TWI696634B - 抗-唾液酸結合性類免疫球蛋白凝集素之抗體、包含該抗體之藥學組合物及其用途 - Google Patents

Abstract

本揭示內容是關於對Siglec-3受器具有結合親和力的新穎單株抗體。依據實施方式，該單株抗體可回復由HBV所媒介的免疫抑制反應。因此，本揭示內容亦提供該單株抗體於治療及/或預防B型肝炎病毒(HBV)感染的用途。

Description

抗-唾液酸結合性類免疫球蛋白凝集素之抗體、包含該抗體之藥學組合物及其用途

本揭示內容是關於治療感染的領域。更具體來說，本揭示內容是關於一種新穎之抗-唾液酸結合性類免疫球蛋白凝集素(sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin, Siglec)抗體，以及其於治療及/或預防B型肝炎病毒(HBV)感染之用途。

與反轉錄病毒相似，HBV亦為一種具有外套膜且部分雙股的DNA病毒。一般來說，HBV會透過RNA中間產物來進行複製，並嵌入宿主的基因體中。HBV獨特的複製週期使其可持續存在於感染細胞中。 HBV感染會造成不同的肝臟疾病，包含急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化及肝癌。世界衛生組織(World Health Organization, WHO)估計全世界約有2.57億的人口罹患HBV感染，於2015年造成約887,000人死亡。

目前尚無治療急性B型肝炎病毒(acute hepatitis B, AHB)感染的方法。因此，護理主要著重於維持病患的舒適度及營養均衡，包含補充因嘔吐及腹瀉造成的水分流失。至於慢性B型肝炎病毒(chronic hepatitis B, CHB)感染，美國食品及藥物管理局已核准數項藥品，包含恩替卡韋(entecavir, Baraclude)、蘭弗定(lamivudine, Epivir HBV)、干適能(adefovir dipivoxil, Hepsera)、干擾素α-2b (interferon alpha-2b, Intron A)、聚乙二醇化干擾素(pegylated interferon, Pegasys)、喜必福(telbivudine, Tyzeka)及惠立妥(tenofovir, Viread)。然而，對多數病患來說，該些治療僅能抑制病毒複製，而無法有效治癒HBV感染。因此，多數病患需終身接受B型肝炎的治療。

有鑑於此，相關領域亟需一種可有效預防及/或治療HBV感染之新穎方法，以減少病患罹患肝硬化及肝癌的機率，進而改善病患的長期存活率。

發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。

本揭示內容的第一態樣是關於一種用以治療或預防HBV感染的抗體或其片段。該抗體包含一輕鏈變異(light chain variable, VL)區及一重鏈變異(heavy chain variable, VH)區，其中該VL區包含一第一輕鏈互補性決定區(complementarity determining region)(CDR-L1)、一第二輕鏈CDR (CDR-L2)及一第三輕鏈CDR (CDR-L3)；且該VH區包含一第一重鏈CDR (CDR-H1)、一第二重鏈CDR (CDR-H2)，及一第三重鏈CDR (CDR-H3)。

依據本揭示內容某些實施方式，CDR-L1 具有VYY的胺基酸序列，CDR-L2具有ISSAG (序列編號：3)的胺基酸序列，而CDR-L3則具有QYFNFP (序列編號：4)的胺基酸序列。在該些實施方式中，CDR-H1具有NNGW (序列編號：5)的胺基酸序列，CDR-H2具有GIGPYGGSTF (序列編號：6)的胺基酸序列，且CDR-H3具有SRFIGSYSHM (序列編號：7)的胺基酸序列。

較佳地，該VL區的胺基酸序列至少85%相似於序列編號：8，且該VH區的胺基酸序列至少85%相似於序列編號：9。在一特定實施例中，該VL區具有序列編號：8的胺基酸序列，且該VH區具有序列編號：9的胺基酸序列。

本揭示內容的第二態樣因此是關於依據上述任一實施方式所述之抗體於製備一藥物或一藥學組合物的用途，其中該藥物或該藥學組合物可用以預防或治療HBV感染。該藥物或該藥學組合物包含一有效量之上述抗體，以及一藥學上可接受之載體。

本發明抗體的重量約佔藥學組合物或藥物總重的0.1%到99%。在某些實施方式中，本發明抗體的重量至少佔藥學組合物或藥物總重的1%。在某些實施方式中，本發明抗體的重量至少佔藥學組合物或藥物總重的5%。在某些實施方式中，本發明抗體的重量至少佔藥學組合物或藥物總重的10%。在其他實施方式中，本發明抗體的重量至少佔藥學組合物或藥物總重的25%。

本揭示內容的另一態樣是關於一種用以預防或治療一個體之HBV感染的方法。該方法包含對該個體投予一有效量之本發明抗體、藥學組合物或藥物。

可接受本發明方法治療的個體為一哺乳動物，舉例來說，人類、小鼠、大鼠、天竺鼠、倉鼠、猴子、豬、狗、貓、馬、綿羊、山羊、牛及兔子。較佳地，該個體是一人類。

在參閱下文實施方式後，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的，以及本發明所採用之技術手段與實施態樣。

為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。

I.定義

雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數皆是約略的數值，此處已盡可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處，「約」通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10%、5%、1%或0.5%之內。或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。除了實驗例之外，或除非另有明確的說明，當可理解此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比（例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者）均經過「約」的修飾。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。在此處，將數值範圍表示成由一端點至另一段點或介於二端點之間；除非另有說明，此處所述的數值範圍皆包含端點。

除非本說明書另有定義，此處所用的科學與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。此外，在不和上下文衝突的情形下，本說明書所用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型；而所用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。

「抗體」(antibody)一詞在本揭示內容包含單株抗體(包含全長單株抗體)、多株抗體、多效抗體(例如雙效抗體)及具有特定生物活性的抗體片段。「抗體片段」(antibody fragment)一詞包含一全長抗體的一部分，一般為其抗原結合或變異區。例示性的抗體片段包含Fab、Fab′、F(ab′)₂ 及Fv片段；雙價抗體(diantibody)；直線性抗體(linear antibody)；單鏈抗體分子；以及由抗體片段所形成的雙特異性抗體。

「抗體片段」(antibody fragment)僅包含一完整抗體的部分，其中該部分保留一完整抗體之部分、多數或全部功能。在一實施方式中，一抗體片段包含完整抗體的抗原結合位點，據以保留結合抗原的能力。在另一實施方式中，抗體片段(例如包含Fc區域的抗體片段)保留該Fc區域存在於完整抗體時，至少一與該Fc區域相關的生物功能，例如FcRn結合、抗體半衰期調控、ADCC功能和補體結合。在一實施方式中，抗體片段為一單價抗體，其具有大致與完整抗體相似的活體內半衰期。舉例來說，該抗體片段可包含一個抗原結合臂，其係與可賦予該片段活體內穩定性的Fc序列連結。本發明之抗體片段可以不同形式存在，舉例來說，變異片段(variable fragment, Fv)、單鏈變異片段(single-chain variable fragment, scFv)、抗原結合片段(antigen-binding fragment, Fab)、F(ab)₂ 及單鏈抗體。

一抗體的「變異區域」(variable region)或「變異域」(variable domain)係指該抗體重鏈或輕鏈的胺基末端域。該些位置為抗體最易變動的部分，且包含抗原結合位點。

「變異」(variable)一詞係指變異域中某些部分在抗體間序列差異廣泛且用於每種特定抗體對其特定抗原的結合及專一性的實情。然而，變異性並非均勻分佈於抗體的整個變異域。其主要集中於輕鏈及重鏈變異域中3個CDR或高度變異區域。變異域中更加高度保守的部分稱作框架區域(framework region, FR)。天然重鏈和輕鏈的變異域各自包含四個FR，它們大多採取β-折疊片構形，通過形成環狀連接且在有些情況中形成β-折疊片結構一部分的三個CDR連接。每條抗體鏈中的CDR通過FR非常接近的保持在一起，並與另一條鏈的CDR一起促成抗體的抗原結合位點的形成。恆定域不直接參與抗體與抗原的結合，但具有不同的作用功效，例如抗體於抗體相關細胞毒殺(antibody-dependent cellular toxicity)的作用。

「互補性決定區域」(complementarity determining region, CDR)在本說明書是指一抗體分子的高變異區域，其可與結合抗原之三維立體表面形成互補表面。由N端到C端，各抗體重鏈及輕鏈皆包含三個CDR (CDR 1、CDR 2及CDR3)。因此，一抗原結合位置包含共6個CDR，其分別為位於重鏈變異區域的3個CDR (即CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3)，以及位於輕鏈變異區域的3個CDR (即CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3)。

依據重鏈恆定域之胺基酸序列的不同，抗體(免疫球蛋白)可分為不同類型。五種主要的免疫球蛋白類型包含：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，其中可再細分為次類型(同型(isotype))，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。對應不同類型之免疫球蛋白的重鏈恆定域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。習知技藝人士皆知不同類型之免疫球蛋白的次單元結構及三維構型，或舉例來說，可參見Abbas et al. Cellular and Mol. Immunology, 4th ed. (2000)。一抗體可為一較大融合分子(由抗體與一或多其他蛋白或胜肽共價或非共價結合所形成)的一部分。

本揭示內容及請求保護之發明概念亦包含抗體之胺基酸序列的微小變異，其中胺基酸序列的變異維持至少85%序列相似度，例如至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列相似度。可藉由特定修飾來改變抗體的特性，而不影響其生理活性。舉例來說，可改變及/或刪除某些胺基酸而不影響本發明抗體的生理活性(即治療HBV感染之能力)。特別是，保留性胺基酸取代亦包含於其中。保留性取代為具有相似/相關側鏈之胺基酸間的相互取代。一般來說，由基因編碼的胺基酸可分為四大類：(1) 酸性胺基酸，即天門冬胺酸(aspartate)、麩胺酸(glutamate)；(2)鹼性胺基酸，即離胺酸(lysine)、精胺酸(arginine)、組胺酸(histidine)；(3)非極性胺基酸，即丙胺酸(alanine)、纈胺酸(valine)、白胺酸(leucine)、異白胺酸(isoleucine)、脯胺酸(proline)、苯丙胺酸(phenylalanine)、甲硫胺酸(methionine)、色胺酸(tryptophan)；以及(4)非帶電極性胺基酸，即甘胺酸(glycine)、天門冬醯胺(asparagine)、麩醯胺酸(glutamine)、半胱胺酸(cysteine)、絲胺酸(serine)、蘇胺酸(threonine)、酪胺酸(tyrosine)。較佳的分類是：絲胺酸及蘇胺酸係屬脂肪羥基(aliphatic-hydroxy)類；天冬醯胺酸及麩醯胺係屬含醯胺(amide-containing)類；丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸係屬脂肪類；而苯丙胺酸、色胺酸及酪胺酸則屬芳香(aromatic)類。舉例來說，當可想見若以異白胺酸或纈胺酸取代白胺酸、以麩胺酸取代天門冬胺酸、以絲胺酸取代蘇胺酸，或是以一結構相似的胺基酸取代另一胺基酸時，並不會造成分子結合或蛋白特性的顯著改變，特別是當該取代位置不是位於骨架區域時，胺基酸之間的取代更不會影響上述特性。可藉由檢測抗體衍生物之特定活性來瞭解一胺基酸的改變是否可形成一具功能性的抗體。可利用本發明所屬技術領域具有通常知識者所知的方法來製備抗體片段或類似物。片段或類似物之較佳的胺基及羧基末端是鄰近功能域的邊界。在一實施例中，是對本發明抗體的一胺基酸殘基(例如纈胺酸)進行保留性置換(例如以白胺酸進行置換)。在其他實施例中，是以其他適合的胺基酸殘基來對本發明抗體的二個胺基酸殘基進行保留性置換；舉例來說，可以例示性之甲硫胺酸(M)及 離胺酸(K)、離胺酸(K)及脯胺酸(P)、色胺酸(W)及異白胺酸(I)、異白胺酸(I)及脯胺酸(P)、天門冬醯胺(N)及纈胺酸(V)，以及麩醯胺酸(G)及離胺酸(K)等胺基酸對來置換纈胺酸(V)及精胺酸(R)。

此處針對蛋白質或核酸片段之胺基酸序列或核苷酸序列所述的「序列相似度百分比」(Percent (%) sequence identity)係指一候選蛋白質或核酸片段的胺基酸/核苷酸殘基與一參考蛋白質或核酸片段的胺基酸/核苷酸殘基完全相同的百分比。於進行上述比對時，可將所述的候選蛋白質/核酸片段與所述的蛋白質或核酸片段並排，並於必要時引入間隙，以使二序列形成最高的序列相似度。在計算相似度時，保守性置換之胺基酸殘基視為不同的殘基；簡併密碼子的核苷酸殘基也視為不同的殘基，譬如同樣編碼天門冬醯胺酸(asparagine, Asn, N)的密碼子AAU和AAC之間，視為有一個不同的殘基。相關領域已有多種方法可供進行上述並排，譬如可公開取得的軟體如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)等。本發明所屬技術領域中具有通常知識者在進行並排時，可選擇適當的參數與計算方式，以得到最佳的排列方式。在本說明書中，二胺基酸/核苷酸序列間的序列比較是採用美國國家生物科技資訊中心(Nation Center for Biotechnology Information，簡稱NCBI)所提供的蛋白質-蛋白質BLAST分析資料庫Blastp或核苷酸-核苷酸BLAST分析資料庫Blastn來進行。一候選序列A相較於一參考序列B的胺基酸/核苷酸序列相似度(在本說明書中亦稱之為序列A與序列B具有特定百分比(%)的胺基酸/核苷酸序列相似度)的計算方式如下:

其中X是利用Blastp或Blastn分析資料庫對序列A、B進行排列後所得到的相同胺基酸/核苷酸殘基數目(identical matches)，而Y是A、B二序列中較短者的胺基酸/核苷酸殘基總數。

「有效量」(effective amount) 在此處係指一藥物的用量足以產生欲求的療效反應。有效量亦指一種化合物或組合物，其治療利益效果超越其毒性或有害影響。具體的有效量取決於多種因素，如欲治療的特定狀況、患者的生理條件(如，患者體重、年齡或性別)、接受治療的哺乳動物或動物的類型、治療持續時間、目前療法(如果有的話)的本質以及所用的具體配方和化合物或其衍生物的結構。舉例來說，可將有效量表示成藥物的總重量(譬如以公克、毫克或微克為單位)或表示成藥物重量與體重之比例(其單位為毫克/公斤(mg/kg))。或者是，可將有效量表示成活性成分(例如，本揭示內容之單株抗體)的濃度，例如莫耳濃度、重量濃度、體積濃度、重量莫耳濃度、莫耳分率、重量分率及混合比值。習知技藝人士可依據動物模式的劑量來計算藥物(如本揭示內容之抗體)的人體等效劑量(human equivalent dose, HED)。舉例來說，習知技藝人士可依據美國食品藥物管理局(US Food and Drug Administration, FDA)所公告之「估算成人健康志願者在初始臨床治療測式之最大安全起始劑量」(Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers)來估算人體使用之最高安全劑量。

在本揭示內容中，「治療」(treat)一詞包含部份或完全預防、改善、減輕及/或處理HBV感染之相關病徵(symptom)、次要病徵(secondary disorder)或症狀(condition)。「治療」(treat)一詞於本說明書中亦指對一個體應用或投予一或多本發明抗體，該個體係患有HBV感染之相關病徵、次要病徵或症狀，以達到部份或完全減輕、減緩、治癒疾病、延遲發病、抑制病程發展、降低疾病嚴重性，及/或降低一或多種與HBV感染相關之病徵、症狀、或次要病徵的發生。與HBV感染相關之病徵、次要病徵及/或症狀包含，但不限於，疲勞、噁心、嘔吐、深色尿液、關節及肌肉疼痛、食慾不振、發燒、腹部不適、虛弱、黃疸及肝衰竭。在此「治療」(treat)亦可指投予至患有早期該些病徵或症狀之個體，以降低該個體發展與HBV感染相關之病徵、次要病徵及/或症狀的風險。當一治療可減少一或多種病症或臨床標記時，則該治療為「有效的」(effective)。或者是，當一治療可降低、減緩或終止疾病病程、病徵或症狀的發展時，則該治療為「有效的」(effective)。

在本揭示內容中，「預防」(prevention或prophylaxis)一詞是指對一個體投予預防性治療，其中該個體具有罹患與HBV感染相關之病徵、次要病徵或症狀的風險，藉以降低該個體發展與HBV感染相關之病徵、次要病徵及/或症狀的機率。具體來說，「預防」(prevention或prophylaxis)一詞是指抑制與HBV感染相關之病徵、次要病徵或症狀的發生；意即，減少病徵、次要病徵或症狀發生的機率或頻率。在使用一抗體、一包含該抗體之藥學組合物及/或方法來進行「預防」(prevention或prophylaxis)時，是指該抗體、包含該抗體之藥學組合物及/或方法可抑制該病徵、次要病徵或症狀的發生，及減少該病徵、次要病徵或症狀發生的機率及/或頻率，而非指示或暗示使用該抗體、包含該抗體之藥學組合物及/或方法後，保證該病徵、次要病徵或症狀不會再次發生。

「藥學上可接受的」(pharmaceutically acceptable)一詞是指當投予至人體後，通常被視為安全的分子或組合物，例如該些具有生理相容性及不會產生過敏或類似不當反應(例如胃部不適及暈眩等)的分子或組合物。較佳地，「藥學上可接受的」(pharmaceutically acceptable)一詞在本說明書中是指經由美國聯邦或州政府之管理機構認可且可應用於動物或人類的分子或組合物。

「個體」(subject)一詞是指包含人類的動物，其可接受本發明方法的治療。除非特定指出，否則「個體」(subject)一詞同時意指男性及女性。

II.發明詳細說明

本揭示內容至少部分是基於發明人首次發現HBV對Siglec-3具有結合親和力，且對Siglec-3具有專一性之抗體可用以回復HBV誘發的免疫抑制反應。

因此，本揭示內容提供一種對Siglec-3受器具有結合專一性的單株抗體或其片段。

依據本揭示內容之實施方式，是利用噬菌體表現之scFv抗體庫來製備本發明單株抗體。當可想見，亦可藉由傳統免疫法(即，以特定胜肽免疫化動物)來製備本發明單株抗體。

一般來說，可以諸如 t-BOC或FMOC α-胺基團保護法等習知方法來合成多肽(即，Siglec-3多肽)。二種方法皆為逐步合成，即由胜肽的C端開始，每步驟加入單一個胺基酸。亦可以習知的固相胜肽合成法來合成本發明多肽。

之後，可以合成多肽免疫化宿主動物(例如小鼠、大鼠或兔子)，藉以製備抗體。可依據慣常流程來進行免疫化反應。免疫化的時間間隔並無特定限定。免疫化的間隔時間可為數天至數週，較佳為一週；共進行2-10次，直接到達特定的抗體效價。舉例來說，可每週對宿主動物皮下注射合成多肽，連續注射8週。

於最後一劑注射後，取出該動物之脾臟細胞及區域淋巴結。採取血液檢體並將之離心處理以分離血清。可利用任何適合的方法來檢測所得血清中的抗體效價，例如酵素結合免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)、酵素免疫分析(enzyme immunoassay, EIA)或放射免疫分析(radio immunoassay, RIA)。在一較佳的實施例中，是利用ELISA來測定抗體之效價。由分離之脾臟細胞及區域淋巴結製備可產生抗體的細胞。在製備可產生抗體的細胞時，宜先盡可能移出組織殘渣及紅血球。在此步驟可使用商業購買之紅血球去除劑。或者是，可以使用包含氯化銨及三羥甲基氨基甲烷(Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris))的緩衝液。立即將可產生抗體的細胞與永生細胞(例如骨髓瘤細胞)進行融合，以製得融合瘤細胞；融合瘤細胞為一種可持續生長繁殖，並產生抗體的半永生細胞。可以使用由動物(例如小鼠)取得之常用的細胞株。較適用於本發明的細胞株為可有效融合、持續產生高量抗體、對次黃嘌呤-胺蝶呤-胸腺核苷(hypoxanthine-aminopterin-thymidine, HAT)培養液具有敏感性，且唯有在與可產生抗體之細胞融合後方可存活的細胞株。適合的骨髓瘤細胞包含，但不限於，小鼠骨髓瘤細胞株(例如骨髓瘤FO細胞)及人類骨髓瘤細胞株(例如Karpas 707H)。細胞融合通常是將脾臟細胞或淋巴結細胞與商業取得之骨髓瘤細胞在一促進細胞融合因子的作用下，進行融合反應，例如平均分子量約為200至20,000 kDa的聚乙二醇(Polyethylene glycol, PEG)或其他類似物。或者是，細胞融合可以利用商業細胞融合儀，藉由電刺激(例如電融合)來進行融合反應。融合後，將所得細胞稀釋並培養於HAT培養液中。

由該些融合細胞中挑選出適合的融合瘤細胞。於HAT培養液中存活的融合細胞會形成聚集群落。收集各培養液的上清液，且以抗原來檢測是否具有抗體效價。如上所述，可以使用酵素免疫吸附法、酵素免疫分析或放射免疫分析來進行檢測，其係將抗原塗佈於盤中，並由此進行篩選。一旦確認可產生抗體的孔洞，即可將其中的細胞轉移至不含胺蝶呤的次黃嘌呤-胸腺核苷(hypoxanthine-thymidine, HT)培養液中培養。經過培養，再次確認培養上清液中的抗體效價。由最終篩選出的細胞中，分離出單一顆細胞。待單一顆細胞生長繁殖成一聚集群落後，篩選對抗原具有高度專一性的聚集群落，並使其持續生長繁殖以製成融合瘤細胞株。

依據本揭示內容較佳的實施方式，在篩選出一株融合瘤細胞株後，可利用任何已知方式由該融合瘤細胞株單離或製備單株抗體。舉例來說，可以將融合瘤細胞株培養於低血清濃度的培養液中，再由該培養上清液製備抗體。或者是，將融合瘤細胞株注入動物的腹腔，由腹水來製備抗體。抗體可以任何方式進行純化，該方式包含親和性管柱、膠濾層析、離子交換層析或相關技術。可以使用任何相關領域習知技藝人士所熟知的方法或其組合。

或者是，可藉由DNA基因選殖來製備本發明單株抗體。可利用常規步驟來單離及定序分析(例如可專一結合至用以編碼單株抗體之重鏈及輕鏈基因的寡核苷酸探針)用以編碼本發明單株抗體之DNA。較佳的DNA來源是利用該些融合瘤細胞株。一旦分離後，可將DNA建構至表現載體，再將表現載體轉染至宿主細胞(例如大腸桿菌細胞、猿猴COS細胞、中國倉鼠卵巢CHO細胞或不會產生免疫球蛋白的骨髓瘤細胞)，藉此於重組宿主細胞中製備出單株抗體。

製得的單株抗體及用以編碼該些單株抗體的DNA可用以製備嵌合型抗體(例如雙專一性抗體)、人類化抗體及/或其抗體片段。

非人類來源的單株抗體因具有免疫抗原性(immunogenicity)而會造成過敏反應。單株抗體多是源自小鼠，其注射至人體後往往會引起嚴重的免疫反應。為降低非人類來源之單株抗體的免疫抗原性，將非人類來源之單株抗體的重鏈及輕鏈變異區與人類抗體之恒定區接合，藉此製備人類化抗體。

為製備人類化的單株抗體，先將該些用以編碼抗體的DNA分離並定序，再據以進行人類化建構。

依據本揭示內容較佳的實施方式，將非人類來源之單株抗體的VH及VL基因建構至人類IgG1載體中。由此製得的抗體因此具有源自非人類來源之單株抗體的VH及VL區，而其恒定區基因(即CK或CH1-H-CH2-CH3)則為人類的IgG。

一旦製得，可依據相關領域中的標準步驟來純化人類化單株抗體，包含掃流過濾(cross-flow filtration)、親和性管柱層析(affinity column chromatography)或膠體過慮(gel filtration)等方法。當可想見，人類化單株抗體的作用應與非人類來源之單株抗體相同或大致相似。較佳地，相較於非人類化抗體，人類化之單株抗體對人類個體具有較佳的作用效益。

本揭示內容的第一態樣因此是關於一種對Siglec-3受器具有專一性的單株抗體或其片段(即一種抗-Siglec-3單株抗體或一種抗-Siglec-3抗體片段)。依據本揭示內容之實施方式，該單株抗體包含一VL區及一VH區，其中該VL區包含CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3，且該VH區包含CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3。

依據本揭示內容的實施方式，本發明單株抗體係命名為抗體10C8，其CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3分別具有VYY、ISSAG (序列編號：3)及QYFNFP (序列編號：4)的胺基酸序列，且其CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3分別具有NNGW (序列編號：5)、GIGPYGGSTF (序列編號：6)及SRFIGSYSHM (序列編號：7)胺基酸序列。

較佳地，該VL區的胺基酸序列至少85% (即85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% or 100%)相似於序列編號：8，且該VH區的胺基酸序列至少85% (即85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% or 100%)相似於序列編號：9。當可想見，該VL及VH區的骨架序列可有所變異(例如以保留性或非保留性胺基酸殘基進行置換)，而不會影響本發明抗體的結合親和力及/或專一性。較佳地，以一或多具有相似特性的胺基酸殘基來保留性置換骨架區的序列；舉例來說，以異白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸或色胺酸(一非極性胺基酸殘基)來取代白胺酸(另一非極性胺基酸殘基)；以麩胺酸(一酸性胺基酸殘基)取代天門冬胺酸(另一酸性胺基酸殘基)；或是以精胺酸或組胺酸(一鹼性胺基酸殘基)來取代離胺酸(另一鹼性胺基酸殘基)。依據一較佳的實施方式，該VL及VH區的胺基酸序列分別至少90%相似於序列編號：8及9。更佳地，該VL及VH區的胺基酸序列分別至少95%相似於序列編號：8及9。在本揭示內容一操作實施例中，該VL區具有序列編號：8的胺基酸序列，且該VH區具有序列編號：9的胺基酸序列。

本發明單株抗體(即，抗-Siglec-3單株抗體)可用以治療或預防HBV感染。據此，本揭示內容亦提供一種藥學組合物或藥物，據以預防或治療HBV感染，以及/或是減緩或改善與HBV感染相關/由HBV感染所造成之病徵。該藥學組合物或藥物包含一有效量之依據本揭示內容之任一態樣或實施例所述的單株抗體，以及非必要性地，一藥學上可接受之載體。

一般來說，本發明單株抗體/抗體片段的重量約佔藥學組合物或藥物總重的0.1%到99%。在某些實施方式中，該單株抗體/抗體片段的重量至少佔藥學組合物或藥物總重的1%。在某些實施方式中，該單株抗體/抗體片段的重量至少佔藥學組合物或藥物總重的5%。在某些實施方式中，該單株抗體/抗體片段的重量至少佔藥學組合物或藥物總重的10%。在其他實施方式中，該單株抗體/抗體片段的重量至少佔藥學組合物或藥物總重的25%。

可將本發明藥學組合物配製為固體、半固體或液體形式，例如錠劑、膠囊、粉末、顆粒、軟膏、溶液、栓劑及注射液。據此，可藉由諸如口服、頰部、直腸、非腸胃道、靜脈注射及腹腔注射等不同路徑來投予本發明單株抗體/抗體片段。在藥劑形式中，可單獨投予本發明單株抗體/抗體片段，或是與其他已知用以治療由HBV感染造成之疾病及病症的藥學活性劑合併投予。本發明所屬技術領域具有通常知識者可依據投予路徑的不同來選擇適當的劑型。最佳的投予路徑會因疾病或病症的本質或嚴重程度不同而有所差異。

可依據可接受的藥物製作方法來製備本發明藥物或藥學組合物，例如於Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17^th edition, ed. Alfonoso R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, Pa (1985)所述的方法。藥學上可接受之載體為該些與劑型中其他成分相容且可為生物體接受的物質。

可使用之固體賦形劑可以包含一或多種物質，該物質可以是調味劑、潤滑劑、增溶劑、懸浮劑、填充劑、助流劑、壓縮助劑、粘合劑、片劑崩解劑或包覆性材料。若以粉末形式存在，該賦形劑係為一可與細碎活性成分混合的細碎的固體。若以片劑方式存在，活性成分是與一具有壓縮特性的賦形劑，以適當比例壓縮為所需的形狀及大小。粉末及片劑最好包含高達99%的活性成分。適用於本發明之固體賦形劑可以是磷酸鈣、硬脂酸鎂、滑石、糖、乳糖、糊精、澱粉、明膠、纖維素、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉，以及聚乙烯吡咯烷酮等。

亦可將本揭示內容之單株抗體/抗體片段配製為無菌溶液或懸浮液形式之液體藥學組合物，其係可以靜脈內、動脈內、肌肉內、皮下、脊內、腹腔或顱內等方式注射至個體。

可將本揭示內容之藥學組合物或藥物配製為適用於非口服施予的劑型，例如注射施予，其包含，但不限於皮下、彈丸注射(bolus injection)、肌肉內、腹腔內及靜脈內注射。藥學組合物或藥物可配製成油性或水性的等張懸浮液、溶液或乳膠，且可包含處方藥劑，例如懸浮、穩定或分散藥劑。或者是，藥學組合物或藥物可以製成乾燥形式，例如粉末、晶體或冷凍乾燥的固體，並附與使用前為無菌且無熱原(pyrogen-free)的水或等張生理食鹽水。組合物亦可置於無菌的安瓶或小瓶中。

當本發明單株抗體/抗體片段係配製為靜脈內、經皮或皮下注射等投予劑型時，可將單株抗體製為無熱原之非口服可接受的液體溶液。在考量到pH值、等張性及穩定性等因素下，本發明所屬技術領域中具有通常知識者皆知如何製備該非口服可接受的液體溶液。除了本發明單株抗體/抗體片段外，一較佳之用以靜脈內、經皮或皮下注射的藥學組合物或藥物應包含一等張賦形劑，例如氯化鈉注射液、林格氏注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖及氯化鈉注射液、乳酸林格氏注射液或其他習知之賦形劑。本發明藥學組合物或藥物亦可包含穩定劑、防腐劑、緩衝液、抗氧化劑或其他本發明所屬領域具有通常知識者所知的添加劑。靜脈投予本揭示內容之藥學組合物或藥物的間隔時間會隨著疾病的嚴重程度及每位個體之狀況與潛在特異反應的不同而有所差異。在連續靜脈內投予時，每次投予本發明單株抗體的間隔時間可為12到24小時。醫療人員可決定最終之靜脈治療的療程。

本揭示內容的另一態樣是關於一種用以預防一個體感染HBV及/或治療一個體之HBV感染的方法。該方法包含對該個體投予一有效量之本揭示內容所述之單株抗體/抗體片段、藥學組合物或藥物。

該投予至個體的有效劑量約為每公斤個體體重0.01到1,000毫克，例如每公斤個體體重0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1,000毫克；較佳地，約為每公斤個體體重0.1到100毫克。可以單一等分投予該劑量，或是以多等分進行投予。習知技藝人士或臨床人員可依據病患的生理狀況或疾病的嚴重程度來調整投予劑量或療程。

依據本揭示內容某些實施方式，HBV感染會抑制個體的免疫反應，而投予本發明單株抗體(即，抗-Siglec-3單株抗體)則可回復HBV造成的免疫抑制反應。在該些實施方式中，本發明抗-Siglec-3單株抗體可用以阻斷HBV及Siglect-3的結合，據以活化/改善宿主的免疫反應，進而清除個體體內的HBV病毒顆粒。因此，本發明抗-Siglec-3單株抗體可用以預防或治療HBV感染，以及/或是減緩或改善與HBV感染相關/由HBV感染造成之病徵。

基本上，可接受本發明方法治療之個體為一哺乳動物，舉例來說，人類、小鼠、大鼠、天竺鼠、倉鼠、猴子、豬、狗、貓、馬、綿羊、山羊、牛及兔子。較佳地，該個體是一人類。

本發明單株抗體(即，抗-Siglec-3單株抗體)可以一適當的路徑投予至個體體內，例如口服、腸內、鼻腔、局部、黏膜或非口服投予，其中非口服投予可以是肌肉內、靜脈內或腹腔內注射。

當可想見，可單獨對個體施予本發明方法，亦或是可與其他對預防或治療HBV感染有所助益的額外療法共同施予。依據所需/治療目的不同，本發明方法可於投予該額外療法之前、期間或之後進行投予。

下文提出多個實驗例來說明本發明的某些態樣，以利本發明所屬技術領域中具有通常知識者實作本發明，且不應將這些實驗例視為對本發明範圍的限制。據信習知技藝者在閱讀了此處提出的說明後，可在不需過度解讀的情形下，完整利用並實踐本發明。此處所引用的所有公開文獻，其全文皆視為本說明書的一部分。 實施例

材料及方法

血液供體

本研究血液供體是源自中國醫藥大學附設醫院中未經治療且為HBeAg陽性(HBV DNA ＞ 每毫升2x10⁷ IU)的CHB病患(n=6)。所有的病患皆未經其他病毒感染，包含C型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)、人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)、巨細胞病毒(cytomegalovirus, CMV)及艾司坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus, EBV)。健康供體(n=6)則來自台灣血液中心。本研究經倫理委員會核准，且所有參與者皆有簽署知情同意書。

質體及融合蛋白

以反轉錄-PCR來擴增源自人類GM-Mϕ的人類Siglec-3/-7胞外域(extracellular domain, ECD) DNA片段，並將其次轉殖至pSecTag2-hIgG載體，以製備重組Siglec-3/-7 ECD.Fc融合蛋白。依據使用者操作說明，利用FreeStyle 293表現系統來過量表現重組Siglec-3/-7/-9 ECD.Fc融合蛋白。於轉染後第3天及第5天收集培養上清液，並以蛋白A管柱來純化重組融合蛋白。

純化及定量分析 HBV 病毒

分別由CHB病患及HBV基因轉殖小鼠的血液檢體純化HBV。利用習知方法來進行純化。依據標準HBV質體，以RT-PCR來決定HBV病毒量。利用ELISA套組來定量分析HBsAg的含量。

以奈米 -LC-MS/MS 確認 HBsAg 之聚醣結構

將由CHB病患及基因轉殖小鼠純化的HBV注入12% SDS-PAGE，依據HBsAg的分子量將膠體切割為不同片段，接著以胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶分解之。以配有奈米電噴霧離子源、Agilent 1100連續二元高效液相色析泵及Famos自動推樣器的LTQFT Ultra (線性四極離子阱傅立葉轉換離子迴旋共振)質譜儀進行高解晰度及高質量準確度奈流LC-MS/MS實驗。以每分鐘10微升的流速將6微升的分解溶液注入自填式預柱(150微米I.D. x 20毫米，5微米，100 Å)。利用自填式反相C18奈米管柱(75微米I.D. x 300毫米，5微米，100 Å)，以 0.1%之溶於水的甲酸作為移動相A，以及0.1%之溶於80%乙腈的甲酸作為移動相B，將流速設定為每分鐘300奈升，進行色析分離。檢測全掃描MS條件：質量範圍為m/z 320-2000，m/z 400的解晰度為50,000。以LTQ 依序分離強度最強的五種離子。使電噴霧電壓維持於1.8 kV，且將毛細管溫度設置為200°C。

以唾液酸酶移除 HBV 及唾液酸聚醣的唾液酸

分別利用唾液酸酶S及唾液酸酶C移除HBV或唾液酸聚醣上的唾液酸聚醣。唾液酸酶S僅會釋放出α(2–3)連接的Neu5Ac，而唾液酸酶C則會釋放α(2–3)連接及α(2-6)連接的Neu5Ac。經唾液酸酶處理的受質可用以進行HBV-Siglec-3結合試驗及競爭試驗。

HBV 與 Siglec.Fc 融合蛋白之間的結合反應

於4°C，分別將HBV (每毫升10⁹ 拷貝數)與重組Siglec-3/-7/-9 ECD.Fc融合蛋白培養16小時後，加入與瓊脂糖鍵結的蛋白A磁珠進行免疫沉澱反應。利用12% SDS-PAGE分離不同分子量之檢體後，轉漬至PVDF膜，加入阻斷緩衝液(0.05%之溶於包含5% BSA之TBS的Tween 20)並於4°C反應至隔日。加入與HRP鍵結之多株山羊-抗-HBs抗體於室溫反應1小時，之後加入鏈酶卵白素-HRP (1:10000稀釋)於室溫再反應1小時，並以ECL觀測表現量。

競爭試驗

將Siglec ECD.Fc融合蛋白(5微克)塗佈於微量滴定盤，在包含不同濃度之以下聚醣的環境中，加入HBsAg (100奈克)：Neu5Ac(α2-6)-Gal-GlcNAc、Neu5Ac(α2-3)-Gal-GlcNAc及Gal-GlcNAc，於不含蛋白的阻斷緩衝液中，於4°C反應12小時。經唾液酸酶處理及未經唾液酸酶處理的唾液酸聚醣可用以進行競爭試驗。

利用生物層干涉法 (Bio-layer interferometry , BLI) 決定受器 - 病毒的結合反應

利用生物層干涉法來決定人類Siglec.Fc融合蛋白與HBV之間的結合反應。簡單來說，使生物感測器與Siglec.Fc融合蛋白固定後，於室溫以流動緩衝液(10 mM Tris·HCl、150mM NaCl、2mM CaCl₂ 及2mM MgCl₂ ，pH 7.4)分析Siglec.Fc與HBV之間的結合。決定HBV與人類Siglec-3之間的價數，如以下公式所述，其與多價結合強度及單價結合強度相關： KA, surf = F (Sx10^-2 )^n-1 x (KA,單)ⁿ ，其中KA, surf為KD (HBV與Siglec-3)的倒數，KA,單為KD (雙觸角(Biantennary) α2-6連結的唾液酸醣肽及Siglec-3)的倒數；n為價數值；F為系統中的統計因子，S等於40(Å)，其係依據RCSB蛋白資料庫(編號：5J0B)之Siglec-3的晶體結構推知而得。計算三項獨立的BLI分析結果，以得到n值(價數值)。

製備及確認抗 -Siglec 單株抗體，並篩選拮抗性抗體

由噬菌體表現之合成抗體庫來製備抗-Siglec單株抗體。結合功能性scFv變異體及人類IgG來建構通用型人類抗體，並以FreeStyle 293表現系統進行製備。

利用與APC鍵結之抗-Siglec-3及人類IgG (由與APC鍵結之套組所製備)進行流式細胞儀分析，以決定其與moDC的結合能力。基於抗體對經TLR2刺激之moDC分泌細胞激素的抑制功效來確認為促效型及拮抗性型-Siglec-3單株抗體。簡單來說，將moDC種植於培養盤24小時，加入抗-Siglec單株抗體反應1小時，之後再加入pam3csk4 (每毫升0.05微克)反應24小時。以ELISA套組來分析上清液中細胞激素的含量。

細胞培養

利用標準密度梯度離心，由健康人類供體及CHB病患之全血分離PBMC。為製備初始巨噬細胞，利用抗-CD14微磁珠進行高梯度磁選，由PBMC純化CD14⁺ 細胞。將細胞培養於包含10% FCS及人類GM-CSF/IL-4的全RPMI 1640細胞培養液中培養6-7天，以製備moDC。

為了解HBV的抑制功效，將moDC (每孔洞6 x 10⁴ 細胞)與HBV培養24小時，之後加入Pam3csk4 (每毫升0.05微克)或聚(I:C)(每毫升100微克)+IFN-γ (每毫升100奈克)反應24小時。為確認為促效型或拮抗性型Siglec-3單株抗體，將CHB病患的moDC (每孔洞6 x 10⁴ 細胞)及PBMC (每孔洞6 x 10⁴ 細胞)與抗-Siglec單株抗體培養1小時，再加入HBV反應24小時，之後加入Pam3csk4 (每毫升0.05微克)或聚(I:C)(每毫升100微克)反應24小時。以ELISA套組分析上清液中細胞激素的含量。

共軛焦顯微鏡

將CHB病患的moDC (2 x 10⁵ 細胞)及PBMC與分離自CHB病患之HBV (每毫升10⁹ 拷貝數)在包含或不包含抗-Siglec-3單株抗體(每毫升3微克，殖株10C8)的環境中，冰上培養1小時。於4°C洗滌並固定細胞1小時，接著於室溫加入細胞通透緩衝液(0.5%之溶於PBS的Triton X-100)作用15小時後，置於阻斷緩衝液(3% BSA)反應1小時，之後加入一級抗體。於4°C培養24小時後，於室溫加入二級抗體反應1小時，接著加入鬼筆環肽(phalloidin，每微升1單位)及Hoechst 33342作用10分鐘，再以 Leica SP5共軛焦顯微鏡觀察表現量。

螢光共振能量轉移 (Fluorescence resonance energy transfer, FRET) 及螢光生命週期影像 (fluorescence lifetime imaging, FLIM)

將Siglec-3 (作為供體)與一級抗體於4°C共同培養24小時後，加入驢抗-小鼠(H+L) Alexa-Fluor 647鍵結的二級抗體，於室溫反應1小時。將HBsAg (作為受體)與100微升之每毫升10微克的一級抗體於4°C共同培養24小時後，加入驢抗-山羊(H+L)Alexa-Fluor 546鍵結的二級抗體，於室溫反應1小時。染色後，以PBS洗滌細胞，並將細胞重新懸浮於包埋溶液，並以蓋玻片封蓋。

為進行FLIM-FRET分析，以Leica SP5共軛焦顯微鏡記錄FLIM。測量僅表現FRET供體之細胞及同時表現FRET供體及受體之細胞的螢光生命週期。以雷射(488奈米)脈衝檢體，並收集檢體的發散波長(500到550奈米)。各檢體皆記錄10,000個光子。依據以下公式計算FRET效率(E)：E=1-(τDA/τD)，其中τDA為共同表現FRET供體及受體之細胞的平均螢光生命週期，而τD則為僅表現FRET供體之細胞的平均螢光生命週期。

偵測經 HBV 處理之 moDC 中，與 Siglec-3 結合的 SHP-1 及 SHP-2

將moDC與HBV培養後，重新懸浮於細胞分解緩衝液中，加入抗-Siglec-3多株抗體後，以與蛋白A鍵結之瓊脂糖進行免疫沉澱反應。利用SDS-PAGE分離不同分子量之免疫沉澱物，並其轉漬至PVDF膜，分別加入抗-SHP-1及SHP-2抗體。之後依序加入與HRP鍵結之抗-兔子IgG抗血清，以及增強化學冷光偵測試劑。為偵測Siglec-3的總量，以Re-Blot增強溶液移除結合抗體後，加入小鼠抗-Siglec-3抗體。

統計分析

將數值表示為平均值±標準差。所有的實驗皆至少重覆3次。以Studentt 試驗評估分析結果。當P值為0.05時，即視為具有顯著差異。

實施例 1 HBsAg 的聚醣結構

為了解hHBV與mHBV之唾液酸聚醣的不同，以CsCl₂ 超速離心法分別純化CHB病患(hHBV)及基因轉殖小鼠(mHBV)血清中的病毒顆粒，接著以奈流LC-MS/MS及GlycoSeq軟體決定聚醣結構。

結果發現源自hHBV表面抗原(hHBsAg)且具有重疊序列的二條胜肽皆包含N-聚醣。第一條胜肽具有序列編號：1的胺基酸序列(T₁₄₀ KPT DGN₁₄₆ CTCIPIPSSW₁₅₆ ，N-聚醣係位於Asn-146位置)；而第二條胜肽則具有序列編號：2 的胺基酸序列(P₁₄₂ S DGN₁₄₆ CTCIPIPSSWAFGK₁₆₀ ，N-聚醣係位於Asn-146位置)。T/S₁₄₃ 突變指出CHB病患的血清存在HBV突變株。對第一條胜肽來說，荷質比(mass to charge ratio, m/z) 1068.94的訊號值表示GlcNAc，m/z 656.92的訊號值表示Neu5Ac-Gal-GlcNAc，而m/z 1515.02-1923.80的訊號值則表示具有唾液酸化聚醣之延伸分支的片段化(結果未顯示)。該結果顯示， hHBsAg具有雙觸角N 聚醣：Neu5Ac-Gal-GlcNAc-Man連接於GlcNAc。進一步以偽-MS質譜儀來分析末端唾液酸與半乳糖的連結。低m/z 274.12及m/z 292.15訊號值顯示Neu5Ac(α2-6)-Gal-GlcNAc的存在(結果未顯示)。此外，約有45%胜肽包含與二個唾液酸(biS2, 27.6%)或一個唾液酸(biS1, 17.9%)鍵結的雙觸角N-聚醣(第1圖之圖A)。於第二條胜肽亦可觀察到相似的結果(第1圖之圖B)。相較之下，即使具有相同之與聚醣鍵結的胜肽序列，源自mHBV表面抗原(mHBAg)的第一條胜肽並不包含N-聚醣(第1圖之圖C)。

該些結果指出，源自CHB病患之HBsAg (稱為hHBsAg)包含雙觸角Neu5Ac(α2-6)GalGlcNAcMan，其係與hHBV之小型S抗原的Asn-146鍵結，而源自HBV 基因轉殖小鼠之mHBsAg於相同位置則不具有雙觸角Neu5Ac(α2-6)GalGlcNAcMan。

實施例 2 HBV Asn-146 唾液酸聚醣與人類 Siglec 的結合反應

基於hHBV雙觸角聚醣相似於人類Siglec-3、-7、-9的配位體，本實施例將分析hHBV與該些骨髓性Siglec (高度表現於樹突細胞及其他骨髓細胞)的結合反應。

將重組Siglec ECD.Fc融合蛋白與hHBV共同培養，以檢測其與hHBV的結合反應。抗-HBsAg多株抗體可結合所有醣化及非醣化的HBsAg (小型、中型及大型)，而人類Siglec-3.Fc則主要結合醣化小型HBsAg(h)(gs, 27KDa)(第2圖之圖A)；該些結果指出，Siglec-3偏好與hHBV之小型HBsAg的唾液酸聚醣結合。然而，在相同條件下，Siglec-7.Fc及 Siglec-9則不會產生相似的結合反應(第2圖之圖A)，該結果顯示hHBV偏好藉由小型HBsAg上的唾液酸聚醣來與Siglec-3結合(第2圖之圖A)。

即使mHBV 之Asn-146位置不具有唾液酸聚醣，惟於mHBV 可發現醣化及非醣化HBsAg (第2圖之圖B)。該結果與先前研究結果一致，即於胺基酸殘基Asn-129、Asn-130及Asn-131可偵測到其他的醣化位置。進一步以免疫沉澱法及ELISA來分析骨髓性Siglec與mHBV的結合專一性。然而，該些Siglec均無法與mHBV結合(第2圖之圖B)，ELISA結果亦顯示其不會與三種Siglec結合(第2圖之圖C)。

為確認hHBV與人類Siglec-3離體的結合專一性，由CHB病患分離周邊血液細胞後，以抗-HBsAg抗體及與Alexa-Fluor 546鍵結的二級抗體，以及抗-Siglec-3單株抗體及與Alexa-Fluor 488鍵結的二級抗體進行雙染。以鬼筆環肽染色細胞輪廓。數據指出僅能於Siglec-3⁺ 細胞偵測HBsAg，其係與HBsAg同位表現(結果未顯示)。該些結果顯示，hHBV會結合至Siglec-3⁺ 人類骨膸細胞。接著以FRET來分析hHBV與Siglec-3的直接結合。數據指出僅能於hHBV與Siglec-3之間偵測到高能量轉移，而於Siglec-7及Siglec-9則無法偵測到(第2圖之圖D及圖E)。此外，加入Siglec-3配位體 (Neu5Ac(α2-6)GalGlcNAc)可以劑量相關的方式抑制Siglec-3-HBV的結合反應，而在相同條件下加入Neu5Ac(α2–3)GalGlcNAc及GalGlcNAc則不會抑制Siglec-3-HBV的結合反應(第2圖之圖F)。為進一步確認hHBV-Siglec-3的結合是透過α2-3連結之唾液酸，分別加入唾液酸酶S (釋放α2-3 唾液酸)及唾液酸酶C (釋放α2-3 and α2-6 唾液酸)以移除Neu5Ac(α2-6)GalGlcNAc聚醣及hHBV上的唾液酸。結果證實經唾液酸酶C (而非唾液酸酶S)處理的Neu5Ac(α2-6)GalGlcNAc聚醣會喪失其對Siglec-3-HBV結合反應的抑制功效(第2圖之圖G)，且唾液酸酶C會降低hHBV結合至Siglec-3 (第2圖之圖H)。

整體來說，該些結果證實hHBV與Siglec-3的結合主要是透過與HBsAg相關之唾液酸聚醣上的末端α2-6唾液酸。

實施例 3 決定 HBV 與人類 Siglec 的結合親和力

本實施例將分析人類Siglec-3與hHBV病毒體之間的結合親和力。重組Siglec-3.Fc (Siglec-3為二聚體)及單聚體Neu5Ac(α2-6)GalGlcNAc之間的平衡解離常數(KD)為1.59 (±0.97) x 10^-3 ，而Siglec-3.Fc及雙觸角Neu5Ac(α2-6)GalGlcNAc之間的KD則為9.59 (±1.45) x 10^-5 (表1)。 表1 Siglec-3.Fc與Neu5Ac(α2-6)GalGlcNAc聚醣的反應動力學

Ka：結合速率常數。 Kd：解離速率常數。 KD：平衡解離常數。由三項獨立實驗得到結果，並將結果表示為平均值±標準差。

重組Siglec-3與人類HBV (hHBV)病毒體之間的KD會增加至1.15 (±0.11) x 10^-10 (表2)。相較之下，於相同條件下，小鼠HBV (mHBV)病毒體則不會與人類Siglec-3結合(表3)。 表 2 重組Siglec-3與hHBV的反應動力學

Ka：結合速率常數。 Kd：解離速率常數。 KD：平衡解離常數。由三項獨立實驗得到結果，並將結果表示為平均值±標準差。 表3 重組Siglec-3與mHBV的反應動力學

Ka：結合速率常數。 Kd：解離速率常數。 KD：平衡解離常數。由三項獨立實驗得到結果，並將結果表示為平均值±標準差。

HBV與重組Sigelc-3.Fc之間的價數(N)為2，意指各單聚體Siglec-3會結合至一雙觸角Neu5Ac(α2-6)GalGlcNAc。相較之下，在相同條件下，hHBV則不會與其他Siglec-7及Siglec-9結合。以唾液酸酶C移除hHBV上α2-6連結之Neu5Ac可阻斷Siglec-3與hHBV的結合(表4)。 表4 Siglec-3與特定hHBV的反應動力學

Ka：結合速率常數。 Kd：解離速率常數。 KD：平衡解離常數。由三項獨立實驗得到結果，並將結果表示為平均值±標準差。

該些數據指出，hHBV病毒體會藉由雙觸角Neu5Ac(α2-6)GalGlcNAc的末端α2-6唾液酸結合至Siglec-3。

實施例 4 hHBV 會抑制 TLR 配位體刺激 moDC 分泌細胞激素

本實施例將分析Asn-146唾液酸聚醣是否會影響TLR配位體(其為免疫細胞的潛力活化劑)刺激moDC分泌細胞激素。

分別將源自CHB病患及基因轉殖小鼠的moDC與Pam3csk4 (TLR-2配位體)及聚(I:C)(TLR-3配位體)與干擾素-α (IFN-α)共同培養。hHBV會以劑量相關的方式抑制腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF-α)及干擾素γ誘發蛋白10 (interferon gamma-induced protein 10, IP-10)的產生；在相同條件下，mHBV則不具該抑制功效(第3圖之圖A到圖D)。該些結果顯示hHBV所媒介之抑制反應可能是藉由活化Siglec-3所造成。為確認該推論是否屬實，將moDC與hHBV共同培養不同時間後，以抗-Siglec-3單株抗體進行免疫沉澱反應，以偵測SHP-1及SHP-2，其於Siglec-3活化後會藉由ITIM域聚集(第3圖之圖E)。該些結果顯示，於15分鐘時，可偵測到SHP-1及SHP-2的訊號，於30分鐘時達最大量，而於培養60分鐘後減少(第3圖之圖E)。此外，hHBV會以劑量相關的方式聚集SHP-1及SHP-2 (第3圖之圖F)。

該些數據顯示，hHBV會藉由Siglec-3誘發的抑制訊息來抑制TLR配位體誘發細胞激素分泌。

實施例 5 評估抗 -Siglec-3 單株抗體對 HBV 感染的功效

5.1 製備及確認抗 - 人類 Siglec-3 單株抗體

本實施例將製備四株抗Siglec-3單株抗體，據以確認可阻斷HBV媒介之免疫抑制反應的拮抗型抗-Siglec-3單株抗體。

首先，由噬菌體表現之合成人類抗體庫篩選出抗-人類Siglec-3單株抗體，並評估其對HBV媒介之免疫抑制反應的抑制功效。流式細胞儀分析結果顯示，在篩選出的殖株中，殖株2B9及殖株10C8對moDC具有最高的平均螢光強度(mean fluorescence intensity, MFI)(結果未顯示)。依據定序結果，單株抗體10C8的VL及VH區分別包含序列編號：8及9的胺基酸序列，其中CDR-L1到CDR-L3分別包含VYY、ISSAG (序列編號：3)及QYFNFP (序列編號：4)的胺基酸序列；而CDR-H1到CDR-H3則分別包含NNGW (序列編號：5)、GIGPYGGSTF (序列編號：6)及SRFIGSYSHM (序列編號：7)的胺基酸序列。

基於會促使SHP-1及SHP-2聚集(第4圖之圖A)及抑制經Pam3csk4刺激之moDC表現TNF-α　(第4圖之圖B)之結果，殖株2B9顯然為一促效型單株抗體。殖株3B8、4D2及5E3亦呈現與殖株2B9相似的特性，因此亦為促效型單株抗體(結果未顯示)。相較之下，於相同條件下，殖株10C8既不會使SHP-1及SHP-2聚集，亦不會抑制Pam3csk4誘發TNF-α表現(第4圖之圖A及圖B)，意即殖株10C8不會藉由Siglec-3產生抑制訊息。

此外，如FRET結果所示，殖株10C8可抑制CHB病患之PBMC中Siglec-3與HBV的結合反應(第5圖之圖A)。螢光影像指出，在投予同型對照單株抗體(IgG1)或未投予單株抗體時，Siglec-3會與HBV同位表現於CHB病患的PBMC，而投予殖株10C8則會阻斷Siglec-3與HBV的結合反應(結果未顯示)。相似的結果亦可見於與外源性hHBV培養的moDC (第5圖之圖B)。

該些結果證實殖株10C8為拮抗型抗-Siglec-3單株抗體，可用以阻斷細胞表面HBV-Siglec-3的結合。

5.2 HBV 會抑制 TLR 配位體誘發細胞激素表現，而拮抗型抗 -Siglec-3 單株抗體則可回復該抑制反應

本實施例將分析殖株10C8是否可回復hHBV媒介之抑制反應。

在含有hHBV的環境下，將moDC與pam3csk4及聚(I:C)+IFN-γ共同培養，接著以ELISA偵測TNF-α及IP-10的表現量。第6圖的結果指出，HBV會以劑量相關的方式抑制經Pam3sk4或聚(I:C)+IFN-γ刺激之moDC表現TNF-α及IP-10，而殖株10C8可阻斷HBV媒介的抑制反應(第6圖之圖A到D)。此外，殖株10C8亦可抑制hHBV誘發SHP-1及SHP-2聚集至Siglec-3的反應(第6圖之圖E)。再者，殖株10C8可增加CHB病患之經TLR配位體刺激之PBMC中TNF-α及IP-10表現量(第6圖之圖F及圖I)。

據此，該些數據證實殖株10C8為一拮抗型抗-Siglec-3單株抗體，可用以阻斷moDC中HBV媒介的抑制訊息。

總結上述，本發明之發明人非預期地確認HBV對Siglec-3受器具有結合親和力。基於該發現，本揭示內容提供了一種新穎的抗-Siglec-3單株抗體(即，10C8單株抗體)，其可回復HBV誘發的免疫抑制反應，因此可用以研發治療及/或預防HBV感染的藥物。

雖然上文實施方式中揭露了本發明的具體實施例，然其並非用以限定本發明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不悖離本發明之原理與精神的情形下，當可對其進行各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍當以附隨申請專利範圍所界定者為準。

無

為讓本發明的上述與其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下： 第1圖為依據本揭示內容實施例1所闡述之結果，其係關於B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)之特定聚醣的百分比。圖A：源自CHB病患之HBV (hHBV)且具有序列編號：1之胺基酸序列的胜肽。圖B：源自hHBV且具有序列編號：2之胺基酸序列的胜肽。圖C：源自基因轉殖小鼠之HBV (mHBV)且具有序列編號：1之胺基酸序列的胜肽。bi：無末端Neu5Ac；biS1：一個Neu5Ac；biS2：二個Neu5Ac。 第2圖為依據本揭示內容實施例2所闡述之結果，其係關於HBV及Siglec-3的結合反應。圖A及圖B：利用Siglec ECD.Fc融合蛋白進行hHBV (圖A)及mHBV (圖B)的免疫沉澱分析。S/M/L：小型/中型/大型HBsAg，gS：醣化小型HBsAg。圖C：利用ELISA以Siglec ECD.Fc來決定hHBV及mHBV的結合反應。圖D：於經hHBV感染之源自單核球的樹突細胞(monocyte-derived dendritic cell, moDC)中，hHBV與Siglec-3、-7、-9之間的FRET效率。圖E：在CHB病患(血清HBV DNA含量＞每毫升2.0 x 10⁷ IU)之周邊血液單核細胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)中，hHBV與Siglec-3、-7、-9之間的FRET效率。以FLIM-FRET分析軟體，並依據「材料及方法」所述之公式來決定FRET效率。每組實驗n值為10-15，並將所得數據表示為平均值±標準差(standard deviation, s.d.)。** p＜0.01 (Student’s t-試驗)。圖F及圖G：以唾液酸聚醣(sialoglycan，圖F)及經唾液酸酶-C/唾液酸酶-S處理唾液酸聚醣(圖G)，進行hHBV與Siglec-3結合反應的競爭試驗。圖H：唾液酸酶-C及唾液酸酶-S對hHBV與Siglec-3結合反應的作用。* p＜0.05，** p＜0.01，*** P＜0.001 (Student’s t-試驗)。所有的數據皆為三組獨立實驗的分析結果。 第3圖為依據本揭示內容實施例4所闡述之結果，其係關於hHBV對TLR配位體(ligand)誘發細胞激素分泌的抑制功效。圖A到圖 D：在經Pam3csk4刺激之moDC (圖A及圖B)或經聚(I:C)(poly (I:C))刺激之moDC (圖C及圖D)中，hHBV可抑制細胞激素的分泌。以hHBV或mHBV前處理moDC 24小時後，投予pam3csk4 (圖A及圖B)或聚(I:C)+干擾素-γ (圖C及圖D)反應24小時。以ELISA決定上清液中細胞激素的含量。將三次獨立實驗結果表示為平均值±標準差。* p＜0.05，** p＜0.01，***：P＜0.001 (Student’s t-試驗)。圖E及圖F：hHBV以時間相關(圖E)及劑量相關(圖F)的方式聚集SHP-1及SHP-2。對moDC投予不同劑量之hHBV (圖E)或經過不同反應時間(圖F)，以西方墨點法觀察SHP-1及SHP-2於moDC的聚集狀況。利用軟體進行密度測量法以定量分析訊號值。以起始量標準化所得數值，並將其表示為倍數改變量。 第4圖為依據本揭示內容實施例5所闡述之特定單株抗體(monoclonal antibody, mAb)。圖A：對moDC投予hHBV或抗-Siglec-3單株抗體(殖株2B9或 10C8)後，觀察SHP-1及SHP-2與Siglec-3的結合。將抗-Siglec-3單株抗體加入細胞分解物中，並以西方墨點法來偵測SHP-1及SHP-2。圖B：抗-Siglec-3單株抗體(殖株2B9)可抑制經pam3csk4刺激之moDC分泌TNF-α。以抗-Siglec-3單株抗體前處理moDC 1小時後，投予pam3csk4。以ELISA決定上清液中TNF-α的含量。將由三次獨立實驗結果表示為平均值±標準差。** P＜0.01，*** P＜0.001 (Student’s t-試驗)。 第5圖為依據本揭示內容實施例5.1所闡述之結果，其係關於單株抗體10C8的生物活性，其中抗-Siglec-3單株抗體(殖株10C8)可降低Siglec-3與hHBV之間的FRET效率。圖A：Siglec-3與hHBV於CHB病患之PBMC中的結合反應。圖B：Siglec-3與hHBV於經外源性hHBV處理後之moDC中的結合反應。以 FLIM-FRET分析軟體，並依據「材料及方法」所述之公式來決定FRET效率。每組實驗n值為10-15，並將所得數據表示為平均值±標準差。** p＜0.01 (Student’s t-試驗)。 第6圖為依據本揭示內容實施例5.2所闡述之結果，其係關於單株抗體10C8對hHBV媒介之免疫抑制反應的功效。圖A到圖D：抗-Siglec-3單株抗體可回復經pam3csk4刺激之moDC (圖A及圖B)或經聚(I:C)刺激之moDC (圖C及圖D)分泌細胞激素。以抗-Siglec-3單株抗體前處理moDC 1小時後，在pam3csk4 (圖A及圖B)或聚(I:C)+IFN-γ (圖C及圖D)存在的環境中，投予不同劑量之hHBV反應24小時。以ELISA決定細胞激素的含量。圖E：抗-Siglec-3單株抗體可抑制hHBV媒介之SHP-1及SHP-2的聚集反應。以抗-Siglec-3單株抗體前處理moDC 1小時後，投予HBV培養30分鐘，接著加入抗-Siglec-3單株抗體進行反應。以SDS-PAGE分離免疫沉澱產物，並加入抗-SHP-1及抗-SHP-2單株抗體。利用軟體進行密度測量法進行定量分析，並以未處理之對照組標準化數值後，表示為倍數值。圖F到圖I：回復經pam3csk4刺激(圖F及圖G)或經聚(I:C)刺激(圖H及圖I)之 CHB病患的PBMC分泌細胞激素。以抗-Siglec-3單株抗體前處理由CHB病患新鮮分離之PBMC，再投予pam3csk4 (圖F及圖G)或聚(I:C)(圖H及圖I)培養。以ELISA來分析上清液中細胞激素的含量。將三次獨立實驗結果表示為平均值±標準差。* P＜0.05，** p＜0.01，*** P＜0.001。

<110> 中央研究院

<120> 抗-唾液酸結合性類免疫球蛋白凝集素之抗體、包含該抗體之藥學組合物及其用途

<160> 9

<170> BiSSAP 1.3

<210> 1

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的-hHBsAg胜肽1

<400> 1

<210> 2

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的-hHBsAg胜肽2

<400> 2

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的-CDR-L2

<400> 3

<210> 4

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的-CDR-L3

<400> 4

<210> 5

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的-CDR-H1

<400> 5

<210> 6

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的-CDR-H2

<400> 6

<210> 7

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的-CDR-H3

<400> 7

<210> 8

<211> 237

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的-VL區

<400> 8

<210> 9

<211> 468

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的-VH區

<400> 9

Claims (6)

1. 一種結合至人類唾液酸結合性類免疫球蛋白凝集素-3(sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin,Siglec-3)的抗體或其片段，包含：一輕鏈變異區，其包含一第一輕鏈互補性決定區(complementarity determining region)(CDR-L1)、一第二輕鏈CDR(CDR-L2)及一第三輕鏈CDR(CDR-L3)，其中該CDR-L1具有VYY的胺基酸序列、該CDR-L2具有ISSAG(序列編號：3)的胺基酸序列，且該CDR-L3具有QYFNFP(序列編號：4)的胺基酸序列；以及一重鏈變異區，其包含一第一重鏈CDR(CDR-H1)、一第二重鏈CDR(CDR-H2)及一第三重鏈CDR(CDR-H3)，其中該CDR-H1具有NNGW(序列編號：5)的胺基酸序列、該CDR-H2具有GIGPYGGSTF(序列編號：6)的胺基酸序列，且該CDR-H3具有SRFIGSYSHM(序列編號：7)的胺基酸序列。
2. 如請求項1所述之抗體或其片段，其中該輕鏈變異區具有序列編號：8的胺基酸序列，且該重鏈變異區具有序列編號：9的胺基酸序列。
3. 一種如請求項1所述之抗體或其片段於製備一藥物之用途，其中該藥物可用以預防或治療一個體之HBV感染。
4. 如請求項3所述之用途，其中該輕鏈變異區具有序列編號：8的胺基酸序列，且該重鏈變異區具有序列編號：9的胺基酸序列。
5. 一種用以預防或治療HBV感染的藥學組合物，包含一有效量之如請求項1所述之抗體或其片段，以及一藥學上可接受之載體。
6. 如請求項5所述之藥學組合物，其中該輕鏈變異區具有序列編號：8的胺基酸序列，且該重鏈變異區具有序列編號：9的胺基酸序列。

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