CN105579470A - Il-21结合蛋白和其用途 - Google Patents

Il-21结合蛋白和其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN105579470A
CN105579470A CN201480037182.8A CN201480037182A CN105579470A CN 105579470 A CN105579470 A CN 105579470A CN 201480037182 A CN201480037182 A CN 201480037182A CN 105579470 A CN105579470 A CN 105579470A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
associated proteins
cell
seqidno
set forth
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201480037182.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105579470B (zh
Inventor
查尔斯·瑞·麦凯
迪玉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Monash University
Original Assignee
Monash University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from AU2013902377A external-priority patent/AU2013902377A0/en
Application filed by Monash University filed Critical Monash University
Publication of CN105579470A publication Critical patent/CN105579470A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105579470B publication Critical patent/CN105579470B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/74—Inducing cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本公开提供了包含结合白介素-21(IL-21)的抗体的抗原结合位点的蛋白质及其用途，例如用于治疗。

Description

IL-21结合蛋白和其用途
相关申请资料
本申请要求2013年6月27日提交的标题为“Asuper-agonistmonoclonalantibodytohumanIL-21anditsapplicationinimmunomodulation”的澳大利亚临时专利申请号2013902377的优先权，其全部内容以引用的方式并入本文中。
领域
本公开涉及包含结合白介素-21(IL-21)的抗体的抗原结合位点的蛋白质和其用途，例如，用于治疗。
序列表
本申请与电子形式的序列表一起提交。序列表的全部内容以引用的方式并入本文中且构成说明书描述的一部分。
背景
细胞因子一般刺激造血系细胞的增殖或分化，或参与机体的免疫和炎症应答机制。白介素是介导免疫学应答的细胞因子家族。对免疫应答关键的是T细胞，其产生许多细胞因子且实现对抗原的适应性免疫。由T细胞产生的细胞因子被分类为TH1和TH2。1型细胞因子包括IL-2、IFN-γ、LT-α，且参与炎性应答、病毒免疫性、细胞内寄生物免疫性和同种异体移植排斥反应。2型细胞因子包括IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13，且参与体液应答、蠕虫免疫性和过敏应答。1型和2型之间的共有细胞因子包括IL-3、GM-CSF和TNF-α。有一些证据表明产生1型和2型的T细胞群体优先迁移到不同类型的发炎组织中。
天然杀伤(NK)细胞与T细胞和B细胞具有共同的祖细胞，并且在免疫监督中起作用。构成血液淋巴细胞的多达15％的NK细胞不表达抗原受体，并且是先天免疫的组成部分。NK细胞参与识别和杀伤肿瘤细胞和病毒感染的细胞。在体内，NK细胞被认为需要活化，然而，在体外，NK细胞已经显示在不活化的情况下杀伤一些类型的肿瘤细胞。
IL-21已经被证明是细胞毒性T细胞和NK细胞的有效调节剂(modulator)。IL-21已经显示共刺激NK细胞的扩增，并且它已经显示增强这些细胞的效应功能。T细胞应答包括增强初次抗原应答作为对记忆T细胞功能的调节。
已经显示IL-21R敲除小鼠与正常小鼠相比在抗原暴露之后表达较高水平的IgE和较低水平的IgG1。在给小鼠注射IL-21之后，IgE水平降低。这暗示由于IgE在过敏性1型应答中的作用而带来的IL-21在控制过敏性应答方面的作用。
已经尝试过IL-21作为用于减轻过敏性应答的疗法。除了在小鼠鼻炎(鼻道炎症)模型中降低IgE水平以外，它还显示成功地减少了由T细胞产生的促炎性细胞因子。这强烈暗示了IL-21控制局部和全身过敏的药理学发展。
Li等(Journalofimmunology175(4)：2261-9(2005))首先报道了IL-21在调节人T细胞的分化程序方面的作用，其中显示了富集具有IL-2产生能力的独特CD28+CD127hiCD45RO+表型的中央记忆型CTL群体。通过在IL-21存在下进行初次免疫产生的肿瘤反应性抗原特异性CTL产生了稳定的“非辅助细胞依赖性”表型。
IL-21被批准用于转移性黑素瘤(MM)和肾细胞癌(RCC)患者的1期临床试验。显示了施用安全性，伴随流感样症状作为副作用。剂量限制性毒性包括低淋巴细胞、嗜中性粒细胞和血小板计数以及肝毒性。根据实体肿瘤应答评估准则(RECIST)应答量表，47个MM患者中有2个且19个RCC患者中有4个分别显示了完全和部分应答。另外，在外周NK细胞和CD8+T细胞中存在穿孔素、颗粒酶B、IFN-γ和CXCR3mRNA增加。这表明IL-21增强了CD8+效应功能，因此引起抗肿瘤应答。IL-21进入2期临床试验，其中它单独或与如索拉非尼(sorafinib)和利妥昔单抗(rituximab)的药物联合施用。
IL-21还可能是控制持续性病毒感染的重要因子。与正常小鼠相比，感染慢性LCMV(淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒)的IL-21(或IL-21R)敲除小鼠不能够克服慢性感染。此外，这些具有受损的IL-21信号传导的小鼠具有更显著的LCMV特异性CD8+T细胞耗竭，表明由CD4+T细胞产生的IL-21对于持续的CD8+T细胞效应子活性且然后为维持免疫性以消除持续性病毒感染所需。因此，IL-21可能有助于CD4+T辅助细胞指挥免疫系统对病毒感染应答的机制。
在HIV感染受试者中，已经报道了IL-21显著改善了HIV特异性细胞毒性T细胞应答和NK细胞功能。还显示了来自于“HIV控制者(controller)”(通过在不进行治疗的情况下控制病毒复制而不会进展成AIDS的稀少个体)的HIV特异性CD4T细胞能够产生与进展者(progressor)的IL-21相比显著更多的IL-21。另外，在HIV控制者中还优先发现了产生IL-21的病毒特异性CD8T细胞。这些数据和IL-21刺激的CD8或NK细胞能够体外抑制HIV病毒复制这一事实显示，这种细胞因子可能潜在地可用于抗HIV治疗剂。
已经开发了针对IL-21的单克隆抗体，然而，这些抗体已经显示能拮抗或抑制IL-21的功能。这些拮抗性抗体可用于抑制炎性病症。迄今为止，还没有开发能激动或增强IL-21活性的抗体的公开文献。
发明概要
诸位发明人已经产生了结合IL-21且增强IL-21的活性的抗体。诸位发明人因此首次开发出了充当IL-21激动剂的抗体。
在一个实施例中，本公开提供了一种包含抗体的抗原结合结构域的IL-21结合蛋白，所述抗原结合结构域结合或特异性结合IL-21且增强IL-21活性。
在一个实施例中，所述IL-21结合蛋白增强IL-21介导的B细胞的体外或体内增殖。
在另一个实施例中，所述IL-21结合蛋白增强IL-21介导的CD8+T细胞的体外或体内细胞毒性。
在另一个实施例中，所述IL-21结合蛋白增强IL-2介导的NK细胞的增殖。
在一个实施例中，所述IL-21结合蛋白是IL-21激动剂。
在另一个实施例中，所述IL-21结合蛋白增加IL-21体内半衰期。举例来说，所述IL-21结合蛋白可以使IL-21体内半衰期从数小时增加到数天。在一个实施例中，所述IL-21结合蛋白增加IL-21体内半衰期持续至少24小时。
在另一个实施例中，IL-21的活性与不存在所述IL-21结合蛋白时的IL-21活性相比增加至少五倍。
本公开另外或替代地提供了一种包含抗体的抗原结合结构域的IL-21结合蛋白，其中所述抗原结合结构域结合或特异性结合IL-21中包含序列STNAGRRQK(SEQIDNO：23)的表位。在另一个实施例中，所述IL-21结合或特异性结合包含如SEQIDNO：19中所阐述的序列PPSTNAGRRQKHRLT的表位。在另一个实施例中，所述IL-21结合蛋白结合或特异性结合Il-21中包含如SEQIDNO：20中所阐述的序列PPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYE的表位。在另一个实施例中，所述IL-21结合蛋白结合或特异性结合IL-21中包含SEQIDNO：4中所阐述的序列IKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYE的表位。
本公开另外或替代地提供了一种包含抗体的抗原结合结构域的IL-21结合蛋白，其中所述抗原结合结构域结合或特异性结合IL-21，且其中所述蛋白质竞争性地抑制抗体2P2(包含有包含SEQIDNO：2中所阐述的序列的VH和包含SEQIDNO：3中所阐述的序列的VL)与IL-21的结合。
在一个实施例中，所述IL-21结合蛋白竞争性地抑制抗体2P2与SEQIDNO：19、20或4中所阐述的表位序列的结合。
在一个实施例中，所述IL-21结合蛋白结合或特异性结合哺乳动物IL-21(hIL-21)。在另一个实施例中，所述IL-21结合蛋白结合或特异性结合人IL-21。在另一个实施例中，所述IL-21结合蛋白结合或特异性结合猫或狗IL-21。
在一个实施例中，所述IL-21结合蛋白不会可检测地结合小鼠IL-21。
在一个实施例中，所述IL-21结合蛋白对于哺乳动物IL-21或hIL-21具有约9×10- 9M或更小的亲和力常数(KD)。举例来说，所述KD是约8×10-9M或更小或约7×10-9M或更小或约6×10-9M或更小或约5×10-9M或更小。在一个实施例中，所述KD是约4.8×10-9M或更小。
在另一个实施例中，所述IL-21结合蛋白对于哺乳动物IL-21或hIL-21具有约2×10-9M或更小的亲和力常数(KD)。举例来说，所述KD是约1×10-9M或更小或约9×10-10M或更小或约8×10-10M或更小或约7×10-10M或更小。在一个实施例中，所述KD是约5×10-10M或更小。在一个实施例中，所述KD是约4×10-10M或更小。在一个实施例中，所述KD是约3×10-10M或更小。在一个实施例中，所述KD是约2×10-10M或更小。在一个实施例中，所述KD是约1.5×10-10M或更小。
在一个实施例中，涉及各前述实施例，所述KD可以是0.1×10-12M或更大或1×10- 12M或更大。
在一个实施例中，所述KD是使用生物传感器，例如通过表面等离子体共振来评估。举例来说，对所述IL-21结合蛋白进行固定，并且测定与hIL-21或哺乳动物IL-21结合的水平。
本公开另外或替代地提供了一种包含抗体的抗原结合结构域的IL-21结合蛋白，其中所述抗原结合结构域结合或特异性结合IL-21，其中所述抗原结合结构域包含以下各项中的至少一项：
(i)VH，其包含有包含与SEQIDNO：5中所阐述的序列具有至少约80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少99％同一性的序列的互补性决定区(CDR)1、包含与SEQIDNO：6中所阐述的序列具有至少约80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少99％同一性的序列的CDR2和包含与SEQIDNO：7中所阐述的序列具有至少约80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少99％同一性的序列的CDR3；
(ii)VH，其包含与SEQIDNO：2中所阐述的序列具有至少约95％或96％或97％或98％或99％同一性的序列；
(iii)VL，其包含有包含与SEQIDNO：8中所阐述的序列具有至少约80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少99％同一性的序列的CDR1、包含与SEQIDNO：9中所阐述的序列具有至少约80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少99％同一性的序列的CDR2和包含与SEQIDNO：10中所阐述的序列具有至少约80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少99％同一性的序列的CDR3；
(iv)VL，其包含与SEQIDNO：3中所阐述的序列具有至少约95％同一性的序列；
(v)VH，其包含有包含SEQIDNO：5中所阐述的序列的CDR1、包含SEQIDNO：6中所阐述的序列的CDR2和包含SEQIDNO：7中所阐述的序列的CDR3；；
(vi)VH，其包含SEQIDNO：2中所阐述的序列；
(vii)VL，其包含有包含SEQIDNO：8中所阐述的序列的CDR1、包含SEQIDNO：9中所阐述的序列的CDR2和包含SEQIDNO：10中所阐述的序列的CDR3；
(viii)VL，其包含SEQIDNO：3中所阐述的序列；
(ix)VH，其包含有包含SEQIDNO：5中所阐述的序列的CDR1、包含SEQIDNO：6中所阐述的序列的CDR2和包含SEQIDNO：7中所阐述的序列的CDR3；和VL，其包含有包含SEQIDNO：8中所阐述的序列的CDR1、包含SEQIDNO：9中所阐述的序列的CDR2和包含SEQIDNO：10中所阐述的序列的CDR3；以及
(x)VH，其包含SEQIDNO：2中所阐述的序列；和VL，其包含SEQIDNO：3中所阐述的序列。
在一个实施例中，所述序列与所述IL-21结合蛋白之间的差异是取代。
技术人员将能够确定对本公开的IL-21结合蛋白进行取代的位点，例如在含可变区的蛋白质的骨架区内。
本公开还提供了一种包含抗体的抗原结合结构域的IL-21结合蛋白，其中所述抗原结合结构域结合或特异性结合IL-21且增强IL-21信号传导，并且其中所述抗原结合结构域包含有VH，其包含SEQIDNO：2中所阐述的序列；和VL，其包含SEQIDNO：3中所阐述的序列。
在一个实施例中，本文中所描述的IL-21结合蛋白至少包含VH和VL，其中所述VH和VL结合以形成包含抗原结合结构域的Fv。技术人员应理解，所述抗原结合结构域包含所述抗体的结合位点。
在一个实施例中，所述VH和所述VL呈单条多肽链形式。举例来说，所述蛋白质是：
(i)单链Fv片段(scFv)；
(ii)二聚scFv(di-scFv)；
(iii)与抗体的恒定区、Fc或重链恒定结构域(CH)2和/或CH3连接的(i)或(ii)之一；或
(iv)与结合免疫效应细胞的蛋白质连接的(i)或(ii)之一。
在一个实施例中，所述VL和VH呈单独的多肽链形式。
举例来说，所述蛋白质是：
(i)双抗体；
(ii)三抗体；
(iii)四抗体；
(iv)Fab；
(v)F(ab′)2；
(vi)Fv；
(vii)与抗体的恒定区、Fc或重链恒定结构域(CH)2和/或CH3连接的(i)至(vi)之一；
(viii)与结合免疫效应细胞的蛋白质连接的(i)至(vi)之一。
上述蛋白质还可以被称为是抗体的抗原结合结构域。
在一个实施例中，所述蛋白质是抗体，例如单克隆抗体。在一个实施例中，所述抗体是裸抗体。
在一个实施例中，蛋白质(或抗体)是嵌合的、去免疫的、人源化的、人的或灵长类化的(primatized)。
在一个实施例中，所述蛋白质或抗体是人的。
在一个实施例中，所述互补性决定区序列(CDR)根据Kabat编号系统来定义。
在另一个实施例中，所述CDR根据IMGT编号系统来定义。
本文中提及“结合”IL-21的蛋白质或抗体为“特异性结合”IL-21的蛋白质或抗体提供文字支持。
本公开还提供了上述抗体的抗原结合结构域或抗原结合片段。
在一个实施例中，如本文中所描述的蛋白质或抗体包含人恒定区，例如IgG恒定区，诸如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定区或其混合物。在抗体或蛋白质包含VH和VL的情况下，所述VH可以连接于重链恒定区且所述VL可以连接于轻链恒定区。
可以例如在抗体或蛋白质的产生或纯化期间或通过对编码抗体重链的核酸进行重组工程改造来去除本公开的整个抗体(或包含恒定区或CH3的IL-21结合蛋白)的重链恒定区的C末端赖氨酸。相应地，整个抗体(或IL-21结合蛋白)可以包括去除了所有C末端赖氨酸残基的群体、未去除C末端赖氨酸残基的群体和/或具有存在和不存在C末端赖氨酸残基的蛋白质的混合物的群体。在一些实施例中，所述群体可以另外包括在重链恒定区之一中去除了C末端赖氨酸残基的蛋白质。类似地，整个抗体的组合物可以包含存在或不存在C末端赖氨酸残基的抗体群体的相同或相似的混合物。
在一个实施例中，如本文中所描述的蛋白质或抗体包含IgG4抗体的恒定区或IgG4抗体的稳定化恒定区。在一个实施例中，所述蛋白质或抗体包含在241位具有脯氨酸的IgG4恒定区(根据Kabat编号系统(Kabat等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，WashingtonDC，UnitedStatesDepartmentofHealthandHumanServices，1987和/或1991))。
在一个实施例中，如本文中所描述的蛋白质或抗体或如本文中所描述的蛋白质或抗体的组合物包含重链恒定区(包括稳定化重链恒定区)，包含完全或部分存在或不存在C末端赖氨酸残基的序列混合物。
在一个实施例中，本公开的抗体包含与IgG4恒定区或稳定化IgG4恒定区(例如，如以上所讨论)连接或融合的本文中所公开的VH和与K轻链恒定区连接或融合的VL。
本公开的IL-21结合蛋白的功能特征将被用来对本公开的抗体施加必要的修饰。
在一个实施例中，如本文中所描述的IL-21结合蛋白或抗体是分离的和/或重组的。
在一个实施例中，本公开的IL-21结合蛋白或抗体与另一种化合物缀合，所述另一种化合物例如可检测标记或可延长所述蛋白质或抗体的半衰期的化合物，诸如聚乙二醇或白蛋白结合蛋白。其他合适的化合物描述于本文中。
本公开还提供了一种编码本公开的IL-21结合蛋白或抗体或其多肽的核酸。
本公开另外或替代地提供了一种包含抗体的抗原结合结构域的IL-21结合蛋白，其中所述抗原结合结构域结合或特异性结合IL-21，其中所述抗原结合结构域是由包含以下各项中的至少一项的核酸序列编码：
(i)VH，其包含与SEQIDNO：17中所阐述的序列具有至少约95％或96％或97％或98％或99％同一性的序列；
(ii)VL，其包含与SEQIDNO：18中所阐述的序列具有至少约95％或96％或97％或98％或99％同一性的序列；
(iii)VH，其包含SEQIDNO：17中所阐述的序列；
(iv)VL，其包含SEQIDNO：18中所阐述的序列；以及
(v)VH，其包含SEQIDNO：17中所阐述的序列；和VL，其包含SEQIDNO：18中所阐述的序列。
在一个实施例中，这样的核酸被包括在表达构建体中，其中所述核酸可操作地连接于启动子。这样的表达构建体可以处在载体，例如质粒中。
在针对单多肤链IL-21结合蛋白的本公开实施例中，所述表达构建体可以包含与编码该多肽链的核酸连接的启动子。
在针对形成IL-21结合蛋白的多个多肽链的实施例中，表达构建体包含编码包含例如可操作地连接于启动子的VH的多肽的核酸和编码包含例如可操作地连接于启动子的VL的多肽的核酸。
在另一个实施例中，所述表达构建体是双顺反子表达构建体，例如按5′至3′顺序包含以下可操作地连接的组分：
(i)启动子
(ii)编码第一多肽的核酸；
(iii)内部核糖体进入位点；和
(iv)编码第二多肽的核酸，
其中所述第一多肤包含VH且所述第二多肽包含VL，或反之亦然。
本公开还涵盖单独的表达构建体，其中一种编码包含VH的第一多肽且其中另一种编码包含VL的第二多肽。举例来说，本公开还提供了一种组合物，其包含：
(i)第一表达构建体，其包含编码包含可操作地连接于启动子的VH的多肽的核酸；和
(ii)第二表达构建体，其包含编码包含可操作地连接于启动子的VL的多肽的核酸。
本公开还提供了一种分离的或重组的细胞，其表达本公开的IL-21结合蛋白。
在一个实施例中，所述细胞包括本公开的表达构建体或：
(i)第一表达构建体，其包含编码包含可操作地连接于启动子的VH的多肽的核酸；和
(ii)第二表达构建体，其包含编码包含可操作地连接于启动子的VL的多肽的核酸，
其中所述第一多肤与所述第二多肽缔合以形成本公开的IL-21结合蛋白。
本公开的细胞的实例包括细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
本公开另外提供了用于产生本公开的IL-21结合蛋白或抗体的方法。举例来说，这样的方法包括将本公开的表达构建体维持在足以产生IL-21结合蛋白或抗体的条件下。
在一个实施例中，用于产生本公开的IL-21结合蛋白或抗体的方法包括在足以产生和任选地分泌IL-21结合蛋白或抗体的条件下培养本公开的细胞。
在一个实施例中，所述用于产生本公开的IL-21结合蛋白或抗体的方法另外包括分离所述蛋白质或抗体，和任选地将所述IL-21结合蛋白或抗体配制成药物组合物。
本公开另外提供了一种组合物，其包含本公开的IL-21结合蛋白或抗体和药学上可接受的载剂。
在一些实施例中，所述组合物包含：
(i)本公开的抗体，其包含来自于重链的C末端赖氨酸残基；
(ii)本公开的抗体，其缺乏来自于重链的C末端赖氨酸残基；和/或
(iii)本公开的抗体，其在一个重链上包含C末端赖氨酸残基且在另一个重链上缺乏C末端赖氨酸残基，
和任选地，药学上可接受的载剂。
本公开还提供了一种复合物，其包含本公开的IL-21结合蛋白和IL-21。在一个实施例中，所述IL-21是重组IL-21。重组IL-21的实例在本领域中是已知的。
本公开还提供了一种用于在受试者中治疗或预防感染或感染性疾病、过敏性免疫应答或癌症的方法，所述方法包括施用本公开的IL-21结合蛋白或复合物。在这方面，IL-21结合蛋白或复合物可以用来预防病状复发，并且这被视为预防所述病状。
在一个实施例中，所述感染是慢性感染。在另一个实施例中，所述感染是病毒感染，诸如HIV感染。
在一个实施例中，所述传染病是乙型或丙型肝炎。
示例性癌症包括血液癌症、上皮源性癌症、肝癌、胰脏癌、胃癌、骨肉瘤、子宫内膜癌和卵巢癌。
本公开还提供了一种用于在受试者中增强IL-21活性的方法，所述方法包括施用本公开的IL-21结合蛋白或复合物。
在一个实施例中，本文中所描述的方法包括施用介于约0.05mg/kg与30mg/kg之间的所述IL-21结合蛋白或复合物。举例来说，所述方法包括施用介于0.1mg/kg与10mg/kg之间或介于0.2mg/kg与5mg/kg之间的所述IL-21结合蛋白或复合物。在一个实施例中，所述方法包括施用约0.5mg/kg至2.0mg/kg的所述IL-21结合蛋白或复合物。本公开还提供了如本文中在任何实施例所描述的IL-21结合蛋白或复合物在医学中的用途。
本公开还提供了如本文中根据任何实施例所描述的IL-21结合蛋白或复合物在制造用以治疗感染、过敏性免疫应答或癌症的药物方面的用途。
本公开还提供了一种用于定位和/或检测和/或诊断和/或预测与表达IL-21的细胞相关的IL-21介导的病状的方法，所述方法包括在体内检测与所述IL-21表达细胞结合的如本文中所描述的IL-21结合蛋白或抗体(如果存在)，其中所述IL-21结合蛋白或抗体与可检测标签缀合。
在一个实施例中，所述方法另外包括向所述受试者施用所述IL-21结合蛋白。
本公开还提供了一种培养、扩增包括免疫系统前体细胞的细胞群体的方法，所述方法包括在本公开的IL-21结合蛋白或复合物的存在下体外或离体培养所述细胞群体。
应了解，在本公开的IL-21结合蛋白或复合物的存在下培养所述细胞将增强诸如NK细胞、B细胞和T细胞之类的免疫系统细胞的增殖和分化。
在一个实施例中，所述培养方法还包括向所述细胞群体中加入外源性IL-21。
可以从取自哺乳动物受试者的生物样本中分离包括免疫系统前体细胞的细胞群体。所述样本可以来源于许多来源，包括但不限于外周血、白细胞去除血液产品、血浆分离置换血液产品、骨髓、胸腺、组织活检、肿瘤、淋巴结组织、肠相关淋巴组织、粘膜相关淋巴组织、肝脏、免疫学病变部位(例如滑液)、胰脏和脑脊髓液。供体受试者优选为人，并且可以是胎儿、新生儿、儿童、成人，而且可以是正常的、患病的或对感兴趣的疾病敏感的。
在一些实施方案中，所述细胞样本包括得自于血液样本的外周血单核细胞(PBMC)。“外周血单核细胞”或“PBMC”意指淋巴细胞(包括T细胞、B细胞、NK细胞等)和单核细胞。总体来说，PBMC是使用标准技术从患者分离。在一些实施方案中，仅取PBMC，而将基本上所有的红细胞和多形核白细胞留下或送回到所述供体。PBMC可以使用本领域中已知的方法，诸如白细胞去除术来分离。总体来说，进行5至7升白细胞去除术步骤，这基本上从患者中去除了PBMC，而送回剩余的血液组分。样本的收集优选地在抗凝剂(例如，肝素)的存在下进行。
应了解，如本文中所描述的体外和离体细胞培养可以用于扩增NK细胞、B细胞和T细胞。
应了解，本公开还提供了一种用于在受试者中治疗或预防感染或感染性疾病、过敏性免疫应答或癌症的方法，方式是通过施用根据以上所描述的方法已经体外或离体扩增的细胞。
通过以上所公开的方法获得的体外或离体扩增的细胞群体单独或与本公开的IL-21结合蛋白或复合物的组合可以用来预防病状复发，并且这被视为预防所述病状。示例性感染包括HIV、乙型肝炎或丙型肝炎。示例性癌症包括血液癌症、上皮源性癌症、肝癌、胰脏癌、胃癌、骨肉瘤、子宫内膜癌和卵巢癌。
本公开还提供了一种用于检测样本中IL-21或表达其的细胞的方法，所述方法包括使所述样本与如本文中根据任何实施例所描述的蛋白质或抗体接触从而形成复合物，和检测所述复合物，其中检测到所述复合物表明所述样本中存在IL-21或表达其的细胞。在一个实施例中，所述方法是离体或体外进行。
本公开还提供了一种试剂盒(例如包装或制品)，其包括如本文中根据任何实施例所描述的IL-21结合蛋白或复合物，任选地与用于如本文中所描述的方法中的说明书一起包装。
序列表解释
SEQIDNO1：智人IL-21的氨基酸序列
SEQIDNO2：抗体2P2的VH链的氨基酸序列
SEQIDNO3：抗体2P2的VL链的氨基酸序列
SEQIDNO4：2P2结合表位的氨基酸序列
SEQIDNO5：使用IMGT编号方案的抗体2P2的VH链的CDR1的氨基酸序列
SEQIDNO6：使用IMGT编号方案的抗体2P2的VH链的CDR2的氨基酸序列
SEQIDNO7：使用IMGT编号方案的抗体2P2的VH链的CDR3的氨基酸序列
SEQIDNO8：使用IMGT编号方案的抗体2P2的VL链的CDR1的氨基酸序列
SEQIDNO9：使用IMGT编号方案的抗体2P2的VL链的CDR2的氨基酸序列
SEQIDNO10：使用IMGT编号方案的抗体2P2的VL链的CDR3的氨基酸序列
SEQIDNO11：使用Kabat编号方案的抗体2P2的VH链的CDR1的氨基酸序列
SEQIDNO12：使用Kabat编号方案的抗体2P2的VH链的CDR2的氨基酸序列
SEQIDNO13：使用Kabat编号方案的抗体2P2的VH链的CDR3的氨基酸序列
SEQIDNO14：使用Kabat编号方案的抗体2P2的VL链的CDR1的氨基酸序列
SEQIDNO15：使用Kabat编号方案的抗体2P2的VL链的CDR2的氨基酸序列
SEQIDNO16：使用Kabat编号方案的抗体2P2的VL链的CDR3的氨基酸序列
SEQIDNO17：编码抗体2P2的VH链的核苷酸序列
SEQIDNO18：编码抗体2P2的VL链的核苷酸序列
SEQIDNO19：2P2结合表位的氨基酸序列
SEQIDNO20：2P2结合表位的氨基酸序列
SEQIDNO21：2P2结合表位的氨基酸序列
SEQIDNO22：2P2结合表位的氨基酸序列
SEQIDNO23：2P2结合表位的核心氨基酸序列
附图简述
图1示出了mAB2P2在2ng/nlhIL-21的存在下以剂量依赖性方式增加表达人IL-21受体的Ba/F3细胞(BaF3-hIL-21R)的增殖(n＝3±SEM)。
图2是显示通过IMGT编号方案确定的抗体2P2的VH和VL的CDR的图示。
图3示出了mAb2P2增加Ba/F3-hIL-21R细胞而非Ba/F3-mIL-21R细胞的增殖(A)和mAb2P2使hIL-21生物活性增加超过10倍(B)(n＝3±SEM)。
图4示出了mAb2P2增加hIL-21介导的人B细胞的增殖；和5ng/ml的hIL-21加1ug/mlmAb2P2显示与100ng/ml的hIL-21类似的生物活性，表明mAb2P2使hIL-21生物活性增加约20倍。
图5示出了mAb2P2增加hIL-21介导的人CD8T细胞的活化，以表达细胞毒性分子(包括颗粒酶B和穿孔素)，其对抗病毒和抗肿瘤免疫性非常重要。
图6示出了经静脉内(IV)或皮下(SC)施用的IL-21/2P2复合物或单独IL-21的半衰期测定结果(n＝3±SEM)。
图7示出了在淋巴结中对于滤泡B细胞(A)、边缘区B细胞(B)和过渡B细胞(C)来说2P2增强IL-21介导的B细胞增殖的结果(n＝3±SEM；*P＞0.05，**P＞0.01，***P＞0.001)。
图8示出了在脾中对于滤泡B细胞(A)、边缘区B细胞(B)和过渡B细胞(C)来说2P2增强IL-21介导的B细胞增殖的结果(n＝3±SEM；*P＞0.05，**P＞0.01，***P＞0.001)。
图9示出了根据结构模拟被认为参与2P2结合的人IL-21的残基(以粗体指示)。对位于IL-21螺旋区的残基加下划线。
图10示出了通过ELISA测定的人IL-21肽片段与2P2和对照抗体3A3之间的结合。
图11示出了(A)人IL-21或小鼠IL-21与2P2之间的结合，(B)示出了人IL-21和小鼠IL-21与对照抗体3A3之间的结合。
发明详述
综述
在本说明书通篇中，除非另外明确说明或上下文另外要求，否则提及单个步骤、物质组成、步骤群组或物质组成群组应被视为涵盖那些步骤、物质组成、步骤群组或物质组成群组中的一个和多个(即，一个或多个)。因此，除非上下文另外清楚指出，否则如本文中所使用，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数形式的方面。举例来说，提及“一个”包括单个以及两个或更多个；提及“一种”包括单种以及两种或更多种；提及“所述”包括单个(种)以及两个(种)或更多个(种)；等等。
本领域技术人员应了解，本公开容许具体描述内容以外的变化和修改。应理解，本公开包括所有这些变化和修改。本公开还包括本说明书中个别地或共同地提及或指示的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及所述步骤或特征的任何和所有组合或其中任何两个或更多个。
本公开的范围不受本文中所描述的具体实施例限制，所述具体实施例仅意在用于示例的目的。功能上等同的产物、组合物和方法清楚地在本公开的范围内。
除非另外明确地陈述，否则本文中的任何本公开实施例都应该被视为对本公开的任何其他实施例施加必要的变更。
除非另外明确定义，否则本文中所使用的所有技术和科学术语都应该被视为具有与本领域(例如，在细胞培养、分子遗传学、免疫学、免疫组织化学、蛋白质化学和生物化学方面)技术人员通常所理解的相同含义。
除非另有指示，否则本公开中所利用的重组蛋白、细胞培养和免疫学技术对于本领域技术人员是众所周知的标准程序。这样的技术描述并解释于诸如以下来源的文献中：J.Perbal，APracticalGuidetoMolecularCloning，JohnWileyandSons(1984)；J.Sambrook等，MolecularCloning：ALaboratoryManual，ColdSpringHarbourLaboratoryPress(1989)；T.A.Brown(编)，EssentialMolecularBiology：APracticalApproach，第1卷和第2卷，IRLPress(1991)；D.M.Glover和B.D.Hames(编)，DNACloning：APracticalApproach，第1-4卷，IRLPress(1995和1996)；和F.M.Ausubel等(编)，CurrentProtocolsinMofecularBiology，GreenePub.AssociatesandWiley-Interscience(1988，包括直至目前的所有更新)；EdHarlow和DavidLane(编)Antibodies：ALaboratoryManual，ColdSpringHarbourLaboratory，(1988)；和J.E.Coligan等(编)CurrentProtocolsinImmunology，JohnWiley&Sons(包括直至目前的所有更新)。
本文中对可变区和其部分、免疫球蛋白、抗体和其片段的描述和定义可以通过以下文献中的讨论而更清楚：KabatSequencesofProteinsofImmunologicalInterest，NationalInstitutesofHealth，Bethesda，Md.，1987和1991；Bork等，JMol.Biol.242，309-320，1994；Chothia和LeskJ.MolBiol.196：901-917，1987；Chothia等，Nature342，877-883，1989；和/或Al-Lazikani等，JMolBiol273，927-948，1997。
术语“和/或”，例如“X和/或Y”应理解为意指“X和Y”或“X或Y”，并且应被视为明确支持两种含义或任一种含义。
在本说明书通篇中，词语“包括(comprise)”或诸如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”之类的变化形式将被理解为暗示包括所述要素、整数或步骤或者要素、整数或步骤的群组，但不排除任何其他要素、整数或步骤或者要素、整数或步骤的群组。
如本文中所使用，术语“来源于”应被视为指示指定的整数可以从特定的来源获得，但未必直接来自该来源。
本文中提及例如残基的范围时应理解为包括首尾。举例来说，提及“包含氨基酸56至65的区域”应以包括首尾的方式加以理解，即，所述区域包含指定的序列中编号为56、57、58、59、60、61、62、63、64和65的氨基酸序列。
所选的定义
仅出于命名而非限制的目的，人IL-21的示例性序列阐述于SEQIDNO1中。
短语“增强IL-21活性”应理解为意指本公开的IL-21结合蛋白增强天然存在的IL-21的任何一种或多种活性，包括但不限于刺激NK细胞的增殖、细胞毒性或成熟；刺激B细胞和T细胞的增殖或分化；刺激B细胞中的抗体产生和亲和力成熟；刺激CD8+T细胞的细胞毒性；刺激T细胞和NK细胞中干扰素γ产生；抑制树突状细胞(DC)活化和成熟；抑制炎性介质从肥大细胞释放；增强巨噬细胞的吞噬作用；抑制TReg细胞的产生或存活；和刺激骨髓祖细胞的增殖。
术语“分离的蛋白质”或“分离的多肽”是由于其衍生起源或来源不与在其天然状态下伴随其的天然缔合的组分缔合、基本上不含来自相同来源的其他蛋白质的蛋白质或多肽。可以使用本领域中已知的蛋白质纯化技术，通过分离使蛋白质基本上不含天然缔合的组分或基本上纯化。“基本上纯化”意指蛋白质基本上不含污染剂，例如至少约70％或75％或80％或85％或90％或95％或96％或97％或98％或99％不含污染剂。
术语“重组”应理解为意指人工基因重组的产物。相应地，在包含抗体抗原结合结构域的重组蛋白的情形下，这一术语不涵盖受试者体内天然存在的抗体，所述天然存在的抗体是B细胞成熟期间发生的天然重组的产物。然而，如果这样的抗体经过分离，则它将被视为包含抗体抗原结合结构域的分离的蛋白质。类似地，如果编码所述蛋白质的核酸经过分离且使用重组手段加以表达，则所产生的蛋白质是包含抗体抗原结合结构域的重组蛋白。重组蛋白在它处于例如表达它的细胞、组织或受试者内时还涵盖通过人工重组手段表达的蛋白质。
术语“蛋白质”应被视为包括单多肽链，即由肽键连接的一系列连续氨基酸或者彼此共价或非共价连接的一系列多肽链(即，多肽复合物)。举例来说，可以使用合适的化学键或二硫键共价连接所述一系列多肽链。非共价键的实例包括氢键、离子键、范德华力和疏水性相互作用。
根据前面段落，术语“多肽”或“多肽链”应理解为意指由肽键连接的一系列连续氨基酸。
如本文中所使用，术语“抗原结合结构域”应被视为意指抗体中能够特异性结合抗原的区域，即，VH或VL或包含VH和VL两者的Fv。抗原结合结构域不必是在整个抗体的情形下，例如，它可以呈分离(例如结构域抗体)形式或呈另一种形式，例如，如本文中所描述，诸如scFv。
出于本公开的目的，术语“抗体”包括能够借助于Fv内所含有的抗原结合结构域特异性结合一个或几个密切相关的抗原(例如IL-21)的蛋白质。这一术语包括四链抗体(例如两个轻链和两个重链)、重组或经修饰抗体(例如嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、CDR移植抗体、灵长类化抗体、去免疫抗体、同人源化(synhumanized)抗体、半抗体、双特异性抗体)。抗体一般包含恒定结构域，所述恒定结构域可以布置于恒定区或恒定片段或可结晶片段(Fc)中。抗体的示例性形式包含四链结构作为其基本单元。全长抗体包含共价连接的两条重链(约50至70kD)和两条轻链(各约23kDa)。轻链一般包含可变区(如果存在)和恒定结构域，且在哺乳动物中是κ轻链或λ轻链。重链一般包含可变区和通过铰链区连接于额外恒定结构域的一个或两个恒定结构域。哺乳动物的重链属于以下类型之一：α、δ、ε、γ或μ。各轻链还共价连接于重链之一。举例来说，两条重链以及重链和轻链是通过链间二硫键和通过非共价相互作用维持在一起。链间二硫键的数目在不同类型的抗体间可以变化。各链具有N末端可变区(VH或VL，其中各自为约110个氨基酸长)和一个或多个C末端恒定结构域。使轻链的恒定结构域(约110个氨基酸长的CL)与重链的第一恒定结构域(330至440个氨基酸长的CH1)对准并以二硫键连接。使轻链可变区与重链可变区对准。抗体重链可以包含2个或更多个额外的CH结构域(诸如CH2、CH3等等)，并且可以包含介于CH1与CH2恒定结构域之间的铰链区。抗体可以属于任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、lgA1和lgA2)或亚类。在一个实施例中，所述抗体是鼠类(小鼠或大鼠)抗体或灵长类(诸如人)抗体。在一个实施例中，所述抗体重链缺失C末端赖氨酸残基。在一个实施例中，所述抗体是人源化的、同人源化的、嵌合的、CDR移植的或去免疫化的。
术语“全长抗体”、“完整抗体”或“整个抗体”可互换用于指与抗体的抗原结合片段相反，呈其基本上完整的形式的抗体。具体来说，整个抗体包括具有包括Fc区的重链和轻链的那些。恒定结构域可以是野生型序列恒定结构域(例如，人野生型序列恒定结构域)或其氨基酸序列变异体。
如本文中所使用，“可变区”是指如本文中所定义的能够特异性结合抗原且包括互补性决定区(CDR)(即CDR1、CDR2和CDR3)和骨架区(FR)的氨基酸序列的抗体的轻链和/或重链的部分。举例来说，可变区包含三个或四个FR(例如FR1、FR2、FR3和任选地FR4)连同三个CDR。VH是指重链可变区。VL是指轻链可变区。
如本文中所使用，术语“互补性决定区”(同义词CDR；即CDR1、CDR2和CDR3)是指抗体可变区中作为特异性抗原结合的主要促成者的氨基酸残基。各可变区结构域(VH或VL)典型地具有三个CDR，标识为CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施例中，分配给CDR和FR的氨基酸位置是根据KabatSequencesofProteinsofImmunologicalInterest，NationalInstitutesofHealth，Bethesda，Md.，1987和1991(本文中也称为“Kabat编号系统”)加以限定。在另一个实施例中，分配给CDR和FR的氨基酸位置是根据EnhancedChothiaNumberingScheme(http://www.bioinfo.org.uk/mdex.html)加以限定。根据Kabat编号系统，VHFR和CDR定位如下：残基1至30(FR1)、31至35(CDR1)、36至49(FR2)、50至65(CDR2)、66至94(FR3)、95至102(CDR3)和103至113(FR4)。根据Kabat编号系统，VLFR和CDR定位如下：残基1至23(FR1)、24至34(CDR1)、35至49(FR2)、50至56(CDR2)、57至88(FR3)、89至97(CDR3)和98至107(FR4)。本公开不限于如由Kabat编号系统所限定的FR和CDR，而是包括所有编号系统，包括规范编号系统或以下编号系统：Chothia和LeskJ.Mol.Biol.196：901-917，1987；Chothia等，Nature342：877-883，1989；和/或Al-Lazikani等，J.Mol.Biol.273：927-948，1997；Honnegher和PlükthunJ.Mol.Biol.309：657-670，2001的编号系统；或Giudicelli等，NucleicAcidsRes.25：206-2111997中所讨论的IMGT系统。在一个实施例中，所述CDR是根据Kabat编号系统加以限定。任选地，根据Kabat编号系统的重链CDR2不包含本文中所列出的五个C末端氨基酸，或者这些氨基酸中的任何一个或多个被另一个天然存在的氨基酸取代。在这方面，Padlan等，FASEBJ.，9：133-139，1995确定了重链CDR2的五个C末端氨基酸一般不参与抗原结合。
“骨架区”(FR)是除CDR残基以外的那些可变区残基。
如本文中所使用，术语“Fv”应被视为意指任何蛋白质，不论是由多个多肽还是单个多肽构成，其中VL和VH缔合并且形成具有抗原结合结构域，即，能够特异性结合抗原的复合物。形成抗原结合结构域的VH和VL可以在单个多肽链中或在不同的多肽链中。此外，本公开的Fv(以及本公开的任何蛋白质)可以具有多个抗原结合结构域，所述结构域可能结合或可能不结合相同抗原。这一术语应该理解为涵盖直接来源于抗体的片段以及使用重组手段产生的对应于这样的片段的蛋白质。在一些实施例中，VH不连接于重链恒定结构域(CH)1和/或VL不连接于轻链恒定结构域(CL)。示例性的含Fv的多肽或蛋白质包括Fab片段、Fab′片段、F(ab′)片段、scFv、双抗体、三抗体、四抗体或更高阶复合物，或与恒定区或其结构域(例如CH2或CH3结构域)连接的上述各项中的任一者，例如迷你抗体。“Fab片段”由免疫球蛋白的单价抗原结合片段组成，并且可以通过用酶木瓜蛋白酶消化整个抗体以产生由完整的轻链和重链的一部分组成的片段来产生，或者可以通过重组手段产生。可以通过用胃蛋白酶处理整个抗体，随后还原以产生由完整的轻链和重链中包含VH和单个恒定结构域的部分组成的分子来获得抗体的“Fab′片段”。以这种方式处理每个抗体获得两个Fab′片段。Fab′片段还可以通过重组手段产生。抗体的“F(ab′)2片段”由两个Fab′片段通过两个二硫键连在一起的二聚体组成，并且是通过用酶胃蛋白酶处理整个抗体分子无需后续还原而获得。“Fab2”片段是重组片段，其包含使用例如亮氨酸拉链或CH3结构域连接的两个Fab片段。“单链Fv”或“scFv”是含有其中轻链可变区和重链可变区通过合适的柔性多肽连接子共价连接的抗体的可变区片段(Fv)的重组分子。
如本文中所使用，术语“结合”在提及IL-21结合蛋白或其抗原结合结构域与抗原的相互作用时意指所述相互作用取决于所述抗原上的特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在。举例来说，抗体一般识别并结合特定蛋白质结构而非蛋白质。如果抗体结合表位“A”，则在含有经过标记的“A”与蛋白质的反应中，存在含有表位A(或游离的、未标记的“A”)的分子将减少与所述抗体结合的经过标记的A的量。
如本文中所使用，术语“特异性结合”应被视为意指相对于本公开的IL-21结合蛋白与替代抗原或细胞的反应或缔合，本公开的IL-21结合蛋白更频繁、更快速、以更长持续时间和/或以更大亲和力与特定抗原或表达其的细胞反应或缔合。举例来说，相对于IL-21结合蛋白与其他白介素或由多反应性天然抗体通常所识别的抗原(即，通过已知可结合在天然情况下在人中发现的多种抗原的天然存在的抗体)的结合，IL-21结合蛋白以实质上更大的亲和力(例如1.5倍或2倍或5倍或10倍或20倍或40倍或60倍或80倍至100倍或150倍或200倍)结合IL-21(例如hIL-21)。在本公开的一个实施例中，相较于IL-21结合蛋白与另一种白介素的结合，IL-21结合蛋白以至少1.5倍或2倍或更大(例如5倍或10倍或20倍或50倍或100倍或200倍)的亲和力“特异性结合”hIL-21。一般但未必，提及结合意指特异性结合，且各术语应理解为明确支持另一个术语。
如本文中所使用，术语“不会可检测地结合”应理解为意指IL-21结合蛋白(例如抗体)以高出背景不到10％或8％或6％或5％的水平结合候选抗原。所述背景可以是在不存在所述蛋白质和/或存在负对照蛋白质(例如同型对照抗体)时检测到的结合信号水平和/或在存在负对照抗原时检测到的结合水平。结合水平使用生物传感器分析(例如Biacore)检测，其中使IL-21结合蛋白固定并且与抗原接触。
如本文中所使用，术语“不显著结合”应理解为意指本公开的IL-21结合蛋白与多肽的结合水平不会统计上显著地高于背景，例如，在不存在IL-21结合蛋白时和/或在存在负对照蛋白质(例如同型对照抗体)时检测到的结合信号水平和/或在存在负对照多肽时检测到的结合水平。结合水平使用生物传感器分析(例如Biacore)检测，其中使IL-21结合蛋白固定并且与抗原接触。
出于清楚的目的且如本领域人员基于本文中所示例的主题显而易见，本说明书中提及“亲和力”是提及蛋白质或抗体的KD。
出于清楚的目的且如本领域人员基于本文中的描述显而易见，提及“至少约……的亲和力”应理解为意指亲和力(或KD)等于所述值或更高(即，亲和力较低时所述的值)，即2nM的亲和力大于3nM的亲和力。换言之，这一术语可以是“X或更小的亲和力”，其中X是本文中所述的值。
如本文中所使用，术语“表位”(同义词“抗原决定簇”)应理解为意指IL-21中与包含抗体的抗原结合结构域的IL-21结合蛋白结合的区域。这一术语未必局限于IL-21结合蛋白接触的特定残基或结构。举例来说，这一术语包括跨越IL-21结合蛋白所接触的氨基酸的区域和此区域外的5-10(或更多)或2-5或1-3个氨基酸。在一些实施例中，所述表位包含当IL-21结合蛋白折叠时位于彼此接近处的一系列不连续氨基酸，即，“构象表位”。技术人员还应该知道，术语“表位”不局限于肽或多肽。举例来说，术语“表位”包括分子的化学活性表面基团，诸如糖侧链、磷酰基侧链或磺酰基侧链，且在某些实施例中，可能具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。
术语“竞争性抑制”应理解为意指本公开的IL-21结合蛋白(或其抗原结合结构域)减少或防止所述抗体或IL-21结合蛋白与IL-21，例如与hIL-21的结合。这可能是由于IL-21结合蛋白(或抗原结合结构域)和抗体结合相同或重叠的表位。从上文应显而易见，IL-21结合蛋白不必完全抑制抗体的结合，相反它仅需使结合减少统计上显著的量，例如减少至少约10％或20％或30％或40％或50％或60％或70％或80％或90％或95％。优选地，IL-21结合蛋白使抗体的结合减少至少约30％，更优选地减少至少约50％，更优选地减少至少约70％，更优选地减少至少约75％，甚至更优选地减少至少约80％或85％，且甚至更优选地减少至少约90％。用于测定结合的竞争性抑制的方法在本领域中是已知的和/或描述于本文中。举例来说，在存在或不存在IL-21结合蛋白时将抗体暴露于IL-21。如果存在IL-21结合蛋白时与不存在IL-21结合蛋白时相比较少的抗体结合，则所述蛋白质被视为竞争性抑制抗体的结合。在一个实施例中，所述竞争性抑制并非由于空间位阻。
“重叠”在两个表位的情形下应被视为意指两个表位共用足够数目的氨基酸残基，从而允许结合一个表位的IL-21结合蛋白(或其抗原结合结构域)竞争性抑制能结合另一个表位的IL-21结合蛋白(或抗原结合结构域)的结合。举例来说，“重叠”表位共用至少1或2或3或4或5或6或7或8或9或20个氨基酸。
如本文中所使用，术语“激动”应被视为意指蛋白质能够在细胞中增强IL-21介导的信号传导。用于测定增强的活性的方法在本领域中是已知的和/或描述于本文中。
如本文中所使用，术语“病状”是指破环或干扰正常功能，并且不局限于任何特定病状，而且将包括疾病或病症。
如本文中所使用，术语“预防”包括施用本公开的IL-21结合蛋白，从而停止或阻碍病状的至少一种症状的发展。这一术语还涵盖治疗正在缓解中的受试者以预防或阻碍复发。
如本文中所使用，术语“治疗”包括施用本文中所描述的IL-21结合蛋白，从而减轻或消除指定疾病或病状的至少一种症状。
如本文中所使用，术语“受试者”应被视为意指包括人在内的任何动物，例如哺乳动物。示例性受试者包括但不限于人和非人灵长类。举例来说，受试者是人。
抗体
在一个实施例中，如本文中根据任何实施例所描述的IL-21结合蛋白是抗体。
用于产生抗体的方法在本领域中是已知的且/或描述于Harlow和Lane(编)Antibodies：ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratory，(1988)中。一般来说，在这样的方法中，将任选地与任何合适的或所需的载剂、佐剂或药学上可接受的赋形剂一起配制的IL-21(例如hIL-21)或其区域(例如细胞外区域)或其免疫原性片段或表位或表达和呈现其的细胞(即，免疫原)施用给非人动物，例如小鼠、鸡、大鼠、兔子、豚鼠、狗、马、奶牛、山羊或猪。所述免疫原可以经鼻内、肌肉内、皮肤下、静脉内、真皮内、腹膜内或通过其他已知途径来施用。
多克隆抗体的产生可以通过免疫后在不同的点对经过免疫的动物的血液进行取样加以监测。需要时可以给予一次或多次进一步免疫，以实现所需的抗体效价。重复加强免疫和测定效价的过程，直到实现合适的效价。当获得了所需水平的免疫原性时，对经过免疫的动物进行取血并且分离血清并存储，和/或使用所述动物来产生单克隆抗体(mAb)。
单克隆抗体是本公开所涵盖的抗体的一种示例性形式。术语“单克隆抗体”或“mAb”是指能够结合相同抗原，例如抗原内的相同表位的均质抗体群体。该术语不希望在抗体来源或其产生方式方面受限制。
对于mAb的产生，可以使用许多已知技术中的任一种，举例来说，诸如US4196265或Harlow和Lane(1988)，同上中所示例的程序。
举例来说，在足以刺激抗体产生细胞的条件下用免疫原使合适的动物免疫。诸如兔子、小鼠和大鼠之类的啮齿动物是示例性动物。经过基因工程改造以表达人抗体，例如不表达鼠类抗体的小鼠还可以用来产生本公开的抗体(例如，如WO2002/066630中所描述)。
免疫后，选择具有产生抗体的潜力的体细胞，具体来说是B淋巴细胞(B细胞)以用于mAb产生方案。这些细胞可以获自脾、扁桃体或淋巴结的活检或获自外周血液样本。然后使来自于经过免疫的动物的B细胞与一般来源于与用所述免疫原免疫的动物相同的物种的永生骨髓瘤细胞融合。
通过在包含阻断组织培养基中的核苷酸从头合成的试剂的选择性培养基中进行培养来扩增杂交物。示例性试剂是氨基蝶呤、氨甲蝶呤和重氮丝氨酸。
针对抗体特异性和/或效价对经过扩增的杂交瘤进行功能选择，举例来说，诸如通过流式细胞术和/或免疫组织化学和/或免疫测定(例如放射免疫测定、酶免疫测定、细胞毒性测定、蚀斑测定、印迹免疫测定等)。
替代地，使用ABL-MYC技术(NeoClone，MadisonWl53713，USA)来产生分泌MAb的细胞系(例如，如Largaespada等，J.Immunol.Methods.197：85-95，1996中所描述)。
还可以通过筛选展示文库，例如噬菌体展示文库来产生或分离抗体，例如，如US6300064和/或US5885793中所描述。举例来说，诸位发明人已经从噬菌体展示文库中分离了完全人抗体。
本公开的抗体可以是合成抗体。举例来说，所述抗体是嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、同人源化抗体、灵长类化抗体或去免疫抗体。
去免疫的、嵌合的、CDR移植的、人源化的、同人源化的、灵长类化的、人的和复合的 IL-21结合蛋白
本公开的IL-21结合蛋白可以是CDR移植蛋白，其包括移植到人抗体的FR上或插入其中的来自于非人物种(例如小鼠或大鼠或非人灵长类)的抗体的CDR，或包括移植到另一种类型抗体(例如另一种类型的人抗体)的FR上或插入其中的来自于一种抗体类型的抗体(例如一种类型的人抗体)的CDR。这一术语还涵盖包含例如一个或多个CDR移植可变区和一个或多个例如人可变区、嵌合可变区、同人源化可变区或灵长类化可变区的复合IL-21结合蛋白。
本公开的IL-21结合蛋白可以是人源化蛋白质。
术语“人源化蛋白质”应理解为是指包含人样可变区的蛋白质，其包括移植到人抗体的FR上或插入其中的来自于非人物种(例如小鼠或大鼠或非人灵长类)的抗体的CDR(这类型抗体属于“CDR移植抗体”这一类别)。人源化IL-21结合蛋白还包括其中人蛋白质的一个或多个残基通过一个或多个氨基酸取代而被修饰和/或人蛋白质的一个或多个FR残基被相应的非人残基置换的蛋白质。人源化蛋白质还可以包含既不是在人抗体中也不是在非人抗体中发现的残基。蛋白质的任何其他区域(例如Fc区)一般是人的。人源化可以使用本领域中已知的方法来进行，例如US5225539、US6054297、US7566771或US5585089。术语“人源化蛋白质”还涵盖超人源化蛋白质，例如，如US7732578中所描述。这一术语还涵盖包含例如一个或多个人源化可变区和一个或多个例如人可变区、嵌合可变区、同人源化可变区或灵长类化可变区的复合蛋白质。
本公开的IL-21结合蛋白可以是人IL-21结合蛋白。如本文中所使用的术语“人蛋白质”是指具有在人中，例如在人生殖细胞系或体细胞中发现的可变抗体区和任选地恒定抗体区或来自于使用这样的区域产生的文库的蛋白质。“人”蛋白质可以包括并非由人序列编码的氨基酸残基，例如通过体外随机或定点突变而引入的突变(具体来说，涉及保守取代的突变或少量蛋白质残基，例如1、2、3、4或5个蛋白质残基的突变)。未必需要产生这些“人蛋白质”作为人免疫应答的结果，相反，它们可以使用重组手段(例如，筛选噬菌体展示文库)和/或由包含编码人抗体恒定区和/或可变区的核酸的转基因动物(例如小鼠)和/或使用定向选择来产生(例如，如US5565332中所描述)。这一术语还涵盖这样的抗体的亲和力成熟形式。出于本公开的目的，人蛋白质还将被视为包括包含来自于人抗体的FR或包含来自于人FR共有序列的序列的FR的蛋白质，且其中一个或多个CDR是随机或半随机的，例如，如US6300064和/或US6248516中所描述。
任选地，VH连接于重链恒定区，例如IgG4重链恒定区。在一个实施例中，重链恒定区缺乏C末端赖氨酸残基。
任选地，VL连接于轻链恒定区。
本公开的IL-21结合蛋白可以是同人源化蛋白质。术语“同人源化蛋白质”是指通过WO2007/019620中所描述的方法制备的蛋白质。同人源化IL-21结合蛋白包括抗体的可变区，其中所述可变区包含来源于新世界灵长类抗体可变区的FR和来自于非新世界灵长类抗体可变区的CDR。举例来说，同人源化IL-21结合蛋白包括抗体的可变区，其中所述可变区包含来自于新世界灵长类抗体可变区的FR和来自于小鼠或大鼠抗体的CDR。在一个实施例中，所述同人源化IL-21结合蛋白是IL-21结合抗体，其中一个或两个可变区被同人源化。这一术语还涵盖包含例如一个或多个同人源化可变区和一个或多个例如人可变区或人源化可变区或嵌合可变区的复合蛋白质。
本公开的IL-21结合蛋白可以是灵长类化蛋白质。“灵长类化蛋白质”包含来自于对非人灵长类(例如食蟹猴)免疫后产生的抗体的可变区。任选地，将非人灵长类抗体的可变区连接于人恒定区以产生灵长类化抗体。用于产生灵长类化抗体的示例性方法描述于US6113898中。这一术语还涵盖包含例如一个或多个灵长类化可变区和一个或多个例如人可变区或人源化可变区或嵌合可变区的复合蛋白质。
在一个实施例中，本公开的IL-21结合蛋白是嵌合蛋白质。术语“嵌合蛋白质”是指其中抗原结合结构域来自于特定物种(例如鼠类，诸如小鼠或大鼠)或属于特定抗体类别或亚类，而蛋白质的其余部分来自于来源于另一个物种(举例来说，诸如人或非人灵长类)的蛋白质或属于另一个抗体类别或亚类的蛋白质。在一个实施例中，嵌合蛋白质是包含来自于非人抗体(例如鼠类抗体)的VH和/或VL的嵌合抗体且所述抗体的其余区域来自于人抗体。这样的嵌合蛋白质的产生在本领域中是已知的，并且可以通过标准手段来实现(例如，如US6331415、US5807715、US4816567和US4816397中描述)。这一术语还涵盖包含例如一个或多个嵌合可变区和一个或多个例如人可变区或人源化可变区或嵌合可变区的复合蛋白质。
本公开还涵盖去免疫的IL-21结合蛋白，例如，如WO2000/34317和WO2004/108158中所描述。去免疫抗体和蛋白质去除了一个或多个表位，例如B细胞表位或T细胞表位(即，突变)，从而降低了受试者针对所述抗体或蛋白质产生免疫应答的可能性。举例来说，分析本公开的IL-21结合蛋白以鉴别一个或多个B或T细胞表位，且使所述表位内的一个或多个氨基酸残基突变，从而降低IL-21结合蛋白的免疫原性。
技术人员从上述公开内容应显而易见，“复合”蛋白质包含一种形式的VH(例如人)和另一种形式的VL(例如人源化)。本公开明确涵盖多种形式的VH和VL的所有组合。
互补性决定区的确定
在一个实施例中，本文中所公开的互补性决定区(CDR)是基于Lefranc和同事的编号系统，称为ImMunoGeneTics(IMGT)编号系统(Lefranc，Marie-Paule等(1999)Nucl.Acids.Res.27(1)：209-212)，这是针对免疫球蛋白可变结构域生殖细胞系序列，包括抗体λ和κ轻链和重链可变结构域以及T细胞受体α、β、γ和δ链可变结构域的统一编号系统。
本领域技术人员应了解，CDR还可以使用Kabat等的编号系统(Kabat等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterestWashingtonDCUnitedStatesDepartmentofHealthandHumanServices，1987和/或1991)来确定。根据这一编号系统，CDR区被确定为：
可变重链
CDR1DYYIH
CDR2WIDPESGDTEYAPKFQV
CDR3GSGY
可变轻链
CDR1KSSQSLLDSDGETYLN
CDR2LVSKLDS
CDR3WQGTHFPYT
相应地，本公开还涵盖包含抗体的抗原结合结构域的IL-21结合蛋白，其中抗原结合结构域包含如上文根据Kabat编号系统所描述的重链和轻链互补性决定区序列。
含有抗体结合结构域的蛋白质
单结构域抗体
在一些实施例中，本公开的蛋白质是或包含单结构域抗体(这可与术语“结构域抗体”或“dAb”互换使用)。单结构域抗体是包含抗体的所有或一部分重链可变区的单多肽链。在某些实施例中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis，Inc.，Waltham，MA；参见例如US6248516)。
双抗体、三抗体、四抗体
在一些实施例中，本公开的蛋白质是或包含双抗体、三抗体、四抗体或更高阶蛋白质复合物，诸如WO98/044001和/或WO94/007921中所描述的那些。
举例来说，双抗体是包含两个缔合的多肽链的蛋白质，各多肽链包含结构VL-X-VH或VH-X-VL，其中VL是抗体轻链可变区，VH是抗体重链可变区，X是包含不足以允许单多肽链中的VH和VL缔合(或形成Fv)的残基的连接子或不存在，且其中一个多肽链的VH结合另一个多肽链的VL，以形成抗原结合结构域，即，形成能够特异性结合一个或多个抗原的Fv分子。各多肽链中的VL和VH可以相同，或各多肽链中的VL和VH可以不同，从而形成双特异性双抗体(即，包含具有不同的特异性的两个Fv)。
单链Fv(scFv)
技术人员应该知道，scFv包含单多肽链中的VH和VL区和介于VH与VL之间的多肽连接子，使得scFv能够形成抗原结合所需的结构(即，单多肤链的VH和VL彼此缔合以形成Fv)。举例来说，所述连接子包含超过12个氨基酸残基，其中(Gly4Ser)3是更偏好用于scFv的连接子之一。
本公开还涵盖二硫键稳定化的Fv(或diFv或dsFv)，其中将单半胱氨酸残基引入到VH的FR和VL的FR中，并且所述半胱氨酸残基通过二硫键连接以产生稳定的Fv。
替代地或另外，本公开涵盖二聚scFv，即包含由非共价或共价键联，例如由亮氨酸拉链结构域(例如来源于Fos或Jun)连接的两个scFv分子的蛋白质。替代地，两个scFv由长度足以允许两个scFv形成并且与抗原结合的肽连接子连接，例如，如US20060263367中所描述。
重链抗体
重链抗体在结构上不同于许多其他形式的抗体，因为它们包含重链但不包含轻链。因此，这些抗体也被称为“仅有重链的抗体”。重链抗体发现于例如骆驼科和软骨鱼中(也称为IgNAR)。
天然存在的重链抗体中所存在的可变区一般被称为“VHH结构域”(在骆驼抗体中)和V-NAR(在IgNAR中)，以便将它们与常规4链抗体中所存在的重链可变区(这被称为“VH结构域)”和常规4链抗体中所存在的轻链可变区(这被称为“VL结构域”)区分开来。
来自于骆驼科的重链抗体和其可变区以及其产生和/或分离和/或使用方法的一般描述尤其见于以下参考文献中：WO94/04678、WO97/49805和WO97/49805。
来自于软骨鱼的重链抗体和其可变区以及其产生和/或分离和/或使用方法的一般描述尤其见于WO2005/118629中。
包含其抗原结合结构域的其他抗体和蛋白质
本公开还涵盖包含其抗原结合结构域的其他抗体和蛋白质，诸如：
(i)“钥匙与匙孔”双特异性蛋白质，如US5731168中所描述；
(ii)异源缀合蛋白质，例如，如US4676980中所描述；
(iii)使用化学交叉连接子产生的异源缀合蛋白质，例如，如US4676980中所描述；和
(iv)Fab3(例如，如EP19930302894中所描述)。
蛋白质的突变
本公开还提供了一种与本文中所公开的序列具有至少80％同一性的IL-21结合蛋白或其编码核酸。在一个实施例中，本公开的IL-21结合蛋白或核酸包含与本文中所公开的序列具有至少约85％或90％或95％或97％或98％或99％同一性的序列。
替代地或另外，所述IL-21结合蛋白包含与如本文中根据任何实施例所描述的VH或VL的CDR具有至少约80％或85％或90％或95％或97％或98％或99％同一性的CDR(例如三个CDR)。
在另一个实施例中，本公开的核酸包含与编码具有如本文中根据任何实施例所描述的功能的IL-21结合蛋白的序列具有至少约80％或85％或90％或95％或97％或98％或99％同一性的序列。本公开还涵盖编码本公开的IL-21结合蛋白的核酸，其由于遗传密码子的简并性而不同于本文中所示例的序列。
核酸或多肽的同一性％是通过GAP(Needleman和Wunsch.Mol.Biol.48，443-453，1970)分析(GCG方案)测定，其中空位产生罚分＝5且空位延伸罚分＝0.3。查询序列的长度是至少50个残基，且GAP分析在至少50个残基的区域上比对两个序列。举例来说，查询序列的长度是至少100个残基，且GAP分析在至少100个残基的区域上比对两个序列。举例来说，在其整个长度上比对两个序列。
本公开还涵盖在严格杂交条件下与编码本文中所描述的IL-21结合蛋白的核酸杂交的核酸。“中等严格度”在本文中定义为在含0.1％(w/v)SDS的2×SSC缓冲液中、在45℃至65℃范围内的温度下或等同条件下进行杂交和/或洗涤。“高严格度”在本文中定义为在含0.1％(w/v)SDS或更低盐浓度的0.1×SSC缓冲液中且在至少65℃的温度下或等同条件下进行杂交和/或洗涤。本文中提及特定严格度水平涵盖使用本领域技术人员已知的除SSC以外的洗涤/杂交溶液的等同条件。举例来说，用于计算双链核酸的各链将会解离的温度(也称为解链温度或Tm)的方法在本领域中是已知的。与核酸的Tm类似(例如5℃内或10℃内)或相等的温度被视为高严格度。中等严格度将被视为在核酸的计算Tm的10℃至20℃或10℃至15℃内。
本公开还涵盖本公开的IL-21结合蛋白的突变形式，其与本文中所阐述的序列相比包含一个或多个保守氨基酸取代。在一些实施例中，IL-21结合蛋白包含10个或更少，例如9或8或7或6或5或4或3或2或1个保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有类似的侧链和/或疏水性和/或亲水性的氨基酸残基置换的取代。
本领域中已经定义了具有类似的侧链的氨基酸残基的家族，包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。亲水性指数描述于例如Kyte和DoolittleJ.Mol.Biol.，157：105-132，1982中，而疏水性指数描述于例如US4554101中。
本公开还涵盖非保守氨基酸变化。举例来说，特别感兴趣的是用另一个带电氨基酸和用中性或带正电氨基酸取代带电氨基酸。在一些实施例中，IL-21结合蛋白包含10个或更少，例如9或8或7或6或5或4或3或2或1个非保守氨基酸取代。
在一个实施例中，突变发生在本公开的IL-21结合蛋白的抗原结合结构域的FR内。在另一个实施例中，突变发生在本公开的IL-21结合蛋白的CDR内。
用于产生突变形式的IL-21结合蛋白的示例性方法包括：
·DNA(Thie等，MethodsMol.Biol.525：309-322，2009)或RNA(Kopsidas等，Immunol.Lett.107：163-168，2006；Kopsidas等，BMCBiotechnology，7：18，2007；和WO1999/058661)诱变；
·将编码多肽的核酸引入突变细胞中，例如XL-1Red、XL-mutS和XL-mutS-Kanr细菌细胞(Stratagene)；
·DNA改组，例如，如Stemmer，Nature370：389-91，1994中所公开；和
·定点诱变，例如，如Dieffenbach(编)和Dveksler(编)中所描述(PCRPrimer：ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratories，NY，1995)。
用于测定本公开的突变IL-21结合蛋白的生物活性的示例性方法将对技术人员显而易见和/或描述于本文中，例如抗原结合。举例来说，用于测定抗原结合、对结合的竞争性抑制、亲和力、缔合、解离和治疗功效的方法描述于本文中。
恒定区
本公开涵盖本文中所描述的IL-21结合蛋白和/或抗体，其包含抗体的恒定区。这包括抗体的与Fc融合的抗原结合片段。
可用于产生本公开的蛋白质的恒定区的序列可以获自许多不同的来源。在一些实施例中，蛋白质的恒定区或其部分来源于人抗体。恒定区或其部分可以来源于任何抗体类别，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，以及任何抗体同型，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在一个实施例中，恒定区是人同型IgG4或稳定化IgG4恒定区。
在一个实施例中，例如，与天然或野生型人IgG1或IgG3Fc区相比，恒定区的Fc区诱导效应功能的能力有所降低。在一个实施例中，效应功能是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。用于评估含有Fc区的蛋白质的效应功能水平的方法在本领域中是已知的且/或描述于本文中。
在一个实施例中，Fc区是IgG4Fc区(即，来自于IgG4恒定区)，例如人IgG4Fc区。合适的IgG4Fc区的序列对于技术人员将显而易见和/或可在公共可利用的数据库中获得(例如，可得自美国国家生物技术信息中心)。
在一个实施例中，恒定区是稳定化IgG4恒定区。术语“稳定化IgG4恒定区”应理解为意指已经过修饰以减少Fab臂交换或者进行Fab臂交换或形成半抗体的倾向性或者形成半抗体的倾向性的IgG4恒定区。“Fab臂交换”是指针对人IgG4的蛋白质修饰类型，其中将IgG4重链和所连接的轻链(半分子)交换成来自于另一个IgG4分子的重链-轻链对。因此，IgG4分子可以获得两个独特的Fab臂，从而识别两种独特的抗原(产生双特异性分子)。Fab臂交换在天然情况下发生在体内，并且可以通过纯化的血细胞或诸如还原型谷胱甘肽之类的还原剂在体外诱导。当IgG4抗体解离以形成两个分子，各分子含有单一重链和单一轻链时，“半抗体”形成。
在一个实施例中，根据Kabat系统(Kabat等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，WashingtonDC，UnitedStatesDepartmentofHealthandHumanServices，1987和/或1991)，稳定化IgG4恒定区在铰链区的241位包含脯氨酸。根据EU编号系统(Kabat等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，WashingtonDC，UnitedStatesDepartmentofHealthandHumanServices，2001；和Edelman等，Proc.Natl.Acad.USA，63，78-85，1969)，这个位置对应于铰链区的228位。在人IgG4中，这个残基一般是丝氨酸。丝氨酸取代为脯氨酸后，IgG4铰链区包含序列CPPC。在这方面，技术人员应该知道，“铰链区”是抗体重链恒定区中连接Fc和Fab区从而赋予抗体的这两个Fab臂以移动性的富脯氨酸部分。铰链区包括参与重链间二硫键的半胱氨酸残基。根据Kabat编号系统，它一般定义为从人IgG1的Glu226延伸到Pro243。其他IgG同型的铰链区可以通过将形成重链间二硫(S-S)键的第一个和最后一个半胱氨酸残基放在相同的位置而与IgG1序列进行比对(参见例如WO2010/080538)。
稳定化IgG4抗体的其他实例是其中人IgG4的重链恒定区中409位(根据EU编号系统)上的精氨酸被赖氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸或亮氨酸取代的抗体(例如，如WO2006/033386中所描述)。恒定区的Fc区可以另外或替代地在对应于405的位置(根据EU编号系统)上包含选自以下的残基：丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、异亮氨酸和亮氨酸。任选地，铰链区在241位上包含脯氨酸(即，CPPC序列)(如以上所描述)。
在另一个实施例中，Fc区是经修饰以具有减少的效应功能的区域，即，“非免疫刺激性Fc区”。举例来说，Fc区是在选自以下的一个或多个位置上包含取代的IgG1Fc区：268、309、330和331。在另一个实施例中，Fc区是包含一个或多个以下变化E233P、L234V、L235A和G236缺失和/或一个或多个以下变化A327G、A330S和P331S的IgG1Fc区(Armour等，EurJImmunol.29：2613-2624，1999；Shields等，JBiolChem.276(9)：6591-604，2001)。非免疫刺激性Fc区的其他实例描述于例如Dall′Acqua等，JImmunol.177：1129-11382006；和/或HezarehJVirol，75：12161-12168，2001)中。
在另一个实施例中，Fc区是嵌合Fc区，例如包含至少一个来自于IgG4抗体的CH2结构域和至少一个来自于IgG1抗体的CH3结构域，其中所述Fc区在选自以下的一个或多个氨基酸位置上包含取代：240、262、264、266、297、299、307、309、323、399、409和427(EU号码)(例如，如WO2010/085682中所描述)。示例性取代包括240F、262L、264T、266F、297Q、299A、299K、307P、309K、309M、309P、323F、399S和427F。
其他修饰
本公开还涵盖对包含Fc区或恒定区的抗体或IL-21结合蛋白的其他修饰。
举例来说，所述抗体包含一个或多个增加所述蛋白质的半衰期的氨基酸取代。举例来说，所述抗体包含有包含一个或多个增加Fc区对新生儿Fc区(FcRn)的亲和力的氨基酸取代的Fc区。举例来说，Fc区在较低pH值(例如约pH6.0)下对FcRn具有增加的亲和力，以促进核内体中的Fc/FcRn结合。在一个实施例中，与其在约pH7.4下的亲和力相比，Fc区在约pH6下对FcRn具有增加的亲和力，这促进Fc在细胞再循环后再释放到血液中。这些氨基酸取代可用于通过降低从血液中的清除率而延长蛋白质的半衰期。
根据EU编号系统，示例性氨基酸取代包括T250Q和/或M428L或T252A、T254S和T266F或M252Y、S254T和T256E或H433K和N434F。另外或替代氨基酸取代描述于例如US20070135620或US7083784中。
蛋白质产生
在一个实施例中，本文中根据任何实施例所描述的IL-21结合蛋白通过在足以产生所述蛋白质的条件(例如，如本文中所描述的和/或如本领域中已知的)下培养杂交瘤来产生。
重组表达
在另一个实施例中，如本文中根据任何实施例所描述的IL-21结合蛋白是重组的。
在重组蛋白的情况下，可以将编码其的核酸克隆到表达构建体或载体中，然后将表达构建体或载体转染到诸如大肠杆菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞(诸如猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾(HEK)细胞或骨髓瘤细胞)之类的否则将不产生所述蛋白质的宿主细胞中。用于表达蛋白质的示例性细胞是CHO细胞、骨髓瘤细胞或HEK细胞。实现这些目的的分子克隆技术在本领域中是已知的，并且描述于例如以下文献中：Ausubel等(编)，CurrentProtocolsinMolecularBiology，GreenePub.AssociatesandWiley-lnterscience(1988，包括直到目前的所有更新)；或Sambrook等，MolecularCloning：ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989)。多种克隆和体外扩增方法适用于构建重组核酸。产生重组抗体的方法在本领域中也是已知的，参见例如US4816567或US5530101。
分离后，将核酸插入，与表达构建体或表达载体中的启动子可操作地连接以便进一步克隆(扩增DNA)或者在无细胞系统中或在细胞中表达。
如本文中所使用，术语“启动子”将理解为其最广泛情形，并且包括基因组基因中例如响应于发育刺激和/或外部刺激或以组织特异性方式改变核酸的表达的转录调节序列，包括精确转录起始所需的TATA盒或启动元件，存在或不存在其他调节元件(例如上游活化序列、转录因子结合位点、增强子和沉默子)。在本发明的上下文中，术语“启动子”还用于描述重组、合成或融合核酸，或者提供、活化或增强它可操作地连接的核酸的表达的衍生物。示例性启动子可以含有一个或多个特定调节元件的额外拷贝，以进一步增强所述核酸的表达和/或改变空间表达和/或暂时表达。
如本文中所使用，术语“可操作地连接于”意指相对于核酸安置启动子，从而通过所述启动子控制所述核酸的表达。
用于在细胞中表达的许多载体是可利用的。载体组分一般包括但不限于以下各项中的一项或多项：信号序列、编码蛋白质的序列(例如来源于本文中所提供的信息)、增强子元件、启动子和转录终止序列。技术人员应该知道用于表达蛋白质的合适的序列。示例性信号序列包括原核细胞分泌信号(例如pelB、碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp或热稳定肠毒素II)、酵母分泌信号(例如转化酶前导序列、α因子前导序列或酸性磷酸酶前导序列)或哺乳动物分泌信号(例如单纯性疱疹gD信号)。
在哺乳动物细胞中具有活性的示例性启动子包括巨细胞病毒立即早期启动子(CMV-IE)、人延长因子1-α启动子(EF1)、小核RNA启动子(U1a和U1b)、α-肌球蛋白重链启动子、猿猴病毒40启动子(SV40)、劳氏肉瘤病毒启动子(RSV)、腺病毒主要晚期启动子、β-肌动蛋白启动子；包含CMV增强子/β-肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子或其活性片段的杂合调节元件。可用的哺乳动物宿主细胞系的实例是被SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7，ATCCCRL1651)；人胚肾细胞系(经过亚克隆以便在悬浮液培养基中生长的293或293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCCCCL10)；或中国仓鼠卵巢细胞(CHO)。
适合于在举例来说，诸如选自包括巴斯德毕赤氏酵母(Pichiapastoris)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和粟酒裂殖酵母(S.pombe)的组的酵母细胞之类的酵母细胞中表达的典型启动子包括但不限于ADH1启动子、GAL1启动子、GAL4启动子、CUP1启动子、PHO5启动子、nmt启动子、RPR1启动子或TEF1启动子。
用于将分离的核酸或包含其的表达构建体引入到细胞中以便表达的手段对本领域技术人员是已知的。用于指定细胞的技术取决于已知的成功技术。用于将重组DNA引入到细胞中的手段尤其包括显微注射、由DEAE-葡聚糖介导的转染、由脂质体介导的转染(诸如通过使用lipofectamine(Gibco，MD，USA)和/或cellfectin(Gibco，MD，USA))、PEG介导的DNA吸收、电穿孔和微粒轰击(诸如通过使用DNA涂布的钨或金粒子)(AgracetusInc.，Wl，USA)。
可以在多种培养基中培养用于产生蛋白质的宿主细胞，这取决于所使用的细胞类型。市售培养基，诸如Ham′sFI0(Sigma)、最低必需培养基(MEM)(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)(Sigma)，适合于培养哺乳动物细胞。用于培养本文中讨论的其他细胞类型的培养基在本领域中是已知的。
蛋白质的分离
用于分离蛋白质的方法在本领域中是已知的且/或描述于本文中。
在IL-21结合蛋白被分泌到培养基中的情况下，可以首先使用市售蛋白质浓缩过滤器，例如Amicon或MilliporePellicon超滤装置来浓缩得自于这样的表达系统的上清液。任何上述步骤中都可以包括诸如PMSF之类的蛋白酶抑制剂以抑制蛋白水解作用，并且可以包括抗生素以防止偶生污染物的生长。替代地或另外，可以对上清液进行过滤和/或与表达所述蛋白质的细胞分离，例如使用连续离心。
由所述细胞制备的IL-21结合蛋白可以使用例如离子交换、羟基磷灰石色谱法、疏水性相互作用色谱法、凝胶电泳、渗析、亲和色谱法(例如蛋白A亲和色谱法或蛋白G色谱法)或上述各项的任何组合加以纯化。这些方法在本领域中是已知的且描述于例如WO99/57134或EdHarlow和DavidLane(编)Antibodies：ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratory，(1988)中。
本领域技术人员还会知道，蛋白质可以经过修饰以包括标签以便促进纯化或检测，所述标签例如聚组氨酸标签，例如六组氨酸标签，或流感病毒血球凝集素(HA)标签，或猿猴病毒5(V5)标签，或FLAG标签，或谷胱甘肽S转移酶(GST)标签。然后使用本领域中已知的方法，诸如亲和力纯化来纯化所产生的蛋白质。举例来说，通过使包含所述蛋白质的样本与特异性结合被固定在固体或半固体载体上的六组氨酸标签的镍-氨三乙酸(Ni-NTA)接触、洗涤所述样本以去除未结合的蛋白质和随后洗脱结合的蛋白质来纯化包含六组氨酸标签的蛋白质。替代地或另外，将结合标签的配体或抗体用于亲和力纯化方法中。
缀合物
在一个实施例中，本公开的IL-21结合蛋白与化合物缀合。举例来说，所述化合物选自放射性同位素、可检测标记、治疗性化合物、胶体、毒素、核酸、肽、蛋白质、增加IL-21结合蛋白在受试者中的半衰期的化合物和其混合物。
另一种化合物可以直接或间接地与IL-21结合蛋白结合(例如，在间接结合的情况下可以包含连接子)。化合物的实施例包括放射性同位素(例如碘-131、钇-90或铟-111)、可检测标记(例如，荧光团或荧光纳米晶体或量子点)、治疗性化合物(例如化学治疗剂或消炎剂)、胶体(例如金)、毒素(例如篦麻毒素或破伤风类毒素)、核酸、肤(例如，血清白蛋白结合肽)、蛋白质(例如包含抗体的抗原结合结构域的蛋白质或血清白蛋白)、增加IL-21结合蛋白在受试者中的半衰期的化合物(例如聚乙二醇或具有此活性的其他水溶性聚合物)和其混合物。可以与本公开的IL-21结合蛋白缀合的示例性化合物和用于这样的缀合的方法在本领域中是已知的且描述于例如WO2010/059821中。
IL-21结合蛋白可以与纳米粒子缀合(例如，如Kogan等，Nanomedicine(Lond).2：287-306，2007中所综述)。所述纳米粒子可以是金属纳米粒子。
IL-21结合蛋白可以包含在抗体靶向的细菌微型细胞中(例如，如PCT/IB2005/000204中所描述)。
表1中列出了可以与本公开的IL-21结合蛋白缀合的一些示例性化合物。
表1.可用于缀合的化合物。
测定IL-21结合蛋白的活性
与IL-21和其突变体的结合
技术人员从本文中的公开内容应显而易见，本公开的一些IL-21结合蛋白结合hIL-21并且结合hIL-21的特定突变形式。用于评估与蛋白质的结合的方法在本领域中是已知的，例如，如Scopes(Proteinpurification：principlesandpractice，第三版，SpringerVerlag，1994)中所描述。这样的方法一般包括固定IL-21结合蛋白和使它与经过标记的抗原接触。在洗涤以去除非特异性结合的蛋白质后，检测标记和因此结合的抗原的量。当然，可以标记IL-21结合蛋白并且固定抗原。还可以使用淘选型测定。替代地或另外，可以使用表面等离子体共振测定。
任选地，测定经过固定的IL-21结合蛋白对IL-21或其表位的解离常数(Kd)、缔合常数(Ka)和/或亲和力常数(KD)。在一个实施例中，通过放射性标记或荧光标记的IL-21结合测定来测量IL-21结合蛋白的“Kd”或“Ka”或“KD”。在“Kd”的情况下，该测定在未经标记的IL-21的滴定系列的存在下用最低浓度的经过标记的IL-21使IL-21结合蛋白平衡。在洗涤以去除未结合的IL-21后，测定标记的量，这指示所述蛋白质的Kd。
根据另一个实施例，通过使用表面等离子体共振测定来测量Kd、Ka或KD，例如使用利用经过固定的IL-21或其区域或者经过固定的IL-21结合蛋白的BIAcore表面等离子体共振(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)。
在一些实施例中，IL-21结合蛋白与抗体8E2相比具有类似的KD或提高的KD(即，较低的KD值)，因为它们可能竞争结合IL-21。
测定竞争性结合
用于测定竞争性地抑制抗体2P2的结合的蛋白质的测定对技术人员将显而易见。一种这样的方法示例于本文中。
举例来说，所述抗体与可检测标记，例如荧光标记或放射性标记缀合。然后混合经过标记的抗体与测试IL-21结合蛋白，并且与IL-21或其区域或表达其的细胞接触。然后测定经过标记的抗体的水平，并且与当经过标记的抗体与所述IL-21、区域或细胞在不存在IL-21结合蛋白的情况下接触时测定的水平相比较。如果存在测试IL-21结合蛋白时的经过标记的抗体的水平与不存在IL-21结合蛋白时相比有所降低，则IL-21结合蛋白被视为竞争性地抑制所述抗体与IL-21的结合。
任选地，测试IL-21结合蛋白与针对抗体的不同的标记缀合。这种替代标记允许检测测试IL-21结合蛋白与IL-21或其区域或细胞的结合水平。
测定激动剂活性
在本公开的一些实施例中，蛋白质能够增强IL-21活性。
本领域中已知用于评估蛋白质通过受体增强配体的信号传导的能力的各种测定。
在一个实施例中，IL-21结合蛋白增强在IL-21存在下培养的表达IL-21R和gp130(例如经修饰以表达这两种蛋白质的细胞)的细胞(例如BaF3细胞)的增殖。在存在IL-21(例如介于约0.5ng/mL至约5ng/mL(诸如0.5ng/mL或5ng/mL)之间)(对于hIL-21)和存在或不存在测试IL-21结合蛋白的情况下培养细胞(例如约1×104个细胞)。用于评估细胞增殖的方法在本领域中是已知的，并且包括例如MTT还原和/或胸苷并入。与不存在IL-21结合蛋白时观测到的水平相比增强增殖水平的IL-21结合蛋白被视为能增强或激动IL-21信号传导。
可以利用B9细胞或T10细胞进行与上一段落中所描述的测定类似的测定(Dams-Kozlowska等，BMCBiotechnol，12：8，2012；和Yokote等，JAOAC，83：1053-1057，2000)。在利用T10细胞的测定的情况下，可以通过比色检测四唑化合物4-[3-(4-碘苯基)-2-(4-硝基苯基)-2H-5-四唑鎓基]-1，3-苯二磺酸酯(WST-1)还原来测量增殖。
本公开涵盖用于评估IL-21信号传导的增强的其他方法。
测定IL-21的半衰期
可以例如通过药物动力学研究，例如根据Kim等，EurJofImmunol24：542，1994所描述的方法来测量IL-21的半衰期。根据这种方法，将经过放射性标记的IL-21经静脉内注射到小鼠中，且定期测量其血浆浓度随时间的变化，例如在注射后3分钟至72小时。因此获得的清除率曲线应该是二相性的，即，α相和β相。对于测定蛋白质的体内半衰期，计算β相中的清除率并且与野生型或未修饰蛋白质的相比较。
评估治疗功效
上文关于测定IL-21结合蛋白的中和作用描述了用于评估治疗功效的测定。
在另一个实施例中，使用体内测定评估蛋白质治疗病状的功效。
举例来说，可以在癌症(例如胃癌)模型中测试IL-21结合蛋白。举例来说，对于gp130的Y757F突变体(gp130Y757F/Y757F)而言同源的小鼠发展胃肿瘤(Jenkins等，Blood109：2380-2388，2007)。用IL-21结合蛋白处理小鼠(例如，八周龄小鼠)，并且评估胃息肉的数目和/或重量。减少息肉尺寸和/或重量的IL-21结合蛋白被视为可用于治疗癌症。可以使用类似的测定来测试对结肠癌的作用，其中基本上如Greten(等，Cell，118：285-296，2004)中所描述依次用氧化偶氮甲烷(AOM)和葡聚糖硫酸钠(DSS)处理gp130Y757F/Y757F小鼠以诱导结肠癌，随后用IL-21结合蛋白治疗。
可以另外或替代地在癌症转移或癌症相关骨病模型中测试IL-21结合蛋白，例如，如Li等，Oncol.Lett.3：802-806，2012中所描述。
欲治疗的病状
IL-21是来源于CD4+T细胞的细胞因子，它对于最佳CD8+T细胞介导的免疫性、NK活化以及诸如抗体产生和B细胞成熟之类的最佳体液应答非常重要。IL-21已经显示能诱导许多促炎性细胞因子，诸如IL18、IL-15、IL-5、IL-6、IL-7A、IL-17F、TNFRII、sCD25和RANTES。
本公开的IL-21结合蛋白可用于治疗癌症。示例性癌症包括囊性和实体肿瘤、骨和软组织肿瘤，包括肛门组织肿瘤、胆管肿瘤、膀胱肿瘤、血细胞肿瘤、锥形体肿瘤、肠肿瘤、脑肿瘤、乳房肿瘤、类癌瘤、宫颈肿瘤、眼部肿瘤、食管肿瘤、头颈部肿瘤、肾肿瘤、喉肿瘤、白血病、肝脏肿瘤、肺肿瘤、淋巴结肿瘤、淋巴瘤、黑素瘤、间皮瘤、骨髓瘤、卵巢肿瘤、胰脏肿瘤、阴茎肿瘤、前列腺肿瘤、皮肤肿瘤、肉瘤、胃肿瘤、睾丸肿瘤、甲状腺肿瘤、阴道肿瘤、外阴肿瘤。软组织肿瘤包括良性单体性许旺氏细胞瘤(schwannomaMonosomy)、硬纤维瘤、成脂细胞瘤、脂肪瘤、子宫平滑肌瘤、明细胞肉瘤、皮肤纤维肉瘤、尤因氏肉瘤、骨骼外粘液样软骨肉瘤、粘液样脂肪肉瘤、小泡型横纹肌肉瘤和滑膜肉瘤。具体的骨肿瘤包括非骨化性纤维瘤、单房性骨囊肿、内生软骨瘤、动脉瘤样骨囊肿、成骨细胞瘤、成软骨细胞瘤、软骨粘液纤维瘤、骨化性纤维瘤和釉质瘤、巨细胞瘤、纤维性结构不良、尤因氏肉瘤、嗜曙红细胞肉芽肿、骨肉瘤、软骨瘤、软骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤和转移癌。白血病包括急性成淋巴细胞性白血病、急性成髓细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病和慢性髓细胞样白血病。
本公开的IL-21结合蛋白可用于治疗和预防人病毒感染。病毒感染的实例包括由以下各项造成的感染：DNA病毒(例如疱疹病毒，诸如单纯性疱疹病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、巨细胞病毒；痘病毒，诸如天花(小痘)病毒；肝病毒(例如乙型肝炎病毒)；乳头状瘤病毒；腺病毒)；RNA病毒(例如HIVI、HIVII；HTLVI、HTLVII；脊髓灰质炎病毒；甲型肝炎；冠状病毒，诸如突发性急性呼吸道综合征(SARS)；正粘病毒(例如流感病毒)；副粘病毒(例如麻疹病毒)；狂犬病病毒；丙型肝炎病毒)、黄病毒、流感病毒；杯状病毒；狂犬病病毒、牛瘟病毒、砂粒样病毒等等。此外，可以使用IL-21的病毒相关疾病类型的实例包括但不限于：获得性免疫缺陷；肝炎；肠胃炎；出血性疾病；肠炎；心脏炎；脑炎；麻痹；细支气管炎；上下呼吸道疾病；呼吸道乳头状瘤病；关节炎；播散性性疾病；脑膜炎；单核细胞增多症。
本公开的IL-21结合蛋白还可用于治疗微生物感染，包括衣原体、李斯特菌、幽门螺杆菌、分枝杆菌、支原体、炭疽杆菌、沙门氏菌和志贺氏菌。
本公开的IL-21结合蛋白还可用作单一疗法用于急性和慢性病毒感染以及用于免疫能力受损的患者。增强免疫性的方法可以加快患有不明原因性感染(unresolvedinfection)的患者的恢复时间。免疫疗法可以对免疫能力受损的患者的子集，诸如非常年轻的或年老的以及受通过感染获得或在诸如化学疗法或骨髓摘除术之类的医学干预后诱导的免疫缺陷困扰的患者具有甚至更大的影响。正在经由免疫调节治疗的适应症类型的实例包括，IFN-α用于慢性肝炎、HIV感染后使用IL-2、和干扰素用于治疗移植后爱泼斯坦-巴尔病毒感染。
本公开的IL-21结合蛋白还可用作过敏症免疫疗法用于治疗例如过敏性鼻炎、枯草热和支气管性哮喘。
组合物
在一些实施例中，如本文中所描述的IL-21结合蛋白可以经口、经肠胃外、通过吸入喷雾、吸附、吸收、局部、直肠、鼻、口腔、阴道、心室内、经由植入式容器以含有药学上可接受的常规无毒载剂的剂量制剂的形式或通过任何其他便利剂型施用。如本文中所使用的术语“肠胃外”包括皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内、鞘内、心室内、胸骨内和颅内注射或输注技术。
用于将IL-21结合蛋白制备成适合施用于受试者的形式(例如药物组合物)的方法在本领域中是已知的，并且包括例如Remington′sPharmaceuticalSciences(第18版，MackPublishingCo.，Easton，Pa.，1990)和U.S.Pharmacopeia：NationalFormulary(MackPublishingCompany，Easton，Pa.，1984)中所描述的方法。
本公开的药物组合物特别可用于肠胃外施用，诸如静脉内施用或施用于体腔或器官内腔或关节中。用于施用的组合物通常将包括IL-21结合蛋白溶解于药学上可接受的载剂，例如水性载剂中的溶液。可以使用多种水性载剂，例如缓冲生理盐水等。所述组合物可以视需要含有药学上可接受的辅助物质以接近生理条件，诸如pH值调节和缓冲剂、毒性调节剂等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。本公开的IL-21结合蛋白在这些制剂中的浓度可以广泛变化，并且将主要基于流体体积、粘度、体重等根据所选的具体施用模式和患者的需要进行选择。示例性载剂包括水、生理盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和5％人血清白蛋白。还可以使用非水性媒介物，诸如混合油和油酸乙酯。还可以使用脂质体作为载剂。媒介物可以含有增强等渗性和化学稳定性的少量添加剂，例如缓冲剂和防腐剂。
配制后，本公开的IL-21结合蛋白将以与剂量制剂相容的方式且以治疗/预防有效的量施用。制剂容易以多种剂型施用，诸如上述可注射溶液类型，但也涵盖其他药学上可接受的形式，例如片剂、丸剂、胶囊或其他口服固体、栓剂、子宫托、鼻用溶液或喷雾、气雾剂、吸入剂、脂质体形式等。还可以使用药用“缓释”胶囊或组合物。缓释制剂一般设计成能在较长时期内得到恒定药物水平，并且可以用来递送本公开的IL-21结合蛋白。
WO2002/080967描述了用于施用包含抗体的雾化组合物以便治疗例如哮喘的组合物和方法，这也适合于施用本公开的IL-21结合蛋白。
组合疗法
在一个实施例中，本公开的IL-21结合蛋白与一种或多种可用于治疗本文中所描述的病状的其他化合物组合施用，作为组合或额外治疗步骤或作为治疗制剂的额外组分。
在另一个实施例中，另一种化合物是用于治疗癌症的化疗药物或其他药物。
在另一个实施例中，在放射疗法前后施用本文中所描述的蛋白质以治疗癌症。
在另一个实施例中，将本发明的IL-21结合蛋白与免疫疗法组合施用。
合适的免疫疗法包括但不限于：检查点抑制剂；酪氨酸激酶抑制剂、肿瘤坏死因子受体抑制剂、细胞因子或白介素；干扰素；粒细胞巨噬细胞集落刺激因子；疫苗(癌症疫苗或传染病)；抗病毒药物；溶瘤病毒；多糖，诸如β葡聚糖(蘑菇多糖)；和过继性细胞疗法(ACT)，诸如以非T辅助细胞依赖性方式针对细胞毒性T淋巴细胞命运的离体培养的T细胞或经基因修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞。
合适的免疫疗法可以靶向但不限于靶向以下各物：程序性死亡蛋白1(PD1)、程序性死亡配体1(PDL1)或程序性死亡配体2(PDL2)、分化簇80(CD80)、分化簇80(CD86)、B7相关蛋白1(B7RP1)、分化簇276(CD276)、分化簇274(CD274)、疱疹病毒进入介体(HVEM)、分化簇配体(CD137L)、肿瘤坏死因子受体超家族成员4配体(OX40L)、分化簇(CD70)、分化簇(CD40)、半乳糖凝集素9(GAL9)、分化簇28(CD28)、细胞毒性T淋巴细胞活化因子-4(CTLA4)、可诱导T细胞共刺激因子(ICOS)、B和T淋巴细胞弱化因子(BTLA)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、TCR、淋巴细胞活化基因3(LAG3)、死亡受体5(DR5)、分化簇137(CD137)、肿瘤坏死因子受体超家族成员42(OX40)、分化簇27(CD27)、分化簇40配体(CD40L)、腺苷酸A2a受体(AZaR)或TIM3(T细胞免疫球蛋白-3)。
合适的检查点抑制剂包括：PD-1抑制剂尼鲁单抗(Bristol-MyersSquibb/OnoPharmaceutical)、兰利珠单抗(MK-3475；Merck)、皮地珠单抗(Pidilizunab)(CureTech/Teva)和AMP-224(Amplimmune/GlaxoSmithKline)；PD-L1抑制剂RG-7446(Roche)和MEDI-4736(AstraZeneca)；和CTLA-4抑制剂伊匹单抗。合适的酪氨酸激酶抑制剂包括索拉非尼、伊马替尼、吉非替尼、钯、埃罗替尼、拉帕替尼、舒尼替尼、尼罗替尼。合适的肿瘤坏死因子受体抑制剂包括针对DR5的抗体。合适的细胞因子或白介素包括IL-2、IL-7、IL-12。合适的干扰素包括IFN-α、IFN-β和IFN-γ。合适的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子包括沙格莫丁(Sargramostin)。合适的疫苗包括Sipuleucel-T，且合适的溶瘤病毒包括T-VEC。
在另一个实施例中，本发明的IL-21结合蛋白与诸如针对DR5和/或CD137的抗体之类的抑制剂组合施用。
在另一个实施例中，本发明的IL-21结合蛋白是与免疫调节药物药物组合施用。
合适的免疫调节药物包括沙利度胺(反应停(Thalomid))、来那度胺(雷利度胺(Revlimid))和泊马度胺(Pomalyst)。
施用剂量和时程
本公开的IL-21结合蛋白的合适的剂量将取决于具体的IL-21结合蛋白、欲治疗的病状和/或正在治疗的受试者而变化。决定合适的剂量在熟练医师的能力范围内，例如，通过以亚最佳剂量开始且以递增放上改变剂量以确定最佳或可用剂量。替代地，为了测定适用于治疗/预防的剂量，使用得自于细胞培养测定或动物研究的数据，其中合适的剂量在包括具有极小毒性或没有毒性的活性化合物的ED50的循环浓度的范围内。所述剂量可以在这个范围内变化，这取决于所采用的剂型和所利用的施用途径。可以由细胞培养测定初步估计治疗/预防有效剂量。可以在动物模型中用公式计算剂量以便达到包括如在细胞培养物中测定的IC50(即，达到对症状的半最大抑制的化合物浓度或用量)的循环血浆浓度范围。这样的信息可以用于更精确地确定在人中的可用剂量。举例来说，可以通过高效液相色谱法测量血浆中的水平。
在一些实施例中，本公开的方法包括施用预防或治疗有效量的本文中所描述的蛋白质。
术语“治疗有效量”是当施用于需要治疗的受试者时能改善所述受试者的预后和/或状态和/或能将本文中所描述的临床病状的一种或多种症状的水平减轻或抑制到低于观测且接受为该病状的临床诊断水平或临床特征水平的量。施用于受试者的量将取决于欲治疗的病状的具体特征、正治疗的病状的类型和阶段、施用模式和受试者的特征，诸如一般健康状况、其他疾病、年龄、性别、基因型和体重。本领域技术人员将能够依赖于这些和其他因素确定适当的剂量。相应地，这一术语不应被视为将本公开局限于具体的量，例如蛋白质的重量或用量，相反，本公开涵盖足以在受试者中实现所述结果的任何IL-21结合蛋白用量。
如本文中所使用，术语“预防有效量”应被视为意指足以预防或抑制或延迟临床病状的一种或多种可检测症状的发作的量。技术人员将会知道，这样的量将取决于例如所施用的具体IL-21结合蛋白和/或具体的受试者和/或病状的类型或严重程度或水平和/或病状的倾向(基因或其他方面)而变化。相应地，这一术语不应被视为将本公开局限于具体的量，例如IL-21结合蛋白的重量或用量，相反，本公开涵盖足以在受试者中实现所述结果的任何IL-21结合蛋白用量。
对于本文中所描述的IL-21结合蛋白的体内施用来说，正常剂量可以从每天约10ng/kg变化到约100mg/kg个体体重或更高。对于在若干天或更长时间内重复施用来说，取决于欲治疗的疾病或病症的严重程度，治疗可以持续直到实现症状所需的抑制。
在一些实施例中，IL-21结合蛋白以介于约1mg/kg至约30mg/kg之间，诸如约1mg/kg至约10mg/kg或约1mg/kg或约2mg/kg或5mg/kg的初始(或负荷)剂量施用。然后可以用介于约0.01mg/kg至约2mg/kg之间，诸如约0.05mg/kg至约1mg/kg，例如约0.1mg/kg至约1mg/kg，诸如约0.1mg/kg或0.5mg/kg或1mg/kg的较低维持剂量施用IL-21结合蛋白。可以每7-30天，诸如每10-15天，例如每10或11或12或13或14或15天施用所述维持剂量。
在一些实施例中，IL-21结合蛋白以介于约0.01mg/kg至约50mg/kg之间，诸如介于约0.05mg/kg至约30mg/kg之间，例如介于约0.1mg/kg至约20mg/kg之间，例如介于约0.1mg/kg至约10mg/kg之间，诸如介于约0.1mg/kg至约2mg/kg之间的剂量施用。举例来说，IL-21结合蛋白以介于约0.01mg/kg至约5mg/kg之间，诸如介于约0.1mg/kg至约2mg/kg之间，诸如约0.2mg/kg或0.3mg/kg或0.5mg/kg或1mg/kg或1.5mg/kg(例如，非较高负荷剂量或较低维持剂量)的剂量施用。在一些实施例中，施用多次剂量，例如每7-30天，诸如每10-22天，例如每10-15天，例如每10或11或12或13或14或15或16或17或18或19或20或21或22天。举例来说，每7天或每14天或每21天施用IL-21结合蛋白。
在一些实施例中，在开始治疗时，向哺乳动物施用IL-21结合蛋白不超过连续7天或连续6天或连续5天或连续4天。
在不充分应答治疗的哺乳动物的情况下，一周内可以施用多个剂量。替代地或另外，可以施用增加的剂量。
在另一个实施例中，对于经历不良反应的哺乳动物，初始(或负荷)剂量可以拆分在一周内的许多天或连续的许多天。
根据本公开的方法施用IL-21结合蛋白可以是连续的或间歇性的，这取决于例如接受者的生理条件、施用的目的是治疗还是预防、和熟练从业者已知的其他因素。IL-21结合蛋白的施用可以在预定时间段内是基本上连续的，或可以是一系列间隔的剂量，例如在病状发展期间或之后。
试剂盒
本公开另外包括一种试剂盒，其包括以下各项中的一项或多项：
(i)本公开的IL-21结合蛋白或编码其的表达构建体；
(ii)本公开的细胞；
(iii)本公开的复合物；或
(iii)本公开的药物组合物。
在用于检测IL-21的试剂盒的情况下，所述试剂盒可以另外包括检测手段，例如，连接于本公开的IL-21结合蛋白。
在用于治疗性/预防性用途的试剂盒的情况下，所述试剂盒可以另外包括药学上可接受的载剂。
任选地，本公开的试剂盒与用于本文中根据任何实施例所描述的方法的说明书包装在一起。
本公开包括以下非限制性实施例。
实施例
方法
人B细胞增殖测定
根据标准技术从健康人供体分离外周血液单核细胞(PBMC)，并且用CFSE将PBMC染色，然后分选成CD19+CD27-lgD+天然B细胞和CD19+CD27+IgD-记忆B细胞。将所分选的细胞种到培养板中。然后在有或无2P2的情况下用0.5至50ng/ml人IL-21刺激细胞。5天后，经由CFSE稀释或3H胸苷增殖测定来测定细胞增殖。
体内半衰期ELISA测定
为了检测hIL-21/2P2复合物的体内半衰期，用hIL-21/2P2或单独hIL-21对小鼠进行静脉内或皮下注射，其中复合物中的2P2已经使用市售生物素化试剂盒进行了生物素化。在注射后1h、3h、8h和24h之后，对小鼠进行取血并且通过ELISA测量血清中的hIL-21水平。通过用未缀合的3A3涂布培养板，随后阻断并且与血清一起孵育来进行ELISA。随后将培养板与生物素化2P2一起孵育，并且用抗生蛋白链菌素-HRP和TMB底物进行检测。
ELISA测定
为了检测2P2和3A3的表位，大批合成由hIL-21的不同区域组成的肤并且涂布在ELISA培养板上，随后用含3％BSA的PBS阻断非特异性结合位点。随后向各孔中加入生物素化2P2或3A3，并且用抗生蛋白链菌素-HRP和TMB底物显色。
然后测试从前述实验鉴别的表位阻断2P2或3A3与全长hIL-21结合的能力。将全长hIL-21涂布于EIA培养板上，随后用BSA阻断非特异性结合位点。随后用相应的肽对生物素化2P2或3A3进行加标并且在培养板上孵育，随后用TMB底物检测。
实施例1筛选抗IL-21抗体
诸位发明人产生了针对人IL-21(hIL-21)的单克隆抗体库。针对克隆使表达人IL-21受体的原代人B细胞(BaF3细胞)(BaF3-hIL-21R细胞)的细胞增殖增强的能力对其进行筛选(Parrish-NovakJ等(2000)Nature408：57-63)。如图1中所示将各单克隆抗体连续稀释10倍且与2ng/mlhIL-21混合，并且分别与在RPMI-1640培养基中培养的BaF3-hIL-21R细胞一起在含5％CO2的湿润腔室中在37C下孵育。为了进行[3H]标记的胸苷并入测定以测量细胞增殖，使BaF3-huIL-21R细胞在无细胞因子的培养基中饥饿18h，然后在加入1μCi/孔[3H]-胸苷(PerkinElmer，Waltham，MA，USA)的情况下孵育72h，培养的最后18h存在细胞因子。在过滤垫(PerkinElmer)上收集细胞，并且使用TopCountNXT闪烁计数器(PackardBiosciences，Meriden，CT，USA)对并入的放射性核酸进行计数。结果表示为一式三份培养物的平均计数/分钟(CPM)。
如图1中所显示，单克隆抗体2P2以剂量依赖性方式增加BaF3-hIL-21R细胞的增殖。相应地，抗体2P2在IL-21细胞因子存在下显示了对细胞增殖的增强能力，表明所述抗体可以充当人IL-21的激动剂。VH和VL的重链和轻链CDR示于图2中。如通过IMGT编号方案确定的CDR序列加下划线。
实施例2mAB2P2通过IL-21受体增强hIL-21
诸位发明人接下来确定2P2单克隆抗体的增强能力是否对人IL-21受体具有特异性。在0.1、1.0和10.0μg/ml2P2抗体(图3A)和2ng/ml人IL-21的存在下接种原代人BaF3细胞、表达鼠类IL-21受体的BaF3细胞(BaF3-mIL-21R)和表达人IL-21受体的BaF3细(BaF3-hIL-21R)。通过PCR分别从人或小鼠cDNA文库克隆人IL-21R(huIL-21R)和小鼠IL-21R(msIL-21R)的编码序列，测序以匹配NM_021798和NM_021887。为了进行[3H]标记的胸苷并入测定以测量细胞增殖，使Ba/F3-huIL-21R或Ba/F3-mIL-21R细胞在无细胞因子的培养基中饥饿18h，然后在加入1μCi/孔[3H]-胸苷(PerkinElmer，Waltham，MA，USA)的情况下孵育72h，培养的最后18h存在具有所指示浓度的细胞因子。在过滤垫(PerkinElmer)上收集细胞，并且使用TopCountNXT闪烁计数器(PackardBiosciences，Meriden，CT，USA)对并入的放射性核酸进行计数。结果表示为一式三份培养物的平均计数/分钟(CPM)。
结果显示，2P2特异性增加Ba/F3-hIL-21R细胞的增殖而不增加Ba/F3-mIL-21R或Ba/F3细胞的增殖，表明2P2抗体的活性对人IL-21具有特异性，因为它并不增强鼠类IL-21的功能。图3B示出了2P2对Ba/F3-hIL-21R细胞(实心圆)和BaF3-mIL-21R细胞(空心圆)的细胞增殖的影响相对于人IL-12(ng/ml)的图。在10μg/ml2P2的浓度下，人IL-21的生物活性增加超过10倍。然而，在表达鼠类IL-21受体的细胞的存在下对人IL-21的生物活性没有影响。
实施例32P2增强hIL-21介导的人B细胞增殖
使用标记物CD19、CD27、CD4和CD45从健康供体的外周血液单核细胞富集人B细胞。使用流式细胞术根据标准方法测量B细胞增殖。用羧基荧光素琥珀酰亚胺脂(CFSE)标记细胞且在0、0.3、1、5、20和100ng/ml人IL-21的存在下进行孵育。通过流式细胞术测定已经进行了至少一次分裂的细胞的百分比。如图4A中所示，举例来说，在20ng/ml人IL-21下，约67％的人B细胞发生增殖。在图4B中，流式细胞术数据再现为前六个条柱。其余四个条柱示出了在存在5ng/mlIL-21和0、0.01、01和1μg/ml2P2抗体时的增殖的B细胞的百分比。在不存在2P2抗体时5ng/mlhIL-21加1μg/mlmAb2P2显示了与100ng/mlhIL-21类似的生物活性，因此显示mAb2P2使hIL-21的生物活性增加了大约20倍，表明它是有效的IL-21活性激动剂。
实施例42P2增强hIL-21介导的人CD8T细胞活化
在图5中所示的各种浓度的IL-21的存在下孵育人CD8T细胞。在前三张图中，在单独IL-21(2ng/ml和25ng/ml)和IL-21加2P2(分别是2ng/ml和1μg/ml)的存在下孵育细胞。在第二张图中，在单独IL-21(10ng/ml和100ng/ml)和IL-21加2P2(分别是10ng/ml和10μg/ml)的存在下孵育细胞。针对指示CD8T细胞活化的颗粒酶B和穿孔素对细胞进行染色，因为这些细胞毒性分子的表达对抗病毒和抗肿瘤免疫性非常重要。颗粒酶B/穿孔素双阳性细胞的百分比示于右上角象限。图5示出了2ng/mlhIL-21加1μg/mlmAb2P2与单独25ng/mlhIL-21相比对T细胞显示了更佳生物活性(21.89％阳性对比20.29％阳性)且10ng/mlhIL-21加10μg/mlmAb2P2与单独10ng/mlhIL-21相比显示了更佳生物活性(31.70％对比25.77％阳性)，表明mAb2P2使hIL-21生物活性增加了超过10倍。
实施例5单克隆抗体2P2延长hIL-21体内半衰期
根据ELISA测定体内测定hIL-21/2P2和hIL-21/3A3复合物的血清半衰期。用25μghIL-21、25μghIL-21加125μg2P2-生物素；或25μghIL-21加125μg3A3-生物素对野生型小鼠进行静脉内注射。在1、3、8和24h从小鼠面颊取血并且获得了100μl血液。然后在室温下将血液孵育30min以获得血清。对血清中的hIL-21水平的测量是通过ELISA来测定。所述测定的检测极限是1ng/ml。图6示出了在24h内由血清进行的对静脉内(IV)或皮下(SC)施用的hIL-21/2P2复合物的检测。当与单独施用的hIL-12相比时，经由任一种途径施用的2P2在所有测试时间点都引起hIL-21的血清停留时间显著增加。当皮下施用时2P2使hIL-21的血清AUC增加54倍(SC单独IL-21AUC117；SCIL-21/2P2AUC6340)，且当静脉内施用时增加164倍(IV单独IL-21AUC91.36；IVIL-21/2P2AUC14993)。
实施例6抗体2P2增强体内IL-21活性
诸位发明人然后测定2P2是否增强IL-21体内活性。通过用hIL-21受体置换内源性mIL-21受体来产生小鼠品系。这些小鼠没有内源性IL-21细胞因子，并且被称为纯合hIL-21RKI/KI和hIL21KI/KI。所述小鼠具有正常的免疫系统和hIL-21R生理表达，所以它们可以用于体内测试hIL-21和2P2的功能。
小鼠在D0、D2和D4经静脉内注射hIL-21或hIL-21和2P2。处理方案阐述于以下表2中。
表2处理方案
组(n＝3) 处理
1 5μg IL-21
2 25μg IL-21
3 5μg IL-21+125μg 2P2
4 5μg IL-21+125μg 3A3
使用结合人IL-21但不增强IL-21的活性的抗体3A3(市售)作为对照。在D5，将小鼠处死并且收集其脾和淋巴结。发现在hIL-21R敲入小鼠中，施用hIL-21/2P2复合物与单独的重组hIL-21相比使脾扩大了更大程度，表明2P2在体内的免疫刺激功能更佳。
根据标准方案制备单一细胞悬浮液。为了进行B细胞检测，用抗体对细胞悬浮液进行染色，并且通过FACS(流式细胞术LSR2，得自于BD)进行分析。分析B细胞群体如下：
滤泡区(FZ)B细胞-CD3-B220+IgD+；
边缘区(MZ)B细胞-CD3-B220+lgM+CD23-；
过渡B细胞-CD3-B220+lgM+AA4.1+。
结果示于图7(对得自于淋巴结的FZ、MZ和过渡B细胞)和图8(对得自于脾的FZ、MZ和过渡B细胞)中。使用单因素ANOVA(纽曼-科伊尔斯检验)进行统计分析，以分析多个组之间的差异。(GraphpadPrism统计软件(GraphpadSoftwareInc，LaJolla，CAUSA)。结果显示加入2P2显著增加了淋巴结和脾中的过渡B细胞，并且显著增加了淋巴结的边缘区B细胞(表4和表5)。
表4单因数ANOVA概述
表5纽曼-科伊尔斯多重比较检验
实施例7表位细化
诸位发明人然后设法确定人IL-21的哪些残基被2P2抗体结合。图9示出了人IL-21的序列，根据结构模拟研究，预测以粗体表示的残基为被抗体2P2结合的残基，加下划线的残基位于IL-21螺旋区内。诸位发明人产生了如下且如图9中所示的5种hIL-21肽：
肽1(P1，30aa；SEQIDNO19)：FLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANT
肽2(P2，27aa；SEQIDNO20)：AQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPP
肽3(P3，30aa；SEQIDNO4)：IKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYE
肽4(P4，23aa；SEQIDNO21)：PPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYE
肽5(P5，15aa；SEQIDNO22)：PPSTNAGRRQKHRLT
使用ELISA测定来检验抗体2P2和3A3和仅抗生蛋白链菌素-HRP二抗对照与肽P1至P5中的每一种、hTL-21和OVA肽的结合。如图10中所示，抗体2P2结合的肽3最强，随后是肽4和肽5。因此，抗体2P2识别的表位包含9mer至15mer的最小序列，其中核心序列是STNAGRRQK(SEQIDNO23)。还存在序列CPSCD时结合更强，且当存在序列IKKLK、CPSCD和STNAGRRQK时观测到最强结合。在包含序列IKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYE(SEQIDNO4)的肽3的情况下观测到最强结合(概括于图10中)。当预孵育2P2与肽3时，2P2没能结合全长hIL-21(图11A)。预孵育对照抗体3A3与肽3不抑制与全长hIL-21的结合(图11B)。这显示肽3中存在的表位足以实现2P2与hIL-21的结合。
实施例82P2与hIL-21的结合亲和力
在Bio-radXPR36系统上通过直接胺偶合法进行表面等离子体共振结合动力学测定。简言之，使用EDC[N-乙基-N′-(3-二乙基氨基-丙基)碳化二亚胺]和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)的混合物流来活化GLC传感器芯片的细胞表面，随后使25μg/ml抗IL-21mAb流过，然后使用乙醇胺射流来阻断细胞表面上的其余活性位点。之后，使从0到40nM的IL-21连续稀释溶液在细胞表面上流动以结合被固定的抗IL-21mAb分子。在25℃下以30μL/min的流速、3min的缔合时间和6min的解离时间进行结合动力学分析。缓冲液由Hepes、NaCl、tween20和1mg/mLBSA组成，pH7.4。介于循环之间的流通池再生缓冲液是15mM磷酸。使用双参考来处理传感图。对结合曲线与1∶1朗缪尔结合模型(Langmuirbindingmodel)进行全局拟合。
根据n＝5个测量值的平均值，2P2与hIL-21的最终结合亲和力计算为3.0E-09M(表6)。hIL-21与2P2的亲和力在2.47×10-9至4.29×10-9范围内，平均值是3.33×10-9且SD是0.74×10-9。
表6hIL-21/2P2复合物的解离常数
复合物/孔编号 KD(M)
IL-21/2P2，孔1 3.83×10-9
IL-21/2P2，孔2 3.29×10-9
IL-21/2P2，孔3 2.79×10-9
1L-21/2P2，孔4 4.29×10-9
IL-21/2P2，孔5 2.47×10-9

Claims (23)

1.一种包含抗体的抗原结合结构域的IL-21结合蛋白，其中所述抗原结合结构域结合或特异性结合IL-21且增强IL-21活性。
2.如权利要求1所述的IL-21结合蛋白，其中所述IL-21结合蛋白增强IL-21介导的B细胞的体外增殖。
3.如权利要求1或权利要求2所述的IL-21结合蛋白，其中所述IL-21结合蛋白增强IL-21介导的CD8T细胞的体外细胞毒性。
4.如权利要求1至3中任一项所述的IL-21结合蛋白，其中所述IL-21结合蛋白增强IL-21的体内半衰期。
5.如权利要求1至4中任一项所述的IL-21结合蛋白，所述抗原结合结构域结合SEQIDNO：23或SEQIDNO：4中所阐述的表位。
6.一种包含抗体的抗原结合结构域的IL-21结合蛋白，其中所述抗原结合结构域结合或特异性结合IL-21且增强IL-21活性，并且其中所述蛋白质竞争性抑制抗体P2P(包含有包含SEQIDNO：2中所阐述的序列的重链和包含SEQIDNO：3中所阐述的序列的轻链)的结合。
7.一种包含抗体的抗原结合结构域的IL-21结合蛋白，其中所述抗原结合结构域结合或特异性结合IL-21，其中所述抗原结合结构域包含以下各项中的至少一项：
(i)VH，其包含有包含与SEQIDNO：5中所阐述的序列具有至少约80％同一性的序列的互补性决定区(CDR)1、包含与SEQIDNO：6中所阐述的序列具有至少约80％同一性的序列的CDR2和包含与SEQIDNO：7中所阐述的序列具有至少约80％同一性的序列的CDR3；
(ii)VH，其包含与SEQIDNO：2中所阐述的序列具有至少约95％或96％或97％或98％或99％同一性的序列；
(iii)VL，其包含有包含与SEQIDNO：8中所阐述的序列具有至少约80％同一性的序列的CDR1、包含与SEQIDNO：9中所阐述的序列具有至少约80％同一性的序列的CDR2和包含与SEQIDNO：10中所阐述的序列具有至少约80％同一性的序列的CDR3；
(iv)VL，其包含与SEQIDNO：3中所阐述的序列具有至少约95％同一性的序列；
(v)VH，其包含有包含SEQIDNO：5中所阐述的序列的CDR1、包含SEQIDNO：6中所阐述的序列的CDR2和包含SEQIDNO：7中所阐述的序列的CDR3；
(vi)VH，其包含SEQIDNO：2中所阐述的序列；
(vii)VL，其包含有包含SEQIDNO：8中所阐述的序列的CDR1、包含SEQIDNO：9中所阐述的序列的CDR2和包含SEQIDNO：10中所阐述的序列的CDR3；
(viii)VL，其包含SEQIDNO：3中所阐述的序列；
(ix)VH，其包含有包含SEQIDNO：5中所阐述的序列的CDR1、包含SEQIDNO：6中所阐述的序列的CDR2和包含SEQIDNO：7中所阐述的序列的CDR3；和VL，其包含有包含SEQIDNO：8中所阐述的序列的CDR1、包含SEQIDNO：9中所阐述的序列的CDR2和包含SEQIDNO：10中所阐述的序列的CDR3；以及
(x)VH，其包含SEQIDNO：2中所阐述的序列；和VL，其包含SEQIDNO：3中所阐述的序列。
8.如权利要求1至7中任一项所述的IL-21结合蛋白，其至少包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH和所述VL结合以形成包含抗原结合结构域的Fv，其中所述VH和所述VL呈单条多肽链形式或所述VL和所述VH呈单独的多肽链形式。
9.如权利要求8所述的IL-21结合蛋白，其中如果所述VH和所述VL呈单条多肽链形式，则所述蛋白质是：
(i)单链Fv片段(scFv)；
(ii)二聚scFv(di-scFv)；
(iii)与抗体的恒定区、Fc或重链恒定结构域(CH)2和/或CH3连接的(i)或(ii)之一；或
(iv)与结合免疫效应细胞的蛋白质连接的(i)或(ii)之一；或
如果所述VH和所述VL呈单独的多肽链形式，则所述蛋白质是：
(i)双抗体；
(ii)三抗体；
(iii)四抗体；
(iv)Fab；
(v)F(ab′)2；
(vi)Fv；
(vii)与抗体的恒定区、Fc或重链恒定结构域(CH)2和/或CH3连接的(i)至(vi)之一；
(viii)与结合免疫效应细胞的蛋白质连接的(i)至(vi)之一；或
(ix)抗体。
10.一种复合物，其包含如权利要求1至9中任一项所述的IL-21结合蛋白和IL-21多肽。
11.如权利要求1至9中任一项所述的IL-21结合蛋白或如权利要求10所述的复合物，其与另一种化合物缀合。
12.一种核酸，其编码如权利要求1至9中任一项所述的IL-21结合蛋白。
13.一种表达构建体，其包含如权利要求12所述的核酸。
14.一种分离的或重组的细胞，其表达如权利要求1至9中任一项所述的IL-21结合蛋白。
15.一种组合物，其包含如权利要求1至9中任一项所述的IL-21结合蛋白或如权利要求10所述的复合物和药学上可接受的载剂。
16.如权利要求1至9中任一项所述的IL-21结合蛋白或如权利要求10所述的复合物或如权利要求15所述的组合物在医学中的用途。
17.一种用于治疗或预防受试者中的慢性感染、过敏性免疫应答或癌症的方法，所述方法包括施用如权利要求1至9中任一项所述的IL-21结合蛋白或如权利要求10所述的复合物。
18.如权利要求1至9中任一项所述的IL-21结合蛋白或如权利要求10所述的复合物在制造用以治疗或预防慢性感染、过敏性免疫应答或癌症的药物方面的用途。
19.如权利要求1至9中任一项所述的IL-21结合蛋白或如权利要求10所述的复合物或如权利要求15所述的组合物，其用于治疗慢性感染、过敏性免疫应答或癌症。
20.如权利要求16至18中任一项所述的用途或方法，其中所述IL-21结合蛋白与一种或多种免疫治疗化合物组合施用，
21.根据权利要求20所述的用途或方法，其中所述免疫治疗化合物选自检查点抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、肿瘤坏死因子受体抑制剂、细胞因子或白介素；干扰素；粒细胞巨噬细胞集落刺激因子；疫苗(癌症疫苗或传染病)；抗病毒药物或溶瘤病毒。
22.如权利要求21所述的用途或方法，其中所述检查点抑制剂是程序性死亡蛋白1(PD1)、程序性死亡配体1(PDL1)或程序性死亡配体2(PDL2)、分化簇80(CD80)、分化簇80(CD86)、B7相关蛋白1(B7RP1)、分化簇276(CD276)、分化簇274(CD274)、疱疹病毒进入介体(HVEM)、分化簇配体(CD137L)、肿瘤坏死因子受体超家族成员4配体(OX40L)、分化簇(CD70)、分化簇(CD40)、半乳糖凝集素9(GAL9)、分化簇28(CD28)、细胞毒性T淋巴细胞活化因子-4(CTLA4)、可诱导T细胞共刺激因子(ICOS)、B和T淋巴细胞弱化因子(BTLA)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、TCR、淋巴细胞活化基因3(LAG3)、死亡受体5(DR5)、分化簇137(CD137)、肿瘤坏死因子受体超家族成员42(OX40)、分化簇27(CD27)、分化簇40配体(CD40L)、腺苷酸A2a受体(AZaR)或TIM3(T细胞免疫球蛋白-3)的抑制剂。
23.一种培养、扩增包含免疫系统前体细胞的细胞群体的方法，所述方法包括在本公开的IL-21结合蛋白或复合物存在下体外或离体培养所述细胞群体。
CN201480037182.8A 2013-06-27 2014-06-27 Il-21结合蛋白和其用途 Expired - Fee Related CN105579470B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2013902377A AU2013902377A0 (en) 2013-06-27 A super-agonist monoclonal antibody to human IL-21 and its application in immunomodulation
AU2013902377 2013-06-27
PCT/AU2014/000673 WO2014205501A1 (en) 2013-06-27 2014-06-27 Il-21 binding proteins and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105579470A true CN105579470A (zh) 2016-05-11
CN105579470B CN105579470B (zh) 2021-05-25

Family

ID=52140667

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201480037182.8A Expired - Fee Related CN105579470B (zh) 2013-06-27 2014-06-27 Il-21结合蛋白和其用途

Country Status (8)

Country Link
US (3) US10077301B2 (zh)
EP (1) EP3013858B1 (zh)
JP (1) JP6563389B2 (zh)
CN (1) CN105579470B (zh)
AU (1) AU2014302028B2 (zh)
CA (1) CA2915882C (zh)
ES (1) ES2898650T3 (zh)
WO (1) WO2014205501A1 (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6563389B2 (ja) 2013-06-27 2019-08-21 モナッシュ ユニバーシティ Ｉｌ−２１結合タンパク質及びその使用
WO2016094962A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 Monash University Il-21 antibodies
IL260083B2 (en) * 2016-01-12 2023-09-01 Univ Chiba Nat Univ Corp Antibody against myl9
CN111491655A (zh) 2017-08-07 2020-08-04 加利福尼亚大学董事会 用于生成安全细胞治疗剂的平台
WO2022117569A1 (en) 2020-12-02 2022-06-09 Oncurious Nv A ccr8 antagonist antibody in combination with a lymphotoxin beta receptor agonist antibody in therapy against cancer
EP4263600A1 (en) 2020-12-18 2023-10-25 Century Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptor systems with adaptable receptor specificity

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2005244942A1 (en) * 2004-05-19 2005-12-01 Wyeth Modulation of immunoglobulin production and atopic disorders
WO2006105538A2 (en) * 2005-03-31 2006-10-05 Centocor, Inc. Methods and compositions for treating il-21 related pathologies
CN102027011A (zh) * 2007-12-07 2011-04-20 津莫吉尼蒂克斯公司 抗人il-21单克隆抗体
WO2012164021A1 (en) * 2011-05-31 2012-12-06 Novo Nordisk A/S Il-21 epitope and il-21 ligands

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6309636B1 (en) * 1995-09-14 2001-10-30 Cancer Research Institute Of Contra Costa Recombinant peptides derived from the Mc3 anti-BA46 antibody, methods of use thereof, and methods of humanizing antibody peptides
US7973139B2 (en) 2004-03-26 2011-07-05 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies against nogo receptor
ITRM20040586A1 (it) 2004-11-29 2005-02-28 Giuliani Spa Epitopi antigenici dell'interleuchina-21, anticorpi relativi e loro uso in campo medico.
PT1963369E (pt) 2005-11-28 2013-05-28 Zymogenetics Inc Antagonistas de il-21
WO2007109742A2 (en) 2006-03-21 2007-09-27 Weaver David T Methods for humanizing antibodies and humanized antibodies made thereby
US20080267910A1 (en) * 2007-03-09 2008-10-30 Wu Paul W Rat, rabbit, and cynomolgus monkey IL-21 and IL-22 nucleotide and polypeptide sequences
WO2009100035A2 (en) 2008-02-01 2009-08-13 Wyeth Interleukin-21 (il-21) and il-21 receptor (il-21r) modulation of regulatory t cells and forkhead box p3 (foxp3)
JP6563389B2 (ja) 2013-06-27 2019-08-21 モナッシュ ユニバーシティ Ｉｌ−２１結合タンパク質及びその使用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2005244942A1 (en) * 2004-05-19 2005-12-01 Wyeth Modulation of immunoglobulin production and atopic disorders
WO2006105538A2 (en) * 2005-03-31 2006-10-05 Centocor, Inc. Methods and compositions for treating il-21 related pathologies
CN102027011A (zh) * 2007-12-07 2011-04-20 津莫吉尼蒂克斯公司 抗人il-21单克隆抗体
WO2012164021A1 (en) * 2011-05-31 2012-12-06 Novo Nordisk A/S Il-21 epitope and il-21 ligands

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
H. SØNDERGAARD等: "IL-21: roles in immunopathology and cancer therapy", 《TISSUE ANTIGENS》 *
PAUL J. CARTER: "Potent antibody therapeutics by design", 《NATURE REVIEWS IMMUNOLOGY》 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20160145332A1 (en) 2016-05-26
US20210002362A1 (en) 2021-01-07
WO2014205501A1 (en) 2014-12-31
US20190071497A1 (en) 2019-03-07
EP3013858B1 (en) 2021-07-28
EP3013858A4 (en) 2017-01-25
CA2915882A1 (en) 2014-12-31
CA2915882C (en) 2022-12-06
JP6563389B2 (ja) 2019-08-21
US10787510B2 (en) 2020-09-29
CN105579470B (zh) 2021-05-25
AU2014302028A1 (en) 2016-01-21
JP2016529213A (ja) 2016-09-23
EP3013858A1 (en) 2016-05-04
ES2898650T3 (es) 2022-03-08
AU2014302028B2 (en) 2019-09-19
US10077301B2 (en) 2018-09-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7212821B2 (ja) 抗ｌａｇ－３抗体および組成物
JP7043685B2 (ja) ヒト化抗ヒトｐｄ－１抗体
JP2019033743A (ja) インターロイキン−２１ムテイン及び治療方法
CN111727197A (zh) 抗pd-1抗体和治疗方法
US20210002362A1 (en) Il-21 binding proteins and uses thereof
JP2023145487A (ja) 抗ｔｉｍ－３抗体のための投与レジメンおよびその使用
CN113573782A (zh) 针对人pd-1的双功能分子
CN113614109A (zh) 双功能抗pd-1/il-7分子
CN105473615A (zh) 抗-CD38抗体和与致弱干扰素α-2B的融合体
CN113574067A (zh) 双功能抗PD-1/SIRPα分子
US20210244825A1 (en) Il-21 antibodies
JP2022101631A (ja) 抗ｐｄ‐ｌ１抗体とｉｌ‐７との融合
JP2022523197A (ja) Ｔ細胞関連のがん細胞に結合する多機能性分子およびその使用
EA039598B1 (ru) Соединение, нацеленное на ил-23а и фно-альфа, и его применение
US20240247047A1 (en) BTLA Fusion Protein Agonists and Uses Thereof
CN107531784A (zh) 通过多特异性抗体超强力地中和细胞因子和其用途
CN115443151A (zh) 用于癌症治疗的抗cd137抗原结合分子
TW202104261A (zh) 三特異性結合蛋白、方法及其用途
TW202144420A (zh) 一種免疫細胞啟動劑的開發及應用
TWI853077B (zh) 新型抗ｃｄ３９抗體

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20210525