JP2023505311A - 抗原負荷 - Google Patents

Abstract

本発明は、抗原提示細胞またはその前駆体に標的抗原を抗原負荷して、Ｔ細胞へ標的抗原を提示する方法であって、標的抗原の存在下で、抗原提示細胞またはその前駆体をＣＤ３００ｆ結合タンパク質と接触させることを含む方法に関する。本発明はまた、抗原提示細胞またはその前駆体に抗原負荷する組成物、抗原提示細胞またはその前駆体を抗原負荷する免疫複合体、および被験体における標的抗原に対するＴ細胞応答を促進または増加させる、抗原負荷された抗原提示細胞および免疫複合体の使用に関する。

Description

発明の詳細な説明

本出願は、２０１９年１２月５日に出願されたオーストラリア仮出願第２０１９９０４６１４号からの優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
［技術分野］
本発明は、抗原提示細胞またはその前駆体を抗原負荷する（antigen loading）方法、標的抗原に対するＴ細胞応答を促進または増加させる抗原負荷された抗原提示細胞またはその前駆体の使用、抗原提示細胞またはその前駆体を抗原負荷する組成物、および抗原提示細胞またはその前駆体を抗原負荷する、または被験体における標的抗原に対する免疫応答を促進または増加させるＣＤ３００ｆ結合タンパク質免疫複合体に関する。
［背景］
免疫療法とは、免疫系を活性化または抑制することにより状態または疾患を治療するために設計された治療形態である。免疫療法は、癌の治療において特に興味深いものとなっている。

細胞に基づく免疫療法は、一部の癌に有効である。Ｔリンパ球（例えば、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞および細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞）などの免疫エフェクター細胞は、癌抗原などの特異的な標的抗原が抗原提示細胞の表面においてエフェクター細胞に提示されていれば、その標的抗原を標的とすることができる。抗原提示細胞の表面上の標的抗原のＴ細胞への提示は、標的抗原を発現する細胞に対する抗原特異的Ｔ細胞応答の発端となる。

樹状細胞（ＤＣ）は抗原特異的Ｔ細胞応答を誘導する抗原提示細胞である。細胞に基づく免疫療法における最近のアプローチは、樹状細胞などの抗原提示細胞に標的抗原を負荷することにより樹状細胞ワクチンを産生することを伴う。樹状細胞への標的抗原の負荷は通常、樹状細胞を被験体から単離し、標的抗原を樹状細胞に導入することによって達成される。次に、標的抗原は樹状細胞によってプロセシングされ、樹状細胞の表面上に提示され、典型的にはＭＨＣ Ｉと複合体を形成し、樹状細胞ワクチン（ＤＣワクチン）を産生する。次いで、樹状細胞ワクチンを、標的抗原に対する免疫応答を誘導するために、被験体に投与することができる。

癌を治療するための免疫療法の最近の進歩にもかかわらず、ＤＣワクチン接種療法はまだ広く使用されるようになっていない。ＤＣワクチン接種は安全かつ有効であることが示されているが、現行のｅｘ ｖｉｖｏ負荷戦略のコストおよび送達可能性は、利用を困難にしている。

必要とされているものは、抗原負荷された抗原提示細胞、ＤＣワクチン接種および他の治療、の代替となるアプローチである。
［概要］
ＣＤ３００ｆは、染色体１７ｑ２５上の遺伝子複合体によってコードされた、免疫調節性分子ＣＤ３００ファミリーメンバーである。それは細胞質領域と細胞外ドメインを有する膜貫通糖タンパク質である。細胞質領域は抑制性ＩＴＩＭとＰＩ３Ｋリン酸化部位の両方を含む。ＣＤ３００ｆ分子にはいくつかのアイソフォームがあるが、いずれも同じＩｇ様の細胞外ドメインを共有している。

本発明者らは、ＣＤ３００ｆが抗原提示細胞およびその前駆体上で発現され、内在化され得、そしてＤＥＣ－２０５の発現プロファイルよりも制限された発現プロファイルを有することを見出した。本発明者らは、ＣＤ３００ｆモノクローナル抗体が標的抗原を送達し、そしてｉｎ ｖｉｔｒｏで標的抗原特異的Ｔ細胞応答を誘導し得ることを見出した。本発明者らはまた、抗ＣＤ３００ｆ抗体がアジュバントなしで樹状細胞を活性化し、樹状細胞の移動を促進することを示した。

第１の態様は、Ｔ細胞へ標的抗原を提示するために、抗原提示細胞またはその前駆体に前記標的抗原を抗原負荷する方法であって、標的抗原の存在下で、抗原提示細胞またはその前駆体をＣＤ３００ｆ結合タンパク質と接触させることを含む方法を提供する。

第２の態様は、Ｔ細胞へ標的抗原を提示するために、抗原提示細胞またはその前駆体に前記標的抗原を抗原負荷して、前記抗原提示細胞またはその前駆体の活性化を促進する方法であって、標的抗原の存在下で、抗原提示細胞またはその前駆体をＣＤ３００ｆ結合タンパク質と接触させることを含む方法を提供する。

第３の態様は、標的抗原をＴ細胞に提示する方法であって、以下を含む方法を提供する：
標的抗原の存在下で、抗原提示細胞またはその前駆体をＣＤ３００ｆ結合タンパク質と接触させることにより、抗原提示細胞またはその前駆体に標的抗原を抗原負荷して、抗原負荷された抗原提示細胞またはその前駆体を産生すること；および
抗原負荷された抗原提示細胞またはその前駆体を、Ｔ細胞を含む集団と共に、集団のＴ細胞への標的抗原の提示を可能にする条件下で培養すること。

第４の態様は、標的抗原に対するＴ細胞応答を促進または増加させる方法であって、以下を含む方法を提供する：
標的抗原の存在下で、抗原提示細胞またはその前駆体をＣＤ３００ｆ結合タンパク質と接触させることによって、抗原提示細胞またはその前駆体に標的抗原を抗原負荷して、抗原負荷された抗原提示細胞またはその前駆体を産生すること；および
集団のＴ細胞への標的抗原の提示を可能にし、標的抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する条件下で、Ｔ細胞を含む集団と共に、抗原負荷された抗原提示細胞またはその前駆体を培養すること。

第５の態様は、被験体中の標的抗原に対するＴ細胞応答を促進または増加させる方法であって、有効量のＣＤ３００ｆ結合タンパク質および標的抗原を被験体に投与することを含む方法を提供する。

別の第５の態様は、被験体中の標的抗原に対するＴ細胞応答を促進または増加させるときに使用する、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質および標的抗原；または被験体中の標的抗原に対するＴ細胞応答を促進または増加させる医薬の製造における、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質および標的抗原の使用、を提供する。

第６の態様は、標的抗原に対するＴ細胞応答を必要とする疾患または状態を治療する方法であって、有効量のＣＤ３００ｆ結合タンパク質および標的抗原を投与することを含む方法を提供する。

別の第６の態様は、標的抗原に対するＴ細胞応答を必要とする疾患または状態の治療に使用する、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質および標的抗原；または、標的抗原に対するＴ細胞応答を必要とする疾患または状態を治療する医薬の製造における、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質および標的抗原の使用、を提供する。

第７の態様は、抗原提示細胞またはその前駆体に標的抗原を負荷する組成物であって、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質および標的抗原を含む組成物を提供する。

第８の態様は、標的抗原に対するＴ細胞応答を促進または増加させる薬学的組成物であって、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質および標的抗原を含む組成物を提供する。

第９の態様は、抗原提示細胞またはその前駆体に標的抗原を抗原負荷する免疫複合体であって、標的抗原に連結されているＣＤ３００ｆ結合タンパク質を含む免疫複合体を提供する。

第１０の態様は、標的抗原をＴ細胞に提示することができる、抗原負荷された抗原提示細胞またはその前駆体を産生する方法であって、標的抗原の存在下で、抗原の取り込みを可能にするのに十分な時間、抗原提示細胞またはその前駆体を標的ＣＤ３００ｆ結合タンパク質と接触させることを含む方法を提供する。

第１１の態様は、標的抗原をＴ細胞に提示することができる抗原負荷された抗原提示細胞またはその前駆体を提供し、ここで抗原負荷された抗原提示細胞またはその前駆体は、標的抗原の存在下で、標的抗原の取り込みを可能にするのに十分な時間、抗原提示細胞またはその前駆体を、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質と接触させることによって産生される。

第１２の態様は、標的抗原に対するＴ細胞応答を促進する方法であって、Ｔ細胞に対する標的抗原の提示を促進する条件下で、Ｔ細胞を含む集団と共に、第１１の態様の抗原負荷された抗原提示細胞またはその前駆体をインキュベートすることを含む、方法を提供する。

第１３の態様は、被験体における標的抗原に対するＴ細胞応答を促進または増加させる方法であって、有効量の第１１の態様の抗原負荷された抗原提示細胞またはその前駆体を被験体に投与することを含む方法を提供する。

別の第１３の態様は、被験体における標的抗原に対するＴ細胞応答を促進または増加に使用する、第１１の態様の抗原負荷された抗原提示細胞またはその前駆体；または、被験体における標的抗原に対するＴ細胞応答を促進または増加させる医薬の製造における、第１１の態様の抗原負荷された抗原提示細胞またはその前駆体の使用、を提供する。

第１４の態様は、標的抗原に対するＴ細胞応答を必要とする疾患または状態を治療する方法であって、有効量の第１１の態様の抗原負荷された抗原提示細胞またはその前駆体を投与することを含む方法を提供する。

別の第１４の態様は、標的抗原に対するＴ細胞応答を必要とする疾患または状態の治療に使用する、第１１の態様の抗原負荷された抗原提示細胞またはその前駆体；または、標的抗原に対するＴ細胞応答を必要とする疾患または状態を治療する医薬の製造における、第１１の態様の抗原負荷された抗原提示細胞またはその前駆体の使用、を提供する。

第１５の態様は、被験体中の標的抗原に対する免疫応答を促進または増加させる方法であって、有効量の第１１の態様の抗原負荷された抗原提示細胞またはその前駆体を被検体に投与することを含む方法を提供する。

別の第１５の態様は、被験体中の標的抗原に対する免疫応答の促進または増加に使用する、第１１の態様の抗原負荷された抗原提示細胞またはその前駆体；または、被験体中の標的抗原に対する免疫応答を促進または増加させる医薬の製造における、第１１の態様の抗原負荷された抗原提示細胞またはその前駆体の使用、を提供する。

第１６の態様は、被験体における標的抗原に対するＴ細胞応答を促進または増加させる方法であって、有効量の第９の態様の免疫複合体を被験体に投与することを含む方法を提供する。

別の第１６の態様は、被験体における標的抗原に対するＴ細胞応答を促進または増加に使用する、第９の態様の免疫複合体；または、被験体における標的抗原に対するＴ細胞応答を促進または増加させる医薬の製造における、第９の態様の免疫複合体の使用、を提供する。

第１７の態様は、標的抗原に対するＴ細胞応答を必要とする疾患または状態を治療する方法であって、有効量の第９の態様の免疫複合体を投与することを含む方法を提供する。

別の第１７の態様は、標的抗原に対するＴ細胞応答を必要とする疾患または状態の治療に使用する、第９の態様の免疫複合体；または、標的抗原に対するＴ細胞応答を必要とする疾患または状態を治療する医薬の製造における、第９の態様の免疫複合体の使用、を提供する。

第１８の態様は、抗原提示細胞またはその前駆体をＣＤ３００ｆ結合タンパク質と接触させることを含む、抗原提示細胞またはその前駆体の活性化を促進する方法を提供する。

別の第１８の態様は、抗原提示細胞またはその前駆体の活性化の促進に使用する、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質；または、抗原提示細胞またはその前駆体の活性化を促進する医薬の製造における、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質の使用、を提供する。

第１９の態様は、抗原提示細胞またはその前駆体をＣＤ３００ｆ結合タンパク質と接触させることを含む、抗原提示細胞またはその前駆体のＣＣＬ１９および／またはＣＣＬ２１への移動を促進する方法を提供する。

第２０の態様は、抗原提示細胞またはその前駆体をＣＤ３００ｆ結合タンパク質と接触させることを含む、抗原提示細胞またはその前駆体におけるＣＣＲ７発現を増加させる方法を提供する。

第２１の態様は、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質および標的抗原を含む融合タンパク質を提供する。

第２２の態様は、配列番号１５によって表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号１６によって表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、を含むＣＤ３００ｆ結合タンパク質を提供する。

第２３の態様は、配列番号１５によって表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号１６によって表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、を含むＣＤ３００ｆ結合タンパク質を含む組成物を提供する。

第２４の態様は、配列番号１５によって表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１６によって表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含むＣＤ３００ｆ結合タンパク質をコードする核酸を提供する。
［図面の簡単な説明］
図１Ａは、３７℃での抗ＣＤ３０２、抗ＣＭＲＦ５６、抗ＣＤ３００ｆ、および抗ＤＥＣ２０５表面抗体の内在化を示したグラフである。内在化は、ＨＬ６０上のＰＥ標識されたＭＭＲＩ－２０およびＤＣＲ－２、単球細胞株、ならびにＫＭＨ２上のＦＩＴＣ標識された抗ＣＭＲＦ－５６およびＭＭＲＩ－７を使用して測定した全抗体（total antibody）を、経時的に比較することによって評価した（全抗体、塗りつぶし記号）。これをヤギ抗マウスＩｇＧ ＡＦ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ２１２３７）で検出された残りの表面Ｉｇと比較した。

図１Ｂは、単球由来ＤＣ（ＭｏＤＣ）内へのＣＤ３００ｆの内在化速度に対する、活性化の効果を示したグラフである。内在化は、単球由来ＤＣ（ＭｏＤＣ）＋／－ＬＰＳ １００ｎｇ／ｍｌで一晩評価した。

図２は、抗原提示細胞におけるＣＤ３００ｆ、ＣＤ３０２およびＤＥＣ２０５発現を示したグラフである。ＰＢＭＣをＮ＝３の健康なドナーの末梢血から単離した。ＤＣサブセットは、抗体パネルを使用するフローサイトメトリー分析によって決定した。ＣＤ３００ｆ、ＣＤ３０２およびＤＥＣ２０５の発現は、各抗原に対するビオチン化抗体で氷上にて２０分間染色し、次いで、ストレプトアビジン－ＰＥ １：１００（ＢＤ ５４０６１）で氷上にて２０分間検出することによって決定した。

図３は、正常組織全体におけるＣＤ３０２、ＣＤ３００ｆおよびＤＥＣ２０５のｍＲＮＡ発現を、ＲＮＡシーケンシングにより示したグラフである。この分析からのデータは、ｄｂＧａＰアクセッション番号ｐｈｓ００２４．ｖＮ．ｐＮから抽出した。

図４Ａは、ヒト抗原提示細胞サブセット（ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１ｃＤＣ、ＣＤ１４１ＤＣ、ｐＤＣ ＤＣ、ＣＤ１６ ＤＣ）および単球上のＣＤ３００ｆの表面発現を、にＤＣＲ－２またはＣＭＲＦ－８１（アイソタイプ対照）を用いたフローサイトメトリー分析によって示したグラフである。

図４Ｂは、１人のドナーからの骨髄系サブセットおよび単球上のＣＤ３００ｆ発現を示したグラフである。

図５は、抗体指向性抗原取り込みに対するＴ細胞応答を示したグラフである。ＰＢＭＣをＣＤ１４マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，１３０－０５０－２０１）で、４℃で１５分間染色し、ａｕｔｏＭＡＣＳセパレータを用いて磁気分離することによって、Ｎ＝３の健康なドナーのＰＢＭＣからＣＤ１４＋細胞を正の選択（positively select）をした。ＣＤ１４＋細胞は、ＧＭ－ＣＳＦ ８００Ｕ／ｍＬおよびＩＬ－４ １０００ｕ／ｍＬを補充した完全ＡＢ培地中で３．３３×１０^６／ｍＬで５日間インキュベートすることによってＭｏ－ＤＣに分化した。ＣＤ３陽性細胞を、ＥａｓｙＳｅｐ Ｈｕｍａｎ Ｔ細胞単離キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ、１７９５１）を用いてＰＢＭＣから単離し、１日目に凍結した。一次ビオチン化抗体で氷上にて２０分間染色することにより、５日目にＭｏ－ＤＣにＣＭＶ抗原を負荷し、次いでＨＣＭＶ－ｐｐ６５送達試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ １３０－０９５－４０６）で１０分間染色し、洗浄し、次いでＬＰＳ １００ｎｇ／ｍｌと共に一晩インキュベートした。５日目に、自家Ｔ細胞を解凍し、２時間静置し、ＣＳＦＥで染色した後、Ｍｏ－ＤＣに１：１０の比率で５日間添加し、その時点で細胞を採取し、フローサイトメトリーによって表現型を評価した。グラフは分裂したＴ細胞の割合（ＣＤ３ ＣＳＦＥ低Ｔ細胞の割合）を示す。

図６はＣＤ３００ファミリーメンバーとの架橋が骨髄系ＤＣに及ぼす活性化マーカー発現に及ぼす影響を示したグラフである。９６ウェル平底組織培養プレート（Ｆａｌ ３５３０７２）を、１０ｕｇ／ｍｌのＤＣＲ－２（抗ＣＤ３００ｆ）、ＵＰＨ２（抗ＣＤ３００ｅ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３３９７０２）、対照のＣＭＲＦ－８１抗体、およびＣＭＲＦ－３５（抗ＣＤ３００ａ／ｃ）、の上清で４℃にて一晩コーティングし、次いでＰＢＳで洗浄した。ＥａｓｙＳｅｐヒト骨髄系ＤＣ濃縮キット（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１９０６１）および１×１０^５の骨髄系ＤＣを用いて単離した骨髄系ＤＣを、３７℃および５％のＣＯ２で１８時間インキュベートした２００ｕｌのＲＰＭＩ１０％のＡＢ完全培地に添加した。上清はサイトカイン分析のために回収し、細胞はフローサイトメトリーによる、ＣＤ８０ Ｐｅ－Ｃｙ７（Ｌ３０７．４、ＢＤ５６１１３５）、ＣＤ８３ ＦＩＴＣ（Ｈｂ１５ａ、ＩＭ２４１０Ｕ）、ＣＤ８６ ＢＶ６５０（ＩＴ２．２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）およびＨＬＡＤＲ ＡＰＣ－Ｈ７（ｌ２４３、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用した表現型分析のために採取した。

図７Ａは、ＤＣＲ－２またはＣＭＲＦ－８１と架橋された骨髄系ＤＣを有する同種異系ＭＬＲを示したグラフである。骨髄系ＤＣをＤＣＲ－２またはＣＭＲＦ－８１と（示されるように）架橋し、ＣＳＦＥ標識Ｔ細胞と１：５の比率で混合し、ＲＭＰＩ１０％のＡＢ培地中で６日間インキュベートした。６日目に、ＣＤ３ ＡＦ ７００（ＳＰ３４－２、ＢＤ ５５９１７）、ＣＤ４ ＰｅｒＣＰ Ｃｙ５．５（ＲＰＡ－Ｔ４、ＢＤ ５６０６５０）、ＣＤ８ ＢＶ４２１（ＲＰＡ－Ｔ８、ＢＤ ５６２４２８）で染色した後、細胞を採取し、フローサイトメトリーによって分析した。分裂した細胞の割合は、各集団におけるＣＳＦＥ低細胞の頻度によって決定する。

図７Ｂは、ＤＣＲ－２またはＣＭＲＦ－８１と架橋された骨髄系ＤＣと共にインキュベートしたＴ細胞の上清中の、サイトカインＩＦＮ－γ、ＩＬ－１０およびＩＬ－１７ａの濃度を示したグラフである。６日目に上清を回収し、ＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘ Ｈｕｍａｎ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ Ｐａｎｅｌ Ｋｉｔ（カタログ番号７４０４０９）を用いてサイトカイン濃度を分析した（ｎ＝３）。

図８Ａおよび８Ｂは、ＤＣＲ－２による架橋が表面分子発現を変化させることを示したグラフである。図７ＡはＥａｓｙＳｅｐヒト骨髄系ＤＣ濃縮キット（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１９０６１）を用いて骨髄系ＤＣを単離し、ＣＭＲＦ－８１またはＤＣＲ－２と架橋した後に、フローサイトメトリーを用いて評価した、骨髄系ＤＣ上のＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ８０、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ８３、ＣＤ８６またはＴＩＭ－３の表面マーカー発現を示したグラフである。骨髄系ＤＣを架橋するために、１×１０^５の骨髄系ＤＣを、１０ｕｇ／ｍｌのＤＣＲ－２または制御ＣＭＲＦ－８１抗体と共に３７℃および５％ＣＯ_２で１８時間インキュベートした２００ｕｌのＲＰＭＩ１０％のＡＢ完全培地に添加した。図８Ｂは単球上のＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ８０、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ８３、ＣＤ８６またはＴＩＭ－３の表面マーカー発現を示したグラフであり、磁気分離およびＣＤ１４マイクロビーズ（１３０－０５０－２０１）を用いた単球の単離、およびＣＭＲＦ－８１またはＤＣＲ－２との１８時間の架橋後に、フローサイトメトリーを用いて評価した。

図９Ａおよび９Ｂは、ＣＣＲ７の発現および移動に対するＤＣＲ－２との架橋の効果を示したグラフである。図９Ａは、ＤＣＲ－２またはＣＭＲＩ－８１と架橋された骨髄系樹状細胞のＣＣＲ７発現およびＣＣＬ２１およびＣＣＬ１９への移動を示したグラフである。図９Ｂは、ＤＣＲ－２またはＣＭＲＩ－８１と架橋された単球のＣＣＲ２発現およびＣＣＬ２への移動を示したグラフである。架橋された骨髄系ＤＣは採取し、ＣＣＲ７ ＰＥ（Ｒ＆Ｄ、ＦＡＢ１９７Ｐ）で３７℃にて１５分間染色した。架橋されたＤＣまたは単球の移動は、ケモカインを含まない場合と比較して、すべてＲＰＭＩ（１％ＢＳＡ、ＰＳＧ）中で、トランスウェル（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３４２１）を横切って、４時間で０．１ｕｇ／ｍｌの濃度でＣＣＬ１９に向かって、または２時間で１００ｎｇ／ｍｌでＣＣＬ２１に向かって、もしくは２時間でＣＣＬ２に向かって、移動したＤＣまたは単球の数を決定することによって評価した。ＤＣを、Ｌｉｎ２ ＦＩＴＣ（ＣＤ３／１４／１９／２０／５６、ＢＤ ６４３３９７）およびＨＬＡ－ＤＲ ＡＰＣ－Ｈ７（Ｉ２４３、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色したトランスウェルの底部から採取し、Ｃｏｕｎｔ ｂｒｉｇｈｔ Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ｃｏｕｎｔ Ｂｅａｄｓ ２５００／ｍｌを含む２００ｕｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。移動した細胞の数は、（ｌｉｎ－ＤＲ＋細胞／計測ビーズ）×５０００ビーズの数として計算した。移動指数＝＃細胞移動ケモカイン／＃細胞移動ケモカインなし。スチューデントＴ試験を適用した（^＊ｐ＜０．０５）。

図１０は、単球に対するＤＣＲ－２の架橋の効果を示したグラフである。９６ウェル平底組織培養プレート（Ｆａｌ ３５３０７２）を、１０ｕｇ／ｍｌのＤＣＲ－２（抗ＣＤ３００ｆ）、対照のＣＭＲＦ－８１抗体またはＰＢＳ対照で、４℃にてコーティングし、次いでＰＢＳで洗浄した。ＣＤ１４＋細胞を、ＣＤ１４＋マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ １３０－０５０－２０１）を用いてＮ＝４の健康なドナーから正の選択をし、ＡｕｔｏＭａｃを用いて磁気分離した。１×１０^５のＣＤ１４＋細胞を、３７℃および５％のＣＯ２で１８時間インキュベートした２００μＬのＲＰＭＩ１０％のＡＢ完全培地に添加した。上清はサイトカイン分析のために回収し、細胞は、ＣＤ８０ Ｐｅ－Ｃｙ７（Ｌ３０７．４、ＢＤ５６１１３５）、ＣＤ８３ ＦＩＴＣ（Ｈｂ１５ａ、ＩＭ２４１０Ｕ）、ＣＤ８６ ＢＶ６５０（ＩＴ２．２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）およびＨＬＡＤＲ ＡＰＣ－Ｈ７（ｌ２４３、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用するフローサイトメトリー分析のために採取した。

図１１は、ＤＣＲ－２の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列、ならびにＤＣＲ－２のマウス（上）およびヒト化（下）軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。ＣＤＲ配列は枠で囲っている。配列をヒト化するために置換されたアミノ酸には、ヒト化配列において下線が引かれている。

図１２は、ＤＣＲ－２の重鎖可変領域のヌクレオチド配列、ならびにＤＣＲ－２のマウス（上）およびヒト化（下）軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。ＣＤＲ配列は枠で囲っている。配列をヒト化するために置換されたアミノ酸には、ヒト化配列において下線が引かれている。

図１３は、マウスＤＣＲ－２（ｍＤＣＲ－２）、キメラＤＣＲ－２およびヒト化ＤＣＲ－２の、Ｕ９３７細胞への結合を示したグラフである。
［詳細な説明］
本開示は、Ｔ細胞へ標的抗原を提示するために、抗原提示細胞またはその前駆体に前記標的抗原を抗原負荷する一つの形態に関する。

本明細書中で使用される場合、「抗原提示細胞またはその前駆体に標的抗原を抗原負荷する」という語句は、標的抗原を抗原提示細胞またはその前駆体に導入し、標的抗原またはその部分が、標的抗原に対する抗原特異的Ｔ細胞応答を促進し得る方法で、細胞の表面上に提示されるようにすることをいう。

本発明者らは、標的抗原の存在下で、抗原提示細胞またはその前駆体をＣＤ３００ｆ結合タンパク質と接触させると、結合タンパク質および標的抗原の取り込み、ならびに標的抗原に対する抗原特異的Ｔ細胞応答を促進し得る方法での抗原提示細胞の細胞表面上の標的抗原の提示が生じることを見出した。したがって本発明者らは、例えば、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質を使用して抗原提示細胞またはその前駆体に標的抗原が負荷されるＤＣワクチンの調製に、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質が使用され得ることを想定する。

よって、一態様はＴ細胞へ標的抗原を提示するために、抗原提示細胞またはその前駆体に前記標的抗原を抗原負荷する方法であって、標的抗原の存在下で、抗原提示細胞またはその前駆体をＣＤ３００ｆ結合タンパク質と接触させることを含む方法を提供する。

別の態様は、標的抗原をＴ細胞に提示することができる、抗原負荷された抗原提示細胞またはその前駆体を産生する方法であって、標的抗原の存在下で、抗原提示細胞による抗原の取り込みを可能にするのに十分な時間、抗原提示細胞またはその前駆体を標的ＣＤ３００ｆ結合タンパク質と接触させることを含む方法を提供する。

一実施形態においては、抗原提示細胞またはその前駆体は、抗原提示細胞またはその前駆体をＣＤ３００ｆ結合タンパク質および標的抗原を含む免疫複合体と接触させることによって、標的抗原の存在下でＣＤ３００ｆ結合タンパク質と接触される。一実施形態においては、免疫複合体は、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質および標的抗原を含む融合タンパク質である。

一実施形態においては、抗原提示細胞は樹状細胞（ＤＣ）である。一実施形態においては、樹状細胞は骨髄系樹状細胞（Ｍｏ－ＤＣ）である。一実施形態においては、骨髄系ＤＣは、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１ｃおよびＣＤ１６から選択されるマーカーの１つ以上を発現する。一実施形態において、骨髄系ＤＣはＣＤ１１ｃを発現する。一実施形態においては、骨髄系ＤＣはＣＤ１ｃを発現する。一実施形態においては、骨髄系ＤＣはＣＤ１６を発現する。一実施形態においては、骨髄系ＤＣは、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１ｃおよびＣＤ１６を発現する。

一実施形態においては、抗原負荷された抗原提示細胞またはその前駆体は、ＤＣワクチンである。

一実施形態においては、抗原提示細胞の前駆体は単球である。

一実施形態においては、抗原提示細胞またはその前駆体をＣＤ３００ｆ結合タンパク質と接触させることが、抗原提示細胞またはその前駆体の活性化を促進する。

一実施形態においては、抗原提示細胞またはその前駆体の活性化は、１つ以上の活性化マーカーの発現を増加させる。

一実施形態においては、活性化マーカーは、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、およびＨＬＡ－ＤＲから選択される１つ以上のタンパク質である。

一実施形態においては、抗原提示細胞は樹状細胞であり、活性化マーカーはＣＤ８０、ＣＤ８３およびＣＤ８６である。

本発明者らは、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質を用いて、標的抗原を負荷された抗原提示細胞が、標的抗原に対する抗原特異的Ｔ細胞応答を生じることを示した。

よって、一態様において、標的抗原をＴ細胞に提示する方法であって、以下を含む方法が提供される：
（ａ）抗原提示細胞またはその前駆体による標的抗原の取り込みを可能にするのに十分な時間、標的抗原の存在下で、抗原提示細胞またはその前駆体をＣＤ３００ｆ結合タンパク質と接触させることによって、抗原提示細胞またはその前駆体に標的抗原を抗原負荷して、抗原負荷された抗原提示細胞またはその前駆体を産生すること；
（ｂ）集団のＴ細胞への抗原の提示を促進する条件下で、Ｔ細胞を含む集団と共に、抗原負荷された抗原提示細胞またはその前駆体を培養すること。

別の態様は、標的抗原に対するＴ細胞応答を促進または増加させる方法であって、以下を含む方法を提供する：
（ａ）抗原提示細胞またはその前駆体による標的抗原の取り込みを可能にするのに十分な時間、標的抗原の存在下で、抗原提示細胞またはその前駆体をＣＤ３００ｆ結合タンパク質と接触させることによって、抗原提示細胞またはその前駆体に標的抗原を抗原負荷して、抗原負荷された抗原提示細胞またはその前駆体を産生すること；
（ｂ）集団のＴ細胞への抗原の提示を促進する条件下で、Ｔ細胞を含む集団と共に、抗原負荷された抗原提示細胞またはその前駆体を培養すること。

抗原提示およびＴ細胞刺激のためにＴ細胞集団を培養する方法は、当該分野で公知である。

一実施形態においては、Ｔ細胞を含む集団がＣＤ３^＋Ｔ細胞を含むリンパ球集団を含む。一実施形態においては、Ｔ細胞を含む集団がＣＤ３^＋、ＣＤ８^＋Ｔ細胞を含むリンパ球集団を含む。一実施形態においては、Ｔ細胞を含む集団がＣＤ３^＋、ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞を含むリンパ球集団を含む。

一実施形態においては、Ｔ細胞を含む集団が細胞傷害性Ｔ細胞を含む。Ｔ細胞集団の調製のための方法は当該分野で公知であり、例えば、Hsu et al., (2018) A blood dendritic cell vaccine for acute myeloid leukemia expands anti-tumor T cell responses at remission, OncoImmunology, 7:4, e1419114に記載されている。

一態様は、本明細書中に記載される抗原負荷された抗原提示細胞またはその前駆体と共に培養することによって活性化されたＴ細胞を含むＴ細胞集団を提供する。

被験体におけるＴ細胞応答を促進または増加させるために、抗原負荷された抗原提示細胞またはその前駆体が被験体に投与されてもよい。

よって、一態様において、被験体において標的抗原をＴ細胞に提示する方法であって、以下を含む方法が提供される：
（ａ）抗原提示細胞またはその前駆体による標的抗原の取り込みを可能にするのに十分な時間、標的抗原の存在下で、抗原提示細胞またはその前駆体をＣＤ３００ｆ結合タンパク質と接触させることによって、抗原提示細胞またはその前駆体に標的抗原を抗原負荷して、抗原負荷された抗原提示細胞またはその前駆体を産生すること；
（ｂ）抗原負荷された抗原提示細胞またはその前駆体を被験体に投与すること。

別の態様は、被験体中の標的抗原に対するＴ細胞応答を促進または増加させる方法であって、以下を含む方法を提供する：
（ａ）抗原提示細胞またはその前駆体による標的抗原の取り込みを可能にするのに十分な時間、標的抗原の存在下で、抗原提示細胞またはその前駆体をＣＤ３００ｆ結合タンパク質と接触させることによって、抗原提示細胞またはその前駆体に標的抗原を抗原負荷して、抗原負荷された抗原提示細胞またはその前駆体を産生すること；
（ｂ）抗原負荷された抗原提示細胞またはその前駆体を被験体に投与すること。
＜ＣＤ３００ｆ結合タンパク質＞
ＣＤ３００ｆ結合タンパク質はＣＤ３００ｆに特異的に結合し、内在化される、任意のタンパク質であってもよい。

ＣＤ３００ｆは、染色体１７ｑ２５上の遺伝子複合体によってコードされた、免疫調節性分子ＣＤ３００ファミリーメンバーである。それは細胞質領域と細胞外ドメインを有する膜貫通糖タンパク質である。細胞質領域は抑制性ＩＴＩＭとＰＩ３Ｋリン酸化部位の両方を含む。ＣＤ３００ｆ分子にはいくつかのアイソフォームがあるが、いずれも同じＩｇ様の細胞外ドメインを共有している。

一実施形態においては、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質はＣＤ３００ｆに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片である。一実施形態においては、抗体またはその抗原結合断片は、ＣＤ３００ｆの細胞外ドメインに特異的に結合する。

本発明者らは、ＣＤ３００ｆの細胞外ドメインに特異的に結合する、本明細書中でＤＣＲ－２と呼ばれるモノクローナル抗体を以前に産生した。ＤＣＲ－２はＷＯ２０１８／０９４４６０に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＤＣＲ－２を産生するハイブリドーマを、CellBank Australia, 214 Hawkesbury Rd., Westmead, NSW 2145, Australiaに、２０１６年９月２７日にブダペスト条約の下で寄託し、アクセッション番号ＣＢＡ２０１６００２９と指定された。

一実施形態においては、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質が以下を含む：
（ａ）以下を含む重鎖可変領域：
（ｉ）配列番号１によって表されるアミノ酸配列のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一、典型的には少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるアミノ酸配列；ならびに／または
（ｉｉ）配列番号２によって表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号３によって表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、および／もしくは配列番号４によって表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）；ならびに
（ｂ）以下を含む軽鎖可変領域：
（ｉ）配列番号５によって表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一、典型的には少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるアミノ酸配列；ならびに／または
（ｉｉ）配列番号６によって表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号７によって表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、および／もしくは配列番号８によって表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）。

一実施形態においては、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質が以下を含む：
（ａ）配列番号２によって表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号３によって表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、および配列番号４によって表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域；ならびに
（ｂ）配列番号６によって表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号７によって表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、および配列番号８によって表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域。

一実施形態においては、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質が以下を含む：
（ａ）配列番号１によって表されるアミノ酸配列のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一、典型的には少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号２によって表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号３によって表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、および配列番号４によって表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）；ならびに
（ｂ）配列番号５によって表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一、典型的には少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％が同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、ならびに配列番号６によって表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号７によって表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、および配列番号８によって表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）。

一実施形態において、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質は、配列番号１によって表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号５によって表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

ＤＣＲ－２の重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）のアミノ酸配列は、以下のアミノ酸配列によって表される：
ＭＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＰＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＧＦＳＧＳＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＧＱＩＮＰＤＳＳＴＩＮＹＴＰＳＬＫＤＫＦＩＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＩＮＫＶＲＳＥＤＴＡＬＹＹＣＡＲＲＧＦＦＥＧＹＳＡＷＦＡＹＷ（配列番号１）。

ＤＣＲ－２の重鎖可変領域のＣＤＲ１のアミノ酸配列は、アミノ酸配列ＧＦＧＦＳＧＳＷ（配列番号２）によって表される。

ＤＣＲ－２の重鎖可変領域のＣＤＲ２のアミノ酸配列は、アミノ酸配列ＩＮＰＤＳＳＴＩ（配列番号３）によって表される。

ＤＣＲ－２の重鎖可変領域のＣＤＲ３のアミノ酸配列は、アミノ酸配列ＡＲＲＧＦＦＥＧＹＳＡＷＦＡＹ（配列番号４）によって表される。

ＤＣＲ－２の軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）のアミノ酸配列は、以下のアミノ酸配列によって表される：
ＩＬＭＴＱＴＰＫＦＬＬＶＳＡＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＳＶＳＮＤＶＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＳＬＬＩＹＹＡＳＮＲＮＴＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＹＥＴＤＦＴＦＴＩＳＴＶＱＡＥＤＬＡＶＹＦＣＱＱＤＹＴＳＰＷＴＦＧＧＧ（配列番号：５）。

ＤＣＲ－２の軽鎖可変領域のＣＤＲ１のアミノ酸配列は、アミノ酸配列ＱＳＶＳＮＤ（配列番号６）によって表される。

ＤＣＲ－２の軽鎖可変領域のＣＤＲ２のアミノ酸配列は、アミノ酸配列ＹＡＳ（配列番号７）によって表される。

ＤＣＲ－２の軽鎖可変領域のＣＤＲ３のアミノ酸配列は、アミノ酸配列ＱＱＤＹＴＳＰＷＴ（配列番号８）によって表される。

一実施形態においては、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質が以下を含む：
（ａ）以下を含む重鎖可変領域：
（ｉ）配列番号１によって表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一、典型的には少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列；または
（ｉｉ）配列番号２によって表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号３によって表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、および／もしくは配列番号４によって表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）；ならびに
（ｂ）以下を含む軽鎖可変領域：
（ｉ）配列番号５によって表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一、典型的には少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列；または
（ｉｉ）配列番号６によって表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号７によって表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、および／もしくは配列番号８によって表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）。

一実施形態においては、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質が以下を含む：
（ａ）以下を含む重鎖可変領域：
（ｉ）配列番号１によって表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一、典型的には少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列；ならびに／または
（ｂ）以下を含む軽鎖可変領域：
（ｉ）配列番号５によって表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一、典型的には少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列。

一実施形態においては、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質が以下を含む：
（ａ）以下を含む重鎖可変領域：
（ｉ）配列番号２によって表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号３によって表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、および配列番号４によって表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）；または
（ｂ）以下を含む軽鎖可変領域：
（ｉ）配列番号６によって表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号７によって表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、および配列番号８によって表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）である。

一実施形態においては、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質が以下を含む：
（ａ）以下を含む重鎖可変領域：
（ｉ）配列番号２によって表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号３によって表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、および配列番号４によって表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）；ならびに
（ｂ）以下を含む軽鎖可変領域：
（ｉ）配列番号６によって表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号７によって表されるアミノ酸配列と同一である相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、および配列番号８によって表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）。

一実施形態においては、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質は、配列番号１によって表されるアミノ酸配列と１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。

一実施形態においては、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質は、配列番号５によって表されるアミノ酸配列と１００％同一である軽鎖可変領域を含む。

本発明者らは、ＤＣＲ－２の重鎖および軽鎖可変領域をさらにヒト化した。ＤＣＲ－２のヒト化重鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）のアミノ酸配列は、以下のアミノ酸配列によって表される：
ＭＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＧＦＳＧＳＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＮＩＮＰＤＳＳＴＩＹＹＶＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＧＦＦＥＧＹＳＡＷＦＡＹＷ（配列番号１５）
ＤＣＲ－２のヒト化軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）のアミノ酸配列は、以下のアミノ酸配列によって表される：
ＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＳＶＳＮＤＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＹＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＤＹＴＳＰＷＴＦＧＧＧ（配列番号１６）。

一実施形態においては、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質が配列番号１５によって表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号１６によって表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

種々の実施形態において、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質は以下を含む：
（ａ）配列番号１または１５によって表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｂ）配列番号１によって表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、典型的には少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｃ）配列番号５または１６によって表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（ｄ）配列番号５によって表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、典型的には少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（ｅ）配列番号１によって表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号５によって表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（ｆ）配列番号１によって表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一、典型的には少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号５によって表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一、典型的には少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（ｇ）配列番号２によって表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；
（ｈ）配列番号３によって表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；
（ｉ）配列番号４によって表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；
（ｊ）配列番号２によって表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、および配列番号３によって表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；
（ｋ）配列番号２によって表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、および配列番号４によって表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；
（ｌ）配列番号３によって表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号４によって表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；
（ｍ）配列番号２によって表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号３によって表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号４によって表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；
（ｎ）配列番号６によって表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；
（ｏ）配列番号７によって表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；
（ｐ）配列番号８によって表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３；
（ｑ）配列番号６によって表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、および配列番号７によって表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；
（ｒ）配列番号６によって表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、および配列番号８によって表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３；
（ｓ）配列番号７によって表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号８によって表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３；
（ｔ）配列番号６によって表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号７によって表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号８によって表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３；
（ｕ）配列番号２によって表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、および配列番号６によって表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；
（ｖ）配列番号３によって表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号７によって表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；
（ｗ）配列番号４によって表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、および配列番号８によって表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３；
（ｘ）配列番号２によって表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号３によって表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号６によって表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、および配列番号７によって表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；
（ｙ）配列番号２によって表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号４によって表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号６によって表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、および配列番号８によって表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３；
（ｚ）配列番号３によって表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号４によって表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号７によって表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号８によって表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３；
（ａａ）配列番号２によって表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号３によって表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号４によって表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号６によって表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号７によって表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号８によって表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３；
（ｂｂ）配列番号１によって表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一、典型的には少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号２によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号４によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
（ｃｃ）配列番号５によって表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一、典型的には少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号６によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号８によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
（ｄｄ）配列番号１によって表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一、典型的には少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号２によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号４によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号５によって表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一、典型的には少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号６によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号８によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
（ｅｅ）配列番号１５によって表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、典型的には少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号１６によって表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、典型的には少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（ｆｆ）配列番号１５によって表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号１６によって表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（ｇｇ）配列番号１５によって表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号５によって表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一、典型的には少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号６によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号８によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
（ｈｈ）配列番号１によって表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一、典型的には少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号２によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号４によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号１６によって表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。

一実施形態においては、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質は、配列番号１３によって表されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む。

一実施形態においては、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質は、配列番号１４によって表されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

一実施形態においては、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質は、配列番号１または１５によって表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号５または１６によって表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、を含む。

一実施形態においては、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質は、配列番号１または１５によって表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号５または１６によって表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、を含む。

一実施形態においては、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質は、配列番号２によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号４によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号６によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号８によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、を含む。

一実施形態においては、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質は、配列番号１によって表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号２によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号４によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号５によって表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号６によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号８によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、を含む。

一実施形態においては、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質は、配列番号１によって表されるアミノ酸配列と少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号２によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号４によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号５によって表されるアミノ酸配列と少なくとも７５％同一であり、配列番号６によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号８によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、を含む。

２つのアミノ酸配列間の同一性の割合は、例えば、配列解析プログラムのＦＡＳＴＡパッケージ（Lipman & Pearson, (1985)Science 227(4693): 1435-1441）；ＢＬＡＳＴ（Altschul et al. J.Mol.Biol.215(3):403-410）を含む、当技術分野で公知の任意のアラインメントアルゴリズムを用いて決定することができる。

一実施形態においては、抗体またはその抗原結合断片が、１０^－７Ｍ未満、典型的には１０^－８Ｍ未満、１０^－９Ｍ未満、９×１０^－１０Ｍ未満、８×１０^－１０未満、７×１０^－１０未満、６×１０^－１０未満、５×１０^－１０未満、または４×１０Ｍ^－１０未満の範囲の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）で、ヒトＣＤ３００ｆに結合する。

一実施形態においては、抗体またはその抗原結合断片が１×１０^－１０～１×１０^－７Ｍ、典型的には１×１０^－１０～１×１０^－７Ｍ、１×１０^－１０～１×１０^－８Ｍ、１×１０^－１０～１×１０^－９Ｍ、１×１０^－１０～９×１０^－１０Ｍ、１×１０^－１０～８×１０^－１０Ｍまたは１×１０^－１０～７ｘ１０^－１０Ｍ、２×１０^－１０～６×１０^－１０Ｍ、または３×１０^－１０～５×１０^－１０Ｍの範囲にある平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）で、ヒトＣＤ３００ｆに結合する。

一実施形態においては、抗体またはその抗原結合断片は、約１×１０^６Ｍ^－１ｓ^－１以下のＫ_Ａで、ヒトＣＤ３００ｆに結合する。種々の実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、１×１０^５～５×１０^６Ｍ^－１ｓ^－１、典型的には１×１０^５～１×１０^６Ｍ^－１ｓ^－１の範囲にあるＫ_Ａで、ヒトＣＤ３００ｆに結合する。

一実施形態においては、抗体またはその抗原結合断片は、５×１０^－２ｓ^－１以下、典型的には１×１０^－２ｓ^－１以下、５×１０^－３ｓ^－１以下、１×１０^－３ｓ^－１以下、または５×１０^－４ｓ^－１以下、４×１０^－４ｓ^－１以下、３×１０^－４ｓ^－１以下、または２×１０^－４ｓ^－１以下のオフレートで、ヒトＣＤ３００ｆに結合する。

一実施形態においては、抗体またはその抗原結合断片は、５×１０^－２ｓ^－１～１×１０^－５ｓ^－１、１×１０^－２～５×１０^－５ｓ^－１、５×１０^－３～５×１０^－４ｓ^－１、１×１０^－３～５×１０^－４ｓ^－１、または１×１０^－３～１×１０^－４ｓ^－１の範囲にあるオフレートでヒトＣＤ３００ｆに結合する。

抗体は、抗原に特異的に結合可能である免疫グロブリン分子である。抗体は、キメラ、ヒト化、脱免疫化、ＣＤＲ移植、合成ヒト化、二重特異性、またはヒトを含む、組換えまたは修飾がされていてもよい。全長抗体は、典型的には２つの重鎖に共有結合した２つの軽鎖を含む。全長抗体の各重鎖は、重鎖可変領域および重鎖定常領域を含む。全長抗体の各軽鎖は、軽鎖可変領域および軽鎖定常領域を含む。全長抗体は、以下のタイプのいずれかであってもよい：ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＡ。一実施形態においては、抗体はＩｇＧである。

本明細書中で使用される場合、抗体の「抗原結合断片」は、抗体の抗原結合ドメインを含み、典型的には、全長抗体と同じエピトープに特異的に結合する抗体の一部を含む。典型的には、抗体の抗体断片は、抗体の重鎖および／または軽鎖の可変領域の一部を含む。典型的には、抗原結合断片は、重鎖可変領域のＣＤＲ１、２および／もしくは３領域、ならびに／または軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および／もしくは３領域、を含む。より典型的には、抗原結合断片が重鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３領域、ならびに／または軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３領域、を含む。さらにより典型的には、抗原結合断片が重鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３領域、ならびに軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３領域を含む。いくつかの実施形態において、抗体の抗原結合断片は、抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。重鎖および軽鎖可変領域の当該部分は、Ｆｖ断片などの別々のポリペプチド鎖上にあってもよく、または軽鎖および重鎖可変領域がペプチドリンカー（「ｓｃＦｖタンパク質」）によって接続されている単一のポリペプチド鎖中にあってもよい。抗体の抗原結合断片の例には、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ、ｓｃＦｖなどが含まれてもよい。

本明細書中で使用される場合、抗体の抗原結合断片は、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ、またはｓｃＦｖなどの、抗体の抗原結合ドメインを含む１つ以上のポリペプチドを包含する。

「抗原結合ドメイン」は、抗原に特異的に結合することができる抗体の領域を指す。典型的には、抗原結合ドメインは、抗体の軽鎖可変領域由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／もしくはＣＤＲ３、ならびに／または重鎖可変領域由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／もしくはＣＤＲ３を含む。より典型的には、抗原結合ドメインは、抗体の軽鎖可変領域由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに／または重鎖可変領域由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３を含む。さらにより典型的には、抗原結合ドメインは、抗体の軽鎖可変領域由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに重鎖可変領域由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。

「可変領域」という用語は、抗原に特異的に結合することができる抗体の軽鎖および／または重鎖の部分を指す。可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）およびフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。フレームワーク領域は、相補性決定領域以外の可変領域である。

「相補性決定領域」という用語は、抗体が抗原に特異的に結合する能力の主な原因で抗体の軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域の可変領域の３つのアミノ酸配列のうちの１つを指す。軽鎖および重鎖の可変領域の３つの相補性決定領域は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と呼ばれる。

軽鎖および重鎖可変領域のＣＤＲ領域およびフレームワーク領域（ＦＲ）を決定するための方法は、当該分野で公知である。例えば、ＣＤＲおよびＦＲに割り当てられるアミノ酸位置は、Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institute of Health, Bethesda, MD, 1987 and 1991; Enhanced Clothia Numbering Scheme; Clothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917; Clothia et al. Nature 342: 877-883; Honnegher and Plukthun, J. Mol. Biol. 309: 657-670に従って定義されてもよい。抗体またはその抗原結合断片は、ＣＤ３００ｆの細胞外ドメインに特異的に結合する。本明細書中で使用される場合、「ＣＤ３００ｆの細胞外ドメインに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片」は、他の抗原とより頻繁に、より迅速に、より長い時間にわたって、またはより大きな親和性で、ＣＤ３００ｆの細胞外ドメインと連携する抗体またはその抗原結合断片である。

抗体由来の可変ドメインは当該分野で公知であり、そして例えば、Sambrook and Russell, Eds, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3^rdEd, vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001に記載される従来の技術を使用して、クローニングされてもよい。一般に、マウス抗体などの抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域配列は、ＲＴ－ＰＣＲ、５’－ＲＡＣＥ、およびｃＤＮＡライブラリースクリーニングなどの様々な分子クローニング手順によって得ることができる。

本明細書中で使用される場合、キメラ抗体は１つの種に由来する抗体、典型的にはマウス抗体、の相補性決定領域（ＣＤＲ）、典型的には可変領域を含む抗体タンパク質であり、一方、抗体分子の定常ドメイン、およびいくつかの実施形態において、フレームワーク領域（ＦＲ）は、ヒトなどの別の種に由来する。

ヒト化抗体はＣＤＲのアミノ酸配列が１つの種由来の抗体に由来するキメラ抗体の形態であり、一例として、マウス抗体であり、ならびに定常領域のアミノ酸配列、および典型的にはフレームワーク領域はヒト抗体に由来するものである。

一実施形態においては、抗体またはその抗原結合断片は、キメラ抗体である。キメラ抗体は、ＤＣＲ－２の相補性決定領域（ＣＤＲ）、および典型的にはＦＲを含む。キメラ抗体は、ヒト抗体の軽鎖および重鎖定常領域を含んでもよい。キメラ化モノクローナル抗体に由来する抗体成分の使用は、マウス定常領域の免疫原性に連携する潜在的な問題を軽減する。典型的には、抗体はヒト化抗体である。マウス抗体および抗体断片のヒト化は当業者に公知であり、そして例として、ＵＳ５２２５５３９；ＵＳ６０５４２９７；およびＵＳ７５６６７７１に記載される。例えば、ヒト化モノクローナル抗体はマウス免疫グロブリンの重鎖および軽鎖可変鎖からのマウス相補的決定領域をヒト可変領域に移し、次いで、マウス対応物のフレームワーク領域中のヒト残基を置換することによって産生されてもよい。ヒトフレームワーク領域配列の使用は、ヒト定常領域配列に加えて、ＨＡＭＡ反応を誘導する機会をさらに減少させる。

抗体は、種々の十分に確立された技術によって、血清およびハイブリドーマ培養物から単離および精製され得る。このような単離技術には、プロテインＡセファロースによるアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーが含まれる。例えば、Baines et al., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)," in Methods in Molecular Biology, Vol. 10, pages 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992)を参照されたい。

いくつかの実施形態においては、抗体の抗原結合断片は、抗体の重鎖および／または軽鎖可変領域の部分を含む。重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域の部分は、Ｆｖ断片などの別々のポリペプチド鎖上にあってもよく、または軽鎖可変領域および重鎖可変領域がペプチドリンカー（例えばｓｃＦｖタンパク質）によって接続されている単一のポリペプチド鎖中にあってもよい。抗体断片の例として、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ、ｓｃＦｖなどが含まれる。典型的には、抗体断片が重鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３領域ならびに／または軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３領域を含む。特定のエピトープを認識する抗体断片は、公知の技術によって生成され得る。Ｆ（ａｂ’）_２断片は例えば、抗体分子のペプシン消化によって産生される。これらおよび他の方法は、例えばHarlow & Lane (Eds.) Antibodies: A Laboratory Manual, CSHL Press, 1988.に記載されている。あるいは、Ｆａｂ’発現ライブラリーは、所望の特異性を有するＦａｂ’断片の迅速かつ容易な同定を可能にするように構築され得る。

いくつかの実施形態においては、抗体の抗原結合断片が一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）であってもよい。一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）は、典型的には軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む。軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、典型的にはペプチドリンカー（Ｌ）によって共有結合され、折り畳まれて抗原結合部位を形成する。重鎖可変領域および軽鎖可変領域は共に直接接合されてもよい一方で、当業者は当該領域が、１つ以上のアミノ酸からなるペプチドリンカーによって分離され得ることを認識しているであろう。ペプチドリンカーおよびそれらの使用は、当該分野で公知である。一般に、ペプチドリンカーは当該領域を接合すること、または重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間のある最小距離または他の空間的関係を保存すること以外に、特定の生物学的活性を有さない。しかし、ペプチドリンカーの構成アミノ酸は折り畳み、正味の電荷、または疎水性などの分子のいくつかの特性に影響を及ぼすように選択されてもよい。一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体は、任意に、５０アミノ酸以下、一般的には４０アミノ酸以下、好ましくは３０アミノ酸以下、より好ましくは２０アミノ酸以下、の長さのペプチドリンカーを含む。

ｓｃＦｖ抗体を作製する方法は当該分野で公知であり、そして例えば、US5260203; Lo(Ed), Antibody Engineering: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, v. 248): p117-134 and 161-190.に記載されている。簡潔には、免疫された動物由来のＢ細胞由来のｍＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡを調製する。ｃＤＮＡは、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖可変領域に特異的なプライマーを使用して増幅される。ＰＣＲ産物を精製し、そして核酸配列を接合する。リンカーペプチドが所望される場合、ペプチドをコードする核酸配列は、重鎖核酸配列と軽鎖核酸配列との間に挿入される。ｓｃＦｖをコードする核酸をベクターに挿入し、適切な宿主細胞中で発現させる。所望の抗原に特異的に結合するｓｃＦｖは、典型的にはファージディスプレイライブラリーのパニング（panning）によって見出される。パニングは、いくつかの方法のいずれかによって行うことができる。パニングは、その表面上に所望の抗原を発現する細胞を使用して、または所望の抗原でコーティングされた固体表面を使用して、都合よく実施され得る。好都合には、表面は磁気ビーズであり得る。結合していないファージを固体表面から洗い流し、結合したファージを溶出する。

抗体の他の抗原結合断片を調製するための方法は、当該分野で公知である。例えば、抗原結合断片はまた、全長抗体のタンパク質分解加水分解によって、または断片をコードするE. coliまたは別のＤＮＡ宿主の中での発現によって調製され得る。抗体断片は、従来の方法による全長抗体のペプシンまたはパパイン消化によって得ることができる。例えば、抗体断片はＦ（ａｂ’）_２と示される約１００Ｋｄ断片を提供するために、ペプシンを用いた抗体の酵素的切断によって産生され得る。この断片は、チオール還元剤、および任意にジスルフィド結合の切断から生じるスルフヒドリル基のためのブロッキング基を使用してさらに切断して、約５０ＫｄのＦａｂ’一価断片を生成することができる。あるいは、パパインを使用する酵素的切断が２つの一価Ｆａｂ断片およびＦｃ断片を直接産生する。

一価軽重鎖断片を形成するための重鎖の分離、断片のさらなる切断、または他の酵素的、化学的もしくは遺伝的技術などの抗体を切断する他の方法もまた、当該断片が完全な抗体によって認識されるエピトープに結合する限り、使用されてもよい。

一態様は、配列番号１５によって表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号１６によって表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、を含むＣＤ３００ｆ結合タンパク質を提供する。

一実施形態においては、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質は、以下を含む：
（ａ）配列番号１５によって表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）配列番号５によって表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一、典型的には少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号６によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号８によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域。

一実施形態においては、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質は、以下を含む：
（ａ）配列番号１によって表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一、典型的には少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号２によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号４によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）配列番号１６によって表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。

一実施形態においては、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質は、配列番号１５によって表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であり、配列番号２によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号４によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号１６によって表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であり、配列番号６によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号８によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、を含む。

一実施形態においては、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質は、配列番号１５によって表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号１６によって表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、を含む。

一実施形態においては、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質は、配列番号１５によって表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号２によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号４によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号１６によって表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であり、配列番号６によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号８によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、を含む。
＜免疫複合体＞
抗原提示細胞またはその前駆体は、標的抗原の存在下で、抗原提示細胞またはその前駆体をＣＤ３００ｆ結合タンパク質と接触させることによって、標的抗原を負荷される。

抗原提示細胞またはその前駆体によるＣＤ３００ｆ結合タンパク質の内在化が標的抗原の内在化をもたらす場合、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質は標的抗原の存在下にある。

種々の実施形態において、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質が以下の状態であるとき、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質は標的抗原の存在下にあってもよい：
標的抗原を含むポリペプチドの存在下にあるとき；本質的に標的抗原からなるポリペプチドの存在下にあるとき；または、
標的抗原からなるポリペプチドの存在下にあるとき。

一実施形態においては、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質は、標的抗原に連結されない。このような実施形態においては、標的抗原がＣＤ３００ｆ結合タンパク質とは別個の分子である。しかし、抗原提示細胞またはその前駆体をＣＤ３００ｆ結合タンパク質と接触させる間、標的抗原を含む分子は、ＣＤ３００ｆ結合分子に十分に近く、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質が内在化されるときに標的抗原の内在化を可能にする。

一実施形態においては、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質は、標的抗原に連結される。このような実施形態においては、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質および標的抗原は、免疫複合体を形成する。それゆえ、一実施形態においては、抗原提示細胞またはその前駆体をＣＤ３００ｆ結合タンパク質および標的抗原を含む免疫複合体と接触させることによって、抗原提示細胞またはその前駆体は、標的抗原の存在下で、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質と接触させられる。一実施形態においては、免疫複合体は、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質および標的抗原を含む融合タンパク質である。

よって、一実施形態においては、標的抗原に連結されているＣＤ３００ｆ結合タンパク質を含む免疫複合体が提供される。一実施形態においては、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質は、以下を含む：
（ａ）以下を含む重鎖可変領域：
（ｉ）配列番号１によって表されるアミノ酸配列のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列；ならびに／または
（ｉｉ）配列番号２によって表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号３によって表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、および／もしくは配列番号４によって表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）；ならびに／または
（ｂ）以下を含む軽鎖可変領域：
（ｉ）配列番号５によって表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列；ならびに／または
（ｉｉ）配列番号６によって表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号７によって表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、および／もしくは配列番号８によって表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）。

一実施形態においては、配列番号１によって表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、典型的には７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５によって表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、典型的には７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＣＤ３００ｆ結合タンパク質とを含み、当該ＣＤ３００ｆ結合タンパク質が標的抗原に連結される、免疫複合体が提供される。

一実施形態においては、配列番号１５によって表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号１６によって表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、を含むＣＤ３００ｆ結合タンパク質を含み、当該ＣＤ３００ｆ結合タンパク質は標的抗原に連結される、免疫複合体が提供される。

一実施形態においては、配列番号１５によって表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、典型的には少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号２によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号４によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号１６によって表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、典型的には少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であり、配列番号６によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号８によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、を含む軽鎖可変領域、を含むＣＤ３００ｆ結合タンパク質を含み、当該ＣＤ３００ｆ結合タンパク質は標的抗原に連結される、免疫複合体が提供される。

用語「連結された」は、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質と標的抗原との会合を記載するために使用される。ＣＤ３００ｆ結合タンパク質がＣＤ３００ｆに結合し、意図したように結合した標的抗原と内在化することができるならば、標的抗原へのＣＤ３００ｆ結合タンパク質の任意の取付様式が適切である。本発明による連結方法は例えば、標的抗原に直接もしくは間接的に融合されたＣＤ３００ｆ結合タンパク質もしくはその一部を含む融合ペプチドとしての免疫複合体の発現、標的抗原および／もしくはＣＤ３００ｆ結合タンパク質の事前修飾を伴うまたは伴わない、標的抗原のＣＤ３００ｆ結合タンパク質への直接または間接的な取付、ならびに／またはリンカーを介する取付を含む。リンカーは例えば、酸不安定性、感光性、酵素切断可能なリンカー、切断不可能なリンカーなどに、機能的に分類することができる。

一実施形態においては、免疫複合体は、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質および標的抗原を含む融合タンパク質である。ＣＤ３００ｆ結合タンパク質は、標的抗原に直接融合されてもよく、または標的抗原に間接的に融合されてもよい。ＣＤ３００ｆ結合タンパク質と標的抗原との間に介在アミノ酸配列がないとき、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質は標的抗原に直接融合される。ＣＤ３００ｆ結合タンパク質と標的抗原との間に介在アミノ酸配列が存在するとき、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質は標的抗原に間接的に融合される。ＣＤ３００ｆ結合タンパク質が別個の重鎖および軽鎖を含む実施形態において、標的抗原は、重鎖または軽鎖に連結されてもよい。典型的には、標的抗原は重鎖に連結される。このような実施形態において、重鎖可変領域または全長重鎖は、標的抗原を含む融合タンパク質として発現され得、そしてこの融合はＣＤ３００ｆ軽鎖と組み合わされる。他の実施形態においては、免疫複合体は、ＣＤ３００ｆ ｓｃＦｖおよび標的抗原を含む融合タンパク質であってもよい。

一実施形態においては、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質はリンカーを通じて標的抗原に連結される。

抗体との融合タンパク質を産生するための方法の例は、例えばTsuji, et al. (2011) J Immunol. 186:1218-1227.に記載されている。

融合タンパク質を産生するための方法は、当該分野で公知である。タンパク質および他の分子を、例えば抗体などの結合タンパク質に連結させるための方法もまた、当該分野で公知である。

いくつかの実施形態においては、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質は、標的抗原を含むポリペプチドに連結される。このような実施形態では、標的抗原は、ポリペプチドの一部である連続するアミノ酸配列であり、標的抗原を含むポリペプチドは、内在化後にプロセシングされて、標的抗原を抗原存在細胞またはその前駆体の表面に提示する。標的抗原を含むポリペプチドは、任意の長さであってもよい。典型的には、標的抗原は、ＭＨＣ Ｉ複合体中の抗原提示細胞の表面上に提示することができる長さのアミノ酸配列を含む。典型的には、標的抗原が８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個の連続するアミノ酸のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態においては、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質は、標的抗原を含む全長タンパク質に連結される。いくつかの実施形態においては、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質は、標的抗原から本質的になるポリペプチドに連結される。このような実施形態においては、ポリペプチドは標的抗原を含み、抗原提示細胞またはその前駆体の表面に提示されるアミノ酸配列ではない１、２、３、４、または５個のアミノ酸が両側に隣接していてもよい。

いくつかの実施形態においては、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質は、標的抗原からなるポリペプチドに連結される。

一態様は、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質および標的抗原を含む融合タンパク質を提供する。
＜標的抗原＞
標的抗原は、Ｔ細胞応答が必要とされる任意の抗原であってもよく、典型的には、抗原特異的Ｔ細胞応答を促進する様式で、抗原提示細胞によってＴ細胞に提示され得るアミノ酸配列を含む。標的抗原は、Ｔ細胞応答を促進することができるアミノ酸配列を含む。典型的には、標的抗原は、抗原提示細胞のＭＨＣクラスＩ分子に負荷されることができるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態においては、標的抗原が全長タンパク質である。いくつかの実施形態において、標的抗原は、抗原特異的Ｔ細胞応答を促進する様式で、抗原提示細胞によってＴ細胞に提示され得るアミノ酸配列を含む、全長タンパク質の断片である。

一実施形態においては、標的抗原は癌抗原である。本明細書中で使用される癌抗原は、腫瘍または癌細胞表面に連携し、そして抗原提示細胞の表面上に提示されるときに免疫応答を促進し得るアミノ酸配列を含む、例えばペプチドまたはタンパク質などの化合物である。癌抗原は、組換え発現される抗原、腫瘍もしくは癌の免疫原性部分、または全腫瘍もしくは癌が含まれるが、これらに限定されない。このような抗原は、組換えによって、または当該分野で公知の任意の他の手段によって、単離または調製され得る。特定の抗原は、正常細胞において通常サイレントである（すなわち発現されない）もの、分化のある段階でのみ発現されるもの、ならびに胚および胎児抗原などの一時的に発現されるもの、として特徴づけることができる。他の癌抗原は、発癌遺伝子（例えば、活性化ｒａｓ発癌遺伝子）、抑制遺伝子（例えば、突然変異ｐ５３）、内部欠失または染色体転座に起因する融合タンパク質、などの突然変異細胞遺伝子によってコードされている。さらに他の癌抗原は、ＲＮＡおよびＤＮＡ腫瘍ウイルス上に担持されるものなどのウイルス遺伝子によってコードされ得る。癌抗原の例については、Cheever et al. (2009), The Prioritization of Cancer Antigens: A National Cancer Institute Pilot Project for the Acceleration of Translational Research, Clin. Cancer Res. 15(17):5323-5337に記載されており、また例えば、ＷＴ－１もしくはその免疫原性断片、ＭＵＣ－１もしくはその免疫原性断片、ＬＭＰ２もしくはその免疫原性断片、ＨＰＶ Ｅ６ Ｅ７もしくはその免疫原性断片、ＥＧＦＲｖＩＩＩもしくはその免疫原性断片、ＨＥＲ－２もしくはその免疫原性断片、イディオタイプもしくはその免疫原性断片、ＭＡＧＥ Ａ３もしくはその免疫原性断片、ｐ５３非突然変異体もしくはその免疫原性断片、ＮＹ－ＥＳＯ－１もしくはその免疫原性断片、ＰＳＭＡ、ＧＤ２もしくはその免疫原性断片、ＣＥＡもしくはその免疫原性断片、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１もしくはその免疫原性断片、Ｒａｓ突然変異体もしくはその免疫原性断片、ｇｐ１００もしくはその免疫原性断片、ｐ５３突然変異体もしくはその免疫原性断片、プロテイナーゼ３（ＰＲ１）もしくはその免疫原性断片、Ｂｃｒ－ａｂｌもしくはその免疫原性断片、チロシナーゼもしくはその免疫原性断片、サバイビン（survivin）もしくはその免疫原性断片、ＰＳＡもしくはその免疫原性断片、ｈＴＥＲＴもしくはその免疫原性断片、肉腫転座切断点もしくはその免疫原性断片、ＥｐｈＡ２もしくは免疫原性断片、ＰＡＰもしくはその免疫原性断片、ＭＬ－ＩＡＰもしくはその免疫原性断片、ＡＦＰもしくはその免疫原性断片、ＥｐＣＡＭもしくはその免疫原性断片、ＥＲＧもしくはその免疫原性断片、ＮＡ１７もしくはその免疫原性断片、ＰＡＸ３もしくはその免疫原性断片、ＡＬＫもしくはその免疫原性断片、アンドロゲン受容体もしくはその免疫原性断片、サイクリンＢ１もしくはその免疫原性断片、ポリシアル酸もしくはその免疫原性断片、ＭＹＣＨもしくはその免疫原性断片、ＴＲＰ－２もしくはその免疫原性断片、ＲｈｏＣもしくはその免疫原性断片、ＧＤ３もしくはその免疫原性断片、フコシルＧＭ１もしくはその免疫原性断片、メソテリンもしくはその免疫原性断片、ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）もしくはその免疫原性断片、ＭＡＧＥ Ａ１もしくはその免疫原性断片、ｓＬｅ（ａ）もしくはその免疫原性断片、ＣＹＰ１Ｂ１もしくはその免疫原性断片、ＰＬＡＣ１もしくはその免疫原性断片、ＧＭ３ガングリオシドもしくはその免疫原性断片、ＢＯＲＩＳ(brother of regulator of imprinted sites) もしくはその免疫原性断片、Ｔｎもしくはその免疫原性断片、ＧｌｏｂｏＨもしくはその免疫原性断片、ＥＴＶ６－ＡＭＬもしくはその免疫原性断片、ＮＹ－ＢＲ－１もしくはその免疫原性断片、ＲＧＳ５もしくはその免疫原性断片、ＳＡＲＴ３もしくはその免疫原性断片、ＳＴｎもしくはその免疫原性断片、カルボニックアンヒドラーゼもしくはその免疫原性断片、ＰＡＸ５もしくはその免疫原性断片、ＬＣＫもしくはその免疫原性断片、ＨＭＷＭＡＡもしくはその免疫原性断片、ＡＫＡＰ－４もしくはその免疫原性断片、ＳＳＸ－２もしくはその免疫原性断片、精子線維鞘タンパク質もしくはその免疫原性断片、ＸＡＧＷ １もしくはその免疫原性断片、Ｂ７Ｈ３もしくはその免疫原性断片、レグマイン（Legumain）もしくはその免疫原性断片、Ｔｉｅ ２もしくはその免疫原性断片、Ｐａｇｅ４もしくはその免疫原性断片、ＶＥＧＦＲ２もしくはその免疫原性断片、ＭＡＤ－ＣＴ－１もしくはその免疫原性断片、ＦＡＰもしくはその免疫原性断片、ＰＤＧＦＲ－ベータもしくはその免疫原性断片、またはＦｏｓ関連抗原もしくはその免疫原性断片、を含む。免疫原性断片は、Ｔ細胞応答を誘発することができるタンパク質の断片である。典型的には、免疫原性断片は、長さが少なくとも８アミノ酸、より典型的には長さが少なくとも９、１０、または少なくとも１１アミノ酸である。免疫原性断片の例は例えば、the Cancer Antigenic Peptide Database （https://caped.icp.ucl.ac.be/Peptide/list）；Wei et al. 2019, Cancer-Testis Antigen Peptide Vaccine for Cancer Immunotherapy: Progress and Prospects, Transl. Oncol. 12(5):733-738に記載されている。

癌細胞に対するＴ細胞応答を促進または増加させる癌抗原は、当該分野で公知であり、そして例えば、"A listing of human tumor antigens recognized by T cells," Renkvist N, Castelli C, Robbins P F, Parmiani G. Cancer Immunology Immunotherapy 50: (1) 3-15 Mar. 2001に記載されている。

一実施形態においては、標的抗原は微生物抗原である。本明細書で使用される微生物抗原は、微生物の抗原であり、ウイルス、細菌、寄生虫、および真菌を含むが、これらに限定されない。ヒト内に見出され、微生物抗原が得られる感染性ウイルスの例としては、以下を含んでもよく、しかしこれらに限定されない：レトロウイルス科（例えば、ＨＩＶ－１などのヒト免疫不全ウイルス）；ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）；カルシウイルス科（例えば、胃腸炎を引き起こす株）；トガウイルス科（例えば、馬脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；フラビウイルス科（例えば、デング熱ウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）；コロノウイルス科（例えば、コロナウイルス）；ラブドウイルス科（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；フィロウイルス科（例えば、エボラウイルス）；パラミクソウイルス科（例えば、パラインフルエンザウイルス、おたふくかぜウイルス、麻疹ウイルス、ＲＳウイルス）；オルトミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルス）；ブンガウイルス科（例えば、ハンタンウイルス、ブンガウイルス、フレボウイルス、ナイロウイルス）；アレナウイルス科（出血熱ウイルス）；レオウイルス科（例えば、レオウイルス、オルビウルス、ロタウイルス）；ビルナウイルス；ヘパドナウイルス科（Ｂ型肝炎ウイルス）；パルボウイルス（パルボウイルス）；パポバウイルス科（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）；アデノウイルス科（大部分のアデノウイルス）；ヘルペスウイルス科（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１および２、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス）；ポキシウイルス科（水痘ウイルス、ワクシニアウイルス、痘瘡ウイルス）；およびイリドウイルス科（例えば、アフリカ豚コレラウイルス）；ならびに分類されていないウイルス（例えば、海綿状脳症の病原体、デルタ肝炎およびＣ型肝炎の病原体、ノルウォークウイルスおよび関連ウイルス、アストロウイルス）。
＜抗原提示細胞＞
樹状細胞（ＤＣ）などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、そのような細胞が見出される被験体の任意の組織から単離することができる。ＡＰＣ（例えば、ＤＣ）は、例えば、被験体の骨髄、血液、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、または脾臓から単離することができる。

抗原提示細胞またはその前駆体は、当該分野で公知の任意の方法を使用して単離されてもよい。反復密度勾配分離、蛍光活性化細胞選別技術、正の選択（positive selection）、負の選択（negative selection）、またはそれらの組み合わせを含む、抗原提示細胞（樹状細胞など）の単離のための多数の方法のいずれかが、当該分野で公知である。抗原細胞単離のための方法は例えば、Fromm et al., (2016) CMRF-56+ blood dendritic cells loaded with mRNA induce effective antigen-specific cytotoxic T-lymphocyte responses, OncoImmunology, 5:6, e1168555, DOI: 10.1080/2162402X.2016.1168555; Prue et al., Peptides for Immunotherapy of Metastatic Hormone Refractory Prostate Cancer. J Immunother 2015, 38(2):71-76; Sallusto, F. and A. Lanzavecchia, J Exp Med, 1994. 179(4): p. 1109-18.に記載されている。

例えば、抗原提示細胞は、健康なドナーから得られたＰＢＭＣからＣＤ１４^＋細胞を正の選択をすることによって単離されてもよい。ＣＤ１４＋細胞は、例えばＣＤ１４マイクロビーズ（Miltenyi Biotec, 130-050-201）と共にＰＢＭＣをインキュベートし、ＣＤ１４＋細胞に結合したマイクロビーズを分離することによって得ることができる。ＣＤ１４＋細胞は、例えばＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－４を補充した完全ＡＢ培地中で、ＣＤ１４＋細胞を５日間インキュベートすることによって、骨髄性樹状細胞（ＭｏＤＣ）に分化され得る。ＭｏＤＣは、ＣＤ３００抗体および標的抗原と共にインキュベートすることによって、標的抗原が負荷され得る。

ＣＤ３００はその発現が制限されているので、樹状細胞の単離は必要ではない。この点に関して、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質は、細胞の混合集団中の標的樹状細胞へ使用され得る。よって、いくつかの実施形態においては、樹状細胞は、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質および標的抗原とともに、任意の組織、典型的にはＰＢＭＣまたは血液をインキュベートすることによって、ｅｘ ｖｉｖｏで負荷されてもよい。いくつかの実施形態においては、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質および標的抗原が、典型的には複合体の形態で、被験体から任意の組織または細胞を単離することなく、被験体に投与されてもよい。
＜組成物＞
本明細書中に記載されるＣＤ３００ｆ結合タンパク質、標的抗原、ＣＤ３００ｆ結合免疫複合体、および樹状細胞ワクチンは、薬学的組成物を含む組成物として処方されてもよい。

よって、さらなる態様は、以下を含む組成物、典型的には薬学的組成物を提供する：
（ａ）本明細書に記載の、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質および標的抗原；または
（ｂ）本明細書に記載の、標的抗原に連結されたＣＤ３００ｆ結合タンパク質を含む免疫複合体；または
（ｃ）本明細書に記載の、抗原負荷された抗原提示細胞またはその前駆体（例えばＤＣワクチン）、
ならびに典型的には、薬学的に許容可能な担体。

「薬学的に許容可能な担体」とは、それが組成物の他の成分と適合しており、被験体に有害でないことを意味する。組成物は以下に記載される他の治療薬を含有してもよく、例えば、医薬製剤の分野で周知の技術（例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., 2005, Lippincott Williams & Wilkinsを参照されたい）に従っている、所望の投与様式に適切なタイプの医薬添加剤（例えば賦形剤、結合剤、保存剤、安定剤、香料など）と同様に、従来の液体ビヒクルまたは希釈剤を使用することによって処方されてもよい。

薬学的組成物は、典型的には無菌の注射可能な水性懸濁液の形態である。この懸濁液は公知の技術に従って処方してもよく、水性懸濁液の製造に適した賦形剤と混合して活性物質を含有する。このような賦形剤は、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガントゴムおよびアラビアゴムなどの懸濁剤を含み；分散剤または湿潤剤は、天然に存在するホスファチド、例えばレシチン、またはアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物、例えばポリオキシエチレンステアレート、またはエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物、例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール、またはエチレンオキシドと、脂肪酸およびポリオキシエチレンソルビトールモノオレエートなどのヘキシトールに由来する部分エステルと、の縮合生成物、またはエチレンオキシドと、脂肪酸および無水ヘキシトール、例えばポリエチレンソルビタンモノオレエート、に由来する部分エステルとの縮合生成物、であってもよい。水性懸濁液はまた、エチル、またはｎ－プロピル、ｐ－ヒドロキシ安息香酸塩などの１つ以上の防腐剤、１つ以上の着色剤、１つ以上の香料、およびスクロースまたはサッカリンのなどの１つ以上の甘味料を含有してもよい。

無菌の注射可能な調製物はまた、例えば１，３－ブタンジオール中の溶液として、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の、無菌の注射可能な溶液または懸濁液であってもよい。使用されてもよい許容されるビヒクルおよび溶媒に包含されるものは水、リンゲル液および等浸透性塩化ナトリウム溶液である。さらに、無菌の不揮発性油を、溶媒または懸濁媒として常時使用できる。この目的においては、合成モノまたはジグリセリドを含む、任意の無刺激性不揮発性油を使用してもよい。さらに、オレイン酸などの脂肪酸は、注射用製剤の調製において使用される。
＜ＤＣワクチンと治療＞
本発明者らは、本明細書中に記載される方法が、標的抗原または抗原に対する免疫応答の強化に使用され得る樹状細胞ワクチンを調製するために使用され得ることを想定する。

よって、一実施形態においては、標的抗原に対するＴ細胞応答を促進する樹状細胞ワクチンであって、抗原負荷された樹状細胞またはその前駆体を含むワクチンであって、抗原負荷された樹状細胞またはその前駆体が、標的抗原の存在下で、樹状細胞またはその前駆体をＣＤ３００ｆ結合タンパク質と接触させることによって産生される、樹状細胞ワクチンが提供される。

一実施形態においては、樹状細胞またはその前駆体を標的抗原に連結されているＣＤ３００ｆ結合タンパク質を含むＣＤ３００ｆ結合タンパク質複合体と接触させることによって、樹状細胞またはその前駆体は、標的抗原の存在下で、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質と接触される。

また、被験体中の標的抗原に対するＴ細胞応答を促進する方法であって、本明細書に記載の樹状細胞ワクチンの有効量を被験体に投与することを含む、方法も提供される。

別の態様は、標的抗原に対するＴ細胞応答を必要とする疾患または状態を治療する方法であって、本明細書中に記載される樹状細胞ワクチンの有効量を投与することを含む、方法を提供する。

本明細書に記載される免疫複合体の投与は、標的抗原に対する抗原特異的免疫応答を促進するために使用され得ることもまた想定される。この点に関して、標的抗原はｉｎ ｖｉｖｏでＤＣに送達または負荷され得る。これは、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質が標的抗原に連結されている免疫複合体を投与することによって達成することができる。このアプローチの可能性は、ＤＥＣ－２０５を標的とした第１相臨床試験で実証されている。この点に関して、癌抗原に連結されているａｎｔ－ＤＥＣ－２０５抗体の投与によって、抗腫瘍免疫応答を生じることが示されている。しかしながら、ＤＥＣ－２０５は発現プロファイルが広く、ＤＥＣ－２０５を標的とすることは、アジュバントと同時投与されない限り、耐性を引き起こす。

一態様は、被験体中の標的抗原に対するＴ細胞応答を促進または増加させる方法であって、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質および標的抗原を含む免疫複合体の有効量を投与することを含む方法を提供する。

別の態様は、被験体中の標的抗原に対するＴ細胞応答を必要とする疾患または状態を治療する方法であって、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質および標的抗原を含むＣＤ３００ｆ結合タンパク質複合体の有効量を投与することを含む、方法を提供する。

本明細書中で使用される場合、標的抗原に対するＴ細胞応答を必要とする疾患または状態は、標的抗原に対するＴ細胞応答が有益であり得る疾患または状態である。

本明細書中に記載される方法は、標的抗原に対するＴ細胞応答が有益であり得る任意の疾患または状態を治療するために使用され得る。

一実施形態においては、疾患または状態は癌である。このような実施形態では、標的抗原は癌抗原である。癌抗原の例については、Cheever et al. (2009), The Prioritization of Cancer Antigens: A National Cancer Institute Pilot Project for the Acceleration of Translational Research, Clin. Cancer Res. 15(17):5323-5337に記載されており、そして例えば、ＷＴ－１、ＭＵＣ－１、ＬＭＰ２、ＨＰＶ Ｅ６ Ｅ７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＨＥＲ－２、イディオタイプ、ＭＡＧＥ Ａ３、ｐ５３非突然変異体、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＳＭＡ、ＧＤ２、ＣＥＡ、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ突然変異体、ｇｐ１００、ｐ５３突然変異体、プロテイナーゼ３（ＰＲ１）、Ｂｃｒ－ａｂｌ、チロシナーゼ、サバイビン、ＰＳＡ、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点、ＥｐｈＡ２、ＰＡＰ、ＭＬ－ＩＡＰ、ＡＦＰ、ＥｐＣＡＭ、ＥＲＧ、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、ＡＬＫ、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ポリシアル酸、ＭＹＣＨ、ＴＲＰ－２、ＲｈｏＣ、フコシルＧＭ１、メソテリン、ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）、ＭＡＧＥ Ａ１、ｓＬｅ（ａ）、ＣＹＰ１Ｂ１、ＰＬＡＣ１、ＧＭ３ガングリオシド、ＢＯＲＩＳ(brother of regulator of imprinted sites)、Ｔｎ、ＧｌｏｂｏＨ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＲＧＳ５、ＳＡＲＴ３、ＳＴｎ、カルボニックアンヒドラーゼ、ＰＡＸ５、ＬＣＫ、ＨＭＷＭＡＡ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ－２、精子線維鞘タンパク質、ＸＡＧＷ １、Ｂ７Ｈ３、レグマイン、Ｔｉｅ ２、Ｐａｇｅ ４、ＶＥＧＦＲ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＦＡＰ、ＰＤＧＦＲ－ベータ、Ｆｏｓ関連抗原、またはそれらの免疫原性断片が含まれる。免疫原性断片は、Ｔ細胞応答を誘発することができるタンパク質の断片である。典型的には、免疫原性断片は、長さが少なくとも８アミノ酸、より典型的には長さが少なくとも９、１０、または少なくとも１１アミノ酸である。免疫原性断片の例は例えば、the Cancer Antigenic Peptide Database (https://caped.icp.ucl.ac.be/Peptide/list); Wei et al. 2019, Cancer-Testis Antigen Peptide Vaccine for Cancer Immunotherapy: Progress and Prospects, Transl. Oncol. 12(5):733-738に記載されている。

本明細書に記載の医薬組成物は、任意の好適な方法によって、典型的には、非経口的に、例えば、皮下、静脈内、筋肉内、皮内（経皮）、もしくは大槽内注射または注入技術（例えば、無菌注射可能な水溶液または懸濁液として）によって；非毒性の、薬学的に許容されるビヒクルまたは希釈剤を含む投薬単位製剤で、投与されてもよい。

投与する薬学的組成物は、単位投薬形態で簡便に提供してもよく、薬学の分野で周知の任意の方法によって調製してもよい。一般に、薬学的組成物は、化合物を液体担体と均一かつ密接に会合させることによって調製される。薬学的組成物において、活性化合物は、疾患のプロセスまたは状態に所望の効果を産生するのに十分な量で含まれる。本明細書中で使用される場合、用語「組成物」は、特定の量の特定の成分を含む製品、ならびに特定の量の特定の成分の組み合わせから、直接的または間接的に生じる任意の製品を包含することが意図される。

一般に、用語「治療する」は、被験体、組織または細胞に影響を及ぼし、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを意味し、以下を含む：（ａ）疾患にかかりやすいかもしれないが、それを有すると未だ診断されていない被験体において、疾患が生じることを予防すること；（ｂ）疾患を阻害すること、すなわち、その進行を停止させること；または（ｃ）疾患の効果を軽減または改善すること、すなわち、疾患の効果の回帰を引き起こすこと。一実施形態において、治療は、レシピエント被験体における癌細胞の数を減少させる結果を達成する。

用語「被験体」は、本方法による治療を必要とする疾患を有する任意の動物を指す。ヒトなどの霊長類に加えて、種々の他の哺乳動物が、本発明の方法を使用して治療され得る。例えば、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、モルモット、ラットまたは他のウシ類、ヒツジ類、ウマ類、イヌ類、ネコ類、げっ歯類もしくはネズミ類の種を含むがこれらに限定されない哺乳動物を治療することができる。特にイヌは、多発性骨髄腫を経験することが知られている。

用語「有効量」は、研究者、獣医師、医師または他の臨床医が求めている、組織、系、動物またはヒトの生物学的または医学的応答を誘発する抗体、抗原結合断片または免疫複合体の量を指す。

癌の治療または予防において、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質複合体の適切な服用量レベルは一般に、患者体重１ｋｇ／日当たり約０．０１～５０ｍｇであり、これは、単回または複数回服用で投与され得る。好ましくは、服用量レベルは約０．１～約２５ｍｇ／ｋｇ／日；より好ましくは約０．５～約１０ｍｇ／ｋｇ／日である。好適な服用量レベルは、約０．０１～２５ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０５～１０ｍｇ／ｋｇ／日、または約０．１～５ｍｇ／ｋｇ／日であってもよい。この範囲内で、服用量は、０．０５～０．５、０．５～５または５～１５ｍｇ／ｋｇ／日であってもよい。

単回または複数回服用での投与が可能な、患者体重１ｋｇ／日当たりの抗原負荷された樹状細胞の適切な用量レベル。

任意の特定の患者に対する特定の服用量レベルおよび服用頻度は変化してもよく、使用される特定の化合物の活性、その化合物の代謝安定性および作用の長さ、年齢、体重、全身の健康、性別、食事、投与の様式および時間、排泄速度、薬物の組み合わせ、特定の状態の重篤度、ならびに治療を受けている宿主を含む、種々の要素に依存するであろうことが理解される。

本明細書に記載されるＣＤ３００ｆ結合タンパク質および標的抗原、本明細書に記載されるＣＤ３００ｆ結合タンパク質複合体、または本明細書に記載される樹状細胞ワクチン、を含むキットもまた本明細書に開示される。種々の実施形態においては、キットは以下を含む：
（ａ）本明細書に記載の、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質および標的抗原；または
（ｂ）本明細書に記載の、標的抗原に連結されているＣＤ３００ｆ結合タンパク質を含む、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質複合体；または
（ｃ）本明細書中に記載の、抗原負荷された抗原提示細胞（例えば、ＤＣワクチン）。

本明細書中で使用される用語は、特定の実施形態のみを記載するためのものであり、そして添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することは意図されないことは理解されるべきである。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に他のものを示していない限り、複数の参照を含む。それゆえ、例えば、「抗体」への言及は、複数のこのような抗体を含む。異なる定義がなされていない限り、ここで使用するすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の業者が通常理解するものと同じ意味を有する。

本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の材料および方法を使用して、本発明を実施または試験することができるが、好ましい材料および方法が本明細書に記載される。

本明細書中に記載される全ての刊行物は、刊行物中に報告され、そして本発明に関連して使用され得るプロトコルおよび試薬を記載および開示する目的のために引用される。本明細書のいかなる内容も、本発明が先の発明を根拠にそのような開示より先行する権利がないことを認めるものとして解釈されない。

本明細書に言及された全ての刊行物は、本明細書中に参考として援用される。当業者であれば、広く説明された本発明の精神または範囲から逸脱することなく、特定の実施形態に示されるように、本発明に多数の変形および／または修正を行ってもよいことを理解するであろう。したがって、本実施形態はすべての点で例示的であり、限定的ではないと考えられるべきである。

以下の特許請求の範囲および本発明の前述の説明において、文脈が、明示的な言語または必要な含意に起因して、そわないことを必要とする場合を除いて、単語「含む（comprise）」、または「含む（comprises）」または「含んでいる（comprising）」などの変形は包括的な意味で使用され、すなわち、記載された特徴の存在を指定するが、本発明の種々の実施形態におけるさらなる特徴の存在または追加を排除しない。

本発明の性質をより明確に理解できるように例示するために、以下の非限定的な実施例を提供する。
［実施例］
本発明者らは、血液ＤＣが限局性および進行性疾患に存在することを実証し、ＣＤ３００ｆの機能的寄与を評価した。

ＦＡＣＳ分析によって、本発明者らは、ＤＣおよび他の抗原提示細胞上で発現される３つのマーカーについて、細胞株上で内在化するそれらの能力をＤＥＣ ２０５との比較により評価した。３つの選択されたマーカーおよびそれらの抗体は、ＤＣＲ－２（マウス抗ヒトＣＤ３００ｆモノクローナル抗体）、ＭＭＲＩ－２０（マウス抗ヒトＣＤ３０２モノクローナル抗体）およびＣＭＲＦ－５６（活性化ＤＣおよび単球を選択するマウスモノクローナル抗体）である。３７℃での表面抗体の内在化は、ＨＬ６０上のＰＥ標識ＭＭＲＩ２０およびＤＣＲ－２、単球細胞株、ならびにＫＭＨ２上のＦＩＴＣ標識抗ＣＭＲＦ５６およびＭＭＲＩ－７を使用して測定した全抗体を、経時的に比較することによって評価した（全抗体、塗りつぶし記号）。これをヤギ抗マウスＩｇＧ ＡＦ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ２１２３７）で検出された残りの表面Ｉｇと比較した。結果を図１Ａに示す。図１Ａから分かるように、本発明者らは、ＤＣＲ－２およびＭＭＲＩ２０が内在化し、ＣＭＲＦ－５６は内在化しないことを見出した。本発明者らはまた、内在化動態に対する活性化の効果を調べた。この点に関して、ＣＤ３００ｆの内在化程度に対する単球由来ＤＣ（Ｍｏ－ＤＣ）の活性化の効果を、活性化剤として一晩、単球由来ＤＣ（Ｍｏ－ＤＣ）＋／ＬＰＳ １００ｎｇ／ｍｌで評価した。これらの結果を図１Ｂに示す。図１Ｂから分かるように、内在化はＭｏ－ＤＣの活性化に伴って減少するように見える。

共焦点画像を用いて、ポリクローナル抗ＣＤ３００ｆ抗体ｇＬＭＩＲ３の内在化を、固定された細胞（したがって内在化なし）および生きた（live）ＨＬ－６０およびＣＤ１４＋単球において、３７℃で３０分間インキュベートした後比較した。その結果、ＣＤ３００ｆポリクローナル抗体ｇＬＭＩＲ３は生きたＨＬ－６０およびＣＤ１４＋細胞では内在化するが、固定された細胞では内在化しないことが示された。

本発明者らは次に、ＣＤ３００ｆ、ＣＤ３０２およびＤＥＣ ２０５の発現を比較した（図２）。この点に関して、健康なドナー３名の末梢血からＰＢＭＣを単離した。樹状細胞サブセットは、Fromm, Kupresanin, Brooks, Dunbar, Haniffa, Hart and Clark, Clinical & Translational Immunology (2016) 5, e68に記載されている通りに、白血球系統、ＨＬＡ－ＤＲおよびＣＤ１ｃ、ＣＤ１４１、ｐＤＣ、およびＣＤ１６に対する抗体を含む抗体パネルを用いたＦＡＣｓ解析により決定した。ＣＤ３００ｆ、ＣＤ３０２およびＤＥＣ２０５の発現は、各抗原に対するビオチン化抗体で氷上にて２０分間染色し、次いでｓｔｒｅｐ ＰＥ １：１００（ＢＤ ５４０６１）で氷上にて２０分間染色することによって決定された。染色の結果を図２および図４に示す。その結果、ＣＤ３００ｆ、ＤＥＣ２０５、ＣＤ３０２のいずれも、広範囲のＴ細胞応答を導くことのできる末梢血中のメインＤＣサブセットであるＣＤ１ｃ上に、同程度に発現されることが示された。ＣＤ３００ｆとＣＤ３０２はＣＤ１４１ ＤＣでは発現されておらず、ＣＤ３００ｆはＣＤ１１ｃ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１６ ＤＣと単球で高度に発現されていた（図２、図４ＡおよびＢ）。

免疫療法の標的において、脾臓などのリンパ組織における高い発現および他の場所における低い発現が望ましい。したがって、ＣＤ３００ｆ、ＣＤ３０２およびＤＥＣ－２０５のｍＲＮＡ発現は、ＲＮＡシーケンシングにより正常組織全体で評価された。結果を図３に示す。図３から理解されるように、ＣＤ３００ｆは発現プロファイルが制限されているが、ＣＤ３０２は制限されていない（図３）。

次に、本発明者らは、ＤＥＣ－２０５（ＭＭＲＩ７）、ＣＤ３００ｆ（ＤＣＲ－２）およびＣＤ３０２（ＭＭＲＩ－２０）に対する抗体が、抗原特異的応答を生じるかどうかを評価した。この点に関して、ＰＢＭＣをＣＤ１４マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、１３０－０５０－２０１）で、４℃で１５分間染色し、ａｕｔｏＭＡＣＳセパレータを用いて磁気分離することによって、３人の健康なドナーのＰＢＭＣからＣＤ１４＋細胞を正の選択をした。ＣＤ１４＋細胞は、ＧＭ－ＣＳＦ ８００Ｕ／ｍＬおよびＩＬ－４ １０００ｕ／ｍＬを補充した完全ＡＢ培地中で３．３３×１０^６／ｍＬで５日間インキュベートすることによってＭｏＤＣに分化した。ＣＤ３陽性細胞を、ＥａｓｙＳｅｐ Ｈｕｍａｎ Ｔ細胞単離キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ、１７９５１）を用いてＰＢＭＣから単離し、１日目に凍結した。一次ビオチン化抗体で氷上にて２０分間染色することによって、５日目にＭｏＤＣにＣＭＶ抗原を負荷し、次いでＨＣＭＶ－ｐｐ６５送達試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ １３０－０９５－４０６）で１０分間染色し、洗浄し、次いでＬＰＳ １００ｎｇ／ｍｌと共に一晩インキュベートした。次いで、自家Ｔ細胞を解凍し、２時間静置し、ＣＳＦＥで染色した後、Ｍｏ－ＤＣに１：１０の比率で５日間添加した。５日目に、細胞を回収し、ＦＡＣｓを実施した。結果を図５に示す。図５のグラフは、分裂したものの割合（ＣＤ３ ＣＳＦＥ低Ｔ細胞の割合）を示す。図５から分かるように、ＤＣＲ－２およびＭＭＲＩ－２０は、ＭＭＲＩ－７の応答と同様の応答を生じることが見出された（図５）。

ＣＤ３００ｆは、ＤＣの抗原負荷の良好な候補のようであった。ＤＣＲ－２のＣＤ３００ｆへの結合は、ＵＰＤ２の結合を強化することが以前に示されており（ＷＯ ２０１８／０９４４６０）、それはＣＤ３００ｆの構造変化を導き、ＵＰＤ２が結合するためにエピトープを開く活性抗体であることを示唆する。それゆえ、本発明者らは、ＤＣＲ２が骨髄系ＤＣにおける表現型変化をもたらすか否かを評価した。最初に、本発明者らは、これによって架橋実験を行い、骨髄系ＤＣおよび単球に対するＤＣＲ－２の架橋の効果を調べた。９６ウェル平底組織培養プレート（Ｆａｌ ３５３０７２）を、１０ｕｇ／ｍｌのＤＣＲ－２（抗ＣＤ３００ｆ）、ＵＰＨ２（抗ＣＤ３００ｅ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３３９７０２）、対照のＣＭＲＦ８１抗体、およびＣＭＲＦ３５（抗ＣＤ３００ａ／ｃ）、の上清で４℃にて一晩コーティングし、次いでＰＢＳで洗浄した。ＥａｓｙＳｅｐヒト骨髄系ＤＣ濃縮キット（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１９０６１）および１×１０^５の骨髄系ＤＣを用いて単離した骨髄系ＤＣを、３７℃および５％のＣＯ２で１８時間インキュベートした２００μｌのＲＰＭＩ１０％のＡＢ完全培地に添加した。上清はサイトカイン分析のために回収し、細胞は、ＣＤ８０ Ｐｅ－Ｃｙ７（Ｌ３０７．４、ＢＤ５６１１３５）、ＣＤ８３ ＦＩＴＣ（Ｈｂ１５ａ、ＩＭ２４１０Ｕ）、ＣＤ８６ ＢＶ６５０（ＩＴ２．２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）およびＨＬＡＤＲ ＡＰＣ－Ｈ７（ｌ２４３、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用するフローサイトメトリー分析のために採取した。結果を図６に示し、これは、ＤＣＲ－２の架橋が骨髄系ＤＣ上の活性化マーカーのアップレギュレーションをもたらすことを示す。

ＤＣＲ－２との架橋ＤＣは、活性化マーカーのアップレギュレーションをもたらす。本発明者らはまた、ＤＣＲ－２は、骨髄系ＤＣがＬＰＳにどのように応答するかを変化させ、いかなる差も見出さなかったかどうかを評価した。ＤＣＲ－２が活性化マーカーの増加をもたらす場合、本発明者らは、これらのＤＣがより刺激的であるという疑問について回答を求めた。同種異系ＭＬＲを使用して、本発明者らは、これらのＤＣがより刺激性である傾向を示す。３人の健康なドナーからの骨髄系ＤＣを、図６に関連して上述したように一晩架橋した。骨髄系ＤＣを採取し、１人のドナー由来の解凍したＣＳＦＥ標識ＣＤ３Ｔ細胞に添加し、ＲＰＭＩ１０％のＡＢ培地中で６日間インキュベートした。６日目に、細胞を採取し、フローサイトメトリーによって分析した。ＣＤ３ ＡＦ ７００（ＳＰ３４－２、ＢＤ ５５９１７）、ＣＤ４ ＰｅｒＣＰ Ｃｙ５．５（ＲＰＡ－Ｔ４、ＢＤ ５６０６５０）、ＣＤ８ ＢＶ４２１（ＲＰＡ－Ｔ８、ＢＤ ５６２４２８）で染色した。パーセントは、各集団におけるＣＳＦＥ低細胞の頻度によって決定する。結果を図７Ａに示す。

本発明者らはまた、ＤＣＲ－２またはＣＭＲＦ－８１と架橋された骨髄系ＤＣと共にインキュベートしたＴ細胞の上清中の、サイトカインＩＦＮ－γ、ＩＬ－１０およびＩＬ－１７ａの濃度を測定した。６日目に上清を回収し、ＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘ Ｈｕｍａｎ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ Ｐａｎｅｌ Ｋｉｔ（カタログ番号７４０４０９）を用いてサイトカイン濃度を分析した（ｎ＝３）。結果を図７Ｂに示す。図７Ｂは、ＤＣＲ－２による骨髄系ＤＣの架橋がＩＦＮ－γの産生を促進し、ＩＬ－１７ａをより少ない程度に促進したことを示す。

次に、本発明者らは、ＤＣＲ－２がＤＣを活性化するために必要な架橋について求めた。本発明者らは、骨髄系ＤＣおよび単球に対する活性化マーカーの発現に対するＤＣＲ２およびＣＭＲＦＩ－８１との架橋の効果を調べた。骨髄系ＤＣの単離後にフローサイトメトリーを用いて、骨髄系ＤＣ上のＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ８０、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ８３、ＣＤ８６またはＴＩＭ－３を評価した。骨髄系ＤＣを、ＥａｓｙＳｅｐヒト骨髄系ＤＣ濃縮キット（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１９０６１）を用いて単離し、１×１０^５の骨髄系ＤＣを、１０μｇ／ｍｌのＤＣＲ－２または対照のＣＭＲＦ－８１抗体と共に、３７℃およびＣＯ２で１８時間インキュベートした２００μｌのＲＰＭＩ１０％のＡＢ完全培地に添加した。上清はサイトカイン分析のために回収し、細胞はＣＤ８０ Ｐｅ－Ｃｙ７（Ｌ３０７．４、ＢＤ５６１１３５）、ＣＤ８３ ＦＩＴＣ（Ｈｂ１５ａ、ＩＭ２４１０Ｕ）、ＣＤ８６ ＢＶ６５０（ＩＴ２．２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）およびＨＬＡ－ＤＲ ＡＰＣ－Ｈ７（ｌ２４３、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用するフローサイトメトリー分析のために採取した。結果を図８Ａに示す。単球上のＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ８０、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ８３、ＣＤ８６またはＴＩＭ－３発現を、磁気分離およびＣＤ１４マイクロビーズ（１３０－０５０－２０１）を用いた単球の単離後、フローサイトメトリーを用いて評価し、ＣＭＲＦ－８１またはＤＣＲ－２で１８時間架橋した。結果を図８Ｂに示す。ＤＣＲ－２との架橋は、アイソタイプ対照と比較して、骨髄系ＤＣにおけるＣＤ８０、ＣＤ８３、およびＣＤ８６の発現における統計的に有意な増加をもたらした。

次に、本発明者らは、ＤＣＲ－２による架橋が移動に影響を及ぼすかどうかを試験した。第１に、本発明者らは、ケモカイン受容体ＣＣＲ７の発現を評価した。架橋された骨髄系ＤＣを採取し、ＣＣＲ７ ＰＥ（Ｒ＆Ｄ、ＦＡＢ１９７Ｐ）で、３７℃にて１５分間染色した。架橋されたＤＣまたは単球の移動は、ケモカインを含まない場合と比較して、すべてＲＰＭＩ（１％ ＢＳＡ、ＰＳＧ）中で、トランスウェル（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３４２１）を横切って、４時間で０．１ｕｇ／ｍｌの濃度でＣＣＬ１９に向かって、または２時間で１００ｎｇ／ｍｌでＣＣＬ２１に向かって、もしくは２時間でＣＣＬ２に向かって、移動したＤＣまたは単球の数を決定することによって評価した。ＤＣを、Ｌｉｎ２ ＦＩＴＣ（ＣＤ３／１４／１９／２０／５６、ＢＤ ６４３３９７）およびＨＬＡ－ＤＲ ＡＰＣ－Ｈ７（Ｉ２４３、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色したトランスウェルの底部から採取し、Ｃｏｕｎｔ ｂｒｉｇｈｔ Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ｃｏｕｎｔ Ｂｅａｄｓ ２５００／ｍｌを含む２００ｕｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。移動した細胞の数は、（系統－ＤＲ＋細胞／計測ビーズ）×５０００ビーズの数として計算した。移動指数＝＃細胞移動ケモカイン／＃細胞移動ケモカインなし。骨髄系ＤＣにおけるＣＣＲ７発現、およびＤＣＲ－２またはＣＭＲＦ－８１との架橋後の、ＣＣＬ２１およびＣＣＬ１９への骨髄系ＤＣの移動の結果を図９Ａに示す。図９Ａに示すように、ＣＣＲ７発現は、ＣＤ３００ｆ架橋骨髄系ＤＣ上でアップレギュレートされた。ＣＣＬ１９への移動はＤＣＲ－２との架橋によって有意に増加したが、ＣＣＬ２１へは増加しなかった。単球におけるＣＣＲ２発現、およびＤＣＲ－２またはＣＭＲＦ－８１との架橋後のＣＣＬ２への単球の移動の結果を図９Ｂに示す。

本発明者らはまた、単球に対する活性化マーカーの発現に対する架橋の効果を評価した。この点に関して、９６ウェル平底組織培養プレート（Ｆａｌ ３５３０７２）を、１０μｇ／ｍｌのＤＣＲ ２（抗ＣＤ３００ｆ）、対照ＣＭＲＦ－８１抗体およびＰＢＳ対照で、４℃にてコーティングし、次いでＰＢＳで洗浄した。ＣＤ１４＋細胞を、ＣＤ１４＋マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ １３０－０５０－２０１）を用いてＮ＝４人の健康なドナーから正の選択をし、ＡｕｔｏＭａｃを用いて磁気分離した。１×１０^５のＣＤ１４＋細胞を、３７℃および５％のＣＯ２で１８時間インキュベートした２００μＬのＲＰＭＩ１０％のＡＢ完全培地に添加した。上清はサイトカイン分析のために回収し、細胞は、ＣＤ８０ Ｐｅ－Ｃｙ７（Ｌ３０７．４、ＢＤ５６１１３５）、ＣＤ８３ ＦＩＴＣ（Ｈｂ１５ａ、ＩＭ２４１０Ｕ）、ＣＤ８６ ＢＶ６５０（ＩＴ２．２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）およびＨＬＡＤＲ ＡＰＣ－Ｈ７（ｌ２４３、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用するフローサイトメトリー分析のために採取した。結果を図１０に示す。ＤＣとは対照的に、単球上ではＨＬＡ－ＤＲのアップレギュレーションの傾向があるが、他の活性化マーカーはない。

ヒト化ＤＣＲ－２
ＤＣＲ－２のマウスＶＨおよびマウスＶＬのアミノ酸配列を、ＩｇＢＬＡＳＴを通してヒトＩｇ配列に整列させた。ＶＨおよびＶＬ配列のフレームワーク領域中のアミノ酸を、マウスからヒト残基に変化させた（図１１および１２において下線を引いた）。ＣＤＲ領域は抗原への結合において最も重要である可能性が高いので、ＣＤＲ領域への変更はない。アミノ酸配列はチャイニーズハムスター（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）における発現のために、ＧＥＮＥＡＲＴソフトウェアを通してコドンを最適化した。ヒトＩｇＧ１重鎖にスプライシングされたＶＨをコードする核酸配列をｐｃＤＮＡ３に挿入し、ヒトカッパ配列にスプライシングされたＶＬをｐｃＤＮＡ３に挿入し、発現のためにＥＸＰＩ ＣＨＯにトランスフェクトした。免疫グロブリンを、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーによって組織培養上清から精製した。ヒト化可変軽鎖のアミノ酸配列を図１１にマウスと比較して示し、ヒト化可変重鎖のアミノ酸配列を図１２にマウスと比較して示す。精製抗体は、完全性および濃度についてはバイオアナライザーにより、ならびに細胞表面ＣＤ３００ｆに結合する能力についてはフローサイトメトリーにより、評価した。マウスＤＣＲ－２およびキメラＤＣＲ－２に対する結合能力の比較の結果を図１３に示す。

まとめると：
・ＣＤ３００ｆは、細胞株およびＭｏ－ＤＣ上に内在化する。
・それは、他の組織上で限定された発現を有する血液ＤＣおよび単球上で発現される。
・ＤＣＲ－２を、抗原負荷されたＤＣに使用することにより、抗原特異的Ｔ細胞応答を生じさせることができる。
・ＤＣＲ－２との架橋により、ＤＣ上の活性化マーカーが増加するが、単球上では増加しない。
・同種異系ＭＬＲを使用すると、ＤＣＲ－２で架橋された骨髄系ＤＣがより刺激性であることが示唆される。
・ＤＣＲ－２との架橋は、ＤＣ移動の増加をもたらす。
＜配列＞
ＤＣＲ－２の重鎖可変領域（配列番号１）：
Met Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Pro Leu Lys Leu
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Gly Phe Ser Gly Ser Trp Met Ser Trp
Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Gln Ile Asn
Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu Lys Asp Lys Phe
Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Ile Asn
Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Gly
Phe Phe Glu Gly Tyr Ser Ala Trp Phe Ala Tyr Trp
ＤＣＲ－２の重鎖可変領域のＣＤＲ１（配列番号２）：
Gly Phe Gly Phe Ser Gly Ser Trp
ＤＣＲ－２の重鎖可変領域のＣＤＲ２（配列番号３）：
Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile
ＤＣＲ－２の重鎖可変領域のＣＤＲ３（配列番号４）：
Ala Arg Arg Gly Phe Phe Glu Gly Tyr Ser Ala Trp Phe Ala Tyr
ＤＣＲ－２の軽鎖可変領域（配列番号５）：
Ile Leu Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly Asp
Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp Val
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Ser Leu Leu Ile Tyr
Tyr Ala Ser Asn Arg Asn Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser
Gly Tyr Glu Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala Glu
Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Thr Ser Pro Trp Thr
Phe Gly Gly Gly
ＤＣＲ－２の軽鎖可変領域のＣＤＲ１（配列番号６）：
Gln Ser Val Ser Asn Asp
ＤＣＲ－２の軽鎖可変領域のＣＤＲ２（配列番号７）：
Tyr Ala Ser
ＤＣＲ－２の軽鎖可変領域のＣＤＲ３（配列番号８）：
Gln Gln Asp Tyr Thr Ser Pro Trp Thr
ＤＣＲ－２の重鎖可変領域（配列番号９）：
atggagtctg gaggtggcct ggtgcagcct ggaggacccc tgaaactctc ctgtgcagcc 60
tcaggattcg gttttagtgg atcttggatg agttgggtcc ggcaggctcc agggaaaggg 120
ctagaatgga ttggacaaat taatccagat agcagtacga taaattatac accatctcta 180
aaggataaat tcatcatctc cagagacaac gccaaaaata ccctgtacct gcaaattaac 240
aaagtgagat ctgaggacac agccctttat tactgtgcaa gacgggggtt ctttgaaggt 300
tactccgcct ggtttgctta ctgg 324
ＤＣＲ－２の軽鎖可変領域（配列番号１０）：
attttgatga cccagactcc caaattcctg cttgtatcag caggagacag ggtgaccata 60
acctgcaagg ccagtcagag tgtgagtaat gatgtagctt ggtaccaaca gaagccaggg 120
cagtctcctt cactcctgat atactatgca tccaatcgca acactggagt ccctgatcgc 180
ttcactggca gtggatatga gacggatttc actttcacca tcagcactgt gcaggctgaa 240
gacctggcag tttatttctg tcagcaggat tatacctctc cgtggacgtt cggtggaggc 300
ＤＣＲ－２のコドン最適化されたキメラ重鎖（配列番号１１）：
atggtcctga gcctgctgta cctgctgaca gctctgcctg gcatcctgtc tgaggtccag 60
ctgcaagagt ctggccccat ggaatctggc ggaggattgg ttcaacctgg cggccctctg 120
aagctgtctt gtgccgcttc tggcttcggc ttctccggct cttggatgtc ctgggtccga 180
caggctcctg gcaaaggcct ggaatggatc ggccagatca accccgactc ctccaccatc 240
aactacaccc ctagcctgaa ggacaagttc atcatctccc gggacaacgc caagaacacc 300
ctgtacttgc agatcaacaa agtgcggagc gaggacaccg ctctgtacta ctgtgccaga 360
cggggcttct tcgagggcta ctctgcttgg tttgcctact ggggccaggg cacactggtc 420
acagtttctg ccgcctctac caagggaccc agcgttttcc ctctggctcc atcctccaag 480
tctacctctg gcggaacagc tgctctgggc tgcctggtca aggactactt tcctgagcca 540
gtgaccgtgt cctggaactc tggcgctctg acatctggcg tgcacacctt tccagctgtg 600
ctgcagtcct ccggcctgta ctctctgtcc tctgtcgtga ccgtgccttc cagctctctg 660
ggaacccaga cctacatctg caatgtgaac cacaagcctt ccaacaccaa ggtggacaag 720
aaggtggaac ccaagtcctg cgacaagacc cacacctgtc ctccatgtcc tgctccagaa 780
ctgctcggcg gaccttccgt gttcctgttt cctccaaagc ctaaggacac cctgatgatc 840
tctcggaccc ctgaagtgac ctgcgtggtg gtggatgtgt ctcacgagga tcccgaagtg 900
aagttcaatt ggtacgtgga cggcgtggaa gtgcacaatg ccaagaccaa gcctagagag 960
gaacagtaca actccaccta tagagtggtg tccgtgctga ccgtgctgca ccaggattgg 1020
ctgaacggca aagagtacaa gtgcaaggtg tccaacaagg ccctgcctgc tcctatcgaa 1080
aagaccatct ccaaggccaa gggccagcct agggaacccc aggtttacac cttgcctcca 1140
tctcgggacg agctgaccaa gaaccaggtg tccctgacct gtctcgtgaa gggcttctac 1200
ccctccgata tcgccgtgga atgggagtct aatggccagc ctgagaacaa ctacaagaca 1260
acccctcctg tgctggactc cgacggctca ttcttcctgt actccaagct gacagtggac 1320
aagtccagat ggcagcaggg caacgtgttc tcctgctccg tgatgcacga ggccctgcac 1380
aatcactaca cccagaagtc cctgtctctg tcccctggca ag 1422
コドン最適化されたキメラ軽鎖（配列番号１２）：
atggactctc aggcccaggt gctgatgctg ctgctgttgt gggtgtccgg cacctgtggc 60
gacatcctga tgacccagac tcctaagttc ctgctggtgt ctgccggcga cagagtgacc 120
atcacatgca aggcctctca gtccgtgtcc aacgacgtgg cctggtatca gcagaagcct 180
ggccagtctc ctagcctgct gatctactac gcctccaaca gaaacaccgg cgtgcccgat 240
agattcaccg gctctggcta cgagacagac ttcaccttca ccatctccac cgtgcaggcc 300
gaggatctgg ccgtgtactt ctgccagcaa gactacacct ctccatggac ctttggcgga 360
ggcaccaagc tggaaatcaa gcggacagtg gccgctcctt ccgtgttcat cttcccacct 420
tccgacgagc agctgaagtc tggcacagcc tctgtcgtgt gcctgctgaa caacttctac 480
cctcgggaag ccaaggtgca gtggaaggtg gacaatgccc tgcagtccgg caactcccaa 540
gagtctgtga ccgagcagga ctccaaggac agcacctaca gcctgtcctc cacactgacc 600
ctgtccaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaagtgac ccatcagggc 660
ctgtctagcc ctgtgaccaa gtctttcaac cggggcgagt gc 702
最適化されたヌクレオチド配列によってコードされた重鎖（配列番号１３）：
Met Val Leu Ser Leu Leu Tyr Leu Leu Thr Ala Leu Pro Gly Ile Leu
Ser Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Met Glu Ser Gly Gly Gly
Leu Val Gln Pro Gly Gly Pro Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
Phe Gly Phe Ser Gly Ser Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Gln Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile
Asn Tyr Thr Pro Ser Leu Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn
Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Ile Asn Lys Val Arg Ser Glu Asp
Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Gly Phe Phe Glu Gly Tyr Ser
Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
コドン最適化されたヌクレオチド配列によってコードされた軽鎖（配列番号１４）：
Met Asp Ser Gln Ala Gln Val Leu Met Leu Leu Leu Leu Trp Val Ser
Gly Thr Cys Gly Asp Ile Leu Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu
Val Ser Ala Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser
Val Ser Asn Asp Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro
Ser Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Asn Thr Gly Val Pro Asp
Arg Phe Thr Gly Ser Gly Tyr Glu Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser
Thr Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr
Thr Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
ＤＣＲ－２のヒト化重鎖可変領域（配列番号１５）：
Met Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Gly Phe Ser Gly Ser Trp Met Ser Trp
Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Asn Ile Asn
Pro Asp Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn
Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Gly
Phe Phe Glu Gly Tyr Ser Ala Trp Phe Ala Tyr Trp
ＤＣＲ－２のヒト化軽鎖可変領域（配列番号１６）：
Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp
Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp Leu
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Thr Ser Pro Trp Thr
Phe Gly Gly Gly
重鎖接合領域（配列番号１７）：
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

３７℃での抗ＣＤ３０２、抗ＣＭＲＦ５６、抗ＣＤ３００ｆ、および抗ＤＥＣ２０５表面抗体の内在化を示したグラフである。 単球由来ＤＣ（ＭｏＤＣ）内へのＣＤ３００ｆの内在化速度に対する、活性化の効果を示したグラフである。 抗原提示細胞におけるＣＤ３００ｆ、ＣＤ３０２およびＤＥＣ２０５発現を示したグラフである。 正常組織全体におけるＣＤ３０２、ＣＤ３００ｆおよびＤＥＣ２０５のｍＲＮＡ発現を、ＲＮＡシーケンシングにより示したグラフである。 図４Ａは、ヒト抗原提示細胞サブセット（ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１ｃＤＣ、ＣＤ１４１ＤＣ、ｐＤＣ ＤＣ、ＣＤ１６ ＤＣ）および単球上のＣＤ３００ｆの表面発現を、にＤＣＲ－２またはＣＭＲＦ－８１（アイソタイプ対照）を用いたフローサイトメトリー分析によって示したグラフである。図４Ｂは、１人のドナーからの骨髄系サブセットおよび単球上のＣＤ３００ｆ発現を示したグラフである。 抗体指向性抗原取り込みに対するＴ細胞応答を示したグラフである。 ＣＤ３００ファミリーメンバーとの架橋が骨髄系ＤＣに及ぼす活性化マーカー発現に及ぼす影響を示している図である。 ＣＤ３００ファミリーメンバーとの架橋が骨髄系ＤＣに及ぼす活性化マーカー発現に及ぼす影響を示している図である。 ＤＣＲ－２またはＣＭＲＦ－８１と架橋された骨髄系ＤＣを有する同種異系ＭＬＲを示したグラフである。 ＤＣＲ－２またはＣＭＲＦ－８１と架橋した骨髄系ＤＣと共にインキュベートしたＴ細胞の上清中の、サイトカインＩＦＮ－ガンマ、ＩＬ－１０およびＩＬ－１７ａの濃度を示したグラフである。 図８Ａおよび８Ｂは、ＤＣＲ－２による架橋が表面分子発現を変化させることを示したグラフである。 図９Ａは、ＤＣＲ－２またはＣＭＲＩ－８１と架橋された骨髄系樹状細胞のＣＣＲ７発現およびＣＣＬ２１およびＣＣＬ１９への移動を示したグラフである。図９Ｂは、ＤＣＲ－２またはＣＭＲＩ－８１と架橋された単球のＣＣＲ２発現およびＣＣＬ２への移動を示したグラフである。 単球に対するＤＣＲ－２の架橋の効果を示したグラフである。 ＤＣＲ－２の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列、ならびにＤＣＲ－２のマウス（上）およびヒト化（下）軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。 ＤＣＲ－２の重鎖可変領域のヌクレオチド配列、ならびにＤＣＲ－２のマウス（上）およびヒト化（下）軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。 マウスＤＣＲ－２（ｍＤＣＲ－２）、キメラＤＣＲ－２およびヒト化ＤＣＲ－２の、Ｕ９３７細胞への結合を示したグラフである。

Claims (41)

1. Ｔ細胞へ標的抗原を提示するために、抗原提示細胞またはその前駆体に前記標的抗原を抗原負荷する方法であって、前記標的抗原の存在下で、前記抗原提示細胞またはその前駆体をＣＤ３００ｆ結合タンパク質と接触させることを含む、方法。
2. 前記抗原提示細胞またはその前駆体をＣＤ３００ｆ結合タンパク質と接触させることが、前記抗原提示細胞またはその前駆体の活性化を促進する、請求項１に記載の方法。
3. Ｔ細胞へ標的抗原を提示するために、抗原提示細胞またはその前駆体に前記標的抗原を抗原負荷して、前記抗原提示細胞またはその前駆体の活性化を促進する方法であって、前記標的抗原の存在下で、前記抗原提示細胞またはその前駆体をＣＤ３００ｆ結合タンパク質と接触させることを含む、方法。
4. 前記抗原提示細胞またはその前駆体が、樹状細胞または単球である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記樹状細胞が、骨髄系樹状細胞である、請求項４に記載の方法。
6. 前記ＣＤ３００ｆ結合タンパク質が前記抗原に連結される、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記抗原提示細胞またはその前駆体の活性化が、１つ以上の活性化マーカーの発現を増加させる、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記１つ以上の活性化マーカーが、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、およびＨＬＡ－ＤＲから選択される１つ以上のタンパク質である、請求項７に記載の方法。
9. 前記抗原提示細胞が樹状細胞であり、前記１つ以上の活性化マーカーがＣＤ８０、ＣＤ８３およびＣＤ８６である、請求項８に記載の方法。
10. 標的抗原をＴ細胞に提示する方法であって、以下を含む方法：
    （ａ）標的抗原の存在下で、抗原提示細胞またはその前駆体をＣＤ３００ｆ結合タンパク質と接触させることにより、前記抗原提示細胞またはその前駆体に前記標的抗原を抗原負荷して、抗原負荷された抗原提示細胞またはその前駆体を産生すること；および
    （ｂ）前記抗原負荷された抗原提示細胞またはその前駆体を、Ｔ細胞を含む集団と共に、前記集団のＴ細胞への前記標的抗原の提示を可能にする条件下で培養すること。
11. 前記抗原提示細胞が、樹状細胞またはその前駆体である、請求項１０に記載の方法。
12. 前記樹状細胞が、骨髄系樹状細胞である、請求項１１に記載の方法。
13. 前記ＣＤ３００ｆ結合タンパク質が前記抗原に複合される、請求項１０～１２のいずれか１項に記載の方法。
14. Ｔ細胞を含む前記集団が、ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む混合リンパ球集団である、請求項１０～１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 前記ＣＤ８＋Ｔ細胞が、細胞傷害性Ｔ細胞である、請求項１４に記載の方法。
16. 標的抗原に対するＴ細胞応答を促進または増加させる方法であって、以下を含む方法：
    （ａ）標的抗原の存在下で、抗原提示細胞またはその前駆体をＣＤ３００ｆ結合タンパク質と接触させることにより、前記抗原提示細胞またはその前駆体に抗原を抗原負荷して、抗原負荷された抗原提示細胞またはその前駆体を産生すること；および
    （ｂ）Ｔ細胞への前記標的抗原の提示に続いて、Ｔ細胞の刺激を促進する条件下で、Ｔ細胞を含む集団と共に、前記抗原負荷された抗原提示細胞またはその前駆体を培養すること。
17. Ｔ細胞を含む前記集団が、ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む混合リンパ球集団である、請求項１６に記載の方法。
18. 前記ＣＤ８＋Ｔ細胞が、細胞傷害性Ｔ細胞である、請求項１７に記載の方法。
19. 被験体中の標的抗原に対するＴ細胞応答を促進または増加させる方法であって、有効量のＣＤ３００ｆ結合タンパク質および標的抗原を被験体に投与することを含む、方法。
20. 標的抗原に対するＴ細胞応答を必要とする疾患または状態を治療する方法であって、有効量のＣＤ３００ｆ結合タンパク質および標的抗原を投与することを含む、方法。
21. 前記ＣＤ３００ｆ結合タンパク質が、前記標的抗原に連結される、請求項１９または２０に記載の方法。
22. 前記標的抗原が癌抗原である、請求項１～２１のいずれか１項に記載の方法。
23. 前記標的抗原がウイルス抗原である、請求項１～２１のいずれか１項に記載の方法。
24. 抗原提示細胞またはその前駆体に標的抗原を抗原負荷する組成物であって、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質および標的抗原を含む、組成物。
25. 標的抗原に対するＴ細胞応答を促進または増加させる薬学的組成物であって、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質および標的抗原を含む、組成物。
26. 抗原提示細胞またはその前駆体に標的抗原を抗原負荷する免疫複合体であって、標的抗原に連結されているＣＤ３００ｆ結合タンパク質を含む、免疫複合体。
27. 前記標的抗原が癌抗原である、請求項２６に記載の免疫複合体。
28. 前記標的抗原がウイルス抗原である、請求項２６に記載の免疫複合体。
29. 標的抗原をＴ細胞に提示することができる、抗原負荷された抗原提示細胞またはその前駆体を産生する方法であって、標的抗原の存在下で、抗原提示細胞またはその前駆体をＣＤ３００ｆ結合タンパク質と接触させることを含む、方法。
30. 抗原負荷された抗原提示細胞またはその前駆体であって、標的抗原の存在下で、抗原提示細胞またはその前駆体を、ＣＤ３００ｆ結合タンパク質と接触させることによって産生される、抗原負荷された抗原提示細胞またはその前駆体。
31. 標的抗原に対するＴ細胞応答を促進する方法であって、前記Ｔ細胞に対する前記抗原の提示を促進する条件下で、Ｔ細胞を含む集団と共に、請求項３０に記載の抗原負荷された抗原提示細胞またはその前駆体をインキュベートすることを含む、方法。
32. 被験体における標的抗原に対するＴ細胞応答を促進または増加させる方法であって、有効量の請求項２６～２８のいずれか１項に記載の免疫複合体、または請求項３０に記載の抗原負荷された抗原提示細胞もしくはその前駆体を被験体に投与することを含む、方法。
33. 標的抗原に対するＴ細胞応答を必要とする疾患または状態を治療する方法であって、有効量の請求項２６～２８のいずれか１項に記載の免疫複合体、または請求項３０に記載の抗原負荷された抗原提示細胞もしくはその前駆体を投与することを含む、方法。
34. 被験体中の標的抗原に対する免疫応答を促進または増加させる方法であって、有効量の請求項２６～２８のいずれか１項に記載の免疫複合体、または請求項３０に記載の抗原負荷された抗原提示細胞もしくはその前駆体を被験体に投与することを含む、方法。
35. 前記ＣＤ３００ｆ結合タンパク質が、以下を含む、請求項１～２３または２９～３４のいずれか１項に記載の方法：
    （ａ）配列番号２によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号４によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、を含む重鎖可変領域；ならびに
    （ｂ）配列番号６によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号８によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、を含む軽鎖可変領域。
36. 前記重鎖可変領域が、配列番号１または１５のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であり、前記軽鎖可変領域が、配列番号５または１６と少なくとも７０％同一である、請求項３５に記載の方法。
37. 前記ＣＤ３００ｆ結合タンパク質が、以下を含む、請求項２６～２８のいずれか１項に記載の免疫複合体：
    （ａ）配列番号２によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号４によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、を含む重鎖可変領域；ならびに
    （ｂ）配列番号６によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、配列番号８によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、を含む軽鎖可変領域。
38. 前記重鎖可変領域が、配列番号１または１５のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であり、前記軽鎖可変領域が、配列番号５または１６と少なくとも７０％同一である、請求項３５に記載の方法。
39. 前記ＣＤ３００ｆ結合タンパク質が、以下を含む、請求項２４または２５に記載の組成物：
    （ａ）配列番号２によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号４によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに
    （ｂ）配列番号６によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号８によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域。
40. 前記ＣＤ３００ｆ結合タンパク質が、以下を含む、請求項３０に記載の抗原負荷された抗原提示細胞またはその前駆体：
    （ａ）配列番号２によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号４によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、を含む重鎖可変領域；ならびに
    （ｂ）配列番号６によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号８によって表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、を含む軽鎖可変領域。
41. 以下を含むＣＤ３００ｆ結合タンパク質：（ａ）配列番号１５によって表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および（ｂ）配列番号１６によって表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。

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