнальные каскады, их форма, их скорость роста, их способность оказывать влияние на другие клетки, их реакция в ответ на влияние других клеток или других реагентов или изменение условий, их статус дифференцировки и т.д.

Затем можно получать индивидуальные клоны трансформированных В-клеток из культуры положительных трансформированных В-клеток. Этап клонирования для выделения индивидуальных клонов из смеси положительных клеток можно проводить с использованием лимитирующего разведения, микроманипуляции, выделения отдельных клеток сортировкой клеток или другим известным в данной области способом.

Нуклеиновую кислоту из культивируемых плазматических клеток можно выделять, клонировать и экспрессировать в клетках НЕК293Т или других известных клетках-хозяевах известными в данной области способами.

Клоны иммортализованных В-клеток или трансфицированные клетки-хозяева по изобретению можно использовать различными способами, например, в качестве источника моноклональных антител, в качестве источника нуклеиновой кислоты (ДНК или мРНК), кодирующей представляющее интерес моноклональное антитело, для исследования и т. д.

Изобретение относится к композиции, содержащей иммортализованные В-клетки памяти или трансфицированные клетки-хозяева, продуцирующие антитела, которые нейтрализуют инфекцию К8У, МРУ и РУМ.

- 14 030319

Клон иммортализованных В-клеток или культивируемые плазматические клетки по изобретению также можно использовать в качестве источника нуклеиновой кислоты для клонирования генов антитела для последующей рекомбинантной экспрессии. Экспрессия рекомбинантными источниками является наиболее распространенной для фармацевтических целей, чем экспрессия В-клетками или гибридомами, например, по причинам стабильности, воспроизводимости, простоты культивирования и т.д.

Таким образом, изобретение относится к способу получения рекомбинантной клетки, включающему этапы: (ί) получения одной или более нуклеиновых кислот (например, мРНК тяжелой и/или легкой цепи), кодирующих предоставляющее интерес антитело, из клона В-клеток или культивируемых плазматических клеток; (ίί) встраивания нуклеиновой кислота в экспрессирующий вектор и (ίίί) трансфекции вектора в клетку-хозяина для обеспечения экспрессии представляющего антитела в такой клеткехозяине.

Аналогично, изобретение относится к способу получения рекомбинантной клетки, включающему этапы: (ί) секвенирования нуклеиновой кислоты(т), кодирующей представляющее интерес антитело, из клона В-клеток или культивируемых плазматических клеток и (ίί) использования информации секвенирования из этапа (ί) для получения нуклеиновой кислоты(т) для введения в клетку-хозяина для обеспечения экспрессии представляющего интерес антитела в такой клетке-хозяине. Нуклеиновую кислоту можно, но не обязательно, подвергать манипуляции между этапами (ί) и (ίί) для введения участков рестрикции для изменения частоты использования кодона и/или для оптимизации регуляторных последовательностей транскрипции и/или трансляции.

Изобретение также относится к способу получения трансфицированной клетки-хозяина, включающему этап трансфекции клетки-хозяина одной или более нуклеиновыми кислотами, которые кодируют представляющее интерес антитело, где нуклеиновые кислоты представляют собой нуклеиновые кислоты, которые получали из клона иммортализованных В-клеток или культивируемой плазматической клетки по изобретению. Таким образом, способы предварительного получения нуклеиновой кислоты(т), а затем использования ее для трансфекции клетки-хозяина можно проводить в различные моменты времени, их могут проводить различные люди в разных местах (например, в разных странах).

Такие рекомбинантные клетки по изобретению затем можно использовать для экспрессии и культивирования. Они являются особенно пригодными для экспрессии антител для крупномасштабного фармацевтического производства. Их также можно использовать в качестве активного ингредиента фармацевтической композиции. Можно использовать любой подходящий способ культивирования, включая, но, не ограничиваясь ими, статическую культуру, культивирование во вращающихся флаконах, асцитную жидкость, картридж биореактора типа полого волокна, модульный миниферментер, смесительный бак, культивирование на микроносителе, орошение керамического стержня и т. д.

Способы получения и секвенирования генов иммуноглобулинов из В-клеток или плазматических клеток хорошо известны в данной области (например, см. СНар1сг 4 о£ КиЬу 1штипо1оду, 41Н βάίΐίοη, 2000).

Трансфицированная клетка-хозяин может представлять собой эукариотическую клетку, включая дрожжевые и животные клетки, в частности клетки млекопитающих (например, клетки СНО, клетки N80, клетки человека, такие как клетки РЕК.Сб или НКВ-11, миеломные клетки), а также растительные клетки.

Предпочтительные экспрессирующие хозяева могут гликозилировать антитело по изобретению, в частности, с углеводными структурами, которые сами по себе не являются иммуногенными у людей. В одном из вариантов осуществления трансфицированная клетка-хозяин может расти в среде, не содержащей сыворотку. В дополнительном варианте осуществления трансфицированная клетка-хозяин может расти в культуре без присутствия получаемых из животных продуктов. Трансфицированную клеткухозяина также можно культивировать с получением линии клеток.

Изобретение также относится к способу получения одной или более молекул нуклеиновой кислоты (например, генов тяжелых и легких цепей), которые кодируют представляющее интерес антитело, включающему этапы: (ί) получения клона иммортализованных В-клеток или культивирования плазматических клеток по изобретению; (ίί) получения из клона В-клеток или культивируемых плазматических клеток нуклеиновой кислоты, кодирующей представляющее интерес антитело. Кроме того, изобретение относится к способу получения последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей представляющее интерес антитело, включающему этапы: (ί) получения клона иммортализованных В-клеток или культивирования плазматических клеток по изобретению; (ίί) секвенирования нуклеиновой кислоты, кодирующей представляющее интерес антитело, из клона В-клеток или культивируемых плазматических клеток.

Изобретение также относится к способу получения молекулы(л) нуклеиновой кислоты, которая кодирует представляющее интерес антитело, включающему этап получения нуклеиновой кислоты, которую получали из клона трансформированных В-клеток или культивируемых плазматических клеток по изобретению. Таким образом, способы для предварительного получения клона В-клеток или культивируемой плазматической клетки, а затем получения нуклеиновой кислоты(т) из клона В-клеток или культивируемых плазматических клеток можно проводить в различные моменты времени, их могут проводить различные люди в разных местах (например, в разных странах).

- 15 030319

Изобретение относится к способу получения антитела (например, для фармацевтического применения), включающему этапы: (ί) получения и/или секвенирования одной или более нуклеиновых кислот (например, генов тяжелых и легких цепей) из выбранного клона В-клеток или культивируемых плазматических клеток, экспрессирующих представляющее интерес антитело; (ίί) встраивания нуклеиновой кислоты(т) или использования последовательности(ей) нуклеиновой кислоты для получения экспрессирующего вектора; (ΐΐΐ) трансфекции клетки-хозяина, которая может экспрессировать представляющее интерес антитело; (ίν) культивирования или субкультивирования трансфицированных клеток-хозяев в условиях, когда экспрессируется представляющее интерес антитело, и необязательно (ν) очистки представляющего интерес антитела.

Изобретение также относится к способу получения антитела, включающему этапы культивирования или субкультивирования популяции трансфицированных клеток-хозяев в условиях, когда экспрессируется представляющее интерес антитело, и необязательно очистки представляющего интерес антитела, где указанная популяцию трансфицированных клеток-хозяев получали путем (ί) предоставления нуклеиновой кислоты(т), кодирующей выбранное представляющее интерес антитело, которое продуцируется клоном В-клеток или культивируемыми плазматическими клетками, получаемыми как описано выше, (ίί) встраивания нуклеиновой кислоты(т) в экспрессирующий вектор, (ΐΐΐ) трансфекции вектора в клеткихозяева, которые могут экспрессировать представляющее интерес антитело, и (ίν) культивирования или субкультивирования трансфицированной клетки-хозяина, содержащей встроенные нуклеиновые кислоты, с получением представляющего интерес антитела. Таким образом, способы предварительного получения рекомбинантной клетки-хозяина, а затем ее культивирования для экспрессии антитела можно проводить в различные моменты времени, их могут проводить различные люди в разных местах (например, в разных странах).

Эпитопы.

Как указано выше, антитела по изобретению можно использовать для картирования эпитопов, с которыми они связываются. Авторы изобретения сделали открытие, что нейтрализующие антитела по изобретению направлены на эпитопы, встречающиеся в Р-белке до слияния, но не после слияния. В одном из вариантов осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты связываются с Р-белком К8У до слияния и не связываются с Р-белком К8У после слияния. В другом варианте осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты связываются с Р-белком К8У и МРУ до слияния и не связываются с Р-белком К8У и МРУ после слияния. В еще одном варианте осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты связываются с Р-белком К8У, МРУ и РУМ до слияния, но не связываются с Р-белком К.8У, МРУ и РУМ после слияния.

Эпитопы, с которыми связываются антитела по изобретению, могут быть линейными (непрерывными) или конформационными (прерывными). В одном из вариантов осуществления антитела и фрагменты антител по изобретению связываются с конформационным эпитопом. В другом варианте осуществления конформационный эпитоп презентируется только в невосстановительных условиях. Без связи с какой-либо теорией конформационный эпитоп, с которым связываются антитела по изобретению, обусловлен наличием дисульфидных связей между аминокислотными остатками в Р-белке.

В другом варианте осуществления эпитоп, с которым связываются антитела по изобретению, отличается от антигенного участка I, антигенного участка II, антигенного участка 1У, как определяют в Рбелке К8У после слияния и соответствующих участках в Р-белке МРУ. В еще одном варианте осуществления антитела и антигенсвязывающие фрагменты по изобретению не конкурируют перекрестно с паливизумабом, мотавизумабом, шАЬ 101Р, шАЬ 131-2А или шАЬ Ό25 за связывание с Р-белком Р.8У и не конкурируют перекрестно с тАЬ 234 за связывание с Р-белком МРУ. В другом варианте осуществления область, с которой связываются антитела по изобретению, содержит полипептид, располагающийся в Ν'концевом участке Р-белка К8У, включая остатки 8АУ8КСУЕ8АЕРТСАУТ8У1Т (8Е0 ГО N0:63). Коровая часть в этом полипептиде образована остатками Υ(χ1)δ(χ2)ΡΚΤΟΑ, которые являются высококонсервативными для К8У, МРУ и РУМ, и где аминокислота в положении (χ1) может представлять собой, но не ограничиваться ими, Ь, Р или К, и где аминокислота в положении (χ2) может представлять собой, но не ограничиваться ими, А или У. Примеры вариантов полипептида, с которыми связываются антитела по изобретению включают, но не ограничиваются ими, УЕААЕКТОА (8Е0 ГО N0:64), ΥΡδΑΡΚΤΌΑ (МТ) ГО N0:65), УКАЕКТСАА (АНО ГО N0:66), ΥΙΥΥΙ.ΚΊΟΑΥ (8Е0 ГО N0:67), УКУА.КТОА (8Е0 ГО N0:68) и Υ^ΑΡΚΤΟΑ (ТОО ΙΌ N0:69).

Полипептиды, которые связываются с антителами по настоящему изобретению, могут находить ряд применений. Полипептиды и их варианты полипептидов в очищенной или синтетической форме можно использовать для повышения иммунных ответов (т.е. в качестве вакцины или для продукции антител для других применений) или для скрининга сыворотки на антитела, которые иммунологически взаимодействует с эпитопом или его мимеотопами. В одном из вариантов осуществления такие полипептиды или варианты полипептидов или антиген, содержащий такие полипептиды или варианты полипептидов, можно использовать в качестве вакцины для повышения иммунного ответа, которая содержит антитела такого же качестве, как антитела, описываемые в настоящем изобретении. Антитела и фрагменты анти- 16 030319 тел по изобретению также можно использовать в способе мониторинга в качестве вакцин. В частности, антитела можно использовать для проверки того, что антиген в вакцине содержит правильный иммуногенный эпитоп в правильной конформации. Также предусматривают, что в объем изобретения входит использование антитела по изобретению или его антигенсвязывающего фрагмента для мониторинга качества вакцины против Р8У. или МРУ, или К.8У и МРУ, например, посредством проверки того, что антиген указанной вакцины содержит конкретный эпитоп в правильной конформации.

Полипептиды, которые связываются с антителами по настоящему изобретению, также могут являться пригодными для скрининга лигандов, которые связываются с указанными полипептидами. Такие лиганды включают, но не ограничиваются ими, антитела, включая антитела от верблюдовых, акульих и других видов, фрагменты антител, пептиды, продукты технологии фагового дисплея, аптамеры, аднектины или фрагменты других вирусных или клеточных белков, могут блокировать эпитоп и, таким образом, предотвращать инфекцию. Такие лиганды входят в объем изобретения.

Фармацевтические композиции.

Изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей одно или более из антител или фрагментов антител по изобретению; нуклеиновой кислоты, кодирующей такие антитела или фрагменты; векторов, кодирующих нуклеиновые кислоты, или полипептидов, распознаваемых антителами или антигенсвязывающим фрагментом по изобретению. Фармацевтическая композиция также может содержать фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент. Хотя носитель или эксципиент может облегчать введение, он не должен сам по себе индуцировать образование антител, опасных для индивидуума, получающего композицию. Он также не должен являться токсичным. Подходящие носители могут представлять собой большие медленно метаболизируемые макромолекулы, такие как белки, полипептиды, липосомы, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот и неактивные вирусные частицы.

Можно использовать фармацевтически приемлемые соли, например соли неорганических кислот, такие как гидрохлориды, гидробромиды, фосфаты и сульфаты, или соли органических кислот, такие как ацетаты, пропионаты, малонаты и бензоаты.

Фармацевтически приемлемые носители в терапевтических композициях могут дополнительно содержать жидкости, такие как вода, физиологический раствор, глицерин и этанол. Кроме того, в таких композициях могут содержаться вспомогательные вещества, такие как смачивающие средства или эмульгаторы, или буферизирующие рН вещества. Такие носители обеспечивают возможность формулировать фармацевтические композиции в виде таблеток, пилюль, драже, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, взвесей и суспензией, для приема внутрь индивидуумом.

В объем изобретения входят композиции, представленные в нескольких формах введения, формы включают, но не ограничиваются ими, такие формы, подходящие для парентерального введения, например, посредством инъекции или инфузии, например посредством болюсной инъекции или непрерывной инфузии. В случае, когда продукт предназначен для инъекции или инфузии, он может находиться в форме суспензии, раствора или эмульсии в масляном или водном носителе, и он может содержать вспомогательные средства, такие как суспендирующие средства, консерванты, стабилизаторы и/или диспергирующие средства. Альтернативно, молекула антитела может находиться в сухой форме, которую необходимо восстанавливать перед применением с использованием подходящей стерильной жидкости.

После формулирования композиции по изобретению можно вводить непосредственно индивидууму. В одном из вариантов осуществления композиции адаптируют для введения млекопитающему, например, являющимся людьми индивидуумам.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно вводить любым из ряда путей, включая, но, не ограничиваясь ими, пероральный, внутривенный, внутримышечный, внутриартериальный, интрамедуллярный, интраперитонеальный, интратекальный, внутрижелудочковый, трансдермальный, чрескожный, местный, подкожный, интраназальный, энтеральный, сублингвальный, внутривлагалищный или ректальный путь. Для введения фармацевтических композиций по изобретению также можно использовать безыгольные шприцы. Как правило, терапевтические композиции можно получать в виде инъецируемых растворов, а также в виде жидких растворов или суспензий. Также можно получать твердые формы, подходящие для растворения или суспендирования в жидких носителях переде инъекцией.

Прямую доставку композиций, как правило, проводят посредством инъекции, подкожно, интраперитонеально, внутривенно или внутримышечно или доставляют в межклеточное пространство ткани. Композиции также можно вводить в очаг поражения. Дозированное лечение может представлять собой схему однократного дозирования или схему многократного дозирования. Известные фармацевтические средства на основе антител обеспечивают рекомендации относительно частоты введения, например, необходимо ли фармацевтическое средство доставлять ежесуточно, еженедельно, ежемесячно и т.д. Частота и дозирование также могут зависеть от тяжести симптомов.

Композиции по изобретению можно получать в различных формах. Например, композиции можно получать в виде инъецируемых растворов, а также в виде жидких растворов или суспензий. Также можно получать твердые формы, подходящие для растворения или суспендирования в жидких носителях перед

- 17 030319 инъекцией (например, лиофилизированной композиции, такой как §упад18™ и НетсерДп™ для восстановления стерильной водой, содержащей консервант). Композицию можно получать для местного введения, например, в виде мази, крема или порошка. Композицию можно получать для перорального введения, например, в виде таблетки или капсулы, в виде спрея или в виде сиропа (необязательно ароматизированного). Композицию можно получать для легочного введения, например, в виде ингаляционного аэрозоля, с использованием тонкодисперсного порошка или спрея. Композицию можно получать в виде суппозитория или пессария. Композицию можно получать для назального, ушного или глазного введения, например, в виде капель. Композиция может находиться в форме набора, сконструированного таким образом, чтобы комбинированную композицию восстанавливать непосредственно перед введением индивидууму. Например, лиофилизированное антитело можно предоставлять в форме набора со стерильной водой или стерильным буфером.

Следует понимать, что активный ингредиент в композиции представляет собой молекулу антитела, фрагмент антитела или их варианты и производные. В связи с этим он подвергается деградации в желудочно-кишечном тракте. Таким образом, если композицию необходимо вводить путем с использованием желудочно-кишечного тракта, композиция должна содержать средства, которое защищает антитело от деградации, но которое высвобождает антитело после его всасывания из желудочно-кишечного тракта.

Всестороннее обсуждение фармацевтически приемлемых носителей доступно в Сенпато (2000) КеШ1п§1оп: Тйе Заепсе и РтасНсе о£ Рйатшасу, 20Л ебйюп, ΙδΒΝ: 0683306472.

Фармацевтические композиции по изобретению, как правило, имеют рН от 5,5 до 8,5, в некоторых вариантах осуществления он может составлять от 6 до 8 и в других вариантах осуществления приблизительно 7. рН можно поддерживать посредством использования буфера. Композиция может являться стерильной и/или апирогененной. Композиция может быть изотонической по отношению к людям. В одном из вариантов осуществления фармацевтические композиции по изобретению поставляют в герметически закрытых контейнерах.

Фармацевтические композиции содержат эффективное количество одного или более антител по изобретению и/или полипептида, содержащего эпитоп, который связывается с антителом по изобретению, т.е. количество, которое является достаточным для лечения, улучшения состояния, ослабления или профилактики желаемого заболевания или состояния или для проявления детектируемого терапевтического эффекта.

Терапевтические эффекты также включают снижение или ослабление патогенной активности или физических симптомов. Точное эффективное количество для любого конкретного индивидуума зависит от его размера, массы и состояния здоровья, природы и выраженности состояния и терапевтических средств или комбинации терапевтических средств, выбранных для введения. Эффективное количество для данной ситуации определяют общепринятым экспериментированием, и оно зависит от решения врача-клинициста. Для целей настоящего изобретения эффективная доза, как правило, составляет приблизительно от 0,01 мг/кг приблизительно до 50 мг/кг или приблизительно от 0,05 мг/кг приблизительно до 10 мг/кг композиций по настоящему изобретению для индивидуума, которому ее вводят. Известные фармацевтические средства на основе антител предоставляют рекомендации относительно такой дозы, например, НетсерДп™ вводят посредством внутривенной инфузии 21 мг/мл раствора с начальной ударной дозой 4 мг/кг массы тела и еженедельной поддерживающей дозой 2 мг/кг массы тела; Кйихап¹™ вводят еженедельно при 375 мг/м² и т.д.

В одном из вариантов осуществления композиции могут содержать более одного (например, 2, 3 и т.д.) антитела по изобретению для обеспечения аддитивного или синергического терапевтического эффекта. В другом варианте осуществления композиция может содержать одно или более (например, 2, 3 и т.д.) антител по изобретению и одно или более (например, 2, 3 и т.д.) дополнительных антител против КЗУ, МРУ или КЗУ и МРУ. Кроме того, в объем изобретения входит введение антител по изобретению совместно с антителами, специфическими для других патогенов, например вируса гриппа А или гриппа В. Антитела по изобретению можно вводить в комбинации/одновременно или в отдельные моменты времени от антител, специфических к патогенам, отличным от КЗУ или МРУ.

В другом варианте осуществления изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей два или более антител, где первое антитело представляет собой антитело по изобретению, как описано в настоящем описании, и второе антитело является специфическим к КЗУ, МРУ или КЗУ и МРУ или другому патогену, который может содержаться у индивидуума со смешанной инфекцией, которому вводят фармацевтическую композицию.

Примеры антител по изобретению, специфичных к КЗУ, МРУ и РУМ и которые нейтрализуют их, включают, но не ограничиваются ими, вариант 3 НМВ3210, вариант 1 НМВ3210, вариант 2 НМВ3210, вариант 4 НМВ3210, вариант 5 НМВ3210, вариант 6 НМВ3210, вариант 1 НМВ2430, вариант 2 НМВ2430, вариант 3 НМВ2430, вариант 4 НМВ2430 или вариант 5 НМВ2430.

В одном из вариантов осуществления изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей вариант 1 антитела НМВ3210 или его антигенсвязывающий фрагмент и фармацевтически приемлемый носитель. В другом варианте осуществления изобретение относится к фармацевтической ком- 18 030319 позиции, содержащей вариант 2 антитела НМВ3210 или его антигенсвязывающий фрагмент и фармацевтически приемлемый носитель. В другом варианте осуществления изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей вариант 3 антитела НМВ3210 или его антигенсвязывающий фрагмент и фармацевтически приемлемый носитель. В другом варианте осуществления изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей вариант 4 антитела НМВ3210 или его антигенсвязывающий фрагмент и фармацевтически приемлемый носитель. В другом варианте осуществления изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей вариант 5 антитела НМВ3210 или его антигенсвязывающий фрагмент и фармацевтически приемлемый носитель. В другом варианте осуществления изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей вариант 6 антитела НМВ3210 или его антигенсвязывающий фрагмент и фармацевтически приемлемый носитель.

В еще одном варианте осуществления изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей вариант 1 антитела НМВ2430 или его антигенсвязывающий фрагмент и фармацевтически приемлемый носитель. В другом варианте осуществления изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей вариант 2 антитела НМВ2430 или его антигенсвязывающий фрагмент и фармацевтически приемлемый носитель. В другом варианте осуществления изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей вариант 3 антитела НМВ2430 или его антигенсвязывающий фрагмент и фармацевтически приемлемый носитель. В другом варианте осуществления изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей вариант 4 антитела НМВ2430 или его антигенсвязывающий фрагмент и фармацевтически приемлемый носитель. В другом варианте осуществления изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей вариант 5 антитела НМВ2430 или его антигенсвязывающий фрагмент и фармацевтически приемлемый носитель.

Антитела по изобретению можно вводить (комбинировано или раздельно) совместно с другими терапевтическими средствами, например с химиотерапевтическими соединениями, с лучевой терапией и т.д. В одном из вариантов осуществления терапевтические соединения включают противовирусные соединения, такие как ТатШи™. Такое комбинированное лечение обеспечивает аддитивное или синергическое улучшение терапевтической эффективности по сравнению с индивидуальными терапевтическими средствами при отдельном введении. Термин синергизм используют для описания комбинированного действия двух или более активных средств, которое является больше, чем сумма отдельных действия каждого соответствующего активного средства. Таким образом, когда комбинированное действие двух или более средств приводит к синергическому ингибированию активности или процесса, следует понимать, что ингибирование активности или процесса является больше, чем сумма ингибирующего действия каждого соответствующего активного средства. Термин синергический терапевтический эффект относится к терапевтическому эффекту, наблюдаемому для комбинации двух или более терапевтических средств, где терапевтический эффект (как определяют по любому из ряда параметров) является больше, чем сумма отдельных терапевтических эффектов, наблюдаемых для соответствующих отдельных видов терапии.

Антитела можно вводить таким индивидуумам, у которых ранее не выявляли ответной реакции, т.е. было показано, что они являются устойчивыми к лечению инфекции К8У или МРУ. Такое лечение может включать предшествующее лечение противовирусным средством. Это может быть обусловлено, например, инфекцией устойчивым к противовирусному средству штаммом К8У, МРУ или К8У и МРУ.

В одном из вариантов осуществления композиция по изобретению может содержать антитела по изобретению, где антитела могут составлять по меньшей мере 50 мас.% (например, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 мас.% или более) от общего белка в композиции. В такой композиции антитела находятся в очищенной форме.

Изобретение относится к способу получения фармацевтической композиции, включающему этапы: (ί) получения антитела по изобретению и (ίί) смешивания очищенного антитела с одним или более фармацевтически приемлемых носителей.

В другом варианте осуществления способ получения фармацевтической композиция включает этап смешивания антитела с одним или более фармацевтически приемлемых носителей, где антитело представляет собой моноклональное антитело, которое получали из трансформированной В-клетки или культивированной плазматической клетки по изобретению. Таким образом, способы предварительного получения моноклонального антитела, а затем получения фармацевтического препарата можно проводить в различные моменты времени, их могут проводить различные люди в разных местах (например, в разных странах).

В качестве альтернативы доставки антитела или В-клетки для терапевтических целей можно доставлять нуклеиновую кислоту (как правило, ДНК), кодирующую представляющее интерес моноклональное антитело (или его активный фрагмент), получаемую из В-клетки или культивируемых плазматических клеток, индивидууму, таким образом, что нуклеиновая кислота может экспрессироваться у индивидуума ίη 8Йи, обеспечивая желаемый терапевтический эффект. Подходящая генотерапия и доставка векторов нуклеиновой кислоты являются известными в данной области.

Композиции по изобретению могут представлять собой иммуногенные композиции и в некоторых вариантах осуществления могут представлять собой вакцинные композиции, содержащие антиген, со- 19 030319 держащий эпитоп, распознаваемый антителом по изобретению или его антигенсвязывающим фрагментом. Вакцины по изобретению могут быть профилактическими (т.е. предотвращать инфекцию) или терапевтическими (т.е. лечить или приводить к улучшению состояния инфекции).

Композиции могут содержать противомикробное средство, в частности, если упакованы в формате многократных доз. Они могут содержать детергент, например Т\уссп (полисорбат), такой как Т\уссп 80. Детергенты, как правило, содержатся на низких уровнях, например менее 0,01%. Композиции также могут содержать натриевые соли (например, хлорид натрия) для придания тоничности. Характерной является концентрация №С1 10±2 мг/мл.

Кроме того, композиции могут содержать сахарный спирт (например, маннит) или дисахарид (например, сахарозу или трегалозу), например, приблизительно 15-30 мг/мл (например, 25 мг/мл), в частности, если их необходимо лиофилизировать или если они содержат вещество, которое восстанавливали из лиофилизированного вещества. рН композиции для лиофилизации можно регулировать от 5 до 8, или от 5,5 до 7, или приблизительно 6,1 перед лиофилизацией.

Композиции по изобретению также могут содержать одно или более иммунорегулирующих средств. В одном из вариантов осуществления одно или более иммунорегулирующих средств включает адъювант.

Композиции эпитопа по изобретению могут вызывать опосредованный клетками иммунный ответ, а также гуморальный иммунный ответ для эффективной борьбы с инфекцией К8У и МРУ. Такой иммунный ответ может индуцировать присутствующие длительное время (например, нейтрализующие) антитела и опосредованный клетками иммунитет, который может быстро реагировать при экспозиции К8У или МРУ или К8У и МРУ.

Виды медицинского лечения и применения.

Антитела и фрагменты антител по изобретению или их производные и варианты можно использовать для лечения инфекции К8У или МРУ или смешанной инфекции К8У и МРУ, для профилактики инфекции К8У, или МРУ, или К8У и МРУ или для диагностики инфекции К8У или МРУ.

Способы диагностики могут включать приведение антитела или фрагмента антитела в контакт с образцом. Такие образцы могут представлять собой образцы ткани, получаемые, например, из носовых проходов, придаточных пазух полости носа, слюнных желез, легких, печени, поджелудочной железы, почки, уха, глаза, плаценты, пищеварительного тракта, сердца, яичников, гипофиза, надпочечников, щитовидной железы, головного мозга или кожи. Способы диагностики также могут включать детекцию комплекса антиген/антитело.

Таким образом, изобретение относится к (ί) антителу, фрагменту антитела или его вариантам и производным по изобретению, (ίί) клону иммортализованных В-клеток по изобретению, (ίίί) эпитопу, способному связываться с антителом по изобретению, или (ίν) лиганду, предпочтительно антителу, способному связываться с эпитопом, который связывается с антителом по изобретению, для применения в терапии.

Изобретение также относится к способу лечения индивидуума, включающему введение индивидууму антитела, фрагмента антитела или его вариантов и производных по изобретению, или лиганда, предпочтительно антитела, способного связываться с эпитопом, который связывается с антителом по изобретению. В одном из вариантов осуществления способ приводит к сниженной инфекции К8У или МРУ у индивидуума. В другом варианте осуществления способ предотвращает, снижает риск или замедляет развитие инфекции К8У или МРУ у индивидуума.

Изобретение также относится к применению (ί) антитела, фрагмента антитела или его вариантов и производных по изобретению, (ίί) клона иммортализованных В-клеток по изобретению, (ίίί) эпитопу, способному связываться с антителом по изобретению, (ίν) лиганду, предпочтительно антителу, который связывается с эпитопом, способным связываться с антителом по изобретению, или (ν) фармацевтической композиции по изобретению для (ί) производства лекарственного средства для лечения или ослабления инфекции К8У, или МРУ, или К.8У и МРУ (ίί) вакцины или (ίίί) диагностики инфекции К8У и МРУ.

Изобретение относится к композиции по изобретению для применения в качестве лекарственного средства для профилактики или лечения инфекции К8У или МРУ. Оно также относится к использованию антител по изобретению и/или белка, содержащего эпитоп, с которым такое антитело связывается, в производстве лекарственного средства для лечения индивидуума и/или диагностики у индивидуума. Оно также относится к способу лечения индивидуума, включающему этап введения индивидууму композиции по изобретению. В некоторых вариантах осуществления индивидуум может представлять собой человека. Один из путей проверки эффективности терапевтического лечения включает мониторинг симптомов заболевания после введения композиции по изобретению. Лечение может представлять собой схему с однократным дозированием или схему с многократным дозированием.

В одном из вариантов осуществления антитело, фрагмент антитела, клон иммортализованных Вклеток, эпитоп или композицию по изобретению вводят нуждающемуся в таком лечении индивидууму. Такой индивидуум включает, но не ограничивается ими, индивидуума, который особенно подвергается риску или является предрасположенным к инфекции К8У или МРУ, включая, например, индивидуума с ослабленным иммунитетом. Антитело или фрагмент антитела по изобретению также можно использо- 20 030319 вать при пассивной иммунизации или активной вакцинации.

Антитела и их фрагменты, как описано в настоящем изобретении, также можно использовать в наборе для диагностики инфекции КЗУ или МРУ. Кроме того, эпитопы, способные связываться с антителом по изобретению, можно использовать в наборе для мониторинга эффективности способов вакцинации путем детекции наличия защитных антител против К8У или антитела против МРУ. Антитела, фрагмент антитела или их варианты и производные, как описано в настоящем изобретении, также можно использовать в наборе для мониторинга производства вакцины с желаемой иммуногенностью.

Изобретение также относится к эпитопу, который специфически связывается с антителом по изобретению или его антигенсвязывающим фрагментом, для применения (ί) в терапии, (ίί) в производстве лекарственного средства для лечения или ослабления инфекции К8У, или МРУ, или К8У и МРУ, (ίίί) в качестве вакцины или (ίν) для скрининга лигандов, способных нейтрализовать инфекцию К8У, или МРУ, или К8У и МРУ.

Изобретение также относится к способу получения фармацевтического средства, включающему этап смешивания моноклонального антитела с одним или более фармацевтически приемлемых носителей, где моноклональное антитело представляет собой моноклональное антитело, которое получали из трансфицированной клетки-хозяина по изобретению. Таким образом, способы предварительного получения моноклонального антитела (например, его экспрессии и/или его очистки), а затем его смешивания с фармацевтическим носителем(ями) можно проводить в различные моменты времени, их могут проводить различные люди в разных местах (например, в разных странах).

Начиная с трансформированной В-клетки или культивируемой плазматической клетки по изобретению, можно проводить различные этапы культивирования, субкультивирования, клонирования, субклонирования, секвенирования, получения нуклеиновой кислоты и т. д. с оптимальной оптимизацией на каждом этапе для сохранения антитела, экспрессируемого трансформированной В-клеткой или культивируемой плазматической клеткой. В одном из вариантов осуществления указанные выше способы дополнительно включают способы оптимизации (например, созревание аффинности или оптимизации), применяемые к нуклеиновым кислотам, кодирующим антитело. Настоящее изобретение относится ко всем клеткам, нуклеиновым кислотам, векторам, последовательностям, антителам и т.д., используемым и получаемым во время таких этапов.

Во всех этих способах нуклеиновую кислоту, используемую в экспрессирующем хозяине, можно подвергать манипуляции для встраивания, удаления или изменения определенных последовательностей нуклеиновой кислоты. Изменения в результате такой манипуляции включают, но не ограничиваются ими, изменения для введения участков рестрикции, для улучшения частоты использования кодона, для добавления или оптимизации регуляторных последовательностей транскрипции и/или трансляции и т. д. Также можно изменять нуклеиновую кислоту для изменения кодируемых аминокислот. Например, пригодным может являться введение одной или более (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и т.д.) замен аминокислот, делеций и/или вставок в аминокислотную последовательность антитела. Такие точечные мутации могут модифицировать эффекторные функции, аффинность связывания с антигеном, посттрансляционные модификации, иммуногенность и т.д., могут вводить аминокислоты для присоединения ковалентных групп (например, меток) или могут вводить метки (например, для очистки). Мутации можно вводить в конкретные участки или можно вводить случайным образом с последующей селекцией (например, молекулярной эволюцией). Например, одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих любую из областей СЭР, вариабельные области тяжелой цепи или вариабельные области легкой цепи антител по изобретению можно подвергать случайному или направленному мутагенезу для введения различных свойств в кодируемые аминокислоты. Такие изменения могут приводить к итеративному процессу, где сохраняются начальные изменения, и вводятся новые изменения в другие положения нуклеотида. Кроме того, можно комбинировать изменения, получаемые на независимых этапах. Различные свойства, вводимые в кодируемые аминокислоты, могут включать, но не ограничиваться ими, повышенную аффинность.

Общие положения

Как используют в настоящем описании, термины антигенсвязывающий фрагмент, фрагмент и фрагмент антитела используют взаимозаменяемо для обозначения любого фрагмента антитела по изобретению, который сохраняет антигенсвязывающую активность антитела. Примеры фрагментов антител включают, но не ограничиваются ими, одноцепочечное антитело, РаЬ, РаЬ', Р(аЬ')₂, Εν или 8сРν. Кроме того, термин антитело, как используют в настоящем описании, включает антитела и их антигенсвязывающие фрагменты.

Как используют в настоящем описании, нейтрализующее антитело представляет собой антитело, которое нейтрализует, например, предотвращает, ингибирует, снижает, затрудняет или препятствует способности патогена инициировать и/или сохранять инфекцию у хозяина. Термины нейтрализующее антитело и антитело, которое нейтрализует или антитела, которые нейтрализуют в настоящем описании используют взаимозаменяемо.

Такие антитела можно использовать отдельно или в комбинации в качестве профилактических или терапевтических средств после соответствующего формулирования в ассоциации с активной вакцинацией, в качестве диагностического средства или в качестве средства получения, как описано в настоящем

- 21 030319 описании.

Термин содержащий включает включающий, а также состоящий, например композиция, содержащая X может состоять исключительно из X или может содержать какое-либо дополнение, например, Χ+Υ.

Слово по существу не исключает полностью, например, композиция, которая по существу, не содержит Υ, может абсолютно не содержать Υ. При необходимости слово по существу можно не указывать в определении изобретения.

Термин приблизительно в отношении численной величины х означает, например, х±5%, или х±7%, или х±10%, или х±12%, или х±15%, или х±20%.

Предполагают, что термин заболевание, как используют в настоящем описании, как правило, является синонимом, и его используют взаимозаменяемо с терминами нарушение и состояние (как в медицинском состоянии), что обусловлено тем, что все они отражают аномальное состояние организма человека или животного или одного из его частей, которое нарушает нормальное функционирование, как правило, манифестирует с отличительными признаками и симптомами, и приводит к тому, что продолжительность или качество жизни человека или животного снижается.

Как используют в настоящем описании, ссылка на лечение индивидуума или пациента предназначена включать предотвращение, профилактику, ослабление, улучшение состояния и терапию. Термины индивидуум или пациент в настоящем описании используют взаимозаменяемо для обозначения всех млекопитающих, включая людей. Примеры индивидуумов включают людей, коров, собак, кошек, лошадей, коз, овцу, свиней и кроликов. В одном из вариантов осуществления пациент представляет собой человека.

Примеры

Иллюстративные варианты осуществления настоящего изобретения предоставлены в следующих ниже примерах. Следующие ниже примеры предоставлены только в качестве иллюстрации и для помощи специалисту в данной области использовать изобретение. Примеры не предназначены ограничивать объем изобретения каким-либо образом.

Пример 1. Выделение и характеристика моноклональных антител из В-клеток памяти человека, способных перекрестно нейтрализовать К8У и МРУ.

Из когорты 125 доноров крови авторы выбирали 7 доноров, у которых выявляли высокие титры антител против К8У и МРУ в сыворотке. В-клетки СО22+ 1§С+ выделяли из криоконсервированных мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) и подвергали иммортализации в 3-5 клетках/лунку с использованием вируса Эпштейна-Барра (ЕВУ) и олигодезоксинуклеотида 2006 СрС и облученных аллогенных РВМС в качестве фидерных клеток. Супернатанты культур собирали через 14 суток и анализировали на наличие нейтрализующих антител анализом микронейтрализации на основе инфекции клеток Нер-2 штаммом А2 К8У или клеток ЬЬС-МК2 штаммом А1 1-РУ-03/01-6621 МРУ. Чистые супернатанты инкубировали с 50-100 ТСГО₅₀ вирусов в течение 1 ч при комнатной температуре перед добавлением клеток-мишеней Нер-2 или ЬЬС-МК2, с которыми инкубировали в течение 6 или 8 суток соответственно. Затем детектировали жизнеспособные клетки с использованием спектрофотометра, добавляя к культурам реагент ХУ8Т-1 (КосЬе) в течение от 3 до 4 ч.

Из трех независимых экспериментов выделяли 36 моноклональных антител (тАЬ), которые нейтрализовали МРУ (фиг. 1, левая панель), и из пяти независимых экспериментов выделяли 136 тАЬ, которые нейтрализуют К8У (фиг. 1, правая панель). Затем проводили вторичный скрининг для тестирования, способны ли выделенные тАЬ нейтрализовать МРУ и К8У. С использованием этой стратегии было выявлено, что два тАЬ, выделенные у одного из доноров (дон. 5), перекрестно нейтрализуют К8У и МРУ: (ί) НМВ2430, которое исходно отбирали на основании нейтрализации К8У, и (ίί) НМВ3210, которое исходно отбирали на основании нейтрализации МРУ.

Гены УН и УЪ НМВ2430 и НМВ3210 клонировали в экспрессирующие векторы для 1§С1 и получали рекомбинантные тАЬ временной трансфекцией клеток 293 Ргее81у1е (293Р). Супернатанты от трансфицированных клеток собирали через 10 суток культивирования и 1§С аффинно очищали хроматографией с белком А. Два тАЬ обладали наиболее общими фрагментами генов У и ί (ЮНУ3-21*01, ЮШ4*02, ЮЬУ1-40*01 и ЮЬЛ*01) согласно анализу гомологии, проводимому с использованием базы данных 1МСТ, но различали в Ν-областях по частоте использования ЮНЭ (Ό3-10*01 и Ό5-24*01 для НМВ2430 и НМВ3210 соответственно) и по паттерну соматических мутаций, и, таким образом, их не считали клонально родственными.

Половину максимальной ингибирующей концентрации (1С₅₀) НМВ2430 и НМВ3210 определяли с использованием анализа микронейтрализации, описанного выше, со 100 инфицирующими дозами 50 для культуры тканей (ТСГО50) вируса. Значения 1С₅₀ уа1ие8 рассчитывали посредством интерполяции кривых нейтрализации, аппроксимированных с использованием нелинейной регрессией с 4 параметрами с переменным наклоном. Результаты анализа представлены на фиг. 2 и в табл. 4.

Таблица 4

- 22 030319

	тАЬ 1С50 (нг/мл)
Вирусы (группа)	НМВ2430	НМВ3210	Паливизумаб	234
А2 ПЗУ (А)	146	86	524	>20000
МРУ 1-РУ 03/01-6621 (А1)	393	52	>20000	7

Пример 2. Степень реактивности всех групп и подгрупп К8У и МРУ.

Для оценки спектра реактивности НМВ2430 и НМВ3210 очищенные тАЬ тестировали РАС8 на связывание с инфицированными К8У клетками Нер-2 или с инфицированными МРУ клетками ЬЬС-МК2 с использованием следующих штаммов К8У и МРУ: А2 К8У (А, 1961 АизйаНа; А/А2/61), К8У Ьоп§ (А, Магу1апд И8, 1956; А/Ьопд/56), К8У Капда11 (А, СЫеадо И8, 1958; А/КапдаП/58), К8У 9320 (В, МаззасНизсИз и8, 1977; В/9320/77), АУ 14617 85 (В, Нип1т§1оп Аез! Ухгдтт, 1985; В/14617/85), 18537 (В, АазНт§1оп ΌΐδΐΓίοΐ о£ Со1итЬт И8, 1962; В/18537/62), МРУ 1-РУ-03/01-6621 (А1, Рау1а ΙΤ, 2001; А1/6621/01), МРУ 1-РУ-02/06-8938 (А2, Рау1а ΙΤ, 2006; А2/8938/06), 1-РУ-03/04-4702 (В1, Рау1а ΙΤ, 2004; В1/4702/04) и 1-РУ-02/04-3817 (В2, Рау1а ΙΤ, 2004; В2/3817/04). Параллельно тестировали три ранее описанных тАЬ: (ΐ) мотавизумаб, специфичный к К8У; (ΐΐ) тАЬ 234, специфичное к МРУ, и (ΐΐΐ) ΡΟ32, специфичное к гриппу А (используемое в качестве отрицательного контроля). Все тАЬ тестировали на связывание с инфицированными или неинфицированнымми клетками при 10 мкг/мл. НМВ2430 и НМВ3210 взаимодействовали со всеми 6 тестируемыми штаммами К8У и всеми 4 тестируемыми штаммами МРУ, характерными для известных групп и подгрупп К8У и МРУ (табл. 5). В противоположность этому, мотавизумаб взаимодействовал со всеми тестируемыми 6 штаммами К8У, но не взаимодействовал с каким-либо из 4 тестируемых штаммов МРУ. В свою очередь, тАЬ 234 взаимодействовало со всеми 4 тестируемыми штаммами МРУ, но не взаимодействовало с каким-либо из 6 тестируемых штаммов К8У.

Таблица 5

Окрашивание клеток Нер-2 или ЬЬС-МК2, инфицированных различными штаммами К8У или МРУ соответственно, ΡΘ32 (отрицательный контроль),мотавизумабом, 234,

НМВ2430 и НМВ3210, как измеряют проточной цитометрией

	Моноклональное антитело (10 мкг/мл)
Вирус	РОЗ 2	Мотавизумаб	тАЬ 234	НМВ2430	НМВ3210
ПЗУ А/А2/61	-	+	-	+	+
ПЗУ А/Ьопд/56	-	+	-	+	+
ПЗУ А/КапЬа11/58	-	+	-	+	+
ПЗУ В/18537/62 ПЗУ В/14617/85 ПЗУ В/9320/77 МРУ А1/6621/01 МРУ А2/8938/06 МРУ В1/4702/04 МРУ В2/3817/04 Моек ЬЬС-МК2	-	1 1 1 1 1 + + +	1 1 1 + + + + 1	1 + + + + + + +	+ + + + + + +
Моек Нер-2	-	-	-	-	-

- - <5% окрашенных клеток, + - >5 0% окрашенных клеток.

Пример 3. Связывание с рекомбинантным Ρ-белком К8У и МРУ посредством ЕЫ8А и окрашиванием трансфицированных клеток.

Для идентификации антигена-мишени, распознаваемого НМВ2430 и НМВ3210 на вирусах К8У и МРУ, авторы анализировали два тАЬ параллельно с мотавизумабом и тАЬ 234 в отношении их способности связываться с гомотримерным растворимым Ρ-белком К8У (штамм А2), который получали из временно трансфицированных клеток 293Ρ. Как представлено на фиг. 3, НМВ2430 и НМВ3210 специфически взаимодействовали с Ρ-белком К8У согласно ЕЫ8А, и для них демонстрировали отличающийся профиль связывания по сравнению с мотавизумабом. Кроме того, НМ2430 и НМВ3210 окрашивали внутриклеточно клетки 293Ρ временно трансфицированные экспрессирующими векторами на основе клеток млекопитающих, кодирующих полноразмерный Ρ-белок из К8У (штамма А2) или МРУ (штамма ΝΕ/1/99 В1) (табл. 6), свидетельствуя о том, что НМВ2430 и НМВ3210 распознают общий эпитоп, презентируемый на Ρ-белках К8У и МРУ. Это открытие является особенно неожиданным, учитывая, что Ρбелки К8У и МРУ обладают только 33-35% идентичностью аминокислотных последовательностей. Как и ожидалось, паливизумаб и мотавизумаб связывались с клетками, экспрессирующими Ρ-белок К8У, но не с клетками, экспрессирующими Ρ-белок МРУ (табл. 6). В свою очередь, тАЬ 234 связывалось с клетками, экспрессирующими Ρ-белок МРУ, но не с клетками, экспрессирующими Ρ-белок К8У (табл. 6).

- 23 030319

Таблица 6

Окрашивание нетрансфицированных клеток 293Р или клеток 293Р, трансфицированных Р-белком К8У или МРУ, как измеряют проточнойцитометрией

Антитело	293Г+К5У Г	293Г+МРУ Г	Нетрансфицированные
(10 мкг/мл)	(А/А2/61; А)	(ΝΙι/1/99; В1)	293Г
НМВ3210	+	+	-
НМВ2410	+	+	-
Паливизумаб	+	-	-
Мотавизумаб	+	-	-
234	-	+	-

- - <5% окрашенных клеток, + - >50% окрашенных клеток.

Пример 4. Картирование эпитопов с использованием анализа ингибирования связывания на инфицированных К8У клетках.

Для того чтобы установить эпитоп Р-белка, распознаваемый НМВ2430 и НМВ3210, авторы разработали анализа ингибирования связывания с использованием клеток Нер-2, инфицированных штаммом А2 К8У. Следующую ниже панель специфических к Р-белку К8У тАЬ приобретали или получали синтезом генов: (ΐ) мотавизумаб, специфический для антигенного участка II; (ΐΐ) 101Р, специфическое для антигенного участка IV; (ίίί) Ό25 неопределенной специфичности; (ίν) 131-2а, специфическое для антигенного участка I. тАЬ метили биотином и тестировали на связывание с инфицированными клетками Нер-2 для определения оптимальной концентрации тАЬ, необходимой для получения 70-80% максимального связывания. Затем использовали меченные биотином тАЬ в качестве зондов для оценки, ингибировалось ли их связывание (измеряемое с использованием стрептавидина, конъюгированного с флуорофором) предварительной инкубацией клеток, инфицированных А2 К8У, с 50-кратным избытком гомологичных или гетерологичных немеченых тАЬ. Как и ожидалось, связывание меченного биотином НМВ2430 блокировали предварительной инкубацией клеток с немеченым НМВ2430, но его также частично блокировали немеченым НМВ3210 (фиг. 4). В противоположность этому связывание всех других тестируемых меченных биотином тАЬ, не предотвращали предварительной инкубацией с НМВ2430 или НМВ3210 (фиг. 4). В своей совокупности эти результаты свидетельствуют о том, что НМВ2430 и НМВ3210 распознают частично перекрывающиеся эпитопы на Р-белке, которые являются общими в К8У и МРУ, и что эти эпитопы отличаются от эпитопов в антигенном участке II Р-белка (распознаваемом мотавизумабом и паливизумабом), антигенном участке IV (распознаваемым тАЬ 101Р) и антигенном участке I (распознаваемым тАЬ 131-2А). Кроме того, эпитопы, распознаваемые тАЬ НМВ2430 и НМВ3210 на Р-белке К8У, отличаются от неизвестного эпитопа, распознаваемого тАЬ Ό25.

Пример 5. Реактивность моноклонального антитела по отношению к Р-белкам К8У и МРУ в восстановительных и невосстановительных условиях.

Для дополнительного подтверждения открытия, что НМВ2430 и НМВ3210 распознают Р-белок К8У и МРУ, авторы тестировали два тАЬ на их способность окрашивать Р-белки К8У и МРУ в вестернблоттинге. Клетки Нер-2 инфицировали К8У и клетки ЬЬС-МК2 инфицировали МРУ, лизировали с мягким детергентом и прогоняли на геле δΌδ-РАОЕ в восстановительных или невосстановительных условиях. Затем белки переносили на мембрану РУОР, которую затем инкубировали с НМВ2430, НМВ3210, мотавизумабом или тАЬ 234. Связывание тАЬ детектировали с использованием антитела, конъюгированного с НКР, против антитела человека в комбинации с ЕСЬ реагентом для детекции для вестернблоттинга. НМВ2430 и НМВ3210 связывались с Р-белком, получаемом из инфицированных К8У клеток (фиг. 5) и инфицированных МРУ клеток (фиг. 6) в невосстановительных условиях. Специфическое к МРУ тАЬ 234 (которое распознает эпитоп на Р-белке МРУ, который соответствует антигенному участку II на Р-белке К8У) связывалось с Р-белком МРУ в невосстановительных условиях, но не связывалось с Рбелком К8У. В противоположность этому специфическое к К8У тАЬ мотавизумаб связывалось с Рбелком К8У как в восстановительных, так и в невосстановительных условиях, подтверждая распознавание преимущественно линейного эпитопа. Эти результаты позволяют предположить, что в отличие от мотавизумаба и паливизумаба НМВ2430 и НМВ3210 распознают конформационные эпитопы, которые также обусловлены наличием дисульфидных связей между аминокислотными остатками в Р-белках К8У и МРУ.

Пример 6. Нейтрализация всех групп и подгрупп К8У и МРУ НМВ2430 и НМВ3210.

Очищенные НМВ2430 и НМВ3210 тАЬ тестировали на их способность нейтрализовать инфекцию К8У или МРУ клеток Нер-2 или ЬЬС-МК2 соответственно. Тестировали следующие ниже штаммы К8У и МРУ: А2 К8У (А, 1961 АшЦайа; А/А2/61), К8У Ьоид (А, Магу1аий υδ, 1956; А/Ьоид/56), К8У Каийай (А, СЫсадо υδ, 1958; А/Каийа11/58), К8У 9320 (В, МаззасЬизеПз υδ, 1977; В/9320/77), ^У/14617/85 (В, НиийидЮи Шек1 Уй-д1та, 1985; В/14617/85), 18537 (В, ШакНтдЮи ΌίδΙτίΟ о£ Со1итЫа υδ, 1962; В/18537/62), К8У 9727/2009 (В, Раша II, 2009; В/9727/09), К8У 9736/2009 (В, Раша II, 2009; В/9736/09), К8У 9847/2009 (В, Раша II, 2009; В/9847/09), МРУ КРУ-03/01-6621 (А1, Раша II, 2001; А1/6621/01),

- 24 030319

МРУ ГРУ-02/06-8938 (А2, Ρаν^а ΙΤ, 2006; А2/8938/06), 1-РУ-02/06-8908 (А2, Рахоа ΙΤ, 2006; А2/8908/06), 1-УР-02/06-8909 (А2, Ρаν^а ΙΤ, 2006; А2/8909/06), 1-РУ-03/04-4702 (В1, Ρаν^а ΙΤ, 2004; В1/4702/04) и Ι-РУ02/04-3817 (В2, Ρаν^а ΙΤ, 2004; В2/3817/04).

В том же эксперименте НМВ2430 и НМВ3210 сравнивали с паливизумабом (специфическим к К8У) и тАЬ 234 (специфическим к МРУ). НМВ3210 нейтрализовало все 11 тестируемых штаммов К8У и все 6 тестируемых штаммов МРУ, характерных для известных групп и подгрупп К8У и МРУ (табл. 7). НМВ2430 нейтрализовало все 11 тестируемых штаммов К8У и все тестируемые штаммы А1 и А2 МРУ, но не тестируемые штаммы В1 или В2 МРУ. Как и ожидалось, паливизумаб нейтрализовал все 11 тестируемых штаммов К8У, но ни одного из 6 тестируемых штаммов МРУ, тогда как тАЬ 234 нейтрализовал все 6 тестируемых штаммов МРУ, но ни одни из 11 тестируемых штаммов К8У.

НМВ3210 и НМВ2430 эффективно нейтрализовали все 11 тестируемых штаммов К8У (средние значение Ιί₅₀ 0,070 и 0,133 мкг/мл соответственно). Эти значения являлись в среднем в 5,4 и 2,6 раза выше, чем значение Ιί₅₀ паливизумаба (0,284 мкг/мл). НМВ3210 эффективно нейтрализовало все 6 тестируемых штаммов МРУ (средние значение Ιί₅₀ 0,113 мкг/мл), которое являлось в среднем в 1,7 раза ниже, чем значение Ιί₅₀ 234 (0,046 мкг/мл).

Таблица 7

Нейтрализация штаммов К8У и МРУ

	1С₅₀ нейтрализации (мкг/мл)
Вирус	Паливизумаб.	тАЬ 234	НМВ2430	НМВ3210
КЗУ А/А2/61	0, 617	-	0,350	0,184
КЗУ А/Ьопд/56	0,599	-	0,361	0,187
КЗУ А/Капс1а11/58	0, 440	-	0, 179	0,116
КЗУ А/9846/09	0,283	-	0, 123	0, 06
КЗУ А/9835/0 9	0,284	-	0, 076	0,063
КЗУ В/18537/62	0, 143	-	0, 094	0,034
КЗУ В/14617/85	0, 129	-	0, 096	0,038
КЗУ В/9727/09	0,275	-	0, 084	0,051
КЗУ В/9320/77	0, 069	-	0, 021	0,012
КЗУ В/9736/09	0, 092	-	0, 027	0,007
КЗУ В/9847/09	0,209	-	0, 053	0,026
МРУ А1/6621/01	-	0,040	0,744	0,071
МРУ А2/8938/06	-	0,044	1, 049	0,045
МРУ А2/8908/06	-	0,057	2,795	0,066
МРУ А2/8909/06	-	0,012	0, 161	0,007
МРУ В1/4702/04	-	0,019	-	0,029
МРУ В2/3817/04	-	0,106	-	0,465

Пример 7. Отсутствие селекции ускользнувших мутантов вирусов К8У и МРУ.

НМВ3210, паливизумаб и тАЬ 234 тестировали на их способность отбирать устойчивые к моноклональным антителам мутанты К8У или МРУ (МАКМ) ίη νίΐΐΌ. Несмотря на неоднократные попытки, НМВ3210 не отбирали каких-либо МАКМ К8У или МРУ при тестировании против 32х10е6 ΤίΙΏ50 К8У А/Ьоп§/58 ΤίΙΏ50 и против 16х10е6 ΤίΙΏ50 МРУ А1/6621/01. В противоположность этому паливизумаб отбирал МАКМ с высокой частотой (всего 85 независящих от паливизумаба МАКМ отбирали из входных данных 16х-10е6 ΤίΙΏ50 К8У А/Ьоп§/58, что соответствовало частоте ΤίΙΏ50 1 из 185000). тАЬ 234 в тех же экспериментальных условиях не отбирает каике-либо МАКМ МРУ. Трудность выделения МАКМ тАЬ 234 согласуется с опубликованными данными И1Ьгапб! е! а1. (I. Оепега1. Упо1., 2008), которые демонстрировали, что для выделения небольшого числа МАКМ необходимым являлся высокий уровень вируса. Ускользнувшие вирусы картировали по мутации Κ242Ν с использованием изолята В1 ΝΕ/1/99 МРУ. Собирали независящие от паливизумаба МАКМ (Р2-МАКМ) и Ρ-белок 10 из них подвергали полному секвенированию (табл. 8). Р2-МАКМ2, Р2-МАКМ3, Р2-МАКМ4, Р2-МАКМ5, Р/.МАКМ6, Р2-МАКМ8 и Р2-МАКМ10 обладали одинаковыми двумя мутациями аминокислот (Р1018/К272Г); Р2-МАКМ1 также содержал две мутации аминокислот в том же положении, но с другой заменой аминокислот (Р1018/К272Р); Р/.-МАКМ7 содержал мутацию одной аминокислоты (Κ272Ν) снова в положении 272, наконец, Р2-МАКМ9 содержал мутацию в общем с другими Р/.-МАКМ положении и уникальную мутацию в положении 262 (Р1018/Ш62У). Точечные мутации в этой области (положение нуклеотида 827 и 828) были уже описаны (/.Као е! а1., У1го1о§у, 2004) и приводят к двум различным заменам аминокислот в положении 272 (К272Р и К272М). Первая мутация (т.е. К272Р) также присутствует в Р2-МАКМ1, описанном в настоящем описании. Вирусы, несущие такие точечные мутации, являлись полностью устойчивыми к профилактическим эффектам паливизумаба у хлопковых хомяков (/.Као е! а1., У1го1о§у, 2004), и аналогичные мутации наряду с другими были описаны у инфицированных

- 25 030319

К8У хлопковых хомяков с ослабленным иммунитетом, которых профилактически обрабатывали паливизумабом.

Затем тестировали НМВ3210, НМВ2430 и паливизумаб на их способность нейтрализовать инфекцию ΡΖ-ΜΑΚΜ6 клеток Нер-2. Несмотря на то, что паливизумаб не нейтрализовал ΡΖ-ΜΑΚΜ6, НМВ3210 и НМВ2430 эффективно нейтрализовали этот вирус до уровней, сравнимых с уровнями, наблюдаемыми для соответствующего вируса дикого типа (фиг. 7).

В своей совокупности эти результаты демонстрируют, что НМВ3210 и НМВ2430 не отбирает МАЕМ К8У или МРУ ίη νίΐτο. Эти результаты соответствуют представлению, что эпитопы-мишени, распознаваемые НМВ3210 и НМВ2430, являются очень консервативными, и что мутации, которые отменяют связывание антитела, являются крайне редкими или могут быть ассоциированы с потерей репликативной способности вируса.

Таблица 8

Вариабельная область легкой цепи НМВ3210 содержит мотив Ν-гликозилирования (Νχ8/Τ, где х может представлять собой любую аминокислоту, за исключением пролина) в ЬСЭК3 в положении 113 (нумерация 1МОТ). Аспарагин в положении 113 (N113) заменяет серин, содержащийся в зародышевой последовательности. Наличие мотивов гликозилирования в вариабельной области может оказывать положительное или отрицательное влияние на активность антитела, и признано, что оно обуславливает гетерогенность антитела. Содержание гликана в легкой цепи НМВ3210 оценивали на геле 8Ό8-ΡΑΘΕ в восстановительных условиях после инкубации в присутствии или отсутствие Ν-гликозидазы ΡΝΘ-азы Р (фиг. 8). Этот анализ указывал на то, что меньшая часть легкой цепи является фактически гликозилированной. Затем удаляли остаток Ν113 и восстанавливали соответствующий кодируемый зародышевой последовательностью остаток серина. Параллельно также удаляли другую соматическую мутацию в каркасной области -1 легкой цепи (Р7Т) для восстановления кодируемого зародышевой последовательностью остатка пролина в положении 7 (нумерация 1МСТ в соответствующем гене ЮЬУ1 -40*02). Затем получали новый вариант НМВ3210 (называемый ΗΜΒ3210ν3), состоящий из УН.2 тяжелой цепи НМВ3210 (8Ε^ ГО 17) и УЬ.3 легкой цепи НМВ3210, и тестировали его нейтрализующую активность против штаммов А2 К8У и 1-РУ 03/01-6621 МРУ параллельно с НΜΒ3210ν2 (состоящим из УН.2 тяжелой цепи НМВ3210 (8Ε^ ГО N0:17) и УЬ легкой цепи 8Ε^ ГО N0:14). Для этого варианта (НΜΒ3210ν3) демонстрировали незначительно улучшенную нейтрализацию в отношении тестируемых штаммов К8У и МРУ (фиг. 9), таким образом, демонстрируя, что удаление участка гликозилирования легкой цепи не влияет на связывание с эпитопами-мишенями К8У и МРУ. Затем параллельно тестировали два варианта антител в отношении панели вирусов КУ 8 и МРУ и демонстрировали, что они обладают сравнимыми активностями против всех тестируемых вирусов (фиг. 10). В заключении НΜΒ3210ν3 является не гликозилированным в вариабельной области легкой цепи и является в целом слабо мутированным по сравнению с зародышевыми генами тяжелых и легких цепей, содержит только 8 соматических мутаций амино- 26 030319 кислот в тяжелой цепи и 4 в легкой цепи: 858А (НСЭК2). 1658 (НСЭК2). Υ66Ό (НРК3), У71А (НРК3), Ъ85Т (НРК3), Υ88Ρ (НРК3), У1011 (НРК3), Υ103Ρ (НРК3), Ο56Ό (I .СОКТ), 865N (I .СПК2), О78А (ЬРК3) и 8109К (ЬСОР3) (все положения указаны в соответствии с нумерацией 1МОТ).

Пример 9. Перекрестная реактивность НМВ3210 и НМВ2430 против МРУ обусловлена соматическими мутациями.

Для понимания роли соматических мутаций в перекрестной реактивности НМВ2430 и НМВ3210 против К8У и МРУ синтезировали варианты тАЬ без модификации на уровне зародышевых генов и тестировали на их способность нейтрализовать штаммы А2 К8У и 1-РУ 03/01-6621 МРУ. тАЬ НМВ2430 и НМВ3210 без модификации на уровне зародышевых генов (НМВ2430-ОЬ и НМВ3210-ОЬ соответственно) состояли из УН.3 и УЪ.2 в случае НМВ2430-ОЬ и из УН.3 и УЪ.4 в случае НМВ3210-ОЬ. Обе формы тАЬ без модификации на уровне зародышевых генов эффективно нейтрализовали К8У до уровней, сравнимых с уровнями, наблюдаемыми для исходных НМВ3210 и НМВ2430 с соматическими мутациями (фиг. 11). Однако НМВ3210-СЬ и НМВ2430-СЬ оказались неспособны нейтрализовать МРУ, таким образом, свидетельствуя о том, что соматические мутации являются необходимыми для нейтрализации МРУ. Для дополнительного понимания, являются ли соматические мутации тяжелой или легкой цепи ответственны за нейтрализацию МРУ, авторы получали антитела, несущие либо тяжелую, либо легкую цепь в зародышевой конфигурации: НМВ2430-УНСЬ-УЪ8М, состоящий из УН.3 и УЪ; НМВ2430УН8М-УЪСЬ, состоящий из УН.2 и УЪ.2; НМВ3210-УНСЬ-УЪ8М, состоящий из УН.3 и УЪ; НМВ3210УН8М-УЪСЬ, состоящий из УН.2 и УЪ.4. Удаление соматических мутаций в тяжелой цепи НМВ3210 не влияло на нейтрализацию вирусов К8У или МРУ, тогда как удаление соматических мутаций в тяжелой цепи НМВ2430 влияло на нейтрализацию МРУ, хотя и сохраняя нейтрализацию К8У. Удаление соматических мутаций в легкой цепи НМВ2430 и НМВ3210 устраняло нейтрализацию МРУ, при это не влияя на нейтрализацию К8У (фиг. 11). В своей совокупности эти открытия указывают на то, что НМВ3210 и НМВ2430 изначально отбирались по К8У и затем развивались, посредством накопления соматических мутаций, перекрестной реактивности против МРУ. Всего только 3 соматические мутации в СЭР легкой цепи обуславливают приобретение перекрестной реактивности против МРУ в специфическом к К8У антителе без модификации на уровне зародышевых генов. Следует отметить, что НМВ2430 и НМВ3210 (клонально не родственные) содержат одинаковую соматическую мутацию в БСОР3 8 на К в положении 109.

Пример 10. Распознавание НМВ3210 конформаций Р-белка до и после слияния.

Конструкцию ДНК, кодирующую Р-остатки 26-136 и 147-512 К8У (соответствующие эктодомену Р без пептида слияния штамма А2 К8У), с С-концевой гистидиновой меткой подвергали оптимизации кодона и синтезировали. Рекомбинант Р экспрессировали с использованием экспрессирующего вектора на основе бакуловируса в клетках 8Г21 и очищали из супернатанта посредством никель-аффинной и эксклюзионной хроматографии (8ЕС). Аналогичную конструкцию уже использовали другие исследователи (8«»η с1 а1., РNА8, 2011 и МсРсИал с1 а1., ί. У1го1., 2011) для исследования кристаллической структуры Р-белка после слияния. Белок анализировали в невосстановительных условиях на геле δϋδ-РАСЕ гель и получали полосу =65-70 кДа, а затем анализировали 8ЕС на колонке 8200 Р-белок после слияния К8У, элюируемый в виде симметричного пика с кажущейся молекулярной массой =150 кДа, что соответствует М,. тримерного Р-белка, и частично совпадает с объемом элюирования антител 1дС1 человека. Рбелок после слияния инкубировали с НМВ3210 или паливизумабом и пропускали две смеси через колонку 8200. Инкубация Р-белка после слияния с паливизумабом смещала пик элюирования к более низкому объему элюирования (соответствующему кажущейся М,. =300 кДа) по сравнению с одним Рбелком, указывая на то, что паливизумаб связывается с Р-белком после слияния, как уже описано. Следует отметить, что инкубация НМВ3210 с Р-белком после слияния не приводит к сдвигу объема элюирования (фиг. 12). Тот факт, что НМВ3210 и Р-белок после слияния элюируются в виде независимых молекул, указывает на то, что НМВ3210 в отличие от паливизумаба не связывается с Р-белком после слияния.

Затем синтезировали стабилизированную форму полноразмерного Р-белка К8У до слияния согласно стратегии, адаптированной Мадго с1 а1., РNА8, 2012, путем замены 4 аминокислотных остатков (Ь481, Ό489, 8509 и Ό510) на цистеины и путем замены 9 основных аминокислотных остатков (К106, К108, К109, К131, К132, К133, К134, К135 и К136) в двух участках расщепления Р-белка на достатки для абляции участков расщепления фурином. Последовательность Р-белка дополнительно модифицировали посредством встраивания участка расщепления ТЕУ после трансмембранной области с последующими СРР и меткой 6-Н18 на С-конце для облегчения очистки. 4 введенных цистеина располагали в соответствии со структурой Р до слияния Р1У-5 таким образом, что образование межмономерных дисульфидных связей являлось возможным, только когда Р-белок находился в конформации до слияния, но не когда повторно сворачивался в структуру после слияния, таким образом, обеспечивая стабилизацию Р-белка до слияния. Мадго с1 а1. описали что стабилизированный Р-белок до слияния является гетерогенным, вследствие того, что он также содержит часть молекул, в которых дополнительные остатки цистеина не связаны дисульфидными связями. Описанную в настоящем описании конструкцию Р-белка получали с ис- 27 030319 пользованием экспрессирующего вектора на основе бакуловируса в клетках 8!21, солюбилизировали из клеточной мембраны мягким детергентом и очищали никель-аффинной и эксклюзионной хроматографией. Очищенный Р-белок до слияния анализировали посредством 8ЕС на колонке 8200 и элюировали в виде симметричного пика с кажущейся молекулярной массой =150 кДа, что соответствует М„ тримерного Р-белка и что частично совпадает с объемом элюирования 1дО1 человека. Инкубация Р-белка до слияния с паливизумабом сдвигала пик элюирования к более низкому объему элюирования (соответствующему кажущейся М„ =300 кДа) по сравнению с одним Р-белком, а также индуцировала образование высокомолекулярного комплекса, который элюировался в мертвом объеме колонки, что может быть связано с образованием более крупных агрегатов. Аналогичный сдвиг объема элюирования также наблюдали, когда НМВ3210у2 инкубировали с белком до слияния (фиг. 13). Эти результаты указывают на то, что паливизумаб связывается с формами Р-белка до слияния и после слияния, тогда как НМВ3210 избирательно распознает форму Р-белка до слияния. Две Р белка (формы до и после слияния) также тестировали поверхностным плазмонным резонансом (8РК). Паливизумаб связывался с белками до и после слияния со сходными аффинностями, тогда как НМВ3210у3 избирательно связывался с Р-белком до слияния с высокой аффинностью (константа Кй 0,1 нМ по сравнению с Кй паливизумаба 2 нМ) (фиг. 14).

Пример 11. НМВ3210у3 перекрестно нейтрализуют два парамиксовируса животных: респираторносинцитиальный вирус крупного рогатого скота (ВК8У) и вирус пневмонии мышей (РУМ).

Также оценивали спектр реактивности НМВ3210 на двух других парамиксовирусах животных: ВК8У и РУМ, двух вирусах, которые обладают 81 и 40% идентичностью аминокислот в Р-белка с К8У соответственно. НМВ3210 тестировали на его способность нейтрализовать штамм 15 РУМ и штамм КВ94 ВК8У, было продемонстрировано, что оно является эффективным против этих вирусов со значениями 1С₅₀ 100 и 10 нг/мл соответственно. Эти результаты указывают на то, что наряду с парамиксовирусами человека К8У и МРУ НМВ3210 также является эффективным против других двух вирусов семейства Рагатухоутйае.

Пример 12. Ингибирование распространения вируса НМВ3210.

Авторы также измеряли способность НМВ3210 и специфического антитела к К8У Ό25 предотвращать распространение вируса от клетки к клетке, для которого было описано, что оно является отличительным свойством антител против К8У независимо от нейтрализующей активности. Авторы инфицировали клетки Нер-2 штаммами А или В К8У, добавляли через 20 ч различные концентрации антител и анализировали образование синцитиев на 3 сутки для определения 50% концентрации антитела, ингибирующей распространение вируса, обозначаемой в настоящем описании как 1850. Оба антитела оказались способны ингибировать распространение вируса, но в более высоких концентрациях. Следует отметить, что в этом анализе для НМВ3210 демонстрировали 1850, сравнимую с 1850 более эффективного нейтрализующего антитела Ό25 (фиг. 15).

Пример 13. Профилактическая и терапевтическая эффективность НМВ3210 против К8У, МРУ и РУМ.

На модели К8У на мышах НМВ3210 являлся в среднем от пяти до десяти раз более эффективным, чем паливизумаб в отношении снижения титров К8У в легких и являлся эффективным в концентрациях, настолько низких как 0,12 мг/кг (фиг. 16а). На модели МРУ на мышах НМВ3210 являлось сравнительно эффективным (фиг. 16Ь). Для тестирования терапевтического потенциала НМВ3210 авторы инфицировали К8У мышей с дефицитом 8ТАТ1 и вводили НМВ3210 на сутки 1, 2 или 3 после инфекции. Несмотря на ограничения этой модели вследствие слабой репликации вируса, для МВ3210 демонстрировали терапевтическую эффективность во все моменты времени и сниженные титры вирусов и воспалительных цитокинов в легких (фиг. 17).

Для тестирования НМВ3210 на более релевантной модели острой инфекции нижних дыхательных путей на животных авторы использовали его перекрестную реактивность против вируса РУМ, вируса, который вызывает заболевание с летальным исходом у мышей после очень небольшого инокулята и воспроизводит признаки тяжелой инфекции К8У и МРУ у людей. В профилактических условиях НМВ3210 полностью защищало мышей от летальности при 0,12 мг/кг и от потери массы тела при 0,6 мг/кг (фиг. 18а). Кроме того, в терапевтических условиях НМВ3210 полностью защищало от летальности при введении через 3 суток после инфекции при 30 и 5 мг/кг и обеспечивало существенную защиту при введении на 4 или 5 сутки при 30 мг/кг (фиг. 18Ь-й). В этой системе рибавирин, который представляет собой единственный утвержденный стандарт лечения при терапии у людей, как описано ранее (ВоиуШе е! а1., 2004, 1оигпа1 о! Уио1оду, 78:7984-7989) являлся неэффективным. Следует отметить, что терапевтическая доставка НМВ3210 эффективно блокировала дальнейшее увеличение РНК вируса в легких (фиг. 19). Для определения роли эффекторных механизмов ш У1уо авторы сравнивали НМВ3210 1дО1 с мутантом, в котором отсутствует комплемент и связывание Рс-рецептора (НМВ3210-ЬАЬА). Два антитела сравнивали в отношении нейтрализующей активности ш уйго, и было продемонстрировано, что они являются эквивалентными. При сравнении в ограниченных количествах в профилактических условиях (0,12 мг/кг) НМВ3210-ЬАЬА демонстрировал существенно сниженную эффективность (фиг. 20а). В противоположность этому при использовании в терапевтических условиях НМВ3210-ЬАЬА являлся таким же эффек- 28 030319 тивным, как НМВ3210 во всех тестируемых дозах (фиг. 20Ь) . Терапевтическая эффективность НМВ3210 на модели инфекции РУМ, где рибавирин является неэффективным, может быть обусловлена сочетанием факторов, таких как эффективная нейтрализующая и ингибирующая распространение активность, избирательное распознавание белка до слияния, что позволяет избегать расходования антитела содержащимися в избытке белками после слияния, действующими как ловушки, и неспособностью отбирать ускользнувших мутантов. Неожиданно, для терапевтической эффективности НМВ3210 на модели РУМ на мышах не требуются эффекторные функции, подтверждая, что активность антитела ΐη νίνο обусловлена преимущественно нейтрализацией вируса и ингибированием распространения вируса.

Пример 14. НМВ3210 связывается с высококонсервативной бета-цепью в Р-белке до слияния, которая является недоступной в Р-белке после слияния.

Для идентификации эпитопа, распознаваемого НМВ3210, авторы проводили скрининг библиотеки из 7095 структурированных пептидов, включающих полную последовательность Р-белка К8У человека. Эксперименты, представленные в примере 5, демонстрировали, что НМВ3210 взаимодействовало в вестерн-блоттингах с Р-белками К8У и МРУ в невосстановительных условиях, подтверждая, что НМВ3210 направлено на эпитоп, конформация которого является стабильной в присутствии анионного детергента 8Э8 (фиг. 5 и 6). Подход скрининга библиотеки приводил к идентификации предполагаемого эпитопа НМВ3210 в Ν-концевой области Р2, включая остатки 8ДУ8КСУР8ДРИРС^УР8У1Р (8Ер ГО N0:63). Коровая последовательность в этой области, УРДДРКТСУ⁷ (8ЕР ГО N0:64), является высококонсервативной у К8У, МРУ, ВК8У и РУМ (фиг. 21), где варианты ΥΙ.8\Ί.ΚΤ(ι\Υ (8Ер ГО N0:65), \Т8Д1.КТ(ДУ (8Ер ГО N0:66), ΥР8У^ΚΤΟУ (8Ер ГО N0:67), ΥΚ8ΑΙ.ΚΤ(,\Υ (8Ер ГО N0:68) и ΥК8У^ΚΤΟУ (8Ер ГО N0:69) также распознаются НМВ3210. Эта последовательность не экспонируется на поверхности Рбелка К8У после слияния, но в модели Р-белка К8У до слияния, выстроенного вокруг структуры Р-белка Р^5 (Υΐη е! а1., 2006, №1иге, 439:38-44), предполагают, что она располагается в экспонируемой бетацепи вблизи области петли, на которую направлен паливизумаб (фиг. 22). Такое картирование соответствует специфичности НМВ3210 в отношении Р-белка до слияния, продемонстрированной в примере 10. Этот эпитоп является близким, но отличным от эпитопа, распознаваемого паливизумабом, и сосредоточен вокруг последовательности Υ^8У^ΚΤΟУ, которая является высококонсервативной у 551 штаммов вирусов, включая штаммы 364 НК8У, 162 НМРУ, 8 ВК8У и 5 РУМ (фиг. 23).

Таблица последовательностей и номеров 8ЕР ГО

8Е<2 ГО ΝΟ	Описание	Последовательность
1	а.к. СОКН1	ΟΡΤΡδδΥδ
2	а.к. С0РН2	Ι5Α555Υ5
3	а.к. СОРНЗ	ΑΚΑΚΑΤΟΥδδΙΤΡΥΡϋΙ
4	а.к. С0РЫ	δδΝΙΟΑΟΥϋ
5	а.к. С0РЬ2	ϋΝΝ
6	а.к. СОКЬЗ	ΟδΥΙ)ΚΝΡδ(ίν
7	нуклеотиды . С0РН1	§§аПсасс11са§1а§Па1а§с
8	нуклеотиды С0РН2	а!1а§1§саа§1а§са§11аса§с
9	нуклеотиды СОРНЗ	§с§а§а§с1с§§§саас1§§с1аса§11сса11ассссс1асШ§аса11
10	нуклеотиды СОРЫ	а§с1ссааса1с§§§§са§§11а1§а!
11	нуклеотиды С0РЬ2	§а!аасаас
12	нуклеотиды ΟϋΚΙ_3	са§1сс!а1§аса§§аасс1§а§1§§1§1с
13	а.к. тяжелой цепи	ΡΡΟΡΡΡδΟΟΟΡνΚΡΟΟδΡΚΡδΟΑΑδΟΡΤΡδδΥδΜΝλΥνΚΟΑΡ ΟΚΟΡΡΥννδδΙδΑδδδΥδΟΥΑϋδΑΚΟΚΡΤΙδΚΟΝΑΚΤδΡΡΡΟΜ N8 РК Л НОТА I ΥΓΡΑ К Λ ΚΛΤ(ί Υδ δ ΙΤΡ ΥΓΙ) IV/(ί()(ί'Π ΛΊ’νδ δ
14	а.к. легкой цепи	ΟδννΤΟΤΡδνδΟΑΡΟΟΚνΤΙδΟΤΟδδδΝΙΟΑΟΥΟνΗΥνΥΟΟΡΡ ΟΤΑΡΚΡΡΙΥϋΝΝΝΚΡδΟνΡΟΚΡδΑδΚδΟΤδΑδΡΑΙΤΟΡΟΑΡϋΡ ΑΙ)ΥΥ(’ΟδΥΙ)ΚΝΙ,δ(7νΐ’(7Ί’(Π’ΚνΊ’νΐ.
15	нуклеотиды тяжелой цепи	§а§§ааса§с1§с1а§а§1с!§§§§§а§§сс1§§1саа§сс1§§§§§§1ссс1§а§ас1с1сс 1§1§са§сс1с1§§а11сасс11са§1а§11а1а§са1§аас1§§§1сс§сса§§с1сса§§§аа §§§§с1§§а§1§§§1с1са1сса11а§1§саа§1а§са§11аса§с§а11ас§са§ас1са§с§ аа§§§сс§а11сасса1с1сса§а§асаас§ссаа§асс1сас1§Шс1§сааа1§ааса§сс1 §а§а§сс§а§§асас§§с1а1с1аШс1§1§с§а§а§с1с§§§саас1§§с1аса§11сса11а ссссс1ас111§асаШ§§§§сса§§§аассс1§§1сасс§1с1сс1са§
16	нуклеотиды легкой цепи	са§1с1§1с§1§ас§са§ас§ссс1са§1§1с1§§§§сссса§§§са§а§§§1сасса1с1сс! §сас1§§§а§са§с1ссааса1с§§§§са§§11а1§а1§1асас1§§1асса§саас11сса§§ ааса§сссссааас1сс1са1с1а1§а!аасаасаа1с§ассс1са§§§§1ссс§§асс§а11с1 с1§сс1ссаа§1с!§§сасс1са§сс1ссс1§§сса1сасс§§§с1сса§§с1§а§§а1§а§§с 1§а11а11ас1§сса§1сс1а1§аса§§аасс1§а§1§§1§1с11с§§аас1§§§ассаа§§1сас с§1сс!а§

- 29 030319

17	а. к. тяжелой цепи	ΕνρΕνΕδ(ΚΚΗΎΚΡ(ΚϊδΕΚΕδ(’ΛΛδ(ϊΕΤΕδδΥδΜΝ\ννΚ(,)ΛΡ (ϊΚ(ϊΕΗ\ννδδΙδΛδδδΥδΙ)ΥΛΙ)δΛΚ(ϊΚ]ΊΙδΚΙ)ΝΛΚΤδΕ1Β(,)Μ Νδ ι .к л в ])тл ι υιγλ к л клто Υδ δ ιτρ γ ΐΐ) ι\ν (ί(9(ί'π. ντ νδ δ
18	а. к. тяжелой цепи	§а§§1§са§с1§§1§§а§1с!§§§§§а§§сс1§§1саа§сс1§§§§§§1ссс1§а§ас1с1сс 1§1§са§сс1с1§§а11сасс11са§1а§Иа1а§са1§аас1§§§1сс§сса§§с1сса§§§аа §§§§с1§§а§1§§§1с1са1сса11а§1§саа§1а§са§Иаса§с§а11ас§са§ас1са§с§ аа§§§сс§а11сасса1с1сса§а§асаас§ссаа§асс1сас1§И1с1§сааа1§ааса§сс1 §а§а§сс§а§§асас§§с1а1с1а111с1§1§с§а§а§с1с§§§саас1§§с1аса§Исса11а ссссс1ас111§асаШ§§§§сса§§§аассс1§§1сасс§1с1сс1са§
19	а.к. СОКН1	ΟΡΑΡΤΟΥΟ
20	а.к. СОКН2	ΙΤΑΟδδΥΙ
21	а.к. СОКНЗ	ΛΚνΛδΡΡνΚϋΤΙ II Τ)Υ
22	а.к. СОК1.2	ΛΝΙ)
23	а.к. СОКЬЗ	(9δΥΐ)κτι,δνν
24	нуклеотиды СОРН1	§§аПс§са11сас1§§Па1§§1
25	нуклеотиды СОКН2	а!сас1§с1§§аа§с1са1аса1с
26	нуклеотиды СОРНЗ	§с§а§а§П§с§1с1сс1с1§§Пс§§§§ас1ссас11а§ас1ас
27	нуклеотиды СОКЬ2	§с!аас§ас
28	нуклеотиды СОКЬЗ	са§1сс!а1§асс§сассс1§а§1§1а§1§
29	а.к. тяжелой цепи	ЕУНРУЕЗОООРУКРООЗРКРЗСААЗОРАРТОУОРНАУКрУР ΟΚΟΤΤΑνδδΙΤΛΟδδΥΙΙ)ΥΛΡδνΚΟΚΙ’ΤΙδΚΙ)ΝΟΚΝΤΤΤ’Τ0Μ δΙ)ΒΚΛΙ)Ι)ΤΛνΥΥ(’ΛΚνΛδΡΒνΚ(Η3ΙΒΙ)Υ\ν(ί(9(ίΛΒντνδδ
30	а.к. легкой цепи	Οδνΐ.ΤΟΙΤ/δΜδΟΛΙΌΟΚνΤΙδΟΤΟΟδδΝΙΟΛΟΥΙΐνΟΑΥΟΟΤ ΡΟΑΑΡΚΒΒΙΥΑΝΟΝΚΡδΟνΡΟΚΡδΟδΚδΟΤδΟδΡνίΑΟΒΚΑΕ Ι)ΡΛΙ)ΥΥΟΟδΥΙ)ΚΤΤδνν]ϋϋϋΤΚΕΤνΤ
31	нуклеотиды тяжелой цепи	§а§§1§сасс1§§1§§а§1с!§§§§§а§§сс1§§1саа§сс1§§§§§§1ссс1§а§ас1с1сс 1§1§са§сс1с1§§а11с§са11сас1§§11а1§§1с1ааа11§§§1сс§сса§§11сса§§§аа§ §§сс1§§а§1§§§111са1сса1сас1§с1§§аа§с1са1аса1с§ас1ас§са§а§1са§1§аа §§§сс§айсасса1с1сса§а§асаас§§саа§аа1асас1§11сс1§сааа1§а§с§асс1§ а§а§сс§ас§асас§§с1§1с1а11ас1§1§с§а§а§И§с§1с1сс1с1§§Ис§§§§ас1сса с!1а§ас1ас1§§§§сса§§§а§ссс1§§1сасс§1с1сс1са§
32	нуклеотиды легкой цепи	са§1с!§1§с1§ас§са§сс§ссс1саа1§1сс§§§§сссса§§§са§а§§§1сасса1с1сс 1§сас1§§§§§са§с1ссааса1с§§§§са§§Иа1§а1§1§са§1§§1асса§саас11сса§ §а§са§сссссааас1сс1са1с1а1§с1аас§асаа!с§§ссс1са§§§§1ссс1§асс§а11с 1с1§§с1ссаа§1с1§§сасс1са§§с1ссс1а§1са1с§с1§§сс1сс§§§с1§а§§а1§а§§ с1§а11а11ас1§сса§1сс1а1§асс§сассс1§а§1§1а§1§11с§§с§§а§§§ассаа§с1§ асс§1сс!§§
33	а.к. тяжелой цепи	ΡνΟΤνΡδϋϋϋΤνΚΡϋϋδΤΚΤδΟΛΛδϋΓΛΓΤϋΥϋΤΝν/УК(,)УР ΟΚΟΤΤΑνδδΙΤΛΟδδΥΙΙ)ΥΛΡδνΚΟΚΙ’ΤΙδΚΙ)ΝΟΚΝΤΤΤ’Τ0Μ δΙ)ΒΚΛΙ)Ι)ΤΛνΥΥ(’ΛΚνΛδΡΒνΚ(Η3ΙΒΙ)Υ\ν(ί(9(ίΛΒντνδδ
34	нуклеотиды тяжелой цепи	§а§§1§са§с1§§1§§а§1с!§§§§§а§§сс1§§1саа§сс1§§§§§§1ссс1§а§ас1с1сс 1§1§са§сс1с1§§а11с§са11сас1§§Иа1§§1с1ааа11§§§1сс§сса§§11сса§§§аа§ §§сс1§§а§1§§§1Иса1сса1сас1§с1§§аа§с1са1аса1с§ас1ас§са§а§1са§1§аа §§§сс§аИсасса1с1сса§а§асаас§§саа§аа1асас1§Исс1§сааа1§а§с§асс1§ а§а§сс§ас§асас§§с1§1с1а11ас1§1§с§а§а§П§с§1с1сс1с1§§Пс§§§§ас1сса с!1а§ас1ас1§§§§сса§§§а§ссс1§§1сасс§1с1сс1са§
35	а.к. СОКЬЗ	(2δΥϋΚδΕδθν
36	нуклеотиды СОКЬЗ	са§1сс!а1§аса§§а§сс1§а§1§§1§1с
37	а.к. легкой цепи	ΟδννΤΟΡΡδνδΟΛΡΟΟΚνΤΙδ(Ί’ΟδδδΝΙΟΛΟΥΙ)νΐΙ\ΥΥΟΟΙ.Ρ 0ΤΛΡΚΤΥΙΥΙ)ΝΝΝΚΡ80νΡΙ)ΚΡ8Λ8Κ80Τ8Λ8ΤΛΠΌΡ(,)ΛΙ4)Ρ ΑϋΥΥΟ(2δΥΟΚδΡδθνΡΟΤΟΤΚντνΡ
38	нуклеотиды легкой цепи	са§1с1§1с§1§ас§са§сс§ссс1са§1§1с1§§§§сссса§§§са§а§§§1сасса1с1сс! §сас1§§§а§са§с1ссааса1с§§§§са§§11а1§а1§1асас1§§1асса§саас11сса§§ ааса§сссссааас1сс1са1с1а1§а!аасаасаа1с§ассс1са§§§§1ссс§§асс§а11с1 с1§сс1ссаа§1с!§§сасс1са§сс1ссс1§§сса1сасс§§§с1сса§§с1§а§§а1§а§§с 1§а11а11ас1§сса§1сс1а1§аса§§а§сс1§а§1§§1§1с11с§§аас1§§§ассаа§§1сас с§1сс!а§
39	а.к. СОКН2	ΙδδδδδΥΙ
40	а.к. СОКНЗ	ΑΚΑΚΑΤΟΥΝδΙΤΡΥΡϋΙ
41	а.к. СОК1.2	ΟΝδ
42	а.к. СОР1_3	(^δΥϋδδΕδΟν
43	нуклеотиды СОРН1	§§с11саса!1са§с1сс1ас1с1
44	нуклеотиды СОРН2	а1с!саа§с1сс1с1а§11аса1с
45	нуклеотиды СОРНЗ	§ссс§§§с1а§а§сааса§§с1а1ааса§сайас1сс11ас111§аса1с
46	нуклеотиды СОРИ	1са1ссааса1с§§с
47	нуклеотиды ΟϋΡΙ_2	§§§ааса§с
48	нуклеотиды ΟϋΡΙ_3	са§1сИа1§а11с11с1с1§1с1§§а§1с
49	а.к. тяжелой цепи	ΡνΟΤνΡδΟΟΟΤνΚΡΟΟδΤΚΤδΟΛΛδΟΓΊΤδδ ΥδΜΝΑ УК(,)ЛР (1Κ(Η.ΕΑνδδΙδδδδδΥΙΥΥΛΙ)δνΚ(1ΚΙ’ΤΙδΚΙ)ΝΛΚΝδΙ.ΥΙ.(9Μ ΝδΕΚΛΕΙ)ΤΛνΥΥ(’ΛΚΛΚΛΤ(ίΥΝδΙΤΡΥΕΙ)Ι\ν(ί(,)(ίΤΙ.ντνδδ
50	а.к. легкой цепи	ΟδννΤΟΡΡδνδΟΛΡΟΟΚνΤΙδ(Ί’ΟδδδΝΙΟΛΟΥΙ)νΐΙ\νΥΟΟΤΡ ΟΤΑΡΚΕΕΙΥΟΝδΝΚΡδθνΡΟΚΡδΟδΚδΟΤδΑδΕΑΙΤΟΕ(2ΑΕΟΕ ΑϋΥΥΟ(2δΥΟδδΡδθνΡΟΤΟΤΚντνΡ

- 30 030319

51	нуклеотиды тяжелой цепи	§а§§1§са§с1§§1§§а§а§с§§а§§с§§ас1§§1сааасс1§§с§§§1сас1§а§ас1§1с а1§с§са§саа§с§§с11сасайса§с1сс1ас1с1а1§аас1§§§1§с§аса§§с1сс1§§са а§§§ас1§§а§1§§§1с1с1а§1а1с1саа§с1сс1с1а§11аса1с1ас1а1§са§ас1сс§1§аа §§§аа§§11сасса1с1сас§с§а1аас§ссааааа1а§сс1§1а1с1§са§а1§аайссс1§а §а§сс§аа§асасс§с1§1с1ас1ай§с§ссс§§§с1а§а§сааса§§с1а1ааса§са11ас 1ссйас111§аса1с1§§§§аса§§§сасас1§§1§асс§1с1сс1са
52	нуклеотиды легкой цепи	са§1сс§1с§1сас1са§сс1ссаа§с§1са§с§§§§сасс1§§§са§с§§§1сасаа1с1са1 §сас1§§§1сс1са1ссааса1с§§с§с1§§§1ас§ас§1§сас1§§1а1са§са§с1§сс1§§ ааса§сасс1аа§с1§с1§а1с1ас§§§ааса§саа1с§§сса1с1§§а§1сссс§а1а§айс а§с§§а1ссааа1с1§§сасса§1§сс1сас1§§с1айаса§§§с1§са§§са§а§§ас§аа §сс§а11ас1а11§сса§1с11а1§а11с11с1с1§1с1§§а§1с11с§§сасс§§сасаааа§1сас с§1сс1§
53	а.к. СОКНЗ	ΛΚνΛδΡΜνΚΟΙ.ΙΙΙΌΥ
54	а.к. СОКЬЗ	ЦЗУОЗЗЬЗУУ
55	нуклеотиды СОКН1	§§с111асс111а§с1сс1ас1с1
56	нуклеотиды СОРНЗ	§ссс§с§1с§с1а§ссс1а1§§1§с§§§§§с1§саШ1§ааа1
57	нуклеотиды СОКИ	1с11саааса1с§§с§с1§§§1ас§ас
58	нуклеотиды ΟϋΡΙ_3	са§а§с1ас§айса1ссс1§а§с§1§§1с
59	а.к. тяжелой цепи	ΓΑφΙ Α]'’δ(ί(ϊ(ϊΙ.νΚΡ(ί(ίδΙ.ΚΙ.δ(’ΛΛδ(ϊ]’Τ]’δδΥδΜΝ\ννΚ(,)ΛΡ (ίΚ(ίΙ.ΕΑν88Ι88888ΥΙΥΥΛ])8νΚ(ίΚ]Ί’Ι8Κ])ΝΑΚΝ8Ι.ΥΙ.(9Μ ΝδΙ.ΚΛΙΤΪΙ’ΛνΥΥΙ’ΑΚνΑδΙ’ΜνΚΙίΙ.ΙΙΙ’ΙΙΥΑΙίφΙί'Π.ντνδδ
60	а.к. легкой цепи	Ц8УЕТЦРР8У8ОАРОЦКУТ18СТС888№ОАОУОУНАУЦЦЕР СТАРКЕЕ1УСХ8ХЕР8СУРОЕГ8С8К8СТ8А8ЕА1ТСЕЦАЕОЕ АОУУСЦ8УО88Е8УУРОООТКЕТУЕ
61	нуклеотиды тяжелой цепи	§аа§1§са§с1§§1§§аа1с1§§§§§с§§§с1§§1сааасс1§§с§§аа§1с1§а§§с1§1сс 1§1§с1§с1а§1§§с111асста§с1сс1ас1с1а1§аас1§§§1§с§аса§§сасс1§§саа§ §§ас1§§а§1§§§1с1с1а§1а1с1саа§с1сс1с1а§11аса1с1ас1а1§с1§ас1сс§1§аа§§ §сс§§11сасса1с1саа§а§а1аас§саааааа1а§сс1§1а1с1§са§а1§аайссс1§а§§ §са§аа§асаса§сс§1§1ас1а11§с§ссс§с§1с§с1а§ссс1а1§§1§с§§§§§с1§сай 11§айай§§§§аса§§§аас1с1§§1§асс§1с1са1сс
62	нуклеотиды легкой цепи	са§а§с§1сс1§ассса§ссасса1сс§1§а§с§§с§сассс§§сса§с§а§1§ас1а1йсс 1§1асс§§са§11с11саааса1с§§с§с1§§§1ас§ас§1§сас1§§1а1са§са§с1§сс1§§ ааса§сасс1аа§с1§с1§а1с1ас§§§ааса§саа1с§§сса1с1§§а§1сссс§а1а§айс а§с§§а1ссааа1с1§§сасса§1§сс1сас1§§с1айаса§§§с1§са§§са§а§§ас§аа §сс§айас1а11§сса§а§с1ас§а11са1ссс1§а§с§1§§1с11с§§а§§с§§сасаааас1 §ас1§1сс1§
63	а.к.	8Λν8Κ(ίΥΙ,8ΛΙ.ΚΤ(ί\ΥΥΤ8νΐΤ
64	а.к.	ΥΙ,8ΛΙ.ΚΤ(ί\Υ

65	а.к.	γι,δνι.κτσν/
66	а.к.	Υ]’8ΑΙ.ΡΤ(ί\ν
67	а.к.	ΥΙ’δνΐ.ΚΊΧίΑ
68	а.к.	ΥΚ8ΑΕΚΤΟΆ
69	а.к.	γκδνι.κτσν/

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> НишаЬз ΒϊοΜθά ЗА <120> АНТИТЕЛА, НЕЙТРАНЛИЗУЮЩИЕ ПЗУ, МРУ И РУМ, И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ <130> НМВ0014-201-ИЗ <150> 61/613,197 <151> 2012-03-20 <150> 61/655,310 <151> 2012-06-04

- 31 030319 <160> 69

<170>	РаЛепЫп	уегзтоп	3.5
<210>	1
<211>	8
<212>	БЕЛОК
<213>	Ното зарбепз
<400>	1
О1у РЬе	! ТНг РНе	Бег Бег	Туг Бег
1		5

<210>	2
<211>	8
<212>	БЕЛОК
<213>	Ното зарбепз
<400>	2
11е Бег А1а Бег Бег Бег Туг Бег
1	5

<210>	3
<211>	17
<212>	БЕЛОК
<213>	Ното зарбепз

- 32 030319 <400> 3

А1а Агд А1а Агд А1а ТЪг О1у Туг Зег Зег 11е ТЪг Рго Туг РЪе Азр

5 10 15

11е <210> 4 <211> 9 <212> БЕЛОК <213> Ното зар1епз <400> 4

Зег Зег Азп 11е О1у А1а О1у Туг Азр

5 <210> 5 <211> 3 <212> БЕЛОК <213> Ното зар1епз <400> 5

Азр Азп Азп

- 33 030319

<210>	6
<211>	10
<212>	БЕЛОК
<213>	Ното	зарбепз
<400>	6
О1п Зег	Туг	Азр Агд Азп Ьей	Зег О1у ναι
1		5	10

<210>	7
<211>	24
<212>	ДНК
<213>	Ното зарбепз
<400>	7
ддаббсассб бсадбадбба бадс	24

<210>	8
<211>	24
<212>	ДНК
<213>	Ното зарбепз
<400>	8
аббадбдсаа дбадсадбба садс	24
<210>	9

- 34 030319

<211>	51
<212>	ДНК
<213>	Ното зарчепз
<400>	9

дсдададсЕс дддсаасЕдд сЕасадЕЕсс аЕЕасссссЕ асЕЕЕдасаЕ Е 51

<210>	10
<211>	27
<212>	ДНК
<213>	Ното зарчепз
<400>	10

адсЕссааса Есддддсадд ЕЕаЕдаЕ 27

<210>	11
<211>	9
<212>	ДНК
<213>	Ното зарчепз
<400>	11

даЕаасаас 9

<210>	12
<211>	30
<212>	ДНК
<213>	Ното зарчепз
<400>	12

- 35 030319 садЬссЬаЬд асаддаассЬ дадЬддЬдЬс

<210>	13
<211>	124
<212>	БЕЛОК
<213>	Ното :
<400>	13

О1и О1и О1п Ьеи Ьеи О1и Зег О1у О1у О1у Ьеи Уа1 Ьуз Рго О1у О1у

5 10 15

Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег О1у РЪе ТЪг РЪе Зег Зег Туг

25 30

Зег МеЬ Азп Тгр Уа1 Агд О1п А1а Рго О1у Ьуз О1у Ьеи О1и Тгр Уа1

40 45

Зег Зег 11е Зег А1а Зег Зег Зег Туг Зег Азр Туг А1а Азр Зег А1а

55 60

Ьуз О1у Агд РЪе ТЪг 11е Зег Агд Азр Азп А1а Ьуз ТЪг Зег Ьеи РЪе

70 75 80

Ьеи О1п МеЬ Азп Зег Ьеи Агд А1а О1и Азр ТЪг А1а 11е Туг РЪе Суз

- 36 030319

А1а Агд А1а Агд А1а

100

11е Тгр О1у О1п О1у

115 <210> 14 <211> 110 <212> БЕЛОК <213> Ното зар1епз <400> 14

О1п Бег Уа1 Уа1 ТНг

5

Агд Уа1 ТНг 11е Бег

Туг Азр Уа1 Н1з Тгр

Ьеи 11е Туг Азр Азп

95

ТЬг О1у Туг Бег Бег 11е ТНг Рго Туг РНе Азр

105 110

ТНг Ьеи Уа1 ТНг Уа1 Бег Бег

120

О1п ТНг Рго Бег Уа1 Бег О1у А1а Рго О1у О1п

15

Суз ТНг О1у Бег Бег Бег Азп 11е С1у А1а С1у

30

Туг О1п О1п Ьеи Рго О1у ТНг А1а Рго Ьуз Ьеи

45

Азп Азп Агд Рго Бег О1у Уа1 Рго Азр Агд РНе

60

- 37 030319

Зег А1а Зег Ьуз Зег О1у ТЪг Зег А1а Зег Ьеи А1а 11е ТЪг О1у Ьеи

70 75 80

О1п А1а О1и Азр О1и А1а Азр Туг Туг Суз О1п Зег Туг Азр Агд Азп

90 95

Ьеи Зег О1у Уа1 РЪе О1у ТЪг О1у ТЪг Ьуз Уа1 ТЪг Уа1 Ьеи

100 105 110 <210> 15 <211> 373 <212> ДНК <213> Ното зар1епз <400> 15 даддаасадс ДдсДададДс Ддддддаддс сДддДсаадс сДддддддДс ссДдадасДс 60

ДссДдДдсад ссДсДддаДД сассДДсадД адДДаДадса ДдаасДдддД ссдссаддсД 120 ссадддаадд ддсДддадДд ддДсДсаДсс аДДадДдсаа дДадсадДДа садсдаДДас 180 дсадасДоад сдаадддссд аДДсассаДс Дссададаса асдссаадас сДсасДдДДД 240 сДдсаааДда асадссДдад адссдаддас асддсДаДсД аДДДсДдДдс дададсДсдд 300 дсаасДддсД асадДДссаД ДасссссДас ДДДдасаДДД ддддссаддд аасссДддДс 360

- 38 030319 ассдЕсЕссЕ сад

373

<210>	16
<211>	331
<212>	ДНК
<213>	Ното зарчепз
<400>	16

садЕсЕдЕсд Едасдсадас дсссЕсадЕд ЕсЕддддссс садддсадад ддЕсассаЕс

ЕссЕдсасЕд ддадсадсЕс саасаЕсддд дсаддЕЕаЕд аЕдЕасасЕд дЕассадсаа

120 сЕЕссаддаа садсссссаа асЕссЕсаЕс ЕаЕдаЕааса асааЕсдасс сЕсаддддЕс

180 ссддассдаЕ ЕсЕсЕдссЕс саадЕсЕддс ассЕсадссЕ сссЕддссаЕ сассдддсЕс

240 саддсЕдадд аЕдаддсЕда ЕЕаЕЕасЕдс садЕссЕаЕд асаддаассЕ дадЕддЕдЕс

300

ЕЕсддаасЕд ддассааддЕ сассдЕссЕа д

331

<210>	17
<211>	124
<212>	БЕЛОК
<213>	Ното	зарчепз
<400>	17
О1и Уа1	О1п	Ьеи Уа1 О1и	Бег О1у О1у О1у Ьеи Уа1 Ьуз	Рго О1у О1у
1		5	10	15

- 39 030319

Зег Ьеи Агд

Зег МеЕ Азп

Зег Зег 11е

Ьуз О1у Агд

Ьеи О1п МеЕ

А1а Агд А1а

11е Тгр О1у

115 <210> 18

Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег О1у РНе ТНг РНе Зег Зег Туг

25 30

Тгр Уа1 Агд О1п А1а Рго О1у Ьуз О1у Ьеи О1и Тгр Уа1

45

Зег А1а Зег Зег Зег Туг Зег Азр Туг А1а Азр Зег А1а

60

РНе ТНг 11е Зег Агд Азр Азп А1а Ьуз ТНг Зег Ьеи РНе

75 80

Азп Зег Ьеи Агд А1а О1и Азр ТНг А1а 11е Туг РНе Суз

90 95

Агд А1а ТНг О1у Туг Зег Зег 11е ТНг Рго Туг РНе Азр

100 105 110

О1п О1у ТНг Ьеи Уа1 ТНг Уа1 Зег Зег

120

- 40 030319 <211> 373 <212> ДНК <213> Ното заргепз <400> 18 даддЕдсадс ЕддЕддадЕс Едддддаддс сЕддЕсаадс сЕддддддЕс ссЕдадасЕс

ЕссЕдЕдсад ссЕсЕддаЕЕ сассЕЕсадЕ адЕЕаЕадса ЕдаасЕдддЕ ссдссаддсЕ ссадддаадд ддсЕддадЕд ддЕсЕсаЕсс аЕЕадЕдсаа дЕадсадЕЕа садсдаЕЕас дсадасЕсад сдаадддссд аЕЕсассаЕс Ессададаса асдссаадас сЕсасЕдЕЕЕ сЕдсаааЕда асадссЕдад адссдаддас асддсЕаЕсЕ аЕЕЕсЕдЕдс дададсЕсдд дсаасЕддсЕ асадЕЕссаЕ ЕасссссЕас ЕЕЕдасаЕЕЕ ддддссаддд аасссЕддЕс ассдЕсЕссЕ сад

120

180

240

300

360

373 <210> 19 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Ното зарйепз <400> 19

О1у РНе А1а РНе ТНг О1у Туг О1у

5 <210> 20

- 41 030319 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Ното заргепз <400> 20

11е ТЪг А1а О1у Зег Зег Туг 11е <210> 21 <211> 15 <212> БЕЛОК <213> Ното заргепз <400> 21

А1а Агд Уа1 А1а Зег Рго Ьеи Уа1 Агд О1у Ьеи Нгз Ьеи Азр Туг <210> 22 <211> 3 <212> БЕЛОК <213> Ното заргепз <400> 22

А1а Азп Азр

- 42 030319 <210> 23 <211> 10 <212> БЕЛОК <213> Ното зарчепз <400> 23

О1п Бег Туг Азр Агд ТЪг Ьеи Бег Уа1 Уа1

5 10 <210> 24 <211> 24 <212> ДНК <213> Ното зарчепз <400> 24 ддаЕЕсдсаЕ ЕсасЕддЕЕа ЕддЕ <210> 25 <211> 24 <212> ДНК <213> Ното зарчепз <400> 25 аЕсасЕдсЕд даадсЕсаЕа саЕс <210> 26 <211> 45

- 43 030319

<212>	ДНК
<213>	Ното зарбепз
<400>	26

дсдададЬЬд сдЬсЬссЬсЬ ддЬЬсдддда сЬссасЬЬад асЬас 45

<210>	27
<211>	9
<212>	ДНК
<213>	Ното зарбепз
<400>	27

дсЬаасдас 9

<210>	28
<211>	30
<212>	ДНК
<213>	Ното зарбепз
<400>	28

садЬссЬаЬд ассдсасссЬ дадЬдЬадЬд 30

<210>	29
<211>	122
<212>	БЕЛОК
<213>	Ното зарбепз
<400>	29

- 44 030319

О1и Уа1 Ηΐ3 Ьеи Уа1 О1и Зег О1у О1у О1у Ьеи Уа1 Ьуз Рго О1у О1у

5 10 15

Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег О1у РНе А1а РНе ТНг О1у Туг

25 30

О1у Ьеи Азп Тгр Уа1 Агд О1п Уа1 Рго О1у Ьуз О1у Ьеи О1и Тгр Уа1

40 45

Зег Зег 11е ТНг А1а О1у Зег Зег Туг 11е Азр Туг А1а О1и Зег Уа1

55 60

Ьуз О1у Агд РНе ТНг 11е Зег Агд Азр Азп О1у Ьуз Азп ТНг Ьеи РНе

70 75 80

Ьеи О1п Меб Зег Азр Ьеи Агд А1а Азр Азр ТНг А1а Уа1 Туг Туг Суз

90 95

А1а Агд Уа1 А1а Зег Рго Ьеи Уа1 Агд О1у Ьеи Н1з Ьеи Азр Туг Тгр

100 105 110

О1у О1п О1у А1а Ьеи Уа1 ТНг Уа1 Зег Зег

115

120

- 45 030319 <210> 30 <211> 110 <212> БЕЛОК <213> Ното зарбепз <400> 30

О1п Зег Уа1 Ьей ТЪг

5

Агд Уа1 ТЪг 11е Зег

Туг Азр Уа1 О1п Тгр

Ьей 11е Туг А1а Азп

Зег О1у Зег Ьуз Зег

Агд А1а О1и Азр О1и

О1п Рго Рго Зег Меб Зег О1у А1а Рго О1у О1п

15

Суз ТЪг О1у О1у Зег Зег Азп 11е О1у А1а О1у

30

Туг О1п О1п Ьей Рго О1у А1а А1а Рго Ьуз Ьей

45

Азр Азп Агд Рго Зег О1у Уа1 Рго Азр Агд РЪе

60

О1у ТЪг Зег О1у Зег Ьей Уа1 11е А1а О1у Ьей

75 80

А1а Азр Туг Туг Суз О1п Зег Туг Азр Агд ТЪг

95

- 46 030319

Ьеи Зег Уа1 Уа1 РНе О1у О1у О1у ТНг Ьуз Ьеи ТНг Уа1 Ьеи

100

105

110 <210> 31 <211> 367 <212> ДНК <213> Ното зарчепз <400> 31 даддЬдсасс ЬддЬддадЬс Ьдддддаддс сЬддЬсаадс сЬддддддЬс ссЬдадасЬс

ЬссЬдЬдсад ссЬсЬддаЬЬ сдсаЬЬсасЬ ддЬЬаЬддЬс ЬаааЬЬдддЬ ссдссаддЬЬ ссадддаадд дссЬддадЬд ддЬЬЬсаЬсс аЬсасЬдсЬд даадсЬсаЬа саЬсдасЬас дсададЬсад Ьдаадддссд аЬЬсассаЬс Ьссададаса асддсаадаа ЬасасЬдЬЬс сЬдсаааЬда дсдассЬдад адссдасдас асддсЬдЬсЬ аЬЬасЬдЬдс дададЬЬдсд

120

180

240

300

ЬсЬссЬсЬдд

ЬЬсддддасЬ ссасЬЬадас

ЬасЬддддсс адддадсссЬ ддЬсассдЬс

360

ЬссЬсад

367

<210>	32
<211>	331
<212>	ДНК
<213>	Ното зарчепз
<400>	32

- 47 030319 садЕсЕдЕдс Едасдсадсс дсссЕсааЕд Ессддддссс садддсадад ддЕсассаЕс 60

ЕссЕдсасЕд ддддсадсЕс саасаЕсддд дсаддЕЕаЕд аЕдЕдсадЕд дЕассадсаа 120 сЕЕссаддад садсссссаа асЕссЕсаЕс ЕаЕдсЕаасд асааЕсддсс сЕсаддддЕс 180 ссЕдассдаЕ ЕсЕсЕддсЕс саадЕсЕддс ассЕсаддсЕ сссЕадЕсаЕ сдсЕддссЕс 240 сдддсЕдадд аЕдаддсЕда ЕЕаЕЕасЕдс садЕссЕаЕд ассдсасссЕ дадЕдЕадЕд 300

ЕЕсддсддад ддассаадсЕ дассдЕссЕд д 331

<210>	33
<211>	122
<212>	БЕЛОК
<213>	Ното
<400>	33

О1и Уа1 О1п Ьеи Уа1 О1и Бег О1у О1у О1у Ьеи Уа1 Ьуз Рго О1у О1у

5 10 15

Бег Ьеи Агд Ьеи Бег Суз А1а А1а Бег О1у РНе А1а РНе ТНг О1у Туг

- 48 030319

Бег Бег 11е ТНг А1а О1у Бег Бег Туг 11е Азр Туг А1а О1и Бег Уа1

55 60

Ьуз О1у Агд РНе ТНг 11е Бег Агд Азр Азп О1у Ьуз Азп ТНг Ьеи РНе

70 75 80

Ьеи О1п МеЕ Бег Азр Ьеи Агд А1а Азр Азр ТНг А1а Уа1 Туг Туг Суз

90 95

А1а Агд Уа1 А1а Бег Рго Ьеи Уа1 Агд О1у Ьеи Н1з Ьеи Азр Туг Тгр

100 105 110

О1у О1п О1у А1а Ьеи Уа1 ТНг Уа1 Бег Бег

115 120 <210> 34 <211> 367 <212> ДНК <213> Ното зар1епз <400> 34 даддЕдсадс ЕддЕддадЕс Едддддаддс сЕддЕсаадс сЕддддддЕс ссЕдадасЕс

ЕссЕдЕдсад ссЕсЕддаЕЕ сдсаЕЕсасЕ ддЕЕаЕддЕс ЕаааЕЕдддЕ ссдссаддЕЕ ссадддаадд дссЕддадЕд ддЕЕЕсаЕсс аЕсасЕдсЕд даадсЕсаЕа саЕсдасЕас

120

180

- 49 030319

дсададТсад	Тдаадддссд	аТТсассаТс	Тссададаса	асддсаадаа	ТасасТдТТс	240
сТдсаааТда	дсдассТдад	адссдасдас	асддсТдТсТ	аТТасТдТдс	дададТТдсд	300

ТсТссТсТдд

ТТсддддасТ ссасТТадас

ТасТддддсс адддадсссТ ддТсассдТс

360

ТссТсад

367 <210>

<211>

<212>

<213>

БЕЛОК

Ното зарбепз <400> 35

О1п Бег Туг Азр Агд Бег Ьеи Бег О1у Уа1

5 10

<210>	36
<211>	30
<212>	ДНК
<213>	Ното
<400>	36

садТссТаТд асаддадссТ дадТддТдТс <210> 37

- 50 030319 <211> 110 <212> БЕЛОК <213> Ното зар1епз <400> 37

О1п Зег Уа1 Уа1 ТЪг

5

Агд Уа1 ТЪг 11е Зег

Туг Азр Уа1 Н1з Тгр

Ьеи 11е Туг Азр Азп

Зег А1а Зег Ьуз Зег

О1п А1а О1и Азр О1и

Ьеи Зег О1у Уа1 РЪе

100

О1п Рго Рго Зег Уа1 Зег О1у А1а Рго О1у О1п

15

Суз ТЪг О1у Зег Зег Зег Азп 11е О1у А1а О1у

30

Туг О1п О1п Ьеи Рго О1у ТЪг А1а Рго Ьуз Ьеи

45

Азп Азп Агд Рго Зег О1у Уа1 Рго Азр Агд РЪе

60

О1у ТЪг Зег А1а Зег Ьеи А1а 11е ТЪг О1у Ьеи

75 80

А1а Азр Туг Туг Суз О1п Зег Туг Азр Агд Зег

95

О1у ТЪг О1у ТЪг Ьуз Уа1 ТЪг Уа1 Ьеи

105 110

- 51 030319 <210> 38 <211> 331 <212> ДНК <213> Ното зар1епз <400> 38 садДсДдДсд Ддасдсадсс дсссДсадДд ДсДддддссс садддсадад ддДсассаДс

ДссДдсасДд ддадсадсДс саасаДсддд дсаддДДаДд аДдДасасДд дДассадсаа сДДссаддаа садсссссаа асДссДсаДс ДаДдаДааса асааДсдасс сДсаддддДс ссддассдаД ДсДсДдссДс саадДсДддс ассДсадссД сссДддссаД сассдддсДс саддсДдадд аДдаддсДда ДДаДДасДдс садДссДаДд асаддадссД дадДддДдДс

120

180

240

300

ДДсддаасДд ддассааддД сассдДссДа д

331 <210>

<211>

<212>

<213>

БЕЛОК

Ното зартепз <400> 39

11е Зег Зег Зег Зег Зег Туг 11е

5

- 52 030319 <210> 40 <211> 17 <212> БЕЛОК <213> Ното заръепз <400> 40

А1а Агд А1а Агд А1а ТЪг О1у Туг Азп Зег 11е ТЪг Рго Туг РЪе Азр

11е <210> 41 <211> 3 <212> БЕЛОК <213> Ното заръепз <400> 41

О1у Азп Зег <210> 42 <211> 10 <212> БЕЛОК <213> Ното зартепз

- 53 030319 <400> 42

Ο1η Зег Туг Азр Зег Зег Ьеи Зег О1у Уа1

5 10 <210> 43 <211> 24 <212> ДНК <213> Ното заргепз <400> 43 ддсЬЬсасаЬ ЬсадсЬссЬа сЬсЬ

<210>	44
<211>	24
<212>	ДНК
<213>	Ното зар1епз
<400>	44

аЬсЬсаадсЬ ссЬсЬадЬЬа саЬс 24

<210>	45
<211>	51
<212>	ДНК
<213>	Ното зар1епз
<400>	45

дсссдддсЬа дадсаасадд сЬаЬаасадс аЬЬасЬссЬЬ асЬЬЬдасаЬ с 51

- 54 030319

<210>	46
<211>	15
<212>	ДНК
<213>	Ното зарчепз
<400>	46

ЕсаЕссааса Есддс 15

<210>	47
<211>	9
<212>	ДНК
<213>	Ното зарчепз
<400>	47

дддаасадс 9

<210>	48
<211>	30
<212>	ДНК
<213>	Ното зарчепз
<400>	48

садЕсЕЕаЕд аЕЕсЕЕсЕсЕ дЕсЕддадЕс 30

<210>	49
<211>	124
<212>	БЕЛОК

- 55 030319 <213> Ното <400> 49

О1и Уа1 О1п

Зег Ьеи Агд зартепз

Зег МеЕ Азп

Зег Зег 11е

Ьуз О1у Агд

Ьеи О1п МеЕ

А1а Агд А1а

Ьеи Уа1 О1и Зег О1у О1у О1у Ьеи Уа1 Ьуз Рго О1у О1у

10 15

25 30

45

Зег Зег Зег Зег Зег Туг 11е Туг Туг А1а Азр Зег Уа1

60

РНе ТНг 11е Зег Агд Азр Азп А1а Ьуз Азп Зег Ьеи Туг

75 80

Азп Зег Ьеи Агд А1а О1и Азр ТНг А1а Уа1 Туг Туг Суз

90 95

Агд А1а ТНг О1у Туг Азп Зег 11е ТНг Рго Туг РНе Азр

100 105 110

- 56 030319

11е Тгр О1у О1п О1у

115 <210> 50 <211> 110 <212> БЕЛОК <213> Ното зар1епз <400> 50

О1п Бег Уа1 Уа1 ТЬг

5

Агд Уа1 ТЬг 11е Бег

Туг Азр Уа1 Н1з Тгр

Ьеи 11е Туг О1у Азп

Бег О1у Бег Ьуз Бег

ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Бег Бег

120

О1п Рго Рго Бег Уа1 Бег О1у А1а Рго О1у О1п

15

Суз ТЬг О1у Бег Бег Бег Азп 11е О1у А1а О1у

30

Туг О1п О1п Ьеи Рго О1у ТЬг А1а Рго Ьуз Ьеи

45

Бег Азп Агд Рго Бег О1у Уа1 Рго Азр Агд РЬе

60

О1у ТЬг Бег А1а Бег Ьеи А1а 11е ТЬг О1у Ьеи

75 80

- 57 030319

О1п А1а О1и Азр О1и А1а Азр Туг Туг Суз О1п Зег Туг Азр Зег Зег

90 95

Ьеи Зег О1у Уа1 РНе О1у ТЪг О1у ТЪг Ьуз Уа1 ТЪг Уа1 Ьеи

100 105 110 <210> 51 <211> 372 <212> ДНК <213> Ното зар1епз <400> 51 даддЕдсадс ЕддЕддадад сддаддсдда сЕддЕсааас сЕддсдддЕс асЕдадасЕд 60

ЕсаЕдсдсад саадсддсЕЕ сасаЕЕсадс ЕссЕасЕсЕа ЕдаасЕдддЕ дсдасаддсЕ 120 ссЕддсаадд дасЕддадЕд ддЕсЕсЕадЕ аЕсЕсаадсЕ ссЕсЕадЕЕа саЕсЕасЕаЕ 180 дсадасЕссд Едаадддаад дЕЕсассаЕс ЕсасдсдаЕа асдссааааа ЕадссЕдЕаЕ 240 сЕдсадаЕда аЕЕсссЕдад адссдаадас ассдсЕдЕсЕ асЕаЕЕдсдс ссдддсЕада 300 дсаасаддсЕ аЕаасадсаЕ ЕасЕссЕЕас ЕЕЕдасаЕсЕ ддддасаддд сасасЕддЕд 360 ассдЕсЕссЕ са 372 <210> 52 <211> 330

- 58 030319 <212> ДНК <213> Ното зарчепз <400> 52 садЕссдЕсд ЕсасЕсадсс ЕссаадсдЕс адсддддсас сЕдддсадсд ддЕсасааЕс

ЕсаЕдсасЕд ддЕссЕсаЕс саасаЕсддс дсЕдддЕасд асдЕдсасЕд дЕаЕсадсад сЕдссЕддаа садсассЕаа дсЕдсЕдаЕс Еасдддааса дсааЕсддсс аЕсЕддадЕс сссдаЕадаЕ ЕсадсддаЕс саааЕсЕддс ассадЕдссЕ сасЕддсЕаЕ ЕасадддсЕд

120

180

240 саддсададд асдаадссда

ЕЕасЕаЕЕдс садЕсЕЕаЕд аЕЕсЕЕсЕсЕ дЕсЕддадЕс

300

ЕЕсддсассд дсасаааадЕ сассдЕссЕд

330

<210>	53
<211>	15
<212>	БЕЛОК
<213>	Ното
<400>	53

А1а Агд Уа1 А1а Бег Рго МеЕ Уа1 Агд О1у Ьеи Нчз РНе Азр Туг

5 10 15

<210>	54
<211>	10
<212>	БЕЛОК
<213>	Ното зарчепз

- 59 030319 <400> 54

О1п Зег Туг Азр Зег Зег Ьеи Зег Уа1 Уа1

5 10 <210> 55 <211> 24 <212> ДНК <213> Ното зартепз <400> 55 ддсДДДассД ДДадсДссДа сДсД <210> 56 <211> 45 <212> ДНК <213> Ното зартепз <400> 56 дсссдсдДсд сДадсссДаД ддДдсддддд сДдсаДДДДд аДДаД <210> 57 <211> 27 <212> ДНК <213> Ното зартепз <400> 57

- 60 030319 бсббсаааса бсддсдсбдд дбасдас <210> 58 <211> 30 <212> ДНК <213> Ното заргепз <400> 58 сададсбасд аббсабсссб дадсдбддбс <210> 59 <211> 122 <212> БЕЛОК <213> Ното зар1епз <400> 59

5 10 15

Бег Ьеи Агд Ьеи Бег Суз А1а А1а Бег О1у РНе ТНг РНе Бег Бег Туг

25 30

Бег Меб Азп Тгр Уа1 Агд О1п А1а Рго О1у Ьуз О1у Ьеи О1и Тгр Уа1

40 45

Бег Бег 11е Бег Бег Бег Бег Бег Туг 11е Туг Туг А1а Азр Бег Уа1

- 61 030319

Ьуз О1у Агд РЬе ТЬг

Ьеи О1п МеЕ Азп Бег

А1а Агд Уа1 А1а Бег

100

О1у О1п О1у ТЬг Ьеи

115 <210> 60 <211> 110 <212> БЕЛОК <213> Ното зарчепз <400> 60

О1п Бег Уа1 Ьеи ТЬг

5

Агд Уа1 ТЬг 11е Бег

60

11е Бег Агд Азр Азп А1а Ьуз Азп Бег Ьеи Туг

75 80

Ьеи Агд А1а О1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз

95

Рго МеЕ Уа1 Агд О1у Ьеи Нчз РЬе Азр Туг Тгр

105 110

Уа1 ТЬг Уа1 Бег Бег

120

С1п Рго Рго Бег Уа1 Бег О1у А1а Рго О1у С1п

15

Суз ТЬг О1у Бег Бег Бег Азп 11е С1у А1а С1у

- 62 030319

25 30

Туг Азр Уа1 Н1з Тгр Туг О1п О1п Ьеи Рго О1у ТЪг А1а Рго Ьуз Ьеи

40 45

Ьеи 11е Туг О1у Азп Зег Азп Агд Рго Зег О1у Уа1 Рго Азр Агд РЪе

55 60

Зег О1у Зег Ьуз Зег О1у ТЪг Зег А1а Зег Ьеи А1а 11е ТЪг О1у Ьеи

70 75 80

90 95

Ьеи Зег Уа1 Уа1 РЪе О1у О1у О1у ТЪг Ьуз Ьеи ТЪг Уа1 Ьеи

100

105

110 <210> 61 <211> 366 <212> ДНК <213> Ното зартепз <400> 61 даадЬдсадс ЬддЬддааЬс 5дддддсддд сЬддЬсааас сЬддсддаад ЬсЬдаддсЬд

ЬссЬдЬдсЬд сЬадЬддсЬЬ ЬассЬЬЬадс ЬссЬасЬсЬа

ЬдаасЬдддЬ дсдасаддса

120

- 63 030319

ссЕддсаадд	дасЕддадЕд	ддЕсЕсЕадЕ	аЕсЕсаадсЕ	ссЕсЕадЕЕа	саЕсЕасЕаЕ	180
дсЕдасЕссд	Едаадддссд	дЕЕсассаЕс	ЕсаададаЕа	асдсаааааа	ЕадссЕдЕаЕ	240
сЕдсадаЕда	аЕЕсссЕдад	ддсадаадас	асадссдЕдЕ	асЕаЕЕдсдс	ссдсдЕсдсЕ	300
адсссЕаЕдд	ЕдсдддддсЕ	дсаЕЕЕЕдаЕ	ЕаЕЕддддас	адддаасЕсЕ	ддЕдассдЕс	360

ЕсаЕсс 366

<210>	62
<211>	330
<212>	ДНК
<213>	Ното зар1епз
<400>	62

сададсдЕсс	Едасссадсс	ассаЕссдЕд	адсддсдсас	ссддссадсд	адЕдасЕаЕЕ	60
ЕссЕдЕассд	дсадЕЕсЕЕс	ааасаЕсддс	дсЕдддЕасд	асдЕдсасЕд	дЕаЕсадсад	120
сЕдссЕддаа	садсассЕаа	дсЕдсЕдаЕс	Еасдддааса	дсааЕсддсс	аЕсЕддадЕс	180
сссдаЕадаЕ	ЕсадсддаЕс	саааЕсЕддс	ассадЕдссЕ	сасЕддсЕаЕ	ЕасадддсЕд	240
саддсададд	асдаадссда	ЕЕасЕаЕЕдс	сададсЕасд	аЕЕсаЕсссЕ	дадсдЕддЕс	300
ЕЕсддаддсд	дсасаааасЕ	дасЕдЕссЕд				330

- 64 030319 <210> 63 <211> 21 <212> БЕЛОК <213> Ното зарчепз <400> 63

Зег А1а Уа1 Зег Ьуз О1у Туг Ьеи Зег А1а Ьеи Агд ТНг О1у Тгр Туг

5 10 15

ТНг Зег Уа1 11е ТНг <210> 64 <211> 9 <212> БЕЛОК <213> Ното зарчепз <400> 64

Туг Ьеи Зег А1а Ьеи Агд ТНг О1у Тгр

5 <210> 65 <211> 9 <212> БЕЛОК <213> Ното зарчепз <400> 65

- 65 030319

Туг Ьеи Бег Уа1 Ьеи Агд ТНг О1у Тгр

5 <210> 66 <211> 9 <212> БЕЛОК <213> Ното зарбепз <400> 66

Туг РЬе Бег А1а Ьеи Агд ТНг О1у Тгр

5 <210> 67 <211> 9 <212> БЕЛОК <213> Ното зарбепз <400> 67

Туг РНе Бег Уа1 Ьеи Агд ТНг О1у Тгр

5 <210> 68 <211> 9 <212> БЕЛОК <213> Ното зарбепз

- 66 030319 <400> 68

Туг Ьуз Бег А1а Ьеи Агд ТНг О1у Тгр

5 <210> 69 <211> 9 <212> БЕЛОК <213> Ното зарчепз <400> 69

Туг Ьуз Бег Уа1 Ьеи Агд ТНг О1у Тгр

5

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который нейтрализует инфекцию И8У, МРУ и РУМ, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит последовательности определяющей комплементарность области тяжелой цепи (СИИН)1 СИИН2 и СЭИН3, как указано в 8ЕЦ ГО N0:1, 8ЕЦ ГО N0:2 и 8ЕЦ ГО N0:3 соответственно, и последовательности определяющей комплементарность области легкой цепи (СОИЬ)1, СГОИЬ2 и С0ИЬ3, как указано в 8ЕЦ ГО N0: 4, 8ЕЦ ГО N0:5 и 8ЕЦ ГО N0:35 соответственно.
2. Выделенное антитело по п.1 или его антигенсвязывающий фрагмент, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфически связывается с Р-белком до слияния и не связывается с Рбелком после слияния И8У и МРУ.
3. Антитело по п.1 или 2 или его антигенсвязывающий фрагмент, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент нейтрализует инфекцию группы А и группы В И8У, а также группы А и группы В МРУ.
4. Антитело по п.1 или 2 или его антигенсвязывающий фрагмент, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент нейтрализует инфекцию подгруппы А1, А2, В1 и В2 МРУ.
5. Антитело по п.2 или его антигенсвязывающий фрагмент, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент нейтрализует инфекцию И8У, МРУ и РУМ.
6. Антитело по п.1 или 2 или его антигенсвязывающий фрагмент, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент не связывается с Р-белок И8У в участке, который перекрывается с антигенным участком Ι, антигенным участком ΙΙ или антигенным участком ГУ.
7. Антитело по п.1 или 2 или его антигенсвязывающий фрагмент, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент связывается с консервативной областью в аминоконцевом участке Р-белка И8У, МРУ или РУМ, содержащей аминокислотную последовательность, как указано в любой из 8ЕЦ ГО N0:64-69.
8. Антитело по п.1 или 2 или его антигенсвязывающий фрагмент, где концентрация антитела или фрагмента, необходимая для 50% нейтрализации И8У, МРУ или РУМ, составляет 500 нг/мл или менее.
9. Антитело по п.1 или его антигенсвязывающий фрагмент, где антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕЦ ГО N0:17, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕЦ ГО N0:37.

- 67 030319
10. Антитело по любому из предшествующих пунктов или его антигенсвязывающий фрагмент, где антитело представляет собой антитело человека, моноклональное антитело, моноклональное антитело человека, очищенное антитело или одноцепочечное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой РаЬ, РаЬ', Р(аЬ')2, Ρν или δοΡν.
11. Антитело по любому из предшествующих пунктов или его антигенсвязывающий фрагмент для лечения или ослабления инфекции К8У, или МРУ, или К8У и МРУ.
12. Молекула нуклеиновой кислоты, содержащая полинуклеотид, кодирующий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, антитела по любому из предшествующих пунктов.
13. Молекула нуклеиновой кислоты по п.12, где полинуклеотидная последовательность является по меньшей мере на 75% идентичной последовательности нуклеиновой кислоты любой из 8ЕО ГО N0:7-11, 17, 36 или 37.
14. Экспрессирующий вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п.12 или 13.
15. Клетка, экспрессирующая антитело по любому из пп.1-11 или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащая экспрессирующий вектор по п.14.
16. Фармацевтическая композиция для производства лекарственного средства для лечения или профилактики инфекции К8У, или МРУ, или К8У и МРУ, содержащая антитело по любому из пп.1-11 или его антигенсвязывающий фрагмент, молекулу нуклеиновой кислоты по п.12 или 13, вектор по п.14 или клетку по п.15, и фармацевтически приемлемый разбавитель или носитель.
17. Фармацевтическая композиция для производства лекарственного средства для лечения или профилактики инфекции К8У, или МРУ, или К8У и МРУ, содержащая первое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент и второе антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, где первое антитело представляет собой антитело по любому из пп.1-11, и второе антитело нейтрализует инфекцию К8У, или МРУ, или К8У и МРУ.
18. Применение антитела по любому из пп.1-11 или его антигенсвязывающего фрагмента в производстве лекарственного средства для лечения или профилактики инфекции К8У, или МРУ, или К8У и МРУ.
19. Применение антитела по любому из пп.1-11 или его антигенсвязывающего фрагмента в диагностике инфекции К8У или МРУ.
20. Применение молекулы нуклеиновой кислоты по п.12 или 13 в производстве лекарственного средства для лечения или профилактики инфекции К8У, или МРУ, или К8У и МРУ.
21. Применение молекулы нуклеиновой кислоты по п.12 или 13 в диагностике инфекции К8У или МРУ.
22. Применение антитела по любому из пп.1-11 или его антигенсвязывающего фрагмента для мониторинга качества вакцин против К8У или против МРУ путем проверки того, что антиген указанной вакцины содержит специфический эпитоп в правильной конформации.
23. Способ ослабления инфекции К8У или МРУ или снижения риска развития инфекции К8У или МРУ, включающий введение нуждающемуся в этом индивидууму терапевтически эффективного количества антитела по любому из пп.1-11 или его антигенсвязывающего фрагмента.

- 68 030319

Первичный скрининг с использованиям анализа микронейтрализации МРУ