ES2898650T3

ES2898650T3 - Proteínas de unión a IL-21 y usos de las mismas

Info

Publication number: ES2898650T3
Application number: ES14817437T
Authority: ES
Inventors: Charles Reay Mackay; Di Yu
Original assignee: Monash University
Current assignee: Monash University
Priority date: 2013-06-27
Filing date: 2014-06-27
Publication date: 2022-03-08
Anticipated expiration: 2034-06-27
Also published as: JP6563389B2; CN105579470B; EP3013858B1; EP3013858A1; US20210002362A1; AU2014302028A1; JP2016529213A; US10787510B2; US20190071497A1; CA2915882A1; CA2915882C; AU2014302028B2; EP3013858A4; US10077301B2; US20160145332A1; WO2014205501A1; CN105579470A

Abstract

Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo, en el que el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo se une a IL-21 y mejora la actividad de IL-21, y en donde el dominio de unión a antígeno del anticuerpo o del fragmento de unión a antígeno del mismo comprende: (i) una región variable de cadena pesada (VH) que comprende una región determinante de complementariedad (CDR) 1 que comprende la secuencia establecida en SEQ ID NO: 5, una CDR2 que comprende la secuencia establecida en SEQ ID NO: 6 y una CDR3 que comprende la secuencia establecida en SEQ ID NO: 7; y una región variable de cadena ligera (VL) que comprende una CDR1 que comprende la secuencia establecida en SEQ ID NO: 8, una CDR2 que comprende la secuencia establecida en SEQ ID NO: 9 y una CDR3 que comprende la secuencia establecida en SEQ ID NO: 10; o (ii) una VH que comprende una CDR1 que comprende la secuencia establecida en SEQ ID NO: 11, una CDR2 que comprende la secuencia establecida en SEQ ID NO: 12 y una CDR3 que comprende la secuencia establecida en SEQ ID NO: 13; y una VL que comprende una CDR1 que comprende la secuencia establecida en SEQ ID NO: 14, una CDR2 que comprende la secuencia establecida en SEQ ID NO: 15 y la CDR3 que comprende la secuencia establecida en SEQ ID NO: 16.

Description

DESCRIPCIÓN

Proteínas de unión a IL-21 y usos de las mismas

Datos de solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica la prioridad de la solicitud de la patente provisional Australiana No. 2013902377 titulada "A super-agonist monoclonal antibody to human IL-21 and its application in immunomodulation" presentada el 27 de junio de 2013.

Campo

La presente divulgación se refiere a proteínas que comprenden sitios de unión a antígeno de anticuerpos que se unen a interleucina-21 (IL-21) y usos de las mismas, por ejemplo, en terapia.

Listado de secuencias

La presente solicitud se presenta con un listado de secuencias en formato electrónico. El listado de secuencias constituye parte de la descripción de la especificación.

Antecedentes

Las citocinas generalmente estimulan la proliferación o diferenciación de células del linaje hematopoyético o participan en los mecanismos de respuesta inmune e inflamatoria del cuerpo. Las interleucinas son una familia de citocinas que median las respuestas inmunológicas. El centro de una respuesta inmune es la célula T, que produce muchas citocinas y afecta la inmunidad adaptativa a los antígenos. Las citocinas producidas por la célula T se han clasificado como TH1 y TH2. Las citocinas de tipo 1 incluyen IL-2, IFN-y, LT-a y están implicadas en respuestas inflamatorias, inmunidad viral, inmunidad intracelular de parásitos y rechazo de aloinjertos. Las citocinas de tipo 2 incluyen IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 e IL-13, y están implicadas en las respuestas humorales, la inmunidad a los helmintos y la respuesta alérgica. Las citocinas compartidas entre los tipos 1 y 2 incluyen IL-3, GM-CSF y TNF-a. Existe alguna evidencia que sugiere que las poblaciones de células T productoras de Tipo 1 y Tipo 2 migran preferentemente a diferentes tipos de tejido inflamado.

Las células asesinas naturales (NK) tienen una célula progenitora común con las células T y las células B, y desempeñan un papel en la supervisión inmunológica. Las células NK, que comprenden hasta el 15% de los linfocitos sanguíneos, no expresan receptores de antígenos y son un componente de la inmunidad innata. Las células NK están implicadas en el reconocimiento y la destrucción de células tumorales y células infectadas por virus. In vivo, se cree que las células NK requieren activación, sin embargo, in vitro, se ha demostrado que las células NK destruyen algunos tipos de células tumorales sin activación.

Se ha demostrado que IL-21 es un potente modulador de células T citotóxicas y células NK. Se ha demostrado que la IL-21 co-estimula la expansión de las células NK y se ha demostrado que potencia las funciones efectoras de estas células. Las respuestas de las células T incluyen la mejora de la respuesta del antígeno primario como modulación de las funciones de las células T de memoria.

Se ha demostrado que los ratones IL-21 R knock-out expresan niveles más altos de IgE y niveles más bajos de IgG1 que los ratones normales después de la exposición al antígeno. Los niveles de IgE disminuyeron después de que se inyectara IL-21 a los ratones. Esto tiene implicaciones para el papel de la IL-21 en el control de las respuestas alérgicas debido al papel de la IgE en las respuestas de hipersensibilidad de tipo 1.

Se ha probado la IL-21 como terapia para aliviar las respuestas alérgicas. Se demostró que tiene éxito en la disminución de las citocinas proinflamatorias producidas por las células T, además de disminuir los niveles de IgE en un modelo de ratón para la rinitis (inflamación de las vías nasales). Esto tiene fuertes implicaciones para el desarrollo farmacológico de IL-21 para el control de alergias tanto localizadas como sistémicas.

El papel de la IL-21 en la modulación de la programación de diferenciación de las células T humanas fue reportado por primera vez por Li et al (Journal of immunology 175 (4): 2261-9 (2005)), donde se demostró que enriquece para una población de CTL de tipo memoria central con un fenotipo CD28 CD127hi CD45RO único con capacidad de producción de IL-2. Los CTL específicos de antígenos reactivos al tumor generados por cebado en presencia de IL-21 condujeron a un fenotipo estable, "auxiliar independiente".

La IL-21 fue aprobada para ensayos clínicos de fase 1 en pacientes con melanoma metastásico (MM) y carcinoma de células renales (RCC). Se demostró que es seguro para la administración con síntomas similares a los de la gripe como efectos secundarios. Las toxicidades limitantes de la dosis incluyeron recuento bajo de linfocitos, neutrófilos y trombocitos, así como hepatotoxicidad. Según la escala de respuesta Response Evaluation Criteria in Solid Tumors (RECIST), 2 de 47 pacientes con MM y 4 de 19 pacientes con RCC mostraron respuestas completas y parciales, respectivamente. Además, hubo un aumento de mRNA de perforina, granzima B, IFN-y y CXCR3 en células NK periféricas y células T CD8+. Esto sugirió que la IL-21 mejora las funciones efectoras de CD8+, lo que conduce a una respuesta antitumoral. La IL-21 pasó a los ensayos de fase clínica 2 en los que se administró sola o combinada con fármacos como sorafinib y rituximab.

La IL-21 también puede ser un factor crítico en el control de infecciones virales persistentes. Los ratones Knock-out IL-21 (o IL-21 R) infectados con LCMV crónico (virus de la coriomeningitis linfocítica) no pudieron superar la infección crónica en comparación con los ratones normales. Además, estos ratones con alteración de la señalización de IL-21 tuvieron un agotamiento más dramático de las células T CD8+ específicas de LCMV, lo que sugiere que la IL-21 producida por las células T CD4+ es necesaria para la actividad efectora sostenida de las células T CD8+ y después, para mantener la inmunidad para resolver la infección viral persistente. Por tanto, la IL-21 puede contribuir al mecanismo por el cual las células T CD4+ auxiliares organizan la respuesta del sistema inmunológico a las infecciones virales.

En sujetos infectados por el HIV, se ha reportado que la IL-21 mejora críticamente las respuestas de las células T citotóxicas específicas del HIV y las funciones de las células NK. También se ha demostrado que las células T CD4 específicas del HIV de los "controladores del HIV" (individuos raros que no progresan al AIDS controlando la replicación del virus sin tratamiento) son capaces de producir significativamente más IL-21 que las de los progresores. Además, las células T CD8 específicas del virus que producen IL-21 también se encontraron preferentemente en los controladores del HIV. Estos datos y el hecho de que las células CD8 o NK estimuladas por IL-21 pueden inhibir la replicación viral del HIV in vitro muestran que esta citoquina podría ser potencialmente útil para terapias anti-HIV.

Se han desarrollado anticuerpos monoclonales dirigidos contra IL-21, sin embargo, se ha demostrado que estos anticuerpos antagonizan o inhiben la función de IL-21. Estos anticuerpos antagonistas son útiles para suprimir los trastornos inflamatorios. Hasta la fecha no ha habido publicaciones sobre el desarrollo de anticuerpos que disminuyen o potencian la actividad de IL-21.

El documento de Patente WO 2009/100035 A2 se refiere a métodos para modular el nivel y la actividad de Tregs y Foxp3 usando moduladores de IL-21/IL-21 R, y se dice que describe agonistas de IL-21, agonistas de IL-21R, antagonistas de IL-21 y antagonistas de IL-21 R y su uso para mejorar la inmunidad o inducir la inmunosupresión in vivo, ex vivo y/o in vitro, por ejemplo, para tratar, mejorar o prevenir trastornos autoinmunitarios o inflamatorios, cánceres y trastornos infecciosos.

El documento de Patente WO 2006/105538 A2 se refiere a métodos para tratar al menos una afección o patología relacionada con IL-21, que incluyen composiciones, métodos y dispositivos terapéuticos, en los que dicho patólogo implica el aumento en la producción de IgE o el cambio de isotipo de IgE.

El documento de Patente WO 2005/112983 A2 se refiere a un polipéptido de IL-21 u otro agonista de la vía de IL-21 que se dice que se usa para tratar trastornos atópicos, por ejemplo, asma.

Sondergaard et al (2009) Tissue Antigens, 74 (6): 467-479 es un artículo de revisión que se refiere a los papeles de la IL-21 en la inmunoterapia y la terapia del cáncer.

Resumen

Los presentes inventores han generado un anticuerpo que se une a IL-21 y potencia la actividad de IL-21. Por tanto, los presentes inventores han desarrollado, por primera vez, un anticuerpo que funciona como un agonista de IL-21.

La invención actualmente reivindicada es como se define en las reivindicaciones. Para evitar dudas, en la medida en que el tema en cuestión mencionado aquí no entre dentro de la invención reivindicada en la actualidad, se incluye simplemente con fines de referencia.

Por tanto, un primer aspecto de la presente invención proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a IL-21 y mejora la actividad de IL-21, y en el que el dominio de unión a antígeno del anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno del mismo, comprende: (i) una región variable de cadena pesada (V^h) que comprende una región determinante de complementariedad (CDR) 1 que comprende la secuencia establecida en SEQ ID NO: 5, una CDR2 que comprende la secuencia establecida en SEQ ID NO: 6 y una CDR3 que comprende la secuencia establecida en SEQ ID NO: 7; y una región variable de cadena ligera (V^l) que comprende una CDR1 que comprende la secuencia establecida en SEQ ID NO: 8, una CDR2 que comprende la secuencia establecida en SEQ ID NO: 9 y una CDR3 que comprende la secuencia establecida en SEQ ID NO: 10; o (ii) una V^hque comprende una CDR1 que comprende la secuencia establecida en SEQ ID NO: 11, una CDR2 que comprende la secuencia establecida en SEQ ID NO: 12 y una CDR3 que comprende la secuencia establecida en SEQ ID NO: 13; y una V^lque comprende una CDR1 que comprende la secuencia establecida en SEQ ID NO: 14, una CDR2 que comprende la secuencia establecida en SEQ ID NO: 15 y la CDR3 que comprende la secuencia establecida en s Eq ID NO: 16.

En un ejemplo, la presente divulgación proporciona una proteína de unión a IL-21 que comprende un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo, el dominio de unión a antígeno se une a o se une específicamente a IL-21 y mejora la actividad de IL-21.

En un ejemplo, la proteína de unión a IL-21 mejora la proliferación de células B mediada por IL-21 in vitro o in vivo.

En otro ejemplo, la proteína de unión a IL-21 mejora la citotoxicidad de células T CD8+ mediada por IL-21 in vitro o in vivo.

En otro ejemplo, la proteína de unión a IL-21 mejora la proliferación de células NK mediada por IL-2.

En un ejemplo, la proteína de unión a IL-21 es un agonista de IL-21.

En otro ejemplo, la proteína de unión a IL-21 mejora la vida media de IL-21 in vivo. Por ejemplo, la proteína de unión a IL-21 puede mejorar la vida media de IL-21 in vivo de horas a días. En un ejemplo, la proteína de unión a IL-21 mejora la vida media de IL-21 in vivo durante al menos 24 horas.

En otro ejemplo, la actividad de IL-21 se mejora al menos cinco veces en comparación con la actividad de IL-21 en ausencia de la proteína de unión a IL-21.

La presente divulgación proporciona adicional o alternativamente una proteína de unión a IL-21 que comprende un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo, en el que el dominio de unión a antígeno se une a o se une específicamente a un epítopo de IL-21 que comprende la secuencia STNAGRRQK (SEQ ID N0: 23). En otro ejemplo, la IL-21 se une a o se une específicamente a un epítopo que comprende la secuencia PPSTNAGRRQKHRLT como se establece en SEQ ID NO: 19. En otro ejemplo, la proteína de unión a IL-21 se une a o se une específicamente a un epítopo de IL-21 que comprende la secuencia PPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYE como se establece en SEQ ID NO: 20. En otro ejemplo, la proteína de unión a IL-21 se une a, o se une específicamente a un epítopo de IL-21 que comprende la secuencia IKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYE establecida en SEQ ID NO: 4.

La presente divulgación proporciona adicional o alternativamente una proteína de unión a IL-21 que comprende un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo, en el que el dominio de unión a antígeno se une a o se une específicamente a IL-21 y en el que la proteína inhibe de manera competitiva la unión del anticuerpo 2P2 (que comprende un V^hque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 2 y un V^lque comprende una secuencia establecida en SeQ ID NO: 3) a IL-21.

En un ejemplo, la proteína de unión a IL-21 inhibe de manera competitiva la unión del anticuerpo 2P2 a una secuencia de epítopo establecida en SEQ ID NO: 19, 20 o 4.

En un ejemplo, la proteína de unión a IL-21 se une a o se une específicamente a la IL-21 de mamífero (hIL-21). En otro ejemplo, la proteína de unión a IL-21 se une a o se une específicamente a la IL-21 humana. En un ejemplo adicional, la proteína de unión a IL-21 se une a, o se une específicamente a, IL-21 de gato o perro.

En un ejemplo, la proteína de unión a IL-21 no se une de forma detectable a la IL-21 de ratón.

En un ejemplo, la proteína de unión a IL-21 tiene una constante de afinidad (K^d) para IL-21 de mamífero o hIL-21 de aproximadamente 9x10-9 M o menos. Por ejemplo, la K^des aproximadamente 8x10-9 M o menos o aproximadamente 7x10-9 M o menos o aproximadamente 6x10-9 M o menos o aproximadamente 5x10-9 M o menos. En un ejemplo, la K^des aproximadamente 4.8x10-9 M o menos.

En otro ejemplo, la proteína de unión a IL-21 tiene una constante de afinidad (K^d) para IL-21 de mamífero o hIL-21 de aproximadamente 2x10-9 M o menos. Por ejemplo, la K^des aproximadamente 1 x10-9 M o menos o aproximadamente 9x10-10 M o menos o aproximadamente 8x10-10 M o menos o aproximadamente 7x10-10 M o menos. En un ejemplo, la K^des aproximadamente 5x10-10 M o menos. En un ejemplo, la K^des 4x10-10 M o menos. En un ejemplo, la K^des aproximadamente 3x10-10 M o menos. En un ejemplo, la K^des aproximadamente 2x10-10 M o menos. En un ejemplo, la K^des aproximadamente 1.5x10-10 M o menos.

En un ejemplo, en relación con cada uno de los ejemplos anteriores, la K^dpuede ser 0.1x10-12 M o más o 1x10-12 M o más.

En un ejemplo, la K^dse evalúa usando un biosensor, por ejemplo, mediante resonancia de plasmón de superficie. Por ejemplo, la proteína de unión a IL-21 se inmoviliza y se determina el nivel de unión a hIL-21 o IL-21 de mamífero.

La presente divulgación proporciona adicional o alternativamente una proteína de unión a IL-21 que comprende un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo, en el que el dominio de unión a antígeno se une a o se une específicamente a IL-21, en el que el dominio de unión a antígeno comprende al menos uno de:

(i) una V^hque comprende una región determinante de complementariedad (CDR) 1 que comprende una secuencia al menos aproximadamente 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 92%, al menos 95%, al menos 97%, al menos 99% idéntica a una secuencia establecida en SEQ ID NO: 5, una CDR2 que comprende una secuencia al menos aproximadamente 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 92%, al menos 95%, al menos 97%, al menos 99% idéntica a una secuencia establecida en SEQ ID NO: 6 y una CDR3 que comprende una secuencia al menos aproximadamente 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 92%, al menos 95%, al menos 97%, al menos 99% idéntica a una secuencia establecida en SEQ ID NO: 7;

(ii) una V^hque comprende una secuencia al menos aproximadamente 95% o 96% o 97% o 98% o 99% idéntica a una secuencia establecida en SEQ ID NO: 2;

(iii) una V^lque comprende una CDR1 que comprende una secuencia al menos aproximadamente 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 92%, al menos 95%, al menos 97%, al menos 99% idéntica a una secuencia establecida en SEQ ID NO: 8, una CDR2 que comprende una secuencia al menos aproximadamente 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 92%, al menos 95%, al menos 97%, al menos 99% idéntica a una secuencia establecida en SEQ ID NO: 9 y una CDR3 que comprende una secuencia al menos aproximadamente 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 92%, al menos 95%, al menos 97%, al menos 99% idéntica a una secuencia establecida en SEQ ID NO: 10; (iv) una V^lque comprende una secuencia al menos aproximadamente un 95% idéntica a una secuencia establecida en SEQ ID NO: 3;

(v) una V^hque comprende una CDR1 que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 5, una CDR2 que comprende una secuencia establecida entre SEQ ID NO: 6 y una CDR3 que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 7;

(vi) una VH que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 2;

(vii) una V^lque comprende una CDR1 que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 8, una CDR2 que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 9 y una CDR3 que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 10;

(viii) una V^lque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 3;

(ix) una V^hque comprende una CDR1 que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 5, una CDR2 que comprende una secuencia establecida entre SEQ ID NO: 6 y una CDR3 que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 7; y una V^lque comprende una CDR1 que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 8, una CDR2 que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 9 y una CDR3 que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 10; y

(x) una V^hque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 2 y un V^lque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 3.

En un ejemplo, las diferencias entre la secuencia mencionada y la proteína de unión a IL-21 son sustituciones. El experto en la materia será capaz de determinar sitios para sustituciones en una proteína de unión a IL-21 de la divulgación, por ejemplo, dentro de una región marco de una proteína que contiene una región variable.

La presente divulgación también proporciona una proteína de unión a IL-21 que comprende un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo, en el que el dominio de unión a antígeno se une a o se une específicamente a IL-21 y mejora la señalización de IL-21 y en el que el dominio de unión a antígeno comprende una V^hque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 2 y una V^lque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 3. En un ejemplo, una proteína de unión a IL-21 descrita en la presente memoria comprende al menos una V^hy una V^l, en la que la V^hy V^lse unen para formar un Fv que comprende un dominio de unión a antígeno. El experto en la materia comprenderá que el dominio de unión al antígeno comprende el sitio de unión del anticuerpo.

En un ejemplo, la V^hy la V^lestán en una sola cadena polipeptídica. Por ejemplo, la proteína es:

(i) un fragmento Fv monocatenario (scFv);

(ii) un scFv dimérico (di-scFv);

(iii) uno de (i) o (ii) unido a una región constante de un anticuerpo, Fc o un dominio constante de cadena pesada (CH) 2 y/o C^h3; o

(iv) uno de (i) o (ii) unido a una proteína que se une a una célula efectora inmunitaria.

En un ejemplo, la V^ly V^hestán en cadenas polipeptídicas separadas.

Por ejemplo, la proteína es:

(i) un diacuerpo;

(ii) un triacuerpo;

(iii) un tetracuerpo;

(iv) un Fab;

(v) una F (ab')²;

(vi) un Fv;

(vii) uno de (i) a (vi) unido a una región constante de un anticuerpo, Fc o un dominio constante de cadena pesada (C^h) 2 y/o C^h3;

(viii) uno de (i) a (vi) unido a una proteína que se une a una célula efectora inmunitaria.

Las proteínas anteriores también pueden denominarse dominios de unión a antígenos de anticuerpos.

En un ejemplo, la proteína es un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal. En un ejemplo, el anticuerpo es un anticuerpo desnudo.

En un ejemplo, una proteína (o anticuerpo) es quimérica, des-inmunizada, humanizada, humana o primatizada.

En un ejemplo, la proteína o el anticuerpo es humano.

En un ejemplo, las secuencias de la región determinante de complementariedad (CDRs) se definen según el sistema de numeración de Kabat.

En otro ejemplo, las CDRs se definen según el sistema de numeración IMGT.

La referencia en la presente memoria a una proteína o anticuerpo que "se une a" IL-21 proporciona un soporte literal para una proteína o anticuerpo que "se une específicamente a" o "se une de manera específica a" IL-21.

La presente divulgación también proporciona dominios de unión a antígenos o fragmentos de unión a antígenos de los anticuerpos anteriores.

En un ejemplo, una proteína o anticuerpo como se describe en la presente memoria comprende una región constante humana, por ejemplo, una región constante de IgG, tal como una región constante de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 o mezclas de las mismas. En el caso de un anticuerpo o proteína que comprenda una V^hy una V^l, la V^hpuede estar unida a una región constante de cadena pesada y la VL se puede unir a una región constante de cadena ligera.

La lisina C-terminal de la región constante de cadena pesada de un anticuerpo completo (o una proteína de unión a IL-21 que comprende una región constante o una C^h3) de la divulgación se puede eliminar, por ejemplo, durante la producción o purificación del anticuerpo o proteína, o mediante ingeniería recombinante del ácido nucleico que codifica una cadena pesada del anticuerpo. En consecuencia, los anticuerpos completos (o proteínas de unión a IL-21) pueden comprender poblaciones con todos los restos de lisina C-terminal eliminados, poblaciones sin restos de lisina C-terminal eliminados y/o poblaciones que tienen una mezcla de proteínas con y sin el resto de lisina C- terminal. En algunos ejemplos, las poblaciones pueden comprender adicionalmente una proteína en la que el resto de lisina C-terminal se elimina en una de las regiones constantes de cadena pesada. De manera similar, una composición de anticuerpos completos puede comprender la misma o una mezcla similar de poblaciones de anticuerpos con o sin el resto de lisina C-terminal.

En un ejemplo, una proteína o anticuerpo como se describe en la presente memoria comprende una región constante de un anticuerpo IgG4 o una región constante estabilizada de un anticuerpo IgG4. En un ejemplo, la proteína o el anticuerpo comprenden una región constante de IgG4 con una prolina en la posición 241 (según el sistema de numeración de Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest Washington DC United States Department of Health and Human Services, 1987 y/o 1991)).

En un ejemplo, una proteína o anticuerpo como se describe en la presente memoria o una composición de una proteína o anticuerpo como se describe en la presente memoria, comprende una región constante de cadena pesada, que incluye una región constante de cadena pesada estabilizada, que comprende una mezcla de secuencias total o parcialmente con o sin el resto de lisina C-terminal.

En un ejemplo, un anticuerpo de la divulgación comprende una V^hdescrita en la presente memoria unida o fusionada a una región constante de IgG4 o región constante de IgG4 estabilizada (por ejemplo, como se discutió anteriormente) y la VL se une o fusiona a una región constante de cadena ligera kappa.

Las características funcionales de una proteína de unión a IL-21 de la divulgación se considerarán aplicables mutatis mutandis a un anticuerpo de la divulgación.

En un ejemplo, una proteína o anticuerpo de unión a IL-21 como se describe en la presente memoria se aísla y/o se recombina.

En un ejemplo, una proteína o anticuerpo de unión a IL-21 de la divulgación se conjuga con otro compuesto, por ejemplo, un marcador detectable o un compuesto que alarga la vida media de la proteína o anticuerpo, tal como polietilenglicol o una proteína de unión a albúmina. En la presente memoria se describen otros compuestos adecuados.

La presente divulgación también proporciona un ácido nucleico que codifica la proteína o el anticuerppo de unión a IL-21 de la presente divulgación o un polipéptido del mismo.

La presente divulgación proporciona adicional o alternativamente una proteína de unión a IL-21 que comprende un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo, en el que el dominio de unión a antígeno se une a o se une específicamente a IL-21, en el que el dominio de unión a antígeno está codificado por la secuencia de ácido nucleico que comprende en al menos uno de:

(i) una V^hque comprende una secuencia al menos aproximadamente 95% o 96% o 97% o 98% o 99% idéntica a una secuencia establecida en SEQ ID NO: 17;

(ii) una V^lque comprende una secuencia al menos aproximadamente 95% o 96% o 97% o 98% o 99% idéntica a una secuencia establecida en SEQ ID NO: 18;

(iii) una V^hque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 17;

(iv) una V^lque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 18; y

(v) una V^hque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 17 y una V^lque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 18.

En un ejemplo, dicho ácido nucleico se incluye en un constructo de expresión en el que el ácido nucleico está operativamente unido a un promotor. Dicho constructo de expresión puede estar en un vector, por ejemplo, un plásmido. En ejemplos de la divulgación dirigidos a proteínas de unión a IL-21 de cadena polipeptídica simple, el constructo de expresión puede comprender un promotor unido a un ácido nucleico que codifica esa cadena polipeptídica.

En ejemplos dirigidos a cadenas polipeptídicas múltiples que forman una proteína de unión a IL-21, un constructo de expresión comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende, por ejemplo, una V^hoperativamente unida a un promotor y un ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende, por ejemplo, una V^loperativamente unida a un promotor.

En otro ejemplo, el constructo de expresión es un constructo de expresión bicistrónico, por ejemplo, que comprende los siguientes componentes unidos operativamente en orden de 5' a 3':

(i) un promotor

(ii) un ácido nucleico que codifica un primer polipéptido;

(iii) un sitio de entrada de ribosoma interno; y

(iv) un ácido nucleico que codifica un segundo polipéptido,

en donde el primer polipéptido comprende una V^hy el segundo polipéptido comprende una V^l, o viceversa.

La presente divulgación también contempla constructos de expresión separados, uno de las cuales codifica un primer polipéptido que comprende una V^hy otro de los cuales codifica un segundo polipéptido que comprende una V^l. Por ejemplo, la presente divulgación también proporciona una composición que comprende:

(i) un primer constructo de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende una V^hunida operativamente a un promotor; y

(ii) un segundo constructo de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende una V^loperativamente unida a un promotor.

La presente divulgación también proporciona una célula aislada o recombinante que expresa una proteína de unión a IL-21 de la divulgación.

En un ejemplo, la célula comprende el constructo de expresión de la divulgación o:

(ii) un segundo constructo de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende una V^loperativamente unida a un promotor,

en el que el primer y segundo polipéptidos se asocian para formar una proteína de unión a IL-21 de la presente divulgación.

Los ejemplos de células de la presente divulgación incluyen células bacterianas, células de levadura, células de insectos o células de mamíferos.

La presente divulgación proporciona además métodos para producir una proteína o anticuerpo de unión a IL-21 de la divulgación. Por ejemplo, dicho método implica mantener el (los) constructo (s) de expresión de la divulgación en condiciones suficientes para que se produzca la proteína o el anticuerpo de unión a IL-21.

En un ejemplo, un método para producir una proteína o anticuerpo de unión a IL-21 de la divulgación comprende cultivar la célula de la divulgación en condiciones suficientes para que la proteína o anticuerpo de unión a IL-21 se produzca y, opcionalmente, se secrete.

En un ejemplo, el método para producir una proteína o anticuerpo de unión a IL-21 de la divulgación comprende además aislar la proteína o anticuerpo y, opcionalmente, formular la proteína o anticuerpo de unión a IL-21 en una composición farmacéutica.

La presente divulgación proporciona adicionalmente una composición que comprende una proteína o anticuerpo de unión a IL-21 de la divulgación y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En algunos ejemplos, la composición comprende:

(i) un anticuerpo de la divulgación que comprende un resto de lisina C-terminal de la cadena pesada;

(ii) un anticuerpo de la divulgación que carece de un resto de lisina C-terminal de la cadena pesada; y/o

(iii) un anticuerpo de la divulgación que comprende un resto de lisina C-terminal en una cadena pesada y que carece de un resto de lisina C-terminal en otra (o la otra) cadena pesada,

y, opcionalmente, un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La presente divulgación también proporciona un complejo que comprende una proteína de unión a IL-21 de la divulgación e IL-21. En un ejemplo, la IL-21 es IL-21 recombinante. Se conocen en la técnica ejemplos de IL-21 recombinante. La presente divulgación también proporciona un método para tratar o prevenir una infección o enfermedad infecciosa, una respuesta inmune alérgica o cáncer en un sujeto, comprendiendo el método administrar una proteína o complejo de unión a IL-21 de la divulgación. En este sentido, se puede usar una proteína o complejo de unión a IL-21 para prevenir una recaída de una afección, y esto se considera que previene la afección.

En un ejemplo, la infección es una infección crónica. En otro ejemplo, la infección es una infección viral, tal como la infección por HIV.

En un ejemplo, la enfermedad infecciosa es la hepatitis B o C.

Los cánceres ejemplares incluyen cánceres hematológicos, cánceres de origen epitelial, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer gástrico, osteosarcoma, cáncer de endometrio y cáncer de ovario.

La presente divulgación también proporciona un método para mejorar la actividad de IL-21 en un sujeto, comprendiendo el método administrar la proteína o complejo de unión a IL-21, de la divulgación.

En un ejemplo, un método descrito en la presente memoria comprende administrar entre aproximadamente 0,05 mg/kg y 30 mg/kg de la proteína o complejo de unión a IL-21. Por ejemplo, el método comprende administrar entre 0,1 mg/kg y 10 mg/kg o entre 0,2 mg/kg y 5 mg/kg de la proteína o complejo de unión a IL-21. En un ejemplo, el método comprende administrar aproximadamente 0,5-2,0 mg/kg de la proteína o complejo de unión a IL-21. La presente divulgación también proporciona el uso de una proteína o complejo de unión a IL-21 como se describe en la presente memoria en cualquier ejemplo en medicina.

La presente divulgación también proporciona el uso de una proteína o complejo de unión a IL-21 como se describe en la presente memoria según cualquier ejemplo en la fabricación de un medicamento para tratar una infección, una respuesta inmune alérgica o cáncer.

La presente divulgación también proporciona un método para localizar y/o detectar y/o diagnosticar y/o pronosticar una afección mediada por IL-21 asociada con una célula que expresa IL-21, comprendiendo el método detectar in vivo una proteína o anticuerpo de unión a IL-21 como se describe en la presente memoria unida a la célula que expresa IL-21, si está presente, en el que la proteína o anticuerpo de unión a IL-21 está conjugada con una etiqueta detectable. En un ejemplo, el método comprende además administrar la proteína de unión a IL-21 al sujeto.

La presente divulgación también proporciona un método de cultivo expandiendo una población de células que comprende células precursoras del sistema inmunológico, comprendiendo el método cultivar la población de células in vitro o ex vivo en presencia de una proteína o complejo de unión a IL-21 de la presente divulgación.

Se apreciará que el cultivo de células en presencia de una proteína o complejo de unión a IL-21 de la presente divulgación mejorará la proliferación y la diferenciación de las células del sistema inmunológico tales como células NK, células B y células T.

Se describe el método de cultivo que comprende además la adición de IL-21 exógena a la población celular.

Las poblaciones de células que comprenden células precursoras del sistema inmunológico pueden aislarse de una muestra biológica tomada de un sujeto mamífero. La muestra puede provenir de varias fuentes, que incluyen, pero no se limitan a, sangre periférica, producto sanguíneo de leucaféresis, producto sanguíneo de aféresis, médula ósea, timo, biopsia de tejido, tumor, tejido de los ganglios linfáticos, tejido linfoide asociado al intestino, tejido linfoide asociado a la mucosa, hígado, sitios de lesiones inmunológicas (por ejemplo, líquido sinovial), páncreas y líquido cefalorraquídeo. El sujeto donante es preferiblemente un ser humano y puede ser fetal, neonatal, niño, adulto y puede ser normal, estar enfermo o ser susceptible a una enfermedad de interés.

Se describe el caso en el que la muestra de células comprende células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de una muestra de sangre. Por "células mononucleares de sangre periférica" o "PBMCs" se entiende linfocitos (que incluyen células T, células B, células NK, etc.) y monocitos. En general, las PBMCs se aíslan de un paciente utilizando técnicas estándar. También se describe el caso en el que solo se toman PBMCs, dejando o devolviendo sustancialmente todos los glóbulos rojos y leucocitos polimorfonucleares al donante. Las PBMCs se pueden aislar usando métodos conocidos en la técnica, tales como leucaforesis. En general, se realiza una etapa de leucaforesis de 5 a 7 litros, que esencialmente elimina las PBMCs de un paciente, devolviendo los componentes sanguíneos restantes. La recolección de la muestra se realiza preferiblemente en presencia de un anticoagulante (por ejemplo, heparina).

Se apreciará que el cultivo celular in vitro y ex vivo, como se describe en la presente memoria, puede usarse para la expansión de células NK, células B y células T.

Se apreciará que la presente divulgación también proporciona un método para tratar o prevenir una infección o enfermedad infecciosa, una respuesta inmune alérgica o cáncer en un sujeto, mediante la administración de las células que se han expandido in vitro o ex vivo, según el método descrito anteriormente.

La población de células expandidas in vitro o ex vivo obtenida mediante el método descrito anteriormente, sola o en combinación con una proteína o complejo de unión a IL-21 de la presente divulgación, puede usarse para prevenir una recaída de una afección, y esto se considera que previene la afección. Las infecciones ejemplares incluyen HIV, hepatitis B o hepatitis C. Los cánceres ejemplares incluyen cánceres hematológicos, cánceres de origen epitelial, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer gástrico, osteosarcoma, cáncer de endometrio y cáncer de ovario.

La presente divulgación también proporciona un método para detectar IL-21 o una célula que lo expresa en una muestra, comprendiendo el método poner en contacto la muestra con una proteína o anticuerpo como se describe en la presente memoria según cualquier ejemplo de manera que se forme un complejo y detectar el complejo, en el que la detección del complejo es indicativa de IL-21 o de una célula que lo expresa en la muestra. En un ejemplo, el método se realiza ex vivo o in vitro.

La presente divulgación también proporciona un kit (por ejemplo, un paquete o artículo de fabricación) que comprende una proteína o complejo de unión a IL-21 como se describe en la presente memoria según cualquier ejemplo, opcionalmente, empaquetado con instrucciones para su uso en un método como se describe en la presente memoria.

Clave para el listado de secuencias

SEQ ID NO 1: secuencia de aminoácidos de IL-21 de Homo sapiens

SEQ ID NO 2: secuencia de aminoácidos de la cadena VH del anticuerpo 2P2

SEQ ID NO 3: secuencia de aminoácidos de la cadena VL del anticuerpo 2P2

SEQ ID NO 4: secuencia de aminoácidos del epítopo de unión a 2P2

SEQ ID NO 5: secuencia de aminoácidos de CDR1 de la cadena VH del anticuerpo 2P2 usando el esquema de numeración IMGT

SEQ ID NO 6: secuencia de aminoácidos de CDR2 de la cadena VH del anticuerpo 2P2 usando el esquema de numeración IMGT

SEQ ID NO 7: secuencia de aminoácidos de CDR3 de la cadena VH del anticuerpo 2P2 usando el esquema de numeración IMGT

SEQ ID NO 8: secuencia de aminoácidos de CDR1 de la cadena VL del anticuerpo 2P2 usando el esquema de numeración IMGT

SEQ ID NO 9: secuencia de aminoácidos de CDR2 de la cadena VL del anticuerpo 2P2 usando el esquema de numeración IMGT

SEQ ID NO 10: secuencia de aminoácidos de CDR3 de la cadena VL del anticuerpo 2P2 usando el esquema de numeración IMGT

SEQ ID NO 11: secuencia de aminoácidos de CDR1 de la cadena VH del anticuerpo 2P2 usando el esquema de numeración de Kabat

SEQ ID NO 12: secuencia de aminoácidos de CDR2 de la cadena VH del anticuerpo 2P2 usando el esquema de numeración de Kabat

SEQ ID NO 13: secuencia de aminoácidos de CDR3 de la cadena VH del anticuerpo 2P2 usando el esquema de numeración de Kabat

SEQ ID NO 14: secuencia de aminoácidos de CDR1 de la cadena VL del anticuerpo 2P2 usando el esquema de numeración de Kabat

SEQ ID NO 15: secuencia de aminoácidos de CDR2 de la cadena VL del anticuerpo 2P2 usando el esquema de numeración de Kabat

SEQ ID NO 16: secuencia de aminoácidos de CDR3 de la cadena VL del anticuerpo 2P2 usando el esquema de numeración de Kabat

SEQ ID NO 17: secuencia de nucleótidos que codifica la cadena VH del anticuerpo 2P2

SEQ ID NO 18: secuencia de nucleótidos que codifica la cadena VL del anticuerpo 2P2

SEQ ID NO 19: secuencia de aminoácidos del epítopo de unión a 2P2

SEQ ID NO 20: secuencia de aminoácidos del epítopo de unión a 2P2

SEQ ID NO 21: secuencia de aminoácidos del epítopo de unión a 2P2

SEQ ID NO 22: secuencia de aminoácidos del epítopo de unión a 2P2

SEQ ID NO 23: secuencia de aminoácidos central del epítopo de unión a 2P2

SEQ ID NO 24: secuencia de aminoácidos del epítopo de unión a 2P2

SEQ ID NO 25: secuencia de aminoácidos del epítopo de unión a 2P2

SEQ ID NO 26: secuencia de aminoácidos de IL-21 de Homo sapiens

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra que mAB 2P2 en presencia de 2 ng/nl de hIL-21 aumentó la proliferación de células Ba/F3 que expresan el receptor de IL-21 humano (BaF3-hIL-21 R) de una manera dependiente de la dosis (n = 3 ± SEM).

La Figura 2 es una representación esquemática que muestra los CDRs de la V^hy V^ldel anticuerpo 2P2 determinado mediante el esquema de numeración IMGT.

La Figura 3 muestra que mAb 2P2 aumentó la proliferación de células Ba/F3-hIL-21 R, pero no de células Ba/F3-mIL-21R (A) y que mAb 2P2 aumentó la bioactividad de hIL-21 en más de 10 veces (B) (n = 3 ± SEM).

La Figura 4 muestra que mAb 2P2 aumentó la proliferación de células B humanas mediada por hIL-21; y que 5 ng/ml de hIL-21 más 1 ug/ml de mAb 2P2 demostraron una bioactividad similar a 100 ng/ml de hIL-21, lo que indica un aumento de aproximadamente 20 veces de la biotactividad de hIL-21 por mAb 2P2.

La Figura 5 muestra que mAb 2P2 aumentó la activación mediada por hIL-21 de células T CD8 humanas para expresar moléculas citotóxicas que incluyen Granzima B y Perforina, que son importantes para la inmunidad antivirus y antitumoral. La Figura 6 muestra los resultados de la determinación de la vida media de los complejos IL-21/2P2 o IL-21 sola, administrados por vía intravenosa (IV) o por vía subcutánea (SC) (n = 3 ± SEM).

La Figura 7 muestra los resultados de la mejora de 2P2 de la proliferación de células B mediada por IL-21 en el ganglio linfático para células B foliculares (A), células B de la zona marginal (B) y células B de transición (C) (n = 3 ± SEM; *P > 0.05, **P > 0.01 ***P > 0.001).

La Figura 8 muestra los resultados de la mejora de 2P2 de la proliferación de células B mediada por IL-21 en el bazo para células B foliculares (A), células B de la zona marginal (B) y células B de transición (C) (n = 3 ± SEM; * P > 0,05, ** P > 0,01 *** P > 0,001).

La Figura 9 muestra restos de IL-21 humana (indicados en negrita) que, según la simulación estructural, se cree que están implicados en la unión de 2P2. Los restos localizados en las regiones de Helix de IL-21 están subrayados. La Figura 10 muestra la unión entre los fragmentos peptídicos de IL-21 humana y 2P2 y el anticuerpo de control 3A3 determinado por ELISA.

La Figura 11 muestra (A) la unión entre IL-21 humana o IL-21 de ratón con 2P2 (B) muestra la unión entre IL-21 humana e IL-21 de ratón con el anticuerpo de control 3A3.

Descripción detallada

General

A lo largo de esta especificación, a menos que se indique específicamente lo contrario o el contexto requiera lo contrario, la referencia a una sola etapa, composición del tema, grupo de etapas o grupo de composiciones del tema debe considerarse para abarcar uno y una pluralidad (es decir, uno o más) de esas etapas, composiciones del tema, grupos de etapas o grupos de composiciones del tema. Por tanto, como se usa en la presente memoria, las formas singulares "un", "una" y "el" incluyen aspectos plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, la referencia a "un" incluye tanto uno como dos o más; la referencia a "un" incluye tanto uno como dos o más; la referencia a "el" incluye tanto uno como dos o más, y así sucesivamente.

Los expertos en la técnica apreciarán que la presente divulgación es susceptible de variaciones y modificaciones distintas de las descritas específicamente. Debe entenderse que la divulgación incluye todas esas variaciones y modificaciones. La divulgación también incluye todas las etapas, características, composiciones y compuestos a los que se hace referencia o indicados en esta especificación, individual o colectivamente, y todas y cada una de las combinaciones o dos o más de dichas etapas o características.

El alcance de la presente divulgación no debe limitarse a los ejemplos específicos descritos en la presente memoria, que están destinados únicamente a fines de ejemplificación. Los productos, composiciones y métodos funcionalmente equivalentes están claramente dentro del alcance de la presente divulgación.

Cualquier ejemplo de la presente divulgación en la presente memoria se tomará para aplicar mutatis mutandis a cualquier otro ejemplo de la divulgación a menos que se indique específicamente lo contrario.

A menos que se defina específicamente de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria se considerará que tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto en la técnica (por ejemplo, en cultivo celular, genética molecular, inmunología, inmunohistoquímica, química de proteínas y bioquímica).

A menos que se indique lo contrario, la proteína recombinante, el cultivo celular y las técnicas inmunológicas utilizadas en la presente divulgación son procedimientos estándar, bien conocidos por los expertos en la técnica. Dichas técnicas se describen y explican a lo largo de la bibliografía en fuentes tales como, J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, volumes 1 y 2, IRL Press (1991), D.M. Glover and B.D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 y 1996), y F.M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, incluidas todas las actualizaciones hasta el presente), Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988), y J.E. Coligan et al. (editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (incluidas todas las actualizaciones hasta el presente).

La descripción y definiciones de regiones variables y partes de las mismas, inmunoglobulinas, anticuerpos y fragmentos de las mismas en la presente memoria se pueden aclarar aún más mediante la discusión en Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 y 1991, Bork et al., J Mol. Biol. 242, 309-320, 1994, Chothia and Lesk J. Mol Biol. 196: 901 -917, 1987, Chothia et al. Nature 342, 877 883, 1989 y/o o Al-Lazikani et al., J Mol Biol 273, 927-948, 1997.

El término "y/o", por ejemplo, "X y/o Y" debe entenderse que significa "X e Y" o "X o Y" y se debe considerar que proporciona un apoyo explícito para ambos significados o para cualquiera de los dos.

A lo largo de esta especificación, la palabra "comprende", o variaciones tales como "comprende" o "que comprende", se entenderá que implica la inclusión de un elemento, número entero o etapa, o grupo de elementos, números enteros o etapas, pero no la exclusión. de cualquier otro elemento, número entero o etapa, o grupo de elementos, números enteros o etapas.

Como se usa en la presente memoria, el término "derivado de" se tomará para indicar que un número entero especificado puede obtenerse de una fuente particular, aunque no necesariamente directamente de esa fuente.

Se entenderá que la referencia en la presente memoria a un intervalo de, por ejemplo, restos, es inclusiva. Por ejemplo, la referencia a "una región que comprende los aminoácidos 56 a 65" se entenderá de manera inclusiva, es decir, la región comprende una secuencia de aminoácidos con los números 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64 y 65 en una secuencia especificada.

Definiciones seleccionadas

A efectos de nomenclatura únicamente y no de limitación, se establece una secuencia ejemplar de una IL-21 humana en la SEQ ID NO 1.

Se entiende que la frase "mejora la actividad de IL-21" significa que la proteína de unión a IL-21 de la presente divulgación mejora una o más actividades de IL-21 de origen natural, incluyendo, pero sin limitarse a, estimular la proliferación, citotoxicidad o maduración de las células NK que estimulan la proliferación o diferenciación de células B y células T; estimular la producción de anticuerpos y la maduración de la afinidad en las células B; estimular la citotoxicidad de las células T CD8+; estimular la producción de interferón gamma en células T y células NK; inhibir la activación y maduración de las células dendríticas (DC); inhibir la liberación de mediadores inflamatorios de los mastocitos, mejorar la fagocitosis de los macrófagos, inhibir la generación o supervivencia de las células TReg y estimular la proliferación de células progenitoras de la médula ósea.

El término "proteína aislada" o "polipéptido aislado" es una proteína o polipéptido que en virtud de su origen o fuente de derivación no está asociado con componentes asociados naturalmente que lo acompañan en su estado nativo; está sustancialmente libre de otras proteínas de la misma fuente. Una proteína puede volverse sustancialmente libre de componentes asociados naturalmente o purificarse sustancialmente mediante aislamiento, usando técnicas de purificación de proteínas conocidas en la técnica. Por "sustancialmente purificada" se entiende que la proteína está sustancialmente libre de agentes contaminantes, por ejemplo, al menos aproximadamente 70% o 75% u 80% u 85% o 90% o 95% o 96% o 97% o 98% o 99% libre de agentes contaminantes.

El término "recombinante" debe entenderse que significa el producto de la recombinación genética artificial. Por consiguiente, en el contexto de una proteína recombinante que comprende un dominio de unión a antígeno de anticuerpo, este término no abarca un anticuerpo que se produce naturalmente dentro del cuerpo de un sujeto que es el producto de la recombinación natural que se produce durante la maduración de las células B. Sin embargo, si se aísla un anticuerpo de este tipo, debe considerarse una proteína aislada que comprende un dominio de unión al antígeno del anticuerpo. De manera similar, si el ácido nucleico que codifica la proteína se aísla y expresa usando medios recombinantes, la proteína resultante es una proteína recombinante que comprende un dominio de unión a antígeno de anticuerpo. Una proteína recombinante también abarca una proteína expresada por medios recombinantes artificiales cuando está dentro de una célula, tejido o sujeto, por ejemplo, en el que se expresa.

Se considerará que el término “proteína” incluye una única cadena polipeptídica, es decir, una serie de aminoácidos contiguos unidos por enlaces peptídicos o una serie de cadenas polipeptídicas unidas covalente o no covalentemente entre sí (es decir, un complejo polipeptídico). Por ejemplo, la serie de cadenas polipeptídicas se puede unir covalentemente usando un enlace químico o disulfuro adecuado. Los ejemplos de enlaces no covalentes incluyen enlaces de hidrógeno, enlaces iónicos, fuerzas de Van der Waals e interacciones hidrofóbicas.

El término "polipéptido" o "cadena polipeptídica" se entenderá por el párrafo anterior que significa una serie de aminoácidos contiguos unidos por enlaces peptídicos.

Como se usa en la presente memoria, el término "dominio de unión a antígeno" debe entenderse como una región de un anticuerpo que es capaz de unirse específicamente a un antígeno, es decir, una V^ho una V^lo un Fv que comprende tanto una V^hy una V^l. El dominio de unión al antígeno no necesita estar en el contexto de un anticuerpo completo, por ejemplo, puede estar aislado (por ejemplo, un anticuerpo de dominio) o en otra forma, por ejemplo, como se describe en la presente memoria, tal como un scFv.

Para los propósitos de la presente divulgación, el término "anticuerpo" incluye una proteína capaz de unirse específicamente a uno o unos pocos antígenos estrechamente relacionados (por ejemplo, IL-21) en virtud de un dominio de unión a antígeno contenido dentro de un Fv. Este término incluye anticuerpos de cuatro cadenas (por ejemplo, dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas), anticuerpos recombinantes o modificados (por ejemplo, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, anticuerpos injertados con CDR, anticuerpos primatizados, anticuerpos des-inmunizados, anticuerpos sin-humanizados, semi-anticuerpos, anticuerpos bis-específicos). Un anticuerpo generalmente comprende dominios constantes, que pueden disponerse en una región constante o fragmento constante o fragmento cristalizable (Fc). Las formas ejemplares de anticuerpos comprenden una estructura de cuatro cadenas como su unidad básica. Los anticuerpos de longitud completa comprenden dos cadenas pesadas (-50 a 70 kD) unidas covalentemente y dos cadenas ligeras (~ 23 kDa cada una). Una cadena ligera generalmente comprende una región variable (si está presente) y un dominio constante y en los mamíferos es una cadena ligera k o una cadena ligera A. Una cadena pesada generalmente comprende una región variable y uno o dos dominios constantes unidos por una región bisagra a dominios constantes adicionales. Las cadenas pesadas de mamíferos son de uno de los siguientes tipos a, 5, £, y o p. Cada cadena ligera también está unida covalentemente a una de las cadenas pesadas. Por ejemplo, las dos cadenas pesadas y las cadenas pesada y ligera se mantienen juntas mediante enlaces disulfuro entre cadenas y mediante interacciones no covalentes. El número de enlaces disulfuro entre cadenas puede variar entre diferentes tipos de anticuerpos. Cada cadena tiene una región variable N-terminal (V^ho V^len donde cada una tiene una longitud de -110 aminoácidos) y uno o más dominios constantes en el extremo C-terminal. El dominio constante de la cadena ligera (C^lque tiene una longitud de -110 aminoácidos) está alineado con y unido por enlaces disulfuro al primer dominio constante de la cadena pesada (C^h1 que tiene una longitud de 330 a 440 aminoácidos). La región variable de la cadena ligera está alineada con la región variable de la cadena pesada. La cadena pesada del anticuerpo puede comprender 2 o más dominios Ch adicionales (tales como, Ch2, Ch3 y similares) y puede comprender una región de bisagra entre los dominios constantes Ch1 y Ch2. Los anticuerpos pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgG¹, IgG², IgG3, IgG4, IgA¹e IgA²) o subclase. En un ejemplo, el anticuerpo es un anticuerpo murino (ratón o rata) o un anticuerpo de primate (tal como humano). En un ejemplo, a la cadena pesada del anticuerpo le falta un resto de lisina C-terminal. En un ejemplo, el anticuerpo está humanizado, sinhumanizado, quimérico, injertado con CDR o des-inmunizado.

Los términos "anticuerpo de longitud completa", "anticuerpo intacto" o "anticuerpo completo" se usan indistintamente para referirse a un anticuerpo en su forma sustancialmente intacta, en oposición a un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo. Específicamente, los anticuerpos completos incluyen aquellos con cadenas pesadas y ligeras que incluyen una región Fc. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de secuencia de tipo nativo (por ejemplo, dominios constantes de secuencia de tipo nativo humano) o variantes de secuencia de aminoácidos de los mismos.

Como se usa en la presente memoria, "región variable" se refiere a las porciones de las cadenas ligeras y/o pesadas de un anticuerpo como se define en la presente memoria que es capaz de unirse específicamente a un antígeno e incluye secuencias de aminoácidos de regiones determinantes de complementariedad (CDRs); es decir, CDRI, CDR2 y CDR3, y regiones marco (FRs). Por ejemplo, la región variable comprende tres o cuatro FRs (por ejemplo, FR1, FR2, FR3 y opcionalmente FR4) junto con tres CDRs. La Vh se refiere a la región variable de la cadena pesada. La Vl se refiere a la región variable de la cadena ligera.

Como se usa en la presente memoria, el término "regiones determinantes de complementariedad" (syn. CDRs; es decir, CDRI, CDR2 y CDR3) se refiere a los restos de aminoácidos de una región variable de anticuerpo cuya presencia es la principal contribuyente a la unión de antígenos específicos. Cada dominio de región variable (Vh o Vl) normalmente tiene tres CDRs identificadas como CDRI, CDR2 y CDR3. En un ejemplo, las posiciones de aminoácidos asignadas a las CDRs y FRs se definen según Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md, 1987 y 1991 (también denominado en la presente memoria "el sistema de numeración de Kabat"). En otro ejemplo, las posiciones de aminoácidos asignadas a las CDRs y FRs se definen según el esquema de numeración mejorado de Chothia (http://www.bioinfo.org.uk/mdex.html). Según el sistema de numeración de Kabat, las FRs y las CDRs de Vh se colocan de la siguiente manera: restos 1 a 30 (FRI), 31 a 35 (CDR1), 36 a 49 (FR2), 50 a 65 (CDR2), 66 a 94 (FR3), 95 a 102 (CDR3) y 103 a 113 (FR4). Según el sistema de numeración de Kabat, las FRs y las CDRs de Vl se colocan de la siguiente manera: restos 1 a 23 (FRI), 24 a 34 (CDR1), 35 a 49 (FR2), 50 a 56 (CDR2), 57 a 88 (FR3), 89 a 97 (CDR3) y 98 a 107 (FR4). La presente divulgación no se limita a los FRs y CDRs según lo definido por el sistema de numeración de Kabat, sino que incluye todos los sistemas de numeración, incluyendo el sistema de numeración canónico o de Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196: 901 -917, 1987; Chothia et al., Nature 342: 877-883, 1989; y/o Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273: 927-948, 1997; el sistema de numeración de Honnegher y Plükthun J. Mol. Biol. 309: 657-670, 2001; o el sistema IMGT discutido en Giudicelli et al., Nucleic Acids Res. 25: 206-211 1997. En un ejemplo, las CDRs se definen según el sistema de numeración de Kabat. Opcionalmente, la CDR2 de cadena pesada según el sistema de numeración de Kabat no comprende los cinco aminoácidos C-terminales enumerados en la presente memoria o cualquier uno o más de esos aminoácidos están sustituidos con otro aminoácido de origen natural. A este respecto, Padlan et al., FASEB J., 9: 133-139, 1995 establecieron que los cinco aminoácidos C-terminales de CDR2 de cadena pesada generalmente no están implicados en la unión de antígenos.

Las "regiones marco" (FRs) son los restos de la región variable distintos de los residuos de CDR.

Como se usa en la presente memoria, el término "Fv" debe entenderse como cualquier proteína, ya sea compuesta por múltiples polipéptidos o un solo polipéptido, en la que una Vl y una Vh se asocian y forman un complejo que tiene un dominio de unión a antígeno, es decir, capaz de unirse específicamente a un antígeno. La Vh y la Vl que forman el dominio de unión al antígeno pueden estar en una única cadena polipeptídica o en diferentes cadenas polipeptídicas. Además, un Fv de la divulgación (así como cualquier proteína de la divulgación) puede tener múltiples dominios de unión a antígeno que pueden o no unirse al mismo antígeno. Se entenderá que este término abarca fragmentos derivados directamente de un anticuerpo, así como las proteínas correspondientes a dicho fragmento producido usando medios recombinantes. En algunos ejemplos, la Vh no está unida a un dominio constante de cadena pesada (Ch) 1 y/o la Vl no está unida a un dominio constante de cadena ligera (Cl). Los Fv ejemplares que contienen polipéptidos o proteínas incluyen un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F (ab'), un scFv, un diacuerpo, un triacuerpo, un tetracuerpo o complejo de orden superior, o cualquiera de los anteriores unidos a una región o dominio constante de la misma, por ejemplo, dominio Ch2 o Ch3, por ejemplo, un minicuerpo. Un "fragmento Fab" consiste en un fragmento monovalente de unión al antígeno de una inmunoglobulina, y se puede producir mediante la digestión de un anticuerpo completo con la enzima papaína, para producir un fragmento que consiste en una cadena ligera intacta y una porción de una cadena pesada o se puede producir usando medios recombinantes. Se puede obtener un "fragmento Fab'" de un anticuerpo tratando un anticuerpo completo con pepsina, seguido de reducción, para producir una molécula que consiste en una cadena ligera intacta y una porción de una cadena pesada que comprende una VH y un único dominio constante. Se obtienen dos fragmentos Fab' por anticuerpo tratado de esta manera. También se puede producir un fragmento Fab' mediante medios recombinantes. Un "fragmento F(ab')2" de un anticuerpo consiste en un dímero de dos fragmentos Fab' unidos por dos enlaces disulfuro, y se obtiene tratando una molécula de anticuerpo completa con la enzima pepsina, sin reducción posterior. Un fragmento "Fab²" es un fragmento recombinante que comprende dos fragmentos Fab unidos usando, por ejemplo, una cremallera de leucina o un dominio C^h3. Un "Fv monocatenario" o "scFv" es una molécula recombinante que contiene el fragmento de región variable (Fv) de un anticuerpo en el que la región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada están unidas covalentemente mediante un enlazador polipeptídico flexible adecuado.

Como se usa en la presente memoria, el término "se une" en referencia a la interacción de una proteína de unión a IL-21 o un dominio de unión a antígeno de la misma con un antígeno significa que la interacción depende de la presencia de una estructura particular (por ejemplo, un determinante antigénico o epítopo) sobre el antígeno. Por ejemplo, un anticuerpo reconoce y se une a una estructura de proteína específica en lugar de a proteínas en general. Si un anticuerpo se une al epítopo "A", la presencia de una molécula que contiene el epítopo "A" (o libre, sin marcar "A"), en una reacción que contiene "A" marcado y la proteína, reducirá la cantidad de "A" marcado unido al anticuerpo.

Como se usa en la presente memoria, el término "se une específicamente" o "se une de manera específica" debe entenderse que significa que una proteína de unión a IL-21 de la divulgación reacciona o se asocia con más frecuencia, más rápidamente, con mayor duración y/o con mayor afinidad con un antígeno particular o célula que lo expresa que con antígenos o células alternativas. Por ejemplo, una proteína de unión a IL-21 se une a IL-21 (por ejemplo, hIL-21) con una afinidad materialmente mayor (por ejemplo, 1,5 veces o 2 veces o 5 veces o 10 veces o 20 veces o 40 veces o 60 veces o 80 veces a 100 veces o 150 veces o 200 veces) que con otras interleucinas o a antígenos comúnmente reconocidos por anticuerpos naturales polireactivos (es decir, por anticuerpos naturales que se sabe que se unen a una variedad de antígenos encontrados de forma natural en humanos). En un ejemplo de la presente divulgación, una proteína de unión a IL-21 que "se une específicamente" a hIL-21 con una afinidad de al menos 1,5 veces o 2 veces o mayor (por ejemplo, 5 veces o 10 veces o 20 veces o 50 veces o 100 veces o 200 veces) que con otra interleucina. Generalmente, pero no necesariamente, la referencia a la unión significa una unión específica, y se entenderá que cada término proporciona un apoyo explícito para el otro término.

Como se usa en la presente memoria, el término "no se une de manera detectable" debe entenderse que significa que una proteína de unión a IL-21, por ejemplo, un anticuerpo, se une a un antígeno candidato a un nivel inferior al 10%, o al 8% o al 6% o al 5% por encima de la base. La base puede ser el nivel de señal de unión detectado en ausencia de la proteína y/o en presencia de una proteína de control negativo (por ejemplo, un anticuerpo de control de isotipo) y/o el nivel de unión detectado en presencia de un antígeno de control negativo. El nivel de unión se detecta usando análisis de biosensor (por ejemplo, Biacore) en el que la proteína de unión a IL-21 se inmoviliza y se pone en contacto con un antígeno.

Como se usa en la presente memoria, el término "no se une significativamente" debe entenderse que significa que el nivel de unión de una proteína de unión a IL-21 de la divulgación a un polipéptido no es estadísticamente significativamente más alto que la base, por ejemplo, el nivel de la señal de unión detectada en ausencia de la proteína de unión a IL-21 y/o en presencia de una proteína de control negativo (por ejemplo, un anticuerpo de control de isotipo) y/o el nivel de unión detectado en presencia de un polipéptido de control negativo. El nivel de unión se detecta usando análisis de biosensores (por ejemplo, Biacore) en el que la proteína de unión a IL-21 se inmoviliza y se pone en contacto con un antígeno.

Para fines de aclaración y como resultará evidente para el experto en la técnica basándose en el tema ejemplificado en la presente memoria, la referencia a "afinidad" en esta especificación es una referencia a la K^dde una proteína o anticuerpo.

Para fines de aclaración y como resultará evidente para el experto en la técnica basándose en la descripción de la presente memoria, se entenderá que la referencia a una "afinidad de al menos aproximadamente" significa que la afinidad (o K^d) es igual al valor indicado o superior (es decir, el valor indicado como afinidad es menor), es decir, una afinidad de 2 nM es mayor que una afinidad de 3 nM. Dicho de otra forma, este término podría ser "una afinidad de X o menos", en el que X es un valor mencionado en la presente memoria.

Como se usa en la presente memoria, el término "epítopo" (syn. "determinante antigénico") debe entenderse que significa una región de IL-21 a la que se une una proteína de unión a IL-21 que comprende un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo. Este término no se limita necesariamente a la estructura o los restos específicos con los que entra en contacto la proteína de unión a IL-21. Por ejemplo, este término incluye la región que abarca los aminoácidos puestos en contacto por la proteína de unión a IL-21 y 5-10 (o más) o 2-5 o 1-3 aminoácidos fuera de esta región. En algunos ejemplos, el epítopo comprende una serie de aminoácidos discontinuos que se colocan cerca unos de otros cuando la proteína de unión a IL-21 está plegada, es decir, un "epítopo conformacional". El experto en la materia también sabrá que el término "epítopo" no se limita a péptidos o polipéptidos. Por ejemplo, el término "epítopo" incluye agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tales como cadenas laterales de azúcar, cadenas laterales de fosforilo o cadenas laterales de sulfonilo y, en ciertos ejemplos, pueden tener características estructurales tridimensionales específicas y/o características de carga específicas.

El término "inhibe competitivamente" debe entenderse que significa que una proteína de unión a IL-21 de la divulgación (o un dominio de unión a antígeno de la misma) reduce o previene la unión de un anticuerpo o proteína de unión a IL-21 mencionados a IL-21, por ejemplo, a hIL-21. Esto puede deberse a la proteína de unión a IL-21 (o dominio de unión a antígeno) y al anticuerpo que se une a la misma o un epítopo superpuesto. Resultará evidente a partir de lo anterior que la proteína de unión a IL-21 no necesita inhibir completamente la unión del anticuerpo, sino que solo necesita reducir la unión en una cantidad estadísticamente significativa, por ejemplo, en al menos aproximadamente un 10% o un 20% o un 30% % o un 40% o un 50% o un 60% o un 70% o un 80% o un 90% o un 95%. Preferiblemente, la proteína de unión a IL-21 reduce la unión del anticuerpo en al menos aproximadamente un 30%, más preferiblemente en al menos aproximadamente un 50%, más preferiblemente, en al menos aproximadamente un 70%, aún más preferiblemente en al menos aproximadamente un 75%, incluso más preferiblemente, en al menos aproximadamente un 80% o un 85% e incluso más preferiblemente, en al menos aproximadamente un 90%. Los métodos para determinar la inhibición competitiva de la unión se conocen en la técnica y/o se describen en la presente memoria. Por ejemplo, el anticuerpo se expone a IL-21 en presencia o ausencia de la proteína de unión a IL-21. Si se une menos anticuerpo en presencia de la proteína de unión a IL-21 que en ausencia de la proteína de unión a IL-21, se considera que la proteína inhibe de manera competitiva la unión del anticuerpo. En un ejemplo, la inhibición competitiva no se debe a un impedimento estérico.

"Superposición" en el contexto de dos epítopos debe entenderse que significa que dos epítopos comparten un número suficiente de restos de aminoácidos para permitir que una proteína de unión a IL-21 (o dominio de unión a antígeno de la misma) que se une a un epítopo para inhibir competitivamente la unión de una proteína de unión a IL-21 (o dominio de unión a antígeno) que se une al otro epítopo. Por ejemplo, los epítopos "superpuestos" comparten al menos 1 o 2 o 3 o 4 o 5 o 6 o 7 u 8 o 9 o 20 aminoácidos.

Como se usa en la presente memoria, el término "agonizar" debe entenderse que significa que una proteína es capaz de mejorar la señalización mediada por IL-21 en una célula. Los métodos para determinar la actividad mejorada se conocen en la técnica y/o se describen en la presente memoria.

Como se usa en la presente memoria, el término "afección" se refiere a una interrupción de o interferencia con la función normal, y no se limita a ninguna afección específica, e incluirá enfermedades o trastornos.

Como se usa en la presente memoria, los términos "que previene", "prevenir" o "prevención" incluyen administrar una proteína de unión a IL-21 de la divulgación para detener u obstaculizar así el desarrollo de al menos un síntoma de una afección. Este término también abarca el tratamiento de un sujeto en remisión para prevenir o dificultar la recaída.

Como se usa en la presente memoria, los términos "que trata", "tratar" o "tratamiento" incluyen la administración de una proteína de unión a IL-21 descrita en la presente memoria para reducir o eliminar así al menos un síntoma de una enfermedad o afección especificada.

Como se usa en la presente memoria, el término "sujeto" debe entenderse que significa cualquier animal, incluyendo los seres humanos, por ejemplo, un mamífero. Los sujetos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, humanos y primates no humanos. Por ejemplo, el sujeto es un ser humano.

Anticuerpos

En un ejemplo, una proteína de unión a IL-21 como se describe en la presente memoria según cualquier ejemplo es un anticuerpo.

Los métodos para generar anticuerpos se conocen en la técnica y/o se describen en Harlow y Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988). Generalmente, en dichos métodos IL-21 (por ejemplo, hIL-21) o una región de la misma (por ejemplo, una región extracelular) o un fragmento o epítopo inmunogénico de la misma o una célula que expresa y muestra la misma (es decir, un inmunógeno), opcionalmente formulado con cualquier vehículo, adyuvante o excipiente farmacéuticamente aceptable adecuado o deseado se administra a un animal no humano, por ejemplo, un ratón, pollo, rata, conejo, cobaya, perro, caballo, vaca, cabra o cerdo. El inmunógeno se puede administrar por vía intranasal, intramuscular, subcutánea, intravenosa, intradérmica, intraperitoneal, o por otra vía conocida.

La producción de anticuerpos policlonales se puede controlar tomando muestras de sangre del animal inmunizado en varios puntos después de la inmunización. Se pueden administrar una o más inmunizaciones adicionales, si se requiere para lograr un título de anticuerpo deseado. El proceso de refuerzo y titulación se repite hasta que se alcanza un título adecuado. Cuando se obtiene un nivel deseado de inmunogenicidad, el animal inmunizado se sangra y el suero se aísla y se almacena, y/o el animal se usa para generar anticuerpos monoclonales (mAbs).

Los anticuerpos monoclonales son una forma ejemplar de anticuerpo contemplada por la presente divulgación. El término "anticuerpo monoclonal" o "mAb" se refiere a una población de anticuerpos homogénea capaz de unirse al mismo (s) antígeno (s), por ejemplo, al mismo epítopo dentro del antígeno. Este término no está destinado a limitarse con respecto a la fuente del anticuerpo o la manera en que se elabora.

Para la producción de mAbs se puede utilizar cualquiera de varias técnicas conocidas, tal como, por ejemplo, el procedimiento ejemplificado en el documento de Patente US4196265 o Harlow and Lane (1988), supra.

Por ejemplo, un animal adecuado se inmuniza con un inmunógeno en condiciones suficientes para estimular las células productoras de anticuerpos. Los roedores tales como conejos, ratones y ratas son animales ejemplares. Los ratones modificados genéticamente para expresar anticuerpos humanos, por ejemplo, que no expresan anticuerpos murinos, también pueden usarse para generar un anticuerpo de la presente divulgación (por ejemplo, como se describe en el documento de Patente WO2002/066630).

Después de la inmunización, las células somáticas con potencial para producir anticuerpos, específicamente linfocitos B (células B), se seleccionan para su uso en el protocolo de generación de mAb. Estas células pueden obtenerse de biopsias de bazos, amígdalas o ganglios linfáticos, o de una muestra de sangre periférica. Las células B del animal inmunizado se fusionan después con células de una célula de mieloma inmortal, generalmente derivadas de la misma especie que el animal que se inmunizó con el inmunógeno.

Los híbridos se amplifican mediante cultivo en un medio selectivo que comprende un agente que bloquea la síntesis de nucleótidos de novo en los medios de cultivo de tejidos. Los agentes ejemplares son aminopterina, metotrexato y azaserina.

Los hibridomas amplificados se someten a una selección funcional de especificidad y/o título de anticuerpos, tal como, por ejemplo, mediante citometría de flujo y/o inmunohistoquímica y/o inmunoensayo (por ejemplo, radioinmunoensayo, inmunoensayo enzimático, ensayo de citotoxicidad, ensayo de placa, inmunoensayo puntual, y similares).

Alternativamente, la tecnología ABL-MYC (NeoClone, Madison WI 53713, USA) se utiliza para producir líneas celulares que secretan MAbs (por ejemplo, como se describe en Largaespada et al., J. Immunol. Methods. 197: 85-95, 1996).

Los anticuerpos también se pueden producir o aislar seleccionando una biblioteca de presentación, por ejemplo, una biblioteca de presentación de fagos, por ejemplo, como se describe en en los documentos de Patente US6300064 y/o US5885793. Por ejemplo, los presentes inventores han aislado anticuerpos completamente humanos de una biblioteca de presentación de fagos.

El anticuerpo de la presente divulgación puede ser un anticuerpo sintético. Por ejemplo, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano sin-humanizado, un anticuerpo primatizado o un anticuerpo des-inmunizado.

Proteínas de unión a IL-21 des-inmunizadas, quiméricas, injertadas con CDR, humanizadas, sin-humanizadas, primatizadas, humanas y compuestas

Las proteínas de unión a IL-21 de la presente divulgación pueden ser proteínas injertadas con CDR que incluyen CDRs de un anticuerpo de una especie no humana (por ejemplo, ratón o rata o primate no humano) injertadas o insertadas en FRs de un anticuerpo humano o que incluyen CDRs de un anticuerpo de un tipo de anticuerpo (por ejemplo, un tipo de anticuerpo humano) injertado o insertado en FRs de otro tipo de anticuerpo (por ejemplo, otro tipo de anticuerpo humano). Este término también abarca una proteína de unión a IL-21 compuesta que comprende, por ejemplo, una o más regiones variables injertadas con CDR y una o más, por ejemplo, regiones variables humanas, regiones variables quiméricas, regiones variables sin-humanizadas o regiones variables primatizadas.

Las proteínas de unión a IL-21 de la presente divulgación pueden ser una proteína humanizada.

El término "proteína humanizada" debe entenderse que se refiere a una proteína que comprende una región variable de tipo humano, que incluye CDRs de un anticuerpo de una especie no humana (por ejemplo, ratón o rata o primate no humano) injertado o insertado en FRs de un anticuerpo humano (este tipo de anticuerpo pertenece a la clase de "anticuerpo injertado con CDR"). Las proteínas de unión a IL-21 humanizadas también incluyen proteínas en las que uno o más restos de la proteína humana se modifican mediante una o más sustituciones de aminoácidos y/o uno o más restos FRs de la proteína humana se reemplazan por los correspondientes restos no humanos. Las proteínas humanizadas también pueden comprender restos que no se encuentran ni en el anticuerpo humano ni en el anticuerpo no humano. Cualquier región adicional de la proteína (por ejemplo, región Fc) es generalmente humana. La humanización se puede realizar usando un método conocido en la técnica, por ejemplo, en los documentos de Patente US5225539, US6054297, US7566771 o US5585089. El término "proteína humanizada" también abarca una proteína súper-humanizada, por ejemplo, como se describe en el documento de Patente US7732578. Este término también abarca una proteína compuesta que comprende, por ejemplo, una o más regiones variables humanizadas y una o más, por ejemplo, regiones variables humanas, regiones variables quiméricas, regiones variables sin-humanizadas o regiones variables primatizadas.

Las proteínas de unión a IL-21 de la presente divulgación pueden ser proteínas de unión a IL-21 humanas. El término "proteína humana" como se usa en la presente memoria se refiere a proteínas que tienen regiones de anticuerpos variables y, opcionalmente, constantes que se encuentran en humanos, por ejemplo, en la línea germinal humana o células somáticas o de bibliotecas producidas usando dichas regiones. Las proteínas "humanas" pueden incluir restos de aminoácidos no codificados por secuencias humanas, por ejemplo, mutaciones introducidas por mutaciones aleatorias o dirigidas al sitio in vitro (en particular mutaciones que implican sustituciones conservadoras o mutaciones en un pequeño número de restos de la proteína, por ejemplo, en 1, 2, 3, 4 o 5 de los restos de la proteína). Estas "proteínas humanas" no necesitan ser generadas necesariamente como resultado de una respuesta inmune de un ser humano, sino que pueden generarse usando medios recombinantes (por ejemplo, seleccionando una biblioteca de presentación de fagos) y/o por un animal transgénico (por ejemplo, un ratón) que comprende ácido nucleico que codifica regiones constantes y/o variables de anticuerpos humanos y/o que utiliza selección guiada (por ejemplo, como se describe en el documento de Patente US5565332). Este término también abarca formas maduradas por afinidad de dichos anticuerpos. Para los propósitos de la presente divulgación, también se considerará que una proteína humana incluye una proteína que comprende FRs de un anticuerpo humano o FRs que comprenden secuencias de una secuencia consenso de FRs humanas y en la que una o más de las CDRs son aleatorias o semi-aleatorias, por ejemplo, como se describe en los documentos de Patente US6300064 y/o US6248516.

Opcionalmente, la V^hestá unida a una región constante de cadena pesada, por ejemplo, una región constante de cadena pesada de IgG4. En un ejemplo, la región constante de la cadena pesada carece del resto de lisina C-terminal.

Opcionalmente, la V^lestá unida a una región constante de cadena ligera.

Las proteínas de unión a IL-21 de la presente divulgación pueden ser proteínas sin-humanizadas. El término "proteína sin-humanizada" se refiere a una proteína preparada mediante un método descrito en el documento de Patente WO2007/019620. Una proteína de unión a IL-21 sin-humanizada incluye una región variable de un anticuerpo, en la que la región variable comprende FRs de una región variable de anticuerpo de primates del Nuevo Mundo y CDRs de una región variable de anticuerpo de primates que no es del Nuevo Mundo. Por ejemplo, una proteína de unión a IL-21 sin-humanizada incluye una región variable de un anticuerpo, en la que la región variable comprende FRs de una región variable de anticuerpo de primate del Nuevo Mundo y CDRs de un anticuerpo de ratón o rata. En un ejemplo, la proteína de unión a IL-21 sin-humanizada es un anticuerpo de unión a IL-21 en el que una o ambas regiones variables están sin-humanizadas. Este término también abarca una proteína compuesta que comprende, por ejemplo, una o más regiones variables sin-humanizadas y una o más, por ejemplo, regiones variables humanas o regiones variables humanizadas o regiones variables quiméricas.

Las proteínas de unión a IL-21 de la presente divulgación pueden ser proteínas primatizadas. Una "proteína primatizada" comprende la región o regiones variables de un anticuerpo generado después de la inmunización de un primate no humano (por ejemplo, un macaco cinomólogo). Opcionalmente, las regiones variables del anticuerpo de primates no humanos se unen a regiones constantes humanas para producir un anticuerpo primatizado. Los métodos ejemplares para producir anticuerpos primatizados se describen en el documento de Patente US6113898. Este término también abarca una proteína compuesta que comprende, por ejemplo, una o más regiones variables primatizadas y una o más, por ejemplo, regiones variables humanas o regiones variables humanizadas o regiones variables quiméricas.

En un ejemplo, una proteína de unión a IL-21 de la divulgación es una proteína quimérica. El término "proteínas quiméricas" se refiere a proteínas en las que un dominio de unión a antígeno es de una especie particular (por ejemplo, murino, tal como ratón o rata) o pertenece a una clase o subclase de anticuerpos en particular, mientras que el resto de la proteína es de una proteína derivada de otra especie (tal como, por ejemplo, primate humano o no humano) o pertenece a otra clase o subclase de anticuerpos. En un ejemplo, una proteína quimérica es un anticuerpo quimérico que comprende una V^hy/o una V^lde un anticuerpo no humano (por ejemplo, un anticuerpo murino) y las regiones restantes del anticuerpo son de un anticuerpo humano. La producción de dichas proteínas quiméricas se conoce en la técnica y se puede lograr por medios estándar (como se describe, por ejemplo, en los documentos de Patente US6331415; US5807715; US4816567 y US4816397). Este término también abarca una proteína compuesta que comprende, por ejemplo, una o más regiones variables quiméricas y una o más, por ejemplo, regiones variables humanas o regiones variables humanizadas o regiones variables quiméricas.

La presente divulgación también contempla una proteína de unión a IL-21 des-inmunizada, por ejemplo, como se describe en los documentos de Patente WO2000/34317 y WO2004/108158. Los anticuerpos y proteínas des inmunizados tienen uno o más epítopos, por ejemplo, epítopos de células B o epítopos de células T eliminados (es decir, mutados) para reducir así la probabilidad de que un sujeto genere una respuesta inmune contra el anticuerpo o proteína. Por ejemplo, una proteína de unión a IL-21 de la divulgación se analiza para identificar uno o más epítopos de células B o T y uno o más restos de aminoácidos dentro del epítopo se muta para reducir así la inmunogenicidad de la proteína de unión a IL-21.

Resultará evidente para el experto en la materia a partir de la descripción anterior que una proteína "compuesta" comprende una forma de V^h(por ejemplo, humana) y otra forma de V^l(por ejemplo, humanizada). La presente divulgación abarca explícitamente todas las combinaciones de las formas de V^hy V^l.

Determinación de las regiones determinantes de complementariedad

Las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) descritas en la presente memoria se basan, en un ejemplo, en el sistema de numeración de Lefranc y colegas, denominado sistema de numeración ImMunoGeneTics (IMGT) (Lefranc, Marie-Paule et al. (1999) Nucl. Acids. Res. 27 (1): 209-212) que es un sistema de numeración unificado para secuencias de línea germinal de dominio variable de inmunoglobulina que incluyen dominios variables de cadena ligera y pesada kappa y lambda de anticuerpo, así como dominios variables de cadena alfa, beta, gamma y delta del receptor de células T.

Los expertos en la técnica apreciarán que las CDRs también se pueden determinar usando el sistema de numeración de Kabat et al. (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest Washington DC United States Department of Health and Human Services, 1987 y/o 1991). Según este sistema de numeración, se determinó que las regiones CDRs eran:

Cadena pesada variable

Cadena ligera variable

Por consiguiente, la presente divulgación también abarca proteínas de unión a IL-21 que comprenden un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo en el que el dominio de unión a antígeno comprende secuencias de regiones determinantes de complementariedad de cadenas pesadas y ligeras como se describió anteriormente según el sistema de numeración de Kabat.

Dominio de unión a anticuerpos que contiene proteínas

Anticuerpos de dominio único

En algunos ejemplos, una proteína de la divulgación es o comprende un anticuerpo de dominio único (que se usa indistintamente con el término "anticuerpo de dominio" o "dAb"). Un anticuerpo de dominio único es una cadena polipeptídica única que comprende toda o una parte de la región variable de la cadena pesada de un anticuerpo. En ciertos ejemplos, un anticuerpo de dominio único es un anticuerpo de dominio único humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; véase, por ejemplo, el documento de Patente US6248516).

Diacuerpos, Triacuerpos, Tetracuerpos

En algunos ejemplos, una proteína de la divulgación es o comprende un diacuerpo, triacuerpo, tetracuerpo o complejo proteico de orden superior como los descritos en los documentos de Patente WO98/044001 y/o WO94/007921.

Por ejemplo, un diacuerpo es una proteína que comprende dos cadenas polipeptídicas asociadas, comprendiendo cada cadena polipeptídica la estructura V^l-X-V^ho V^h-X-V^l, donde V^les una región variable de cadena ligera de anticuerpo, V^hes una región variable de la cadena pesada del anticuerpo, X es un enlazador que comprende restos insuficientes para permitir la V^hy V^len una sola cadena polipeptídica para asociar (o formar un Fv) o está ausente, y donde la V^hde una cadena polipeptídica se une a una V^lde la otra cadena polipeptídica para formar un dominio de unión a antígeno, es decir, para formar una molécula Fv capaz de unirse específicamente a uno o más antígenos. La V^ly V^hpuede ser la misma en cada cadena polipeptídica o la V^ly V^hpueden ser diferentes en cada cadena polipeptídica para formar un diacuerpo bis-específico (es decir, que comprende dos Fvs que tienen diferente especificidad). cadena polipeptídica o la V^ly V^hpueden ser diferentes en cada cadena polipeptídica para formar un diacuerpo bisespecífico (es decir, que comprende dos Fvs que tienen diferente especificidad).

Fv monocatenario (scFv)

El experto en la materia sabrá que los scFvs comprenden regiones V^hy V^len una sola cadena polipeptídica y un enlazador polipeptídico entre la V^hy V^lque permite que el scFv forme la estructura deseada para la unión del antígeno (es decir, para la V^hy la V^lde la cadena polipeptídica única para asociarse entre sí para formar un Fv). Por ejemplo, el enlazador comprende más de 12 restos de aminoácidos con (Gly4Ser)3 siendo uno de los enlazadores más favorecidos para un scFv.

La presente divulgación también contempla un Fv estabilizado con disulfuro (o diFv o dsFv), en el que se introduce un único resto de cisteína en un FR de V^hy un FR de V^ly los restos de cisteína unidos por un enlace disulfuro para producir un Fv estable.

Alternativamente, o, además, la presente divulgación abarca un scFv dimérico, es decir, una proteína que comprende dos moléculas scFv unidas por un enlace covalente o no covalente, por ejemplo, por un dominio de cremallera de leucina (por ejemplo, derivado de Fos o Jun). Alternativamente, dos scFvs están unidos por un péptido enlazador de longitud suficiente para permitir que ambos scFvs se formen y se unan a un antígeno, por ejemplo, como se describe en el documento de Patente US20060263367.

Anticuerpos de cadena pesada

Los anticuerpos de cadena pesada difieren estructuralmente de muchas otras formas de anticuerpos, en la medida en que comprenden una cadena pesada, pero no comprenden una cadena ligera. Por consiguiente, estos anticuerpos también se denominan como "anticuerpos de cadena pesada solamente". Los anticuerpos de cadena pesada se encuentran, por ejemplo, en camélidos y peces cartilaginosos (también llamados IgNAR).

Las regiones variables presentes en los anticuerpos de cadena pesada de origen natural se denominan generalmente como "dominios V^hh"en los anticuerpos de camélidos y V-NAR en IgNAR, con el fin de distinguirlos de las regiones variables de cadena pesada que están presentes en los anticuerpos convencionales de 4 cadenas (que se denominan como "dominios VH") y de las regiones variables de cadena ligera que están presentes en los anticuerpos convencionales de 4 cadenas (que se denominan "dominios V^l").

Se encuentra una descripción general de los anticuerpos de cadena pesada de camélidos y las regiones variables de los mismos y los métodos para su producción y/o aislamiento y/o uso entre otros en las siguientes referencias de los documentos de Patente WO94/04678, WO97/49805 y WO 97/49805.

Se encuentra una descripción general de los anticuerpos de cadena pesada de peces cartilaginosos y las regiones variables de los mismos y los métodos para su producción y/o aislamiento y/o uso inter alia en el documento de Patente WO2005/118629.

Otros anticuerpos y proteínas que comprenden dominios de unión a antígenos de los mismos

La presente divulgación también contempla otros anticuerpos y proteínas que comprenden dominios de unión a antígeno de los mismos, tales como:

(i) proteínas biespecíficas "llave y agujero" como se describe en el documento de Patente US5731168;

(ii) proteínas heteroconjugadas, por ejemplo, como se describe en el documento de Patente US4676980;

(iii) proteínas heteroconjugadas producidas usando un reticulante químico, por ejemplo, como se describe en el documento de Patente US4676980; y

(iv) Fab3 (por ejemplo, como se describe en el documento de Patente EP19930302894).

Mutaciones de proteínas

La presente divulgación también proporciona una proteína de unión a IL-21 o un ácido nucleico que la codifica que tiene al menos un 80% de identidad con una secuencia descrita en la presente memoria. En un ejemplo, una proteína de unión a IL-21 o ácido nucleico de la divulgación comprende una secuencia al menos aproximadamente 85% o 90% o 95% o 97% o 98% o 99% idéntica a una secuencia descrita en la presente memoria.

Alternativamente, o adicionalmente, la proteína de unión a IL-21 comprende una CDR (por ejemplo, tres CDRs) al menos aproximadamente 80% u 85% o 90% o 95% o 97% o 98% o 99% idéntica a las CDRs de una V^ho V^lcomo se describe en la presente memoria según cualquier ejemplo.

En otro ejemplo, un ácido nucleico de la divulgación comprende una secuencia al menos aproximadamente 80% o 85% o 90% o 95% o 97% o 98% o 99% idéntica a una secuencia que codifica una proteína de unión a IL-21 que tiene una función como se describe en la presente memoria según cualquier ejemplo. La presente divulgación también abarca ácidos nucleicos que codifican una proteína de unión a IL-21 de la divulgación, que difiere de una secuencia ejemplificada en la presente memoria como resultado de la degeneración del código genético.

El % de identidad de un ácido nucleico o polipéptido se determina mediante el análisis de GAP (Needleman and Wunsch. Mol. Biol. 48, 443-453, 1970) (programa GCG) con una penalización por creación de huecos = 5 y una penalización por extensión de huecos = 0.3. La secuencia de consulta tiene una longitud de al menos 50 residuos y el análisis de GAP alinea las dos secuencias en una región de al menos 50 residuos. Por ejemplo, la secuencia de consulta tiene al menos 100 residuos de longitud y el análisis de GAP alinea las dos secuencias en una región de al menos 100 residuos. Por ejemplo, las dos secuencias están alineadas en toda su longitud.

La presente divulgación también contempla un ácido nucleico que se hibrida en condiciones rigurosas de hibridación con un ácido nucleico que codifica una proteína de unión a IL-21 descrita en la presente memoria. Una "rigurosidad moderada" se define en la presente memoria como una hibridación y/o lavado realizado en 2 x tampón SSC, SDS al 0,1% (p/v) a una temperatura en el intervalo de 45°C a 65°C, o condiciones equivalentes. Una "alta rigurosidad" se define en la presente memoria como una hibridación y/o lavado realizado en 0,1 x tampón SSC, SDS al 0,1% (p/v) o concentración de sal más baja, y a una temperatura de al menos 65°C, o condiciones equivalentes. La referencia en la presente memoria a un nivel particular de rigurosidad abarca condiciones equivalentes usando soluciones de lavado/hibridación distintas de SSC conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se conocen en la técnica métodos para calcular la temperatura a la que se disociarán las hebras de un ácido nucleico bicatenario (también conocido como temperatura de fusión o Tm). Una temperatura que es similar a (por ejemplo, dentro de 5°C o dentro de 10°C) o igual a la Tm de un ácido nucleico se considera que es de alta rigurosidad. Se debe considerar que la rigurosidad media está comprendida entre 10°C y 20°C o entre 10°C y 15°C de la Tm calculada del ácido nucleico.

La presente divulgación también contempla formas mutantes de una proteína de unión a IL-21 de la divulgación que comprende una o más sustituciones conservadoras de aminoácidos en comparación con una secuencia establecida en la presente memoria. En algunos ejemplos, la proteína de unión a IL-21 comprende 10 o menos, por ejemplo, 9 o 8 o 7 o 6 o 5 o 4 o 3 o 2 o 1 sustituciones conservadoras de aminoácidos. Una "sustitución de aminoácidos conservadora" es aquella en la que el resto de aminoácido se reemplaza con un resto de aminoácido que tiene una cadena lateral y/o hidropaticidad y/o hidrofilia similares.

Se han definido en la técnica familias de restos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares, que incluyen cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales p-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Los índices hidropáticos se describen, por ejemplo, en Kyte and Doolittle J. Mol. Biol. 157: 105-132, 1982 y los índices hidrófilos se describen en, por ejemplo, el documento de Patente US4554101.

La presente divulgación también contempla cambios de aminoácidos no conservativos. Por ejemplo, son de particular interés las sustituciones de aminoácidos cargados por otro aminoácido cargado y por aminoácidos neutros o cargados positivamente. En algunos ejemplos, la proteína de unión a IL-21 comprende 10 o menos, por ejemplo, 9 o 8 o 7 o 6 o 5 o 4 o 3 o 2 o 1 sustituciones de aminoácidos no conservativos.

En un ejemplo, la (s) mutación (es) ocurren dentro de un FR de un dominio de unión a antígeno de una proteína de unión a IL-21 de la divulgación. En otro ejemplo, la (s) mutación (es) ocurren dentro de una CDR de una proteína de unión a IL-21 de la divulgación.

Los métodos ejemplares para producir formas mutantes de una proteína de unión a IL-21 incluyen:

• mutagénesis del DNA (Thie et al., Methods Mol. Biol. 525: 309-322, 2009) o RNA (Kopsidas et al., Immunol. Lett.

107: 163-168, 2006; Kopsidas et al. BMC Biotechnology, 7:18, 2007; y el documento de Patente WO1999/058661);

• introducir un ácido nucleico que codifica el polipéptido en una célula mutadora, por ejemplo, células bacterianas XL-1 Red, XL-mutS y XL-mutS-Kanr (Stratagene);

• Mezcla de DNA, por ejemplo, como se describe en Stemmer, Nature 370: 389-91, 1994; y

• mutagénesis dirigida al sitio, por ejemplo, como se describe en Dieffenbach (ed) y Dveksler (ed) (In: PCR Primer:

A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, NY, 1995).

Los métodos ejemplares para determinar la actividad biológica de las proteínas de unión a IL-21 mutantes de la divulgación serán evidentes para el experto en la técnica y/o se describen en la presente memoria, por ejemplo, unión de antígeno. Por ejemplo, en la presente memoria se describen métodos para determinar la unión de antígenos, la inhibición competitiva de la unión, afinidad, asociación, disociación y eficacia terapéutica.

Regiones constantes

La presente divulgación abarca proteínas y/o anticuerpos de unión a IL-21 descritos en la presente memoria que comprenden una región constante de un anticuerpo. Esto incluye fragmentos de unión a antígeno de un anticuerpo fusionado a un Fc.

Las secuencias de regiones constantes útiles para producir las proteínas de la presente divulgación pueden obtenerse de varias fuentes diferentes. En algunos ejemplos, la región constante o parte de la misma de la proteína se deriva de un anticuerpo humano. La región constante o parte de la misma puede derivarse de cualquier clase de anticuerpos, incluyendo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, y cualquier isotipo de anticuerpo, incluyendo IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. En un ejemplo, la región constante es el isotipo humano IgG4 o una región constante de IgG4 estabilizada.

En un ejemplo, la región Fc de la región constante tiene una capacidad reducida para inducir la función efectora, por ejemplo, en comparación con una región Fc de IgG1 o IgG3 humana nativa o de tipo nativo. En un ejemplo, la función efectora es la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) y/o la fagocitosis mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCP) y/o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Los métodos para evaluar el nivel de función efectora de una proteína que contiene la región Fc se conocen en la técnica y/o se describen en la presente memoria.

En un ejemplo, la región Fc es una región Fc de IgG4 (es decir, de una región constante de IgG4), por ejemplo, una región Fc de IgG4 humana. Las secuencias de regiones Fc de IgG4 adecuadas serán evidentes para el experto y/o estarán disponibles en bases de datos disponibles públicamente (por ejemplo, disponibles en el National Center for Biotechnology Information).

En un ejemplo, la región constante es una región constante de IgG4 estabilizada. El término "región constante de IgG4 estabilizada" se entenderá que significa una región constante de IgG4 que ha sido modificada para reducir el intercambio de brazos Fab o la propensión a sufrir un intercambio de brazos Fab o la formación de un medio anticuerpo o una propensión a formar un medio anticuerpo. "Intercambio de brazo Fab" se refiere a un tipo de modificación de proteína para IgG4 humana, en la que una cadena pesada de IgG4 y una cadena ligera unida (media molécula) se intercambian por un par de cadenas ligeras y pesadas de otra molécula de IgG4. Por tanto, las moléculas de IgG4 pueden adquirir dos brazos Fab distintos que reconocen dos antígenos distintos (dando como resultado moléculas biespecíficas). El intercambio de brazos Fab se produce de forma natural in vivo y puede ser inducido in vitro por células sanguíneas purificadas o agentes reductores como el glutatión reducido. Un "medio anticuerpo" se forma cuando un anticuerpo IgG4 se disocia para formar dos moléculas, cada una de las cuales contiene una única cadena pesada y una única cadena ligera.

En un ejemplo, una región constante de IgG4 estabilizada comprende una prolina en la posición 241 de la región de bisagra según el sistema de Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest Washington DC United States Department of Health and Human Services, 1987 y/o 1991). Esta posición corresponde a la posición 228 de la región de bisagra según el sistema de numeración de la EU (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest Washington DC United States Department of Health and Human Services, 2001 y Edelman et al., Proc. Natl. Acad. USA, 63, 78-85, 1969). En la IgG4 humana, este resto es generalmente una serina. Después de la sustitución de la serina por prolina, la región bisagra de IgG4 comprende una secuencia CPPC. A este respecto, el experto en la materia sabrá que la "región bisagra" es una porción rica en prolina de una región constante de cadena pesada de anticuerpo que une las regiones Fc y Fab que confiere movilidad a los dos brazos Fab de un anticuerpo. La región de bisagra incluye restos de cisteína que están implicados en los enlaces disulfuro entre cadenas pesadas. Generalmente se define como un estiramiento de Glu226 a Pro243 de la IgG1 humana según el sistema de numeración de Kabat. Las regiones de bisagra de otros isotipos de IgG pueden alinearse con la secuencia de IgG1 colocando el primer y último resto de cisteína que forman enlaces disulfuro (S-S) entre cadenas pesadas en las mismas posiciones (véase por ejemplo el documento de Patente WO2010/080538).

Ejemplos adicionales de anticuerpos IgG4 estabilizados son anticuerpos en los que la arginina en la posición 409 en una región constante de cadena pesada de IgG4 humana (según el sistema de numeración de la EU) se sustituye con lisina, treonina, metionina o leucina (por ejemplo, como se describe en el documento de Patente WO2006/033386). La región Fc de la región constante puede comprender adicional o alternativamente un resto seleccionado del grupo que consiste en: alanina, valina, glicina, isoleucina y leucina en la posición correspondiente a 405 (según el sistema de numeración de la EU). Opcionalmente, la región de bisagra comprende una prolina en la posición 241 (es decir, una secuencia de CPPC) (como se describió anteriormente).

En otro ejemplo, la región Fc es una región modificada para tener una función efectora reducida, es decir, una "región Fc no inmunoestimuladora". Por ejemplo, la región Fc es una región Fc de IgG1 que comprende una sustitución en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 268, 309, 330 y 331. En otro ejemplo, la región Fc es una región Fc de IgG 1 que comprende uno o más de los siguientes cambios E233P, L234V, L235A y eliminación de G236 y/o uno o más de los siguientes cambios A327G, A330S y P331S (Armour et al., Eur J Immunol. 29: 2613-2624, 1999; Shields et al., J Biol Chem. 276 (9): 6591-604, 2001). Se describen ejemplos adicionales de regiones Fc no inmunoestimuladoras, por ejemplo, en Dall'Acqua et al., J Immunol. 177: 1129-1138 2006; y/o Hezareh J Virol; 75: 12161-12168, 2001).

En otro ejemplo, la región Fc es una región Fc quimérica, por ejemplo, que comprende al menos un dominio CH2 de un anticuerpo IgG4 y al menos un dominio C^h3 de un anticuerpo IgG 1, en el que la región Fc comprende una sustitución en una o más posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en 240, 262, 264, 266, 297, 299, 307, 309, 323, 399, 409 y 427 (Numeración EU) (por ejemplo, como se describe en el documento de Patente WO2010/085682). Las sustituciones ejemplares incluyen 240F, 262L, 264T, 266F, 297Q, 299A, 299K, 307P, 309K, 309M, 309P, 323F, 399S y 427F.

Modificaciones adicionales

La presente divulgación también contempla modificaciones adicionales de un anticuerpo o proteína de unión a IL-21 que comprende una región Fc o una región constante.

Por ejemplo, el anticuerpo comprende una o más sustituciones de aminoácidos que aumentan la vida media de la proteína. Por ejemplo, el anticuerpo comprende una región Fc que comprende una o más sustituciones de aminoácidos que aumentan la afinidad de la región Fc por la región Fc neonatal (FcRn). Por ejemplo, la región Fc tiene mayor afinidad por FcRn a pH más bajo, por ejemplo, aproximadamente pH 6,0, para facilitar la unión de Fc/FcRn en un endosoma. En un ejemplo, la región Fc tiene una afinidad aumentada por FcRn a aproximadamente pH 6 en comparación con su afinidad a aproximadamente pH 7,4, lo que facilita la re-liberación de Fc a la sangre después del reciclaje celular. Estas sustituciones de aminoácidos son útiles para extender la vida media de una proteína, al reducir el aclaramiento de la sangre.

Ejemplos de sustituciones de aminoácidos incluyen T250Q y/o M428L o T252A, T254S y T266F o M252Y, S254T y T256E o H433K y N434F según el sistema de numeración de la EU. Se describen sustituciones de aminoácidos adicionales o alternativas, por ejemplo, en los documentos de Patente US20070135620 o US7083784.

Producción de proteínas

En un ejemplo, una proteína de unión a IL-21 descrita en la presente memoria según cualquier ejemplo se produce cultivando un hibridoma en condiciones suficientes para producir la proteína, por ejemplo, como se describe en la presente memoria y/o como se conoce en la técnica.

Expresión recombinante

En otro ejemplo, una proteína de unión a IL-21 descrita en la presente memoria según cualquier ejemplo es recombinante.

En el caso de una proteína recombinante, el ácido nucleico que la codifica se puede clonar en constructos de expresión o vectores, que después se transfectan en células huésped, tales como células E. coli, células de levadura, células de insectos o células de mamíferos, tales como células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO), células de riñón embrionario humano (HEK) o células de mieloma que de otro modo no producen la proteína. Las células ejemplares utilizadas para expresar una proteína son células CHO, células de mieloma o células HEK. Las técnicas de clonación molecular para lograr estos fines se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, en Ausubel et al., (Editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, incluyendo todas las actualizaciones hasta el presente) o Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Una amplia variedad de métodos de clonación y amplificación in vitro son adecuados para la construcción de ácidos nucleicos recombinantes. Los métodos para producir anticuerpos recombinantes también se conocen en la técnica, véase, por ejemplo, los documentos de Patente US4816567 o US5530101.

Después del aislamiento, el ácido nucleico se inserta unido operativamente a un promotor en un constructo de expresión o vector de expresión para clonación adicional (amplificación del DNA) o para la expresión en un sistema libre de células o en células.

Como se usa en la presente memoria, el término "promotor" debe tomarse en su contexto más amplio e incluye las secuencias reguladoras de la transcripción de un gen genómico, incluyendo la caja TATA o el elemento iniciador, que se requiere para un inicio preciso de la transcripción, con o sin elementos reguladores adicionales (por ejemplo, secuencias de activación posterior, sitios de unión de factores de transcripción, potenciadores y silenciadores) que alteran la expresión de un ácido nucleico, por ejemplo, en respuesta a un estímulo del desarrollo y/o externo, o de una manera específica de tejido. En el presente contexto, el término "promotor" también se usa para describir un ácido nucleico recombinante, sintético o de fusión, o un derivado que confiere, activa o potencia la expresión de un ácido nucleico al que está operativamente unido. Los promotores ejemplares pueden contener copias adicionales de uno o más elementos reguladores específicos para mejorar más la expresión y/o alterar la expresión espacial y/o la expresión temporal de dicho ácido nucleico.

Como se usa en la presente memoria, el término "unido operativamente a" significa colocar un promotor en relación con un ácido nucleico de manera que la expresión del ácido nucleico esté controlada por el promotor.

Se encuentran disponibles muchos vectores para la expresión en células. Los componentes del vector generalmente incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: una secuencia de señal, una secuencia que codifica una proteína (por ejemplo, derivada de la información proporcionada en la presente memoria), un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción. El experto en la materia conocerá las secuencias adecuadas para la expresión de una proteína. Las secuencias de señales ejemplares incluyen señales de secreción procariota (por ejemplo, pelB, fosfatasa alcalina, penicilinasa, Ipp o enterotoxina II termoestable), señales de secreción de levadura (por ejemplo, líder de invertasa, líder de factor a o líder de fosfatasa ácida) o señales de secreción de mamíferos (por ejemplo, señal gD del herpes simple).

Los promotores ejemplares activos en células de mamíferos incluyen el promotor temprano inmediato del citomegalovirus (CMV-IE), el promotor del factor de elongación humano 1-a (EF1), los promotores de RNA de núcleos pequeños (U1a y U1b), el promotor de la cadena pesada de la a-miosina, el promotor del virus Simian 40 ( SV40), promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV), promotor tardío principal de adenovirus, promotor de p-actina; elemento regulador híbrido que comprende un potenciador de CMV/promotor de p-actina o un promotor de inmunoglobulina o un fragmento activo del mismo. Ejemplos de líneas celulares huésped de mamíferos útiles son la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo en suspensión; células de riñón de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10); o células de ovario de hámster chino (CHO).

Promotores típicos adecuados para la expresión en células de levadura tales como, por ejemplo, una célula de levadura seleccionada del grupo que comprende Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae y S. Pombe incluyen, pero no se limitan a, el promotor de ADH1, el promotor de GAL1, el promotor de GAL4, el promotor de CUP1, el promotor de PHO5 , el promotor de n m t, el promotor de RPR1 , o el promotor de TEF1 .

Los expertos en la técnica conocen medios para introducir el ácido nucleico aislado o el constructo de expresión que lo comprende en una célula para su expresión. La técnica utilizada para una célula determinada depende de las técnicas exitosas conocidas. Los medios para introducir DNA recombinante en las células incluyen microinyección, transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección mediada por liposomas, tal como por ejemplo mediante el uso de lipofectamina (Gibco, MD, USA) y/o cellfectin (Gibco, MD, USA), captación de Dn A mediada por PEG., electroporación y bombardeo de micropartículas, tal como mediante el uso de partículas de oro o tungsteno recubiertas de DNA (Agracetus Inc., WI, USA), entre otras.

Las células huésped utilizadas para producir la proteína se pueden cultivar en una variedad de medios, dependiendo del tipo de célula utilizado. Los medios comercialmente disponibles tal como e1Ham’s FI0 (Sigma), el Medio Esencial Mínimo ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) y el Medio de Eagle Modificado de Dulbecco ((DMEM), Sigma) son adecuados para el cultivo de células de mamíferos. Los medios para cultivar otros tipos de células discutidos en la presente memoria se conocen en la técnica.

Aislamiento de Proteínas

Los métodos para aislar una proteína se conocen en la técnica y/o se describen en la presente memoria.

Cuando se secreta una proteína de unión a IL-21 en el medio de cultivo, los sobrenadantes de dichos sistemas de expresión pueden concentrarse primero usando un filtro de concentración de proteínas disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Se puede incluir un inhibidor de proteasa tal como PMSF en cualquiera de las etapas anteriores para inhibir la proteólisis y se pueden incluir antibióticos para prevenir el crecimiento de contaminantes adventicios. Alternativamente, o adicionalmente, los sobrenadantes se pueden filtrar y/o separar de las células que expresan la proteína, por ejemplo, usando centrifugación continua.

La proteína de unión a IL-21 preparada a partir de las células se puede purificar usando, por ejemplo, intercambio iónico, cromatografía de hidroxiapatita, cromatografía de interacción hidrófoba, electroforesis en gel, diálisis, cromatografía de afinidad (por ejemplo, cromatografía de afinidad de proteína A o cromatografía de proteína G), o cualquier combinación de los anteriores. Estos métodos son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en el documento de Patente WO99/57134 o Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988).

El experto en la materia también sabrá que una proteína puede modificarse para incluir una etiqueta para facilitar la purificación o detección, por ejemplo, una etiqueta de poli-histidina, por ejemplo, una etiqueta de hexa-histidina, o una etiqueta de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe, o una etiqueta de Simian Virus 5 (V5), o una etiqueta FLAG, o una etiqueta de glutatión S-transferasa (GST). Después, la proteína resultante se purifica usando métodos conocidos en la técnica, tales como purificación por afinidad. Por ejemplo, una proteína que comprende una etiqueta hexa-his se purifica poniendo en contacto una muestra que comprende la proteína con ácido níquel-nitrilotriacético (Ni-NTA) que se une específicamente a una etiqueta hexa-his inmovilizada en un soporte sólido o semisólido, lavando la muestra para eliminar la proteína no unida y, posteriormente, eluyendo la proteína unida. Alternativamente, o, además, se usa un ligando o anticuerpo que se une a una etiqueta en un método de purificación por afinidad.

Conjugados

En un ejemplo, una proteína de unión a IL-21 de la presente divulgación se conjuga con un compuesto. Por ejemplo, el compuesto se selecciona del grupo que consiste en un radioisótopo, una etiqueta detectable, un compuesto terapéutico, un coloide, una toxina, un ácido nucleico, un péptido, una proteína, un compuesto que aumenta la vida media de la proteína de unión a IL-21 en un sujeto y mezclas de los mismos.

El otro compuesto puede unirse directa o indirectamente a la proteína de unión a IL-21 (por ejemplo, puede comprender un enlazador en el caso de unión indirecta). Los ejemplos de compuestos incluyen, un radioisótopo (por ejemplo, yodo-131, itrio-90 o indio-111), una etiqueta detectable (por ejemplo, un fluoróforo o un nanocristal fluorescente o punto cuántico), un compuesto terapéutico (por ejemplo, un quimioterapéutico o un antiinflamatorio), un coloide (por ejemplo, oro), una toxina (por ejemplo, ricina o toxoide tetánico), un ácido nucleico, un péptido (por ejemplo, un péptido que se une a la albúmina sérica), una proteína (por ejemplo, una proteína que comprende un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo o albúmina sérica), un compuesto que aumenta la vida media de la proteína de unión a IL-21 en un sujeto (por ejemplo, polietilenglicol u otro polímero soluble en agua que tenga esta actividad) y mezclas de los mismos. Los compuestos ejemplares que se pueden conjugar con una proteína de unión a IL-21 de la divulgación y los métodos para dicha conjugación se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, en el documento de Patente WO2010/059821.

La proteína de unión a IL-21 puede conjugarse con nanopartículas (por ejemplo, como se revisa en Kogan et al., Nanomedicine (Lond). 2: 287-306, 2007). Las nanopartículas pueden ser nanopartículas metálicas.

La proteína de unión a IL-21 puede estar comprendida en minicélulas bacterianas dirigidas a anticuerpos (por ejemplo, como se describe en el documento de Patente PCT/IB2005/000204).

Algunos ejemplos de compuestos que se pueden conjugar con una proteína de unión a IL-21 de la presente divulgación se enumeran en la Tabla 1.

Tabla 1. Compuestos útiles en conjugación.

Ensayo de la actividad de una proteína de unión a IL-21

Unión a IL-21 y mutantes de la misma

Resultará evidente para el experto en la técnica a partir de la divulgación en la presente memoria que algunas proteínas de unión a IL-21 de la presente divulgación se unen a la hIL-21 y a formas mutantes específicas de hIL-21. Los métodos para evaluar la unión a una proteína se conocen en la técnica, por ejemplo, como se describe en Scopes (In: Protein purification: principles and practice, Third Edition, Springer Verlag, 1994). Un método de este tipo generalmente implica inmovilizar la proteína de unión a IL-21 y ponerla en contacto con el antígeno marcado. Después del lavado para eliminar la proteína unida no específica, se detecta la cantidad de marcador y, como consecuencia, el antígeno unido. Por supuesto, la proteína de unión a IL-21 puede marcarse e inmovilizarse el antígeno. También se pueden utilizar ensayos de tipo barrido. Alternativamente, o adicionalmente, pueden usarse ensayos de resonancia de plasmón superficial.

Opcionalmente, se determina la constante de disociación (Kd), la constante de asociación (Ka) y/o la constante de afinidad (K^d) de una proteína de unión a IL-21 inmovilizada para IL-21 o un epítopo de la misma. La "Kd" o "Ka" o "K^d" para una proteína de unión a IL-21 se mide en un ejemplo mediante un ensayo de unión a IL-21 marcado radiactivamente o marcado con fluorescencia. En el caso de una "Kd ", este ensayo equilibra la proteína de unión a IL-21 con una concentración mínima de IL-21 marcado en presencia de una serie de titulación de IL-21 sin marcar Después del lavado para eliminar la IL-21 no unida, se determina la cantidad de marcador, que es indicativa de la Kd de la proteína.

Según otro ejemplo la Kd, Ka o K^dse mide usando ensayos de resonancia de plasmón de superficie, por ejemplo, usando resonancia de plasmón de superficie BIAcore (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) con IL-21 inmovilizada o una región de la misma o proteína de unión a IL-21 inmovilizada.

En algunos ejemplos, la proteína de unión a IL-21 tiene una K^dsimilar o una K^dmejorada (es decir, un valor de K^dinferior) que el anticuerpo 8E2, porque es probable que compitan por la unión a IL-21.

Determinación de la unión competitiva

Los ensayos para determinar una proteína que inhibe competitivamente la unión del anticuerpo 2P2 serán evidentes para el experto en la materia. Uno de dichos métodos se ejemplifica en la presente memoria.

Por ejemplo, el anticuerpo se conjuga con un marcador detectable, por ejemplo, un marcador fluorescente o un marcador radiactivo. A continuación, el anticuerpo marcado y la proteína de unión a IL-21 de prueba se mezclan y se ponen en contacto con IL-21 o una región de la misma o una célula que expresa la misma. A continuación, se determina el nivel de anticuerpo marcado y se compara con el nivel determinado cuando el anticuerpo marcado se pone en contacto con la región o las células de IL-21 en ausencia de la proteína de unión a IL-21. Si el nivel de anticuerpo marcado se reduce en presencia de la proteína de unión a IL-21 de prueba en comparación con la ausencia de la proteína de unión a IL-21, se considera que la proteína de unión a IL-21 inhibe competitivamente la unión del anticuerpo a IL-21.

Opcionalmente, la proteína de unión a IL-21 de prueba se conjuga con un marcador diferente del anticuerpo. Este marcaje alternativo permite la detección del nivel de unión de la proteína de unión a IL-21 de prueba a IL-21 o la región de la misma o la célula.

Determinación de la actividad agonista

En algunos ejemplos de la presente divulgación, una proteína es capaz de potenciar la actividad de IL-21.

Se conocen varios ensayos en la técnica para evaluar la capacidad de una proteína para mejorar la señalización de un ligando a través de un receptor.

En un ejemplo, la proteína de unión a IL-21 potencia la proliferación de células (por ejemplo, células BaF3) que expresan IL-21R y gp130 (por ejemplo, células modificadas para expresar ambas proteínas) que se cultivan en presencia de IL-21. Las células (por ejemplo, aproximadamente 1x104 células) se cultivan en presencia de IL-21 (por ejemplo, entre aproximadamente 0,5 ng/ml y aproximadamente 5 ng/ml (tal como 0,5 ng/ml o 5 ng/ml) para hIL-21 y la presencia o ausencia de una proteína de unión a IL-21 de prueba. Los métodos para evaluar la proliferación celular son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, reducción de MTT y/o incorporación de timidina. Una proteína de unión a IL-21 que mejora el nivel de proliferación en comparación con el nivel observado en ausencia de la proteína de unión a IL-21 se considera que potencia o agoniza la señalización de IL-21.

Se puede realizar un ensayo similar al descrito en el párrafo anterior con células B9 o células T10 (Dams-Kozlowska et al., BMC Biotechnol, 12: 8, 2012; y Yokote et al., J AOAC, 83: 1053-1057, 2000). En el caso de un ensayo que utilice células T10, la proliferación se puede medir detectando colorimétricamente la reducción del compuesto de tetrazolio, disulfonato de 4-[3-(4-yodofenil)-2-(4-nitrofenil)-2H-5-tetrazolio]-1,3- benceno (WST-1).

La presente divulgación contempla otros métodos para evaluar la potenciación de la señalización de IL-21.

Determinación de la vida media de IL-21

La vida media de IL-21 se puede medir, por ejemplo, mediante estudios farmacocinéticos, por ejemplo, según el método descrito por Kim et al., Eur J of Immunol 24: 542, 1994. Según este método, la IL-21 radiomarcada se inyecta por vía intravenosa en ratones y su concentración plasmática se mide periódicamente en función del tiempo, por ejemplo, de 3 minutos a 72 horas después de la inyección. La curva de aclaramiento así obtenida debe ser bifásica, es decir, una fase alfa y una fase beta. Para la determinación de la vida media in vivo de la proteína, se calcula la velocidad de aclaramiento en la fase beta y se compara con la de la proteína de tipo nativo o no modificada.

Evaluación de la eficacia terapéutica

Los ensayos para evaluar la eficacia terapéutica se describen anteriormente en la presente memoria en relación con la determinación de la neutralización por una proteína de unión a IL-21.

En otro ejemplo, la eficacia de una proteína para tratar una afección se evalúa mediante un ensayo in vivo.

Por ejemplo, la proteína de unión a IL-21 se puede probar en un modelo de cáncer, por ejemplo, cáncer gástrico. Por ejemplo, ratones homólogos para el mutante Y757F de gp130 (gp130Y757F/Y757F) desarrollan tumores gástricos Jenkins et al., Blood 109: 2380-2388, 2007). Los ratones (por ejemplo, ratones de ocho semanas) se tratan con una proteína de unión a IL-21 y se evalúa el número y/o el peso de pólipos gástricos. Una proteína de unión a IL-21 que reduce el tamaño y/o el peso de los pólipos se considera útil para tratar el cáncer. Se puede utilizar un ensayo similar para probar un efecto sobre el cáncer de colon, en el que los ratones gp130Y757F/Y757F se tratan con azoximetano (AOM) seguido de dextrano sulfato de sodio (DSS) esencialmente como se describe en Greten (et al., Cell, 118: 285-296, 2004) para inducir cáncer de colon antes del tratamiento con la proteína de unión a IL-21.

La proteína de unión a IL-21 se puede probar adicional o alternativamente en un modelo de metástasis de cáncer o enfermedad ósea relacionada con el cáncer, por ejemplo, como se describe en Li et al., Oncol. Lett. 3: 802-806, 2012.

Condiciones a tratar

IL-21 es una citocina derivada de células T CD4+ que es importante para una inmunidad mediada por células T CD8+ óptima, activación de NK y respuestas humorales óptimas tal como la producción de anticuerpos y la maduración de las células B. Se ha demostrado que IL-21 induce varias citocinas proinflamatorias tales como IL18, IL-15, IL-5, IL-6, IL-7A, IL-17F, TNFRII, sCD25 y RANTES.

Las proteínas de unión a IL-21 de la presente divulgación son útiles en el tratamiento de cánceres. Los cánceres ejemplares incluyen tumores quísticos y sólidos, tumores de huesos y tejidos blandos, incluyendo tumores en tejido anal, conducto biliar, vejiga, glóbulos, cono, intestino, cerebro, mama, carcinoide, cuello uterino, ojo, esófago, cabeza y cuello, riñón, laringe, leucemia, hígado, pulmón, ganglios linfáticos, linfoma, melanoma, mesotelioma, mieloma, ovario, páncreas, pene, próstata, piel, sarcomas, estómago, testículos, tiroides, vagina, vulva. Los tumores de tejido blando incluyen schwannoma benigno monosomía, tumor desmoide, lipoblastoma, lipoma, leiomioma uterino, sarcoma de células claras, dermatofibrosarcoma, sarcoma de Ewing, condrosarcoma mixoide extraesquelético, mixoide de liposarcooma, rabdomiosarcoma alveolar y sarcoma sinovial. Los tumores óseos específicos incluyen fibroma no osificante, quiste óseo unicameral, enchon-droma, quiste óseo aneurismático, osteoblastoma, condroblastoma, condromixofibroma, fibroma osificante y adamantinoma, tumor de células gigantes, displasia fibrosa, granulondoma eosinofílico del sarcoma de Ewing, osteosarcoma, condroma, histiocitoma fibroso maligno y carcinoma metastásico. Las leucemias incluyen linfoblástica aguda, mieloblástica aguda, linfocítica crónica y mieloide crónica.

Las proteínas de unión a IL-21 de la presente divulgación son útiles en el tratamiento y prevención de infecciones virales humanas. Los ejemplos de infecciones virales incluyen infecciones causadas por virus de DNA (por ejemplo, virus del herpes tales como los virus del herpes simple. Virus de Epstein-Barn. Citomegalovirus; virus de la viruela tal como el virus de la viruela Variola (viruela); hepadnavirus (por ejemplo, virus de la hepatitis B); virus del papiloma; Adenovirus); Virus de RNA (por ejemplo, VIH I, II; HTLV I, II; Poliovirus; Hepatitis A; coronovirus, tal como el síndrome respiratorio agudo repentino (SARS); Ortomixovirus (por ejemplo, Virus de la gripe); Paramixovirus (por ejemplo, Virus del sarampión); Virus de la rabia: Virus de la hepatitis C), flavivirus, virus de la gripe; calicivirus; virus de la rabia, virus de la peste bovina, virus Arena y similares. Además, los ejemplos de los tipos de enfermedades relacionadas con virus para las que podría usarse IL-21 incluyen, pero no se limitan a: inmunodeficiencia adquirida; Hepatitis; Gastroenteritis; Enfermedades hemorrágicas; Enteritis; Carditis; Encefalitis; Parálisis; Bronquiolitis; Enfermedad de las vías respiratorias superiores e inferiores; Papilomatosis respiratoria; Artritis; Enfermedad diseminada, meningitis. Mononucleosis.

Las proteínas de unión a IL-21 de la presente divulgación también son útiles en el tratamiento de infecciones microbianas que incluyen clamidias, listerias, helicobacter pylori, mycobacterium, mycoplasma, bacillus anthracis, salmonella, y shigella.

Las proteínas de unión a IL-21 de la presente divulgación también son útiles como monoterapia para infecciones virales agudas y crónicas y para pacientes inmunodeprimidos. Los métodos que mejoran la inmunidad pueden acelerar el tiempo de recuperación en pacientes con infecciones no resueltas. Las inmunoterapias pueden tener un impacto aún mayor en subconjuntos de pacientes inmunodeprimidos, tales como los muy jóvenes o ancianos, así como en los pacientes que sufren inmunodeficiencias adquiridas a través de una infección o inducidas después de intervenciones médicas tal como la quimioterapia o la ablación de la médula ósea. Los ejemplos de los tipos de indicaciones que se tratan mediante inmunomodulación incluyen; el uso de IFN-a para la hepatitis crónica, el uso de IL-2 después de la infección por HIV y el uso de interferón para tratar las infecciones por el virus de Epstein Barr después de un trasplante.

Las proteínas de unión a IL-21 de la presente divulgación también son útiles como inmunoterapia de alergia para el tratamiento de, por ejemplo, rinitis alérgica, fiebre del heno y asma bronquial.

Composiciones

En algunos ejemplos, una proteína de unión a IL-21 como se describe en la presente memoria se puede administrar por vía oral, parenteral, por inhalación, adsorción, absorción, tópica, rectal, nasal, bucal, vaginal, intraventricular, a través de un depósito implantado en formulaciones de dosificación que contienen vehículos farmacéuticamente aceptables no-tóxicos convencionales, o por cualquier otra forma de dosificación conveniente. El término "parenteral", como se usa en la presente memoria, incluye técnicas de inyección o infusión subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, intraesternal e intracraneal.

Los métodos para preparar una proteína de unión a IL-21 en una forma adecuada para su administración a un sujeto (por ejemplo, una composición farmacéutica) son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, los métodos como se describe en Remington’s Pharmaceutical Sciences (18a ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990) y U.S. Pharmacopeia: National Formulary (Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1984).

Las composiciones farmacéuticas de esta divulgación son particularmente útiles para la administración parenteral, tal como la administración intravenosa o la administración en una cavidad corporal o lumen de un órgano o articulación. Las composiciones para la administración comprenderán comúnmente una solución de una proteína de unión a IL-21 disuelta en un vehículo farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, un vehículo acuoso. Puede usarse una variedad de vehículos acuosos, por ejemplo, solución salina tamponada y similares. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximar las condiciones fisiológicas tales como agentes reguladores de pH y tamponadores, agentes reguladores de la toxicidad y similares, por ejemplo, acetato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, lactato de sodio y similares. La concentración de proteínas de unión a IL-21 de la presente divulgación en estas formulaciones puede variar ampliamente y se seleccionará principalmente en función de los volúmenes de fluido, viscosidades, peso corporal y similares según el modo particular de administración seleccionado y las necesidades del paciente. Los vehículos ejemplares incluyen agua, solución salina, solución de Ringer, solución de dextrosa y albúmina de suero humano al 5%. También se pueden usar vehículos no acuosos tales como aceites mixtos y oleato de etilo. Los liposomas también se pueden usar como vehículos. Los vehículos pueden contener cantidades menores de aditivos que mejoran la isotonicidad y la estabilidad química, por ejemplo, tampones y conservantes.

Tras la formulación, se administrará una proteína de unión a IL-21 de la presente divulgación de una manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad tal que sea terapéutica/profilácticamente eficaz. Las formulaciones se administran fácilmente en una variedad de formas de dosificación, tal como el tipo de soluciones inyectables descritas anteriormente, pero también se contemplan otras formas farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, tabletas, píldoras, cápsulas u otros sólidos para administración oral, supositorios, pesarios, soluciones nasales o pulverizaciones, aerosoles, inhalantes, formas liposomales y similares. También se pueden usar cápsulas o composiciones farmacéuticas de "liberación lenta". Las formulaciones de liberación lenta se diseñan generalmente para proporcionar un nivel de fármaco constante durante un período prolongado y se pueden usar para administrar una proteína de unión a IL-21 de la presente divulgación.

El documento de Patente WO2002/080967 describe composiciones y métodos para administrar composiciones en aerosol que comprenden anticuerpos para el tratamiento de, por ejemplo, asma, que también son adecuados para la administración de una proteína de unión a IL-21 de la presente divulgación.

Terapias combinadas

En un ejemplo, una proteína de unión a IL-21 de la presente divulgación se administra en combinación con uno o más de otros compuestos útiles para tratar una afección descrita en la presente memoria, ya sea como etapas de tratamiento combinadas o adicionales o como componentes adicionales de una formulación terapéutica.

En otro ejemplo, el otro compuesto es un fármaco de quimioterapia u otro fármaco utilizado para tratar el cáncer.

En otro ejemplo, la proteína descrita en la presente memoria se administra antes o después de la radioterapia para el tratamiento del cáncer.

En otro ejemplo, la proteína de unión a IL-21 de la presente divulgación se administra en combinación con una inmunoterapia.

Las inmunoterapias adecuadas incluyen, pero no se limitan a: inhibidores de puntos de control; inhibidores de tirosina quinasa, inhibidores del receptor del factor de necrosis tumoral, citocinas o interleucinas; interferones; factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos; vacunas (vacuna contra el cáncer o enfermedad infecciosa); medicamentos antivirales; virus oncolíticos; polisacáridos tales como beta glucano (Lentinan); y terapias de células adoptivas (ACT) tales como células T cultivadas ex vivo para un destino de linfocitos T citotóxicos de una manera independiente de células T auxiliares o células T modificadas genéticamente para expresar receptores de antígenos quiméricos (CARs).

Las inmunoterapias adecuadas pueden dirigirse a, pero no limitarse a, lo siguiente:

Muerte programada 1 (PD1), ligando de muerte programada 1 (PDL1) o ligando de muerte programada 2 (PDL2), grupo de diferenciación 80 (CD80), grupo de diferenciación 80 (CD86), proteína 1 relacionada con B7 (B7RP1), grupo de Diferenciación 276 (CD276), Grupo de diferenciación 274 (CD274), mediador de entrada de herpesvirus (HVEM), Grupo de ligando de diferenciación (CD137L), Ligando del miembro 4 de la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral (OX40L), Grupo de diferenciación (CD70), Grupo de Diferenciación (CD40), Galectina 9 (GAL9), Grupo de Diferenciación 28 (CD28), Activador 4 del linfocito T citotóxico (CTLA4), coestimulador inducible de células T (ICOS), atenuador de linfocitos B y T (BTLA), receptores de tipo inmunoglobulina de células asesinas (KIR), TCR, gen 3 de activación de linfocitos (LAG3), receptor de muerte 5 (DRS), grupo de diferenciación 137 (CD137), miembro de la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral 42 (OX40), grupo de diferenciación 27 ( CD27), ligando del grupo de diferenciación 40 (CD40L), receptor de adenosina A2a (AZaR) y TIM3 (inmunoglobulina de células T-3).

Los inhibidores de puntos de control adecuados incluyen: los inhibidores de PD-1 Nivolumab (Bristol-Myers Squibb/Ono Pharmaceutical), Lambrolizumab (MK-3475; Merck), Pidilizunab (CureTech/Teva) y AMP-224 (Amplimmune/GlaxoSmithKline); los inhibidores de PD-L1 RG-7446 (Roche) y MEDI-4736 (AstraZeneca); y el inhibidor de CTLA-4 Ipilimumab. Los inhibidores de tirosina quinasa adecuados incluyen Sorafinib, Imatinib, Gefinitib, Palladia, Erlotinib, Lapatinib, Sunitinib, Nilotinib. Los inhibidores de los receptores del factor de necrosis tumoral adecuados incluyen anticuerpos dirigidos al DRS. Las citocinas o interleucinas adecuadas incluyen IL-2, IL-7, IL-12. Los interferones adecuados incluyen IFN-alfa, IFN-beta e IFN-gamma. Un factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos adecuado incluye sargramostina. Las vacunas adecuadas incluyen Sipuleucel-T y los virus oncolíticos adecuados incluyen Talimogene laherparepvec.

En otro ejemplo, la proteína de unión a IL-21 de la presente divulgación se administra en combinación con inhibidores, tales como anticuerpos, dirigidos a DR5 y/o CD137.

En otro ejemplo, la proteína de unión a IL-21 de la presente divulgación se administra en combinación con un fármaco inmunomodulador.

Los fármacos inmunomoduladores adecuados incluyen Thalidomice (Thalomid), lenalidomide (Revlimid) y pomalidomide (Pomalyst).

Posología y tiempo de administración

Las dosis adecuadas de una proteína de unión a IL-21 de la presente divulgación variarán dependiendo de la proteína de unión a IL-21 específica, la afección a tratar y/o el sujeto a tratar. Está dentro de la capacidad de un médico experto determinar una dosis adecuada, por ejemplo, comenzando con una dosis subóptima y modificando gradualmente la dosis para determinar una dosis óptima o útil. Alternativamente, para determinar una dosis apropiada para el tratamiento/profilaxis, se utilizan datos de los ensayos de cultivo celular o estudios en animales, en donde una dosis adecuada está dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la ED⁵⁰del compuesto activo con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. Una dosis terapéutica/profilácticamente eficaz puede estimarse inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Se puede formular una dosis en modelos animales para lograr un intervalo de concentración plasmática circulante que incluya la IC⁵⁰(es decir, la concentración o cantidad del compuesto que logra la mitad de la inhibición máxima de los síntomas) según se determina en cultivo celular. Dicha información se puede utilizar para determinar con mayor precisión las dosis útiles en humanos. Los niveles en plasma pueden medirse, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alta resolución.

En algunos ejemplos, un método de la presente divulgación comprende administrar una cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz de una proteína descrita en la presente memoria.

El término "cantidad terapéuticamente eficaz" es la cantidad que, cuando se administra a un sujeto que necesita tratamiento, mejora el pronóstico y/o el estado del sujeto y/o que reduce o inhibe uno o más síntomas de una afección clínica descrita en la presente memoria a un nivel que está por debajo del observado y aceptado como clínicamente diagnóstico o clínicamente característico de esa afección. La cantidad que se administrará a un sujeto dependerá de las características particulares de la afección a tratar, el tipo y etapa de la afección a tratar, el modo de administración y las características del sujeto, tales como salud general, otras enfermedades, edad, sexo, genotipo y peso corporal. Una persona experta en la técnica será capaz de determinar las dosis apropiadas dependiendo de estos y otros factores. Por consiguiente, este término no debe interpretarse para limitar la presente divulgación a una cantidad específica, por ejemplo, peso o cantidad de proteína (s), sino que la presente divulgación abarca cualquier cantidad de la proteína (s) de unión a IL-21 suficiente para lograr el resultado indicado en un sujeto.

Como se usa en la presente memoria, el término "cantidad profilácticamente eficaz" debe entenderse como una cantidad suficiente de una proteína para prevenir, inhibir o retrasar la aparición de uno o más síntomas detectables de una afección clínica. El experto en la materia sabrá que dicha cantidad variará dependiendo de, por ejemplo, la proteína o proteínas de unión a IL-21 específicas administradas y/o el sujeto particular y/o el tipo o gravedad o nivel de la afección y/o predisposición (genética o de otro tipo) a la enfermedad. Por consiguiente, este término no debe interpretarse como que limita la presente divulgación a una cantidad específica, por ejemplo, el peso o la cantidad de proteína (s) de unión a IL-21, sino que la presente descripción abarca cualquier cantidad de la proteína (s) de unión a IL-21. (s) suficiente para lograr el resultado indicado en un sujeto.

Para la administración in vivo de la proteína de unión a IL-21 descrita en la presente memoria, las cantidades de dosificación normales pueden variar desde aproximadamente 10 ng/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg del peso corporal de un individuo o más por día. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la gravedad de la enfermedad o trastorno a tratar, el tratamiento puede mantenerse hasta que se logre la supresión deseada de los síntomas.

En algunos ejemplos, la proteína de unión a IL-21 se administra en una dosis inicial (o de carga) de entre aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, tal como de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, o aproximadamente 1 mg/kg o aproximadamente 2 mg/kg o 5 mg/kg. La proteína de unión a IL-21 se puede administrar después a una dosis de mantenimiento más baja de entre aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 2 mg/kg, tal como de aproximadamente 0,05 mg/kg a aproximadamente 1 mg/kg, por ejemplo, de aproximadamente 0,1 mg./kg a aproximadamente 1 mg/kg, tal como aproximadamente 0,1 mg/kg o 0,5 mg/kg o 1 mg/kg. Las dosis de mantenimiento se pueden administrar cada 7-30 días, tal como, cada 10-15 días, por ejemplo, cada 10 u 11 o 12 o 13 o 14 o 15 días.

En algunos ejemplos, la proteína de unión a IL-21 se administra en una dosis de entre aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, tal como entre aproximadamente 0,05 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, por ejemplo, entre aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, por ejemplo, entre aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, tal como entre aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 2 mg/kg. Por ejemplo, la proteína de unión a IL-21 se administra en una dosis de entre aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, tal como de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 2 mg/kg, tal como aproximadamente 0,2 mg/kg o 0,3 mg/kg o 0,5 mg/kg o 1 mg/kg o 1,5 mg/kg (por ejemplo, sin una dosis de carga más alta o una dosis de mantenimiento más baja). En algunos ejemplos, se administran numerosas dosis, por ejemplo, cada 7-30 días, por ejemplo, cada 10-22 días, por ejemplo, cada 10-15 días, por ejemplo, cada 10 u 11 o 12 o 13 o 14 o 15 o 16 o 17 o 18 o 19 o 20 o 21 o 22 días. Por ejemplo, la proteína de unión a IL-21 se administra cada 7 días o cada 14 días o cada 21 días.

En algunos ejemplos, en el momento de comenzar la terapia, al mamífero se le administra la proteína de unión a IL-21 en no más de 7 días consecutivos o 6 días consecutivos o 5 días consecutivos o 4 días consecutivos.

En el caso de un mamífero que no responda adecuadamente al tratamiento, se pueden administrar múltiples dosis en una semana. Alternativamente, o, además, se pueden administrar dosis crecientes.

En otro ejemplo, para los mamíferos que experimentan una reacción adversa, la dosis inicial (o de carga) se puede dividir en numerosos días en una semana o en numerosos días consecutivos.

La administración de una proteína de unión a IL-21 según los métodos de la presente divulgación puede ser continua o intermitente, dependiendo, por ejemplo, de la afección fisiológica del receptor, si el propósito de la administración es terapéutico o profiláctico y otros factores conocidos por los practicantes expertos. La administración de una proteína de unión a IL-21 puede ser esencialmente continua durante un período de tiempo preseleccionado o puede ser en una serie de dosis espaciadas, por ejemplo, durante o después del desarrollo de una afección.

Kits

La presente divulgación comprende adicionalmente un kit que comprende uno o más de los siguientes:

(i) una proteína de unión a IL-21 de la divulgación o constructo (s) de expresión que codifica la misma;

(ii) una célula de la divulgación;

(iii) un complejo de la divulgación; o

(iii) una composición farmacéutica de la divulgación.

En el caso de un kit para detectar IL-21, el kit puede comprender adicionalmente un medio de detección, por ejemplo, unido a una proteína de unión a IL-21 de la divulgación.

En el caso de un kit para uso terapéutico/profiláctico, el kit puede comprender adicionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Opcionalmente, se empaqueta un kit de la divulgación con instrucciones para su uso en un método descrito en la presente memoria según cualquier ejemplo.

La presente divulgación incluye los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplos

Métodos

Ensayo de proliferación de células B humanas

Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de donantes humanos sanos según las técnicas estándar y las PBMCs se tiñeron con CFSE y después se clasificaron en células B nativas CD19+ CD27- IgD+ y células B de memoria CD19+ CD27+ IgD-. Las células clasificadas se sembraron en una placa de cultivo. A continuación, las células se estimularon con 0,5 a 50 ng/ml de IL-21 humana con o sin 2P2. Después de 5 días, se determinó la proliferación celular mediante dilución de CFSE o ensayo de proliferación de timidina 3H.

Ensayo ELISA de vida media in vivo

Para detectar la vida media del complejo hIL-21 /2P2 in vivo, se inyectaron ratones I.V. o S.C. con hIL-21 /2P2 o hIL-21 solo, donde 2P2 en el complejo se ha biotinilado usando un kit de biotinilación comercial. Después de 1 hora, 3 horas, 8 horas y 24 horas después de la inyección, se extrajo sangre de los ratones y se midieron los niveles de hIL-21 en suero mediante ELISA. El ensayo ELISA se realizó recubriendo la placa con 3A3 no conjugado, seguido de bloqueo e incubación con suero. Posteriormente, la placa se incubó con 2P2 biotinilado y se detectó con sustratos de estreptavidina-HRP y TMB.

Ensayo ELISA

Para detectar epítopos de 2P2 y 3A3, se sintetizaron comercialmente péptidos que consistían en diferentes regiones de hIL-21 y se recubrieron en una placa ELISA, seguido de bloqueo de sitios de unión no específicos con BSA al 3% en PBS. A continuación, se añadieron 2P2 o 3A3 biotinilados a los pocillos y se desarrollaron con sustratos de estreptavidina-HRP y TMB.

A continuación, se ensayó la capacidad de los epítopos identificados en los experimentos previos para bloquear la unión de 2P2 o 3A3 a hIL-21 de longitud completa. Se recubrió hIL-21 de longitud completa sobre una placa de EIA seguido del bloqueo de los sitios de unión no específicos con BSA. A continuación, se añadieron 2P2 o 3A3 biotinilados con los péptidos correspondientes y se incubaron en una placa, seguido de la detección con sustratos de TMB.

Ejemplo 1 Selección de los anticuerpos anti-IL-21

Los inventores generaron una biblioteca de anticuerpos monoclonales para IL-21 humana (hIL-21). Los clones se seleccionaron por su capacidad para mejorar la proliferación de células de células B humanas primarias (células BaF3) que expresan el receptor de IL-21 humano (células BaF3-hIL-21 R; Parrish-Novak J et al. (2000) Nature 408: 57-63). Cada anticuerpo monoclonal se diluyó en serie 10 veces como se muestra en la Figura 1 y se mezcló con 2 ng/ml de hIL-21 y se incubó con las células BaF3-hIL-21R cultivadas en medio RPMI-1640 respectivamente en una cámara humidificada con 5% de CO²a 37°C. Para el ensayo de incorporación de timidina marcada con [3H] para medir la proliferación celular, las células BaF3-huIL-21 R se privaron de alimento en el medio de cultivo sin citocina durante 18 h y después se incubaron durante 72 h con la adición de 1 pCi/pocillo de [3H] -timidina (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA) durante las últimas 18 h de cultivo en presencia de citocina. Las células se recogieron sobre esteras de filtro (Perkin Elmer) y se contaron los ácidos nucleicos radiactivos incorporados usando un contador de centelleo Top Count NXT Scintillation Counter (Packard Biosciences, Meriden, CT, USA). Los resultados se expresaron como recuento medio por minuto (CPM) para cultivos por triplicado.

Como se demuestra en la Figura 1, el anticuerpo monoclonal 2P2 aumentó la proliferación de células BaF3-hIL-21R de una manera dependiente de la dosis. Por consiguiente, el anticuerpo 2P2 demostró una capacidad potenciadora de la proliferación celular en presencia de la citocina IL-21, lo que sugiere que el anticuerpo puede funcionar como un agonista de la IL-21 humana. Las CDRs pesadas y ligeras de VH y VL y se muestran en la Figura 2. Las secuencias de CDR determinadas mediante el esquema de numeración IMGT están subrayadas.

Ejemplo 2 mAB 2P2 potencia hIL-21 a través del receptor de IL-21

A continuación, los inventores determinaron si la capacidad potenciadora del anticuerpo monoclonal 2P2 era específica del receptor de IL-21 humano. Se sembraron células BaF3 humanas primarias, células BaF3 que expresan un receptor de IL-21 murino (BaF3-mIL-21R) y células BaF3 que expresan un receptor de IL-21 humano (BaF3-hIL-21R) en presencia de 0,1, 1,0 y 10,0 pg/ml de anticuerpo 2P2 (Figura 3A) y 2 ng/ml de IL-21 humana. Las secuencias codificantes de IL-21R humano (hulL-21 R) e IL-21R de ratón (msIL-21R) se clonaron mediante PCR a partir de bibliotecas de cDNA de ratón o humano respectivamente, secuenciadas para coincidir con NM_021798 y NM_021887. Para el ensayo de incorporación de timidina marcada con [3H] para medir la proliferación celular, las células Ba/F3-huIL-21 R o Ba/F3-mIL-21 R se privaron de alimento en el medio de cultivo sin citocina durante 18 h y A continuación se incubaron durante 72 h con la adición de 1 pCi/pocillo de [3H]-timidina (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA) durante las últimas 18 h de cultivo en presencia de citocinas con las concentraciones indicadas. Las células se recogieron sobre esteras de filtro (Perkin Elmer) y se contaron los ácidos nucleicos radiactivos incorporados usando un contador de centelleo Top Count NXT Scintillation Counter (Packard Biosciences, Meriden, CT, USA). Los resultados se expresaron como recuento medio por minuto (CPM) para cultivos por triplicado.

Los resultados demostraron que 2P2 aumentó específicamente la proliferación de células Ba/F3-hIL-21 R, pero no de células Ba/F3-mIL-21 R o Ba/F3, lo que indica que la actividad del anticuerpo 2P2 era específica de IL-21 humana, ya que no lo hizo mejorar la función de IL-21 murina. La Figura 3B muestra el efecto sobre la proliferación celular de células Ba/F3-hIL-21 R (círculos cerrados) y células BaF3-mIL-21 R (círculos abiertos) por 2P2 representado frente a IL-12 humana (ng/ml). A una concentración de 10 pg/ml de 2P2, la bioactividad de la IL-21 humana aumentó más de 10 veces. Sin embargo, no hubo efecto sobre la bioactividad de IL-21 humana en presencia de células que expresan el receptor de IL-21 murino.

Ejemplo 32P2 potencia la proliferación de células B humanas mediada por hIL-21

Las células B humanas se enriquecieron a partir de células mononucleares de sangre periférica de donantes sanos utilizando los marcadores CD19, CD27, CD4 y CD45. La proliferación de células B se midió usando citometría de flujo según métodos estándar. Las células se marcaron con éster de succinimidil-carboxifluoresceína (CFSE) y se incubaron en presencia de 0, 0,3, 1, 5, 20 y 100 ng/ml de IL-21 humana. El porcentaje de células que se habían sometido al menos a una división se determinó mediante citometría de flujo. Como se muestra en la Figura 4A, por ejemplo, a 20 ng/ml de IL-21 humana, proliferaron aproximadamente el 67% de las células B humanas. En la Figura 4B, los datos de citometría de flujo se reproducen como las primeras seis barras. Las cuatro barras restantes muestran el porcentaje de células B proliferadas en presencia de 5 ng/ml de IL-21 y 0, 0,01,01 y 1 pg/ml de anticuerpo 2P2. 5 ng/ml de hIL-21 más 1 pg/ml de mAb 2P2 demostraron una bioactividad similar a 100 ng/ml de hIL-21 en ausencia de anticuerpo 2P2, lo que demuestra que mAb 2P2 aumentó la bioactividad de hIL-21 en aproximadamente 20 veces, lo que sugiere que era un potente agonista de la actividad de IL-21.

Ejemplo 42P2 potencia la activación de células T CD8 humanas mediada por hIL-21

Se incubaron células T CD8 humanas en presencia de IL-21 a las diversas concentraciones que se muestran en la Figura 5. En los primeros tres paneles, las células se incubaron en presencia de IL-21 sola (2 ng/ml y 25 ng/ml) e IL-21 más 2P2 (2 ng/ml y 1 pg/ml respectivamente). En el segundo panel, las células se incubaron en presencia de IL-21 sola (10 ng/ml y 100 ng/ml) e IL-21 más 2P2 (10 ng/ml y 10 pg/ml respectivamente). Las células se tiñeron para granzima B y perforina que eran indicativas de la activación de las células T CD8 ya que la expresión de estas moléculas citotóxicas es importante para la inmunidad antivirus y antitumoral. El porcentaje de células dobles positivas de granzima B/perforina se muestra en el cuadrante superior derecho. La Figura 5 muestra que los 2 ng/ml de hIL-21 más 1 pg/ml de mAb 2P2 demostraron una mejor bioactividad en las células T que la de 25 ng/ml de hIL-21 solo (21,89% positivo frente al 20,29% positivo) y 10 ng/ml de hIL-21 más 10 pg/ml de mAb 2P2 demostraron una mejor bioactividad que la de 10 ng/ml de hIL-21 solo (31,70% frente a 25,77% positivo), lo que indica un aumento de más de 10 veces de la bioactividad de hIL-21 por mAb 2P2.

Ejemplo 5 El anticuerpo monoclonal 2P2 prolonga la vida media de hIL-21 in vivo

La semivida sérica de los complejos hIL-21 /2P2 y hIL-21/3A3 se determinó in vivo según un ensayo ELISA. Se inyectaron por vía intravenosa a ratones de tipo nativo 25 pg de hIL-21; 25 pg de hIL-21 y 125 pg de 2P2-biotina; o 25 pg de hIL-21 y 125 pg de 3A3-biotina. Los ratones se extrajeron sangre de la mejilla a las 1, 3, 8 y 24 horas y se obtuvieron 100 pl de sangre. A continuación, la sangre se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente para obtener suero. La medición del nivel de hIL-21 en el suero se determinó mediante ELISA. El límite de detección del ensayo es 1 ng/ml. La Figura 6 muestra la detección de complejos de hIL-21 /2P2 administrados por vía intravenosa (IV) o subcutánea (SC) a partir de suero durante 24 horas. La ²P²administrada por cualquier vía dio como resultado un aumento significativo en la retención sérica de hIL-21 en todos los puntos de tiempo analizados en comparación con la hIL-12 administrada sola. 2P2 aumentó 54 veces el AUC sérico de hIL-21 cuando se administró por vía subcutánea (SC IL-21 sola AUC 117; SC IL-21/2P2 AUC 6340) y 164 (IV IL-21 sola AUC 91,36; IV IL-21/2P2 AUC 14993) cuando se administró por vía intravenosa.

Ejemplo 6 El anticuerpo 2P2 mejora la actividad de IL-21 in vivo

A continuación, los inventores determinaron si 2P2 mejora la actividad de IL-21 in vivo. Se generó una cepa de ratón reemplazando el receptor mIL-21 endógeno con el receptor hIL-21. Estos ratones no tienen citocina IL-21 endógena y se denominan hIL-21 R homocigotosKI/KI y hIL21KI/KI. Los ratones tienen un sistema inmunológico normal y una expresión fisiológica de hIL-21 R, por lo que pueden usarse para probar la función de hIL-21 y 2P2 in vivo.

Los ratones se inyectaron por vía intravenosa con hIL-21 o hIL-21 y 2P2 en D0, D2 y D4. El programa de tratamiento se establece en la Tabla 2 a continuación.

Tabla 2 Régimen de tratamiento

Se utilizó como control el anticuerpo 3A3 (disponible comercialmente) que se une a la IL-21 humana, pero no potencia la actividad de la IL-21. En el D5 se sacrificaron los ratones y se recogieron el bazo y los ganglios linfáticos. Se encontró que la administración del complejo hIL-21 /2P2 agrandaba los bazos en mayor medida en comparación con hIL-21 recombinante sola en ratones knock-in de hIL-21 R, lo que sugiere una mejor función inmunoestimuladora de 2P2 in vivo.

Se prepararon suspensiones de células individuales según protocolos estándar. Para la detección de células B, la suspensión de células se tiñó con anticuerpos y se analizó mediante FACS (citometría de flujo LSR2 de BD). Las poblaciones de células B se analizaron de la siguiente manera:

Células B de la zona folicular (FZ) - CD3-B220+ IgD+;

Células B de la zona marginal (MZ) - CD3-B220 IgM CD23-;

células B de transición - CD3-B220+ IgM+ AA4.1+.

Los resultados se muestran en la Figura 7 para FZ, MZ y células B de transición del ganglio linfático y la Figura 8 para FZ, MZ y células B de transición del bazo. El análisis estadístico se realizó utilizando un ANOVA de una vía (ensayo de Newman-Keuls) para el análisis de las diferencias entre múltiples grupos. (Graphpad Prism Statistical software (Graphpad Software Inc, La Jolla, CA USA). Los resultados mostraron que la adición de 2P2 aumentó significativamente las células B de transición en los ganglios linfáticos y el bazo y aumentó significativamente las células B de la zona marginal del ganglio linfático Tabla 4 y Tabla 5

Tabla 4 Resumen de ANOVA de una vía

Tabla 5 Ensayo de comparación múltiple de Newman-Keuls

Ejemplo 7 Refinamiento de epítopos

A continuación, los inventores buscaron determinar qué restos de IL-21 humana estaban unidos por el anticuerpo 2P2. La Figura 9 muestra la secuencia de IL-21 humana cuyos restos en negrita se predijo que eran restos unidos por el anticuerpo 2P2 según los estudios de simulación estructural, los restos subrayados están localizados dentro de las regiones helix de IL-21. Los inventores generaron 5 péptidos de hIL-21 como sigue y como se muestra en la Figura 9:

Péptido 1 (P1, 30 aa; SEQ ID NO 19): FLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANT

Péptido 2 (P2, 27 aa; SEQ ID NO 20): AQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPP

Péptido 3 (P3, 30 aa; SEQ ID NO 4): IKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYE

Péptido 4 (P4, 23 aa; SEQ ID NO 21): PPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYE

Péptido 5 (P5, 15 aa; SEQ ID NO 22): PPSTNAGRRQKHRLT

Se usó un ensayo ELISA para examinar la unión entre los anticuerpos 2P2 y 3A3 y un solo control secundario de estreptavidina-HRP para cada uno de los péptidos P1 a P5, hIL-21 y péptido OVA. Como se muestra en la Figura 10, el anticuerpo 2P2 se unió al péptido 3 más fuerte, seguido por el péptido 4 y el péptido 5. Por lo tanto, el epítopo reconocido por el anticuerpo 2P2 comprendía una secuencia mínima de 9 mer a 15 mer, siendo la secuencia central STNAGRRQK (SEQ ID NO 23). La unión fue más fuerte con la secuencia CPSCD también estaba presente y la unión más fuerte se observó cuando estaban presentes las secuencias IKKLK (SEQ ID NO 24), CPSCD (SEQ ID NO 25) y STNAGRRQK (SEQ ID NO 23). Se observó la unión más fuerte con el péptido 3 que comprende la secuencia IKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYE (SEQ ID NO 4) (resumido en la Figura 10). Cuando se pre-incuba 2P2 con el péptido 3, 2P2 no se une a hIL-21 de longitud completa (Figura 11A). La pre-incubación del anticuerpo de control 3A3 con el péptido 3 no inhibió la unión a hIL-21 de longitud completa (Figura 11B). Esto demostró que el epítopo que consiste en el péptido 3 es suficiente para la unión de 2P2 a hIL-21.

Ejemplo 8 Afinidad de unión de 2P2 a hIL-21

El ensayo de cinética de unión de resonancia de plasma superficial se realizó en un sistema Bio-rad XPR36 mediante el método de acoplamiento de amina directo. Brevemente, se utilizó un flujo de mezcla de EDC [N-etil-N'-(3-dietilaminopropil) carbodiimida] y NHS (N-hidroxisuccinimida) para activar la superficie celular de un chip sensor de GLC antes de que 25 pg/ml de mAb anti-IL-21 fluyera a través, después se usó un gran flujo de etanolamina para bloquear los

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo, en el que el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo se une a IL-21 y mejora la actividad de IL-21, y

en donde el dominio de unión a antígeno del anticuerpo o del fragmento de unión a antígeno del mismo comprende: (i) una región variable de cadena pesada (Vh) que comprende una región determinante de complementariedad (CDR) 1 que comprende la secuencia establecida en SEQ ID NO: 5, una CDR2 que comprende la secuencia establecida en SEQ ID NO: 6 y una CDR3 que comprende la secuencia establecida en SEQ ID NO: 7; y una región variable de cadena ligera (Vl) que comprende una CDR1 que comprende la secuencia establecida en SEQ ID NO: 8, una CDR2 que comprende la secuencia establecida en SEQ ID NO: 9 y una CDR3 que comprende la secuencia establecida en SEQ ID NO: 10; o

(ii) una Vh que comprende una CDR1 que comprende la secuencia establecida en SEQ ID NO: 11, una CDR2 que comprende la secuencia establecida en SEQ ID NO: 12 y una CDR3 que comprende la secuencia establecida en SEQ ID NO: 13; y una Vl que comprende una CDR1 que comprende la secuencia establecida en SEQ ID NO: 14, una CDR2 que comprende la secuencia establecida en SEQ ID NO: 15 y la CDR3 que comprende la secuencia establecida en SEQ ID NO: 16.

2. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, en el que el dominio de unión a antígeno del anticuerpo o del fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una Vh que comprende la secuencia establecida en SEQ ID NO: 2.

3. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1 o 2, en el que el dominio de unión a antígeno del anticuerpo o del fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una Vl que comprende la secuencia establecida en SEQ ID NO: 3.

4. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el dominio de unión a antígeno del anticuerpo o del fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una Vh que comprende la secuencia establecida en SEQ ID NO: 2 y una Vl que comprende la secuencia establecida en SEQ ID NO: 3.

5. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la Vh y la Vl se unen para formar un Fv que comprende un dominio de unión a antígeno, en el que la Vh y la Vl están en una sola cadena polipeptídica o en donde la Vl y la Vh están en cadenas polipeptídicas separadas; opcionalmente en donde

si la Vh y la Vl están en una sola cadena polipeptídica, el fragmento de unión al antígeno es:

(i) un fragmento Fv monocatenario (scFv);

(ii) un scFv dimérico (di-scFv);

(iii) uno de (i) o (ii) unido a una región constante de un anticuerpo, Fc o un dominio constante de cadena pesada (CH) 2 y/o Ch3; o

(iv) uno de (i) o (ii) unido a una proteína que se une a una célula efectora inmunitaria, o

si la Vh y la Vl están en cadenas polipeptídicas separadas, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es:

(v) un diacuerpo;

(vi) un triacuerpo;

(vii) un tetracuerpo;

(viii) un Fab;

(ix) un F(ab')²;

(x) un Fv;

(xi) uno de (v) a (x) unido a una región constante de un anticuerpo, Fc o un dominio constante de cadena pesada (Ch) 2 y/o Ch3;

(xii) uno de (v) a (x) unido a una proteína que se une a una célula efectora inmunitaria; o

(xiii) un anticuerpo.

6. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo desnudo o fragmento de unión a antígeno del mismo.

7. Un complejo que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y un polipéptido IL-21.

8. Un ácido nucleico que codifica el anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

9. Una composición que comprende el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o el complejo de la reivindicación 7 y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en el que opcionalmente la composición se formula para administración parenteral, tal como administración intravenosa o administración en una cavidad corporal o lumen de un órgano o articulación.

10. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o el complejo de la reivindicación 7 o la composición de la reivindicación 9 para su uso en medicina.

11. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o el complejo de la reivindicación 7 o la composición de la reivindicación 9 para su uso en el tratamiento de una infección, una respuesta inmune alérgica o cáncer;

en el que, opcionalmente, el tratamiento comprende además la administración de uno o más compuestos inmunoterapéuticos;

preferiblemente en el que el compuesto inmunoterapéutico se selecciona de un inhibidor de punto de control, un inhibidor de tirosina quinasa, un inhibidor del receptor del factor de necrosis tumoral, una citocina, una interleucina, un interferón, un factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos, un fármaco antivírico, un virus oncolítico o una vacuna tal como una vacuna contra el cáncer o una vacuna contra una enfermedad infecciosa;

más preferiblemente en el que el inhibidor del punto de control es un inhibidor de la proteína de muerte celular programada 1 (PD-1), el ligando 1 de muerte celular programada 1 (PDL-1), el ligando 2 de muerte celular programada 1 (PDL-2), el grupo de diferenciación 80 ( CD80), grupo de diferenciación 86 (CD86), proteína 1 relacionada con B7 (B7RP1), grupo de diferenciación 276 (CD276), mediador de entrada del virus del herpes (HVEM), ligando del grupo de diferenciación 137 (CD137L), ligando 4 del miembro de la superfamilia del factor de necrosis tumoral (OX40L), grupo de diferenciación 70 (CD70), grupo de diferenciación 40 (CD40), galectina 9 (GAL9), grupo de diferenciación 28 (CD28), antígeno 4 asociado a linfocitos T citotóxicos (CTLA4), Co-estimulador de células T inducible (ICOS), atenuador de linfocitos B y T (BTLA), receptor de tipo inmunoglobulina de células asesinas (KIR), gen 3 de activación de linfocitos (LAG3), receptor de muerte 5 (DR5), grupo de diferenciación 137 (CD137) , miembro 4 de la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral (OX40), grupo de diferenciación 27 (CD27), ligando del grupo de diferenciación 40 (CD40L), receptor de adenosina A2a (A2aR) o proteína 3 que contiene inmunoglobulina de células T y dominio mucino (TIM3).