CN116640224A - Cd137抗体和cd40l的融合蛋白及其应用 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了一种融合蛋白，用于制备此类融合蛋白的方法及其用途，所述融合蛋白包含能特异性结合4‑1BB分子的Fab片段；和能特异性结合CD40分子的CD40L，所述第一CD40L的N端通过第一肽接头与所述Fab片段的轻链或重链的C端连接。本申请的CD137抗体和CD40L的融合蛋白能够与CD40特异性结合，具有诱导树突状细胞成熟、活化淋巴细胞等效果，可用于治疗肿瘤和免疫相关疾病；同时CD137抗体和CD40L的融合蛋白可以靶向4‑1BB并激活4‑1BB的信号转导通路，增强免疫反应。

Description

CD137抗体和CD40L的融合蛋白及其应用
技术领域
本申请涉及免疫学领域，更具体地，涉及CD137抗体和CD40L 的融合蛋白及其应用。
背景技术
CD40是TNF受体(TNFR)超家族的成员，主要在B细胞和其他抗原呈递细胞(APC)，如树突状细胞(DC)和巨噬细胞上表达。 CD40配体(CD40L)主要由活化的T细胞上表达。CD40和CD40L 的相互作用是T细胞活化的共刺激信号。静息B细胞上的CD40- CD40L相互作用能诱导B细胞增殖、免疫球蛋白类别转变和抗体分泌，并且对生发中心的发展和记忆性B细胞的存活都有影响，这些都是体液免疫应答必不可少的(Kehry MR.,J Immunol 1996； 156：2345-2348)。树突状细胞上的CD40与CD40L结合可诱导DC 的成熟，这表现在共刺激分子，如B7家族(CD80，CD86)的表达增加，以及促炎细胞因子，如白细胞介素12的产生，这将导致显著的T细胞应答(Stout RD等人，J Immunol 1996；17：487-492；Brendan O′Sullivan等人，Critical Reviews in Immunology 2003；23：83-97； Cella M等人，J Exp Med 1996；184:747-452)。
CD137(4-1BB)也是TNFR家族的成员，又叫4-1BB，并且是 CD8+和CD4+T细胞、调节性T细胞(Treg)、自然杀伤T细胞(NK(T) 细胞)、B细胞和嗜中性粒细胞上的共刺激分子。在T细胞上，CD137 不是组成型表达，而是在T细胞受体(TCR)激活后被诱导表达，例如，在肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)上表达(Gros等人，J.Clin Invest 2014； 124(5):2246-59))。
现有技术中已经公开了一些刺激CD137的抗体，包括乌瑞芦单抗(urelumab)，一种人IgG4抗体(AU2004279877)和乌托鲁单抗 (utomilumab)，一种人IgG2抗体(Fisher等人，2012Cancer Immunol. Immunother.61:1721-1733)。
Westwood JA等人，Leukemia Research 38(2014),948-954公开了“在小鼠myc驱动的血液癌症中的联合抗CD137和抗CD40抗体治疗(Combination anti-CD137and antiCD40 antibody therapy in murine myc-driven hematological cancers)”。
US20090074711公开了“使用嵌合激动性抗人CD40抗体的人体治疗(Humantherapies using chimeric agonistic anti-human CD40 antibody)”。
尽管如此，但本领域内仍需要可以针对CD40和CD137两者的融合蛋白，以便激活表达这些分子的细胞，从而进行更有针对性的免疫诱导。
发明内容
为解决上述技术问题，本申请提供了能特异性结合CD40和4- 1BB的新型CD137抗体和CD40L的融合蛋白。具体而言，本申请提供了以下技术方案：
在第一方面，本申请提供了一种融合蛋白，其包含：
a)能特异性结合4-1BB分子的Fab片段；
b)能特异性结合CD40分子的第一CD40L，所述第一CD40L 的N端通过第一肽接头与所述Fab片段的轻链或重链的C端连接。
在一些实施方案中，所述融合蛋白还包含：
c)能特异性结合CD40分子的第二CD40L，所述第二 CD40L的N端通过第二肽接头与所述Fab片段的重链或轻链的C 端连接。
在一些实施方案中，所述第一肽接头和所述第二肽接头之间仅能形成一个二硫键，并且各自独立地选自以下：包含SEQ ID NO： 2425所示序列中的任一种的肽接头，其中X代表除Cys的任意氨基酸，或者缺失。
在一些实施方案中，所述第一肽接头和/或所述第二肽接头可以为天然抗体的铰链区，其中可以对铰链区进行仅保留一个半胱氨酸的突变。
在一些实施方案中，所述第一肽接头和/或所述第二肽接头为 C239缺失突变的IgG1铰链区，或C239缺失突变，且铰链区D234- S252倒转的IgG1铰链区。
在一些实施方案中，所述融合蛋白还包含：
d)能特异性结合CD40分子的第三CD40L，所述第三CD40L 的N端通过第三肽接头与所述第一CD40L或所述第二CD40L的 C端连接。
在一些实施方案中，所述第三肽接头包含SEQ ID NO：5和/ 或SEQ ID NO:6所示的序列。
在一些实施方案中，所述融合蛋白还包含：
e)FcBP，其中所述FcBP与所述第一CD40L、第二CD40L和第三CD40L中的任一者或多者连接。
优选地，FcBP包含SEQ ID NO：15所示的序列或由其组成。
在一些实施方案中，所述4-1BB分子和CD40分子独立地来源于哺乳动物，优选非人类的灵长类或者人类。
在一些实施方案中，所述Fab片段包含SEQ ID NO：7所示的 HCDR1，SEQ ID NO：8所示的HCDR2，SEQ ID NO：9所示的 HCDR3。
在一些实施方案中，所述Fab片段包含SEQ ID NO：13所示的重链可变区。
在一些实施方案中，所述Fab片段包含SEQ ID NO：10所示的LCDR1，SEQ ID NO：11所示的LCDR2，SEQ ID NO：12所示的LCDR3。
在一些实施方案中，所述Fab片段包含SEQ ID NO：14所示的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述第一CD40L，第二CD40L和第三CD40L各自独立地包含SEQID NO：1-4中的任一项。
在一些实施方案中，所述融合蛋白以至少1×10-8的亲和力特异性结合所述CD40分子。
在一些实施方案中，所述融合蛋白具有CD40激动剂功能，能够诱导树突状细胞的成熟和/或T细胞活化。
在一些实施方案中，所述融合蛋白以至少1×10-8的亲和力特异性结合所述4-1BB分子。
在一些实施方案中，所述融合蛋白具有4-1BB激动剂功能，能够诱导T细胞活化。
在第二方面，本申请提供了一种核酸，其编码第一方面所述的融合蛋白。
在第三方面，本申请提供了一种表达载体，其包含第二方面所述的核酸。
在第四方面，本申请提供了一种宿主细胞，其包含第二方面所述的核酸或第三方面所述的表达载体。
在第五方面，本申请提供了制备第一方面所述的融合蛋白的方法，其包括：
a)培养第四方面所述的宿主细胞；和
b)从所述宿主细胞中或所述宿主细胞的培养物上清中回收所述融合蛋白。
在第六方面，本申请提供了药物组合物，其包含第一方面所述的融合蛋白，第二方面所述的核酸，第三方面所述的表达载体或第四方面所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体。
在第七方面，本申请提供了第一方面所述的融合蛋白，第二方面所述的核酸，第三方面所述的表达载体或第四方面所述的宿主细胞在制备用于治疗、改善或预防肿瘤、免疫相关疾病或传染性疾病的药物中的用途。
在第八方面，本申请提供了治疗、改善或预防肿瘤、免疫相关疾病或传染性疾病的方法，其包括向有需要的个体施用第一方面所述的融合蛋白，第二方面所述的核酸，第三方面所述的表达载体或第四方面所述的宿主细胞。
在第九方面，本申请提供了第一方面所述的融合蛋白，第二方面所述的核酸，第三方面所述的表达载体或第四方面所述的宿主细胞用于治疗、改善或预防肿瘤、免疫相关疾病或传染性疾病的用途。
本申请的CD137抗体和CD40L的融合蛋白能够与CD40特异性结合，具有诱导树突状细胞成熟、活化淋巴细胞等效果；和/ 或本申请的CD137抗体和CD40L的融合蛋白可以靶向4-1BB并激活4-1BB的信号转导通路，增强免疫反应。
附图说明
图1显示了本申请的CD137抗体和CD40L的融合蛋白的分子结构示意图。
图2显示了本申请的CD137抗体和CD40L的融合蛋白的体外细胞结合活性，通过流式细胞术检测融合蛋白的结合活性。图2A 显示了融合蛋白与HEK Blue::CD40L细胞表面CD40分子的结合；图2B显示了与HEK 293 4-1BB细胞表面4-1BB分子的结合。
图3显示了本申请的CD137抗体和CD40L的融合蛋白的体外细胞功能，通过细胞功能实验检测融合蛋白的功能活性。图3A 显示了融合蛋白可与HEK Blue::CD40L细胞表面CD40分子结合并引发下游信号通路；图3B显示了融合蛋白可与HEK 293 4-1BB 细胞表面4-1BB分子结合并引发下游信号通路。
图4显示了本申请的CD137抗体和CD40L的融合蛋白可以促进DC细胞的成熟，其中图4A显示了融合蛋白可以刺激DC细胞分泌IL-12(p40)；图4B显示了融合蛋白可以刺激DC细胞上调 MHC I类分子的表达；图4C显示了融合蛋白可以刺激DC细胞上调MHC II类分子的表达；图4D显示了融合蛋白可以刺激DC细胞上调CD80分子的表达；图4E显示了融合蛋白可以刺激DC细胞上调CD83分子的表达；图4F显示了融合蛋白可以刺激DC细胞上调CD86分子的表达。
图5显示了本申请的CD137抗体和CD40L的融合蛋白联合 OVA和polyIC:LC在hCD40×h4-1BB KI小鼠的体内刺激实验结果。图5A显示了融合蛋白对hCD40×h4-1BB KI小鼠的第一次模式蛋白免疫刺激的体内刺激实验结果，CD8+细胞中特异性的CTL (CD3+CD8+CD44+OT1+)的百分比；图5B显示了融合蛋白对 hCD40×h4-1BB KI小鼠的第一次模式蛋白免疫刺激的体内刺激实验结果，CD8+细胞中特异性的Tem(CD3+CD8+CD44+CD62L-) 的百分比图；图5C显示了融合蛋白对hCD40×h4-1BB KI小鼠的第一次模式蛋白免疫刺激的体内刺激实验结果的总结；图5D显示了融合蛋白对hCD40×h4-1BB KI小鼠的第二次模式蛋白免疫刺激的体内刺激实验结果，CD8+细胞中特异性的CTL (CD3+CD8+CD44+OT1+)的百分比；图5E显示了融合蛋白对 hCD40×h4-1BB KI小鼠的第二次模式蛋白免疫刺激的体内刺激实验结果，CD8+细胞中特异性的Tem(CD3+CD8+CD44+CD62L-) 的百分比图；图5F显示了融合蛋白对hCD40×h4-1BB KI小鼠的第二次模式蛋白免疫刺激的体内刺激实验结果的总结。
图6显示了本申请的CD137抗体和CD40L的融合蛋白联合 OVA和polyIC:LC在hCD40×h4-1BB KI小鼠体内对B16-OVA皮下移植瘤的抑瘤实验结果。图6A显示了B16-OVA瘤模型的瘤体积变化曲线；图6B显示了融合蛋白的个体抑瘤曲线，分别显示了各组的瘤体积变化；图6C显示了融合蛋白对荷瘤(B16-OVA) hCD40×h4-1BB KI小鼠的瘤重指数；图6D显示了实验终点时融合蛋白对荷瘤(B16-OVA)hCD40×h4-1BB KI小鼠的外周血中CTL 和Tem的影响；图6E显示了实验终点时融合蛋白对荷瘤(B16- OVA)hCD40×h4-1BB KI小鼠的瘤内CTL和Tem的影响；图6F 显示了CD137抗体和CD40L的融合蛋白对荷瘤(B16-OVA)hCD40 ×h4-1BBKI小鼠的肝毒性的影响。
图7显示了本申请的CD137抗体和CD40L的融合蛋白联合 MC38肽和polyIC:LC在hCD40×h4-1BB KI鼠体内对MC38皮下移植瘤的抑瘤实验结果。图7A显示了MC38瘤模型的瘤体积变化曲线；图7B显示了融合蛋白的个体抑瘤曲线，分别显示了各组的瘤体积变化；图7C显示了融合蛋白对荷瘤(MC38)hCD40 ×h4-1BB KI小鼠的瘤重指数；图7D显示了实验终点时融合蛋白对荷瘤(MC38)hCD40×h4-1BB KI小鼠的外周血中CTL和Tem 的影响；图7E显示了实验终点时融合蛋白对荷瘤(MC38)hCD40 ×h4-1BB KI小鼠的瘤内CTL和Tem的影响。
图8显示了本申请的CD137抗体和CD40L的融合蛋白在hCD40×h4-1BB KI小鼠体内进行瘤内给药对MC38皮下移植瘤的抑瘤实验结果。图8A显示了MC38瘤模型的瘤体积变化曲线；图 8B显示了融合蛋白的个体抑瘤曲线，分别显示了各组的瘤体积变化；图8C显示了融合蛋白对荷瘤(MC38)hCD40×h4-1BB KI小鼠的瘤重指数；图8D显示了实验终点时融合蛋白对荷瘤(MC38) hCD40×h4-1BB KI小鼠的外周血中Tem和Treg(CD3+CD4+CD25+) 的影响；图8E显示了实验终点时融合蛋白对荷瘤(MC38)hCD40 ×h4-1BB KI小鼠的瘤内Tem和Treg的影响；图8F显示了CD137 抗体和CD40L的融合蛋白对荷瘤(MC38)hCD40×h4-1BB KI小鼠的肝毒性的影响。
图9显示了本申请的CD137抗体和CD40L的融合蛋白联合放射治疗和polyIC:LC在hCD40×h4-1BB KI小鼠体内进行瘤内给药对MC38皮下移植瘤抑瘤实验结果。图9A显示了MC38瘤模型的瘤体积变化曲线；图9B显示了融合蛋白的个体抑瘤曲线，分别显示了各组的瘤体积变化。图9C显示了融合蛋白对荷瘤(MC38) hCD40×h4-1BB KI小鼠的瘤重指数；图9D显示了实验终点时融合蛋白对荷瘤(MC38)hCD40×h4-1BB KI小鼠的外周血中Tem和 Treg(CD3+CD4+CD25+)的影响。图9E显示了实验终点时融合蛋白对荷瘤(MC38)hCD40×h4-1BBKI小鼠的瘤内Tem和Treg的影响。图9F显示了CD137抗体和CD40L的融合蛋白对荷瘤(MC38)hCD40×h4-1BB KI小鼠的肝毒性的影响。
发明的详细描述
提供以下定义和方法用以更好地界定本申请以及在本申请实践中指导本领域普通技术人员。除非另外指明，本申请中所用的术语具有本领域技术人员通常所理解的含义。本文所引用的所有专利文献、学术论文及其他公开出版物，其中的全部内容整体并入本文作为参考。
定义
本文使用的术语“融合蛋白(fusion protein)”是指有目的地把两段或更多段编码功能蛋白的基因连接在一起，进而表达所述蛋白。这种通过人工条件下将两个或更多个基因的编码区首尾连接，由调控序列控制的基因表达后所得的蛋白质产物即为融合蛋白。
本文所用的术语“肽接头”在本申请的背景下是指用于连接两个功能蛋白之间的短肽，长度可以从3个氨基酸(aa)高至76个氨基酸。肽接头可为融合蛋白中的各功能蛋白提供一定的柔性，使其能够发挥各自的功能。
本文所用的术语“抗体”，是指能够经由至少一个位于免疫球蛋白分子的可变区中的抗原识别位点特异性结合到靶标的免疫球蛋白分子。靶标包括但不限于碳水化合物、多聚核苷酸、脂质、多肽等。本文所使用的“抗体”不仅包括完整的(即全长的)抗体，而且还包括其抗原结合片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、其变异体、包含抗体部分的融合蛋白、人源化抗体、嵌合抗体、双抗体、线性抗体、单链抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)及任何其他包含所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的修改配置，包括抗体的糖基化变体、抗体的氨基酸序列变体及共价修饰的抗体。
通常，完整或全长的抗体包含两个重链和两个轻链。每个重链含有重链变异区(VH)和第一、第二及第三恒定区(CH1、CH2及 CH3)。每个轻链含有轻链变异区(VL)和恒定区(CL)。全长的抗体可以是任何种类的抗体，例如IgD、IgE、IgG、IgA或IgM(或上述的子类)，但抗体不需要属于任何特定的类别。根据重链的恒定域的抗体氨基酸序列，可以将免疫球蛋白指定为不同的类别。通常，免疫球蛋白有五种主要的类别：IgA、IgD、IgE、IgG及 IgM，而且这些类别中有几个可以再被进一步区分成子类(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。对应于不同免疫球蛋白类别的重链恒定域分别称为α、δ、ε、γ、以及μ。不同类别的免疫球蛋白的子单元结构和三维结构是公知的。
本文所用的术语“抗原结合片段”是指抗体结构中决定抗原结合能力的部分。本领域技术人员能够理解，抗体结构中决定抗原结合能力的主要部分是CDR，因此CDR也是抗原结合片段的核心组成部分。抗原结合片段可以包含重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)或上述两者。VH和VL中的每个通常含有三个互补决定区CDR1、CDR2及CDR3。抗体的抗原结合片段可使用任何适合的标准技术从完整抗体分子制备，所述标准技术包括但不限于蛋白水解消化或重组遗传工程化技术等。
抗原结合片段的实例包括但不限于：(1)Fab片段，其可以是具有VL-CL链和VH-CH1链的单价片段；(2)F(ab')2片段，其可以是具有两个Fab'片段的二价片段，该两个Fab'片段由铰链区的二硫桥(即Fab'的二聚物)连接；(3)具有抗体的单臂的VL和VH 域的Fv片段；(4)单链Fv(scFv)，其可以是由VH域和VL域经由胜肽连接符组成的单一多胜肽链；以及(5)(scFv)2，其可以包含两个由胜肽连接符连接的VH域和两个VL域，该两个VL域是经由二硫桥与该两个VH域组合。
本文所用术语“Fab片段”、“Fab部分”或类似的术语是指完整的抗体用木瓜蛋白酶处理后产生的能够与抗原结合的抗体片段，包括完整的轻链(VL-CL)、重链可变区和CH1片段(VH- CH1)。
本领域技术人员公知，互补决定区(CDR，通常有CDR1、CDR2 及CDR3)是可变区中对抗体的亲和力和特异性影响最大的区域。 VH或VL的CDR序列有两种常见的定义方式，即Kabat定义和 Chothia定义，例如参见Kabat等人，“Sequences of Proteins ofImmunological Interest”，National Institutes of Health,Bethesda，MD. (1991)；Al-Lazikani等人，J Mol Biol 273:927-948(1997)；以及Martin 等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:9268-9272(1989)。对于给定抗体的可变区序列，可以根据Kabat定义或者Chothia定义来确定 VH和VL序列中CDR区序列。在本申请的实施方案中，利用Kabat 定义CDR序列。在本文中，重链可变区的CDR1、CDR2及CDR3 分别简称为HCDR1、HCDR2及HCDR3；轻链可变区的CDR1、 CDR2及CDR3分别简称为LCDR1、LCDR2及LCDR3。
对于给定抗体的可变区序列，可以通过多种方式分析可变区序列中CDR区序列，例如可以利用在线软件Abysis确定 (http://www.abysis.org/)。
本文所用的术语“特异性结合”，是指两个分子之间的非随机结合反应，例如抗体至抗原表位的结合，例如抗体以比其对非特异性抗原的亲和性大至少两倍的亲和性结合于特异性抗原的能力。然而应了解，抗体能够特异性结合两种或更多种抗原。例如，本申请的示例性抗体可特异性结合人类与非人类(例如小鼠或非人类灵长动物)的CD40和4-1BB。
本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本同质的抗体群中获得的抗体，即构成该群抗体的单个抗体之间是相同的，除了可以少量存在的可能自然发生的变异外。单克隆抗体高度特异性的针对单一抗原表位。本文公开的单克隆抗体不限于抗体来源或其制备方式(例如，通过杂交瘤、噬菌体挑选、重组表达、转基因动物等)。该术语包括在“抗体”定义下的完整免疫球蛋白以及其片段等。
本文所用的术语“激动剂”是指能增强另一种分子活性、促进某种反应的药物、酶激动剂和蛋白质一类的分子。在本申请的背景下，CD137抗体和CD40L的融合蛋白当被添加至表达CD40的细胞、组织或生物体中时，可使一种或多种CD40活性提高至少约 20％。有些实施方案中，具有激动剂功能的分子，例如本申请的融合蛋白能够使CD40活性提高至少40％，50％或60％或者更高。在一些实施方案中，使用树突状细胞分析法测定IL-12的释放，以测定活化型抗体的活性。
本文所用的术语“同一性”，在两个或更多个核酸或多肽的情况下，指相同或具有相同核苷酸或氨基酸的指定百分比(即在指定区域内，当在比较窗或指定区域内比较和比对最大一致性时，约60％的同一性，优选65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性)的两条或更多条序列或亚序列，如利用BLAST或BLAST 2.0序列比较算法以默认参数或通过手工比对和可视检查(参阅如NCBI网站等)所测量的。
本文所用的术语“CD40相关疾病”包括与CD40信号通路相关的疾病和/或症状。示例性CD40相关疾病或病症包括但不限于肿瘤，例如结肠肿瘤、黑素瘤、白血病、淋巴瘤等。
本文所用的术语“KD”在本申请的背景下是指特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。
具体实施方案
CD40信号转导激活多条通路，包括NF-κB(核因子-κB)、 MAPK(丝裂原活化蛋白激酶)和STAT3(信号转导子和转录激活子- 3)(Pype S等人，J Biol Chem.2000；275(24)：18586-18593)，其通过激活活化蛋白、c-Jun、ATF2(激活转录因子-2)和Rel转录因子(Dadgostar H等人，Proc Natl Acad Sci USA.2002；99(3)：1497-1502) 调节基因表达。通过CD40信号应答而激活的基因包括各种细胞因子和趋化因子，如IL-1、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、TNF-α和巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP1α)。在某些细胞类型中，CD40激活可能会导致产生细胞毒性自由基(Dadgostar H等人，Proc Natl Acad Sci USA.2002；99(3)：1497-1502)、COX-2(环氧合酶-2)，并产生NO(一氧化氮)。
CD40不但在正常的免疫细胞上表达，还可以在许多恶性细胞上表达。例如，CD40可以在以下疾病中过表达：B系NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、多毛细胞白血病(HCL)、霍奇金病(Uckun FM等人，Blood 1990；76：2449-2456；O’Grady JT等人，Am J Pathol 1994；144：21-26)、多发性骨髓瘤(Pellat-Deceunynck C等人，Blood 1994；84(8)：2597-2603)、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、宫颈癌、乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、恶性黑色素瘤(Young LS等人，Immunol Today 1998；19：502-506；Ziebold JL等人，Arch Immunol Ther Exp(Warsz)2000；48：225-233；Gladue R等人，J Clin Oncol 2006；2(18S)：103s)等。
在多种情况下，抗体结合肿瘤细胞表面上CD40分子后，能介导直接的细胞毒作用，通过细胞凋亡和细胞坏死使肿瘤退缩 (Grewal IS等人，Annu Rev Immunol 1998；16：111-135；以及van Kooten C等人，J Leukoc Biol 2000；67(1)：2-17)。除了直接的肿瘤抑制之外，CD40信号激活还能解救荷瘤宿主中抗原呈递细胞的功能，并触发或恢复针对肿瘤相关抗原的活化的免疫应答。据报道， CD40激动剂能克服荷瘤小鼠内的T细胞耐受，激起针对肿瘤相关抗原的有效的细胞毒T细胞应答，并增强抗肿瘤疫苗的效力 (Eliopoulos AG等人，Mol Cell Biol 2000；20(15)：5503-5515；Tong AW等人，Clin Cancer Res 2001；7(3)：691-703)。
CD137(4-1BB)也是TNFR家族的成员，并且是CD8+和CD4+ T细胞、调节性T细胞(Treg)、自然杀伤T细胞(NK(T)细胞)、B细胞和嗜中性粒细胞上的共刺激分子。在T细胞上，CD137不是组成型表达，而是在T细胞受体(TCR)激活后被诱导表达，例如，在肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)上表达(Gros等人，J.Clin Invest 2014； 124(5):2246-59))。通过CD137的早期信号转导涉及K-63多泛素化反应，其最终导致核因子(NF)-kB和丝裂原激活蛋白(MAP)-激酶途径的激活。信号转导会增加T细胞共刺激、增殖、细胞因子产生、使CD8+T细胞成熟和延长CD8+T细胞存活。已显示针对 CD137的激动性抗体在各种临床前模型中促进T细胞的抗肿瘤控制(Murillo等人，Clin Cancer Res 2008；14(21):6895-906)。刺激CD137的抗体可以诱导T细胞的存活和增殖，从而增强抗肿瘤免疫应答。
同时结合表达CD40的APC和表达CD137的T细胞，从而使这些细胞类型紧密接触。这继而可以导致两种细胞类型的活化和抗肿瘤免疫的有效诱导。
本申请针对常规CD40抗体的不足之处，通过基因工程和抗体工程的方法制备了新分子-CD137抗体和CD40L融合蛋白，在 CD40L活化免疫系统的基础上增加了CD137(4-1BB)来进一步增强免疫反应。
在第一方面，本申请提供了一种融合蛋白，其包含：
a)能特异性结合4-1BB分子的Fab片段；
b)能特异性结合CD40分子的第一CD40L，所述第一CD40L 的N端通过第一肽接头与所述Fab片段的轻链或重链的C端连接。
在一些实施方案中，所述融合蛋白还包含：
c)能特异性结合CD40分子的第二CD40L，所述第二 CD40L的N端通过第二肽接头与所述Fab片段的重链或轻链的C 端连接。
在一些实施方案中，所述第一肽接头和所述第二肽接头之间仅能形成一个二硫键，并且各自独立地选自以下：包含SEQ ID NO： 24-25所示序列(SEQ ID NO：24：Xaa ProPro Cys Pro Ala Pro Glu； SEQ ID NO：25：Glu Pro Ala Pro Cys Pro Pro Xaa，其中Xaa可以为除Cys之外的任何氨基酸或不存在)中的任一种的肽接头，其中X代表除Cys的任意氨基酸，或者缺失。除Cys的任意氨基酸可以为天然氨基酸或非天然氨基酸。所述天然氨基酸包括但不限于甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、组氨酸、色氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、天门冬酰胺、谷酰胺、精氨酸等。
在一些实施方案中，所述第一肽接头和/或所述第二肽接头可以为天然抗体的铰链区，其中可以对铰链区进行仅保留一个半胱氨酸的突变。
在一些实施方案中，所述第一肽接头和/或所述第二肽接头为 C239缺失突变的IgG1铰链区，或C239缺失突变，且铰链区D234- S252倒转的IgG1铰链区。
在一些实施方案中，第一肽接头和第二肽接头是相同的。
在一些实施方案中，第一肽接头和第二肽接头是不相同的。
在一些实施方案中，所述融合蛋白还包含：
d)能特异性结合CD40分子的第三CD40L，所述第三CD40L 的N端通过第三肽接头与所述第一CD40L或所述第二CD40L的 C端连接。
在一些实施方案中，所述第三肽接头包含以下的一种或多种： SEQ ID NO：5所示的序列、SEQ ID NO:6所示的序列、串联连接的多个SEQ ID NO：5所示的序列和串联连接的多个SEQ ID NO： 6所示的序列。所述多个包括2、3、4、5、6个或更多个，只要其长度在可接受的范围内即可。
所述融合蛋白还包含e)FcBP，其中所述FcBP与所述第一 CD40L、第二CD40L和第三CD40L中的任一者或多者的C端连接。优选地，所述FcBP与连接在轻链上的CD40L的C端连接，以增加由此获得的融合蛋白的半衰期。
在一些实施方案中，所述第一肽接头与所述第一CD40L之间以及所述第二肽接头与所述第二CD40L之间还连接有第四肽接头和第五肽接头。
在一些实施方案中，所述第四肽接头和所述第五肽接头各自独立地包含以下的一种或多种：SEQ ID NO：5所示的序列、SEQ ID NO:6所示的序列、串联连接的多个SEQ ID NO：5所示的序列和串联连接的多个SEQ ID NO：6所示的序列。优选地，所述第四肽接头和所述第五肽接头相同。所述多个包括2、3、4、5、6个或更多个，只要其长度在可接受的范围内即可。
在一些实施方案中，所述4-1BB分子和CD40分子独立地来源于哺乳动物，优选非人类的灵长类或者人类。
在一些实施方案中，所述Fab片段包含SEQ ID NO：7所示的 HCDR1，SEQ ID NO：8所示的HCDR2，SEQ ID NO：9所示的 HCDR3。
在一些实施方案中，所述Fab片段包含SEQ ID NO：13所示的重链可变区。
在一些实施方案中，所述Fab片段包含与SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列具有至少约70％,75％,80％,85％,86％,87％,88％, 89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或更高的同一性并能够结合4-1BB分子的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述Fab片段包含SEQ ID NO：10所示的LCDR1，SEQ ID NO：11所示的LCDR2，SEQ ID NO：12所示的LCDR3。
在一些实施方案中，所述Fab片段包含SEQ ID NO：14所示的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述Fab片段包含与SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列具有至少约70％,75％,80％,85％,86％,87％,88％, 89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或更高的同一性并能够结合4-1BB分子的轻链可变区。
对抗体的氨基酸序列进行编号以鉴定等同位置，目前针对抗体存在多种不同的编号方案。Kabat方案(Kabat等，1991)是基于相同结构域类型的序列之间的高序列变异区域的位置而开发的。其对抗体重链(VH)和轻链(Vλ和Vκ)可变结构域的编号不同。Chothia方案(Al-Lazikani，1997)与Kabat方案相同，但校正了在第一个VH互补决定区(CDR)周围插入注释的位置，使其对应于结构环。本申请中的抗体是按照Kabat方案来编号的。
在一些实施方案中，所述第一CD40L，第二CD40L和第三 CD40L各自独立地包含SEQID NO：1-4中的任一项。
在一些实施方案中，所述第一CD40L，第二CD40L和第三CD40L各自独立地包含与SEQ ID NO：1-4中的任一项所示的氨基酸序列具有至少约70％,75％,80％,85％,86％,87％,88％,89％, 90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或更高的同一性并能够结合CD40分子的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述融合蛋白以至少1×10-8的亲和力特异性结合所述CD40分子。
在一些实施方案中，所述融合蛋白具有CD40激动剂功能，能够诱导树突状细胞的成熟和/或T淋巴细胞活化。
在一些实施方案中，本文公开的融合蛋白能够诱导树突状细胞的成熟。在一些实施方案中，本文公开的融合蛋白能够诱导T淋巴细胞活化。
例如，在具体实施方案中，本文公开的融合蛋白可以提高树突状细胞表达CD80、CD83、CD86、MHCI和/或MHC II分子的能力。在具体实施方案中，本文公开的融合蛋白可以刺激树突状细胞与附着性单核细胞分泌细胞因子，包括但不限于IL-8、IL-12、IL- 15、IL-18、IL-23等。
在具体实施方案中，本文公开的融合蛋白可以激活抗原特异性T细胞，例如激活hCD40×h4-1BB KI小鼠体内特异性的T细胞。
在一些实施方案中，本文公开的融合蛋白可以抑制肿瘤的生长。例如，在具体实施方案中，本文公开的融合蛋白可以抑制和色素瘤的生长。在具体的实施方案中，上述融合蛋白抑制肿瘤生长至少达50％。在一些实施方案中，在荷瘤个体接受本文公开的融合蛋白处理后7天即可检测到抑制肿瘤生长的情形。在另一些实施方案中，在初次接受抗体处理后4天即可检测到抑制肿瘤生长的情形。
在一些实施方案中，所述融合蛋白以至少1×10-8的亲和力特异性结合所述4-1BB分子。
在一些实施方案中，所述融合蛋白具有4-1BB激动剂功能，能够诱导T细胞活化。
在本文中，分子之间的结合力称为亲和力，其本质是一种非共价作用力。其体现了分子之间(例如抗体和抗原之间，受体和配体之间)结合的能力，测定分子之间的亲和力的方法是本领域内公知的，包括但不限于生物膜干涉技术(BLI)、固相放射免疫法(SP-RIA)、平衡透析法、结合抗原沉淀法、放射免疫法 (RIA)、酶联免疫吸附实验(ELISA法)、表面等离子共振法 (SPR)等。亲和力的大小可以用亲和力常数KD表示，亲和力常数KD越高，则两者结合的能力越强。
在本申请的融合蛋白中，能特异性结合4-1BB分子的Fab片段可以在其重链的C端通过肽接头连接CD40L，优选CD40L的胞外区，例如SEQ ID NO：1-4中任一项所示的CD40L的胞外区，所述肽接头优选C239缺失突变的IgG1铰链区。具体地，SEQ ID NO：1为CD40L的胞外区CD40L 113-261；SEQ ID NO：2为 CD40L的胞外区CD40L 116-261；SEQ ID NO：3为CD40L的胞外区CD40L 119-261；并且SEQ ID NO：4为CD40L的胞外区 CD40L 121-261。在一些实施方案中，能特异性结合4-1BB分子的 Fab片段还可以在其轻链的C端通过肽接头连接CD40L，优选 CD40L的胞外区，例如SEQ ID NO：1-4中任一项所示的CD40L 的胞外区，所述肽接头优选C239缺失突变的IgG1铰链区。因此，本申请的融合蛋白构建体可以包含两个拷贝的CD40L的胞外区。在一些具体的实施方案中，包含两个拷贝的CD40L的胞外区的融合蛋白还可以包含另外一个拷贝的CD40L的胞外区，该另外一个拷贝的CD40L的胞外区可以通过另外一个接头与已有的两个 CD40L的胞外区的任一个的C端连接，从而形成包含三个拷贝的 CD40L的胞外区的融合蛋白。
在第二方面，本申请提供了一种核酸，其编码第一方面所述的融合蛋白。
在优选的实施方案中，所述核酸可以是适合在宿主细胞中表达的密码子优化的核酸。例如根据密码子的简并性，其仍然编码同样的蛋白质。根据所用宿主细胞进行密码子优化的方法是本领域技术人员公知的。
在第三方面，本申请提供了一种表达载体，其包含第二方面所述的核酸。
可以使用任何合适的表达载体。例如，原核克隆载体包括来自大肠杆菌的质粒，如colEl、pCRl、pBR322、pMB9、pUC、 pKSM和RP4。原核载体还包括噬菌体DNA如M13和其它丝状单链DNA噬菌体的衍生物。可用于酵母的载体的实例是2μ质粒。用于在哺乳动物细胞中表达的合适载体包括以下众所周知的衍生物：SV-40、腺病毒、逆转录病毒衍生的DNA序列以及衍生自功能性哺乳动物载体(如上述那些)和功能性质粒和噬菌体DNA 的组合的穿梭载体。
另外的真核表达载体为本领域已知的(例如，P J.Southern&P. Berg,J.Mol.Appl.Genet,1:327-341(1982)；Subramani等人,Mol. Cell.Biol,1:854-864(1981)；Kaufinann&Sharp,"Amplification And Expression of SequencesCotransfected with a Modular Dihydrofolate Reductase Complementary DNA Gene,"J.Mol.Biol,159:601-621 (1982)；Kaufhiann&Sharp,Mol.Cell.Biol,159:601-664(1982)； Scahill等人,"Expression And Characterization Of The Product Of AHuman Immune Interferon DNA Gene In Chinese Hamster Ovary Cells,"Proc.Nat'lAcad.Sci USA,80:4654-4659(1983)；Urlaub& Chasin,Proc.Nat'l Acad.Sci USA,77:4216-4220,(1980)，将其全部通过引用并入本文)。
可用于本申请的表达载体含有至少一个表达控制序列，其与待表达的DNA序列或片段可操作连接。将控制序列插入载体中以控制和调节克隆的DNA序列的表达。有用的表达控制序列的实例是lac系统，trp系统，tac系统，trc系统，噬菌体λ的主要操纵子和启动子区，fd外壳蛋白的控制区，酵母的糖酵解启动子，例如3- 磷酸甘油酸激酶的启动子，酵母酸性磷酸酶的启动子，例如Pho5，酵母α-交配因子的启动子，以及来源于多瘤病毒、腺病毒、逆转录病毒和猿猴病毒的启动子，例如SV40的早期和晚期启动子和已知控制原核或真核细胞及其病毒或其组合的基因表达的其它序列。
在第四方面，本申请提供了一种宿主细胞，其包含第二方面所述的核酸或第三方面所述的表达载体。
在一些实施方案中，所述宿主细胞为哺乳动物细胞。哺乳动物细胞可以包括但不限于CHO细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、 HEK293细胞、COS细胞和PER.C6细胞。本领域技术人员能够根据需要选择适合的宿主细胞。
在第五方面，本申请提供了制备第一方面所述的融合蛋白的方法，其包括：
a)培养第四方面所述的宿主细胞；和
b)从所述宿主细胞中或所述宿主细胞的培养物上清中回收所述融合蛋白。
在第六方面，本申请提供了药物组合物，其包含第一方面所述的融合蛋白，第二方面所述的核酸，第三方面所述的表达载体或第四方面所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体。
第六方面的药物组合物可按制药领域的常规方法制备成所需的剂型。在一些实施方案中，所述药物组合物优选为液体或悬浮液剂型。
在一些实施方案中，所述药学上可接受的载体为不减弱免疫细胞活力以及功能、不影响抗体或其抗原结合片段与抗原特异性结合的载体，包括但不限于细胞培养基、缓冲液、生理盐水和平衡盐溶液等。缓冲液的实例包括等渗磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐以及碳酸盐等。在具体的实施方案中，所述药学上可接受的载体为含1％血清的磷酸盐缓冲液。
本文公开的融合蛋白及其药物组合物能够用于治疗、改善或预防个体的肿瘤、免疫相关疾病或传染性疾病。
本文公开的融合蛋白及其药物组合物可以任何合适的方式施用。优选地，本申请的融合蛋白及其药物组合物通过注射(例如，皮下，静脉内，肿瘤内，动脉内，肌肉内，皮内，腹膜内或鞘内)施用。优选地，本申请的融合蛋白及其药物组合物通过静脉内施用。对于本申请的融合蛋白及其药物组合物，用于注射的合适的药学可接受的载体可以包括任何等张载体，例如生理盐水(含约0.90％w/v NaCl的水，含约300mOsm/L NaCl的水，或者每升水约9.0g NaCl)、NORMOSOL R电解质溶液(Abbott,Chicago,IL)、PLASMA-LYTE A(Baxter,Deerfield,IL)、含约5％葡萄糖的水或者乳酸林格氏液。在具体的实施方案中，用人血清白蛋白替换药学上可接受的载体。
第六方面所述的药物组合物还可以包含用于治疗、改善或预防个体的肿瘤、免疫相关疾病或传染性疾病的第二药剂。
在第七方面，本申请提供了第一方面所述的融合蛋白，第二方面所述的核酸，第三方面所述的表达载体或第四方面所述的宿主细胞在制备用于治疗、改善或预防肿瘤、免疫相关疾病或传染性疾病的药物中的用途。
在第八方面，本申请提供了治疗、改善或预防肿瘤、免疫相关疾病或传染性疾病的方法，其包括向有需要的个体施用第一方面所述的融合蛋白，第二方面所述的核酸，第三方面所述的表达载体或第四方面所述的宿主细胞。
在一些实施方案中，所述方法还包括施用治疗、改善或预防肿瘤、自身免疫性疾病或传染性疾病的第二药剂。
对于治疗、改善或预防肿瘤而言，还可以在对个体进行放射治疗和/或化学治疗之前、同时或之后施用第一方面所述的融合蛋白，第二方面所述的核酸，第三方面所述的表达载体或第四方面所述的宿主细胞。
在第九方面，本申请提供了第一方面所述的融合蛋白，第二方面所述的核酸，第三方面所述的表达载体或第四方面所述的宿主细胞用于治疗、改善或预防肿瘤、免疫相关疾病或传染性疾病的用途。
“治疗”既指治疗性处理，也指预防性或防止性的措施，其目的就是预防或减缓(减轻)目标病理状态或病症。需要治疗的个体包括那些已经存在所述病症的个体，还包括那些将发展为该病症的或欲对其病症进行预防的个体。因此，本文中欲被治疗的个体已经被诊断为患有该病症或倾向于或易患该病症。
本文使用的术语“个体”是指哺乳动物，包括但不限于灵长类动物、牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫以及诸如大鼠和小鼠的啮齿类动物。优选地，哺乳动物为非人类的灵长类或者人类。特别优选的哺乳动物是人。
在某些实施方案中，所述肿瘤为原发性癌症或转移性癌症。在具体的实施方案中，肿瘤选自肺癌例如非小细胞肺癌、结直肠癌、胰腺癌、间皮质瘤、膀胱癌、造血系统癌症例如白血病、乳腺癌、胃癌、胃食管结合部腺癌、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤，间变大细胞淋巴瘤、头颈癌例如头颈部鳞状细胞癌、恶性胶质瘤，肾癌、黑色素瘤、前列腺癌、骨癌、骨巨细胞瘤、胰腺癌、肉瘤、肝癌、皮肤鳞癌、甲状腺癌、宫颈癌、鼻咽癌、子宫内膜癌，或上述肿瘤的转移癌。
在某些实施方案中，所述免疫相关疾病可以包括系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、硬皮病、系统性血管炎、皮肌炎和自身免疫性溶血性贫血等。
在某些实施方案中，所述传染性疾病包括呼吸道传染病、消化道传染病、血液传染病、体表传染病和性传染病等。在具体的实施方案中，传染性疾病可以包括但不限于流行性感冒，肺结核，HPV感染，结肠炎，腮腺炎，麻疹，百日咳、蛔虫病，细菌性痢疾，甲型肝炎、乙型肝炎，疟疾，流行性乙型脑炎，丝虫病、血吸虫病，沙眼，狂犬病，破伤风、淋病、梅毒、艾滋病等。
本文中所用的“治疗有效量”可以根据具体情况而定，本领域普通技术人员根据实际所需药量可以很容易地掌握，如可根据患者体重、年龄和病症情况来确定。
本说明书和权利要求书中，词语“包括”、“包含”和“含有”意指“包括但不限于”，且并非意图排除其他部分、添加物、组分、或步骤。
应该理解，在本申请的特定方面、实施方案或实施例中描述的特征、特性、组分或步骤，可适用于本文所描述的任何其他的方面、实施方案或实施例，除非与之矛盾。
上述公开内容总体上描述了本申请，实施例是对本申请作进一步的说明，不应理解为对本申请的限制。实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质粒的方法，将编码蛋白的基因插入到载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法。这样的方法对于本领域具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，例如参见Sambrook,J.,Fritsch, EF.and Maniais，T.(1989)Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第二版，Cold spring Harbor Laboratory Press。
实施例
以下实施例用于说明本申请，但不用来限制本申请的范围。在不背离本申请精神和实质的情况下，对本申请方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本申请的范围。
若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1 CD137抗体和CD40L的融合蛋白的制备、表达与鉴定
融合蛋白的载体制备
通过PCR扩增来获得抗CD137 VH-CH1序列片段(序列参见专利号：US-2019-0284292-A1)、抗CD137 VL-Cκ序列片段 (序列参见专利号：US-2019-0284292-A1)、CD40L序列片段 (包括片段CD40L P1(G4S-CD40L)、CD40L P2(G4S-G3S- CD40L)和CD40L P3(G4S-CD40L)，并且CD40L采用的是胞外区CD40L 116-231)和LFcBP序列片段。片段CD137 VH-CH1、CD40L P1、CD40L P2插入表达全合成的载体pQKX1(通用生物系统(安徽)有限公司)中，得到的产物称为pQK VH；片段CD137 VL-Cκ、CD40L P3、LFcBP插入表达全合成的载体 pQKX2(通用生物系统(安徽)有限公司)中，得到的产物称为 pQK VL。
1.1 CD137抗体和CD40L的融合蛋白的表达载体的制备
1.1.1 CD137抗体和CD40L的融合蛋白的pQK VH和pQK VL 的构建
以pQK Triad2 H和pQK Triad2 L为模板，使用金牌Mix PCR试剂盒(TSINGKE公司)，按照试剂盒的说明书，扩增 CD137 VH-CH1和CD137 VL-Cκ，其扩增产物大小分别约为5.5 kb和6.8kb；以载体HG10239-CH为模板，使用金牌Mix PCR试剂盒(TSINGKE公司)，按照试剂盒的说明书，扩增CD40L P1、CD40L P2和CD40L P3,其扩增产物大小约为500bp；以载体pUC57 LFcBP为模板，使用金牌Mix PCR试剂盒(TSINGKE 公司)，按照试剂盒的说明书，扩增LFcBP,其扩增产物大小约为90bp。以限制性内切酶EcoRI(NEB,R3101S)和BspQI (NEB,R0712L)对全合成载体pQKX1(通用生物系统(安徽) 有限公司)进行酶切，将所得的三种PCR扩增产物(连接顺序从 5’到3’为：CD137 VH-CH1-CD40L P1-CD40L P2)和酶切载体以BM无缝克隆试剂盒(博迈德公司)，按照试剂盒的说明书，进行重组连接以获得重链表达载体pQKVH；同时以限制性内切酶EcoRI(NEB,R3101S)和SapI(NEB,R0712S)对全合成载体 pQKX2(通用生物系统(安徽)有限公司)进行酶切，将所得的三种PCR扩增产物(连接顺序从5’到3’为：CD137抗体VL- κ-CD40L P3-LFcBP)和酶切载体以BM无缝克隆试剂盒(博迈德公司)，按照试剂盒的说明书，进行重组连接以获得轻链表达载体pQK VL。
PCR扩增引物对如下：
1.1.2重组质粒的扩增和制备
将如上获得的重链表达载体pQK VH和轻链表达载体pQK VL分别转化至感受态DH5α中。挑取单克隆并鉴定后，在含有氨苄青霉素(终浓度为100mg/L)的LB培养基中培养16小时，培养条件为37℃，200rpm振荡培养。以8000×g离心20分钟收集细菌。使用NucleoBondXtra Midi试剂盒(Macherey-nagel)，按照试剂盒的说明书，对质粒进行分离提取，以1mL的无菌超纯水进行洗脱，最后使用Nanodrop微量分光光度计测定质粒浓度。
1.2抗体的表达
1.2.1融合蛋白的转染
取样20μL HEK 293Fv细胞(上海奥浦迈生物科技有限公司) 计数,用预热OPM-293CD05培养基(上海奥浦迈生物科技有限公司，81075-001)将细胞稀释到1.5×106个细胞/mL，37℃继续摇床培养24h。用转染体积10％的新鲜OPM-293CD05培养基稀释质粒，按转染细胞体积计算，质粒终浓度为1μg/mL；向稀释后质粒中按细胞体积的1/1000加入3mg/mL的PEI(Sigma， 765090)；立即涡旋震荡10秒；室温放置15分钟；将质粒/PEI 混合物滴加到细胞培养基中，边滴加边轻轻摇动培养瓶。放入摇床培养，第1天补加5％CDF08培养基(奥浦迈，F81288- 001)+1％Gluc(Sigma，G8769),第3天补加1％Gluc，第7-10 天收样。该蛋白指由质粒pQK VH和pQK VL表达的CD137抗体和CD40L的融合蛋白，抗体融合蛋白命名为IMB071703，结构如图1所示。
1.2.2融合蛋白的表达纯化
培养7-10天后，取细胞上清，3500rpm离心30min，收集上清，采用Capto L亲和层析柱(Cytiva，17547803)进行抗体纯化。通过AKTA PURE亲和纯化系统(GE)使用Capto L 5ml纯化柱从培养上清中捕获融合蛋白，流速设定为3mL/min，用5CV 20mM PB+150mM NaCl，pH7.4平衡液平衡纯化柱，柱平衡稳定后上样，上样结束，选择20mM PB+150mM NaCl，pH7.4淋洗，淋洗结束使用50mM柠檬酸pH3.0洗脱液进行洗脱，收集融合蛋白用1M Tris-HCl，pH9.0中和。
1.3 Fortebio测定融合蛋白的亲和力
纯化的融合蛋白使用分子互作仪Fortebio Octet QK(Molecular Devices公司)测定其亲和力常数KD。在用4-1BB蛋白 (BioImmunoah，FZ00401)和CD40蛋白(SinoBiological，10744- H08H)包被Ni-NTA传感器(PALL，18-5102)后，进行融合蛋白的结合和解离曲线的检测和拟合，从而获得结合解离常数。测试抗体的结合解离常数显示于表4中。
表4：融合蛋白的亲和力常数测定结果
抗原 Kon(1/Ms) Koff(1/s) KD(M) R2
CD40 1.96E+04 6.54E-04 3.33E-08 0.997686
4-1BB 1.10E+05 1.31E-03 1.19E-08 0.97082
注：参比抗体未出现解离曲线，数据只作为参考。
实施例2 CD137抗体和CD40L的融合蛋白的体外细胞结合试验
采用流式细胞术分析法来测定本申请的融合蛋白在不同浓度下与稳定表达人CD40的细胞系(HEK Blue::CD40L细胞， InvivoGen，hkb-cd40)的结合活性。
收集1瓶(T75)HEK Blue::CD40L细胞(细胞融合度70-80％)，弃上清，5mL PBS(Servicebio，G4202-500mL)洗一次，1mL 0.25％的胰酶(Gibco，25200-072)消化30s，5mL含10％FBS的 DMEM(Corning，10-013-CV)吹打均匀，1000rpm/min离心5min；弃上清，加入含2％FBS(Gemini，900-108)的PBS(FACS缓冲液) 重悬细胞计数，将HEK Blue::CD40L细胞稀释至1×106个细胞 /mL；按照50μL/管加入流式管中；HEK Blue::CD40L细胞分组为：空白、二抗组和融合蛋白梯度稀释组(1000μg/mL开始进行3倍梯度稀释11个点)；按照50μL/管将待测融合蛋白分别加入各组的流式管中，避光4℃孵育30min；3mL FACS缓冲液洗2次，弃上清；按照组别分别加入10μL/测试(v/v＝1/20稀释)的APC抗-人 IgGκ(Biolegend，392708)，避光4℃孵育30min；3mL FACS缓冲液洗1次，弃上清，300μL/管的含2％FBS的PBS(FACS缓冲液) 重悬上机检测。
结果显示，融合蛋白与人CD40抗原的胞外区结合，且与其浓度呈正相关。此实验结果显示于图2A中。
采用FACS分析法来测定本申请的融合蛋白在不同浓度下与稳定表达人4-1BB的细胞系(HEK 293 4-1BB细胞，吉满生物科技，CM-C04832)的结合活性。
收集1瓶(T75)HEK 293 4-1BB细胞(细胞融合度70-80％)：弃上清，5mL PBS洗一次，1mL 0.25％的胰酶消化30s，5mL含10％ FBS的DMEM吹打均匀，1000rpm/min离心5min；弃上清，加入含2％FBS的PBS(FACS缓冲液)重悬细胞计数，将HEK 293::4- 1BB细胞稀释至1×106个细胞/mL；按照50μL/管加入流式管中； HEK 293::4-1BB细胞分组为：空白、二抗组和融合蛋白梯度稀释组(1000μg/mL开始进行3倍梯度稀释13个点)；按照50μL/管将待测融合蛋白分别加入各组的流式管中，避光4℃孵育30min； 3mL FACS缓冲液洗2次，弃上清；按照组别分别加入10μL/测试 (v/v＝1/20稀释)的APC抗-人IgGκ，避光4℃孵育30min；3mL FACS缓冲液洗1次，弃上清，300μL/管的含2％FBS PBS(FACS 缓冲液)重悬上机检测。
结果显示，融合蛋白与人4-1BB抗原的胞外区结合，且与其浓度呈正相关。此实验结果显示于图2B中。
实施例3 CD137抗体和CD40L的融合蛋白的体外功能试验
采用HEK Blue::CD40L细胞的NF-κB报告系统进行筛选。融合蛋白与HEK Blue::CD40L细胞表面的CD40结合，激活下游信号通路NF-κB，并引起碱性磷酸酶(SEAP)的分泌，碱性磷酸酶与Qunati-Blue(InvivoGen,rep-qbs)反应，采用多功能酶标仪(BMG LABTECHGmbH，CLARIOstar)检测620nm波长下的OD值，进而检测融合蛋白的体外功能活性。
收集1瓶(T75)HEK Blue::CD40L细胞(细胞融合度70-80％)，弃上清，5mL PBS洗一次，1mL 0.25％的胰酶消化30s，3mL含10％ FBS(灭活血清，56℃水浴灭活30min)的DMEM吹打均匀， 1000rpm/min离心5min；弃上清，加入5mL含10％FBS(灭活血清，56℃水浴灭活30min)的DMEM重悬细胞计数，将HEK Blue::CD40L细胞稀释至2×105个细胞/mL；按照100μL/孔加入96 孔透明板(Thermo，167008)，放入5％CO2的37℃细胞培养箱(Thermo)孵育30min；按照100μL/孔，加入稀释好的融合蛋白，将 96孔板放入5％CO2的37℃细胞培养箱孵育20h；取160μL Quanti- Blue(提前融化)于96孔板中，取40μL细胞上清，加入96孔板中，于37℃细胞培养箱中孵育1h，使用多功能酶标仪在620nm下检测OD值。
结果显示，融合蛋白可与人CD40抗原的胞外区结合并激发下游信号通路，其EC50值为0.005649μg/ml，R2＝0.9974。此实验结果示于图3A中。
采用HEK 293 4-1BB细胞的NF-κB报告系统进行筛选。融合蛋白与HEK 293 4-1BB细胞表面的4-1BB结合，激活下游信号通路NF-κB，并引起荧光素酶信号通路的激活，ONE-GloTM Luciferase Assay System(Promega，E6120)与荧光素酶反应，采用多功能酶标仪检测全光谱的相应信号值，进而检测抗体的体外功能活性。
收集1瓶(T75)HEK 293 4-1BB细胞(细胞融合度70-80％)，弃上清，5mL PBS洗1次，1mL 0.25％胰酶消化30s，加入4mL含 10％FBS的DMEM，吹打均匀后收集细胞，1000rpm/min离心5min；弃上清，加入含1％FBS(灭活血清，56℃水浴灭活30min)的 DMEM重悬细胞计数,将HEK 293 4-1BB细胞稀释至4×105个细胞/mL；按照50μL/孔将HEK 293 4-1BB细胞加入96孔黑壁透底板(PerkinElmerTM，6005182)；按照50μL/孔的体系加入稀释好的蛋白(根据组别将培养体系加至100μL/孔)，将96孔板放入5％ CO2的37℃细胞培养箱孵育5h；按照100μL/孔ONE-Glo(融化后室温平衡5min)加入96孔黑壁透底板(提前取出室温平衡5- 10min)中，室温避光孵育5min，使用多功能酶标仪检测响应信号值(采用ADCC程序)。
结果显示，融合蛋白可与人4-1BB抗原的胞外区结合并引发激发下游信号通路，其EC50值为1.773μg/ml，R2＝0.9906。此实验结果示于图3B中。
实施例4 CD137抗体和CD40L的融合蛋白促进树突状细胞成熟
根据树突状细胞的成熟实验来确定本申请的融合蛋白是否可以促进树突状细胞的成熟以及能否调节树突状细胞表面MHC I类分子、MHC II、CD80、CD83和CD86以及分泌因子的表达。
使用EDTA·K2抗凝采血管(2mL，GE，367863)采集健康志愿者的外周血，通过Ficoll(GE，17-1440-02)密度梯度离心法分离获得白膜层。具体地，使用无菌PBS按照抗凝血:PBS＝1:2(v/v) 进行稀释；按照稀释血液:Ficoll＝20:15(v/v)缓慢加在Ficoll液面上；按照800g离心20min(升3降1)室温离心；吸取白膜层，1×PBS 洗2次；弃上清，使用2倍白膜层体积的含10％FBS的RPMI 1640 洗2次，400g离心5min；弃上清，5mL含10％FBS的RPMI1640 重悬细胞计数。
将PBMC用含10％FBS的RPMI 1640稀释至2×106个细胞 /mL，按照4mL/孔加入6孔板中；37℃孵育1-2h，用5mL/孔含 10％FBS的1640轻柔洗掉未贴壁的细胞；使用无血清DC培养基配制细胞因子诱导培养基：1000U/mL的GM-CSF(Pepro Tech， 300-03)+500U/mL的IL-4(Pepro Tech，200-04)。37℃孵育6 天，每隔2-3天进行更换培养基。
收集imDC细胞，含10％FBS的RPMI 1640洗1次后重悬计数；将细胞稀释至1×106个细胞/mL，100μL/孔铺入U型底96孔板(Thermo，168136)；按照100μL/孔向96孔板中分别加入10％ FBS的RPMI 1640、1μg/mL LPS(Sigma-Aldrich，L4391)和不同浓度的融合蛋白，37℃孵育48-72h。
将96孔板按照1000rpm/min 4℃离心5min，取细胞上清，采用人IL-12p40 ELISA试剂盒(联科生物，EK1183-96)检测IL-12 (p40)；按照组别收集细胞，3mL的FACS缓冲液洗2次后，加入抗人CD11c(Biolegend，301626)、抗人MHCI(HLA-ABC) 类分子(Biolegend，311426)、抗人MHCII(HLA-DR)类分子 (Biolegend，307606)、抗人CD80(Biolegend，305208)、抗人CD83(Biolegend，305325)和抗人CD86(Biolegend，305412)， 4℃孵育30min，含2％FBS的1×PBS洗1次，300μL/管含2％ FBS的1×PBS重悬。进行MHCI类分子、MHCII类分子、CD80、 CD83和CD86的流式检测。
结果如图4所示，融合蛋白可以促进树突状细胞的成熟，刺激树突状细胞IL-12(P40)的分泌(图4A)，并上调树突状细胞表面MHC I类分子、MHC II类分子、CD80、CD83和CD86的表达 (图4B-F)。
实施例5.融合蛋白在模式抗原和免疫佐剂模式的小鼠中的体内刺激实验
采用OVA(Sigma-Aldrich，A5503)作为模式抗原，TLR3激动剂poly IC:LC(Sigma-Aldrich，P1530)作为免疫佐剂，在hCD40 ×h4-1BB KI人源化小鼠(购于百奥赛图)体内验证融合蛋白是否可以刺激人源化小鼠体内产生特异性杀伤T细胞(CTL，CD3+ CD8+OT-1+CD44+T细胞)和记忆性效应型T细胞(Tem，CD3+ CD8+CD44+CD62L-T细胞)。
腹腔给药(i.p.)；第0天和第6天给药，组别为生理盐水组、模式抗原和免疫佐剂组以及融合蛋白与模式抗原和免疫佐剂组(模式抗原和免疫佐剂混合给药，融合蛋白单独给药)；生理盐水组给予生理盐水(10μl/g体重)，模式抗原和免疫佐剂组给予OVA(12.5mg/kg)和polyIC:LC(1.25mg/kg)的混合药物(10μl/g体重)，融合蛋白与模式抗原和免疫佐剂组给予融合蛋白(5mg/kg)、 OVA(12.5mg/kg)和polyIC:LC(1.25mg/kg)的混合药物(10μl/g体重)；第一次给药后第6天和第12天取肝素抗凝全血进行CTL和Tem 的百分比检测。具体地，取100μL/管的外周血，加入OT-1四聚体 (MBL，TS-5001-1c)，4℃孵育30min，然后加入抗小鼠CD45 (Biolegend，103126)、抗小鼠CD3e(Biolegend，100234)、抗小鼠CD8a(MBL，D271-4)、抗小鼠CD44(Biolegend，103030) 和抗小鼠CD62L(Biolegend，104408)，4℃孵育30min；加入1mL/管红细胞裂解液(Gibco，11814389001)，室温避光裂红5min， 3mL/管1×PBS洗1次，300μL/管1×PBS重悬,进行特异性杀伤 T细胞(CTL)和记忆性效应型T细胞(Tem)的流式检测。
第一次给药后第6天，融合蛋白可以刺激人源化小鼠体内特异性杀伤T细胞(CTL)和记忆性效应型T细胞(Tem)的产生， CTL的增加比例大约为2％(图5A)，Tem的增加比例大约为7％ (图5B)，CTL/Tem的增加比例大约为25％(图5C)。
第一次给药后第12天，融合蛋白可以刺激人源化小鼠体内特异性杀伤T细胞(CTL)和记忆性效应型T细胞(Tem)的产生， CTL增加比例大约为20％(图5D)，Tem增加比例大约为25％ (图5E)，CTL/Tem的增加比例大约为70％(图5F)。
实施例6.融合蛋白与模式抗原和免疫佐剂模式在小鼠体内抑制B16-OVA皮下移植瘤的生长实验
使用hCD40×h4-1BB KI小鼠验证本申请的融合蛋白与模式抗原和免疫佐剂模式是否可以抑制小鼠皮下移植瘤B16-OVA的生长。
建立皮下移植瘤模型：经皮下注射肿瘤细胞(B16-OVA细胞，由ImmunoahTherapeutics,In赠送)，浓度为2x105个细胞/只动物。在注射肿瘤之后第7天，量取瘤体的长和宽，按照v＝ab2/2(a为瘤体长度，b为瘤体宽度)计算瘤体积。瘤体积达到80～120mm3时，随机进行分组。组别为生理盐水组、模式抗原和免疫佐剂组和融合蛋白与模式抗原和免疫佐剂组(模式抗原和免疫佐剂混合给药，融合蛋白单独给药)。生理盐水组给予生理盐水(10μl/g体重)，模式抗原和免疫佐剂组给予OVA(12.5mg/kg)和polyIC:LC(1.25mg/kg) 的混合药物(10μl/g体重)，融合蛋白与模式抗原和免疫佐剂组给予融合蛋白(5.5mg/kg)、OVA(12.5mg/kg)和polyIC:LC(1.25mg/kg) 的混合药物(10μl/g体重)；进行腹腔给药，每6天一次给药，共 2次给药。每隔2-3天测量肿瘤体积和小鼠体重。实验终点时对瘤体积数据进行统计学分析。
小鼠处死后，取肝素抗凝全血和瘤组织进行特异性杀伤T细胞(CTL)和记忆性效应型T细胞(Tem)的百分比检测。同时，获取小鼠血清后进行肝毒性相关指标的检测。
具体地，取100μL/管的外周血和瘤组织悬液，加入OT-1四聚体(MBL，TS-5001-1c)，4℃孵育30min，然后加入抗小鼠CD45 (Biolegend，103126)、抗小鼠CD3e(Biolegend，100234)、抗小鼠CD8a(MBL，D271-4)、抗小鼠CD44(Biolegend，103030) 和抗小鼠CD62L(Biolegend，104408)，4℃孵育30min；加入1 mL/管红细胞裂解液(Gibco，11814389001)，室温避光裂红5min， 3mL/管1×PBS洗1次，300μL/管1×PBS重悬,进行特异性杀伤 T细胞(CTL)和记忆性效应型T细胞(Tem)的流式检测。
结果显示，融合蛋白与模式抗原和免疫佐剂模式可以抑制 B16-OVA瘤体积的增加，抑制率达到60％。图中每一点表示来自单个动物的测定值。实验终点融合蛋白与模式抗原和免疫佐剂模式可以显著刺激CTL和Tem的产生(图6D和图6E)。融合蛋白在5.5mg/kg的剂量下对小鼠无肝毒性(图6F)。
实施例7.融合蛋白与MC38肿瘤抗原和免疫佐剂模式在小鼠体内抑制MC38皮下移植瘤的生长实验
使用hCD40×h4-1BB KI小鼠验证本申请的融合蛋白与肿瘤抗原和免疫佐剂模式是否可以抑制小鼠皮下移植瘤MC38的生长。
建立皮下移植瘤模型：经皮下注射肿瘤细胞(MC38细胞，由 ImmunoahTherapeutics,In赠送)，浓度为4x105个细胞/只动物。在注射肿瘤之后第7-9天，量取瘤体的长和宽，按照v＝ab2/2(a为瘤体长度，b为瘤体宽度)计算瘤体积。瘤体积达到80～120mm3时，随机进行分组。组别为生理盐水组、MC38肿瘤抗原和免疫佐剂组以及融合蛋白与MC38肿瘤抗原和免疫佐剂组(MC38肿瘤抗原和免疫佐剂混合给药，融合蛋白单独给药)。生理盐水组给予生理盐水(10μl/g体重)，模式抗原和免疫佐剂组给予MC38肿瘤抗原 (5mg/kg)和polyIC:LC(1.25mg/kg)的混合药物(10μl/g体重)，融合蛋白与MC38肿瘤抗原(5mg/kg)和免疫佐剂组给予融合蛋白 (5.5mg/kg)、OVA(12.5mg/kg)和polyIC:LC(1.25mg/kg)的混合药物(10μl/g体重)；进行腹腔给药，每6天一次给药，共2次给药。每隔2-3天测量肿瘤体积和小鼠的体重。实验终点时对瘤体积数据进行统计学分析。
小鼠处死后，取肝素抗凝全血和瘤组织进行特异性杀伤T细胞(CTL)和记忆性效应型T细胞(Tem)的百分比检测。
具体地，取100μL/管的外周血和瘤组织悬液，加入Adpgk四聚体(MBL,TB-5113-1)，4℃孵育30min，然后加入抗小鼠CD45 (Biolegend，103126)、抗小鼠CD3e(Biolegend，100234)、抗小鼠CD8a(MBL，D271-4)、抗小鼠CD44(Biolegend，103030)、抗小鼠CD62L(Biolegend，104408)，4℃孵育30min；加入1mL/ 管红细胞裂解液(Gibco，11814389001)，室温避光裂红5min， 3mL/管1×PBS洗1次，300μL/管1×PBS重悬,进行特异性杀伤 T细胞(CTL)和记忆性效应型T细胞(Tem)的流式检测。
结果显示，融合蛋白与肿瘤抗原和免疫佐剂模式可以抑制 MC38瘤体积的增长，抑制率达到40％左右。图中每一点表示来自单个动物的测定值。实验终点融合蛋白与MC38肿瘤抗原和免疫佐剂模式可以显著刺激CTL和Tem的产生(图7D和图7E)。
实施例8.融合蛋白瘤内给药在小鼠体内抑制MC38皮下移植瘤的生长实验
使用hCD40×h4-1BB KI小鼠验证本申请的融合蛋白瘤内给药是否可以抑制小鼠皮下移植瘤MC38的生长。
建立皮下移植瘤模型：经皮下注射肿瘤细胞(MC38细胞)，浓度为4x105个细胞/只动物。在注射肿瘤之后第7-9天，量取瘤体的长和宽，按照v＝ab2/2(a为瘤体长度，b为瘤体宽度)计算瘤体积。瘤体积达到80～120mm3时，随机进行分组。组别为生理盐水组、和融合蛋白组。生理盐水组给予生理盐水(2μl/g体重)，融合蛋白组给予融合蛋白(5.0mg/kg，2μl/g体重)；进行瘤内给药，一周2次给药，共4次给药。每隔2-3天测量肿瘤体积和小鼠的体重。实验终点时对瘤体积数据进行统计学分析。
小鼠处死后，取肝素抗凝全血和瘤组织进行记忆性效应型T细胞(Tem)和调节性T细胞(Treg)的百分比检测。同时，获取小鼠血清后进行肝毒性相关指标的检测。
具体地，取100μL/管的外周血和瘤组织悬液，加入抗小鼠 CD45(Biolegend，130112)、抗小鼠CD3e(Biolegend，100234)、抗小鼠CD8a(Biolegend，100714)、抗小鼠CD44(Biolegend， 103022)和抗小鼠CD62L(Biolegend，104408)，4℃孵育30min；加入1mL/管红细胞裂解液(Gibco，11814389001)，室温避光裂红5min，3mL/管1×PBS洗1次，300μL/管1×PBS重悬,进行记忆性效应型T细胞(Tem)的流式检测。
取100μL/管的外周血和瘤组织悬液，加入抗小鼠CD45 (Biolegend，103132)、抗小鼠CD3e(Biolegend，100204)、anti mouse、CD8a(Biolegend，100714)、抗小鼠CD4(Biolegend， 100449)和抗小鼠CD25(Biolegend，102016)，4℃孵育30min；加入1mL/管红细胞裂解液(Gibco，11814389001)，室温避光裂红5min，3mL/管1×PBS洗1次；弃上清，加入1mLFix/Perm液 (invitrogen，88-8824-00)，室温避光孵育1h，2mL的1×Perm缓冲液(invitrogen，00-833-56)洗1次，弃上清，加入抗小鼠CD25 (Biolegend，320008)，室温避光孵育30min；2mL的1×Perm 缓冲液洗1次，弃上清，300μL/管1×Perm缓冲液重悬,进行调节性T细胞(Treg)的流式检测。
结果显示，融合蛋白可以抑制MC38瘤体积的增加，抑制率达到85％。图中每一点表示来自单个动物的测定值。实验终点融合蛋白可以刺激CTL的产生(图8D)；并减少Treg的占比(图8E)。融合蛋白在5mg/kg的剂量下对小鼠无肝毒性(图8F)。
实施例9.融合蛋白瘤内给药联合放射治疗和免疫佐剂模式在小鼠体内抑制MC38皮下移植瘤的生长实验
使用hCD40×h4-1BB KI小鼠验证本申请的融合蛋白瘤内给药联合放射治疗和免疫佐剂模式是否可以抑制小鼠皮下移植瘤 B16-OVA的生长。
建立皮下移植瘤模型：经皮下注射肿瘤细胞(MC38细胞)，浓度为4x105个细胞/只动物。在注射肿瘤之后第7-9天，量取瘤体的长和宽，按照v＝ab2/2(a为瘤体长度，b为瘤体宽度)计算瘤体积。瘤体积达到80～120mm3时，随机进行分组。组别为生理盐水组、放射治疗和免疫佐剂组和融合蛋白与放射治疗和免疫佐剂组(免疫佐剂和融合蛋白分别单独给药)。生理盐水组给予生理盐水 (2μl/g体重)，免疫佐剂组给予polyIC:LC(1.25mg/kg，10μl/g体重)，融合蛋白与免疫佐剂组分别给予融合蛋白(5mg/kg，2μl/g体重)和polyIC:LC(1.25mg/kg，2μl/g体重)；进行钴源6Gy的照射后，进行瘤内给药，每6周2次给药，共4次给药。每隔2-3天测量肿瘤体积和小鼠的体重。每隔2-3天测量肿瘤体积和小鼠的体重。实验终点时对瘤体积数据进行统计学分析。
小鼠处死后，取肝素抗凝全血和瘤组织进行记忆性效应型T细胞(Tem)和调节性T细胞(Treg)的百分比检测。同时，获取小鼠血清后进行肝毒性相关指标的检测。
具体地，取100μL/管的外周血和瘤组织悬液，加入抗小鼠 CD45(Biolegend，130112)、抗小鼠CD3e(Biolegend，100234)、抗小鼠CD8a(Biolegend，100714)、抗小鼠CD44(Biolegend， 103022)和抗小鼠CD62L(Biolegend，104408)，4℃孵育30min；加入1mL/管红细胞裂解液(Gibco，11814389001)，室温避光裂红5min，3mL/管1×PBS洗1次，300μL/管1×PBS重悬,进行记忆性效应型T细胞(Tem)的流式检测。
取100μL/管的外周血和瘤组织悬液，加入抗小鼠CD45 (Biolegend，103132)、抗小鼠CD3e(Biolegend，100204)、anti mouse、CD8a(Biolegend，100714)、抗小鼠CD4(Biolegend， 100449)和抗小鼠CD25(Biolegend，102016)，4℃孵育30min；加入1mL/管红细胞裂解液(Gibco，11814389001)，室温避光裂红5min，3mL/管1×PBS洗1次；弃上清，加入1mLFix/Perm液 (invitrogen，88-8824-00)，室温避光孵育1h，2mL的1×Perm 缓冲液(invitrogen，00-833-56)洗1次，弃上清，加入抗小鼠CD25 (Biolegend，320008)，室温避光孵育30min；2mL的1×Perm 缓冲液洗1次，弃上清，300μL/管1×Perm缓冲液重悬,进行调节性T细胞(Treg)的流式检测。
结果显示，融合蛋白瘤内给药联合放射治疗和免疫佐剂模式可以抑制MC38瘤体积的增加，抑制率达到86％。图中每一点表示来自单个动物的测定值。实验终点融合蛋白瘤内给药联合放射治疗和免疫佐剂模式可以刺激CTL的产生(图9D)；并减少Treg 的占比(图9E)。融合蛋白在5mg/kg的剂量下对小鼠无肝毒性(图 9F)。
可以理解，尽管本申请以上述具体形式描述了所涉及的发明，但这些发明并不局限于这些具体形式描述的特定内容。对本领域的技术人员显而易见的是，在不偏离本申请所描述的发明精神的前提下，还可对其中所涉及的发明包含的技术特征进行各种等同变化，这些变化都应该属于所述发明的范围之内。
序列表
<110> 北京免疫方舟医药科技有限公司
<120> CD137抗体和CD40L的融合蛋白及其应用
<160> 25
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 149
<212> PRT
<213> 智人(homo sapiens)
<400> 1
Met Gln Lys Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser
1 5 10 15
Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly
20 25 30
Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln
35 40 45
Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr
50 55 60
Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser
65 70 75 80
Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala
85 90 95
Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His
100 105 110
Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn
115 120 125
Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe
130 135 140
Gly Leu Leu Lys Leu
145
<210> 2
<211> 146
<212> PRT
<213> 智人(homo sapiens)
<400> 2
Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser Glu Ala Ser
1 5 10 15
Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr
20 25 30
Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln Leu Thr Val
35 40 45
Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr Phe Cys Ser
50 55 60
Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser Leu Cys Leu
65 70 75 80
Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala Ala Asn Thr
85 90 95
His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His Leu Gly Gly
100 105 110
Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr Asp
115 120 125
Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu
130 135 140
Lys Leu
145
<210> 3
<211> 143
<212> PRT
<213> 智人(homo sapiens)
<400> 3
Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser Glu Ala Ser Ser Lys Thr
1 5 10 15
Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Ser Asn
20 25 30
Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln Leu Thr Val Lys Arg Gln
35 40 45
Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu
50 55 60
Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser Leu Cys Leu Lys Ser Pro
65 70 75 80
Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala Ala Asn Thr His Ser Ser
85 90 95
Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His Leu Gly Gly Val Phe Glu
100 105 110
Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr Asp Pro Ser Gln
115 120 125
Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu
130 135 140
<210> 4
<211> 141
<212> PRT
<213> 智人(homo sapiens)
<400> 4
Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser
1 5 10 15
Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu
20 25 30
Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu
35 40 45
Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser
50 55 60
Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg
65 70 75 80
Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys
85 90 95
Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln
100 105 110
Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser
115 120 125
His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu
130 135 140
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 6
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 7
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Ser Tyr Trp Met Asp
1 5
<210> 8
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Asn Ile Tyr Pro Asp Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Ser
<210> 9
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Glu Glu Ala Leu Gly Gly Tyr Tyr Glu Leu Thr Tyr
1 5 10
<210> 10
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser Ser Tyr Ser Tyr Met His
1 5 10 15
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Gln His Ser Trp Glu Ile Pro Tyr Thr
1 5
<210> 13
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asn Ile Tyr Pro Asp Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Glu Ala Leu Gly Gly Tyr Tyr Glu Leu Thr Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 14
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Ser Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp
85 90 95
Glu Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 15
<211> 48
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cagagatttg tgaccggcca cttcggcggc ctgtatcctg ctaatgga 48
<210> 16
<211> 53
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tgtggctgag aggtgccaga tgtgaagtgc agctggttca gtctggcgcc gaa 53
<210> 17
<211> 48
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cgcaatttga ggattctgat caccgctgcc gccgccgcct gacggtcc 48
<210> 18
<211> 46
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gaccgtcagg cggcggcggc agcggtgatc agaatcctca aattgc 46
<210> 19
<211> 55
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
caatttgagg attctgatca ccagagcctc caccagagcc tccacccccg agttt 55
<210> 20
<211> 54
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
caaactcggg ggtggaggct ctggtggagg ctctggtgat cagaatcctc aaat 54
<210> 21
<211> 48
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tgattatgat caatgaattc ctagagtttg agtaagccaa aggacgtg 48
<210> 22
<211> 47
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
acgtcctttg gcttactcaa actccagaga tttgtgaccg gccactt 47
<210> 23
<211> 44
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ctgattatga tcaatgaatt ctcatccatt agcaggatac aggc 44
<210> 24
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
Xaa Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
1 5
<210> 25
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
Glu Pro Ala Pro Cys Pro Pro Xaa
1 5

Claims (10)

1.一种融合蛋白，其包含：
a)能特异性结合4-1BB分子的Fab片段；
b)能特异性结合CD40分子的第一CD40L，所述第一CD40L的N端通过第一肽接头与所述Fab片段的轻链或重链的C端连接，
任选地，所述融合蛋白还包含：
c)能特异性结合CD40分子的第二CD40L，所述第二CD40L的N端通过第二肽接头与所述Fab片段的重链或轻链的C端连接，
其中所述第一肽接头和所述第二肽接头之间仅能形成一个二硫键，并且各自独立地选自以下：包含SEQ ID NO：24-25所示序列中的任一种的肽接头，其中X代表除Cys的任意氨基酸，或者缺失，任选地，所述第一肽接头和/或所述第二肽接头为天然抗体的铰链区，其中对铰链区进行仅保留一个半胱氨酸的突变，任选地，所述第一肽接头和/或所述第二肽接头为C239缺失突变的IgG1铰链区，或C239缺失突变，且铰链区D234-S252倒转的IgG1铰链区。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白还包含d)能特异性结合CD40分子的第三CD40L，所述第三CD40L的N端通过第三肽接头与所述第一CD40L或所述第二CD40L的C端连接，任选地，所述融合蛋白还包含e)FcBP，其中所述FcBP与所述第一CD40L、第二CD40L和第三CD40L中的任一者或多者的C端连接，任选地，所述第一肽接头与所述第一CD40L之间以及所述第二肽接头与所述第二CD40L之间还连接有第四肽接头和第五肽接头，任选地，所述第三肽接头、所述第四肽接头和所述第五肽接头各自独立地包含以下的一种或多种：SEQID NO：5所示的序列、SEQ ID NO:6所示的序列、串联连接的多个SEQ ID NO：5所示的序列和串联连接的多个SEQ ID NO：6所示的序列。
3.如权利要求1或2所述的融合蛋白，其中所述4-1BB分子和CD40分子独立地来源于哺乳动物，优选非人类的灵长类或者人类，任选地，所述Fab片段包含SEQ ID NO：7所示的HCDR1，SEQ ID NO：8所示的HCDR2，SEQ ID NO：9所示的HCDR3，任选地，所述Fab片段包含SEQID NO：10所示的LCDR1，SEQ ID NO：11所示的LCDR2，SEQ ID NO：12所示的LCDR3，任选地，所述Fab片段包含SEQ ID NO：13所示的重链可变区，任选地，所述Fab片段包含SEQ ID NO：14所示的轻链可变区，任选地，所述第一CD40L，第二CD40L和第三CD40L各自独立地包含SEQID NO：1-4中的任一项，任选地，所述FcBP包含SEQ ID NO：15所示的序列。
4.如前述权利要求任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白以至少1×10-8的亲和力特异性结合所述CD40分子，任选地，所述融合蛋白具有CD40激动剂功能，能够诱导树突状细胞的成熟和/或T细胞活化，任选地，其中所述融合蛋白以至少1×10-8的亲和力特异性结合所述4-1BB分子，任选地，所述融合蛋白具有4-1BB激动剂功能，能够诱导T细胞活化。
5.一种核酸，其编码权利要求1-4中任一项所述的融合蛋白。
6.一种表达载体，其包含权利要求5所述的核酸。
7.一种宿主细胞，其包含权利要求5所述的核酸或权利要求6所述的表达载体，任选地，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞选自CHO细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、HEK293细胞、COS细胞和PER.C6细胞。
8.制备权利要求1-4中任一项所述的融合蛋白的方法，其包括：
a)培养权利要求7所述的宿主细胞；和
b)从所述宿主细胞中或所述宿主细胞的培养物上清中回收所述融合蛋白。
9.药物组合物，其包含权利要求1-4中任一项所述的融合蛋白，权利要求5所述的核酸，权利要求6所述的表达载体或权利要求7所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体。
10.权利要求1-4中任一项所述的融合蛋白，权利要求5所述的核酸，权利要求6所述的表达载体或权利要求7所述的宿主细胞在制备用于治疗、改善或预防肿瘤、免疫相关疾病或传染性疾病的药物中的用途，任选地，所述肿瘤选自肺癌、间皮质瘤、结直肠癌、膀胱癌、白血病、乳腺癌、胃癌、胃食管结合部腺癌、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤，间变大细胞淋巴瘤、头颈癌、恶性胶质瘤、肾癌、黑色素瘤、前列腺癌、骨癌、胰腺癌、肉瘤、肝癌、皮肤鳞癌、宫颈癌、鼻咽癌、子宫内膜癌，或上述肿瘤的转移癌，任选地，所述免疫相关疾病选自系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、系统性血管炎和自身免疫性溶血性贫血，任选地，所述传染性疾病选自流行性感冒、结肠炎、HPV感染、乙型肝炎、狂犬病、梅毒、艾滋病。
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