TW202144420A - 一種免疫細胞啟動劑的開發及應用 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種抗OX40抗體及免疫細胞啟動的開發及應用，本發明的抗OX40抗體或其片段保留對人OX40或恒河猴OX40有較強的結合。

Description

一種免疫細胞啟動劑的開發及應用

本發明涉及生物免疫技術領域，尤其涉及特異性結合OX40的新型抗體和抗體片段。

免疫系統的檢查點有兩類，一類是抑制性的，如PD-1，一類是啟動性的，如OX40。而免疫系統中T細胞的充分啟動，需要兩級信號。第一信號由T細胞抗原受體識別抗原產生，經由CD3分子將啟動信號轉至細胞內，而第二信號被稱為共刺激信號，由抗原提呈細胞或者靶細胞表面的共刺激分子與啟動的T細胞表面的共刺激分子受體相互作用而產生。共刺激信號促進抗原特異性T細胞增殖和分化為效應T細胞。(Lindsay K等Immunity 2016,  44(5):1005-1019)。

OX40，也稱為TNFRSF4、ACT35、CD134等，屬於腫瘤壞死因數受體超家族（TNFRSF）, 也是一種I型跨膜糖蛋白。OX40不在靜息的T細胞上表達，而是表達於被啟動的CD4+T細胞、CD8+T細胞上、NK細胞和NKT細胞上(Paterson DJ等Mol. Immunol. 1987; 24:1281-1290)。T細胞被抗原啟動後，會在1-3天內高表達OX40分子。而OX40信號的啟動會進一步增強T細胞的啟動信號，以增強免疫系統的反應(Gramaglia I 等J. Immunol. 2000; 165:3043-3050)。

OX40L，也稱為TNFSF4、TXGP1、gp34和CD252，是II型跨膜糖蛋白，是OX40的天然配體，以三聚體的形式存在於被活化的抗原呈遞細胞(APC)上，如DC細胞和B細胞，且受CD40、toll樣受體(TLR)以及炎性因數的介導而表達。OX40L還廣泛地存在於非造血細胞中，如平滑肌和血管內皮細胞(Murata K等J. Immunol. 2002; 169:4628-4636)。

通過OX40L所啟動的OX40的胞內信號通路和T細胞胞內的多個信號通路相關聯。通過分子內二硫鍵所形成的三聚體OX40L和T細胞膜上的OX40結合後(Compaan DM等. Structure. 2006; 14:1321-30)，能初步啟動OX40的胞內信號通路。而要想進一步或充分啟動OX40胞內信號，需要受體的進一步寡聚化，形成六聚體或以上(H Wajant. Cell Death and Differentiation (2015) 22, 1727-1741)。OX40被啟動後，通過其胞內區募集TNF receptor-associated factor (TRAF) 2和5，從而啟動NFκB信號通路，發揮抗凋亡效果，抑制細胞的凋亡(Song J等J. Immunol. 2008; 180:7240-8)。

此外，OX40的胞內信號通路還特定地輔助T細胞的TCR胞內信號通路，主要是PKB/PI3K和鈣離子相關的NFAT信號通路。前者能促進被啟動的T細胞的存活和細胞週期的進行(Song J等Nat Immunol. 2004; 5:150-8)。後者主要是促進活化的T細胞的增殖以及相應細胞因數的分泌(So T等Proc Natl Acad Sci USA. 2006; 103:3740-5)。

有研究者發現在腫瘤浸潤的CD4+Treg細胞（調節性T細胞）上，也會高表達OX40。Treg是能抑制效應T細胞(Teff)。目前，關於OX40信號通路對Treg細胞的功能的調節作用的還有沒有統一確定的觀點。有些研究表明OX40信號通路能夠抑制Treg細胞的免疫抑制功能(Piconese S等J. Exp. Med. 2008; 205:825-39; Voo KS等J. Immunol. 2013; 191:3641-50)。而有些則發現OX40對於Treg細胞充分發揮其免疫抑制功能是必須的( Piconese S等Eur. J. Immunol. 2010; 40:2902-13; Griseri T等J. Exp. Med. 2010; 207:699-709)。OX40胞內信號通路對Treg細胞的增殖和凋亡的影響，會隨著細胞所處的微環境不同而發生改變。還有研究所發現，在沒有IFN-γ和IL-4存在或是有FoxP3表達時，OX40的啟動能夠有力促進Treg細胞的增殖(Ruby CE等J. Immunol. 2009; 183:4853-7)。而在其它微環境中，則觀察到OX40的啟動對於Treg細胞的增殖毫無影響(Vu MD等Blood. 2007; 110:2501-10)。

目前，普遍認為，抗OX40抗體主要通過以下三種細胞生理機制，達到啟動免疫系統的T細胞和抑制腫瘤的效果。一是，通過直接啟動CD4+和CD8+的效應T細胞，促進它們的增殖和生存，以及分泌相關的炎性因數。二是，通過抑制Treg的信號和活性，從而減弱其對免疫系統的抑制效果。三是，通過ADCC或ADCP等，耗竭Treg細胞，減少其對效應T細胞的抑制(J. Willoughby等Molecular Immunology 83, 2017, 13-22)。

抗OX40抗體或利用OX40的信號通路，來治療腫瘤的概念，已經在大量的小鼠腫瘤模型上得到有力的驗證。根據現有的研究有力地表明，OX40是腫瘤免疫療法中的一個非常有潛力的啟動性靶點，能為腫瘤免疫治療提供新的手段。

本發明提供了能特異識別並結合OX40（尤其是人OX40（hOX40））的新的抗體或其片段。其中所述抗體或其片段能夠以更高的親和力結合hOX40，同時不和OX40配體(OX40L)競爭，能更有效活化T細胞，產生更強的免疫應答，提高抗腫瘤活性。

本發明公開了一種抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其片段特異性結合OX40，所述抗體或其片段包含（a）-（f）中一種或多種胺基酸序列： （a）如SEQ ID NO: 1、4、10、16、104或22所示的VH CDR1； （b）如SEQ ID NO: 2、5、7、8、11、13、14、17、20、23或26所示的VH CDR2； （c）如SEQ ID NO: 3、6、9、12、15、18、21、24或27所示的VH CDR3； （d）如SEQ ID NO: 28、31、37、40、43、46、49、52、55、58或61所示的VL CDR1； （e）如SEQ ID NO: 19、25、29、32、35、38、44、47、50、56、59或62所示的VL CDR2； （f）如SEQ ID NO: 30、33、34、36、39、41、42、45、48、51、53、54、57、60或63所示的VL CDR3。

在一些實施方案中，所述抗體或其片段包含如SEQ ID NO: 1、4、10、16、104或22所示的VH CDR1。在一些實施方案中，所述抗體或其片段包含如SEQ ID NO: 2、5、7、8、11、13、14、17、20、23或26所示的VH CDR2。在一些實施方案中，所述抗體或其片段包含如SEQ ID NO: 3、6、9、12、15、18、21、24或27所示的VH CDR3。在一些實施方案中，所述抗體或其片段包含如SEQ ID NO: 28、31、37、40、43、46、49、52、55、58或61所示的VL CDR1。在一些實施方案中，所述抗體或其片段包含如SEQ ID NO: 19、25、29、32、35、38、44、47、50、56、59或62所示的VL CDR2。在一些實施方案中，所述抗體或其片段包含如SEQ ID NO: 30、33、34、36、39、41、42、45、48、51、53、54、57、60或63所示的VL CDR3。

在一些實施方案中，所述抗體或其片段包含如SEQ ID NO: 10所示的VH CDR1。在一些實施方案中，所述抗體或其片段包含如SEQ ID NO: 7、11、13或26所示的VH CDR2。在一些實施方案中，所述抗體或其片段包含如SEQ ID NO: 12或27所示的VH CDR3。在一些實施方案中，所述抗體或其片段包含如SEQ ID NO: 37、43或61所示的VL CDR1。在一些實施方案中，所述抗體或其片段包含如SEQ ID NO: 19、25、38、44或62所示的VL CDR2。在一些實施方案中，所述抗體或其片段包含如SEQ ID NO: 34、39、41、45、53或63所示的VL CDR3。

在一些實施方案中，所述抗體或其片段包含：如SEQ ID NO: 1、4、10、16、104或22所示的VH CDR1；如SEQ ID NO: 2、5、7、8、11、13、14、17、20、23或26所示的VH CDR2；以及如SEQ ID NO: 3、6、9、12、15、18、21、24或27所示的VH CDR3。在一些實施方案中，所述抗體或其片段包含：如SEQ ID NO: 28、31、37、40、43、46、49、52、55、58或61所示的VL CDR1；如SEQ ID NO: 19、25、29、32、35、38、44、47、50、56、59或62所示的VL CDR2；以及如SEQ ID NO: 30、33、34、36、39、41、42、45、48、51、53、54、57、60或63所示的VL CDR3。

在一些實施方案中，所述抗體或其片段包含：如SEQ ID NO: 1、4、10、16、104或22所示的VH CDR1；如SEQ ID NO: 2、5、7、8、11、13、14、17、20、23或26所示的VH CDR2；如SEQ ID NO: 3、6、9、12、15、18、21、24或27所示的VH CDR3；如SEQ ID NO: 28、31、37、40、43、46、49、52、55、58或61所示的VL CDR1；如SEQ ID NO: 19、25、29、32、35、38、44、47、50、56、59或62所示的VL CDR2；以及如SEQ ID NO: 30、33、34、36、39、41、42、45、48、51、53、54、57、60或63所示的VL CDR3。

在一些實施方案中，所述抗體或其片段包含：如SEQ ID NO: 10所示的VH CDR1；如SEQ ID NO: 7、11、13或26所示的VH CDR2；如SEQ ID NO: 12或27所示的VH CDR3；如SEQ ID NO: 37、43或61所示的VL CDR1；如SEQ ID NO: 19、25、38、44或62所示的VL CDR2；以及如SEQ ID NO: 34、39、41、45、53或63所示的VL CDR3。

在一些實施方案中，所述抗體或其片段包含：如SEQ ID NO: 1所示的VH CDR1；如SEQ ID NO: 2所示的VH CDR2；如SEQ ID NO: 3所示的VH CDR3；如SEQ ID NO: 28所示的VL CDR1；如SEQ ID NO: 29所示的VL CDR2；以及如SEQ ID NO: 30所示的VL CDR3。

在一些實施方案中，所述抗體或其片段包含：如SEQ ID NO: 4所示的VH CDR1；如SEQ ID NO: 5所示的VH CDR2；如SEQ ID NO: 6所示的VH CDR3；如SEQ ID NO: 31所示的VL CDR1；如SEQ ID NO: 32所示的VL CDR2；以及如SEQ ID NO: 33所示的VL CDR3。

在一些實施方案中，所述抗體或其片段包含：如SEQ ID NO: 1所示的VH CDR1；如SEQ ID NO: 8所示的VH CDR2；如SEQ ID NO: 9所示的VH CDR3；如SEQ ID NO: 31所示的VL CDR1；如SEQ ID NO: 35所示的VL CDR2；以及如SEQ ID NO: 36所示的VL CDR3。

在一些實施方案中，所述抗體或其片段包含：如SEQ ID NO: 10所示的VH CDR1；如SEQ ID NO: 11所示的VH CDR2；如SEQ ID NO: 12所示的VH CDR3；如SEQ ID NO: 37所示的VL CDR1；如SEQ ID NO: 38所示的VL CDR2；以及如SEQ ID NO: 39所示的VL CDR3。

在一些實施方案中，所述抗體或其片段包含：如SEQ ID NO: 10所示的VH CDR1；如SEQ ID NO: 11所示的VH CDR2；如SEQ ID NO: 12所示的VH CDR3；如SEQ ID NO: 40所示的VL CDR1；如SEQ ID NO: 29所示的VL CDR2；以及如SEQ ID NO: 42所示的VL CDR3。

在一些實施方案中，所述抗體或其片段包含：如SEQ ID NO: 10所示的VH CDR1；如SEQ ID NO: 11所示的VH CDR2；如SEQ ID NO: 12所示的VH CDR3；如SEQ ID NO: 43所示的VL CDR1；如SEQ ID NO: 44所示的VL CDR2；以及如SEQ ID NO: 39所示的VL CDR3。

在一些實施方案中，所述抗體或其片段包含：如SEQ ID NO: 10所示的VH CDR1；如SEQ ID NO: 26所示的VH CDR2；如SEQ ID NO: 27所示的VH CDR3；如SEQ ID NO: 61所示的VL CDR1；如SEQ ID NO: 25所示的VL CDR2；以及如SEQ ID NO: 34所示的VL CDR3。

在一些實施方案中，所述抗體或其片段包含：如SEQ ID NO: 10所示的VH CDR1；如SEQ ID NO: 14所示的VH CDR2；如SEQ ID NO: 15所示的VH CDR3；如SEQ ID NO: 46所示的VL CDR1；如SEQ ID NO: 47所示的VL CDR2；以及如SEQ ID NO: 48所示的VL CDR3。

在一些實施方案中，所述抗體或其片段包含：如SEQ ID NO: 16所示的VH CDR1；如SEQ ID NO: 17所示的VH CDR2；如SEQ ID NO: 18所示的VH CDR3；如SEQ ID NO: 49所示的VL CDR1；如SEQ ID NO: 50所示的VL CDR2；以及如SEQ ID NO: 51所示的VL CDR3。

在一些實施方案中，所述抗體或其片段包含：如SEQ ID NO: 16所示的VH CDR1；如SEQ ID NO: 17所示的VH CDR2；如SEQ ID NO: 18所示的VH CDR3；如SEQ ID NO: 52所示的VL CDR1；如SEQ ID NO: 29所示的VL CDR2；以及如SEQ ID NO: 54所示的VL CDR3。

在一些實施方案中，所述抗體或其片段包含：如SEQ ID NO: 1所示的VH CDR1；如SEQ ID NO: 20所示的VH CDR2；如SEQ ID NO: 21所示的VH CDR3；如SEQ ID NO: 55所示的VL CDR1；如SEQ ID NO: 56所示的VL CDR2；以及如SEQ ID NO: 57所示的VL CDR3。

在一些實施方案中，所述抗體或其片段包含：如SEQ ID NO: 22所示的VH CDR1；如SEQ ID NO: 23所示的VH CDR2；如SEQ ID NO: 24所示的VH CDR3；如SEQ ID NO: 58所示的VL CDR1；如SEQ ID NO: 59所示的VL CDR2；以及如SEQ ID NO: 60所示的VL CDR3。

在一些實施方案中，所述抗體或其片段包含：如SEQ ID NO: 10所示的VH CDR1；如SEQ ID NO: 26所示的VH CDR2；如SEQ ID NO: 27所示的VH CDR3；如SEQ ID NO: 61所示的VL CDR1；如SEQ ID NO: 62所示的VL CDR2；以及如SEQ ID NO: 63所示的VL CDR3。

在一些實施方案中，所述抗體或其片段包含：如SEQ ID NO: 10所示的VH CDR1；如SEQ ID NO: 11所示的VH CDR2；如SEQ ID NO: 27所示的VH CDR3；如SEQ ID NO: 61所示的VL CDR1；如SEQ ID NO: 62所示的VL CDR2；以及如SEQ ID NO: 34所示的VL CDR3。

在一些實施方案中，所述抗體或其片段包含：如SEQ ID NO: 10所示的VH CDR1；如SEQ ID NO: 26所示的VH CDR2；如SEQ ID NO: 27所示的VH CDR3；如SEQ ID NO: 61所示的VL CDR1；如SEQ ID NO: 44所示的VL CDR2；以及如SEQ ID NO: 39所示的VL CDR3。

在一些實施方案中，所述抗體或其片段包含：如SEQ ID NO: 10所示的VH CDR1；如SEQ ID NO: 11所示的VH CDR2；如SEQ ID NO: 12所示的VH CDR3；如SEQ ID NO: 61所示的VL CDR1；如SEQ ID NO: 25所示的VL CDR2；以及如SEQ ID NO: 34所示的VL CDR3。

在一些實施方案中，所述抗體或其片段包含：如SEQ ID NO: 10所示的VH CDR1；如SEQ ID NO: 26所示的VH CDR2；如SEQ ID NO: 27所示的VH CDR3；如SEQ ID NO: 61所示的VL CDR1；如SEQ ID NO: 25所示的VL CDR2；以及如SEQ ID NO: 39所示的VL CDR3。

在一些實施方案中，所述抗體或其片段包含：如SEQ ID NO: 10所示的VH CDR1；如SEQ ID NO: 26所示的VH CDR2；如SEQ ID NO: 27所示的VH CDR3；如SEQ ID NO: 61所示的VL CDR1；如SEQ ID NO: 44所示的VL CDR2；以及如SEQ ID NO: 34所示的VL CDR3。

在一些實施方案中，所述抗體或其片段包含：如SEQ ID NO: 10所示的VH CDR1；如SEQ ID NO: 11所示的VH CDR2；如SEQ ID NO: 27所示的VH CDR3；如SEQ ID NO: 61所示的VL CDR1；如SEQ ID NO: 25所示的VL CDR2；以及如SEQ ID NO: 39所示的VL CDR3。

在一些實施方案中，所述抗體或其片段包含：如SEQ ID NO: 10所示的VH CDR1；如SEQ ID NO: 11所示的VH CDR2；如SEQ ID NO: 27所示的VH CDR3；如SEQ ID NO: 61所示的VL CDR1；如SEQ ID NO: 44所示的VL CDR2；以及如SEQ ID NO: 34所示的VL CDR3。

在一些實施方案中，所述抗體或其片段包含重鏈可變區，所述重鏈可變區包含如SEQ ID NO: 64、65、66、67、68、69、70、71或72所示胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 64、65、66、67、68、69、70、71或72所示胺基酸序列至少有90%、至少有91%、至少有92%、至少有93%、至少有94%、至少有95%、至少有96%、至少有97%、至少有98%、至少有99%序列同源性的胺基酸序列。

在一些實施方案中，所述抗體或其片段包含重鏈可變區，所述重鏈可變區包含如SEQ ID NO: 67或72所示胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 67或72所示胺基酸序列至少有90%、至少有91%、至少有92%、至少有93%、至少有94%、至少有95%、至少有96%、至少有97%、至少有98%、至少有99%序列同源性的胺基酸序列。

在一些實施方案中，所述抗體或其片段還包含輕鏈可變區，所述輕鏈可變區包含如SEQ ID NO: 73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83或84所示胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83或84所示胺基酸序列至少有90%、至少有91%、至少有92%、至少有93%、至少有94%、至少有95%、至少有96%、至少有97%、至少有98%、至少有99%序列同源性的胺基酸序列。

在一些實施方案中，所述抗體或其片段還包含輕鏈可變區，所述輕鏈可變區包含如SEQ ID NO: 76、78或84所示胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 76、78或84所示胺基酸序列至少有90%、至少有91%、至少有92%、至少有93%、至少有94%、至少有95%、至少有96%、至少有97%、至少有98%、至少有99%序列同源性的胺基酸序列。

在一些實施方案中，所述抗體或其片段包含如SEQ ID NO: 72所示重鏈可變區，和如SEQ ID NO: 84所示輕鏈可變區。

在一些實施方案中，所述抗體或其片段是IgG、IgM、IgA、IgE或IgD的其中一種同種型。

在一些實施方案中，所述抗體或其片段是IgG同種型；在一些實施方案中，所述抗體或其片段是IgG1同種型、IgG2同種型、IgG3同種型或IgG4同種型。沒有限制地，抗體或其片段是一種嵌合抗體、一種人源化抗體或是一種全人源抗體。在某一方面，抗體或其片段是一種人源化抗體。

在一些實施方案中，所述抗體或其片段還包含重鏈恒定區、輕鏈恒定區、Fc區或其結合。

在一些實施方案中，本文所述的抗體是IgG同種型。在一些實施方案中，抗體的恒定區為人IgG1同種型，具有包含SEQ ID NO: 90所示胺基酸序列的重鏈恒定區和包含SEQ ID NO: 91所示胺基酸序列的輕鏈恒定區。

在一些實施方案中，抗體的恒定區為人IgG2同種型，具有包含SEQ ID NO: 92所示胺基酸序列的重鏈恒定區和包含SEQ ID NO: 93所示胺基酸序列的輕鏈恒定區。

在一些實施方案中，抗體的恒定區為人IgG4同種型，具有包含SEQ ID NO: 94所示胺基酸序列的重鏈恒定區和包含SEQ ID NO: 95所示胺基酸序列的輕鏈恒定區。

在一些實施方案中，所述Fc區是人抗體的Fc區。在一些實施方案中，所述人Fc區重鏈在345位（Eu編號）的胺基酸為R（E345R）。在一些實施例中，所述人Fc區重鏈在440位（Eu編號）的胺基酸為Y（S440Y）。在一些實施例中，所述人Fc區包含於SEQ IN NO:88或SEQ IN NO:89所示胺基酸序列。

在一些實施方案中，所述重鏈恒定區包含如SEQ ID NO: 88、89或90所示的胺基酸序列，和/或所述輕鏈恒定區包含如SEQ ID NO: 91所示的胺基酸序列。在一些實施方案中，所述重鏈恒定區包含如SEQ ID NO: 90所示的胺基酸序列，和/或所述輕鏈恒定區包含如SEQ ID NO: 91所示的胺基酸序列。

在一些實施方案中，所述抗體或其片段是嵌合抗體或其片段，或人源化抗體或其片段，或全人源抗體或其片段。

在一些實施方案中，所述抗體包含重鏈和輕鏈，所述重鏈包含如SEQ ID NO: 86所示的胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 86所示胺基酸序列至少有90%、至少有91%、至少有92%、至少有93%、至少有94%、至少有95%、至少有96%、至少有97%、至少有98%、至少有99%序列同源性的胺基酸序列，所述輕鏈包含如SEQ ID NO: 87所示的胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 87所示胺基酸序列至少有90%、至少有91%、至少有92%、至少有93%、至少有94%、至少有95%、至少有96%、至少有97%、至少有98%、至少有99%序列同源性的胺基酸序列。

在一些實施方案中，所述抗體包含如SEQ ID NO: 86所示的重鏈，以及如SEQ ID NO: 87所示的輕鏈。

在一些實施方案中，所述抗體或其片段能特異識別並結合人OX40或恒河猴OX40。

在一些實施方案中，所述抗體或其片段啟動、增強或誘導OX40的活性。

在一些實施方案中，所述抗體或其片段可以活化T細胞。

在一些實施方案中，所述抗體或其抗原結合片段促進被啟動的T細胞的進一步活化，分泌更多的炎性因數。

在一些實施方案中，所述抗體或其抗原結合片段能啟動所述的OX40的胞內信號通路。

在一些實施方案中，所述抗體或其片段與OX40的親和力數值KD≤5nM。在一些實施方案中，所述抗體或其片段與OX40的親和力數值KD≤3.5nM。在一些實施方案中，所述抗體或其片段與OX40的親和力數值KD≤2nM。在一些實施方案中，所述抗體或其片段與OX40的親和力數值KD≤1nM。在一些實施方案中，所述抗體或其片段與OX40的親和力數值KD≤0.2nM。

在一些實施方案中，所述抗體或片段為單克隆抗體或片段。

在一些實施方案中，所述抗體或其片段在CHO細胞中表達。

在一些實施方案中，所述抗體或其片段在一種基因組被編輯的CHO細胞中表達，所述CHO細胞表達低岩藻糖含量或不含岩藻糖的抗體或其片段。在一些實施方案中，所述基因組被編輯的CHO細胞為α-1,6-岩藻糖基轉移酶基因(fut8基因)、GDP-甘露糖4,6-脫水酶（GMD）基因、GDP-4-酮-6-去氧甘露糖-3,5-表異構酶-4-還原酶（GMER）基因、GDP-岩藻糖轉運子（GFT）基因(如Slc35c1基因)中的一個或多個被減少或剔除的CHO細胞。在一些實施方案中，所述抗體或其片段在剔除fut8基因的CHO細胞中表達。

在一些實施方案中，所述抗體或其片段中的一個、兩個或三個胺基酸殘基有岩藻糖修飾。

在一些實施方案中，所述抗體或其片段中，岩藻糖的含量不超過10%。在一些實施方案中，所述抗體或其片段中，岩藻糖的含量不超過5%。在一些實施方案中，所述抗體或其片段中，岩藻糖的含量不超過1%。在一些實施方案中，所述抗體或其片段中，岩藻糖的含量不超過0.5%。在一些實施方案中，所述抗體或其片段沒有結合岩藻糖。

在一些實施方案中，所述抗體或其片段是分離的抗體或其抗原結合片段。

在一些實施方案中，本發明還提供一種多聚核苷酸，所述多聚核苷酸編碼所述的抗體或其片段。在一些實施方案中，所述多聚核苷酸為分離的多聚核苷酸。

在一些實施方案中，所述多聚核苷酸包含如SEQ ID NO: 96-101所示的一種或多種核苷酸序列。在一些實施方案中，所述多聚核苷酸包含如SEQ ID NO: 96、97和98所示的核苷酸序列。在一些實施方案中，所述多聚核苷酸包含如SEQ ID NO: 99、100和101所示的核苷酸序列。在一些實施方案中，所述多聚核苷酸包含如SEQ ID NO: 102所示的核苷酸序列。在一些實施方案中，所述多聚核苷酸包含如SEQ ID NO: 103所示的核苷酸序列。在一些實施方案中，所述多聚核苷酸包含如SEQ ID NO: 102所示的核苷酸序列，和/或如SEQ ID NO: 103所示的核苷酸序列。

在一些實施方案中，本發明還提供一種載體，所述載體包含編碼所述的抗體或其片段的一種或多種多聚核苷酸。在一些實施方案中，所述載體為分離的載體。在一些實施方案中，所述載體是表達載體，所述表達載體包括質粒或病毒。

在一些實施方案中，本發明還提供一種細胞，所述細胞包含編碼所述的抗體或其片段的一種或多種多聚核苷酸。在一些實施方案中，所述細胞為分離的細胞。在一些實施方案中，所述細胞為CHO細胞。在一些實施方案中，所述細胞包含所述載體。在一些實施方案中，所述細胞中一種或多種基因組被編輯，進而所述CHO細胞表達低岩藻糖含量或不含岩藻糖的抗體或其片段。在一些實施方案中，所述基因組被編輯的CHO細胞為Slc35c1基因、fut8基因、GDP-甘露糖4,6-脫水酶（GMD）基因、GDP-4-酮-6-去氧甘露糖-3,5-表異構酶-4-還原酶（GMER）基因、GDP-岩藻糖轉運子（GFT）基因中的一個或多個被減少或剔除的CHO細胞。

在一些實施方案中，本發明還提供一種組合物，所述組合物包含所述的抗體或其片段、所述的多聚核苷酸或所述的細胞，以及藥學上可接受的載體。

在一些實施方案中，本發明還提供一種在有需要的患者中治療癌症或感染的方法，所述方法包括向所述患者施用有效劑量的所述的抗體或其片段。在一些實施方案中，本發明還提供本文所述的抗體或其片段在治療癌症或感染中的用途。在一些實施方案中，本發明還提供本文所述的抗體或其片段在製備治療癌症或感染的藥物中的用途。

在一些實施方案中，所述癌症是實體瘤。

在一些實施方案中，所述癌症選自非霍奇金淋巴瘤（NHL）、急性淋巴細胞性白血病（ALL）、急性骨髓性白血病（AML）、慢性淋巴細胞性白血病（CLL）、慢性骨髓性白血病（CML）、多發性骨髓瘤（MM）、乳腺癌、卵巢癌、頭頸癌、膀胱癌、黑素瘤、結直腸癌、胰腺癌、肺癌、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、膠質瘤、成膠質細胞瘤等。實體瘤包括例如乳腺癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、黑素瘤、結直腸癌、頭頸癌、膀胱癌、食道癌、肝癌和腎癌。

在一些實施方案中，所述方法還包括向所述患者施用第二種癌症治療劑。在一些實方案中，所述第二種癌症治療劑包括化學治療劑、抗增生劑和共刺激受體的激動劑/或T細胞上抑制信號的拮抗劑。在一些實施方案中，所述化學治療劑包括但不限於：喜樹堿(camptothecin，CPT-11)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、順鉑(cisplatin)、多柔比星(doxorubicin)、伊立替康(irinotecan)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、吉西他濱(gemcitabine)、順鉑、卡鉑、蛋白酶體抑制劑(例如硼替佐米(bortezomib)或MG132)、Bcl-2抑制劑(例如BH3I-2’(bcl-xl抑制劑)、吲哚胺雙加氧酶-1(IDO1)抑制劑(例如INCB24360)、AT-101(R-(-)-棉酚衍生物)、ABT-263(小分子)、GX-15-070(奧巴克拉(obatoclax))、MCL-1(骨髓樣白血病細胞分化蛋白-1)拮抗劑)、iAP拮抗劑(例如smac7、smac4、小分子smac模擬物、合成smac肽)、HDAC(組蛋白去乙醯酶)抑制劑、靶向VEGF及VEGFR的抗血管生成劑(例如阿瓦斯汀(Avastin))、合成三萜、c-FLIP(細胞FLICE抑制蛋白)調節劑(例如PPARγ(過氧化物酶體增殖物活化受體γ)的天然及合成配體)、激酶抑制劑(例如索拉菲尼(Sorafenib))。在一些實施方案中，本發明抗體或抗原結合片段可與細胞毒性劑組合用於治療癌症或腫瘤，細胞毒性劑包括但不限於：尿嘧啶氮芥、甲川氯(Chlormethine)、環磷醯胺(CYTOXANTM)、異環磷醯胺、美法侖(Melphalan)、苯丁酸氮芥、呱血生(Pipobroman)、三乙烯三聚氰胺、三乙烯硫代磷醯胺、白消安(Busulfan)、卡莫司汀(Carmustine)、洛莫司汀(Lomustine)、鏈脲黴素(Streptozocin)、達卡巴嗪及替莫唑胺(Temozolomide)。在一些實施方案中，所述抗增生劑包括但不限於：多西他賽(docetaxel)、海綿內酯(DDM)、迪克他汀(dictyostatin，DCT)、培洛賽德(Peloruside)A、埃博黴素、埃博黴素A、埃博黴素B、埃博黴素C、埃博黴素D、埃博黴素E、埃博黴素F、呋喃埃博黴素D、去氧埃博黴素B1、海綿內酯、帕土匹龍(patupilone，EPO-906)、ILX-651(鹽酸泰絲多汀(tasidotin hydrochloride))、軟海綿素(Halichondrin)B、甲磺酸艾日布林(Eribulin mesylate，E-7389)、哈米特林(Hemiasterlin，HTI-286)、薩托辛(Cyrptophycin)、LY-355703、類美登素免疫偶聯物(DM-1)、艾榴塞洛素(eleutherobin)、17β-乙醯氧基-2-乙氧基-6-側氧基-B-均-雌甾-1,3,5(10)-三烯-3-醇、環鏈汀(cyclostreptin)、異勞力馬來(isolaulimalide)和勞力馬來。在一些實施方案中，所述激動劑或拮抗劑的靶點包括但不限於CTLA-4、PD-1、PD-L1、ICOS、PD-L2、LAG-3、TIM-3、VEGF、BTLA、CD69、TIGIT、CD113、GPR56、VISTA、2B4、CD48、GARP、PD1H、LAIR1、TIM-1、TIM-4、CD39、B7-1、B7-2、CD28、4-1BB、4-1BBL、GITR、GITRL、OX40、OX40L、CD70、CD27、CD40、DR3和CD28H等。在一些實施方案中，可以與本發明抗體或抗原結合片段一起施用的抗體為利妥昔單抗、曲妥珠單抗、托西莫單抗(tositumomab)、替伊莫單抗(ibritumomab)、阿倫珠單抗、依帕珠單抗(eprtuzumab)、貝伐珠單抗(bevacizumab)、伊匹單抗(ipilimumab)、加利昔單抗(galiximab)、魯卡木單抗(Lucatumumab)、莫羅單抗(Muromonab)。

在一些實施方案中，所述感染是病毒感染、細菌感染、真菌感染或寄生蟲感染。

在一些實施方案中，本發明還提供一種在有需要的患者中治療癌症或感染的方法，所述方法包括：（a）在體外，用本文所述的抗體或其片段處理細胞，和（b）將處理後的細胞施用於患者體內。在一些實施方案中，所述方法在步驟（a）之前還包括從個體分離出所述細胞。在一些實施方案中，所述細胞從所述患者體內分離出來。在一些實施方案中，所述細胞從不同於所述患者的供體個體中分離出來。

在一些實施方案中，所述細胞是T細胞。在一些實施方案中，所述T細胞是腫瘤浸潤性T淋巴細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞或其組合。

在一些實施方案中，本發明還提供一種檢測樣品中OX40表達的方法，使樣品與本文所述的抗體或其片段抗體接觸，使得所述抗體或其片段結合OX40，並檢測反映樣品中OX40的表達量的所述結合。在一些實施方案中，所述樣品包含腫瘤細胞、腫瘤組織、感染組織或血液樣品。

在一些實施方案中，本發明還提供一種在有需要的患者中治療需要增強免疫機能的疾病的方法，其特徵在於，所述方法包括向所述患者施用有效劑量的所述的抗體或其片段。

本發明提供了結合人OX40或恒河猴OX40的抗體或其片段，其中，本發明的抗OX40抗體或其片段保留對人OX40或恒河猴OX40有較強的結合。

定義

除非另有定義，本發明中使用的科學和技術術語的含義是本領域技術人員所通常理解的含義。通常，本文所述的細胞培養、分子生物學以及蛋白質純化使用的命名和技術是本領域公知且普遍使用的。對於重組DNA、寡核苷酸合成和細胞培養與轉化（如電穿孔、脂質轉染），使用了標準技術。酶促反應和純化技術根據生產商的說明書或本領域普遍使用或本文所述的方法進行。前述技術和方法通常根據本領域公知且本說明書中引用和討論的多部綜合和較具體的文獻中描述的那樣使用。參見例如Sambrook等，Molecular Cloning: A Laboratory Manual（《分子克隆：實驗室手冊》）（第2版，冷泉港實驗室出版社，紐約冷泉港（1989））。

在本發明中，術語「多肽」旨在涵蓋單數的「多肽」以及複數的「多肽」，並且是指由通過醯胺鍵（也稱為肽鍵）線性連接的單體（胺基酸）組成的分子。術語「多肽」是指兩個或更多個胺基酸的任何單條鏈或多條鏈，並且不涉及產物的特定長度。因此，「多肽」的定義中包括肽、二肽、三肽、寡肽、「蛋白質」、「胺基酸鏈」或用於指兩個或多個胺基酸鏈的任何其他術語，並且術語「多肽」可以用來代替上述任何一個術語，或者與上述任何一個術語交替使用。術語「多肽」也意在指多肽表達後修飾的產物，包括但不限於糖基化、乙醯化、磷酸化、醯胺化、通過已知的保護/封閉基團衍生化、蛋白水解切割或非天然發生的胺基酸修飾。多肽可以源自天然生物來源或通過重組技術產生，但其不必從指定的核酸序列翻譯所得。它可以包括化學合成等任何方式產生。

「胺基酸」是指含有胺基和羧基兩種官能團化合物，比如α-胺基酸。兩個或多個胺基酸可以通過醯胺鍵（也稱為肽鍵）組成多肽。單個胺基酸由三個核苷酸(所謂的密碼子或堿基三聯體)組成的核酸編碼。每一個胺基酸由至少一個密碼子編碼。相同胺基酸由不同密碼子編碼稱為「遺傳密碼的簡並性」。胺基酸包括天然胺基酸和非天然胺基酸。天然胺基酸包括丙胺酸(三字母代碼：Ala，一字母代碼：A)、精胺酸(Arg，R)、天冬醯胺(Asn，N)、天門冬胺酸(Asp，D)、半胱胺酸(Cys，C)、麩胺酸(Gln，Q)、麩胺醯胺(Glu，E)、甘胺酸(Gly，G)、組胺酸(His，H)、異白胺酸(Ile，I)、白胺酸(Leu，L)、賴胺酸(Lys，K)、甲硫胺酸(Met，M)、苯丙胺酸(Phe，F)、脯胺酸(Pro，P)、絲胺酸(Ser，S)、蘇胺酸(Thr，T)、色胺酸(Trp，W)、酪胺酸(Tyr，Y)和纈胺酸(Val，V)。

本發明中關於細胞、核酸、多肽、抗體等所使用的術語「分離的」，例如「分離的」DNA或RNA是指分別與天然來源中的其它組分如天然DNA或RNA所分離的分子。本發明使用的術語「分離的」還指當通過重組DNA技術產生基本上不含細胞材料、病毒材料或細胞培養基的核酸或多肽，或化學合成時的化學前體或其他化學品。此外，「分離的核酸」意在包括不以天然狀態存在的核酸片段。術語「分離的」在本發明中也用於指從其他細胞蛋白質或組織分離的細胞或多肽。分離的多肽意在包括純化的和重組的多肽。分離的多肽、抗體等通常通過至少一個純化步驟製備。在一些實施方案中，分離的核酸、多肽、抗體等的純度至少為50%、60%，70%，80%，90%，或95%。

在本發明中，術語「重組」涉及多肽或多聚核苷酸，意指天然不存在的多肽或多聚核苷酸的形式，可以通過組合產生通常並不存在的多聚核苷酸或多肽。

「同源性」或「同一性」或「相似性」是指兩個多肽之間或兩個核酸分子之間的序列相似性。通過比較每個序列中可以比對的位置來確定同源性。當被比較的序列中的位置被相同的堿基或胺基酸佔據時，則分子在該位置是同源的。序列之間的同源程度是由序列共有的匹配或同源位置的數目組成的一個函數。

多聚核苷酸或多聚核苷酸區域（或多肽或多肽區域）與另一序列有具有一定百分比（例如，60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或者99％）的「序列同一性」或「序列同源性」是指當序列比對時，所比較的兩個序列中該百分比的堿基（或胺基酸）相同。可以使用本領域已知的軟體程式來確定該比對和同源性百分比或序列同一性，比如Ausubel et al. eds.（2007）在Current Protocols in Molecular Biology中所述的軟體程式。在一些實施方案中，使用默認參數進行比對。其中一種比對程式是使用預設參數的BLAST。生物學上等同的多聚核苷酸是具有上述指定百分比的同源性並編碼具有相同或相似生物學活性的多肽的多聚核苷酸。

術語「多聚核苷酸」和「寡核苷酸」可互換使用，是指任何長度的核苷酸的聚合形式，無論是去氧核糖核苷酸還是核糖核苷酸或其類似物。多聚核苷酸可以具有任何三維結構並且可以執行已知或未知的任何功能。比如：基因或基因片段（例如探針、引物、EST或SAGE標籤）、外顯子、內含子、信使RNA（mRNA）、轉運RNA、核糖體RNA、核糖酶、cDNA、dsRNA、siRNA、miRNA、重組多聚核苷酸、分支的多聚核苷酸、質粒、載體、任何序列的分離的DNA和、任何序列的分離的RNA。多聚核苷酸可以包含修飾的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸類似物。對核苷酸的結構修飾可以在組裝多聚核苷酸之前或之後進行。核苷酸的序列可以被非核苷酸組分中斷。聚合後可以進一步修飾多聚核苷酸。這個術語也指雙鏈和單鏈分子。除另有說明或要求外，本公開的任何多聚核苷酸包括雙鏈形式和已知或預測構成雙鏈形式的兩種可互補單鏈形式中的每一種。

術語「編碼」應用於多核苷酸時，是指可以「編碼」多肽的多核苷酸，如果在其天然狀態或當通過本領域技術人員公知的方法操作時，其可以被轉錄和/或翻譯以產生多肽和/或其片段的mRNA。反義鏈是這種核酸的互補序列，其編碼序列可以從中推導出來。

在本發明中，「抗體」或「抗原結合片段」是指特異性識別和結合抗原的多肽或多肽複合物。抗體可以是完整的抗體或其任何抗原結合片段或其單鏈。因此術語「抗體」包括分子中含有與抗原結合的具有生物學活性的免疫球蛋白分子的部分或整體的蛋白質或肽。包括但不限於重鏈或輕鏈或其配體結合部分的互補決定區（CDR）、重鏈可變區（VH）、輕鏈可變區（VL）、重鏈恒定區（CH）、輕鏈恒定區（CL）、框架區（FR）或其任何部分。CDR包括輕鏈的CDR（VL CDR）和重鏈的CDR（VH CDR）。抗體重鏈的類別包括γ、μ、α、δ、ε，其中還有一些亞類（例如γ1-γ4）。該鏈的性質決定了抗體的「種類」分別為IgG、IgM、IgA、IgG或IgE。其中一些可進一步分成免疫球蛋白亞類（同種型），例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等。輕鏈的類別包括κ、λ。每個重鏈可以與κ或λ輕鏈結合。一般來說，當由雜交瘤，B細胞或基因工程宿主細胞生產免疫球蛋白時，其輕鏈和重鏈通過共價鍵結合，兩條重鏈的「尾巴」部分通過共價二硫鍵或非共價鍵結合。在重鏈中，胺基酸序列從Y構型的叉狀末端的N末端延伸至每條鏈底部的C末端。免疫球蛋白κ輕鏈可變區為Vκ；免疫球蛋白λ輕鏈可變區為Vλ。本發明通常用的VL為Vκ。雖然某些討論針對免疫球蛋白分子的IgG種類，所有的免疫球蛋白種類都在本發明公開的保護範圍內。關於IgG，標準的免疫球蛋白分子包含分子量約23,000道爾頓的兩條相同的輕鏈多肽和分子量約為53,000-70,000的兩條相同的重鏈多肽。輕鏈和重鏈都可分成結構和功能同源性的區域。術語「恒定的」和「可變的」根據功能被使用。就這點而言，應理解，VL和VH決定了抗原識別和特異性。VL和VH上的抗原結合位點能夠識別抗原決定簇並且與抗原特異性的結合。抗原結合位點由VH和VL中各自的三個CDR定義（即VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3）。CL和CH（CH1、CH2或CH3）賦予重要的生物學性質，如分泌、經胎盤移動、Fc受體結合、補體結合等。按照慣例，恒定區的編號隨著它們變得更遠離抗體的抗原結合位點或胺基末端而增加。N端部分是可變區，C端部分是恒定區；CH3和CL結構域實際上分別包含重鏈和輕鏈的羧基端。

在本發明中，抗體的重鏈恒定區可以來源於不同的免疫球蛋白分子。例如，抗體的重鏈恒定區可以包括源自IgG1分子的CH1結構域和源自IgG3分子的鉸鏈區。在另一實施例中，重鏈恒定區可以包括部分源自IgG1分子和部分源自IgG3分子的鉸鏈區。在另一實施例中，部分重鏈可以包括部分源自IgG1分子和部分源自IgG4分子的嵌合鉸鏈區。

在本發明中，術語「鉸鏈區」包括連接CH1結構域和CH2結構域的部分重鏈結構。所述鉸鏈區包含約25個殘基並且是有韌性的，從而使得兩個N端抗原結合區能夠獨立移動。

在本發明中，術語「二硫鍵」包括兩個硫原子之間形成的共價鍵。半胱胺酸包含可以與第二個硫醇基團形成二硫鍵或橋接的硫醇基團。在大多數天然存在的IgG分子中，CH1和CL區通過二硫鍵連接，兩條重鏈通過兩個二硫鍵相連接。

在本發明中，術語「片段」、「抗體片段」或「抗原結合片段」是抗體的一部分，例如F(ab')2、F(ab)2、Fab'、Fab、Fv、scFv等。不管其結構如何，抗體片段與被完整抗體識別的同一抗原結合。術語「抗原結合片段」包括適體、鏡像異構體和雙價抗體，還包括通過與特定抗原結合形成複合物起抗體作用的任何合成或基因工程蛋白質。

「scFv」是指免疫球蛋白的VH和VL的融合蛋白。在一些方面，這些區域與約10個至約25個胺基酸的短接頭肽連接。接頭可以富含甘胺酸以增加柔韌性，以及富含絲胺酸或蘇胺酸以增加溶解性，並且可以連接VH的N端和VL的C端，反之亦然。儘管該蛋白質被除去了恒定區和引入了接頭，但其保留了原始免疫球蛋白的特異性。

本發明公開的抗體、抗原結合片段、變體或衍生物包括但不限於多克隆、單克隆、多特異性，全人源、人源化、靈長類化，或嵌合抗體、單鏈抗體、表位結合片段。

本文所用術語「表位」包括任意能夠特異性結合免疫球蛋白或其片段或T細胞受體的蛋白決定區。表位元決定區通常由分子的化學活性表面基團(如胺基酸或糖側鏈) 組成且通常有特定的三維結構性質以及特定的電荷性質。當解離常數小於等於1µM (例如小於等於100nM、小於等於10nM或小於等於1nM) 時，即可稱抗體特異性結合抗原。

在本領域中使用和/或接受的術語有兩個或多個定義的情況下，除非明確地對立指出，否則本文使用的術語的定義包括所有這些含義。

除非另有說明，抗體各個結構域中的殘基的編號根據EU編號系統，其也被稱為EU索引，如在Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991中所述。

本發明公開的抗體可以來源於任何動物，包括鳥類和哺乳動物。較佳地，抗體是人源、鼠源、驢源、兔源、山羊源、豚鼠源、駱駝源、美洲駝源、馬源或雞源抗體。在另一實施例中，可變區可以是軟骨魚綱來源（例如來自鯊魚）。

在本發明中，術語「嵌合抗體」被認為是指抗體的可變區從第一個物種中獲得或衍生，而其恒定區（在本發明中可以是完整的、部分的或修飾過的）來源於第二個物種的任何抗體。在一些實施例中，可變區來自非人源（例如小鼠或靈長類動物），而恒定區是人源。

「特異性結合」或「對……具有特異性」通常是指抗體通過其抗原結合結構域與表位元結合，並且該結合需要抗原結合結構域和表位元之間具有互補性。根據這個定義，當抗體通過其抗原結合結構域與該表位元結合時，比它結合到隨機的、不相關的表位更容易，其被稱為「特異性結合」該表位。術語「特異性」在本發明中用於限定特定抗體與特定表位結合的相對親和力。免疫學結合相互作用的強度或親和力可以以相互作用的平衡解離常數(KD)表示，其中較小的KD代表親和力較強。所選多肽的免疫結合特性可使用本領域熟知方法進行定量。一種方法，需要測量抗原結合位元點/抗原複合物形成和解離的速率，其中那些速率取決於複合物配偶體的濃度、相互作用的親和力和在兩個方向同等影響該速率的幾何參數。因此，「結合速率常數」(Kon)和「解離速率常數」(Koff)兩者可通過計算濃度和實際的締合和解離速率測定(參見Nature 361:186-87 (1993))。Koff/Kon比率能夠消除與親和力無關的參數，並且等於平衡解離常數KD，即為親和力數值。(通常參見Davies等人 (1990) Annual Rev Biochem 59:439-473)。當與OX40的平衡結合常數(KD)≦1µM 時，本公開的抗體可以視為與OX40特異性結合。

在本發明中，抗體的岩藻糖的「含量」，是指在抗體中，含有岩藻糖的糖型部分在抗體所有糖型部分中占的摩爾比。在一些實施方案中，抗體的岩藻糖含量不低於約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%。在一些實施方案中，抗體的岩藻糖含量約為96%。在一些實施方案中，抗體的岩藻糖含量不超過約10%、約9%、約8%、約7%、約6%、約5%、約4%、約3%、約2%、約1%或約0.5%。在一些實施方案中，抗體的岩藻糖含量約為0。

在本發明中，術語「治療」是指預防性措施和/或治療性治療，其目的是預防、減緩和/或消除不良的生理改變或紊亂(如癌症)的進程。有益的或期望的臨床結果包括但不限於以下結果：如症狀的緩解、疾病程度的減小、疾病狀態的穩定（即不惡化）、疾病進展的延遲或減緩、疾病狀態的改善或緩和等。「治療」還意指延長的生存期限（與不接受治療時預期的生存期限相比）。需要治療的包括那些已經患有病症或紊亂的人，以及那些容易患有病症或紊亂的人，或者那些需要預防該病症或紊亂的人。

「患者」通常指需要診斷、預後或治療的任何患者，特別是哺乳動物患者。哺乳動物患者包括人類、狗、貓、豚鼠、兔子、大鼠、小鼠、馬、牛、奶牛等，特別是人類。

在本發明中，諸如「需要治療的患者」包括從施用本發明公開的抗體或組合物中用於檢測、診斷過程、預防和/或治療中受益的患者，例如哺乳動物患者。

除非另有說明，術語「OX40」指來自任何脊椎動物來源（包括哺乳動物諸如靈長類(如人、恒河猴)和齧齒類(如小鼠和大鼠)）的任何天然OX40。該術語涵蓋「全長」，未加工的OX40以及因細胞中的加工所致的任何形式的OX40。

「OX40活化」指OX40受體的活化。通常，OX40活化導致信號轉導。

「活化T細胞」意指誘導、引起或刺激效應或記憶T細胞具有更新、持續或放大的生物學功能。增強T細胞功能的例子包括：相對於干預前，來自CD8+效應T細胞的γ-干擾素(例如IFNg)或白細胞介素(例如IL-2)分泌增加，來自CD4+記憶和/或效應T細胞的γ-干擾素(例如IFNg)或白細胞介素(例如IL-2)分泌增加，CD4+效應和/或記憶T細胞增殖增強，CD8+效應T細胞增殖增強，抗原回應性(例如清除)增強。相關的測量方法是本領域技術人員已知的。

術語「細胞因數」是由一種細胞群釋放的，作為細胞間介質作用於另一細胞的蛋白質的通稱。此類細胞因數的例子有淋巴因數、單核因數、白介素(IL)（諸如IL-1、IL-1α、IL-2、

IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-15）、腫瘤壞死因數（諸如TNF-α或TNF-β）及其它多肽因數（包括LIF和kit配體(KL)和γ-干擾素）。如本文中使用的，術語細胞因數包括來自天然來源或來自重組細胞培養物的蛋白質及天然序列細胞因數的生物學活性等效物。生物學活性等效物包括通過人工合成產生的小分子實體，及其藥劑學可接受的衍生物和鹽。

如本文所用，術語「標記」或「經標記的」是指摻入可檢測標記，例如，通過摻入放射性標記的胺基酸，或者附著於可標記的親和素(例如，含有螢光標記或可由光學方法或量熱法檢測的具有酶活性的鏈黴親和素)檢測的生物素基部分的多肽。在某些情況下，標記物或標記也可為治療性的。標記多肽和糖蛋白的各種方法是本領域已知的並且可以使用。用於多肽的標記物的示例包括但不限於以下項：放射性同位素或放射性核素(例如3H、14C、15N、 35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、螢光標記物(例如FITC、羅丹明、鑭系磷光體)、酶標記物(例如辣根過氧化酶、β-半乳糖苷酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶)、化學發光標記、生物素醯基、被二級報告基因識別的預定多肽表位(例如亮胺酸拉鍊對序列、二級抗體結合位元點、金屬結合結構域、表位元標籤)。在一些實施方案中，標記通過各種長度的間隔臂連接以減小可能的空間位阻。

抗OX40抗體

本發明的抗體具有結合OX40的能力，能啟動OX40的胞內信號通路，特別是在Fc受體或表達Fc受體的細胞參與時，以此促進T細胞的啟動，並抑制腫瘤的生長或轉移。例如，可使用本文實施例中描述的NFκB報告基因系統檢驗其啟動T細胞的功能。

在一些實施方案中，本發明提供了結合人OX40或恒河猴OX40的抗體或其抗原結合片段。在一些實施方案中，本發明的抗OX40抗體或其抗原結合片段保留對人OX40或恒河猴OX40的強的結合（例如與已知的抗OX40抗體，例如OX40mAb24和11D4相當或更強）。

在一些實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合片段結合人OX40或恒河猴OX40。本發明的抗體或其抗原結合片段不結合或相比與人OX40或恒河猴OX40的結合較低地結合鼠OX40，例如小鼠OX40。

在一些實施方案中，本發明的抗OX40抗體或其抗原結合片段結合人OX40的KD小於或等於約20nM、約19nM、約12nM、約6nM、約5nM、約4nM或約2nM。在一些實施方案中，KD小於或等於約1nM、約0.8nM、約0.6nM、約0.4nM或約0.2nM。在一些實施方案中，KD為約0.16nM。在一些實施方案中，抗體結合親和力是使用生物光干涉測定法（例如Fortebio親和測量）測定的。

在一些實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合片段對人OX40的結合是使用流式細胞術測定法測定的。在一些實施方案中，對人OX40的結合具有小於或等於約1.5nM的EC50。在一些實施方案中，對人OX40的結合具有小於或等於約1.33nM或約1.0nM的EC50。

在一些實施方案中，抗OX40抗體的激動劑活性由OX40信號傳導來評估。主要是利用轉染了OX40和NFκB報告基因的Jurkat細胞來檢測。本發明提供了與用IgG對照抗體相比，提高NFκB介導的轉錄活性水準的抗OX40抗體或其抗原結合片段。在一些實施方案中，與相應的對照IgG相比，在raji細胞的參與下，抗OX40抗體或其抗原結合片段能夠將NFκB介導的轉錄活性水準提高大約9倍多。在一些實施方案中，與相應的對照IgG相比，本發明的抗OX40抗體或其片段能夠將NFκB介導的轉錄活性水準提高大約5倍或更多。

在一些實施方案中，抗OX40抗體的Fc經過RY(E345R和S440Y)和R(E345R)突變後，利用轉染OX40和NFκB報告基因的Jurkat細胞來檢測它們的活性。經過RY突變後的抗體的活性比沒突變的抗體的高12倍，而經過R突變的抗體的活性比沒突變的抗體高10倍。

在一些實施方案中，抗OX40抗體的激動劑活性由PBMC細胞活化後釋放的細胞因數（IL-2）的水準來評估。與相應的對照IgG相比，本發明的抗OX40抗體或其片段能夠將PBMC細胞分泌的IL-2水準增加高達約1倍、約2倍、約3倍或更高。

在一些實施方案中，抗OX40抗體或其抗原結合片段，經過親和力成熟後，其親和力提高了約5倍、約10倍、約20倍或約70倍。

在一些實施方案中，本發明的抗OX40抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)，其中所述VH包含互補決定區域VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，其中VH CDR1包含與選自SEQ ID NO: 1、4、10、16、104或22的胺基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的胺基酸序列或由其組成，VH CDR2包含與選自SEQ ID NO: 2、5、7、8、11、13、14、17、20、23或26的胺基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的胺基酸序列或由其組成，且VH CDR3包含與選自SEQ  ID  NO:3、6、9、12、15、18、21、24或27的胺基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的胺基酸序列或由其組成。

在一些實施方案中，本發明的抗OX40抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區(VL)，其中所述VL包含互補決定區域(CDR)VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，其中VL CDR1包含與選自SEQ ID NO: 28、31、37、40、43、46、49、52、55、58或61的胺基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的胺基酸序列或由其組成，VL CDR2包含與選自SEQ ID NO: 19、25、29、32、35、38、44、47、50、56、59或62的胺基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的胺基酸序列或由其組成，VL CDR3包含與選自SEQ ID NO: 30、33、34、36、39、41、42、45、48、51、53、54、57、60或63的胺基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的胺基酸序列或由其組成。本發明抗體或其抗原結合片段中VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3可以是表1中各CDR對應的任一胺基酸序列的示例性組合。

表1 各序號對應的CDR序列

SEQ ID NO	VH CDR1	SEQ ID NO	VH CDR2	SEQ ID NO	VH CDR3
1	GFTFSSYA	2	ISYDGSNK	3	ARELGVYSGYDTPFDY
4	GFTFDDYA	5	IGGSGGST	6	AKDRGYGDYYWYFDL
10	SYGMH	7	VISEDGSNQYYADSVKG	9	AKDPLGSSWFEYFQH
16	GFTFSTYA	8	ISGSGGNT	12	DNQDSSPDVGIDY
22	GFTVSSNY	11	VISYDGSNQYYADSVKG	15	AKDGPYFDY
104	GFTFSSYG	13	VIAEVGSNQYYADSVKG	18	AKSSSTVATDFDYGMDV
	14	ISNSGGST	21	ARGDSSSWFIFQD
17	ISGTGDWA	24	ARVVVPGYFDL
20	ISGSGGST	27	DNQDTSPDVGIDY
23	IYYGGST
26	VIWEDGSNQYYADSVKG
SEQ ID NO	VL CDR1	SEQ ID NO	VL CDR2	SEQ ID NO	VL CDR3
28	RDIRDD	19	AAVALQS	30	LQDSDYPLT
31	SSDVGGYNY	25	AAVGLQS	33	SSYTTSSTLV
37	QDILGY	29	AAS	34	QQYTDYPLT
40	QSISSYLN	32	DVS	36	SSYSSSSTLVV
43	RASQNISPFLN	35	EVS	39	QQYNSYPLT
46	QGIGDD	38	ATS	41	QQYDDYPLT
49	EEIGSWLAW	44	AASSLQS	42	LQIDSYPLT
52	EDIGRW	47	KAS	45	QQYNDYPLT
55	SSNMGSNP	50	EAS	48	QQAHSFPPT
58	DSLRSYYAS	56	NNN	51	QQYGSYPPT
61	RASQNISPFLN	59	NNR	53	QQYSDYPLT
	62	AAVGSQS	54	QQYYNYPPT
	57	AAWDDGLNGWV
60	HSRDSSGKYV
63	QQYTDYPL

在一些實施方案中，本發明的抗OX40抗體或其片段包含重鏈可變區VH，其包含與選自SEQ ID NO: 64-72的胺基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的胺基酸序列或由其組成。

在一些實施方案中，本發明的抗OX40抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區VL，其包含與選自SEQ ID NO: 73-84的胺基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的胺基酸序列或由其組成。

在一些實施方案中，本發明抗體或其抗原結合片段中重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL為表3的示例性組合。

在一些實施方案中，所述抗體或其片段還包含重鏈恒定區、輕鏈恒定區、Fc區或其結合。

在一些實施方案中，所述抗體包含如SEQ ID NO: 86所示的重鏈，以及如SEQ ID NO: 87所示的輕鏈。

本發明公開的抗體、抗原結合片段、變體或衍生物。變體是指對抗體或其抗原結合片段中的一個或多個胺基酸殘基進行刪除和/或替換，或插入一個或多個胺基酸殘基而得到的抗體或其抗原結合片段。衍生物包括被修飾的衍生物，即通過任何類型的分子與抗體的共價連接進行修飾，其中共價連接不會阻止抗體與表位結合。包括但不限制以下實例，抗體可以通過例如糖基化、乙醯化、聚乙二醇化、磷酸化、醯胺化、通過已知的保護/封閉基團衍生化、蛋白水解切割、連接至細胞配體或其他蛋白質等。眾多化學修飾中的任一種修飾可以通過現有技術進行，包括但不限於特異性化學裂解、乙醯化、甲醯化、衣黴素的代謝合成等。此外，抗體可以含有一個或多個非自然的胺基酸。

在一些實施例中，抗體可以與治療劑、藥物前體、肽、蛋白質、酶、病毒、脂類、生物反應調節劑、藥劑或PEG綴合。

抗體可以與治療劑綴合或融合，所述治療劑可包括可檢測標記，如放射性標記、免疫調節劑、激素、酶、寡核苷酸、光敏治療劑或診斷劑、可以是藥物或毒素的細胞毒性劑、超聲增強劑、非放射性標記物及其組合物，和本領域已知的其它此類試劑。

抗體可通過將其偶聯至化學發光化合物來被可檢測地標記。然後通過檢測在化學反應過程中出現的發光從而確定化學發光標記的抗原結合片段的存在。特別有用的化學發光標記化合物的實例包括魯米諾、異魯米諾、芳香吖啶酯、咪唑、吖啶鹽和草酸酯。

在一些實施方案中，本發明抗OX40抗體或其片段的重鏈和/或輕鏈還包含信號肽序列，例如MEFGLSWVFLVAILKGVQC(SEQ ID NO:85)。

在一些實施方案中，本發明的抗體還涵蓋抗OX40抗體的胺基酸序列的變體，以及與上文所述的任何抗體結合相同表位的抗體。

在一些實施方案中，本發明的抗OX40抗體還涵蓋其抗體片段；在一些實施方案中，選自以下的抗體片段：Fab、Fab'-SH、Fv、scFv或 (Fab’)2 片段。

本發明的抗OX40抗體可通過常規重組DNA技術製備，例如，通過使用本領域技術人員公知的重組DNA技術可以選擇、構建和培養編碼抗體的DNA、生產抗體的載體及細胞系。這些技術在各種實驗室手冊和主要出版物中均有描述。在這方面，下文描述的適合本發明使用的技術參考Current Protocols in Immunology, Coligan et al., Eds., Green Publishing Associates and Wiley-Interscience, John Wiley and Sons, New York (1991)，其全部內容包括補充內容通過引用併入全文。

在一些實施方案中，可以按常規方法根據本文所述抗體胺基酸序列設計合成編碼抗體的DNA，將其置入表達載體中，然後轉染宿主細胞，在培養基中培養被轉染的宿主細胞產生單克隆抗體。在一些實施方案中，表達抗體載體包括至少一個啟動子元件，抗體編碼序列，轉錄終止信號和polyA尾。其他元件包括增強子，Kozak序列及插入序列兩側RNA剪接的供體和受體位點。可以通過SV40的前期和後期啟動子，來自逆轉錄病毒的長末端重複序列如RSV、HTLV1、HIVI及巨細胞病毒的早期啟動子來獲得高效的轉錄，也可應用其它一些細胞的啟動子如肌動蛋白啟動子。合適的表達載體可包括pIRES1neo，pRetro-Off，pRetro-On，PLXSN，或者Plncx，pcDNA3.1（+/-），pcDNA/Zeo(+/-)，pcDNA3.1/Hygro（+/-），PSVL，PMSG，pRSVcat，pSV2dhfr，pBC12MI和pCS2等。常使用的哺乳動物細胞包括293細胞，Cos1細胞，Cos7細胞，CV1細胞，鼠L細胞和CHO細胞等。

在一些實施方案中，插入基因片段需含有篩選標記，常見的篩選標記包括二氫葉酸還原酶，穀胺醯胺合成酶，新黴素抗性，潮黴素抗性等篩選基因，以便於轉染成功的細胞的篩選分離。將構建好的質粒轉染到宿主細胞，經過選擇性培養基培養，轉染成功的細胞大量生長，產生想要獲得的目的蛋白。

在一些實施方案中，本發明提供了編碼以上任何抗OX40抗體或其片段的核酸。在一個實施方案中，提供包含所述核酸的載體。在一個實施方案中，載體是表達載體。表達載體包括質粒、逆轉錄病毒、YAC、EBV衍生的附加體等等。在一個實施方案中，提供包含所述載體的宿主細胞。在一個實施方案中，所述宿主細胞是真核的。在另一個實施方案中，宿主細胞選自酵母細胞、哺乳動物細胞(例如CHO細胞或293F細胞)或適用於製備抗體或其抗原結合片段的其它細胞。

在一些實施方案中，所述多聚核苷酸包含如SEQ ID NO: 96-101所示的一種或多種核苷酸序列。在一些實施方案中，所述多聚核苷酸包含如SEQ ID NO: 96、97和98所示的核苷酸序列。在一些實施方案中，所述多聚核苷酸包含如SEQ ID NO: 99、100和101所示的核苷酸序列。在一些實施方案中，所述多聚核苷酸包含如SEQ ID NO: 102所示的核苷酸序列。在一些實施方案中，所述多聚核苷酸包含如SEQ ID NO: 103所示的核苷酸序列。在一些實施方案中，所述多聚核苷酸包含如SEQ ID NO: 102所示的核苷酸序列，和/或如SEQ ID NO: 103所示的核苷酸序列。在一些實施方案中，包含如SEQ ID NO: 96、97、98、99、100或101所示的核苷酸序列的多聚核苷酸可分別編碼產生包含如SEQ ID NO: 10、26、27、61、62或63所示的胺基酸序列的多肽。在一些實施方案中，包含如SEQ ID NO: 102所示的核苷酸序列的多聚核苷酸可編碼產生包含如SEQ ID NO: 72所示的胺基酸序列的多肽；在一些實施方案中，包含如SEQ ID NO: 103所示的核苷酸序列的多聚核苷酸可編碼產生包含如SEQ ID NO: 84所示的胺基酸序列的多肽。在一些實施方案中，包含如SEQ ID NO: 105所示的核苷酸序列的多聚核苷酸可編碼產生包含如SEQ ID NO: 90所示的胺基酸序列的多肽；在一些實施方案中，包含如SEQ ID NO: 106所示的核苷酸序列的多聚核苷酸可編碼產生包含如SEQ ID NO: 91所示的胺基酸序列的多肽。其中，各核苷酸序列如下表2所示。

表2 各編號核苷酸的序列表

SED ID NO:	序列
96	tcctacggcatgcac
97	gtgatctgggaggatggctccaaccagtactatgccgacagcgtgaaggga
98	gacaaccaagacaccagccccgacgtgggcatcgattat
99	agagccagccagaacatctccccctttctgaat
100	gccgctgtgggactgcagagc
101	cagcagtataccgactaccctctgacc
102	caagtgcagctggtggagagcggaggaggagtggtgcaacccggcgagtccctcagactgagctgtgccgccagcggcttcaccttcagctcctacggcatgcactgggtgagacaagcccccggcaaaggactggagtgggtggccgtgatctgggaggatggctccaaccagtactatgccgacagcgtgaagggaagattcaccatctctagagacaactccaagaacacactgtatctgcagatgaactctctgagggccgaggacaccgccgtgtactactgcgccaaggacaaccaagacaccagccccgacgtgggcatcgattattggggccagggtaccctggttaccgttagcagc
103	gacatccagatgacccagagccctagctctctgtccgctagcgtgggagatagagtgaccatcacatgcagagccagccagaacatctccccctttctgaattggtatcagcagaagcccggcaaggcccctaagctgctgatctatgccgctgtgggactgcagagcggagtgccttccagattctccggcagcggcagcggaaccgacttcacactgaccatcagctctctgcagcccgaggacttcgccacctactactgccagcagtataccgactaccctctgaccttcggaggcggcaccaaggtggagatcaag
105	gcgagcaccaaaggcccgagcgtgtttccgctggccccgagcagcaaaagcaccagcggtggcaccgcagcgctgggttgcctggtgaaagattatttcccggaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa
106	cgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt

本發明的藥物組合物可包括本發明的抗體或其抗原結合片段。這些藥物組合物可包括於試劑盒中，如診斷試劑盒。

本發明還提供了通過給予有需要的患者一種或多種本文所述抗體或片段從而緩解癌症或其他腫瘤病症或感染症狀的方法。所述抗體的給藥劑量應足夠緩解患者中癌症或其他腫瘤病症或感染症狀。在一些實施方案中，所述患者是人。在一些實施方案中，所述抗體是嵌合、人源化或全人源的。在一些實施方案中，所述抗體或其片段能啟動T細胞，促進其增殖或分泌炎性因數。在一些實施方案中，所述抗體或其片段是一種IgG同種型，所述IgG同種型選自IgG1同種型、IgG2同種型、IgG3同種型和/或IgG4同種型組成的組。在一些實施方案中，所述抗體或其抗原結合片段是選自IgG4P和IgG4PE的IgG同種型。在一些實施方案中，所述抗體或其抗原結合片段是選自含RY(E345R和S440Y)和R(E345R)的IgG同種型。

在一些實施方案中，所述抗OX40抗體和其它治療劑被製備為單個治療組合物，並同時給予所述抗OX40抗體和其它治療劑。或者，所述抗OX40抗體和其它治療劑彼此獨立，例如分別製備為獨立的治療組合物，並同時給予所述抗OX40抗體和其它治療劑，或在治療方案期間在不同時間給予所述抗OX40抗體和其它治療劑。例如，在給予其它治療劑前給予所述抗OX40抗體，在給予其它治療劑後給予所述抗OX40抗體，或在以交替的方案給予所述抗OX40抗體和其它治療劑。本文中，以單個劑量或多個劑量給予所述抗OX40抗體和其它治療劑。

本領域技術人員應理解本發明的抗體有多種用途。例如，本發明的抗體可用作治療劑、用作診斷試劑盒中的試劑或用作診斷工具、或用作競爭實驗中的試劑以生成治療劑。

本發明提供了表3中的抗體及其序列。本文中，這些抗體被統稱作抗OX40抗體。

本文所述抗體的一些特性包括：與人OX40和恒河猴OX40特異性結合；能啟動OX40的胞內信號通路；能促進T細胞的啟動；針對癌症，顯示有力的抑制腫瘤活性。

本發明的抗體及其片段與人OX40表位結合的平衡解離常數（KD）是用生物光干涉測定法和BIACORE測定的，其小於或等於約20nM、約19nM、約12nM、約6nM、約5nM、約4nM、約2nM。在一些實施方案中，所述KD小於或等於大約1nM或0.16nM。

本發明的抗體或其片段對人OX40表位結合的平衡結合常數（KD）是用流式細胞術測定法測定的。在一些實施方案中，對人OX40的結合具有小於或等於大約1.5nM的EC50。在一些實施方案中，對人OX40的結合具有小於或等於大約1.33nM或1.0nM的EC50。其所測定的KD等於或小於已知的對照抗體。

本發明的抗OX40抗體啟動OX40的活性是用NFκB報告基因系統鑒定的，在protein A存在時，EC50約為0.14μg/ml，而在Raji細胞存在時，EC50約0.0602μg/ml和0.0722μg/ml。

本發明的示例性抗體包括抗體-F10、抗體-F15-1L、抗體-A2、抗體-X35-6L、抗體-A6-1k、抗體-M5-5k、抗體-M5-7k、抗體-F23-4k、抗體-F23-7k、抗體-F23-32k、抗體-FE-16H和抗體M。本發明的示例性抗體包括含有序列選自SEQ ID NO:64-72的可變重鏈和序列選自SEQ ID NO:73-84的可變輕鏈（VL）的抗體。特別地，示例性抗體包括表3所提供的抗體。

表3 各編號抗OX40抗體的序列表

編號	名稱	重鏈可變區	輕鏈可變區
1	抗體-F10	QVQLQESGGGLEKPGRSLRLSCAASGFTFSSYA MHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNK YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARELGVYSGYDTPFDY WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:64)	DIQMTQSPSSLSASVGDRITITCRASRDIRDD LAWYQQKPGGAPKLLIYAAS TLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQDSDYPLT FGGGTKLEIK (SEQ ID NO:73)
2	抗體-X35-6L	EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYA MHWVRQAPGRGLEWVSGIGGSGGST YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNGLGAEDTAVYYCAKDRGYGDYYWYFDL WGRGTLVTVSS (SEQ ID NO:65)	SSELTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNY VSWYQQHPGKAPKLMIYDVS NRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTTSSTLV FGGGTKVTVL (SEQ ID NO:74)
3	抗體-F15-1L	QVQLRESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYA MNWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGNT YYADSVKGRLTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPLGSSWFEYFQH WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:66)	QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNY VSWYQKHPGKAPKLMIYEVS NRPSGVSNRFSGSKSANTASLTISGLQAEDEADYFCSSYSSSSTLVV FGGGTKLTVL (SEQ ID NO:75)
4	抗體-F23-4k	QVQLEESGGGVVQPGESLRLSCAASGFTFSSYGMH WVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNQYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDNQDSSPDVGIDY WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:67)	DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDILGY VNWYQQKPGKAPILLIYATS GLQGGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPLT FGGGTKVDIK  (SEQ ID NO:76)
5	抗體-F23-7k	QVQLEESGGGVVQPGESLRLSCAASGFTFSSYGMH WVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNQYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDNQDSSPDVGIDY WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:67)	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLN WYQQKPGKAPKLLMYAAS SLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQIDSYPLT FGGGTKVEIK (SEQ ID NO:77)
6	抗體-F23-32k	QVQLEESGGGVVQPGESLRLSCAASGFTFSSYGMH WVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNQYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDNQDSSPDVGIDY WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:67)	DIQMTQSPSSLSASVGDTVTIT CRASQNISPFLN WYQQ KPGKAPKLLIYAASSLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPLT FGGGTKVEIK (SEQ ID NO:78)
7	抗體-A6-1k	QVQLQRSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYG MTWVRQAPGKGLEWVSAISNSGGST YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDGPYFDY WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:68)	DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRVSQGIGDD LGWYQQKPGKAPKLLIYKAS NLESGVPSRFSGSGSGTDFSLTISSLQPEDFATYFCQQAHSFPPT FGGGTKLEIK (SEQ ID NO:79)
8	抗體-M5-5k	QVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCTASGFTFSTYA MSWVRQAPGKGLEWVSAISGTGDWA SYADSVKGRFTTSRDNSRNTLYLQMNNLRDEDTAIYYCAKSSSTVATDFDYGMDV WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:69)	ETTLTQSPSTLSASVGDRVTITCRASEEIGSWLAW YQQTPGKAPKRLIYEAS SLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYGSYPPT FGQGTKVEIK (SEQ ID NO:80)
9	抗體-M5-7k	QVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCTASGFTFSTYA MSWVRQAPGKGLEWVSAISGTGDWA SYADSVKGRFTTSRDNSRNTLYLQMNNLRDEDTAIYYCAKSSSTVATDFDYGMDV WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:69)	DIVMTQSPSTLSASVGDRVTVTCRASEDIGRW LAWYQQKPGKAPKRLIYAAS SLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYNYPPT FGQGTKVEIK (SEQ ID NO:81)
10	抗體-FE-16H	QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYA MSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGST YYADSVKGRFTISRDNSKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGDSSSWFIFQD WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:70)	QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNMGSNP VNWYQQLPGEAPQLLMYNNN QRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEAEYYCAAWDDGLNGWV FGGGTKLTVL (SEQ ID NO:82)
11	抗體-A2	QVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTVSSNY MSWVRQAPGEGLEWIATIYYGGST YYNPSLKSRVTISADMSKNQFSLKLSSMTAADTAVYYCARVVVPGYFDL WGRGTLVTVSS (SEQ ID NO:71)	SSELTQDPAVSVALGQTVSITCQGDSLRSYYAS WYQQKPGQAPVPVIYGKNNR PSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCHSRDSSGKYV FGVGTKLTVL  (SEQ ID NO:83)
12	抗體M	QVQLVESGGGVVQPGESLRLSCAASGFTFSSYGMH WVRQAPGKGLEWVAVIWEDGSNQYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDNQDTSPDVGIDY WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:72)	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNISPFLN WYQQKPGKAPKLLIYAAVGLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYTDYPLT FGGGTKVEIK (SEQ ID NO:84)

本發明還包括與本文所述抗OX40抗體結合同一表位的抗體。例如，本發明的抗體特異性結合包括人OX40上一個或多個胺基酸殘基的表位（參見例如Uniprot上的P434489）。

本領域技術人員將認識到，只需要通過查明待測抗體是否阻止已知抗體與OX40結合，而無需進行過多實驗就可以確定抗體是否與本文所述抗體(例如表3所列抗體，或者具有選自SEQ ID NO:64-72的可變重鏈和序列選自SEQ ID NO:73-84的可變輕鏈中的一種)結合同一表位。如由本文所述抗體的結合減少所示出的那樣，如果受試抗體與本公開抗體競爭，則兩種抗體可能結合至相同或相近的表位。

一種用於確定抗體是否具有本文所述抗體的特異性的替代方法是將本文所述抗體與通常該抗體對其有反應的可溶OX40蛋白質一起預孵育然後加入測試的抗體以確定測試的抗體與OX40結合的能力是否受到抑制。如果測試的抗體受到抑制，則其具有與本公開的抗體相同、或功能相同的表位特異性。

在一些實施方案中，本發明的抗體，可以使用例如下文所提供實施例中描述的方法製備。在一些實施方案中，還可通過使用Trioma技術，人B細胞雜交瘤技術(參見Kozbor等人，1983, Immunol Today 4:72)，以及EBV雜交瘤技術(參見Cole等人，1985, In: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc.，第77-96頁)等來製備產生。

抗體可以通過公知的技術純化，例如利用蛋白A或蛋白G進行親和層析，免疫親和色譜等。例如D. Wilkinson (The Scientist，由 The Scientist, Inc., Philadelphia Pa.出版，第14卷，第8期(2000)，第25-28 頁)討論了免疫球蛋白的純化。

本發明的單克隆抗OX40抗體具有調節、促進、啟動、啟動和或以其它方式使得OX40胞內信號被啟動的能力。在一些實施方案中，抗OX40抗體可以通過例如酵母表面展示方法來產生抗OX40抗體（如全人源抗體或人源化抗體），參考WO2009036379和WO2010105256專利。在該方法中，使用天然或重組OX40來源或其片段來篩選攜帶有隨機的輕鏈和重鏈對的酵母組合庫。

Fc修飾

本文所述抗體的有關效應子功能可以通過修飾，以提高例如抗體在治療與OX40信號傳導相關的疾病和障礙中的有效性。例如，因為在腫瘤浸潤的調節性T細胞（Treg）是遍在表達的，所以可將一個或多個突變引入到抗體的Fc區中，從而提高ADCC的功能，由此更有效殺死Treg。也例如，OX40的胞內信號的充分啟動，需要多個OX40受體的聚集，甚至需要其發生寡聚化，所以可將一個或多個突變引入到抗體的Fc區中，從而提高抗體本身的聚集能力或提高和Fc受體的結合能力來促進抗體的聚集，從而更充分啟動OX40的胞內信號。

在一些實施方案中，本文所述的抗體是IgG同種型。在一些實施方案中，抗體的恒定區為人IgG1同種型，具有SEQ ID NO:90和SEQ ID NO:91的胺基酸序列。在一些實施方案中，對人IgG1恒定區上的特定胺基酸進行修飾以修改抗體的糖基化，例如N297的去岩藻糖。在一些實施方案中，所述抗體或其抗原結合片段含有少量的岩藻糖修飾，或幾乎不含岩藻糖修飾，或不含岩藻糖修飾，ADCC效果明顯提高。在一些實施例中，所述抗體或其片段最多有一個（或者最多兩個，或三個）胺基酸殘基有岩藻糖修飾。在一些實施例中，包含所述抗體或其片段最多有不到0.01%、0.1%、1%、2%、3%、4%、或5%的蛋白分子被岩藻糖修飾。在一些實施方案中，減低或者去除岩藻糖修飾的抗體有更強的ADCC，適合於某些治療用途。在一些實施方案中，抗體或其抗原結合片段用經過改造的CHO細胞表達。在一些實施方案中，經過改造的CHO細胞為Slc35c1基因、fut8基因、GDP-甘露糖4,6-脫水酶（GMD）基因、GDP-4-酮-6-去氧甘露糖-3,5-表異構酶-4-還原酶（GMER）基因、GDP-岩藻糖轉運子（GFT）基因中的一個或多個被減少或剔除的CHO細胞。在一些實施方案中，經過改造的CHO細胞為fut8基因被剔除的CHO細胞。

在一些實施方案中，對抗體恒定區上的特定胺基酸進行修飾以改變Fc 受體相互作用，例如S267E/L328F的突變。

在一些實施方案中，抗體的恒定區為人IgG2同種型，具有SEQ ID NO: 92和93的胺基酸序列。其中SEQ ID NO: 92的胺基酸序列為：

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK；

其中SEQ ID NO: 93的胺基酸序列為：

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC。

在一些實施方案中，抗體的恒定區為人IgG4同種型，具有SEQ ID NO: 94和95的胺基酸序列。其中SEQ ID NO: 94的胺基酸序列為：

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK；

其中SEQ ID NO: 95的胺基酸序列為：

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC。

在一些實施方案中，對人IgG4恒定區內的鉸鏈區進行修飾以避免或減少鏈交換。在其他實施方式中，對人IgG4恒定區上的胺基酸235進行修飾以改變Fc受體相互作用。

針對抗OX40抗體或其抗原結合片段的使用

本文所述抗OX40抗體可以治療的疾病或病症包括血液癌症和/或實體瘤。血液癌症包括例如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。在一些實施方案中，白血病包括急性淋巴細胞性白血病(ALL)；急性骨髓性白血病(AML)；慢性淋巴細胞性白血病(CLL)；慢性骨髓性白血病 (CML)；骨髓性增生疾病/腫瘤(MPDS)。淋巴瘤包括霍奇金淋巴瘤、無痛性和侵襲性非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤和濾泡性淋巴瘤(小細胞和大細胞)。骨髓瘤包括多發性骨髓瘤(MM)、巨細胞骨髓瘤、重鏈骨髓瘤和輕鏈或本斯-瓊斯骨髓瘤。實體瘤包括例如乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、黑素瘤、結直腸癌、肺癌、頭頸癌、膀胱癌、食道癌、肝癌和腎癌。

本發明的抗體的治療有效量涉及達到治療目標所需的量。給藥所需的量取決於抗體對其特異抗原的結合親和力，疾病、紊亂或病症的嚴重程度、給藥途徑、在接受給藥的物件中給予的抗體從自由體積耗盡的速率等。在一些實施方案中，本發明的抗體或抗體片段的治療有效劑量的範圍為從約0.01mg/kg到約100mg/kg。在一些實施方案中，本發明的抗體或抗體片段的治療有效劑量的範圍為從約0.1mg/kg到約30mg/kg。劑量頻率範圍可以是例如每兩週一次或每三週一次。

在另一些實施方案中，針對OX40的抗體可用於本領域中已知的與OX40定位和/或定量相關的方法(例如，用於測定適當生理樣品中的OX40和/或OX40和OX40L兩者的水準， 用於診斷方法，用於蛋白成像等等)。

在一些實施方案中，將抗OX40抗體給予經診斷具有一種或多種前述疾病(包括但不限於癌症或其他腫瘤病症)相關臨床症狀的患者。診斷後，給予抗OX40抗體以減輕或反轉一種或多種前述疾病相關臨床症狀的效果。

在某些腫瘤樣品中觀察到OX40的過表達，並且具有OX40過表達的細胞的患者可能對使用本發明的抗OX40抗體的治療有響應。因此，本發明的抗體也可以用於診斷和預後。

在一些實施方案中，包含細胞的樣品可以從患者體內獲得，該患者可以是癌症患者或待診斷的患者。細胞是腫瘤組織或腫瘤塊、血液樣本、尿液樣本或來自患者的任何樣本的細胞。在選擇性地對樣品進行預處理之後，可以在允許抗體與可能存在於樣品中的OX40蛋白相互作用的條件下，將樣品與本發明的抗體一起孵育，利用抗OX40抗體來檢測樣品中OX40蛋白的存在。

本發明的抗體還用於檢測患者樣品中的OX40，並因此可用於診斷。例如，本發明的抗OX40抗體用於體外試驗(如ELISA)以檢測患者樣品中的OX40水準。

在一個實施方式中，本發明的抗OX40抗體固定在固體支持物(如微量滴定板的孔)上。固定的抗體作為捕捉抗體，捕捉測試樣品中可能存在的任何OX40。在使固定的抗體接觸患者樣品前，清洗固相載體並使用封閉試劑(如牛奶蛋白或白蛋白)處理以避免分析物的非特異性吸附。隨後使用可能含有抗原的測試樣品或使用含有標準量抗原的溶液處理所述孔。這類樣品是例如來自物件的血清樣品，其可能具有被認為可診斷某一病變的迴圈抗原水準。洗去測試樣品或標準品後，使用可檢測標記的二抗處理固相支援物。標記的二抗用作檢測抗體。測量可檢測標記的水準，通過與標準樣品所建立的標準曲線進行比較確定測試樣品中OX40的濃度。

基於使用本發明的抗OX40抗體在體外診斷試驗中獲得的結果，可以基於OX40和/或OX40L的表達水準對物件的疾病進行分級(例如與缺血、自身免疫性或炎性疾病相關的臨床症狀)。對於特定的疾病，從被診斷處於疾病發展的多個階段和/或處於疾病治療的多個點上的物件中提取血液樣品。使用對發展或療法的各階段提供統計顯著性結果的樣品群體，確定了被認為是各階段特徵的抗原濃度範圍。

在一些實施方案中，使用本文所述的抗OX40抗體或其抗原結合片段時，抗體或其片段以藥物組合物的形式存在。其中，藥物組合物可以由抗OX40抗體或其抗原結合片段與藥學上可接受的載體組成。如本文所用，術語「藥學上可接受的載體」旨在包括與藥物給藥相容的任何和所有溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延緩劑等。合適載體描述於最新版的Remington's Pharmaceutical Sciences中。此類載體或稀釋劑包括但不限於水、鹽水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和/或5％的人血清白蛋白。

藥物組合物的配製應與其預期的給藥途徑相容。給藥途徑的示例包括腸胃外，例如靜脈內、皮內、皮下、經口(例如吸入)、經皮(即局部的)、經粘膜和直腸給藥。用於腸胃外、皮內或皮下施用的溶液或懸浮液可包括以下組分：注射用無菌稀釋劑例如水、鹽溶液、固定油、聚乙二醇類、甘油、丙二醇或其它合成溶劑；抗細菌劑，例如苄醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，例如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，例如乙二胺四乙酸(EDTA)；緩衝劑，例如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽、以及調節滲透壓的試劑，例如氯化鈉或右旋糖。pH可用酸或堿進行調節，例如鹽酸或氫氧化鈉。可將腸胃外製劑包裝在安瓿、一次性注射器或玻璃或塑膠制多劑量小瓶內。

適於注射用途的藥物組合物包括無菌水性溶液(在此是水溶性的)或分散體以及用於即時製備無菌注射液或分散體的無菌粉末。對於靜脈內施用，合適的載體包括生理鹽水、抑菌水或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。在一些實施方案中，組合物須是無菌的並且易於注射的。其在製造和儲存條件下必須是穩定的並且必須能防止微生物例如細菌和真菌的污染作用。載體可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)的溶劑或分散介質，及其適宜的混合物。在一些實施方案中，藥學上可接受的載體可以包含抗細菌劑和/或抗真菌劑，如對羥基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等來實現。在一些實施方案中，藥學上可接受的載體可以包含等滲劑，如糖、多元醇(諸如甘露糖醇、山梨醇)、氯化鈉。

根據需要，可以通過將抗體以所需量摻入具有上文所列成分中的一種或多種組合(按需要)的合適溶劑中來製備無菌注射溶液，然後過濾消毒。也可以將前述的無菌溶液通過冷凍乾燥獲得粉末，用於在給藥時製備無菌注射溶液。

在一些實施方案中，本發明的抗體可以啟動免疫應答，從而用於治療感染。

感染是由致病因數侵入生物體組織、它們的繁殖以及宿主組織對這些生物體及它們產生的毒素的反應。感染可能由傳染原引起，例如病毒、類病毒、朊病毒、細菌、線蟲如寄生性蛔蟲和蟯蟲、節肢動物如蜱、蟎蟲、跳蚤和蝨子、真菌如癬以及其他大寄生物如絛蟲和其他蠕蟲。在某一方面，傳染原是細菌，如革蘭氏陰性細菌。在某一方面，傳染原是病毒，例如DNA病毒、RNA病毒和逆轉錄病毒。病毒的非限制性實例包括腺病毒、柯薩奇病毒、EB病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、單純皰疹病毒1型、單純皰疹病毒2型、巨細胞病毒、人皰疹病毒8型、HIV、流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人乳頭瘤病毒、副流感病毒、脊髓灰質炎病毒、狂犬病毒、呼吸道合胞病毒、風疹病毒、水痘-帶狀皰疹病毒。

本發明的抗體還可以用於治療由微生物引起的傳染病，或者通過靶向結合微生物和免疫細胞殺滅微生物以實現消除微生物的目的。在某一方面，微生物是包括RNA和DNA病毒的病毒、革蘭氏陽性細菌、革蘭氏陰性細菌、原生動物或真菌。

實施例1：OX40抗原以及對照抗體的生產和純化

1.1 人源OX40抗原的製備：

從蛋白資料庫Uniprot上，找到人OX40的胺基酸序列（P43489），其中人OX40的胞外區的胺基酸序列是1到216位殘基。從蛋白資料庫Uniprot上，找到人的IgG1-Fc的胺基酸序列（P01857）是104到330位殘基。然後通過人工合成（通用公司），得到OX40和Fc對應的核苷酸序列，通過酶切連接，把其插入到pCDNA3.0載體（購自Invitrogen公司）。得到重組質粒：pCDNA-OX40-his和pCDNA-OX40-Fc。再把上述質粒通過PEI瞬轉HEK293，在培養7天後收集上清液，最後通過純化得到hOX40-FC和hOX40-his蛋白樣品，用於下面各種實施例。

1.2 陽性對照抗體11D4和OX40mAb24的製備。

11D4的重鏈和輕鏈的序列來自美國專利US8236930。OX40mAb24的重鏈和輕鏈的序列來自美國專利US2016/0137740。通過人工合成得到上述對應的核苷酸序列，再通過酶切連接分別把重鏈的核苷酸和輕鏈的核苷酸連接到pCHO1.0質粒中（購自Invitrogen），得到用於表達全抗的重組質粒。根據製造商的說明書使用Freedom CHO-S試劑盒(購自Invitrogen)，把上述重組質粒轉入CHO-S細胞系，培養11天後，收集上清液，最後通過純化得到11D4和OX40mAb24抗體蛋白樣品，用於下面各種實施例。

實施例2：抗OX40抗體的製備

按照如表3所示第1-11號的各抗體的可變區，如SEQ ID NO: 90所示重鏈恒定區，如SEQ ID NO: 91所示輕鏈恒定區，通過分子克隆技術，把其對應核酸序列插入到pCHO1.0質粒中（購自Invitrogen），得到用於表達全抗的重組質粒。根據製造商的說明書使用Freedom CHO-S試劑盒(購自Invitrogen)，把上述重組質粒轉入CHO-S細胞系，培養11天後，收集上清液，最後通過純化得到十一株抗體的蛋白樣品，測序證實序列，用於下面各種實施例。

其中，重鏈恒定區的序列SEQ ID NO: 90如下：

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

輕鏈恒定區的序列SEQ ID NO: 91如下：

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

實施例3：抗人OX40抗體的結合能力鑒定

3.1 通過生物光干涉測量抗人OX40抗體的親和力

ForteBio親和力測定按照現有的常規方法(Estep, P等MAbs, 2013, 5(2):270-8)。粗略過程如下，感測器在分析緩衝液，如PBS，中線下平衡20分鐘，然後上機檢測60秒建立信號基線，上機載入如上所述獲得的經純化後的抗體至相應感測器(ForteBio)上，最後進行ForteBio親和力測量。用SA感測器吸附生物素化的候選抗體，再檢測hOX40-FC的結合與解離，各約5min，結果如表4；表4中，N.D表示未檢測出。最後都用1:1結合模型進行動力學的分析。結果表明，部分本發明的抗體的親和力優於或接近和對照抗體的親和力。

表4：通過生物光干涉測量本發明候選抗體和hOX40-FC的親和力（KD）

候選抗體 測定方法	SA吸附生物素化的抗體，檢測OX40-Fc（50nM，二價）
OX40mAb24	0.3nM
抗體-F10	N.D
抗體-X35-6L	＜0.1nM
抗體-F15-1L	3nM
抗體-F23-4k	0.6nM
抗體-F23-7k	2nM
抗體-F23-32k	0.4nM
抗體-A6-1k	4nM
抗體-M5-5k	2nM
抗體-M5-7k	0.4nM
抗體-FE-16H	3nM
抗體-A2	9nM

3.2 抗人OX40抗體的細胞表面抗原的結合能力

通過轉染帶有的人OX40  cDNA的pCMV載體產生過表達人OX40的Jurkat細胞(Jurkat-hOX40細胞)。將Jurkat-hOX40細胞(0.5 × 106個細胞)與100nM的實驗抗體在PBS含0.1％BSA中在冰上孵育40分鐘。然後將細胞洗滌兩次，並與二抗在PBS  0.1％BSA中在冰上孵育25分鐘。將細胞洗滌兩次，在Accuri  C6系統(BD  Biosciences)上進行流式細胞術分析，結果見圖1。

抗體-F23-4k和抗體-F23-32k，以及兩個對照抗體11D4和OX40mAb24，用不同濃度的抗體去孵育Jurkat-hOX40細胞。抗體濃度從50nM開始，按照3倍往下稀釋，共九個濃度點，統計MFI，並用SoftMax Pro處理資料，測得EC50值分別為1.5nM、1.0nM、1.5nM和5nM。

用抗-CD3/CD28  磁珠(購自Invitrogen)啟動來自健康人的PBMC細胞（購自雷德生物）48小時，並將0.5 x 106個細胞與50nM的實驗抗體，共孵育在PBS 中，孵育40分鐘。然後將細胞洗滌兩次，並與anti-FC-PE二抗(購自ebioscience)在PBS中在冰上孵育30分鐘。將細胞洗滌兩次並，通過流式細胞術進行分析，計算MFI。結果如表5所示。

表5：實驗抗體和被啟動的T細胞（人的PBMC）上OX40的結合

	結合百分比%	MFI（萬）
IgG1	23	0.7
OX40mAb24	81	6.0
抗體-F23-32K	79	5.8

實施例4：抗人OX40抗體的特異性

和3.2實例中的方法類似，把100nM實驗抗體和過表達不同抗原的Jurkat細胞（Jurkat-TIM3、Jurkat-CTLA4、Jurkat-TIGIT）、CHO以及raji孵育，然後用流式檢測，結果如圖2。結果表明，抗體-F23-32k和這些抗原或細胞株均沒有明顯結合，表明其特異性好。

用ELISA的方法，先包被10ng的小鼠的OX40-his（mOX40-his）、hCD27-FC以及hOX40-his，4℃過夜，洗滌後，再孵育抗體-F23-32K和對照抗體，最後通過HRP標記的二抗進行標記顯色。檢測所得的OD值如表6。和實例3.2的方法類似，按照protein A感測器---Antibody---OX40-his（100nM）程式設置，用Fortebio檢測抗體-F23-32K和對照抗體與恒河猴OX40（Rh-OX40）的親和力，結果如表6。以上結果表明，抗體-F23-32K不結合hCD27（hOX40的同家族蛋白），也不結合小鼠的OX40，但明顯結合恒河猴的OX40。

表6 抗體-F23-32k與hCD27、小鼠OX40、恒河猴OX40的結合情況

ELISA（OD值）	抗體-F23-32k	OX40mAb24
mOX40-his	0.17	0.20	0.17	0.19
hCD27-FC	0.15	0.13	0.20	0.20
hOX40-his	3.68	3.48	3.10	3.20
Fortibio（KD ）	抗體-F23-32k	OX40mAb24
Rh-OX40-his	9nM	3nM

實施例5：抗OX40抗體的生物活性檢測

5.1 用NFκB 報告基因系統檢測候選抗體的體外啟動活性。

在3.2實例中的Jurkat-hOX40的基礎上，把pGL6-NFkB-lufiferas-reporter質粒（購自碧雲天）電轉入細胞中，最後經過抗生素的加壓篩選，得到穩定的單克隆株，命名為Jurkat-hOX40-NFκB。復性細胞，繼代三次，然後按20x104細胞/孔進行鋪板，每孔60µl培養基，加入相應1μg/ml的實驗抗體和2.5μg/ml的anti-FC 抗體（羊抗人，購自invitrogen） ，孵育5小時，然後每孔添加螢光反應物50μl（ONE-Glo™ Luciferase Assay System，購自promega公司），結果如圖3。資料表明在1μg/ml濃度下實驗抗體的啟動信號都強於對照抗體。

按照之前描述的方法，重新構建一個視窗值更大的Jurkat-hOX40-NFκB-2細胞，用於抗體的啟動活性的驗證。有研究表明針對啟動性靶點受體的抗體，若想有力發揮啟動活性，是需要Fc-R的參與。和上述方法類似，復性Jurkat-hOX40-NFκB-2細胞，繼代三次，然後按4x104細胞/孔進行鋪板，每孔60μl培養基，加入相應的實驗抗體和4萬個raji細胞（其表面天然帶有一定Fc-受體（即Fc-R））每孔，孵育4.5小時，然後每孔添加螢光反應物50μl，結果如表7。資料表明，在raji細胞存在時，其能明顯提高候選抗體的啟動活性。

表7 用NFκB 報告基因系統檢測在raji細胞存在時候選抗體的體外啟動活性

	抗體-F23-32k	+raji	抗體-F23-32K + raji	OX40L
螢光素酶IFM	3700	1.6×104	1.5×105	5.9×104

和上述方法類似，復性Jurkat-hOX40-NFκB-2細胞，繼代三次，然後按4x104細胞/孔進行鋪板，每孔60μl培養基。先把實驗抗體和protein A/G 按1：1孵育2min，起始濃度為1.5μg/ml，然後按梯度稀釋，結果如圖4。抗體-F23-32k和11D4的EC50分別為0.1405μg/ml和0.2261μg/ml。

5.2 檢測抗體對被啟動的PBMC的IL-2的分泌的影響

通過測量T細胞活化後由T細胞釋放的炎性細胞因數評估本發明的抗OX40抗體的激動劑活性。取得PBMC後，按20萬個/孔鋪板，200μl培養基，鋪到96孔板，並加入80μg/ml的SEB活化PBMC，2天後，收集PBMC。洗滌後，按20萬個/孔鋪板，200μl培養基，再加入1μg/ml的候選抗體或對照抗體和2μg/ml的anti-FC 抗體（羊抗人，購自invitrogen）。3天後，通過ELISA 試劑盒檢測培養基中IL-2分泌水準，結果如圖5所示。和上述操作類似，先把1μg/ml的候選抗體或對照抗體4攝氏度過夜包板，洗板三次後，把啟動的PBMC進行鋪板，按20萬個/孔鋪板，200μl培養基。3天後，通過ELISA 試劑盒檢（購自欣博盛）測培養基中IL-2分泌水準，結果如圖5所示。資料表明本發明的抗體-F23-32k與陽性對照相當。

實施例6：Fc 突變對抗OX40抗體生物活性的增強

通過人工合成得到兩個IgG1-Fc突變序列，分別是RY（E345R和S440Y）和R(E345R)，各命名為IgG1-FC-RY（SEQ IN NO:88）和IgG1-FC-R（SEQ IN NO:89），序列如表8所示（底線表示突變位置）。對抗體-F23-32k進行RY或R突變，所得抗體分別命名為32k-RY和32k-R。而且，經過HPLC驗證，在游離狀態，主要以單體的形式存在。復性Jurkat-hOX40-NFκB-2和Jurkat-hOX40-NFκB細胞，分別用於以下實驗。和5.1實例的操作類似，細胞繼代三次，然後按4x104或20萬細胞/孔進行鋪板，加入相應的抗體（1μg/ml）、抗體突變體（1μg/ml）、raji細胞（1萬個細胞每孔）或protein A（1μg/ml，購自生物工程有限公司）。添加到96孔的樣品方案和組合，具體見圖6，結果也如圖6所示。含RY或R突變的抗體，在protein A 不存在是也能明顯啟動OX40的信號，而且比野生型的抗體強十倍左右。

表8 兩個IgG1-Fc突變序列

SEQ ID NO	序列
88	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPR R PQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK Y LSLSPGK
89	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPR R PQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

實施例7：通過人源化小鼠接種MC38腫瘤模型驗證anti-抗OX40抗體對腫瘤抑制的能力

在OX40人源化小鼠模型(購自百奧賽圖)中研究本發明的抗OX40抗體的抗腫瘤功效。將MC38腫瘤細胞以5×105個/0.1 mL濃度接種於B-hOX40人源化雌性小鼠的右側皮下，待腫瘤生長到119 mm3時按腫瘤體積隨機分組，每組6隻。抗體腹腔給藥，按Q3D（每3日1次）的頻率給藥，3mg/kg，共給藥6次，PBS作為陰性對照。

在整個研究期間每週測量兩次腫瘤和體重，當腫瘤達到端點時或當小鼠具有20％體重減輕時使小鼠安樂死。每組用數字卡尺估計平均腫瘤體積，並且通過下式計算腫瘤體積(mm 3 )：每組的(寬度)2×長度/2約為50mm 3。結果如圖7。圖7中，TGI%為相對腫瘤體積的抑制率，其計算公式為：TGI%=(1-(mean RTV給藥組)/(mean RTV對照組))×100%；mean RTV給藥組：給藥組RTV平均值，mean RTV對照組：對照組RTV平均值；RTVn=Vnt/Vn0；Vnt：編號為n的小鼠在第t天的腫瘤體積，Vn0：編號為n的小鼠在第0天的腫瘤體積，RTVn：編號為n的小鼠在第t天的腫瘤相對體積；抗體4K-RY的重鏈由抗體-F23-4k的FC突變所得（E345R和S440Y）。

為了進步瞭解實驗抗體給藥後，對腫瘤浸潤的T細胞（TIL）的影響。在上述實驗，結束後，選擇合適的小鼠，每組個4隻。通過常規的解剖手段，獲取腫瘤浸潤的淋巴T細胞，以及血液中的淋巴T細胞。進步用不同標記物對細胞進行螢光標記，最後用流式分選儀，進行螢光檢測。結果表明本發明的實驗抗體能增加腫瘤內部CD4+和CD8+T細胞比例。而對血液中的CD4+和CD8+T細胞比例，沒有影響。

實施例8：

1）候選抗體的親和力成熟以及親和力測定

表9顯示抗體-F23-32K的CDR的某些突變，其中，底線的胺基酸為突變位點。表10例舉含有這些胺基酸突變的8個全抗體的CDR，其餘序列與抗體-F23-32K同。用BIACORE測定它們的親和力，具體流程為先用探針結合抗體，再檢測20nM的OX40-his的結合和解離。結果如表11所示，其中抗體M的親和力提高了約70倍，達到0.16nM，比OX40mAb24的親和力高約21倍，比11D4的抗體高約9倍。如同前面所述的方法，用不同濃度的WEST+VGTD和ST+VGTD抗體，孵育過表達OX40的jurkat細胞，得到EC50值分別為1.2nM和1.3nM，結果如圖8所示。抗OX40抗體（抗體M）的序列如表12所示；其中，以上抗體（包括抗體M）採用的表達細胞為CHO-S細胞，抗體M-KF的製備方法為：抗體M-KF與抗體M的胺基酸序列是相同的，採用fut8基因被剔除的CHO細胞株表達（抗體M-KF的岩藻糖的含量約為0%）。

表9  抗體-F23-32K的突變位點示意圖

	VH-CDR2	VH-CDR3	VL-CDR2	VL-CDR3
抗體-F23-32K	VISYD GSNQYYADSVKG	DNQDS SPDVGIDY	AASSL QS	QQYNS YPL
劃線部位的胺基酸突變	WED、SED、AEV	T	VGL、VAL、VGS	TD、ND、DD、SD

表10  8個突變的抗OX40抗體的CDR序列

	VH CDR1	VH CDR2	VH CDR3	VL CDR1	VL CDR2	VL CDR3
抗體M	SYGMH	VIWEDGSNQYYADSVKG	DNQDTSPDVGIDY	RASQNISPFLN	AAVGLQS	QQYTDYPLT
T+VGL+TD	SYGMH	VISYDGSNQYYADSVKG	DNQDTSPDVGIDY	RASQNISPFLN	AAVGLQS	QQYTDYPLT
WEST+VL	SYGMH	VIWEDGSNQYYADSVKG	DNQDTSPDVGIDY	RASQNISPFLN	AASSLQS	QQYNSYPLT
VH+VGTD	SYGMH	VISYDGSNQYYADSVKG	DNQDSSPDVGIDY	RASQNISPFLN	AAVGLQS	QQYTDYPLT
WEST+VG	SYGMH	VIWEDGSNQ	DNQDTSPDVGIDY	RASQNISPFLN	AAVGLQS	QQYNSYPLT
WEST+TD	SYGMH	VIWEDGSNQYYADSVKG	DNQDTSPDVGIDY	RASQNISPFLN	AASSLQS	QQYTDYPLT
T+VG	SYGMH	VISYDGSNQYYADSVKG	DNQDTSPDVGIDY	RASQNISPFLN	AAVGLQS	QQYNSYPLT
T+TD	SYGMH	VISYDGSNQYYADSVKG	DNQDTSPDVGIDY	RASQNISPFLN	AASSLQS	QQYTDYPLT

表11  8個突變的抗OX40抗體的親和力

抗體	KD  (M)	Ka  (1/Ms)	Kd  (1/s)
11D4	1.31×10-09	353000	0.000461
OX40mAb24	3.45×10-09	408100	0.001410
抗體-F23-32K	1.15×10-08	841000	0.00965
抗體M	1.6×10-10	610000	0.0000977
T+VGL+TD	2.66×10-10	448000	0.000119
WEST+VL	1.93×10-09	371000	0.000714
VH+VGTD	5.65×10-10	431000	0.000243
WEST+VG	7.7×10-10	452000	0.000348
WEST+TD	6.53×10-10	491000	0.000321
T+VG	4.54×10-09	292000	0.00133
T+TD	5.01×10-09	278000	0.00139

表12 抗OX40抗體（抗體M）的序列

SEQ ID NO	名稱	序列
86	抗體M重鏈	QVQLVESGGGVVQPGESLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWEDGSNQYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDNQDTSPDVGIDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
87	抗體M輕鏈	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNISPFLNWYQQKPGKAPKLLIYAAVGLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYTDYPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

2）抗體的抗原結合特異性檢測

採用ELISA方法測定了抗體M-KF與人及食蟹猴的OX40的結合能力。試驗方法為：先4℃過夜包被人或食蟹猴的OX40，其濃度為2ug/ml，再孵育不同濃度的抗體M-KF進行檢測。抗體M-KF的起始濃度為1μg/ml或2μg/ml，並以2倍的梯度進行稀釋。

結果表明，抗體M-KF與人及食蟹猴的OX40能夠結合，結合的EC50值分別約為0.0340ng/ml和0.0352ng/ml。

實施例9：抗體的ADCC效應和體外啟動活性。

抗體M的岩藻糖含量約為96%。抗體M-KF的岩藻糖含量約為0%。在jurkat細胞上轉入FC-RIIIA和NF-AT報告基因，得到Jurkat-ADCC細胞。把Jurkat-hOX40細胞和jurkat-ADCC細胞按1:1混勻，再加入相應濃度梯度的抗體M和抗體M-KF，結果如圖9所示。如前面所述的方法（實施例5），用NFκB 報告基因系統檢測候選抗體的體外啟動活性。復性Jurkat-hOX40-NFκB-2細胞，繼代三次，然後按4x104個細胞/孔進行鋪板，每孔60μl培養基，加入相應的實驗抗體和4萬個raji細胞，結果如圖10所示。抗體M、抗體M-KF的EC50值稍好於11D4，但前兩者的啟動峰值約是後者的2.5倍。

實施例10：抗體的體外藥效實驗

如前面所述，在OX40人源化小鼠模型(購自百奧賽圖)中研究本發明的抗OX40抗體的抗腫瘤功效。將MC38腫瘤細胞以5×105個/0.1 mL濃度接種於B-hOX40人源化雌性小鼠的右側皮下，待腫瘤生長到119 mm3時按腫瘤體積隨機分組，每組6隻。通過表達純化得到一批無內毒抗體，抗體M和抗體M-KF，腹腔給藥，按Q3D的頻率，三個劑量組1mg/kg、0.2mg/kg、0.04mg/kg，共給藥6次。

在整個研究期間每週測量兩次腫瘤和體重，當腫瘤達到端點時或當小鼠具有20％體重減輕時使小鼠安樂死。每組用數字卡尺估計平均腫瘤體積，並且通過下式計算腫瘤體積(mm3 )：每組的(寬度)2×長度/2約為50mm3，結果如圖11；其中，第21天的結果如圖12所示。抗體M和抗體M-KF的高劑量組能明顯抑制腫瘤的生長(P＜0.05), 且效果明顯好於11D4的高劑量組。抗體M-KF的中劑量組也能明顯抑制腫瘤的生長(P＜0.05)。

實施例11：抗體的ADCC效應（PBMC法）

以Jurkat-hOX40細胞為靶細胞，以來源於健康人的PBMC為效應細胞。PBMC和Jurkat-OX40細胞以25:1的數量比例混合，並加入抗體M-KF或抗體M（起始濃度為1μg/ml，並以4倍的梯度進行稀釋），37℃下孵育4h，然後採用試劑盒CytoTox 96® Non-Radioactive Cytotoxicity Assay（Promega）測定相應的信號，通過此系統檢測抗體的ADCC介導的活細胞殺傷作用。

結果如圖13所示，抗體M-KF具有明顯的ADCC作用，EC50約為1.891ng/ml，比抗體M強2倍多。

實施例12：檢測抗體對被啟動的PBMC的IL-2的分泌的影響

採用ELISA的方法，通過檢測IL-2細胞因數的釋放，檢測抗體M-KF對外源刺激下的人外周血單個核細胞（PBMC）的啟動效應。先用SEB（金黃色葡萄球菌腸溶素B）的刺激PBMC 24h，再添加不同濃度的抗體M-KF或參照抗體11D4，繼續孵育3天，最後採Human IL-2 ELISA development kit (HRP)試劑盒（Mabtech，貨號為3445-1H-20），檢測PBMC所分泌的IL-2。

結果如圖14所示，抗體M-KF在0.32μg/ml或更高濃度下，刺激PBMC分泌IL-2的量約是陰性對照IgG1的4倍。

實施例13：檢測抗體對非啟動條件下PBMC細胞因數釋放的影響

採用ELISA的方法，通過檢測IL-2、INF-γ、IL-6、TNF-α細胞因數的釋放，檢測抗體M-KF對無外源刺激的人PBMC的啟動效應，以考察其安全性。抗體M-KF作用機理的最終目的是活化T細胞從而刺激免疫系統，增強免疫功能。從安全性角度考慮，這類型的抗體有可能會導致機體免疫系統過度活躍，從而引起細胞因數風暴。而IL-2、INF-γ、IL-6、TNF-α皆是細胞因數風暴發生時常見的大量產生的因數之一，選擇這幾個因數進行檢測。

把未經過啟動處理的人PBMC和不同濃度的抗體M-KF或CD28抗體共同孵育，抗體的起始濃度為200μg/ml，並按3倍梯度進行稀釋。最後用Mabtech公司相應的細胞因數檢測試劑盒，檢測PBMC所分泌的IL-2、INF-γ、IL-6、TNF-α。

如圖15所示，於陽性對照CD28抗體相比，抗體M-KF在200μg/mL及以下的濃度均不能使無外源刺激下的PBMC產生IL-2、INF-γ、IL-6、TNF-α，預計抗體M-KF具有一定的安全性。

本文引用的所有出版物和專利文獻都通過引用納入本文，就好像每個所述出版物或文獻都特定和單獨表示通過引用納入本文。對上述出版物和專利文獻的引用並不表示承認上述任何內容是相關的在先技術，也並不表示承認其內容或日期。現在，本發明已以書面說明書方式描述，本領域技術人員應認識到可以多種實施方式實踐本發明，而上文的說明書和實施例旨在說明而非限制本發明的權利要求。

無

圖1表示的是候選抗體和高表達OX40的Jurkatx細胞結合的流式圖驗證。X軸表示50nM的hOX40-FC結合的螢光強度。 圖2表示抗體-F23-32k不結合Jurkat-TIM3、Jurkat-CTLA4、Jurkat-TIGIT、CHO以及raji細胞。 圖3表示用NFκB報告基因系統檢測候選抗體的體外啟動活性。 圖4 表示用NFκB報告基因系統，利用protein A使得候選抗體發生聚集時，體外啟動活性；圖4中EC50值的單位是μg/ml。 圖5表示的是檢測經SEB活化後PBMC，在本發明抗體的刺激下，IL-2炎性因數的分泌水準。 圖6表示用NFκB報告基因系統檢測實驗抗體的Fc突變體32k-RY和32k-R的體外啟動活性，以及在protein A或raji存在時，其啟動活性的變化。 圖7表示候選抗體在體內對腫瘤（MC38）生長的抑制效果。 圖8 表示親和力成熟後的抗體和細胞表面的OX40的結合能力；圖8中EC50值的單位是nM。 圖9 表示候選抗體ADCC效應的檢測；圖9中EC50值的單位是μg/ml。 圖10 表示用NFκB報告基因系統，檢測在raji細胞存在時親和力成熟後的抗體的體外啟動活性。 圖11 表示親和力成熟後的抗體在體內對腫瘤（MC38）生長的抑制效果。 圖12 表示親和力成熟後的抗體在體內對腫瘤（MC38）生長的第21天的抑制效果。 圖13 表示抗體的ADCC效應的檢測；其中，橫坐標表示濃度，縱坐標表示細胞毒性。 圖14 表示抗體對被啟動的PBMC的IL-2的分泌的影響。 圖15 表示抗體對非啟動條件下PBMC細胞因數釋放的影響。

無

Claims (17)

1. 一種抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其片段特異性結合OX40，所述抗體或其片段包含（a）-（f）中一種或多種胺基酸序列： （a）如SEQ ID NO: 1、4、10、16、104或22所示的VH CDR1； （b）如SEQ ID NO: 2、5、7、8、11、13、14、17、20、23或26所示的VH CDR2； （c）如SEQ ID NO: 3、6、9、12、15、18、21、24或27所示的VH CDR3； （d）如SEQ ID NO: 28、31、37、40、43、46、49、52、55、58或61所示的VL CDR1； （e）如SEQ ID NO: 19、25、29、32、35、38、44、47、50、56、59或62所示的VL CDR2；以及 （f）如SEQ ID NO: 30、33、34、36、39、41、42、45、48、51、53、54、57、60或63所示的VL CDR3。
2. 如請求項1所述的抗體或其片段，所述抗體或其片段包含： 如SEQ ID NO: 10所示的VH CDR1； 如SEQ ID NO: 7、11、13或26所示的VH CDR2； 如SEQ ID NO: 12或27所示的VH CDR3； 如SEQ ID NO: 37、43或61所示的VL CDR1； 如SEQ ID NO: 19、25、38、44或62所示的VL CDR2；以及 如SEQ ID NO: 34、39、41、45、53或63所示的VL CDR3。
3. 如請求項1所述的抗體或其片段，所述抗體或其片段包含：如SEQ ID NO: 10所示的VH CDR1；如SEQ ID NO: 26所示的VH CDR2；如SEQ ID NO: 27所示的VH CDR3；如SEQ ID NO: 61所示的VL CDR1；如SEQ ID NO: 25所示的VL CDR2；以及如SEQ ID NO: 34所示的VL CDR3。
4. 一種抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其片段包含重鏈可變區，所述重鏈可變區包含如SEQ ID NO: 64-72所示的任一胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 64-72所示的任一胺基酸序列至少有90%序列同源性的肽；和/或 所述抗體或其片段還包含輕鏈可變區，所述輕鏈可變區包含如SEQ ID NO: 73-84所示的任一胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 73-84所示的任一胺基酸序列至少有90%序列同源性的肽。
5. 一種抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其片段包含如SEQ ID NO: 72所示重鏈可變區，和如SEQ ID NO: 84所示輕鏈可變區。
6. 如請求項4所述的抗體或其片段，所述抗體或其片段包含重鏈恒定區和/或輕鏈恒定區，所述重鏈恒定區為如SEQ ID NO: 88、89或90所示的重鏈恒定區，和/或所述輕鏈恒定區為如SEQ ID NO: 91所示的輕鏈恒定區。
7. 一種抗體，所述抗體包含如SEQ ID NO: 86所示的重鏈，以及如SEQ ID NO: 87所示的輕鏈。
8. 如請求項1-7任一項所述的抗體或其片段，所述抗體或其片段與OX40的親和力數值KD≤5nM。
9. 如請求項1-7任一項所述的抗體或其片段，所述抗體的岩藻糖的含量不超過10%。
10. 如請求項1-7任一項所述的抗體或其片段，所述抗體由fut8基因被剔除的CHO細胞表達。
11. 如請求項10所述的抗體或其片段，所述抗體的岩藻糖的含量為0%。
12. 一種多聚核苷酸，所述多聚核苷酸編碼如請求項1-7任一項所述的抗體或其片段。
13. 一種細胞，所述細胞包含編碼如請求項1-7任一項所述的抗體或其片段的一種或多種多聚核苷酸。
14. 一種組合物，所述組合物包含如請求項1-7任一項所述的抗體或其片段、如請求項12所述的多聚核苷酸或如請求項13所述的細胞，以及藥學上可接受的載體。
15. 一種在有需要的患者中治療癌症或感染的方法，所述方法包括向所述患者施用有效劑量的如請求項1-7任一項所述的抗體或其片段。
16. 如請求項15所述的方法，所述癌症選自非霍奇金淋巴瘤、急性淋巴細胞性白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴細胞性白血病、慢性骨髓性白血病、多發性骨髓瘤、乳腺癌、卵巢癌、頭頸癌、膀胱癌、黑素瘤、結直腸癌、胰腺癌、肺癌、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、膠質瘤、成膠質細胞瘤、前列腺癌、食道癌、肝癌和腎癌。
17. 如請求項15所述的方法，所述方法還包括向所述患者施用第二種癌症治療劑。

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