CN110799546B - 重组双特异性抗体 - Google Patents

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Abstract

提供了一种针对CTLA‑4和PDL‑1的重组双特异性抗体，编码抗体的核酸分子，包含该核酸分子的载体和宿主细胞，以及制备该抗体的方法。还提供了包含该双特异性抗体的药物组合物，以及该双特异性抗体在制备药物组合物中的用途。

Description

重组双特异性抗体
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别是预防和/或治疗与CTLA-4和/或PDL-1相关的疾病的领域。具体而言，本发明涉及特异性结合CTLA-4和PDL-1，或PDL-1和CTLA-4的双特异性抗体。
背景技术
PD-1/PDL-1信号通路在调节免疫耐受、微生物感染及肿瘤免疫逃逸中发挥重要作用。PD-1(programmed cell death 1，程序性细胞死亡因子1)的表达主要在T细胞等免疫细胞，而PD-1的配体PDL-1主要在许多人类肿瘤组织呈高表达。应用免疫组织化学方法，已先后在乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌、食管癌、卵巢癌、宫颈癌、肾癌、膀胱癌、胰腺癌、神经胶质瘤、黑素瘤等多种人类肿瘤组织中检测到PDL-1蛋白的表达，且PDL-1的表达水平和患者的临床及预后紧密相关。
阻断PD-1/PDL-1信号通路可使被抑制的T细胞激活，进而攻击癌细胞。阻断PD-1/PDL-1信号可以促进肿瘤抗原特异性T细胞的增殖，发挥杀伤肿瘤细胞的作用，进而抑制局部肿瘤生长(Julie R et al.,2012，N Engl J Med.366:2455–2465)；PDL-1单抗可上调浸润CD8+T细胞IFN-γ的分泌，表明PD-1/PDL-1信号通路的阻断在以诱导免疫应答为目的的肿瘤免疫应答中发挥作用(Blank C et al.,2006，Int.J.Cancer.119:317–327)。
另外，PDL-1在体内还可以与B7-1结合。已有研究表明PDL-1/B7-1复合物也是T细胞活化的负信号，二者的结合可以导致T细胞表面活化标记物的表达下降，抑制T细胞增殖等。
细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(cytotoxic T lymphocyte associatedantigen-4，亦简称为CTLA-4)与CD28分子在基因结构、染色体定位、序列的同源性及基因表达具有十分相近的关系，都是共刺激分子B7的受体，主要表达于被激活T细胞表面。CTLA-4与B7结合后能抑制小鼠和人T细胞的激活，在T细胞活化中起负调节作用。
目前，药品审批部门在CTLA-4靶点上批准了Ipilimumab
Figure GDA0002329075410000021
在PD-1和PDL-1靶点上批准了Nivolumab
Figure GDA0002329075410000022
和Pembrolizumab
Figure GDA0002329075410000023
Atezolizumab
Figure GDA0002329075410000024
Durvalumab
Figure GDA0002329075410000025
等。
Ipilimumab
Figure GDA0002329075410000026
抗体被FDA批准用于治疗晚期黑色素瘤，但该抗体注射液存在严重的甚至致命的免疫介导性不良反应。这些免疫介导性不良反应可能涉及到任何器官系统；然而，最常见的严重的免疫介导性不良反应为小肠结肠炎、肝炎、皮炎(包括中毒性表皮坏死松懈症)、神经病及内分泌病。大多数这些免疫介导性反应最初出现在治疗过程中；而另外一小部分则发生于停药后的几星期内。对于严重的免疫介导性反应，应永久停用
Figure GDA0002329075410000027
并开始进行全身性大剂量的进行糖皮质激素治疗。
双特异性抗体(BsAb)是一类具有双亲嗜性的组合抗体，通常是双价的(也有四价和六价的)，即有两条抗原结合臂，具有结合两种不同特异性抗原的功能。中国专利申请CN106967172A公开了抗CTLA-4-抗PD-1双功能抗体、其药物组合物及其用途，CN104987421A也公开了特异结合PD-1和/或CTLA-4的双重可变结构域免疫球蛋白。与此同时施贵宝2017年8月公布了其Opdivo/Yervoy组合作为一线疗法在晚期肾癌(RCC)病人与Sutent(舒尼替尼)比较的三期临床CM214的顶层数据。Opdivo/Yervoy组合的应答率为41.6％，Sutent为26.5％，达到这个一级终点。但是这个组合错过mPFS(中位无进展生存期)这个一级终点(11.6vs 8.4个月，但未达到统计显著)。阿斯列康2017年7月公布了其PDL-1抗体Durvalumab(商品名Imfinzi)与CTLA-4抗体Tremelimumab组合在一个叫做Mystic的三期临床中期分析结果。这个试验比较Durva/Treme组合和标准化疗在PDL-1>25％一线NSCLC病人对PFS(无进展生存期)和OS(总生存期)的影响，结果这个组合没有改善PFS(试验一级终点之一)。已有数据显示Durvalumab单方改善PFS机会也很小(试验二级终点之一)。
因此，对于自身免疫性疾病或肿瘤等疾病仍有未满足的需求，发展创新的、能更为有效、且副作用更小的治疗方法和药物是迫切而必要的。
发明内容
在本申请中，发明人通过大量的研究开发了一种双特异性结合CTLA-4和PDL-1，或PDL-1和CTLA-4的双特异性抗体，编码双特异性抗体的核酸分子，包含核酸分子的载体，制备双特异性抗体的方法，包含双特异性抗体的药物组合物，药物组合物的在制备药物中的用途，双特异性抗体在诊断/治疗/预防与CTLA-4和PDL-1相关的疾病(例如自身免疫性疾病或肿瘤)中的用途或方法，以及包含双特异性抗体的试剂盒。
双特异性抗体
因此，在一个方面，本发明提供了一种双特异性抗体，其包含同时结合抗原PDL-1和抗原CTLA-4的蛋白或多肽。
在某些优选的实施方案中，所述双特异性抗体包含：
1)特异性结合第一抗原的第一抗体，所述第一抗体包括重链(HC)和轻链(LC)；和
2)特异性结合第二抗原的包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体片段(例如Fv，scFv，di-scFv)；
其中，所述抗体片段连接于第一抗体的重链或轻链的N端或C端；
所述第一抗原为CTLA-4，并且所述第二抗原为PDL-1；或者，第一抗原为PDL-1，并且所述第二抗原为CTLA-4。
在某些优选的实施方案中，所述抗体片段为scFv。
在某些优选的实施方案中，所述双特异性抗体包含1个所述第一抗体和2个所述scFv；并且，所述第一抗体包括两条HC和两条LC，其中所述第一抗体的一条HC的重链可变区(VH)与一条LC的轻链可变区(VL)形成抗原结合部位，另一条HC的重链可变区(VH)与另一条LC的轻链可变区(VL)形成抗原结合部位。
在某些优选的实施方案中，每个所述scFv分别连接于所述第一抗体的两条重链或两条轻链的N端或C端。
在某些优选的实施方案中，每个所述scFv分别连接于所述第一抗体的两条重链的N端。在某些优选的实施方案中，每个所述scFv分别连接于所述第一抗体的两条重链的C端。在某些优选的实施方案中，第一抗原为PDL-1，所述第二抗原为CTLA-4，且所述结合第二抗原的scFv连接于所述第一抗体的两条重链的C端。
在某些优选的实施方案中，每个所述scFv分别连接于所述第一抗体的两条轻链的N端。在某些优选的实施方案中，每个所述scFv分别连接于所述第一抗体的两条轻链的C端。
在某些优选的实施方案中，一个所述scFv连接于所述第一抗体的重链或轻链的N端，另一个所述scFv连接于所述第一抗体的重链或轻链的C端。
在某些优选的实施方案中，本发明双特异性抗体，包含：
1)特异性结合第一抗原的第一抗体，所述第一抗体包括重链(HC)和轻链(LC)；和2)特异性结合第二抗原的scFv；所述双特异性抗体包含1个所述第一抗体和2个所述scFv；并且，所述第一抗体包括两条HC和两条LC，其中所述第一抗体的一条HC的VH与一条LC的VL形成抗原结合部位，另一条HC的VH与另一条LC的VL形成抗原结合部位；每个所述scFv分别连接于所述第一抗体的两条重链的N端；或者，每个所述scFv分别连接于所述第一抗体的两条重链的C端；所述第一抗原为PDL-1，并且所述第二抗原为CTLA-4。在某些优选的实施方案中，所述每个scFv通过接头S1与所述第一抗体的每条重链的N端或C端连接。在某些优选的实施方案中，所述scFv的由VH与VL通过S2接头连接。在某些优选的实施方案中，所述scFv的结构为NH2-VL-S2-VH-COOH，其中所述S2为接头。
在某些优选的实施方案中，所述第一抗体的重链包含重链可变区(VH)和CH1结构域，并且所述轻链包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)。在此类实施方案中，所述第一抗体可以为Fab片段、Fab’片段或F(ab’)2片段。在某些优选的实施方案中，所述第一抗体的重链包含重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)，并且所述轻链包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)。在此类实施方案中，所述第一抗体可以为全长抗体。
在某些优选的实施方案中，所述第一抗体的重链为IgG同种型，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4；优选为人IgG同种型。在某些实施方案中，所述第一抗体的重链为人IgG1同种型。在某些优选的实施方案中，所述第一抗体的轻链为Kappa同种型，优选为人Kappa同种型。
在某些优选的实施方案中，所述第一抗体的两条HC包含相同的CDR；和/或，所述第一抗体的两条LC包含相同的CDR。
在某些优选的实施方案中，所述第一抗体的两条HC包含相同的VH；和/或，所述第一抗体的两条LC包含相同的VL。
在某些优选的实施方案中，所述第一抗体的两条HC具有相同的氨基酸序列；和/或，所述第一抗体的两条LC具有相同的氨基酸序列。
在某些优选的实施方案中，两个所述scFv具有相同或不相同的氨基酸序列。在某些优选的实施方案中，两个所述scFv具有相同的氨基酸序列。
在某些优选的实施方案中，所述双特异性抗体包含两条第一多肽链和两条第二多肽链，其中对于所述每条多肽链：
a)所述第一多肽链各自独立地包含所述第一抗体的重链(HC)和所述scFv；和
b)所述第二多肽链各自独立地包含所述第一抗体的轻链(LC)；
其中，所述scFv通过接头S1与所述第一抗体的HC的N端或C端相连。
在某些优选的实施方案中，所述双特异性抗体包含两条第一多肽链和两条第二多肽链，其中对于所述每条多肽链：
i)所述第一多肽链各自独立地包含所述第一抗体的轻链(LC)和所述scFv；和
ii)所述第二多肽链各自独立地包含所述第一抗体的重链(HC)；
其中，所述scFv通过接头S1与所述第一抗体的LC的N端或C端相连。
在某些优选的实施方案中，所述scFv的N端或C端与接头S1的C端或N端连接。
在某些优选的实施方案中，所述scFv具有结构：NH2-VH-S2-VL-COOH或NH2-VL-S2-VH-COOH，其中所述S2为接头。
在某些优选的实施方案中，所述接头S1和/或S2为肽接头，例如具有如(GmSn)x所示的氨基酸序列，其中m、n各自独立地选自1～8的整数(例如，1、2、3、4、5、6、7或8)，x独立地选自1～20的整数(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)。在某些优选的实施方案中，所述接头S1和/或S2具有如(G4S)x所示的氨基酸序列，x独立地选自1-6的整数。
在某些优选的实施方案中，所述接头S1和/或S2具有选自下列的氨基酸序列：SEQID NO:25、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27。
在某些优选的实施方案中，所述接头S2具有如(G4S)4所示的氨基酸序列，即GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:25)。在某些优选的实施方案中，当所述scFv与所述第一抗体的重链或轻链的N端连接时，所述接头S1具有如(G4S)3所示的氨基酸序列，即GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:26)；当所述scFv与所述第一抗体的重链或轻链的C端连接时，所述接头S1具有如(G4S)2所示的氨基酸序列，即GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:27)。
在某些优选的实施方案中，所述scFv的VH与VL之间存在二硫键。在抗体的VH和VL之间引入二硫键的方法是本领域熟知的，例如可参见美国专利申请US5,747,654；Rajagopal等人，Prot.Engin.10(1997)1453-1459；Reiter等人，Nature Biotechnology 14(1996)1239-1245；Reiter等人，Protein Engineering 8(1995)1323-1331；Webber等人，Molecular Immunology32(1995)249-258；Reiter等人，Immunity 2(1995)281-287；Reiter等人，JBC269(1994)18327-18331；Reiter等人，Inter.J.of Cancer 58(1994)142-149；或，Reiter等人，Cancer Res.54(1994)2714-2718；其通过引用并入本文。
在某些优选的实施方案中，所述scFv的位于VH第44位的氨基酸和位于VL第100位的氨基酸分别为半胱氨酸，其中提及的氨基酸位置是根据Kabat编号系统的位置；并且，所述scFv的VH与VL通过分别位于VH第44位和VL第100位的2个半胱氨酸残基之间所形成的二硫键连接。
在某些优选的实施方案中，所述第一抗体特异性结合CTLA-4，并且所述scFv特异性结合PDL-1，其中所述scFv包含：
如SEQ ID NO:1所示的HCDR1；如SEQ ID NO:2所示的HCDR2；以及，如SEQ ID NO:3所示的HCDR3；如SEQ ID NO:4所示的LCDR1；如SEQ ID NO:5所示的LCDR2；以及，如SEQ IDNO:6所示的LCDR3。
在某些优选的实施方案中，所述第一抗体特异性结合CTLA-4，并且所述scFv特异性结合PDL-1，其中：
所述第一抗体包含：
如SEQ ID NO:13所示的HCDR1；如SEQ ID NO:14所示的HCDR2；以及，如SEQ ID NO:15所示的HCDR3；如SEQ ID NO:16所示的LCDR1；如SEQ ID NO:17所示的LCDR2；以及，如SEQID NO:18所示的LCDR3；
和/或，
所述scFv包含：
如SEQ ID NO:1所示的HCDR1；如SEQ ID NO:2所示的HCDR2；以及，如SEQ ID NO:3所示的HCDR3；如SEQ ID NO:4所示的LCDR1；如SEQ ID NO:5所示的LCDR2；以及，如SEQ IDNO:6所示的LCDR3。
在某些优选的实施方案中，所述第一抗体包含：如SEQ ID NO:13所示的HCDR1；如SEQ ID NO:14所示的HCDR2；以及，如SEQ ID NO:15所示的HCDR3；如SEQ ID NO:16所示的LCDR1；如SEQ ID NO:17所示的LCDR2；以及，如SEQ ID NO:18所示的LCDR3；并且，所述scFv包含：如SEQ ID NO:1所示的HCDR1；如SEQ ID NO:2所示的HCDR2；以及，如SEQ ID NO:3所示的HCDR3；如SEQ ID NO:4所示的LCDR1；如SEQ ID NO:5所示的LCDR2；以及，如SEQ ID NO:6所示的LCDR3。
在某些优选的实施方案中，所述第一抗体的重链可变区(VH)的氨基酸序列与SEQID NO:19所示的重链可变区的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性；并且，所述第一抗体的轻链可变区(VL)的氨基酸序列与SEQ ID NO:21所示的轻链可变区的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性；和，所述scFv的重链可变区(VH)的氨基酸序列与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8所示的重链可变区的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性；并且，所述scFv的的轻链可变区(VL)的氨基酸序列与SEQ IDNO:9或SEQ ID NO:10所示的轻链可变区的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性。
在某些优选的实施方案中，所述scFv的重链可变区选自SEQ ID NO:7所示的重链可变区；并且，所述scFv的的轻链可变区选自SEQ ID NO:9所示的轻链可变区。
在某些优选的实施方案中，所述scFv的重链可变区选自SEQ ID NO:8所示的重链可变区；并且，所述scFv的的轻链可变区选自SEQ ID NO:10所示的轻链可变区。
在某些优选的实施方案中，所述第一抗体的重链可变区选自SEQ ID NO:19所示的重链可变区；并且，所述第一抗体的轻链可变区选自SEQ ID NO:21所示的轻链可变区；和，所述scFv的重链可变区选自SEQ ID NO:7所示的重链可变区；并且，所述scFv的的轻链可变区选自SEQ ID NO:9所示的轻链可变区。
在某些优选的实施方案中，所述第一抗体的重链可变区选自SEQ ID NO:19所示的重链可变区；并且，所述第一抗体的轻链可变区选自SEQ ID NO:21所示的轻链可变区；和，所述scFv的重链可变区选自SEQ ID NO:8所示的重链可变区；并且，所述scFv的的轻链可变区选自SEQ ID NO:10所示的轻链可变区。
在某些优选的实施方案中，所述第一抗体包含：如SEQ ID NO:19所示的VH和如SEQID NO:21所示的VL；
并且，所述scFv包含：
(1)如SEQ ID NO:7所示的VH和如SEQ ID NO:9所示的VL；或，
(2)如SEQ ID NO:8所示的VH和如SEQ ID NO:10所示的VL。
在某些优选的实施方案中，所述第一抗体特异性结合PDL-1，并且所述scFv特异性结合CTLA-4，其中：
所述第一抗体包含：
(a)如SEQ ID NO:1所示的HCDR1；如SEQ ID NO:2所示的HCDR2；以及，如SEQ IDNO:3所示的HCDR3；如SEQ ID NO:4所示的LCDR1；如SEQ ID NO:5所示的LCDR2；以及，如SEQID NO:6所示的LCDR3；
和/或，
所述scFv包含：
如SEQ ID NO:13所示的HCDR1；如SEQ ID NO:14所示的HCDR2；以及，如SEQ ID NO:15所示的HCDR3；如SEQ ID NO:16所示的LCDR1；如SEQ ID NO:17所示的LCDR2；以及，如SEQID NO:18所示的LCDR3。
在某些优选的实施方案中，所述第一抗体特异性结合PDL-1，并且所述scFv特异性结合CTLA-4，其中所述第一抗体包含：
如SEQ ID NO:1所示的HCDR1；如SEQ ID NO:2所示的HCDR2；以及，如SEQ ID NO:3所示的HCDR3；如SEQ ID NO:4所示的LCDR1；如SEQ ID NO:5所示的LCDR2；以及，如SEQ IDNO:6所示的LCDR3。
在某些优选的实施方案中，所述第一抗体包含：如SEQ ID NO:1所示的HCDR1；如SEQ ID NO:2所示的HCDR2；以及，如SEQ ID NO:3所示的HCDR3；如SEQ ID NO:4所示的LCDR1；如SEQ ID NO:5所示的LCDR2；以及，如SEQ ID NO:6所示的LCDR3；并且，所述scFv包含：如SEQ ID NO:13所示的HCDR1；如SEQ ID NO:14所示的HCDR2；以及，如SEQ ID NO:15所示的HCDR3；如SEQ ID NO:16所示的LCDR1；如SEQ ID NO:17所示的LCDR2；以及，如SEQ IDNO:18所示的LCDR3。
在某些优选的实施方案中，所述第一抗体的重链可变区(VH)的氨基酸序列与SEQID NO:7所示的重链可变区的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性；并且，所述第一抗体的的轻链可变区(VL)的氨基酸序列与SEQ ID NO:9所示的轻链可变区的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性；和，所述scFv的重链可变区(VH)的氨基酸序列与SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20所示的重链可变区的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性；并且，所述scFv的的轻链可变区(VL)的氨基酸序列与SEQ IDNO:21或SEQ ID NO:22所示的轻链可变区的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性。
在某些优选的实施方案中，所述第一抗体的重链可变区选自SEQ ID NO:7所示的重链可变区；并且，所述第一抗体的轻链可变区选自SEQ ID NO:9所示的轻链可变区。
在某些优选的实施方案中，所述第一抗体的重链可变区选自SEQ ID NO:7所示的重链可变区；并且，所述第一抗体的轻链可变区选自SEQ ID NO:9所示的轻链可变区；和，所述scFv的重链可变区选自SEQ ID NO:19所示的重链可变区；并且，所述scFv的的轻链可变区选自SEQ ID NO:21所示的轻链可变区。
在某些优选的实施方案中，所述第一抗体的重链可变区选自SEQ ID NO:7所示的重链可变区；并且，所述第一抗体的轻链可变区选自SEQ ID NO:9所示的轻链可变区；和，所述scFv的重链可变区选自SEQ ID NO:20所示的重链可变区；并且，所述scFv的的轻链可变区选自SEQ ID NO:22所示的轻链可变区。
在某些优选的实施方案中，所述第一抗体包含：如SEQ ID NO:7所示的VH和如SEQID NO:9所示的VL；
并且，所述scFv包含：
(1)如SEQ ID NO:19所示的VH和如SEQ ID NO:21所示的VL；或，
(2)如SEQ ID NO:20所示的VH和如SEQ ID NO:22所示的VL。
在某些优选的实施方案中，所述双特异性抗体包含两条相同的第一多肽链和两条相同的第二多肽链。
在某些优选的实施方案中，所述第一多肽链具有选自下列的氨基酸序列：SEQ IDNOs:28,29任一项所示的氨基酸序列；和/或，所述第二多肽链具有选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NOs:11，23任一项所示的氨基酸序列。
在某些优选的实施方案中，所述双特异性抗体包含：
(1)如SEQ ID NO:28所示的第一多肽链和如SEQ ID NO:11所示的第二多肽链；
(2)如SEQ ID NO:29所示的第一多肽链和如SEQ ID NO:11所示的第二多肽链；
(3)如SEQ ID NO:28所示的第一多肽链和如SEQ ID NO:23所示的第二多肽链；
(4)如SEQ ID NO:29所示的第一多肽链和如SEQ ID NO:23所示的第二多肽链；
在某些实施方式中，本发明双特异性抗体中所述第一抗体包含：如Uniprot的Entry号P01857所示的CH；和/或，如Uniprot的Entry号P01834所示的CL。可选的，所述CH还可以包含如下突变：在UniProt的Entry号P01857的CH中第117,118，120位突变为A；或，在UniProt的Entry号P01857的CH中第97位突变为R。
在某些实施方案中，本发明的双特异性抗体具有抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性。在某些实施方案中，本发明的双特异性抗体具有抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性，并且还具有补体依赖的细胞毒性(CDC)活性。在某些优选的实施方案中，本发明的双特异性抗体具有增强的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性，和/或具有增强的补体依赖性细胞毒性(CDC)活性。在某些优选的实施方案中，所述增强的ADCC和/或CDC活性是由双特异性抗体的第一抗体CH发生突变导致。
另一方面，本发明的双特异性抗体，具有与所述第一抗体的亲本抗体相比同等或更弱的结合第一抗原的活性；在某些优选的实施方案中，本发明的双特异性抗体，具有与所述scFv的亲本抗体相比同等或更弱的结合第二抗原的活性；在某些优选的实施方案中，本发明的双特异性抗体，具有与所述第一抗体的亲本抗体相比同等或更弱的结合第一抗原的活性，且具有与所述scFv的亲本抗体相比同等或更弱的结合第二抗原的活性；在某些优选的实施方案中，本发明的双特异性抗体，具有与所述第一抗体的亲本抗体相比同等的结合第一抗原的活性，且具有与所述scFv的亲本抗体相比更弱的结合第二抗原的活性；在某些优选的实施方案中，本发明的双特异性抗体，具有与结合PDL-1的亲本抗体相比同等的结合活性；在某些优选的实施方案中，本发明的双特异性抗体，具有与结合CTLA-4的亲本抗体相比更弱的结合活性；在某些优选的实施方案中，本发明的双特异性抗体，具有与结合PDL-1的亲本抗体相比同等的结合活性，且具有与结合CTLA-4的亲本抗体相比更弱的结合活性。
另一方面，本发明的双特异性抗体对CTLA-4和PDL-1具有亲和力。在某些优选的实施方案中，本发明的双特异性抗体对CTLA-4和PDL-1具有与其各自的亲本抗体相比同等亲和力。在某些优选的实施方案中，本发明的双特异性抗体对PDL-1具有与其亲本抗体相比同等的亲和力。在某些优选的实施方案中，本发明的双特异性抗体对CTLA-4具有与其亲本抗体相比同等的亲和力。在某些优选的实施方案中，本发明的双特异性抗体对CTLA-4具有与其亲本抗体相比更弱的亲和力。在某些优选的实施方案中，本发明的双特异性抗体对PDL-1具有与其亲本抗体相比同等的亲和力，对CTLA-4具有与其亲本抗体相比更弱的亲和力。
另一方面，本发明的双特异性抗体具有良好的热稳定性。在某些优选的实施方案中，本发明的双特异性抗体具有与亲本抗体相比基本相同的热稳定性。
双特异性抗体的表达
在另一个方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，其包含编码本发明的双特异性抗体的核苷酸序列。在某些优选的实施方案中，所述分离的核酸分子编码本发明的双特异性抗体。
在某些优选的实施方案中，所述分离的核酸分子包含编码本发明的第一多肽链的核苷酸序列。在某些优选的实施方案中，所述分离的核酸分子包含编码本发明的第二多肽链的核苷酸序列。在某些优选的实施方案中，所述分离的核酸分子包含编码本发明的第一多肽链的核苷酸序列和编码本发明的第二多肽链的核苷酸序列。
在另一个方面，本发明提供了一种载体(例如克隆载体或表达载体)，其包含本发明的分离的核酸分子。
在某些优选的实施方案中，所述载体包含编码本发明的第一多肽链的核苷酸序列。在某些优选的实施方案中，所述载体包含编码本发明的第二多肽链的核苷酸序列。在某些优选的实施方案中，所述载体包含编码本发明的第一多肽链的核苷酸序列和编码本发明的第二多肽链的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中，本发明的载体是例如质粒，粘粒，噬菌体等。在某些优选的实施方案中，所述载体能够在受试者(例如哺乳动物，例如人)体内表达本发明的双特异性抗体、第一多肽链或第二多肽链。
在另一个方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含本发明的分离的核酸分子或本发明的载体。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。在某些优选的实施方案中，本发明的宿主细胞是哺乳动物细胞，例如CHO(例如CHO-K1、CHO-S、CHO DG44)或HEK293。
在另一个方面，本发明提供了制备本发明的双特异性抗体的方法，其包括，在允许所述双特异性抗体表达的条件下，培养本发明的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述双特异性抗体。
在某些优选的实施方案中，所述方法包括：
(1)构建包含编码第一多肽链的核苷酸序列和编码第二多肽链的核苷酸序列的表达载体；或，构建包含编码第一多肽链的核苷酸序列的第一表达载体和包含编码第二多肽链的核苷酸序列的第二表达载体；
(2)将步骤(1)中所述的表达载体转化至宿主细胞；或，将步骤(1)中所述的第一表达载体和第二表达载体转化至宿主细胞；
(3)在允许本发明的双特异性抗体表达的条件下，培养步骤(2)中所述的宿主细胞；和
(4)从培养的宿主细胞培养物中回收所述双特异性抗体。
治疗方法和药物组合物
本发明的双特异性抗体可用于体外或在受试者体内中抑制CTLA-4和PDL-1的活性，阻断CTLA-4和/或PDL-1信号通路，以及用于预防和/或治疗与CTLA-4和/或PDL-1相关的疾病(例如自身免疫性疾病或肿瘤或传染病)。
因此，在另一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其含有本发明的双特异性抗体，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。在某些优选的实施方案中，所述药物组合物还可以包含另外的药学活性剂。在某些优选的实施方案中，所述另外的药学活性剂是用于预防和/或治疗与CTLA-4和/或PDL-1相关的疾病(例如自身免疫性疾病或肿瘤或传染病)的药物，例如抗炎药物或免疫抑制剂，例如非甾体抗炎药(如布洛芬、双氯芬酸、萘普生、吲哚美辛、吡罗昔康、美洛昔康、萘丁美酮或尼美舒利)、甾体抗炎药(如强的松、地塞米松或氢化考的松)、致炎性细胞因子的抗体或拮抗剂等。
在另一个方面，本发明提供了本发明的双特异性抗体或本发明的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于在受试者(例如人)中预防和/或治疗与CTLA-4和/或PDL-1相关的疾病(如自身免疫性疾病或肿瘤或传染病)，和/或用于体外或在受试者(例如人)体内抑制CTLA-4和/或PDL-1的活性。
在另一个方面，本发明提供了一种用于在受试者(例如人)中预防和/或治疗与CTLA-4和/或PDL-1相关的疾病(如自身免疫性疾病或肿瘤或传染病)，和/或用于体外或在受试者(例如人)体内抑制CTLA-4和/或PDL-1的活性的方法，其中所述方法包括，给有此需要的受试者施用有效量的本发明的双特异性抗体，或者本发明的药物组合物。
在本发明中，所述与CTLA-4和/或PDL-1相关的疾病包括但不限于如自身免疫性疾病或肿瘤或传染病病，例如肿瘤，包括但不限于：腺癌、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、肉瘤，或包括但不限于肾上腺、胆囊、骨、骨髓、脑、乳腺、胆管、胃肠道、心脏、肾脏、肝脏、肺、肌肉、卵巢、胰腺、甲状旁腺、阴茎、前列腺、皮肤、唾液腺、脾脏、睾丸、胸腺、甲状腺和子宫相关的肿瘤，传染病包括但不限于乙肝，甲肝，HIV。
本发明的双特异性抗体或者本发明的药物组合物可以配制成医学领域已知的任何剂型，例如，片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射剂(包括注射液、注射用无菌粉末与注射用浓溶液)、吸入剂、喷雾剂等。优选剂型取决于预期的给药方式和治疗用途。本发明的药物组合物应当是无菌的并在生产和储存条件下稳定。一种优选的剂型是注射剂。此类注射剂可以是无菌注射溶液。例如，可通过下述方法来制备无菌注射溶液：在适当的溶剂中掺入必需剂量的本发明的双特异性抗体，以及任选地，同时掺入其他期望的成分(包括但不限于，pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，等渗剂、防腐剂、稀释剂，或其任何组合)，随后过滤除菌。此外，可以将无菌注射溶液制备为无菌冻干粉剂(例如，通过真空干燥或冷冻干燥)以便于储存和使用。此类无菌冻干粉剂可在使用前分散于合适的载体中，例如无菌无热原水。
此外，本发明的双特异性抗体可以以单位剂量形式存在于药物组合物中，以便于施用。在某些实施方案中，所述单位剂量为至少1mg，至少2mg，至少3mg，至少4mg，至少5mg，至少6mg，至少7mg，至少8mg，至少9mg，至少10mg，至少15mg，至少20mg，至少25mg，至少30mg，至少45mg，至少50mg，至少75mg，或至少100mg。在所述药物组合物为液体(例如，注射剂)剂型的情况下，其可以包含浓度至少为0.1mg/ml，如至少0.25mg/ml，至少0.5mg/ml，至少1mg/ml，至少2.5mg/ml，至少5mg/ml，至少8mg/ml，至少10mg/ml，至少15mg/ml，至少25mg/ml，至少50mg/ml，至少75mg/ml，或至少100mg/ml的本发明的双特异性抗体。
本发明的双特异性抗体或药物组合物可以通过本领域已知的任何合适的方法来施用，包括但不限于，口服、口腔、舌下、眼球、局部、肠胃外、直肠、叶鞘内、内胞浆网槽内、腹股沟、膀胱内、局部(如，粉剂、药膏或滴剂)，或鼻腔途径。但是，对于许多治疗用途而言，优选的给药途径/方式是胃肠外给药(例如静脉注射，皮下注射，腹膜内注射，肌内注射)。技术人员应理解，给药途径和/或方式将根据预期目的而发生变化。在一个优选的实施方案中，本发明的双特异性抗体或药物组合物通过静脉输注或注射给予。
本发明所提供的药物、药物组合物或双特异性抗体可以单独使用或联合使用，也可以与另外的药学活性剂(如自身免疫性疾病或肿瘤或传染病)联合使用。在某些优选的实施方案中，将本发明的双特异性抗体与其它抗炎药物或免疫抑制剂联合使用，以预防和/或治疗与CTLA-4和/或PDL-1相关的疾病(如自身免疫性疾病或肿瘤或传染病)。这种另外的药学活性剂可以在施用本发明的双特异性抗体或本发明的药物组合物之前、同时或之后施用。
本发明的药物组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明的双特异性抗体。“预防有效量”是指，足以预防，阻止，或延迟疾病(例如与CTLA-4和/或PDL-1相关的疾病)的发生的量。“治疗有效量”是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。本发明的双特异性抗体的治疗有效量可根据如下因素发生变化：待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。
在本发明中，可调整给药方案以获得最佳目的反应(例如治疗或预防反应)。例如，可以单次给药，可以在一段时间内多次给药，或者可以随治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。
本发明的双特异性抗体的治疗或预防有效量的典型非极限范围是0.02～50mg/kg，例如0.1～50mg/kg，0.1～25mg/kg，或1～10mg/kg。应注意的是，剂量可随需要治疗的症状的类型和严重性不同而发生变化。此外，本领域技术人员理解，对于任一特定患者，特定的给药方案应根据患者需要和医生的专业评价而随时间调整；此处给出的剂量范围只用于举例说明目的，而不限定本发明药物组合物的使用或范围。
在本发明中，所述受试者可以为哺乳动物，例如人。
检测/诊断方法和试剂盒
本发明的双特异性抗体能够特异性结合CTLA-4和/或PDL-1，从而可用于检测CTLA-4和/或PDL-1在样品中的存在或其水平，以及诊断受试者是否患有与CTLA-4和/或PDL-1相关的疾病(如自身免疫性疾病或肿瘤或传染病)。
因此，在另一个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括本发明的双特异性抗体。在某些优选的实施方案中，本发明的双特异性抗体带有可检测的标记。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别本发明的双特异性抗体的第一抗体或scFv。优选地，所述第二抗体还包括可检测的标记。
在本发明中，所述可检测的标记可以是可通过荧光、光谱、光化学、生物化学、免疫学、电学、光学或化学手段检测的任何物质。特别优选的是，此类标记能够适用于免疫学检测(例如，酶联免疫测定法、放射免疫测定法、荧光免疫测定法、化学发光免疫测定法等)。这类标记是本领域熟知的，包括但不限于，酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶，等)、放射性核素(例如，3H、125I、35S、14C或32P)、荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素(FITC)、荧光素、异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC)、藻红蛋白(PE)、德克萨斯红、罗丹明、量子点或花菁染料衍生物(例如Cy7、Alexa 750))、吖啶酯类化合物、磁珠(例如，
Figure GDA0002329075410000161
)、测热标记物例如胶体金或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶，等)珠、以及用于结合上述标记物修饰的亲和素(例如，链霉亲和素)的生物素。教导该标记物的使用的专利包括，但不限于，美国专利3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149；及4,366,241(全部通过引用并入本文)。本发明中涵盖的标记物可通过本领域已知的方法检测。例如，放射性标记可使用摄影胶片或闪烁计算器检测，荧光标记物可使用光检测器检测，以检测发射的光。酶标记物一般通过给酶提供底物及检测通过酶对底物的作用产生的反应产物来检测，及测热标记物通过简单可视化着色标记物来检测。在某些实施方案中，可通过不同长度的接头将如上所述的可检测的标记连接至本发明的双特异性抗体，以降低潜在的位阻。
在另一个方面，本发明提供了检测CTLA-4和/或PDL-1在样品中的存在或其水平的方法，其包括使用本发明的双特异性抗体的步骤。在一个优选的实施方案中，本发明的双特异性抗体还带有可检测的标记。在另一个优选的实施方案中，所述方法还包括，使用带有可检测的标记的试剂来检测本发明的双特异性抗体段。所述方法可以用于诊断目的，或者非诊断目的(例如，所述样品是细胞样品，而非来自患者的样品)。
在另一个方面，本发明提供了诊断受试者是否患有与CTLA-4和/或PDL-1相关的疾病(如自身免疫性疾病或肿瘤或传染病)的方法，其包括：使用本发明的双特异性抗体检测CTLA-4和/或PDL-1在来自所述受试者的样品中的存在或其水平。在一个优选的实施方案中，本发明的双特异性抗体还带有可检测的标记。在另一个优选的实施方案中，所述方法还包括，使用带有可检测的标记的试剂来检测本发明的双特异性抗体的步骤。
在另一个方面，提供了本发明的双特异性抗体在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测CTLA-4和/或PDL-1在样品中的存在或其水平，或用于诊断受试者是否患有与CTLA-4和/或PDL-1相关的疾病(如自身免疫性疾病或肿瘤或传染病)。
术语定义
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、生物化学、核酸化学、免疫学实验室等操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
在本文中，“PDL-1”也被称为“程序性死亡配体1(Programmed death-ligand 1)”、“程序性细胞死亡配体1(Programmed cell death ligand 1)”、“蛋白质PD-L1”、“PD-L1”、“PDL1”、“PDCDL1”、“hPD-L1”、“hPD-LI”、“CD274”及“B7-H1”，并且可互换的使用。
如本文中所使用的，术语“抗体”是指，通常由两对多肽链(每对具有一条轻链(LC)和一条重链(HC))组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ(kappa)和λ(lambda)轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗原结合部位。氨基酸至各区域或结构域的分配可遵循Kabat,Sequences of Proteins ofImmunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987and1991))，或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature342:878-883的定义。
如本文中所使用的，术语“互补决定区”或“CDR”是指抗体可变区中负责抗原结合的氨基酸残基，其通常可包括，轻链可变区中的残基24-34{LCDR1}、50-56{LCDR2}、89-97{LCDR3}以及重链可变区中的残基31-35{HCDR1}、50-65{HCDR2}、95-102{HCDR3}(参见例如，Kabat等，Sequences of Proteins of lmmunological lnterest，第五版，PublicHealth Service，美国国立卫生研究院，贝塞斯达、马里兰州(1991))，或者轻链可变区中的残基26-32{Ll}、50-52{L2}、91-96{L3}以及重链可变区中的残基26-32{H1}、53-55{H2}、96-101{H3}(参见，Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。或,CDR可以通过本领域技术人员所熟知的技术手段，例如通过VBASE2数据库根据IMGT定义分析下面的重链可变区的氨基酸序列或者轻链可变区的氨基酸序列得到。
如本文中所使用的，术语“构架区”或“FR”残基是指，抗体可变区中除了如上定义的CDR残基以外的那些氨基酸残基。
术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。
如本文中所使用的，术语“抗原结合部位”是指，由重链以及轻链的可变区(VH和VL)的氨基酸残基所形成的、参与进行抗原结合的部分，其包含那些与抗原相互作用且决定了该抗体对抗原的特异性及亲和力的氨基酸残基。所述抗原结合部位还可以包含那些对维持上述直接结合抗原的氨基酸残基的合适构象所必需的框架区的氨基酸残基。
如本文中所使用的，术语“全长抗体”意指，由两条“全长重链”和两条“全长轻链”组成的抗体。其中，“全长重链”是指这样的多肽链，其在N端到C端的方向上由重链可变区(VH)、重链恒定区CH1结构域、铰链区(HR)、重链恒定区CH2结构域、重链恒定区CH3结构域组成；并且，当所述全长抗体为IgE同种型时，任选地还包括重链恒定区CH4结构域。优选地，“全长重链”是在N端到C端方向上由VH、CH1、HR、CH2和CH3组成的多肽链。“全长轻链”是在N端到C端方向上由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成的多肽链。两对全长抗体链通过在CL和CH1之间的二硫键和两条全长重链的HR之间的二硫键连接在一起。本发明的全长抗体可以来自单一物种，例如人；也可以是嵌合抗体或人源化抗体。本发明的全长抗体包含分别由VH和VL对形成的两个抗原结合部位，这两个抗原结合部位特异性识别/结合相同的抗原。
如本文中所使用的，术语“Fab片段”意指由VL、VH、CL和CH1结构域组成的抗体片段；术语“Fab'片段”意指还原连接F(ab')2片段中两个重链片段的二硫键后所获片段，由一条完整的轻链和重链的Fd片段(由VH和CH1结构域组成)组成；术语“F(ab')2片段”意指包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的抗体片段。上述各个抗体片段均保持了特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合。
如本文中所使用的，术语“scFv”是指，包含VL和VH结构域的单个多肽链，其中所述VL和VH通过接头(linker)相连(参见，例如,Bird等人,Science 242:423-426(1988)；Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883(1988)；和Pluckthun，ThePharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Roseburg和Moore编，Springer-Verlag，纽约，第269-315页(1994))。此类scFv分子可具有一般结构：NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。本发明的scFv的VH与VL之间还可以存在二硫键。在抗体的VH和VL之间引入二硫键的方法是本领域熟知的，例如可参见美国专利申请US5,747,654；Rajagopal等人，Prot.Engin.10(1997)1453-1459；Reiter等人，Nature Biotechnology 14(1996)1239-1245；Reiter等人，Protein Engineering 8(1995)1323-1331；Webber等人，Molecular Immunology 32(1995)249-258；Reiter等人，Immunity 2(1995)281-287；Reiter等人，JBC 269(1994)18327-18331；Reiter等人，Inter.J.of Cancer58(1994)142-149；或，Reiter等人，Cancer Res.54(1994)2714-2718；其通过引用并入本文。如本文中所使用的，术语“di-scFv”是指，由两个scFv连接形成的抗体片段。
如本文中所使用的，术语“Fv片段”意指由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的抗体片段。
如本文中所使用的，术语“亲本抗体”是指，用于制备本发明的双特异性抗体的抗PDL-1抗体或抗CTLA-4抗体，该抗体所具有的氨基酸序列可通过例如氨基酸置换或结构改变等方式以用于制备本发明的双特异性抗体所包含的第一抗体或scFv。
本发明的双特异性抗体所包含的CDR、VH、VL、CH、CL、HC、LC还可以来自其他被本领域所知晓的能够特异性结合PDL-1或CTLA-4的抗体或其抗体片段，或者与上述已知抗体、其抗体片段或其CDR、VH、VL、CH、CL、HC、LC具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的抗体。
如本文中所使用的，术语“接头”是指，由多个氨基酸残基通过肽键连接形成的线性多肽。本发明的接头可以为人工合成的氨基酸序列，或天然存在的多肽序列，例如具有铰链区功能的多肽。此类接头多肽是本领域众所周知的(参见例如，Holliger,P.等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448；Poljak,R.J.等人(1994)Structure 2:1121-1123))。
如本文中所使用的，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的亲和力(KD)结合该抗原。在本发明中，术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。通常，抗体(例如，本发明的抗体)以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的解离平衡常数(KD)结合抗原(例如，HBsAg)，例如，如使用表面等离子体共振术(SPR)在BIACORE仪中测定的。
如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。
如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。
如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.ApplBiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weight residue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoIBiol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。
本文涉及的二十个常规氨基酸的编写遵循常规用法。参见例如，Immunology-ASynthesis(2nd Edition,E.S.Golub and D.R.Gren,Eds.,Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991))，其以引用的方式并入本文中。在本发明中，术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。
如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19thed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，稀释剂，维持渗透压的试剂，延迟吸收的试剂，防腐剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液。表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80。离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。维持渗透压的试剂包括但不限于糖、NaCl及其类似物。延迟吸收的试剂包括但不限于单硬脂酸盐和明胶。
如本文中使用的，术语“受试者”是指哺乳动物，例如灵长类哺乳动物，例如人。在某些实施方式中，所述受试者(例如人)患有与CTLA-4和/或PDL-1相关的疾病，或者，具有患有上述疾病的风险。通常而言，这类疾病或疾病状态的特征是其将受益于CTLA-4和/或PDL-1水平的降低或CTLA-4和/或PDL-1活性的抑制从而得到缓解或治愈。
如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病(例如与CTLA-4和/或PDL-1相关的疾病)有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病(例如与CTLA-4和/或PDL-1相关的疾病)的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。
如本文中所使用的，术语“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)”是指，一种细胞毒性形式，Ig通过与细胞毒性细胞(例如自然杀伤(NK)细胞、中性粒细胞或巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)结合，使这些细胞毒性效应细胞特异性结合到抗原附着的靶细胞上，然后通过分泌细胞毒素杀死靶细胞。检测抗体的ADCC活性的方法是本领域已知的，例如可通过测定待测抗体与Fc受体(例如CD16a)之间的结合活性来评价。
如本文中所使用的，术语“补体依赖的细胞毒性(CDC)”是指，通过使补体成分C1q与抗体Fc结合来激活补体级联的细胞毒性形式。检测抗体的CDC活性的方法是本领域已知的，例如可通过测定待测抗体与Fc受体(例如C1q)之间的结合活性来评价。
发明的有益效果
与现有技术相比，本发明的技术方案至少具有以下有益效果：
本发明的双特异性抗体不仅能够特异性识别/结合CTLA-4和PDL-1，而且其对CTLA-4和PDL-1的亲和力与其各自的亲本抗体相当，或对CTLA-4的亲和力比其亲本抗体减弱，在体外和受试者体内能够显著且同时抑制CTLA-4和/或PD–L1的活性，阻断CTLA-4和/或PD–L1信号通路。并且，本发明的双特异性抗体还具有与第一抗体的亲本抗体同等优良的热稳定性。尤其令人意外的是，在部分细胞水平及体内实验中，本发明的双特异性抗体甚至展现出了明显优于其亲本抗体的抑制活性和降低的抗体毒性反应，提升了药物的安全性。因此，本发明的双特异性抗体具有用于治疗与CTLA-4和PDL-1相关的疾病(如自身免疫性疾病或肿瘤或传染病)的潜力，具有重大的临床价值。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得可实施。
附图说明
图1显示了抗PDL-1和CTLA-4重组双特异抗体AB03和AB04结构示意图。
图2显示了AB03和AB04的还原SDS-PAGE电泳图，从左至右泳道为：AB01还原，AB02还原，AB03还原，AB04还原。
图3显示了抗体与PDL-1结合活性曲线。
图4中的图4A和图4B显示了抗体与不同批次CTLA-4结合活性曲线。
图5显示了抗体同时与PDL-1和CTLA-4结合活性曲线。
图6显示了抗体阻断PD-1与PDL-1结合活性曲线。
图7显示了抗体与CD16a(Val)结合活性曲线。
图8显示了抗体与C1q结合活性曲线。
图9显示了抗体阻断PD1/PDL-1细胞结合活性曲线。
图10显示了抗体在SEB刺激PBMC下增强T细胞分泌IL-2的活性图。
图11显示了AB01对非小细胞肺癌模型的疗效。
图12显示了抗体在结肠癌小鼠模型中的疗效。
图13显示了抗体在非小细胞肺癌小鼠模型中的疗效。
序列信息
本发明涉及的部分序列的信息提供于下面的表1中。
表1：序列的描述
Figure GDA0002329075410000241
Figure GDA0002329075410000251
*注：AB01-scFv表示亲本抗体AB01来源的scFv，其可变区与AB01的区别在于：该scFv的VH第44位和VL第100位氨基酸分别为半胱氨酸；AB02-scFv表示亲本抗体AB02来源的scFv，其可变区与AB02的区别在于：该scFv的VH第44位和VL第100位氨基酸分别为半胱氨酸；其他类似的表述具有类似的含义。
具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。
除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John Wiley&Sons,Inc.，1995中所述的方法进行；限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。
实施例1：编码抗PDL-1/CTLA-4重组双特异性抗体的表达载体的构建
在本实施例中，表2中所示的抗CTLA-4亲本抗体(AB02)从施贵宝公司购买，首先通过DNA重组技术，获得表2中所示的抗PDL-1亲本抗体(AB01)，然后分别构建包含编码第一多肽链的核苷酸序列的表达载体和编码第二多肽链的核苷酸序列的表达载体，以获得本发明的重组抗体AB03和AB04。
各亲本抗体AB01和AB02可变区及恒定区序列参照表2。亲本抗体(AB01)的编码核酸序列由南京金斯瑞生物技术服务公司全基因合成，克隆到PUC19载体上。
表2：亲本抗体及PDL-1/CTLA-4重组双特异性抗体的可变区及恒定区序列
Figure GDA0002329075410000252
Figure GDA0002329075410000261
注：数据库收录号为Uniprot的收录号。
按照表3中所示各重组抗体的构建方式构建编码该重组抗体的第一多肽链的核苷酸序列和编码第二多肽链的核苷酸序列。其中，对于各重组抗体中的scFv，其VL、VH通过肽接头S2(SEQ ID NO:25，氨基酸序列为：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS)相连接，并且通过PCR定点突变方法将该scFv的亲本抗体的VH第44位和VL第100位氨基酸分别突变为半胱氨酸(Cys，C)，从而使得该scFv的VH与VL之间形成二硫键。其中突变后的AB01-scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示，突变后VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示，突变后VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。其中突变后的AB02-scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示，突变后VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示，突变后VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示。
表3中所示各重组抗体的构建方式例举见图1。
表3：各重组抗体的构建方式
Figure GDA0002329075410000262
具体而言，作为示例地部分重组抗体的核酸构建体的构建方式如下：
将编码AB02-scFv的核苷酸序列通过编码SEQ ID NO:26所示接头S1的核苷酸序列连接于编码AB01的VH的核苷酸序列的5’端，然后连接于重链恒定区UniProt P01857的编码核苷酸序列的5’端，构建编码AB03的第一多肽链的核苷酸序列；其中AB02-scFv从N端到C端的顺序为VL-S2-VH，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示。
将编码AB01轻链的核苷酸序列作为ABO3的第二多肽链的编码核苷酸序列。
将AB01的VH的核苷酸序列连接于重链恒定区UniProt P01857的编码核苷酸序列的5’端，通过编码SEQ ID NO:27所示接头S1的核苷酸序列连接于编码AB02-scFv的核苷酸序列的5’端，构建编码AB04的第一多肽链的核苷酸序列；其中AB02-scFv从N端到C端的顺序为VL-S2-VH，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示。
将编码AB01轻链的核苷酸序列作为ABO4的第二多肽链的编码核苷酸序列。
将编码上述各第一多肽链或第二多肽链的核苷酸序列与编码IgG-Kappa信号肽的核苷酸序列连接(氨基酸序列SEQ ID NO:30)，并通过同源重组的方式分别导入pTT5质粒，以构建编码第一多肽链的表达载体及编码第二多肽链的表达载体pTT5。最终获得的各重组抗体的氨基酸序列如表4所示。
表4:各重组抗体的氨基酸序列
Figure GDA0002329075410000271
实施例2：抗PDL-1/CTLA-4重组双特异性抗体的表达
将生长状态良好、处于对数期的CHO-S细胞(购自Thermo公司，货号A1155701)，离心并按3.5×106细胞/ml接种250mlCHOgro培养基(购自MIRUS公司)。将实施例1中获得的待转染质粒通过0.22μm滤膜除菌过滤，取125μg第一多肽链重组质粒及125μg相应的第二多肽链重组质粒，加入25ml CHOgro复合物形成溶液(CHOgro Complex Formation Solution，购自MIRUS公司)，加入1mg/ml PEIMAX(购自polysciencse公司)1.25ml，震荡混匀三次，静置10min，加入到250ml上述细胞培养物中。将培养物置于37℃、5％CO2摇床培养，24h后加入20ml 10％Sheff-CHO PF ACF(购自KERRY公司)，继续培养7天后收获细胞培养物。
实施例3：抗PDL-1/CTLA-4重组双特异性抗体的纯化
取实施例2中表达7天的CHO-S细胞培养物，先低速离心分离上清与细胞沉淀；再高速离心，得到澄清的料液。通过亲和层析法(Protein A)和离子交换两步法进行重组抗体的纯化，纯化中使用的介质分别是GE公司生产的Mab Select SuRe和Millipore公司生产的Eshmuno CPX。各重组双特异性抗体表达产量基本一致，均在40-85mg/L区间，且和同等条件抗PDL-1亲本抗体AB01的表达水平保持一致，说明各重组抗体均可成功表达，且具有较高的表达效率，具体表达水平见表5。分离纯化的重组抗体通过超滤管浓缩并换液到PBS溶液中，还原SDS-PAGE电泳显示如图2所示，AB01、AB02还原后为50kDa(重链)及25kDa(轻链)；双特异抗体AB03、AB04还原条带大小为75kDa(第一肽链)及25kDa(第二肽链)，并且SEC纯度分别为96.34％和96.04％。条带大小符合预期，说明重组各双特异性抗体均能高效表达，正确装配，且无明显聚集降解，说明稳定性良好。
表5：重组双特异性抗体的表达水平
抗体名称 获得蛋白量 表达产量
AB01 20.5mg 60mg/L
AB03 22.6mg 83mg/L
AB04 12.2mg 42mg/L
实施例4：抗PDL-1/CTLA-4重组双特异性抗体的抗原结合活性检测
本实施例以ELISA的方式分别检测各重组双特异性抗体与其亲本抗体结合相同抗原的亲和力的差异，以及重组双特异性抗体同时结合两种抗原的相对亲和力高低，以验证单独封闭一种抗原能力比亲本抗体是否有所下降；是否能同时封闭两种抗原，阻断两种信号通路，从而产生协同作用。
4.1重组双特异性性抗体对PDL-1的结合活性检测
将重组PDL-1-mFc蛋白(获得自科伦博泰uniport号：Q9NZQ7)以100ng/孔加入96孔酶标板(购自thermo公司)，4℃包被过夜；次日，弃孔内溶液，用洗涤缓冲液(含有0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液)洗1次，拍干；加入含2％BSA的PBS溶液，100μl/孔，37℃封闭2h后拍干；重组双特异性抗体AB03、AB04以及亲本抗体AB01以1000ng/ml起始，分11个浓度点做3倍稀释，100μl/孔；将酶标板放入37℃孵育2h，拍干，洗涤缓冲液洗涤3次；加入HRP偶联GoatAnti-Human IgG(H+L)溶液，100μl/孔，37℃孵育1h；100μl/孔加入TMB溶液，室温反应约5min；100μl/孔加入终止液，并放入酶标仪，读OD450吸光值。实验数据通过曲线拟合，如图3所示，并计算EC50。
EC50结果如表6所示，所检测的重组双特异抗体结合PDL-1-mFc的活性EC50与亲本抗体AB01抗PDL-1-mFc的EC50相当，表明本发明的重组抗体整体上保持了与亲本抗体同等优良的对PDL-1-mFc的结合活性。
表6：重组抗体对PDL-1-mFc的结合活性
重组抗体/亲本抗体 EC50(pM)
AB01 15.55
AB03 21.46
AB04 32.43
4.2重组双特异性抗体对CTLA-4的结合活性检测
分别将两批次的重组CLTA-4-His蛋白(获得自科伦博泰,uniport号：P16410)用PBS稀释,100ng/孔加入96孔酶标板，4℃包被过夜；次日，弃孔内溶液，用洗涤缓冲液洗1次，拍干；加入含2％BSA的PBS溶液，100μl/孔，37℃封闭2h后拍干；重组双特异性抗体AB03、AB04以及抗CTLA-4亲本抗体AB02以30nM起始，分11个梯度做4倍稀释，100μl/孔；将酶标板放入37℃孵育2h，拍干，洗涤缓冲液洗涤3次；加入HRP偶联Goat Anti-Human IgG(H+L)溶液，37℃孵育1h；加入TMB溶液，室温反应约8min；加入终止液，并放入酶标仪，读OD450吸光值。实验数据通过曲线拟合，两批次的重组CLTA-4-His结合活性检测结果分别如图4A和图4B所示，并计算EC50。
EC50结果如表7所示。
表7：重组抗体对CTLA-4的结合活性
CLTA-4-His蛋白批号 批次一 批次二
重组抗体/亲本抗体 EC50(pM) EC50(pM)
AB02 55.93 42.38
AB03 107.5 86.17
AB04 600.2 531.3
根据实验结果可知，所检测的的重组双特异抗体AB03结合CTLA-4的EC50与亲本抗体AB02相比略有升高，而重组双特异抗体AB04结合CTLA-4的EC50约是亲本抗体AB02的10-12倍，可见AB04结合CTLA-4的活性明显弱于亲本抗体，但仍然具有pM级别的高效结合活性。
4.3重组双特异性抗体同时结合PDL-1及CTLA-4的活性检测
将重组PDL-1-mFc蛋白以100ng/孔，4℃过夜包被于96孔酶标板；次日，弃孔内溶液，用洗涤缓冲液(含有0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液)洗1次，拍干；加入含2％BSA的PBS溶液，100μl/孔，37℃封闭2h后拍干；重组双特异性抗体以10000ng/ml起始，分11个梯度做5倍稀释，100μl/孔；将酶标板放入37℃孵育2h，拍干，洗涤缓冲液洗涤3次；每孔加CTLA-4-His蛋白1.5μg/ml，100μl/孔，37℃孵育2h，拍干，洗涤缓冲液洗涤3次；加入HRP偶联GoatAnti-His(购自BioLegend公司)溶液，37℃孵育1h；加入TMB溶液，室温反应约5min；加入终止液，并放入酶标仪，读OD450吸光值。实验数据通过曲线拟合，如图5所示，并计算EC50。
EC50结果如表8所示，重组双特异性抗体AB03及AB04同时结合PDL-1及CTLA-4两种抗原EC50都在pM级，上述结果表明本发明的重组双特异性抗体结合一种抗原后，不影响第二种抗原结合，AB03及AB04等重组双特异性抗体都能同时高效的结合两种抗原，可以通过同时封闭肿瘤免疫中起关键作用的PDL-1及CTLA-4靶点，以同时抑制两条信号通路，从而在肿瘤治疗中起到药效协同作用。
表8：重组双特异性抗体同时结合PDL-1及CTLA-4的活性
重组双特异抗体名称 EC50(pM)
AB03 16.24
AB04 12.98
实施例5：重组双特异性抗体阻断PD-1/PDL-1结合活性竞争ELISA检测
本实施例中，通过竞争ELISA检测重组双特异性抗体是否能阻断PD1和PDL-1的结合。
将重组PD1-hFc蛋白(购自北京义翘神州公司)以100ng/孔加入96孔酶标板(购自thermo公司)，4℃包被过夜；次日，弃孔内溶液，用洗涤缓冲液(含有0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液)洗1次，拍干；加入含2％BSA的PBS溶液，100μl/孔，37℃封闭2h后拍干；重组双特异性抗体AB03、AB04以及亲本抗体AB01以10μg/ml起始，分11个梯度做1.5倍稀释，加入等体积1.6μg/ml PDL-1-mFC(获得自科伦博泰)混匀室温放置30min，然后加入100μl/孔至酶标板中；将酶标板放入37℃孵育2h，拍干，洗涤缓冲液洗涤3次；加入HRP偶联Goat Anti-mouseIgG(H+L)(购自thermo公司)溶液，100μl/孔，37℃孵育1h；100μl/孔加入TMB溶液，室温反应约5min；100μl/孔加入终止液，并放入酶标仪，读OD450吸光值。实验数据通过曲线拟合，如图6所示，并计算EC50。
EC50结果如表9所示，所检测的重组双特异抗体AB03、AB04阻断PDL-1结合PD1的活性EC50与抗PDL-1亲本抗体AB01相比表现更强，表明本发明的重组双特异抗体整体上保持了与亲本抗体同等或更优良的对PDL-1结合PD1的阻断活性。
表9：重组抗体对PDL-1/PD1的阻断活性
重组抗体/亲本抗体 EC50(nM)
AB01 3.82
AB03 2.60
AB04 1.84
实施例6：重组双特异性抗体的CDC、ADCC活性ELISA检测
本实施例为验证重组双特异性抗体ADCC、CDC活性，通过ELISA实验检测重组双特异性抗体分别与CD16a(Val)、C1q的结合。
6.1重组双特异性抗体对CD16a(Val)的结合活性检测
将重组CD16a(Val)蛋白(购自义翘神州公司)以100ng/孔加入96孔酶标板(购自thermo公司)，4℃包被过夜；次日，弃孔内溶液，用洗涤缓冲液(含有0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液)洗1次，拍干；加入含2％BSA的PBS溶液，100μl/孔，25℃封闭2h后拍干；重组双特异性抗体AB03、AB04以及亲本抗体AB01和阳性对照抗体Human IgG1(获得自科伦博泰)以50μg/ml，加入Goat F(ab)2anti-Human Kappa(购自BIORAD公司)37℃交联反应1h，然后分11个梯度做3倍稀释，100μl/孔；将酶标板放入25℃孵育2h，拍干，洗涤缓冲液洗涤3次；加入1:10000HRP偶联F(ab)2亲和纯化F(ab’)2片段化山羊抗人IgG二抗(购自Jackson公司)溶液，100μl/孔，25℃孵育1h；拍干，洗涤缓冲液洗涤5次；100μl/孔加入TMB溶液，室温反应约30min；100μl/孔加入终止液，并放入酶标仪，读OD450吸光值。实验数据通过曲线拟合，如图7。
结果如图7所示，所检测的重组双特异抗体AB03、AB04具有结合CD16a(Val)蛋白的活性，并且与Human IgG1相当，而AB01几乎与CD16a(Val)不结合，表明本申请重组双特异抗体具有ADCC活性。
6.2重组双特异性抗体对C1q的结合活性检测
将重组双特异性抗体AB03、AB04以及亲本抗体AB01和阳性对照抗体Human IgG1(获得自科伦博泰)以500μg/mL起始，分11个梯度做3倍稀释，100μl/孔，加入96孔酶标板，4℃包被过夜。次日，弃孔内溶液，用洗涤缓冲液洗1次，拍干；加入含2％BSA的PBS溶液，100μl/孔，37℃封闭2h后拍干。含2％BSA的PBS溶液稀释C1q(购买PROSPEC公司)3μg/mL，100μl/孔；将酶标板放入37℃孵育2h，拍干，洗涤缓冲液洗涤3次；加入1:200稀释HRP抗C1q抗体(购买Abcam公司)溶液，100μl/孔，37℃孵育1h；拍干，洗涤缓冲液洗涤5次，加入TMB溶液，室温反应约5min；加入终止液，并放入酶标仪，读OD450吸光值。实验数据通过曲线拟合,如图8。
结果如图8所示，所检测的重组双特异抗体AB03、AB04结合C1q蛋白的活性与HumanIgG1相比更强，表明其具有更强的CDC活性。
实施例7：热变性温度Tm检测
7.1DSF(差示扫描荧光法)测定重组双特异性抗体的Tm值
将重组双特异性抗体及亲本抗体AB01用PBS溶液稀释至1mg/ml，将
Figure GDA0002329075410000331
橙色蛋白凝胶染色液(Orange Protein Gel Stain，购自Thermo公司，货号S6651)用蒸馏水稀释40倍。取0.2ml离心管，依次加入稀释样品12.5μl，
Figure GDA0002329075410000332
橙色蛋白凝胶染色液4.2μl，蒸馏水8.3μl。混匀后放入荧光定量PCR仪(购自Thermo公司，型号7500),设置反应参数25℃3min,以1％速率上升至95℃，95℃ 2min。
7.2DSC(差示扫描量热法)测定重组双特异性抗体的Tm值
将重组双特异性抗体用PBS溶液稀释至1mg/ml，9μl/孔，放入高通量蛋白稳定分析仪(UNCHAINED LABS公司，型号Uncle),设置反应参数25℃到95℃，速率0.3℃/min。
DSF与DSC结果如表10所示，所述重组双特异性抗体AB03、AB04的热稳定性良好，其中，AB03热稳定性优于AB04，与亲本抗体AB01、AB02的Tm值更为相近，本发明所述重组双特异性抗体整体上具有良好热稳定性。
表10：重组双特异性抗体的热变性温度
重组抗体/亲本抗体 AB01 AB02 AB03 AB04
DSF Tm(℃) 77.6 75.2 71.8 68.7
DSC Tm1(℃) 72.0 未检测 74.6 71.0
DSC Tm2(℃) 81.3 未检测 82.1 79.8
实施例8：重组双特异性抗体的阻断PD1/PDL-1细胞活性
报告基因法来检测PD-1/PDL-1抗体的生物活性。CHO-PDL-1-CD3L细胞系稳定表达PDL-1和anti-CD3-scFv，作为靶细胞；Jurkat-PD-1-NFAT细胞系稳定表达PD-1和荧光素酶(luciferase)，荧光素酶基因受NFAT元件(转录因子)调控(IL-2启动子)，作为效应细胞。PD-1与PDL-1结合可以阻断CD3下游信号的转导，从而抑制荧光素酶的表达，当加入PD-1抗体或者PDL-1抗体时，这种Block效应被反转，荧光素酶可以表达，从而检测到荧光信号。
具体实验步骤:取Jurkat-PD1NFAT细胞、CHO-S-OKT3-PDL1细胞(购买Promega公司)，200g离心5min，检测缓冲液RPMI1640+1％FBS重悬。CHO-S-OKT3-PDL1细胞5×105个/40μL/孔铺板。Jurkat-PD1-NFAT细胞2.5×106个/40μL/孔加入至预先铺好CHO-S-OKT3-PDL1细胞的孔中，加入40μL 100μg/mL起始5倍稀释的重组双特异性抗体AB03、AB04以及AB01抗体。共孵育6小时后取出，室温放置20min,加入60μL检测试剂Bright-Glo Luciferase(购自Promega公司)，室温震荡5min，酶标仪(BMG公司，PHEARstar FS)上机检测。实验数据通过GraphPad prism5拟合曲线并计算EC50，如图9所示。
结果如表11所示，所检测的重组双特异抗体AB03、AB04阻断PDL-1结合PD1的细胞活性EC50与抗PDL-1亲本抗体AB01相当，表明本发明的重组双特异抗体整体上保持了与亲本抗体同等优良的对PDL-1结合PD1的阻断细胞活性。
表11：重组抗体对PDL-1/PD1的阻断活性
重组抗体/亲本抗体 EC50(nM)
AB01 1.68
AB03 1.82
AB04 1.53
实施例9：重组双特异性抗体在SEB刺激PBMC下增强T细胞分泌IL-2的活性
超抗原(SEB)可以交联APC细胞的MHC II与T细胞的TCR来激活T细胞，促进IL-2细胞因子表达。T细胞上PD1与APC细胞上PDL-1结合、T细胞上CTLA-4与APC细胞上CD80/CD86结合会抑制T细胞激活,降低IL-2细胞因子表达。本发明所述重组双特异性抗体能阻断PD1/PDL-1及CTLA-4/CD80(CD86)，能进一步促进SEB刺激PBMC分泌IL-2表达。
具体实验步骤：复苏PBMC细胞，使用5mL RPMI1640+10％FBS(胎牛血清)重悬，细胞活率85％，活细胞密度8×105细胞/ml，37℃CO2培养箱培养大于2小时；120uL细胞悬液，105细胞/孔；配制RPMI1640+10％FBS含2.5ng/mL SEB(来自中科院)抗体稀释液，分别稀释重组双特异性抗体AB03、AB04以及对照抗体AB01、AB02，加入80uL至对应孔中；混匀，放于37℃CO2培养箱培养3天；取上清，采用IL-2检测试剂盒(购自CisBio公司)进行IL-2表达量检测。
结果如图10所示，所检测的重组双特异抗体AB03、AB04与亲本抗体AB01、AB02相比，整体上均能大幅提升SEB刺激PBMC分泌IL-2表达。同时在高浓度时，重组双特异抗体和亲本抗体都发挥了最大响应值，在低浓度抗体条件下，重组双特异抗体AB03、AB04比亲本抗体AB01、AB02作用功能有一定的增强(标记星号处)。
实施例10：PDL-1抗体AB01对结肠癌的体内疗效
1.受试药物
AB01，
Figure GDA0002329075410000351
人IgG均由四川科伦药物研究院有限公司提供；其中
Figure GDA0002329075410000352
购自Roche公司，人IgG购自成都蓉生药业有限责任公司。
配制方法：三药均用含0.1％BSA生理盐水稀释成所需浓度。
2.试验细胞和动物
MC-38/H-11细胞是小鼠结肠癌MC-38(购自Cobioer,货号CBP60825)细胞敲除了小鼠内源性PDL-1，转染并表达人PDL-1的单克隆细胞,因此，MC-38/H-11细胞只高表达人PDL-1蛋白。
C57BL/6小鼠，7-8周，♀，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。
3.实验步骤
每只小鼠皮下接种1×105MC-38/H-11细胞，接种后第二天(D0)随机分组并腹腔注射(IP)药物，隔1天1次(Q2D)；溶剂组注射相同体积的人IgG(15mg/kg)，AB01(1.5、5、15mg/kg)、
Figure GDA0002329075410000353
(15mg/kg)，注射体积0.1mL/10g体重。各组均为10只小鼠。
4.实验指标
实验指标为考察药物对肿瘤生长的影响，具体指标为T/C％或抑瘤率TGI(％)。
每周二次用游标卡尺测量肿瘤直径,肿瘤体积(V)计算公式为：
V＝1/2×a×b2，其中a、b分别表示长、宽。
T/C％＝T/C×100,C、T分别为溶剂组和治疗组的肿瘤体积或肿瘤重量。
抑瘤率(TGI)(％)＝(C-T)/C×100,C、T分别为溶剂组和治疗组的肿瘤体积或肿瘤重量。
5.实验结果
如下面的表12所示。
表12：AB01(1.5、5、15mg/kg)、
Figure GDA0002329075410000361
对小鼠结肠癌MC-38/H-11小鼠皮下移植瘤的疗效
Figure GDA0002329075410000362
注：随机分组，第一次给药时间为D0；D27为给药后第27天。
AB01(1.5、5、15mg/kg)对MC-38/H-11小鼠皮下移植瘤的抑瘤率分别为63.9％、75.8％和68.6％(根据平均肿瘤体积计算)；鉴于每组肿瘤的个体差异较大，采用中位肿瘤体积计算抑瘤率比较合理，则抑瘤率调整为100％、100％和100％；参比药物
Figure GDA0002329075410000363
(15mg/kg)对MC-38/H-11的抑瘤率为93.8％(根据中位肿瘤体积计算)；采用中位肿瘤重量计算抑瘤率，则AB01(1.5、5、15mg/kg)对MC-38/H-11的抑瘤率分别为100％、100％、100％，
Figure GDA0002329075410000364
的抑瘤率为93.7％；中位肿瘤体积与中位肿瘤重量计算所得抑瘤率非常一致，说明肿瘤体积测量方法的可靠性。AB01(1.5、5、15mg/kg)不但抑制肿瘤生长，还抑制肿瘤成瘤，实验结束时(D27)，AB01(1.5、5、15mg/kg)剂量组成瘤率分别为40％、40％和40％，
Figure GDA0002329075410000371
组的成瘤率为50％。荷瘤小鼠对以上药物均能很好耐受，没有明显体重减轻等症状发生。相比较，AB01(1.5、5、15mg/kg)对小鼠结肠癌MC-38/H-11小鼠皮下移植瘤较
Figure GDA0002329075410000372
具有更强的抑瘤作用。
实施例11：PDL-1抗体AB01对肺癌的体内疗效
建模方法：将非小细胞肺癌细胞HCC827(购自ATCC货号CRL-2868)皮下接种NOG鼠，构建肺癌荷瘤鼠模型，待肿瘤长到约100mm3,给药前小鼠静脉注射激活后的人PBMCs模拟人免疫系统，然后给药。
给药方案：给药剂量为10mg/kg，静脉注射、每两天一次，共计给药四次。给药后每周两次测定肿瘤体积。分为对照IgG，AB01，
Figure GDA0002329075410000373
三组，每组6只。
肿瘤生长曲线见图11。
结果显示，在第4天开始，AB01组的肿瘤体积明显小于
Figure GDA0002329075410000374
组和IgG对照组，AB01的肿瘤生长几乎被完全抑制，
Figure GDA0002329075410000375
组和IgG对照组肿瘤在不断生长，证明了AB01抗体较
Figure GDA0002329075410000376
具有更强的体内抑瘤作用。
实施例12.重组双特异性抗体在转基因结肠癌小鼠模型的测试
用含10％胎牛血清的RPMI1640培养液，在37℃，5％CO2的条件下培养MC38-1F3细胞,收集指数生长期的MC38-1F3细胞，PBS重悬至适合浓度，接种于雌性研-C57BL/6J-huCTLA-4小鼠(集萃药康)皮下建立结肠癌模型。待肿瘤平均体积约82mm3时，根据肿瘤大小随机分组，分别为静注人免疫球蛋白(阴性对照)组、AB01对照组、AB04抗体的低剂量组和高剂量组，腹腔注射，每周2次，共给药3周。给药后观察并定期测量小鼠肿瘤体积及体重，具体结果见表13，图12。
由试验结果可知，AB04抗体低剂量组(3mg/kg)对MC38-1F3结肠癌移植瘤模型的抗肿瘤药效好于AB01，且其高剂量组(10mg/kg)抗肿瘤药效显著好于低剂量组，抗肿瘤药效显著。所有治疗组在观察期内均无动物死亡及显著动物体重降低，没有表现明显的药物毒性，治疗期间小鼠对AB04抗体耐受性良好。
表13.重组双特异性抗体对小鼠结肠癌疗效
Figure GDA0002329075410000381
实施例13.重组双特异性抗体在转基因非小细胞肺癌小鼠模型的测试
用含10％胎牛血清的RPMI1640培养液，在37℃，5％CO2的条件下培养人非小细胞肺癌细胞株HCC827。收集指数生长期的HCC827细胞，PBS重悬至适合浓度，接种于雌性NSG免疫缺陷小鼠皮下建立移植瘤模型(hPBMC-NSG(百奥赛图)-HCC827人免疫重建模型)。待肿瘤平均体积约77mm3时，根据肿瘤大小随机分组，分别为生理盐水(阴性对照)组、AB01对照组、AB04抗体的低剂量组和高剂量组。用含10％胎牛血清、CD28/CD3和DNase的RPMI1640培养液，在37℃，5％CO2的条件下培养人外周血单核细胞PBMC。经CD3和CD28刺激培养3天后，收集活化的PBMC，用PBS重悬至适合浓度，尾静脉接种于已纳入分组的雌性NSG小鼠体内以重建其免疫系统。分组后尾静脉注射，每周2次，共给药3周。给药后观察并定期测量小鼠肿瘤体积及体重，具体结果见表14，图13。
表14.重组双特异性抗体对转基因非小细胞肺癌小鼠疗效
Figure GDA0002329075410000382
由试验结果可知，AB04抗体低剂量组(1mg/kg)对皮下移植人非小细胞肺癌HCC827的NSG免疫重建小鼠的肿瘤生长有一定抑制作用，高剂量组(10mg/kg)抗肿瘤药效显著。所有治疗组在观察期内均无动物死亡及显著动物体重降低，没有表现明显的药物毒性，治疗期间小鼠对抗体耐受性良好。
实施例14.重组双特异性抗体的毒理试验
为检测重组双特性抗体在食蟹猴体内的毒理情况，本次试验为静脉注射食蟹猴(雌雄各一只)，单次给药，设置给药组AB04，对照组为生理盐水，恢复期14天。实验结果表明:单次静脉注射给予500mg/kg的AB04，食蟹猴对药物耐受性良好，MTD为500mg/kg；重复给药按100mg/kg的剂量，每周1次，连续给药5次，未见明显毒性靶器官和给药部位刺激性，NOAEL(未见毒性反应剂量)为100mg/kg。根据现有FDA公布的研究资料显示，抗CTLA-4抗体Ipilimumab(商品名：Yervoy)的重复给药NOAEL为10mg/kg，(在该剂量下，给药后可见脾脏重量降低，多器官淋巴细胞浸润等轻微毒性反应),MTD为30mg/kg。AB04降低了CTLA-4抗体毒性作用，一定程度上提升了药物的安全性。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川科伦博泰生物医药股份有限公司
<120> 重组双特异性抗体
<160> 32
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<221> UNSURE
<223> AB01 HCDR1
<400> 1
Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr Asp
1 5
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<221> UNSURE
<223> AB01 HCDR2
<400> 2
Ile Trp Thr Gly Gly Ala Thr
1 5
<210> 3
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<221> UNSURE
<223> AB01 HCDR3
<400> 3
Val Arg Asp Ser Asn Tyr Arg Tyr Asp Glu Pro Phe Thr Tyr
1 5 10
<210> 4
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<221> UNSURE
<223> AB01 LCDR1
<400> 4
Gln Ser Ile Gly Thr Asn
1 5
<210> 5
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<221> UNSURE
<223> AB01 LCDR2
<400> 5
Tyr Ala Ser
1
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<221> UNSURE
<223> AB01 LCDR3
<400> 6
Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Tyr Thr
1 5
<210> 7
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<221> UNSURE
<223> AB01 VH
<400> 7
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Asp Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Asn Pro Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Met Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Arg Asp Ser Asn Tyr Arg Tyr Asp Glu Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 8
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<221> UNSURE
<223> AB01突变型VH
<400> 8
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Asp Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Asn Pro Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Met Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Arg Asp Ser Asn Tyr Arg Tyr Asp Glu Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 9
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<221> UNSURE
<223> AB01 VL
<400> 9
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Thr Leu Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn
20 25 30
Ile His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Cys Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 10
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<221> UNSURE
<223> AB01突变型VL
<400> 10
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Thr Leu Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn
20 25 30
Ile His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 11
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<221> UNSURE
<223> AB01 轻链
<400> 11
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Thr Leu Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn
20 25 30
Ile His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 12
<211> 450
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<221> UNSURE
<223> AB01 重链
<400> 12
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Asp Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Asn Pro Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Met Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Arg Asp Ser Asn Tyr Arg Tyr Asp Glu Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 13
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<221> UNSURE
<223> AB02 HCDR1
<400> 13
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Thr
1 5
<210> 14
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<221> UNSURE
<223> AB02 HCDR2
<400> 14
Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys
1 5
<210> 15
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<221> UNSURE
<223> AB02 HCDR3
<400> 15
Ala Arg Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 16
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<221> UNSURE
<223> AB02 LCDR1
<400> 16
Gln Ser Val Gly Ser Ser Tyr
1 5
<210> 17
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<221> UNSURE
<223> AB02 LCDR2
<400> 17
Gly Ala Phe
1
<210> 18
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<221> UNSURE
<223> AB02 LCDR3
<400> 18
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr
1 5
<210> 19
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<221> UNSURE
<223> AB02 VH
<400> 19
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 20
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<221> UNSURE
<223> AB02 突变型VH
<400> 20
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val
35 40 45
Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 21
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<221> UNSURE
<223> AB02 VL
<400> 21
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Phe Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 22
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<221> UNSURE
<223> AB02 突变型VL
<400> 22
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Phe Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 23
<211> 215
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<221> UNSURE
<223> AB02 轻链
<400> 23
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Phe Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 24
<211> 448
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<221> UNSURE
<223> AB02 重链
<400> 24
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 25
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<221> UNSURE
<223> S2
<400> 25
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 26
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<221> UNSURE
<223> S1
<400> 26
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 27
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<221> UNSURE
<223> S1
<400> 27
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 28
<211> 711
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<221> UNSURE
<223> AB03第一多肽链氨基酸序列
<400> 28
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Phe Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
130 135 140
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
145 150 155 160
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val
165 170 175
Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
180 185 190
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
195 200 205
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
210 215 220
Ala Arg Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
225 230 235 240
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
245 250 255
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu
260 265 270
Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe
275 280 285
Ser Leu Ser Asn Tyr Asp Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys
290 295 300
Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Ala Thr Asn Tyr
305 310 315 320
Asn Pro Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys
325 330 335
Asn Gln Val Ser Leu Lys Met Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala
340 345 350
Val Tyr Tyr Cys Val Arg Asp Ser Asn Tyr Arg Tyr Asp Glu Pro Phe
355 360 365
Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
370 375 380
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
385 390 395 400
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
405 410 415
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
420 425 430
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
435 440 445
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
450 455 460
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
465 470 475 480
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
485 490 495
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
500 505 510
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
515 520 525
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
530 535 540
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
545 550 555 560
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
565 570 575
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
580 585 590
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
595 600 605
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
610 615 620
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
625 630 635 640
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
645 650 655
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
660 665 670
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
675 680 685
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
690 695 700
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
705 710
<210> 29
<211> 706
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<221> UNSURE
<223> AB04 第一多肽链氨基酸序列
<400> 29
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Asp Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Asn Pro Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Met Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Arg Asp Ser Asn Tyr Arg Tyr Asp Glu Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu
450 455 460
Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr
465 470 475 480
Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Ser Tyr Leu Ala Trp
485 490 495
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala
500 505 510
Phe Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
515 520 525
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe
530 535 540
Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr Phe Gly
545 550 555 560
Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
565 570 575
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu
580 585 590
Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu
595 600 605
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Thr Met His Trp
610 615 620
Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val Thr Phe Ile Ser
625 630 635 640
Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
645 650 655
Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn
660 665 670
Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Gly
675 680 685
Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
690 695 700
Ser Ser
705
<210> 30
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<221> UNSURE
<223> IgG-Kappa信号肽氨基酸
<400> 30
Met Arg Ala Trp Ile Phe Phe Leu Leu Cys Leu Ala Gly Arg Ala Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 31
<211> 247
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<221> UNSURE
<223> AB01-scFv
<400> 31
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Thr Leu Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn
20 25 30
Ile His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
115 120 125
Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr
130 135 140
Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr Asp
145 150 155 160
Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Leu Gly
165 170 175
Val Ile Trp Thr Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Ser
180 185 190
Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys
195 200 205
Met Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg
210 215 220
Asp Ser Asn Tyr Arg Tyr Asp Glu Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly
225 230 235 240
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 32
<211> 246
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<221> UNSURE
<223> AB02-scFv
<400> 32
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Phe Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
130 135 140
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
145 150 155 160
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val
165 170 175
Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
180 185 190
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
195 200 205
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
210 215 220
Ala Arg Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
225 230 235 240
Leu Val Thr Val Ser Ser
245

Claims (52)

1. 一种双特异性抗体，其包含：
1）特异性结合第一抗原的第一抗体，所述第一抗体包括重链HC和轻链LC；和
2）特异性结合第二抗原的scFv；
其中，所述scFv连接于第一抗体的重链的N端或C端；
所述第一抗原为PDL-1，并且所述第二抗原为CTLA-4；
其中：
所述第一抗体包含：
如SEQ ID NO: 1所示的HCDR1；如SEQ ID NO: 2所示的HCDR2；以及，如SEQ ID NO: 3所示的HCDR3；如SEQ ID NO: 4所示的LCDR1；如SEQ ID NO: 5所示的LCDR2；以及，如SEQ IDNO: 6所示的LCDR3；
并且，
所述scFv包含：
如SEQ ID NO: 13所示的HCDR1；如SEQ ID NO: 14所示的HCDR2；以及，如SEQ ID NO:15所示的HCDR3；如SEQ ID NO: 16所示的LCDR1；如SEQ ID NO: 17所示的LCDR2；以及，如SEQ ID NO: 18所示的LCDR3，
其中所述双特异性抗体包含1个所述第一抗体和2个所述scFv；并且
其中每个所述scFv分别连接于所述第一抗体的两条重链的N端；或者，每个所述scFv分别连接于所述第一抗体的两条重链的C端。
2.权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述第一抗体包括两条HC和两条LC，其中所述第一抗体的一条HC的VH与一条LC的VL形成抗原结合部位，另一条HC的VH与另一条LC的VL形成抗原结合部位。
3.权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述每个scFv通过接头S1与所述第一抗体的每条重链的N端或C端连接，并且其中所述接头S1为肽接头。
4.权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述scFv由VH与VL通过S2接头连接，并且其中所述接头S2为肽接头。
5.权利要求4所述的双特异性抗体，其中所述scFv的结构为NH2-VL-S2-VH-COOH，其中所述S2为肽接头。
6.权利要求1-4中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第一抗体的重链包含重链可变区VH和重链恒定区CH，并且所述轻链包含轻链可变区VL和轻链恒定区CL。
7.权利要求1-4中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第一抗体为全长抗体。
8.权利要求1-4中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第一抗体的重链为IgG同种型；和/或，所述第一抗体的轻链为Kappa同种型。
9.权利要求8所述的双特异性抗体，其中所述IgG同种型为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
10.权利要求8所述的双特异性抗体，其中所述IgG同种型为人IgG同种型。
11.权利要求8所述的双特异性抗体，其中所述Kappa同种型为人Kappa同种型。
12.权利要求1-4中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第一抗体的两条HC包含相同的VH；并且，所述第一抗体的两条LC包含相同的VL。
13.权利要求1-4中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第一抗体的两条HC具有相同的氨基酸序列；并且，所述第一抗体的两条LC具有相同的氨基酸序列。
14.权利要求1-4中任一项所述的双特异性抗体，其中两个所述scFv具有相同的氨基酸序列。
15. 权利要求1-4中任一项所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体包含两条第一多肽链和两条第二多肽链，其中对于所述每条多肽链：
a）所述第一多肽链各自独立地包含所述第一抗体的重链HC和所述scFv；和
b）所述第二多肽链各自独立地包含所述第一抗体的轻链LC；
其中，所述scFv通过接头S1与所述第一抗体的HC的N端或C端相连，所述接头S1为肽接头。
16.权利要求15所述的双特异性抗体，其中所述scFv具有结构：NH2-VL-S2-VH-COOH，其中所述S2为肽接头。
17.权利要求16所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体包含两条相同的第一多肽链和两条相同的第二多肽链。
18.权利要求3-5中任一项所述的双特异性抗体，其中所述肽接头的氨基酸序列如(GmSn)x所示，其中m、n各自独立地选自1～8的整数，x独立地选自1～20的整数。
19.权利要求3所述的双特异性抗体，其中所述接头S1的氨基酸序列如(G4S)x所示，x独立地选自1-6的整数。
20.权利要求4或5所述的双特异性抗体，其中所述接头S2的氨基酸序列如(G4S)x所示，x独立地选自1-6的整数。
21. 权利要求3所述的双特异性抗体，其中所述接头S1的氨基酸序列选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26和SEQ ID NO: 27。
22. 权利要求4或5所述的双特异性抗体，其中所述接头S2的氨基酸序列选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26和SEQ ID NO: 27。
23. 权利要求4或5所述的双特异性抗体，其中所述接头S2的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示。
24. 权利要求3所述的双特异性抗体，其中当所述scFv与所述第一抗体的重链或轻链的N端连接时，所述接头S1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 26所示，当所述scFv与所述第一抗体的重链或轻链的C端连接时，所述接头S1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 27所示。
25.权利要求1-4中任一项所述的双特异性抗体，其中所述scFv的VH与VL之间存在二硫键。
26.权利要求25所述的双特异性抗体，其中所述scFv的位于VH第44位的氨基酸和位于VL第100位的氨基酸分别为半胱氨酸，其中提及的氨基酸位置是根据Kabat编号系统的位置；并且，所述scFv的VH与VL通过分别位于VH第44位和VL第100位的2个半胱氨酸残基之间所形成的二硫键连接。
27. 权利要求1-4中任一项所述的双特异性抗体，其中：所述第一抗体包含如SEQ IDNO: 7所示的VH和如SEQ ID NO: 9所示的VL。
28. 权利要求1-4中任一项所述的双特异性抗体，其中：所述第一抗体包含如SEQ IDNO: 7所示的VH和如SEQ ID NO: 9所示的VL；并且，所述scFv包含：
（1）如SEQ ID NO: 19所示的VH和如SEQ ID NO: 21所示的VL；或，
（2）如SEQ ID NO: 20所示的VH和如SEQ ID NO: 22所示的VL。
29.权利要求1-4中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第一抗体包含：如Uniprot的收录号P01857所示的CH；和，如Uniprot的收录号P01834所示的CL，
可选地，所述CH含有突变，为在UniProt的收录号P01857的CH中第117，118，120位突变为A；或，在UniProt的收录号P01857的CH中第97位突变为R。
30. 权利要求1-4中任一项所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体包含：
(1) 如SEQ ID NO: 28所示的第一多肽链和如SEQ ID NO: 11所示的第二多肽链；或
(2) 如SEQ ID NO: 29所示的第一多肽链和如SEQ ID NO: 11所示的第二多肽链。
31.一种分离的核酸分子，其包含编码权利要求1-30中任一项所述的双特异性抗体的核苷酸序列。
32.权利要求31所述的分离的核酸分子，其中所述分离的核酸分子是编码权利要求15-30中任一项所述的双特异性抗体的第一多肽链的多核苷酸。
33.权利要求31所述的分离的核酸分子，其中所述分离的核酸分子是编码权利要求15-30中任一项所述的双特异性抗体的第二多肽链的多核苷酸。
34.一种载体，其包含权利要求31-33中任一项所述的分离的核酸分子。
35.宿主细胞，其包含权利要求31-33中任一项所述的分离的核酸分子或权利要求34所述的载体。
36.制备权利要求1-30中任一项所述的双特异性抗体的方法，其包括，在允许所述双特异性抗体表达的条件下，培养权利要求35所述的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述双特异性抗体。
37.药物组合物，其含有权利要求1-30中任一项所述的双特异性抗体，以及药学上可接受的载体。
38.药物组合物，其含有权利要求1-30中任一项所述的双特异性抗体，以及药学上可接受的赋形剂。
39.权利要求37或38所述的药物组合物，其中所述药物组合物还包含另外的药学活性剂。
40.权利要求39所述的药物组合物，其中另外的药学活性剂是用于预防和/或治疗与CTLA-4和/或PDL-1相关的疾病的药物。
41.权利要求39所述的药物组合物，其中另外的药学活性剂是抗炎药物或免疫抑制剂。
42.权利要求40所述的药物组合物，其中所述与CTLA-4和/或PDL-1相关的疾病为自身免疫性疾病或肿瘤或传染病。
43.权利要求40所述的药物组合物，其中所述与CTLA-4和/或PDL-1相关的疾病为肿瘤，包括但不限于：白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、肉瘤，或包括但不限于肾上腺、胆囊、骨、骨髓、脑、乳腺、胆管、胃肠道、心脏、肾脏、肝脏、肺、肌肉、卵巢、胰腺、甲状旁腺、阴茎、前列腺、皮肤、唾液腺、脾脏、睾丸、胸腺、甲状腺和子宫相关的肿瘤。
44.权利要求40所述的药物组合物，其中所述与CTLA-4和/或PDL-1相关的疾病为腺癌。
45.权利要求40所述的药物组合物，其中所述与CTLA-4和/或PDL-1相关的疾病为传染病，包括但不限于乙肝，甲肝，HIV。
46.权利要求1-30中任一项所述的双特异性抗体或权利要求37-45中任一项所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于在受试者中治疗与CTLA-4和/或PDL-1相关的疾病，和/或用于体外或在受试者体内抑制CTLA-4和/或PDL-1的活性。
47.权利要求46所述的用途，其中所述受试者为哺乳动物。
48.权利要求46或47所述的用途，其中所述受试者为人。
49.权利要求46或47所述的用途，其中所述与CTLA-4和/或PDL-1相关的疾病为自身免疫性疾病或肿瘤或传染病。
50.权利要求46或47所述的用途，其中所述与CTLA-4和/或PDL-1相关的疾病为肿瘤，包括但不限于：白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、肉瘤，或包括但不限于肾上腺、胆囊、骨、骨髓、脑、乳腺、胆管、胃肠道、心脏、肾脏、肝脏、肺、肌肉、卵巢、胰腺、甲状旁腺、阴茎、前列腺、皮肤、唾液腺、脾脏、睾丸、胸腺、甲状腺和子宫相关的肿瘤。
51.权利要求46或47所述的用途，其中所述与CTLA-4和/或PDL-1相关的疾病为腺癌。
52.权利要求46或47所述的用途，其中所述与CTLA-4和/或PDL-1相关的疾病为传染病，包括但不限于乙肝，甲肝，HIV。
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