CN107531784A - 通过多特异性抗体超强力地中和细胞因子和其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了多特异性抗体和其抗原结合片段，其强力地中和细胞因子并且因而可以用于预防和/或治疗炎性和/或自身免疫疾病。具体而言，本发明提供了多特异性抗体或其抗原结合片段，其包括特异性地结合至细胞因子中的至少两个不同的非重叠位点的至少两个不同结构域和Fc部分。本发明还涉及编码这样的抗体和抗体片段的核酸以及生产这样的抗体或抗体片段的无限增殖化B细胞和培养的浆细胞。此外，本发明还涉及本发明的抗体和抗体片段在筛选方法以及在诊断、预防和治疗炎性和/或自身免疫疾病中的用途。

Description

通过多特异性抗体超强力地中和细胞因子和其用途
本发明涉及多特异性抗-细胞因子——优选地抗-GM-CSF——抗体，和其抗原结合片段，其强力地中和细胞因子，特别是GM-CSF。本发明的多特异性抗-细胞因子——优选地抗-GM-CSF——抗体包括至少两个不同的结构域，其特异性地结合至单细胞因子分子上的至少两个不同的非重叠位点。本发明还涉及编码这样的抗体和抗体片段的核酸，以及产生这样的抗体和抗体片段的无限增殖化B细胞和培养的浆细胞。此外，本发明涉及本发明的抗体和抗体片段在筛选方法以及在诊断、预防和治疗疾病——特别是，炎性疾病和自身免疫疾病——中的用途。
细胞因子是由多种细胞分泌并且局部地或全身地对其它细胞起作用的免疫调节分子的家族。大多数细胞因子具有免疫调节活性，其参与控制不同类型的炎性过程和宿主防御机制。细胞因子包括趋化因子、干扰素、白介素、淋巴因子、肿瘤坏死因子、单核因子和集落刺激因子。细胞因子由宽范围的细胞产生，所述细胞包括免疫细胞比如巨噬细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞和肥大细胞，以及内皮细胞，成纤维细胞和各种基质细胞；给定的细胞因子可以通过超过一种类型的细胞产生。
细胞因子粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)是127个氨基酸的单体蛋白，取决于不同的糖基化程度，其分子量范围在14kDa和35kDa之间。非糖基化和糖基化的GM-CSF在体外显示了类似活性(Cebon,J.,Nicola,N.,Ward,M.,Gardner,I.,Dempsey,P.,Layton,J.,Dührsen,U.,Burgess,A.W.,Nice,E.,and Morstyn,G.(1990).Granulocyte-macrophage colony stimulating factor from human lymphocytes.The effect ofglycosylation on receptor binding and biological activity.J.Biol.Chem.265,4483–4491)。GM-CSF通过结合至其受体发挥其生物学活性(Hansen,G.,Hercus,T.R.,McClure,B.J.,Stomski,F.C.,Dottore,M.,Powell,J.,Ramshaw,H.,Woodcock,J.M.,Xu,Y.,Guthridge,M.,et al.(2008).The structure of the GM-CSF receptor complexreveals a distinct mode of cytokine receptor activation.Cell 134,496–507)，所述受体在髓样细胞和内皮细胞的细胞表面上表达但是不存在于淋巴细胞上。该受体是异二聚体的并且由α和β亚基组成。α亚基以纳摩尔亲和力结合GM-CSF。β亚基也是白介素-3和白介素-5受体复合物的一部分并且与GM-CSF受体α亚基和GM-CSF缔合，导致多聚体复合物的形成，在该多聚体复合物中GM-CSF以皮摩尔结合亲和力结合。
GM-CSF可以由多种细胞类型表达，所述细胞类型包括T淋巴细胞、巨噬细胞、NK细胞、肥大细胞、内皮细胞、成纤维细胞和一些恶性细胞(Gasson,J.C.(1991).Molecularphysiology of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor.Blood 77,1131–1145；Hamilton,J.A.,and Anderson,G.P.(2004).GM-CSF Biology.Growth Factors 22,225–231；Sergeeva,A.,Ono,Y.,Rios,R.,and Molldrem,J.J.(2008).High titerautoantibodies to GM-CSF in patients with AML,CML and MDS are associated withactive disease.Leukemia 22,783–790)。GM-CSF充当造血前体细胞上的生长因子以产生粒细胞和单核细胞。其对于小胶质细胞的发育和对于肺泡巨噬细胞的功能也是必需的。此外，GM-CSF也对表达GM-CSF受体的免疫系统的细胞具有多种促炎作用。这些功能最重要的是在数种炎性疾病和自身免疫疾病中活化单核细胞、巨噬细胞和粒细胞(Hamilton,J.A.(2002).GM-CSF in inflammation and autoimmunity.Trends Immunol 23,403–408)，其又导致产生其它细胞因子和趋化因子、基质降解蛋白酶、增加的HLA表达以及增加的黏附分子或CC-趋化因子受体的表达。GM-CSF也可以与其它炎性因子比如其它细胞因子或LPS协同(Parajuli,B.,Sonobe,Y.,Kawanokuchi,J.,Doi,Y.,Noda,M.,Takeuchi,H.,Mizuno,T.,and Suzumura,A.(2012).GM-CSF increases LPS-induced production ofproinflammatory mediators via upregulation of TLR4 and CD14 in murinemicroglia.J Neuroinflammation 9,268)。总之，GM-CSF因而是免疫/炎性级联的一部分。
因此，GM-CSF可以被视为抗炎和自身免疫疗法的靶标。慢性和急性炎性和/或自身免疫疾病比如类风湿性关节炎(RA)、多发性硬化(MS)、克罗恩病、牛皮癣、哮喘、特应性皮炎或休克可以受益于GM-CSF中和以及随之发生的促炎级联。例如，在MS中，GM-CSF的提高水平与MS的活跃期相关联(McQualter,J.L.,Darwiche,R.,Ewing,C.,Onuki,M.,Kay,T.W.,Hamilton,J.A.,Reid,H.H.,and Bernard,C.C.(2001).Granulocyte macrophage colony-stimulating factor:a new putative therapeutic target in multiple sclerosis.JExp Med 194,873–882；Noster,R.,Riedel,R.,Mashreghi,M.-F.,Radbruch,H.,Harms,L.,Haftmann,C.,Chang,H.-D.,Radbruch,A.,and Zielinski,C.E.(2014).IL-17and GM-CSFexpression are antagonistically regulated by human T helper cells.Sci TranslMed 6,241ra80–241ra80)，并且GM-CSF缺陷小鼠未能在多发性硬化的实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)鼠科模型中发展疾病(McQualter,J.L.,Darwiche,R.,Ewing,C.,Onuki,M.,Kay,T.W.,Hamilton,J.A.,Reid,H.H.,and Bernard,C.C.(2001).Granulocytemacrophage colony-stimulating factor:a new putative therapeutic target inmultiple sclerosis.J Exp Med 194,873–882)。
在哮喘中，GM-CSF的增加水平在哮喘患者的气道中发现(Broide,D.H.,andFirestein,G.S.(1991).Endobronchial allergen challenge in asthma.Demonstrationof cellular source of granulocyte macrophage colony-stimulating factor by insitu hybridization.J Clin Invest 88,1048–1053；Sousa,A.R.,Poston,R.N.,Lane,S.J.,Nakhosteen,J.A.,and Lee,T.H.(1993).Detection of GM-CSF in asthmaticbronchial epithelium and decrease by inhaledcorticosteroids.Am.Rev.Respir.Dis.147,1557–1561)。的确，GM-CSF与IL-5的协同作用促进嗜酸性粒细胞的分化、活化和存活(Yamashita,N.,Tashimo,H.,Ishida,H.,Kaneko,F.,Nakano,J.,Kato,H.,Hirai,K.,Horiuchi,T.,and Ohta,K.(2002).Attenuation ofairway hyperresponsiveness in a murine asthma model by neutralization ofgranulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF).Cellular Immunology219,92–97)。GM-CSF中和抗体的有用性在小鼠哮喘模型中被证明，在该模型中它们的施用导致气道高反应性和炎症的显著降低(Yamashita,N.,Tashimo,H.,Ishida,H.,Kaneko,F.,Nakano,J.,Kato,H.,Hirai,K.,Horiuchi,T.,and Ohta,K.(2002).Attenuation ofairway hyperresponsiveness in a murine asthma model by neutralization ofgranulocyte-macrophage colony-stimulating factor(GM-CSF).Cellular Immunology219,92–97))。
在肺病中，GM-CSF也具有作用，其中高嗜中性粒细胞数目、蛋白酶诱导和TNF-α超量生产被认为是疾病发病机制中的中心因子(central agent)，比如由含LPS的生物气溶胶引起的职业性肺病。的确，在小鼠模型中，肺的LPS依赖性炎症通过使用GM-CSF中和抗体降低(Bozinovski,S.,Jones,J.,Beavitt,S.-J.,Cook,A.D.,Hamilton,J.A.,and Anderson,G.P.(2004).Innate immune responses to LPS in mouse lung are suppressed andreversed by neutralization of GM-CSF via repression of TLR-4.Am.J.Physiol.Lung Cell Mol.Physiol.286,L877–L885)。
在RA中，多个团队已经在滑膜关节液中测量了高水平的GM-CSF(Alvaro-Gracia,J.M.,Zvaifler,N.J.,Brown,C.B.,Kaushansky,K.,and Firestein,G.S.(1991).Cytokines in chronic inflammatory arthritis.VI.Analysis of the synovialcells involved in granulocyte-macrophage colony-stimulating factor productionand gene expression in rheumatoid arthritis and its regulation by IL-1andtumor necrosis factor-alpha.J Immunol 146,3365–3371；Haworth,C.,Brennan,F.M.,Chantry,D.,Turner,M.,Maini,R.N.,and Feldmann,M.(1991).Expression ofgranulocyte-macrophage colony-stimulating factor in rheumatoid arthritis:regulation by tumor necrosis factor-alpha.Eur J Immunol 21,2575–2579；Fiehn,C.,Wermann,M.,Pezzutto,A.,Hüfner,M.,and Heilig,B.(1992).[Plasma GM-CSFconcentrations in rheumatoid arthritis,systemic lupus erythematosus andspondyloarthropathy].Z Rheumatol 51,121–126)，并且在化疗之后利用重组GM-CSF治疗显示了引起RA的加重(flare)(de Vries,E.G.,Willemse,P.H.,Biesma,B.,Stern,A.C.,Limburg,P.C.,and Vellenga,E.(1991).Flare-up of rheumatoid arthritis duringGM-CSF treatment after chemotherapy.The Lancet 338,517–518)。GM-CSF中和抗体在RA中的治疗潜能由其在小鼠的胶原诱导性关节炎模型中的功效暗示(Cook,A.D.,Braine,E.L.,Campbell,I.K.,Rich,M.J.,and Hamilton,J.A.(2001).Blockade of collagen-induced arthritis post-onset by antibody to granulocyte-macrophage colony-stimulating factor(GM-CSF):requirement for GM-CSF in the effector phase ofdisease.Arthritis Res.3,293–298；Cornish,A.L.,Campbell,I.K.,McKenzie,B.S.,Chatfield,S.,and Wicks,I.P.(2009).G-CSF and GM-CSF as therapeutic targets inrheumatoid arthritis.Nat Rev Rheumatol 5,554–559)。
能够中和GM-CSF的抗体可以因而代表炎性和/或自身免疫疾病比如MS、RA和其它自身免疫和炎性疾病的新的有效的预防剂和/或治疗剂。原则上，细胞因子中和可以通过抗体实现，该抗体结合至其靶可溶性细胞因子或结合至细胞膜上展现的细胞因子受体。MOR103和奈米布单抗(Namilumab)是两种噬菌体衍生的人单克隆抗体，其中和GM-CSF并且正发展为RA和MS中的治疗剂(Steidl,S.,Ratsch,O.,Brocks,B.,Dürr,M.,and Thomassen-Wolf,E.(2008).In vitro affinity maturation of human GM-CSF antibodies bytargeted CDR-diversification.Mol Immunol 46,135–144；Krinner,E.-M.,Raum,T.,Petsch,S.,Bruckmaier,S.,Schuster,I.,Petersen,L.,Cierpka,R.,Abebe,D.,Molhoj,M.,Wolf,A.,et al.(2007).A human monoclonal IgG1potently neutralizing the pro-inflammatory cytokine GM-CSF.Mol Immunol 44,916–925；Behrens,F.,Tak,P.P.,Ostergaard,M.,Stoilov,R.,Wiland,P.,Huizinga,T.W.,Berenfus,V.Y.,Vladeva,S.,Rech,J.,Rubbert-Roth,A.,et al.(2014).MOR103,a human monoclonal antibody togranulocyte-macrophage colony-stimulating factor,in the treatment of patientswith moderate rheumatoid arthritis:results of a phase Ib/IIa randomised,double-blind,placebo-controlled,dose-escalation trial.Ann Rheum Dis)，并且马威利姆单抗(mavrilimumab)是靶向RA患者中发展中的GM-CSF受体-α的人单克隆抗体(Burmester,G.R.,Feist,E.,Sleeman,M.A.,Wang,B.,White,B.,and Magrini,F.(2011).Mavrilimumab,a human monoclonal antibody targeting GM-CSF receptor-α,insubjects with rheumatoid arthritis:a randomised,double-blind,placebo-controlled,phase I,first-in-human study.Ann Rheum Dis 70,1542–1549)。
但是，单一GM-CSF中和抗体在体内导致大量长龄的GM-CSF的积累，这些大量长龄的GM-CSF仍然能够解离和引发受体并且可以是单克隆抗体在体内对普通γ-链细胞因子的增强活性的基础(Boyman,O.,Kovar,M.,Rubinstein,M.P.,Surh,C.D.,and Sprent,J.(2006).Selective stimulation of T cell subsets with antibody-cytokine immunecomplexes.Science 311,1924–1927)。
鉴于以上，本发明的目标是提供如此抗体：其与当前可利用的抗体相比更强力和有效地中和细胞因子，特别是GM-CSF。这样的抗体可以在较低剂量下使用，从而降低副作用的风险并且节约成本。而且，本发明的目标是提供如此抗体：其中和细胞因子，特别是GM-CSF，但是其不导致大量长龄的细胞因子特别是GM-CSF——其仍然能够解离并且引发其受体——的积累。总之，本发明的目标因而是提供改进的抗体或其抗原结合片段，以及相关的核酸分子、载体和细胞及药物组合物，其通过成本有效的和直接的途径克服了现有技术的缺点。
本发明潜在的目标通过要求保护的主题解决。
虽然本发明在下文详细描述，但是应当理解本发明不限于本文描述的具体的方法、方案和试剂，因为这些可以改变。还应当理解，本文使用的术语不意欲限制本发明的范围，本发明的范围将仅由所附权利要求书所限制。除非另有限定，本文使用的所有技术和科学术语与本领域普通技术人员通常理解的具有相同的含义。
在下文中，将描述本发明的要素。这些要素利用具体的实施方式来列举，但是，应当理解，它们可以以任何方式和以任何数目进行组合以产生另外的实施方式。各种描述的实例和优选的实施方式不应当被解释为限制本发明至仅明确描述的实施方式。本说明书应当被解释为支持和包含将明确描述的实施方式与任何数目公开的和/或优选的要素组合的实施方式。而且，本申请中所有描述的要素的任何排列与组合应当被视为由本申请的说明书公开，除非上下文另有指示。
遍及本说明书和所附权利要求书，除非上下文另有要求，术语“包括”和变体比如“包含”将被理解为暗示包含规定的元件、整数或步骤，但是不排除任何其它未陈述的元件、整数或步骤。术语“由……组成”是术语“包括”的具体实施方式，其中任何其它未陈述的元件、整数或步骤被排除。在本发明的背景下，术语“包括”涵盖术语“由……组成”。术语“包括”因而涵盖“包含”以及“由……组成”，例如，“包括”X的组合物可以排它性地由X组成或者可以包括一些另外的，例如X+Y。
术语“一个(a,an)”和“该(the)”以及在描述本发明的背景下(尤其在权利要求书的背景下)使用的类似参考对象将被解释为覆盖单数和复数二者，除非此处另有指示或者上下文明显矛盾。本文中值的范围的叙述仅仅意欲充当单独引用落入该范围的每个单独值的速记方法。除非本文另有指示，每个单独值被并入说明书，如同其单独地在本文中被叙述一样。说明书中的语言不应当被解释为指示对于实践本发明必不可少的任何非要求保护的要素。
词语“基本上”不排除“完全地”，例如，“基本上不含”Y的组合物可以完全地不含Y。必要时，词语“基本上”可以从本发明的限定省略。
与数值x相关的术语“大约”意思是x±10％。
如本文所使用的术语“疾病”与术语“紊乱”和“病症”意欲是通常同义的，并且可互换地使用(如在医学病症中)，因为都反映人或动物体或其部位中一种的异常状况，其损害正常功能，通常通过区别征兆和症状表明，并且使得人或动物具有降低的持续时间或生活质量。
如本文所使用，提及对象或患者的“治疗”意欲包括防止、预防、缓解、改善和治疗。术语“对象”或“患者”在本文中可互换地使用以指包括人在内的所有哺乳动物。对象的实例包括人、牛、狗、猫、马、山羊、绵羊、猪和兔。在一个实施方式中，患者是人。
如本文所使用，术语“抗体”包含各种形式的抗体，优选地单克隆抗体，其包括但不限于全抗体、抗体片段、人抗体、嵌合抗体、人源化抗体和基因工程化抗体(变体或突变体抗体)，只要保留了根据本发明的特征性质。尤其优选的是人或人源化单克隆抗体，尤其作为重组人抗体。
如本文所使用，术语“人抗体”意欲包括具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。人抗体在现有技术中是已知的(van Dijk,M.A.,and van de Winkel,J.G.,Curr.Opin.Chem.Biol.5(2001)368-374)。人抗体还可以在转基因动物(例如，小鼠)中产生，这些转基因动物在免疫后能够在缺乏内源免疫球蛋白产生的情况下产生人抗体的全部所有组成成分和选择成分(selection)。在这样的种系突变体小鼠中转移人种系免疫球蛋白基因阵列将导致在抗原攻击之后产生人抗体(参见，例如，Jakobovits,A.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)2551-2555；Jakobovits,A.,et al.,Nature 362(1993)255-258；Bruggemann,M.,et al.,Year Immunol.7(1993)3340)。人抗体还可以在噬菌体展示文库中产生(Hoogenboom,H.R.,and Winter,G.,J.Mol.Biol.227(1992)381-388；Marks,J.D.,et al.,J.Mol.Biol.222(1991)581-597)。Cole等和Boerner等的技术对于制备人单克隆抗体也是可利用的(Cole et al.,Monoclonal Antibodies and CancerTherapy,Alan R.Liss,p.77(1985)；和Boerner,P.,et al.,J.Immunol.147(1991)86-95)。如本文所使用的术语“人抗体”还包括这样的抗体：其例如在可变区中被修饰以生成根据本发明的性质。
如本文所使用，术语“重组人抗体”意欲包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的所有人抗体，比如从宿主细胞比如CHO细胞或从动物(例如小鼠)——其对于人免疫球蛋白基因是转基因的——分离的抗体，或使用转染入宿主细胞的重组表达载体表达的抗体。这样的重组人抗体具有重排形式的可变区和恒定区。根据本发明的重组人抗体已经经受体内体细胞高变。因而，重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是如此序列：尽管衍生自人种系VH和VL序列并与其相关，但是可能不在体内天然地存在于人抗体种系所有组成成分内。
如本文所使用，术语“抗原结合片段”、“片段”和“抗体片段”可互换地使用，其指的是保留根据本发明的抗体的特异性结合活性的本发明的抗体的任何片段和Fc部分(Fcmoiety)。抗体片段的实例包括但不限于单链抗体、Fab、Fab’、F(ab')2、Fv或scFv。本发明的抗体的片段可以通过包括利用酶——比如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶——消化的方法，和/或通过化学还原裂解二硫键从抗体获得。可选地，抗体的片段可以通过克隆并表达重和/或轻链的序列的部分获得。“片段”包括但不限于Fab、Fab’、F(ab')2和Fv片段。本发明还包括衍生自本发明的抗体的重链和轻链的单链Fv片段(scFv)。例如，本发明包括scFv，其包括来自本发明的抗体的CDR。还包括重或轻链单体和二聚体、单结构域重链抗体、单结构域轻链抗体、以及单链抗体，例如单链Fv，在它们中重和轻链可变结构域通过肽连接体接合。本发明的抗体片段可以赋予单价或多价相互作用并且可以包含在如上面描述的多种结构中。例如，scFv分子可以被合成以创建三价“三链抗体”或四价“四链抗体(tetrabody)”。scFv分子可以包括Fc区的结构域——导致二价微抗体(minibody)。此外，本发明的序列可以是多特异性分子的成分，其中本发明的序列靶向本发明的表位并且分子的其它区结合至其它靶标。示例性分子包括但不限于双特异性Fab2、三特异性Fab3、双特异性scFv和双抗体(Holliger和Hudson,2005,Nature Biotechnology 9:1126-1136)。虽然本说明书——包括权利要求书，可以在一些地方明确指抗原结合片段(一种或多种)、抗体片段(一种或多种)、抗体的变体(一种或多种)和/或衍生物(一种或多种)，但是应当理解术语“抗体”或“本发明的抗体”包括所有类别的抗体，即抗原结合片段(一种或多种)、抗体片段(一种或多种)、抗体的变体(一种或多种)和衍生物(一种或多种)。进一步，本文使用的术语“抗体”包括抗体和其抗原结合片段二者。
如本文所使用，“中和抗体”是如此抗体：其可以中和，即防止、抑制、降低、阻碍或干扰病原体在宿主中起始和/或持续感染的能力。术语“中和抗体”和“中和……的抗体”或“中和……的多种抗体”在本文中可互换地使用。这些抗体可以单独或组合使用，作为在适当配制后与主动免疫接种相关联的预防或治疗剂，作为诊断工具，或作为本文描述的生产工具。
如本文所使用，术语“可变区”(轻链的可变区(VL)、重链的可变区(VH))表示轻和重链对的每一个，其直接地参与结合抗体至抗原。在天然抗体中，可变的人轻和重链的结构域具有相同的一般结构，并且每个结构域包括通过三个“高变区”(或互补决定区，CDR)连接的四个框架(FR)区，它们的序列是广泛保守的。框架区采取β-折叠构象并且CDR可以形成连接β-折叠结构的环。每个链中的CDR通过框架区以它们的三维结构保持并且与来自其它链的CDR一起形成抗原结合位点。抗体重和轻链CDR3区在根据本发明的抗体的结合特异性/亲和力中起着特别重要的作用并且因而提供本发明的进一步目标。
如本文所使用，术语“高变区”指的是负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区包括来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基。“框架”或“FR”区是除了如本文所限定的高变区残基之外的那些可变结构域区。因此，天然抗体的轻和重链从N至C端包括结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。在每个链上的CDR被这些框架氨基酸分离。特别地，重链的CDR3是最有助于抗原结合的区。CDR和FR区根据Kabat等，Sequences of Proteins ofImmunological Interest,5th ed.,Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.(1991)的标准定义来确定。
如本文所使用，术语“恒定结构域”指的是抗体的结构域，其不直接地参与结合抗体至抗原，但是展现多种效应物功能。根据它们的重链的恒定区的氨基酸序列，抗体或免疫球蛋白被分为如下几类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的数种可以进一步被分为亚类，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，IgA1和IgA2。与不同种类的免疫球蛋白对应的重链恒定区分别被称为α、ε、γ和μ。根据本发明的抗体优选地具有IgG类型。
如本文所使用，术语“核酸或核酸分子”意欲包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链的或双链的，但是优选的是双链DNA。
如本文所使用，术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换地使用并且所有这些指代包括后代。因而，词语“转化体”和“转化细胞”包括原代对象细胞和从其衍生的培养物，而不考虑转移的次数。还应当理解，由于有意或无意的突变，所有后代在DNA含量方面可能不是精确相同的。包括变体后代，其与在原始转化细胞中筛选的具有相同功能或生物学活性。在意欲不同指代时，其从上下文将是清楚的。
剂量通常关于体重表达。因而，表达为[g、mg或其它单位]/kg(或g、mg等)的剂量通常指[g、mg或其它单位]“每kg(或g、mg等)体重”，即使术语“体重”没有被明确提及。
术语“特异性地结合”和类似参考对象不包括非特异性黏着(sticking)。
如本文所使用的术语“疫苗”通常被理解为提供至少一种抗原——优选地免疫原——的预防或治疗材料。抗原或免疫原可以衍生自适合于疫苗接种的任何材料。例如，抗原或免疫原可以衍生自病原体，比如衍生自细菌或病毒粒子等，或者衍生自肿瘤或癌性组织。抗原或免疫原刺激身体的适应性免疫系统以提供适应性免疫应答。具体而言，“抗原”或“免疫原”通常指可以被免疫系统，优选地被适应性免疫系统识别的物质，并且其能够触发抗原特异性免疫应答，例如通过形成作为适应性免疫应答的一部分的抗体和/或抗原特异性T细胞。通常地，抗原可以是或者可以包括可以通过MHC呈递至T细胞的肽或蛋白质。
如本文所使用，“序列变体”指的是参考序列的任何改变，其中参考序列是“序列表格和SEQ ID编号”(序列表)——即SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:190——中列举的任何序列。因而，术语“序列变体”包括核苷酸序列变体和氨基酸序列变体。具体而言，在“序列变体”中，(参考序列的)功能性被保留，即序列变体是功能性的。如本文所使用的“序列变体”通常具有如下序列：其与参考序列具有至少70％同一性，优选地与参考序列具有至少80％同一性，更优选地与参考序列具有至少90％同一性、甚至更优选地至少95％同一性、并且特别优选地至少99％同一性。
序列同一性通常关于参考序列(即本申请中叙述的序列)的全长计算。如本文所提及，百分比同一性可以例如使用NCBI(the National Center for BiotechnologyInformation；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)[Blosum 62矩阵；缺口开放罚分(gap openpenalty)＝11和缺口延伸罚分(gap extension penalty)＝1]规定的缺省参数使用BLAST测定。
如本文所使用，“核苷酸序列变体”具有改变的序列，其中参考序列中的核苷酸的一个或多个缺失或被置换，或者一个或多个核苷酸被插入参考核苷酸序列的序列中。在本文中通过标准的一字母命名(A、C、G或T)提及核苷酸。由于遗传密码的简并性，“核苷酸序列变体”可以导致各自的参考氨基酸序列中，即“氨基酸序列变体”中的改变，或者不改变。优选的序列变体是这样的核苷酸序列变体——其不导致氨基酸序列变体(沉默突变)，但是其它非沉默突变也在该范围内，特别是导致如下氨基酸序列的突变体核苷酸序列：其与参考序列具有至少70％同一性，优选地与参考序列具有至少80％同一性，更优选地与参考序列具有至少90％同一性、甚至更优选地至少95％同一性、并且特别优选地至少99％同一性。
如本文所使用，术语“突变(mutation,mutating)”应当被理解为包括例如在核酸序列中物理地制造突变(例如，通过改变——例如通过定点诱变——编码一个氨基酸的核酸分子的密码子以导致编码不同氨基酸的密码子)，或者合成序列变体(例如，通过已知编码多肽的核酸分子的核苷酸序列和通过设计包括编码多肽变体的核苷酸序列的核酸分子的合成，而不需要使核酸分子的一个或多个核苷酸突变)。
“氨基酸序列变体”具有改变的序列，其中参考序列中的氨基酸的一个或多个缺失或被置换，或者一个或多个氨基酸被插入参考氨基酸序列的序列中。作为改变的结果，氨基酸序列变体具有如下氨基酸序列：其与参考序列具有至少70％同一性，优选地与参考序列具有至少80％同一性，更优选地与参考序列具有至少90％同一性、甚至更优选地至少95％同一性、并且特别优选地至少99％同一性。具有至少90％同一性的变体序列具有参考序列的每100个氨基酸不超过10个改变，即缺失、插入或置换的任意组合。
在肽/蛋白质的背景下，“线性序列”或“序列”是在氨基至羧基端方向中，在肽/蛋白质中的氨基酸的顺序，在该方向中序列中彼此相邻的残基在肽/蛋白质的一级结构中是连续的。
虽然具有非保守氨基酸置换是可能的，但是优选的是置换是保守氨基酸置换，其中置换的氨基酸与参考序列中对应的氨基酸具有类似的结构或化学性质。举例而言，保守氨基酸置换涉及将一种脂肪族或疏水性氨基酸——例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸——置换为另一种；将一种含羟基的氨基酸例如丝氨酸和苏氨酸置换为另一种；将一种酸性残基例如谷氨酸或天冬氨酸置换为另一种；将一种含酰胺的残基例如天冬酰胺和谷氨酰胺替换为另一种；将一种芳香族残基例如苯丙氨酸和酪氨酸替换为另一种；将一种碱性残基例如赖氨酸、精氨酸和组氨酸替换为另一种；和将一种小氨基酸例如丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸和甘氨酸替换为另一种。
氨基酸序列插入包括长度范围从一个残基到包含一百或更多残基的多肽的氨基和/或羧基端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。端插入的实例包括将氨基酸序列的N或C端融合至报道分子或酶。
重要的是，序列变体是功能性序列变体，即序列变体中的改变不废除各自参考序列的功能性，在当前情况下，例如，抗体的序列或其抗原结合片段结合至细胞因子——特别是GM-CSF——的相同的非重叠表位/位点，和/或充分中和细胞因子——特别是GM-CSF——的功能性。测定哪些核苷酸和氨基酸残基可以分别被置换、插入或缺失而不废除这样的功能性的指导通过使用本领域中熟知的计算机程序找到。
如本文所使用，“衍生自”指定核酸、肽、多肽或蛋白质的核酸序列或氨基酸序列指的是多肽的起源。优选地，衍生自特定序列的核酸序列或氨基酸序列具有如此氨基酸序列：该氨基酸序列与其衍生自的那个序列或其部分是基本上同一的，其中“基本上同一的”包括如上面所限定的序列变体。优选地，衍生自特定肽或蛋白质的核酸序列或氨基酸序列衍生自该特定肽或蛋白质中的对应结构域。其中，“对应”具体指相同的功能性。例如，多特异性抗体——其“衍生自(特定)单特异性抗体”——中的CDR(或CDRH1)氨基酸序列或核酸序列通常衍生自该单特异性抗体的(对应)CDR(或CDRH1)氨基酸序列或核酸序列(并且不来自该单特异性抗体的另一个(非对应)部分)。肽、蛋白质和核酸的“对应”部分因而对于本领域普通技术人员而言是容易鉴定的(例如，CDR1对应于CDR1，CDR2对应于CDR2，等)。同样，“衍生自”另一序列的序列对于本领域普通技术人员而言通常容易鉴定为在该序列中具有其起源。
优选地，衍生自另一核酸、肽、多肽或蛋白质的核酸序列或氨基酸序列与起始核酸、肽、多肽或蛋白质(其衍生自的)可以是同一的。但是，衍生自另一核酸、肽、多肽或蛋白质的核酸序列或氨基酸序列相对于起始核酸、肽、多肽或蛋白质(其衍生自的)也可以具有一个或多个突变，具体而言，衍生自另一核酸、肽、多肽或蛋白质的核酸序列或氨基酸序列可以是起始核酸、肽、多肽或蛋白质(其衍生自的)的如上所述的功能性序列变体。例如，在肽/蛋白质中，一个或多个氨基酸残基可以被其它氨基酸残基置换或者可以发生一个或多个氨基酸残基插入或缺失。
遍及本说明书的文本引用了数个文件。本文中引用的每个文件(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、指令等)，无论上文或下文，在此通过引用以其全部并入。本文中的所有语言都不被解释为承认凭借在先发明，本发明无权早于这样的公开内容。
将理解，本发明不限于本文描述的具体方法、方案和试剂，因为这些可以改变。还将理解，本文使用的术语仅仅是为了描述具体实施方式的目的，并且不意欲限制本发明的范围，本发明的范围将仅由所附权利要求书所限制。除非另有限定，本文使用的所有技术和科学术语与本领域普通技术人员通常理解的具有相同的含义。
本发明基于如下发现等：结合至相同细胞因子——特别是GM-CSF——中的不同的非重叠位点的三种抗体的混合物，基于重量，比当前可利用的抗体MOR103或奈米布单抗更强力。具体而言，当使用三种抗体的混合物时，不发生大量长龄的GM-CSF的累积，但是抗体形成在体内以Fc依赖性方式迅速降解的免疫复合物。这促进本发明人设计由上面描述的抗体的组合起源的多特异性抗体。出人意料地，不仅与当前可利用的GM-CSF抗体相比，而且与抗体的混合物——其中每种抗体仅对于细胞因子的单一位点是特异性的——相比，这些多特异性抗体具有大大增强的中和活性。暗示了在根据本发明的多特异性抗体构建体中，细胞因子——特别是GM-CSF——变得不可逆转地被隔离(sequester)，并且不再可用于与受体相互作用。这些多特异性抗体可以以极低的剂量使用来治疗数种细胞因子依赖性——特别是GM-CSF依赖性——疾病，比如自身免疫疾病和炎性疾病。
多特异性抗体或其抗原结合片段
在第一方面，本发明提供了分离的多特异性抗-细胞因子——优选地抗-GM-CSF——抗体或其抗原结合片段，包括：
(a)至少两个不同的表位结合位点，它们中的每个特异性地结合至细胞因子的单独表位，其中与至少两个不同的表位结合位点结合的细胞因子的单独表位是非重叠表位；和
(b)Fc部分。
根据本发明的这样的多特异性抗-细胞因子——优选地抗GM-CSF——抗体或其抗原结合片段通常强力地中和细胞因子，具体而言所述细胞因子的靶效应，例如根据本发明的多特异性抗体或其抗原结合片段通常强力地中和GM-CSF，具体而言，所述GM-CSF的靶效应。这样的中和可以在本领域技术人员已知的中和试验中评估并如下面描述。
优选地，根据本发明的多特异性抗-细胞因子——优选地抗-GM-CSF——抗体或其抗原结合片段包括非天然存在的氨基酸序列。
如本文所使用，“多特异性”抗体指的是如此抗体，其中单个抗体分子可以结合至至少两个不同表位，例如结合至细胞因子——特别是GM-CSF——中至少两个不同的非重叠位点。与通常结合至不同分子上的至少两个不同表位的大部分已知的多特异性抗体相比，根据本发明的多特异性抗-细胞因子——优选地抗-GM-CSF——抗体或其抗原结合片段的单个分子可以结合至单个细胞因子分子上，特别是单个GM-CSF分子上的至少两个不同的非重叠位点。因而，根据本发明的多特异性抗体或其抗原结合片段相对于单个细胞因子(分子)是“多特异性的”。
优选地，根据本发明的多特异性抗-细胞因子——优选地抗-GM-CSF——抗体或其抗原结合片段是双特异性的、三特异性的、四特异性的或五特异性的，更优选地抗体或其抗原结合片段是双特异性的、三特异性的或四特异性的，甚至更优选地抗体或其抗原结合片段是双特异性的或三特异性的，并且特别优选地抗体或其抗原结合片段是三特异性的。因此，意味着根据本发明的多特异性抗-细胞因子——优选地抗-GM-CSF——抗体或其抗原结合片段相对于单个细胞因子(分子)——特别是相对于单个GM-CSF(分子)——是双特异性的、三特异性的、四特异性的或五特异性的。
与本发明的抗体结合的表位——即细胞因子中，特别是单个细胞因子分子中，例如GM-CSF中，特别是单个GM-CSF分子中的位点——可以是线性的(连续的)或构象的(不连续的)。优选地，本发明的抗体和抗体片段结合构象表位，更具体地构象表位仅在非还原条件下存在。但是，本发明的抗体和抗体片段也可以结合至线性表位，更优选地线性表位在非还原条件和还原条件二者下存在。
根据本发明的抗体包括至少两个不同的表位结合位点，它们中的每个特异性地结合至细胞因子的单独表位，其中与至少两个不同的表位结合位点结合的细胞因子的单独表位是非重叠表位，具体而言细胞因子例如GM-CSF的一级序列的非重叠表位。重要地，与本发明的抗体结合的表位——即细胞因子中，特别是单个细胞因子分子中，例如GM-CSF中，特别是单个GM-CSF分子中的位点——是不同的(即不是相同的)和非重叠的。在单个细胞因子(例如GM-CSF)分子中，与根据本发明的多特异性抗-细胞因子——优选地抗-GM-CSF——抗体结合的表位(也被称为“位点”)可以直接相邻地排列或者可以例如被连接体、被另一种抗体结构域等分离，但是根据本发明，表位必定不重叠。因而，非重叠意思是细胞因子(例如GM-CSF)的氨基酸序列中没有氨基酸被用在与根据本发明的抗体结合的多于一个表位/位点中。换句话说，细胞因子(例如GM-CSF)的氨基酸序列中的每个氨基酸是与根据本发明的抗体结合的一个单个表位的一部分或者不是与根据本发明的抗体结合的任何表位的一部分。
因此，根据本发明的抗体或其抗原结合片段还可以被用于定位(map)与它们结合的细胞因子(例如GM-CSF)的表位。
根据本发明的抗体或其抗原结合片段包括特异性地结合至细胞因子(例如GM-CSF)中的至少两个不同的非重叠位点的至少两个不同的结构域。换句话说，根据本发明的抗体或其抗原结合片段包括特异性地结合至细胞因子(例如GM-CSF)中的第一位点的至少一个第一结构域和至少一个第二结构域，该至少一个第二结构域与至少一个第一结构域不同并且特异性地结合至细胞因子(例如GM-CSF)中的第二位点，其中细胞因子(例如GM-CSF)中的第二位点不同于细胞因子(例如GM-CSF)中的第一位点并且与其不重叠。
在本文中，特异性地结合至细胞因子(例如GM-CSF)的抗体的结构域也可以被称为“结合结构域”、“表位结合结构域”或“表位结合位点”。优选地，抗体的这样的表位结合位点包括至少一个，优选地三个并且更优选地六个CDR，其至少满足特异性地结合至不同表位的最低要求(因而构成“表位结合位点”)并且其可以例如衍生自单特异性抗体。因此，更优选的是如果抗体的这样的表位结合位点包括六个CDR，其共同形成表位结合位点，例如衍生自单特异性抗体的重链的CDR1、CDR2和CDR3，以及衍生自相同的单特异性抗体的对应轻链的CDR1、CDR2和CDR3。甚至更优选地，根据本发明的多特异性抗-细胞因子——优选地抗-GM-CSF——抗体的这样的表位结合位点可以包括重链可变区和/或(对应的)轻链可变区，其可以例如衍生自(相同的)单特异性抗体。
原则上，根据本发明的多特异性抗-细胞因子——优选地抗-GM-CSF——抗体或其抗原结合片段的每个不同的表位结合位点可以存在于抗体中一次或多次，例如二、三、四、五、六、或更多次。例如，天然IgG是二价的和单特异性的，因为其包含两个同一的Fab，其二者识别相同的表位。因而，根据本发明的多特异性抗体或其抗原结合片段是至少二价的，即在两个不同的表位结合位点的情况下，每个在抗体中出现一次。而且，根据本发明的多特异性抗体或其抗原结合片段也可以是三价的，例如在三个不同的表位结合位点的情况下，每个出现一次，或者在两个不同的表位结合位点的情况下，一个出现一次并且另一个出现两次；四价的，例如在四个不同的表位结合位点的情况下，每个出现一次，或者在三个不同的表位结合位点的情况下，两个每个出现一次并且第三个出现两次，或者在两个不同的表位结合位点的情况下，每个出现两次或者一个出现一次和另一个出现三次；五价的；六价的；七价的；八价的；九价的；十价的；十一价的；十二价的；十三价的；十四价的等。
优选地，不同表位结合位点中的每个在根据本发明抗体分子中出现两次。换句话说，根据本发明的抗体分子精确地包括不同结构域中每个特异性地结合至细胞因子中的至少两个不同的非重叠位点的两个拷贝，其由抗体或其抗原结合片段组成。因此，根据本发明的多特异性抗体或其抗原结合片段优选地是四价的、六价的、八价的、十价的、十二价的、十四价的等，其中抗体分子精确地包括不同表位结合位点中每个的两个拷贝。更优选地，根据本发明的多特异性抗-细胞因子——优选地抗-GM-CSF——抗体或其抗原结合片段是双特异性四价抗体、三特异性六价抗体或四特异性八价抗体；甚至更优选地，根据本发明的多特异性抗体或其抗原结合片段是双特异性四价抗体或三特异性六价抗体。
一般而言，优选的是根据本发明的抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体或其抗原结合片段。单克隆抗体通常通过B淋巴细胞的单一克隆产生，例如通过例如从非分泌性骨髓瘤细胞与免疫脾细胞的融合制造形成杂种抗体的细胞。与多克隆抗体相比，多特异性单克隆抗体结合至(预先)确定的表位。因此，意料不到的结合特别是至未确定的表位被大大地避免并且单克隆抗体与多克隆抗体相比被视为更安全。
优选地，根据本发明的抗体，或其抗原结合片段，是人抗体、单克隆抗体、人单克隆抗体、或纯化的抗体。根据本发明的抗体或其抗原结合片段也可以是单链抗体。
Fc部分
根据本发明的多特异性抗体或其抗原结合片段包括Fc部分。优选地，Fc部分衍生自人起源，例如衍生自人IgG1、IgG2、IgG3和/或IgG4，其中人IgG1是特别优选的。
如本文所使用，术语“Fc部分”指的是衍生自免疫球蛋白重链的部分的序列，其开始于木瓜蛋白酶切割位点(例如，天然IgG中的残基216，使得重链恒定区的第一残基为114)正上游的铰链区，终止于免疫球蛋白重链的C端。因此，Fc部分可以是完整的Fc部分或其部分(例如，结构域)。完整的Fc部分至少包括铰链区、CH2结构域和CH3结构域(例如，EU氨基酸位置216-446)。额外的赖氨酸残基(K)有时存在于Fc部分的最C端，但是常常从成熟抗体切割。Fc区内的氨基酸位置中的每个已经根据Kabat的本领域公认的EU编号系统编号，参见例如Kabat等，在“Sequences of Proteins of Immunological Interest”,U.S.Dept.Healthand Human Services,1983and 1987中。
优选地，在本发明的背景下，Fc部分包括如下的至少一种：铰链(例如，上、中和/或下铰链区)结构域，CH2结构域，CH3结构域，或其变体、部分或片段。在优选的实施方式中，Fc部分至少包括铰链结构域、CH2结构域或CH3结构域。更优选地，Fc部分是完整的Fc部分。Fc部分还可以包括相对于天然存在的Fc部分的一个或多个氨基酸插入、缺失或置换。例如，铰链结构域、CH2结构域或CH3结构域(或其部分)中的至少一个可以缺失。例如，Fc部分可以包括或由下列组成：(i)融合至CH2结构域(或其部分)的铰链结构域(或其部分)，(ii)融合至CH3结构域(或其部分)的铰链结构域(或其部分)，(iii)融合至CH3结构域(或其部分)的CH2结构域(或其部分)，(iv)铰链结构域(或其部分)，(v)CH2结构域(或其部分)，或(vi)CH3结构域或其部分。
本领域普通技术人员将理解，Fc部分可以被修饰使得其在与天然存在的免疫球蛋白分子的完整Fc部分在氨基酸序列方面改变，同时保留由天然存在的Fc部分赋予的至少一种期望的功能。这样的功能包括Fc受体(FcR)结合、抗体半衰期调节、ADCC功能、蛋白A结合、蛋白G结合和补体结合。天然存在的Fc部分的部分——其负责这样的功能和/或对于这样的功能是必需的——是本领域技术人员熟知的。
例如，为了激活补体级联，C1q结合至IgG1的至少两个分子或IgM的一个分子——其附接至抗原靶标(Ward,E.S.和Ghetie,V.,Ther.Immunol.2(1995)77-94)。Burton,D.R.描述了(Mol.Immunol.22(1985)161-206)包括氨基酸残基318至337的重链区参与补体固定。Duncan,A.R.和Winter,G.(Nature 332(1988)738-740)，使用位点定向诱变，报道了Glu318、Lys320和Lys322形成与C1q的结合位点。C1q的结合中Glu318、Lys320和Lys322残基的作用通过包含这些残基的短合成肽抑制补体介导的裂解的能力确认。
例如，FcR结合可以通过(抗体的)Fc部分与Fc受体(FcR)的相互作用介导，Fc受体(FcR)是造血细胞上的特化的细胞表面受体。Fc受体属于免疫球蛋白超家族，并且显示为介导通过免疫复合物的吞噬作用去除抗体包被的病原体，和经由抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC；Van de Winkel,J.G.和Anderson,C.L.,J.Leukoc.Biol.49(1991)511-524)裂解包被有对应抗体的红细胞以及各种其它细胞靶标(例如肿瘤细胞)二者。FcR通过它们对免疫球蛋白种类的特异性来限定；IgG抗体的Fc受体被称为FcγR，对于IgE为FcεR，对于IgA为FcαR，以此类推，并且新生的Fc受体被称为FcRn。Fc受体结合例如在Ravetch,J.V.和Kinet,J.P.,Annu.Rev.Immunol.9(1991)457-492；Capel,P.J.等，Immunomethods 4(1994)25-34；de Haas,M.等，J Lab.Clin.Med.126(1995)330-341；和Gessner,J.E.等，Ann.Hematol.76(1998)231-248中描述。
通过天然IgG抗体的Fc结构域(FcγR)交联受体引发多种效应物功能，包括吞噬作用、抗体依赖性细胞毒性和炎性介质的释放，以及免疫复合物清除和抗体产生的调控。在人中，三类FcγR已经被表征，其是：(i)FcγRI(CD64)，其以高亲和力结合单体IgG并且在巨噬细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞上表达；(ii)FcγRII(CD32)，其以中至低亲和力结合复合的IgG，广泛地被表达——特别是在白细胞上，已知为在抗体介导的免疫中是中心因子(central player)，并且其可以分为FcγRIIA、FcγRIIB和FcγRIIC——其在免疫系统中执行不同的功能，但是以类似的低亲和力结合至IgG-Fc，并且这些受体的胞外域是高度同源的；和(iii)FcγRIII(CD16)，其以中至低亲和力结合IgG并且作为两种类型存在：FcγRIIIA，在NK细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和一些单核细胞和T细胞上发现并介导ADCC，和FcγRIIIB，其在嗜中性粒细胞上高度表达。FcγRIIA在参与杀伤的许多细胞(例如巨噬细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞)上发现并且似乎能够激活杀伤过程。FcγRIIB似乎在抑制过程中起作用并且在B细胞、巨噬细胞上以及在肥大细胞和嗜酸性粒细胞上发现。在B细胞上，其似乎起如下功能：抑制进一步免疫球蛋白产生和同种型转换以例如指明(say)IgE种类。在巨噬细胞上，FcγRIIB旨在抑制如通过FcγRIIA介导的吞噬作用。在嗜酸性粒细胞和肥大细胞上，b形式可以有助于通过IgE结合至其单独受体抑制这些细胞的激活。
关于FcγRI结合，E233-G236、P238、D265、N297、A327和P329中至少一种的天然IgG的修饰降低结合至FcγRI。在位置233-236处的IgG2残基被置换为IgG1和IgG4降低结合至FcγRI达103倍并且消除了对抗体敏感的红细胞的人单核细胞应答(Armour,K.L.,etal.Eur.J.Immunol.29(1999)2613-2624)。关于FcγRII结合，例如对于E233-G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、R292和K414中至少一种的IgG突变，FcγRIIA的降低的结合被发现。关于FcγRIII结合，例如对于E233-G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、S239、E269、E293、Y296、V303、A327、K338和D376中至少一种的突变，降低的结合至FcγRIIIA被发现。对Fc受体，在人IgG1上定位结合位点，上面提及的突变位点和用于测量结合至FcγRI和FcγRIIA的方法在Shields,R.L.等，J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604中描述。
关于结合至关键性的FcγRII，天然IgG Fc的两个区对于FcγRII和IgG的相互作用似乎是关键的，即(i)IgG Fc的下铰链位点，特别是氨基酸残基L、L、G、G(234–237，EU编号)，和(ii)IgG Fc的CH2结构域的相邻区，特别是在与下铰链区相邻的上CH2结构域中——例如，P331的区中——的环和链(strand)(Wines,B.D.,et al.,J.Immunol.2000；164:5313–5318)。而且，FcγRI似乎结合至IgG Fc上的相同位点，而FcRn和蛋白A结合至IgG Fc上的不同位点，其似乎在CH2-CH3界面处(Wines,B.D.,et al.,J.Immunol.2000；164:5313–5318)。
例如，Fc部分可以至少包括Fc部分的在本领域中已知为对于FcRn结合或延长半衰期需要的部分或由其组成。可选地或另外地，本发明的抗体的Fc部分至少包括在本领域中已知为对于蛋白A结合需要的部分和/或本发明的抗体的Fc部分至少包括在本领域中已知为对于蛋白G结合需要的Fc分子的部分。优选地，保留的功能是清除细胞因子-免疫复合物，例如GM-CSF-免疫复合物，其被假设为通过FcγR结合来介导。因此，优选的Fc部分至少包括在本领域中已知为对于FcγR结合需要的部分。如上面所概括的，优选的Fc部分因而可以至少包括(i)天然IgG Fc的下铰链位点，特别是氨基酸残基L、L、G、G(234–237，EU编号)，和(ii)天然IgG Fc的CH2结构域的相邻区，特别是在与下铰链区相邻的上CH2结构域中——例如，P331的区中，例如P331周围的天然IgG Fc的上CH2结构域中的至少3、4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的区，例如介于天然IgG Fc的氨基酸320和340(EU编号)之间——的环和链。
优选地，根据本发明的多特异性抗-细胞因子——优选地抗-GM-CSF——抗体或其抗原结合片段包括Fc区。如本文所使用，术语“Fc区”指的是由抗体重链的两个或更多个Fc部分形成的免疫球蛋白的部分。例如，Fc区可以是单体的或“单链”Fc区(即scFc区)。单链Fc区由在单一多肽链内连接的Fc部分组成(例如，以单一连续的核酸序列编码的)。示例性的scFc区在WO 2008/143954 A2中公开。优选地，Fc区是二聚的Fc区。“二聚的Fc区”或“dcFc”指的是由两个单独的免疫球蛋白重链的Fc部分形成的二聚体。二聚的Fc区可以是两个同一的Fc部分(例如，天然存在的免疫球蛋白的Fc区)的同型二聚体或两个非同一Fc部分的异源二聚体。
Fc区的Fc部分可以具有相同的或不同的种类和/或亚类。例如，Fc部分可以衍生自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚类的免疫球蛋白(例如，人免疫球蛋白)。优选地，Fc区的Fc部分具有相同的种类和亚类。但是，Fc区(或Fc区的一个或多个Fc部分)也可以是嵌合的，其中嵌合Fc区可以包括衍生自不同免疫球蛋白种类和/或亚类的Fc部分。例如，二聚的或单链Fc区的Fc部分的至少两个可以来自不同的免疫球蛋白种类和/或亚类。另外地或可选地，嵌合Fc区可以包括一个或多个嵌合Fc部分。例如，嵌合Fc区或部分可以包括衍生自第一亚类(例如，IgG1、IgG2或IgG3亚类)的免疫球蛋白的一个或多个部分，而Fc区或部分的剩余部分具有不同的亚类。例如，Fc多肽的Fc区或部分可以包括衍生自第一亚类(例如，IgG1、IgG2或IgG4亚类)的免疫球蛋白的CH2和/或CH3结构域，和来自第二亚类(例如，IgG3亚类)的免疫球蛋白的铰链区。例如，Fc区或部分可以包括衍生自第一亚类(例如，IgG4亚类)的免疫球蛋白的铰链和/或CH2结构域和来自第二亚类(例如，IgG1、IgG2或IgG3亚类)的免疫球蛋白的CH3结构域。例如，嵌合Fc区可以包括来自第一亚类(例如，IgG4亚类)的免疫球蛋白的Fc部分(例如，完整的Fc部分)和来自第二亚类(例如，IgG1、IgG2或IgG3亚类)的免疫球蛋白的Fc部分。例如，Fc区或部分可以包括来自IgG4免疫球蛋白的CH2结构域和来自IgG1免疫球蛋白的CH3结构域。例如，Fc区或部分可以包括来自IgG4分子的CH1结构域和CH2结构域以及来自IgG1分子的CH3结构域。例如，Fc区或部分可以包括来自抗体的具体亚类的CH2结构域的部分，例如CH2结构域的EU位置292-340。例如，Fc区或部分可以包括衍生自IgG4部分的CH2的位置292-340的氨基酸和衍生自IgG1部分的CH2的剩余部分(可选地，CH2的292-340可以衍生自IgG1部分和CH2的剩余部分衍生自IgG4部分)。
而且，Fc区或部分可以(另外地或可选地)例如包括嵌合铰链区。例如，嵌合铰链可以例如部分地衍生自IgG1、IgG2或IgG4分子(例如，中上和中下铰链序列)，并且部分地衍生自IgG3分子(例如，中间铰链序列)。在另一实例中，Fc区或部分可以包括部分地衍生自IgG1分子和部分地衍生自IgG4分子的嵌合铰链。在另一实例中，嵌合铰链可以包括来自IgG4分子的上和下铰链结构域以及来自IgG1分子的中间铰链结构域。这样的嵌合铰链可以例如通过在IgG4铰链区的中间铰链结构域中的EU位置228处引入脯氨酸置换(Ser228Pro)制造。在另一实施方式中，嵌合铰链可以包括来自IgG2抗体的EU位置233-236处的氨基酸和/或Ser228Pro突变，其中铰链的剩余氨基酸来自IgG4抗体(例如，序列ESKYGPPCPPCPAPPVAGP的嵌合铰链)。可以在根据本发明的抗体的Fc部分中使用的进一步的嵌合铰链在US 2005/0163783 A1中描述。
尤其包含在“Fc区”的定义内的是“无糖基化的Fc区”。术语“无糖基化的Fc区”指的是如此Fc区：该Fc区在其Fc部分的一个或多个中例如在EU位置297处的N-糖基化位点处缺乏共价连接的寡糖或聚糖。例如，无糖基化的Fc区可以是完全无糖基化的，即，其所有Fc部分都缺乏糖类。可选地，无糖基化的Fc区可以是部分无糖基化的(即，半糖基化的)。无糖基化的Fc区可以是去糖基化的Fc区，即Fc糖类已经例如化学地或酶促地被去除的Fc区。可选地或另外地，无糖基化的Fc区可以是非糖基化的或未糖基化的(unglycosylated)，即没有Fc糖类表达的抗体，例如通过突变例如在EU位置297或299处的N-糖基化位点处编码糖基化模式的一个或多个残基，通过在不天然地附接糖类至蛋白质的有机体(例如，细菌)中表达，或者通过在宿主细胞或有机体——已经通过基因操作或通过加入糖基化抑制剂(例如，糖基转移酶抑制剂)致使其糖基化机器缺陷——中表达。可选地，Fc区是“糖基化的Fc区”，即，其在所有可利用的糖基化位点处是完全糖基化的。
在本发明中，优选的是Fc部分或Fc区包括衍生自人免疫球蛋白序列(例如，衍生自来自人IgG分子的Fc区或Fc部分)的氨基酸序列或由其组成。但是，多肽可以包括来自另一哺乳动物物种的一种或多种氨基酸。例如，灵长类动物Fc部分或灵长类动物结合位点可以包含在目标多肽中。可选地，一种或多种鼠科氨基酸可以存在于Fc部分中或Fc区中。
优选地，特别是除了上面描述的Fc部分之外，根据本发明的多特异性抗-细胞因子——优选地抗-GM-CSF——抗体还包括其它部分，其衍生自恒定区，特别是衍生自IgG的恒定区，优选地衍生自IgG1的恒定区，更优选地衍生自人IgG1的恒定区。更优选地，特别是除了上面描述的Fc部分之外，根据本发明的多特异性抗体还包括恒定区的所有其它部分，特别是IgG的恒定区的所有其它部分，优选地IgG1的恒定区的所有其它部分，更优选地人IgG1的恒定区的所有其它部分。
如上面所概述的，根据本发明的特别优选的多特异性抗体包括衍生自人IgG1的(完整的)Fc区。更优选地，特别是除了衍生自人IgG1的(完整的)Fc区之外，根据本发明的多特异性抗体还包括IgG的恒定区的所有其它部分，优选地IgG1的恒定区的所有其它部分，更优选地人IgG1的恒定区的所有其它部分。
细胞因子
根据本发明的多特异性抗-细胞因子——优选地抗-GM-CSF——抗体或其抗原结合片段结合至细胞因子，优选地结合至GM-CSF。细胞因子通常是在细胞信号传导中重要的小蛋白(～5–20kDa)。它们由细胞释放并影响其它细胞的行为，并且有时影响释放细胞自身的行为。细胞因子包括趋化因子、干扰素、白介素、淋巴因子、肿瘤坏死因子、单核因子和集落刺激因子，但是通常不是激素。细胞因子由宽范围的细胞产生，所述细胞包括免疫细胞比如巨噬细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞和肥大细胞，以及内皮细胞、成纤维细胞和各种基质细胞，其中给定的细胞因子可以通过超过一种类型的细胞产生。
趋化因子介导细胞之间的化学引诱作用(趋化性)。根据行为和结构特征，细胞因子蛋白被分类为趋化因子。除了已知用于介导趋化性之外，趋化因子的大小均大约为8-10kDa，在保守位置——其对于形成它们的三维形状是关键的——中具有四个半胱氨酸残基。这些蛋白质在历史上已知在数个其它名称下，其包括细胞因子的SIS家族、细胞因子的SIG家族、细胞因子的SCY家族、血小板因子-4超家族或互泌素。趋化因子可以被分类为四个主要的亚家族：CXC、CC、CX3C和XC。
CC趋化因子(或β-趋化因子)蛋白靠近它们的氨基端具有两个相邻的半胱氨酸(氨基酸)。对于哺乳动物报道存在至少27种不同的该亚组的成员，称为CC趋化因子配体(CCL)-1至(CCL)-28；CCL10与CCL9相同。该亚家族的趋化因子通常包含四个半胱氨酸(C4-CC趋化因子)，但是少量的CC趋化因子具备六个半胱氨酸(C6-CC趋化因子)。C6-CC趋化因子包括CCL1、CCL15、CCL21、CCL23和CCL28。CC趋化因子诱导单核细胞和其它细胞类型比如NK细胞和树突细胞的迁移。CC趋化因子的实例包括单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1或CCL2)，其诱导单核细胞离开血流并进入周围组织以变成组织巨噬细胞。CCL5(或RANTES)吸引表达受体CCR5的细胞，比如T细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。血浆中增加的CCL11水平与小鼠和人的衰老(和降低的神经发生)相关联。CC趋化因子包括例如CCL1–CCL28。
CXC趋化因子(或α-趋化因子)的两个N端半胱氨酸被一个氨基酸分离，在该名称中以“X”代表。存在在哺乳动物中描述的17种不同的CXC趋化因子，其被细分为两个类别，就在CXC基序的第一半胱氨酸之前具有谷氨酸-亮氨酸-精氨酸(或简称为ELR)的特异性氨基酸序列(或基序)的那些(ELR阳性)，和不具有ELR基序的那些(ELR阴性)。ELR阳性的CXC趋化因子明确地诱导嗜中性粒细胞的迁移，并且与趋化因子受体CXCR1和CXCR2相互作用。ELR阳性的CXC趋化因子的实例是白介素-8(IL-8)，其诱导嗜中性粒细胞离开血流并进入周围组织。缺乏ELR基序的其它CXC趋化因子比如CXCL13倾向于是淋巴细胞的化学引诱物。CXC趋化因子结合至CXC趋化因子受体，迄今为止已经发现七种CXC趋化因子受体，被命名为CXCR1-7。CXC趋化因子包括例如CXCL1–CXCL17。
第三组趋化因子被称为C趋化因子(或γ趋化因子)，并且与所有其它趋化因子不同，因为其仅具有两个半胱氨酸；一个N端半胱氨酸和下游的一个半胱氨酸。已经描述了该亚组的两种趋化因子并且被称为XCL1(淋巴细胞趋化因子-α)和XCL2(淋巴细胞趋化因子-β)。
第四组也已经被发现并且成员在两个半胱氨酸之间具有三个氨基酸并且被称为CX3C趋化因子(或d-趋化因子)。迄今为止被发现的仅有的CX3C趋化因子被称为CXXXC趋化分子(或CX3CL1)。其被分泌并系于表达它的细胞的表面，从而充当化学引诱物和粘附分子二者。
干扰素(IFN)是例如响应于病原体——比如病毒、细菌、寄生虫或肿瘤细胞——的存在而产生和释放的一组细胞因子。在典型的情形中，病毒感染的细胞将释放干扰素，引起邻近的细胞加强它们的抗病毒防御。超过二十种不同的IFN基因和蛋白已经在动物包括人中被鉴定。基于它们通过其发信号的受体的类型，人干扰素已经被分为三种主要类型：I型IFN、II型IFN和III型IFN。属于所有三个种类的IFN对于抵抗病毒感染和对于调控免疫系统是重要的。
所有I型IFN结合至被称为IFN-α/β受体(IFNAR)——其由IFNAR1和IFNAR2链组成——的特定细胞表面受体复合物。在人中存在的I型干扰素是IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-κ和IFN-ω。一般而言，当身体识别已经侵入它的病毒时产生I型干扰素。它们由成纤维细胞和单核细胞产生。但是，I型IFN-α的产生可以通过被称为白介素-10的另一种细胞因子禁止。一旦被激活，I型干扰素能够产生防止病毒产生和复制其RNA和DNA的分子。总的来说，IFN-α被建议用于治疗乙型肝炎和丙型肝炎感染，而IFN-β被建议用于治疗多发性硬化。
II型干扰素还被称为免疫干扰素并且特别是通过白介素-12激活。而且，II型干扰素由T辅助细胞——具体地类型1——释放。但是，它们能够阻断T辅助细胞II型的增殖。前面的导致Th2免疫应答的抑制和Th1免疫应答的进一步诱导，其导致衰竭性疾病(debilitating disease)比如多发性硬化的发展。IFN II型结合至IFNGR，其由IFNGR1和IFNGR2链组成。在人中，示例性的IFN II型是IFN-γ。
III型干扰素通过由IL10R2(还被称为CRF2-4)和IFNLR1(还被称为CRF2-12)组成的受体复合物发信号。虽然比I型和II型IFN更近地发现，但是近来的信息证明了III型IFN在一些类型的病毒感染中的重要性。
白介素是一组细胞因子，其首先被认为由白细胞(白血球)表达的。免疫系统的功能在很大程度上取决于白介素，并且它们中许多的罕有的缺陷已经被描述，所有都以自身免疫疾病或免疫缺陷为特征。大多数白介素由辅助CD4T淋巴细胞，以及通过单核细胞、巨噬细胞和内皮细胞合成。它们促进T和B淋巴细胞以及造血细胞的发育和分化。白介素的实例包括IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34、IL-35和IL-36。
淋巴因子是由淋巴细胞产生的细胞因子的子集。它们是通常由T细胞产生以在免疫系统细胞之间通过信号传导来指导免疫系统应答的蛋白介体。淋巴因子具有许多作用，包括吸引其它免疫细胞——包括巨噬细胞和其它淋巴细胞——至感染部位和它们的随后激活以准备它们来进行(mount)免疫应答。循环的淋巴细胞可以检测非常低浓度的淋巴因子并且然后朝向需要免疫应答的地方提升浓度梯度。淋巴因子帮助B细胞产生抗体。由T辅助细胞分泌的重要的淋巴因子包括：IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、GM-CSF和干扰素-γ。
肿瘤坏死因子(或TNF家族)指的是可以引起细胞死亡(细胞凋亡)的一组细胞因子。基于序列、功能和结构相似性，十九种蛋白质被鉴定为TNF家族的一部分，包括肿瘤坏死因子(TNF)(还已知为恶液质素或TNFα)，其是具有多种功能的细胞因子，例如，其可以引起某些肿瘤细胞系的细胞溶解，其参与恶病质的诱导，其是通过直接作用或通过刺激白介素-1分泌引起发烧的强力致热原，并且其可以在某些条件下刺激细胞增殖并诱导细胞分化；淋巴毒素-α(LT-α)和淋巴毒素-β(LT-β)，由淋巴细胞产生的两种相关的细胞因子，其在体外和体内对于宽范围的肿瘤细胞具有细胞毒性；T细胞抗原gp39(CD40L)，在B细胞发育和激活中似乎重要的细胞因子；CD27L，如此细胞因子：其在T细胞激活中起作用并且其诱导共刺激T细胞的增殖和增强溶细胞性T细胞的生成；CD30L，诱导T细胞增殖的细胞因子；FASL，参与细胞死亡的细胞表面蛋白；4-1BBL，有助于T细胞刺激的诱导型T细胞表面分子；OX40L，共刺激T细胞增殖和细胞因子产生的细胞表面蛋白；和TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL)，诱导细胞凋亡的细胞因子。
所有这些TNF家族成员似乎形成同源三聚体(或在LT-α/β情况下，异源三聚体)复合物，其被它们的特异性受体识别。在单体之间的强的氢键使三级结构稳定。一个这样的实例是在小家鼠(M.musculus)TNFα中的Asn34-Arg82氢键。该家族的PROSITE模式位于跨越所有成员保守的蛋白质的中心区段中的β-链中。TNF家族的所有成员，除了分泌的淋巴毒素和增殖诱导配体(APRIL)之外，是从免疫细胞突出的II型跨膜蛋白。当这些膜结合的TNF配体接触并结合其它细胞上它们的同族受体时，它们频繁地发信号回免疫细胞。TNF家族成员的实例包括CD40LG(TNFSF5)；CD70(TNFSF7)；EDA；FASLG(TNFSF6)；LTA(TNFSF1)；LTB(TNFSF3)；TNF,TNFSF4(OX40L)；TNFSF8(CD153)；TNFSF9；TNFSF10(TRAIL)；TNFSF11(RANKL)；TNFSF12(TWEAK)；TNFSF13；TNFSF13B；TNFSF14；TNFSF15；TNFSF18。
单核因子是细胞因子，其主要由单核细胞和巨噬细胞产生。单核因子的实例包括IL-1、TNFα、干扰素α和β、和集落刺激因子。
集落刺激因子(CSF)是分泌的糖蛋白，其结合至造血干细胞表面上的受体蛋白，从而激活可以引起细胞增殖和分化为特定种类的血细胞的细胞内信号传导途径。与造血微环境的其它膜结合的物质相反，集落刺激因子通常是可溶的。这有时被用作限定CSF。它们通过旁分泌、内分泌或自分泌信号传导转导。集落刺激因子的实例包括CSF1(还被称为“巨噬细胞集落刺激因子”)、CSF2(还被称为“粒细胞巨噬细胞集落刺激因子”；GM-CSF和沙格司亭)、CSF3(还被称为“粒细胞集落刺激因子”；G-CSF和非格司亭)、以及合成的CSF，比如Promegapoietin。
在本发明的背景下，优选的是细胞因子是集落刺激因子或干扰素，该细胞因子与多特异性抗-细胞因子——优选地抗-GM-CSF——抗体结合，特别是其中两个不同的结构域结合至细胞因子中两个不同的非重叠位点。在集落刺激因子中，天然存在的CSF是优选的(特别是CSF1、CSF2(GM-CSF)和CSF3(G-CSF))，并且GM-CSF是更优选的。在干扰素中，I型和II型干扰素是优选的，I型干扰素是更优选的，并且干扰素β是甚至更优选的。因而，细胞因子优选地是GM-CSF或干扰素β，更优选地，细胞因子是GM-CSF。
连接体
优选地，根据本发明的抗体或其抗原结合片段进一步包括：
(a)至少一个连接体。
一般而言，根据本发明的多特异性抗-细胞因子——优选地抗-GM-CSF——抗体的两种成分之间的连接可以是直接地或间接地，即两种成分直接地邻接或者它们可以通过复合物的额外成分例如通过连接体连接。具体而言，根据本发明的多特异性抗体的成分中的一些可以直接连接，而其它通过连接体连接。优选地，根据本发明的多特异性抗体包括例如两个VH序列、两个VL序列和/或VH序列与VL序列之间的重链中的连接体(“VH序列”衍生自单特异性抗体的重链并且因而被称为“VH”，即使其可以存在于根据本发明的多特异性抗体的重链或轻链中，并且“VL序列”衍生自单特异性抗体的轻链并且因而被称为“VL”，即使其可以存在于根据本发明的多特异性抗体的重链或轻链中)。因此，在轻链中，连接体可以优选地存在于两个VH序列、两个VL序列和/或VH序列与VL序列之间。另外，如果连接体存在于根据本发明的多特异性抗体的重链中，在恒定结构域例如CH3(例如在IgG CH1-CH2-CH3中)与VH/VL序列之间，其也是优选的。
如本文所使用，术语“连接的”、“融合的”或“融合”可互换地使用。这些术语指的是两个或更多元件或成分通过无论什么方式——包括化学缀合或重组方式——接合在一起。化学缀合的方法(例如，使用异双功能交联剂)在本领域中是已知的。优选地，根据本发明的抗体的成分通过两个或更多个蛋白质、多肽或其片段的共价连接或附接而连接，例如经由它们单独的肽骨架，例如通过编码那些成分或肽片段的单一蛋白分子的表达。优选的融合是框内的，即，在编码核酸分子的水平下，两个或多个开放阅读框(ORF)以维持最初ORF的正确阅读框的方式被融合以形成连续的更长的ORF。因而，所得到的重组融合蛋白是包含与由最初ORF编码的多肽对应的两个或更多个蛋白区段的单一多肽(所述区段正常地实质上是不如此接合的)。虽然如此使得阅读框遍及融合的遗传区段连续，但是蛋白区段可以物理地或空间地被例如(框内)肽连接体分离。
因此，连接多特异性抗体的两种成分的连接体可以是肽连接体。可选地，连接体也可以是非肽的，例如交联剂，但是，肽连接体是优选的。
非肽间隔区可以包括或者可以是酯、硫酯和二硫化物。用于肽或蛋白交联的交联剂包括例如(i)胺-至-胺交联剂，例如同双功能胺特异性蛋白交联试剂，其基于选择性缀合伯胺的NHS酯和亚氨酸酯反应基团；在短的、长的、可裂解的、不可逆的、膜可透过的和细胞表面种类中可利用的；(ii)巯基-至-糖类交联剂，例如基于缀合和形成共价交联的马来酰亚胺和酰肼反应基团的交联试剂；(iii)巯基-至-巯基交联剂，例如同双功能巯基特异性交联试剂，其基于选择性共价缀合蛋白和肽硫醇(还原的半胱氨酸)以形成稳定的硫醚键的马来酰亚胺或吡啶基二硫酚反应基团；(iv)光反应性交联剂，例如芳基叠氮化物、双吖丙啶(diazirine)和其它光反应性(光激活的)化学异双功能交联试剂以经由两步激活缀合参与受体-配体相互作用复合物的蛋白质、核酸和其它分子结构；(v)胺-至-巯基交联剂，例如用于在蛋白质和其它分子的伯胺(赖氨酸)和巯基(半胱氨酸)基团之间缀合的异双功能蛋白交联试剂；以不同长度和类型的间隔臂可利用的；和(vi)胺-至-胺交联剂，例如羧基-至-胺交联剂，例如碳二亚胺交联试剂、DCC和EDC(EDAC)，其用于缀合羧基(谷氨酸、天冬氨酸，C端)至伯胺(赖氨酸，N端)，和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，用于稳定激活用于胺缀合的羧酸盐。
肽连接体优选地由大约1-30个氨基酸组成，其中“短连接体”优选地由大约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸，更优选地由大约1、2、3、4、5或6个氨基酸，甚至更优选地由4-6个氨基酸，特别优选地由5个氨基酸组成，其可以优选地根据SEQ ID NO:143或其功能序列变体。相比之下，“长连接体”优选地由大约10-30个氨基酸，更优选地由大约12-25个氨基酸，和甚至更优选地由大约14-20个氨基酸组成。特别优选的长连接体具有15-17个氨基酸，优选地16个氨基酸，更优选地根据SEQ ID NO:144或其功能序列变体。在根据本发明的多特异性抗体中，长连接体优选地连接VH序列和对应的VL序列(“对应”在本文中指的是共同形成表位结合位点的VH和VL序列)，例如衍生自相同的单特异性抗体的VH序列和VL序列。短连接体可以优选地连接VH/VL序列与“非对应的”VH/VL序列，例如来自不同的单特异性抗体，和/或可以优选地连接恒定结构域例如CH3(例如在IgG CH1-CH2-CH3中)与VH/VL序列。
优选的连接体包括根据SEQ ID NO:143或SEQ ID NO:144或其功能序列变体的氨基酸序列或由其组成。
可选地，肽连接体的氨基酸序列可以与N端或C端侧翼区的氨基酸序列是同一的。可选地，肽连接体可以由非天然氨基酸序列组成，该非天然氨基酸序列比如由所述天然侧翼区的保守氨基酸置换得到的氨基酸序列。在具体的实施方式中，肽间隔区不包含任何Cys(C)残基。在优选的实施方式中，连接体序列包含至少20％、更优选地至少40％、甚至更优选地至少50％、并且特别优选地至少70％Gly(G)或β-丙氨酸残基(A)。更优选地，连接体序列包含至少20％、更优选地至少40％、甚至更优选地至少50％、并且特别优选地至少70％Gly(G)残基。适合的连接体序列可以由本领域技术人员容易地选择和制备。它们可以由D和/或L氨基酸组成。
抗体格式(format)和构建体类型
原则上，根据本发明的多特异性抗体可以具有任何抗体格式，只要该抗体包括特异性地结合至细胞因子(例如GM-CSF)中至少两个不同的非重叠位点的至少两个不同的结构域和FC部分。
例如，抗体可以是具有Fc部分的多特异性抗体片段。具体而言，具有Fc部分的双特异性抗体片段的实例是串联scFv-Fc、scFv-Fc、scFv-Fc杵臼(knobs-into-holes)、scFv-Fc-scFv和scDiabody-Fc，其例如在Chan,A.C.and Carter,P.J.(2010)Nat Rev Immu 10:301-316的图3b中示出并且在所述文章中描述。
根据本发明的抗体可以基于任何免疫球蛋白种类(例如IgA、IgG、IgM等)和亚类(例如IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等)。优选地，根据本发明的多特异性抗体基于IgG(还被称为“IgG类型”)。在IgG种类内，抗体可以基于IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚类，其中基于IgG1(还被称为“IgG1类型”)的抗体是优选的。优选地，本发明的抗体可以具有κ或λ轻链。
IgG基多特异性抗体格式是本领域技术人员熟知的，并且优选的IgG基抗体格式包括例如杂种杂交瘤、具有共同轻链的杵臼、不同的IgG-scFv格式、不同的scFv-IgG格式、二合一(two-in-one)IgG、双重的(或多重的，分别地，例如3倍、4倍等)V结构域IgG、IgG-V和V-IgG，其在Chan,A.C.和Carter,P.J.(2010)Nat Rev Immu 10:301-316的图3c中示出并且在所述文章中描述——用于双特异性IgG基抗体，或导致IgG类型的多特异性抗体的其任何组合。其它优选的IgG基抗体格式包括例如DAF、CrossMab、IgG-dsscFv、DVD、IgG-dsFV、IgG-scFab、scFab-dsscFv和Fv2-Fc，其在Weidle U.H.et al.(2013)Cancer Genomics andProteomics 10:1–18的图1A中示出并且在所述文章中描述。
优选地，根据本发明的多特异性抗体或其抗原结合片段具有IgG类型，优选地具有IgG1类型，更优选地包括IgG1 CH1-CH2-CH3类型的重链恒定区和IgG CK类型的轻链恒定区，甚至更优选地包括IgG1 CH1-CH2-CH3类型——其包括根据SEQ ID NO:140或其功能序列变体的氨基酸序列或由组成——的重链恒定区，和IgG CK类型的轻链恒定区——其包括根据SEQ ID NO:141或其功能序列变体的氨基酸序列或由其组成。
由于IgG具有两个天然的表位结合位点，因此进一步的表位结合位点即“非天然的”表位结合位点优选地缀合至构成IgG抗体格式的一个或两个重链的CH3结构域，优选地缀合至该CH3结构域的C端。可选地，进一步的表位结合位点，即“非天然的”表位结合位点，优选地缀合至IgG抗体格式的天然表位结合位点的轻链可变区的一个或两个，优选地缀合至该轻链可变区的一个或两个的N端，和/或缀合至IgG抗体格式的天然表位结合位点的重链可变区的一个或两个，优选地缀合至该重链可变区的一个或两个的N端。可选地，进一步的表位结合位点，即“非天然的”表位结合位点，优选地缀合至构成IgG抗体格式的一个或两个重链的CH3结构域，优选地缀合至该CH3结构域的C端，和缀合至IgG抗体格式的天然表位结合位点的轻链可变区的一个或两个，优选地缀合至该轻链可变区的一个或两个的N端。可选地，进一步的表位结合位点，即“非天然的”表位结合位点，优选地缀合至构成IgG抗体格式的一个或两个重链的CH3结构域，优选地缀合至该CH3结构域的C端，和缀合至IgG抗体格式的天然表位结合位点的重链可变区的一个或两个，优选地缀合至该重链可变区的一个或两个的N端。
在IgG抗体格式的任何这样的附接位点处，优选地在天然表位结合位点的轻和/或重链可变区和/或重链的CH3结构域处，一个或多于一个例如两个、三个、四个或更多个非天然表位结合位点可以被附接，其中一个或两个非天然表位结合位点的附接是优选的并且一个非天然表位结合位点的附接是更优选的。
例如，如果根据本发明的抗体是IgG格式的双特异性抗体，则一个“特异性”优选地由天然表位结合位点提供并且另一个“特异性”优选地由非天然表位结合位点提供。具体而言，非天然表位结合位点然后可以附接至上面提及的附接位点中的任一个，优选地天然表位结合位点的轻链可变区，天然表位结合位点的重链可变区，或者IgG抗体格式的重链的CH3结构域。
例如，如果根据本发明的抗体是IgG格式的三特异性抗体，则一个“特异性”(“特异性1”)优选地由天然表位结合位点提供并且另外两个“特异性”(“特异性2”和“特异性3”)优选地由非天然表位结合位点提供。因此，“特异性2”的非天然表位结合位点可以优选地附接至上面提及的附接位点中的任一个，优选地天然表位结合位点的轻链可变区，天然表位结合位点的重链可变区，或者IgG抗体格式的重链的CH3结构域，同时“特异性3”的非天然表位结合位点可以优选地附接至任何其它的上面提及的附接位点，即至其中“特异性2”的非天然表位结合位点不附接的任何附接位点。可选地，另外两个特异性(“特异性2”和“特异性3”)的非天然表位结合位点可以优选地附接至相同的附接位点，例如另外两个特异性(“特异性2”和“特异性3”)的非天然表位结合位点都附接至天然表位结合位点的轻链可变区，或者另外两个特异性(“特异性2”和“特异性3”)的非天然表位结合位点都附接至天然表位结合位点的重链可变区，或者另外两个特异性(“特异性2”和“特异性3”)的非天然表位结合位点都附接至IgG抗体格式的重链的CH3结构域。在该情况下，即另外两个特异性(“特异性2”和“特异性3”)的非天然表位结合位点都附接至相同附接位点，“特异性2”的非天然表位结合位点和“特异性3”的非天然表位结合位点优选地被连续地布置，即非天然表位结合位点中仅一个直接(或经由本文描述的连接体)附接至附接位点，而非表位结合位点中另一个优选地连接至非天然表位结合位点的第一个。
具体而言，根据本发明的抗体优选地包括表位结合位点中每个的两个拷贝，其中优选的是这两个拷贝在IgG基抗体的第一和第二重链的对应位置处附接，例如(i)一个拷贝缀合至IgG抗体格式的第一重链的天然表位结合位点的重链可变区并且另一个拷贝缀合至IgG抗体格式的第二重链的天然表位结合位点的重链可变区；或者(ii)一个拷贝缀合至IgG抗体格式的第一轻链的天然表位结合位点的轻链可变区并且另一个拷贝缀合至IgG抗体格式的第二轻链的天然表位结合位点的轻链可变区；或者(iii)一个拷贝缀合至IgG抗体格式的第一重链的CH3结构域并且另一个拷贝缀合至IgG抗体格式的第一轻链的CH3结构域。
根据本发明的多特异性抗体的优选抗体格式以及它们的构建在US 2009/0155275A1中描述，该专利申请具体地涉及包括抗体恒定结构域的Fc区的多特异性表位结合蛋白。因而，在US 2009/0155275 A1中公开的抗体格式优选地被用于根据本发明的多特异性抗体。
根据本发明的抗体的示例性构建体类型包括构建体类型“Bs1”、“Bs2”、“Bs3”、“Ts1”、“Ts2”和“Ts3”，其在图4中示出。因此，根据本发明的多特异性抗体或其抗原结合片段优选地根据选自Bs1、Bs2、Bs3、Ts1、Ts2和Ts3的构建体类型。更优选地，根据本发明的多特异性抗体或其抗原结合片段根据构建体类型Ts3，优选地，抗体或其抗原结合片段是根据构建体类型Ts3的三特异性抗体。
构建体类型“Bs1”是基于IgG，优选地基于IgG1的双特异性四价抗体格式。Bs1的重链包括(以N至C端的这个顺序)：
(a)第一可变区，例如衍生自第一单特异性抗体的重或轻链；优选地衍生自第一单特异性抗体的VH序列，即重链可变区；
(b)与第一可变区(a)一起形成第一表位结合位点的对应的第二可变区，例如衍生自第一单特异性抗体的对应的重或轻链可变区；优选地衍生自第一单特异性抗体的VL序列，即轻链可变区；
(c)第三可变区，例如衍生自第二单特异性抗体的重链；优选地衍生自第二单特异性抗体的VH序列，即重链可变区；和
(d)IgG CH1-CH2-CH3。
优选地，成分(a)和(b)通过长连接体连接，成分(b)和(c)通过短连接体连接并且成分(c)和(d)直接连接。Bs1的轻链包括(以N至C端的这个顺序)：
(e)与第三可变区(c)一起形成第二表位结合位点的第四可变区，例如衍生自第二单特异性抗体的对应的轻链可变区；优选地衍生自第二单特异性抗体的VL序列，即轻链可变区；和
(f)IgG CK或IG CL；优选地Ig CK。
优选地，成分(e)和(f)直接连接。由于Bs1基于IgG，因此Bs1包括两个同一的重链和两个同一的轻链。如本文所使用，抗体中的位置——在该位置中布置形成Bs1中的第一表位结合位点的CDR/可变区(成分(a)和(b))——被称为“位置A”，并且抗体中的位置——在该位置中布置形成Bs1中的第二表位结合位点的CDR/可变区(成分(c)和(d))——被称为“位置B”(参见图4)。在构建中，(第二)单特异性抗体可以充当“支架”，来自该抗体的重和轻链可变区分别地被用于多特异性抗体的重和轻链中。构建体类型“Bs1”和其构建的优选实施方式在US 2009/0155275 A1的图4E和4F以及对应的说明书中描述。
构建体类型“Bs2”是基于IgG，优选地基于IgG1的双特异性四价抗体格式。Bs2的重链包括(以N至C端的这个顺序)：
(a)第一可变区，例如衍生自第一单特异性抗体的重链；优选地衍生自第一单特异性抗体的VH序列，即重链可变区；和
(b)IgG CH1-CH2-CH3
优选地，成分(a)和(b)直接连接。Bs2的轻链包括(以N至C端的这个顺序)：
(c)第二可变区，例如衍生自第二单特异性抗体的重或轻链；优选地衍生自第二单特异性抗体的VH序列，即重链可变区；
(d)与第二可变区(c)一起形成第一表位结合位点的对应的第三可变区，例如衍生自第二单特异性抗体的对应的重或轻链可变区；优选地衍生自第二单特异性抗体的VL序列，即轻链可变区；
(e)与第一可变区(a)一起形成第二表位结合位点的第四可变区，例如衍生自第一单特异性抗体的对应的轻链可变区；优选地衍生自第一单特异性抗体的VL序列，即轻链可变区；和
(f)IgG CK或IG CL；优选地Ig CK。
优选地，成分(c)和(d)通过长连接体连接，成分(d)和(e)通过短连接体连接并且成分(e)和(f)直接连接。由于Bs2基于IgG，因此Bs2包括两个同一的重链和两个同一的轻链。如本文所使用，抗体中的位置——在该位置中布置形成Bs2中的第一表位结合位点的CDR/可变区(成分(c)和(d))——被称为“位置A”，并且抗体中的位置——在该位置中布置形成Bs2中的第二表位结合位点的CDR/可变区(成分(a)和(e))——被称为“位置B”(参见图4)。在构建中，(第一)单特异性抗体可以充当“支架”，来自该抗体的重和轻链可变区分别地被用于多特异性抗体的重和轻链中。构建体类型“Bs2”和其构建的优选实施方式在US2009/0155275 A1的图4C和4D以及对应的说明书中描述。
构建体类型“Bs3”是基于IgG，优选地基于IgG1的双特异性四价抗体格式。Bs3的重链包括(以N至C端的这个顺序)：
(a)第一可变区，例如衍生自第一单特异性抗体的重链；优选地衍生自第一单特异性抗体的VH序列，即重链可变区；和
(b)IgG CH1-CH2-CH3；
(c)第二可变区，例如衍生自第二单特异性抗体的重或轻链；优选地衍生自第二单特异性抗体的VH序列，即重链可变区；
(d)与第二可变区(c)一起形成第一表位结合位点的对应的第三可变区，例如衍生自第二单特异性抗体的对应的重或轻链可变区；优选地衍生自第二单特异性抗体的VL序列，即轻链可变区。
优选地，成分(a)和(b)直接连接，成分(b)和(c)通过短连接体连接并且成分(c)和(d)通过长连接体连接。Bs3的轻链包括(以N至C端的这个顺序)：
(e)与第一可变区(a)一起形成第二表位结合位点的第四可变区，例如衍生自第一单特异性抗体的对应的轻链可变区；优选地衍生自第一单特异性抗体的VL序列，即轻链可变区；和
(f)IgG CK或IG CL；优选地Ig CK。
优选地，成分(e)和(f)直接连接。由于Bs3基于IgG，因此Bs3包括两个同一的重链和两个同一的轻链。如本文所使用，抗体中的位置——在该位置中布置形成Bs3中的第一表位结合位点的CDR/可变区(成分(c)和(d))——被称为“位置C”，并且抗体中的位置——在该位置中布置形成Bs3中的第二表位结合位点的CDR/可变区(成分(a)和(e))——被称为“位置B”(参见图4)。在构建中，(第一)单特异性抗体可以充当“支架”，来自该抗体的重和轻链可变区分别地被用于多特异性抗体的重和轻链中。构建体类型“Bs3”(但是具有其它“特异性”，即不根据本发明的表位结合位点)和其构建的原理也在Dimasi,N.,Gao,C.,Fleming,R.,Woods,R.M.,Yao,X.-T.,Shirinian,L.,Kiener,P.A.,and Wu,H.(2009).Thedesign and characterization of oligospecific antibodies for simultaneoustargeting of multiple disease mediators.J Mol Biol 393,672–692的图1(d)(“Bs3Ab”)和对应的说明书中描述。
构建体类型“Ts1”是基于IgG，优选地基于IgG1的三特异性六价抗体格式。Ts1的重链包括(以N至C端的这个顺序)：
(a)第一可变区，例如衍生自第一单特异性抗体的重链；优选地衍生自第一单特异性抗体的VH序列，即重链可变区；
(b)IgG CH1-CH2-CH3；
(c)第二可变区，例如衍生自第二单特异性抗体的重或轻链；优选地衍生自第二单特异性抗体的VH序列，即重链可变区；
(d)与第二可变区(c)一起形成第一表位结合位点的对应的第三可变区，例如衍生自第二单特异性抗体的对应的重或轻链可变区；优选地衍生自第二单特异性抗体的VL序列，即轻链可变区；
(e)第四可变区，例如衍生自第三单特异性抗体的重或轻链；优选地衍生自第三单特异性抗体的VH序列，即重链可变区；
(f)与第四可变区(e)一起形成第二表位结合位点的对应的第五可变区，例如衍生自第三单特异性抗体的对应的重或轻链可变区；优选地衍生自第三单特异性抗体的VL序列，即轻链可变区。
优选地，成分(a)和(b)直接连接，成分(b)与(c)和成分(d)与(e)通过短连接体连接并且成分(c)与(d)和成分(e)与(f)通过长连接体连接。Ts1的轻链包括(以N至C端的这个顺序)：
(g)与第一可变区(a)一起形成第三表位结合位点的第六可变区，例如衍生自第一单特异性抗体的对应的轻链可变区；优选地衍生自第一单特异性抗体的VL序列，即轻链可变区；和
(h)IgG CK或IG CL；优选地Ig CK。
优选地，成分(g)和(h)直接连接。由于Ts1基于IgG，因此Ts1包括两个同一的重链和两个同一的轻链。如本文所使用，抗体中的位置——在该位置中布置形成Ts1中的第一表位结合位点的CDR/可变区(成分(c)和(d))——以及抗体中的位置——在该位置中布置形成Ts1中的第二表位结合位点的CDR/可变区(成分(e)和(f))——被称为“位置C”，并且抗体中的位置——在该位置中布置形成Ts1中的第三表位结合位点的CDR/可变区(成分(a)和(g))——被称为“位置B”(参见图4)。在构建中，(第一)单特异性抗体可以充当“支架”，来自该抗体的重和轻链可变区分别地被用于多特异性抗体的重和轻链中。构建体类型“Ts1”和其构建的优选实施方式在US 2009/0155275 A1的图3A和3B以及对应的说明书中描述。
构建体类型“Ts2”是基于IgG，优选地基于IgG1的三特异性六价抗体格式。Ts2的重链包括(以N至C端的这个顺序)：
(a)第一可变区，例如衍生自第一单特异性抗体的重或轻链；优选地衍生自第一单特异性抗体的VH序列，即重链可变区；
(b)与第一可变区(a)一起形成第一表位结合位点的对应的第二可变区，例如衍生自第一单特异性抗体的对应的重或轻链可变区；优选地衍生自第一单特异性抗体的VL序列，即轻链可变区；
(c)第三可变区，例如衍生自第二单特异性抗体的重链；优选地衍生自第二单特异性抗体的VH序列，即重链可变区；和
(d)IgG CH1-CH2-CH3。
优选地，成分(a)和(b)通过长连接体连接，成分(b)和(c)通过短连接体连接并且成分(c)和(d)直接连接。Ts2的轻链包括(以N至C端的这个顺序)：
(e)第四可变区，例如衍生自第三单特异性抗体的重或轻链；优选地衍生自第三单特异性抗体的VH序列，即重链可变区；
(f)与第四可变区(e)一起形成第二表位结合位点的对应的第五可变区，例如衍生自第三单特异性抗体的对应的重或轻链可变区；优选地衍生自第三单特异性抗体的VL序列，即轻链可变区；
(g)与第三可变区(c)一起形成第三表位结合位点的第六可变区，例如衍生自第二单特异性抗体的对应的轻链可变区；优选地衍生自第二单特异性抗体的VL序列，即轻链可变区；和
(h)IgG CK或IG CL；优选地Ig CK。
优选地，成分(e)和(f)通过长连接体连接，成分(f)和(g)通过短连接体连接并且成分(g)与(h)直接连接。由于Ts2基于IgG，因此Ts2包括两个同一的重链和两个同一的轻链。如本文所使用，抗体中的位置——在该位置中布置形成Ts2中的第一表位结合位点的CDR/可变区(成分(a)和(b))——以及抗体中的位置——在该位置中布置形成Ts2中的第二表位结合位点的CDR/可变区(成分(e)和(f))——被称为“位置A”，并且抗体中的位置——在该位置中布置形成Ts2中的第三表位结合位点的CDR/可变区(成分(c)和(g))——被称为“位置B”(参见图4)。在构建中，(第二)单特异性抗体可以充当“支架”，来自该抗体的重和轻链可变区分别地被用于多特异性抗体的重和轻链中。构建体类型“Ts2”和其构建的优选实施方式在US 2009/0155275 A1的图4G和4H以及对应的说明书中描述。
构建体类型“Ts3”是基于IgG，优选地基于IgG1的三特异性六价抗体格式。Ts3的重链包括(以N至C端的这个顺序)：
(a)第一可变区，例如衍生自第一单特异性抗体的重或轻链；优选地衍生自第一单特异性抗体的VH序列，即重链可变区；
(b)与第一可变区(a)一起形成第一表位结合位点的对应的第二可变区，例如衍生自第一单特异性抗体的对应的重或轻链可变区；优选地衍生自第一单特异性抗体的VL序列，即轻链可变区；
(c)第三可变区，例如衍生自第二单特异性抗体的重链；优选地衍生自第二单特异性抗体的VH序列，即重链可变区；
(d)IgG CH1-CH2-CH3；
(e)第四可变区，例如衍生自第三单特异性抗体的重或轻链；优选地衍生自第三单特异性抗体的VH序列，即重链可变区；和
(f)与第四可变区(e)一起形成第二表位结合位点的对应的第五可变区，例如衍生自第三单特异性抗体的对应的重或轻链可变区；优选地衍生自第三单特异性抗体的VL序列，即轻链可变区。
优选地，成分(a)与(b)和成分(e)与(f)通过长连接体连接，成分(b)与(c)和成分(d)与(e)通过短连接体连接并且成分(c)和(d)直接连接。Ts3的轻链包括(以N至C端的这个顺序)：
(e)与第三可变区(c)一起形成第三表位结合位点的第六可变区，例如衍生自第二单特异性抗体的对应的轻链可变区；优选地衍生自第二单特异性抗体的VL序列，即轻链可变区；和
(f)IgG CK或IG CL；优选地Ig CK。
优选地，成分(e)和(f)直接连接。由于Ts3基于IgG，因此Ts3包括两个同一的重链和两个同一的轻链。如本文所使用，抗体中的位置——在该位置中布置形成Ts3中的第一表位结合位点的CDR/可变区(成分(a)和(b))——被称为“位置A”，抗体中的位置——在该位置中布置形成Ts3中的第二表位结合位点的CDR/可变区(成分(e)和(f))——被称为“位置C”，并且抗体中的位置——在该位置中布置形成Ts3中的第三表位结合位点的CDR/可变区(成分(c)和(d))——被称为“位置B”(参见图4)。在构建中，(第二)单特异性抗体可以充当“支架”，来自该抗体的重和轻链可变区分别地被用于多特异性抗体的重和轻链中。
对于关于构建体类型Bs1、Bs2、Bs3、Ts1和Ts2的构建的进一步的信息，可以使用文件US 2009/0155275 A1和Dimasi,N.,Gao,C.,Fleming,R.,Woods,R.M.,Yao,X.-T.,Shirinian,L.,Kiener,P.A.和Wu,H.(2009):The design and characterization ofoligospecific antibodies for simultaneous targeting of multiple diseasemediators；J Mol Biol 393,672–692。在这些文件中概括的构建原理可以改编并且然后应用于新型构建体类型Ts3。
中和
优选地，根据本发明的多特异性抗体或其抗原结合片段中和细胞因子——特别是GM-CSF——的靶效应，
(i)在严格条件下，具有150ng/ml或更低的IC90，优选地具有120ng/ml或更低的IC90，更优选地具有100ng/ml或更低的IC90，甚至优选地具有50ng/ml或更低的IC90，并且特别优选地具有10ng/ml或更低的IC90；
(ii)在较低严格条件下，具有20ng/ml或更低的IC90，优选地具有15ng/ml或更低的IC90，更优选地具有10ng/ml或更低的IC90，甚至优选地具有5ng/ml或更低的IC90，并且特别优选地具有1ng/ml或更低的IC90；
(iii)在更严格条件下，具有160ng/ml或更低的IC90，优选地具有130ng/ml或更低的IC90，更优选地具有100ng/ml或更低的IC90，甚至优选地具有50ng/ml或更低的IC90，并且特别优选地具有10ng/ml或更低的IC90；和/或
(iv)在非常严格条件下，具有1000ng/ml或更低的IC90，优选地具有500ng/ml或更低的IC90，更优选地具有250ng/ml或更低的IC90，甚至优选地具有100ng/ml或更低的IC90，并且特别优选地具有50ng/ml或更低的IC90。
其中，“x ng/ml或更低的IC90”指的是90％中和(IC90)细胞因子(例如GM-CSF)的靶效应需要的根据本发明的抗体或其抗原结合片段的浓度(x ng/ml或更低)。
一般而言，抗体的功能性通过其中和细胞因子(例如GM-CSF)的重要效应(“靶效应”)的能力来评估。在中和试验中，可以测定中和例如细胞因子(例如GM-CSF)的靶效应或病毒的感染性需要的抗体的浓度。各种中和试验对于本领域技术人员而言是已知的，其中技术人员通常根据细胞因子(例如GM-CSF)和其靶效应选择中和试验。例如，在中和试验中有用的细胞因子(例如GM-CSF)靶效应包括例如指示细胞系的细胞因子诱导的增殖、细胞因子诱导的细胞因子产生、L929细胞系的TNF-α诱导的杀伤和对L929和A549细胞系的病毒感染的IFN-γ保护。
在下面，给出了中和试验的非限制性实例以阐明中和试验的原理：
(1)例如在微量滴定板中或以任何其它适合的格式制备不同浓度的待测试的抗体，例如连续稀释；
(2)将靶剂量的细胞因子(即给定量的细胞因子，例如GM-CSF)加入至抗体并且在适合的条件下共培育，例如在室温下或在37℃下持续1小时；
(3)将共培育的抗体-细胞因子(例如共培育的抗体-GM-CSF)转移至适合的靶细胞培养物，例如在包含靶细胞(例如靶细胞的单层)的孔中，并且进行培育，例如在室温或37℃下持续预定量的时间，例如1、2、3、4、5、6或7天；和
(4)其后，分析靶效应并且可以测定IC90。
测量的效应通常是剂量依赖性的：抗体效价越高，靶效应的中和越强。根据抗体的中和特性，IC90值改变，例如显著中和特性的抗体将需要加入较低量(的抗体)，例如用于在试验中实现靶效应的相同量的中和。
如本文所使用，“较低严格条件”指的是大约50pg/ml的最终细胞因子(例如GM-CSF)浓度和大约1000个细胞/孔。“严格条件”指的是大约50pg/ml的最终细胞因子(例如GM-CSF)浓度和大约10000个细胞/孔。“更严格条件”指的是大约500pg/ml的最终细胞因子(例如GM-CSF)浓度和大约1000个细胞/孔。“非常严格条件”指的是大约500pg/ml的最终细胞因子(例如GM-CSF)浓度和大约10000个细胞/孔。
用于评估中和细胞因子诱导的增殖或中和细胞因子诱导的细胞因子产生的适合指示细胞系的实例包括TF-1、MC/9、L929、D10、CTLL-2、B9、脾细胞、NIH/3T3、COLO205、A549、hPBMC、NHDF和Nag 7/8，其中TF-1细胞优选地被用于中和细胞因子GM-CSF、IL-13、IL-4和IL-5，MC/9细胞优选地被用于中和细胞因子GM-CSF、IL-5和IL-10，L929细胞优选地被用于中和细胞因子IFN-γ和TNF-α，D10细胞优选地被用于中和细胞因子IL-1α和IL-1β，CTLL-2细胞优选地被用于中和细胞因子Il-2、IL-4和IL-15，B9细胞优选地被用于中和细胞因子IL-6和IL-21，脾细胞细胞优选地被用于中和细胞因子IL-12/IL-23p40和IL-23，NIH/3T3细胞优选地被用于中和细胞因子IL-17A，COLO205细胞优选地被用于中和细胞因子IL-22，A549细胞优选地被用于中和细胞因子IFN-γ和IFN-β，hPBMC细胞优选地被用于中和细胞因子IL-12/IL-23p40，NHDF细胞优选地被用于中和细胞因子IL-17A，和Nag7/8细胞优选地被用于中和细胞因子TSLP。
如果抗体中和细胞因子GM-CSF——特别是GM-CSF诱导的增殖——的能力被评估，则待使用的优选的细胞是TF-1细胞。优选的GM-CSF中和试验包括下列步骤：
(1)例如在微量滴定板中或以任何其它适合的格式制备不同浓度的待测试的抗体，例如连续稀释；
(2)将靶剂量的GM-CSF例如100pg/ml加入至抗体并且在适合的条件下共培育，特别是在37℃下持续1小时；
(3)将共培育的抗体-GM-CSF转移至TF-1细胞，特别是转移至包含1000或10000个TF-1细胞/孔的孔，并且进行培育，例如在37℃下持续3-4天，例如72h；和
(4)其后，分析增殖的中和并且可以测定IC90，例如GM-CSF中和可以利用下式计算为抑制TF-1生长的百分比：[1-(单孔的CCPM–在没有GM-CSF的情况下生长的对照细胞的平均CCPM)/(在具有GM-CSF的情况下生长的对照细胞的平均CCPM–在没有GM-CSF的情况下生长的对照细胞的平均CCPM)]×100(CCPM＝校正的计数/分钟)，并且IC90(μg/ml)可以对于每个样品通过非线性回归分析，例如使用GraphPad Prism 5软件计算。
在该试验中，较低严格条件指的是大约50pg/ml的最终GM-CSF浓度和大约1000个TF-1细胞/孔。严格条件指的是大约50pg/ml的最终GM-CSF浓度和大约10000个TF-1细胞/孔。更严格条件指的是大约500pg/ml的最终GM-CSF浓度和大约1000个TF-1细胞/孔。非常严格条件指的是大约500pg/ml的最终GM-CSF浓度和大约10000个TF-1细胞/孔。
可变区和CDR
优选地，根据本发明的抗体或其抗原结合片段包括一个或多个互补决定区(CDR)。一般而言，互补决定区(CDR)是抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域中存在的高变区。优选地，根据本发明的抗体或其抗原结合片段包括在重链上的至少三个CDR和在轻链上的至少三个CDR。更优选地，根据本发明的抗体或其抗原结合片段包括在重链上的至少六个CDR和在轻链上的至少三个CDR。甚至更优选地，根据本发明的抗体或其抗原结合片段包括在重链上的至少九个CDR和在轻链上的至少三个CDR或者在重链上的至少六个CDR和在轻链上的至少六个CDR。
典型地，抗体的结构域——其特异性地结合至抗原的表位，例如结合至细胞因子分子特别是GM-CSF中的某一位点——还被称为“抗原受体”或“表位结合位点”。抗体的该结构域，即抗原受体/表位结合位点，特别是在天然单特异性IgG抗体中，通常由重链的三个CDR和连接的轻链的三个CDR形成。换句话说，由于特别是在天然单特异性IgG抗体中，抗原受体/表位结合位点一般由两个可变结构域组成，因此对于每个抗原受体存在六个CDR(重链：CDRH1、CDRH2和CDRH3；轻链：CDRL1、CDRL2和CDRL3)。单一抗体——特别是单一天然单特异性IgG抗体——通常具有两个(同一的)抗原受体并且因此包括十二个CDR(即2×六个CDR)。
但是，根据本发明的多特异性抗体或其抗原结合片段包括特异性地结合至细胞因子——特别是GM-CSF——的至少两个不同的非重叠位点的至少两个不同的结构域。优选地，根据本发明的多特异性抗体或其抗原结合片段的单个分子包括每个不同结构域特异性地结合至细胞因子的至少两个不同的非重叠位点的两个同一的结构域。还优选的是根据本发明的多特异性抗体或其抗原结合片段的单个分子包括两个重链和两个轻链。更优选地，根据本发明的多特异性抗体或其抗原结合片段的单个分子包括两个重链和两个轻链，其中两个重链共享至少80％、优选地85％、更优选地90％、甚至更优选地95％，和特别优选地100％序列同一性，和/或两个轻链共享至少80％、优选地85％、更优选地90％、甚至更优选地95％和特别优选地100％序列同一性。因而，如果根据本发明的多特异性抗体或其抗原结合片段的单个分子包括每个不同结构域特异性地结合至细胞因子(例如GM-CSF)的至少两个不同的非重叠位点的两个同一的结构域，则所述同一的结构域中的一个优选地由第一重链和轻链组成，并且另一个优选地由多特异性抗体的第二重链和轻链组成。
由于它们的“多特异性”，即不同表位结合位点，根据本发明的多特异性抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链可以(每个)包括多于三个CDR，特别是多于三个不同的CDR。例如，根据本发明的多特异性抗体或其抗原结合片段可以包括特异性地结合至细胞因子——特别是GM-CSF——的至少两个不同的非重叠位点的至少两个不同的结构域，其中所述至少两个不同的结构域中的每个衍生自不同的单特异性抗体，例如IgG类型的不同的单特异性抗体。由于这样的单特异性抗体典型地包括形成抗原受体/表位结合位点的在重链中的三个CDR和在轻链中的三个CDR，因此根据本发明的多特异性抗体可以具体地包括第一抗体的重链的三个CDR和第一抗体的轻链的三个CDR、第二抗体的重链的三个CDR和第二抗体的轻链的三个CDR、任选地第三抗体的重链的三个CDR和第三抗体的轻链的三个CDR等。因而，由根据本发明的多特异性抗体的重链和/或轻链组成的CDR的数目优选地是三的倍数，例如三、六、九、十二等。因此，还优选的是由根据本发明的多特异性抗体的重链和轻链二者组成的CDR的总和是六的倍数，例如六、十二、十八等。
具体而言，在根据本发明的多特异性抗体或其抗原结合片段中，重链还可以包括衍生自单特异性抗体的轻链的CDR或可变区。例如，在根据本发明的多特异性抗体中，重链可以包括衍生自第一单特异性抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)以及衍生自与第一单特异性抗体不同的第二单特异性抗体的重链可变区(VH)，而衍生自第二单特异性抗体的轻链可变区(VL)由根据本发明的多特异性抗体的轻链组成。在这样的多特异性抗体中，第二单特异性抗体可以具体地被用作“支架”。因此，在根据本发明的多特异性抗体中，重链可以包括衍生自第一单特异性抗体的一个或多个，优选地所有三个重链CDR和一个或多个，优选地所有三个轻链CDR，和衍生自与第一单特异性抗体不同的第二单特异性抗体的一个或多个，优选地所有三个重链CDR，而衍生自第二单特异性抗体的一个或多个，优选地所有三个轻链CDR由根据本发明的多特异性抗体的轻链组成。在这样的多特异性抗体中，第二单特异性抗体可以被具体地用作“支架”。
典型地，特别是在天然单特异性IgG抗体中，三个CDR(CDR1、CDR2和CDR3)在可变结构域中被非连续地布置。换句话说，重和/或轻链上的CDR可以例如被框架区分离，其中框架区(FR)是可变结构域中与CDR相比较少“可变的”区。例如，在根据本发明的抗体中，可变区(或者每个可变区，分别地)可以优选地包括被三个CDR分离的四个框架区。
如上面所描述，在根据本发明的多特异性抗体中，单链优选地重链可以包括多于三个CDR(CDR1、CDR2和CDR3)和/或超过一个可变区，如上面描述的。由于“抗原受体”通常由CDR——即CDRH1、CDRH2和CDRH3以及CDRL1、CDRL2和CDRL3——表征，因此在根据本发明的多特异性抗体中优选的是CDR被布置使得顺序(例如，衍生自相同单特异性抗体的CDRH1、CDRH2和CDRH3和/或CDRL1、CDRL2和CDRL3)被维持以保存“抗原受体”，即以保存特异性地结合至抗原(例如细胞因子，特别是GM-CSF)中的某一位点的能力。这意味着例如，氨基酸段(stretch)中衍生自第一单特异性抗体的CDRH1、CDRH2和CDRH3的顺序优选地不被衍生自第二单特异性抗体的任何CDR中断。而且，如果根据本发明的多特异性抗体的单链——优选地重链——包括衍生自第一单特异性抗体的重链和轻链的CDR，则重链CDR(一个或多个)优选地紧靠衍生自相同单特异性抗体的轻链CDR(一个或多个)被布置。例如，这样的布置可以是-CDRH1(a)-CDRH2(a)-CDRH3(a)-CDRL1(a)-CDRL2(a)-CDRL3(a)-CDRH1(b)-CDRH2(b)-CDRH3(b)-，其中(a)和(b)指的是不同单特异性抗体，各自的CDR衍生自其并且CDR通常以非连续方式布置，即CDR可以被不是CDR——例如框架区和/或连接体——的任何氨基酸序列分离。重要地，如果根据本发明的多特异性抗体包括衍生自至少两个不同单特异性抗体的表位结合位点(抗原受体)，则这些单特异性抗体的CDR或可变区被布置在根据本发明的多特异性抗体中，使得CDR(或可变区)衍生自的每个单特异性抗体的“抗原受体”被保存，即其特异性地结合至抗原(例如细胞因子，特别是GM-CSF)中的某一位点的能力被保存。
CDR氨基酸的位置在本文中根据IMGT编号系统(IMGT:http://www.imgt.org/；cf.Lefranc,M.-P.et al.(2009)Nucleic Acids Res.37,D1006-D1012)限定。在序列表中公开了CDR、重链、轻链的实例序列以及编码本发明的抗体——即根据本发明的数种抗体——的CDR、重链、轻链的核酸分子的序列。衍生自单特异性抗体的重链CDR的根据本发明的多特异性抗体的CDR还分别被称为CDRH1、CDRH2和CDRH3。类似地，衍生自单特异性抗体的轻链CDR的根据本发明的多特异性抗体的CDR还分别被称为CDRL1、CDRL2和CDRL3。因而，例如，CDRL1、CDRL2和CDRL3还可以存在于根据本发明的多特异性抗体的重链上。因此，衍生自单特异性抗体的重链可变区的根据本发明的多特异性抗体的可变区还被称为VH，并且衍生自单特异性抗体的轻链可变区的根据本发明的多特异性抗体的可变区还被称为VL。因而，例如VL还可以存在于根据本发明的多特异性抗体的重链上。
优选地，根据本发明的抗体或其抗原结合片段包括含有至少一个CDRH1、至少一个CDRH2和至少一个CDRH3的重链和含有至少一个CDRL1、至少一个CDRL2和至少一个CDRL3的轻链，其中至少一个重链CDRH3包括根据SEQ ID NO:3、51、69或107或其功能序列变体的氨基酸序列，优选地至少一个重链CDRH3包括根据SEQ ID NO:3或69或其功能序列变体的氨基酸序列。还优选的是重链包括至少两个CDRH1、至少两个CDRH2和至少两个CDRH3，其中一个CDRH1、CDRH2和CDRH3衍生自第一单特异性抗体和一个CDRH1、CDRH2和CDRH3衍生自与第一单特异性抗体不同的第二单特异性抗体。
还优选的是，本发明的多特异性抗体或其抗原结合片段包括含有至少一个CDRH1、至少一个CDRH2和至少一个CDRH3的重链和含有至少一个CDRL1、至少一个CDRL2和至少一个CDRL3的轻链，其中至少一个重链CDRH3包括与SEQ ID NO:3、51、69或107，优选地与SEQ IDNO:3或69具有至少90％，例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
表1提供了六个CDR的氨基酸序列的SEQ ID编号，所述CDR衍生自示例性单特异性抗体并且在本发明的示例性多特异性抗体中使用。
表1.衍生自示例性单特异性抗体的CDR肽的SEQ ID编号
变体抗体也包括在本发明的范围内。因而，在本申请中叙述的序列的变体也包括在本发明的范围内。这样的变体包括在免疫反应期间通过体细胞突变在体内生成的或者在无限增殖化B细胞克隆的培养时在体外生成的自然变体。可选地，变体可能由于遗传密码的简并性出现，或者可能由于转录或翻译中的错误产生。
具有改善的亲和力和/或效力的抗体序列的进一步的变体可以使用本领域中已知的方法获得并且包括在本发明的范围内。例如，氨基酸置换可以被用于获得具有进一步改善的亲和力的抗体。可选地，核苷酸序列的密码子优化可以被用于改善用于产生抗体的表达系统中翻译的效率。进一步，如此多核苷酸也在本发明的范围内：其包括通过应用直接进化方法至本发明的核酸序列中的任一个而优化抗体特异性或中和活性的序列。
优选地，变体抗体序列可以与本申请中陈述的序列共享70％或更多(即75％、80％、85％、88％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)氨基酸序列同一性。这样的变体通常在重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的CDR中比在框架区中与本文列举的序列具有更高同源性。如本领域技术人员已知的，突变在框架区中比在CDR中是更耐受的，即有限丧失或者不丧失功能(例如，特异性或中和能力)。
本发明因而包括抗体或其抗原结合片段，其中来自本文提供的序列的变化优选地在抗体的框架区(一个或多个)中或者在编码抗体的框架区(一个或多个)的核酸残基中。
在本发明中，这样的(变体)抗体是优选的，其中体细胞突变的数目被降低(即“种系的(germlined)”抗体：回复至“种系”构型)。抗体的种系序列可以被测定，例如参考IMGT数据库(例如，根据IMGT VDJ和VJ分配和重排解释：http://www.imgt.org/；cf.Lefranc,M.-P.et al.(2009)Nucleic Acids Res.37,D1006-D1012)，和“种系的”抗体变体可以产生，例如通过基因合成或通过位点定向诱变。低水平的体细胞突变降低了抗体免疫原性的潜在风险。优选地，体细胞突变的数目在框架区(FR)(即“框架区种系的”抗体，在本文中还被称为FR-GL变体)中降低。(变体)抗体或其抗原结合片段和FR-GL变体——在框架区(FR)中分别地不含任何体细胞突变——是更优选的。特别优选的是这样的(变体)抗体或其抗原结合片段和FR-GL变体——分别地具有尽可能少的体细胞突变，从而在另一方面，中和活性不受损(与包含(更多)体细胞突变的参考抗体/片段相比)。在一方面，这样的抗体在它们的中和活性方面不受损，因而显示非常高的效力和广度(breadth)。在另一方面，抗体免疫原性的潜在风险被显著地降低。
在优选的实施方式中，本发明的多特异性抗体或抗体片段包括具有如此序列的至少一个CDR：其与SEQ ID NO:1-7、49-55、67-73和105-111中的任一个具有至少95％序列同一性。
优选地，本发明的多特异性抗体或抗体片段包括具有如此序列的多于一个的CDR：其与SEQ ID NO:1-7、49-55、67-73和105-111中的任一个具有至少95％序列同一性。
优选地，抗体或其抗原结合片段包括具有如此序列的两个CDR：其与SEQ ID NO:1-7、49-55、67-73和105-111中的任一个具有至少95％序列同一性。因而，优选的是抗体或其抗原结合片段包括(i)与SEQ ID NO:1、49、67和105中的任一个具有至少95％序列同一性的CDRH1和与SEQ ID NO:4、52、70和108中的任一个具有至少95％序列同一性的CDRL1；(ii)与SEQ ID NO:2、50、68和106中的任一个具有至少95％序列同一性的CDRH2和与SEQ ID NO:5、6、53、54、71、72、109和110中的任一个具有至少95％序列同一性的CDRL2；或(iii)与SEQ IDNO:3、51、69和107中的任一个具有至少95％序列同一性的CDRH3和与SEQ ID NO:7、55、73和111中的任一个具有至少95％序列同一性的CDRL3。
优选地，抗体或其抗原结合片段包括具有如此序列的三个CDR：其与SEQ ID NO:1-7、49-55、67-73和105-111中的任一个具有至少95％序列同一性。因而，优选的是抗体或其抗原结合片段包括(i)与SEQ ID NO:1、49、67和105中的任一个具有至少95％序列同一性的CDRH1，与SEQ ID NO:2、50、68和106中的任一个具有至少95％序列同一性的CDRH2，和与SEQID NO:3、51、69和107中的任一个具有至少95％序列同一性的CDRH3；或(ii)与SEQ ID NO:4、52、70和108中的任一个具有至少95％序列同一性的CDRL1，与SEQ ID NO:5、6、53、54、71、72、109和110中的任一个具有至少95％序列同一性的CDRL2和与SEQ ID NO:7、55、73和111中的任一个具有至少95％序列同一性的CDRL3。
优选地，抗体或其抗原结合片段包括具有如此序列的四个CDR：其与SEQ ID NO:1-7、49-55、67-73和105-111中的任一个具有至少95％序列同一性。因而，优选的是抗体或其抗原结合片段包括(i)与SEQ ID NO:1、49、67和105中的任一个具有至少95％序列同一性的CDRH1，与SEQ ID NO:2、50、68和106中的任一个具有至少95％序列同一性的CDRH2，与SEQID NO:3、51、69和107中的任一个具有至少95％序列同一性的CDRH3，和与SEQ ID NO:4-7、52-55、70-73或108-111中的任一个具有至少95％序列同一性的CDRL；(ii)与SEQ ID NO:4、52、70和108中的任一个具有至少95％序列同一性的CDRL1，与SEQ ID NO:5、6、53、54、71、72、109和110中的任一个具有至少95％序列同一性的CDRL2，与SEQ ID NO:7、55、73和111中的任一个具有至少95％序列同一性的CDRL3，和与SEQ ID NO:1-3、49-51、67-69和105-107中的任一个具有至少95％序列同一性的CDRH，其中与SEQ ID NO:3、51、69和107中的任一个具有至少95％序列同一性的CDRH3是特别优选的；(iii)与SEQ ID NO:1、49、67和105中的任一个具有至少95％序列同一性的CDRH1，与SEQ ID NO:4、52、70和108中的任一个具有至少95％序列同一性的CDRL1，与SEQ ID NO:2、50、68和106中的任一个具有至少95％序列同一性的CDRH2，和与SEQ ID NO:5、6、53、54、71、72、109和110中的任一个具有至少95％序列同一性的CDRL2；(iv)与SEQ ID NO:1、49、67和105中的任一个具有至少95％序列同一性的CDRH1，与SEQ ID NO:4、52、70和108中的任一个具有至少95％序列同一性的CDRL1，与SEQID NO:3、51、69和107中的任一个具有至少95％序列同一性的CDRH3，和与SEQ ID NO:7、55、73和111中的任一个具有至少95％序列同一性的CDRL3；或(v)与SEQ ID NO:2、50、68和106中的任一个具有至少95％序列同一性的CDRH2，与SEQ ID NO:5、6、53、54、71、72、109和110中的任一个具有至少95％序列同一性的CDRL2，与SEQ ID NO:3、51、69和107中的任一个具有至少95％序列同一性的CDRH3，和与SEQ ID NO:7、55、73和111中的任一个具有至少95％序列同一性的CDRL3。
优选地，抗体或其抗原结合片段包括具有如此序列的五个CDR：其与SEQ ID NO:1-7、49-55、67-73和105-111中的任一个具有至少95％序列同一性。因而，优选的是抗体或其抗原结合片段包括选自下列的五个CDR：与SEQ ID NO:1、49、67和105中的任一个具有至少95％序列同一性的CDRH1，与SEQ ID NO:2、50、68和106中的任一个具有至少95％序列同一性的CDRH2，与SEQ ID NO:3、51、69和107中的任一个具有至少95％序列同一性的CDRH3，与SEQ ID NO:4、52、70和108中的任一个具有至少95％序列同一性的CDRL1，与SEQ ID NO:5、6、53、54、71、72、109和110中的任一个具有至少95％序列同一性的CDRL2，和与SEQ ID NO:7、55、73和111中的任一个具有至少95％序列同一性的CDRL3。
优选地，抗体或其抗原结合片段包括具有如此序列的六个CDR：其与SEQ ID NO:1-7、49-55、67-73和105-111中的任一个具有至少95％序列同一性。因而，优选的是抗体或其抗原结合片段包括选自下列的六个CDR：与SEQ ID NO:1、49、67和105中的任一个具有至少95％序列同一性的CDRH1，与SEQ ID NO:2、50、68和106中的任一个具有至少95％序列同一性的CDRH2，与SEQ ID NO:3、51、69和107中的任一个具有至少95％序列同一性的CDRH3，与SEQ ID NO:4、52、70和108中的任一个具有至少95％序列同一性的CDRL1，与SEQ ID NO:5、6、53、54、71、72、109和110中的任一个具有至少95％序列同一性的CDRL2，和与SEQ ID NO:7、55、73和111中的任一个具有至少95％序列同一性的CDRL3。更优选地，抗体或其抗原结合片段包括：
(i)分别根据SEQ ID NO:1-5和7或其功能序列变体，或根据SEQ ID NO:1-4和6-7或其功能序列变体的重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列以及轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列；
(ii)分别根据SEQ ID NO:49-53和55或其功能序列变体，或根据SEQ ID NO:49-52和54-55或其功能序列变体的重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列以及轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列；
(iii)分别根据SEQ ID NO:67-71和73或其功能序列变体，或根据SEQ ID NO:67-70和72-73或其功能序列变体的重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列以及轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列；和/或
(iv)分别根据SEQ ID NO:105-109和111或其功能序列变体，或根据SEQ ID NO:105-108和110-111或其功能序列变体的重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列以及轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列。
在上面描述的本发明的抗体或其抗原结合片段——其具有至少一个CDR，即如上面描述的一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个CDR——的实施方式中，这样的抗体或其抗原结合片段的实施方式是优选的：其包括与SEQ ID NO:3、51、69和107中的任一个具有至少95％序列同一性的CDRH3。
还优选的是，本发明的分离的抗体或抗原结合片段包括具有SEQ ID NO:1、49、67和105或其功能序列变体的氨基酸序列的重链CDR1；具有SEQ ID NO:2、50、68和106或其功能序列变体的氨基酸序列的重链CDR2；和具有SEQ ID NO:3、51、69和107或其功能序列变体的氨基酸序列的重链CDR3。在某些实施方式中，本文中提供的抗体或抗体片段包括包括含有下列的氨基酸序列的重链：(i)CDRH1，SEQ ID NO:1；CDRH2，SEQ ID NO:2；和CDRH3，SEQID NO:3，(ii)CDRH1，SEQ ID NO:49；CDRH2，SEQ ID NO:50；和CDRH3，SEQ ID NO:21，(iii)CDRH1，SEQ ID NO:67；CDRH2，SEQ ID NO:68；和CDRH3，SEQ ID NO:69，和/或(iv)CDRH1，SEQID NO:105；CDRH2，SEQ ID NO:106；和CDRH3，SEQ ID NO:107。
优选地，本发明的抗体或抗原结合片段包括具有根据SEQ ID NO:4、52、70和108中任一个或其功能序列变体的氨基酸序列的轻链CDR1；具有根据SEQ ID NO:5、6、53、54、71、72、109和110中任一个或其功能序列变体的氨基酸序列的轻链CDR2；和/或具有根据SEQ IDNO:7、55、73和111中任一个或其功能序列变体的氨基酸序列的轻链CDR3。在某些实施方式中，本文中提供的抗体或抗体片段包括包括含有下列的氨基酸序列的轻链：(i)CDRL1，SEQID NO:4；CDRL2，SEQ ID NO:5或6；和CDRL3，SEQ ID NO:7；(ii)CDRL1，SEQ ID NO:52；CDRL2，SEQ ID NO:53或54；和CDRL3，SEQ ID NO:55；(iii)CDRL1，SEQ ID NO:70；CDRL2，SEQID NO:71或72；和CDRL3，SEQ ID NO:73；和/或(iv)CDRL1，SEQ ID NO:108；CDRL2，SEQ IDNO:109或110；和CDRL3，SEQ ID NO:111。
在本发明的另一个实施方式中，本发明包括分离的抗体或其抗原结合片段，包括重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列，其分别与SEQ ID NO:1-7、49-55、67-73和105-111的任何六个氨基酸序列具有至少80％，例如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
表2提供了重和轻链可变区的氨基酸序列以及编码它们的核酸序列的SEQ ID编号，所述重和轻链可变区衍生自示例性单特异性抗体并且在本发明的示例性多特异性抗体中使用。
表2.衍生自示例性单特异性抗体的VH和VL肽的SEQ ID编号
起源(单特异性AB) VH氨基酸 VL氨基酸 VH核酸 VL核酸
GCA7 37 38 39-43 44-48
GCA21 63 64 65 66
GCB59 95 96 97-100 101-104
GCE536 130 131 132-135 136-139
取决于它们衍生自单特异性抗体(例如GCA7、GCA21、GCB59或GCE536)的重链还是衍生自单特异性抗体(例如GCA7、GCA21、GCB59或GCE536)的轻链，这些序列分别被称为“VH序列”或“VL序列”。因而，在根据本发明的多特异性抗体中，例如重链还可以(例如除了一个或多个VH序列之外)包括一个或多个VL序列(其由它们衍生自的单特异性抗体的轻链组成)。
优选地，根据本发明的分离的抗体或抗原结合片段包括具有如此氨基酸序列的VH序列：其与根据SEQ ID NO:37、63、95和130的序列中任一个具有大约70％、75％、80％、85％、88％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在另一实施方式中，抗体或抗体片段包括具有如此氨基酸序列的VL序列：其与根据SEQ ID NO:38、64、96和131的序列中任一个具有大约70％、75％、80％、85％、88％、90％、85％、88％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
优选地，根据本发明的抗体或抗原结合片段包括：
(i)根据SEQ ID NO:37或其功能序列变体的VH氨基酸序列和根据SEQ ID NO:38或其功能序列变体的VL氨基酸序列；和/或
(ii)根据SEQ ID NO:63或其功能序列变体的VH氨基酸序列和根据SEQ ID NO:64或其功能序列变体的VL氨基酸序列；和/或
(iii)根据SEQ ID NO:95或其功能序列变体的VH氨基酸序列和根据SEQ ID NO:96或其功能序列变体的VL氨基酸序列；和/或
(iv)根据SEQ ID NO:130或其功能序列变体的VH氨基酸序列和根据SEQ ID NO:131或其功能序列变体的VL氨基酸序列。
而且，根据本发明的抗体或其抗原结合片段的重链优选地包括选自根据SEQ IDNO:38、64、96和131或其功能序列变体的氨基酸序列的VL氨基酸序列。更优选地，抗体或抗原结合片段的重链包括选自根据SEQ ID NO:38和96或其功能序列变体的氨基酸序列的VL氨基酸序列，并且甚至更优选地，抗体或抗原结合片段的重链包括根据SEQ ID NO:96或其功能序列变体的VL氨基酸序列。
在根据本发明的多特异性抗体或其抗原结合片段中，优选的是
(i)抗体或抗原结合片段具有选自构建体类型Bs1、Bs2、Bs3、Ts1、Ts2和Ts3的构建体类型；和
(ii)抗体或抗原结合片段包括CDRH1氨基酸序列、CDRH2氨基酸序列、CDRH3氨基酸序列、CDRL1氨基酸序列、CDRL2氨基酸序列和CDRL3氨基酸序列，其选自(a)根据SEQ ID NO:1-5和7或其功能序列变体的氨基酸序列；(b)根据SEQ ID NO:1-4和6-7或其功能序列变体的氨基酸序列；(c)根据SEQ ID NO:67-71和73或其功能序列变体的氨基酸序列；(d)根据SEQ ID NO:67-70和72-73或其功能序列变体的氨基酸序列；(e)根据SEQ ID NO:49-53和55或其功能序列变体的氨基酸序列；(f)根据SEQ ID NO:49-52和54-55或其功能序列变体的氨基酸序列；(g)根据SEQ ID NO:105-109和111或其功能序列变体的氨基酸序列；和(h)根据SEQ ID NO:105-108和110-111或其功能序列变体的氨基酸序列。
更优选地，根据本发明的多特异性抗体或其抗原结合片段
(i)具有选自构建体类型Bs1、Bs2、Bs3、Ts1、Ts2和Ts3的构建体类型；和
(ii)在位置A和/或C的任一个处包括CDRH1氨基酸序列、CDRH2氨基酸序列、CDRH3氨基酸序列、CDRL1氨基酸序列、CDRL2氨基酸序列和CDRL3氨基酸序列，其选自(a)根据SEQID NO:1-5和7或其功能序列变体的氨基酸序列；(b)根据SEQ ID NO:1-4和6-7或其功能序列变体的氨基酸序列；(c)根据SEQ ID NO:67-71和73或其功能序列变体的氨基酸序列；和(d)根据SEQ ID NO:67-70和72-73或其功能序列变体的氨基酸序列。
甚至更优选地，根据本发明的多特异性抗体或其抗原结合片段
(i)具有选自构建体类型Bs1、Bs2、Bs3、Ts1、Ts2和Ts3的构建体类型；和
(ii)在位置A和/或C的任一个处包括根据SEQ ID NO:67-71和73或其功能序列变体或根据SEQ ID NO:67-70和72-73或其功能序列变体的CDRH1氨基酸序列、CDRH2氨基酸序列、CDRH3氨基酸序列、CDRL1氨基酸序列、CDRL2氨基酸序列和CDRL3氨基酸序列。
特别优选地，根据本发明的多特异性抗体或其抗原结合片段
(i)具有选自构建体类型Bs1、Bs2、Bs3、Ts1、Ts2和Ts3的构建体类型；和
(ii)在位置A处包括根据SEQ ID NO:67-71和73或其功能序列变体或根据SEQ IDNO:67-70和72-73或其功能序列变体的CDRH1氨基酸序列、CDRH2氨基酸序列、CDRH3氨基酸序列、CDRL1氨基酸序列、CDRL2氨基酸序列和CDRL3氨基酸序列。
优选地，根据本发明的多特异性抗体或其抗原结合片段根据gTs1GC1、gTs1GC2a、gTs2GC2b、gTs2GC2c、gTs3GC2d、gTs3GC2e、gBs3GC1a、gBs3GC1b、gBs2GC1c、gBs2GC1d、gBs1GC2a、gBs3GC2b、gBs1GC3a、gBs3GC3b、gBs3GC4和gBs3GC5，优选地其根据gTs3GC2d或gBs1GC3a。更优选地，抗体或其抗原结合片段是Ts1GC1、Ts1GC2a、Ts2GC2b、Ts2GC2c、Ts3GC2d、Ts3GC2e、Bs3GC1a、Bs3GC1b、Bs2GC1c、Bs2GC1d、Bs1GC2a、Bs3GC2b、Bs1GC3a、Bs3GC3b、Bs3GC4和Bs3GC5，优选地Ts3GC2d或Bs1GC3a。
本发明人已经设计并构建了十六种多特异性抗体，其在本文中被称为Ts1GC1、Ts1GC2a、Ts2GC2b、Ts2GC2c、Ts3GC2d、Ts3GC2e、Bs3GC1a、Bs3GC1b、Bs2GC1c、Bs2GC1d、Bs1GC2a、Bs3GC2b、Bs1GC3a、Bs3GC3b、Bs3GC4和Bs3GC5(参见实施例5；表7)。基于抗体Ts1GC1、Ts1GC2a、Ts2GC2b、Ts2GC2c、Ts3GC2d、Ts3GC2e、Bs3GC1a、Bs3GC1b、Bs2GC1c、Bs2GC1d、Bs1GC2a、Bs3GC2b、Bs1GC3a、Bs3GC3b、Bs3GC4和Bs3GC5，特别是基于衍生自四种单特异性抗体(GCA7、GCA21、GCB59、GCE536)的VH和VL序列的组合，如本文所使用的术语gTs1GC1、gTs1GC2a、gTs2GC2b、gTs2GC2c、gTs3GC2d、gTs3GC2e、gBs3GC1a、gBs3GC1b、gBs2GC1c、gBs2GC1d、gBs1GC2a、gBs3GC2b、gBs1GC3a、gBs3GC3b、gBs3GC4和gBs3GC5指的是各自的“通用(generic)”抗体或其抗原结合片段，其包括由如下面所概述的特定核苷酸序列编码的特定VH和VL氨基酸序列。
表7(实施例5)分别示出了抗体Ts1GC1、Ts1GC2a、Ts2GC2b、Ts2GC2c、Ts3GC2d、Ts3GC2e、Bs3GC1a、Bs3GC1b、Bs2GC1c、Bs2GC1d、Bs1GC2a、Bs3GC2b、Bs1GC3a、Bs3GC3b、Bs3GC4和Bs3GC5的重链的氨基酸序列的SEQ ID NO以及轻链的氨基酸序列的SEQ ID NO(在表7中还被称为“完整序列”)，以及编码它们的核酸序列。各自的序列在“实施例”后的“序列表和SEQ ID编号”中示出。
如本文所使用，“gTs1GC1”指的是三特异性抗体或其抗原结合片段，包括：
(i)重链，其包括根据SEQ ID NO:63的VH氨基酸序列、根据SEQ ID NO:37的VH氨基酸序列、根据SEQ ID NO:38的VL氨基酸序列、根据SEQ ID NO:95的VH氨基酸序列和根据SEQID NO:96的VL氨基酸序列；和
(ii)轻链，其包括根据SEQ ID NO:64的VL氨基酸序列。
优选地，gTs1GC1具有IgG1类型，其中gTs1GC1的轻链进一步包括根据SEQ ID NO:141的IgG1 CK序列并且gTs1GC1的重链进一步包括根据SEQ ID NO:140的IgG1 CH1-CH2-CH3序列，和任选地例如根据SEQ ID NO:143或144的一个或多个连接体序列，其中短连接体可以优选地被布置在根据SEQ ID NO:140的IgG1 CH1-CH2-CH3序列与根据SEQ ID NO:37的VH氨基酸序列之间以及根据SEQ ID NO:38的VL氨基酸序列与根据SEQ ID NO:95的VH氨基酸序列之间，并且长连接体可以优选地被布置在根据SEQ IDNO:37的VH氨基酸序列与根据SEQ ID NO:38的VL氨基酸序列之间以及根据SEQ IDNO:95的VH氨基酸序列与根据SEQ IDNO:96的VL氨基酸序列之间。优选地，gTs1GC1的构建体类型是Ts1。
如本文所使用，“gTs1GC2a”指的是三特异性抗体或其抗原结合片段，包括：
(i)重链，其包括根据SEQ ID NO:130的VH氨基酸序列、根据SEQ ID NO:37的VH氨基酸序列、根据SEQ ID NO:38的VL氨基酸序列、根据SEQ ID NO:95的VH氨基酸序列和根据SEQ ID NO:96的VL氨基酸序列；和
(ii)轻链，其包括根据SEQ ID NO:131的VL氨基酸序列。
优选地，gTs1GC2a具有IgG1类型，其中gTs1GC2a的轻链进一步包括根据SEQ IDNO:141的IgG1 CK序列并且gTs1GC2a的重链进一步包括根据SEQ ID NO:140的IgG1 CH1-CH2-CH3序列，和任选地例如根据SEQ ID NO:143或144的一个或多个连接体序列，其中短连接体可以优选地被布置在根据SEQ ID NO:140的IgG1 CH1-CH2-CH3序列与根据SEQ ID NO:37的VH氨基酸序列之间以及根据SEQ ID NO:38的VL氨基酸序列与根据SEQ ID NO:95的VH氨基酸序列之间，并且长连接体可以优选地被布置在根据SEQ ID NO:37的VH氨基酸序列与根据SEQ ID NO:38的VL氨基酸序列之间以及根据SEQ ID NO:95的VH氨基酸序列与根据SEQID NO:96的VL氨基酸序列之间。优选地，gTs1GC2a的构建体类型是Ts1。
如本文所使用，“gTs2GC2b”指的是三特异性抗体或其抗原结合片段，包括：
(i)重链，其包括根据SEQ ID NO:95的VH氨基酸序列、根据SEQ ID NO:96的VL氨基酸序列和根据SEQ ID NO:130的VH氨基酸序列；和
(ii)轻链，其包括根据SEQ ID NO:37的VH氨基酸序列、根据SEQ ID NO:38的VL氨基酸序列和根据SEQ ID NO:131的VL氨基酸序列。
优选地，gTs2GC2b具有IgG1类型，其中gTs2GC2b的轻链进一步包括根据SEQ IDNO:141的IgG1 CK序列，和任选地例如根据SEQ ID NO:143或144的一个或多个连接体序列，其中短连接体可以优选地被布置在根据SEQ ID NO:38的VL氨基酸序列与根据SEQ ID NO:131的VL氨基酸序列之间，并且长连接体可以优选地被布置在根据SEQ ID NO:37的VH氨基酸序列与根据SEQ ID NO:38的VL氨基酸序列之间，并且gTs2GC2b的重链进一步包括根据SEQ ID NO:140的IgG1CH1-CH2-CH3序列，和任选地例如根据SEQ ID NO:143或144的一个或多个连接体序列，其中短连接体可以优选地被布置在根据SEQ ID NO:96的VL氨基酸序列与根据SEQ ID NO:130的VH氨基酸序列之间并且长连接体可以优选地被布置在根据SEQ IDNO:95的VH氨基酸序列与根据SEQ ID NO:96的VL氨基酸序列之间。优选地，gTs2GC2b的构建体类型是Ts2。
如本文所使用，“gTs2GC2c”指的是三特异性抗体或其抗原结合片段，包括：
(i)重链，其包括根据SEQ ID NO:95的VH氨基酸序列、根据SEQ ID NO:96的VL氨基酸序列和根据SEQ ID NO:37的VH氨基酸序列；和
(ii)轻链，其包括根据SEQ ID NO:130的VH氨基酸序列、根据SEQ ID NO:131的VL氨基酸序列和根据SEQ ID NO:38的VL氨基酸序列。
优选地，gTs2GC2c具有IgG1类型，其中gTs2GC2c的轻链进一步包括根据SEQ IDNO:141的IgG1 CK序列，和任选地例如根据SEQ ID NO:143或144的一个或多个连接体序列，其中短连接体可以优选地被布置在根据SEQ ID NO:131的VL氨基酸序列与根据SEQ ID NO:38的VL氨基酸序列之间，并且长连接体可以优选地被布置在根据SEQ ID NO:130的VH氨基酸序列与根据SEQ ID NO:131的VL氨基酸序列之间，并且gTs2GC2c的重链进一步包括根据SEQ ID NO:140的IgG1 CH1-CH2-CH3序列，和任选地例如根据SEQ ID NO:143或144的一个或多个连接体序列，其中短连接体可以优选地被布置在根据SEQ ID NO:96的VL氨基酸序列与根据SEQ ID NO:37的VH氨基酸序列之间并且长连接体可以优选地被布置在根据SEQ IDNO:95的VH氨基酸序列与根据SEQ ID NO:96的VL氨基酸序列之间。优选地，gTs2GC2c的构建体类型是Ts2。
如本文所使用，“gTs3GC2d”指的是三特异性抗体或其抗原结合片段，包括：
(i)重链，其包括根据SEQ ID NO:95的VH氨基酸序列、根据SEQ ID NO:96的VL氨基酸序列、根据SEQ ID NO:130的VH氨基酸序列、根据SEQ ID NO:37的VH氨基酸序列和根据SEQ ID NO:38的VL氨基酸序列；和
(ii)轻链，其包括根据SEQ ID NO:131的VL氨基酸序列。
优选地，gTs3GC2d具有IgG1类型，其中gTs3GC2d的轻链进一步包括根据SEQ IDNO:141的IgG1 CK序列并且gTs3GC2d的重链进一步包括根据SEQ ID NO:140的IgG1 CH1-CH2-CH3序列，和任选地例如根据SEQ ID NO:143或144的一个或多个连接体序列，其中短连接体可以优选地被布置在根据SEQ ID NO:140的IgG1CH1-CH2-CH3序列与根据SEQ ID NO:37的VH氨基酸序列之间以及根据SEQ ID NO:96的VL氨基酸序列与根据SEQ ID NO:130的VH氨基酸序列之间，并且长连接体可以优选地被布置在根据SEQ ID NO:37的VH氨基酸序列与根据SEQ ID NO:38的VL氨基酸序列之间以及根据SEQ ID NO:95的VH氨基酸序列与根据SEQID NO:96的VL氨基酸序列之间。优选地，gTs3GC2d的构建体类型是Ts3。
如本文所使用，“gTs3GC2e”指的是三特异性抗体或其抗原结合片段，包括：
(i)重链，其包括根据SEQ ID NO:95的VH氨基酸序列、根据SEQ ID NO:96的VL氨基酸序列、根据SEQ ID NO:37的VH氨基酸序列、根据SEQ ID NO:130的VH氨基酸序列和根据SEQ ID NO:131的VL氨基酸序列；和
(ii)轻链，其包括根据SEQ ID NO:38的VL氨基酸序列。
优选地，gTs3GC2e具有IgG1类型，其中gTs3GC2e的轻链进一步包括根据SEQ IDNO:141的IgG1 CK序列并且gTs3GC2e的重链进一步包括根据SEQ ID NO:140的IgG1 CH1-CH2-CH3序列，和任选地例如根据SEQ ID NO:143或144的一个或多个连接体序列，其中短连接体可以优选地被布置在根据SEQ ID NO:140的IgG1 CH1-CH2-CH3序列与根据SEQ ID NO:130的VH氨基酸序列之间以及根据SEQ ID NO:96的VL氨基酸序列与根据SEQ ID NO:37的VH氨基酸序列之间，并且长连接体可以优选地被布置在根据SEQ ID NO:130的VH氨基酸序列与根据SEQ ID NO:131的VL氨基酸序列之间以及根据SEQ ID NO:95的VH氨基酸序列与根据SEQ ID NO:96的VL氨基酸序列之间。优选地，gTs3GC2e的构建体类型是Ts3。
如本文所使用，“gBs3GC1a”指的是双特异性抗体或其抗原结合片段，包括：
(i)重链，其包括根据SEQ ID NO:130的VH氨基酸序列、根据SEQ ID NO:37的VH氨基酸序列和根据SEQ ID NO:38的VL氨基酸序列；和
(ii)轻链，其包括根据SEQ ID NO:131的VL氨基酸序列。
优选地，gBs3GC1a具有IgG1类型，其中gBs3GC1a的轻链进一步包括根据SEQ IDNO:141的IgG1 CK序列并且gBs3GC1a的重链进一步包括根据SEQ ID NO:140的IgG1 CH1-CH2-CH3序列，和任选地例如根据SEQ ID NO:143或144的一个或多个连接体序列，其中短连接体可以优选地被布置在根据SEQ ID NO:140的IgG1CH1-CH2-CH3序列与根据SEQ ID NO:37的VH氨基酸序列之间，并且长连接体可以优选地被布置在根据SEQ ID NO:37的VH氨基酸序列与根据SEQ ID NO:38的VL氨基酸序列之间。优选地，gBs3GC1a的构建体类型是Bs3。
如本文所使用，“gBs3GC1b”指的是双特异性抗体或其抗原结合片段，包括：
(i)重链，其包括根据SEQ ID NO:37的VH氨基酸序列、根据SEQ ID NO:130的VH氨基酸序列和根据SEQ ID NO:131的VL氨基酸序列；和
(ii)轻链，其包括根据SEQ ID NO:38的VL氨基酸序列。
优选地，gBs3GC1b具有IgG1类型，其中gBs3GC1b的轻链进一步包括根据SEQ IDNO:141的IgG1 CK序列并且gBs3GC1b的重链进一步包括根据SEQ ID NO:140的IgG1 CH1-CH2-CH3序列，和任选地例如根据SEQ ID NO:143或144的一个或多个连接体序列，其中短连接体可以优选地被布置在根据SEQ ID NO:140的IgG1 CH1-CH2-CH3序列与根据SEQ ID NO:130的VH氨基酸序列之间，并且长连接体可以优选地被布置在根据SEQ ID NO:130的VH氨基酸序列与根据SEQ ID NO:131的VL氨基酸序列之间。优选地，gBs3GC1b的构建体类型是Bs3。
如本文所使用，“gBs2GC1c”指的是双特异性抗体或其抗原结合片段，包括：
(i)重链，其包括根据SEQ ID NO:130的VH氨基酸序列；
(ii)轻链，其包括根据SEQ ID NO:37的VH氨基酸序列、根据SEQ ID NO:38的VL氨基酸序列和根据SEQ ID NO:131的VL氨基酸序列。
优选地，gBs2GC1c具有IgG1类型，其中gBs2GC1c的轻链进一步包括根据SEQ IDNO:141的IgG1 CK序列，和任选地例如根据SEQ ID NO:143或144的一个或多个连接体序列，其中短连接体可以优选地被布置在根据SEQ ID NO:38的VL氨基酸序列与根据SEQ ID NO:131的VL氨基酸序列之间，并且长连接体可以优选地被布置在根据SEQ ID NO:37的VH氨基酸序列与根据SEQ ID NO:38的VL氨基酸序列之间，并且gBs2GC1c的重链进一步包括根据SEQ ID NO:140的IgG1 CH1-CH2-CH3序列。优选地，gBs2GC1c的构建体类型是Bs2。
如本文所使用，“gBs2GC1d”指的是双特异性抗体或其抗原结合片段，包括：
(i)重链，其包括根据SEQ ID NO:37的VH氨基酸序列；
(ii)轻链，其包括根据SEQ ID NO:130的VH氨基酸序列、根据SEQ ID NO:131的VL氨基酸序列和根据SEQ ID NO:38的VL氨基酸序列。
优选地，gBs2GC1d具有IgG1类型，其中gBs2GC1d的轻链进一步包括根据SEQ IDNO:141的IgG1 CK序列，和任选地例如根据SEQ ID NO:143或144的一个或多个连接体序列，其中短连接体可以优选地被布置在根据SEQ ID NO:131的VL氨基酸序列与根据SEQ ID NO:38的VL氨基酸序列之间，并且长连接体可以优选地被布置在根据SEQ ID NO:130的VH氨基酸序列与根据SEQ ID NO:131的VL氨基酸序列之间，并且gBs2GC1d的重链进一步包括根据SEQ ID NO:140的IgG1 CH1-CH2-CH3序列。优选地，gBs2GC1d的构建体类型是Bs2。
如本文所使用，“gBs1GC2a”指的是双特异性抗体或其抗原结合片段，包括：
(i)重链，其包括根据SEQ ID NO:95的VH氨基酸序列、根据SEQ ID NO:96的VL氨基酸序列和根据SEQ ID NO:130的VH氨基酸序列；和
(ii)轻链，其包括根据SEQ ID NO:131的VL氨基酸序列。
优选地，gBs1GC2a具有IgG1类型，其中gBs1GC2a的轻链进一步包括根据SEQ IDNO:141的IgG1 CK序列并且gBs1GC2a的重链进一步包括根据SEQ ID NO:140的IgG1 CH1-CH2-CH3序列，和任选地例如根据SEQ ID NO:143或144的一个或多个连接体序列，其中短连接体可以优选地被布置在根据SEQ ID NO:96的VL氨基酸序列与根据SEQ ID NO:130的VH氨基酸序列之间，并且长连接体可以优选地被布置在根据SEQ ID NO:95的VH氨基酸序列与根据SEQ ID NO:96的VL氨基酸序列之间。优选地，gBs1GC2a的构建体类型是Bs1。
如本文所使用，“gBs3GC2b”指的是双特异性抗体或其抗原结合片段，包括：
(i)重链，其包括根据SEQ ID NO:95的VH氨基酸序列、根据SEQ ID NO:130的VH氨基酸序列和根据SEQ ID NO:131的VL氨基酸序列；和
(ii)轻链，其包括根据SEQ ID NO:96的VL氨基酸序列。
优选地，gBs3GC2b具有IgG1类型，其中gBs3GC2b的轻链进一步包括根据SEQ IDNO:142的IgG1 CL序列并且gBs3GC2b的重链进一步包括根据SEQ ID NO:140的IgG1 CH1-CH2-CH3序列，和任选地例如根据SEQ ID NO:143或144的一个或多个连接体序列，其中短连接体可以优选地被布置在根据SEQ ID NO:140的IgG1 CH1-CH2-CH3序列与根据SEQ ID NO:130的VH氨基酸序列之间，并且长连接体可以优选地被布置在根据SEQ ID NO:130的VH氨基酸序列与根据SEQ ID NO:131的VL氨基酸序列之间。优选地，gBs3GC2b的构建体类型是Bs3。
如本文所使用，“gBs1GC3a”指的是双特异性抗体或其抗原结合片段，包括：
(i)重链，其包括根据SEQ ID NO:95的VH氨基酸序列、根据SEQ ID NO:96的VL氨基酸序列和根据SEQ ID NO:37的VH氨基酸序列；和
(ii)轻链，其包括根据SEQ ID NO:38的VL氨基酸序列。
优选地，gBs1GC3a具有IgG1类型，其中gBs1GC3a的轻链进一步包括根据SEQ IDNO:141的IgG1 CK序列并且gBs1GC3a的重链进一步包括根据SEQ ID NO:140的IgG1 CH1-CH2-CH3序列，和任选地例如根据SEQ ID NO:143或144的一个或多个连接体序列，其中短连接体可以优选地被布置在根据SEQ ID NO:96的VL氨基酸序列与根据SEQ ID NO:37的VH氨基酸序列之间，并且长连接体可以优选地被布置在根据SEQ ID NO:95的VH氨基酸序列与根据SEQ ID NO:96的VL氨基酸序列之间。优选地，gBs1GC3a的构建体类型是Bs1。
如本文所使用，“gBs3GC3b”指的是双特异性抗体或其抗原结合片段，包括：
(i)重链，其包括根据SEQ ID NO:95的VH氨基酸序列、根据SEQ ID NO:37的VH氨基酸序列和根据SEQ ID NO:38的VL氨基酸序列；和
(ii)轻链，其包括根据SEQ ID NO:96的VL氨基酸序列。
优选地，gBs3GC3b具有IgG1类型，其中gBs3GC3b的轻链进一步包括根据SEQ IDNO:142的IgG1 CL序列并且gBs3GC3b的重链进一步包括根据SEQ ID NO:140的IgG1 CH1-CH2-CH3序列，和任选地例如根据SEQ ID NO:143或144的一个或多个连接体序列，其中短连接体可以优选地被布置在根据SEQ ID NO:140的IgG1 CH1-CH2-CH3序列与根据SEQ ID NO:37的VH氨基酸序列之间，并且长连接体可以优选地被布置在根据SEQ ID NO:37的VH氨基酸序列与根据SEQ ID NO:38的VL氨基酸序列之间。优选地，gBs3GC3b的构建体类型是Bs3。
如本文所使用，“gBs3GC4”指的是双特异性抗体或其抗原结合片段，包括：
(i)重链，其包括根据SEQ ID NO:63的VH氨基酸序列、根据SEQ ID NO:130的VH氨基酸序列和根据SEQ ID NO:131的VL氨基酸序列；和
(ii)轻链，其包括根据SEQ ID NO:64的VL氨基酸序列。
优选地，gBs3GC4具有IgG1类型，其中gBs3GC4的轻链进一步包括根据SEQ ID NO:141的IgG1 CK序列并且gBs3GC4的重链进一步包括根据SEQ ID NO:140的IgG1 CH1-CH2-CH3序列，和任选地例如根据SEQ ID NO:143或144的一个或多个连接体序列，其中短连接体可以优选地被布置在根据SEQ ID NO:140的IgG1 CH1-CH2-CH3序列与根据SEQ ID NO:130的VH氨基酸序列之间，并且长连接体可以优选地被布置在根据SEQ ID NO:130的VH氨基酸序列与根据SEQ ID NO:131的VL氨基酸序列之间。优选地，gBs3GC4的构建体类型是Bs3。
如本文所使用，“gBs3GC5”指的是双特异性抗体或其抗原结合片段，包括：
(i)重链，其包括根据SEQ ID NO:63的VH氨基酸序列、根据SEQ ID NO:37的VH氨基酸序列和根据SEQ ID NO:38的VL氨基酸序列；和
(ii)轻链，其包括根据SEQ ID NO:64的VL氨基酸序列。
优选地，gBs3GC5具有IgG1类型，其中gBs3GC5的轻链进一步包括根据SEQ ID NO:141的IgG1 CK序列并且gBs3GC5的重链进一步包括根据SEQ ID NO:140的IgG1 CH1-CH2-CH3序列，和任选地例如根据SEQ ID NO:143或144的一个或多个连接体序列，其中短连接体可以优选地被布置在根据SEQ ID NO:140的IgG1 CH1-CH2-CH3序列与根据SEQ ID NO:37的VH氨基酸序列之间，并且长连接体可以优选地被布置在根据SEQ ID NO:37的VH氨基酸序列与根据SEQ ID NO:38的VL氨基酸序列之间。优选地，gBs3GC5的构建体类型是Bs3。
优选地，根据本发明的分离的多特异性抗体或抗原结合片段包括由gTs3GC2d的所有各自的VH和VL序列组成的所有CDR，或者根据本发明的分离的多特异性抗体或抗原结合片段包括由gBs1GC3a的所有各自的VH和VL序列组成的所有CDR。下面的表3示出了哪些VH或VL序列(氨基酸序列的SEQ ID编号)包括哪些CDR(氨基酸序列的SEQ ID 编号)，以及它们衍生自的示例性的单特异性抗体。可选地，根据本发明的分离的多特异性抗体或抗原结合片段包括由gTs1GC1的所有各自的VH和VL序列组成的所有CDR。可选地，根据本发明的分离的多特异性抗体或抗原结合片段包括由gTs1GC2a的所有各自的VH和VL序列组成的所有CDR。可选地，根据本发明的分离的多特异性抗体或抗原结合片段包括由gTs2GC2b的所有各自的VH和VL序列组成的所有CDR。可选地，根据本发明的分离的多特异性抗体或抗原结合片段包括由gTs2GC2c的所有各自的VH和VL序列组成的所有CDR。可选地，根据本发明的分离的多特异性抗体或抗原结合片段包括由gTs2GC2c的所有各自的VH和VL序列组成的所有CDR。可选地，根据本发明的分离的多特异性抗体或抗原结合片段包括由gTs3GC2d的所有各自的VH和VL序列组成的所有CDR。可选地，根据本发明的分离的多特异性抗体或抗原结合片段包括由gTs3GC2d的所有各自的VH和VL序列组成的所有CDR。可选地，根据本发明的分离的多特异性抗体或抗原结合片段包括由gTs3GC2e的所有各自的VH和VL序列组成的所有CDR。可选地，根据本发明的分离的多特异性抗体或抗原结合片段包括由gBs3GC1a的所有各自的VH和VL序列组成的所有CDR。可选地，根据本发明的分离的多特异性抗体或抗原结合片段包括由gBs3GC1b的所有各自的VH和VL序列组成的所有CDR。可选地，根据本发明的分离的多特异性抗体或抗原结合片段包括由gBs2GC1c的所有各自的VH和VL序列组成的所有CDR。可选地，根据本发明的分离的多特异性抗体或抗原结合片段包括由gBs2GC1d的所有各自的VH和VL序列组成的所有CDR。可选地，根据本发明的分离的多特异性抗体或抗原结合片段包括由gBs1GC2a的所有各自的VH和VL序列组成的所有CDR。可选地，根据本发明的分离的多特异性抗体或抗原结合片段包括由gBs3GC2b的所有各自的VH和VL序列组成的所有CDR。可选地，根据本发明的分离的多特异性抗体或抗原结合片段包括由gBs1GC3a的所有各自的VH和VL序列组成的所有CDR。可选地，根据本发明的分离的多特异性抗体或抗原结合片段包括由gBs3GC3b的所有各自的VH和VL序列组成的所有CDR。可选地，根据本发明的分离的多特异性抗体或抗原结合片段包括由gBs3GC4的所有各自的VH和VL序列组成的所有CDR。可选地，根据本发明的分离的多特异性抗体或抗原结合片段包括由gBs3GC5的所有各自的VH和VL序列组成的所有CDR。
表3：如表中指示的由VH或VL氨基酸序列组成的CDR氨基酸序列的SEQ ID编号
根据本发明的多特异性抗体或其抗原结合片段可以被用作药物。具体而言，根据本发明的多特异性抗体或其抗原结合片段可以被用于预防、治疗或缓解炎性和/或自身免疫疾病。该用途的进一步细节在下面描述，例如在药物组合物和医疗用途的上下文中。
本发明进一步包括抗体或其片段，其结合至与本发明的抗体或抗原结合片段相同的表位，即结合至细胞因子——特别是GM-CSF——中的相同的至少两个不同的非重叠位点；或者与本发明的抗体或抗原结合片段竞争的抗体。
优选地，结合至与上面描述的抗体相同表位的根据本发明的抗体或其抗原结合片段还包括Fc部分。上面对于根据本发明的多特异性抗体或其抗原结合片段描述的优选的实施方式还应用于结合至与上面描述的抗体相同表位的根据本发明的抗体或其抗原结合片段，根据本发明的多特异性抗体或其抗原结合片段包括：
(a)特异性地结合至细胞因子中至少两个不同的非重叠位点的至少两个不同的结构域；和
(b)Fc部分。
本发明的抗体还包括杂种多特异性抗体分子，其包括：
(a)特异性地结合至细胞因子中至少两个不同的非重叠位点的至少两个不同的结构域；和
(b)Fc部分
如上面所描述，其包括来自本发明的抗体的一个或多个CDR和来自另一抗体的一个或多个CDR，其特别地针对相同表位或者针对相同细胞因子——特别是GM-CSF——上或者另一抗原——例如另一细胞因子——上的进一步表位、肿瘤相关表位、T细胞表位、B细胞表位等。在一个实施方式中，这样的杂种抗体包括来自本发明的抗体的三个CDR和来自另一抗体的三个CDR，例如其针对如上面描述的相同的或其它表位。示例性杂种抗体包括(i)来自本发明的抗体的三个重链CDR和来自另一抗体的三个轻链CDR，其针对如上面描述的相同或其它表位，或(ii)来自本发明的抗体的三个轻链CDR和来自另一抗体的三个重链CDR，其针对如上面描述的相同或其它表位。
核酸分子
在另一方面，本发明还提供了核酸分子，其包括编码如上面描述的根据本发明的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸。编码本发明的抗体的轻和重链以及CDR的部分或全部的核酸序列是优选的。优选地，本文提供了如此核酸序列：其编码本发明的示例性抗体的轻和重链——特别是VH和VL序列——以及CDR的部分或全部。编码衍生自单特异性抗体的VH和VL序列并且在本发明的抗体的一些实例中使用的核酸序列的SEQ ID编号可以从表7中得出。下面的表4提供了编码本发明的抗体的一些实例的CDR的核酸序列的SEQ ID编号。由于遗传密码的冗余性，本发明还包括编码相同氨基酸序列的这些核酸序列的变体。
因而，本发明还包括如此核酸分子：其包括编码根据本发明的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸。
核酸分子是包括核酸成分优选地由其组成的分子。术语核酸分子优选地指的是DNA或RNA分子。具体而言，其与术语“多核苷酸”同义使用。优选地，核酸分子是包括核苷酸单体或由其组成的聚合物，这些核苷酸单体通过糖/磷酸盐骨架的磷酸二酯键彼此共价地连接。术语“核酸分子”还涵盖修饰的核酸分子，比如碱修饰的DNA或RNA分子、糖修饰的DNA或RNA分子或骨架修饰的DNA或RNA分子等。
表4.衍生自如指示的单特异性抗体并在根据本发明的一些示例性抗体中使用的CDR多核苷酸的SEQ ID编号
优选地，根据本发明的核酸分子的序列包括根据SEQ ID NO:8-36、39-48、56-62、65-66、74-94、97-104、112-129、132-139、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188和190中任一个或其功能序列变体的核酸序列或由其组成。
还优选的是根据本发明的核酸序列包括与编码在根据本发明的抗体中使用的VH序列和/或VL序列的核酸具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列。因而，核酸分子是优选的，其中多核苷酸序列包括根据SEQ ID NO:39-48、65-66、97-104和132-139中任一个或其功能序列变体的核酸序列或由其组成。更优选地，根据本发明的核酸分子包括编码根据本发明的示例性抗体中一个的完整重链或完整轻链的核酸序列或由其组成。因而，核酸分子是优选的，其中多核苷酸序列包括根据SEQ ID NO:152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188和190中任一个或其功能序列变体的核酸序列或由其组成。
在另一实施方式中，本发明的核酸序列具有编码本发明的示例性抗体的重或轻链CDR的核酸的序列。例如，根据本发明的核酸序列包括与SEQ ID NO:8-36、39-48、56-62、65-66、74-94、97-104、112-129、132-139、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188和190的核酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列或由其组成。
一般而言，核酸分子可以被操作以插入、缺失或改变某些核酸序列。来自这样操作的变化包括但不限于引入限制位点、修改密码子使用、增加或优化转录和/或翻译调控序列等的变化。还可能的是变化核酸以改变编码的氨基酸。例如，可以有用的是将一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个等)氨基酸置换、缺失和/或插入引入抗体的氨基酸序列。这样的点突变可以修改效应物功能、抗原结合亲和力、翻译后修饰、免疫原性等，可以引入用于附接共价基团(例如，标签)的核酸或者可以引入标记物(例如，出于纯化目的)。突变可以被引入特定位点中或者可以随机被引入，然后选择(例如，分子进化)。例如，编码本发明的(示例性)抗体的CDR区、VH序列或VL序列、或重链或轻链中任一种的一个或多个核酸可以随机地或定向地被突变以在编码的氨基酸中引入不同的性质。这样的改变可以是迭代过程的结果，其中最初的变化被保留并且在其它核苷酸位置处引入新的变化。进一步，在独立步骤中实现的变化可以组合。引入编码的氨基酸的不同性质可以包括但不限于增强的亲和力。
载体
进一步包括在本发明范围内的是载体，例如表达载体，其包括根据本发明的核酸序列。优选地，载体包括根据本发明的核酸分子，例如上面描述的核酸分子。
术语“载体”指的是核酸分子，优选地指的是人工核酸分子，即不天然存在的核酸分子。在本发明的上下文中的载体适合于并入或具有期望的核酸序列。这样的载体可以是存储载体、表达载体、克隆载体、转移载体等。存储载体是允许方便存储核酸分子的载体。因而，该载体可以包括与例如根据本发明的期望抗体或其抗体片段对应的序列。表达载体可以用于产生表达产物，比如RNA例如mRNA，或肽、多肽或蛋白质。例如，表达载体可以包括对于载体的序列段的转录需要的序列，比如启动子序列。克隆载体通常是包含克隆位点的载体，其可以被用于将核酸序列并入载体。克隆载体可以是例如质粒载体或噬菌体载体。转移载体可以是适合于将核酸分子转移入细胞或有机体的载体，例如病毒载体。在本发明的上下文中的载体可以是例如RNA载体或DNA载体。优选地，载体是DNA分子。例如，在本申请的意义中的载体包括克隆位点、选择标记比如抗生素抗性因子、和适合于操作载体的序列，比如复制起点。优选地，在本发明的上下文中的载体是质粒载体。细胞
转化有这样的载体的细胞也包括在本发明的范围内。这样的细胞的实例包括但不限于真核细胞，例如酵母细胞、动物细胞或植物细胞。在一个实施方式中，细胞是哺乳动物，例如人、CHO、HEK293T、PER.C6、NS0、骨髓瘤或杂交瘤细胞。因此，本发明还提供了表达根据本发明的抗体或其抗原结合片段的细胞；或包括根据本发明的载体的细胞。
具体而言，细胞可以转染有根据本发明的载体，优选地转染有表达载体。术语“转染”指的是将核酸分子比如DNA或RNA(例如mRNA)分子引入细胞，优选地引入真核细胞。在本发明的上下文中，术语“转染”涵盖技术人员已知的用于将核酸分子引入细胞，优选地引入真核细胞，比如引入哺乳动物细胞的任何方法。例如，这样的方法涵盖电穿孔、脂质转染——例如基于阳离子脂质和/或脂质体、磷酸钙沉淀、基于纳米粒子的转染、基于病毒的转染或基于阳离子聚合物——比如DEAE-葡聚糖或聚乙烯亚胺等——的转染。优选地，引入是非病毒的。
多肽
本发明还涉及多肽，例如分离的或纯化的免疫原性多肽，其包括特异性地结合至根据本发明的抗体或其抗原结合片段的至少两个表位。例如，根据本发明的(免疫原性)多肽可以在诊断如本文描述的疾病中和/或在产生、纯化和/或验证过程期间和/或在根据本发明的抗体的质量控制期间被用于疫苗。优选地，根据本发明的(免疫原性)多肽——其包括特异性地结合至根据本发明的抗体或其抗原结合片段的至少两个表位——是重组多肽，即天然不存在的多肽。
单克隆或重组抗体在鉴定和纯化单独多肽或其针对的其它抗原中是特别有用的。本发明的抗体因而具有另外的实用性，因为它们可以用作免疫分析、放射免疫分析(RIA)或酶联免疫吸附试验(ELISA)中的试剂。在这些应用中，抗体可以标记有分析可检测的试剂，比如放射性同位素、荧光分子或酶。抗体还可以被用于抗原的分子鉴定和表征(表位定位)。
因此，结合至本发明的抗体的多肽可以具有许多用途。纯化或合成形式的多肽和其多肽变体可以被用于提升免疫应答(即，作为疫苗，或者用于生产用于其它用途的抗体)或者用于筛选与表位或其模拟表位免疫反应的抗体的血清。在一个实施方式中，这样的多肽或多肽变体，或包括这样的多肽或多肽变体的抗原可以被用作用于提升免疫应答的疫苗，其包括与在本发明中描述的那些相同质量的抗体。
结合至本发明的抗体的多肽还可以用于筛选结合至所述多肽的配体。这样的配体包括但不限于抗体；包括来自骆驼、鲨鱼和其它物种的那些，抗体的片段，肽，噬菌体展示技术产物，适配子，阿德奈汀(adnectin)，或其它病毒或细胞蛋白的片段，其可以阻断表位并且从而防止感染。这样的配体包括在本发明的范围内。
抗体的任选的另外的特征
例如，本发明的抗体可以偶联至药物用于递送至治疗位点或者偶联至可检测的标签以促进包括感兴趣细胞的位点的成像。用于偶联抗体至药物和可检测标签的方法在本领域中是熟知的，如使用可检测标签成像的方法。标记的抗体可以在多种试验中采用，采用多种标签。通过将可检测的物质附接至抗体可以促进检测在本发明的抗体与细胞因子——特别是GM-CSF——上的感兴趣表位之间的抗体-抗原复合物的形成。适合的检测方式包括使用标签比如放射性核素、酶、辅酶、荧光剂、化学发光剂、发色体、酶底物或辅因子、酶抑制剂、辅基复合物、自由基、粒子、染料等。适合的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；适合的辅基复合物的实例包括链霉亲和素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；适合的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪基胺(dichlorotriazinylamine)荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；适合的发光材料的实例是鲁米诺；生物发光材料的实例包括萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白；和适合的放射性材料的实例包括125I、131I、35S或3H。这样标记的试剂可以在多种熟知的试验中使用，比如放射免疫分析、酶免疫分析例如ELISA、荧光免疫分析等。根据本发明的标记的抗体可以因而被用在这样的分析中，例如在US 3,766,162；US 3,791,932；US 3,817,837；和US 4,233,402中描述的。
根据本发明的抗体可以缀合至治疗部分(therapeutic moiety)，比如细胞毒素、治疗剂、或放射性金属离子或放射性同位素。放射性同位素的实例包括但不限于I-131、I-123、I-125、Y-90、Re-188、Re-186、At-211、Cu-67、Bi-212、Bi-213、Pd-109、Tc-99、In-111等。这样的抗体缀合物可被用于修饰给定的生物学应答；药物部分不被解释为限于经典的化学治疗剂。例如，药物部分可以是具备期望生物学活性的蛋白质或多肽。这样的蛋白质可以包括例如毒素，比如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素或白喉毒素。
用于缀合这样的治疗部分至抗体的技术是熟知的。参见，例如，Arnon et al.(1985)“Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy,”in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,ed.Reisfeld et al.(Alan R.Liss,Inc.),pp.243-256；ed.Hellstrom et al.(1987)“Antibodies for Drug Delivery,”inControlled Drug Delivery,ed.Robinson et al.(2d ed；Marcel Dekker,Inc.),pp.623-653；Thorpe(1985)"Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy:AReview,"in Monoclonal Antibodies'84:Biological and Clinical Applications,ed.Pinchera et al.pp.475-506(Editrice Kurtis,Milano,Italy,1985)；“Analysis,Results,and Future Prospective of the Therapeutic Use of RadiolabeledAntibody in Cancer Therapy,”in Monoclonal Antibodies for Cancer Detection andTherapy,ed.Baldwin et al.(Academic Press,New York,1985),pp.303-316；和Thorpeet al.(1982)Immunol.Rev.62:119-158。
可选地，抗体或其抗体片段可以缀合至第二抗体或其抗体片段以形成抗体复共轭对配合物，如在US 4,676,980中描述的。此外，连接体可以在标签和本发明的抗体之间使用，例如在US 4,831,175中描述的。抗体或其抗原结合片段可以直接地利用放射性碘、铟、钇或本领域中已知的其它放射性粒子——例如，在US 5,595,721中描述的——标记。治疗可以由同时或随后施用的缀合的和非缀合的抗体的治疗的组合组成，如在WO00/52031；WO00/52473中描述的。
本发明的抗体还可以附接至固相支持体。另外，本发明的抗体或其功能抗体片段可以通过共价缀合至聚合物以例如增加它们的循环半衰期化学地修饰。聚合物的实例和附接它们至肽的方法在US 4,766,106；US 4,179,337；US 4,495,285和US 4,609,546中示出。在一些实施方式中，聚合物可以选自聚氧乙烯化多元醇和聚乙二醇(PEG)。PEG在室温下在水中是可溶的并且具有通式：R(O--CH2--CH2)n O—R，其中R可以是氢或者保护基，比如烷基或烷醇基。优选地，保护基可以具有在1和8个之间的碳。例如，保护基是甲基。符号n是正整数。在一个实施方式中，n在1和1,000之间。在另一实施方式中，n在2和500之间。优选地，PEG具有在1,000和40,000之间的平均分子量，更优选地PEG具有在2,000和20,000之间的分子量，甚至更优选地PEG具有在3,000和12,000之间的分子量。而且，PEG可以具有至少一个羟基，例如PEG可以具有端羟基。例如，其是被活化以与抑制剂上的游离氨基反应的端羟基。但是，将理解，反应基团的类型和量可以改变以实现本发明的共价缀合的PEG/抗体。
水溶性聚氧乙烯化多元醇也可以在本发明中使用。它们包括聚氧乙烯化山梨醇、聚氧乙烯化葡萄糖、聚氧乙烯化丙三醇(POG)等。在一个实施方式中，使用POG。不受任何理论束缚，因为聚氧乙烯化丙三醇的丙三醇骨架是在例如动物和人中在单-、二-、三酸甘油酯中天然存在的相同骨架，因此该支化将不一定被视为身体中的外来剂。POG可以具有与PEG相同范围的分子量。可以被用于增加循环半衰期的另一药物递送系统是脂质体。制备脂质体递送系统的方法对于本领域技术人员而言是已知的。其它药物递送系统是本领域中已知的并且在例如Poznansky et al.(1980)和Poznansky(1984)中描述并引用。
本发明的抗体可以以纯化形式提供。通常地，抗体将在基本上不含其它多肽的组合物中存在，例如其中少于90％(按重量计)，通常少于60％并且更通常地少于50％的组合物由其它多肽组成。
本发明的抗体在非人(或异源)宿主中，例如在小鼠中可以是免疫原性的。具体而言，抗体可以具有独特位(idiotope)，其在非人宿主中，但是不在人宿主中为免疫原性的。用于人用途的本发明的抗体包括不能容易地自宿主——比如小鼠、山羊、兔、大鼠、非灵长类哺乳动物等——分离的那些，并且通常不能通过人源化或从异种小鼠获得。
抗体的产生
根据本发明的抗体可以通过本领域中已知的任何方法制造。例如，使用杂交瘤技术制造单克隆抗体的一般方法是熟知的(Kohler,G.and Milstein,C,.1975；Kozbar etal.1983)。在一个实施方式中，使用在WO2004/076677中描述的可选的EBV无限增殖化方法。
使用在WO 2004/076677中描述的方法，生产本发明的抗体的B细胞可以转化有EBV和多克隆B细胞活化剂。细胞生长和分化的另外刺激剂可以任选地在转化步骤期间添加以进一步增强效率。这些刺激剂可以是细胞因子比如IL-2和IL-15。在一方面，IL-2在无限增殖化步骤期间添加以进一步提高无限增殖化的效率，但是其使用不是必需的。使用这些方法产生的无限增殖化B细胞然后可以使用本领域中已知的方法培养并从其分离抗体。
使用在WO 2010/046775中描述的方法，浆细胞可以以有限的数目培养，或者在微孔培养板中作为单一浆细胞培养。抗体可以自浆细胞培养物分离。进一步，从浆细胞培养物，使用本领域中已知的方法，可以提取RNA并且可以进行PCR。抗体的VH和VL区可以通过RT-PCR(逆转录酶PCR)扩增，测序并克隆入表达载体，该表达载体然后被转染入HEK293T细胞或其它宿主细胞。核酸在表达载体中的克隆、宿主细胞的转染、转染的宿主细胞的培养和生产的抗体的分离可以使用本领域技术人员已知的任何方法进行。
如果需要，可以使用过滤、离心和各种色谱方法，比如HPLC或亲和色谱法，进一步纯化抗体。用于纯化抗体例如单克隆抗体的技术——包括用于生产药用级别抗体的技术——是本领域中熟知的。
本发明的抗体的片段可以从抗体通过包括利用酶比如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶进行消化的方法和/或通过经由化学还原裂解二硫键获得。可选地，抗体的片段可以通过克隆或表达重或轻链的序列的部分获得。抗体“片段”包括Fab、Fab’、F(ab')2和Fv片段。本发明还涵盖衍生自本发明的抗体的重和轻链的单链Fv片段(scFv)。例如，本发明包括含有来自本发明的抗体的CDR的scFv。还包含的是重或轻链单体或二聚体、单结构域重链抗体、单结构域轻链抗体以及单链抗体，例如单链Fv，其中重和轻链可变结构域通过肽连接体接合。
本发明的抗体片段可以赋予单价或多价相互作用并且包含在如上面描述的多种结构中。例如，scFv分子可以被合成以创建三价“三链抗体”或四价“四链抗体”。scFv分子可以包括导致二价微抗体的Fc区的结构域。此外，本发明的序列可以是多特异性分子的成分，其中本发明的序列靶向本发明的表位并且分子的其它区结合至其它靶标。示例性分子包括但不限于双特异性Fab2、三特异性Fab3、双特异性scFv和双抗体(Holliger和Hudson,2005,Nature Biotechnology 9:1126-1136)。
分子生物学的标准技术可以被用于制备编码本发明的抗体或抗体片段的DNA序列。期望的DNA序列可以使用寡核苷酸合成技术完全地或部分地合成。位点定向诱变和聚合酶链反应(PCR)技术可以适当使用。
任何适合的宿主细胞/载体系统可以被用于表达编码本发明的抗体分子或其片段的DNA序列。细菌例如大肠杆菌和其它微生物系统可以部分地被用于表达抗体片段比如Fab和F(ab’)2片段，并且尤其是Fv片段和单链抗体片段，例如，单链Fv。真核例如哺乳动物宿主细胞表达系统可以被用于产生较大的抗体分子，包括完整抗体分子。适合的哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、HEK293T、PER.C6、NS0、骨髓瘤或杂交瘤细胞。
本发明还提供了用于产生根据本发明的抗体分子的方法，其包括在适合于从编码本发明的抗体分子的DNA表达蛋白质的条件下培养包括编码本发明的核酸的载体的宿主细胞，并分离抗体分子。
抗体分子可以包括仅重或轻链多肽，在该情况下仅重链或轻链多肽编码序列需要被用于转染宿主细胞。对于包括重和轻链二者的产物的生产，细胞系可以转染有两种载体：编码轻链多肽的第一载体和编码重链多肽的第二载体。可选地，可以使用单一载体，该载体包括编码轻链和重链多肽的序列。可选地，根据本发明的抗体可以通过如下产生：(i)在宿主细胞中表达根据本发明的核酸序列，和(ii)分离表达的抗体产物。另外，方法可以包括(iii)纯化分离的抗体。转化的B细胞和培养的浆细胞可以被筛选用于产生期望特异性或功能的抗体的那些。
筛选步骤可以通过任何免疫分析例如ELISA，通过组织或细胞(包括转染的细胞)的染色，通过中和试验或者通过本领域中已知的用于鉴定期望特异性或功能的许多其它方法中的一个来实施。试验可以基于一种或多种抗原的简单识别进行选择，或者可以另外基于期望的功能进行选择，例如以选择中和抗体而不是仅仅抗原结合抗体，以选择可以改变靶细胞的特性的抗体，靶细胞的特性比如它们的信号级联放大、它们的形状、它们的生长速率、它们影响其它细胞的能力、它们对其它细胞或受其它试剂或受条件改变的影响的反应、它们的分化状态等。
单独转化的B细胞克隆然后可以从阳性转化的B细胞培养物产生。用于从阳性细胞的混合物分离单独克隆的克隆步骤可以使用限制稀释、显微操作、通过细胞分选的单细胞沉积或本领域中已知的其它方法实施。
来自培养的浆细胞的核酸可以在HEK293T细胞或其它已知宿主细胞中使用本领域中已知的方法分离、克隆和表达。
本发明的无限增殖化B细胞克隆或转染的宿主细胞可以以多种途径被用作例如单克隆抗体的来源、用作编码感兴趣的单克隆抗体的核酸(DNA或mRAN)的来源、用于研究等。
本发明还提供了包括生产根据本发明的抗体的无限增殖化B记忆细胞或转染的宿主细胞的组合物。
本发明的无限增殖化B细胞克隆或培养的浆细胞还可以被用作核酸的来源，用于克隆随后重组表达的抗体基因。从重组来源的表达与从B细胞或杂交瘤的表达相比更加普遍的用于制药用途，例如由于稳定性、再现性、培养容易等原因。
因而，本发明还提供了用于制备重组细胞的方法，其包括如下步骤：(i)从B细胞克隆或培养的浆细胞获得编码感兴趣抗体的一种或多种核酸(例如，重和/或轻链mRNA)；(ii)将核酸插入表达载体；和(iii)将载体转染入宿主细胞以便于允许感兴趣的抗体在该宿主细胞中表达。
类似地，本发明提供了用于制备重组细胞的方法，其包括如下步骤：(i)从B细胞克隆或培养的浆细胞测序编码感兴趣抗体的核酸(一种或多种)；和(ii)使用来自步骤(i)的序列信息制备用于插入宿主细胞的核酸(一种或多种)以便于允许感兴趣的抗体在该宿主细胞中表达。核酸可以但是不必在步骤(i)和(ii)之间操作以引入限制位点、以改变密码子使用、和/或以优化转录和/或翻译调控序列。
而且，本发明还提供了制备转染的宿主细胞的方法，其包括利用编码感兴趣抗体的一种或多种核酸转染宿主细胞的步骤，其中核酸是衍生自本发明的无限增殖化B细胞克隆或培养的浆细胞的核酸。因而，首先制备核酸(一种或多种)并且然后使用其转染宿主细胞的程序可以在不同的时间由不同的人在不同的地方(例如在不同国家)执行。
本发明的这些重组细胞然后可以被用于表达和培养目的。它们特别地可用于表达用于大规模药物生产的抗体。它们还可以被用作药物组合物的活性成分。可以使用任何适合的培养技术，包括但不限于静置培养、滚瓶培养、腹水、中空纤维型生物反应器筒、模块化微发酵罐、搅拌槽、微运载体培养、陶瓷芯灌注等。
用于从B细胞或浆细胞获得和测序免疫球蛋白基因的方法在本领域中是熟知的(例如，参见Kuby Immunology的第四章，第4版，2000)。
转染的宿主细胞可以是真核细胞，包括酵母和动物细胞，特别是哺乳动物细胞(例如，CHO细胞、NS0细胞、人细胞比如PER.C6或HKB-11细胞、骨髓瘤细胞)；以及植物细胞。优选的表达宿主可以使本发明的抗体糖基化，具体地利用其自身在人中不具有免疫原性的糖类结构使本发明的抗体糖基化。在一个实施方式中，转染的宿主细胞可以能够在不含血清的培养基中生长。在进一步实施方式中，转染的宿主细胞可以能够在培养中在不存在动物源产物的情况下生长。转染的宿主细胞还可以被培养以给出细胞系。
本发明还提供了用于制备编码感兴趣抗体的一种或多种核酸分子(例如，重和轻链基因)的方法，其包括如下步骤：(i)根据本发明制备无限增殖化B细胞克隆或培养浆细胞；(ii)从B细胞克隆或培养的浆细胞获得编码感兴趣抗体的核酸。进一步，本发明提供了获得编码感兴趣抗体的核酸序列的方法，其包括如下步骤：(i)根据本发明制备无限增殖化B细胞克隆或培养浆细胞；(ii)从B细胞克隆或培养的浆细胞测序编码感兴趣抗体的核酸。
本发明进一步提供了制备编码感兴趣抗体的核酸分子(一种或多种)的方法，其包括获得核酸的步骤，该核酸从本发明的转化的B细胞克隆或培养的浆细胞获得。因而，首先获得B细胞克隆或培养的浆细胞，并且然后从B细胞克隆或培养的浆细胞获得核酸(一种或多种)的程序可以在不同的时间由不同的人在不同的地方(例如在不同国家)执行。
本发明还包括用于制备根据本发明的抗体(例如，用于制药用途)的方法，其包括如下步骤：从表达感兴趣抗体的选择的B细胞克隆或培养的浆细胞获得和/或测序一种或多种核酸(例如，重和轻链基因)；(ii)将核酸(一种或多种)插入表达载体或使用核酸(一种或多种)序列(一种或多种)来制备表达载体；(iii)转染可以表达感兴趣抗体的宿主细胞；(iv)在感兴趣抗体被表达的条件下培养或继代培养转染的宿主细胞；和任选地(v)纯化感兴趣抗体。
本发明还提供了制备抗体的方法，其包括如下步骤：在感兴趣抗体被表达的条件下培养或继代培养转染的宿主细胞群，和任选地纯化感兴趣抗体，其中所述转染的宿主细胞群已经通过如下步骤制备：(i)提供编码通过如上面描述制备的B细胞克隆或培养的浆细胞产生的选择的感兴趣抗体的核酸(一种或多种)，(ii)将核酸(一种或多种)插入表达载体，(iii)在可以表达感兴趣抗体的宿主细胞中转染载体，和(iv)培养或继代培养包括插入的核酸的转染的宿主细胞以产生感兴趣抗体。因而，首先制备重组宿主细胞并且然后培养其以表达抗体的程序可以在不同的时间由不同的人在不同的地方(例如在不同国家)执行。
药物组合物
本发明还提供了包括下列的一种或多种的药物组合物：
(i)根据本发明的抗体或抗体片段；
(ii)编码根据本发明的抗体或抗体片段的核酸；
(iii)编码根据本发明的核酸的载体；
(iv)表达根据本发明的抗体或者包括根据本发明的载体的细胞；或
(v)由根据本发明的抗体或其抗原结合片段识别的免疫原性多肽。
药物组合物还可以包含药学上可接受的运载体、稀释剂和/或赋形剂。优选地，根据本发明的药物组合物包括下列的一种或多种：
(i)根据本发明的抗体或抗体片段；
(ii)编码根据本发明的抗体或抗体片段的核酸；
(iii)编码根据本发明的核酸的载体；
(iv)表达根据本发明的抗体或者包括根据本发明的载体的细胞；或
(v)由根据本发明的抗体或其抗原结合片段识别的免疫原性多肽；和
药学上可接受的赋形剂、稀释剂和/或运载体。
虽然运载体或赋形剂可以促进施用，但是其自身不应当诱导产生对于接受组合物的个体有害的抗体。其也不应当是有毒的。适合的运载体可以是大的、缓慢代谢的大分子，比如蛋白质、多肽、脂质体、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合的氨基酸、氨基酸共聚物和灭活的病毒颗粒。
可以使用药学上可接受的盐，例如无机酸盐，比如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐和硫酸盐，或有机酸的盐，比如醋酸盐、丙酸盐、丙二酸盐和苯甲酸盐。
在治疗组合物中的药学上可接受的运载体可以另外地包含液体比如水、盐水、甘油和乙醇。另外，辅助物质，比如湿润或乳化剂或pH缓冲物质，可以存在于这样的组合物中。这样的运载体能够使得药物组合物被配制为片剂、丸剂、糖锭剂、胶囊剂、液体、凝胶剂、糖浆剂、膏剂和悬浮液，以便被对象消化。
本发明的组合物可以以各种形式制备。例如，组合物可以被制备为可注射剂——为液体溶液或悬浮液。在注射之前适合于溶解在或悬浮在液体媒介中的固体形式也可以被制备(例如，冻干组合物，比如SynagisTM和HerceptinTM，利用包含防腐剂的无菌水重构)。组合物可以被制备用于外部施用，例如作为药膏、霜剂或粉末。组合物被制备用于口服施用，例如作为片剂或胶囊剂，作为喷剂或作为糖浆剂(任选地经过调味的)。组合物可以被制备用于肺部施用，例如作为吸入剂，使用细粉末或喷剂。组合物可以被制备为栓剂或子宫托。组合物可以被制备用于鼻部、耳部或眼部施用，例如作为滴剂。组合物可以以试剂盒形式，被设计使得合并的组合物就在施用至对象之前被重构。例如，冻干的抗体可以以具有无菌水或无菌缓冲液的试剂盒形式提供。
优选的是组合物中的活性成分是抗体分子、抗体片段或其变体和衍生物，具体而言组合物中的活性成分是根据本发明的抗体、抗体片段或其变体和衍生物。因此，其可以对在胃肠道中的降解是敏感的。因而，如果组合物通过使用胃肠道的途径被施用，则组合物可以包含如此药剂：其保护抗体免受降解但是一旦其从胃肠道被吸收其释放抗体。
药学上可接受的运载体的深入讨论可见于Gennaro(2000)Remington:TheScience and Practice of Pharmacy,20th edition,ISBN:0683306472中。
本发明的药物组合物通常具有在5.5和8.5之间的pH，在一些实施方式中这可以在6和8之间，并且在其它实施方式中大约7。pH可以通过缓冲剂的使用来维持。组合物可以是无菌的和/或不含致热原的。组合物相对于人可以是等渗的。在一个实施方式中，本发明的药物组合物在密闭容器中供应。
在本发明的范围内的是以数种施用形式存在的组合物；这些形式包括但不限于适合于肠胃外施用——例如通过注射或输注，例如通过快速浓注或持续输注——的那些形式。在产品用于注射或输注的情况下，其可以采取在油性或水性媒介中的悬浮液、溶液或乳液的形式，并且其可以包含配方剂(formulatory agent)，比如悬浮、防腐、稳定和/或分散剂。可选地，抗体分子可以是干燥形式，以便于在使用之前利用适合的无菌液体重构。媒介通常被理解为适合于储存、运输和/或施用化合物——比如药学上的活性化合物，特别是根据本发明的抗体——的材料。例如，媒介可以是生理学上可接受的液体，其适合于储存、运输和/或施用药学上的活性化合物，特别是根据本发明的抗体。一旦被配制，本发明的组合物可以直接被施用至对象。在一个实施方式中，组合物适合于施用至哺乳动物，例如人对象。
本发明的药物组合物可以通过许多途径施用，包括但不限于口服、静脉内、肌肉内、动脉内、髓内、腹膜内、鞘内、心室内、经皮、经皮肤、外部、皮下、鼻内、肠内、舌下、阴道内或直肠途径。无痛皮下注射器也可以被用于施用本发明的药物组合物。优选地，药物组合物可以被制备用于口服施用，例如作为片剂、胶囊剂等，用于外部使用，或者作为可注射剂，例如作为液体溶液或悬浮液。也可以制备在注射之前适合于溶解在或悬浮在液体媒介中的固体形式。
对于注射，例如静脉内、皮肤或皮下注射，或者在病痛部位处的注射，活性成分将优选地是肠胃外可接受的水溶液的形式，其不含致热原并且具有适合的pH、等渗性和稳定性。相关领域技术人员能够充分地使用例如等渗媒介比如氯化钠注射液、林格注射液、乳酸盐林格注射液制备适合的溶液。如果需要，可以包含防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其它添加剂。无论其是多肽、肽、或核酸分子、根据本发明的给予个体的其它药学上有用的化合物，施用优选地以“预防上有效量”或“治疗上有效量”(视情况而定)，这足以显示对个体有益。施用的实际量和施用的速率和时间进程将取决于正在被治疗的性质和严重性。对于注射，根据本发明的药物组合物可以例如在预装注射器中提供。
如上面所限定的发明性药物组合物也可以以任何口服可接受的剂型被口服施用，其包括但不限于胶囊剂、片剂、水性悬浮液或溶液。在用于口服使用的片剂的情况下，通常使用的运载体包括乳糖和玉米淀粉。通常也添加润滑剂，比如硬脂酸镁。对于以胶囊剂形式的口服施用，有用的稀释剂包括乳糖和干燥的玉米淀粉。当水性悬浮液被要求用于口服使用时，活性成分即如上面所限定的发明性转运蛋白货物(transporter cargo)缀合物分子与乳化和悬浮剂组合。如果需要，也可以添加某些甜味剂、调味剂或着色剂。
发明性药物组合物也可以外部被施用，尤其是当治疗的靶标包括通过外部施用易接近的区域或器官时，例如包括皮肤或任何其它可接近的上皮组织的疾病。适合的外部制剂容易被制备用于这些区域或器官中的每个。对于外部施用，发明性药物组合物可以以包含发明性药物组合物——特别是如上面所限定的其成分悬浮或溶解在一种或多种运载体中——的适合的药膏配制。用于外部施用的运载体包括但不限于矿物油、液体凡士林、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。可选地，发明性药物组合物可以以适合的洗剂或霜剂配制。在本发明的上下文中，适合的运载体包括但不限于矿物油、失水山梨糖醇单硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、十六烷基酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苄醇和水。
剂量治疗可以是单剂量方案或多剂量方案，其中在本发明的上下文中优选的是多剂量方案。已知的基于抗体的药物，特别是基于抗-细胞因子例如抗-GM-CSF的药物提供了关于施用频率的指导，例如，药物是否应当被每日、每周、每月等递送。频率和剂量也可以取决于症状的严重性。
例如，根据本发明的药物组合物可以每日施用，例如每天一次或数次，例如每天一次、两次、三次或四次，优选地每天一次或两次，更优选地每天一次，持续1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21或更多天，例如每天施用持续1、2、3、4、5、6个月。优选地，根据本发明的药物组合物可以每周施用，例如每周一次或两次，优选地一次，持续1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21或更多周，例如每周施用持续1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月或每周施用持续2、3、4或5年。
具体而言，优选的是对于单剂量，例如每日、每周或每月剂量，优选地对于每周剂量，根据本发明的药物组合物中的抗体或其抗原结合片段的量不超过150mg，优选地不超过100mg，更优选地不超过50mg，甚至更优选地不超过20mg，并且特别优选地不超过10mg。抗体的该量优选地指的是如上面所描述的单剂量，其例如如上面所描述被每日、每周等施用。根据本发明的抗体的这样低的量可以以稳定形式(例如，在冻干制剂中，例如先前的研究已经显示了通过冻干保存的单克隆抗体在40℃下稳定33个月和在50℃下稳定5个月)且在可负担起的成本下生产和配制。
药物组合物通常包括有效量的本发明的一种或多种抗体和/或包括结合本发明的抗体的表位的多肽，即足以治疗、改善、缓解或防止期望疾病或病症，或足以展现可检测治疗效果的量。治疗效果也包括病原效力或身体症状的降低或缓解。对于任何具体对象精确的有效的量将取决于它们的尺寸、重量和健康情况、病症的性质和程度、以及选择用于施用的治疗剂或治疗剂的组合。对于给定情况有效的量由常规实验测定并且在临床医师的判断内。出于本发明的目的，有效剂量将通常是与其被施用至的个体的体重(例如，以kg)相关的从大约0.005至大约100mg/kg，优选地从大约0.0075至大约50mg/kg，更优选地从大约0.01至大约10mg/kg，甚至更优选地从大约0.02至大约5mg/kg，并且特别优选地从大约0.03至大约1mg/kg的本发明的抗体(例如，药物组合物中的抗体的量)。
而且，根据本发明的药物组合物也可以包括根据本发明的至少两种抗体或其抗原结合片段，其中这两种抗体或其抗原结合片段特异性地结合至细胞因子上——特别是GM-CSF上——的不同组的非重叠表位。例如，根据本发明的药物组合物包括根据本发明的第一抗体或其抗原结合片段，和根据本发明的第二抗体或其抗原结合片段，其中第一抗体或其抗原结合片段特异性地结合至细胞因子上——特别是GM-CSF上——的第一组非重叠表位，其不同于细胞因子上——特别是GM-CSF上——的与第二抗体或其第二抗原结合片段结合的非重叠表位组。例如，“细胞因子上——特别是GM-CSF上——的不同组的非重叠表位”在本文中意思是第一组包括细胞因子上的表位I和表位II并且第二(不同)组包括细胞因子上的表位I和表位III。因而，不同组可以是重叠的，即包括相同表位，但是它们通常具有至少一个表位的不同。但是，优选地，不同组的表位是非重叠的，即第一抗体结合至细胞因子例如GM-CSF上的至少两个不同位点，其中至少两个不同位点中的每个不同于细胞因子例如GM-CSF上与第二抗体结合的至少两个不同位点。例如，如果根据本发明的药物组合物包括根据本发明的两种抗体或其抗原结合片段，并且第一抗体或其抗原结合片段特异性地结合至细胞因子上——特别是GM-CSF上——的非重叠位点I和II，则第二抗体或其抗原结合片段可以特异性地结合至细胞因子上——特别是GM-CSF上——的非重叠位点III和IV。以这样的方式，细胞因子例如GM-CSF上的所有(非重叠)位点可以被根据本发明的抗体覆盖。
而且，药物组合物也可以包含多于两种例如3、4、5、6种等的根据本发明的抗体，其中包含的至少两种，优选地多于两种，更优选地所有抗体结合至细胞因子例如GM-CSF上的不同组的表位。
优选地，根据本发明的两种抗体以等摩尔量存在于药物组合物中，优选地为等摩尔混合物。
优选地，组合物可以包括本发明的两种或更多种(例如2、3、4、5种等)抗体以提供附加的或协同的治疗效果。术语“协同”被用于描述两种或多种活性剂的组合效果，其强于每种各自的活性剂的单独效果的总和。因而，在两种或多种药剂的组合效果导致活性或过程的“协同抑制”的情况下，意图是活性或过程的抑制强于每种各自的活性剂的抑制效果的总和。术语“协同治疗效果”指的是利用两种或更多种疗法的组合观察到的治疗效果，其中治疗效果(如通过任意许多参数测量的)强于利用各自单独疗法观察到的单独治疗效果的总和。
在另一实施方式中，组合物可以包括根据本发明的一种或多种(例如，2、3种等)抗体和针对细胞因子——特别是GM-CSF——的一种或多种(例如，2、3种等)另外的抗体。进一步，本发明的抗体与特异于其它细胞因子，或者更通常地特异于其它抗原的抗体一起施用在本发明的范围内。本发明的抗体可以与特异于其它细胞因子，或者更通常地特异于其它抗原的抗体组合/同时或在分开的时间下被施用。
针对细胞因子——特别是针对GM-CSF——的本发明的抗体的实例包括但不限于Ts1GC1、Ts1GC2a、Ts2GC2b、Ts2GC2c、Ts3GC2d、Ts3GC2e、Bs3GC1a、Bs3GC1b、Bs2GC1c、Bs2GC1d、Bs1GC2a、Bs3GC2b、Bs1GC3a、Bs3GC3b、Bs3GC4和Bs3GC5。
而且，包括根据gTs1GC1的抗体或其抗原结合片段，和药学上可接受的运载体的药物组合物也是优选的。包括根据gTs1GC2a的抗体或其抗原结合片段，和药学上可接受的运载体的药物组合物也是优选的。包括根据gTs2GC2b的抗体或其抗原结合片段，和药学上可接受的运载体的药物组合物也是优选的。包括根据gTs2GC2c的抗体或其抗原结合片段，和药学上可接受的运载体的药物组合物也是优选的。包括根据gTs3GC2d的抗体或其抗原结合片段，和药学上可接受的运载体的药物组合物也是优选的。包括根据gTs3GC2e的抗体或其抗原结合片段，和药学上可接受的运载体的药物组合物也是优选的。包括根据gBs3GC1a的抗体或其抗原结合片段，和药学上可接受的运载体的药物组合物也是优选的。包括根据gBs3GC1b的抗体或其抗原结合片段，和药学上可接受的运载体的药物组合物也是优选的。包括根据gBs2GC1c的抗体或其抗原结合片段，和药学上可接受的运载体的药物组合物也是优选的。包括根据gBs2GC1d的抗体或其抗原结合片段，和药学上可接受的运载体的药物组合物也是优选的。包括根据gBs1GC2a的抗体或其抗原结合片段，和药学上可接受的运载体的药物组合物也是优选的。包括根据gBs3GC2b的抗体或其抗原结合片段，和药学上可接受的运载体的药物组合物也是优选的。包括根据gBs1GC3a的抗体或其抗原结合片段，和药学上可接受的运载体的药物组合物也是优选的。包括根据gBs3GC3b的抗体或其抗原结合片段，和药学上可接受的运载体的药物组合物也是优选的。包括根据gBs3GC4的抗体或其抗原结合片段，和药学上可接受的运载体的药物组合物也是优选的。包括根据gBs3GC5的抗体或其抗原结合片段，和药学上可接受的运载体的药物组合物也是优选的。
此外，包括抗体Ts1GC1或其抗原结合片段，和药学上可接受的运载体的药物组合物也是优选的。包括抗体Ts1GC2a或其抗原结合片段，和药学上可接受的运载体的药物组合物也是优选的。包括抗体Ts2GC2b或其抗原结合片段，和药学上可接受的运载体的药物组合物也是优选的。包括抗体Ts2GC2c或其抗原结合片段，和药学上可接受的运载体的药物组合物也是优选的。包括抗体Ts3GC2d或其抗原结合片段，和药学上可接受的运载体的药物组合物也是优选的。包括Ts3GC2e或其抗原结合片段，和药学上可接受的运载体的药物组合物也是优选的。包括抗体Bs3GC1a或其抗原结合片段，和药学上可接受的运载体的药物组合物也是优选的。包括抗体Bs3GC1b或其抗原结合片段，和药学上可接受的运载体的药物组合物也是优选的。包括抗体Bs2GC1c或其抗原结合片段，和药学上可接受的运载体的药物组合物也是优选的。包括抗体Bs2GC1d或其抗原结合片段，和药学上可接受的运载体的药物组合物也是优选的。包括抗体Bs1GC2a或其抗原结合片段，和药学上可接受的运载体的药物组合物也是优选的。包括抗体Bs3GC2b或其抗原结合片段，和药学上可接受的运载体的药物组合物也是优选的。包括抗体Bs1GC3a或其抗原结合片段，和药学上可接受的运载体的药物组合物也是优选的。包括抗体Bs3GC3b或其抗原结合片段，和药学上可接受的运载体的药物组合物也是优选的。包括抗体Bs3GC4或其抗原结合片段，和药学上可接受的运载体的药物组合物也是优选的。包括抗体Bs3GC5或其抗原结合片段，和药学上可接受的运载体的药物组合物也是优选的。
在一个实施方式中，本发明的组合物可以包括本发明的抗体，其中抗体可以组成组合物中总蛋白的按重量计至少50％(例如，60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或更多)。在这样的组合物中，抗体优选地是纯化形式。
本发明还提供了制备药物组合物的方法，其包括如下步骤：(i)制备本发明的抗体；和(ii)将纯化的抗体与一种或多种药学上可接受的运载体混合。
在另一实施方式中，制备药物组合物的方法包括如下步骤：将抗体与一种或多种药学上可接受的运载体混合，其中抗体是获得自本发明的转化的B细胞或培养的浆细胞的单克隆抗体。因而，用于首先获得单克隆抗体并且然后制备药物的程序可以在不同的时间由不的同人在不同的地方(例如在不同国家)执行。
作为出于治疗目的递送抗体或B细胞的可选方案，可能的是递送衍生自B细胞或培养的浆细胞的编码感兴趣的单克隆抗体(或其活性片段)的核酸(通常地DNA)至对象，使得核酸可以在对象中原位表达以提供期望的治疗效果。适合的基因疗法和核酸递送载体在本领域中是已知的。
组合物可以包括抗菌剂，特别是如果以多剂量格式包装。它们可以包括清洁剂，例如吐温(聚山梨醇酯)，比如吐温80。清洁剂通常以低水平例如低于0.01％存在。组合物还可以包括钠盐(例如，氯化钠)以给出张力。例如，10±2mg/ml NaCl的浓度是典型的。
进一步，组合物可以包括例如大约15-30mg/ml(例如25mg/ml)的糖醇(例如，甘露醇)或二糖(例如，蔗糖或海藻糖)，特别是如果它们被冻干或者如果它们包括已经从冻干材料重构的材料的话。用于冻干的组合物的pH在冻干之前可以被调节至5和8之间，或者在5.5和7之间，或者大约6.1。
本发明的组合物也可以包括一种或多种免疫调节剂。在一个实施方式中，免疫调节剂中的一种或多种包括佐剂。
医学治疗和用途
在进一步方面，本发明提供了根据本发明的抗体或其抗原结合片段、根据本发明的核酸、根据本发明的载体、根据本发明的细胞、根据本发明的免疫原性多肽或根据本发明的药物组合物在(i)预防、治疗或缓解炎性和/或自身免疫疾病中；或在(ii)诊断炎性和/或自身免疫疾病中的用途。
炎性疾病可以由于多种原因。在本发明的上下文中，优选地，这样的炎性疾病可以被治疗、缓解和/或防止，其起因于物理原因，例如烧伤，冻伤，物理伤害，钝挫伤(blunt)或穿透性伤(penetrating)，异物体——包括碎片、灰尘和杂物，创伤和电离辐射；生物学原因，例如被病原体感染、由于高敏性而导致的免疫反应、和应激；和化学原因，例如化学刺激物、毒素和醇。
炎性疾病(还被称为炎性紊乱)包括如下疾病，并且因而，在本发明的上下文中，炎性疾病可以优选地选自阑尾炎、粘液囊炎、结肠炎、膀胱炎、皮炎、静脉炎、RSD/CRPS、鼻炎、腱炎、扁桃体炎、血管炎、阿耳茨海默病、强直性脊柱炎、关节炎(骨关节炎、类风湿性关节炎(RA)、牛皮癣性关节炎)、哮喘、动脉粥样硬化、克罗恩病、结肠炎、皮炎、憩室炎、纤维肌痛、肝炎、肠道易激综合征(IBS)、系统性红斑狼疮(SLE)、肾炎、帕金森病、溃疡性结肠炎、寻常痤疮、自身炎性疾病、腹部疾病(celiac disease)、前列腺炎、肺泡蛋白沉积、肾小球性肾炎、高敏性、炎症性肠病、盆腔炎、再灌注损伤、结节病、移植排斥、血管炎、间质性膀胱炎、炎性肌病、脑脊髓炎特别是急性播散性脑脊髓炎、脊柱炎特别是强制性脊柱炎、抗合成酶综合征、皮炎特别是特应性皮炎或接触性皮炎、肝炎特别是自身免疫性肝炎、自身免疫性周围神经病、胰腺炎特别是自身免疫性胰腺炎、贝切特病、Bickerstaff脑炎、Blau综合征、乳糜泄(coeliac disease)、恰加斯病、多发性神经病特别是慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、骨髓炎特别是慢性复发性多病灶性骨髓炎、丘-施二氏综合征、寇甘综合征、巨细胞性动脉炎、CREST综合征、血管炎特别是皮肤小血管炎(cutaneous small-vessel vasculitis)和荨麻疹性血管炎、疱疹样皮炎、皮肌炎、系统性硬皮炎、德雷斯勒综合征、药物诱发性红斑狼疮、盘状红斑狼疮、起止点炎、嗜酸性筋膜炎、嗜酸性肠胃炎、结节性红斑、特发性肺纤维变性、胃炎、格雷夫斯病、格-巴二氏综合征、桥本甲状腺炎、过敏性紫癜、化脓性汗腺炎、特发性炎性脱髓鞘病、肌炎特别是包涵体肌炎、膀胱炎特别是间质性膀胱炎、川崎病、扁平苔癣、狼疮样肝炎、Majeed综合征、美尼尔病、显微镜下多动脉炎、混合结缔组织病、脊髓炎特别是视神经脊髓炎、甲状腺炎特别是奥德甲状腺炎(Ord’s thyroiditis)、风湿病特别是复发性风湿病、Parsonage-Turner综合征、寻常天疱疮、静脉周脑脊髓炎、结节性多动脉炎、多肌痛特别是风湿性多肌痛、多肌炎、肝硬化特别是原发性胆汁性肝硬化、胆管炎特别是原发性硬化性胆管炎、进行性炎症性神经病、腊斯默森脑炎、复发性多软骨炎、关节炎特别是反应性关节炎(莱特尔病)和类风湿性关节炎、风湿热、肉样瘤病、施尼茨勒综合征、血清病、脊柱关节病、高安动脉炎、托-亨二氏综合征、横贯性脊髓炎和韦格纳肉芽肿病。
自身免疫紊乱(也被称为自身免疫疾病)包括如下疾病，并且因而，在本发明的上下文中，自身免疫疾病可以优选地选自CNS的自身免疫疾病、自身炎症性疾病、腹部疾病；斯耶格伦综合征、系统性红斑狼疮、Blau综合征、大疱性类天疱疮、癌症、卡斯尔曼病、腹部疾病、恰加斯病、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、慢性复发性多病灶性骨髓炎、慢性阻塞性肺病、丘-施二氏综合征、疤痕性类天疱疮、寇甘综合征、冷凝集素病、补体成分2缺陷、接触性皮炎、颅动脉炎、CREST综合征、克罗恩病、库兴综合征、德尔肯病、疱疹样皮炎、皮肌炎、1型糖尿病、弥漫性皮肤系统性硬化、德雷斯勒综合征、狼疮、盘状红斑狼疮、湿疹、急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、阿狄森病、无γ球蛋白血症、肌萎缩性侧索硬化(还被称为卢伽雷病(Lou Gehrig's disease)；运动神经元病)、强直性脊柱炎抗磷脂综合征、抗合成酶综合征、特应性皮炎、自身免疫性再生障碍性贫血、自身免疫性心肌病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳病、自身免疫性淋巴细胞增生综合征、自身免疫性周围神经病变、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性多内分泌综合征、自身免疫性孕酮性皮炎、自身免疫性血小板减少性紫癜、自身免疫性荨麻疹、自身免疫性眼葡萄膜炎(Autoimmune uveitis)、巴洛病/巴洛同心圆性硬化(Balo concentric sclerosis)、贝切特病、贝格尔病、Bickerstaff脑炎、子宫内膜组织异位、起止点炎相关的关节炎、嗜酸性胃肠炎、后天性大疱性表皮松解、胎儿溶血症、伊凡斯综合征、骨化性纤维发育不良、纤维性肺泡炎(或特发性肺纤维变性)、胃炎、肾小球性肾炎、古德帕斯彻综合征、格雷夫斯病、格-巴二氏综合征、桥本脑炎(encephelopathy)、桥本甲状腺炎、妊娠期类天疱疮、化脓性汗腺炎、低丙球蛋白血症、特发性血小板减少性紫癜(自身免疫性血小板减少性紫癜)、lgA肾病、眼疤痕性类天疱疮、包涵体肌炎、类风湿性关节炎、慢性炎症性风湿热、脱髓鞘性多发性神经病、肉样瘤病、复发性风湿病、间质性膀胱炎、幼年型特发性精神分裂症、PANDAS(儿童关节炎，又称为青少年自身免疫性类风湿性关节炎)、施密特综合征、神经精神病学川崎病——APS的另一种形式、施尼茨勒综合征、癌旁小脑肌无力综合征、白细胞分裂性血清病、扁平苔癣、斯耶格伦综合征、硬化性苔癣、Parsonage-Tumer线性IgA疾病、斯蒂尔病、寻常天疱疮、类狼疮性肝炎、自身免疫性肝炎、僵人综合征、恶性贫血(Pemicious anaemia)、亚急性细菌性心内膜炎(SBE)、POEMS综合征、红斑狼疮、斯威特综合征、交感性眼炎、美尼尔病、系统性狼疮、原发性胆汁性肝硬化、Miller-Fisher综合征、高安综合征、胆管炎、进行性炎症性神经病、穆-哈二氏病、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、坏疽性脓皮病、多发性硬化、单纯性红细胞再生不良、腊斯默森脑炎、重症肌无力、横贯性脊髓炎、雷诺现象、镜下结肠炎、溃疡性结肠炎、肌炎、特发性炎症性肠病(IBD)、视神经脊髓炎、德维克病和神经性肌强直。
通常，自身免疫疾病起因于身体针对正常存在于身体中的物质和组织的异常免疫应答(自身免疫性)。这可以局限于某些器官(例如在自身免疫性甲状腺炎中)或者可以涉及在不同地方的具体组织(例如，古德帕斯彻病，其可以影响肺和肾脏二者中的基膜)。自身免疫疾病可以通过高敏性的相应类型来分类：I型(即由自体血清诱导的荨麻疹)、II型、III型或IV型。
具体而言，至少一些自身免疫紊乱也可以是炎性疾病，并且反之亦然。
自身免疫疾病和/或炎性疾病，其在本发明的背景下被优选地治疗、防止和/或缓解，包括多发性硬化、肺泡蛋白沉积、关节炎特别是类风湿性关节炎、和哮喘。
关于药物组合物，在本发明范围内的是如上面所述的抗体或其抗原结合片段、核酸、载体、细胞、免疫原性多肽或药物组合物的数种施用形式和途径。这在如本文所述的抗体或其抗原结合片段、核酸、载体、细胞、免疫原性多肽的用途的上下文中，特别是关于优选的施用形式和途径也适用。
诊断方法可以包括将抗体或抗体片段与样品接触。这样的样品可以分离自对象，例如取自例如鼻道、窦腔(sinus cavity)、唾液腺、肺、肝、胰腺、肾脏、耳、眼睛、胎盘、消化道、心脏、卵巢、垂体、肾上腺、甲状腺、脑、皮肤或血液的分离的组织样品，优选地是血清。诊断方法也可以包括检测抗原/抗体复合物，特别是在抗体或抗体片段与样品接触之后。这样的检测步骤通常在试验台(bench)处进行，即不与人或动物体进行任何接触。检测方法的实例包括例如ELISA(酶联免疫吸附试验)。
本发明还提供了(i)根据本发明的抗体、抗体片段或其变体和衍生物，(ii)根据本发明的无限增殖化B细胞克隆，(iii)根据本发明的核酸或载体，或(iv)本发明的药物组合物在(a)制造用于治疗或缓解炎性和/或自身免疫疾病的药物或(b)诊断炎性和/或自身免疫疾病中的用途。
本发明还提供了本发明的组合物用作用于预防或治疗炎性和/或自身免疫疾病的药物。其还提供了本发明的抗体和/或包括与这样的抗体结合的表位的蛋白质在制造用于治疗对象和/或用于在对象中进行诊断的药物中的用途。其还提供了用于治疗对象的方法，其包括将本发明的组合物施用至对象的步骤。在一些实施方式中，对象可以是人。检查治疗性处理的功效的一种方式包括在施用本发明的组合物之后监测疾病症状。治疗可以是单剂量方案或者多剂量方案。
在一个实施方式中，根据本发明的抗体、抗体片段、无限增殖化B细胞克隆或药物组合物被施用至需要这种治疗的对象。这样的对象包括但不限于具体地处于炎性和/或自身免疫疾病风险下的对象或者易受炎性和/或自身免疫疾病影响的对象。
在本发明中描述的抗体和其片段也可以被用在诊断炎性和/或自身免疫疾病的试剂盒中。进一步，能够结合本发明的抗体的至少两种表位，特别是细胞因子，例如GM-CSF可以被用在用于通过检测保护性抗-细胞因子——特别是抗-GM-CSF——抗体的存在或测定其效价监测应用程序的效率的试剂盒中使用。
本发明还提供了制备药物的方法，其包括将单克隆抗体与一种或多种药学上可接受的运载体混合的步骤，其中单克隆抗体是获得自本发明的转染的宿主细胞的单克隆抗体。因而，首先获得单克隆抗体(例如，表达它和/或纯化它)并且然后将它与药物运载体(一种或多种)混合的程序可以在不同的时间由不同的人在不同的地方(例如在不同国家)执行。
以本发明的转化的B细胞或培养的浆细胞开始，培养、继代培养、克隆、亚克隆、测序、核酸制备等的各个步骤可以被执行，以便于使通过转化的B细胞或培养的浆细胞表达的抗体持续，在每个步骤任选的优化。在一个实施方式中，上面的方法进一步包括应用至编码抗体的核酸的优化(例如，亲和力成熟或优化)技术。本发明涵盖在这样的步骤期间使用和制备的所有细胞、核酸、载体、序列、抗体等。
在所有这些方法中，在表达宿主中使用的核酸可以被操作以插入、缺失或改变某些核酸序列。来自这样的操作的变化包括但不限于引入限制位点、修改密码子使用、增加或优化转录和/或翻译调控序列等的变化。还可能的是变化核酸以改变编码的氨基酸。例如，可以有用的是将一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个等)氨基酸置换、缺失和/或插入引入抗体的氨基酸序列。这样的点突变可以修改效应物功能、抗原结合亲和力、翻译后修饰、免疫原性等，可以引入用于附接共价基团(例如，标记)的核酸或者可以引入标记物(例如，出于纯化目的)。突变可以被引入特定位点中或者可以随机被引入，然后选择(例如，分子进化)。例如，编码本发明的抗体的CDR区、重链可变区或轻链可变区中任一种的一个或多个核酸可以随机地或定向地被突变以在编码的氨基酸中引入不同的性质。这样的变化可以是迭代过程的结果，其中最初的改变被保留并且在其它核苷酸位置处引入新的变化。进一步，在独立步骤中实现的变化可以组合。引入编码的氨基酸的不同性质可以包括但不限于增强的亲和力。
本发明不限于本文描述的具体实施方式的范围。的确，除了本文描述的那些之外的本发明的各种修改根据说明书和附图对于本领域技术人员将变得显而易见。这些修改落入所附权利要求书的范围内。
除非另有限定，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。虽然与本文描述的那些类似或等价的方法和材料可以在实践或测试本发明中使用，但是本文描述了适合的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引用以其全部被并入。在冲突的情况下，本说明书包括定义将主导。
下面的附图、序列和实施例意欲进一步阐明本发明。它们不意欲将本发明的主题限制于其。
附图描述
图1显示了(A)GCA21、GCA7和GCB59之间的SPR交叉竞争，(B)包被有GCA21、GCA7或位点IV GCB59的多通道芯片被GM-CSF饱和并且连续地暴露于过量的相同抗体。(C)包含三种非交叉竞争抗体——单独地或以等摩尔浓度(1:1)或以10倍抗体过量(10:1)加入GM-CSF——的样品的SEC-HPLC图。
图2显示了通过三种抗体的组合在体外强力地中和GM-CSF。固定量的GM-CSF(最终浓度50pg ml-1)利用连续稀释的一种或多种抗体培育，添加至TF1细胞(10,000个/孔)并且细胞增殖在第3天通过胸苷并入测量。(A)TF-1生物测定的方案。(B)连续稀释的单克隆抗体或两种或三种非交叉竞争抗体的混合物被测试它们中和GM-CSF的能力。(C)测试的灵敏度通过根据指示改变细胞的数目和GM-CSF的浓度来变化。对于每种实验条件示出了使用单一抗体或者三种非交叉竞争抗体的组合获得的抑制。
图3显示了GM-CSF免疫复合物在体内的Fc依赖性清除。(A)在特异性抗体存在下，夹心ELISA来检测GM-CSF。将固定量的GM-CSF加入至小鼠血清，同时单独地或组合地加入三种单克隆抗体(GCA21、GCA7、GCB59)。GM-CSF的定量通过夹心ELISA使用对于用于捕获的位点II和用于检测的位点I特异性的抗体执行。加入在中性(左)或碱性缓冲液(右)中血清的连续稀释液并且参照GM-CSF标准品测定GM-CSF浓度。虚线代表在不存在抗体的情况下测量的GM-CSF的浓度。(B)给雌性Balb/c小鼠(5只/组)注射100μg单克隆抗体——以IgG或IgG-LALA格式的GCA21(1mAb)或GCA21+GCA7+GCB59(3mAb)，或者来自PAP患者的2mg总IgG，然后在16小时后注射2μg GM-CSF。在1或5天之后收集血清并且GM-CSF浓度通过ELISA在未处理的血清中和在pH 11.6下处理以解离免疫复合物的血清中测量。显示了在第1天和第5天在未处理的血清(左)或碱处理的血清(右)中的GM-CSF浓度。(C)响应于在使用GM-CSF和指示的抗体之前24小时注射的小鼠血清的不同稀释液的TF-1细胞的增殖。(D)将由一种或三种抗体(以IgG1或IgG1-LALA格式)形成的GM-CSF免疫复合物结合至表达Fc RIIa或Fc RIIb的TZM-bl细胞，如通过流式细胞术使用抗-IgG Fc特异性抗体测量的。
图4显示了三种双特异性构建体类型Bs1、Bs2和Bs3与三种三特异性构建体类型Ts1、Ts2和Ts3的方案。显示了每种构建体类型的位置A、B和/或C(如果适用)。不同GM-CSF抗体的重链和轻链二者的单链可变结构域(ScVd)在被用作支架的一种GM-CSF抗体的重链或轻链的N端处和/或C端处添加。黑色椭圆形代表VH结构域，而深灰色椭圆形代表VL结构域。不同ScVd的VH和VL通过特异性连接体接合在一起。其它连接体被用于接合彼此之间的ScVd和被用作支架的全抗体。浅灰色椭圆形代表IgG1CH和CL结构域。
图5显示了TsGC1以非常高的亲和力、以非常缓慢的解离速率(off-rate)结合至GM-CSF(A)。(B-C)TsGC1可以使用对于结合至GM-CSF的所有3种不同的特异性。GCA21、GCA7和GCB59被固定化在SPR芯片上并且连续地暴露于GM-CSF，然后分别地GCA7、GCB59和GCA21，并且最后TsGC1。(E)TsGC1可以与GM-CSF形成高分子量复合物。TsGC1被固定化在SPR芯片上并且连续地3轮暴露于GM-CSF，然后可溶的TsGC1。显示了利用GCA7为对照执行的相同实验。
图6显示了与单一抗体或者抗体的组合——形成TsgC2d和BsGC3a——相比，通过TsgC2d和BsGC3a极其强力地中和GM-CSF。
图7显示了由GM-CSF和TsGC2d或BsGC3a形成的免疫复合物结合至表达FcγRIIa或FcγRIIb的TZM-bl细胞，如通过流式细胞术使用抗-IgG Fc特异性抗体测量的。该结合与单一抗体和2或3种抗体的组合——形成BsGC3a和TsGC2d——的结合分别进行比较。
实施例
本发明的示例性实施方式在下面的实施例中提供。下面的实施例仅通过阐明的方式呈现并且意欲帮助本领域普通技术人员使用本发明。实施例不意欲以任何方式另外限制本发明的范围。
实施例1：分离和表征GM-CSF特异性抗体
外周血样品自五名肺泡蛋白沉积(PAP)患者收集。IgG记忆B细胞通过磁力和荧光激活的细胞分选术的组合——特别是在利用CD22-FITC(BD Phamingen)染色PBMC之后使用抗-FITC微珠(Miltenyi Biotec)——自冷冻保存的或新鲜的PBMC分离。IgG记忆B细胞然后在克隆条件下利用EBV(爱泼斯坦-巴尔病毒)和CpG在384孔微板中在饲养细胞的存在下无限增殖化，如由Traggiai E.等(2004)Nat Med.10(8):871-5和WO 2004/076677A2描述的。通过ELISA筛选培养物上清液中GM-CSF特异性IgG抗体的存在。产生GM-CSF单克隆抗体的四种无限增殖化B细胞克隆被鉴定。cDNA从阳性培养物合成并且抗体V基因(重链和轻链可变区)使用IMGT数据库(http://www.imgt.org/)测序并分析。四种PAP自身抗体的V(D)J基因使用在表5中示出。
表5.4种PAP自身抗体的V(D)J基因使用。抗体使用不同的V、D和J基因并且被体细胞突变。体细胞突变的负载比得上针对非自身抗原的T细胞依赖性应答的那个特征——在VH基因区段中范围从8.8％到16.7％和在VL基因区段中范围从0％至8.6％。
所有抗体通过使用聚乙烯亚胺(PEI)瞬时转染HEK 293自由式细胞(Invitrogen)重组地作为IgG1生产。然后通过ELISA测试抗体结合至人GM-CSF。结合性质和V基因使用在表5中示出。抗体显示了比得上抗体MOR103和奈米布单抗的高亲和力，抗体MOR103和奈米布单抗是在临床研发下的GM-CSF中和单克隆抗体，其在本文中充当参比抗体。EC50值(ng/ml)通过ELISA测定并且使用GraphPad Prism 5软件通过非线性回归分析计算每个样品的EC50值(ng/ml)。EC50值的范围为从61.4到307.6ng/ml。有趣地，抗体不与小鼠和大鼠GM-CSF二者交叉反应。
结合的动力学通过表面等离子体共振(SPR)测定。简言之，对于SPR，蛋白A(450nM)在10mM，pH 4.5醋酸盐缓冲液中稳定并且通过胺偶联固定化在EDC/NHS预活化的ProteOn传感器芯片(Biorad)上；未反应的基团通过注射HCl乙醇胺(1M)封闭。HEPES缓冲盐水(HBS)(10mM HEPES，pH 7.4，150mM NaCl，3mM EDTA，0.005％表面活性剂吐温-20)被用作运行缓冲液。所有注射在100μl/min的流速下进行。单克隆抗体在HBS(200nM)中稀释并且被注射至蛋白A包被的芯片上用于捕获，然后注射不同浓度的人GM-CSF(400nM、200nM、100nM、50nM、25nM)；芯片的一个通道注射有HBS并且被用作分析的参比。注射时间和解离时间分别为120s和600s。mAb与GM-CSF的每种结合相互作用使用ProteON XPR36仪器(Biorad)评估和数据用ProteOn Manager软件处理。Ka、Kd和KD应用Langmuir拟合模型计算。测定的KD范围为从0.18到0.69nM，这与高亲和力结合一致。但是，动力学值是高度多相(heterogeneous)的。例如，抗体GCA7和GCB59具有比得上的KD值(分别为0.38和0.68nM)，但是显示了不同的动力学，其中GCA7的特征在于缓慢的结合速率(on-rate)/缓慢的解离速率和GCB59的特征在于高的结合速率/高的解离速率(表6)。
表6.来自PAP患者的GM-CSF自身抗体的结合性质和V基因使用。来自PAP患者的人单克隆抗体显示了比得上参比单克隆抗体的高亲和力。该表格示出了通过ELISA测定的EC50值和通过SPR测定的Ka、Kd和KD值；参比单克隆抗体以粗体强调。
mAb EC50(ng/ml) Ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(M)
GCA7 186.8 2.4E+05 6.0E-05 3.8E-10
GCA21 59.4 9.5E+05 6.5E-04 6.9E-10
GCB59 307.6 1.7E+06 1.2E-03 6.8E-10
GCE536 61.4 6.6E+05 1.1E-04 1.8E-10
克隆3092 61.0 5.9E+05 3.4E-04 5.7E-10
克隆1089 1080.0 1.8E+05 7.9E-05 4.4E-10
MOR103 90.0 2.7E+05 1.5E-05 1.9E-10
奈米布单抗 75.3 3.1E+05 7.7E-05 2.4E-10
实施例2：四种PAP自身抗体识别GM-CSF上的不同位点并且可以形成高分子量免疫复合物
为了评估不同mAB与GM-CSF的同时结合，SPR交叉竞争实验通过上面描述的SPR执行(实施例1)，其中不同的mAb(每种200nM)在GM-CSF捕获(50nM)之后被连续注射。注射时间和解离时间分别为60s和20s。由此，发现了GCA7、GCA21、GCB59和GCE536在它们之间不交叉竞争结合至GM-CSF(图1A)。有趣的是，SPR实验显示了三种非交叉竞争自身抗体可以同时结合至GM-CSF的单分子(图1B)。而且，当GM-CSF利用过量的三种抗体培育时，高分子量免疫复合物的形成可以通过尺寸排阻色谱法(SEC-HPLC)检测到(图1C)。在SEC-HPLC实验中，三种非交叉竞争mAb在PBS中单一地被稀释或者作为三抗体组合(10μg的总抗体量)被稀释，并且与GM-CSF(1:1或10:1摩尔比)在RT下混合1小时。样品通过Agilent 1100HPLC机器使用TSK-GEL G3000SW柱(Tosoh，床体积：13ml，空隙容积：4.6ml)利用PBS作为流动相(流速：1ml/min)进行分析。通用溶剂2μm过滤器(Agilent)被放置在注射器和柱之间。通过可变波长检测器(VWD，Agilent)利用在220nm下的紫外线吸收执行检测。
实施例3：在体外强力中和地GM-CSF需要结合至非重叠位点的3种抗体的组合
自身抗体的中和活性通过测量它们抑制TF-1细胞响应于重组GM-CSF增殖的能力来评估(图2A)。为此，TF-1细胞(CLS，Cell Lines Service)在RPMI 1640培养基中维持，该培养基补充有10％胎牛血清(Hyclone)、1％GlutaMAX、1％青霉素/链霉亲和素、1％非必需氨基酸、1％丙酮酸钠、1‰2-巯基乙醇(都来自GIBCO)、5ng/ml人GM-CSF(Gentaur)、10ng/ml人IL-3(ImmunoTools)。细胞在37℃下在含有5％CO2的潮湿培养箱中生长。GM-CSF中和试验通过如下步骤执行：在不含GM-CSF和IL-3的生长培养基中连续地稀释mAb(或mAb、总IgG或亲和纯化的抗体的组合)、添加100pg/ml浓度下的GM-CSF和在96孔平底细胞培养板(Costar)中在37℃下预培育1小时。TF-1细胞被洗涤五次，在不含GM-CSF和IL-3的生长培养基中稀释，并且接种10,000个细胞/孔(最终GM-CSF浓度等于50pg/ml)。在其它测试中，GM-CSF在500和5,000pg/ml的最终浓度下使用，并且接种1,000个细胞/孔。在不存在抗体的情况下含有或不含GM-CSF的细胞被用作对照来测定细胞增殖的最大和最小水平。板在37℃下在含有5％CO2的潮湿培养箱中培育72小时，并且细胞增殖在利用0.2μCi/孔的[3H]-胸苷(PerkinElmer)进行6小时培育之后测量。GM-CSF中和利用下式被计算为TF-1生长的抑制百分比：[1-(单孔的CCPM–在没有GM-CSF的情况下生长的对照细胞的平均CCPM)/(在具有GM-CSF的情况下生长的对照细胞的平均CCPM–在没有GM-CSF的情况下生长的对照细胞的平均CCPM)]×100(CCPM＝校正的计数/分钟)。每个样品的IC90(μg/ml)通过非线性回归分析使用GraphPad Prism 5软件计算。在一些实验中，小鼠血清在TF-1生长培养基中滴定并且在37℃预培育30min。TF-1细胞被洗涤并被接种(1,000个细胞/孔)。加入GM-CSF(60,000至0.3ng/ml)的滴定作为生长对照。每个单孔的CCPM针对血清滴定绘制。
惊人地，使用该生物测定，GCA21、GCA7和GCB59未能中和GM-CSF(图2B)——甚至当在1mg/ml的浓度下测试时(数据未显示)。仅有的例外是GCE536，其中和GM-CSF活性，具有2.43μg/ml的IC90值，而治疗抗体奈米布单抗和MOR103分别显示0.80和0.16的IC90值。有趣地，当组合在一起时，两种非交叉竞争抗体在剂量依赖性和百分比抑制二者方面都显示了增强的中和活性，GCA21和GCB59的组合为最有效的(图2B)。显著地，三种非交叉竞争抗体(GCA21、GCA7和GCB59)的组合导致增殖的完全抑制，IC90值为0.08μg/ml(表达为三种mAb的总浓度)，该IC90值低于治疗抗体MOR103和奈米布单抗的IC90值(图2B)。
正如从质量作用定律预期的，发现了通过改变细胞数目和GM-CSF浓度，试验的灵敏度被显著地影响。具体而言，降低TF-1细胞的数目和GM-CSF的浓度导致更加灵敏的测试，该测试显示通过单一和多种抗体增加的中和(图2C)。相比之下，当使用大数目的TF-1细胞和大剂量的GM-CSF时，甚至最强力的中和抗体MOR103和奈米布单抗未能中和GM-CSF——甚至当以400倍摩尔过量存在时。显著地，在所有条件下，三种非竞争抗体的组合能够完全地中和GM-CSF(图2C)。
实施例4：GM-CSF免疫复合物的在体内FcR依赖性清除
已经确立了GM-CSF可以与三种抗体形成复合物，导致细胞因子生物学活性的有效体外中和，单一对多种自身抗体在体内的效果被调查。为此，6-8周龄雌性BALB/c小鼠的组被静脉注射有100μg纯化的mAb或自PA96患者纯化的2mg总IgG。在16小时之后，注射2μg的人GM-CSF。血清样品在第1天和第5天收集。GM-CSF通过夹心ELISA定量。简言之，结合至GM-CSF的位点II的10μg/ml抗体被用于涂布96孔Maxisorp板(Nunc)，其然后利用PBS+10％FBS(Gibco)封闭。所有血清和GM-CSF——其被用作标准品(范围为3.4-600,000pg/ml)——被滴定并且并行地在不同条件下测试(未处理或者在碱性处理以解离免疫复合物之后；图3A)：在一个板中，所有样品补充有25％(vol/vol)的碱性解离缓冲液(2.5％Triton X100，2M乙醇胺，0.15M NaCl，pH 11.6)，在另一个板中，所有样品补充有25％(vol/vol)的PBS+10％FBS。板在RT下静置过夜。捕获的GM-CSF的检测利用结合至GM-CSF的位点I的1μg/ml生物素化抗体在RT下进行1h，然后在RT下结合0.5μg/ml链霉亲和素-AP(JacksonImmunoResearch)持续1h。板然后被洗涤，加入底物(p-NPP，Sigma)并且在405nm下阅读板。
在不存在抗体的情况下，注射的GM-CSF迅速地从血清消失并且在24小时之后是不可检测的(图3B)。相比之下，当单一抗体(GCA21或MOR103)被使用时，高水平的GM-CSF在第1天从血清回收并且在第5天时仍然存在。值得注意的是，在MOR103而不是GCA21的情况下，GM-CSF检测需要碱性解离，这与两种抗体的不同解离速率一致(表6)。鲜明对比的是，当小鼠接受三种非交叉竞争抗体(GCA21、GCA7和GCB59)或PAP IgG时，由于仅低或不可检测量的细胞因子可以分别在碱性解离之后在第1天和第5天血清中被检测到，因此GM-CSF被快速清除。
为了解决Fc受体在清除GM-CSF中的可能角色，相同抗体以被称为LALA的变体形式——其不结合至C1q或Fc-γ受体——测试。与野生型抗体类似，单一LALA抗体导致血清中GM-CSF水平的增加。但是，与针对三种野生型抗体观察到的相比，三种LALA抗体不能清除GM-CSF，其在碱性解离之后甚至在第5天在血清中数量上恢复(图3B)。
为了查证抗体结合的GM-CSF是否将是生物可利用的，小鼠的血清支持TF-1增殖的能力被测试(图3C)。接受GCA21或MOR103的小鼠的血清导致TF-1细胞的稳健增殖，这与足以接合细胞因子受体的GM-CSF解离速率一致。相比之下，接受三种野生型抗体或PAP IgG的小鼠血清不能够刺激增殖，这与免疫复合物在体内的清除一致。此外，虽然包含高水平的GM-CSF，但是接受三种LALA抗体的小鼠血清不是刺激性的，该发现与GM-CSF在稳定免疫复合物中的不可逆隔离一致。
为了进一步解决Fcγ受体的角色，测试在GM-CSF和野生型或LALA抗体之间形成的免疫复合物结合至表达不同Fcγ受体的TZM-bl细胞的能力。为此，每种转染有特异性Fcγ受体(FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb或FcγRIIIa)的四种TZM-bl细胞系(NIH AIDSResearch&Reference Reagent Program)在补充有10％胎牛血清(Hyclone)、0.025MHepes、10μg/ml庆大霉素和20μg/ml杀稻瘟素的DMEM培养基中维持。未转染的TZM-bl细胞被用作阴性对照并且在补充有10％胎牛血清(Hyclone)和2％青霉素/链霉亲和素的DMEM培养基中维持。细胞在37℃下在含有5％CO2的潮湿培养箱中生长。特异性FcγR的表达通过利用FITC缀合的抗-CD64(抗-FcγRI)、抗-CD32(抗-FcγRIIa和抗-FcγRIIb)和抗-CD16(抗-FcγRIIIa)抗体(所有均来自BD Pharmingen)染色TZM-bl细胞来评估。未转染的和转染的TZM-bl细胞利用染色缓冲液(具有10％胎牛血清和2mM EDTA的PBS)洗涤并且在96孔板中以50,000个细胞/孔的密度接种。在2.5μg/ml的最终浓度下的单一抗-GM-CSF mAb(GCA21)或三种非交叉竞争mAb(GCA21、GCA7和GCB59)的组合与0.05μg/ml GM-CSF或染色缓冲液(具有10％胎牛血清和2mM EDTA的PBS)混合。所有抗体的LALA版本和具有不同特异性的mAb被包括作为对照。样品在37℃下培育30min以允许免疫复合物形成并且然后在将它们加入至TZM-bl细胞之前冷却至4℃持续30min。洗涤细胞两次并且利用抗-人IgG Fcγ片段特异性F(ab’)2片段(Jackson ImmunoResearch)进行染色。在BD FACSCanto(BD Biosciences)上分析样品并且平均荧光强度被分析并且在样品之间进行比较。
仅在FcγRIIa-和FcγRIIb-表达细胞上和当免疫复合物通过三种野生型而不是LALA抗体形成时观察到强结合(图3D)。综合起来，上述结果指示单一抗体——甚至当在体外强力地中和时——增加GM-CSF的半衰期并且构建生物可利用的细胞因子的循环库。相比之下，三种或更多种抗体导致形成免疫复合物，其通过Fc依赖性机制有效地被清除。
实施例5：工程化具有最高GM-CSF中和活性的多特异性抗体
鉴于靶向GM-CSF上的多个独立位点以实现在体内有效地中和并清除细胞因子的需要，携带GCA21、GCA7、GCB59和GCE536表位结合位点，特异性连接体和完整的人IgG1 Fc的双特异性和三特异性抗体被设计和产生(表7)。六种不同的构建体类型被用于产生多特异性抗体(图4)。具体而言，三种构建体类型Ts1、Ts2和Ts3被用于产生6种不同的三特异性六价抗体，而三种构建体类型Bs1、Bs2和Bs3被用于产生10种不同的双特异性四价抗体(图4和表7)。构建体类型Bs1、Bs2、Bs3、Ts1和Ts2根据US 2009/0155275 A1设计。
表7.GM-CSF多特异性抗体的描述
1用作支架的抗体加下划线。
2从N端到C端。
实施例6：多特异性抗体的生产力和聚集的评价
抗GM-CSF多特异性抗体在293F细胞中产生并且在蛋白A上纯化。通过Pierce二喹啉甲酸(BCA)蛋白试验根据制造商的使用说明(Thermo Scientific)进行定量。该试验使用基于BCA的清洁剂可相容的制剂，用于比色检测和定量总蛋白。根据含有Bs3GC1a、Bs1GC2a、Bs1GC3a、Bs3GC3b、Bs3GC5的不同抗体在大于30μg/ml的浓度下产生，生产力改变。多特异性抗体(最终浓度：1mg/ml)的聚集通过在不存在或存在GM-CSF(最终浓度：0.1mg/ml)下在OD340nm下测量它们的浊度进行分析(表8)。
表8.293F细胞的多特异性mAb的生产力(μg/ml)和通过在不存在或存在GM-CSF下在OD 340nm下的浊度测量的它们的聚集。低OD值指示较低水平的浊度。
实施例7：多特异性抗体以高亲和力结合至GM-CSF
通过ELISA测试所有多特异性抗体与GM-CSF的结合。如通过在下面的表9中的EC50值所显示的，该结合对于GM-CSF是具有高亲和力的高度特异性的。多特异性抗体的不同结合位点的用途通过SPR实验使用Ts1GC1为模型测试。在该实验中，GM-CSF由形成Ts1GC1的过量的3种抗体中的2种结合，并且揭示了通过第3种特异性随后结合Ts1GC1至GM-CSF。Ts1GC1具有非常高的亲和力，具有如在图5A中示出的非常低的KD。在不同的SPR实验中，GM-CSF与组成Ts1GC1的3种抗体中的2种抗体复合，使得3种GM-CSF表位中仅一种保持不通过Ts1GC1结合(图5B-D)。此外，当在SPR芯片上固定化时，当芯片连续地暴露于多轮可溶性GM-CSF和Ts1GC1时，Ts1GC1——与常规抗体比如GCA7不同——能够形成高分子量复合物(图5E)。
表9.如通过ELISA测定的将多特异性mAb结合至GM-CSF。
实施例8：通过多特异性抗体极其强力地中和GM-CSF
如上面所描述的，使用体外生物测定基于TF-1细胞测试GM-CSF中和(实施例3)，其中2种不同的GM-CSF浓度(50和500pg/ml)和2种不同数目的细胞/孔(1,000个和10,000个)被测试。IC90值在表10中被报道。有趣的是，在以非常低的浓度(对于大多数多特异性抗体，低于1ng/ml)测试的所有条件下，所有多特异性抗体完全抑制TF-1增殖。值得注意的是，与最佳多特异性抗体(Ts1GC2a)相比，使用较低严格条件，MOR103和奈米布单抗分别需要100倍和690倍更大的浓度。在严格条件下，大多数多特异性抗体可以在低于10ng/ml的浓度下中和GM-CSF，而MOR103和奈米布单抗需要大于1mg/ml的浓度。两种多特异性抗体Ts3GC2d和Bs1GC3a由于它们的总体性质被选择并且与它们衍生自的单一抗体或抗体的组合比较(图6)。
表10.通过多特异性抗体极其强力地中和GM-CSF。较低严格条件：50pg/ml GM-CSF和1,000个TF-1/孔。严格条件：50pg/ml GM-CSF和10,000个TF-1/孔。更严格条件：500pg/mlGM-CSF和1,000个TF-1/孔。非常严格条件：500pg/ml GM-CSF和10,000个TF-1/孔。
实施例9：GM-CSF与多特异性抗体的免疫复合物结合至Fcγ受体IIa和IIb
为了解决Fcγ受体的接合，测试在GM-CSF与多特异性抗体之间形成的免疫复合物被结合至表达FcγRIIa和FcγRIIb受体的TZM-bl细胞的能力。多特异性抗体与0.05μg/ml的GM-CSF或染色缓冲液混合。样品在37℃下培育30min以允许形成免疫复合物，并且然后在将它们加入至TZM-bl细胞之前至冷却至4℃持续30分钟。洗涤细胞两次并且利用抗-人IgGFcγ片段特异性F(ab’)2片段进行染色。在BD FACSCanto(BD Biosciences)上分析样品并且平均荧光强度被分析并且在样品之间进行比较。观察到了由GM-CSF与不同多特异性抗体在FcγRIIa-和FcγRIIb-表达细胞上形成的免疫复合物的强结合(表11)。具体而言，Ts3GC2d和Bs1GC3a显示了在GM-CSF存在下最强结合至FcγRIIa和FcγRIIb，而它们在不存在GM-CSF下较差地结合相同的FcR(图7)。综合起来，上述结果暗示具有多特异性单克隆抗体的免疫复合物中的GM-CSF可以从人体通过Fc依赖性机制清除。
表11.由GM-CSF和不同多特异性mAb形成的免疫复合物与表达FcγRIIa或FcγRIIb的TZM-bl细胞的结合，如通过流式细胞术使用抗-IgG Fc特异性抗体测量的。显示了单独多特异性抗体或与低(1∶10mAb:GM-CSF比率)或高GM-CSF浓度(1∶1mAb:GM-CSF比率)复合的多特异性抗体的平均荧光强度(MFI)，和在存在和不存在GM-CSF下结合的平均比率。深灰色单元格表示与多特异性抗体——其在不存在GM-CSF下较差地结合至FcR——形成的GM-CSF复合物。
序列表格和SEQ ID编号
*以黑体强调的序列是CDR区(核苷酸或aa)并且与“种系”序列相比，加下划线的残基是突变的残基。

Claims (32)

1.分离的多特异性抗-细胞因子抗体或其抗原结合片段，其包括：
(a)至少两个不同的表位结合位点，它们中的每个特异性地结合至细胞因子的单独表位，其中与所述至少两个不同的表位结合位点结合的所述细胞因子的单独表位是非重叠表位；和
(b)Fc部分。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于所述抗体或其抗原结合片段是双特异性的、三特异性的、四特异性的或五特异性的，优选地所述抗体或其抗原结合片段是双特异性的、三特异性的或四特异性的，更优选地所述抗体或其抗原结合片段是双特异性的或三特异性的，甚至优选地所述抗体或其抗原结合片段是三特异性的。
3.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于所述抗体分子精确地包括每个不同表位结合位点特异性地结合至细胞因子中的至少两个不同的非重叠表位的两个拷贝。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于所述抗-细胞因子抗体选自抗-集落刺激因子抗体和抗-干扰素抗体，优选地所述抗-细胞因子抗体是抗-GM-CSF抗体和抗-干扰素β抗体。
5.根据权利要求4所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于所述抗-细胞因子抗体是抗-GM-CSF抗体。
6.根据权利要求5所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于所述抗体是双特异性四价抗体或三特异性六价抗体。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于所述抗体或其抗原结合片段进一步包括：
(c)至少一个连接体。
8.根据权利要求7所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于所述连接体包括根据SEQID NO:143或SEQ ID NO:144或其功能序列变体的氨基酸序列或由其组成。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于所述抗体或其抗原结合片段具有IgG类型，优选地具有IgG1类型，更优选地包括IgG1CH1-CH2-CH3类型的重链恒定区和IgG CK类型的轻链恒定区，甚至更优选地包括IgG1CH1-CH2-CH3类型的重链恒定区和IgG CK类型的轻链恒定区，所述IgG1CH1-CH2-CH3类型的重链恒定区包括根据SEQ ID NO:140或其功能序列变体的氨基酸序列或由其组成，所述IgG CK类型的轻链恒定区包括根据SEQ ID NO:141或其功能序列变体的氨基酸序列或由其组成。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于所述抗体或其抗原结合片段具有选自Bs1、Bs2、Bs3、Ts1、Ts2和Ts3的构建体类型。
11.根据权利要求10所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于所述抗体或其抗原结合片段根据构建体类型Ts3，优选地所述抗体或其抗原结合片段是根据所述构建体类型Ts3的三特异性抗体。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于所述抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体或其抗原结合片段。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于所述抗体或其抗原结合片段中和所述细胞因子
(i)在严格条件下，具有150ng/ml或更低的IC90；
(ii)在较低严格条件下，具有20ng/ml或更低的IC90；
(iii)在更严格条件下，具有160ng/ml或更低的IC90；和/或
(iv)在非常严格条件下，具有1000ng/ml或更低的IC90。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于所述抗体或抗原结合片段包括含有至少一个CDRH1、至少一个CDRH2和至少一个CDRH3的重链以及含有至少一个CDRL1、至少一个CDRL2和至少一个CDRL3的轻链，其中所述至少一个重链CDRH3包括根据SEQ ID NO:3、51、69或107或其功能序列变体的氨基酸序列，优选地所述至少一个重链CDRH3包括根据SEQ ID NO:3或69或其功能序列变体的氨基酸序列。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于所述抗体或其抗原结合片段包括：
(i)分别根据SEQ ID NO:1-5和7或其功能序列变体，或根据SEQ ID NO:1-4和6-7或其功能序列变体的CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列以及CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列；
(ii)分别根据SEQ ID NO:49-53和55或其功能序列变体，或根据SEQ ID NO:49-52和54-55或其功能序列变体的CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列以及CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列；
(iii)分别根据SEQ ID NO:67-71和73或其功能序列变体，或根据SEQ ID NO:67-70和72-73或其功能序列变体的CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列以及轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列；和/或
(iv)分别根据SEQ ID NO:105-109和111或其功能序列变体，或根据SEQ ID NO:105-108和110-111或其功能序列变体的重链CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列以及轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于所述抗体或抗原结合片段包括：
(i)根据SEQ ID NO:37或其功能序列变体的VH氨基酸序列和根据SEQ ID NO:38或其功能序列变体的VL氨基酸序列；
(ii)根据SEQ ID NO:63或其功能序列变体的VH氨基酸序列和根据SEQ ID NO:64或其功能序列变体的VL氨基酸序列；
(iii)根据SEQ ID NO:95或其功能序列变体的VH氨基酸序列和根据SEQ ID NO:96或其功能序列变体的VL氨基酸序列；和/或
(iv)根据SEQ ID NO:130或其功能序列变体的VH氨基酸序列和根据SEQ ID NO:131或其功能序列变体的VL氨基酸序列。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于所述抗体或抗原结合片段的重链包括选自根据SEQ ID NO:4、52、70、108或其功能序列变体的氨基酸序列的CDRL1氨基酸序列，选自根据SEQ ID NO:5、6、53、54、71、72、109、110或其功能序列变体的氨基酸序列的CDRL2氨基酸序列，和/或选自根据SEQ ID NO:7、55、73、111或其功能序列变体的氨基酸序列的CDRL3氨基酸序列。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于所述抗体或抗原结合片段的重链包括选自根据SEQ ID NO:38、64、96、131或其功能序列变体的氨基酸序列的VL氨基酸序列，优选地所述抗体或抗原结合片段的重链包括根据SEQ ID NO:38或96或其功能序列变体的VL氨基酸序列，更优选地所述抗体或抗原结合片段的重链包括根据SEQ ID NO:96或其功能序列变体的VL氨基酸序列。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于
(i)所述抗体或抗原结合片段具有选自构建体类型Bs1、Bs2、Bs3、Ts1、Ts2和Ts3的构建体类型；和
(ii)在位置A和/或C的任一个处包括CDRH1氨基酸序列、CDRH2氨基酸序列、CDRH3氨基酸序列、CDRL1氨基酸序列、CDRL2氨基酸序列和CDRL3氨基酸序列，其选自根据SEQ ID NO:1-7和67-73或其功能序列变体的氨基酸序列；优选地在位置A处包括根据SEQ ID NO:67-71和73或其功能序列变体或根据SEQ ID NO:67-70和72-73或其功能序列变体的CDRH1氨基酸序列、CDRH2氨基酸序列、CDRH3氨基酸序列、CDRL1氨基酸序列、CDRL2氨基酸序列和CDRL3氨基酸序列。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于所述抗体或其抗原结合片段根据gTs1GC1、gTs1GC2a、gTs2GC2b、gTs2GC2c、gTs3GC2d、gTs3GC2e、gBs3GC1a、gBs3GC1b、gBs2GC1c、gBs2GC1d、gBs1GC2a、gBs3GC2b、gBs1GC3a、gBs3GC3b、gBs3GC4和gBs3GC5，优选地其根据gTs3GC2d或gBs1GC3a。
21.根据权利要求20所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于所述抗体或其抗原结合片段是Ts1GC1、Ts1GC2a、Ts2GC2b、Ts2GC2c、Ts3GC2d、Ts3GC2e、Bs3GC1a、Bs3GC1b、Bs2GC1c、Bs2GC1d、Bs1GC2a、Bs3GC2b、Bs1GC3a、Bs3GC3b、Bs3GC4和Bs3GC5，优选地Ts3GC2d或Bs1GC3a。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于所述抗体或抗原结合片段是人抗体、单克隆抗体、人单克隆抗体、纯化的抗体或单链抗体。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其用作药物。
24.根据权利要求1-22中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其用于预防、治疗或缓解炎性疾病和/或自身免疫疾病。
25.一种核酸分子，其包括编码根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸。
26.根据权利要求25所述的核酸分子，其中所述多核苷酸序列包括根据SEQ ID NO:8-36、39-48、56-62、65-66、74-94、97-104、112-129、132-139、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190中任一个或其功能序列变体的核酸序列或由其组成。
27.根据权利要求26所述的核酸分子，其中所述多核苷酸序列包括根据SEQ ID NO:39-48、65-66、97-104、132-139、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190中任一个或其功能序列变体的核酸序列或由其组成。
28.一种载体，其包括根据权利要求25-27中任一项所述的核酸分子。
29.一种细胞，其表达根据权利要求1-24中任一项所述的抗体或其抗原结合片段；或包括根据权利要求28所述的载体。
30.一种分离的或纯化的免疫原性多肽，其包括特异性地结合至根据权利要求1-24中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的至少两个表位。
31.一种药物组合物，其包括根据权利要求1-24中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、根据权利要求25-27所述的核酸、根据权利要求28所述的载体、根据权利要求29所述的细胞或根据权利要求30所述的免疫原性多肽，和药学上可接受的赋形剂、稀释剂或运载体。
32.根据权利要求1-24中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、根据权利要求25-27所述的核酸、根据权利要求28所述的载体、根据权利要求29所述的细胞、或根据权利要求30所述的免疫原性多肽或根据权利要求31所述的药物组合物在(i)预防、治疗或缓解炎性疾病和/或自身免疫疾病中；或(ii)在诊断炎性疾病和/或自身免疫疾病中的用途。
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