JP2023519584A - 免疫細胞活性化剤の開発及び応用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、抗OX40抗体及び免疫細胞活性化剤の開発及び応用を提供し、本発明の抗OX40抗体又はその断片は、ヒトOX40又はアカゲザルOX40に対する比較的強い結合を保持する。
Description
本発明は、生物免疫技術の分野に関し、特にOX40に特異的に結合する新規な抗体及び抗体断片に関する。
免疫系の検査ポイントには2種類があり、1つは、PD-1のような抑制性であり、もう1つは、OX40のような活性化性である。免疫系におけるT細胞の十分な活性化は、2段階のシグナルが必要である。第1のシグナルは、抗原を認識するT細胞抗原受容体によって産生され、CD3分子を介して活性化シグナルを細胞内に伝達し、第2のシグナルは、共刺激シグナルと呼ばれ、抗原提示細胞又はターゲット細胞表面の共刺激分子と活性化T細胞表面の共刺激分子受容体との相互作用によって産生される。共刺激シグナルは、抗原特異性T細胞の増殖及びエフェクターT細胞への分化を促進する。(Lindsay KらImmunity2016,44(5):1005-1019)。
OX40は、TNFRSF4、ACT35、CD134などと呼ばれる場合もあり、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー(TNFRSF)に属し、1つのI型膜貫通糖タンパク質でもある。OX40は、休止T細胞上に発現されず、活性化されたCD4+T細胞、CD8+T細胞、NK細胞とNKT細胞上に発現される(Paterson DJらMol.Immunol.1987;24:1281-1290)。T細胞は、抗原により活性化された後、1~3日内でOX40分子を高発現することができる。OX40シグナルの活性化は、更にT細胞の活性化シグナルを増強し、免疫系の反応を増強させる(GramagliaIら J.Immunol.2000;165:3043-3050)。
OX40Lは、TNFSF4、TXGP1、gp34とCD252と呼ばれる場合もあり、II型膜貫通糖タンパク質であり、OX40の天然リガンドであり、活性化された抗原提示細胞(APC)上、例えばDC細胞とB細胞上に三量体の形態で存在し、かつCD40、toll様の受容体(TLR)及び炎症性因子の媒介によって発現される。OX40Lは、また非造血細胞、例えば平滑筋と血管内皮細胞において広く存在している(Murata KらJ.Immunol.2002;169:4628-4636)。
OX40Lによって活性化されたOX40の細胞内シグナル経路は、T細胞内の複数のシグナル経路に関連する。分子内のジスルフィド結合によって形成された三量体OX40LがT細胞膜上のOX40と結合した後(Compaan DMら.Structure.2006;14:1321-30)、OX40の細胞内シグナル経路を最初に活性化することができる。OX40細胞内シグナルをさらに又は十分に活性化するためには、受容体の更なるオリゴ化が必要であり、六量体又はそれ以上を形成する(H Wajant.Cell Death and Differentiation(2015)22,1727-1741)。OX40が活性化された後、その細胞内領域を介してTNF receptor-associatedfactor(TRAF)2と5を募集することにより、NFκBシグナル経路を活性化し、抗アポトーシス効果を発揮し、細胞のアポトーシスを抑制する(Song Jら J.Immunol.2008;180:7240-8)。
なお、OX40の細胞内シグナル経路は、T細胞のTCR細胞内シグナル経路、主にPKB/PI3Kとカルシウムイオンに関連するNFATシグナル経路を特異的に補助する。前者は、活性化されたT細胞の生存と細胞周期の進行を促進することができる(Song JらNatImmunol.2004;5:150-8)。後者は、主に活性化されたT細胞の増殖及び該当するサイトカインの分泌を促進する(So TらProc Natl Acad Sci USA.2006;103:3740-5)。
ある研究者は、腫瘍に浸潤したCD4+Treg細胞(制御性T細胞)上に、OX40を高発現することもできることを見出した。Tregは、エフェクターT細胞(Teff)を抑制することができる。現在、Treg細胞の機能に対するOX40シグナル経路の調節作用について、統一的な明確な観点はない。OX40シグナル経路がTreg細胞の免疫抑制機能を抑制できることが幾つかの研究で示唆されている(Piconese SらJ.Exp.Med.2008;205:825-39;Voo KSらJ.Immunol.2013;191:3641-50)。OX40はTreg細胞に対してその免疫抑制機能を十分に発揮することが必要であることを見出した(Piconese SらEur.J.Immunol.2010;40:2902-13;Griseri TらJ.Exp.Med.2010;207:699-709)。OX40細胞内シグナル経路のTreg細胞の増殖とアポトーシスに対する影響は、細胞が所在する微小環境によって変化する。また、IFN-γとIL-4が存在しない場合やFoxP3が発現している場合、OX40の活性化は、Treg細胞の増殖を強力に促進できることも見出した(Ruby CEらJ.Immunol.2009;183:4853-7)。他の微小環境において、OX40の活性化は、Treg細胞の増殖に全く影響しないことが観察された(Vu MDらBlood.2007;110:2501-10)。
現在、抗OX40抗体は、主に以下の3つの細胞生理学的機序によって、免疫系のT細胞の活性化と腫瘍抑制の効果を達成すると考えられる。1つは、CD4+とCD8+のエフェクターT細胞を直接活性化することにより、それらの増殖と生存、及び関連する炎症性因子を分泌することを促進することである。2つは、Tregのシグナルと活性を抑制することによって、その免疫系に対する抑制効果を弱くすることである。3つは、ADCC又はADCPなどによって、Treg細胞を枯渇し、そのエフェクターT細胞に対する抑制を減少させることである(J.WilloughbyらMolecular Immunology83,2017,13-22)。
抗OX40抗体又はOX40のシグナル経路を利用して腫瘍を治療する概念は、すでに大量のマウス腫瘍モデルから有力な検証を得た。OX40が腫瘍免疫療法における非常に潜在力のある活性化標的であり、腫瘍免疫療法のために新たな手段を提供できることが従来の研究で強く示唆されている。
抗OX40抗体又はOX40のシグナル経路を利用して腫瘍を治療する概念は、すでに大量のマウス腫瘍モデルから有力な検証を得た。OX40が腫瘍免疫療法における非常に潜在力のある活性化標的であり、腫瘍免疫療法のために新たな手段を提供できることが従来の研究で強く示唆されている。
本発明は、OX40(特にヒトOX40(hOX40))を特異的に認識かつ結合することができる新規な抗体又はその断片を提供する。ここで、前記抗体又はその断片は、より高い親和性でhOX40に結合することができるとともに、OX40リガンド(OX40L)と競争することなく、T細胞をより効果的に活性化し、より強い免疫応答を産生し、抗腫瘍活性を高めることができる。
本発明は、抗体又はその抗原結合断片を開示し、前記抗体又はその断片は、OX40に特異的に結合し、前記抗体又はその断片は、
(a)SEQ ID NO:1、4、10、16、104又は22に示されるVH CDR1、
(b)SEQ ID NO:2、5、7、8、11、13、14、17、20、23又は26に示されるVH CDR2、
(c)SEQ ID NO:3、6、9、12、15、18、21、24又は27に示されるVH CDR3、
(d)SEQ ID NO:28、31、37、40、43、46、49、52、55、58又は61に示されるVL CDR1、
(e)SEQ ID NO:19、25、29、32、35、38、44、47、50、56、59又は62に示されるVL CDR2、
(f)SEQ ID NO:30、33、34、36、39、41、42、45、48、51、53、54、57、60又は63に示されるVL CDR3のうちの1種又は複数種のアミノ酸配列を含む。
(a)SEQ ID NO:1、4、10、16、104又は22に示されるVH CDR1、
(b)SEQ ID NO:2、5、7、8、11、13、14、17、20、23又は26に示されるVH CDR2、
(c)SEQ ID NO:3、6、9、12、15、18、21、24又は27に示されるVH CDR3、
(d)SEQ ID NO:28、31、37、40、43、46、49、52、55、58又は61に示されるVL CDR1、
(e)SEQ ID NO:19、25、29、32、35、38、44、47、50、56、59又は62に示されるVL CDR2、
(f)SEQ ID NO:30、33、34、36、39、41、42、45、48、51、53、54、57、60又は63に示されるVL CDR3のうちの1種又は複数種のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、SEQ ID NO:1、4、10、16、104又は22に示されるVH CDR1を含む。いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、SEQ ID NO:2、5、7、8、11、13、14、17、20、23又は26に示されるVH CDR2を含む。いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、SEQ ID NO:3、6、9、12、15、18、21、24又は27に示されるVH CDR3を含む。いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、SEQ ID NO:28、31、37、40、43、46、49、52、55、58又は61に示されるVL CDR1を含む。いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、SEQ ID NO:19、25、29、32、35、38、44、47、50、56、59又は62に示されるVL CDR2を含む。いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、SEQ ID NO:30、33、34、36、39、41、42、45、48、51、53、54、57、60又は63に示されるVL CDR3を含む。
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、SEQ ID NO:10に示されるVH CDR1を含む。いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、SEQ ID NO:7、11、13又は26に示されるVH CDR2を含む。いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、SEQ ID NO:12又は27に示されるVH CDR3を含む。いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、SEQ ID NO:37、43又は61に示されるVL CDR1を含む。いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、SEQ ID NO:19、25、38、44又は62に示されるVL CDR2を含む。いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、SEQ ID NO:34、39、41、45、53又は63に示されるVL CDR3を含む。
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、SEQ ID NO:1、4、10、16、104又は22に示されるVH CDR1、SEQ ID NO:2、5、7、8、11、13、14、17、20、23又は26に示されるVH CDR2、及びSEQ ID NO:3、6、9、12、15、18、21、24又は27に示されるVH CDR3を含む。いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、SEQ ID NO:28、31、37、40、43、46、49、52、55、58又は61に示されるVL CDR1、SEQ ID NO:19、25、29、32、35、38、44、47、50、56、59又は62に示されるVL CDR2、及びSEQ ID NO:30、33、34、36、39、41、42、45、48、51、53、54、57、60又は63に示されるVL CDR3を含む。
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、SEQ ID NO:1、4、10、16、104又は22に示されるVH CDR1、SEQ ID NO:2、5、7、8、11、13、14、17、20、23又は26に示されるVH CDR2、SEQ ID NO:3、6、9、12、15、18、21、24又は27に示されるVH CDR3、SEQ ID NO:28、31、37、40、43、46、49、52、55、58又は61に示されるVL CDR1、SEQ ID NO:19、25、29、32、35、38、44、47、50、56、59又は62に示されるVL CDR2、及びSEQ ID NO:30、33、34、36、39、41、42、45、48、51、53、54、57、60又は63に示されるVL CDR3を含む。
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、SEQ ID NO:10に示されるVH CDR1、SEQ ID NO:7、11、13又は26に示されるVH CDR2、SEQ ID NO:12又は27に示されるVH CDR3、SEQ ID NO:37、43又は61に示されるVL CDR1、SEQ ID NO:19、25、38、44又は62に示されるVL CDR2、及びSEQ ID NO:34、39、41、45、53又は63に示されるVL CDR3を含む。
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、SEQ ID NO:1に示されるVH CDR1、SEQ ID NO:2に示されるVH CDR2、SEQ ID NO:3に示されるVH CDR3、SEQ ID NO:28に示されるVL CDR1、SEQ ID NO:29に示されるVL CDR2、及びSEQ ID NO:30に示されるVL CDR3を含む。
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、SEQ ID NO:4に示されるVH CDR1、SEQ ID NO:5に示されるVH CDR2、SEQ ID NO:6に示されるVH CDR3、SEQ ID NO:31に示されるVL CDR1、SEQ ID NO:32に示されるVL CDR2、及びSEQ ID NO:33に示されるVL CDR3を含む。
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、SEQ ID NO:1に示されるVH CDR1、SEQ ID NO:8に示されるVH CDR2、SEQ ID NO:9に示されるVH CDR3、SEQ ID NO:31に示されるVL CDR1、SEQ ID NO:35に示されるVL CDR2、及びSEQ ID NO:36に示されるVL CDR3を含む。
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、SEQ ID NO:10に示されるVH CDR1、SEQ ID NO:11に示されるVH CDR2、SEQ ID NO:12に示されるVH CDR3、SEQ ID NO:37に示されるVL CDR1、SEQ ID NO:38に示されるVL CDR2、及びSEQ ID NO:39に示されるVL CDR3を含む。
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、SEQ ID NO:10に示されるVH CDR1、SEQ ID NO:11に示されるVH CDR2、SEQ ID NO:12に示されるVH CDR3、SEQ ID NO:40に示されるVL CDR1、SEQ ID NO:29に示されるVL CDR2、及びSEQ ID NO:42に示されるVL CDR3を含む。
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、SEQ ID NO:10に示されるVH CDR1、SEQ ID NO:11に示されるVH CDR2、SEQ ID NO:12に示されるVH CDR3、SEQ ID NO:43に示されるVL CDR1、SEQ ID NO:44に示されるVL CDR2、及びSEQ ID NO:39に示されるVL CDR3を含む。
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、SEQ ID NO:10に示されるVH CDR1、SEQ ID NO:26に示されるVH CDR2、SEQ ID NO:27に示されるVH CDR3、SEQ ID NO:61に示されるVL CDR1、SEQ ID NO:25に示されるVL CDR2、及びSEQ ID NO:34に示されるVL CDR3を含む。
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、SEQ ID NO:10に示されるVH CDR1、SEQ ID NO:14に示されるVH CDR2、SEQ ID NO:15に示されるVH CDR3、SEQ ID NO:46に示されるVL CDR1、SEQ ID NO:47に示されるVL CDR2、及びSEQ ID NO:48に示されるVL CDR3を含む。
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、SEQ ID NO:16に示されるVH CDR1、SEQ ID NO:17に示されるVH CDR2、SEQ ID NO:18に示されるVH CDR3、SEQ ID NO:49に示されるVL CDR1、SEQ ID NO:50に示されるVL CDR2、及びSEQ ID NO:51に示されるVL CDR3を含む。
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、SEQ ID NO:16に示されるVH CDR1、SEQ ID NO:17に示されるVH CDR2、SEQ ID NO:18に示されるVH CDR3、SEQ ID NO:52に示されるVL CDR1、SEQ ID NO:29に示されるVL CDR2、及びSEQ ID NO:54に示されるVL CDR3を含む。
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、SEQ ID NO:1に示されるVH CDR1、SEQ ID NO:20に示されるVH CDR2、SEQ ID NO:21に示されるVH CDR3、SEQ ID NO:55に示されるVL CDR1、SEQ ID NO:56に示されるVL CDR2、及びSEQ ID NO:57に示されるVL CDR3を含む。
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、SEQ ID NO:22に示されるVH CDR1、SEQ ID NO:23に示されるVH CDR2、SEQ ID NO:24に示されるVH CDR3、SEQ ID NO:58に示されるVL CDR1、SEQ ID NO:59に示されるVL CDR2、及びSEQ ID NO:60に示されるVL CDR3を含む。
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、SEQ ID NO:10に示されるVH CDR1、SEQ ID NO:26に示されるVH CDR2、SEQ ID NO:27に示されるVH CDR3、SEQ ID NO:61に示されるVL CDR1、SEQ ID NO:62に示されるVL CDR2、及びSEQ ID NO:63に示されるVL CDR3を含む。
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、SEQ ID NO:10に示されるVH CDR1、SEQ ID NO:11に示されるVH CDR2、SEQ ID NO:27に示されるVH CDR3、SEQ ID NO:61に示されるVL CDR1、SEQ ID NO:62に示されるVL CDR2、及びSEQ ID NO:34に示されるVL CDR3を含む。
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、SEQ ID NO:10に示されるVH CDR1、SEQ ID NO:26に示されるVH CDR2、SEQ ID NO:27に示されるVH CDR3、SEQ ID NO:61に示されるVL CDR1、SEQ ID NO:44に示されるVL CDR2、及びSEQ ID NO:39に示されるVL CDR3を含む。
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、SEQ ID NO:10に示されるVH CDR1、SEQ ID NO:11に示されるVH CDR2、SEQ ID NO:12に示されるVH CDR3、SEQ ID NO:61に示されるVL CDR1、SEQ ID NO:25に示されるVL CDR2、及びSEQ ID NO:34に示されるVL CDR3を含む。
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、SEQ ID NO:10に示されるVH CDR1、SEQ ID NO:26に示されるVH CDR2、SEQ ID NO:27に示されるVH CDR3、SEQ ID NO:61に示されるVL CDR1、SEQ ID NO:25に示されるVL CDR2、及びSEQ ID NO:39に示されるVL CDR3を含む。
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、SEQ ID NO:10に示されるVH CDR1、SEQ ID NO:26に示されるVH CDR2、SEQ ID NO:27に示されるVH CDR3、SEQ ID NO:61に示されるVL CDR1、SEQ ID NO:44に示されるVL CDR2、及びSEQ ID NO:34に示されるVL CDR3を含む。
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、SEQ ID NO:10に示されるVH CDR1、SEQ ID NO:11に示されるVH CDR2、SEQ ID NO:27に示されるVH CDR3、SEQ ID NO:61に示されるVL CDR1、SEQ ID NO:25に示されるVL CDR2、及びSEQ ID NO:39に示されるVL CDR3を含む。
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、SEQ ID NO:10に示されるVH CDR1、SEQ ID NO:11に示されるVH CDR2、SEQ ID NO:27に示されるVH CDR3、SEQ ID NO:61に示されるVL CDR1、SEQ ID NO:44に示されるVL CDR2、及びSEQ ID NO:34に示されるVL CDR3を含む。
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、重鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、SEQ ID NO:64、65、66、67、68、69、70、71又は72に示されるアミノ酸配列、又はSEQ ID NO:64、65、66、67、68、69、70、71又は72に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、重鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、SEQ ID NO:67又は72に示されるアミノ酸配列、又はSEQ ID NO:67又は72に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、軽鎖可変領域をさらに含み、前記軽鎖可変領域は、SEQ ID NO:73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83又は84に示されるアミノ酸配列、又はSEQ ID NO:73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83又は84に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、軽鎖可変領域をさらに含み、前記軽鎖可変領域は、SEQ ID NO:76、78又は84に示されるアミノ酸配列、又はSEQ ID NO:76、78又は84に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、SEQ ID NO:72に示される重鎖可変領域と、SEQ ID NO:84に示される軽鎖可変領域とを含む。
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、IgG、IgM、IgA、IgE又はIgDのうちの1つのアイソタイプである。
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、IgG、IgM、IgA、IgE又はIgDのうちの1つのアイソタイプである。
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、IgGアイソタイプであり、いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、IgG1アイソタイプ、IgG2アイソタイプ、IgG3アイソタイプ又はIgG4アイソタイプである。限定的でなく、抗体又はその断片は、キメラ抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト化抗体である。ある態様では、抗体又はその断片は、ヒト化抗体である。
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、重鎖定常領域、軽鎖定常領域、Fc領域又はその結合をさらに含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載された抗体は、IgGアイソタイプである。いくつかの実施形態では、抗体の定常領域は、ヒトIgG1アイソタイプであり、SEQ ID NO:90に示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、SEQ ID NO:91に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域とを有する。
いくつかの実施形態では、抗体の定常領域は、ヒトIgG2アイソタイプであり、SEQ ID NO:92に示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、SEQ ID NO:93に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域とを有する。
いくつかの実施形態では、抗体の定常領域は、ヒトIgG2アイソタイプであり、SEQ ID NO:92に示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、SEQ ID NO:93に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域とを有する。
いくつかの実施形態では、抗体の定常領域は、ヒトIgG4アイソタイプであり、SEQ ID NO:94に示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、SEQ ID NO:95に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域とを有する。
いくつかの実施形態では、前記Fc領域は、ヒト抗体のFc領域である。いくつかの実施形態では、前記ヒトFc領域重鎖の345位(Eu番号)のアミノ酸は、R(E345R)である。いくつかの実施例では、前記ヒトFc領域重鎖の440位(Eu番号)のアミノ酸は、Y(S440Y)である。いくつかの実施例では、前記ヒトFc領域は、SEQ ID NO:88又はSEQ ID NO:89に示されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、前記重鎖定常領域は、SEQ ID NO:88、89又は90に示されるアミノ酸配列を含み、及び/又は前記軽鎖定常領域は、SEQ ID NO:91に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記重鎖定常領域は、SEQ ID NO:90に示されるアミノ酸配列を含み、及び/又は前記軽鎖定常領域は、SEQ ID NO:91に示されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、キメラ抗体又はその断片、又はヒト化抗体又はその断片、又は完全ヒト化抗体又はその断片である。
いくつかの実施形態では、前記抗体は、重鎖と、軽鎖とを含み、前記重鎖は、SEQ ID NO:86に示されるアミノ酸配列、又はSEQ ID NO:86に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖は、SEQ ID NO:87に示されるアミノ酸配列、又はSEQ ID NO:87に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、前記抗体は、SEQ ID NO:86に示される重鎖及びSEQ ID NO:87に示される軽鎖を含む。
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、ヒトOX40又はアカゲザルOX40を特異的に認識かつ結合することができる。
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、OX40の活性を活性化、増強又は誘導する。
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、T細胞を活性化することができる。
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその抗原結合断片は、活性化されたT細胞の更なる活性化を促進し、より多くの炎症性因子を分泌する。
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその抗原結合断片は、前記OX40の細胞内シグナル経路を活性化することができる。
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片のOX40に対する親和性数値KD≦5nMである。いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片のOX40に対する親和性数値KD≦3.5nMである。いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片のOX40に対する親和性数値KD≦2nMである。いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片のOX40に対する親和性数値KD≦1nMである。いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片のOX40に対する親和性数値KD≦0.2nMである。
いくつかの実施形態では、前記抗体又は断片は、モノクローナル抗体又は断片である。
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、CHO細胞において発現される。
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、ゲノムが編集されたCHO細胞において発現され、前記CHO細胞は、フコース含有量が低いか又はフコースを含まない抗体又はその断片を発現する。いくつかの実施形態では、前記ゲノムが編集されたCHO細胞は、α-1,6-フコシルトランスフェラーゼ遺伝子(fut8遺伝子)、GDP-マンノース4,6-デヒドラターゼ(GMD)遺伝子、GDP-4-ケト-6-デオキシマンノース-3,5-エピメラーゼ-4-レダクターゼ(GMER)遺伝子、GDP-フコーストランスポーター(GFT)遺伝子(例えばSlc35c1遺伝子)のうちの1つ又は複数が減少又はノックアウトされたCHO細胞である。いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、fut8遺伝子をノックアウトしたCHO細胞において発現される。
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、ゲノムが編集されたCHO細胞において発現され、前記CHO細胞は、フコース含有量が低いか又はフコースを含まない抗体又はその断片を発現する。いくつかの実施形態では、前記ゲノムが編集されたCHO細胞は、α-1,6-フコシルトランスフェラーゼ遺伝子(fut8遺伝子)、GDP-マンノース4,6-デヒドラターゼ(GMD)遺伝子、GDP-4-ケト-6-デオキシマンノース-3,5-エピメラーゼ-4-レダクターゼ(GMER)遺伝子、GDP-フコーストランスポーター(GFT)遺伝子(例えばSlc35c1遺伝子)のうちの1つ又は複数が減少又はノックアウトされたCHO細胞である。いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、fut8遺伝子をノックアウトしたCHO細胞において発現される。
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片のうちの1つ、2つ又は3つのアミノ酸残基は、フコース修飾される。
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片において、フコース含有量は、10%を超えない。いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片において、フコース含有量は、5%を超えない。いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片において、フコース含有量は、1%を超えない。いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片において、フコース含有量は、0.5%を超えない。いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、フコースに結合していない。
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、単離された抗体又はその抗原結合断片である。
いくつかの実施形態では、本発明は、ポリヌクレオチドをさらに提供し、前記ポリヌクレオチドは、前記抗体又はその断片をコードする。いくつかの実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、単離されたポリヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:96~101に示される1種又は複数種のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:96、97と98に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:99、100と101に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:102に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:103に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:102に示されるヌクレオチド配列、及び/又はSEQ ID NO:103に示されるヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、前記抗体又はその断片をコードする1種又は複数種のポリヌクレオチドを含む担体をさらに提供する。いくつかの実施形態では、前記担体は、単離された担体である。いくつかの実施形態では、前記担体は、プラスミド又はウイルスを含む発現ベクターである。
いくつかの実施形態では、本発明は、前記抗体又はその断片をコードする1種又は複数種のポリヌクレオチドを含む細胞をさらに提供する。いくつかの実施形態では、前記細胞は、単離された細胞である。いくつかの実施形態では、前記細胞は、CHO細胞である。いくつかの実施形態では、前記細胞は、前記担体を含む。いくつかの実施形態では、前記細胞のうちの1種又は複数種のゲノムが編集され、さらに前記CHO細胞は、フコース含有量が低い又はフコースを含まない抗体又はその断片を発現する。いくつかの実施形態では、前記ゲノムが編集されたCHO細胞は、Slc35c1遺伝子、fut8遺伝子、GDP-マンノース4,6-デヒドラターゼ(GMD)遺伝子、GDP-4-ケト-6-デオキシマンノース-3,5-エピメラーゼ-4-レダクターゼ(GMER)遺伝子、GDP-フコーストランスポーター(GFT)遺伝子のうちの1つ又は複数が減少又はノックアウトされたCHO細胞である。
いくつかの実施形態では、本発明は、前記抗体又はその断片、前記ポリヌクレオチド又は上記細胞、及び薬学的に許容しうる担体を含む組成物をさらに提供する。
いくつかの実施形態では、本発明は、前記患者に有効量の前記抗体又はその断片を投与することを含む、必要とされる患者においてがん又は感染を治療する方法をさらに提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、がん又は感染の治療における本明細書に記載された抗体又はその断片の使用をさらに提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、がん又は感染を治療するための薬物の調製における本明細書に記載された抗体又はその断片の使用をさらに提供する。
いくつかの実施形態では、前記がんは、固形がんである。
いくつかの実施形態では、前記がんは、非ホジキンリンパ腫(NHL)、急性リンパ性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性リンパ性白血病(CLL)、慢性骨髄性白血病(CML)、多発性骨髄腫(MM)、乳がん、卵巣がん、頭頸部がん、膀胱がん、黒色腫、結腸直腸がん、膵臓がん、肺がん、平滑筋腫、平滑筋肉腫、神経膠腫、神経膠芽腫などから選択される。固形がんは、例えば乳がん、卵巣がん、肺がん、前立腺がん、黒色腫、結腸直腸がん、頭頸部がん、膀胱がん、食道がん、肝臓がんと腎臓がんを含む。
いくつかの実施形態では、前記方法は、前記患者に第2のがん治療剤を投与することをさらに含む。
いくつかの実施形態では、前記感染は、ウイルス感染、細菌感染、真菌感染又は寄生虫感染である。
いくつかの実施形態では、本発明は、(a)体外で、本明細書に記載された抗体又はその断片を用いて細胞を処理するステップと、(b)処理後の細胞を患者体内に投与するステップとを含む必要とされる患者においてがん又は感染を治療する方法をさらに提供する。いくつかの実施形態では、前記方法は、ステップ(a)の前に、個体から前記細胞を単離することをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記細胞は、前記患者体内から単離されたものである。いくつかの実施形態では、前記細胞は、前記患者とは異なるドナー個体から単離されたものである。
いくつかの実施形態では、前記細胞は、T細胞である。いくつかの実施形態では、前記T細胞は、腫瘍浸潤性Tリンパ球、CD4+T細胞、CD8+T細胞又はその組み合わせである。
いくつかの実施形態では、本発明は、検体を本明細書に記載された抗体又はその断片抗体と接触させ、前記抗体又はその断片をOX40に結合し、検体中のOX40の発現量を反映する前記結合を検出する検体中のOX40発現を検出する方法をさらに提供する。いくつかの実施形態では、前記検体は、腫瘍細胞、腫瘍組織、感染組織又は血液検体を含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、前記患者に有効量の前記抗体又はその断片を投与することを含むことを特徴とする必要とされる患者において免疫機能を増強する必要がある疾病を治療する方法をさらに提供する。
本発明は、ヒトOX40又はアカゲザルOX40に結合する抗体又はその断片を提供し、ここで、本発明の抗OX40抗体又はその断片は、ヒトOX40又はアカゲザルOX40に対して比較的強い結合を保持する。
(定義)
特に定義されない限り、本明細書で使用される科学的および技術的用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。一般的には、本明細書に記載された細胞培養、分子生物学及びタンパク質精製で使用される命名と技術は、当該分野では既知で、一般的に使用されるものである。組換えDNA、オリゴヌクレオチド合成と細胞培養及び形質転換(例えば電気穿孔、リポフェクション)について、標準技術を用いた。酵素反応と精製技術は、製造業者の説明書又は当該分野で一般的に使用されるか、又は本明細書に記載された方法に従って行われる。上述した技術と方法は、一般的には、当該分野で既知であり、かつ本明細書で参照及び説明される複数の総合と比較的具体的な文献に記載されるように使用される。Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual(『分子クローニング:実験マニュアル』)(第2版、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版社、ニューヨークコールドスプリング(1989))を参照されたい。
特に定義されない限り、本明細書で使用される科学的および技術的用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。一般的には、本明細書に記載された細胞培養、分子生物学及びタンパク質精製で使用される命名と技術は、当該分野では既知で、一般的に使用されるものである。組換えDNA、オリゴヌクレオチド合成と細胞培養及び形質転換(例えば電気穿孔、リポフェクション)について、標準技術を用いた。酵素反応と精製技術は、製造業者の説明書又は当該分野で一般的に使用されるか、又は本明細書に記載された方法に従って行われる。上述した技術と方法は、一般的には、当該分野で既知であり、かつ本明細書で参照及び説明される複数の総合と比較的具体的な文献に記載されるように使用される。Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual(『分子クローニング:実験マニュアル』)(第2版、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版社、ニューヨークコールドスプリング(1989))を参照されたい。
本発明では、「ポリペプチド」という用語は、単数の「ポリペプチド」及び複数の「ポリペプチド」を包含することを意図しており、また、アミド結合(ペプチド結合と呼ばれる場合もある)によって線形的に結合したモノマー(アミノ酸)からなる分子を意味する。「ポリペプチド」という用語は、2つ以上のアミノ酸の任意の単鎖又は複数の鎖を意味し、また、生成物の特定の長さに関与しない。そのため、「ポリペプチド」の定義には、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」又は2つ以上のアミノ酸鎖を意味するための任意の他の用語が含まれており、また、「ポリペプチド」という用語は、上記任意の1つの用語の代わりに使用されてもよく、又は上記任意の1つの用語と交互に使用されてもよい。「ポリペプチド」という用語は、ポリペプチドの発現後に修飾された生成物を意味することも意図され、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護/閉鎖基による誘導体化、タンパク質加水分解切断又は非天然発生のアミノ酸修飾を含むが、これらに限らない。ポリペプチドは、天然生物から由来するか、又は組換え技術によって産生されてもよいが、必ずしも指定された核酸配列から翻訳して得られるとは限らない。それは化学合成などを含む任意の方式で産生されてもよい。
「アミノ酸」とは、アミノ基とカルボキシル基の2つの官能基を含有する化合物、例えばα-アミノ酸を意味する。2つ以上のアミノ酸は、アミド結合(ペプチド結合と呼ばれる場合もある)によってポリペプチドを構成することができる。単一のアミノ酸は、3つのヌクレオチド(いわゆるコドン又は塩基トリプレット)からなる核酸によってコードされる。各々のアミノ酸は、少なくとも1つのコドンによってコードされる。同じアミノ酸を異なるコドンによってコードすることは、「遺伝子コードの縮重性」と呼ばれる。アミノ酸は、天然アミノ酸と非天然アミノ酸とを含む。天然アミノ酸は、アラニン(3文字表記:Ala、1文字表記:A)、アルギニン(Arg、R)、アスパラギン(Asn、N)、アスパラギン酸(Asp、D)、システイン(Cys、C)、グルタミン(Gln、Q)、グルタミン酸(Glu、E)、グリシン(Gly、G)、ヒスチジン(His、H)、イソロイシン(Ile、I)、ロイシン(Leu、L)、リジン(Lys、K)、メチオニン(Met、M)、フェニルアラニン(Phe、F)、プロリン(Pro、P)、セリン(Ser、S)、スレオニン(Thr、T)、トリプトファン(Trp、W)、チロシン(Tyr、Y)とバリン(Val、V)を含む。
本発明において細胞、核酸、ポリペプチド、抗体などに関して使用される用語「単離された」、例えば「単離された」DNA又はRNAは、天然由来における他の成分、例えば天然DNA又はRNAからそれぞれ単離された分子を意味する。本発明で使用される用語「単離された」はまた、組換えDNA技術によって産生される場合に細胞材料、ウイルス材料又は細胞培地の核酸又はポリペプチド、又は化学合成場合の化学前駆体又は他の化学物質を基本的に含まないことを意味する。なお、「単離された核酸」は、天然状態で存在しない核酸断片を含むことが意図される。本発明では、用語「単離された」は、他の細胞タンパク質又は組織から単離された細胞又はポリペプチドを意味するためにも用いられる。単離されたポリペプチドは、精製された及び組換えられたポリペプチドを含むことが意図される。単離されたポリペプチド、抗体などは、一般的には、少なくとも1つの精製ステップによって調製される。いくつかの実施形態では、単離された核酸、ポリペプチド、抗体などの純度は、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、又は95%である。
本発明では、用語「組換え」は、ポリペプチド又はポリヌクレオチドに関し、天然で存在しないポリペプチド又はポリヌクレオチドの形態を意味し、組み合わせによって通常存在しないポリヌクレオチド又はポリペプチドを産生することができる。
「相同性」又は「同一性」又は「類似性」は、2つのポリペプチドの間又は2つの核酸分子の間の配列類似性を意味する。相同性は、各配列におけるアライメント可能な位置を比較することによって決定される。比較された配列における位置が同じ塩基又はアミノ酸で占められている場合、分子は、この位置上で相同である。配列間の相同性の程度は、配列の共有するマッチング位置又は相同位置の数からなる関数である。
ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド領域(又はポリペプチド又はポリペプチド領域)が、別の配列と一定百分率(例えば、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%又は99%)の「配列同一性」又は「配列相同性」を有することは、配列のアラインメントの時、比較される2つの配列において、この百分率の塩基(又はアミノ酸)が同じであることを意味する。当該分野で既知のソフトウェアプログラム、例えばAusubel et al. eds.(2007)のCurrent Protocols in Molecular Biologyに記載されているソフトウェアプログラムを用いて、当該アラインメントと相同性の百分率又は配列同一性を決定することができる。いくつかの実施形態では、デフォルトパラメータを用いてアラインメントを行う。ここで1つのアラインメントプログラムは、デフォルトパラメータを用いるBLASTである。生物学的に同等のポリヌクレオチドは、上記に指定された百分率の相同性を有し、同様又は類似の生物学活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。
用語「ポリヌクレオチド」は、「オリゴヌクレオチド」と相互に交換して使用可能であり、デオキシリボヌクレオチドであるかリボヌクレオチド又はその同種物であるかに関わらず、任意の長さのヌクレオチドの重合形態を意味する。ポリヌクレオチドは、任意の3次元構造を有してもよく、また、既知又は未知の任意の機能を実行することができる。例えば、遺伝子又は遺伝子断片(例えばプローブ、プライマー、EST又はSAGEタグ)、エクソン、イントロン、メッセンジャーRNA(mRNA)、転移RNA、リボソームRNA、リボザイム、cDNA、dsRNA、siRNA、miRNA、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたDNAと任意の配列の単離されたRNAが挙げられる。ポリヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチド、例えばメチル化されたヌクレオチド及びヌクレオチド類似体を含んでもよい。ヌクレオチドに対する構造修飾は、ポリヌクレオチドを組み立てる前又は後に行われてもよい。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断されることができる。重合後、ポリヌクレオチドをさらに修飾することができる。この用語は、二本鎖と一本鎖分子も指す。特に説明又は要求されていない限り、本開示の任意のポリヌクレオチドは、二本鎖形態と既知の又は予測された、二本鎖形態を構成する2つの相補可能性な一本鎖形態の各々を含む。
用語「コードする」をポリヌクレオチドに用いる場合、ポリペプチドを「コードする」ことができるポリヌクレオチドを指し、その天然状態にあると、又は当業者に知られている既知の方法によって操作される場合、ポリペプチド及び/又はその断片のmRNAを産生するために、転写及び/又は翻訳されることができる。アンチセンス鎖は、このような核酸の相補的配列であり、そのコード配列は、それから導出されることができる。
本発明では、「抗体」又は「抗原結合断片」は、抗原を特異的に認識及び結合するポリペプチド又はポリペプチド複合体を意味する。抗体は、完全な抗体又はその任意の抗原結合断片又はその一本鎖であってもよい。そのため、用語「抗体」は、抗原に結合する生物学活性を有する免疫グロブリン分子を分子に含む一部又は全部のタンパク質又はペプチドを含む。重鎖又は軽鎖又はそのリガンド結合部分の相補性決定領域(CDR)、重鎖可変領域(VH)、軽鎖可変領域(VL)、重鎖定常領域(CH)、軽鎖定常領域(CL)、フレームワーク領域(FR)又はその任意の部分を含むが、これらに限らない。CDRは、軽鎖のCDR(VL CDR)と重鎖のCDR(VH CDR)とを含む。抗体重鎖のクラスは、γ、μ、α、δ、εを含み、ここで、いくつかのサブクラス(例えばγ1~γ4)がある。この鎖の性質は、抗体の「種類」がそれぞれIgG、IgM、IgA、IgD又はIgEであることを決定している。ここでいくつかは、さらに例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4などの免疫グロブリンサブクラス(アイソタイプ)に分類されてもよい。軽鎖のクラスはκ、λを含む。各重鎖は、κ又はλ軽鎖に結合することができる。一般に、ハイブリドーマ、B細胞又は遺伝子工学宿主細胞から免疫グロブリンを産生する場合、その軽鎖と重鎖は、共有結合を介して結合し、2本の重鎖の「尾」部分は、共有ジスルフィド結合又は非共有結合を介して結合する。重鎖では、アミノ酸配列は、Y配置の叉状末端のN末端から各本の鎖の底部のC末端まで延びている。免疫グロブリンのκ軽鎖可変領域はVκであり、免疫グロブリンのλ軽鎖可変領域はVλである。本発明で一般的に用いられるVLはVκである。いくつかの議論は、免疫グロブリン分子のIgG種類に関するが、全ての免疫グロブリンの種類は、本発明に開示された請求範囲内に含まれるものとする。IgGについては、標準的な免疫グロブリン分子は、分子量が約23,000ダルトンである2本の同じ軽鎖ポリペプチドと、分子量が約53,000~70,000の2本の同じ重鎖ポリペプチドとを含む。軽鎖と重鎖は、いずれも構造と機能相同性の領域に分類されてもよい。用語「定常の」と「可変の」は、機能に応じて使用される。この点から、VLとVHは、抗原認識と特異性を決定すると理解すべきである。VLとVH上の抗原結合部位は、抗原決定基を認識するとともに、抗原に特異的に結合することができる。抗原結合部位は、VHとVLにおけるそれぞれの3つのCDR(即ちVH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2とVL CDR3)によって定義される。CLとCH(CH1、CH2又はCH3)は、例えば分泌、胎盤を介した移動、Fc受容体結合、補体結合などの重要な生物学性質を付与する。慣例に従って、定常領域の番号は、抗体の抗原結合部位又はアミノ基末端からより遠くなるにつれて増加する。N末端部分は、可変領域であり、C末端部分は、定常領域であり、CH3とCL構造ドメインは、実際には、それぞれ重鎖と軽鎖を含むカルボキシル末端である。
本発明では、抗体の重鎖定常領域は、異なる免疫グロブリン分子に由来してもよい。例えば、抗体の重鎖定常領域は、IgG1分子由来のCH1構造ドメインとIgG3分子由来のヒンジ領域とを含んでもよい。別の実施例では、重鎖定常領域は、部分的にIgG1分子に由来するヒンジ領域と部分的にIgG3分子に由来するヒンジ領域を含んでもよい。別の実施例では、重鎖の一部は、部分的にIgG1分子に由来するキメラヒンジ領域と部分的にIgG4分子に由来するキメラヒンジ領域を含んでもよい。
本発明では、用語「ヒンジ領域」は、CH1構造ドメインとCH2構造ドメインとを結合する一部の重鎖構造を含む。前記ヒンジ領域は、約25個の残基を含み、かつ柔軟であることで、2つのN末端抗原結合領域を単独に移動させることができる。
本発明では、用語「ジスルフィド結合」は、2つの硫黄原子の間で形成された共有結合を含む。システインは、第2のチオール基とジスルフィド結合を形成し、又は架橋可能なチオール基を含む。多くの天然に存在するIgG分子では、CH1とCL領域は、ジスルフィド結合を介して結合し、2本の重鎖は、2つのジスルフィド結合を介して結合する。
本発明では、用語「ヒンジ領域」は、CH1構造ドメインとCH2構造ドメインとを結合する一部の重鎖構造を含む。前記ヒンジ領域は、約25個の残基を含み、かつ柔軟であることで、2つのN末端抗原結合領域を単独に移動させることができる。
本発明では、用語「ジスルフィド結合」は、2つの硫黄原子の間で形成された共有結合を含む。システインは、第2のチオール基とジスルフィド結合を形成し、又は架橋可能なチオール基を含む。多くの天然に存在するIgG分子では、CH1とCL領域は、ジスルフィド結合を介して結合し、2本の重鎖は、2つのジスルフィド結合を介して結合する。
本発明では、用語「断片」、「抗体断片」又は「抗原結合断片」は、例えばF(ab’)2、F(ab)2、Fab’、Fab、Fv、scFvなど、抗体の一部である。その構造に関わらず、抗体断片は、完全抗体で認識された同一の抗原に結合する。用語「抗原結合断片」は、アプタマーと、鏡像異性体と、二価抗体とを含み、特定の抗原に結合することによって複合体を形成して、抗体として用いられる任意の合成された又は遺伝子工学によってなされたタンパク質をさらに含む。
「scFv」は、免疫グロブリンのVHとVLの融合タンパク質を意味する。いくつかの態様では、これらの領域は、約10個~約25個のアミノ酸の短いリンカーペプチドに結合している。リンカーは、柔軟性を増加させるためにグリシンを豊富に含んでもよく、溶解性を増加させるためにセリン又はスレオニンを豊富に含んでもよく、かつ、VHのN末端とVLのC末端に結合してもよく、その逆でもよい。このタンパク質は、定常領域が除去され、リンカーが導入されたにも関わらず、原始免疫グロブリンの特異性を保持している。
「scFv」は、免疫グロブリンのVHとVLの融合タンパク質を意味する。いくつかの態様では、これらの領域は、約10個~約25個のアミノ酸の短いリンカーペプチドに結合している。リンカーは、柔軟性を増加させるためにグリシンを豊富に含んでもよく、溶解性を増加させるためにセリン又はスレオニンを豊富に含んでもよく、かつ、VHのN末端とVLのC末端に結合してもよく、その逆でもよい。このタンパク質は、定常領域が除去され、リンカーが導入されたにも関わらず、原始免疫グロブリンの特異性を保持している。
本発明に開示される抗体、抗原結合断片、変種又は誘導体は、ポリクローナル、モノクローナル、多重特異性、完全ヒト化、ヒト化、霊長類化、又はキメラ抗体、一本鎖抗体、エピトープ結合断片を含むが、これらに限らない。
本明細書で使用される用語「エピトープ」は、免疫グロブリン又はその断片又はT細胞受容体に特異的に結合することができる任意のタンパク質決定領域を含む。エピトープ決定領域は、一般的には、分子の化学活性表面基(例えばアミノ酸又は糖側鎖)からなり、かつ一般的には、特定の3次元構造特性及び特定の電荷特性を有する。解離定数が1μM以下(例えば100nM以下、10nM以下又は1nM以下)である場合、抗体特異的結合抗原と呼ぶことができる。
当該技術分野で使用及び/又は許容される用語が2つ以上の定義を有する場合、明示的に対立して指摘されない限り、本明細書で使用された用語の定義は、これらの全ての意味を含む。
特に説明されていない限り、抗体の各構造ドメインにおける残基の番号は、EU番号システムに従って、EUインデックスとも呼ばれ、例えばKabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991で記載されている。
本発明に開示された抗体は、鳥類と哺乳動物とを含む任意の動物に由来してもよい。好ましくは、抗体は、ヒト、マウス、ロバ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ラマ、ウマ又はニワトリ由来の抗体である。別の実施例では、可変領域は、軟骨魚綱由来のもの(例えばサメ由来)であってもよい。
本発明では、用語「キメラ抗体」は、抗体の可変領域が第1の種から得られるか、又は誘導され、その定常領域(本発明では、完全な、一部の又は修飾されたものであってもよい)が第2の種から由来する任意の抗体を指すと考えられる。いくつかの実施例では、可変領域は、非ヒト(例えばマウス又は霊長類動物)に由来し、定常領域は、ヒト由来である。
「特異的に結合」又は「...に対して、特異性を有する」は、一般的には、抗体がその抗原結合構造ドメインを介してエピトープに結合することを意味し、この結合は、抗原結合構造ドメインとエピトープとの間の相補性を必要とする。この定義によれば、抗体がその抗原結合構造ドメインを介してこのエピトープに結合する場合、それがランダムで無関係なエピトープに結合するよりも容易であり、このエピトープに「特異的に結合」すると呼ばれる。用語「特異性」は、本発明において、特定のエピトープに結合する特定の抗体の相対親和性を限定するために用いられる。免疫学的結合相互作用の強度又は親和性は、相互作用の平衡解離定数(KD)で表されてもよく、ここで、比較的小さいKDは、親和性が比較的強いことを表す。選択されたポリペプチドの免疫結合特性は、当該分野でよく知られている方法で定量されてもよい。一方法では、抗原結合部位/抗原複合体の形成と解離の速度を測定する必要があり、ここで、それらの速度は、複合体パートナーの濃度、相互作用の親和性と2つの方向においてこの速度に等しく影響する幾何学的パラメータに依存する。そのため、「結合速度定数」(Kon)と「解離速度定数」(Koff)の両方は、濃度と実際の会合と解離速度とを計算することによって測定することができる(Nature361:186-87(1993)参照)。Koff/Kon比率は、親和性とは無関係なパラメータを除去することができ、平衡解離定数KDに等しく、親和性数値である。(一般的には、Daviesら(1990)Annual Rev Biochem 59:439-473を参照)。OX40との平衡結合定数(KD)が≦1μMである場合、本開示の抗体は、OX40に特異的に結合すると考えられる。
本発明では、抗体のフコースの「含有量」は、抗体において、フコースを含有するグリコフォーム部分が抗体の全てのグリコフォーム部分に占めるモル比を意味する。いくつかの実施形態では、抗体のフコース含有量は、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%又は約99%以上である。いくつかの実施形態では、抗体のフコース含有量は約96%である。いくつかの実施形態では、抗体のフコース含有量は、約10%、約9%、約8%、約7%、約6%、約5%、約4%、約3%、約2%、約1%又は約0.5%を超えない。いくつかの実施形態では、抗体のフコース含有量は約0である。
本発明では、用語「治療」は、予防的措置及び/又は治療的措置を意味し、有害の生理的改変又は障害(例えばがん)の進行を予防、緩和及び/又は解消することを目的とする。有益又は所望の臨床結果は、例えば症状の緩和、疾患の程度の低減、疾患状態の安定(即ち悪化しない)、疾患進行の遅延又は緩和、疾患状態の改善又は緩和などを含むが、これらに限らない。「治療」とは、延長された生存期限(治療を受けない場合に所望の生存期限と比較して)を意味する。治療を必要とするのは、すでに病状又は障害に罹患しているヒト、及び病状又は障害に罹患しやすいヒト、又は当該病状又は障害を予防する必要があるヒトを含む。
「患者」は、一般的には、診断、予後又は治療を必要とする任意の患者、特に哺乳動物患者を意味する。哺乳動物患者は、ヒト、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、乳牛などを含み、特にヒトである。
本発明では、例えば「治療を必要とする患者」は、検出、診断プロセス、予防及び/又は治療に用いられる本発明に開示された抗体又は組成物を投与することから利益を受けた患者、例えば哺乳動物患者を含む。
本発明では、例えば「治療を必要とする患者」は、検出、診断プロセス、予防及び/又は治療に用いられる本発明に開示された抗体又は組成物を投与することから利益を受けた患者、例えば哺乳動物患者を含む。
特に説明されていない限り、用語「OX40」は、任意の脊椎動物由来の(哺乳動物、例えば霊長類(例えばヒト、アカゲザル)と、齧歯類(例えばマウスとラット)とを含む)任意の天然OX40を意味する。この用語は、「全長」の、未加工のOX40及び細胞における加工による任意の形態のOX40を含む。
「OX40活性化」は、OX40受容体の活性化を意味する。一般的には、OX40活性化は、シグナル形質導入を引き起こす。
「活性化T細胞」は、エフェクター又は記憶T細胞が再生、持続、または増幅された生物学機能を有するように誘導、誘発又は刺激することを意味する。T細胞機能を増強する例は、介入前と比較して、CD8+エフェクターT細胞由来のγ-インターフェロン(例えばIFNg)又はインターロイキン(例えばIL-2)の分泌が増加すること、CD4+記憶及び/又はエフェクターT細胞由来のγ-インターフェロン(例えばIFNg)又はインターロイキン(例えばIL-2)の分泌が増加すること、CD4+エフェクター及び/又は記憶T細胞の増殖が増加すること、CD8+エフェクターT細胞の増殖が増加すること、抗原応答性(例えば除去)が増強することを含む。関連する測定方法は、当業者の既知のものである。
用語「サイトカイン」は、1つの細胞群によって放出されたものであり、細胞間媒質として別の細胞に作用するタンパク質の総称である。このようなサイトカインの例としては、リンホカイン、モノカイン、インターロイキン(IL)(例えばIL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-15)、腫瘍壊死因子(例えばTNF-α又はTNF-β)及び他のポリペプチド因子(LIFとkitリガンド(KL)とγ-インターフェロンを含む)が挙げられる。例えば、本明細書で使用されるように、サイトカインという用語は、天然由来の、又は組換え細胞培養物由来のタンパク質及び天然配列サイトカインの生物活性等価物を含む。生物活性等価物は、人工合成により産生される小分子実体、及びその薬学的に許容しうる誘導体と塩を含む。
例えば、本明細書で使用されるように、用語「標識」又は「標識された」は、例えば、放射性標識アミノ酸、又は標識可能なアビジン(例えば、蛍光標識を含有するか、又は光学的方法又は熱量測定法によって検出した酵素活性を有するストレプトアビジン)により検出されたビオチン基部分に付着したポリペプチドを組み込むことにより、検出可能な標識を組み込むことを意味する。場合によっては、マーカー又は標識は、治療的なものであってもよい。ポリペプチドと糖タンパク質を標識する様々な方法は、当該分野で既知かつ使用可能なものである。ポリペプチド用のマーカーの例としては、放射性同位体又は放射性核種(例えば3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、蛍光マーカー(例えばFITC、ローダミン、ランタニドリン光体)、酵素マーカー(例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ)、化学発光標識、ビオチニル基、二次レポーター遺伝子によって認識された所定のポリペプチドエピトープ(例えばロイシンジッパーペア配列、二次抗体結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ)を含むが、これらに限らない。いくつかの実施形態では、標識は、可能な立体障害を低減するために、様々な長さのスペーサーアームを介して結合される。
(抗OX40抗体)
本発明の抗体は、OX40に結合する能力を有し、OX40の細胞内シグナル経路を活性化することができ、特にFc受容体又はFc受容体を発現する細胞が関与する場合に、それによってT細胞の活性化を促進し、腫瘍の成長又は転移を抑制する。例えば、本明細書の実施例に記載のNFκBレポーター遺伝子系を用いて、そのT細胞を活性化する機能を検証することができる。
本発明の抗体は、OX40に結合する能力を有し、OX40の細胞内シグナル経路を活性化することができ、特にFc受容体又はFc受容体を発現する細胞が関与する場合に、それによってT細胞の活性化を促進し、腫瘍の成長又は転移を抑制する。例えば、本明細書の実施例に記載のNFκBレポーター遺伝子系を用いて、そのT細胞を活性化する機能を検証することができる。
いくつかの実施形態では、本発明は、ヒトOX40又はアカゲザルOX40に結合する抗体又はその抗原結合断片を提供する。いくつかの実施形態では、本発明の抗OX40抗体又はその抗原結合断片は、ヒトOX40又はアカゲザルOX40に対する強い結合(例えば、OX40mAb24と11D4などの既知の抗OX40抗体に相当又はそれより強い)を保持する。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、ヒトOX40又はアカゲザルOX40に結合する。本発明の抗体又はその抗原結合断片は、結合しないか、又はヒトOX40又はアカゲザルOX40の結合と比較して、ネズミOX40、例えばマウスOX40に比較的低く結合する。
いくつかの実施形態では、本発明の抗OX40抗体又はその抗原結合断片がヒトOX40に結合するKDは、約20nM、約19nM、約12nM、約6nM、約5nM、約4nM又は約2nM以下である。いくつかの実施形態では、KDは、約1nM、約0.8nM、約0.6nM、約0.4nM又は約0.2nM以下である。いくつかの実施形態では、KDは約0.16nMである。いくつかの実施形態では、抗体結合親和性は、生物光学干渉による測定法(例えばFortebio親和性測定)を用いて測定したものである。
いくつかの実施形態では、本発明の抗OX40抗体又はその抗原結合断片がヒトOX40に結合するKDは、約20nM、約19nM、約12nM、約6nM、約5nM、約4nM又は約2nM以下である。いくつかの実施形態では、KDは、約1nM、約0.8nM、約0.6nM、約0.4nM又は約0.2nM以下である。いくつかの実施形態では、KDは約0.16nMである。いくつかの実施形態では、抗体結合親和性は、生物光学干渉による測定法(例えばFortebio親和性測定)を用いて測定したものである。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合断片のヒトOX40に対する結合は、フローサイトメトリー測定法を用いて測定したものである。いくつかの実施形態では、ヒトOX40に対する結合は、約1.5nM以下のEC50を有する。いくつかの実施形態では、ヒトOX40に対する結合は、約1.33nM又は約1.0nM以下のEC50を有する。
いくつかの実施形態では、抗OX40抗体のアゴニスト活性は、OX40シグナルの伝達によって評価される。主に、OX40とNFκBレポーター遺伝子をトランスフェクションしたJurkat細胞を用いて検出する。本発明は、IgG対照抗体と比較して、NFκB媒介の転写活性レベルを高める抗OX40抗体又はその抗原結合断片を提供する。いくつかの実施形態では、抗OX40抗体又はその抗原結合断片は、該当する対照IgGと比較して、raji細胞が関与した場合、NFκB媒介の転写活性レベルを約9倍以上増加させることができる。いくつかの実施形態では、本発明の抗OX40抗体又はその断片は、該当する対照IgGと比較して、NFκB媒介の転写活性レベルを約5倍又はそれ以上増加させることができる。
いくつかの実施形態では、抗OX40抗体のFcがRY(E345RとS440Y)とR(E345R)突然変異を経た後、OX40とNFκBレポーター遺伝子をトランスフェクションしたJurkat細胞を用いてそれらの活性を検出する。RY突然変異を経た後の抗体の活性は、突然変異しない抗体より12倍高いが、R突然変異を経た抗体の活性は、突然変異しない抗体より10倍高い。
いくつかの実施形態では、抗OX40抗体のアゴニスト活性は、PBMC細胞活性化後に放出されたサイトカイン(IL-2)のレベルによって評価される。本発明の抗OX40抗体又はその断片は、該当する対照IgGと比較して、PBMC細胞により分泌されたIL-2のレベルを約1倍、約2倍、約3倍又はそれより増加させることができる。
いくつかの実施形態では、抗OX40抗体又はその抗原結合断片は、親和性成熟を経た後、その親和性が約5倍、約10倍、約20倍又は約70倍向上する。
いくつかの実施形態では、本発明の抗OX40抗体又はその抗原結合断片は、重鎖可変領域(VH)を含み、ここで、前記VHは、相補性決定領域VH CDR1、VH CDR2とVH CDR3を含み、ここで、VH CDR1は、SEQ ID NO:1、4、10、16、104又は22から選択されるアミノ酸配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性又は100%の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなり、VH CDR2は、SEQ ID NO:2、5、7、8、11、13、14、17、20、23又は26から選択されるアミノ酸配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性又は100%の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなり、かつVH CDR3は、SEQ ID NO:3、6、9、12、15、18、21、24又は27から選択されるアミノ酸配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性又は100%の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。
いくつかの実施形態では、本発明の抗OX40抗体又はその抗原結合断片は、軽鎖可変領域(VL)を含み、ここで、前記VLは、相補性決定領域(CDR)VL CDR1、VL CDR2とVL CDR3を含み、ここで、VL CDR1は、SEQ ID NO:28、31、37、40、43、46、49、52、55、58又は61から選択されるアミノ酸配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性又は100%の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなり、VL CDR2は、SEQ ID NO:19、25、29、32、35、38、44、47、50、56、59又は62から選択されるアミノ酸配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性又は100%の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなり、VL CDR3は、SEQ ID NO:30、33、34、36、39、41、42、45、48、51、53、54、57、60又は63から選択されるアミノ酸配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性又は100%の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。本発明の抗体又はその抗原結合断片において、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2とVL CDR3は、表1における各CDRに対応するいずれか1つのアミノ酸配列の例示的な組み合わせであってもよい。
いくつかの実施形態では、本発明の抗OX40抗体又はその断片は、SEQ ID NO:64~72から選択されるアミノ酸配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性又は100%の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、重鎖可変領域VHを含む。
いくつかの実施形態では、本発明の抗OX40抗体又はその抗原結合断片は、SEQ ID NO:73~84から選択されるアミノ酸配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性又は100%の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、軽鎖可変領域VLを含む。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合断片における重鎖可変領域VHと軽鎖可変領域VLは、表3の例示的な組み合わせである。
いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、重鎖定常領域、軽鎖定常領域、Fc領域又はその結合をさらに含む。
いくつかの実施形態では、前記抗体は、SEQ ID NO:86に示される重鎖及びSEQ ID NO:87に示される軽鎖を含む。
本発明に開示された抗体、抗原結合断片、変種又は誘導体である。変種は、抗体又はその抗原結合断片における1つ又は複数のアミノ酸残基に対して欠失及び/又は置換を行うか、又は1つ又は複数のアミノ酸残基を挿入して得られる抗体又はその抗原結合断片である。誘導体は、修飾された誘導体を含み、即ち、任意のタイプの分子と抗体の共有結合によって修飾を行い、ここで、共有結合は、抗体のエピトープへの結合を阻止しない。下記の実例を含むが、これらに限定されず、抗体は、、例えばグリコシル化、アセチル化、ポリエチレングリコール化、リン酸化、アミド化、既知の保護/封鎖基による誘導体化、タンパク質加水分解切断、細胞リガンド又は他のタンパク質への接続などによって修飾されてもよい。多くの化学修飾のうちのいずれか1つの修飾は、従来技術によって行われてもよく、特異性化学分解、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含むが、これらに限らない。なお、抗体は、1つ又は複数の非自然のアミノ酸を含有してもよい。
いくつかの実施例では、抗体は、治療剤、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生物学的応答調節剤、薬剤又はPEG複合することができる。
抗体は、治療剤に複合又は融合することができ、前記治療剤は、検出可能な標識、例えば放射性標識、免疫調節剤、ホルモン、酵素、オリゴヌクレオチド、光感受性治療剤又は診断剤を含んでもよく、薬物又は毒素の細胞毒性剤、超音波増強剤、非放射性標識及びその組成物及び当該分野で既知の他のこのような試薬であってもよい。
抗体は、治療剤に複合又は融合することができ、前記治療剤は、検出可能な標識、例えば放射性標識、免疫調節剤、ホルモン、酵素、オリゴヌクレオチド、光感受性治療剤又は診断剤を含んでもよく、薬物又は毒素の細胞毒性剤、超音波増強剤、非放射性標識及びその組成物及び当該分野で既知の他のこのような試薬であってもよい。
抗体は、化学発光化合物にカップリングすることによって、検出可能に標識されることができる。そして化学反応中に出現した発光を検出することによって、化学発光標識された抗原結合断片の存在を決定する。特に有用な化学発光標識化合物の実例としては、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩とシュウ酸エステルを含む。
いくつかの実施形態では、本発明の抗OX40抗体又はその断片の重鎖及び/又は軽鎖は、例えばMEFGLSWVFLVAILKGVQC(SEQ ID NO:85)などのシグナルペプチド配列をさらに含む。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、抗OX40抗体のアミノ酸配列の変種及び上述した任意の抗体と同じエピトープに結合する抗体をさらに含む。
いくつかの実施形態では、本発明の抗OX40抗体は、その抗体断片をさらに含み、いくつかの実施形態では、Fab、Fab’-SH、Fv、scFv又は(Fab’)2断片という抗体断から選択される。
本発明の抗OX40抗体は、従来の組換えDNA技術によって調製することができ、例えば、当業者で既知の組換えDNA技術を使用することによって、抗体をコードするDNA、抗体を生産するベクター及び細胞系を選択、構築と培養することができる。これらの技術は、様々な実験室マニュアルと主要な出版物に記載されている。この点で、以下で記述される本発明に適用する技術は、Current Protocols in Immunology,Coligan et al.,Eds.,Green Publishing Associates and Wiley-Interscience,John Wiley and Sons,New York(1991)を参照し、その内容の全ては、追補を含めて、ここに参照として組み込まれる。
いくつかの実施形態では、従来の方法に従って、本明細書に記載された抗体アミノ酸配列に基づいて、抗体をコードするDNAを設計合成し、それを発現ベクターに入れ、宿主細胞をトランスフェクションし、トランスフェクションされた宿主細胞を培地にて培養し、モノクローナル抗体を産生することができる。いくつかの実施形態では、発現抗体ベクターは、少なくとも1つのプロモータエレメント、抗体コード配列、転写終了シグナルとpolyA尾部を含む。他のエレメントは、エンハンサー、Kozak配列及び挿入配列の両側のRNAスプライシングのドナーと受容体部位を含む。SV40の前期と後期プロモーター、レトロウイルス由来の長い末端反復配列、例えばRSV、HTLV1、HIVI及びサイトメガロウイルスの早期プロモーターによって、高効率な転写を得ることができ、アクチンプロモーターのような他のいくつかの細胞のプロモーターを適用することもできる。適切な発現ベクターは、pIRES1neo、pRetro-Off、pRetro-On、PLXSN、又はPlncx、pcDNA3.1(+/-)、pcDNA/Zeo(+/-)、pcDNA3.1/Hygro(+/-)、PSVL、PMSG、pRSVcat、pSV2dhfr、pBC12MIとpCS2などを含んでもよい。一般的に用いられる哺乳動物細胞は、293細胞、Cos1細胞、Cos7細胞、CV1細胞、マウスL細胞とCHO細胞などを含む。
いくつかの実施形態では、挿入遺伝子断片は、スクリーニング標識を含有する必要があり、よく見られるスクリーニング標識は、トランスフェクションに成功した細胞のスクリーニング単離を容易にするように、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、グルタミン合成酵素、ネオマイシン耐性、ハイグロマイシン耐性などのスクリーニング遺伝子を含む。構築したプラスミドを宿主細胞にトランスフェクションし、選択的に培地で培養し、トランスフェクションに成功した細胞が大量に成長し、所望の目標タンパク質を産生する。
いくつかの実施形態では、本発明は、上記任意の抗OX40抗体又はその断片をコードする核酸を提供する。一実施形態では、前記核酸を含むベクターを提供する。一実施形態では、ベクターは、発現ベクターである。発現ベクターは、プラスミド、レトロウイルス、YAC、EBV誘導の付加体などを含む。一実施形態では、前記ベクターを含む宿主細胞を提供する。一実施形態では、前記宿主細胞は真核である。別の実施形態では、宿主細胞は、酵母細胞、哺乳動物細胞(例えばCHO細胞又は293F細胞)又は抗体又はその抗原結合断片の調製に適用する他の細胞から選択される。
いくつかの実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:96~101に示される1種又は複数種のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:96、97と98に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:99、100と101に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:102に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:103に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:102に示されるヌクレオチド配列、及び/又はSEQ ID NO:103に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、SEQ ID NO:96、97、98、99、100又は101に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:10、26、27、61、62又は63に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをそれぞれコードして産生することができる。いくつかの実施形態では、SEQ ID NO:102に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:72に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードして産生することができ、いくつかの実施形態では、SEQ ID NO:103に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:84に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードして産生することができる。いくつかの実施形態では、SEQ ID NO:105に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:90に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードして産生することができ、いくつかの実施形態では、SEQ ID NO:106に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:91に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードして産生することができる。ここで、各ヌクレオチド配列を下記表2に示す。
本発明の薬物組成物は、本発明の抗体又はその抗原結合断片を含んでもよい。これらの薬物組成物は、試薬キット、例えば診断試薬キットに含まれてもよい。
本発明は、必要とされる患者に、1種又は複数種の本明細書に記載された抗体又は断片を投与することによって、がん又は他の腫瘍症状又は感染症状を緩和する方法を提供する。前記抗体の投与用量は、患者におけるがん又は他の腫瘍症状又は感染症状を緩和するのに十分でなければならない。いくつかの実施形態では、前記患者はヒトである。いくつかの実施形態では、前記抗体は、キメラ、ヒト化又は完全ヒト化のものである。いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、T細胞を活性化し、その増殖又は炎症性因子の分泌を促進することができる。いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、IgGアイソタイプであり、前記IgGアイソタイプは、IgG1アイソタイプ、IgG2アイソタイプ、IgG3アイソタイプ及び/又はIgG4アイソタイプからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、前記抗体又はその抗原結合断片は、IgG4PとIgG4PEから選択されるIgGアイソタイプである。いくつかの実施形態では、前記抗体又はその抗原結合断片は、RY(E345RとS440Y)とR(E345R)を含むものから選択されるIgGアイソタイプである。
本発明は、必要とされる患者に、1種又は複数種の本明細書に記載された抗体又は断片を投与することによって、がん又は他の腫瘍症状又は感染症状を緩和する方法を提供する。前記抗体の投与用量は、患者におけるがん又は他の腫瘍症状又は感染症状を緩和するのに十分でなければならない。いくつかの実施形態では、前記患者はヒトである。いくつかの実施形態では、前記抗体は、キメラ、ヒト化又は完全ヒト化のものである。いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、T細胞を活性化し、その増殖又は炎症性因子の分泌を促進することができる。いくつかの実施形態では、前記抗体又はその断片は、IgGアイソタイプであり、前記IgGアイソタイプは、IgG1アイソタイプ、IgG2アイソタイプ、IgG3アイソタイプ及び/又はIgG4アイソタイプからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、前記抗体又はその抗原結合断片は、IgG4PとIgG4PEから選択されるIgGアイソタイプである。いくつかの実施形態では、前記抗体又はその抗原結合断片は、RY(E345RとS440Y)とR(E345R)を含むものから選択されるIgGアイソタイプである。
いくつかの実施形態では、前記抗OX40抗体と他の治療剤は、単一の治療組成物として調製され、また前記抗OX40抗体と他の治療剤を同時に投与する。又は、前記抗OX40抗体と他の治療剤は、互いに独立して、例えば、それぞれ、独立した治療組成物として調製され、また、前記抗OX40抗体と他の治療剤を同時に投与するか、又は治療レジメンの間で前記抗OX40抗体と他の治療剤を異なる時間点で投与する。例えば、他の治療剤を投与する前に、前記抗OX40抗体を投与するか、他の治療剤を投与した後に、前記抗OX40抗体を投与するか、又は交互のレジメンで前記抗OX40抗体と他の治療剤を投与する。本明細書では、前記抗OX40抗体と他の治療剤は、単一用量又は複数の用量で投与される。
本発明の抗体が様々な用途を有することを、当業者は理解するであろう。例えば、本発明の抗体は、治療剤として、診断試薬キットにおける試薬又は診断ツールとして、又は治療剤を生成するために競合実験における試薬として用いることができる。
本発明は、表3に記載されている抗体及びその配列を提供する。本明細書では、これらの抗体は、抗OX40抗体と総称される。
本発明は、表3に記載されている抗体及びその配列を提供する。本明細書では、これらの抗体は、抗OX40抗体と総称される。
本明細書に記載された抗体のいくつかの特性は、ヒトOX40とアカゲザルOX40に特異的に結合することと、OX40の細胞内シグナル経路を活性化することができることと、T細胞の活性化を促進することができることと、がんに対して強力な腫瘍抑制活性を示すこととを含む。
本発明の抗体及びその断片のヒトOX40のエピトープに結合する平衡解離定数(KD)は、生物光学干渉による測定法とBIACOREを用いて測定したものであり、約20nM、約19nM、約12nM、約6nM、約5nM、約4nM、約2nM以下である。いくつかの実施形態では、前記KDは、約1nM又は0.16nM以下である。
本発明の抗体又はその断片のヒトOX40のエピトープに結合する平衡結合定数(KD)は、フローサイトメトリー測定法を用いて測定したものである。いくつかの実施形態では、ヒトOX40に対する結合は、約1.5nM以下のEC50を有する。いくつかの実施形態では、ヒトOX40に対する結合は、約1.33nM又は1.0nM以下のEC50を有する。その測定したKDは、既知の対照抗体以下である。
本発明の抗OX40抗体のOX40を活性化する活性は、NFκBレポーター遺伝子系を用いて同定したものであり、protein Aが存在する場合、EC50は約0.14μg/mlであるが、Raji細胞が存在する場合、EC50は、約0.0602μg/mlと0.0722μg/mlである。
本発明の例示的な抗体は、抗体-F10、抗体-F15-1L、抗体-A2、抗体-X35-6L、抗体-A6-1k、抗体-M5-5k、抗体-M5-7k、抗体-F23-4k、抗体-F23-7k、抗体-F23-32k、抗体-FE-16Hと抗体Mを含む。本発明の例示的な抗体は、配列がSEQ ID NO:64~72から選択される可変重鎖と、配列がSEQ ID NO:73~84から選択される可変軽鎖(VL)とを含有する抗体を含む。特に、例示的な抗体は、表3に提供された抗体を含む。
本発明は、本明細書に記載された抗OX40抗体と同じエピトープに結合する抗体をさらに含む。例えば、本発明の抗体特異的結合は、ヒトOX40上の1つ又は複数のアミノ酸残基のエピトープ(例えばUniprot上のP434489を参照)を含む。
過度の実験を行うことなく、被検抗体が既知の抗体のOX40への結合を抑制するか否かを究明するだけで抗体が本明細書に記載された抗体(例えば表3に示す抗体、又はSEQ ID NO:64~72から選択される可変重鎖と、配列がSEQ ID NO:73~84から選択される可変軽鎖を有する抗体のうちの1つ)と同じエピトープに結合するか否かを決定することができることを、当業者は認識するだろう。本明細書に記載された抗体の結合減少に示されるように、被験抗体が本開示の抗体と競争すると、2種類の抗体は、同じ又は類似するエピトープに結合する可能性がある。
抗体が本明細書に記載された抗体の特異性を有するか否かを決定するための代替方法は、本明細書に記載された抗体を、通常、この抗体に対する反応のある可溶性OX40タンパク質と共に予備インキュベートし、その後試験される抗体を添加して、試験される抗体のOX40と結合する能力が抑制されているか否かを決定することである。試験される抗体が抑制されると、それは、本開示の抗体と同じ、又は機能が同じエピトープ特異性を有する。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、例えば、以下に提供される実施例に説明される方法を用いて調製することができる。いくつかの実施形態では、Trioma技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kozborら,1983,Immunol Today 4:72を参照)、及びEBVハイブリドーマ技術(Coleら,1985,In:Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.,第77-96ページを参照)などを用いて調製して産生することもできる。
抗体は、既知の技術により精製することができ、例えばタンパク質A又はタンパク質Gを用いて親和性クロマトグラフィー、免疫親和性クロマトグラフィーなどを行うことができる。例えばD.Wilkinson(The Scientist、The Scientist,Inc.,Philadelphia Pa.出版、第14巻、第8期(2000)、第25-28ページ)で免疫グロブリンの精製を検討した。
本発明のモノクローナル抗OX40抗体は、調節、促進、活性化、起動と他の方式でOX40細胞内シグナルを活性化させた能力を有する。いくつかの実施形態では、WO2009036379とWO2010105256特許を参照して、例えば酵母表面ディスプレイ方法によって抗OX40抗体(例えば完全ヒト化抗体又はヒト化抗体)を産生することができる。この方法では、天然又は組換えOX40由来又はその断片を用いて、ランダムな軽鎖と重鎖対を持つ酵母組み合わせライブラリをスクリーニングする。
本発明のモノクローナル抗OX40抗体は、調節、促進、活性化、起動と他の方式でOX40細胞内シグナルを活性化させた能力を有する。いくつかの実施形態では、WO2009036379とWO2010105256特許を参照して、例えば酵母表面ディスプレイ方法によって抗OX40抗体(例えば完全ヒト化抗体又はヒト化抗体)を産生することができる。この方法では、天然又は組換えOX40由来又はその断片を用いて、ランダムな軽鎖と重鎖対を持つ酵母組み合わせライブラリをスクリーニングする。
(Fc修飾)
本明細書に記載された抗体の関連するエフェクター機能は、修飾によって、例えばOX40シグナル伝達に関連する疾病と障害の治療における抗体の有効性を向上させることができる。例えば、腫瘍に浸潤した制御性T細胞(Treg)は、遍在的に発現するものであるため、1つ又は複数の突然変異を抗体のFc領域に導入することにより、ADCCの機能を向上させ、それにより、より一層効果的にTregを死滅させることができる。また例えば、OX40の細胞内シグナルの十分な活性化は、複数のOX40受容体の凝集を必要とし、さらにオリゴ化する必要があるため、1つ又は複数の突然変異を抗体のFc領域に導入することによって、抗体自体の凝集能力又はFc受容体との結合能力を向上させることで抗体の凝集を促進し、それによってOX40の細胞内シグナルをより十分に活性化することができる。
本明細書に記載された抗体の関連するエフェクター機能は、修飾によって、例えばOX40シグナル伝達に関連する疾病と障害の治療における抗体の有効性を向上させることができる。例えば、腫瘍に浸潤した制御性T細胞(Treg)は、遍在的に発現するものであるため、1つ又は複数の突然変異を抗体のFc領域に導入することにより、ADCCの機能を向上させ、それにより、より一層効果的にTregを死滅させることができる。また例えば、OX40の細胞内シグナルの十分な活性化は、複数のOX40受容体の凝集を必要とし、さらにオリゴ化する必要があるため、1つ又は複数の突然変異を抗体のFc領域に導入することによって、抗体自体の凝集能力又はFc受容体との結合能力を向上させることで抗体の凝集を促進し、それによってOX40の細胞内シグナルをより十分に活性化することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載された抗体は、IgGアイソタイプである。いくつかの実施形態では、抗体の定常領域は、ヒトIgG1アイソタイプであり、SEQ ID NO:90とSEQ ID NO:91のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、例えばN297の脱フコシル化など、抗体のグリコシル化を変更するために、ヒトIgG1定常領域上の特定のアミノ酸に対して修飾を行う。いくつかの実施形態では、前記抗体又はその抗原結合断片は、少量のフコース修飾を含有するか、又はフコース修飾をほとんど含有しないか、又はフコース修飾を含有せず、ADCC効果が著しく向上する。いくつかの実施例では、前記抗体又はその断片は、最大1つ(又は最大2つ、又は3つ)のアミノ酸残基がフコース修飾を有する。いくつかの実施例では、前記抗体又はその断片は、フコースによって修飾される最大で0.01%、0.1%、1%、2%、3%、4%、又は5%未満のタンパク質分子を含む。いくつかの実施形態では、フコース修飾を低減又は除去した抗体は、より強いADCCを有し、いくつかの治療用途に適している。いくつかの実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、改造されたCHO細胞で発現される。いくつかの実施形態では、改造されたCHO細胞は、Slc35c1遺伝子、fut8遺伝子、GDP-マンノース4,6-デヒドラターゼ(GMD)遺伝子、GDP-4-ケト-6-デオキシマンノース-3,5-エピメラーゼ-4-レダクターゼ(GMER)遺伝子、GDP-フコーストランスポーター(GFT)遺伝子のうちの1つ又は複数が減少又はノックアウトされたCHO細胞である。いくつかの実施形態では、改造されたCHO細胞は、fut8遺伝子がノックアウトされたCHO細胞である。
いくつかの実施形態では、抗体定常領域上の特定のアミノ酸に対して修飾を行って、Fc受容体相互作用、例えばS267E/L328Fの突然変異を改変させる。
いくつかの実施形態では、抗体の定常領域は、ヒトIgG2アイソタイプであり、SEQ ID NO:92と93のアミノ酸配列を有する。ここで、SEQ ID NO:92のアミノ酸配列は以下のとおりである:
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK;
ここで、SEQ ID NO:93のアミノ酸配列は以下のとおりである:
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC。
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK;
ここで、SEQ ID NO:93のアミノ酸配列は以下のとおりである:
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC。
いくつかの実施形態では、抗体の定常領域は、ヒトIgG4アイソタイプであり、SEQ ID NO:94と95のアミノ酸配列を有する。ここで、SEQ ID NO:94のアミノ酸配列は以下のとおりである:
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK;
ここで、SEQ ID NO:95のアミノ酸配列は以下のとおりである:
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC。
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK;
ここで、SEQ ID NO:95のアミノ酸配列は以下のとおりである:
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC。
いくつかの実施形態では、ヒトIgG4定常領域内のヒンジ領域に対して修飾を行うことで、鎖交換を回避又は減少させる。他の実施形態では、ヒトIgG4定常領域上のアミノ酸235に対して修飾を行うことで、Fc受容体相互作用を改変させる。
(抗OX40抗体又はその抗原結合断片に対する使用)
本明細書に記載された抗OX40抗体が治療可能な疾患又は病状は、血液がん及び/又は固形がんを含む。血液がんは、例えば白血病、リンパ腫と骨髄腫を含む。いくつかの実施形態では、白血病は、急性リンパ性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性リンパ性白血病(CLL)、慢性骨髄性白血病(CML)、骨髄増殖性疾患/腫瘍(MPDS)を含む。リンパ腫は、ホジキンリンパ腫、無痛性と侵襲性非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫と濾胞性リンパ腫(小細胞と大細胞)を含む。骨髄腫は、多発性骨髄腫(MM)、巨細胞骨髄腫、重鎖骨髄腫と軽鎖又はベンス-ジョーンズ骨髄腫を含む。固形がんは、例えば乳がん、卵巣がん、肺がん、膵臓がん、前立腺がん、黒色腫、結腸直腸がん、肺がん、頭頸部がん、膀胱がん、食道がん、肝臓がんと腎臓がんを含む。
本明細書に記載された抗OX40抗体が治療可能な疾患又は病状は、血液がん及び/又は固形がんを含む。血液がんは、例えば白血病、リンパ腫と骨髄腫を含む。いくつかの実施形態では、白血病は、急性リンパ性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性リンパ性白血病(CLL)、慢性骨髄性白血病(CML)、骨髄増殖性疾患/腫瘍(MPDS)を含む。リンパ腫は、ホジキンリンパ腫、無痛性と侵襲性非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫と濾胞性リンパ腫(小細胞と大細胞)を含む。骨髄腫は、多発性骨髄腫(MM)、巨細胞骨髄腫、重鎖骨髄腫と軽鎖又はベンス-ジョーンズ骨髄腫を含む。固形がんは、例えば乳がん、卵巣がん、肺がん、膵臓がん、前立腺がん、黒色腫、結腸直腸がん、肺がん、頭頸部がん、膀胱がん、食道がん、肝臓がんと腎臓がんを含む。
本発明の抗体の治療有効量は、治療目標を達成するために必要な量に関する。投与に必要な量は、その特異的抗原に対する抗体の結合親和性、疾患、障害又は症状の重篤程度、投与経路、投与された抗体がそれを投与されたフリー体積の他対から枯渇する速度などに依存する。いくつかの実施形態では、本発明の抗体又は抗体断片の治療有効量の範囲は、約0.01mg/kg~約100mg/kgである。いくつかの実施形態では、本発明の抗体又は抗体断片の治療有効量の範囲は、約0.1mg/kg~約30mg/kgである。用量頻度は、例えば2週ごとに1回又は3週ごとに1回であってもよい。
別のいくつかの実施形態では、OX40に対する抗体は、当該分野で既知のOX40局在及び/又は定量に関連する方法(例えば、適当な生理検体におけるOX40及び/又はOX40とOX40Lの両者のレベルを測定するために用いられ、診断方法に用いられ、アミロイドイメージングなどに用いられる)に用いられることができる。
いくつかの実施形態では、抗OX40抗体を、診断を経て、上記疾患(がん又は他の腫瘍症状を含むが、これらに限らない)に関連する1種又は複数種の臨床症状を有する患者に投与する。診断後、抗OX40抗体を投与して、上記疾患に関連する1種又は複数種の臨床症状の効果を軽減又は反転させる。
いくつかの実施形態では、抗OX40抗体を、診断を経て、上記疾患(がん又は他の腫瘍症状を含むが、これらに限らない)に関連する1種又は複数種の臨床症状を有する患者に投与する。診断後、抗OX40抗体を投与して、上記疾患に関連する1種又は複数種の臨床症状の効果を軽減又は反転させる。
いくつかの腫瘍検体において、OX40の過剰発現が観察され、かつOX40過剰発現の細胞を有する患者は、本発明の抗OX40抗体を用いた治療に対して応答する可能性がある。そのため、本発明の抗体は、診断と予後にも用いられることができる。
いくつかの実施形態では、細胞を含む検体は、患者体内から採取されてもよく、この患者は、がん患者又は診断対象の患者であってもよい。細胞は、腫瘍組織又は腫瘍塊、血液検体、尿液検体又は患者の任意の検体からの細胞である。検体を選択的に前処理した後、検体に存在する可能性のあるOX40タンパク質と抗体との相互作用が許容される条件下で、検体を本発明の抗体と共にインキュベートし、抗OX40抗体を用いて検体中のOX40タンパク質の存在を検出することができる。
いくつかの実施形態では、細胞を含む検体は、患者体内から採取されてもよく、この患者は、がん患者又は診断対象の患者であってもよい。細胞は、腫瘍組織又は腫瘍塊、血液検体、尿液検体又は患者の任意の検体からの細胞である。検体を選択的に前処理した後、検体に存在する可能性のあるOX40タンパク質と抗体との相互作用が許容される条件下で、検体を本発明の抗体と共にインキュベートし、抗OX40抗体を用いて検体中のOX40タンパク質の存在を検出することができる。
本発明の抗体は、患者検体中のOX40を検出するためにも用いられ、そのため診断に用いられることができる。例えば、本発明の抗OX40抗体は、患者検体中のOX40レベルを検出するために、体外試験(例えばELISA)に用いられる。
一実施形態では、本発明の抗OX40抗体は、固体支持体(例えば微量滴定プレートのウェル)上に固定されている。固定された抗体を捕捉抗体として、試験検体に存在可能な任意のOX40を捕捉する。固定された抗体を患者検体に接触させる前に、固相担体を洗浄し、分析物の非特異的吸着を回避するために、ブロッキング試薬(例えば牛乳タンパク質又はアルブミン)を用いて処理する。その後、抗原を含む可能性のある試験検体又は標準量の抗原を含む溶液を用いて前記ウェルを処理する。このような検体は、例えば対象からの血清検体であり、ある病変を診断できると考えられる循環抗原レベルを有する可能性がある。試験検体又は標準品を洗浄した後、検出可能な標識の二次抗体を用いて固相支持体を処理する。標識の二次抗体は検出抗体として用いられる。検出可能な標識のレベルを測定し、標準検体によって構築された標準曲線と比較することによって、試験検体におけるOX40の濃度を決定する。
本発明の抗OX40抗体を用いて体外での診断試験から得られた結果に基づき、OX40及び/又はOX40Lの発現レベルに基づき、対象の疾患(例えば虚血、自己免疫性又は炎症疾病に関連する臨床症状)を分級することができる。特定の疾患については、疾患が進行中の複数の段階及び/又は疾患治療の複数の点にあると診断された対象から血液検体を採取する。進行又は療法の各段階に統計的に有意な結果を提供した検体群を用いて、各段階の特徴と考えられる抗原濃度範囲を決定する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載された抗OX40抗体又はその抗原結合断片を使用する時、抗体又はその断片は、薬物組成物の形態で存在する。ここで、薬物組成物は、抗OX40抗体又はその抗原結合断片と薬学的に許容しうる担体とからなることができる。本明細書で使用されるように、用語「薬学的に許容しうる担体」は、薬物の投与に適合する任意の全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌剤と抗真菌剤、等張化剤と吸収遅延剤などを含むことが意図されている。適切な担体は、最新版のRemington’s Pharmaceutical Sciencesに記述されている。このような担体又は希釈剤は、水、塩水、リンガー溶液、グルコース溶液及び/又は5%のヒト血清アルブミンを含むが、これらに限らない。
薬物組成物の調合は、その所望の投与経路に適合しなければならない。投与経路の例としては、非経口、例えば静脈内、皮内、皮下、経口(例えば吸入)、経皮(即ち局所)、経粘膜と直腸投与が挙げられる。非経口、皮内又は皮下投与用の溶液又は懸濁液は、例えば水、塩溶液、固定油、ポリエチレングリコール類、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒などの注射用無菌希釈剤、、例えばベンジルアルコール又はパラヒドロキシ安息香酸メチルなどの抗細菌剤、例えばアスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムなどの酸化防止剤、例えばエチレンジアミン四酢酸(EDTA)などのキレート剤、例えば酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩などの緩衝剤、及び例えば塩化ナトリウム又は右旋性グルコースなどの浸透圧調節用の試薬の成分を含んでもよい。pHは、酸又は塩基、例えば塩酸又は水酸化ナトリウムで調節することができる。非経口製剤をアンプル、ディスポーザブルシリンジ又はガラス又はプラスチック製の多投与量瓶に包装することができる。
注射用途に適した薬物組成物は、無菌水性溶液(ここでは水溶性)又は分散体及び無菌注射液又は分散体を即時に調製するための無菌粉末を含む。静脈内投与については、適切な担体は、生理食塩水、静菌水又はリン酸塩緩衝塩水(PBS)を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、無菌で注射しやすいものでなければならない。それは、製造及び保管条件下で安定でなければならず、例えば細菌や真菌などの微生物の汚染作用を防止することができなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセリン、プロピレングリコールと液体ポリエチレングリコールなど)を含む溶媒又は分散媒体、及びその適切な混合物であってもよい。いくつかの実施形態では、薬学的に許容しうる担体は、抗細菌剤及び/又は抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどを含んで実現されてもよい。いくつかの実施形態では、薬学的に許容しうる担体は、等張化剤、例えば糖、ポリオール(例えばエリトリトール、ソルビトール)、塩化ナトリウムを含んでもよい。
必要に応じて、抗体を所望の量で、上記の成分における1種又は複数種の組み合わせ(必要に応じて)を有する適切な溶媒に混ぜ込むことによって、無菌注射溶液を調製し、その後、濾過消毒することができる。上記の無菌溶液を凍結乾燥することにより粉末を得て、投与時に無菌注射溶液を調製するためにも用いることがもできる。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、免疫応答を活性化することができ、それによって感染の治療に用いられる。
感染は、病原性因子が生体組織に侵入し、それらの増殖及び宿主組織のこれらの生体及びそれらから産生する毒素に対する反応である。感染は、例えばウイルス、ウイロイド、プリオン、細菌、例えば寄生性回虫と蟯虫などの線虫、例えばマダニ、ダニ、ノミとシラミなどの節足動物、例えば癬などの真菌及び例えばサナダムシと他の蠕虫などの他の大寄生生物などの感染源によって誘発される可能性がある。ある態様では、感染源は、細菌、例えばグラム陰性菌である。ある態様では、感染源は、ウイルス、例えばDNAウイルス、RNAウイルスとレトロウイルスである。ウイルスは、特に限定されず、アデノウイルス、コクサッキーウイルス、EBウイルス、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス1型、単純ヘルペスウイルス2型、巨細胞ウイルス、ヒトヘルペスウイルス8型、HIV、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、耳下腺炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、パラインフルエンザウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器合胞体ウィルス、風疹ウイルス、水痘-帯状疱疹ウイルス含む。
本発明の抗体は、微生物によって誘発される感染症の治療に用いられ、又は微生物と免疫細胞に標的結合して微生物を死滅させることにより、微生物を除去する目的を達成することもできる。ある態様では、微生物は、RNAとDNAウイルスを含むウイルス、グラム陽性菌、グラム陰性菌、原生動物又は真菌である。
〔実施例1:OX40抗原及び対照抗体の生産と精製〕
(1.1 ヒト化OX40抗原の調製)
タンパク質データベースUniprotから、ヒトOX40のアミノ酸配列(P43489)を見つけ、ここでヒトOX40の細胞外領域のアミノ酸配列は、1~216残基であった。タンパク質データベースUniprotから、ヒトのIgG1-Fcのアミノ酸配列(P01857)が104~330残基であることを見つけた。その後、人工合成(ゼネラルモーターズ社)により、OX40とFcに対応するヌクレオチド配列を得て、酵素切断によって結合し、それをpCDNA3.0担体(Invitrogen社から購入)に挿入した。組み換えプラスミドpCDNA-OX40-hisとpCDNA-OX40-Fcを得た。さらに、上記プラスミドをPEIによってHEK293を一過性トランスフェクシしョンし、7日培養した後、上澄み液を収集し、最後に、精製によりhOX40-FCとhOX40-hisタンパク質検体を得て、以下の様々な実施例に用いた。
(1.1 ヒト化OX40抗原の調製)
タンパク質データベースUniprotから、ヒトOX40のアミノ酸配列(P43489)を見つけ、ここでヒトOX40の細胞外領域のアミノ酸配列は、1~216残基であった。タンパク質データベースUniprotから、ヒトのIgG1-Fcのアミノ酸配列(P01857)が104~330残基であることを見つけた。その後、人工合成(ゼネラルモーターズ社)により、OX40とFcに対応するヌクレオチド配列を得て、酵素切断によって結合し、それをpCDNA3.0担体(Invitrogen社から購入)に挿入した。組み換えプラスミドpCDNA-OX40-hisとpCDNA-OX40-Fcを得た。さらに、上記プラスミドをPEIによってHEK293を一過性トランスフェクシしョンし、7日培養した後、上澄み液を収集し、最後に、精製によりhOX40-FCとhOX40-hisタンパク質検体を得て、以下の様々な実施例に用いた。
(1.2 陽性対照抗体11D4とOX40mAb24の調製)
11D4の重鎖と軽鎖の配列は、米国特許US8236930に由来する。OX40mAb24の重鎖と軽鎖の配列は、米国特許US2016/0137740に由来する。人工合成により、上記対応するヌクレオチド配列を得て、そして、酵素切断によって結合し、重鎖のヌクレオチドと軽鎖のヌクレオチドをpCHO1.0プラスミドに(Invitrogenから購入)にそれぞれ結合し、完全抗体を発現するための組み換えプラスミドを得た。メーカーの説明書に基づいて、Freedom CHO-S試薬キット(Invitrogenから購入)を用いて、上記組み換えプラスミドをCHO-S細胞系に形質転換し、11日培養した後、上澄み液を収集し、最後に、精製により11D4とOX40mAb24抗体タンパク質検体を得て、以下の様々な実施例に用いた。
11D4の重鎖と軽鎖の配列は、米国特許US8236930に由来する。OX40mAb24の重鎖と軽鎖の配列は、米国特許US2016/0137740に由来する。人工合成により、上記対応するヌクレオチド配列を得て、そして、酵素切断によって結合し、重鎖のヌクレオチドと軽鎖のヌクレオチドをpCHO1.0プラスミドに(Invitrogenから購入)にそれぞれ結合し、完全抗体を発現するための組み換えプラスミドを得た。メーカーの説明書に基づいて、Freedom CHO-S試薬キット(Invitrogenから購入)を用いて、上記組み換えプラスミドをCHO-S細胞系に形質転換し、11日培養した後、上澄み液を収集し、最後に、精製により11D4とOX40mAb24抗体タンパク質検体を得て、以下の様々な実施例に用いた。
〔実施例2:抗OX40抗体の調製〕
表3に示される第1~11号の各抗体の可変領域、SEQ ID NO:90に示される重鎖定常領域、SEQ ID NO:91に示される軽鎖定常領域に従って、分子クローニング技術により、その対応する核酸配列をpCHO1.0プラスミドに(Invitrogenから購入)に挿入し、完全抗体を発現するための組み換えプラスミドを得た。メーカーの説明書に基づいて、Freedom CHO-S試薬キット(Invitrogenから購入)を用いて、上記組み換えプラスミドをCHO-S細胞系に形質転換し、11日培養した後、上澄み液を収集し、最後に、精製により、11株の抗体のタンパク質検体を得て、シーケンシングにより配列を確認し、以下の様々な実施例に用いた。
表3に示される第1~11号の各抗体の可変領域、SEQ ID NO:90に示される重鎖定常領域、SEQ ID NO:91に示される軽鎖定常領域に従って、分子クローニング技術により、その対応する核酸配列をpCHO1.0プラスミドに(Invitrogenから購入)に挿入し、完全抗体を発現するための組み換えプラスミドを得た。メーカーの説明書に基づいて、Freedom CHO-S試薬キット(Invitrogenから購入)を用いて、上記組み換えプラスミドをCHO-S細胞系に形質転換し、11日培養した後、上澄み液を収集し、最後に、精製により、11株の抗体のタンパク質検体を得て、シーケンシングにより配列を確認し、以下の様々な実施例に用いた。
ここで、重鎖定常領域の配列SEQ ID NO:90は、以下のとおりである:
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
軽鎖定常領域の配列SEQ ID NO:91は、以下のとおりである:
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
〔実施例3:抗ヒトOX40抗体の結合能力測定〕
(3.1 生物光学干渉により抗ヒトOX40抗体の親和性の測定)
ForteBio親和性測定は、従来の一般的な方法(Estep,PらMAbs,2013,5(2):270-8)に従う。概略プロセスは、以下のとおりであり、センサを例えばPBSなどの分析緩衝液で、、オフラインで20分間平衡化し、その後オンラインで60秒検出し、シグナルベースラインを確立し、オンラインで前述したように得られた精製後の抗体を該当するセンサ(ForteBio)上にロードし、最後に、ForteBio親和性測定を行った。ビオチン化された候補抗体をSAセンサで吸着し、hOX40-FCの結合及び解離を検出し、それぞれ約5minであり、結果を表4に示し、表4において、N.Dは、未検出を表す。最後に、いずれも1:1結合モデルを用いて、動態分析を行った。結果から、一部の本発明の抗体の親和性は、対照抗体の親和性よりも優れているか、又はそれに近いことが分かった。
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軽鎖定常領域の配列SEQ ID NO:91は、以下のとおりである:
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
〔実施例3:抗ヒトOX40抗体の結合能力測定〕
(3.1 生物光学干渉により抗ヒトOX40抗体の親和性の測定)
ForteBio親和性測定は、従来の一般的な方法(Estep,PらMAbs,2013,5(2):270-8)に従う。概略プロセスは、以下のとおりであり、センサを例えばPBSなどの分析緩衝液で、、オフラインで20分間平衡化し、その後オンラインで60秒検出し、シグナルベースラインを確立し、オンラインで前述したように得られた精製後の抗体を該当するセンサ(ForteBio)上にロードし、最後に、ForteBio親和性測定を行った。ビオチン化された候補抗体をSAセンサで吸着し、hOX40-FCの結合及び解離を検出し、それぞれ約5minであり、結果を表4に示し、表4において、N.Dは、未検出を表す。最後に、いずれも1:1結合モデルを用いて、動態分析を行った。結果から、一部の本発明の抗体の親和性は、対照抗体の親和性よりも優れているか、又はそれに近いことが分かった。
(3.2抗ヒトOX40抗体の細胞表面抗原の結合能力)
ヒトOX40 cDNAを有するpCMV担体をトランスフェクションすることにより、ヒトOX40を過剰発現するJurkat細胞(Jurkat-hOX40細胞)を産生した。Jurkat-hOX40細胞(0.5×106個の細胞)と100nMの実験抗体を0.1%BSAを含むPBSにて氷上で40分間インキュベートした。その後、細胞を2回洗浄し、二次抗体と0.1%BSAを含むPBSにて氷上で25分間インキュベートした。細胞を2回洗浄し、Accuri C6系(BD Biosciences)上でフローサイトメトリー分析を行い、その結果を図1に示す。
抗体-F23-4kと抗体-F23-32k、及び2つの対照抗体11D4とOX40mAb24など、異なる濃度の抗体でJurkat-hOX40細胞をインキュベートした。抗体濃度は、50nMから3倍下方希釈し、合計9つの濃度点であり、MFIを集計し、SoftMax Proを用いてデータを処理し、測定により、EC50値がそれぞれ、1.5nM、1.0nM、1.5nMと5nMであった。
ヒトOX40 cDNAを有するpCMV担体をトランスフェクションすることにより、ヒトOX40を過剰発現するJurkat細胞(Jurkat-hOX40細胞)を産生した。Jurkat-hOX40細胞(0.5×106個の細胞)と100nMの実験抗体を0.1%BSAを含むPBSにて氷上で40分間インキュベートした。その後、細胞を2回洗浄し、二次抗体と0.1%BSAを含むPBSにて氷上で25分間インキュベートした。細胞を2回洗浄し、Accuri C6系(BD Biosciences)上でフローサイトメトリー分析を行い、その結果を図1に示す。
抗体-F23-4kと抗体-F23-32k、及び2つの対照抗体11D4とOX40mAb24など、異なる濃度の抗体でJurkat-hOX40細胞をインキュベートした。抗体濃度は、50nMから3倍下方希釈し、合計9つの濃度点であり、MFIを集計し、SoftMax Proを用いてデータを処理し、測定により、EC50値がそれぞれ、1.5nM、1.0nM、1.5nMと5nMであった。
抗-CD3/CD28電磁ビーズ(Invitrogenから購入)を用いて、健常人由来のPBMC細胞(雷徳生物から購入)を48時間活性化し、0.5x106個の細胞をPBSにて、50nMの実験抗体と共にインキュベートし、40分間インキュベートした。そしてその後、細胞を2回洗浄し、anti-FC-PE二次抗体(ebioscienceから購入)とPBSにて氷上で30分間インキュベートした。細胞を2回洗浄し、フローサイトメトリーにより分析し、MFIを算出した。結果を表5に示す。
〔実施例4:抗ヒトOX40抗体の特異性〕
例3.2の方法と同様に、100nMの実験抗体と異なる抗原を過剰発現するJurkat細胞(Jurkat-TIM3、Jurkat-CTLA4、Jurkat-TIGIT)、CHO及びrajiをインキュベートし、その後、フローサイトメトリーで測定し、結果を図2に示す。結果から、抗体-F23-32kは、これらの抗原又は細胞株と有意に結合しておらず、特異性が良いことが示唆されることが分かった。
ELISAの方法を用いて、まず、10ngのマウスのOX40-his(mOX40-his)、hCD27-FC及びhOX40-hisをコーティングし、4℃で一晩し、洗浄後、さらに抗体-F23-32Kと対照抗体をインキュベートし、最後に、HRP標識二次抗体によって標識及び発色を行う。検出して得られたOD値を表6に示す。例3.2の方法と同様に、protein Aセンサ---Antibody---OX40-his(100nM)のプロセスグラムに従って設定し、Fortebioを用いて、抗体-F23-32Kと対照抗体及びアカゲザルOX40(Rh-OX40)との親和性を検出し、結果を表6に示す。上記結果から、抗体-F23-32Kは、hCD27(hOX40の同ファミリータンパク質)に結合せず、マウスのOX40にも結合しないが、アカゲザルのOX40に有意に結合していることが分かった。
例3.2の方法と同様に、100nMの実験抗体と異なる抗原を過剰発現するJurkat細胞(Jurkat-TIM3、Jurkat-CTLA4、Jurkat-TIGIT)、CHO及びrajiをインキュベートし、その後、フローサイトメトリーで測定し、結果を図2に示す。結果から、抗体-F23-32kは、これらの抗原又は細胞株と有意に結合しておらず、特異性が良いことが示唆されることが分かった。
ELISAの方法を用いて、まず、10ngのマウスのOX40-his(mOX40-his)、hCD27-FC及びhOX40-hisをコーティングし、4℃で一晩し、洗浄後、さらに抗体-F23-32Kと対照抗体をインキュベートし、最後に、HRP標識二次抗体によって標識及び発色を行う。検出して得られたOD値を表6に示す。例3.2の方法と同様に、protein Aセンサ---Antibody---OX40-his(100nM)のプロセスグラムに従って設定し、Fortebioを用いて、抗体-F23-32Kと対照抗体及びアカゲザルOX40(Rh-OX40)との親和性を検出し、結果を表6に示す。上記結果から、抗体-F23-32Kは、hCD27(hOX40の同ファミリータンパク質)に結合せず、マウスのOX40にも結合しないが、アカゲザルのOX40に有意に結合していることが分かった。
〔実施例5:抗OX40抗体の生物活性の検出〕
(5.1 NFκBレポーター遺伝子系を用いて候補抗体の体外活性化活性の検出)
例3.2のJurkat-hOX40を基礎として、pGL6-NFkB-lufiferas-reporterプラスミド(碧雲天から購入)を細胞に電気的に形質転換し、最後に、抗生物質の加圧スクリーニングにより、安定したモノクローナル株を得て、Jurkat-hOX40-NFκBと命名した。細胞を蘇生させ、3回継代、その後20x104細胞/ウェルに従ってプレートに塗布し、1ウェルあたりに60μlの培地であり、該当する1μg/mlの実験抗体と2.5μg/mlのanti-FC抗体(ヤギ抗ヒト、invitrogenから購入)を加え、5時間インキュベートし、その後50μlの蛍光反応物(ONE-GloTM Luciferase Assay System、promega社から購入)をウェルごとに加え、結果を図3に示す。データから分かるように、1μg/mlの濃度下で実験抗体の活性化シグナルは、いずれも対照抗体より強い。
(5.1 NFκBレポーター遺伝子系を用いて候補抗体の体外活性化活性の検出)
例3.2のJurkat-hOX40を基礎として、pGL6-NFkB-lufiferas-reporterプラスミド(碧雲天から購入)を細胞に電気的に形質転換し、最後に、抗生物質の加圧スクリーニングにより、安定したモノクローナル株を得て、Jurkat-hOX40-NFκBと命名した。細胞を蘇生させ、3回継代、その後20x104細胞/ウェルに従ってプレートに塗布し、1ウェルあたりに60μlの培地であり、該当する1μg/mlの実験抗体と2.5μg/mlのanti-FC抗体(ヤギ抗ヒト、invitrogenから購入)を加え、5時間インキュベートし、その後50μlの蛍光反応物(ONE-GloTM Luciferase Assay System、promega社から購入)をウェルごとに加え、結果を図3に示す。データから分かるように、1μg/mlの濃度下で実験抗体の活性化シグナルは、いずれも対照抗体より強い。
上記で述べた方法に従って、1つのウィンドウ値がより大きなJurkat-hOX40-NFκB-2細胞を再構築し、抗体の活性化活性を検証するために用いられる。活性化標的受容体に対する抗体は、活性化活性を強力に発揮しようとすると、Fc-Rの関与が必要であることがある研究で示唆されている。上記方法と同様に、Jurkat-hOX40-NFκB-2細胞を蘇生させ、3回継代し、その後4x104細胞/ウェルに従ってプレートに塗布し、1ウェルあたりに60μlの培地であり、該当する実験抗体と4万個のraji細胞(その表面に一定のFc-受容体(即ちFc-R)を天然に有する)をウェルごとに加え、4.5時間インキュベートした後、50μlの蛍光反応物をウェルごとに加え、結果を表7に示す。データから、raji細胞が存在する場合、候補抗体の活性化活性を有意に向上させることができることが示唆された。
上記方法と同様に、Jurkat-hOX40-NFκB-2細胞を蘇生させ、3回継代し、その後4x104細胞/ウェルに従ってプレートに塗布し、1ウェルあたりに60μlの培地であった。まず、実験抗体とprotein A/Gを1:1に従って2minインキュベートし、開始濃度を1.5μg/mlとし、その後勾配希釈し、結果を図4に示す。抗体-F23-32kと11D4のEC50は、それぞれ0.1405μg/mlと0.2261μg/mlであった。
(5.2 活性化されたPBMCのIL-2の分泌に対する抗体の影響の検出)
本発明の抗OX40抗体のアゴニスト活性は、T細胞活性化後にT細胞から放出される炎症性サイトカインを測定することによって評価される。PBMC取得後、20万個/ウェルに従ってプレートに塗布し、200μlの培地を96ウェルプレートに塗布し、80μg/mlのSEBを加えてPBMCを活性化させ、2日後、PBMCを収集した。洗浄後、20万個/ウェルに従ってプレートに塗布し、200μlの培地であり、さらに1μg/mlの候補抗体又は対照抗体と2μg/mlのanti-FC抗体(ヤギ抗ヒト、invitrogenから購入)を加えた。3日後、ELISA試薬キットにより培地中のIL-2分泌レベルを検出し、結果を図5に示す。上記操作と同様に、まず、1μg/mlの候補抗体又は対照抗体を4℃でプレートに一晩コーティングし、プレートを3回洗浄した後、活性化されたPBMCをプレートに塗布し、20万個/ウェルに従ってプレートに塗布し、200μlの培地であった。3日後、ELISA試薬キット(欣博盛から購入)により培地中のIL-2分泌レベルを測定し、結果を図5に示す。データから、本発明の抗体-F23-32kが陽性対照に相当することが示唆された。
本発明の抗OX40抗体のアゴニスト活性は、T細胞活性化後にT細胞から放出される炎症性サイトカインを測定することによって評価される。PBMC取得後、20万個/ウェルに従ってプレートに塗布し、200μlの培地を96ウェルプレートに塗布し、80μg/mlのSEBを加えてPBMCを活性化させ、2日後、PBMCを収集した。洗浄後、20万個/ウェルに従ってプレートに塗布し、200μlの培地であり、さらに1μg/mlの候補抗体又は対照抗体と2μg/mlのanti-FC抗体(ヤギ抗ヒト、invitrogenから購入)を加えた。3日後、ELISA試薬キットにより培地中のIL-2分泌レベルを検出し、結果を図5に示す。上記操作と同様に、まず、1μg/mlの候補抗体又は対照抗体を4℃でプレートに一晩コーティングし、プレートを3回洗浄した後、活性化されたPBMCをプレートに塗布し、20万個/ウェルに従ってプレートに塗布し、200μlの培地であった。3日後、ELISA試薬キット(欣博盛から購入)により培地中のIL-2分泌レベルを測定し、結果を図5に示す。データから、本発明の抗体-F23-32kが陽性対照に相当することが示唆された。
〔実施例6:抗OX40抗体生物活性に対するFc突然変異の増強〕
人工合成によって、2つのIgG1-Fc突然変異配列を得て、それぞれRY(E345RとS440Y)とR(E345R)で、IgG1-FC-RY(SEQ ID NO:88)とIgG1-FC-R(SEQ ID NO:89)とそれぞれ命名され、配列を表8に示す(下線は、突然変異位置を表す)。抗体-F23-32kに対してRY又はR突然変異を行い、得られた抗体を32k-RYと32k-Rとそれぞれ命名した。また、HPLC検証を経て、遊離状態で、主にモノマーとして存在した。Jurkat-hOX40-NFκB-2とJurkat-hOX40-NFκB細胞を蘇生させ、それぞれ以下の実験に用いた。例5.1の操作と同様に、細胞を3回継代し、その後4x104又は20万細胞/ウェルに従ってプレートに塗布し、該当する抗体(1μg/ml)、抗体突然変異体(1μg/ml)、raji細胞(1ウェルあたり1万個の細胞)又はprotein A(1μg/ml、生工生物工程(Sangon Biotech)から購入)を加えた。96ウェルに添加した検体レジメンと組み合わせを具体的に図6に示し、結果も図6に示す。RY又はR突然変異を含む抗体は、protein Aが存在しない場合もOX40のシグナルを有意に活性化することができ、かつ野生型の抗体よりも10倍前後強い。
人工合成によって、2つのIgG1-Fc突然変異配列を得て、それぞれRY(E345RとS440Y)とR(E345R)で、IgG1-FC-RY(SEQ ID NO:88)とIgG1-FC-R(SEQ ID NO:89)とそれぞれ命名され、配列を表8に示す(下線は、突然変異位置を表す)。抗体-F23-32kに対してRY又はR突然変異を行い、得られた抗体を32k-RYと32k-Rとそれぞれ命名した。また、HPLC検証を経て、遊離状態で、主にモノマーとして存在した。Jurkat-hOX40-NFκB-2とJurkat-hOX40-NFκB細胞を蘇生させ、それぞれ以下の実験に用いた。例5.1の操作と同様に、細胞を3回継代し、その後4x104又は20万細胞/ウェルに従ってプレートに塗布し、該当する抗体(1μg/ml)、抗体突然変異体(1μg/ml)、raji細胞(1ウェルあたり1万個の細胞)又はprotein A(1μg/ml、生工生物工程(Sangon Biotech)から購入)を加えた。96ウェルに添加した検体レジメンと組み合わせを具体的に図6に示し、結果も図6に示す。RY又はR突然変異を含む抗体は、protein Aが存在しない場合もOX40のシグナルを有意に活性化することができ、かつ野生型の抗体よりも10倍前後強い。
〔実施例7:ヒト化マウスにMC38腫瘍を接種したモデルにより、腫瘍抑制に対するanti-抗OX40抗体の能力の検証〕
OX40ヒト化マウスモデル(百奥賽図から購入)において、本発明の抗OX40抗体の抗腫瘍効果を検証した。MC38腫瘍細胞を5×105個/0.1mLの濃度でB-hOX40のヒト化雌性マウスの右側皮下に接種し、腫瘍が119mm3まで成長する時に、腫瘍体積に従ってランダムに群分けし、1群あたりに6匹であった。抗体を腹腔内投与し、Q3D(3日ごとに1回)の頻度に従って投与し、3mg/kgであり、合計6回投与し、PBSを陰性対照とした。
OX40ヒト化マウスモデル(百奥賽図から購入)において、本発明の抗OX40抗体の抗腫瘍効果を検証した。MC38腫瘍細胞を5×105個/0.1mLの濃度でB-hOX40のヒト化雌性マウスの右側皮下に接種し、腫瘍が119mm3まで成長する時に、腫瘍体積に従ってランダムに群分けし、1群あたりに6匹であった。抗体を腹腔内投与し、Q3D(3日ごとに1回)の頻度に従って投与し、3mg/kgであり、合計6回投与し、PBSを陰性対照とした。
全研究期間にわたって腫瘍と体重を週に2回測り、腫瘍が終点に達した時、又はマウスが20%体重減少した時、マウスを安楽死させた。各群に対して、デジタルノギスを用いて平均腫瘍体積を推定し、以下の式によって腫瘍体積(mm3)を算出し、各群の(幅)2×長さ/2は約50mm3であった。結果を図7に示す。図7において、TGI%は、腫瘍体積に対する抑制率であり、その計算式は、:TGI%=(1-(mean RTV投与群)/(mean RTV対照群))×100%であり、mean RTV投与群は、投与群のRTV平均値であり、mean RTV対照群は、対照群のRTV平均値であり、RTVn=Vnt/Vn0であり、Vntは、番号がnであるマウスのt日目の腫瘍体積でり、Vn0は、番号がnであるマウスの0日目の腫瘍体積であり、RTVnは、番号がnであるマウスのt日目の腫瘍相対体積であり、抗体4K-RYの重鎖は、抗体-F23-4kのFC突然変異(E345RとS440Y)から得られた。
実験抗体の投与後、腫瘍に浸潤したT細胞(TIL)に対する影響をさらに了解するためである。上記実験が終了した後、適切なマウスを選択し、1群あたりに4匹であった。従来の解剖手段により、腫瘍に浸潤したリンパT細胞、及び血液中のリンパT細胞を取得した。さらに異なるマーカーを用いて細胞に対して蛍光標識を行い、最後に、フローセルソーターを用いて蛍光検出を行った。結果から、本発明の実験抗体が腫瘍内部CD4+とCD8+T細胞の割合を増加させることが分かった。一方、血液中のCD4+とCD8+T細胞の割合に影響を与えなかった。
〔実施例8〕
1)候補抗体の親和性成熟及び親和性測定
表9に抗体-F23-32KのCDRのいくつかの突然変異を示し、ここで、下線のアミノ酸は、変異部位とした。表10には、これらのアミノ酸の変異の8つの完全抗体のCDRが挙げられ、残りの配列は、抗体-F23-32Kと同じであった。BIACOREを用いて、それらの親和性を測定し、具体的なプローは、まずプローブを用いて抗体に結合し、20nMのOX40-hisの結合と解離を検出した。結果を表11に示し、ここで抗体Mの親和性は、約70倍向上し、0.16nMに達し、OX40mAb24の親和性より約21倍高く、11D4の抗体より約9倍高かった。上記方法と同様に、異なる濃度のWEST+VGTDとST+VGTD抗体を用いて、OX40を過剰発現するjurkat細胞をインキュベートし、得られたEC50値は、それぞれ、1.2nMと1.3nMであり、結果を図8に示す。抗OX40抗体(抗体M)の配列は、表12に示すとおりであり、ここで、上記抗体(抗体Mを含む)に用いられる発現細胞は、CHO-S細胞であり、抗体M-KFの調製方法は、抗体M-KFと抗体Mのアミノ酸配列が同じであり、fut8遺伝子がノックアウトされたCHO細胞株を用いて発現した(抗体M-KFのフコース含有量は約0%であった)。
1)候補抗体の親和性成熟及び親和性測定
表9に抗体-F23-32KのCDRのいくつかの突然変異を示し、ここで、下線のアミノ酸は、変異部位とした。表10には、これらのアミノ酸の変異の8つの完全抗体のCDRが挙げられ、残りの配列は、抗体-F23-32Kと同じであった。BIACOREを用いて、それらの親和性を測定し、具体的なプローは、まずプローブを用いて抗体に結合し、20nMのOX40-hisの結合と解離を検出した。結果を表11に示し、ここで抗体Mの親和性は、約70倍向上し、0.16nMに達し、OX40mAb24の親和性より約21倍高く、11D4の抗体より約9倍高かった。上記方法と同様に、異なる濃度のWEST+VGTDとST+VGTD抗体を用いて、OX40を過剰発現するjurkat細胞をインキュベートし、得られたEC50値は、それぞれ、1.2nMと1.3nMであり、結果を図8に示す。抗OX40抗体(抗体M)の配列は、表12に示すとおりであり、ここで、上記抗体(抗体Mを含む)に用いられる発現細胞は、CHO-S細胞であり、抗体M-KFの調製方法は、抗体M-KFと抗体Mのアミノ酸配列が同じであり、fut8遺伝子がノックアウトされたCHO細胞株を用いて発現した(抗体M-KFのフコース含有量は約0%であった)。
2)抗体の抗原結合特異性の検出
ELISA方法を用いて抗体M-KFとヒト及びカニクイザルのOX40との結合能力を測定した。試験方法は、まず、ヒト又はカニクイザルのOX40を4℃で一晩コーティングし、その濃度を2ug/mlとし、異なる濃度の抗体M-KFをインキュベートして検出した。抗体M-KFの開始濃度は、1μg/ml又は2μg/mlであり、2倍の勾配で希釈した。
ELISA方法を用いて抗体M-KFとヒト及びカニクイザルのOX40との結合能力を測定した。試験方法は、まず、ヒト又はカニクイザルのOX40を4℃で一晩コーティングし、その濃度を2ug/mlとし、異なる濃度の抗体M-KFをインキュベートして検出した。抗体M-KFの開始濃度は、1μg/ml又は2μg/mlであり、2倍の勾配で希釈した。
結果から分かるように、抗体M-KFは、ヒト及びカニクイザルのOX40に結合することができ、結合したEC50値がそれぞれ、約0.0340ng/mlと0.0352ng/mlであった。
〔実施例9:抗体のADCCエフェクターと体外活性化活性〕
抗体Mのフコース含有量は、約96%であった。抗体M-KFのフコース含有量は、約0%であった。jurkat細胞上にFC-RIIIAとNF-ATレポーター遺伝子を形質転換し、Jurkat-ADCC細胞を得た。Jurkat-hOX40細胞とjurkat-ADCC細胞を1:1に従って混合し、該当する濃度勾配の抗体Mと抗体M-KFを加え、結果を図9に示す。上述した方法(実施例5)のように、NFκBレポーター遺伝子系を用いて、候補抗体の体外活性化活性を検出した。Jurkat-hOX40-NFκB-2細胞を蘇生させ、3回継代し、その後4x104個の細胞/ウェルに従ってプレートに塗布し、1ウェルあたりに60μlの培地であり、該当する実験抗体と4万個のraji細胞を加え、結果を図10に示す。抗体M、抗体M-KFのEC50値は、11D4よりも少し良く、しかし、前両者の活性化ピーク値は、後者の約2.5倍であった。
抗体Mのフコース含有量は、約96%であった。抗体M-KFのフコース含有量は、約0%であった。jurkat細胞上にFC-RIIIAとNF-ATレポーター遺伝子を形質転換し、Jurkat-ADCC細胞を得た。Jurkat-hOX40細胞とjurkat-ADCC細胞を1:1に従って混合し、該当する濃度勾配の抗体Mと抗体M-KFを加え、結果を図9に示す。上述した方法(実施例5)のように、NFκBレポーター遺伝子系を用いて、候補抗体の体外活性化活性を検出した。Jurkat-hOX40-NFκB-2細胞を蘇生させ、3回継代し、その後4x104個の細胞/ウェルに従ってプレートに塗布し、1ウェルあたりに60μlの培地であり、該当する実験抗体と4万個のraji細胞を加え、結果を図10に示す。抗体M、抗体M-KFのEC50値は、11D4よりも少し良く、しかし、前両者の活性化ピーク値は、後者の約2.5倍であった。
〔実施例10:抗体の体外薬力学試験〕
前述したように、OX40ヒト化マウスモデル(百奥賽図から購入)において、本発明の抗OX40抗体の抗腫瘍効果を検証した。MC38腫瘍細胞を5×105個/0.1mLの濃度でB-hOX40のヒト化雌性マウスの右側皮下に接種し、腫瘍成長が119mm3まで成長する時に、腫瘍体積に従ってランダムに群分けし、1群あたりに6匹であった。発現及び精製により一連のエンドトキシンを含まない抗体、抗体Mと抗体M-KFを得て、腹腔内投与し、Q3Dの頻度に従って、3つの用量群1mg/kg、0.2mg/kg、0.04mg/kgに分けられ、合計6回投与した。
前述したように、OX40ヒト化マウスモデル(百奥賽図から購入)において、本発明の抗OX40抗体の抗腫瘍効果を検証した。MC38腫瘍細胞を5×105個/0.1mLの濃度でB-hOX40のヒト化雌性マウスの右側皮下に接種し、腫瘍成長が119mm3まで成長する時に、腫瘍体積に従ってランダムに群分けし、1群あたりに6匹であった。発現及び精製により一連のエンドトキシンを含まない抗体、抗体Mと抗体M-KFを得て、腹腔内投与し、Q3Dの頻度に従って、3つの用量群1mg/kg、0.2mg/kg、0.04mg/kgに分けられ、合計6回投与した。
全研究期間にわたって腫瘍と体重を週に2回測り、腫瘍が終点に達した時、又はマウスが20%体重減少した時、マウスを安楽死させた。各群に対して、デジタルノギスを用いて平均腫瘍体積を推定し、以下の式によって腫瘍体積(mm3)を算出し、各群の(幅)2×長さ/2は、約50mm3であり、結果を図11に示し、ここで、21日目の結果を図12に示す。抗体Mと抗体M-KFの高用量群は、腫瘍の成長を顕著に抑制することができ(P<0.05)、かつ効果も11D4の高用量群より明らかに良かった。抗体M-KFの中用量群は、腫瘍の成長を顕著に抑制することもできる(P<0.05)。
〔実施例11:抗体のADCCエフェクター(PBMC法)〕
Jurkat-hOX40細胞をターゲット細胞とし、健常人由来のPBMCをエフェクター細胞とした。PBMCとJurkat-OX40細胞を25:1の量比で混合し、抗体M-KF又は抗体M(開始濃度を1μg/mlとし、4倍の勾配で希釈したもの)を加え、37℃下で4hインキュベートし、その後試薬キットCytoTox 96(登録商標) Non-Radioactive Cytotoxicity Assay(Promega)を用いて該当するシグナルを測定し、この系により抗体のADCC媒介の生細胞傷害作用を検出した。
Jurkat-hOX40細胞をターゲット細胞とし、健常人由来のPBMCをエフェクター細胞とした。PBMCとJurkat-OX40細胞を25:1の量比で混合し、抗体M-KF又は抗体M(開始濃度を1μg/mlとし、4倍の勾配で希釈したもの)を加え、37℃下で4hインキュベートし、その後試薬キットCytoTox 96(登録商標) Non-Radioactive Cytotoxicity Assay(Promega)を用いて該当するシグナルを測定し、この系により抗体のADCC媒介の生細胞傷害作用を検出した。
結果を図13に示し、抗体M-KFは、明らかなADCC作用を持ち、EC50は、約1.891ng/mlであり、抗体Mより2倍強であった。
〔実施例12:活性化されたPBMCのIL-2の分泌に対する抗体の影響の検出〕
ELISAの方法を用いて、IL-2サイトカインの放出を検出することによって、抗体M-KFの外来刺激下のヒト末梢血単核細胞(PBMC)に対する活性化エフェクターを検出した。まず、SEB(ブドウ球菌エンテロトキシンB)でPBMCを24h刺激し、異なる濃度の抗体M-KF又は参照抗体11D4を加え、3日続けてインキュベートし、最後に、Human IL-2 ELISA development kit(HRP)試薬キット(Mabtech、品番3445-1H-20)を用いて、PBMCから分泌されたIL-2を検出した。
ELISAの方法を用いて、IL-2サイトカインの放出を検出することによって、抗体M-KFの外来刺激下のヒト末梢血単核細胞(PBMC)に対する活性化エフェクターを検出した。まず、SEB(ブドウ球菌エンテロトキシンB)でPBMCを24h刺激し、異なる濃度の抗体M-KF又は参照抗体11D4を加え、3日続けてインキュベートし、最後に、Human IL-2 ELISA development kit(HRP)試薬キット(Mabtech、品番3445-1H-20)を用いて、PBMCから分泌されたIL-2を検出した。
結果を図14に示し、0.32μg/ml又はそれ以上の濃度下で、抗体M-KFによってPBMCを刺激してIL-2を分泌する量は、陰性対照IgG1の約4倍であった。
〔実施例13:非活性化条件下でのPBMCサイトカイン放出に対する抗体の影響の検出〕
ELISAの方法を用いて、IL-2、INF-γ、IL-6、TNF-αサイトカインの放出を検出することによって、外来刺激無しのヒトPBMCに対する抗体M-KFの活性化エフェクターを検出し、その安全性を考察した。抗体M-KF作用機序の最終目的は、T細胞を活性化することにより、免疫系を刺激し、免疫機能を増強させることである。安全性の観点から考えると、このような抗体は、生体免疫系の過度活性化を招き、それによってサイトカインストームを誘発するおそれがある。IL-2、INF-γ、IL-6、TNF-αは、いずれもサイトカインストームの発生時に、よく見られる大量産生する因子の1つであり、これらの因子を選択して検出を行った。
ELISAの方法を用いて、IL-2、INF-γ、IL-6、TNF-αサイトカインの放出を検出することによって、外来刺激無しのヒトPBMCに対する抗体M-KFの活性化エフェクターを検出し、その安全性を考察した。抗体M-KF作用機序の最終目的は、T細胞を活性化することにより、免疫系を刺激し、免疫機能を増強させることである。安全性の観点から考えると、このような抗体は、生体免疫系の過度活性化を招き、それによってサイトカインストームを誘発するおそれがある。IL-2、INF-γ、IL-6、TNF-αは、いずれもサイトカインストームの発生時に、よく見られる大量産生する因子の1つであり、これらの因子を選択して検出を行った。
活性化処理されていないヒトPBMCと異なる濃度の抗体M-KF又はCD28抗体を共にインキュベートし、抗体の開始濃度を200μg/mlとし、3倍勾配に従って希釈した。最後に、Mabtech社の該当するサイトカイン検出試薬キットを用いて、PBMCから分泌されたIL-2、INF-γ、IL-6、TNF-αを検出した。
図15に示すように、陽性対照CD28抗体と比較して、抗体M-KFは、200μg/mL及びそれ以下の濃度で、いずれも外来刺激無しのPBMCからIL-2、INF-γ、IL-6、TNF-αを産生させることができず、抗体M-KFは、一定の安全性を持つと予想される。
本明細書で引用された全ての出版物と特許文献は、あたかも、各出版物又は文献が具体的かつ個々に参照により本明細書に組み込まれるように、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。上記出版物と特許文献についての引用は、上述したいかなる内容が関連する先行技術であることを認めることを示すものではなく、その内容又は日付を認めることを示すものではない。ここで、本発明を明細書の方式で説明したが、当業者であれば、本発明を様々な実施形態で実施することができ、上記した明細書と実施例は、本発明の特許請求の範囲を限定するものではなく、説明するものが意図されていることを、認識するであろう。
Claims (17)
- 抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗体又はその断片は、OX40に特異的に結合し、前記抗体又はその断片は、
(a)SEQ ID NO:1、4、10、16、104又は22に示されるVH CDR1、
(b)SEQ ID NO:2、5、7、8、11、13、14、17、20、23又は26に示されるVH CDR2、
(c)SEQ ID NO:3、6、9、12、15、18、21、24又は27に示されるVH CDR3、
(d)SEQ ID NO:28、31、37、40、43、46、49、52、55、58又は61に示されるVL CDR1、
(e)SEQ ID NO:19、25、29、32、35、38、44、47、50、56、59又は62に示されるVL CDR2、
(f)SEQ ID NO:30、33、34、36、39、41、42、45、48、51、53、54、57、60又は63に示されるVL CDR3のうちの1種又は複数種のアミノ酸配列を含む、ことを特徴とする抗体又はその抗原結合断片。 - 前記抗体又はその断片は、
SEQ ID NO:10に示されるVH CDR1、
SEQ ID NO:7、11、13又は26に示されるVH CDR2、
SEQ ID NO:12又は27に示されるVH CDR3、
SEQ ID NO:37、43又は61に示されるVL CDR1、
SEQ ID NO:19、25、38、44又は62に示されるVL CDR2、及び
SEQ ID NO:34、39、41、45、53又は63に示されるVL CDR3を含む、ことを特徴とする請求項1に記載の抗体又はその断片。 - 前記抗体又はその断片は、SEQ ID NO:10に示されるVH CDR1、SEQ ID NO:26に示されるVH CDR2、SEQ ID NO:27に示されるVH CDR3、SEQ ID NO:61に示されるVL CDR1、SEQ ID NO:25に示されるVL CDR2、及びSEQ ID NO:34に示されるVL CDR3を含む、ことを特徴とする請求項1に記載の抗体又はその断片。
- 抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗体又はその断片は、重鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、SEQ ID NO:64~72に示されるいずれか1つのアミノ酸配列、又はSEQ ID NO:64~72に示されるいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するペプチドを含み、及び/又は
前記抗体又はその断片は、軽鎖可変領域をさらに含み、前記軽鎖可変領域は、SEQ ID NO:73~84に示されるいずれか1つのアミノ酸配列、又はSEQ ID NO:73~84に示されるいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するペプチドを含む、ことを特徴とする抗体又はその抗原結合断片。 - 抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗体又はその断片は、SEQ ID NO:72に示される重鎖可変領域と、SEQ ID NO:84に示される軽鎖可変領域とを含む、ことを特徴とする抗体又はその抗原結合断片。
- 前記抗体又はその断片は、重鎖定常領域及び/又は軽鎖定常領域を含み、前記重鎖定常領域は、SEQ ID NO:88、89又は90に示される重鎖定常領域であり、及び/又は前記軽鎖定常領域は、SEQ ID NO:91に示される軽鎖定常領域である、ことを特徴とする請求項1~5のいずれか1項に記載の抗体又はその断片。
- 抗体であって、前記抗体は、SEQ ID NO:86に示される重鎖、及びSEQ ID NO:87に示される軽鎖を含む、ことを特徴とする抗体。
- 前記抗体又はその断片のOX40に対する親和性数値KD≦5nMである、ことを特徴とする請求項1~7に記載の抗体又はその断片。
- 前記抗体のフコース含有量は、10%を超えない、ことを特徴とする請求項1~8のいずれか1項に記載の抗体又はその断片。
- 前記抗体は、fut8遺伝子がノックアウトされたCHO細胞により発現される、ことを特徴とする請求項1~8のいずれか1項に記載の抗体又はその断片。
- 前記抗体のフコース含有量は、0%である、ことを特徴とする請求項10に記載の抗体又はその断片。
- ポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドは、請求項1~11のいずれか1項に記載の抗体又はその断片をコードする、ことを特徴とするポリヌクレオチド。
- 細胞であって、前記細胞は、請求項1~11のいずれか1項に記載の抗体又はその断片をコードする1種又は複数種のポリヌクレオチドを含む、ことを特徴とする細胞。
- 組成物であって、前記組成物は、請求項1~11のいずれか1項に記載の抗体又はその断片、請求項12に記載のポリヌクレオチド又は請求項13に記載の細胞、及び薬学的に許容しうる担体を含む、ことを特徴とする組成物。
- 必要とされる患者において、がん又は感染を治療する方法であって、前記方法は、前記患者に有効量の請求項1~11のいずれか1項に記載の抗体又はその断片を投与することを含む、ことを特徴とする方法。
- 前記がんは、非ホジキンリンパ腫、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、乳がん、卵巣がん、頭頸部がん、膀胱がん、黒色腫、結腸直腸がん、膵臓がん、肺がん、平滑筋腫、平滑筋肉腫、神経膠腫、神経膠芽腫、前立腺がん、食道がん、肝臓がんと腎臓がんから選択される、ことを特徴とする請求項15に記載の方法。
- 前記方法は、前記患者に第2のがん治療剤を投与することをさらに含む、ことを特徴とする請求項15に記載の方法。
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