CN104350069B - 中和rsv、mpv和pvm的抗体和其应用 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及抗体和其抗原结合片段，其中和RSV、MPV和PVM的感染。本公开还涉及编码这样的抗体和抗体片段的核酸、产生这样的抗体和抗体片段的无限增殖化B细胞和培养的浆细胞以及结合这样的抗体和抗体片段的多肽。此外，本公开涉及抗体、抗体片段以及本发明的抗体识别的多肽在筛选方法以及在RSV或MPV感染和RSV和MPV共感染的诊断、治疗和预防中的应用。

Description

中和RSV、MPV和PVM的抗体和其应用
该申请要求2012年3月20日提交的美国临时申请号61/613,197和2012年6月4日提交的美国临时申请号61/655,310的权益，其公开内容以其全部在此通过引用被并入，如同记载在本文中。
发明背景
小鼠呼吸道合胞病毒(RSV)和变性肺病毒(MPV)和肺炎病毒是常见的属于副粘病毒(paramyxovirus)家族的感冒病毒，其共享目标群体和代表新生儿和免疫受损的患者中主要的健康问题。
RSV是全球婴儿和成人呼吸道疾病的主要原因。具有RSV感染的儿童的0.5％和3.2％需要住院(Thompson,W.W.et al.,2003,JAMA:The Journal of the AmericanMedical Association 289:179-186)，并且儿童的5％至10％具有延长的严重感染，认为是以后童年里易感染哮鸣和哮喘样症状的一个因素。对RSV的免疫似乎是短暂的，因此再感染频繁(Ogra,2003,Paediatric Respiratory Reviews 5Suppl A:S119-126)。
人MPV在2001年被首次分离，并且现在被公认为是婴儿和成人中急性呼吸道疾病的第二主要原因；据估计它感染超过50％的两岁婴儿和几乎所有五岁的儿童。MPV占住院的幼儿中呼吸性疾病的大致5至15％(Alto,2004,The Journal of the American Board ofFamily Practice/American Board of Family Practice 17:466-469；Williams et al.,2004,N Engl J Med 350:443-450)。具有MPV的感染是濒临危险的早产儿中的疾病、早产的慢性肺病、充血性心脏病和免疫缺陷的显著负担(Martino et al.,2005,Biology ofBlood and Marrow Transplantation:Journal of the American Society for Bloodand Marrow Transplantation 11:781-796)。
MPV和RSV的共感染可以是常见的，假定它们的流行和重叠的冬季疾病流行。虽然不清楚是否协同的病理学可在这两种病毒之间发生，但是导致特别严重的呼吸道疾病的恶化在一些MPV和RSV共感染的儿童中观察到(Greensill,2003,Emerging InfectiousDiseases 9:372)。
RSV——其属于肺病毒属(Pneumoviriniae)亚科肺炎病毒(Pneumovirus)属，以及MPV——其属于肺病毒属亚科变性肺病毒(Metapneumovirus)属，在它们的基因结构中具有一些相似性，虽然MPV缺少在RSV中发现的非结构基因NS1和NS2。RSV和MPV包膜含有三个病毒编码的跨膜表面糖蛋白：主要附着蛋白G、融合蛋白F和小的疏水SH蛋白。虽然RSV和MPV包膜含有功能上相似的蛋白，然而，重要的是注意RSV和MPV的F蛋白只共享33％的氨基酸序列同一性。另外，针对RSV或MPV产生的抗血清不交叉中和两种病毒(Wyde et al.,2003,Antiviral Research 60:51-59)，并且到目前为止能交叉中和RSV和MPV的单克隆抗体没有被分离。
RSV和MPV F糖蛋白通过病毒粒子包膜和宿主细胞质膜之间的融合来指导病毒穿入。后来在感染中，细胞表面上表达的F蛋白可用邻近细胞介导融合，形成合胞体(Collinset al.,1984PNAS 81:7683-7687)。在两种情况中，溶蛋白性裂解和含有氨基酸的疏水伸展的F亚基——称作融合肽——的N-端直接插入靶细胞膜以启动融合。结合到靶细胞和随后的活化之后，相对稳定的融合前F蛋白经历一系列结构重排，其导致融合肽插入靶细胞膜，之后是当病毒和细胞膜放在附近时形成的稳定的螺旋束的形成。这些结构变化导致稳定的融合后F蛋白的形成。
RSV或MPV感染的疫苗目前得不到。发现20世纪60年代测试的福尔马林灭活的和铝为佐剂的RSV疫苗(FI-RSV)使婴儿易患导致高热和严重肺炎的自然RSV感染之后增强的疾病，导致高的住院率和甚至一些死亡率(Fulginiti et al.,1969,American Journal ofEpidemiology 89:435-448；Kapikian et al.,1969,American Journal of Epidemiology89:405-421；Kim et al.,1969,American Journal of Epidemiology 89:422-434)。相似地，福尔马林灭活的MPV疫苗显示在年幼的短尾猴中免疫介导的增强的疾病(de Swart etal.,2007,Vaccine 25:8518-8528)。另外，抗病毒治疗如利巴韦林尚未被证明在RSV或MPV感染中有效。
血清抗体在抵御RSV病毒的保护中的作用的证据已出现自流行病学以及动物研究。在婴儿中，母亲传递的抗体效价与抵抗严重疾病相关(Glezen et al.,1981,TheJournal of Pediatrics 98:708-715)，在成人中，下呼吸道受累的发生率和严重性在存在高水平的血清RSV中和抗体的情况下减少了(McIntosh et al.,1978,The Journal ofInfectious Diseases 138:24-32)。单克隆抗体，帕利珠单抗(Synagis)，被注册用于早产新生儿中RSV感染的预防。然而，帕利珠单抗在预防RSV感染中不总是有效并且在治疗上没有效果。另外，在存在帕利珠单抗的情况下动物中RSV延长的肺的复制在抵抗的病毒株出现之后继起(Zhao和Sullender,2005,Journal of Virology 79:3962-3968)。目前没有用于MPV感染的治疗或预防的单克隆抗体。
缺少针对最严重形式的RSV感染的好的操作动物模型与RSV和MPV是宿主受限的肺炎病毒病原体这一事实相关。用于RSV和MPV感染治疗的新药的发展已受到缺少能概括人疾病的所有症状和严重性的动物模型的阻碍。实际上，RSV和MPV不是天然的小鼠病原体和响应病毒的大量的、非生理学的接种物只引起有限的、最低限度的症状和迅速中止的首次感染。小鼠肺炎病毒(PVM)是天然的啮齿动物肺炎病毒病原体，其属于人和牛RSV的相同家族、亚科和属(肺炎病毒)。PVM F蛋白只共享与人RSV F蛋白的40％氨基酸同一性，但是具有相同的遗传组织，除了M2-L重叠——其存在于RSV但不存在于PVM。当它发生在人婴儿中时，天然的小鼠病原体PVM引起的感染复制最严重形式的RSV的体征和症状中的许多。PVM感染被表征为迅速的病毒复制，伴有大量的炎症应答——其导致呼吸衰竭和死亡(Rosemberg和Domachowske,2008,Immunology Letter 118:6-12)。小鼠中PVM感染因此被认为是人RSV和MPV严重感染最相关的动物模型。
缺少针对MPV感染的预防性治疗和针对RSV和MPV感染的疫苗以及帕利珠单抗治疗的无效，突出了对于这些显著的人病原体的新的预防和治疗剂的需要。假定大流行和共感染的可能性，将高度期望具有单个药剂——其能预防以及治疗或减弱RSV和MPV感染——和具有在其中测试药剂的动物模型。因此，存在对广泛交叉反应的中和抗体的需要，所述中和抗体保护抵御宽范围的副粘病毒，例如，至少RSV和MPV，和优选RSV、MPV和PVM。
发明内容
本发明部分基于中和RSV、MPV和PVM感染的广泛中和抗体，以及本发明的抗体结合的多肽的发现。因此，在本发明的一个方面，本发明包括分离的抗体，例如单克隆抗体、人抗体、人单克隆抗体、抗体变体或抗原结合片段，其交叉中和RSV、MPV和PVM的感染。
在本发明的一个实施方式中，本发明包括分离的抗体或其抗原结合片段，其中和RSV和MPV的感染。在本发明的另一个实施方式中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其中和RSV、MPV和PVM的感染。
在本发明的另一个实施方式中，本发明包括分离的抗体或其抗原结合片段，其特异地结合RSV融合前F蛋白而不是RSV融合后F蛋白。在再一个实施方式中，本发明包括分离的抗体或其抗原结合片段，其特异地结合RSV和MPV的融合前F蛋白而不是融合后F蛋白。在再一个实施方式中，本发明包括分离的抗体或其抗原结合片段，其特异地结合RSV、MPV和PVM的融合前F蛋白而不是融合后F蛋白。
在本发明的另一个实施方式中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包括至少一个互补决定区(CDR)序列，所述序列与SEQ ID NO：1-6、19-23、35、39-42或53-54中任一个具有至少95％的序列同一性，其中所述抗体中和RSV、MPV和PVM的感染。
在本发明的另一个实施方式中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包括具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:19的氨基酸序列的重链CDR1；具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:39的氨基酸序列的重链CDR2；和具有SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:40或SEQ ID NO:53的氨基酸序列的重链CDR3，其中所述抗体中和RSV、MPV和PVM的感染。在本发明的另一个实施方式中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包括具有SEQ IDNO:4的氨基酸序列的轻链CDR1；具有SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:41的氨基酸序列的轻链CDR2；和具有SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:42或SEQID NO:54的氨基酸序列的轻链CDR3，其中所述抗体中和RSV、MPV和PVM的感染。
在本发明的再一个实施方式中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包括：(i)分别在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中列出的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，和分别在SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:35中列出的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；(ii)分别在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中列出的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，和分别在SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6中列出的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；(iii)分别在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40中列出的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，和分别在SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42中列出的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；(iv)分别在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40中列出的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，和分别在SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6中列出的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；(v)分别在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中列出的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，和分别在SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42中列出的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列，并且其中所述抗体中和RSV、MPV和PVM的感染。
在本发明的再一个实施方式中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包括：(i)分别在SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21中列出的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，和分别在SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23中列出的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；(ii)分别在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:53中列出的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，和分别在SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:54中列出的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；(iii)分别在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:53中列出的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，和分别在SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23中列出的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；或(iv)分别在SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21中列出的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，和分别在SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:41和SEQ IDNO:54中列出的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列，并且其中所述抗体中和RSV、MPV和PVM的感染。
在本发明的再一个实施方式中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包括包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的轻链可变区；或包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链可变区；或包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ IDNO:14的氨基酸序列的轻链可变区；或包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的轻链可变区；或包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链可变区；或包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的轻链可变区，并且其中所述抗体中和RSV、MPV和PVM的感染。
在本发明的再一个实施方式中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包括包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的轻链可变区；或包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的轻链可变区；或包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ IDNO:60的氨基酸序列的轻链可变区；或包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的轻链可变区；或包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的轻链可变区，并且其中所述抗体中和RSV、MPV和PVM的感染。
本发明进一步包括抗体或其抗原结合片段，其在本文中描述为HMB3210(或3210)；或HMB2430(或2430)。在另一个实施方式中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其中和RSV、MPV和PVM的感染，其中所述抗体或其片段由产生HMB3210或HMB2430的无限增殖化B细胞克隆表达。
另一方面，本发明包括核酸分子，其包括编码本发明的抗体或抗体片段的多核苷酸。再一方面，本发明包括载体，其包括本发明的核酸分子。本发明还包括表达本发明的抗体或其抗原结合片段的细胞。又一方面，本发明包括分离的或纯化的免疫原性多肽，其包括与本发明的抗体或抗原结合片段结合的表位。
本发明进一步包括药物组合物，所述药物组合物包括本发明的抗体或其抗原结合片段、本发明的核酸分子、包括本发明的核酸分子的载体、表达本发明的抗体或抗体片段的细胞或本发明的免疫原性多肽以及药学上可接受的稀释剂或载体。本发明还包括药物组合物，其包括第一抗体或其抗原结合片段以及第二抗体或其抗原结合片段，其中第一抗体是本发明的抗体，而第二抗体是抗体或其抗原结合片段，其中和RSV或MPV、或RSV和MPV、或RSV、MPV和PVM所有三种的感染。
本发明的抗体或其抗原结合片段、本发明的核酸、包括本发明的核酸的载体、表达本发明的载体的细胞、包括与本发明的抗体或抗体片段结合的表位的分离的或纯化的免疫原性多肽、或本发明的药物组合物(i)在制备用于治疗或减弱RSV或MPV、或RSV和MPV共感染的药物中，(ii)在疫苗中，或(iii)在RSV和/或MPV病毒感染的诊断中的应用也被考虑在本发明的范围内。另外，本发明的抗体或其抗原结合片段用于通过检查所述疫苗的抗原含有处于正确构象的特异表位而监测针对RSV或MPV、或RSV和MPV的疫苗质量的应用也被考虑在本发明的范围内。
另一方面，本发明包括治疗或减弱RSV和MPV感染或降低RSV和MPV感染的危险的方法，包括给予需要其的对象治疗有效量的本发明的抗体或抗原结合抗体片段。
在另外的方面，本发明包括多肽，其特异地与本发明的抗体或其抗原结合片段结合，用(i)在治疗中，(ii)在制备用于治疗或减弱RSV或MPV、或RSV和MPV感染的药物中，(iii)作疫苗，或(iv)在筛选能中和RSV或MPV、或RSV和MPV感染的配体中。
附图说明
图1显示筛选由来自7个供体(供体1至7)的EBV-无限增殖化记忆B细胞产生的单克隆抗体体外中和RSV或MPV病毒感染的能力的结果。
图2显示单克隆抗体HMB2430、HMB3210、234mAb和帕利珠单抗中和RSV和MPV的结果。
图3显示单克隆抗体莫托维珠单抗、234mAb、HMB2430和HMB3210与RSV F或破伤风毒素蛋白的结合，如通过ELISA所测量的。
图4显示在存在大量过量的指示的未标记抗体的情况下标记的单克隆抗体与RSV感染的Hep-2细胞的结合。
图5显示在还原或非还原条件下单克隆抗体HMB2430、HMB3210、234mAb和莫托维珠单抗与来自RSV-Hep-2感染的细胞的溶胞产物的RSV F蛋白的结合，如蛋白印迹分析所测量的。
图6显示在还原或非还原条件下单克隆抗体HMB3210和234mAb与来自MPV-LLC-MK2感染的细胞的溶胞产物的MPV F蛋白的结合，如蛋白印迹分析所测量的。
图7显示单克隆抗体HMB2430、HMB3210、234mAb和帕利珠单抗中和RSV长株和PZ-MARM6隔离群的结果。
图8显示在存在(+)或缺少(-)N-糖苷酶PNG-ase F的情况下温育之后还原的SDS-PAGE凝胶上HMB3210v2的分析结果。用黑框突出显示的是被糖基化的HMB3210轻链的小的部分。
图9显示单克隆抗体HMB3210v2和HMB3210v3中和MPV I-PV 03/01-6621和RSV A2的结果。
图10显示单克隆抗体HMB3210v2和HMB3210v3中和一组MPV和RSV株的结果。
图11显示HMB3210和HMB2430单克隆抗体种系化的变体中和MPV I-PV 03/01-6621和RSV A2的结果。
图12显示与HMB3210或帕利珠单抗共同温育或不与其共同温育的RSV F融合后重组蛋白的尺寸排阻层析分析的结果。
图13显示与HMB3210或帕利珠单抗共同温育或不与其共同温育的RSV F融合前重组蛋白的尺寸排阻层析分析的结果。
图14显示HMB3210v3或帕利珠单抗(PVZ)与融合前和融合后RSV F蛋白的结合，如通过表面等离子体共振(SPR)所测量的。
图15显示人单克隆抗体HMB3210v3和D25的病毒中和和病毒播散的抑制。
图16显示RSV或MPV感染中HMB3210v3和帕利珠单抗的预防效力。
图17显示用RSV感染的STAT1缺陷小鼠中HMB3210的治疗效力。
图18显示用致死剂量的PVM感染的小鼠中HMB3210的预防和治疗效力。
图19显示在用PVM致死感染之后第3、4或5天用HMB3210v3处理的小鼠中肺病毒滴度增加的阻断。
图20显示在用致死剂量的PVM感染的小鼠中带有野生型Fc或LALA突变的HMB3210v3变体的预防和治疗效力。
图21显示突出显示与副流感病毒5(PIV5)相比RSV、BRSV、PVM和MPV序列中HMB3210识别的YLSALR肽的高度保守的比对。
图22显示融合前RSV F蛋白的模型，其显示YLSALR肽和邻近的帕利珠单抗(PVZ)位点的位置和突出显示RSV F蛋白的融合前和融合后构象中PVZ和HMB3210v3位点重排的带图。
图23显示364RSV、162MPV、8BRSV和5PVM株中HMB3210核心表位的高度保守。
图24显示多种HMB3210重链和轻链变体的序列。
图25显示多种HMB2430重链和轻链变体的序列。
具体实施方式
本发明部分基于交叉中和RSV和MPV、或RSV、MPV和PVM的抗体以及本发明的抗体结合的表位的发现和分离。这样的抗体是期望的，因为只需要一个或很少的抗体来中和RSV和MPV、或RSV、MPV和PVM。另外，交叉中和抗体以高滴度产生，从而减少生产包括用于治疗RSV和/或MPV感染的抗体的药物的成本。此外，这样的抗体识别的表位可以是能引起针对RSV和MPV的宽的保护的疫苗的部分。
虽然本发明的抗体中和RSV、MPV和PVM，但是在本发明的一些实施方式中，例如与疾病治疗、疫苗开发等相关的那些，目前的公开内容只涉及RSV和MPV，因为这些病毒是人病原体，而PVM是小鼠病原体。如本文所用，术语“RSV和MPV”和“RSV、MPV和PVM”基于上下文可互换地使用。
因此，一方面，本发明提供分离的抗体、抗体变体和其抗原结合片段，其中和RSV和MPV、或RSV、MPV和PVM。在一个实施方式中，RSV是人RSV。在另一个实施方式中，RSV是牛RSV。本发明的抗体中和人RSV(hRSV)和牛RSV(bRSV)。在另一个实施方式中，MPV是人MPV。
在一个实施方式中，本发明还提供分离的抗体或其抗原结合片段，其中和A群和B群RSV的感染。在另一个实施方式中，本发明提供分离的抗体或其抗原结合片段，其中和A群和B群MPV的感染。在再一个实施方式中，本发明提供分离的抗体或其抗原结合片段，其中和A群和B群RSV以及A群和B群MPV的感染。
如更早所讨论的，RSV、MPV和PVM的基因结构具有一些相似性。RSV和MPV中的G和F蛋白的氨基酸序列被分成A和B群；MPV进一步分成4个亚群：A1、A2、B1和B2。PVM没有再分成群或亚群。RSV、MPV或PVM F蛋白是I型跨膜表面蛋白，其具有N-端分裂的信号肽和C-端附近的膜锚着点。RSV和MPV F蛋白被合成为无活性的F0前体，其装配成同型三聚体和通过分裂来活化。F蛋白由三个结构域(DI至DIII)、融合肽(FP)和三个七价重复区(HR-A、-B和-C)形成。RSV和MPV F糖蛋白通过病毒粒子包膜和宿主细胞质膜之间的融合来指导病毒穿入。在两种情况中，F亚基的N-端——其通过溶蛋白性裂解而产生并含有融合肽——直接插入靶膜以启动融合。与靶细胞结合和随后的活化之后，相对稳定的融合前F蛋白经历一系列结构重排，其导致融合肽插入靶细胞膜，之后形成稳定的螺旋束——当病毒和细胞膜放在附近时螺旋束形成。这些结构改变导致稳定的融合后F蛋白的形成。后来在感染中，感染的细胞表面上表达的F蛋白可介导与邻近非感染的细胞的融合，形成大的合胞体。
帕利珠单抗和莫托维珠单抗的表位已被绘制在残基255-275形成的融合后RSV F蛋白抗原位点II(也称作A位点)上。MAB19和101F靶向残基422-438形成的RSV的融合后RSVF蛋白抗原位点IV(也称作C位点)。MAB19在临床试验中被测试，但是没有显示显著的效力(Johnson et al.,1999,The Journal of Infectious Diseases 180:35-40；Meissner etal.,1999,Antimicrobial Agents and Chemotherapy 43:1183-1188)。
为了有效，抗体应识别融合前F蛋白——其是阻断病毒进入的有关构造，并优选避免大量可充当诱饵的融合后F蛋白的识别，因此消耗抗体和减少其效力。到目前为止识别RSV融合前而不是RSV融合后F蛋白的抗体尚未被分离。
在本发明的一个实施方式中，本发明包括分离的抗体或其抗原结合片段，其特异地结合RSV融合前F蛋白而不是RSV融合后F蛋白。在另一个实施方式中，本发明包括分离的抗体或其抗原结合片段，其特异地结合RSV和MPV的融合前F蛋白而不是融合后F蛋白。在另一个实施方式中，本发明提供抗体，其特异地结合到RSV、MPV和PVM的融合前F蛋白而不是融合后F蛋白。
本发明提供抗体，其与RSV、MPV和PVM的F蛋白结合。尽管RSV和MPV、或RSV和PVM F蛋白之间分别只有大约33％和40％的氨基酸序列同一性的事实，但是本发明的抗体识别存在于RSV、MPV和PVM F蛋白上的共享表位。该表位不同于迄今已知的抗体如帕利珠单抗、莫托维珠单抗、mAb 101F等识别的所有那些表位。本发明的抗体不，例如，结合抗原位点II(莫托维珠单抗和帕利珠单抗所识别的)、抗原位点IV(mAb 101F所识别的)，也不结合抗原位点I(mAb 131-2A所结合的)。本发明的抗体识别的RSV F蛋白上的表位也不同于mAb D25——只对RSV特异的抗体——识别的表位。此外，本发明的抗体识别的MPV F蛋白上的表位不同于mAb 234(其识别MPV F蛋白上的表位，其对应RSV F蛋白上的抗原位点II)识别的表位。一般而言，本发明的抗体识别构象表位。在一个实施方式中，构象表位只在非还原条件下存在。在另一个实施方式中，构象表位依赖F蛋白上氨基酸残基之间二硫键的存在。
如本文所示，本发明的抗体或抗原结合片段特异地与RSV和MPV的几个不同株结合并中和RSV和MPV。另外，本发明的抗体或抗原结合片段特异地结合并交叉中和A群和B群RSV以及A群和B群MPV，包括所有相应的MPV亚群(即A1、A2、B1和B2)。
本发明的抗体和抗原结合片段具有高的中和能力。RSV、MPV和PVM的50％中和需要的本发明的抗体的浓度是，例如，约500ng/ml或更少。在一个实施方式中，RSV、MPV和PVM的50％中和需要的本发明的抗体的浓度是约500、450、400、350、300、250、200、175、150、125、100、90、80、70、60或约50ng/ml或更少。这意味着RSV、MPV和PVM的50％中和所需要的只是低的抗体浓度。特异性和能力可利用如本领域技术人员所知的标准检测来测量。
本发明的抗体可以是人抗体、单克隆抗体、人单克隆抗体、重组抗体或纯化的抗体。本发明还提供本发明的抗体的片段，特别是保留抗体的抗原结合活性的片段。这样的片段包括，但不限于，单链抗体、Fab、Fab’、F(ab')2、Fv或scFv。虽然说明书，包括权利要求书，在一些地方可能明确地指抗原结合片段(或多个)、抗体片段(或多个)、抗体的变体(或多个)和/或衍生物(或多个)，但是应当理解术语“抗体”或“本发明的抗体”包括所有类型的抗体，即，抗原结合片段(或多个)、抗体片段(或多个)、抗体的变体(或多个)和衍生物(或多个)。
已确定了本发明的几种抗体的重链和轻链的序列，每个包括重链上的三个CDR和轻链上的三个CDR。CDR氨基酸的位置根据IMGT编号系统确定。CDR、重链、轻链的序列以及编码本发明的抗体的CDR、重链、轻链的核酸分子的序列公开在序列表中。抗体重链的CDR分别称作CDRH1(或HCDR1)、CDRH2(或HCDR2)和CDRH3(或HCDR3)。相似地，抗体轻链的CDR分别称作CDRL1(或LCDR1)、CDRL2(或LCDR2)和CDRL3(或LCDR3)。表1分别提供本发明的示例性抗体的重链和轻链的六个CDR的氨基酸序列的SEQ ID编号。
表1.中和RSV、MPV和PVM的抗体的CDR多肽的SEQ ID编号。
在一个实施方式中，本发明的抗体或抗体片段包括至少一个具有以下序列的CDR：其与SEQ ID NO：1-6、19-23、35、39-42或53-54中任一个具有至少95％的序列同一性。抗体3210和抗体2430的变体的CDR分别在图24和25中提供(CDR以粗体被突出显示)。
在另一个实施方式中，本发明提供包括重链的抗体或抗原结合片段，所述重链包括来自3210变体1、3210变体2、3210变体3、3210变体4、3210变体5、3210变体6、2430变体1、2430变体2、2430变体3、2430变体4或2430变体5的一个或多个(即一、二或所有三个)重链CDR。
在再一个实施方式中，本发明的抗体或抗原结合片段包括具有SEQ ID NO:1或SEQID NO:19的氨基酸序列的重链CDR1；具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:39的氨基酸序列的重链CDR2；和具有SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:40或SEQ ID NO:53的氨基酸序列的重链CDR3。在某些实施方式中，本文所提供的抗体或抗体片段包括包含以下氨基酸序列的重链：(i)针对CDRH1的SEQ ID NO:1、针对CDRH2的SEQ ID NO:2和针对CDRH3的SEQ ID NO:3；(ii)针对CDRH1的SEQ ID NO:1、针对CDRH2的SEQ ID NO:39和针对CDRH3的SEQ ID NO:40；(iii)针对CDRH1的SEQ ID NO:19、针对CDRH2的SEQ ID NO；20和针对CDRH3的SEQ ID NO:21；或(iv)或针对CDRH1的SEQ ID NO:1、针对CDRH2的SEQ ID NO:39和针对CDRH3的SEQ ID NO:53。
还提供包括轻链的抗体或抗原结合片段，所述轻链包括来自3210变体1、3210变体2、3210变体3、3210变体4、3210变体5、3210变体6、2430变体1、2430变体2、2430变体3、2430变体4或2430变体5的一个或多个(即一、二或所有三个)轻链CDR。在一个实施方式中，本发明的抗体或抗原结合片段包括具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链CDR1；具有SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:41的氨基酸序列的轻链CDR2；和具有SEQ ID NO:6、SEQID NO:23、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:54的氨基酸序列的轻链CDR3。在某些实施方式中，本文所提供的抗体或抗体片段包括包含以下氨基酸序列的轻链：(i)针对CDRL1的SEQ ID NO:4、针对CDRL2的SEQ ID NO:5和针对CDRL3的SEQ ID NO:6；(ii)针对CDRL1的SEQ ID NO:4、针对CDRL2的SEQ ID NO:5和针对CDRL3的SEQ ID NO:35；(iii)针对CDRL1的SEQ ID NO:4、针对CDRL2的SEQ ID NO:41和针对CDRL3的SEQ ID NO:42；(iv)针对CDRL1的SEQ ID NO:4、针对CDRL2的SEQ ID NO:22和针对CDRL3的SEQ ID NO:23；或(v)针对CDRL1的SEQ ID NO:4、针对CDRL2的SEQ ID NO:41和针对CDRL3的SEQ ID NO:54。
在一个实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段包括表1所列的抗体3210变体1的所有CDR，并中和RSV、MPV和PVM的感染。在另一个实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段包括表1所列的抗体3210变体2的所有CDR，并中和RSV、MPV和PVM的感染。在另一个实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段包括表1所列的抗体3210变体3的所有CDR，并中和RSV、MPV和PVM的感染。在另一个实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段包括表1所列的抗体3210变体4的所有CDR，并中和RSV、MPV和PVM的感染。在另一个实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段包括表1所列的抗体3210变体5的所有CDR，并中和RSV、MPV和PVM的感染。在另一个实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段包括表1所列的抗体3210变体6的所有CDR，并中和RSV、MPV和PVM的感染。
在再一个实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段包括表1所列的抗体2430变体1的所有CDR，并中和RSV、MPV和PVM的感染。在另一个实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段包括表1所列的抗体2430变体2的所有CDR，并中和RSV、MPV和PVM的感染。在另一个实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段包括表1所列的抗体2430变体3的所有CDR，并中和RSV、MPV和PVM的感染。在另一个实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段包括表1所列的抗体2430变体4的所有CDR，并中和RSV、MPV和PVM的感染。在另一个实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段包括表1所列的抗体2430变体5的所有CDR，并中和RSV、MPV和PVM的感染。
示例性的本发明的抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)氨基酸序列的SEQID编号以及编码它们的核酸序列的SEQ ID编号列在表2中。
表2.中和RSV、MPV和PVM的抗体的VH和VL氨基酸和核酸残基的SEQ ID编号。
在一个实施方式中，本发明的抗体或抗体片段包括重链可变区，其具有这样的氨基酸序列：与SEQ ID NO：13、17、29、33、49或59中任一个所述的序列约70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同。在另一个实施方式中，本发明的抗体或抗体片段包括轻链可变区，其具有这样的氨基酸序列：与SEQ ID NO：14、30、37、50或60中所述的序列约70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同。在再一个实施方式中，本发明的抗体或抗体片段包括重链或轻链可变区，其具有这样的氨基酸序列：与图24和25中提供的序列约70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同。
在本发明的另一个实施方式中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其中和RSV、MPV和PVM的感染并包括包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链可变区；或包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的轻链可变区；或包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的轻链可变区；或包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链可变区；或包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的轻链可变区；或包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的轻链可变区；或包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链可变区；或包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的轻链可变区；或包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的轻链可变区。
在本发明的再一个实施方式中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其中和RSV、MPV和PVM的感染和包括包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的轻链可变区；或包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的轻链可变区；或包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的轻链可变区；或包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的轻链可变区；或包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的轻链可变区；或包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的轻链可变区。
本发明的抗体的实例包括，但不限于，HMB3210变体1、HMB3210变体2、HMB3210变体3、HMB3210变体4、HMB3210变体5、HMB3210变体6、HMB2430变体1、HMB2430变体2、HMB2430变体3、HMB2430变体4或HMB2430变体5。
本发明进一步包括抗体或其片段，其结合与本发明的抗体或抗原结合片段相同的表位，或与本发明的抗体或抗原结合片段竞争的抗体。
从表1和2可见，公开的抗体的CDR、重链和轻链可互换以提供保留它们的结合和中和能力的新抗体。本发明的抗体因此包括这样的抗体和抗原结合片段，其包括表1中提供的CDR或表2中提供的重链和轻链的任何组合。
本发明的抗体还包括杂合抗体分子，其包括来自本发明的抗体的一个或多个CDR和来自针对相同表位的另一个抗体的一个或多个CDR。在一个实施方式中，这样的杂合抗体包括来自本发明的抗体的三个CDR和来自针对相同表位的另一个抗体的三个CDR。示例性的杂合抗体包括(i)来自本发明的抗体的三个轻链CDR和来自针对相同表位的另一个抗体的三个重链CDR，或(ii)来自本发明的抗体的三个重链CDR和来自针对相同表位的另一个抗体的三个轻链CDR。
变体抗体也包括在本发明的范围内。因此，本申请中描述的序列的变体也包括在本发明的范围内。这样的变体包括免疫应答期间体内或无限增殖化B细胞克隆培养之后体外的体细胞突变产生的天然变体。可选地，变体可由于遗传密码的简并性而产生或可由于转录或翻译中的错误而产生。
具有提高的亲和力和/或能力的抗体序列的另外变体可利用本领域已知的方法获得并包括在本发明的范围内。例如，氨基酸取代可用于获得具有进一步提高的亲和力的抗体。可选地，核苷酸序列的密码子优化可用于提高用于抗体产生的表达系统中的翻译效率。另外，包括通过将定向进化方法应用于本发明的核酸序列中任一个而针对抗体特异性或中和活性优化的序列的多核苷酸也包括在本发明的范围内。
在一个实施方式中，变体抗体序列可与本申请中描述的序列共有70％或更多(即75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或更多)的氨基酸序列同一性。在一些实施方式中，这样的序列同一性相对于参考序列(即本申请中描述的序列)的全长来计算。在一些另外的实施方式中，本文所称作的百分比同一性利用NCBI(the National Center forBiotechnology Information；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)指定的缺省参数利用BLAST版本2.1.3来测定[Blosum 62矩阵；空隙开放罚分＝11和空隙延伸罚分＝1]。
另一方面，本发明还包括编码本发明的抗体的轻链和重链和CDR的部分或全部的核酸序列。本文提供编码示例性的本发明抗体的轻链和重链和CDR的部分或全部的核酸序列。表2提供编码本发明的抗体的一些实例的轻链和重链可变区的部分或全部的核酸序列的SEQ ID编号。表3提供编码示例性的本发明抗体的CDR的核酸序列的SEQ ID编号。由于遗传密码过多，编码相同氨基酸序列的这些核酸序列的变体将存在。
表3.中和RSV、MPV和PVM的抗体的CDR多核苷酸的SEQ ID编号。
在一个实施方式中，根据本发明的核酸序列包括与编码本发明的抗体的重链或轻链的核酸具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列。在另一个实施方式中，本发明的核酸序列具有编码本发明的抗体的重链或轻链CDR的核酸的序列。例如，根据本发明的核酸序列包括与SEQ ID NO：7-12、15、16、18、24-28、31-32、34、36、38、43-48、51-52、55-58或61-62的核酸序列至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的序列。
在再一个实施方式中，根据本发明的核酸序列包括与编码图24和25中所提供的本发明的抗体的重链或轻链的核酸具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列。
另外包括在本发明范围内的是载体，例如，表达载体，其包括根据本发明的核酸序列。用这样的载体转化的细胞也包括在本发明的范围内。这样的细胞的实例包括，但不限于，真核细胞，例如，酵母细胞、动物细胞或植物细胞。在一个实施方式中，细胞是哺乳动物细胞，例如，人、CHO、HEK293T、PER.C6、NS0、骨髓瘤或杂交瘤细胞。
本发明还涉及单克隆抗体，其与能结合本发明的抗体或抗原结合片段的表位结合。
单克隆和重组抗体特别用于鉴定和纯化它们所针对的个体多肽或其它抗原。本发明的抗体具有另外的效用，因为它们可用作免疫测定、放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)中的试剂。在这些应用中，抗体可用经分析可检测的试剂如放射性同位素、荧光分子或酶标记。抗体还可用于抗原的分子鉴定和表征(表位绘制)。
本发明的抗体可连接药物用于递送到治疗部位或连接可检测的标记以促进包括感兴趣的细胞如用RSV或MPV或RSV和MPV感染的细胞的部位的成像。连接抗体与药物与可检测的标记的方法在本领域众所周知，其是利用可检测的标记成像的方法。标记的抗体可用于利用许多种标记的许多种测定。本发明的抗体和感兴趣的表位(表位或RSV或MPV或二者)之间抗体-抗原复合体的形成的检测可通过连接可检测的物质与抗体来促进。合适的检测方法包括以下标记的使用，如放射性核素、酶、辅酶、荧光剂、化学发光剂(chemiluminescer)、色素原、酶底物或辅因子、酶抑制剂、辅基复合体、自由基、颗粒、染料等。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合体的实例包括链霉抗生物素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三吖嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的实例是鲁米诺；生物发光材料的实例包括萤光素酶、萤光素和水母荧光素；和合适的放射性物质的实例包括125I、131I、35S或3H。这样的标记的试剂可用于许多种熟知的测定，如放射免疫测定、酶免疫测定，例如，ELISA、荧光免疫测定等。(参见例如US 3,766,162；US 3,791,932；US 3,817,837；和US 4,233,402)。
根据本发明的抗体可与治疗部分如细胞毒素、治疗剂或放射性金属离子或放射性同位素缀合。放射性同位素的实例包括，但不限于，I-131、I-123、I-125、Y-90、Re-188、Re-186、At-211、Cu-67、Bi-212、Bi-213、Pd-109、Tc-99、In-111等。这样的抗体缀合物可用于改变给定的生物反应；药物部分不被解释为限于经典的化学治疗剂。例如，药物部分可以是具有期望的生物学活性的蛋白或多肽。这样的蛋白可包括，例如，毒素如相思豆毒蛋白、蓖麻蛋白A、假单胞菌外毒素或白喉毒素。
缀合这样的治疗部分与抗体的技术众所周知。参见，例如，MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy中的Arnon et al.(1985)“Monoclonal Antibodies forImmunotargeting of Drugs in Cancer Therapy”，编辑Reisfeld et al.(Alan R.Liss,Inc.),pp.243-256；Controlled Drug Delivery中编辑Hellstrom et al.(1987)“Antibodies for Drug Delivery”，编辑Robinson et al.(2d ed；Marcel Dekker,Inc.),pp.623-653；Monoclonal Antibodies'84:Biological and Clinical Applications中Thorpe(1985)"Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy:AReview"，编辑Pinchera et al.pp.475-506(Editrice Kurtis,Milano,Italy,1985)；Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy中“Analysis,Results,andFuture Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in CancerTherapy”，编辑Baldwin et al.(Academic Press,New York,1985),pp.303-316；和Thorpeet al.(1982)Immunol.Rev.62:119-158。
可选地，抗体或抗体其片段可缀合第二抗体或抗体其片段以形成如US 4,676,980中描述的抗体杂缀合物。此外，连接体可用于标记和本发明的抗体之间(例如，US 4,831,175)。抗体或其抗原结合片段可用放射性碘、铟、钇或本领域已知的其它放射性粒子直接标记(例如，US 5,595,721)。治疗可由同时或相继施用的治疗与缀合和非缀合的抗体组合组成(例如，WO00/52031；WO00/52473)。
本发明的抗体还可连接固体载体。另外，本发明的抗体或其功能抗体片段可通过共价缀合而被化学修饰成聚合物以，例如，增加它们的循环半衰期。聚合物和将它们与肽连接的方法的实例显示在US4,766,106；US4,179,337；US4,495,285和US4,609,546中。在一些实施方式中，聚合物可选自聚氧乙烯化多元醇和聚乙二醇(PEG)。PEG在室温溶于水和具有通式：R(O--CH2--CH2)n O—R，其中R可以是氢或保护基如烷基或链烷醇基。在一个实施方式中，保护基可具有1和8之间的碳。在进一步的实施方式中，保护基是甲基。符号n是正整数。在一个实施方式中，n在1和1,000之间。在另一个实施方式中，n在2和500之间。在一个实施方式中，PEG具有1,000和40,000之间的平均分子量。在进一步的实施方式中，PEG具有2,000和20,000之间的分子量。在再进一步的实施方式中，PEG具有3,000和12,000之间的分子量。在一个实施方式中，PEG具有至少一个羟基。在另一个实施方式中，PEG具有末端羟基。在再一个实施方式中，它是末端羟基，其被活化以与抑制剂上的游离氨基反应。然而，应当理解，反应基的类型和量可被改变以获得共价缀合的PEG/本发明的抗体。
水溶性聚氧乙烯化多元醇也用于本发明。它们包括聚氧乙烯化山梨糖醇、聚氧乙烯化葡萄糖、聚氧乙烯化甘油(POG)等。在一个实施方式中，利用POG。不被任何理论限制，因为聚氧乙烯化甘油的甘油主链是在例如动物和人中以单-、二-、三酸甘油酯天然存在的相同的主链，所以该分支将不必看做身体中的外来剂。在一些实施方式中，POG具有与PEG相同范围的分子量。可用于增加循环半衰期的另一个药物递送系统是脂质体。制备脂质体递送系统的方法为本领域技术人员所知。另一个药物递送系统在本领域已知和描述例如引用在Poznansky et al.(1980)和Poznansky(1984)中。
本发明的抗体可以以纯化的形式提供。通常，抗体将存在于组合物中，该组合物基本上没有其它多肽，例如，其中小于90％(按重量计)，通常小于60％和最通常小于50％的组合物由其它多肽组成。
本发明的抗体在非人(或异种)宿主中例如在小鼠中可以是免疫原性的。特别地，抗体具有在非人宿主而不在人宿主中是免疫原性的独特性。本发明的用于人使用的抗体包括不能从宿主如小鼠、山羊、兔子、大鼠、非灵长类哺乳动物等容易分离和通常不能通过人源化或从异种小鼠获得的那些抗体。
本发明的抗体可具有任何同种型(例如，IgA、IgG、IgM即α、γ或μ重链)，但通常将是IgG。在IgG同种型中，抗体可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚类。本发明的抗体可具有κ或λ轻链。
抗体的制备
根据本发明的抗体可通过本领域的任何已知方法制备。例如，用于利用杂交瘤技术制备单克隆抗体的通常的方法学众所周知(Kohler,G.和Milstein,C,.1975；Kozbar etal.1983)。在一个实施方式中，利用可选的在WO2004/076677中描述的EBV无限增殖化方法。
利用WO2004/076677中描述的方法，制备本发明的抗体的B细胞可以用EBV和多克隆B细胞活化剂转化。转化步骤期间细胞生长和分化的另外刺激剂可任选地加入以进一步提高效率。这些刺激剂可以是细胞因子如IL-2和IL-15。一方面，IL-2在无限增殖化步骤期间加入以进一步提高无限增殖化的效率，但其使用不是必需的。利用这些方法制备的无限增殖化B细胞然后可利用本领域已知的方法培养和从中分离抗体。
利用WO 2010/046775中描述的方法，浆细胞可以在微孔培养板中以有限数目或作为单个浆细胞而培养。抗体可从浆细胞培养物分离。另外，RNA可从浆细胞培养物提取和PCR可利用本领域已知的方法进行。抗体的VH和VL区可通过RT-PCR扩增、测序和克隆进表达载体，然后将表达载体转染进HEK293T细胞或其它宿主细胞。表达载体中核酸的克隆、宿主细胞的转染、转染的宿主细胞的培养和制备的抗体的分离可利用本领域技术人员已知的任何方法进行。
如需要，抗体可利用过滤、离心和多种层析方法如HPLC或亲和力层析被进一步纯化。抗体例如单克隆抗体纯化的技术——包括用于制备制药级抗体的技术——在本领域众所周知。
本发明的抗体片段可通过这样的方法获自抗体，所述方法包括用酶如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶和/或通过化学还原的二硫键分裂的消化。可选地，抗体片段可通过重链或轻链的部分序列的克隆和表达而获得。抗体“片段”包括Fab、Fab’、F(ab')2和Fv片段。本发明还包括源自本发明的抗体的重链和轻链的单链Fv片段(scFv)。例如，本发明包括scFv，其包括来自本发明的抗体的CDR。还包括重链或轻链单体和二聚体、单域重链抗体、单域轻链抗体，以及单链抗体，例如单链Fv，其中重链和轻链可变结构域通过肽连接体连接。
本发明的抗体片段可赋予单价或多价相互作用和包含在如上所述的许多种结构中。例如，scFv分子可被合成以产生三价的“三链抗体(triabody)”或四价的“四链抗体(tetrabody)”。scFv分子可包括导致二价微抗体的Fc区结构域。此外，本发明的序列可以是多特异分子的组分，其中本发明的序列靶向本发明的表位，而分子的其它区结合其它靶。示例性的分子包括，但不限于，双特异的Fab2、三特异的Fab3、双特异的scFv和双链抗体(Holliger和Hudson,2005,Nature Biotechnology 9：1126-1136)。
分子生物学的标准技术可用于制备编码本发明的抗体或抗体片段的DNA序列。期望的DNA序列可完全或部分利用寡核苷酸合成技术合成。适当的时候可利用定点诱变和聚合酶链反应(PCR)技术。
任何合适的宿主细胞/载体系统可用于表达编码本发明的抗体分子或其片段的DNA序列。可部分使用细菌，例如大肠杆菌(E.Coli)和其它微生物系统，用于抗体片段如Fab和F(ab’)2片段，并且尤其是Fv片段和单链抗体片段，例如单链Fvs的表达。真核生物，例如哺乳动物，宿主细胞表达系统可用于较大抗体分子包括完整抗体分子的制备。合适的哺乳动物宿主细胞包括，但不限于，CHO、HEK293T、PER.C6、NS0、骨髓瘤或杂交瘤细胞。
本发明还提供制备根据本发明的抗体分子的方法，包括在适合从编码本发明的抗体分子的DNA表达蛋白的条件下培养包括编码本发明的核酸的载体的宿主细胞，和分离抗体分子。
抗体分子可只包括重链或轻链多肽，在这种情况下，只有重链或轻链多肽编码序列需要用于转染宿主细胞。为了包括重链和轻链的产物的制备，细胞系可用两种载体转染，编码轻链多肽的第一载体和编码重链多肽的第二载体。可选地，可使用单个载体，所述载体包括编码轻链和重链多肽的序列。
可选地，根据本发明的抗体可通过如下制备：(i)在宿主细胞中表达根据本发明的核酸序列，和(ii)分离表达的抗体产物。另外，所述方法可包括(iii)纯化分离的抗体。
转化的B细胞和培养的浆细胞可针对产生期望的特异性或功能的抗体的那些细胞进行筛选。
筛选步骤可通过任何免疫测定，例如ELISA，通过组织或细胞(包括转染的细胞)的染色，通过中和试验或通过本领域已知的用于鉴定期望的特异性或功能的许多其它方法进行。测定可在一个或多个抗原的简单识别的基础上选择，或可在另外期望的功能的基础上选择，例如，选择中和抗体而不是仅仅抗原结合抗体，选择可改变靶细胞的特性，如它们的信号级联放大、它们的形状、它们的生长速率、它们影响其它细胞的能力、它们对其它细胞或其它试剂或条件改变影响的反应、它们的分化状态等的抗体。
个体转化的B细胞克隆然后可从阳性转化的B细胞培养物产生。用于将个体克隆从阳性细胞的混合物分离的克隆步骤可利用有限稀释、显微操作、通过细胞分选的单细胞沉积或本领域已知的另一种方法来进行。
来自培养的浆细胞的核酸可利用本领域已知的方法分离、克隆和在HEK293T细胞或其它已知的宿主细胞中表达。
本发明的无限增殖化B细胞克隆或转染的宿主细胞可以以多种方式使用，例如，作为单克隆抗体的来源，作为编码感兴趣的单克隆抗体的核酸(DNA或mRNA)的来源，用于研究等。
本发明提供组合物，其包括无限增殖化B记忆细胞或转染的宿主细胞，其产生中和RSV、MPV和PVM感染的抗体。
本发明的无限增殖化B细胞克隆或培养的浆细胞还可用作克隆用于随后重组表达的抗体基因的核酸来源。从重组来源的表达较从B细胞或杂交瘤的表达对于制药目的更常见，例如由于稳定性、再现性、培养容易等的原因。
因此，本发明提供制备重组细胞的方法，包括以下步骤：(i)从B细胞克隆或培养的浆细胞获得一种或多种编码感兴趣的抗体的核酸(例如，重链和/或轻链mRNAs)；(ii)将核酸插入表达载体和(iii)将载体转染进宿主细胞以便允许感兴趣的抗体在宿主细胞中表达。
相似地，本发明提供制备重组细胞的方法，包括以下步骤：(i)测序来自B细胞克隆或培养的浆细胞的编码感兴趣的抗体的核酸(一种或多种)；和(ii)利用来自步骤(i)的序列信息制备核酸(一种或多种)用于插入宿主细胞以便允许感兴趣的抗体在宿主细胞中表达。核酸可以，但不需要，在步骤(i)和(ii)之间被操作以引入限制位点，改变密码子使用和/或优化转录和/或翻译调节序列。
本发明还提供制备转染的宿主细胞的方法，包括用一种或多种编码感兴趣的抗体的核酸转染宿主细胞的步骤，其中所述核酸是源自本发明的无限增殖化B细胞克隆或培养的浆细胞的核酸。因此，首先制备核酸(一种或多种)和然后利用它转染宿主细胞的程序可在不同地方(例如，在不同国家)由不同的人在不同时间进行。
本发明的这些重组细胞然后可用于表达和培养目的。它们特别用于大规模制药生产的抗体表达。它们还可用作药物组合物的有效成分。可使用任何合适的培养技术，包括但不限于静置培养、滚瓶培养、腹水液体、中空纤维型生物反应器、模块化的微发酵罐、搅拌罐、微载体培养、陶瓷心灌注等。
获得和测序来自B细胞或浆细胞的免疫球蛋白基因的方法在本领域众所周知(例如，参见Chapter 4of Kuby Immunology,4th edition,2000)。
转染的宿主细胞可以是真核细胞，包括酵母和动物细胞，特别是哺乳动物细胞(例如，CHO细胞、NS0细胞、人细胞如PER.C6或HKB-11细胞、骨髓瘤细胞)，以及植物细胞。优选的表达宿主可以使本发明的抗体糖基化，特别地用在人中不是自身免疫原性的碳水化合物结构。在一个实施方式中，转染的宿主细胞可以能够在无血清培养基中生长。在进一步的实施方式中，转染的宿主细胞可以能够在培养物中生长而无需存在源自动物的产物。还可培养转染的宿主细胞以产生细胞系。
本发明还提供制备一种或多种编码感兴趣的抗体的核酸分子(例如，重链和轻链基因)的方法，包括以下步骤：(i)根据本发明制备无限增殖化B细胞克隆或培养浆细胞；(ii)从B细胞克隆或培养的浆细胞获得编码感兴趣的抗体的核酸。另外，本发明提供获得编码感兴趣的抗体的核酸序列的方法，包括以下步骤：(i)根据本发明制备无限增殖化B细胞克隆或培养浆细胞；(ii)测序来自B细胞克隆或培养的浆细胞的编码感兴趣的抗体的核酸。
本发明还提供制备编码感兴趣的抗体的核酸分子(或多种)的方法，包括获得获自本发明的转化的B细胞克隆或培养的浆细胞的核酸的步骤。因此，首先获得B细胞克隆或培养的浆细胞，然后从B细胞克隆或培养的浆细胞获得核酸(一种或多种)的程序可在不同地方(例如，在不同国家)由不同的人在不同时间进行。
本发明提供制备抗体(例如，用于制药用途)的方法，包括以下步骤：(i)获得和/或测序来自选择的表达感兴趣的抗体的B细胞克隆或培养的浆细胞的一种或多种核酸(例如，重链和轻链基因)；(ii)将核酸(一种或多种)插入表达载体或利用核酸(一种或多种)序列(一种或多个)制备表达载体；(iii)转染可表达感兴趣的抗体的宿主细胞；(iv)在感兴趣的抗体表达的条件下培养或传代培养转染的宿主细胞；和，任选地，(v)纯化感兴趣的抗体。
本发明还提供制备抗体的方法，包括以下步骤：在感兴趣的抗体表达的条件下培养或传代培养转染的宿主细胞群，和，任选地，纯化感兴趣的抗体，其中所述转染的宿主细胞群已通过如下制备：(i)提供编码由如上所述制备的B细胞克隆或培养的浆细胞产生的选择的感兴趣的抗体的核酸(或多种)，(ii)将核酸(一种或多种)插入表达载体，(iii)在可表达感兴趣的抗体的宿主细胞中转染载体和(iv)培养或传代培养转染的包括插入的核酸的宿主细胞以产生感兴趣的抗体。因此，首先制备重组宿主细胞和然后培养以表达抗体的程序可在不同地方(例如，在不同国家)由不同的人在不同时间进行。
表位
如上面所提到的，本发明的抗体可用于绘制它们所结合的表位。发明人已发现中和本发明的抗体涉及融合前而不是融合后F蛋白上发现的表位。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段结合RSV融合前F蛋白而不是RSV融合后F蛋白。在另一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段结合RSV和MPV的融合前F蛋白而不是融合后F蛋白。在再一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段结合RSV、MPV和PVM的融合前F蛋白而不是融合后F蛋白。
本发明的抗体结合的表位可以是线性(连续的)或构象的(不连续的)。在一个实施方式中，本发明的抗体和抗体片段结合构象表位。在另一个实施方式中，构象表位只存在于非还原条件下。不被任何理论束缚，本发明的抗体结合的构象表位依赖F蛋白上氨基酸残基之间二硫键的存在。
在另一个实施方式中，本发明的抗体结合的表位不同于RSV融合后F蛋白上所定义的抗原位点I、抗原位点II、抗原位点IV和MPV F蛋白上的相应位点。在再一个实施方式中，本发明的抗体和抗原结合片段不与帕利珠单抗、莫托维珠单抗、mAb 101F、mAb 131-2A或mAb D25交叉竞争结合RSV的F蛋白；也不与mAb 234交叉竞争结合MPV的F蛋白。
在另一个实施方式中，本发明的抗体结合的区域包括位于RSV F蛋白的N端部分的多肽，跨越残基SAVSKGYLSALRTGWYTSVIT(SEQ ID NO:63)。该多肽的核心部分由残基Y(x1)S(x2)LRTGW形成，其在RSV、MPV和PVM之间高度保守，并且其中在位置(x1)的氨基酸可以是，但不限于，L、F或K，并且其中在位置(x2)的氨基酸可以是，但不限于，A或V。本发明的抗体结合的多肽变体的实例包括，但不限于，YLSALRTGW(SEQ ID NO:64)、YLSVLRTGW(SEQ ID NO:65)、YFSALRTGW(SEQ ID NO:66)、YFSVLRTGW(SEQ ID NO:67)、YKSALRTGW(SEQ ID NO:68)和YKSVLRTGW(SEQ ID NO:69)。
结合本发明的抗体的多肽可具有许多用途。纯化或合成形式的多肽和其多肽变体可用于提高免疫应答(即，作为疫苗，或用于制备用于其它用途的抗体)或用于筛选针对与表位或其模拟表位(mimotopes)免疫反应的抗体的血清。在一个实施方式中，这样的多肽或多肽变体，或包括这样的多肽或多肽变体的抗原可用作提高免疫应答的疫苗，其包括与本发明中描述的那些抗体相同质量的抗体。本发明的抗体和抗体片段还可用于监测疫苗质量的方法中。特别地，抗体可用于检查疫苗中的抗原含有正确构象的正确免疫原性表位。本发明的抗体或其抗原结合片段用于监测针对RSV或MPV、或RSV和MPV的疫苗质量，例如检查所述疫苗的抗原含有正确构象的特异表位的应用也考虑在本发明的范围内。
结合本发明的抗体的多肽还可用于筛选结合所述多肽的配体。这样的配体，包括但不限于抗体；包括来自骆驼、鲨鱼和其它物种的那些抗体、抗体片段、肽、噬菌体展示技术产物、适配体、纤连蛋白(adnectins)或其它病毒或细胞蛋白的片段，可阻断表位和因此防止感染。这样的配体包括在本发明的范围内。
药物组合物
本发明提供包括以下中的一种或多种的药物组合物：本发明的抗体或抗体片段；编码这样的抗体或片段的核酸；编码核酸的载体；或本发明的抗体或抗原结合片段识别的多肽。药物组合物还可含有药学上可接受的载体或赋形剂。虽然载体或赋形剂可促进施用，但是它不应自身引起对接受组合物的个体有害的抗体的产生。它也不应是有毒的。合适的载体可以是大的、缓慢代谢的大分子如蛋白质、多肽、脂质体、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合的氨基酸、氨基酸共聚物和灭活的病毒颗粒。
可使用药学上可接受的盐，例如无机酸盐，如氢氯化物、氢溴化物、磷酸盐和硫酸盐或有机酸的盐，如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐和苯甲酸盐。
治疗组合物中药学上可接受的载体可另外含有液体如水、盐水、甘油和乙醇。另外，辅助物质如湿润或乳化剂或pH缓冲物质可存在于这样的组合物中。这样的载体使药物组合物能够配制为片剂、丸剂、锭剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆、膏剂和悬浮剂用于对象的摄入。
在本发明范围内的是以几种施用形式存在的组合物；所述形式包括但不限于，适合胃肠外施用的那些形式，例如，通过注射或输注，例如通过弹丸注射或连续输注。当产品用于注射或输注时，它可采取悬浮剂、溶液或油或水性载体中的乳剂形式，并且它可含有配制剂如悬浮剂、防腐剂、稳定剂和/或分散剂。可选地，抗体分子可以是干燥形式，使用前用适当的无菌液体重构。
一旦制备，本发明的组合物就可直接施用给对象。在一个实施方式中，使组合物适于施用给哺乳动物，例如人对象。
该发明的药物组合物可以通过任何数目的途径施用，包括但不限于经口、静脉内、肌肉内、动脉内、髓内、腹膜内、鞘内、心室内、经皮、透皮、局部、皮下、鼻内、肠、舌下、阴道内或直肠途径。阴道内也可用于施用本发明的药物组合物。通常，治疗组合物可被制备为注射物，作为液体溶液或悬浮液。还可制备适合注射之前液体载体中溶液或悬浮液的固体形式。
组合物的直接递送通常将通过皮下、腹膜内、静脉内或肌肉内注射而实现，或递送到组织的间质间隙。组合物还可被施用到病灶。剂量治疗可以是单剂量方案或多剂量方案。已知的基于抗体的药物提供涉及施用频率的指导，例如，是否药物应每天、每周、每月等递送。频率和剂量还可取决于症状的严重性。
本发明的组合物可以以多种形式制备。例如，组合物可被制备为注射物，作为液体溶液或悬浮液。还可制备适合注射之前液体载体中溶液或悬浮液的固体形式(例如，冻干的组合物，如SynagisTM和HerceptinTM，用于用含有防腐剂的无菌水重构)。组合物可被制备用于局部施用，例如，作为软膏、乳膏或粉末。组合物可被制备用于经口施用，例如，作为片剂或胶囊，作为喷雾剂或作为糖浆(任选地经调味)。组合物可被制备用于肺施用，例如，利用细粉或喷雾剂作为吸入器。组合物可被制备为栓剂或阴道栓剂。组合物可被制备用于鼻、耳或眼睛施用，例如，作为滴剂。组合物可以是试剂盒形式，这样设计以便组合的组合物刚好在施用给对象之前重构。例如，冻干的抗体可以以具有无菌水或无菌缓冲液的试剂盒的形式提供。
将理解组合物中的有效成分将是抗体分子、抗体片段或其变体和衍生物。照这样，它将易于在胃肠道降解。因此，如果组合物将通过利用胃肠道的途径施用，那么组合物将需要含有这样的剂，其保护抗体免于降解，但是一旦它已从胃肠道吸收，其就释放抗体。
药学上可接受的载体的充分讨论在Gennaro(2000)Remington:The Science andPractice of Pharmacy,20th edition,ISBN:0683306472中可获得。
本发明的药物组合物通常具有5.5和8.5之间的pH，在一些实施方式中这可以是6和8之间，并且在其它实施方式中约7。pH可通过施用缓冲液来保持。组合物可以是无菌和/或无热原的。组合物相对于人可以是等渗的。在一个实施方式中，本发明的药物组合物在密封容器中供应。
药物组合物将包括有效量的一种或多种本发明的抗体和/或包括结合本发明的抗体的表位多肽，即，足以治疗、改善、减弱或预防期望的疾病或状况或显示可检测的疗效的量。疗效还包括致病能力或身体症状的减少或减弱。任何特定对象的精确的有效量将取决于它们的大小、重量和健康、状况的性质和范围以及治疗法或针对施用选择的治疗法的组合。给定情形的有效量通过例行试验确定并在临床医生的判断内。为了本发明的目的，有效剂量将通常是将要施用的个体中本发明组合物的约0.01mg/kg至约50mg/kg，或约0.05mg/kg至约10mg/kg。已知的基于抗体的药物在这方面提供指导，例如，HerceptinTM通过21mg/ml溶液的静脉内输注来施用，具有4mg/kg体重的最初负荷剂量和2mg/kg体重的每周维持剂量；RituxanTM每周以375mg/m2施用；等。
在一个实施方式中，组合物可包括超过一种(例如，2、3等)本发明的抗体以提供累积或协同疗效。在另一个实施方式中，组合物可包括一种或多种(例如，2、3等)本发明的抗体和一种或多种(例如，2、3等)针对RSV、MPV、或RSV和MPV的额外抗体。另外，本发明的抗体与对病原体，例如A型流感或B型流感病毒特异的抗体的一起施用在本发明的范围内。本发明的抗体可以与对除RSV或MPV外的病原体特异的抗体组合/同时或在分开的时间施用。
在另一个实施方式中，本发明提供药物组合物，其包括两种或更多抗体，其中所述第一抗体是本文所描述的本发明的抗体，第二抗体对RSV、MPV、或RSV和MPV或药物组合物正在施用的已共同感染对象的不同病原体特异。
对RSV、MPV和PVM特异并中和RSV、MPV和PVM的本发明的抗体的实例包括但不限于，HMB3210变体3、HMB3210变体1、HMB3210变体2、HMB3210变体4、HMB3210变体5、HMB3210变体6、HMB2430变体1、HMB2430变体2、HMB2430变体3、HMB2430变体4或HMB2430变体5。
在一个实施方式中，本发明提供药物组合物，其包括抗体HMB3210变体1或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。在另一个实施方式中，本发明提供药物组合物，其包括抗体HMB3210变体2或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。在另一个实施方式中，本发明提供药物组合物，其包括抗体HMB3210变体3或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。在另一个实施方式中，本发明提供药物组合物，其包括抗体HMB3210变体4或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。在另一个实施方式中，本发明提供药物组合物，其包括抗体HMB3210变体5或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。在另一个实施方式中，本发明提供药物组合物，其包括抗体HMB3210变体6或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。
在再一个实施方式中，本发明提供药物组合物，其包括抗体HMB2430变体1或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。在另一个实施方式中，本发明提供药物组合物，其包括抗体HMB2430变体2或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。在另一个实施方式中，本发明提供药物组合物，其包括抗体HMB2430变体3或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。在另一个实施方式中，本发明提供药物组合物，其包括抗体HMB2430变体4或其抗原结合片段和学上可接受的载体。在另一个实施方式中，本发明提供药物组合物，其包括抗体HMB2430变体5或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。
本发明的抗体可与其它治疗法，例如与化学疗法化合物、与放射疗法等(组合或单独)施用。在一个实施方式中，治疗化合物包括抗病毒化合物如TamifluTM。这样的联合治疗相对于当单独施用时的个体治疗剂提供治疗效力的累积或协同提高。术语“协同”用于描述两种或更多活性剂的联合效果，其大于每种各自的活性剂的个体效果之和。因此，当两种或更多剂的联合效果导致活性或方法的“协同抑制”时，期望活性或方法的抑制大于每种各自的活性剂的抑制效果之和。术语“协同疗效”指两种或更多的治疗组合观察到的疗效，其中所述疗效(如通过许多参数中任何一个所测量的)大于各自的个体治疗观察到的个体疗效之和。
抗体可施用给先前已显示没有反应，即，已显示对RSV或MPV感染的治疗难治的那些对象。这样的治疗可包括先前的用抗病毒剂的治疗。这可由于，例如具有RSV、MPV、或RSV和MPV的抗病毒抗性株的感染。
在一个实施方式中，本发明的组合物可包括本发明的抗体，其中所述抗体可占组合物中总蛋白按重量计至少50％(例如，60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或更多)。在这样的组合物中，抗体处于纯化的形式。
本发明提供制备药物组合物的方法，包括以下步骤：(i)制备本发明的抗体；和(ii)将纯化的抗体与一种或多种药学上可接受的载体混合。
在另一个实施方式中，制备药物组合物的方法包括以下步骤：混合抗体与一种或多种药学上可接受的载体，其中所述抗体是单克隆抗体，其获自本发明的转化的B细胞或培养的浆细胞。因此，首先获得单克隆抗体和然后制备药物的程序可在不同地方(例如，在不同国家)由不同的人在不同时间进行。
作为递送抗体或B细胞用于治疗目的的替代物，可能将编码来自B细胞或培养的浆细胞的感兴趣的单克隆抗体(或其活性片段)的核酸(通常DNA)递送给对象，以便核酸可在对象中原位表达以提供期望的疗效。合适的基因疗法和核酸递送载体在本领域已知。
本发明的组合物可以是免疫原性组合物，并且在一些实施方式中可以是疫苗组合物，其包括包含本发明的抗体或其抗原结合片段识别的表位的抗原。根据本发明的疫苗可以是预防的(即，预防感染)或治疗的(即，治疗或改善感染)。
组合物可包括抗微生物剂，特别地如果以多剂量形式包装。它们可包括洗涤剂例如，Tween(聚山梨酯)，如Tween 80。洗涤剂通常以低水平例如，小于0.01％存在。组合物还可包括钠盐(例如，氯化钠)以提供张力。10±2mg/ml NaCl的浓度是通常的。
另外，组合物可包括糖醇(例如，甘露醇)或二糖(例如，蔗糖或海藻糖)，例如在15-30mg/ml左右(例如，25mg/ml)，特别地如果它们将被冻干或如果它们包括已从冻干的物质重构的物质。在冷冻干燥之前，可将用于冷冻干燥的组合物的pH调节到5和8之间或5.5和7之间或6.1左右。
本发明的组合物还可包括一种或多种免疫调节剂。在一个实施方式中，免疫调节剂中的一种或多种包括佐剂。
本发明的表位组合物可引起细胞介导的免疫应答以及体液免疫应答以有效地解决RSV和MPV感染。该免疫应答可引起长期持续的(例如，中和)抗体和细胞介导的免疫，其可在暴露于RSV或MPV、或RSV和MPV之后迅速应答。
医学治疗和应用
本发明的抗体和抗体片段或其衍生物和变体可用于RSV或MPV感染或RSV和MPV共感染的治疗；用于RSV或MPV、或RSV和MPV感染的预防；或用于RSV或MPV感染的诊断。
诊断方法可包括使抗体或抗体片段与样品接触。这样的样品可以是取自例如鼻道、窦腔、唾液腺、肺、肝、胰、肾、耳、眼、胎盘、消化道、心脏、卵巢、垂体、消化道、甲状腺、脑或皮肤的组织样品。诊断方法还可包括抗原/抗体复合体的检测。
本发明因此提供(i)根据本发明的抗体、抗体片段或其变体和衍生物，(ii)根据本发明的无限增殖化B细胞克隆，(iii)能结合本发明的抗体的表位或(iv)配体，优选抗体，其能结合表位用于治疗，所述表位结合本发明的抗体。
本发明还提供治疗对象的方法，包括给对象施用根据本发明的抗体、抗体片段或其变体和衍生物，或配体，优选抗体，其能结合表位，所述表位结合本发明的抗体。在一个实施方式中，该方法导致对象中减少的RSV或MPV感染。在另一个实施方式中，该方法预防对象中RSV或MPV感染、减少对象中RSV或MPV感染的风险或延迟对象中RSV或MPV感染。
本发明还提供以下的应用：(i)根据本发明的抗体、抗体片段或其变体和衍生物，(ii)根据本发明的无限增殖化B细胞克隆，(iii)能结合本发明的抗体的表位，(iv)配体，优选抗体，其能结合表位用于治疗，所述表位结合本发明的抗体，或(v)本发明的药物组合物在以下中的应用：(i)制备用于治疗或减弱RSV或MPV、或RSV和MPV引起的感染的药物、(ii)疫苗或(iii)RSV和MPV感染的诊断。
本发明提供本发明的组合物，用作RSV或MPV感染的预防或治疗的药物。它还提供本发明的抗体和/或包括该抗体结合的表位的蛋白在制备用于对象治疗和/或对象中诊断的药物中的应用。它还提供治疗对象的方法，包括给对象施用本发明的组合物的步骤。在一些实施方式中，对象可以是人。检查治疗性治疗效力的一种方法包括在本发明的组合物施用之后监测疾病症状。治疗可以是单剂量方案或多剂量方案。
在一个实施方式中，将根据本发明的抗体、抗体片段、无限增殖化B细胞克隆、表位或组合物施用给需要这样的治疗的对象。这样的对象包括但不限于，特别地濒临RSV或MPV感染的危险或对RSV或MPV感染易感的人，包括，例如免疫受损的对象。本发明的抗体或抗体片段还可用于被动免疫或主动疫苗接种。
本发明中描述的抗体和其片段还可用于RSV或MPV感染诊断的试剂盒。另外，能结合本发明的抗体的表位可用于试剂盒，用于通过检测保护性的抗RSV或抗MPV抗体的存在而监测疫苗接种程序的效力。本发明中描述的抗体、抗体片段或其变体和衍生物还可用于试剂盒，用于监测具有期望的免疫原性的疫苗制造。
本发明还提供特异地结合本发明的抗体或其抗原结合片段的表位，用：(i)在治疗中，(ii)在制备用于治疗或减弱RSV或MPV、或RSV和MPV感染的药物中，(iii)作疫苗或(iv)在筛选能中和RSV或MPV、或RSV和MPV感染的配体中。
本发明还提供制备药物的方法，包括混合单克隆抗体与一种或多种药学上可接受的载体的步骤，其中所述单克隆抗体是获自本发明的转染的宿主细胞的单克隆抗体。因此，首先获得单克隆抗体(例如，表达它和/或纯化它)和然后将它与药物载体(一种或多种)混合的程序可在不同地方(例如，在不同国家)由不同的人在不同时间进行。
从本发明的转化的B细胞或培养的浆细胞开始，可进行培养、传代培养、克隆、亚克隆、测序、核酸制备等多种步骤以使转化的B细胞或培养的浆细胞表达的抗体永存，在每个步骤具有任选的优化。在一个实施方式中，上述方法进一步包括应用于编码抗体的核酸的优化(例如，亲和力成熟或优化)技术。本发明包括这样的步骤期间使用和制备的所有细胞、核酸、载体、序列、抗体等。
在所有这些方法中，用于表达宿主的核酸可被操作以插入、缺失或改变某个核酸序列。这样的操作的改变包括但不限于，引入限制位点的改变以修改密码子使用，加入或优化转录和/或翻译调节序列等。它还可能改变核酸以改变编码的氨基酸。例如，它可用于引入一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等)氨基酸取代、缺失和/或插入进抗体的氨基酸序列。这样的点突变可修改效应子功能、抗原结合亲和力、翻译后修饰、免疫原性等，可引入氨基酸用于共价基团(例如，标记)的连接或可引入标签(例如，用于纯化目的)。突变可在特异位点引入或可随机引入，之后是选择(例如，分子进化)。例如，一个或多个编码本发明的抗体的CDR区、重链可变区或轻链可变区中任何一个的核酸可被随机或定向突变以在编码的氨基酸中引入不同性质。这样的改变可导致反复的过程，其中最初的改变被保留，在其它核苷酸位置的新的改变被引入。另外，可组合独立的步骤中获得的改变。引入到编码的氨基酸中的不同性质可包括但不限于提高的亲和力。
一般原则
如本文所用，术语“抗原结合片段”、“片段”和“抗体片段”可互换地使用以指保留抗体的抗原结合活性的本发明的抗体的任何片段。抗体片段的实例包括但不限于，单链抗体、Fab、Fab’、F(ab')2、Fv或scFv。另外，如本文所用，术语“抗体”包括抗体和其抗原结合片段。
如本文所用，“中和抗体”是这样的抗体，其可中和，即，防止、抑制、减少、阻碍或干扰病原体在宿主中启动和/或保存感染的能力。术语“中和抗体”和“中和……的抗体”在本文可互换地使用。这些抗体在适当的形成之后可单独或组合地用作预防或治疗剂，连同主动的疫苗接种，用作诊断工具或用作生产工具，如本文所描述的。
术语“包括(comprising)”包括“包括(including)”以及“由……组成”，例如，“包括”X的组合物唯一地由X组成或可包括另外的某物，例如，X+Y。
词语“基本上”不排除“全部”，例如，“基本上无”Y的组合物可完全没有Y。需要时，词语“基本上”可从本发明的定义中省略。
与数值x有关的术语“约”指，例如，x±5％，或x±7％，或x±10％，或x±12％，或x±15％，或x±20％。
如本文所用，术语“疾病”意欲与术语“病症”和“状况”(如在医学条件中)通常是同义的并可互换地使用——因为所有都反映人或动物体或损害正常功能的部分之一的异常状态，通常通过区分体征和症状来证明，并引起人或动物具有减少的持续时间或生活质量。
如本文所用，提到对象或患者的“治疗”意欲包括防止、预防、减弱、改善和治疗。术语“对象”或“患者”在本文可互换地使用以指包括人在内的所有哺乳动物。对象的实例包括人、牛、狗、猫、马、山羊、绵羊、猪和兔。在一个实施方式中，患者是人。
实施例
示例性的本发明的实施方式在以下实施例中提供。以下实施例只是通过说明的方式呈现和辅助普通技术人员利用本发明。实施例不意欲以任何方式另外限制本发明的范围。
实施例1.来自人记忆B细胞能交叉中和RSV和MPV的单克隆抗体的分离和表征
我们从125个血液供体的组群中选择7个供体，其显示针对RSV和MPV的高血清抗体滴度。CD22+IgG+B细胞从冷藏保存的外周血单核细胞(PBMCs)分选并利用爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)和CpG寡脱氧核苷酸2006和辐照的同种异体的PBMCs作为饲养细胞以3至5个细胞/孔而无限增殖化。14天之后收获培养物上清液并基于RSV株A2引起的Hep-2细胞或MPV A1I-PV-03/01-6621株引起的LLC-MK2细胞的感染，利用微中和测定分析中和抗体的存在。在分别加入温育6或8天的Hep-2或LLC-MK2靶细胞之前，将纯净的上清液与50-100TCID50的病毒在室温温育1小时。然后存活的细胞通过向培养物加入WST-1试剂(Roche)持续3至4个小时而用分光光度计检测。
从三个独立的实验分离中和MPV的36个单克隆抗体(mAbs)(图1，上图)；和从五个独立的实验分离中和RSV的136个mAbs(图1，下图)。然后进行二次筛选以测试分离的mAbs是否能中和MPV和RSV。利用该策略，发现从同一供体(供体5)分离的两个mAb交叉中和RSV和MPV：(i)HMB2430，其最初基于RSV的中和而被选择，和(ii)HMB3210，其最初基于MPV的中和而被选择。
将HMB2430和HMB3210的VH和VL基因克隆进IgG1表达载体，并且重组mAb通过293Freestyle细胞(293F)的瞬时转染而产生。来自转染的细胞的上清液在培养10天之后收集，IgG通过蛋白A层析亲和纯化。根据利用IMGT数据库进行的同源性分析，两个mAbs共有大部分V和J基因片段(IGHV3-21*01、IGHJ4*02、IGLV1-40*01和IGLJ1*01)，但是在IGHD用法的N区(分别针对HMB2430和HMB3210的D3-10*01和D5-24*01)和在体细胞突变的模式中不同，因此认为不是同种细胞相关的。
HMB2430和HMB3210的半数最大抑制浓度(IC50)利用上面描述的微中和测定用100组织培养感染剂量50(TCID50)的病毒来测定。IC50值通过用具有可变的斜率的4参数非线性回归拟合的中和曲线的内插来计算。分析结果显示在图2和表4中。
表4.
实施例2.针对所有RSV和MPV群和亚群的反应性宽度
为了评价HMB2430和HMB3210的反应性宽度，利用以下RSV和MPV株，通过FACS测试纯化的mAb与Hep-2 RSV感染的细胞或LLC-MK2 MPV感染的细胞结合：RSV A2(A，1961澳大利亚；A/A2/61)、RSV Long(A，美国马里兰州，1956；A/Long/56)、RSV Randall(A，美国芝加哥，1958；A/Randall/58)、RSV 9320(B，美国马萨诸塞州，1977；B/9320/77)、WV/14617/85(B，西弗吉尼亚亨廷顿，1985；B/14617/85)、18537(B，美国哥伦比亚华盛顿区，1962；B/18537/62)、MPV I-PV-03/01-6621(A1,意大利帕维亚,2001；A1/6621/01)、MPV I-PV-02/06-8938(A2,意大利帕维亚,2006；A2/8938/06)、I-PV-03/04-4702(B1,意大利帕维亚,2004；B1/4702/04)和I-PV-02/04-3817(B2,意大利帕维亚,2004；B2/3817/04)。平行地，测试三个先前描述的mAb：(i)莫托维珠单抗，RSV特异的；(ii)mAb 234，MPV特异的；和(iii)FO32，A型流感-特异的(用作阴性对照)。以10μg/ml测试所有的mAb与感染或未感染的细胞的结合。HMB2430和HMB3210与测试的所有6个RSV和所有4个MPV株——代表已知的RSV和MPV群和亚群——反应(表5)反应。相比之下，莫托维珠单抗与所有测试的6个RSV菌株反应，但不与测试的4个MPV菌株中任何一个反应。相反，234mAb与所有测试的4个MPV菌株反应，但是不与测试的6个RSV菌株中任何一个反应。
表5.RSV或MPV的不同菌株，FO32(阴性对照)、莫托维珠单抗、234、HMB2430和HMB3210分别感染的Hep-2或LLC-MK2细胞的染色，如流式细胞术所测量的。
(–)<5％染色的细胞
(+)>50％染色的细胞
实施例3.通过ELISA和通过转染的细胞染色的RSV和MPV重组F蛋白的结合
为了鉴定RSV和MPV病毒上HMB2430和HMB3210识别的靶抗原，与莫托维珠单抗和mAb 234平行，我们分析了两个mAb与RSV(A2株)的同源三聚的可溶的F蛋白——从瞬时转染的293F细胞产生——结合的能力。如图3所示，通过ELISA，HMB2430和HMB3210与RSV F蛋白特异地反应，如与莫托维珠单抗相比，显示不同的结合属性(profile)。此外，HM2430和HMB3210细胞内染色用编码来自RSV(A2株)或MPV(NL/1/99B1株)的全长F蛋白的哺乳动物表达载体瞬时转染的293F细胞(表6)，指示HMB2430和HMB3210识别存在于RSV和MPV F蛋白上的共有表位。考虑到RSV和MPV F蛋白只具有33-35％的氨基酸序列同一性，该发现特别引入注目。如期望的，帕利珠单抗和莫托维珠单抗结合表达RSV F蛋白的细胞，而不结合表达MPVF蛋白的那些细胞(表6)。相反，234mAb结合表达MPV F蛋白的细胞，而不结合表达RSV F蛋白的细胞(表6)。
表6.未转染的293F细胞或用RSV或MPV F蛋白转染的293F细胞的染色，如通过流式细胞术所测量的
(–)<5％染色的细胞
(+)>50％染色的细胞
实施例4.利用抑制结合试验对RSV感染的细胞进行表位绘制
为了获得HMB2430和HMB3210识别的F蛋白表位，我们利用以RSV A2株感染的Hep-2细胞建立了抑制结合试验。购买或通过基因合成产生以下RSV F蛋白-特异mAb的组：(i)莫托维珠单抗，对抗原位点II特异；(ii)101F，对抗原位点IV特异；(iii)不确定特异性的D25；(iv)131-2a，对抗原位点I特异。将mAb用生物素标记并测试与Hep-2感染的细胞的结合以确定达到70-80％最大结合需要的mAb的最佳浓度。然后将生物素标记的mAb用作探针以评价是否它们的结合(利用荧光基团结合的链霉抗生物素测量的)由于RSV A2感染的细胞与50倍过量的同源或异源的未标记的mAb预温育而被抑制。如所期望的，生物素标记的HMB2430的结合通过预温育细胞与未标记的HMB2430而阻断，但是它还通过未标记的HMB3210而部分阻断(图4)。相比之下，测试的所有其它生物素标记的mAb的结合没有通过HMB2430或HMB3210的预温育而阻止(图4)。将这些结果汇总，指示HMB2430和HMB3210识别RSV和MPV中共有的F蛋白上部分重叠的表位，这些表位不同于F蛋白抗原位点II(莫托维珠单抗和帕利珠单抗识别的)、抗原位点IV(mAb 101F识别的)和抗原位点I(mAb 131-2A识别的)中的表位。此外，mAb HMB2430和HMB3210识别的RSV F蛋白上的表位不同于mAb D25识别的未知表位。
实施例5.在还原和非还原条件下单克隆抗体与RSV和MPV F蛋白的反应性
为了进一步证实HMB2430和HMB3210识别RSV和MPV的F蛋白这一发现，我们测试了两个mAb在蛋白质印迹中染色RSV和MPV F蛋白的能力。将Hep-2细胞用RSV感染，LLC-MK2细胞用MPV感染，用温和的洗涤剂溶解并还原或非还原条件下在SDS-PAGE凝胶上跑胶。然后将蛋白转移到PVDF膜上，然后将该膜与HMB2430、HMB3210、莫托维珠单抗或234mAb温育。MAb结合用抗人HRP缀合的抗体联合ECL蛋白质印迹检测试剂来检测。在非还原条件下，HMB2430和HMB3210结合源自RSV感染的细胞(图5)和MPV感染的细胞的F蛋白(图6)。在非还原条件下，MPV-特异的mAb 234(其识别MPV F蛋白上的表位，其对应RSV F蛋白上的抗原位点II)结合MPV F蛋白，但不结合RSV F蛋白。相比之下，在还原和非还原条件下，RSV-特异的mAb莫托维珠单抗均结合RSV F蛋白，这证实主要是线性表位的识别。这些结果提示与莫托维珠单抗和帕利珠单抗不同，HMB2430和HMB3210识别构象表位，其也依赖RSV和MPV F蛋白上氨基酸残基之间二硫键的存在。
实施例6.HMB2430和HMB3210中和所有RSV和MPV群和亚群
测试纯化的HMB2430和HMB3210mAb分别中和Hep-2或LLC-MK2细胞的RSV或MPV感染的能力。测试以下RSV和MPV株：RSV A2(A，1961澳大利亚；A/A2/61)、RSV Long(A，美国马里兰州，1956；A/Long/56)、RSV Randall(A，美国芝加哥，1958；A/Randall/58)、RSV 9320(B，美国马萨诸塞州，1977；B/9320/77)、WV/14617/85(B，西弗吉尼亚亨廷顿，1985；B/14617/85)、18537(B，美国哥伦比亚华盛顿区，1962；B/18537/62)、RSV 9727/2009(B,意大利帕维亚,2009；B/9727/09)、RSV 9736/2009(B,意大利帕维亚,2009；B/9736/09)、RSV 9847/2009(B,意大利帕维亚,2009；B/9847/09)、MPV I-PV-03/01-6621(A1,意大利帕维亚,2001；A1/6621/01)、MPV I-PV-02/06-8938(A2,意大利帕维亚,2006；A2/8938/06)、I-PV-02/06-8908(A2,意大利帕维亚,2006；A2/8908/06)、I-PV-02/06-8909(A2,意大利帕维亚,2006；A2/8909/06)、I-PV-03/04-4702(B1,意大利帕维亚,2004；B1/4702/04)和I-PV-02/04-3817(B2,意大利帕维亚,2004；B2/3817/04)。
在相同的实验中，比较HMB2430和HMB3210与帕利珠单抗(RSV特异的)和234mAb(MPV特异的)。HMB3210中和所测试的所有11个RSV和所有6MPV株——其代表已知的RSV和MPV群和亚群(表7)。HMB2430中和所测试的所有11个RSV株和测试的所有A1和A2MPV株，而不中和所测试的B1或B2MPV株。如所期望的，帕利珠单抗中和所测试的所有11个RSV株，而不中和所测试的6个MPV株，而234mAb中和所测试的所有6个MPV株，而不中和所测试的11个RSV株。
HMB3210和HMB2430有效地中和所测试的所有11个RSV株(平均IC50值分别是0.070和0.133μg/ml。该值高于帕利珠单抗的IC50值(0.284μg/ml)平均5.4和2.6倍。HMB3210有效地中和所测试的所有6个MPV株(IC50平均值0.113μg/ml)，其低于234的IC50值(0.046μg/ml)平均1.7倍。
表7.RSV和MPV菌株的中和
实施例7.缺少RSV和MPV病毒逃逸突变体的选择。
测试HMB3210、帕利珠单抗和234mAb体外选择RSV或MPV单克隆抗体抗性突变体(MARMs)的能力。尽管有几次尝试，但是当针对32×10e6RSV A/Long/58TCID50和针对16×10e6MPV A1/6621/01TCID50测试时，HMB3210没有选择任何RSV或MPV MARMs。相比之下，帕利珠单抗以高频率选择MARMs(总共85个独立的帕利珠单抗MARMs分离自16×10e6RSV A/Long/58TCID50的输入，其对应185,000个TCID50中1个的频率)。MAb 234在相同的实验条件下没有选择任何MPV MARMs。分离234mAb MARMs的困难与Ulbrandt et al.(J GeneralVirol 2008)的报道一致，其显示需要高水平的病毒来分离少量的MARMs。利用NL/1/99MPVB1隔离群将逃逸的病毒绘制成突变K242N。收集独立的帕利珠单抗MARMs(PZ-MARMs)，对它们中10个的F蛋白全部测序(表8)。PZ-MARM2、PZ-MARM3、PZ-MARM4、PZ-MARM5、PZ-MARM6、PZ-MARM8和PZ-MARM10共有相同的两个氨基酸突变(P101S/K272T)；PZ-MARM1也在相同位置具有两个氨基酸突变，但是具有不同的氨基酸改变(P101S/K272Q)；PZ-MARM7又在位置272具有单个氨基酸突变(K272N)；最后，PZ-MARM9具有与其它PZ-MARMs共同的突变和在位置262的独特突变(P101S/N262Y)。该区(核苷酸位置827和828)中的点突变已经被描述(Zhao etal.Virology 2004)和导致在位置272的两个不同的氨基酸改变(K272Q和K272M)。第一突变(即K272Q)还存在于本文描述的PZ-MARM1中。带有这些点突变的病毒完全抵抗棉鼠中帕利珠单抗的预防效应(Zhao et al.Virology 2004)和相同的突变连同其它的在用帕利珠单抗预防处理的RSV感染的免疫抑制的棉鼠中被描述。
然后测试HMB3210、HMB2430和帕利珠单抗中和Hep-2细胞的PZ-MARM6感染的能力。虽然帕利珠单抗不中和PZ-MARM6，但是HMB3210和HMB2430有效地将该病毒中和到与相应的野生型病毒中观察到的那些水平相当的水平(图7)。
合起来，这些结果证明HMB3210和HMB2430没有体外选择RSV或MPV MARMs。这些结果与以下想法一致：HMB3210和HMB2430识别的靶表位是非常保守的，并且废除抗体结合的突变非常罕见或可与病毒适合度的丧失相关。
表8.用帕利珠单抗选择的RSV MARMs中的氨基酸变化
实施例8.LCDR3中糖基化位点的去除不影响HMB3210的活性。
HMB3210可变的轻链在LCDR3中在位置113(IMGT编号)具有N-糖基化基序(NxS/T，其中x可以是除脯氨酸外的任何氨基酸)。在位置113的天冬酰胺(N113)替换种系序列中存在的丝氨酸。可变区中糖基化基序的存在可对抗体活性具有积极或消极影响并被认为是抗体异质性的原因。HMB3210的轻链上聚糖的存在在存在或缺少N-糖苷酶PNG-ase F的情况下温育之后在还原SDS-PAGE凝胶上来评价(图8)。该分析指出少数轻链的确被糖基化。然后去除N113残基和恢复相应的种系编码的丝氨酸残基。平行地，轻链的框架–1区中另一个体细胞突变(P7T)也被去除以恢复在位置7(在相应的IGLV1–40*02基因中的IMGT编号)的种系编码的脯氨酸残基。然后产生HMB3210重链VH.2(SEQ ID 17)和HMB3210轻链VL.3制备的新的HMB3210变体(命名为HMB3210v3)，并用HMB3210v2(由HMB3210重链VH.2(SEQ ID NO:17制备)和轻链VLSEQ ID NO:14)平行测试其针对RSV A2和MPV I-PV 03/01-6621菌株的中和活性。该变体(HMB3210v3)显示针对测试的RSV和MPV株稍微提高的中和(图9)，因此显示轻链糖基化位点的去除不影响与RSV和MPV靶表位的结合。然后针对一组RVS和MPV病毒平行测试两个抗体变体，显示具有针对所测试的所有病毒相当的活性(图10)。总之，HMB3210v3在可变的轻链中未被糖基化并且与只具有重链中下列8个氨基酸体细胞突变和轻链中下列4个氨基酸体细胞突变的种系重链和轻链基因相比：S58A(HCDR2)、I65S(HCDR2)、Y66D(HFR3)、V71A(HFR3)、N85T(HFR3)、Y88F(HFR3)、V101I(HFR3)、Y103F(HFR3)、G56D(LCDR2)、S65N(LCDR2)、G78A(LFR3)和S109R(LCDR3)(根据IMGT编号来指示所有位置)，全部不良地突变(overall poorly mutated)。
实施例9.HMB3210和HMB2430与MPV的交叉反应性依赖体细胞突变。
为了获知HMB2430和HMB3210针对RSV和MPV的交叉反应性中体细胞突变的作用，合成两种mAb的种系化版本并测试它们中和RSV A2和MPV I-PV 03/01-6621菌株的能力。HMB2430和HMB3210种系化的mAbs(分别时HMB2430-GL和HMB3210-GL)在HMB2430-GL的情况中由VH.3和VL.2制成，在HMB3210-GL的情况中由VH.3和VL.4制成。mAb的两种种系化形式有效地将RSV中和到与最初体细胞突变的HMB3210和HMB2430中观察到的那些水平相当的水平(图11)。然而，HMB3210-GL和HMB2430-GL没有中和MPV，因此指示体细胞突变对MPV中和必不可少。为了进一步了解是否重链或轻链的体细胞突变均是MPV中和的原因，我们产生了带有种系结构中的重链或轻链的抗体：由VH.3和VL制备的HMB2430-VHGL-VLSM；由VH.2和VL.2制备的HMB2430-VHSM-VLGL；由VH.3和VL制备的HMB3210-VHGL-VLSM；由VH.2和VL.4制备的HMB3210-VHSM-VLGL。HMB3210重链中体细胞突变的去除没有影响RSV或MPV病毒的中和，而HMB2430重链中体细胞突变的去除影响MPV的中和，虽然保持RSV的中和。HMB2430和HMB3210轻链中体细胞突变的去除消除MPV中和，而不影响RSV中和(图11)。合起来，这些发现指示HMB3210和HMB2430最初由RSV选择，随后通过体细胞突变、针对MPV的交叉反应性的累积而发展。总体上，轻链CDR中只有3个体细胞突变解释了RSV-特异的种系化的抗体中MPV交叉反应性的获得。注意，HMB2430和HMB3210(不是同种细胞相关的)共有LCDR3中位置109S到R的相同体细胞突变。
实施例10.融合前和融合后F蛋白构象的HMB3210识别
将具有C端组氨酸标签的编码RSV F残基26–136和147–512(对应F胞外域，而没有RSV株A2的融合肽)的DNA构建体进行密码子优化并合成。利用杆状病毒表达载体在Sf21细胞中表达重组F并通过镍亲和和尺寸排阻层析(SEC)将其从上清液纯化。其他人(Swansonet al.PNAS 2011和McLellan et al.J Virol 2011)已经利用相似的构建体来解决融合后F蛋白的晶体结构。蛋白在非还原条件下在SDS-PAGE凝胶上进行分析和给出在≈65-70kDa的带，并且当通过SEC在S200柱上分析时，“融合后”RSV F蛋白作为对称的峰被洗脱，具有≈150kDa的表观分子量，其对应三聚的F蛋白的MW并与人IgG1抗体的洗脱体积重叠。“融合后”F蛋白与HMB3210或帕利珠单抗温育，并将两种混合物在S200柱上跑柱。与单独的F蛋白相比，“融合后”F蛋白与帕利珠单抗的温育将洗脱峰转变成较低的洗脱体积(对应≈300kDa的表观MW)，指示帕利珠单抗结合“融合后”F蛋白，如已经报道的。注意，HMB3210与“融合后”F蛋白的温育没有导致洗脱体积的移位(图12)。HMB3210和“融合后”F蛋白作为独立的分子洗脱的事实指示HMB3210，不像帕利珠单抗，不结合“融合后”F蛋白。
然后全长融合前RSV F蛋白的稳定形式根据Magro et al.PNAS 2012采用的策略通过用半胱氨酸替代4个氨基酸残基(L481、D489、S509和D510)和通过用N残基替代在两个F蛋白切割位点的9个碱性氨基酸残基(R106、R108、R109、K131、K132、R133、K134、R135和R136)来除去furine切割位点而合成。F蛋白序列通过在跨膜区之后插入TEV切割位点，之后插入GFP和在C-端的6-His标签以促进纯化而被另外修饰。根据PIV-5融合前F结构，4个引入的半胱氨酸以这样的方式被定位：单体间二硫键的形成只是当蛋白处于融合前构象中时才是可能的，但是当再折叠成融合后结构时是不可能的，因此赋予融合前F蛋白的稳定。稳定的融合前F蛋白被Magro et al.描述为异种的，因为它还含有一定比例的分子，其中另外的半胱氨酸残基没有二硫键化。这里描述的F蛋白构建体利用杆状病毒表达载体在Sf21细胞中产生，用温和的洗涤剂从细胞膜溶解和通过镍亲和和尺寸排阻层析纯化。纯化的融合前F蛋白在S200柱上通过SEC分析，并作为对称的峰洗脱，具有≈150kDa的表观分子量，其对应三聚的F蛋白的MW并且其与人IgG1抗体的洗脱体积重叠。与F蛋白单独相比，融合前F蛋白与帕利珠单抗的温育将洗脱峰转变成较低的洗脱体积(对应≈300kDa的表观MW)，并且还诱导形成高分子量复合体，其在柱的无效体积中洗脱，这可能与较大聚集体的形成有关。当HMB3210v2与融合蛋白温育时，也观察到洗脱体积的相似改变(图13)。这些结果指示帕利珠单抗结合F蛋白的融合前和融合后形式，而HMB3210选择性地识别F蛋白的融合前形式。两种F蛋白(融合前和融合后形式)还通过表面等离子体共振(SPR)来测试。帕利珠单抗以相似的亲和力结合融合前和融合后蛋白，而HMB3210v3以高亲和力选择性地结合融合前F蛋白(与帕利珠单抗2nM的Kd相比，为0.1nM的Kd常数)(图14)。
实施例11.HMB3210v3交叉中和两种动物副粘病毒牛呼吸道合胞病毒(BRSV)和小鼠肺炎病毒(PVM)
HMB3210的反应性宽度还在两种其它动物副粘病毒上评价：BRSV和PVM，分别与RSV共有F蛋白中81％和40％的氨基酸同一性的两种病毒。测试HMB3210中和PVM株15和BRSV株RB94的能力，并显示针对这些病毒是有效的，分别具有100ng/ml和10ng/ml的IC50值。这些结果指示除人副粘病毒RSV和MPV外，HMB3210针对副粘病毒科的其它两种病毒也是有效的。
实施例12.HMB3210引起的病毒播散的抑制
我们还测量了HMB3210和D25RSV-特异抗体防止细胞至细胞病毒播散的能力，其已被报道是抗RSV抗体独立于中和活性的独特性质。我们用RSV A或B株感染Hep-2细胞，20小时之后加入不同浓度的抗体并在第3天检查合胞体形成以测定抑制病毒播散的50％抗体浓度，这里定义为IS50。两种抗体均能抑制病毒播散，但是以更高的浓度。有意思的是，在该测定中，HMB3210显示与更有效的中和抗体D25的那些IS50相当的IS50(图15)。
实施例13.HMB3210针对RSV、MPV和PVM的预防和治疗效力
在RSV小鼠模型中，HMB3210在减少RSV肺滴度中较帕利珠单抗更有效平均5至10倍并在低至0.12mg/kg的浓度是有效的(图16a)。在MPV小鼠模型中，HMB3210同等有效(图16b)。为了测试HMB3210的治疗潜力，我们用RSV感染STAT1缺陷小鼠并在感染后第1、2或3天施用HMB3210。尽管由于弱的病毒复制，该模型存在局限，但是HMB3210在所有时间点都显示治疗效力和减少肺中的病毒滴度和炎性细胞因子(图17)。
为了在更相关的急性下呼吸道感染的动物模型中测试HMB3210，我们利用其与PVM的交叉反应性，PVM是在非常低的接种物之后在小鼠中引起致命疾病的病毒并概括人中严重的RSV和MPV感染的特点。在预防情况中，HMB3210以0.12mg/kg完全保护小鼠抵御致命性而以0.6mg/kg抵御体重减轻(图18a)。此外，在治疗情况中，当感染之后施用达3天时，HMB3210以30和5mg/kg完全抵御致命性，并且当在第4或5天以30mg/kg给予时赋予显著的保护(图18b-d)。在该系统中，利巴韦林——其是唯一批准的在人中治疗的护理标准，如先前所描述的(Bonville et al.,2004,Journal of Virology 78:7984-7989)——无效。重要地，HMB3210的治疗学递送有效阻断肺病毒RNA的进一步增加(图19)。为了解决体内效应子机制的作用，我们比较了IgG1 HMB3210与缺少补体和Fc受体结合的突变体(HMB3210-LALA)。比较两种抗体的体外中和活性，显示相当。当在预防情况中以限制的量(0.12mg/kg)施用时，HMB3210-LALA显示严重减少的效力(图20a)。相比之下，当用于治疗情况时，在测试的所有剂量，HMB3210-LALA与HMB3210一样有效(图20b)。在利巴韦林无效的PVM感染模型中HMB3210的治疗效力可以是由于因素的组合，如有效的中和和播散抑制活性，融合前蛋白的选择性识别——其通过大量的充当诱饵的融合后蛋白而避免抗体消耗，和没有选择逃逸的突变体。令人惊讶地，PVM小鼠模型中HMB3210的治疗效力不需要效应子功能，提示体内抗体活性主要依赖病毒中和和病毒播散的抑制。
实施例14.HMB3210结合融合前F蛋白上高度保守的β链，其在融合后F蛋白上是不可得的。
为了鉴定HMB3210识别的表位，我们筛选了涵盖人RSV F蛋白全序列的7,095个结构化肽的文库。实施例5所示的实验显示HMB3210在蛋白质印迹中在非还原条件下与RSV和MPV F蛋白反应，提示HMB3210靶向其构象在存在阴离子洗涤剂SDS的情况下稳定的表位(图5和6)。文库筛选方法导致F2的N端区中推定的HMB3210表位的鉴定，F2的N端区跨越残基SAVSKGYLSALRTGWYTSVIT(SEQ ID NO:63)。该区中的核心序列，YLSALRTGW(SEQ ID NO:64)，在RSV、MPV、BRSV和PVM之间高度保守(图21)，其中变体YLSVLRTGW(SEQ ID NO:65)、YFSALRTGW(SEQ ID NO:66)、YFSVLRTGW(SEQ ID NO:67)、YKSALRTGW(SEQ ID NO:68)和YKSVLRTGW(SEQ ID NO:69)也被HMB3210识别。该序列不暴露在融合后RSV F蛋白表面上，但是在PIV5F蛋白结构周围建立的RSV融合前F蛋白模型中(Yin,et al.,2006,Nature 439:38-44)，期望位于接近帕利珠单抗靶向的环区的暴露的β链中(图22)。该绘制与实施例10中显示的HMB3210针对融合前F蛋白的特异性一致。该表位接近，但不同于帕利珠单抗识别的表位，并且以YLSVLRTGW序列——其在包括364HRSV、162HMPV、8BRSV和5PVM株在内的551个病毒株中高度保守——周围为中心(图23)。
序列和SEQ ID号的表

Claims (21)

1.分离的抗体，其中和RSV、MPV和PVM的感染，包括(i)分别在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中列出的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，和分别在SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:35中列出的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；或(ii)分别在SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:3中列出的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，和分别在SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:6中列出的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。
2.权利要求1所述的抗体，包括SEQ ID NO：13或17的氨基酸序列所示的重链可变区。
3.权利要求1或2所述的抗体，包括SEQ ID NO：14或37的氨基酸序列所示的轻链可变区。
4.抗体，其中所述抗体包括在SEQ ID NO:17的氨基酸序列中列出的重链可变区和在SEQ ID NO:37的氨基酸序列中列出的轻链可变区；或在SEQ ID NO:13的氨基酸序列中列出的重链可变区和在SEQ ID NO:14的氨基酸序列中列出的轻链可变区；或在SEQ ID NO:17的氨基酸序列中列出的重链可变区和在SEQ ID NO:14的氨基酸序列中列出的轻链可变区，其中所述抗体中和RSV、MPV和PVM的感染。
5.权利要求1-2和4中任一项所述的抗体，其中所述抗体是人抗体、单克隆抗体、纯化的抗体、单链抗体、Fab、Fab’、F(ab')2、或Fv。
6.权利要求1-2和4中任一项所述的抗体，其中所述抗体是人单克隆抗体。
7.权利要求1-2和4中任一项所述的抗体，其中所述抗体是scFv。
8.权利要求3所述的抗体，其中所述抗体是人抗体、单克隆抗体、纯化的抗体、单链抗体、Fab、Fab’、F(ab')2、或Fv。
9.权利要求3所述的抗体，其中所述抗体是scFv。
10.权利要求3所述的抗体，其中所述抗体是人单克隆抗体。
11.权利要求1-2和4中任一项所述的抗体，其用于治疗或减弱RSV或MPV，或RSV和MPV的感染。
12.权利要求3所述的抗体，其用于治疗或减弱RSV或MPV，或RSV和MPV的感染。
13.权利要求5所述的抗体，其用于治疗或减弱RSV或MPV，或RSV和MPV的感染。
14.核酸分子，其包括编码权利要求1-10中任一项所述的抗体的多核苷酸。
15.载体，其包括权利要求14所述的核酸分子。
16.细胞，其表达权利要求1-10任一项所述的抗体；或包括权利要求15所述的载体。
17.药物组合物，其包括权利要求1-10中任一项所述的抗体、权利要求14所述的核酸分子、权利要求15所述的载体、或权利要求16所述的细胞，以及药学上可接受的稀释剂或载体。
18.药物组合物，其包括第一抗体以及第二抗体，其中所述第一抗体是权利要求1-10中任一项所述的抗体，并且所述第二抗体中和RSV或MPV，或RSV和MPV的感染。
19.权利要求1-10中任一项所述的抗体、权利要求14所述的核酸分子、权利要求15所述的载体、权利要求16所述的细胞、或权利要求17或权利要求18所述的药物组合物在制备(i)用于治疗或减弱RSV或MPV、或RSV和MPV的感染的药物中，(ii)用于RSV或MPV感染的诊断的试剂盒中的应用。
20.权利要求1-10中任一项所述的抗体用于通过检查所述疫苗的抗原含有处于正确构象的特异表位而监测抗RSV或抗MPV疫苗的质量的应用。
21.权利要求中1-10任一项所述的抗体在制备用于减少RSV或MPV感染、或降低RSV或MPV感染的危险的药物中的应用。
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