CN105693829B - 一种b型禽偏肺病毒f蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种B型禽偏肺病毒F蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。本发明的F蛋白可用于制备疫苗。本发明的F蛋白制备的B型禽偏肺病毒亚单位疫苗具有抗原稳定性高，纯度高，特异性强，不产生其他不相关抗体，检测方法方便准确的特点，为工业化生产B型禽偏肺病毒亚单位疫苗奠定了坚实的基础。

Description

一种B型禽偏肺病毒F蛋白
技术领域
本发明属于疫苗制备技术领域，具体涉及一种B型禽偏肺病毒F蛋白。
背景技术
禽偏肺病毒属于副黏病毒肺病毒属，基因组为不分节段的单股负链RNA，可引起火鸡发生呼吸道疾病，称为火鸡鼻气管炎；感染鸡后引起病毒性气囊炎，鼻气管炎和肿头综合征,产蛋下降。20世纪70年代末，禽偏肺病毒引起的疾病首次在南非报道，随后在北美、南美、中东、远东都有发生。1989年美国首次分离到此病毒。在分离此病毒的同时，往往可分离到波氏杆菌、巴氏杆菌、假单胞杆菌、鼻气管炎鸟疫杆菌、粪产碱杆菌等。禽偏肺病毒能使气管纤毛的活动受到抑制，气管中的灰尘向外排出困难，灰尘中所带的大量细菌很容易发生继发感染，侵害呼吸道。病原禽偏肺病毒可分为三个型：A型感染火鸡，B型感染肉鸡，C型只在美国存在，A和B两型有交叉保护作用，与C型无交叉保护作用。随着我国禽业养殖规模的不断扩大，因禽偏肺病毒感染导致的继发感染也日益严重，对养禽业的危害非常严重，唯一有效办法是通过接种疫苗来预防鸡群的发病。
现有的禽偏肺病毒疫苗均为传统疫苗，是使用完整的病原体作为制苗用抗原。传统的灭活疫苗和弱毒疫苗，具有独特的优势如免疫后抗体均一，抗体效价也较高，但目前制造疫苗使用的毒株与临床流行毒株的抗原性存在较大差异，从而影响了攻毒保护效果，制约灭活疫苗的应用。弱毒疫苗的另一个问题是可能出现毒力返强的问题，存在接种疫苗后发病的情况，生物安全不能完全保证。而且，使用全病毒抗原制备的传统疫苗免疫后产生的抗体，在临床上无法区分野毒感染或是疫苗免疫产生，干扰疫情的监测。这是目前传统疫苗存在的不足。为解决传统疫苗的问题，就需要筛选新的毒株或者开发新的亚单位疫苗以克服现有疫苗的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种B型禽偏肺病毒F蛋白，即一种新型的B型禽偏肺病毒抗原，从而弥补现有技术的不足。
本发明首先提供一种B型禽偏肺病毒F蛋白，包含有：
1)氨基酸序列为SEQ ID NO:1的蛋白，
2)在1)的蛋白上取代、缺失、添加一个或几个氨基酸，且具有1)中蛋白功能的蛋白；
编码上述F蛋白的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO:2；
本发明的F蛋白可用于制备疫苗，优选为亚单位疫苗。
本发明的F蛋白制备的B型禽偏肺病毒亚单位疫苗具有抗原稳定性高，纯度高，特异性强，不产生其他不相关抗体，检测方法方便准确的特点，为工业化生产B型禽偏肺病毒亚单位疫苗奠定了坚实的基础。
附图说明
图1：本发明实施例1的F基因PCR扩增鉴定图；
图2：本发明F基因的核苷酸序列比对图；
图3：本发明F蛋白的氨基酸序列比对图；
图4：本发明实施例高效表达载体的酶切鉴定图；
图5：本发明实施例重组菌株X33-F的PCR鉴定图；
图6：本发明实施例重组菌发酵诱导表达产物的SDS-PAGE电泳检定图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细的说明。
实施例1：F蛋白的扩增及序列分析
2010年在山东省多个种鸡场出现了肿头综合症的症状，而发病鸡群之前已经注射了已有的禽肺病毒疫苗，推测感染的病毒发生了变异；因此从发病个体中进行禽肺病毒的筛选。最终筛选出了一株禽肺病毒SHS/A3。
为验证筛选的病毒的抗原性，使用了包含筛选毒株SHS/A3在内的5个不同来源的病毒株作为抗原制备疫苗，免疫SPF鸡后用SHS/A3株病毒液进行攻毒实验，结果表明相比于其它禽肺病毒疫苗；其本身制备的疫苗具有更好的免疫效果(p＜0.05)；因此确定其发生了遗传上的变异。
1、扩增B型禽偏肺病毒SHS/A3株(APV)F基因
根据NCBI中发表的F基因序列，设计并合成了引物,引物的序列信息如下：
primer1：5′-GGGATGTACCTCAAACTGCTACTAAT-3′；
primer2:5′-TCAACTGATGTAGCCCATGTTGC-3′。
2、PCR扩增F基因克隆与序列测定
提取SHS/A3株的核酸作为模板，用引物primer1和primer2进行PCR扩增目的片段，经序列测定(图1为B型禽偏肺病毒F蛋白基因PCR的扩增鉴定图)，结果核苷酸序列为SEQ IDNO:2；其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。与NCBI中已公布的B型禽偏肺病毒的F基因进行核苷酸序列比对分析，结果同源性在95.1％～99.2％(图2为SHS/A3株F基因的核苷酸序列比对图)；推导的氨基酸序列同源性为95.0％～97.4％(图3为SHS/A3株F蛋白的氨基酸序列比对图)。结果表明，分离的SHS/A3株为新的B型禽偏肺病毒，含有新的F基因。
3、设计并合成B型禽偏肺病毒(APV)F基因
根据SHS/A3株F基因的序列测定结果，设计合成一对引物,引物的序列信息如下：
primer3：5′-GGGGGTACCATGTACTTGAAGTTGCAATTG-3′；
primer4:5′-GCGGCCGCTCAACTGATGTAACCCATGT-3′。
以合成的核苷酸序列为SEQ ID NO:2的F基因为模板，用引物primer3和primer4进行PCR扩增，目的片段产物回收连接pMD18-T载体，转化和筛选阳性克隆pMD18-T-F。
实施例2：F蛋白的重组表达
1.重组B型禽偏肺病毒F蛋白的制备方法
包括以下步骤：a.构建表达载体；b.构建表达菌株；c.重组F蛋白的诱导和提取纯化。
a.构建表达载体：
将阳性克隆质粒pMD18-T-F和表达载体pPICZα载体分别用KpnI和NotI双酶切产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳后,用DNA凝胶回收试剂盒回收,分别获得约1.6kb和3.3kb片段,在16℃定向连接构建pPICZα-F表达载体(图4是本发明实施例高效表达载体的酶切鉴定图)；测序验证序列和读码框无误后,将质粒线性化后，电转化入毕赤酵母感受态细胞。
b.构建表达菌株：
电转化后，F基因重组到毕赤酵母基因组中，构建巴斯德毕赤酵母X33-F(Pichiapastoris X33-F)，已于2016年3月9日保藏于武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2016097；图5)；
c.重组F蛋白的诱导和提取纯化：
诱导表达，挑取含X33-F的单克隆菌落接种于BMGY液体培养基,30℃振荡培养过夜，离心收集菌体，用适量的BMMY悬浮后，加入终浓度0.5％甲醇，30℃诱导96小时。4℃,9000rpm离心5min，保留上清液，加入30％的硫酸铵沉淀后，12000rpm离心5min收集蛋白沉淀，用PBS重溶蛋白。加入蛋白电泳上样缓冲液，沸水煮8分钟后，用12％的分离胶进行SDS-PAGE鉴定。(图6中1、2、3为F蛋白表达产物沉淀，M为分子量标准蛋白质。)
实施例3：亚单位疫苗的制备
一、亚单位疫苗制备
1.制苗用菌液的制备 将X33-F菌种接种于含博莱霉素的YPD液体培养基中，30℃振荡培养16～18小时。然后划线接种于加有博莱霉素的YPD固体培养基，选取典型菌落2～3个混合于少量YPD液体培养基中，置30℃摇床中振荡培养18小时，定量分装，经纯粹检验后，作为一级种子。取一级种子接种于BMGY液体培养基中，30℃振荡培养16～18小时，经镜检后，置2～8℃保存
2.制苗用蛋白的制备 按发酵罐容积60％(V/V)加入BMGY不完全液体培养基，同时按培养基0.1％(V/V)加入消泡剂，通入高温蒸汽灭菌30分钟，待培养基温度降至32℃，加入YNB和生物素，接种B型禽偏肺病毒F蛋白生产用二级种子液，发酵罐参数设置分别为搅拌速度800r/min，温度30℃，维持DO值(溶氧量)在20％。培养24小时后的菌液补加甲醇,甲醇的补加速度为2ml/h/L诱导表达培养，按照以上发酵控制参数及工艺诱导表达120小时；发酵培养菌液经管式离心机10000r/min离心30分钟，收获的上清，加入硫酸铵沉淀蛋白后，按12000r/min离心30分钟收获沉淀，加入适量的生理盐水溶解蛋白沉淀。
3.灭活将蛋白液置于灭活瓶内，计量加入10％甲醛溶液，随加随摇，使其充分混合，甲醛溶液的最终浓度为0.1％。加甲醛溶液后倒入另一灭活瓶中，以避免瓶口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃灭活16小时后取出，置2～8℃保存。
4.半成品检验
(1)无菌检验 按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验。
(2)蛋白含量测定 按Bradford法检测蛋白含量。
(3)灭活检验 将灭活后的蛋白液取少量接种YPD固体培养基，置于置30℃继续培养72小时。观察无菌落生长，判灭活检验合格。
5.亚单位疫苗成品制备
经过检验合格后的半成品蛋白抗原进行疫苗制备(以下配制中各液体成分按体积比计)。
(1)油相制备 取兽用白油95份，硬脂酸铝1份，置于油相制备罐中加热至80℃后，再加司本－80 5份，至温度达到115℃时，维持30min，冷却后备用。
(2)水相制备 将B型禽偏肺病毒F蛋白使用生理盐水稀释成150μg/0.1ml。取灭菌后的5份吐温-80，加入配液罐中，同时加入制苗用蛋白液95份，搅拌20～30min，使吐温-80完全溶解。
(3)乳化 取油相2份放于高速剪切机内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，以10000r/min，乳化5分钟。乳化后，取10ml，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应不超过0.5ml。
二、亚单位疫苗成品检验
(1)性状
外观 疫苗应为乳白色乳剂，无杂质并且外包装应合格。
剂型 为油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第1滴外，均应不扩散。
稳定性 吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应不超过0.5ml。
黏度 按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。
(2)装量检查 按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。
(3)无菌检验 按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。
(4)安全检验 用7日龄SPF鸡10只，每只颈部皮下注射亚单位疫苗1.0ml，同时设对照5只，在相同的条件下饲养，连续观察14日，记录试验鸡采食、饮水及临床情况。应不出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。
(5)效力检验 21日龄SPF鸡10只，每只颈部皮下注射亚单位疫苗，0.3ml/只，另取10只同日龄SPF鸡作为不免疫作对照。于免疫后28日，点眼攻毒SHS/A3株病毒液，0.1ml/只，病毒含量为106.5TCID50/0.1ml。攻毒后连续观察7天，于攻毒后第5天采集鼻拭子、分离病毒。结果表明，用B型禽偏肺病毒F蛋白亚单位疫苗免疫鸡群能够抵抗病毒的攻击，不出现临床症状，病毒分离均为阴性。对照组出现轻微的临床症状，9/10病毒分离阳性。本发明制备的F蛋白亚单位疫苗具有良好的免疫效果(p＜0.05)，可以保护免疫鸡抵抗B型禽偏肺病毒的攻击。
(6)同类产品对比试验 用上述亚单位疫苗、某进口同类产品，分别按上述方法免疫SPF鸡，进行效力对比试验。用禽肺病毒病ELISA试剂盒测定抗体，从抗体值来看，对照鸡均为阴性，亚单位苗免疫鸡均≥2000，同类产品免疫鸡6/10≥2000，亚单位苗明显高于进口同类产品。按上面的方法使用SHS/A3株病毒攻毒，从攻毒保护结果上看，亚单位疫苗攻毒后90％保护，而同类产品的保护率为60％。由以上结果来看亚单位疫苗优于同类产品(参见表1)，发病率远低于其市售疫苗(p＜0.05)。
表1：与同类产品效力对比试验
Figure BDA0000965719790000061
Figure IDA0000965719890000011
Figure IDA0000965719890000021
Figure IDA0000965719890000031
Figure IDA0000965719890000041
Figure IDA0000965719890000051

Claims (4)

1.一种B型禽偏肺病毒F蛋白，其特征在于，所述的F蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
2.一种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求1所述的F蛋白。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。
4.权利要求1所述的F蛋白在制备B型禽偏肺病毒亚单位疫苗中的应用。
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