CN112898426A

CN112898426A - 人源化4-1bb单克隆抗体及其药物组合物

Info

Publication number: CN112898426A
Application number: CN201911133718.7A
Authority: CN
Inventors: 李庆; 马梵辛; 王�忠
Original assignee: Non Identical Chengdu Biotechnology Co ltd
Current assignee: Non Identical Chengdu Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-11-19
Filing date: 2019-11-19
Publication date: 2021-06-04
Also published as: EP4063388A4; JP2023501744A; CN117843786A; US20220403039A1; WO2021098597A1; AU2020387891A1; EP4063388A1; JP7522480B2

Abstract

本发明涉及一种人源化的4‑1BB单克隆抗体、其抗原结合片段、其药物组合物以及医药用途。该单克隆抗体包含：选自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的CDR1，选自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的CDR2，SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的CDR3，SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的CDR1’，SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的CDR2’，SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的CDR3’。该单克隆抗体以高度亲和性和特异性与人4‑1BB结合，导致T细胞增殖和TNF‑γ生成均显著增加，增强和刺激人4‑1BB介导的免疫反应。

Description

人源化4-1BB单克隆抗体及其药物组合物

技术领域

本发明涉及人源化的4-1BB单克隆抗体、其抗原结合片段、其药物组合物以及医药用途。

背景技术

4-1BB（也称为CD137或TNFRSF9）属于TNFR超家族，分子量50-55 kDa，表达于T细胞、NK细胞，NKT细胞、树突细胞（DC）、Tregs以及PDCA+ B细胞上。4-1BB与表达于APC细胞上的高亲和性配体4-1BBL结合，从而促进T细胞增殖，增强细胞因子生成，并阻止激活诱导的细胞死亡（AICD）。

激动性抗4-1BB单克隆抗体（mAb）对各种自身免疫疾病和病毒感染具有显著的抑制作用。许多研究表明，4-1BB在类风湿性关节炎（RA）的发病机制中扮演重要角色。在RA病人中，可溶性4-1BB和4-1BBL的水平均高于健康人群，并且它们的水平与疾病严重程度相关。在抗4-1BB抗体治疗的关节炎小鼠中，大量出现共表达CD11c标记物的CD8+ T细胞亚群。该CD11c+CD8+ T细胞被证实是关节炎症状减轻的原因。进一步研究证实，4-1BB抗体诱导的CD11c+CD8+ T细胞表达高水平的IFN-γ。实验性自身免疫性葡萄膜视网膜炎（EAU）是一种眼血管层的炎症性疾病，可导致视力受损，甚至失明。研究表明，4-1BB抗体与一种EAU诱导剂（IRBP）一同给药使CD11c+CD8+IFN-g+ T细胞和IDO+DC大量扩增，共同抑制病原性CD4+ T细胞。此外，4-1BB抗体还被用来治疗其他自身免疫疾病，包括多发性硬化（MS）、I型糖尿病（T1D）和狼疮。研究还发现，4-1BB抗体可以干扰某些病毒感染，如HSV-1，日本乙型脑炎病毒（JEV）、牛痘病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）。

4-1BB抗体体内抗肿瘤效果是Melero等在1997年首次发现，抗4-1BB抗体抑制小鼠体内低免疫原性肉瘤和高免疫原性肥大细胞瘤的生长。随后，研究者们证实，4-1BB抗体单独或与其他抗肿瘤药物可发挥强大的抗肿瘤作用。当4-1BB抗体被注射至SCID肿瘤小鼠时，肿瘤生长显著受到抑制。4-1BB抗体处理携带肉瘤细胞或胶质瘤细胞的小鼠，可延长小鼠的生存期并且导T细胞依赖性的致肿瘤退化。而且，4-1BB抗体还显示出在内皮肿瘤、肾细胞瘤、肺癌中的治疗作用。此外，大量研究显示，当4-1BB抗体与其他抗癌剂联合使用时，它们具有更佳的效果。例如，4-1BB抗体/PD-1抗体组合、4-1BB抗体/CTLA-4抗体组合、4-1BB抗体/GM-CSF组合、4-1BB抗体/CD40抗体组合、顺铂/4-1BB抗体组合、环磷酰胺/4-1BB抗体组合、4-1BB抗体/细胞因子诱导的杀伤细胞组合、4-1BB抗体/CD4+ T细胞消除组合、IL-2/4-1BB抗体组合，等等。当与其他抗癌剂联合使用时，4-1BB抗体介导的抗肿瘤作用会被放大，这为治疗癌症提供了新的思路。4-1BB抗体的变体，例如4-1BB抗体的ScFv，也具有显著的抗肿瘤效果，肿瘤内注射抗4-1BB ScFv抑制Hepa 1-6肿瘤，这种抗肿瘤作用依赖于增加的IFN-γ以及T细胞对肿瘤的渗透增加。

但是，目前4-1BB抗体还没有上市，多项临床研究都以失败告终，体内效果不理想和严重副作用（包括肝毒性、血小板减少、白细胞减少等）是其失败的主要原因。目前仅有两项4-1BB单抗处于临床试验中，分别是百时美施贵宝公司的完全人源化的Urelumab，以及辉瑞公司的PF2566。因此，有必要提供更多的4-1BB抗体以满足市场需求。

发明内容

本发明提供一种人源化的4-1BB单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述单克隆抗体包含：（1）重链互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，所述CDR1包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，所述CDR2包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，所述CDR3包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；和（2）轻链互补决定区CDR1’、CDR2’、CDR3’，所述CDR1’包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，所述CDR2’包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，所述CDR3’包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。

本发明另一方面提供一种人源化的4-1BB单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述单克隆抗体包含重链可变区（VH）和轻链可变区（VL），其中重链可变区包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，轻链可变区包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。

本发明另一方面还提供一种人源化的4-1BB单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述单克隆抗体包含重链和轻链，其中重链包含SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，轻链包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。

本发明的另一方面还提供一种药物组合物，其包含本发明所述的人源化单克隆抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体。

本发明的另一方面还提供一种药品套装，所述药品套装包括独立存在的包含本发明的人源化单克隆抗体或其抗原结合片段的第一制剂，以及独立存在的具有抗癌活性的第二制剂。所述第二制剂例如是PD-1抗体、CTLA-4抗体、GM-CSF、CD40抗体、顺铂、环磷酰胺、细胞因子诱导的杀伤细胞、IL-2等。

本发明的另一方面还提供本发明所述的结合人4-1BB的人源化单克隆抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗癌症、自身免疫性疾病、炎症性疾病或病毒感染的药物中的应用。

本发明提供的人源化单克隆抗体或其抗原结合片段具有广泛的医疗用途，例如用于治疗癌症、自身免疫性疾病、炎症性疾病或病毒感染。一方面，本发明提供一种治疗对象的癌症的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的本发明所述的结合人4-1BB的人源化单克隆抗体或其抗原结合片段。另一方面，本发明提供一种治疗自身免疫性疾病的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的本发明所述的结合人4-1BB的人源化单克隆抗体或其抗原结合片段。另一方面，本发明提供一种治疗炎症性疾病的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的本发明所述的结合人4-1BB的人源化单克隆抗体或其抗原结合片段。另一方面，本发明提供一种治疗病毒感染的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的本发明所述的结合人4-1BB的人源化单克隆抗体或其抗原结合片段。

此外，本发明还提供生产本发明的抗体或其抗原结合片段的细胞系，包含本发明的核苷酸的重组表达载体，以及通过培养抗体生产细胞系来制备抗体的方法。

本发明提供的人源化单克隆抗体以高度亲和性和特异性结合人4-1BB，导致T细胞增殖和TNF-γ生成均显著增加，增强和刺激人4-1BB介导的免疫反应。这些抗体可被用作抗肿瘤或抗病毒免疫响应的免疫增强剂，或者作为T细胞介导的自身免疫疾病的免疫调节剂。这些抗体也可被用作诊断试剂，用于检测癌症、自身免疫疾病或其他疾病患者的血液或组织中的人4-1BB。

附图说明

图1：抗rh4-1BB的mAb的产生。A. 杂交瘤产生和筛选的示意图。B. 血清滴定测定的ELISA数据。结合强度（OD450）显示为一式三份孔的平均值。C. mAb与4-1BB抗原的结合亲和力测量结果。

图2：4-1BB抗体能够结合细胞膜结合4-1BB。活化T细胞上4-1BB mAb的流式细胞仪分析。

图3：ELISA评估抗体4-1BB配体竞争活性。A. 在预先固定在ELISA板上的一定量的4-1BB配体存在下，mAb与4-1BB的结合活性。B. 被两种不同种类的抗体识别的4-1BB的示意图。

图4：MP4-1和2D10在体内抑制肿瘤生长。对NOD/SCID小鼠（每组n=5）皮下植入LS174T细胞（每只小鼠1×10⁶）和新鲜分离的人PBMC（每只小鼠5×10⁶），然后用如上所述的载体（PBS，黑色）、MP4-1（5 mg/kg，红色）或2D10（5 mg/kg，蓝色）腹膜内处理。然后测量肿瘤体积。数据代表五只小鼠的平均肿瘤体积。误差线代表标准误差（*** P <0.001，Dunnett多重比较检验，载体与MP4-1的对比以及载体与2D10的对比）。

图5：人源化MP4-1候选物的表征。A. 通过BLI分析确定mAb与4-1BB的动力学相互作用。B. 在预先固定在ELISA板上的4-1BB配体的存在下，mAb与4-1BB的结合活性。

图6：PP9150能够特异性结合活化的T细胞。Jurkat细胞（A）和活化的T细胞（B）上的4-1BB mAb的流式细胞术分析。

具体实施方式

抗体

如本文中使用的，术语“抗体”是指表现所需生物学活性（例如抑制配体与其受体的结合或通过抑制配体诱导的受体信号转导）的抗体的任何形式。“抗体片段”和“抗原结合片段”是指抗体的抗原结合片段及抗体类似物，其通常包括至少部分母抗体的抗原结合区或可变区（例如一个或多个CDR）。抗体片段保留母抗体的至少某些结合特异性。通常，当基于摩尔来表示活性时，抗体片段保留至少10％的母体结合活性。优选地，抗体片段保留至少20％、50％、70％、80％、90％、95％或100％或更多的母体抗体对靶标的结合亲和力。抗体片段的例子包括但不限于：Fab、Fab′、F(ab′)₂和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子，例如sc-Fv；纳米抗体；结构域抗体；和由抗体片段形成的多特异性抗体。

“Fab片段”由一条轻链和一条重链的CH1及可变区组成。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。“Fc”区含有包含抗体的CH1和CH2结构域的两个重链片段。两个重链片段由两个或多个二硫键并通过CH3结构域的疏水作用保持在一起。“Fab′片段”含有一条轻链和包含VH结构域和CH1结构域以及CH1和CH2结构域之间区域的一条重链的部分，由此可在两个Fab′片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab′)₂分子。“F(ab′)₂片段”含有两条轻链和两条包含CH1和CH2结构域之间的恒定区的部分的重链，由此在两条重链间形成链间二硫键。因此，F(ab′)₂片段由通过两条重链间的二硫键保持在一起的两个Fab′片段组成。“Fv区”包含来自重链和轻链二者的可变区，但缺少恒定区。

“单链Fv抗体”（或“scFv抗体”）是指包含抗体的VH和VL结构域的抗体片段，其中这些结构域存在于单个多肽链中。一般而言，Fv多肽在VH和VL结构域之间包含额外的多肽接头，该接头使得scFv能形成用于抗原结合的所需结构。

“双抗体”为具有两个抗原结合位点的小抗体片段。所述片段包含在相同的多肽链中与轻链可变区（VL）连接的重链可变区（VH）（VH-VL或VL-VH）。通过使用足够短的接头使得不能在同一链的两个结构区之间配对，迫使所述结构区与另一条链的互补结构区配对并形成两个抗原结合位点。

“人抗体”为其氨基酸序列对应于由人产生的抗体的氨基酸序列的抗体，和/或业已用任何用于制备本文所示的人抗体的技术制备的抗体。该定义明确排除了包含非人类抗原结合残基的人源化抗体。

单克隆抗体

本文所用术语“单克隆抗体”是指从基本上同种抗体群中获得的抗体，即除了可能少量存在的可能的天然突变体外，构成所述群的各个抗体是一致的。单克隆抗体具有高度特异性，可针对单个的抗原位点。此外，与通常包括针对多个不同的决定簇（表位）的多种不同抗体的常规（多克隆）抗体制备物相反，每种单克隆抗体仅针对抗原上的单个决定簇。修饰语“单克隆”表示从基本上同种抗体群获得的抗体的特性，不能理解为需要通过任何特定方法来制备所述抗体。例如，用于本发明的单克隆抗体可通过杂交瘤或重组DNA方法制备。单克隆抗体可以包括“嵌合”抗体。

在本发明的一个方面，本发明的4-1BB单克隆抗体包含：（1）重链互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，所述CDR1包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，所述CDR2包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，所述CDR3包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；以及（2）轻链互补决定区CDR1’、CDR2’、CDR3’，所述CDR1’包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，所述CDR2’包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，所述CDR3’包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。

在一些实施方式中，所述4-1BB单克隆抗体的互补决定区选自以下组合：（a）CDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，CDR1’包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，CDR2’包含SEQID NO:7所示的氨基酸序列，CDR3’包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；或（b）CDR1包含SEQID NO:4所示的氨基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，CDR3包含SEQ IDNO:3所示的氨基酸序列，CDR1’包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，CDR2’包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，CDR3’包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。

在本发明的另一个方面，本发明的4-1BB单克隆抗体包含：（1）重链可变区，其包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列；以及（2）轻链可变区，其包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。

在本发明的另一个方面，本发明的4-1BB单克隆抗体包含：（1）重链，其包含SEQ IDNO:12或SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列；以及（2）轻链，其包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。

可以预期的是，本发明的单克隆抗体的结合结构域可以带有信号肽，其通常位于分泌蛋白的N端，一般由15～30个氨基酸组成。当信号肽序列合成后，被信号识别颗粒(SRP)所识别，蛋白质合成暂停或减缓，信号识别颗粒将核糖体携带至内质网上，蛋白质合成重新开始。在信号肽的引导下，新合成的蛋白质进入内质网腔，而信号肽序列则在信号肽酶的作用下被切除。如终止转运序列存在于新生肽链的C端，也可以不被信号肽酶切除，如卵清蛋白含有内部信号肽。它的前体与成熟形式都没有被信号肽酶切除的过程。一个示例性的信号肽序列为MDPKGSLSWRILLFLSLAFELSYG。另一个示例性的信号肽序列为METDTLLLWVLLLWVPGSTG。

“特异性结合”是指本发明的单克隆抗体能够特异性地与各人靶标分子的至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或更多氨基酸相互作用。抗体的“特异性结合”主要由两个参数来表征：定性参数（结合表位或抗体结合位置）和定量参数（结合亲和力或结合强度）。抗体结合表位可通过FACS法、肽点表位作图法、质谱法或肽ELISA法测定。Biacore法和/或ELISA法可测定抗体与特定表位的结合强度。通常将信噪比作为结合特异性的代表性测定计算方法。在这样的信噪比中，信号代表抗体结合至目标表位的强度，而噪声代表抗体与其他非目标表位结合的强度。优选地，对于目标表位的信噪比为约50时可以认为所评估的抗体以特异性方式结合至目标表位，即“特异性结合”。

变体

如本文中使用的，序列“变体”是指在一个或多个氨基酸残基处不同于所示的序列但保留所得到的分子的生物学活性的序列。

“保守修饰的变体”或“保守的氨基酸取代”是指本领域技术人员已知的氨基酸取代，进行这种取代通常不改变所得到的分子的生物学活性。一般而言，本领域技术人员公认在多肽非必需区的单个氨基酸取代基本上不改变生物学活性。

本文所用的两个序列之间的“％同一性”是指所述序列共有的等同位置的数目的函数（即％同源性＝等同位置数/总位置数x 100），其中会考虑到空位数目及各空位长度，所述空位需要在进行两个序列最佳比对时引入。序列比较和两个序列之间％同一性的确定可用数学算法来完成。例如，两个氨基酸序列之间的％同一性可用E.Meyers和W.Miller（Comput.Appl.Biosci.，4：11-17（1988））的算法来确定，该算法业已被引入到ALIGN程序（2.0版）中，其使用PAM120权重残基表，空位长度罚分为12，空位罚分为4。另外，两个氨基酸序列之间的％同一性可用Needleman和Wunsch（J.MoI.Biol.48：444-453（1970））算法来确定，该算法已被引入到GCG软件包的GAP程序（可在www.gcg.com中得到）中，其使用Blossum62矩阵或PAM250矩阵，空位权重为16、14、12、10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4、5或6。

当提及配体/受体、抗体/抗原或其它结合对时，“特异性”结合是指在蛋白和/或其它生物试剂的异质群体中确定是否存在所述蛋白的结合反应。因此，在所指定的条件下，特定的配体/抗原与特定的受体/抗体结合，并且并不以显著量与样品中存在的其它蛋白结合。

人源化抗体

人源化抗体具有一个或多个来自非人类来源的氨基酸残基。通常可通过用啮齿类动物CDR或CDR序列取代人抗体的相应序列来实施人源化。因此，所述“人源化”抗体为嵌合抗体，其中极小部分的完整人可变结构域被来自非人类物种的相应序列取代。实际上，人源化抗体通常为其中某些CDR残基和可能的某些FR残基被来自非人类（例如啮齿类动物）抗体的类似位点的残基取代的人抗体。

挑选用于制备人源化抗体的人可变结构域（轻链和重链二者）对于降低抗原性极为重要。根据所谓的“最佳拟合”方法，根据已知的人可变结构域序列的完整文库来筛选啮齿类动物抗体的可变结构域序列。然后使最接近啮齿类动物序列的人序列作为用于人源化抗体的人构架（FR）。另一方法则利用来源于轻链或重链的特定亚群的所有人抗体共同序列的特定构架。相同的构架可用于若干不同的人源化抗体。

更重要的是对抗体进行人源化，使其保留对抗原的高亲和力和其它有利的生物学性质。为了达到这一目的，根据优选的方法，通过用母体和人源化序列的三维模型分析母体序列及各种概念上的人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型一般是可得到的，并为本领域技术人员所熟悉。可利用阐明并显示所挑选的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构的计算机程序。对这些显示结构的检查使得可以分析残基在候选免疫球蛋白序列功能中所起的可能的作用，即分析影响候选免疫球蛋白与其抗原结合的能力的残基。以此方式，可从受体和输入序列选择并联合FR残基，以便获得所需的抗体特性，例如对一种或多种靶抗原的亲和力提高。一般而言，CDR残基直接并最充分地参与影响抗原结合。

对抗体的人源化是简单的蛋白质工程工作。几乎所有鼠抗体都可通过CDR嫁接来人源化，从而保持抗原结合性。或者，现在还可能产生在免疫后在不产生内源性免疫球蛋白下能够产生完整人抗体库的转基因动物（例如小鼠）。例如，业已阐明在嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区（JH）基因的纯合缺失完全抑制了内源性抗体产生。

抗体纯化

当使用重组技术时，抗体可产生在细胞内、周质空间或直接分泌到培养基中。若抗体在细胞内产生，则作为第一步，例如通过离心或超滤去除颗粒碎片（宿主细胞或裂解的片段）。当抗体分泌到培养基中时，通常首先用市售的蛋白质浓缩过滤器（例如Amicon或MilliporePellicon超滤单元）浓缩来自所述表达系统的上清液。可在任何前述步骤中使用蛋白酶抑制剂（例如PMSF）以抑制蛋白水解，可使用抗生素以防止外来污染物生长。

根据待回收的抗体，还可利用其它蛋白质纯化技术，例如离子交换柱上分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、硅胶色谱法、阴离子或阳离子交换树脂（例如聚天冬氨酸柱）色谱法、色谱聚焦法、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。在一个实施方式中，糖蛋白可通过以下方法来纯化：使糖蛋白吸附到凝集素基底上（例如凝集素亲和柱），以从制备物中去除含岩藻糖的糖蛋白并由此富集无岩藻糖的糖蛋白。

药物组合物和药品套装

“药物组合物”是指用于人的药物制剂。该药物组合物包含本发明的人源化单克隆抗体或其抗原结合片段以及载体、稳定剂和/或赋形剂的合适制剂。本发明提供包含本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的药物制剂。为了制备药物组合物或无菌组合物，让抗体或其抗原结合片段与可药用载体或赋形剂混合。可通过与生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合，来制备呈例如冻干粉、浆液、水溶液剂或混悬剂形式的治疗及诊断药物的制剂。

可通过标准药物方法，在细胞培养物或实验动物中测定单独给予或与免疫抑制剂联合给予的抗体组合物的毒性和治疗功效，所述方法例如为用于测定LD50（使群体的50％致死的剂量）和ED50（有效治疗群体的50％的剂量）的方法。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数，可表示为LD50与ED50之比。从这些细胞培养物测定及动物研究中获得的数据可用于调配用于人的剂量范围。所述化合物的剂量优选在包括毒性极少或无毒性的ED50的循环浓度范围内。可根据采用的剂型及所用的给药途径，使剂量在该范围内变化。

合适的给药途径包括胃肠外给药（例如肌内、静脉内或皮下给药）及口服给药。可按多种常规方式给予用于药物组合物或用于实践本发明方法的抗体，这些方法例如有经口摄取、吸入、局部施用或经皮肤、皮下、腹膜内、胃肠外、动脉内或静脉内注射。在一个实施方式中，静脉内给予本发明的结合化合物。在另一个实施方式中，皮下给予本发明的结合化合物。或者，人们可以以局部而非全身方式（通常为长效制剂或缓释制剂）给予抗体，例如经由将抗体直接注射到作用位点。此外，人们可以在靶向药物递送系统中给予抗体。

由临床医生例如用本领域已知或怀疑影响治疗或预期影响治疗的参数或因子来测定合适的剂量。通常，开始剂量比最佳剂量稍低，此后少量增加直到达到相对于任何不良副作用所要的或最佳的作用效果。重要的诊断测量包括测量例如炎性症状或所产生的炎性细胞因子的水平。

可通过连续输注或通过以一定间隔（例如一天、一周或每周1-7次）给药来提供抗体、抗体片段和细胞因子。可通过静脉内、皮下、腹膜内、经皮肤、局部、经口、经鼻、经直肠、肌内、大脑内、脊柱内或通过吸入来提供剂量。优选剂量方案是包括避免显著的不合乎需要的副作用的最大剂量或给药频率的方案。周总剂量通常为至少0.05 μg/kg体重，更通常为至少0.2 μg/kg，最通常为至少0.5 μg/kg，典型地为至少1 μg/kg，更典型地为至少10 μg/kg，最典型地为至少109 μg/kg，优选为至少0.2 mg/kg，更优选为至少1.0 mg/kg，最优选为至少2.0 mg/kg，理想地为至少10 mg/kg，更理想地为至少25 mg/kg，而最理想地为至少50mg/kg。基于摩尔/kg计算，小分子治疗剂例如肽模拟物、天然产物或有机化学药剂的所需剂量与抗体或多肽的剂量接近相同。

本发明药物组合物还可以含有其它药剂，包括但不限于细胞毒剂、细胞生长抑制剂、抗血管形成药物或抗代谢药物、靶向肿瘤药物、免疫刺激剂或免疫调节剂或与细胞毒剂、细胞生长抑制剂或其它毒性药物缀合的抗体。也可与其它治疗形式（例如手术、化疗及放射）一起施用所述药物组合物。典型的兽医、实验或研究对象包括猴、狗、猫、大鼠、小鼠、兔、豚鼠、马和人。

本发明的人源化单克隆抗体或其抗原结合片段可以单独使用或与以下其它物质联合使用：抗肿瘤药或免疫原剂（例如减弱的癌细胞、肿瘤抗原（包括重组蛋白质、肽和糖类分子）、抗原呈递细胞例如用来源于肿瘤的抗原或核酸刺激的树突细胞、免疫刺激细胞因子（例如IL-2、IFN_a2、GM-CSF）和用编码免疫刺激细胞因子（例如但不限于GM-CSF）的基因转染的细胞；标准癌症治疗（例如化疗、放疗或手术）；或其它抗体（包括但不限于针对以下物质的抗体：VEGF、EGFR、VEGF受体、其它生长因子受体、CD20、CD40、CTLA-4、OX-40、4-IBB和ICOS）。

相应地，本发明提供一种药品套装以便于进行上述联合疗法，其包括独立存在的包含本发明的人源化单克隆抗体或其抗原结合片段的第一制剂，以及独立存在的具有抗癌活性的第二制剂。在一些实施方式中，个人有时会同时施用第二制剂以及本发明的人源化单克隆抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，第二制剂以及本发明的人源化单克隆抗体或其抗原结合片段分别施用。在一些实施方式中，第二制剂或其他典型施用至癌症患者的药剂以及本发明的人源化单克隆抗体或其抗原结合片段可以组合成药物组合物被施用。

如本文中使用的，术语“第二制剂”或“第二抗癌剂”是指任何的抗肿瘤药品，包括但不限于：PD-1抗体、CTLA-4抗体、GM-CSF、CD40抗体、顺铂、环磷酰胺、细胞因子诱导的杀伤细胞、IL-2等。

本发明的一方面提供一种治疗肿瘤的方法，所述方法包括向患有肿瘤的对象施用治疗有效量的本发明的人源化单克隆抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，所述人源化单克隆抗体包含：（1）重链互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，所述CDR1包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，所述CDR2包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，所述CDR3包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；和（2）轻链互补决定区CDR1’、CDR2’、CDR3’，所述CDR1’包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，所述CDR2’包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，所述CDR3’包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述人源化单克隆抗体包含：（1）重链可变区VH，其包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列；和（2）轻链可变区，其包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述人源化单克隆抗体包含：（1）重链VL，其包含SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列；和（2）轻链，其包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述对象为哺乳动物，优选是人。

本发明的另一方面提供一种治疗肿瘤的方法，所述方法包括向患有肿瘤的对象施用治疗有效量的本发明的药物组合物。在一些实施方式中，所述药物组合物包含本发明的人源化单克隆抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载体。在一些实施方式中，所述药物组合物包含本发明的人源化单克隆抗体或其抗原结合片段及第二抗癌剂。在一些实施方式中，所述对象为哺乳动物，优选是人。

治疗

当用“给予”和“治疗”提及动物、人、实验对象、细胞、组织、器官或生物液时，是指将外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受治疗者、细胞、组织、器官或生物液接触。“给予”和“治疗”可指例如治疗方法、药动学方法、诊断方法、研究方法和实验方法。治疗细胞包括让试剂与细胞接触以及让试剂与流液接触，其中所述流液与细胞接触。“给予”和“治疗”还意味着例如通过试剂、诊断剂、结合组合物或通过其他细胞对细胞进行体外和离体治疗。

如本文中所使用的，术语“抑制”或“治疗”包括延缓与疾病有关的症状的发展和/或减轻所述疾病将要或预期发展的这些症状的严重程度。所述术语还包括减缓已有症状、防止另外的症状和减缓或防止这些症状的潜在原因。因此，所述术语表示已将有益结果赋予患有疾病的脊椎动物对象。

治疗有效量

如本文中所使用的，术语“治疗有效量”或“有效量”是指当将本发明双特异性抗体或其片段单独给予或与另外的治疗剂联合给予细胞、组织或受治疗者时，其有效防止或减缓待治疗的疾病或病症的量。治疗有效剂量进一步指所述化合物足以导致症状减缓的量，所述减缓症状例如为治疗、治愈、防止或减缓相关医学状态，或提高对所述病征的治疗率、治愈率、防止率或减缓率。当施用给个体单独给予的活性成分时，治疗有效量是指该单独的成分。当施用组合时，治疗有效量是指产生治疗效果的活性成分的联合的量，而不论其是联合给予、连续给予还是同时给予。治疗有效量将减轻症状通常至少10％；通常至少20％；优选至少约30％；更优选至少40％和最优选至少50％。

在本发明中，“约”是指数值在由本领域一般技术人员所测定的具体值的可接受误差范围内，所述数值部分取决于怎样测量或测定（即测量体系的限度）。例如，在本领域每一次实行中“约”可意味着在1内或超过1的标准差。或者，“约”或“基本上包含”可意味着至多20％的范围。此外，特别对于生物学系统或过程而言，该术语可意味着至多一个数量级或数值的至多5倍。除非另外说明，否则当具体值在本申请和权利要求中出现时，“约”或“基本上包含”的含义应该假定为在该具体值的可接受误差范围内。

癌症

本发明的人源化单克隆抗体或其抗原结合片段可以用于治疗癌症（即抑制肿瘤细胞的生长或存活）。可用本发明抗体抑制其生长的优选的癌症包括通常对免疫疗法有反应的癌症。用于治疗的优选癌症的非限制性实例包括但不限于食管癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、子宫颈癌、子宫体癌、卵巢癌、膀胱癌、头颈癌、子宫内膜癌、骨肉瘤、前列腺癌、神经母细胞瘤。

自身免疫性疾病

如本文中所使用的，术语“自身免疫性疾病”指的是由机体免疫系统对自身成分的免疫耐受被打破，从而攻击自身的器官、组织或细胞，引起损伤而诱发的一类疾病。这可以局限于某些器官或累及处于不同部位的特定组织。自身免疫性疾病的治疗通常是使用免疫抑制，例如减少免疫反应的药物。

在本发明中，本发明的人源化单克隆抗体或其抗原结合片段可以用于治疗自身免疫性疾病。可用本发明的抗体或其抗原结合片段治疗的自身免疫性疾病包括但不限于格雷夫斯病（Graves' disease）、多发性硬化症、自身免疫性肝病、原发性肾上腺皮质萎缩、慢性甲状炎、l型糖尿病、系统性红斑狼疮、银屑病、克罗恩病（Crohn's disease）、特应性皮炎、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性溶血性贫血、重症肌无力、脱髓鞘疾病、湿疹、移植物抗宿主病、类风湿关节炎、硬皮病、干燥综合征、慢性肾炎、强直性脊柱炎、慢性活动性肝炎、萎缩性胃炎、自身免疫性肾小球肾炎、肺肾出血性综合症、特发性血小板减少性紫癜、特发性白细胞减少症、慢性甲状腺炎、恶性贫血、慢性溃疡性结肠炎。

炎症性疾病

如本文所用的“炎症性疾病”指的是由炎症所引起、由炎症产生、或产生炎症的疾病。术语“炎症性疾病”还可以指的是失调的炎症反应，所述反应导致巨噬细胞、粒细胞、和/或T淋巴细胞的过度反应，从而造成异常的组织损伤和/或细胞死亡。炎症性疾病可以是急性或慢性炎症性病况并且可以由感染或非感染原因所引起。

在本发明中，本发明的人源化单克隆抗体或其抗原结合片段可以用于治疗炎症性疾病。可用本发明的抗体或其抗原结合片段治疗的炎症性疾病包括但不限于关节炎、肌腱炎、动脉硬化症、风湿性多肌痛、粘液囊炎、囊性纤维化、关节骨炎、巨细胞性动脉炎、多发性肌炎、皮肌炎、天疱疮、类天疱疮、混合型结缔组织病、硬化性胆管炎、炎症性肠病、溃疡性结肠炎、炎症性皮肤病、石棉肺、硅肺、尘肺病、类肉瘤病、外源性过敏性肺泡炎、肝炎、迟发型超敏反应、肺炎、呼吸道炎症、成人呼吸窘迫综合征（ARDS）、脑炎、速发型超敏反应、哮喘、花粉热、过敏、急性过敏反应、风湿热、膀胱炎、慢性胆囊炎、同种异体移植排斥反应、宿主抗移植物排斥反应、阑尾炎、动脉炎、细支气管炎、支气管炎、宫颈炎、胆管炎、绒毛膜羊膜炎、结膜炎、泪腺炎、皮肌炎、心内膜炎、子宫内膜炎、肠炎、上髁炎、附睾炎、筋膜炎、纤维织炎、胃炎、胃肠炎、牙龈炎、虹膜炎、喉炎、脊髓炎、心肌炎、肾炎、脐炎、卵巢炎、睾丸炎、骨炎、耳炎、胰腺炎、腮腺炎、心包炎、咽炎、胸膜炎、静脉炎、前列腺炎、鼻炎、输卵管炎、鼻窦炎、口腔炎、滑膜炎、睾丸炎、扁桃体炎、尿道炎、葡萄膜炎、阴道炎、外阴炎、脉管炎、骨髓炎、视神经炎、颞动脉炎、横贯性脊髓炎、坏死性筋膜炎、以及心血管炎症。

病毒感染

如本文中使用的，术语“感染”是指病原体侵入生物体组织，它们的增殖，以及宿主组织对这些生物体和它们产生的毒素的反应。感染可由感染因子，如病毒、类病毒、朊病毒、细菌、线虫（如寄生蛔虫和蛲虫）、节肢动物（如蜱、螨虫、跳蚤和虱子）、真菌（如癣）、以及其他巨型寄生虫如绦虫和其他蠕虫引起。在本发明中，所述的感染因子是病毒。

“病毒感染”是指病毒通过多种途径侵入机体，并在易感的宿主细胞中增殖的过程。在本发明中，本发明的人源化单克隆抗体或其抗原结合片段可以用于治疗病毒感染。造成所述病毒感染的病毒的包括但不限于巨细胞病毒（CMV）、爱泼斯坦-巴尔病毒（EBV）、1型人类免疫缺陷病毒（HIV-1）、2型人类免疫缺陷病毒（HIV-2）、人类偏肺病毒、副流感病毒、流感病毒、呼吸道合胞体病毒（RSV）、腺病毒、鼻病毒、冠状病毒、肠病毒、肠病毒、柯萨基病毒（coxsackievirus）、登革病毒、日本脑炎病毒（JEV）、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、单纯性疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型、人疱疹病毒8型、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人乳头瘤病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、风疹病毒、水痘-带状疱疹病毒。

与所述病毒感染相关的疾病或病症包括但不限于：视网膜炎、肠炎、传染性单核细胞增多症、霍奇金氏淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤（Burkitt’s lymphoma）、鼻咽癌、后天性免疫缺乏综合征（AIDS）、上呼吸道感染（URI）、下呼吸道感染（LRI）、心肌炎、脑炎、登革出血热及登革休克综合征（DHF/DSS）、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、龈口炎（gingivostomatitis）、角膜结膜炎、皮丘疹、腮腺炎、脊髓灰质炎、狂犬病、风疹、水痘。

免疫佐剂

本发明的人源化单克隆抗体或其抗原结合片段可与其它重组蛋白和/或肽（例如肿瘤抗原或癌细胞）联合使用，以便提高对这些蛋白的免疫应答（即在接种方案中）。例如，通过共同给予人源化单克隆抗体或其抗原结合片段与目标抗原（例如疫苗），可将人源化单克隆抗体或其抗原结合片段用于刺激抗原特异性免疫应答。因此，本发明在另一方面提供了增强受治疗者对抗原的免疫应答的方法，所述方法包括给予受治疗者：（i）抗原；和（ii）本发明人源化单克隆抗体或其抗原结合片段部分，以便提高受治疗者对抗原的免疫应答。例如，抗原可为肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原或来自病原体的抗原。所述抗原的非限制性实例包括但不限于肿瘤抗原或来自病毒、细菌或其它病原体的抗原。

其它组合疗法

如上文所述，可共同给予本发明单克隆抗体或其抗原结合片段及一种或多种其它治疗剂（例如细胞毒剂、放射性毒性剂或免疫抑制剂）。所述抗体可与所述药剂连接（作为免疫复合体），或可与治疗剂分开给予。在后一种情况下（分开给予）下，可在给予治疗剂之前、之后或同时给予抗体，或可与其它已知的疗法共同给予。

抗体还可用于体内诊断测定。通常用放射性核素（例如¹¹¹In、⁹⁹Tc、⁴C、³¹I、¹²⁵I、³H、³²P、³⁵S或¹⁸F）标记抗体，以使可用免疫显像或正电子成像术定位抗原或表达抗体的细胞。

通过参考以下实施例将更充分地理解本发明。然而，这些实施例不应该理解为限制本发明范围。本文提及的所有文献和专利引用都明确地通过引用并入本文。

实施例1 抗rh4-1BB的mAb的产生

实验动物

所有动物实验均在中山大学动物实验中心的授权下进行。Balb/c小鼠购自中山大学动物实验中心。非肥胖糖尿病-重症合并免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠购自Charles RiverLaboratories。对于那些涉及免疫受损小鼠的实验，将动物饲养在无病原体条件的隔离室中。

单克隆抗体的产生

为了产生抗rh4-1BB的mAb，对4周龄的雌性Balb/c小鼠皮下注射人4-1BB胞外结构域蛋白（Acro Biosystems）进行3次皮下免疫（S.C），间隔为两周。第三次注射后一周，对所有小鼠进行采血，收集血清用于间接ELISA筛选以确定免疫应答。分离免疫小鼠的脾细胞，并按照标准程序与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞（购自上海细胞库）融合。将细胞接种到96孔板中，并在杂交瘤生长培养基（含有20％FBS、1x HAT培养基补充物（Sigma）的RPMI-1640（Gibco，LifeTechnologies））中培养。通过间接ELISA筛选杂交瘤上清液，并选择阳性的孔进行克隆（通过限制稀释过程）。选择稳定的单克隆用于抗体的扩增和表征。

结果：在较早的产生抗4-1BB抗体的尝试中，我们使用了较高的剂量（每只小鼠50ug）进行初次免疫，所有小鼠均在10天内死亡。由于人4-1BB与小鼠4-1BB的氨基酸序列具有60％的同一性，因此rh4-1BB可能是受刺激分子并诱导强烈的免疫反应，导致小鼠死亡。然后我们将剂量降低至每只小鼠30 ug，进行两次免疫。为了测试免疫效力，通过间接ELISA测试在免疫之前和第三次注射后从小鼠收集的血清。免疫小鼠的血清在1/8000稀释度下显示阳性吸收（OD > 0.2）（图1B）。然后产生杂交瘤克隆，并使用4-1BB蛋白通过ELISA进行筛选。获得了5个具有强结合的不同杂交瘤克隆，并选择进行进一步分析。

实施例2 mAb的4-1BB结合亲和力

通过生物层干涉仪（BLI）确定亲和力

使用Octet RED96仪器（ForteBio, Pall Life Sciences）测量对4-1BB胞外结构域的抗体亲和力。所有测定在测定缓冲液（PBS，PH7.4、0.02％（v/v）Tween 20）中，以设定为1000rpm的搅拌进行。测定在30℃下、纯黑色96孔板（Greiner Bio-one，655209）中进行。将PBST中纯化的4-1BB抗体上样至抗小鼠IgG Fv捕获生物传感器（AMQ）的表面。然后在分析生物传感器上的抗体与测试抗原的缔合之前，使用生物传感器基线步骤进行300s。以七个滴定系列将测试抗原发展为两倍的浓度梯度。然后在含有测定缓冲液的孔中记录解离相互作用。基线漂移通过减去未与抗原孵育的抗体传感器记录的偏移来校正。使用9.0版数据分析软件（PALL/ForteBio）评估八位组数据，并使用全拟合1：1模态确定KD值。

与细胞表面4-1BB结合的抗体的流式细胞术分析

在37℃、5％CO₂湿润的培养箱中，用6孔板平板底部中预包被的0.5 ug/ml OKT3和0.5ug/ml可溶的PFC-1（IL-15融合蛋白）刺激纯化的T细胞。刺激7天后，收集活化的T细胞。将4-1BB抗体与活化的T细胞或Jurkat细胞（购自上海细胞库）一起孵育。然后洗涤细胞，并用Alexa Fluor 488标记的山羊抗人或小鼠IgG（H + L）特异性抗体检测与细胞结合的抗体，并在FC500流式细胞仪（BECKMAN COULTER）上进行分析。

结果：为了评估mAb与4-1BB的结合，测量了不同抗体对抗原的亲和力。通过BLI分析，MP4-1显示出对重组人4-1BB的优异的结合。4-1BB ECD的平衡解离常数（KD）为0.0865nM，比其他mAb候选物高35倍以上（图1C）。使用流式细胞术（FACS）用上述刺激的原代人T细胞测量mAb与细胞膜结合的4-1BB的结合。与阳性对照PF2566相同，每种4-1BB抗体都与活化T细胞的结合（图2）。

实施例3 抗体4-1BB配体竞争活性

抗体4-1BB配体竞争测定

为了确定4-1BB抗体是否能够阻断4-1BB及其配体的相互作用，进行了4-1BB ELISA。简而言之，将具有Fc标签的人4-1BB配体（4-1BBL）蛋白的胞外域（Acro Biosystems）涂在ELISA板上，然后在4-1BB抗体存在的情况下与人4-1BB蛋白（His标签）一起孵育。使用HRP连接的抗6X His标签抗体（Abcam）检测结合在其配体上的4-1BB蛋白。然后将TMB底物溶液（TIANGEN）用于检测。使用微量滴定板读数器（infinite F50，TECAN）在OD450/620处分析样品。

数据分析

所有统计显著性通过GraphPad Prism 7.0软件（GraphPad Software, La JollaCalifornia USA）完成。通过单因素方差分析进行统计分析，然后使用Dunnett多重比较检验。* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001，除非另有说明，否则数据表示为平均值±SEM。

结果：使用ELISA测试抗体阻断人4-1BB蛋白与平板结合的重组4-1BB配体结合的能力。与以前的报道一致，PF2566与重组人4-1BB配体（4-1BBL）竞争性结合至重组人4-1BB（图3A）。对于我们的4-1BB抗体，MP4-1和10A3能够以不同的能力阻断4-1BB与其配体的相互作用，而2D10和9B4则不会影响相互作用（图3A）。显然，MP4-1显示出比PF2566更有效的阻断活性。

实施例4 MP4-1和2D10抑制肿瘤的生长

PBMC和T细胞的分离

根据说明，从健康的供体获得新鲜准备的全血，并使用Ficoll（GE Healthcare）密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞（PBMC）。使用EasySep人CD3阳性选择试剂盒（STEMCELLTechnologies Inc., Vancouver, Canada）纯化T细胞。在测定之前，将分离的T细胞在含10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的完整RPMI 1640中，于37℃、5％CO₂湿润的培养箱中培养。

异种移植模型

在四至五周龄的NOD/SCID小鼠的右侧腹中注射200 ul含有1×10⁶ LS174 T细胞和5×10⁶人PBMC的细胞混合物的PBS。植入后两小时，腹膜内施用4-1BB抗体（5 mg/kg）或载体对照（PBS）。然后在第0、2、6、8、10和12天对动物进行处理（每只小鼠100 μg）。用卡尺在2个垂直尺寸上测量肿瘤体积，并使用公式（宽度²x长度）/2计算。

结果：为了进一步研究4-1BB抗体是否可以在体内抑制肿瘤细胞的生长，MP4-1和2D10被用于评估NOD/SCID小鼠中的抗肿瘤活性。如图4所示，从第10天开始，每一组的肿瘤体积都开始增加，且载体组的肿瘤体积增加的速度最快，明显比4-1BB MP4-1组和4-1BB2D10组的肿瘤体积增加的速度快。第14天时，4-1BB MP4-1组和4-1BB 2D10组的肿瘤体积无显著差异，但都显著小于（P<0.001）载体组的肿瘤体积。这些数据表明，4-1BB抗体MP4-1和2D10在异种移植小鼠模型中可以有效地抑制肿瘤的生长。

实施例5 人源化MP4-1的表征

根据结合亲和力和4-1BB抗体阻断4-1BB与其配体相互作用的活性，选择MP4-1进行进一步的人源化。构建具有人IgG1结构的9个候选物并测试4-1BB结合亲和力。如图5A所示，只有PP9150和PP9153在纳摩尔级具有KD值。在抗体4-1BB配体竞争试验中，PP9150表现出与MP4-1相似的阻断活性（图5B）。然后，我们测试了PP9150与细胞膜结合的4-1BB的结合，与对照PF2566相同，未观察到PP9150与4-1BB阴性Jurkat细胞的结合（图6A）。检测到PP9150和PF2566与活化T细胞的特异性结合（图6B）。

SEQUENCE LISTING

<110> 非同（成都）生物科技有限公司

<120> 人源化4-1BB单克隆抗体及其药物组合物

<130> 191448CN

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人源化4-1BB 重链互补决定区CDR1

<400> 1

Trp Ile Ser Trp Val Arg

1 5

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人源化4-1BB 重链互补决定区CDR2

<400> 2

His Pro Gly Glu Gly Glu Thr Tyr Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg

1 5 10 15

Val

<210> 3

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人源化4-1BB 重链互补决定区CDR3

<400> 3

Cys Ala Arg Arg Thr Arg Tyr Asp Tyr Glu Asp Tyr Phe Ala Met Asp

1 5 10 15

<210> 4

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人源化4-1BB 重链互补决定区CDR1

<400> 4

Trp Met Asn Trp Val Arg

1 5

<210> 5

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人源化4-1BB 重链互补决定区CDR2

<400> 5

His Pro Gly Asp Gly Glu Thr Tyr Tyr Asn Gln Lys Phe Gln Gly Arg

1 5 10 15

Val

<210> 6

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人源化4-1BB 轻链互补决定区CDR1'

<400> 6

Cys Gln Ala Ser Gln Gly Ile Asn Gln Tyr Leu

1 5 10

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人源化4-1BB 轻链互补决定区CDR2'

<400> 7

Phe Tyr Thr Ser Ser Leu His Thr

1 5

<210> 8

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人源化4-1BB 轻链互补决定区CDR3'

<400> 8

Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Glu Leu Pro Phe

1 5 10

<210> 9

<211> 221

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人源化4-1BB 重链可变区VH，Xaa是Glu或Gln

<400> 9

Xaa Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Gly Phe Ser Ser Ser

20 25 30

Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile His Pro Gly Glu Gly Glu Thr Tyr Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Thr Arg Tyr Asp Tyr Glu Asp Tyr Phe Ala Met Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

115 120 125

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly

130 135 140

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

145 150 155 160

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

165 170 175

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

180 185 190

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val

195 200 205

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val

210 215 220

<210> 10

<211> 221

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人源化4-1BB 重链可变区VH

<400> 10

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Gly Phe Ser Ser Ser

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile His Pro Gly Asp Gly Glu Thr Tyr Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Thr Arg Tyr Asp Tyr Glu Asp Tyr Phe Ala Met Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

115 120 125

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser

130 135 140

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

145 150 155 160

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

165 170 175

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

180 185 190

Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val

195 200 205

Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val

210 215 220

<210> 11

<211> 214

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人源化4-1BB 轻链可变区VL

<400> 11

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Gly Ile Asn Gln Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Phe Tyr Thr Ser Ser Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Glu Leu Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 12

<211> 472

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人源化4-1BB 重链，Xaa是Glu或Gln

<400> 12

Met Asp Pro Lys Gly Ser Leu Ser Trp Arg Ile Leu Leu Phe Leu Ser

1 5 10 15

Leu Ala Phe Glu Leu Ser Tyr Gly Xaa Val Gln Leu Val Gln Ser Gly

20 25 30

Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala

35 40 45

Ser Gly Tyr Gly Phe Ser Ser Ser Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala

50 55 60

Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile His Pro Gly Asp Gly

65 70 75 80

Glu Thr Tyr Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala

85 90 95

Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser

100 105 110

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Thr Arg Tyr Asp Tyr

115 120 125

Glu Asp Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

130 135 140

Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro

145 150 155 160

Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val

165 170 175

Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala

180 185 190

Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly

195 200 205

Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly

210 215 220

Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys

225 230 235 240

Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys

245 250 255

Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

260 265 270

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

275 280 285

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr

290 295 300

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

305 310 315 320

Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His

325 330 335

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

340 345 350

Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln

355 360 365

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met

370 375 380

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

385 390 395 400

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

405 410 415

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

420 425 430

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

435 440 445

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

450 455 460

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

465 470

<210> 13

<211> 472

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人源化4-1BB 重链

<400> 13

Met Asp Pro Lys Gly Ser Leu Ser Trp Arg Ile Leu Leu Phe Leu Ser

1 5 10 15

Leu Ala Phe Glu Leu Ser Tyr Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly

20 25 30

Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala

35 40 45

Ser Gly Tyr Gly Phe Ser Ser Ser Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala

50 55 60

Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile His Pro Gly Asp Gly

65 70 75 80

Glu Thr Tyr Tyr Asn Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala

85 90 95

Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser

100 105 110

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Thr Arg Tyr Asp Tyr

115 120 125

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130 135 140

Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro

145 150 155 160

Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val

165 170 175

Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala

180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys

225 230 235 240

Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys

245 250 255

Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

260 265 270

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

275 280 285

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr

290 295 300

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

305 310 315 320

Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His

325 330 335

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

340 345 350

Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln

355 360 365

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met

370 375 380

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

385 390 395 400

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

405 410 415

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

420 425 430

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

435 440 445

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450 455 460

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465 470

<210> 14

<211> 234

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人源化4-1BB 轻链

<400> 14

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

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Lys Leu Leu Ile Phe Tyr Thr Ser Ser Leu His Thr Gly Val Pro Ser

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser

85 90 95

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser

100 105 110

Glu Leu Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

115 120 125

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

130 135 140

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

145 150 155 160

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

165 170 175

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

180 185 190

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

195 200 205

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210 215 220

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210> 15

<211> 24

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 信号肽

<400> 15

Met Asp Pro Lys Gly Ser Leu Ser Trp Arg Ile Leu Leu Phe Leu Ser

1 5 10 15

Leu Ala Phe Glu Leu Ser Tyr Gly

20

<210> 16

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 信号肽

<400> 16

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly

20

Claims

1.一种人源化的4-1BB单克隆抗体或其抗原结合片段，其中

重链互补决定区CDR1为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；

重链互补决定区CDR2为SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；

重链互补决定区CDR3为SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；

轻链互补决定区CDR1’为SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；

轻链互补决定区CDR2’为SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；

轻链互补决定区CDR3’为SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的人源化的4-1BB单克隆抗体或其抗原结合片段，其中

（a）CDR1为SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，CDR2为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；或

（b）CDR1为SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，CDR2为SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的人源化的4-1BB单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化的4-1BB单克隆抗体的重链可变区为SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，轻链可变区为SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。

4.根据权利要求1所述的人源化的4-1BB单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化的4-1BB单克隆抗体的重链为SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，轻链为SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。

5.根据权利要求1所述的人源化的4-1BB单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自抗体4-1BB的scFv、(scFv)₂、Fab、Fab′或F(ab′)₂。

6.一种药物组合物，其包含权利要求1-5中任一项所述的人源化的4-1BB单克隆抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载体。

7.一种药物组合物，其包含权利要求1-5中任一项所述的人源化的4-1BB单克隆抗体或其抗原结合片段以及第二抗癌剂。

8.根据权利要求7所述的药物组合物，所述第二抗癌剂选自PD-1抗体、CTLA-4抗体、GM-CSF、CD40抗体、顺铂、环磷酰胺、细胞因子诱导的杀伤细胞、IL-2中的任何一种。

9.权利要求1-5中任一项所述的人源化的4-1BB单克隆抗体或其抗原结合片段或权利要求6-8中任一项所述的药物组合物在制备用于治疗癌症、自身免疫性疾病、炎症性疾病或病毒感染的药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，所述癌症选自食管癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、子宫颈癌、子宫体癌、卵巢癌、膀胱癌、头颈癌、子宫内膜癌、骨肉瘤、前列腺癌、神经母细胞瘤。

11.根据权利要求9所述的应用，所述自身免疫性疾病选自格雷夫斯病、多发性硬化症、自身免疫性肝病、原发性肾上腺皮质萎缩、慢性甲状炎、l型糖尿病、系统性红斑狼疮、银屑病、克罗恩病、特应性皮炎、自身免疫性溶血性贫血、重症肌无力、脱髓鞘疾病、湿疹、移植物抗宿主病、类风湿关节炎、硬皮病、干燥综合征、慢性肾炎、强直性脊柱炎、慢性活动性肝炎、萎缩性胃炎、自身免疫性肾小球肾炎、肺肾出血性综合症、特发性血小板减少性紫癜、特发性白细胞减少症、慢性甲状腺炎、恶性贫血、慢性溃疡性结肠炎。

12.根据权利要求9所述的应用，所述炎症性疾病选自关节炎、肌腱炎、动脉硬化症、风湿性多肌痛、粘液囊炎、囊性纤维化、关节骨炎、巨细胞性动脉炎、多发性肌炎、皮肌炎、天疱疮、类天疱疮、混合型结缔组织病、硬化性胆管炎、炎症性肠病、溃疡性结肠炎、炎症性皮肤病、石棉肺、硅肺、尘肺病、类肉瘤病、外源性过敏性肺泡炎、肝炎、迟发型超敏反应、肺炎、呼吸道炎症、成人呼吸窘迫综合征、脑炎、速发型超敏反应、哮喘、花粉热、过敏、急性过敏反应、风湿热、膀胱炎、慢性胆囊炎、同种异体移植排斥反应、宿主抗移植物排斥反应、阑尾炎、动脉炎、细支气管炎、支气管炎、宫颈炎、胆管炎、绒毛膜羊膜炎、结膜炎、泪腺炎、皮肌炎、心内膜炎、子宫内膜炎、肠炎、上髁炎、附睾炎、筋膜炎、纤维织炎、胃炎、胃肠炎、牙龈炎、虹膜炎、喉炎、脊髓炎、心肌炎、肾炎、脐炎、卵巢炎、睾丸炎、骨炎、耳炎、胰腺炎、腮腺炎、心包炎、咽炎、胸膜炎、静脉炎、前列腺炎、鼻炎、输卵管炎、鼻窦炎、口腔炎、滑膜炎、睾丸炎、扁桃体炎、尿道炎、葡萄膜炎、阴道炎、外阴炎、脉管炎、骨髓炎、视神经炎、颞动脉炎、横贯性脊髓炎、坏死性筋膜炎、心血管炎症。

13.根据权利要求9所述的应用，与所述病毒感染相关的疾病选自视网膜炎、肠炎、传染性单核细胞增多症、霍奇金氏淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、鼻咽癌、后天性免疫缺乏综合征、上呼吸道感染、下呼吸道感染、心肌炎、脑炎、登革出血热及登革休克综合征、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、龈口炎、角膜结膜炎、皮丘疹、腮腺炎、脊髓灰质炎、狂犬病、风疹、水痘。

14.一种编码权利要求1-5任一项所述的人源化的4-1BB单克隆抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。

15.一种包含权利要求14所述核苷酸序列的载体。

16.一种含有权利要求15所述载体的非人类的宿主细胞。