CN104955839A - 对人偏肺病毒具有特异性的人抗体或其抗原结合性片段 - Google Patents
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Abstract
本发明提供与人偏肺病毒(human metapneumovirus)的F蛋白质特异性结合且中和人偏肺病毒的新的人来源的单克隆抗体及其抗原结合性片段，并且提供含有该抗体或其抗原结合性片段的药物组合物。
Description
技术领域
本发明涉及与人偏肺病毒(human metapneumovirus)的F蛋白质特异性结合且中和人偏肺病毒的生物活性的单克隆抗体及其抗原结合性片段。
背景技术
呼吸器官感染症在罹患率和死亡率方面可以说是人类的主要疾病之一。特别是在不满5岁的儿童中，呼吸器官感染症排名在死亡原因的前列。据报道，在美国，若将肺炎、流感和流感样疾病包括在内，则每年死亡45000人以上，年医疗费达到146亿美元(非专利文献1)。
作为呼吸器官感染症的致病病毒，已知RS病毒(respiratorysyncytial virus：RSV；呼吸道合胞病毒)、副流感病毒、流感病毒、冠状病毒、鼻病毒、腺病毒等。最近，陆续发现了人偏肺病毒(humanmetapneumovirus：hMPV)、SARS冠状病毒和人博卡病毒等引起呼吸器官感染症的病毒，其中，hMPV是在2001年由荷兰的研究小组首次分离、鉴定的病毒(非专利文献2)。该hMPV是一直以来在人之间普遍存在的病毒，但难以进行病毒分离，因此是迄今未被发现的病毒。
人偏肺病毒(hMPV)为单链(负链)RNA病毒，被分类为副粘病毒科、肺病毒亚科、偏肺病毒属，具有编码N蛋白质、P蛋白质、M蛋白质、F蛋白质、M2蛋白质、SH蛋白质、G蛋白质和L蛋白质的8个基因(非专利文献2)。hMPV的基因序列与禽肺病毒(Avian pneumovirus：APV)最类似，另外，在人的病毒中，在基因序列和临床症状的方面与RSV类似(非专利文献3)。hMPV根据血清学特征被分类为A和B这两个组，进一步又各自分为两个亚组(A1和A2、B1和B2)(非专利文献4)，其中，成为近来世界范围内流行的主流的为A2株(非专利文献5)。据报道，在病毒表面存在F蛋白质、G蛋白质和SH蛋白质，但血清中存在的抗hMPV的主要中和抗体为抗F蛋白质的抗体(非专利文献6和7)。
根据Williams等的小组的调查，报道了在不满5岁的儿童呼吸器官感染症患者中，下呼吸道感染症患者的20％、上呼吸道感染症患者的15％感染了hMPV(非专利文献7)，在血液中的抗体效价低的6个月至1岁的婴幼儿、免疫功能低下的老年人、免疫缺陷状态的患者中，存在重症化的危险性，需要特别注意。
目前，虽然确立了hMPV的检查方法，但在抗病毒药中没有有效的药物，基本采取对症疗法。作为hMPV的治疗/预防药，正在研究对hMPV的F蛋白质具有特异性的抗体药品(专利文献1、2和非专利文献9)、活用减毒化病毒等的疫苗的开发等(专利文献3和4)。最近，报道了与hMPV和RSV这两者的F蛋白质均结合的人抗体(专利文献5)，但可以说只是刚刚开始。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO2006/110214
专利文献2：WO2008/043052
专利文献3：WO2002/057302
专利文献4：WO2003/072719
专利文献5：WO2013/140247
非专利文献
非专利文献1：Clin.Micro.Reviews,2006(vol.19)p546
非专利文献2：Nature Medicine,2001(vol.7)p719
非专利文献3：Virology,2002(vol.295)p119
非专利文献4：Emerg.Infect.Dis.,2004(vol.10)p658
非专利文献5：PLoS ONE,2012(vol.7)e34544
非专利文献6：J.Virol.,2004(vol.78)p6927
非专利文献7：J.Gen.Virol.,2004(vol.85)p1655
非专利文献8：New Eng.J.Med.,2004(vol.350)p443
非专利文献9：J.Virol.,2006(vol.80)p7799
发明内容
发明所要解决的问题
关于2001年明确为呼吸器官感染症的致病病毒的人偏肺病毒(hMPV)，据称在不满5岁的儿童的呼吸器官感染症患者中，15～20％为由该病毒引起的疾病，特别是在6个月至1岁的婴幼儿、免疫功能低下的老年人、免疫缺陷状态的患者中，存在重症化的危险性。作为与hMPV类似的人病毒，有RSV，作为该疾病的预防药，特异性识别RSV的F蛋白质的抗体药品(Synagis)已获得许可，正在许多国家销售。但是，针对hMPV的治疗还只是对症疗法。其中，报道了活用减毒化病毒等的疫苗的研究(专利文献3和4)以及对hMPV的F蛋白质具有特异性的抗体药品的研究等，但作为人来源抗体的例子，仅报道了与Synagis同样地识别该病毒的F蛋白质的人Fab抗体DSλ7等(专利文献2)。
但是，从抗体DSλ7等的亲和性、中和活性等来考虑，活性仍然较低，作为候选药物，均还有改善的余地。特别是作为抗hMPV的抗体药物，期望对A1、A2、B1和B2株具有广泛且高的中和活性的抗体，如果可能，则期望对最近成为流行的主流的hMPV_A2株具有特别高的中和活性的抗体。
另外，考虑到病毒的耐性化等，还需要表位不同的抗体。此外，嵌合抗体和人源化抗体均存在免疫原性方面的问题，作为候选药品的抗hMPV抗体，也强烈期望完全的人来源的抗体。
用于解决问题的方法
其中，为了制作以更低的用量显示出与现有同等或更高的有效性的人来源的单克隆抗体，反复进行了深入研究，成功地制作了与hMPV的F蛋白质特异性结合、对hMPV具有广泛且高的中和活性并且按照表位分类被分类为若干不同的组的多种抗体，从而完成了本发明。
即，本发明涉及以下[1]～[41]所述的对人偏肺病毒(hMPV)的F蛋白质具有特异性的人单克隆抗体或其抗原结合性片段、编码该抗体或其抗原结合性片段的核酸(多核苷酸)、含有该核酸的表达载体、含有该载体的宿主细胞、以及含有本发明的抗体或抗原结合性片段的药物组合物等。
[1]一种抗体或其抗原结合性片段，其为与人偏肺病毒的F蛋白质特异性结合且能够中和其生物活性的抗体或其抗原结合性片段，其中，
(i)重链的可变区含有：
(a)选自序列号3、13、23、33、43、53、63、73、83、93、103、113和123的氨基酸序列以及在这些氨基酸序列中具有一个～数个氨基酸残基的缺失、取代、插入和/或添加的突变的氨基酸序列的组中的重链CDR1的氨基酸序列、
(b)选自序列号4、14、24、34、44、54、64、74、84、94、104、114和124的氨基酸序列以及在这些氨基酸序列中具有一个～数个氨基酸残基的缺失、取代、插入和/或添加的突变的氨基酸序列的组中的重链CDR2的氨基酸序列、以及
(c)选自序列号5、15、25、35、45、55、65、75、85、95、105、115和125的氨基酸序列以及在这些氨基酸序列中具有一个～数个氨基酸残基的缺失、取代、插入和/或添加的突变的氨基酸序列的组中的重链CDR3的氨基酸序列；
(ii)轻链的可变区含有：
(a)选自序列号8、18、28、38、48、58、68、78、88、98、108、118和128的氨基酸序列以及在这些氨基酸序列中具有一个～数个氨基酸残基的缺失、取代、插入和/或添加的突变的氨基酸序列的组中的轻链CDR1的氨基酸序列、
(b)选自序列号9、19、29、39、49、59、69、79、89、99、109、119和129的氨基酸序列以及在这些氨基酸序列中具有一个～数个氨基酸残基的缺失、取代、插入和/或添加的突变的氨基酸序列的组中的轻链CDR2的氨基酸序列、以及
(c)选自序列号10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120和130的氨基酸序列以及在这些氨基酸序列中具有一个～数个氨基酸残基的缺失、取代、插入和/或添加的突变的氨基酸序列的组中的轻链CDR3的氨基酸序列。
[2]如[1]所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，
(i)重链的可变区含有：
(a)包含序列号3的氨基酸序列的重链CDR1的氨基酸序列、
(b)包含序列号4的氨基酸序列的重链CDR2的氨基酸序列、以及
(c)包含序列号5的氨基酸序列的重链CDR3的氨基酸序列；
(ii)轻链的可变区含有：
(a)包含序列号8的氨基酸序列的轻链CDR1的氨基酸序列、
(b)包含序列号9的氨基酸序列的轻链CDR2的氨基酸序列、以及
(c)包含序列号10的氨基酸序列的轻链CDR3的氨基酸序列。
[3]如[1]所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，
(i)重链的可变区含有：
(a)包含序列号13的氨基酸序列的重链CDR1的氨基酸序列、
(b)包含序列号14的氨基酸序列的重链CDR2的氨基酸序列、以及
(c)包含序列号15的氨基酸序列的重链CDR3的氨基酸序列；
(ii)轻链的可变区含有：
(a)包含序列号18的氨基酸序列的轻链CDR1的氨基酸序列、
(b)包含序列号19的氨基酸序列的轻链CDR2的氨基酸序列、以及
(c)包含序列号20的氨基酸序列的轻链CDR3的氨基酸序列。
[4]如[1]所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，
(i)重链的可变区含有：
(a)包含序列号23的氨基酸序列的重链CDR1的氨基酸序列、
(b)包含序列号24的氨基酸序列的重链CDR2的氨基酸序列、以及
(c)包含序列号25的氨基酸序列的重链CDR3的氨基酸序列；
(ii)轻链的可变区含有：
(a)包含序列号28的氨基酸序列的轻链CDR1的氨基酸序列、
(b)包含序列号29的氨基酸序列的轻链CDR2的氨基酸序列、以及
(c)包含序列号30的氨基酸序列的轻链CDR3的氨基酸序列。
[5]如[1]所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，
(i)重链的可变区含有：
(a)包含序列号33的氨基酸序列的重链CDR1的氨基酸序列、
(b)包含序列号34的氨基酸序列的重链CDR2的氨基酸序列、以及
(c)包含序列号35的氨基酸序列的重链CDR3的氨基酸序列；
(ii)轻链的可变区含有：
(a)包含序列号38的氨基酸序列的轻链CDR1的氨基酸序列、
(b)包含序列号39的氨基酸序列的轻链CDR2的氨基酸序列、以及
(c)包含序列号40的氨基酸序列的轻链CDR3的氨基酸序列。
[6]如[1]所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，
(i)重链的可变区含有：
(a)包含序列号43的氨基酸序列的重链CDR1的氨基酸序列、
(b)包含序列号44的氨基酸序列的重链CDR2的氨基酸序列、以及
(c)包含序列号45的氨基酸序列的重链CDR3的氨基酸序列；
(ii)轻链的可变区含有：
(a)包含序列号48的氨基酸序列的轻链CDR1的氨基酸序列、
(b)包含序列号49的氨基酸序列的轻链CDR2的氨基酸序列、以及
(c)包含序列号50的氨基酸序列的轻链CDR3的氨基酸序列。
[7]如[1]所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，
(i)重链的可变区含有：
(a)包含序列号53的氨基酸序列的重链CDR1的氨基酸序列、
(b)包含序列号54的氨基酸序列的重链CDR2的氨基酸序列、以及
(c)包含序列号55的氨基酸序列的重链CDR3的氨基酸序列；
(ii)轻链的可变区含有：
(a)包含序列号58的氨基酸序列的轻链CDR1的氨基酸序列、
(b)包含序列号59的氨基酸序列的轻链CDR2的氨基酸序列、以及
(c)包含序列号60的氨基酸序列的轻链CDR3的氨基酸序列。
[8]如[1]所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，
(i)重链的可变区含有：
(a)包含序列号63的氨基酸序列的重链CDR1的氨基酸序列、
(b)包含序列号64的氨基酸序列的重链CDR2的氨基酸序列、以及
(c)包含序列号65的氨基酸序列的重链CDR3的氨基酸序列；
(ii)轻链的可变区含有：
(a)包含序列号68的氨基酸序列的轻链CDR1的氨基酸序列、
(b)包含序列号69的氨基酸序列的轻链CDR2的氨基酸序列、以及
(c)包含序列号70的氨基酸序列的轻链CDR3的氨基酸序列。
[9]如[1]所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，
(i)重链的可变区含有：
(a)包含序列号73的氨基酸序列的重链CDR1的氨基酸序列、
(b)包含序列号74的氨基酸序列的重链CDR2的氨基酸序列、以及
(c)包含序列号75的氨基酸序列的重链CDR3的氨基酸序列；
(ii)轻链的可变区含有：
(a)包含序列号78的氨基酸序列的轻链CDR1的氨基酸序列、
(b)包含序列号79的氨基酸序列的轻链CDR2的氨基酸序列、以及
(c)包含序列号80的氨基酸序列的轻链CDR3的氨基酸序列。
[10]如[1]所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，
(i)重链的可变区含有：
(a)包含序列号83的氨基酸序列的重链CDR1的氨基酸序列、
(b)包含序列号84的氨基酸序列的重链CDR2的氨基酸序列、以及
(c)包含序列号85的氨基酸序列的重链CDR3的氨基酸序列；
(ii)轻链的可变区含有：
(a)包含序列号88的氨基酸序列的轻链CDR1的氨基酸序列、
(b)包含序列号89的氨基酸序列的轻链CDR2的氨基酸序列、以及
(c)包含序列号90的氨基酸序列的轻链CDR3的氨基酸序列。
[11]如[1]所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，
(i)重链的可变区含有：
(a)包含序列号93的氨基酸序列的重链CDR1的氨基酸序列、
(b)包含序列号94的氨基酸序列的重链CDR2的氨基酸序列、以及
(c)包含序列号95的氨基酸序列的重链CDR3的氨基酸序列；
(ii)轻链的可变区含有：
(a)包含序列号98的氨基酸序列的轻链CDR1的氨基酸序列、
(b)包含序列号99的氨基酸序列的轻链CDR2的氨基酸序列、以及
(c)包含序列号100的氨基酸序列的轻链CDR3的氨基酸序列。
[12]如[1]所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，
(i)重链的可变区含有：
(a)包含序列号103的氨基酸序列的重链CDR1的氨基酸序列、
(b)包含序列号104的氨基酸序列的重链CDR2的氨基酸序列、以及
(c)包含序列号105的氨基酸序列的重链CDR3的氨基酸序列；
(ii)轻链的可变区含有：
(a)包含序列号108的氨基酸序列的轻链CDR1的氨基酸序列、
(b)包含序列号109的氨基酸序列的轻链CDR2的氨基酸序列、以及
(c)包含序列号110的氨基酸序列的轻链CDR3的氨基酸序列。
[13]如[1]所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，
(i)重链的可变区含有：
(a)包含序列号113的氨基酸序列的重链CDR1的氨基酸序列、
(b)包含序列号114的氨基酸序列的重链CDR2的氨基酸序列、以及
(c)包含序列号115的氨基酸序列的重链CDR3的氨基酸序列；
(ii)轻链的可变区含有：
(a)包含序列号118的氨基酸序列的轻链CDR1的氨基酸序列、
(b)包含序列号119的氨基酸序列的轻链CDR2的氨基酸序列、以及
(c)包含序列号120的氨基酸序列的轻链CDR3的氨基酸序列。
[14]如[1]所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，
(i)重链的可变区含有：
(a)包含序列号123的氨基酸序列的重链CDR1的氨基酸序列、
(b)包含序列号124的氨基酸序列的重链CDR2的氨基酸序列、以及
(c)包含序列号125的氨基酸序列的重链CDR3的氨基酸序列；
(ii)轻链的可变区含有：
(a)包含序列号128的氨基酸序列的轻链CDR1的氨基酸序列、
(b)包含序列号129的氨基酸序列的轻链CDR2的氨基酸序列、以及
(c)包含序列号130的氨基酸序列的轻链CDR3的氨基酸序列。
[15]如[1]～[14]中任一项所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，含有：
(a)选自序列号2、12、22、32、42、52、62、72、82、92、102、112和122的氨基酸序列以及与这些氨基酸序列具有95％以上的同一性的氨基酸序列的组中的重链可变区(VH)、以及
(b)选自序列号7、17、27、37、47、57、67、77、87、97、107、117和127的氨基酸序列以及与这些氨基酸序列具有95％以上的同一性的氨基酸序列的组中的轻链可变区(VL)。
[16]如[15]所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，含有：
(a)包含序列号2的氨基酸序列或者与序列号2的氨基酸序列具有95％以上的同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)、以及
(b)包含序列号7的氨基酸序列或者与序列号7的氨基酸序列具有95％以上的同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
[17]如[15]所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，含有：
(a)包含序列号12的氨基酸序列或者与序列号12的氨基酸序列具有95％以上的同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)、以及
(b)包含序列号17的氨基酸序列或者与序列号17的氨基酸序列具有95％以上的同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
[18]如[15]所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，含有：
(a)包含序列号22的氨基酸序列或者与序列号22的氨基酸序列具有95％以上的同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)、以及
(b)包含序列号27的氨基酸序列或者与序列号27的氨基酸序列具有95％以上的同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
[19]如[15]所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，含有：
(a)包含序列号32的氨基酸序列或者与序列号32的氨基酸序列具有95％以上的同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)、以及
(b)包含序列号37的氨基酸序列或者与序列号37的氨基酸序列具有95％以上的同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
[20]如[15]所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，含有：
(a)包含序列号42的氨基酸序列或者与序列号42的氨基酸序列具有95％以上的同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)、以及
(b)包含序列号47的氨基酸序列或者与序列号47的氨基酸序列具有95％以上的同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
[21]如[15]所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，含有：
(a)包含序列号52的氨基酸序列或者与序列号52的氨基酸序列具有95％以上的同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)、以及
(b)包含序列号57的氨基酸序列或者与序列号57的氨基酸序列具有95％以上的同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
[22]如[15]所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，含有：
(a)包含序列号62的氨基酸序列或者与序列号62的氨基酸序列具有95％以上的同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)、以及
(b)包含序列号67的氨基酸序列或者与序列号67的氨基酸序列具有95％以上的同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
[23]如[15]所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，含有：
(a)包含序列号72的氨基酸序列或者与序列号72的氨基酸序列具有95％以上的同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)、以及
(b)包含序列号77的氨基酸序列或者与序列号77的氨基酸序列具有95％以上的同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
[24]如[15]所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，含有：
(a)包含序列号82的氨基酸序列或者与序列号82的氨基酸序列具有95％以上的同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)、以及
(b)包含序列号87的氨基酸序列或者与序列号87的氨基酸序列具有95％以上的同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
[25]如[15]所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，含有：
(a)包含序列号92的氨基酸序列或者与序列号92的氨基酸序列具有95％以上的同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)、以及
(b)包含序列号97的氨基酸序列或者与序列号97的氨基酸序列具有95％以上的同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
[26]如[15]所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，含有：
(a)包含序列号102的氨基酸序列或者与序列号102的氨基酸序列具有95％以上的同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)、以及
(b)包含序列号107的氨基酸序列或者与序列号107的氨基酸序列具有95％以上的同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
[27]如[15]所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，含有：
(a)包含序列号112的氨基酸序列或者与序列号112的氨基酸序列具有95％以上的同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)、以及
(b)包含序列号117的氨基酸序列或者与序列号117的氨基酸序列具有95％以上的同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
[28]如[15]所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，含有：
(a)包含序列号122的氨基酸序列或者与序列号122的氨基酸序列具有95％以上的同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)、以及
(b)包含序列号127的氨基酸序列或者与序列号127的氨基酸序列具有95％以上的同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
[29]如[1]～[28]中任一项所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，
该抗体的表位在按照对F蛋白质的部分缺失肽的结合活性进行分类的情况下，属于由抗hMPV抗体EV046115b、EV046130和EV046147代表的表位组Group1、由抗hMPV抗体EV046113、EV046116、EV046141和EV0461142代表的表位组Group2、由抗hMPV抗体EV046124、EV046143和EV046150代表的表位组Group3、由抗hMPV抗体EV046120和EV046135代表的表位组Group4以及由抗hMPV抗体EV046136代表的表位组Group5中的任意一个表位组。
[30]如[1]～[28]中任一项所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，
该抗体的表位在按照对F蛋白质的部分缺失肽的结合活性进行分类的情况下，属于由抗hMPV抗体EV046113、EV046116、EV046141和EV0461142代表的表位组Group2、由抗hMPV抗体EV046124、EV046143和EV046150代表的表位组Group3、由抗hMPV抗体EV046120和EV046135代表的表位组Group4以及由抗hMPV抗体EV046136代表的表位组Group5中的任意一个表位组。
[31]如[1]～[28]中任一项所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，
该抗体的表位在按照对F蛋白质的部分缺失肽的结合活性进行分类的情况下，属于由抗hMPV抗体EV046124、EV046143和EV046150代表的表位组Group3。
[32]如[1]～[31]中任一项所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，所述抗体的类别(亚类)为IgG1(κ)或IgG1(λ)。
[33]如[1]～[32]中任一项所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，所述抗体或其抗原结合性片段对人偏肺病毒JPS02-76(B1型)、JPS05-21(B2型)和JPS03-180(A1型)中的任意一株的中和活性(IC50)均为约1μg/mL(约6.7nM)以下。
[34]如[1]～[32]中任一项所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，所述抗体或其抗原结合性片段对人偏肺病毒JPS03-180(A1型)、JPS03-178(A2型)、JPS02-76(B1型)和JPS05-21(B2型)中的任意一株的中和活性(IC50)均为约1μg/mL(约6.7nM)以下。
[35]如[1]～[32]中任一项所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，所述抗体或其抗原结合性片段对人偏肺病毒JPS03-180(A1型)、JPS03-178(A2型)、JPS02-76(B1型)和JPS05-21(B2型)中的任意一株的中和活性(IC90)均为约2μg/mL(约13.3nM)以下。
[36]如[1]～[32]中任一项所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，所述抗体或其抗原结合性片段对人偏肺病毒的JPS03-178株(A2型)的中和活性(IC50)为约0.1μg/mL(约0.67nM)以下。
[37]一种药物组合物，其含有[1]～[36]中任一项所述的抗体或其抗原结合性片段以及药学上可容许的载体。
[38]如[37]所述的药物组合物，其用于治疗或预防人偏肺病毒感染症。
[39]编码[1]～[36]中任一项所述的抗体或其抗原结合性片段的氨基酸序列的分离的核酸、编码序列号1、6、11、16、21、26、31、36、41、46、51、56、61、66、71、76、81、86、91、96、101、106、111、116、121和126的氨基酸序列的分离的核酸、或者在高严格条件下与这些核酸中的任意一种杂交的分离的核酸。
[40]一种重组表达载体，其整合有[39]所述的分离的核酸。
[41]一种宿主细胞，其导入有[40]所述的重组表达载体。
发明效果
本发明的中和人偏肺病毒(hMPV)的生物活性的单克隆抗体或其抗原结合性片段与人偏肺病毒(hMPV)的F蛋白质特异性结合，使其生物活性丧失(中和)，可以期待预防或治疗hMPV感染症。另外，本发明的抗人偏肺病毒(hMPV)的F蛋白质的人单克隆抗体或其抗原结合性片段的实施方式中，具有无免疫原性、也观察不到免疫反应的优点。另外，含有本发明的特别优选的人单克隆抗体的药物组合物使用极少的量即有效，还可以期待控制医疗成本的可能性。
附图说明
图1为用流程图表示产生本发明的抗hMPV抗体的抗体产生细胞克隆分离的程序的图。
图2为示出使用Biacore T-200进行抗MPV抗体的竞争分析的结果的图。在传感芯片NTA上捕获从hMPV(JPS02-76)的FP基因中除去TM区域(a.a.491-539)并附加有His标签的FP-TM(-)-His后，使作为样品1的抗MPV抗体在传感芯片上结合至饱和水平，接着，使作为样品2的另一抗MPV抗体结合。通过样品2与抗hMPV抗体的结合是否被抑制来判定是否存在竞争。Ab.I.D.用后3位的数字表示。+表示竞争，-表示不竞争。N.D.是由于传感芯片上的抗体的凝集反应而无法测定。需要说明的是，图的Ab.I.D.中，338和210分别表示作为对照使用的mAb388和HMB3210。
图3为表示为了抗hMPV抗体的表位作图而制作的各种缺失突变体(hMPV-FP缺失突变体)的图。HA-V5-Full在hMPV(JPS02-76)FP基因的信号肽(SP)的下游附加有HA标签(HA)，在C-tail(C)的下游附加有V5标签(V5)。使各缺失突变体缺失如图所示的区域，克隆到表达载体中。图中的其他缩写如下所述。F2结构域(F2)、融合肽(FP)、七肽重复序列1(HR1)、F1结构域(F1)、七肽重复序列2(HR2)、跨膜结构域(TM)。
图4为表示抗hMPV抗体对缺失突变体的结合分析的结果的图。将图3所示的各缺失突变体表达载体转染到CHO-K1细胞中，16小时后接种到96孔板中，24小时后进行固定。进行该缺失突变体表达CHO-K1细胞的荧光免疫染色，确认了各抗MPV抗体的结合。详细操作与细胞荧光免疫染色筛选同样。另外，进行利用HA抗体和V5抗体的细胞荧光免疫染色，确认了缺失突变体自身的表达。Ab.I.D.用后3位表示。+++、++、+表示结合，按照荧光强度的顺序。-表示不结合。表位组通过与缺失突变体的结合模式来确定。需要说明的是，图的Ab.I.D.中，338和210分别表示作为对照使用的mAb388和HMB3210。
图5为表示抗hMPV抗体的表位的分类的图。基于图3、图4的结果对抗hMPV抗体的表位进行分类。被圆形包围的分类为竞争分析结果，被四方形包围的分类为缺失突变体结合分析结果。
具体实施方式
1.术语的说明
本说明书中，与本发明相关地使用的科学术语和专业术语具有本领域技术人员通常理解的含义。此外，若非在根据上下文判断为特别必要的情况下，则单数术语包含复数，复数术语包含单数。一般而言，本说明书中记载的与细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质与核酸化学以及杂交的技术相关地使用的命名法为该领域中公知且通常使用的命名法。
本发明涉及与人偏肺病毒(human metapneumovirus)的F蛋白质特异性结合且中和人偏肺病毒的生物活性的单克隆抗体及其抗原结合性片段。以下，通过明确本发明中使用的语句的含义，详细地对本发明的具体实施方式进行说明。
1)人偏肺病毒(human metapneumovirus，也简称为hMPV)
人偏肺病毒是2001年由荷兰的研究小组发现的人呼吸器官感染症的致病病毒之一，被分类为副粘病毒科、肺病毒亚科、偏肺病毒属，进一步基于使用G和F蛋白质的核苷酸序列的系统发生学的分析结果，目前被分类为4个亚组(A1、A2、B1和B2；有时也称为A1型、A2型、B1型和B2型)(非专利文献4)。进而，在2006年在德国，亚组A2被分类为hMPV_A2a和hMPV_A2b这两种(非专利文献5)。作为类似的病毒，有感染禽类的禽肺病毒(avian pneumovirus，也简称为APV)、人RSV(respiratory syncytial virus，也简称为RSV)等。hMPV为13.35kb的单链(负链)RNA病毒，具有N、P、M、F、M2、SH、G和L这8个基因，在病毒表面表达有F、G和SH这三种糖蛋白质((非专利文献1)。据报道，在血清中存在的抗hMPV的中和抗体中，抗F蛋白质的抗体占主要的比例。
2)hMPV的F蛋白质
F蛋白质(以下，有时也简称为FP)为存在于hMPV的病毒表面的糖蛋白质之一，hMPV的4个亚组(A1、A2、B1和B2)的代表株的F蛋白质均由539个氨基酸残基构成。关于它们的代表性的氨基酸序列，A1(NL/1/00株)公开在Genbank登记号AF371337中，A2(NL/17/00株)公开在Genbank登记号AY304360中，B1(NL/1/99株)公开在Genbank登记号AY304361中，B2(NL/1/94株)公开在Genbank登记号AY304362中。将A1的F蛋白质的氨基酸序列与其他病毒进行比较时，与禽肺病毒的C型的F蛋白质具有81％的同一性，与人RSV的F蛋白质确认到33％的同一性(非专利文献3)，认为hMPV的F蛋白质也发挥与这些病毒的F蛋白质相同的作用。即，认为是在附着于细胞的病毒的包膜与宿主细胞膜的融合时参与的融合蛋白质(fusion protein)。因此，报道了在与hMPV的F蛋白质结合的抗体中存在具有高中和活性的抗体(专利文献1和2)，另外，在人RSV的抗F蛋白质抗体中，也存在已经作为药品使用的抗体(Synagis)。
另一方面，在hMPV的4个亚组中对F蛋白质的氨基酸序列进行比较时，各亚组(A1、A2、B1和B2)内的氨基酸序列均可确认到99～100％的同一性，在各自的亚型间(A1与A2、或者B1与B2)确认到97～99％的同一性，在A组与B组的比较中确认到94～97％的同一性，已知hMPV的F蛋白质的氨基酸序列在组内高度保守(非专利文献4)。将本发明中用于人抗体的筛选评价的JPS02-76株(B1；T285I)的F蛋白质的氨基酸序列与上述的代表性的F蛋白质进行比较时，与A1(NL/1/00株)的F蛋白质的同一性为94％，与A2(NL/17/00株)的F蛋白质的同一性为94％，与B1(NL/1/99株)的F蛋白质的同一性为99％，与B2(NL/1/94株)的F蛋白质的同一性为99％，确认到非常高的同一性。即，强烈暗示了：本发明中使用的使用JPS02-76株的F蛋白质的评价系统为能够获得对任一亚组的hMPV株均具有交叉反应性的抗体的方法。
3)与hMPV的F蛋白质结合的抗体：
该抗体为与人偏肺病毒(hMPV)的FP特异性结合的抗体，能够与该FP的表位位点例如线性表位、不连续序列表位或立体结构的表位、或者FP的片段等结合。本说明书中，“抗hMPV抗体”、“能够中和hMPV的抗体”、“抗hPMV-F蛋白质抗体”、“与人偏肺病毒(hMPV)的FP特异性结合的抗体”或“能够中和人偏肺病毒(hMPV)的生物活性的抗体”是指通过与人偏肺病毒(hMPV)的FP结合而抑制hMPV的生物活性的抗体。如前所述，hMPV的亚型间的FP的同一性非常高，为了筛选与hMPV的FP特异性结合的抗体，通常的方法为使用hMPV的4个亚组(A1、A2、B1和B2)的代表株中的任意一株的FP作为抗原的方法。本发明中，使用从hMPV B1株(JPS02-76)克隆FP基因并在CHO-K1细胞中表达而得到的FP。需要说明的是，所得到的FP基因的碱基序列(GenBank登记号AY530089)和FP的氨基酸序列(GenBank登记号AAS22077)分别示于序列号131和132。
4)抗体
本说明书中使用的“抗体”这一术语是指，由4条多肽链、即2条重(H)链和2条轻(L)链通过二硫键相互结合而成的分子构成的免疫球蛋白分子。本发明中的单克隆抗体也由包含各为2条的重链(H链)和轻链(L链)的免疫球蛋白分子构成。各H链由H链可变区(有时称为“HCVR”或“VH”)和H链恒定区(H链恒定区由3个结构域构成，有时将其分别称为“CH1”、“CH2”、“CH3”(统称为CH))构成。各L链由L链可变区(有时称为“LCVR”或“VL”)和L链恒定区(L链恒定区由1个结构域构成，有时称为“CL”)构成，将到各恒定区(也称为不变区)起始之前的部分称为可变区(或可变区)。
特别是VH和VL在与抗体的结合特异性相关的方面是重要的。抗体主要通过VH和VL的氨基酸残基与靶抗原发生相互作用，因此，与位于可变区外的序列相比，可变区内的氨基酸序列在各抗体间的差异更大。此外，VH和VL也可以进一步细分为在各种抗体间保持更恒定的被称为框架区(FR)的区域和被称为互补决定区(CDR)的超可变性区域。VH和VL各自由3个CDR和4个FR构成，它们按照FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4的顺序从氨基末端排列至羧基末端。
需要说明的是，本发明中的抗体是指全长的抗体或其抗原结合性片段。基于表示可变区的氨基酸序列、互补决定区(CDR)的氨基酸序列，利用该技术领域中公知的技术，能够得到与hMPV的F蛋白质特异性结合且能够中和hMPV的生物活性的人单克隆抗体、单克隆抗体(也包括嵌合抗体、人源化抗体)、或它们的抗原结合性片段。这些抗体属于本发明的技术范围内。
5)抗体的“抗原结合性片段”(或仅称为“抗体片段”)
本说明书中使用的抗体的“抗原结合性片段”(或仅称为“抗体片段”)这一术语是指，具有与抗原(hMPV的F蛋白质)特异性结合的能力的1个或多个抗体的片段(例如VH)。需要说明的是，该片段也包括具有与抗原特异性结合的最少限度的氨基酸序列的肽。作为抗体的“抗原结合性片段”这一术语中包含的结合部分的例子，可以列举(i)Fab片段、(ii)F(ab’)2片段、(iii)由VH和CH1结构域构成的Fd片段、(iv)由抗体的单臂的VL和VH结构域构成的Fv片段、(v)由VH结构域构成的dAb片段(Nature 341:544-546,1989)、(vi)具有足以进行特异性结合的框架的分离的互补决定区(CDR)、(vii)双特异性抗体和(viii)多特异性抗体等。需要说明的是，本说明书中，在未特别区分而仅称为“抗体”的情况下，不仅包含全长的抗体，也包含这样的“抗原结合性片段”。
6)同种型和亚类
重链根据恒定区的差异分为γ链、μ链、α链、δ链、ε链，根据该差异分别形成IgG、IgM、IgA、IgD、IgE这5种类别(同种型)的免疫球蛋白。此外，在人的情况下，IgG存在IgG1～IgG4这4个亚类。另一方面，根据轻链恒定区的差异，分为κ链、λ链。本发明中，特别优选的抗体的类别(亚类)为IgG1(κ)或IgG1(λ)。
2.本发明的抗体或其抗原结合性片段
本发明在一个实施方式中提供与hMPV特异性结合且能够中和hMPV的生物活性的抗体或其抗原结合性片段(以下称为本发明的抗体)。典型地，本发明的抗体为与hMPV的F蛋白质特异性结合且能够中和该蛋白质的生物活性的抗体或其抗原结合性片段。
作为本发明的抗hMPV抗体，不仅包括包含本说明书中记载的序列号所示的特定的重链或轻链、其可变区或其CDR等的氨基酸序列的抗hMPV抗体，而且还包括包含与这些氨基酸序列实质上相同的氨基酸序列、并且与hMPV的F蛋白质特异性结合且能够中和hMPV的生物活性的抗hMPV抗体。在此，“实质上相同”这一术语是指，在本发明的蛋白质的氨基酸序列中存在1个以上氨基酸残基的缺失、取代、插入、添加，或者，发生了其中任意2种以上突变的组合是指，在同一序列中的任意的1个或多个氨基酸序列中的位置存在1个或多个氨基酸残基的缺失、取代、插入或添加，也可以同时发生缺失、取代、插入和添加中的2种以上。
构成自然界的蛋白质的氨基酸可以根据其侧链的特性来分组，例如，作为具有同样特性的氨基酸组，可以分类为芳香族氨基酸(酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)、碱性氨基酸(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)、中性氨基酸(丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺)、具有烃链的氨基酸(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸)及其他(甘氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸)的组等。
作为将非天然型氨基酸也包括在内的可相互取代的氨基酸残基的例子，还有如下所述的分组，同一组中所含的氨基酸残基可相互取代。A组：亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、邻甲基丝氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、环己基丙氨酸；B组：天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸；C组：天冬酰胺、谷氨酰胺；D组：赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2,4-二氨基丁酸、2,3-二氨基丙酸；E组：脯氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸；F组：丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸；G组：苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸。
氨基酸序列、碱基序列的同一性可以使用Karlin和Altschul的算法BLAST(PNAS,1990(vol.87)p2264；PNAS,1993(vol.90)p5873)来确定。已开发了基于BLAST算法的被称为BLASTN、BLASTX的程序(JMol Biol,1990(vol.215)p403)。在使用BLASTN对碱基序列进行分析的情况下，参数例如设定为分数(score)＝100、字长(wordlength)＝12。另外，在使用BLASTX对氨基酸序列进行分析的情况下，参数例如设定为分数(score)＝50、字长(wordlength)＝3。在使用BLAST和GappedBLAST程序的情况下，使用各程序的默认参数。或者，在求取蛋白质的氨基酸序列的同一性时，也可以将所比较的2种蛋白质的氨基酸序列并排，计数作为相同的氨基酸残基的部分的数量，通过“(相同的氨基酸残基数/蛋白质全长的氨基酸残基数)×100(％)”求出蛋白质的氨基酸序列的同一性。
将本发明中发现的人来源抗hMPV抗体及其抗原结合性片段与它们的序列表中的氨基酸序列的序列号的对应关系示于表1。
[表1]
各种人抗hMPV抗体相关氨基酸序列的序列号一览
(表中，各单元中的编号表示各自的序列号。)
这些得到的抗体中，对表位组相同且中和活性、CDR序列也非常类似的EV046143(VH：序列号102，VL：序列号107)和EV046150(VH：序列号122，VL：序列号127)分析序列的同一性时，在H链的可变区(序列号102和122)中观察到约73％的同一性。在L链的可变区的氨基酸序列(序列号107和127)中，观察到约82％的同一性。在各自的FR区域(FR1+FR2+FR3+FR4)中，VH的同一性为83％，VL的同一性为约89％。另外，关于CDR的氨基酸序列，在H链CDR1的氨基酸序列(序列号103和123)中，在60％(3/5)观察到同一性。在H链CDR2的氨基酸序列(序列号104和124)中观察到约53％(9/17)的同一性。对H链CDR3的氨基酸序列(序列号105和125)进行比较时，观察到37.5％(6/16)的同一性。归纳起来看，在H链的CDR整体中具有约46％(18/38)的同一性。另一方面，对L链CDR1的氨基酸序列(序列号108和128)进行比较时，观察到约42％(5/12)的同一性。在L链CDR2的氨基酸序列(序列号109和129)中，观察到约87％(6/7)的同一性。进而，对L链CDR3的氨基酸序列(序列号120和130)进行比较时，观察到75％(6/8)的同一性。归纳起来看，在L链的CDR整体中具有约63％(17/72)的同一性。因此，综合地来判断，在上述13种抗体和CDR序列整体上具有50％以上的同一性的抗体或其片段的情况下，可能具有同样的结合活性和hMPV中和活性。进而，在具有60％以上(优选70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上)的同一性的情况下，换言之，在各3个CDR序列(CDR1、CDR2和CDR3)整体中具有一个～数个(具体而言为1～15个、1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个或1个)氨基酸残基的缺失、取代、插入、添加或者其中任意2种以上突变的组合的氨基酸序列的情况下，可能具有与上述13个抗hMPV抗体同样的结合活性和中和活性。
因此，本发明的优选的抗体或抗原结合性片段例如为如下情况：选自序列号3～5和8～10、13～15和18～20、23～25和28～30、33～35和38～40、43～45和48～50、53～55和58～60、63～65和68～70、73～75和78～80、83～85和88～90、93～95和98～100、103～105和108～110、113～115和118～120以及123～125和128～130的组合组中的1个组合中的6个氨基酸序列分别相当于重链的CDR1、CDR2和CDR3以及轻链的CDR1、CDR2和CDR3。但是，只要是与hMPV的F蛋白质特异性结合且能够中和其生物活性的单克隆抗体，则CDR序列也可以为如下的氨基酸序列：在选自序列号3～5和8～10、13～15和18～20、23～25和28～30、33～35和38～40、43～45和48～50、53～55和58～60、63～65和68～70、73～75和78～80、83～85和88～90、93～95和98～100、103～105和108～110、113～115和118～120以及123～125和128～130的组合组中的1个组合中的6个氨基酸序列中，具有一个～数个(具体而言为1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个或1个)或CDR序列中的氨基酸残基数的50％以下(优选40％、30％、20％或10％以下)的氨基酸残基的缺失、取代、插入、添加或者其中任意2种以上突变的组合。另外，CDR以外的氨基酸序列没有特别限定，CDR以外的氨基酸序列来源于其他抗体、特别是其他种的抗体的、所谓CDR移植抗体也包含在本发明的抗体中。其中，更优选CDR以外的氨基酸序列也为人来源的抗体，但可以根据需要在框架区(FR)具有1个～数个(具体而言为1～30个、1～25个、1～20个、1～15个、1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个或1个)氨基酸残基的缺失、取代、插入、添加或者其中任意2种以上突变的组合。
另外，根据情况，只要是与hMPV的F蛋白质特异性结合且能够中和其生物活性的单克隆抗体，则下述情况也包含在本发明中：该抗体中含有的6个CDR序列的组合中选自序列号3～5和8～10、13～15和18～20、23～25和28～30、33～35和38～40、43～45和48～50、53～55和58～60、63～65和68～70、73～75和78～80、83～85和88～90、93～95和98～100、103～105和108～110、113～115和118～120以及123～125和128～130的组合组中的1个组合中的6个氨基酸序列中的5个～1个部分地取代为其他6个组合中的不同的氨基酸序列的情况(例如，在序列号3～5和8～10分别相当于重链的CDR1、CDR2和CDR3以及轻链的CDR1、CDR2和CDR3的情况下，其中的重链的CDR2(序列号4)和CDR3(序列号5)取代为序列号13～15和18～20的组合中的重链的CDR2(序列号14)和CDR3(序列号15)的情况)。
本发明中，作为抗hMPV抗体的优选的另一实施方式，为如下的抗体或其抗原结合性片段，其含有：(a)选自序列号2、12、22、32、42、52、62、72、82、92、102、112和122的氨基酸序列；在序列号2、12、22、32、42、52、62、72、82、92、102、112和122的氨基酸序列中具有一个～数个(具体而言为1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个或1个)氨基酸残基的缺失、取代、插入、添加或者其中任意2种以上突变的组合的氨基酸序列；或者，与序列号2、12、22、32、42、52、62、72、82、92、102、112和122的氨基酸序列具有60％以上(优选70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％、98％以上或99％以上)的同一性的氨基酸序列的组中的重链可变区(VH)，以及(b)选自序列号7、17、27、37、47、57、67、77、87、97、107、117和127的氨基酸序列；在序列号7、17、27、37、47、57、67、77、87、97、107、117和127的氨基酸序列的序列中具有一个～数个(具体而言为1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个或1个)氨基酸残基的缺失、取代、插入、添加或者其中任意2种以上突变的组合的氨基酸序列；或者，与序列号7、17、27、37、47、57、67、77、87、97、107、117和127的氨基酸序列具有60％以上(优选70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％、98％以上或99％以上)的同一性的氨基酸序列的组中的轻链可变区(VL)。
本发明中，作为抗hMPV抗体的更优选的另一实施方式，含有：(a-1)由序列号2的氨基酸序列；在序列号2的氨基酸序列中具有一个～数个(具体而言为1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个或1个)氨基酸残基的缺失、取代、插入、添加或者其中任意2种以上突变的组合的氨基酸序列；或者与序列号2的氨基酸序列具有60％以上(优选70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上)的同一性的氨基酸序列表示的重链可变区(VH)，以及(b-1)由序列号7的氨基酸序列；在序列号7的氨基酸序列中具有一个～数个(具体的数量与上述同样)氨基酸残基的缺失、取代、插入、添加或者其中任意2种以上突变的组合的氨基酸序列；或者与序列号7的氨基酸序列具有60％以上(具体的百分数与上述同样)的同一性的氨基酸序列表示的轻链可变区(VL)。
或者，作为抗hMPV抗体的优选的另一实施方式，含有：(a-2)由序列号12的氨基酸序列；在序列号12的氨基酸序列中具有一个～数个(具体而言为1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个或1个)氨基酸残基的缺失、取代、插入、添加或者其中任意2种以上突变的组合的氨基酸序列；或者与序列号12的氨基酸序列具有60％以上(优选70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上)的同一性的氨基酸序列表示的重链可变区(VH)，以及(b-2)由序列号17的氨基酸序列；在序列号17的氨基酸序列中具有一个～数个(具体的数量与上述同样)氨基酸残基的缺失、取代、插入、添加或者其中任意2种以上突变的组合的氨基酸序列；或者与序列号17的氨基酸序列具有60％以上(具体的百分数与上述同样)的同一性的氨基酸序列表示的轻链可变区(VL)。
或者，作为抗hMPV抗体的优选的另一实施方式，含有：(a-3)由序列号22的氨基酸序列；在序列号22的氨基酸序列中具有一个～数个(具体而言为1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个或1个)氨基酸残基的缺失、取代、插入、添加或者其中任意2种以上突变的组合的氨基酸序列；或者与序列号22的氨基酸序列具有60％以上(优选70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上)的同一性的氨基酸序列表示的重链可变区(VH)，以及(b-3)由序列号27的氨基酸序列；在序列号27的氨基酸序列中具有一个～数个(具体的数量与上述同样)氨基酸残基的缺失、取代、插入、添加或者其中任意2种以上突变的组合的氨基酸序列；或者与序列号27的氨基酸序列具有60％以上(具体的百分数与上述同样)的同一性的氨基酸序列表示的轻链可变区(VL)。
本发明中，作为抗hMPV抗体的优选的另一实施方式，含有：(a-4)由序列号33的氨基酸序列；在序列号33的氨基酸序列中具有一个～数个(具体而言为1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个或1个)氨基酸残基的缺失、取代、插入、添加或者其中任意2种以上突变的组合的氨基酸序列；或者与序列号33的氨基酸序列具有60％以上(优选70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上)的同一性的氨基酸序列表示的重链可变区(VH)，以及(b-4)由序列号38的氨基酸序列；在序列号38的氨基酸序列中具有一个～数个(具体的数量与上述同样)氨基酸残基的缺失、取代、插入、添加或者其中任意2种以上突变的组合的氨基酸序列；或者与序列号38的氨基酸序列具有60％以上(具体的百分数与上述同样)的同一性的氨基酸序列表示的轻链可变区(VL)。
或者，作为抗hMPV抗体的优选的另一实施方式，含有：(a-5)由序列号43的氨基酸序列；在序列号43的氨基酸序列中具有一个～数个(具体而言为1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个或1个)氨基酸残基的缺失、取代、插入、添加或者其中任意2种以上突变的组合的氨基酸序列；或者与序列号43的氨基酸序列具有60％以上(优选70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上)的同一性的氨基酸序列表示的重链可变区(VH)，以及(b-5)由序列号47的氨基酸序列；在序列号47的氨基酸序列中具有一个～数个(具体的数量与上述同样)氨基酸残基的缺失、取代、插入、添加或者其中任意2种以上突变的组合的氨基酸序列；或者与序列号47的氨基酸序列具有60％以上(具体的百分数与上述同样)的同一性的氨基酸序列表示的轻链可变区(VL)。
或者，作为抗hMPV抗体的优选的另一实施方式，含有：(a-6)由序列号52的氨基酸序列；在序列号57的氨基酸序列中具有一个～数个(具体而言为1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个或1个)氨基酸残基的缺失、取代、插入、添加或者其中任意2种以上突变的组合的氨基酸序列；或者与序列号57的氨基酸序列具有60％以上(优选70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上)的同一性的氨基酸序列表示的重链可变区(VH)，以及(b-6)由序列号62的氨基酸序列；在序列号62的氨基酸序列中具有一个～数个(具体的数量与上述同样)氨基酸残基的缺失、取代、插入、添加或者其中任意2种以上突变的组合的氨基酸序列；或者与序列号62的氨基酸序列具有60％以上(具体的百分数与上述同样)的同一性的氨基酸序列表示的轻链可变区(VL)。
本发明中，作为抗hMPV抗体的优选的另一实施方式，含有：(a-7)由序列号62的氨基酸序列；在序列号62的氨基酸序列中具有一个～数个(具体而言为1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个或1个)氨基酸残基的缺失、取代、插入、添加或者其中任意2种以上突变的组合的氨基酸序列；或者与序列号62的氨基酸序列具有60％以上(优选70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上)的同一性的氨基酸序列表示的重链可变区(VH)，以及(b-7)由序列号67的氨基酸序列；在序列号67的氨基酸序列中具有一个～数个(具体的数量与上述同样)氨基酸残基的缺失、取代、插入、添加或者其中任意2种以上突变的组合的氨基酸序列；或者与序列号67的氨基酸序列具有60％以上(具体的百分数与上述同样)的同一性的氨基酸序列表示的轻链可变区(VL)。
或者，作为抗hMPV抗体的优选的另一实施方式，含有：(a-8)由序列号72的氨基酸序列；在序列号72的氨基酸序列中具有一个～数个(具体而言为1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个或1个)氨基酸残基的缺失、取代、插入、添加或者其中任意2种以上突变的组合的氨基酸序列；或者与序列号72的氨基酸序列具有60％以上(优选70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上)的同一性的氨基酸序列表示的重链可变区(VH)，以及(b-8)由序列号77的氨基酸序列；在序列号77的氨基酸序列中具有一个～数个(具体的数量与上述同样)氨基酸残基的缺失、取代、插入、添加或者其中任意2种以上突变的组合的氨基酸序列；或者与序列号77的氨基酸序列具有60％以上(具体的百分数与上述同样)的同一性的氨基酸序列表示的轻链可变区(VL)。
或者，作为抗hMPV抗体的优选的另一实施方式，含有：(a-9)由序列号82的氨基酸序列；在序列号82的氨基酸序列中具有一个～数个(具体而言为1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个或1个)氨基酸残基的缺失、取代、插入、添加或者其中任意2种以上突变的组合的氨基酸序列；或者与序列号82的氨基酸序列具有60％以上(优选70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上)的同一性的氨基酸序列表示的重链可变区(VH)，以及(b-9)由序列号87的氨基酸序列；在序列号87的氨基酸序列中具有一个～数个(具体的数量与上述同样)氨基酸残基的缺失、取代、插入、添加或者其中任意2种以上突变的组合的氨基酸序列；或者与序列号87的氨基酸序列具有60％以上(具体的百分数与上述同样)的同一性的氨基酸序列表示的轻链可变区(VL)。
本发明中，作为抗hMPV抗体的优选的另一实施方式，含有：(a-10)由序列号92的氨基酸序列；在序列号92的氨基酸序列中具有一个～数个(具体而言为1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个或1个)氨基酸残基的缺失、取代、插入、添加或者其中任意2种以上突变的组合的氨基酸序列；或者与序列号92的氨基酸序列具有60％以上(优选70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上)的同一性的氨基酸序列表示的重链可变区(VH)，以及(b-10)由序列号97的氨基酸序列；在序列号97的氨基酸序列中具有一个～数个(具体的数量与上述同样)氨基酸残基的缺失、取代、插入、添加或者其中任意2种以上突变的组合的氨基酸序列；或者与序列号97的氨基酸序列具有60％以上(具体的百分数与上述同样)的同一性的氨基酸序列表示的轻链可变区(VL)。
或者，作为抗hMPV抗体的优选的另一实施方式，含有：(a-11)由序列号102的氨基酸序列；在序列号102的氨基酸序列中具有一个～数个(具体而言为1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个或1个)氨基酸残基的缺失、取代、插入、添加或者其中任意2种以上突变的组合的氨基酸序列；或者与序列号102的氨基酸序列具有60％以上(优选70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上)的同一性的氨基酸序列表示的重链可变区(VH)，以及(b-11)由序列号107的氨基酸序列；在序列号107的氨基酸序列中具有一个～数个(具体的数量与上述同样)氨基酸残基的缺失、取代、插入、添加或者其中任意2种以上突变的组合的氨基酸序列；或者与序列号107的氨基酸序列具有60％以上(具体的百分数与上述同样)的同一性的氨基酸序列表示的轻链可变区(VL)。
或者，作为抗hMPV抗体的优选的另一实施方式，含有：(a-12)由序列号112的氨基酸序列；在序列号112的氨基酸序列中具有一个～数个(具体而言为1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个或1个)氨基酸残基的缺失、取代、插入、添加或者其中任意2种以上突变的组合的氨基酸序列；或者与序列号112的氨基酸序列具有60％以上(优选70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上)的同一性的氨基酸序列表示的重链可变区(VH)，以及(b-12)由序列号117的氨基酸序列；在序列号117的氨基酸序列中具有一个～数个(具体的数量与上述同样)氨基酸残基的缺失、取代、插入、添加或者其中任意2种以上突变的组合的氨基酸序列；或者与序列号117的氨基酸序列具有60％以上(具体的百分数与上述同样)的同一性的氨基酸序列表示的轻链可变区(VL)。
或者，作为抗hMPV抗体的优选的另一实施方式，含有：(a-13)由序列号122的氨基酸序列；在序列号122的氨基酸序列中具有一个～数个(具体而言为1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个或1个)氨基酸残基的缺失、取代、插入、添加或者其中任意2种以上突变的组合的氨基酸序列；或者与序列号122的氨基酸序列具有60％以上(优选70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上)的同一性的氨基酸序列表示的重链可变区(VH)，以及(b-13)由序列号127的氨基酸序列；在序列号127的氨基酸序列中具有一个～数个(具体的数量与上述同样)氨基酸残基的缺失、取代、插入、添加或者其中任意2种以上突变的组合的氨基酸序列；或者与序列号127的氨基酸序列具有60％以上(具体的百分数与上述同样)的同一性的氨基酸序列表示的轻链可变区(VL)。
这些抗体的制作方法可以使用公知的方法(Riechmann L,et al.,Reshaping human antibodies for therapy.Nature,332:323-327,1988)。本发明中，当然优选完全人抗体。
3.编码本发明的抗体等的核酸
根据本发明的另一实施方式，作为编码与hMPV的F蛋白质特异性结合且能够中和其生物活性的抗hMPV抗体或其抗原结合性片段的核酸(核苷酸)且编码选自由序列号4～15、18～29和32～43组成的组中的氨基酸序列的核酸以及与该核酸具有高同一性的分离的核酸也包含在本发明中。在此，“具有高同一性”是指能够在高严格条件下与预定的核酸序列杂交的程度的序列同一性，例如是指具有60％、70％、80％、90％、95％或更高的同一性。本发明提供选自在高严格条件下杂交的核酸中的分离的核酸。上述核酸优选为DNA或RNA，更优选为DNA。
“在高严格条件下”例如为5×SSC、5×邓哈特(Denhardt’s)溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、50℃的条件(例如，参考J.Sambrook等人的Molecular Cloning,A Laboratory Manual(分子克隆实验指南),第二版,冷泉港实验室出版社(1989),特别是11.45节“Conditions forHybridization of Oligonucleotide Probes(寡核苷酸探针的杂交条件)”)。在这些条件下，越提高温度，越可以期待高效地得到具有高同一性的多核苷酸(例如，DNA)。其中，作为影响杂交的严格度的要素，考虑有温度、探针浓度、探针的长度、离子强度、时间、盐浓度等多个要素，本领域技术人员可以通过对这些要素进行适当选择来实现同样的严格度。
作为上述在高严格条件下杂交的核酸，包含与编码氨基酸序列的核酸具有例如70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、97％以上或99％以上的同一性的核酸。
碱基序列的同一性可以利用上述的同一性检索算法等来确定(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-2268,1990；Proc Natl Acad Sci USA 90:5873,1993)。
需要说明的是，作为编码本发明的抗hMPV抗体的核酸，优选的核酸为编码包含序列号3～5、8～10、13～15、18～20、23～25、28～30、33～35、38～40、43～45、48～50、53～55、58～60、63～65、68～70、73～75、78～80、83～85、88～90、93～95、98～100、103～105、108～110、113～115、118～120、123～125和128～130这26种CDR序列的组合中的任意1个组合的CDR序列的抗体的H链或L链或其抗原结合性片段的DNA，更优选为编码包含序列号2、7、12、17、22、27、32、37、42、47、52、57、62、67、72、77、82、87、92、97、102、107、112、117、122和127中的任意一种VH或VL的抗体的H链或L链或其抗原结合性片段的DNA，或者在高严格条件下与这些核酸(DNA)中的任意一种杂交的分离的核酸。
进一步更优选的核酸为编码序列号1、6、11、16、21、26、31、36、41、46、51、56、61、66、71、76、81、86、91、96、101、106、111、116、121或126的氨基酸序列的核酸，或者在高严格条件下与这些核酸中的任意一种杂交的分离的核酸。
4.本发明的载体、宿主细胞和抗体的制作方法
本发明还涉及整合有上述核酸的载体、导入有该载体的宿主细胞以及使用该载体和该宿主细胞的抗体的制作方法。
本发明的抗体也可以作为使用公知的方法的重组人抗体来制作(参考Nature,312:643,1984、Nature,321:522,1986等)。例如，本发明的抗体可以通过如下方法制作：对导入有本发明的载体的宿主细胞进行培养，从培养上清等中纯化所产生的抗体。更具体而言，可以通过如下方法制造：将编码VH和VL的cDNA分别插入到含有由同一细胞或不同的人细胞制作的编码人抗体CH和/或人抗体CL的基因的动物细胞用表达载体中，构建人抗体表达载体，导入动物细胞中并使其进行表达。
作为用于整合编码本发明的抗体的VH或VL的核酸的载体，不一定是限定的，但优选在蛋白质基因等的表达中通用且特别适合于抗体基因的表达的载体或高表达用载体。作为优选的例子，可以列举含有EF启动子和/或CMV增强子的载体。另外，通常分别制作整合有编码VH或VL的核酸的表达载体并将其共转染到宿主细胞中，但也可以整合到单一的表达载体中。
作为用于导入表达载体的宿主细胞，不一定是限定的，但优选在蛋白质基因等的表达中通用且特别适合于抗体基因的表达的细胞。例如，可以列举细菌(大肠杆菌等)、放线菌、酵母、昆虫细胞(SF9等)、哺乳类细胞(COS-1、CHO、骨髓瘤细胞等)。
为了在工业上生产重组抗体，一般利用稳定地高产该抗体的重组动物细胞株、例如CHO细胞株。这种重组细胞株的制作、克隆化、用于高表达的基因扩增和筛选可以使用公知的方法(例如，参考Omasa T.:J.Biosci.Bioeng.,94,600-605,2002等)。
本发明除了包含由2条重链和2条轻链构成的抗体以外，还包含本发明的抗体的抗原结合性片段。作为抗原结合性片段，例如有Fab(fragment of antigen binding，抗体结合片段)、Fab’、F(ab’)2，作为将抗体的活性片段用接头等结合而成的片段，例如有单链抗体(single chainFv：scFv)、二硫键稳定化抗体(disulfide stabilized Fv：dsFv)，作为含有抗体的活性片段的肽，例如可以列举含有CDR的肽。这些片段可以通过将本发明的抗体用适当的蛋白分解酶进行处理的方法或者基因重组技术等公知的方法来制造。
抗体的纯化可以使用盐析法、凝胶过滤法、离子交换层析法或亲和层析法等公知的纯化手段来进行。
此外，也可以通过近年来开发的、利用基因工程技术使重组抗体在噬菌体表面表达的噬菌体展示抗体技术，人工地替换VH、VL基因，以噬菌体融合蛋白质的形式表达多样化的scFv(singlechain Fragment ofvariable region，单链可变区片段)抗体，得到特异抗体。该技术能够避免免疫，作为进一步替代细胞融合法的人源化抗体制作技术得到很高评价。使用该技术以本申请说明书中的序列号2～6、8～12、14～18和20～24的氨基酸序列为参考而制作的特异抗体或其抗原结合性片段属于本发明的技术范围内。
此外，将近年来开发的通过抗体的糖链部分的修饰来大幅改善抗体的ADCC活性的Potellegent技术应用于本发明的抗体而得到的抗体(参考Clin.Cancer Res.,10,6248-6255(2004))、将改善CDC活性的Complegnent技术应用于本发明的抗体而得到的抗体(参考Glycobiology,17,104-118(2007))也属于本发明的技术范围。同样，利用近年来开发的通过对抗体的恒定区部分的氨基酸序列进行修饰来改变ADCC活性(WO2007/039682和WO2007/100083)、CDC活性(WO2007/011041和WO2011/091078)的方法而得到的抗体也属于本发明的技术范围。
此外，应用为了对该抗体附加抗蛋白酶能力、使抗体能够口服施用而进行的Fc区域的部分取代技术(参考WO2006/071877)而得到的抗体或其抗原结合性片段属于本发明的技术范围内。
需要说明的是，作为抗体制作的方法，通常利用小鼠、兔、山羊等实验动物来获得多克隆抗体、单克隆抗体，但这样得到的抗体具有所使用的动物种的特征性序列，因此，如果直接施用于人，有时会被人免疫系统识别为异物而引起人抗动物抗体应答(即，产生抗体的抗体)。
本发明的抗hMPV单克隆抗体或其抗原结合性片段可以由健康人等的血液来源的抗体产生细胞获得，该抗体为完全人抗体。认为该完全人抗体即使作为抗体药物施用于人体，也不具有免疫原性，观察不到免疫反应。
需要说明的是，特别是对于本发明的抗hMPV的F蛋白质的单克隆抗体而言，具有比以往的抗hMPV抗体更高的中和能力，因此，能够以更少的施用量期待相同程度的治疗效果。
5.含有本发明的抗体的药物组合物
接下来，本发明提供含有上述抗体或其抗原结合部分以及药学上可容许的载体的、用于治疗或预防由hMPV引起的呼吸器官疾病的药物组合物。
特别地，本发明的抗hMPV抗体或其抗原结合性片段与hMPV的F蛋白质特异性结合且具有比以往的抗hMPV的F蛋白质抗体更高的中和能力，因此，作为hMPV相关疾病的预防或治疗药有用。
本说明书中使用的“药学上可容许的载体”包括生理学上可适合的任意的或全部的溶剂、分散介质、包衣剂、等渗剂和吸收延缓剂等。
药学上可容许的载体的例子包括水、盐类溶液、磷酸缓冲的生理盐水、右旋糖、甘油、乙醇等中的1种或多种以及它们的组合。在作为注射剂等使用的情况下，优选在组合物中含有pH调节剂、等渗剂，例如糖、甘露醇、山梨醇等多元醇或氯化钠。药学上可容许的载体中可以进一步含有润湿剂、乳化剂、防腐剂、缓冲剂、稳定剂等增强抗体或抗体部分的保存性或有效性的少量的辅助物质。
本发明的组合物可以制成各种剂型。这样的组合物包括例如溶液(例如可注射、可输液的溶液)、分散液、悬浊液、片剂、胶囊、含片、丸剂、粉末、脂质体、栓剂等液体、半固体、固体的剂型。优选的形式根据所需的施用方式和治疗的适用例而不同。一般而言，优选的组合物为与用于使用其他抗体对人进行被动免疫的组合物同样的组合物等可注射或可输液的溶液的形式的组合物。优选的施用方式为非口服方式(例如经由静脉内、皮下、腹腔内、肌肉内)。在优选的实施方式中，抗体通过静脉输液或静脉注射来施用。在另一优选的实施方式中，抗体通过肌肉内注射或皮下注射来施用。
本发明的抗体和抗体片段可以掺入到适合于非口服施用的药品组合物中。在使用单一种类的抗体或抗体部分的情况下，优选制备成含有0.1～250mg/mL的抗体的可注射的制剂。另一方面，在混合使用多个种类的抗体的情况下，优选制备成含有0.001～100mg/mL的抗体的可注射的制剂。需要说明的是，该多个种类的抗体的混合比例可以适当设定。
可注射的制剂可以通过将有效成分溶解于液体而成的制剂或者将有效成分冷冻干燥而成的制剂装入透明玻璃瓶、棕色玻璃瓶、安瓿瓶或预充式注射器而构成。缓冲剂可以使用pH5.0～7.0(最佳的情况下为pH6.0)的L-组氨酸(1～50mM)、最佳的情况下为5～10mM的L-组氨酸。其他适当的缓冲剂包括琥珀酸钠、柠檬酸钠、磷酸钠或磷酸钾，但不限于这些。为了改变浓度为0～300mM的溶液(就液体剂型而言，最佳的情况下为150mM)的渗透压，可以使用氯化钠。冷冻干燥的剂型中可以含有冷冻保护物质，主要为0～10％(最佳的情况下为0.5～5.0％)的蔗糖。其他适当的冷冻保护物质包括甘露醇、海藻糖和乳糖。冷冻干燥的剂型中可以含有增量剂，主要为1～10％的甘露醇(最佳的情况下为2～4％)。液体和冷冻干燥的剂型这两者中可以使用稳定剂，主要为1～50mM(最佳的情况下为5～10mM)的L-蛋氨酸。其他适当的稳定剂包括甘氨酸、精氨酸和聚山梨醇酯80等，在聚山梨醇酯80的情况下，可以含有0～0.05％(最佳的情况下为0.005～0.01％)。其他表面活性剂包括聚山梨醇酯20和BRIJ表面活性剂，但不限于这些。
本药物组合物通常在制造和储存的条件下必须无菌或稳定。该组合物可以配制成溶液、微乳液、分散液、脂质体或适合于高药物浓度的其他有序结构。无菌的可注射的溶液可以通过将所需量的活性化合物(即，抗体或抗体部分)根据需要与上述成分中的1种或组合一同混合到适当的溶剂中、然后进行过滤灭菌来制备。通常，将活性化合物混合到含有基本的分散介质和选自上述列举的成分中的必要的其他成分的无菌载体(vehicle)中，由此制备分散液。在用于制备无菌的可注射的溶液的无菌粉末制剂的情况下，优选的制备方法为如前所述的该灭菌过滤溶液的冷冻真空干燥和喷雾干燥，由此，得到除了活性成分的粉末以外还含有任意的其他期望成分的组合物。溶液的适当的流动性例如可以通过如下方法来维持：使用卵磷脂等的包衣；另外，在分散液的情况下，维持所需的粒度；另外，使用表面活性剂。可注射的组合物的长时间的吸收可以通过在该组合物中含有延缓吸收的药剂例如单硬脂酸盐、明胶来进行。
6.获得本发明的抗hMPV抗体及其抗原结合性片段的步骤
接下来，对得到本发明的抗hMPV单克隆抗体及其抗原结合性片段的步骤进行说明，但得到本发明的抗体等的方法不受这些记载的任何限定，如上所述，当然可以进行该技术领域中的常规变更。
本发明的抗hMPV抗体及其抗原结合性片段可以通过如下方法得到：从人的血液中经过各种步骤分离产生该抗体的细胞克隆，对从抗体产生细胞克隆的培养上清中得到的抗体进行亲和纯化。
1)抗hMPV的F蛋白质的完全人抗体产生细胞克隆的分离
从人的血液中分离B淋巴细胞，诱导该B淋巴细胞的增殖。增殖诱导的方法本身是公知的，例如可以通过使用成为癌症的诱发因子的“爱泼斯坦-巴尔病毒(EB病毒)”(Epstein-Barr virus)(以下称为EBV)的转化法(D.Kozbor等)来进行。
即，使上述B淋巴细胞感染EBV来进行增殖诱导，将增殖后的细胞制成抗体产生细胞文库。
2)从抗体产生细胞文库中回收单克隆抗体
从增殖诱导的细胞中回收单克隆抗体的方法可以通过单克隆抗体的制作中常用的公知的方法来进行。
从上述抗体产生细胞文库中选出产生与hMPV的F蛋白质结合的抗体的淋巴细胞克隆，从其培养上清中提取抗体。即，通过有限稀释法从上述抗体产生细胞文库中筛选产生与hMPV的F蛋白质结合的抗体的细胞群体(克隆)。
与hMPV的F蛋白质结合的克隆的检测可以采用以该F蛋白质作为抗原的ELISA和使用标记小鼠抗人IgG抗体的ELISA来进行。或者，也可以使用如下方法(细胞荧光免疫染色筛选法)：将F蛋白质表达载体导入细胞中，使用固定有表达该F蛋白质的细胞的筛选板，对hMPV抗体进行检测。
对选出的抗体阳性细胞群体进行培养并反复筛选，由此能够得到仅产生目标抗体的细胞群体(克隆)。将表示直至以上的抗体产生细胞克隆的分离为止的步骤的流程图示于图1。
3)使用蛋白质A或G的亲和纯化
为了纯化抗hMPV抗体，可以使挑选出的细胞在培养皿、转瓶、2升的旋转烧瓶或其他培养体系中增殖。
将所得到的培养上清过滤、浓缩后，供于利用蛋白A或蛋白G-琼脂糖(GE Healthcare公司)等的亲和层析，能够对该蛋白质进行纯化。将缓冲液更换为PBS，通过OD280或优选通过浊度仪分析，能够判定浓度。同种型可以通过对同种型抗原具有特异性的方法来考察。这样得到的抗hMPV抗体是由在人体内致敏的B淋巴细胞制作的完全人抗体，因此针对抗体的免疫反应的可能性低。
另外，关于抗体产生细胞克隆制作，利用具有感染B淋巴细胞而增殖诱导的活性的EB病毒这一点也是特征性的。
EB病毒法的优点在于，能够制作在人体内制作的天然抗体以及能够得到亲和性高的抗体。例如已经阐明了：抗某种病毒(例如，人CMV)的人抗体的亲和性比对小鼠进行人工免疫而制作的抗体的亲和性高约10倍～约100倍。因EB病毒感染而增殖的B淋巴细胞群体成为抗体产生细胞的文库。从该文库中分离特定的抗体产生细胞克隆，从而能够得到人抗体。
7.评价在体外的活性的步骤
抗体或抗体组合物的生物学特性可以通过试验该抗体在体外抑制hMPV的F蛋白质的生物活性的能力来评价。抗体的体外评价法包括ELISA等结合分析法和中和分析法等。
1)结合活性
在此，“特异性结合”或“特异性的结合”是指识别预定的抗原并与其结合。测定抗体与hMPV的F蛋白质的结合亲和性可以使用公知的方法。例如，可以使用固定化于芯片上的F蛋白质，通过BiacoreT200(注册商标)这样的蛋白质相互作用分析装置来测定。结合亲和性(KD值)用该测定法中得到的Kd(解离常数)与Ka(结合常数)之比(KD＝Kd/Ka)来表示。本发明的人抗hMPV抗体或其抗原结合性片段优选对JPS02-76(hMPV_B1型)的F蛋白质的结合亲和性(KD值)为1×10-8M以下，优选为1×10-9M以下，更优选为6×10-10M以下。
2)体外中和活性
本说明书中使用的“中和”、“抑制效果”、“抑制”、“阻抑”、“能够抑制”等术语是指，使由抗原(hMPV)引起的生物活性降低约5～100％，优选降低10～100％，更优选降低20～100％，更优选降低30～100％，更优选降低40～100％，更优选降低50～100％，更优选降低60～100％，更优选降低70～100％，进一步优选降低80～100％。
关于抗hMPV抗体的体外中和能力评价，可以使用hMPV的4个亚组(A1、A2、B1和B2型)的代表性细胞株来实施(J.Vorol.2008p8942-8946)。例如，作为使用的hMPV株，使用作为A1型的JPS03-180株、作为A2型的JPS03-178株、作为B1型的JPS02-76株和作为B2型的JPS05-21株，在抗hMPV抗体存在下考察对LLC-MK2细胞的感染能力，由此能够评价该抗体的中和能力。
作为参考，使用虽为小鼠抗体但在迄今报道的抗hMPV抗体中据报道对hMPV的A1、A2、B1、B2中的任一类型的细胞株均具有高中和活性的抗体mAb338(WO2006/110214)、以及作为人抗体的对RSV和hMPV均显示出高中和活性的HMB3210(WO2013/140247)共同作为阳性对照。
本发明的抗hMPV抗体或其抗原结合性片段在使用LLC-MK2细胞的hMPV感染能力的评价系统中对JPS03-180(A1型)、JPS03-178(A2型)、JPS02-76(B1型)和JPS05-21(B2型)中的任意一株在优选约2.3μg/mL(约15nM)以下、更优选约1μg/mL(约6.7nM)以下、进一步更优选约0.6μg/mL(约4nM)以下、最优选约0.3μg/mL(约2nM)以下具有50％的感染抑制活性(IC50)。或者，对JPS03-180(A1型)、JPS03-178(A2型)、JPS02-76(B1型)和JPS05-21(B2型)中的任意一株在优选约3.5μg/mL(约23nM)以下、更优选约2μg/mL(约13.3nM)以下、进一步更优选约1μg/mL(约6.7nM)以下、最优选约0.7μg/mL(约4.7nM)以下具有90％的感染抑制活性(IC90)。
或者，在使用JPS03-178(A2型)的评价系统中，在约2μg/mL(约13.3nM)以下、优选约1μg/mL(约6.7nM)以下、更优选约0.5μg/mL(约3.3nM)以下、进一步优选约0.2μg/mL(约1.33nM)以下、进一步更优选约0.1μg/mL(约0.67nM)以下、最优选约0.03μg/mL(约0.2nM)以下具有50％的感染抑制活性(IC50)的人抗体或其抗原结合性片段包含在本发明中。
或者，在使用JPS03-178(A2型)的评价系统中，在约6μg/mL(约40nM)以下、优选约1μg/mL(约6.7nM)以下、更优选约0.2μg/mL(约1.33nM)以下、进一步优选约0.1μg/mL(约0.67nM)以下具有90％的感染抑制活性(IC90)的人抗体或其抗原结合性片段包含在本发明中。
3)细胞间感染阻止活性
hMPV为了从细胞感染至细胞而需要使FP开裂，但作为体外的hMPV感染的宿主细胞的LLC-MK2细胞、VERO细胞不具有使FP开裂的活性。因此，将具有FP的开裂活性的膜型丝氨酸蛋白酶(TMPRSS2)导入到LLC-MK2细胞中，制作稳定表达TMPRSS2的宿主细胞，使hMPV感染所得到的TMPRSS2稳定表达细胞，利用该系统能够评价抗hMPV抗体的细胞间感染阻止活性。在利用使作为hMPV的B1型的JPS02-76株感染上述宿主细胞的系统来评价抗hMPV抗体的细胞间感染阻止活性时，在约0.2μg/mL(约1.33nM)以下、优选约0.1μg/mL(约0.67nM)以下、更优选约0.05μg/mL(约0.33nM)以下、进一步更优选约0.02μg/mL(约0.133nM)以下具有50％的细胞间感染抑制活性(IC50)的人抗体或其抗原结合性片段包含在本发明中。
8.表位组的分类
抗hMPV抗体的表位的差异可以通过分别考察抗体间的竞争分析和对表达F蛋白质的部分缺失肽的细胞的结合活性来进行评价(参考实施例的“12.表位作图”以及图3和图4)。结果，本发明的抗hMPV抗体可以分类为5个表位组(Group1、Group2、Group3、Group4和Group5)。即，Group1(与FP和HR1缺失突变体结合而不与F2、F1-1、F1-2、F1-3、F1-4、F1-5和F1-6缺失突变体结合的抗体的组)包括EV046115b、EV046130和EV046147。Group2(与FP、HR1、F1-4、F1-5和F1-6缺失突变体结合而不与F2、F1-1、F1-2和F1-3缺失突变体结合的抗体的组)包括mAb338、EV046113、EV046116、EV046141和EV046142。Group3(与FP、F1-4、F1-5和F1-6缺失突变体结合而不与F2、HR1、F1-1、F1-2和F1-3缺失突变体结合的抗体的组)包括EV046124、EV046143和EV046150。Group4(与FP、HR1和F1-6缺失突变体结合而不与F2、F1-1、F1-2、F1-3、F1-4和F1-5缺失突变体结合的抗体的组)包括EV046120和EV046135。并且，Group5(与FP、HR1、F1-1、F1-3、F1-4、F1-5和F1-6缺失突变体结合而不与F2和F1-2缺失突变体结合的抗体的组)包括EV046136。因此，本发明的抗hMPV抗体为与hMPV的F蛋白质结合的抗体或其抗原结合性片段，但优选为属于由上述Group1、Group2、Group3、Group4或Group5定义的任意一个表位组的抗体或其抗原结合性片段，更优选为属于由Group2、Group3、Group4或Group5定义的任意一个表位组的抗体或其抗原结合性片段，进一步更优选为属于由Group3、Group4或Group5定义的任意一个表位组的抗体或其抗原结合性片段，进一步最优选为属于由Group3定义的表位组的抗体或其抗原结合性片段。
在表位组的分类中，将在迄今报道的抗hMPV抗体中对hMPV的A1、A2、B1、B2中的任一类型的细胞株均具有高中和活性且有表位分析报道(F蛋白质的氨基酸238-245)的小鼠抗体mAb338(WO2006/110214)、以及作为人抗体的与hMPV和RSV这两者的F蛋白质结合的HMB3210(WO2013/140247)共同作为对照进行了测定。
以下，通过实施例更具体地对本发明进行说明，但本发明不受这些实施例的任何限制。本实施例中使用的程序若非特别提及，则可以参考Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第3版)(Sambrook等,冷泉港实验室出版社,2001)。
实施例
1.抗hMPV的完全人抗体产生细胞克隆的分离
将直至抗体产生细胞克隆分离为止的流程图示于图1。
从人外周血中分离B淋巴细胞，使其感染EBV。将感染细胞接种到96孔板中，培养3～4周后，进行培养上清中的抗hMPV抗体的一次筛选。将确认到抗hMPV抗体产生的各孔的细胞接种到新的96孔板中。培养3～4周后，进行抗hMPV抗体的二次筛选。将所得到的抗体阳性孔的细胞以每孔1～30个接种到新的96孔板中。培养3～5周后，进行抗hMPV抗体的三次筛选。通过该有限稀释培养等进行克隆操作的结果，得到了产生目标抗体的细胞克隆。
2.抗hMPV抗体的细胞荧光免疫染色筛选
筛选以抗融合蛋白(FP)的抗体作为对象，该融合蛋白为hMPV的主要中和靶标。从hMPV(JPS02-76)中提取RNA，利用十碱基随机引物(Random Decamers)合成cDNA。通过PCR扩增FP基因的全长，将其克隆到表达载体中。将克隆的FP基因的碱基序列和氨基酸序列分别示于序列号131和132。克隆的FP基因与gene bank中登记的原始序列(GenBank登记号AY530089)相差2个碱基，1个部位的氨基酸存在取代。
将FP表达载体导入CHO-K1细胞中，16小时后重新接种到96孔板或384孔板中。基因导入使用lipofection LTX(Invitorgen)和plus试剂(Invitorgen)在制造商的推荐条件下进行。然后，将培养24小时后的CHO-K1细胞用4％多聚甲醛、0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.4)固定。接着，用PBS-0099PBS(-)、0.1％Tween20清洗，用1×PBS(-)、0.2％TritonX-100进行透过处理。将所制作的板作为抗hMPV抗体筛选板使用。
将EBV感染细胞的培养上清添加到抗hMPV抗体筛选板中，在室温下反应1小时后，用PBS-T清洗3次。接着，将作为二次抗体的抗人IgG-Alexa488(Invitorgen)用PBS-T、0.1％FCS稀释1000倍后添加，在室温下反应1小时后，用PBS-T清洗1次。接着，添加0.8μg/ml DAPI、PBS-T，在室温下反应10分钟后，用PBS-T清洗2次，添加1×PBS(-)。
利用In Cell Analyzer2000(GE Healthcare)拍摄染色细胞，将检测到阳性细胞的孔作为抗体阳性孔。
3.抗体同种型和亚类的确认
使用分离的抗体产生细胞克隆的培养上清，通过细胞荧光免疫染色法确认所产生的抗体的同种型。即，使用抗hMPV抗体筛选板，作为二次抗体，使用对各同种型和亚类具有特异性的抗体。将所得到的13种抗hMPV抗体的同种型和亚类示于后述的表2。
4.编码抗hMPV抗体的DNA的克隆
使用寡聚dT引物从抗体产生细胞的总RNA进行逆转录，以所得到的cDNA作为模板，通过PCR法进行抗体基因的扩增。PCR中使用的引物基于编码人IgG抗体H链和L链的cDNA的数据库来设计。为了扩增全长的H链cDNA和L链cDNA，5’末端侧引物具有翻译起始点，3’末端侧引物具有翻译终止点。
5.基于碱基序列的抗体的氨基酸序列的确定
将通过PCR法扩增的各抗体的H链和L链的cDNA插入质粒载体中，利用ABI测序仪确认各自的碱基序列。由所得到的碱基序列分别确定抗体的信号序列、H链和L链的氨基酸序列、可变区的氨基酸序列和互补决定区(CDR)的氨基酸序列。CDR的分析使用Kabat的方法(www.bioinf.org.uk:Dr.Andrew C.R.Martin’s Group,Antibodies:GeneralInformation)。将所得到的抗体的H链和L链的氨基酸序列、可变区的氨基酸序列和互补决定区(CDR)的氨基酸序列的序列号分别示于表1。
6.确认所得到的抗体基因编码抗hMPV抗体
将所得到的H链和L链的基因分别插入到表达载体中，并同时导入CHO-K1细胞中。基因导入使用lipofection LTX(Invitorgen)和plus试剂(Invitorgen)在制造商的推荐条件下进行。2天后回收培养上清，通过使用包被有抗人IgG抗体的96孔板的ELISA法确认培养上清中的抗体为人IgG，通过使用抗hMPV抗体筛选板的细胞荧光免疫染色法确认该抗体与hMPV的FP结合。
7.抗体蛋白质的产生
将所得到的抗hMPV抗体表达载体导入CHO-K1细胞中，在选择标记物存在下进行培养，由此得到恒定地产生抗体的CHO-K1细胞克隆。
将该抗体稳定产生CHO-K1株在无血清培养基中培养，回收培养上清。将该培养上清供于使用蛋白质A柱的亲和纯化，得到纯化抗体。柱使用HiTrap rProteinA FF(GE Healthcare)的预充柱，在制造商的推荐条件下进行纯化。纯化后，利用抗hMPV抗体筛选板确认抗体对hMPVFP的结合性。另外，通过SDS-PAGE进行抗体H链(约50kDa)、抗体L链(约25kDa)的确认。
8.中和活性评价
免疫染色法：
作为抗hMPV抗体的有效性评价，对中和活性进行了确认。中和活性通过抗体对LLC-MK2细胞的hMPV感染的阻止率来评价。hMPV的株使用作为B1株的JPS02-76、作为B2株的JPS05-21株、作为A1株的JPS03-180和作为A2株的JPS03-178。
病毒通过以下的方法制备。
在用1×PBS(-)清洗2次后的LLC-MK2细胞中添加病毒液，培养1小时后，添加作为感染培养基的EMEM、5mM蔗糖、2mM L-谷氨酰胺、0.5μg/ml胰蛋白酶，培养至出现CPE，然后，将未感染的LLC-ML2细胞与感染细胞以1:9混合，在感染培养基中培养至出现CPE，制备感染率100％的种子感染细胞。作为病毒液，将未感染的LLC-MK2细胞与种子感染细胞以1:9混合，在感染培养基中培养至出现CPE，回收培养上清。然后，根据需要通过离心分离(20000g、4℃、2.5小时)对病毒进行浓缩、分注，使用冷冻保存于-80℃的病毒。
中和活性评价通过以下的方法进行。
对于纯化抗hMPV抗体，从10μg/ml起准备6个梯度的4倍稀释系列。将0.8-1.4×104pfu/ml的病毒液与纯化抗体以1:1混合，在25℃下放置1小时。将LLC-MK2细胞以100％铺满的方式在前一天接种到96孔板中，在病毒添加前用EMEM清洗2次。在LLC-MK2中添加病毒液和纯化抗体的混合液，在CO2孵箱中培养1小时。然后，将细胞用EMEM清洗3次，添加EMEM、5mM蔗糖、2mM L-谷氨酰胺，在CO2孵箱中培养20小时。为了检测感染细胞，将细胞用80％丙酮固定，添加1％BSA、1×PBS(-)，在室温下封闭1小时。接着，将小鼠抗hMPV抗体(HMPV123、AbD Serotec)以达到1μg/ml的方式用PBS-T、0.1％山羊血清稀释后添加，在室温下反应1小时。然后，用PBS-T清洗3次，将作为二次抗体的抗小鼠IgG-Alexa488(Invitorgen)稀释3000倍，将DAPI以达到0.4μg/ml的方式用PBS-T、0.1％山羊血清稀释后添加，在室温下反应1小时。然后，用PBS-T清洗3次，添加1×PBS(-)。使用In Cell Analyzer2000拍摄染色细胞，计数阳性细胞。
中和活性评价中的阴性对照使用对hMPV不具有特异性的人单克隆抗体(hIgG)。将阴性对照的感染细胞数的平均值设为0％感染阻止率，由各抗体的各浓度下的感染阻止率算出IC50(由夹着抑制率50％的2个抗体浓度和抑制率算出)(表2)。
关于作为人来源抗hMPV抗体的DSλ7(Fab)，已表明其对B2株和A1株的中和活性(IC60)分别为>59μg/mL(1180nM)和9.8μg/mL(196nM)，几乎观察不到中和活性(WO2008/043052和J.Virol.,2007(vol.81)p8315)。另外，关于同时报道的其他人抗体(DS1、DS6、ACN044等(均为Fab))，在A2株以外的3种类型(A1、B1和B2型)中，完全观察不到中和活性(IC60值：>8μg/mL(160nM))，考虑到上述报道，至少可以说对A1、B1和B2型中的任意一种的IC50值为约1μg/mL(约6.7nM)以下的本发明的抗体显著优于WO2008/043052中公开的人抗体。
[表2]
抗hMPV抗体的同种型和对各hMPV株的IC50
此外，将使用表2所示的数据、使用数据分析软件GraphPad Prism6算出的IC50、IC60和IC90分别示于表3、表4和表5。在这些表3、表4和表5中，追加了对JPS03-178(A2型)的中和活性，并且，作为中和活性的阳性对照，将日本专利JP2008-538353(WO2006/110214)记载的抗hMPV的小鼠抗体mAb338和WO2013/140247记载的人抗体HMB3210基于各专利中公开的信息进行制作来使用。
在求得如上所述重新计算而得到的IC50值(参考表3)和IC60值(参考表4)的情况下，本发明的任意一种抗体对A1、B1和B2型均显示出约1μg/mL以下(约6.7nM以下)的中和活性，可以说本发明的抗体均显著优于WO2008/043052中公开的人抗体。另外，包括A2型在内的IC60值整体为约1～3μg/mL以下。
另外，根据表3的结果，本发明的任意一种抗体在约2.3μg/mL(约15nM)以下对hMPV的任一类型的细胞株均显示出50％抑制效果，可以说具有高中和活性。此外，根据表3的结果，EV046115b、EV046130、EV046147和EV046141以外的抗hMPV抗体对A1、A2、B1和B2中的任意一株在约1μg/mL(约6.7nM)以下均显示出50％抑制效果(IC50)。此外，对于hMPV的A2型，EV046120、EV046124、EV046135、EV046142、EV046143和EV046150均在约0.1μg/mL(约0.67nM)以下显示出50％抑制效果，特别是EV046135、EV046143和EV046150在约0.03μg/mL(约0.2nM)以下显示出50％抑制效果，显著优于HMB3210(139.3ng/mL)。
关于表5的IC90值，除EV046115b以外的所有抗体对A1、A2、B1和B2中的任一类型均在约3.5μg/mL(约23nM)以下显示出90％抑制效果(IC90)。其中，特别是EV046124和EV046150对A1、A2、B1和B2中的任一类型均在约1μg/mL(约6.7nM)以下显示出90％抑制效果(IC90)，可以说具有显著高于HMB3210(约3.6μg/mL以下)的中和活性。此外，EV046124、EV046143和EV046150对hMPV的A2型的IC90值分别为188.1ng/mL、96.71ng/mL和101.1ng/mL，均为约0.2μg/mL(约1.33nM)以下，显示出非常高的中和活性。特别是EV046143和EV046150的IC90值均为约0.1μg/mL(约0.67nM)，显著优于HMB3210(约0.58μg/mL)。
[表3]
抗hMVP抗体对各种hMVP株的IC50
[表4]
抗hMVP抗体对各种hMVP株的IC60
[表5]
抗hMVP抗体对各种hMVP株的IC90
9.细胞间感染阻止活性的评价
进而，作为抗hMPV抗体的有效性评价，对细胞间感染阻止活性进行评价。
hMPV为了感染而需要进行FP的开裂，但作为体外的hMPV感染的宿主细胞的LLC-MK2细胞、VERO细胞不具有使FP开裂的活性，因此，通常在培养基中添加胰蛋白酶。但是，在为了评价细胞间感染阻止活性而持续添加抗体的系统中，胰蛋白酶可能使抗体失活。因此，将据报道具有FP的开裂活性的膜型丝氨酸蛋白酶(TMPRSS2)导入LLC-MK2细胞中，制作稳定表达TMPRSS2的宿主细胞(Shirogane et al.2008J.Virol.82:8942-8946)。
使hMPV感染所得到的TMPRSS2稳定表达细胞，在不添加胰蛋白酶的条件下尝试hMPV的感染扩大，结果，感染细胞数增加，可以确认到Foci。
实际的细胞间感染阻止活性的评价如下进行。使hMPV感染TMPRSS2稳定表达细胞，经过4小时后，以6个梯度添加从40μg/ml起的4倍稀释系列的抗体。在72小时后通过与中和活性评价同样的方法将细胞固定，对感染细胞进行检测。
细胞间感染阻止活性评价中的阴性对照使用对hMPV不具有特异性的人单克隆抗体(hIgG)，阳性对照通过合成日本专利JP2008-538353记载的抗hMPV的抗体mAb338来使用。将阴性对照在各浓度下的感染细胞数的平均值设为0％细胞间感染阻止率，将阳性对照在40μg/ml下的感染细胞数设为100％细胞间感染阻止率，算出各抗体在各浓度下的感染阻止率。将使用数据分析软件GraphPad Prism6对它们的IC50和IC90(ng/ml)进行计算而得到的结果示于表6。
[表6]
抗hMPV抗体的细胞间感染阻止活性
10.亲和性分析
作为抗hMPV抗体的结合活性评价，进行了亲和性分析。
分析中使用的抗原如下制备。将从hMPV(JPS02-76)的FP基因中除去跨膜区(相当于FP的491位至539位的氨基酸残基部分)并附加有His标签的序列(FP-TM(-)-His)克隆到表达载体中。将FP-TM(-)-His表达载体导入CHO-K1细胞中，在选择标记物存在下进行培养，由此得到稳定表达FP-TM(-)-His的CHO-K1细胞克隆。回收FP-TM(-)-His稳定表达细胞的培养上清，使用Ni-Sepharose 6 Fast Flow载体(GEHealthcare)对FP-TM(-)-His进行纯化。纯化后的FP-TM(-)-His通过凝胶过滤而除去咪唑，定量后用于亲和性分析。
亲和性分析使用Biacore T-200进行。利用人IgG捕获试剂盒(GEHealthcare)将抗人IgG固定化于传感芯片上，使其捕获抗hMPV抗体而作为配体。分析物使用上述的纯化FP-TM(-)-His。将抗hMPV抗体对hMPV(JPS02-76)的FP的亲和性示于表4。任意一种抗hMPV抗体对FP的KD值均为10nM以下，显示出非常高的结合活性(表7)。需要说明的是，EV046115b和EV046147在传感芯片上的凝集反应强，无法测定(ND)。
[表7]
抗hMPV抗体的亲和性分析结果
(N.D.：由于传感芯片上的抗体的凝集反应而无法分析)
11.竞争分析
进行抗hMPV抗体的竞争分析。
分析中使用的抗原使用上述亲和性分析中所示的FP-TM(-)-His稳定表达细胞的培养上清。分析使用Biacore T-200进行。在传感芯片NTA(GE healthcare)上捕获FP-TM(-)-His后，使作为样品1的抗hMPV抗体在传感芯片上结合至饱和水平，接着，使作为样品2的另一抗hMPV抗体结合。通过样品2与抗hMPV抗体的结合是否被抑制来判定是否发生竞争。将竞争分析的结果示于图2。需要说明的是，EV046147在传感芯片上的凝集反应强，无法测定。
12.表位作图
为了对抗hMPV抗体的表位进行分类，进行了缺失突变体结合分析。
将制作的缺失突变体示于图3。HA-V5-Full为在hMPV(JPS02-76)FP基因的信号肽(SP)的下游附加有HA标签(HA：TMYPYDVPDYA)、在C-tail(C)的下游附加有接头部分(SLEGPRFE)和V5标签(V5：GKPIPNPLLGLDST)的缺失突变体。将使用的HA-V5-Full的全长碱基序列和氨基酸序列分别示于序列号133和134。
将各缺失突变体克隆到表达载体中，通过与上述细胞荧光免疫染色筛选同样的方法检测抗hMPV抗体的结合。另外，使用抗HA抗体和抗V5抗体，确认了缺失突变体自身得到了表达。将缺失突变体结合分析的结果示于图4。另外，将竞争分析的结果以及表位的分类结果示于图5。
需要说明的是，上述的竞争分析和表位作图使用小鼠抗hMPV抗体mAb338(J.Virol.,2008(vol.89)p3113)和人抗体HMB3210作为对照。
由这些结果可知，HMB3210不属于本发明的抗体中的任意一个表位组，mAb338属于本发明的抗体的表位组2。
产业上的可利用性
本发明的抗人偏肺病毒(hMPV)抗体在用于预防或治疗hMPV相关的疾病的药物组合物等的用途中有用。
Claims (41)
1.一种抗体或其抗原结合性片段，是与人偏肺病毒的F蛋白质特异性结合且能够中和其生物活性的抗体或其抗原结合性片段，其中，
(i)重链的可变区含有：
(a)选自序列号3、13、23、33、43、53、63、73、83、93、103、113和123的氨基酸序列以及在这些氨基酸序列中具有一个～数个氨基酸残基的缺失、取代、插入和/或添加的突变的氨基酸序列的组中的重链CDR1的氨基酸序列、
(b)选自序列号4、14、24、34、44、54、64、74、84、94、104、114和124的氨基酸序列以及在这些氨基酸序列中具有一个～数个氨基酸残基的缺失、取代、插入和/或添加的突变的氨基酸序列的组中的重链CDR2的氨基酸序列、以及
(c)选自序列号5、15、25、35、45、55、65、75、85、95、105、115和125的氨基酸序列以及在这些氨基酸序列中具有一个～数个氨基酸残基的缺失、取代、插入和/或添加的突变的氨基酸序列的组中的重链CDR3的氨基酸序列；
(ii)轻链的可变区含有：
(a)选自序列号8、18、28、38、48、58、68、78、88、98、108、118和128的氨基酸序列以及在这些氨基酸序列中具有一个～数个氨基酸残基的缺失、取代、插入和/或添加的突变的氨基酸序列的组中的轻链CDR1的氨基酸序列、
(b)选自序列号9、19、29、39、49、59、69、79、89、99、109、119和129的氨基酸序列以及在这些氨基酸序列中具有一个～数个氨基酸残基的缺失、取代、插入和/或添加的突变的氨基酸序列的组中的轻链CDR2的氨基酸序列、以及
(c)选自序列号10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120和130的氨基酸序列以及在这些氨基酸序列中具有一个～数个氨基酸残基的缺失、取代、插入和/或添加的突变的氨基酸序列的组中的轻链CDR3的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，
(i)重链的可变区含有：
(a)包含序列号3的氨基酸序列的重链CDR1的氨基酸序列、
(b)包含序列号4的氨基酸序列的重链CDR2的氨基酸序列、以及
(c)包含序列号5的氨基酸序列的重链CDR3的氨基酸序列；
(ii)轻链的可变区含有：
(a)包含序列号8的氨基酸序列的轻链CDR1的氨基酸序列、
(b)包含序列号9的氨基酸序列的轻链CDR2的氨基酸序列、以及
(c)包含序列号10的氨基酸序列的轻链CDR3的氨基酸序列。
3.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，
(i)重链的可变区含有：
(a)包含序列号13的氨基酸序列的重链CDR1的氨基酸序列、
(b)包含序列号14的氨基酸序列的重链CDR2的氨基酸序列、以及
(c)包含序列号15的氨基酸序列的重链CDR3的氨基酸序列；
(ii)轻链的可变区含有：
(a)包含序列号18的氨基酸序列的轻链CDR1的氨基酸序列、
(b)包含序列号19的氨基酸序列的轻链CDR2的氨基酸序列、以及
(c)包含序列号20的氨基酸序列的轻链CDR3的氨基酸序列。
4.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，
(i)重链的可变区含有：
(a)包含序列号23的氨基酸序列的重链CDR1的氨基酸序列、
(b)包含序列号24的氨基酸序列的重链CDR2的氨基酸序列、以及
(c)包含序列号25的氨基酸序列的重链CDR3的氨基酸序列；
(ii)轻链的可变区含有：
(a)包含序列号28的氨基酸序列的轻链CDR1的氨基酸序列、
(b)包含序列号29的氨基酸序列的轻链CDR2的氨基酸序列、以及
(c)包含序列号30的氨基酸序列的轻链CDR3的氨基酸序列。
5.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，
(i)重链的可变区含有：
(a)包含序列号33的氨基酸序列的重链CDR1的氨基酸序列、
(b)包含序列号34的氨基酸序列的重链CDR2的氨基酸序列、以及
(c)包含序列号35的氨基酸序列的重链CDR3的氨基酸序列；
(ii)轻链的可变区含有：
(a)包含序列号38的氨基酸序列的轻链CDR1的氨基酸序列、
(b)包含序列号39的氨基酸序列的轻链CDR2的氨基酸序列、以及
(c)包含序列号40的氨基酸序列的轻链CDR3的氨基酸序列。
6.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，
(i)重链的可变区含有：
(a)包含序列号43的氨基酸序列的重链CDR1的氨基酸序列、
(b)包含序列号44的氨基酸序列的重链CDR2的氨基酸序列、以及
(c)包含序列号45的氨基酸序列的重链CDR3的氨基酸序列；
(ii)轻链的可变区含有：
(a)包含序列号48的氨基酸序列的轻链CDR1的氨基酸序列、
(b)包含序列号49的氨基酸序列的轻链CDR2的氨基酸序列、以及
(c)包含序列号50的氨基酸序列的轻链CDR3的氨基酸序列。
7.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，
(i)重链的可变区含有：
(a)包含序列号53的氨基酸序列的重链CDR1的氨基酸序列、
(b)包含序列号54的氨基酸序列的重链CDR2的氨基酸序列、以及
(c)包含序列号55的氨基酸序列的重链CDR3的氨基酸序列；
(ii)轻链的可变区含有：
(a)包含序列号58的氨基酸序列的轻链CDR1的氨基酸序列、
(b)包含序列号59的氨基酸序列的轻链CDR2的氨基酸序列、以及
(c)包含序列号60的氨基酸序列的轻链CDR3的氨基酸序列。
8.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，
(i)重链的可变区含有：
(a)包含序列号63的氨基酸序列的重链CDR1的氨基酸序列、
(b)包含序列号64的氨基酸序列的重链CDR2的氨基酸序列、以及
(c)包含序列号65的氨基酸序列的重链CDR3的氨基酸序列；
(ii)轻链的可变区含有：
(a)包含序列号68的氨基酸序列的轻链CDR1的氨基酸序列、
(b)包含序列号69的氨基酸序列的轻链CDR2的氨基酸序列、以及
(c)包含序列号70的氨基酸序列的轻链CDR3的氨基酸序列。
9.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，
(i)重链的可变区含有：
(a)包含序列号73的氨基酸序列的重链CDR1的氨基酸序列、
(b)包含序列号74的氨基酸序列的重链CDR2的氨基酸序列、以及
(c)包含序列号75的氨基酸序列的重链CDR3的氨基酸序列；
(ii)轻链的可变区含有：
(a)包含序列号78的氨基酸序列的轻链CDR1的氨基酸序列、
(b)包含序列号79的氨基酸序列的轻链CDR2的氨基酸序列、以及
(c)包含序列号80的氨基酸序列的轻链CDR3的氨基酸序列。
10.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，
(i)重链的可变区含有：
(a)包含序列号83的氨基酸序列的重链CDR1的氨基酸序列、
(b)包含序列号84的氨基酸序列的重链CDR2的氨基酸序列、以及
(c)包含序列号85的氨基酸序列的重链CDR3的氨基酸序列；
(ii)轻链的可变区含有：
(a)包含序列号88的氨基酸序列的轻链CDR1的氨基酸序列、
(b)包含序列号89的氨基酸序列的轻链CDR2的氨基酸序列、以及
(c)包含序列号90的氨基酸序列的轻链CDR3的氨基酸序列。
11.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，
(i)重链的可变区含有：
(a)包含序列号93的氨基酸序列的重链CDR1的氨基酸序列、
(b)包含序列号94的氨基酸序列的重链CDR2的氨基酸序列、以及
(c)包含序列号95的氨基酸序列的重链CDR3的氨基酸序列；
(ii)轻链的可变区含有：
(a)包含序列号98的氨基酸序列的轻链CDR1的氨基酸序列、
(b)包含序列号99的氨基酸序列的轻链CDR2的氨基酸序列、以及
(c)包含序列号100的氨基酸序列的轻链CDR3的氨基酸序列。
12.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，
(i)重链的可变区含有：
(a)包含序列号103的氨基酸序列的重链CDR1的氨基酸序列、
(b)包含序列号104的氨基酸序列的重链CDR2的氨基酸序列、以及
(c)包含序列号105的氨基酸序列的重链CDR3的氨基酸序列；
(ii)轻链的可变区含有：
(a)包含序列号108的氨基酸序列的轻链CDR1的氨基酸序列、
(b)包含序列号109的氨基酸序列的轻链CDR2的氨基酸序列、以及
(c)包含序列号110的氨基酸序列的轻链CDR3的氨基酸序列。
13.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，
(i)重链的可变区含有：
(a)包含序列号113的氨基酸序列的重链CDR1的氨基酸序列、
(b)包含序列号114的氨基酸序列的重链CDR2的氨基酸序列、以及
(c)包含序列号115的氨基酸序列的重链CDR3的氨基酸序列；
(ii)轻链的可变区含有：
(a)包含序列号118的氨基酸序列的轻链CDR1的氨基酸序列、
(b)包含序列号119的氨基酸序列的轻链CDR2的氨基酸序列、以及
(c)包含序列号120的氨基酸序列的轻链CDR3的氨基酸序列。
14.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，
(i)重链的可变区含有：
(a)包含序列号123的氨基酸序列的重链CDR1的氨基酸序列、
(b)包含序列号124的氨基酸序列的重链CDR2的氨基酸序列、以及
(c)包含序列号125的氨基酸序列的重链CDR3的氨基酸序列；
(ii)轻链的可变区含有：
(a)包含序列号128的氨基酸序列的轻链CDR1的氨基酸序列、
(b)包含序列号129的氨基酸序列的轻链CDR2的氨基酸序列、以及
(c)包含序列号130的氨基酸序列的轻链CDR3的氨基酸序列。
15.如权利要求1～14中任一项所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，含有：
(a)选自序列号2、12、22、32、42、52、62、72、82、92、102、112和122的氨基酸序列以及与这些氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的组中的重链可变区(VH)、以及
(b)选自序列号7、17、27、37、47、57、67、77、87、97、107、117和127的氨基酸序列以及与这些氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的组中的轻链可变区(VL)。
16.如权利要求15所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，含有：
(a)包含序列号2的氨基酸序列或者与序列号2的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)、以及
(b)包含序列号7的氨基酸序列或者与序列号7的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
17.如权利要求15所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，含有：
(a)包含序列号12的氨基酸序列或者与序列号12的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)、以及
(b)包含序列号17的氨基酸序列或者与序列号17的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
18.如权利要求15所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，含有：
(a)包含序列号22的氨基酸序列或者与序列号22的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)、以及
(b)包含序列号27的氨基酸序列或者与序列号27的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
19.如权利要求15所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，含有：
(a)包含序列号32的氨基酸序列或者与序列号32的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)、以及
(b)包含序列号37的氨基酸序列或者与序列号37的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
20.如权利要求15所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，含有：
(a)包含序列号42的氨基酸序列或者与序列号42的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)、以及
(b)包含序列号47的氨基酸序列或者与序列号47的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
21.如权利要求15所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，含有：
(a)包含序列号52的氨基酸序列或者与序列号52的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)、以及
(b)包含序列号57的氨基酸序列或者与序列号57的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
22.如权利要求15所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，含有：
(a)包含序列号62的氨基酸序列或者与序列号62的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)、以及
(b)包含序列号67的氨基酸序列或者与序列号67的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
23.如权利要求15所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，含有：
(a)包含序列号72的氨基酸序列或者与序列号72的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)、以及
(b)包含序列号77的氨基酸序列或者与序列号77的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
24.如权利要求15所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，含有：
(a)包含序列号82的氨基酸序列或者与序列号82的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)、以及
(b)包含序列号87的氨基酸序列或者与序列号87的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
25.如权利要求15所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，含有：
(a)包含序列号92的氨基酸序列或者与序列号92的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)、以及
(b)包含序列号97的氨基酸序列或者与序列号97的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
26.如权利要求15所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，含有：
(a)包含序列号102的氨基酸序列或者与序列号102的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)、以及
(b)包含序列号107的氨基酸序列或者与序列号107的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
27.如权利要求15所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，含有：
(a)包含序列号112的氨基酸序列或者与序列号112的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)、以及
(b)包含序列号117的氨基酸序列或者与序列号117的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
28.如权利要求15所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，含有：
(a)包含序列号122的氨基酸序列或者与序列号122的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)、以及
(b)包含序列号127的氨基酸序列或者与序列号127的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
29.如权利要求1～28中任一项所述的抗体或其抗原结合性片段，该抗体的表位在按照对F蛋白质的部分缺失肽的结合活性进行分类的情况下，属于由抗hMPV抗体EV046115b、EV046130和EV046147代表的表位组Group1、由抗hMPV抗体EV046113、EV046116、EV046141和EV0461142代表的表位组Group2、由抗hMPV抗体EV046124、EV046143和EV046150代表的表位组Group3、由抗hMPV抗体EV046120和EV046135代表的表位组Group4以及由抗hMPV抗体EV046136代表的表位组Group5中的任意一个表位组。
30.如权利要求1～28中任一项所述的抗体或其抗原结合性片段，该抗体的表位在按照对F蛋白质的部分缺失肽的结合活性进行分类的情况下，属于由抗hMPV抗体EV046113、EV046116、EV046141和EV0461142代表的表位组Group2、由抗hMPV抗体EV046124、EV046143和EV046150代表的表位组Group3、由抗hMPV抗体EV046120和EV046135代表的表位组Group4以及由抗hMPV抗体EV046136代表的表位组Group5中的任意一个表位组。
31.如权利要求1～28中任一项所述的抗体或其抗原结合性片段，该抗体的表位在按照对F蛋白质的部分缺失肽的结合活性进行分类的情况下，属于由抗hMPV抗体EV046124、EV046143和EV046150代表的表位组Group3。
32.如权利要求1～31中任一项所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，所述抗体的类别(亚类)为IgG1(κ)或IgG1(λ)。
33.如权利要求1～32中任一项所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，所述抗体或其抗原结合性片段对人偏肺病毒JPS02-76(B1型)、JPS05-21(B2型)和JPS03-180(A1型)中的任意一株的中和活性(IC50)均为1μg/mL(约6.7nM)以下。
34.如权利要求1～32中任一项所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，所述抗体或其抗原结合性片段对人偏肺病毒JPS03-180(A1型)、JPS03-178(A2型)、JPS02-76(B1型)和JPS05-21(B2型)中的任意一株的中和活性(IC50)均为约1μg/mL(约6.7nM)以下。
35.如权利要求1～32中任一项所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，所述抗体或其抗原结合性片段对人偏肺病毒JPS03-180(A1型)、JPS03-178(A2型)、JPS02-76(B1型)和JPS05-21(B2型)中的任意一株的中和活性(IC90)均为约2μg/mL(约13.3nM)以下。
36.如权利要求1～32中任一项所述的抗体或其抗原结合性片段，其中，所述抗体或其抗原结合性片段对人偏肺病毒的JPS03-178株(A2型)的中和活性(IC50)为约0.1μg/mL(约0.67nM)以下。
37.一种药物组合物，其含有权利要求1～36中任一项所述的抗体或其抗原结合性片段以及药学上可容许的载体。
38.如权利要求37所述的药物组合物，其用于治疗或预防人偏肺病毒感染症。
39.编码权利要求1～36中任一项所述的抗体或其抗原结合性片段的氨基酸序列的分离的核酸、编码序列号1、6、11、16、21、26、31、36、41、46、51、56、61、66、71、76、81、86、91、96、101、106、111、116、121和126的氨基酸序列的分离的核酸、或者在高严格条件下与这些核酸中的任意一种杂交的分离的核酸。
40.一种重组表达载体，其整合有权利要求39所述的分离的核酸。
41.一种宿主细胞，其导入有权利要求40所述的重组表达载体。
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