JP2020534791A - 組換え二重特異性抗体 - Google Patents

Abstract

ＣＴＬＡ−４およびＰＤＬ−１に対する組換え二重特異性抗体、抗体をコードする核酸分子、前記核酸分子を含むベクター及び宿主細胞、ならびに前記抗体を調製する方法を提供する。さらに、前記二重特異性抗体を含む医薬組成物、及び医薬組成物の調製への前記二重特異性抗体の使用を提供する。

Description

本発明は、バイオ医薬品分野、特にＣＴＬＡ−４および／またはＰＤＬ−１に関連する疾病の予防および／または治療分野に関する。具体的に、本発明は、ＣＴＬＡ−４とＰＤＬ−１、またはＰＤＬ−１とＣＴＬＡ−４に特異的に結合する二重特異性抗体に関する。

ＰＤ−１／ＰＤＬ−１シグナル伝達経路は、免疫寛容、微生物感染、および腫瘍の免疫回避を調節することに重要な役割を果たす。ＰＤ−１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ １，プログラム細胞死タンパク質１）は、主にＴ細胞などの免疫細胞で発現するが、ＰＤ−１リガンドであるＰＤＬ−１は、多くのヒト腫瘍組織で主に高発現を示す。免疫組織化学法により、乳癌、肺癌、胃癌、腸癌、食道癌、卵巣癌、子宮頸癌、腎臓癌、膀胱癌、膵臓癌、神経膠腫、黒色腫などの多種のヒト腫瘍組織から、ＰＤＬ−１タンパク質の発現が検出され、また、ＰＤＬ−１の発現レベルは、患者の臨床症状および予後と密接に関連する。

ＰＤ−１／ＰＤＬ−１シグナル伝達経路を遮断すると、抑制されたＴ細胞を活性化し、がん細胞を攻撃することができる。ＰＤ−１／ＰＤＬ−１シグナル伝達の遮断は、腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の増殖を促進して腫瘍細胞を殺す役割を果たし得、それによって局所腫瘍の成長を阻害する（Ｊｕｌｉｅ Ｒ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．３６６：２４５５−２４６５）；ＰＤＬ−１ ｍＡｂは、浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＦＮ−γの分泌を上方制御し、ＰＤ−１／ＰＤＬ−１シグナル伝達経路の遮断が免疫応答を誘導するための腫瘍免疫応答に役割を果たすことを示唆している（Ｂｌａｎｋ Ｃ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．１１９：３１７−３２７）。

また、ＰＤＬ−１は生体内でさらにＢ７−１に結合できる。ＰＤＬ−１／Ｂ７−１複合体は、Ｔ細胞活性化に対する負のシグナルでもあることを示す研究があるが、この両者の結合は、Ｔ細胞表面活性化マーカーの発現低下やＴ細胞増殖の阻害などにつながる。

細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原−４（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ−４、単に「ＣＴＬＡ−４」とも呼ばれる）およびＣＤ２８分子は、遺伝子構造、染色体位置、配列相同性および遺伝子発現の点で密接に関連し、いずれも共刺激分子Ｂ７の受容体であり、主に活性化Ｔ細胞の表面に発現される。ＣＴＬＡ−４は、Ｂ７に結合すると、マウスおよびヒトＴ細胞の活性化を阻害し、Ｔ細胞の活性化に負の調節の役割を果たす。

現在、薬物規制当局は、ＣＴＬＡ−４を標的とするイピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ、登録商標：Ｙｅｒｖｏｙ）、ＰＤ−１およびＰＤＬ−１を標的とするニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ、登録商標：Ｏｐｄｉｖｏ）、ペンブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ、登録商標：Ｋｅｙｔｒｕｄａ）、アテゾリズマブ（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ、登録商標：Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ）、デュルバルマブ（Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ、登録商標：Ｉｍｆｉｎｚｉ）などを承認した。

イピリムマブ（登録商標：Ｙｅｒｖｏｙ）は、進行期黒色腫の治療薬としてＦＤＡによって承認されたが、この抗体の注射液は、重篤ないし致命的な免疫介在性の副作用がある。これらの免疫介在性の副作用は、あらゆる臓器系に関与する可能性があるが、最も一般的な重篤な免疫介在性副作用として、小腸結腸炎、肝炎、皮膚炎（中毒性表皮壊死症を含む）、神経障害、および内分泌疾患が挙げられる。これらの免疫介在性応答のほとんどは、最初に治療の過程で現れるが、他の一部は、薬物中止後の数週間以内に発生する。重篤な免疫介在性反応が生じた場合、Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標）は永久に中止され、同時に全身性の高用量糖質コルチコイド療法を開始するべきである。

二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）は、二重親和性のコンビナトリアル抗体の一種であり、通常、二価（四価および六価もある）、即ち２つの抗原結合アームを有し、２つの異なる抗原に特異的に結合する機能を有する。中国特許出願ＣＮ１０６９６７１７２Ａは、抗ＣＴＬＡ−４−抗ＰＤ−１二機能性抗体、医薬組成物およびその使用を開示した。ＣＮ１０４９８７４２１Ａは、ＰＤ−１および／またはＣＴＬＡ−４に特異的に結合する二重可変ドメイン免疫グロブリンも開示している。同時に、２０１７年８月に、ブリストル・マイヤーズスクイブは、進行期腎がん（RCC）患者において、Ｏｐｄｉｖｏ／Ｙｅｒｖｏｙの組み合わせを第一選択療法としてＳＵＴＥＮＴ（スニチニブ）と比較した第ＩＩＩ相臨床試験ＣＭ２１４のトップレベルのデータを発表した。Ｏｐｄｉｖｏ／Ｙｅｒｖｏｙの組み合わせの奏効率は４１．６％、Ｓｕｔｅｎｔの奏効率は２６．５％で、主要評価項目（ｐｒｉｍａｒｙ ｅｎｄｐｏｉｎｔ）に達した。ただし、この組み合わせは、ｍＰＦＳという主要評価項目（無増悪生存期間の中央値）を逃した（１１．６ｖｓ８．４ヶ月、統計的有意性に達しなかった）。２０１７年７月に、アストラゼネカは、Ｍｙｓｔｉｃと呼ばれる第ＩＩＩ相臨床試験における、ＰＤＬ−１抗体であるＤｕｒｖａｌｕｍａｂ（商品名Ｉｍｆｉｎｚｉ）とＣＴＬＡ−４抗体であるＴｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂの組合せによる中間分析結果を発表した。この試験では、ＰＤＬ−１＞２５％の第一選択ＮＳＣＬＣ患者における、ＰＦＳ（無増悪生存期間）とＯＳ（全生存期間）に対するＤｕｒｖａ／Ｔｒｅｍｅの組合せと標準化学療法の影響を比較した結果、この組合せはＰＦＳを改善しないことを示した（試験の主要評価項目の１つ）。既知のデータは、デュルバルマブ単独でＰＦＳを改善する可能性が非常に低いことを示した（試験の副次的評価項目の１つ）。

このように、自己免疫疾患や腫瘍などの疾患に対して未だ満たされていないニーズがあり、より効果的で副作用の少ない新規治療法と医薬品を開発することが切実に求められる。

本発明において、本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、ＣＴＬＡ−４とＰＤＬ−１、またはＰＤＬ−１とＣＴＬＡ−４を二重特異的に結合する二重特異性抗体、二重特異性抗体をコードする核酸分子、核酸分子を含むベクター、二重特異性抗体の調製方法、二重特異性抗体を含む医薬組成物、医薬品の調製への医薬組成物の使用、ＣＴＬＡ−４とＰＤＬ−１関連疾患（例えば、自己免疫疾患または腫瘍）の診断／治療／予防への二重特異性抗体の使用または方法、および二重特異性抗体を含むキットを開発した。

二重特異性抗体
したがって、一態様では、本発明は、抗原ＰＤＬ−１および抗原ＣＴＬＡ−４に同時に結合するタンパク質またはポリペプチドを含む二重特異性抗体を提供する。

一部の好ましい実施形態では、前記二重特異性抗体は、
１）第一抗原に特異的に結合する、重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）を含む第一抗体、および
２）重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、第二抗原に特異的に結合する抗体断片（例えば、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｉ−ｓｃＦｖ）
を含み、
前記抗体断片は、第一抗体の重鎖または軽鎖のＮ末端またはＣ末端に連結され、
前記第一抗原はＣＴＬＡ−４であり、且つ前記第二抗原はＰＤＬ−１であり、或いは、前記第一抗原はＰＤＬ−１であり、且つ前記第二抗原はＣＴＬＡ−４である。

一部の好ましい実施形態では、前記抗体断片はｓｃＦｖである。

一部の好ましい実施形態では、前記二重特異性抗体は、１つの前記第一抗体および２つの前記ｓｃＦｖを含み、また、前記第一抗体は２つのＨＣおよび２つのＬＣを含み、ここで、前記第一抗体の１つのＨＣの重鎖可変領域（ＶＨ）と前記第一抗体の１つのＬＣの軽鎖可変領域（ＶＬ）とは、抗原結合部位を形成し、もう１つのＨＣの重鎖可変領域（ＶＨ）およびもう１つのＬＣの軽鎖可変領域（ＶＬ）は、抗原結合部位を形成する。

一部の好ましい実施形態では、前記各ｓｃＦｖは、それぞれ前記第一抗体の２つの重鎖または２つの軽鎖のＮ末端またはＣ末端に連結される。

一部の好ましい実施形態では、前記各ｓｃＦｖは、それぞれ前記第一抗体の２つの重鎖のＮ末端に連結される。一部の好ましい実施形態では、前記各ｓｃＦｖは、それぞれ前記第一抗体の２つの重鎖のＣ末端に連結される。一部の好ましい実施形態では、前記第一抗原はＰＤＬ−１であり、前記第二抗原はＣＴＬＡ−４であり、且つ前記第二抗原に結合するｓｃＦｖは、前記第一抗体の２つの重鎖のＣ末端に連結される。

一部の好ましい実施形態では、前記各ｓｃＦｖは、それぞれ前記第一抗体の２つの軽鎖のＮ末端に連結される。一部の好ましい実施形態では、前記各ｓｃＦｖは、それぞれ前記第一抗体の２つの軽鎖のＣ末端に連結される。

一部の好ましい実施形態では、１つの前記ｓｃＦｖは、前記第一抗体の重鎖または軽鎖のＮ末端に連結され、もう１つの前記ｓｃＦｖは、前記第一抗体の重鎖または軽鎖のＣ末端に連結される。

一部の好ましい実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、
１）第一抗原に特異的に結合する、重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）を含む第一抗体、および
２）第二抗原に特異的に結合するｓｃＦｖ
を含む。
前記二重特異性抗体は、１つの前記第一抗体および２つの前記ｓｃＦｖを含み、また、前記第一抗体は２つのＨＣおよび２つのＬＣを含み、ここで、前記第一抗体の１つのＨＣのＶＨと前記第一抗体の１つのＬＣのＶＬとは、抗原結合部位を形成し、もう１つのＨＣのＶＨともう１つのＬＣのＶＬとは、抗原結合部位を形成する。前記各ｓｃＦｖは、それぞれ前記第一抗体の２つの重鎖のＮ末端に連結され、または、前記各ｓｃＦｖは、それぞれ前記第一抗体の２つの重鎖のＣ末端に連結される。前記第一抗原はＰＤＬ−１であり、前記第二抗原はＣＴＬＡ−４である。一部の好ましい実施形態では、前記各ｓｃＦｖは、それぞれリンカーＳ１を介して前記第一抗体の各重鎖のＮ末端またはＣ末端に連結される。一部の好ましい実施形態では、前記ｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬは、リンカーＳ２を介して連結される。一部の好ましい実施形態では、ｓｃＦｖの構造はＮＨ_２−ＶＬ−Ｓ２−ＶＨ−ＣＯＯＨであり、前記Ｓ２はリンカーである。

一部の好ましい実施形態では、前記第一抗体の重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）およびＣＨ１ドメインを含み、前記軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む。このような実施形態では、前記第一抗体は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片またはＦ（ａｂ’）２断片であっても良い。一部の好ましい実施形態では、前記第一抗体の重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ）を含み、前記軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む。このような実施形態では、前記第一抗体は完全長抗体であっても良い。

一部の好ましい実施形態では、前記第一抗体の重鎖は、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４などのＩｇＧアイソタイプであり、好ましくは、ヒトＩｇＧアイソタイプである。一部の好ましい実施形態では、前記第一抗体の重鎖はヒトＩｇＧ１アイソタイプである。一部の好ましい実施形態では、前記第一抗体の軽鎖はＫａｐｐａアイソタイプ、好ましくはヒトＫａｐｐａアイソタイプである。

一部の好ましい実施形態では、前記第一抗体の２つのＨＣは同じＣＤＲを含み、および／または前記第一抗体の２つのＬＣは同じＣＤＲを含む。

一部の好ましい実施形態では、前記第一抗体の２つのＨＣは同じＶＨを含み、および／または前記第一抗体の２つのＬＣは同じＶＬを含む。

一部の好ましい実施形態では、前記第一抗体の２つのＨＣは同じアミノ酸配列を有し、および／または前記第一抗体の２つのＬＣは同じアミノ酸配列を有する。

一部の好ましい実施形態では、２つの前記ｓｃＦｖは同じまたは異なるアミノ酸配列を有する。一部の好ましい実施形態では、２つの前記ｓｃＦｖは同じアミノ酸配列を有する。

一部の好ましい実施形態では、前記二重特異性抗体は、２つの第一ポリペプチド鎖および２つの第二ポリペプチド鎖を含み、前記ポリペプチド鎖のそれぞれについて
ａ）前記第一ポリペプチド鎖は、それぞれ独立して、前記第一抗体の重鎖（ＨＣ）および前記ｓｃＦｖを含み、
ｂ）前記第二ポリペプチド鎖は、それぞれ独立して、前記第一抗体の軽鎖（ＬＣ）を含み、
ここで、前記ｓｃＦｖは、リンカーＳ１を介して前記第一抗体のＨＣのＮ末端またはＣ末端に連結される。

一部の好ましい実施形態では、前記二重特異性抗体は、２つの第一ポリペプチド鎖および２つの第二ポリペプチド鎖を含み、ポリペプチド鎖のそれぞれについて：
ｉ）前記第一ポリペプチド鎖は、それぞれ独立して、前記第一抗体の軽鎖（ＬＣ）および前記ｓｃＦｖを含み、
ｉｉ）前記第二ポリペプチド鎖は、それぞれ独立して、前記第一抗体の重鎖（ＨＣ）を含み、
ここで、前記ｓｃＦｖは、リンカーＳ１を介して前記第一抗体のＬＣのＮ末端またはＣ末端に連結される。

一部の好ましい実施形態では、前記ｓｃＦｖのＮ末端またはＣ末端は、リンカーＳ１のＣ末端またはＮ末端に連結される。

一部の好ましい実施形態では、前記ｓｃＦｖは、ＮＨ_２−ＶＨ−Ｓ２−ＶＬ−ＣＯＯＨ又はＮＨ_２−ＶＬ−Ｓ２−ＶＨ−ＣＯＯＨという構造があり、前記Ｓ２はリンカーである。

一部の好ましい実施形態では、前記リンカーＳ１および／またはリンカーＳ２は、例えば、（Ｇ_ｍＳ_ｎ）_ｘに示されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカーであり、式中、ｍ、ｎは、それぞれ独立して１〜８の整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８）から選択され、ｘは、独立して１〜２０の整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０）から選択される。一部の好ましい実施形態では、前記リンカーＳ１および／またはＳ２は、（Ｇ_４Ｓ）_ｘに示されるアミノ酸配列を有し、ｘは、独立して１〜６の整数から選択される。

一部の好ましい実施形態では、前記リンカーＳ１および／またはリンカーＳ２は、配列番号２５、配列番号２６、および配列番号２７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。

一部の好ましい実施形態では、前記リンカーＳ２は、（Ｇ_４Ｓ）_４に示されるアミノ酸配列、すなわちＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２５）を有する。一部の好ましい実施形態では、前記ｓｃＦｖが前記第一抗体の重鎖または軽鎖のＮ末端に連結される場合、前記リンカーＳ１は、（Ｇ_４Ｓ）_３に示されるアミノ酸配列、すなわちＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２６）を有し；前記ｓｃＦｖが前記第一抗体の重鎖または軽鎖のＣ末端に連結される場合、前記リンカーＳ１は、（Ｇ_４Ｓ）_２に示されるアミノ酸配列、すなわちＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２７）を有する。

一部の好ましい実施形態では、前記ｓｃＦｖのＶＨとＶＬとの間にジスルフィド結合がある。抗体のＶＨとＶＬの間にジスルフィド結合を導入する方法は、当技術分野で周知であり、例えば、米国特許出願ＵＳ５，７４７，６５４；Ｒａｊａｇｏｐａｌら、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇｉｎ．１０（１９９７）１４５３−１４５９；Ｒｅｉｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４（１９９６）１２３９−１２４５；Ｒｅｉｔｅｒら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ８（１９９５）１３２３−１３３１；Ｗｅｂｂｅｒら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３２（１９９５）２４９−２５８；Ｒｅｉｔｅｒら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２（１９９５）２８１−２８７；Ｒｅｉｔｅｒら、ＪＢＣ ２６９（１９９４）１８３２７−１８３３１；Ｒｅｉｔｅｒら、Ｉｎｔｅｒ．Ｊ．ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ５８（１９９４）１４２−１４９；または、Ｒｅｉｔｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４（１９９４）２７１４−２７１８を参照して、引用により本明細書に組み込まれる。

一部の好ましい実施形態では、前記ｓｃＦｖにおけるＶＨの４４番目のアミノ酸およびＶＬの１００番目のアミノ酸は、それぞれシステインであり、前記アミノ酸位置は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに基き、また、前記ｓｃＦｖにおけるＶＨとＶＬは、それぞれＶＨの４４番目とＶＬの１００番目に位置する２つのシステイン残基の間に形成されたジスルフィド結合によって連結される。

一部の好ましい実施形態では、前記第一抗体はＣＴＬＡ−４に特異的に結合し、前記ｓｃＦｖはＰＤＬ−１に特異的に結合する。ここで、前記ｓｃＦｖは、配列番号１に記載のＨＣＤＲ１、配列番号２に記載のＨＣＤＲ２、配列番号３に記載のＨＣＤＲ３、配列番号４に記載のＬＣＤＲ１、配列番号５に記載のＬＣＤＲ２、および配列番号６に記載のＬＣＤＲ３を含む。

一部の好ましい実施形態では、前記第一抗体はＣＴＬＡ−４に特異的に結合し、前記ｓｃＦｖはＰＤＬ−１に特異的に結合する。
ここで、前記第一抗体は、配列番号１３に記載のＨＣＤＲ１、配列番号１４に記載のＨＣＤＲ２、配列番号１５に記載のＨＣＤＲ３、配列番号１６に記載のＬＣＤＲ１、配列番号１７に記載のＬＣＤＲ２、および配列番号１８に記載のＬＣＤＲ３を含み、
および／または、
前記ｓｃＦｖは、配列番号１に記載のＨＣＤＲ１、配列番号２に記載のＨＣＤＲ２、配列番号３に記載のＨＣＤＲ３、配列番号４に記載のＬＣＤＲ１、配列番号５に記載のＬＣＤＲ２、および配列番号６に記載のＬＣＤＲ３を含む。

一部の好ましい実施形態では、前記第一抗体は、配列番号１３に記載のＨＣＤＲ１、配列番号１４に記載のＨＣＤＲ２、配列番号１５に記載のＨＣＤＲ３、配列番号１６に記載のＬＣＤＲ１、配列番号１７に記載のＬＣＤＲ２、配列番号１８に記載のＬＣＤＲ３を含み、且つ前記ｓｃＦｖは、配列番号１に記載のＨＣＤＲ１、配列番号２に記載のＨＣＤＲ２、配列番号３に記載のＨＣＤＲ３、配列番号４に記載のＬＣＤＲ１、配列番号５に記載のＬＣＤＲ２、および配列番号６に記載のＬＣＤＲ３を含む。

一部の好ましい実施形態では、前記第一抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列は、配列番号１９に記載の重鎖可変領域のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有し；また、前記第一抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列は、配列番号２１に記載の軽鎖可変領域のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有し；また、前記ｓｃＦｖの重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列は、配列番号７または配列番号８に記載の重鎖可変領域のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有し；さらに、前記ｓｃＦｖの軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列は、配列番号９または配列番号１０に記載の軽鎖可変領域のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。

一部の好ましい実施形態では、前記ｓｃＦｖの重鎖可変領域は、配列番号７に記載の重鎖可変領域から選択され、前記ｓｃＦｖの軽鎖可変領域は、配列番号９に記載の軽鎖可変領域から選択される。

一部の好ましい実施形態では、前記ｓｃＦｖの重鎖可変領域は、配列番号８に記載の重鎖可変領域から選択され、前記ｓｃＦｖの軽鎖可変領域は、配列番号１０に記載の軽鎖可変領域から選択される。

一部の好ましい実施形態では、前記第一抗体の重鎖可変領域は、配列番号１９に記載の重鎖可変領域から選択され；前記第一抗体の軽鎖可変領域は、配列番号２１に記載の軽鎖可変領域から選択され；前記ｓｃＦｖの重鎖可変領域は、配列番号７に記載の重鎖可変領域から選択され；前記ｓｃＦｖの軽鎖可変領域は、配列番号９に記載の軽鎖可変領域から選択される。

一部の好ましい実施形態では、前記第一抗体の重鎖可変領域は、配列番号１９に記載の重鎖可変領域から選択され；前記第一抗体の軽鎖可変領域は、配列番号２１に記載の軽鎖可変領域から選択され；前記ｓｃＦｖの重鎖可変領域は、配列番号８に記載の重鎖可変領域から選択され；前記ｓｃＦｖの軽鎖可変領域は、配列番号１０に記載の軽鎖可変領域から選択される。

一部の好ましい実施形態では、前記第一抗体は、配列番号１９に記載のＶＨおよび配列番号２１に記載のＶＬを含み、
また、前記ｓｃＦｖは、
（１）配列番号７に記載のＶＨおよび配列番号９に記載のＶＬ；または
（２）配列番号８に記載のＶＨおよび配列番号１０に記載のＶＬ
を含む。

一部の好ましい実施形態では、前記第一抗体はＰＤＬ−１に特異的に結合し、前記ｓｃＦｖはＣＴＬＡ−４に特異的に結合し、
前記第一抗体は、（ａ）配列番号１に記載のＨＣＤＲ１、配列番号２に記載のＨＣＤＲ２、配列番号３に記載のＨＣＤＲ３、配列番号４に記載のＬＣＤＲ１、配列番号５に記載のＬＣＤＲ２、および配列番号６に記載のＬＣＤＲ３を含み、
および／または、
前記ｓｃＦｖは、配列番号１３に記載のＨＣＤＲ１、配列番号１４に記載のＨＣＤＲ２、配列番号１５に記載のＨＣＤＲ３、配列番号１６に記載のＬＣＤＲ１、配列番号１７に記載のＬＣＤＲ２、および配列番号１８に記載のＬＣＤＲ３を含む。

一部の好ましい実施形態では、前記第一抗体はＰＤＬ−１に特異的に結合し、前記ｓｃＦｖはＣＴＬＡ−４に特異的に結合し、前記第一抗体は、配列番号１に記載のＨＣＤＲ１、配列番号２に記載のＨＣＤＲ２、配列番号３に記載のＨＣＤＲ３、配列番号４に記載のＬＣＤＲ１、配列番号５に記載のＬＣＤＲ２、および配列番号６に記載のＬＣＤＲ３を含む。

一部の好ましい実施形態では、前記第一抗体は、配列番号１に記載のＨＣＤＲ１、配列番号２に記載のＨＣＤＲ２、配列番号３に記載のＨＣＤＲ３、配列番号４に記載のＬＣＤＲ１、配列番号５に記載のＬＣＤＲ２、配列番号６に記載のＬＣＤＲ３を含み；且つ前記ｓｃＦｖは、配列番号１３に記載のＨＣＤＲ１、配列番号１４に記載のＨＣＤＲ２、配列番号１５に記載のＨＣＤＲ３、配列番号１６に記載のＬＣＤＲ１、配列番号１７に記載のＬＣＤＲ２、および配列番号１８に記載のＬＣＤＲ３を含む。

一部の好ましい実施形態では、前記第一抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列は、配列番号７に記載の重鎖可変領域のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有し；また、前記第一抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列は、配列番号９に記載の軽鎖可変領域のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有し；また、前記ｓｃＦｖの重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列は、配列番号１９または２０に記載の重鎖可変領域のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有し；また、前記ｓｃＦｖの軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列は、配列番号２１または２２に記載の軽鎖可変領域のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。

一部の好ましい実施形態では、前記第一抗体の重鎖可変領域は、配列番号７に記載の重鎖可変領域から選択され、且つ前記第一抗体の軽鎖可変領域は、配列番号９に記載の軽鎖可変領域から選択される。

一部の好ましい実施形態では、前記第一抗体の重鎖可変領域は、配列番号７に記載の重鎖可変領域から選択され、且つ前記第一抗体の軽鎖可変領域は、配列番号９に記載の軽鎖可変領域から選択され、また、前記ｓｃＦｖの重鎖可変領域は、配列番号１９に記載の重鎖可変領域から選択され、且つ前記ｓｃＦｖの軽鎖可変領域は、配列番号２１に記載の軽鎖可変領域から選択される。

一部の好ましい実施形態では、前記第一抗体の重鎖可変領域は、配列番号７に記載の重鎖可変領域から選択され、且つ前記第一抗体の軽鎖可変領域は、配列番号９に記載の軽鎖可変領域から選択され、また、前記ｓｃＦｖの重鎖可変領域は、配列番号２０に記載の重鎖可変領域から選択され、且つ前記ｓｃＦｖの軽鎖可変領域は、配列番号２２に記載の軽鎖可変領域から選択される。

一部の好ましい実施形態では、前記第一抗体は、配列番号７に記載のＶＨおよび配列番号９に記載のＶＬを含み、
また、前記ｓｃＦｖは、
（１）配列番号１９に記載のＶＨおよび配列番号２１に記載のＶＬ、または
（２）配列番号２０に記載のＶＨおよび配列番号２２に記載のＶＬ
を含む。

一部の好ましい実施形態では、前記二重特異性抗体は、２つの同じ第一ポリペプチド鎖および２つの同じ第二ポリペプチド鎖を含む。

一部の好ましい実施形態では、前記第一ポリペプチド鎖は、配列番号２８および２９のいずれか１つに記載のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有し、および／または前記第二ポリペプチド鎖は、配列番号１１および２３のいずれか１つに記載のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有する。

一部の好ましい実施形態では、前記二重特異性抗体は、
（１）配列番号２８に記載の第一ポリペプチド鎖および配列番号１１に記載の第二ポリペプチド鎖、
（２）配列番号２９に記載の第一ポリペプチド鎖および配列番号１１に記載の第二ポリペプチド鎖、
（３）配列番号２８に記載の第一ポリペプチド鎖および配列番号２３に記載の第二ポリペプチド鎖、
（４）配列番号２９に記載の第一ポリペプチド鎖および配列番号２３に記載の第二ポリペプチド鎖
を含む。

一部の好ましい実施形態では、本発明の二重特異性抗体における前記第一抗体は、ＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｐ０１８５７に示されるＣＨ、および/またはＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｐ０１８３４に示されるＣＬを含む。必要に応じて、前記ＣＨは、さらに、ＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｐ０１８５７に示されるＣＨにおける１１７、１１８、１２０番目のアミノ酸がＡに変異すること、又はＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｐ０１８５７に示されるＣＨにおける９７番目のアミノ酸がＲに変異することを含んでもよい。

一部の好ましい実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有する。一部の好ましい実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有し、且つ補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を有する。一部の好ましい実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、増強された抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性、および/または増強された補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を有する。一部の好ましい実施形態では、前記増強されたＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性は、二重特異性抗体の第一抗体のＣＨの突然変異によるものである。

別の側面として、本発明の二重特異性抗体は、前記第一抗体の親抗体と比較して同等または弱い第一抗原に対する結合活性を有する。一部の好ましい実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、前記ｓｃＦｖの親抗体と比較して同等または弱い第二抗原に対する結合活性を有する。一部の好ましい実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、前記第一抗体の親抗体と比較して同等または弱い第一抗原に対する結合活性を有し、且つ前記ｓｃＦｖの親抗体と比較して同等または弱い第二抗原に対する結合活性を有する。一部の好ましい実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、前記第一抗体の親抗体と比較して同等の第一抗原に対する結合活性を有し、且つ前記ｓｃＦｖの親抗体と比較して弱い第二抗原に対する結合活性を有する。一部の好ましい実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、ＰＤＬ−１に結合する親抗体と比較して同等の結合活性を有する。一部の好ましい実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、ＣＴＬＡ−４に結合する親抗体と比較して弱い結合活性を有する。一部の好ましい実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、ＰＤＬ−１に結合する親抗体と比較して同等の結合活性を有し、且つＣＴＬＡ−４に結合する親抗体と比較して弱い結合活性を有する。

別の側面として、本発明の二重特異性抗体は、ＣＴＬＡ−４およびＰＤＬ−１に対して親和性を有する。一部の好ましい実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、ＣＴＬＡ−４およびＰＤＬ−１に対して、それぞれの親抗体と比較して同等の親和性を有する。一部の好ましい実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、ＰＤＬ−１に対して、その親抗体と比較して同等の親和性を有する。一部の好ましい実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、ＣＴＬＡ−４に対して、その親抗体と比較して同等の親和性を有する。一部の好ましい実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、ＣＴＬＡ−４に対して、その親抗体と比較して弱い親和性を有する。一部の好ましい実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、ＰＤＬ−１に対して、その親抗体と比較して同等の親和性を有し、且つＣＴＬＡ−４に対して、その親抗体と比較して弱い親和性を有する。

別の側面として、本発明の二重特異性抗体は、良好な熱安定性を有する。一部の好ましい実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、親抗体と比較してほぼ同等の親和性を有する。

二重特異性抗体の発現
別の側面として、本発明は、本発明の二重特異性抗体をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する。一部の好ましい実施形態では、前記単離された核酸分子は、本発明の二重特異性抗体をコードする。

一部の好ましい実施形態では、前記単離された核酸分子は、本発明の第一ポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む。一部の好ましい実施形態では、前記単離された核酸分子は、本発明の第二ポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む。一部の好ましい実施形態では、前記単離された核酸分子は、本発明の第一ポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列、および本発明の第二ポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む。

別の側面として、本発明は、本発明の単離された核酸分子を含むベクター（例えば、クローニングベクターまたは発現ベクター）を提供する。

一部の好ましい実施形態では、前記ベクターは、本発明の第一ポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む。一部の好ましい実施形態では、前記ベクターは、本発明の第二ポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む。一部の好ましい実施形態では、前記ベクターは、本発明の第一ポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列、および本発明の第二ポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む。

一部の好ましい実施形態では、本発明のベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ファージなどである。一部の好ましい実施形態では、前記ベクターは、被験者の生体内（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）で本発明の二重特異性抗体、第一ポリペプチド鎖または第二ポリペプチド鎖を発現することができる。

別の側面として、本発明は、本発明の単離された核酸分子または本発明のベクターを含む宿主細胞を提供する。このような宿主細胞には、大腸菌細胞などの原核細胞、酵母菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、および動物細胞（例えば、マウス細胞、ヒト細胞などの哺乳動物細胞）などの真核細胞が含まれるが、これらに限定されない。一部の好ましい実施形態では、本発明の宿主細胞は、例えば、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ ＤＧ４４）またはＨＥＫ２９３などの哺乳動物細胞である。

別の側面として、本発明は、二重特異性抗体の発現を可能にする条件下で本発明の宿主細胞を培養すること、および、培養した宿主細胞の培養物から前記二重特異性抗体を回収することを含む、本発明の二重特異性抗体を調製する方法を提供する。

一部の好ましい実施形態では、前記方法は、以下の（１）〜（４）を含む。
（１）第一ポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列および第二ポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを構築する。または、第一ポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む第一発現ベクター、および第二ポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む第二発現ベクターを構築する。
（２）工程（１）に記載の発現ベクターを宿主細胞に導入する。または、工程（１）に記載の第一発現ベクターおよび第二発現ベクターを宿主細胞に導入する。
（３）本発明の二重特異性抗体の発現を可能にする条件下で、工程（２）に記載の宿主細胞を培養する。
（４）培養した宿主細胞の培養物から前記二重特異性抗体を回収する。

治療方法および医薬組成物
本発明の二重特異性抗体は、生体外または被験者の体内でＣＴＬＡ−４活性およびＰＤＬ−１活性を阻害すること、ＣＴＬＡ−４および／またはＰＤＬ−１シグナル伝達経路を遮断すること、ならびに、ＣＴＬＡ−４および／またはＰＤＬ−１関連疾患（例えば、自己免疫疾患、腫瘍または感染症）を予防および／または治療することに用いられる。

したがって、別の側面として、本発明は、本発明の二重特異性抗体、および薬学的に許容される担体および/または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。一部の好ましい実施形態では、前記医薬組成物は、他の医薬活性剤を含んでも良い。一部の好ましい実施形態では、前記他の医薬活性剤は、例えば、抗炎症薬または免疫抑制薬などのＣＴＬＡ−４および／またはＰＤＬ−１関連疾患（例えば、自己免疫疾患または腫瘍または感染症）の予防および／または治療のための薬物であり、例えば、非ステロイド性抗炎症薬（例えばイブプロフェン、ジクロフェナク、ナプロキセン、インドメタシン、ピロキシカム、メロキシカム、ナブメトン、またはニメスリド）、ステロイド系抗炎症薬（例えばプレドニゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン）、炎症性サイトカインの抗体またはアンタゴニストである。

別の側面として、本発明は、被験者（例えば、ヒト）におけるＣＴＬＡ−４および／またはＰＤＬ−１関連疾患（自己免疫疾患、腫瘍または感染症）の予防および／または治療、および／または生体外或いは被験者（例えば、ヒト）の生体内でＣＴＬＡ−４および／またはＰＤＬ−１の活性の阻害のための薬物の調製への、本発明の二重特異性抗体または本発明の医薬組成物の使用を提供する。

別の側面として、本発明は、必要とする被験者に有効量の二重特異性抗体または本発明の医薬組成物を投与することを含む、被験者（例えば、ヒト）におけるＣＴＬＡ−４および／またはＰＤＬ−１関連疾患（例えば、自己免疫疾患、腫瘍または感染症）を予防および／または治療する方法、および／または生体外或いは被験者（例えば、ヒト）の生体内でＣＴＬＡ−４および／またはＰＤＬ−１の活性を阻害する方法を提供する。

本発明において、前記ＣＴＬＡ−４および／またはＰＤＬ−１関連疾患には、例えば、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、肉腫などの腫瘍；または、副腎、胆嚢、骨、骨髄、脳、乳房、胆管、胃腸管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、皮膚、唾液腺、脾臓、睾丸、胸腺、甲状腺、および子宮に関連する腫瘍；Ｂ型肝炎、Ａ型肝炎、およびＨＩＶなどの感染症；などの自己免疫疾患、腫瘍または感染性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の二重特異性抗体または本発明の医薬組成物は、例えば、錠剤、丸剤、懸濁液、乳剤、溶液、ゲル剤、カプセル、粉末剤、顆粒剤、エリキシル剤、トローチ剤、坐剤、注射剤（注射液、注射用滅菌粉末、注射用濃縮液を含む）、吸入剤、スプレー剤などの医療分野で知られている任意の剤形に製剤化することができる。好ましい剤形は、所望の投与経路および治療用途に依存する。本発明の医薬組成物は、滅菌されたもので、且つ製造および貯蔵の条件下で安定でなければならない。好ましい製剤の１つは注射剤である。このような注射剤は、滅菌された注射液であっても良い。滅菌注射液は、例えば、適切な溶媒に必要量の本発明の二重特異性抗体を混入し、さらに、任意に、他の所望の成分（ｐＨ調整剤、界面活性剤、アジュバント、イオン強度増強剤、等張剤、防腐剤、希釈剤、またはそれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない）を混入した後、濾過して滅菌することにより、調製される。さらに、滅菌注射液は、保存および使用を容易にするために、滅菌凍結乾燥粉末剤として（例えば、真空乾燥または凍結乾燥により）調製される。このような無菌凍結乾燥粉末は、使用前に、例えば発熱物質を含まない滅菌水のような適切な媒介体に分散させることができる。

さらに、本発明の二重特異性抗体は、投与を容易にするために、単位剤形として医薬組成物に存在してもよい。一部の実施形態では、単位投与量は、少なくとも１ｍｇ、少なくとも２ｍｇ、少なくとも３ｍｇ、少なくとも４ｍｇ、少なくとも５ｍｇ、少なくとも６ｍｇ、少なくとも７ｍｇ、少なくとも８ｍｇ、少なくとも９ｍｇ、少なくとも１０ｍｇ、少なくとも１５ｍｇ、少なくとも２０ｍｇ、少なくとも２５ｍｇ、少なくとも３０ｍｇ、少なくとも４５ｍｇ、少なくとも５０ｍｇ、少なくとも７５ｍｇ、または少なくとも１００ｍｇである。前記医薬組成物は、液剤（例えば、注射剤）の場合、少なくとも０．１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも０．２５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも０．５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２．５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも８ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも１００ｍｇ／ｍｌの濃度の本発明の二重特異性抗体を含むことができる。

本発明の二重特異性抗体または医薬組成物は、経口、口腔内、舌下、眼、局所、非経口、直腸、くも膜下腔、大槽内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｒｎａｌ）、鼠径部、膀胱内、局所（例えば、粉末、軟膏または点滴剤）、または鼻腔内の経路を含む当技術分野で公知の任意の適切な方法によって投与することができるが、これらに限定されない。しかしながら、多くの治療用途において、好ましい投与経路/方式は、非経口投与（例えば、静脈内注射、皮下注射、腹腔内注射、筋肉内注射）である。当業者は、投与経路および/または方式が所望の目的に応じて変更することを理解すべきである。好ましい一実施形態では、本発明の二重特異性抗体または医薬組成物は、静脈内注入または注射によって投与される。

本発明により提供される薬物、医薬組成物または二重特異性抗体は、単独でまたは組み合わせて使用してもよく、他の医薬活性剤（例えば、自己免疫疾患、腫瘍または感染症のための薬剤）と組み合わせて使用してもよい。一部の好ましい実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、ＣＴＬＡ−４および／またはＰＤＬ−１関連疾患（例えば、自己免疫疾患、腫瘍または感染症）を予防および／または治療するために、他の抗炎症薬または免疫抑制薬と組み合わせて使用される。このような他の医薬活性剤は、本発明の二重特異性抗体または本発明の医薬組成物の投与の前／同時／後に投与しても良い。

本発明の医薬組成物は、「治療有効量」または「予防有効量」の本発明の二重特異性抗体を含んでもよい。「予防有効量」とは、疾患（例えば、ＣＴＬＡ−４および／またはＰＤＬ−１関連疾患）を予防、抑制、または遅延させるための十分な量を意味する。「治療有効量」とは、すでに疾患を患っている患者の疾患およびその合併症を治癒または少なくとも部分的に抑制するための十分な量を意味する。本発明の二重特異性抗体の治療有効量は、治療する疾患の重症度、患者自身の免疫系の全体的な状態、年齢や体重や性別などの患者の一般的な状態、薬物の投与方法、および同時に実施するその他の治療法などの要因に応じて変更しても良い。

本発明において、投与レジメンは、最適な目的応答（例えば、治療または予防の応答）を達成するように調整しても良い。例えば、単回投与してもよく、一定期間にわたって複数回投与してもよく、或いは、治療の緊急性に応じて用量を比例的に減少または増加させてもよい。

本発明の二重特異性抗体の治療有効量または予防有効量の典型的な非限定的な範囲は、０．０２〜５０ｍｇ／ｋｇであり、例えば０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ、０．１〜２５ｍｇ／ｋｇ、または１〜１０ｍｇ／ｋｇである。投与量は、治療を必要とする病状の種類と重症度に応じて変更してもよいことに注意する必要がある。さらに、当業者は、特定の患者については、患者のニーズと医師の専門的評価に従って、特定の投与レジメンを経時的に調整する必要があることを理解すべきである。ここで、用量の範囲は、目的の例示のみに使用され、本発明の医薬組成物の使用または範囲を限定するものではない。

本発明において、前記被験者は、ヒトなどの哺乳動物であっても良い。

検出/診断方法及びキット
本発明の二重特異性抗体は、ＣＴＬＡ−４および／またはＰＤＬ−１に特異的に結合することができるため、サンプルにおけるＣＴＬＡ−４および／またはＰＤＬ−１の存在またはそれらのレベルを検出すること、および被験者がＣＴＬＡ−４および／またはＰＤＬ−１関連疾患（例えば、自己免疫疾患、腫瘍または感染症）に罹患するかどうかを診断することに使用することができる。

したがって、別の側面として、本発明は、本発明の二重特異性抗体を含むキットを提供する。一部の好ましい実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、検出可能な標識を有する。一部の好ましい実施形態では、前記キットは、本発明の二重特異性抗体の第一抗体またはｓｃＦｖを特異的に認識する第二抗体をさらに含む。好ましくは、前記第二抗体は、検出可能な標識をさらに含む。

本発明において、検出可能な標識は、蛍光、分光、光化学、生化学、免疫学、電気、光学または化学的手段によって検出可能な任意の物質であり得る。このような標識が免疫学的検出（例えば、酵素結合免疫吸着測定法、放射免疫測定法、蛍光免疫測定法、化学発光免疫測定法など）に適していることは、特に好ましい。このような標識は、当技術分野で周知であり、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼなど）、放射性核種（例えば、^３Ｈ、^１２５Ｉ、^３５Ｓ、^１４Ｃまたは^３２Ｐ）、蛍光色素（フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フルオレセイン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、テキサスレッド、ローダミン、量子ドット、またはシアニン系染料誘導体（例えば、Ｃｙ７、Ａｌｅｘａ ７５０））、アクリジンエステル化合物、磁気ビーズ（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ登録商標）、金コロイドまたは着色ガラスやプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）のビーズのような温度測定標識物、および上記標識物で修飾されたアビジンに結合するビオチン（例えば、ストレプトアビジン）が挙げられるが、これらに限定されない。これらのような標識物の使用を教示する特許として、米国特許第３，８１７，８３７、３，８５０，７５２、３，９３９，３５０、３，９９６，３４５、４，２７７，４３７、４，２７５，１４９、及び４，３６６，２４１号（それぞれ参照により本明細書に組み込まれる）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明に含まれる標識物は、当分野で公知の方法によって検出することができる。例えば、放射性標識は、写真フィルム又はシンチレーションカウンターによって検出することができる。蛍光標識物は、放射光を検出するように、光検出器によって検出することができる。酵素標識物は、通常、酵素に基質を提供し、且つ基質に対する酵素の作用による反応生成物を検出することで、検出される。特定の実施形態において、上記の検出可能な標識は、潜在的な立体障害を低減するために、長さを変えるリンカーによって本発明の二重特異性抗体に結合することができる。また、温度測定標識物は、単に色付き標識物を視覚化することにより検出される。一部の実施形態において、上記のような検出可能な標識は、潜在的な立体障害を低減するために、異なる長さのリンカーによって本発明の二重特異性抗体に連結することができる。

別の側面として、本発明は、本発明の二重特異性抗体を使用する工程を含む、サンプルにおけるＣＴＬＡ−４および／またはＰＤＬ−１の存在またはそれらのレベルを検出する方法を提供する。好ましい実施形態において、本発明の二重特異性抗体は、さらに検出可能な標識を有する。別の好ましい実施形態において、前記方法は、さらに、検出可能な標識を有する薬剤を使用して本発明の二重特異性抗体断片を検出することを含む。この方法は、診断目的または非診断目的（例えば、前記サンプルは、患者由来の試料ではなく、細胞サンプルである）のために使用される。

別の側面として、本発明は、本発明の二重特異性抗体を使用して被験者由来のサンプルにおけるＣＴＬＡ−４および／またはＰＤＬ−１の存在またはそれらのレベルを検出することを含む、被験者がＣＴＬＡ−４および／またはＰＤＬ−１関連疾患（自己免疫疾患、腫瘍または感染症）に罹患するかどうかを診断する方法を提供する。好ましい実施形態において、本発明の二重特異性抗体は、さらに検出可能な標識を有する。別の好ましい実施形態において、この方法は、検出可能な標識を有する薬剤を使用して本発明の二重特異性抗体を検出する工程をさらに含む。

別の側面として、本発明は、キットの調製における本発明の二重特異性抗体の使用を提供する。このキットは、サンプルにおけるＣＴＬＡ−４および／またはＰＤＬ−１の存在またはそれらのレベルを検出すること、または被験者がＣＴＬＡ−４および／またはＰＤＬ−１関連疾患（例えば、自己免疫疾患、腫瘍または感染症）に罹患するかどうかを診断することに使用する。

定義と用語
本発明において、特に明記しない限り、本明細書で使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。さらに、本明細書で使用される細胞培養、生化学、核酸化学、免疫学的実験などの操作手順は、いずれも対応する分野でよく使用されている従来の手順である。また、本発明をより良く理解するために、関連用語の定義および説明を以下に提供する。

本明細書において、「ＰＤＬ−１」は、「プログラム死亡リガンド１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ−ｌｉｇａｎｄ １）」、「プログラム細胞死リガンド１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｌｉｇａｎｄ １）」、「タンパク質ＰＤ−Ｌ１」、「ＰＤ−Ｌ１」、「ＰＤＬ１」、「ＰＤＣＤＬ１」、「ｈＰＤ−Ｌ１」、「ｈＰＤ−ＬＩ」、「ＣＤ２７４」及び「Ｂ７−Ｈ１」とも呼ばれる。これらの用語は互換可能に使用される。

本明細書で使用される「抗体」という用語とは、一般的に２組のポリペプチド鎖（各組が１つの軽鎖（ＬＣ）および１つの重鎖（ＨＣ）を有する）で構成される免疫グロブリン分子を指す。抗体の軽鎖は、κ（ｋａｐｐａ）軽鎖およびλ（ｌａｍｂｄａ）軽鎖に分類される。重鎖はμ、δ、γ、α、またはεに分類され、抗体アイソタイプは、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとして定義される。軽鎖および重鎖において、可変領域と定常領域は、約１２つ以上のアミノ酸の「Ｊ」領域を介して結合され、重鎖は、約３つ以上のアミノ酸の「Ｄ」領域をさらに含む。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）と重鎖定常領域（ＣＨ）で構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）で構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメインであるＣＬで構成される。抗体の定常領域は、免疫系の各種の細胞（例えば、エフェクター細胞）と古典的な補体系の第一成分（Ｃ１ｑ）との結合を含む、宿主組織または因子と免疫グロブリンとの結合を媒介する。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が散在する、高い可変性を有する領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる）にさらに細分化できる。それぞれのＶ_ＨおよびＶ_Ｌは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序でアミノ末端からカルボキシ末端まで配置された３つのＣＤＲと４つのＦＲで構成される。それぞれの重鎖／軽鎖組の可変領域（ＶＨおよびＶＬ）は、それぞれ抗原結合部位を形成する。それぞれの領域またはドメインへのアミノ酸の割り当ては、Ｋａｂａｔ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７ ａｎｄ １９９１））、またはＣｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７；Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８−８８３の定義に従う。

本明細書で使用される「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」という用語は、一般的に軽鎖可変領域における残基２４〜３４｛ＬＣＤＲ１｝、５０〜５６｛ＬＣＤＲ２｝、８９〜９７｛ＬＣＤＲ３｝、および重鎖可変領域における残基３１〜３５｛ＨＣＤＲ１｝、５０〜６５｛ＨＣＤＲ２｝、９５〜１０２｛ＨＣＤＲ３｝（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｌｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｌｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ （１９９１）を参照する）、或いは、軽鎖可変領域における残基２６〜３２｛Ｌｌ｝、５０〜５２｛Ｌ２｝、９１〜９６｛Ｌ３｝および重鎖可変領域における残基２６〜３２｛Ｈ１｝、５３〜５５｛Ｈ２｝、９６〜１０１｛Ｈ３｝（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）を参照する）が含まれる、抗体の可変領域における抗原結合に関与するアミノ酸残基を指す。または、ＣＤＲは、当業者が周知の技術により、例えば、ＶＢＡＳＥ２データベースを利用してＩＭＧＴの定義に従って、以下の重鎖可変領域のアミノ酸配列または軽鎖可変領域のアミノ酸配列を分析することにより得られる。

本明細書で使用される「フレームワーク領域」または「ＦＲ」残基という用語は、上記で定義したＣＤＲ残基以外の抗体の可変領域におけるアミノ酸残基を指す。

「抗体」という用語は、抗体を生成する特定の方法によって制限されない。例えば、組換え抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体が含まれる。抗体は、例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭ抗体のような異なるアイソタイプの抗体であっても良い。

本明細書で使用される「抗原結合部位」という用語は、重鎖および軽鎖の可変領域（ＶＨおよびＶＬ）のアミノ酸残基で形成され、抗原結合に関与する部分を指す。この「抗原結合部位」は、抗原に相互作用し、且つ抗原に対する特異性と親和性を決定するアミノ酸残基を含む。この「抗原結合部位」は、さらに、上記の抗原に直接結合するアミノ酸残基の適切な配座を維持するために必要なフレームワーク領域のアミノ酸残基を含んでも良い。

本明細書で使用される「完全長抗体」という用語は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、２つの「完全長重鎖」および２つの「完全長軽鎖」からなる抗体を意味する。ここで、「完全長重鎖」とは、重鎖可変領域（ＶＨ）、重鎖定常領域ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域（ＨＲ）、重鎖定常領域ＣＨ２ドメイン、および重鎖定常領域ＣＨ３ドメインからなるポリペプチド鎖を指す。また、前記完全長抗体がＩｇＥアイソタイプに属する場合、必要に応じてさらに重鎖定常領域ＣＨ４ドメインを含む。好ましくは、「完全長重鎖」は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ＶＨ、ＣＨ１、ＨＲ、ＣＨ２およびＣＨ３からなるポリペプチド鎖である。「完全長軽鎖」は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、軽鎖可変領域（ＶＬ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）からなるポリペプチド鎖である。２組の完全長抗体鎖は、ＣＬとＣＨ１の間のジスルフィド結合と、２つの完全長重鎖のＨＲの間のジスルフィド結合によって連結されている。本発明の完全長抗体は、例えばヒトなどの単一種由来のものであってもよく、キメラ抗体またはヒト化抗体であってもよい。本発明の完全長抗体は、ＶＨとＶＬ組でそれぞれ形成した２つの抗原結合部位を含む。２つの抗原結合部位は、同じ抗原を特異的に認識／結合する。

本明細書で使用される「Ｆａｂ断片」という用語は、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる抗体断片を意味する。「Ｆａｂ’断片」という用語は、Ｆ（ａｂ’）_２断片の２つの重鎖断片のジスルフィド結合を還元した断片を意味し、このＦａｂ’断片は、完全な軽鎖と重鎖のＦｄ断片（ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなる）からなる。「Ｆ（ａｂ’）_２断片」という用語は、ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む抗体断片を意味する。前記各抗体断片は、それぞれ完全長抗体が結合する同じ抗原に特異的に結合する能力、および／または完全長抗体と競合して抗原に特異的に結合する能力を保持している。

本明細書で使用される「ｓｃＦｖ」という用語は、ＶＬおよびＶＨドメインを含む単一ポリペプチド鎖を指し、前記ＶＬおよびＶＨはリンカーで連結されている（例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３（１９８８）；ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｖｏｌｕｍｅ １１３，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｒｏｓｅｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照する）。このようなｓｃＦｖ分子は、ＮＨ_２−ＶＬ−リンカーＶＨ−ＣＯＯＨ又はＮＨ_２−ＶＨ−リンカーＶＬ−ＣＯＯＨの一般構造を有しても良い。本発明のｓｃＦｖにおけるＶＨとＶＬとの間に、さらにジスルフィド結合が存在してもよい。抗体のＶＨとＶＬの間にジスルフィド結合を導入する方法は、当技術分野で周知であり、例えば、米国特許出願Ｕ．Ｓ５，７４７，６５４；Ｒａｊａｇｏｐａｌ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇｉｎ．１０（１９９７）１４５３−１４５９；Ｒｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４（１９９６）１２３９−１２４５；Ｒｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ８（１９９５）１３２３−１３３１；Ｗｅｂｂｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３２（１９９５）２４９−２５８；Ｒｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２（１９９５）２８１−２８７；Ｒｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ，ＪＢＣ ２６９（１９９４）１８３２７−１８３３１；Ｒｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｔｅｒ．Ｊ．ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ５８（１９９４）１４２−１４９；または、Ｒｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４（１９９４）２７１４−２７１８を参照して、引用により本明細書に組み込まれる。本明細書で使用される「ｄｉ−ｓｃＦｖ」という用語は、２つのｓｃＦｖを連結した抗体断片を指す。

本明細書で使用される「Ｆｖ断片」という用語は、抗体のシングルアームのＶＬおよびＶＨドメインからなる抗体断片を意味する。

本明細書で使用される「親抗体」という用語は、本発明の二重特異性抗体の調製に使用される抗ＰＤＬ−１抗体または抗ＣＴＬＡ−４抗体を指す。この親抗体が有するアミノ酸配列は、例えばアミノ酸置換または構造変化などにより、本発明の二重特異性抗体に含まれる第一抗体またはｓｃＦｖの調製に使用される。

本発明の二重特異性抗体に含まれるＣＤＲ、ＶＨ、ＶＬ、ＣＨ、ＣＬ、ＨＣ、ＬＣは、ＰＤＬ−１またはＣＴＬＡ−４に特異的に結合する当分野で公知した他の抗体またはその抗体断片に由来してもよく、或いは、上記の公知した抗体、その抗体断片、またはそのＣＤＲ、ＶＨ、ＶＬ、ＣＨ、ＣＬ、ＨＣ、ＬＣに対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する抗体に由来してもよい。

本明細書で使用される「リンカー」という用語は、ペプチド結合で複数のアミノ酸残基を連結した線状のポリペプチドを指す。本発明のリンカーは、合成アミノ酸配列、またはヒンジ領域の機能を有するポリペプチドなどの天然に存在するポリペプチド配列であっても良い。このようなリンカーポリペプチドは、当技術分野で公知である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８；Ｐｏｌｊａｋ，ＲＪ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１−１１２３）を参照する）。

本明細書で使用される「特異的に結合する」という用語は、抗体とそれが対応する抗原との間の反応のような、２つの分子間の非ランダム結合反応（ｎｏｎ−ｒａｎｄｏｍ ｂｉｎｄｉｎｇ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を指す。一部の実施形態において、ある抗原に特異的に結合する抗体（又はある抗原に対して特異性を有する抗体）は、抗体が約１０^−５Ｍ未満の親和性（ＫＤ）で抗原に結合することを意味し、この親和性は、例えば、約１０^−６Ｍ未満、１０^−７Ｍ未満、１０^−８Ｍ未満、１０^−９Ｍ未満、または１０^−１０Ｍ未満である。本発明において、「ＫＤ」という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の平衡解離定数を指し、抗体と抗原の間の結合親和性を表現するために使用される。平衡解離定数が小さいほど、抗体と抗原の結合が強くなり、抗体と抗原の間の親和性が高くなる。通常、抗体（例えば、本発明の抗体）は、約１０^−５Ｍ未満の平衡解離定数（ＫＤ）で抗原（例えば、ＨＢｓＡｇ）に結合し、この平衡解離定数は、例えば、約１０^−６Ｍ未満、１０^−７Ｍ未満、１０^−８Ｍ未満、１０^−９Ｍ未満、または１０^−１０Ｍ未満である。平衡解離定数は、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ機器の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定される。

本明細書で使用される「ベクター」という用語は、ポリヌクレオチドを挿入することができる核酸ビヒクルを指す。ベクターは、挿入されたポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質を発現できる場合、発現ベクターと呼ばれる。ベクターは、形質転換、形質導入またはトランスフェクションによって宿主細胞に導入され、それが運ぶ遺伝物質因子を宿主細胞で発現させる。ベクターは、当業者に対して公知であり、プラスミド；ファージミド；コスミド；例えば、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）などの人工染色体；λファージやＭ１３ファージなどのファージ、および動物ウイルスなどが挙げられるが、これらに限定されない。ベクターとして使用される動物ウイルスとして、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス（例えば、ＳＶ４０）が挙げられるが、これらに限定されない。ベクターは、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサ−配列、選択因子、およびレポーター遺伝子などの発現を制御する複数の因子を含んでもよいが、これらに限定されない。さらに、ベクターは、複製起点を含んでもよい。

本明細書で使用される「宿主細胞」という用語は、ベクターの導入に用いられる細胞を指し、例えば、大腸菌または枯草菌などの原核細胞、酵母細胞またはアスペルギルスなどの真菌細胞、Ｓ２ショウジョウバエ細胞またはＳｆ９などの昆虫細胞、或いは、線維芽細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳ０細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、またはヒト細胞などの動物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される「同一性」という用語は、２つのポリペプチドの間または２つの核酸の間の配列一致性を意味する。比較される２つの配列のある位置が同じ塩基またはアミノ酸モノマーサブユニットによって占められた場合（例えば、２つのＤＮＡ分子のある位置がそれぞれアデニンによって占められているか、または２つのポリペプチドのある位置がそれぞれリジンによって占められている）、各分子はその位置で互いに同一である。２つの配列間の「同一性のパーセント」は、２つの配列が共有される一致した位置の数を、比較される位置の数で除算し、×１００した関数である。例えば、２つの配列の１０の位置のうち６つが一致する場合、この２つの配列は、６０％の同一性を有する。例えば、ＣＴＧＡＣＴとＣＡＧＧＴＴのＤＮＡ配列は、ともに５０％の同一性を有する（合計６つの位置のうち３つが一致する）。通常、同一性が最も高くなるように２つの配列を整列させる時、比較を行う。このような整列は、例えば、Ａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）などのコンピュータープログラムを用いて、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎらの方法（（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）を実施することで、実現される。ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に統合されたＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ Ｂｉｏｓｃｉ．，４：１１−１７（１９８８））のアルゴリズムを用い、ＰＡＭ１２０重量残余テーブル（ｗｅｉｇｈｔ ｒｅｓｉｄｕｅ ｔａｂｌｅ）、ギャップ長ペナルティ１２、ギャップペナルティ４によって、２つのアミノ酸配列の間の同一性パーセントを決定しても良い。さらに、ＧＣＧパッケージ（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍから入手可能）のＧＡＰプログラムに統合されたＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈ（Ｊ ＭｏＩ Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３（１９７０））のアルゴリズムを用い、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックス、および１６、１４、１２、１０、８、６または４のギャップウェイト（ｇａｐ ｗｅｉｇｈｔ）と１、２、３、４、５または６の長さウェイト、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントを決定しても良い。

本明細書に係る２０つの通常のアミノ酸の表示は、従来の方法に従う。例えば、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ａ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ （２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅ．Ｓ．Ｇｏｌｕｂ ａｎｄ Ｄ．Ｒ．Ｇｒｅｎ，Ｅｄｓ．，Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．（１９９１））を参照して、引用により本明細書に組み込まれる。本発明において、用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、同じ意味を有し、互換的に使用される。さらに、本発明では、アミノ酸は、一般的に、当分野で公知のように一文字および三文字の略語で表される。例えば、アラニンは、ＡまたはＡｌａで表われる。

本明細書で使用される「薬学的に許容される担体および／または賦形剤」という用語は、被験者や活性成分と薬理学的および／または生理学的に適合する担体および／または賦形剤を指し、この担体および／または賦形剤は当分野で公知（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ． Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｇｅｎｎａｒｏ ＡＲ，１９ｔｈ ｅｄ．Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９５を参照する）であり、ｐＨ調整剤、界面活性剤、アジュバント、イオン強度増強剤、希釈剤、浸透圧維持剤、吸収遅延剤、保存剤が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、ｐＨ調整剤として、リン酸緩衝液が挙げられるが、これに限定されない。界面活性剤として、例えばＴｗｅｅｎ−８０などのカチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤または非イオン性界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。イオン強度増強剤として、塩化ナトリウムが挙げられるが、これに限定されない。保存剤として、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などの様々な抗菌剤および抗真菌剤が挙げられるが、これらに限定されない。浸透圧維持剤として、糖、ＮａＣｌなどが挙げられるが、これらに限定されない。吸収遅延剤として、モノステアリン酸塩およびゼラチンが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される「被験者」という用語は、例えば、ヒトなどの霊長類のような哺乳動物を指す。一部の実施形態において、前記被験者（例えば、ヒト）は、ＣＴＬＡ−４および／またはＰＤＬ−１関連疾患に罹患しているか、または前記疾患に罹患するリスクを有する。一般的に、このような疾患または病状の特徴は、ＣＴＬＡ−４および／またはＰＤＬ−１のレベルの低下、或いはＣＴＬＡ−４および／またはＰＤＬ−１の活性の抑制によって、緩和または治癒されることである。

本明細書で使用される「有効量」という用語は、所望の効果を達成するか、または少なくとも部分的に達成するのに十分な量を指す。例えば、疾患（例えば、ＣＴＬＡ−４および／またはＰＤＬ−１関連疾患）の予防有効量とは、疾患（例えば、ＣＴＬＡ−４および／またはＰＤＬ−１関連疾患）の発生を予防、阻止、または遅延させるのに十分な量である。疾患の治療有効量とは、すでに疾患に罹患した患者の疾患およびその合併症を治癒または少なくとも部分的に阻止するのに十分な量である。このような有効量を測定することは、当業者の能力の範囲内である。例えば、治療用途の有効量は、治療される疾患の重症度、患者自身の免疫系の全体的な状態、年齢や体重や性別のような患者の一般的な状態、薬物の投与方法、および同時に実施するその他の治療法などに依存する。

本明細書で使用される「抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）」という用語は、Ｉｇが細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球またはマクロファージ）におけるＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合することで、これらの細胞傷害性エフェクター細胞を、抗原が付着している標的細胞に特異的に結合させた後、細胞毒の分泌によって標的細胞を殺滅する細胞傷害形態を指す。抗体のＡＤＣＣ活性を検出する方法は、当分野で既知であり、例えば、検出する抗体とＦｃ受容体（例えばＣＤ１６ａ）との間の結合活性を測定することにより評価される。

本明細書で使用される「補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）」という用語は、補体成分であるＣｌｑと抗体であるＦｃと結合することで補体カスケードを活性化させる細胞傷害形態を指す。抗体のＣＤＣ活性を検出する方法は、当分野で既知であり、例えば、検出する抗体とＦｃ受容体（例えばＣ１ｑ）との間の結合活性を測定することにより評価される。

発明の効果
従来技術と比較して、本発明は、少なくとも以下の有利な効果を有する。

本発明の二重特異性抗体は、ＣＴＬＡ−４およびＰＤＬ−１を特異的に認識／結合するだけでなく、ＣＴＬＡ−４およびＰＤＬ−１に対する親和性もそれぞれの親抗体に相当するか、又はＣＴＬＡ−４に対する親和性もその親抗体により弱い。本発明の二重特異性抗体は、生体外および被験者の体内において、ＣＴＬＡ−４および／またはＰＤＬ−１の活性を同時に著しく抑制し、ＣＴＬＡ−４および／またはＰＤＬ−１のシグナル伝達経路を遮断することができる。さらに、本発明の二重特異性抗体は、第一抗体の親抗体と同等の優れた熱安定性を有する。一部の細胞レベルおよび生体内実験において、本発明の二重特異性抗体が、親抗体よりも明らかに優れた抑制活性および低減された抗体毒性を示し、薬物の安全性が向上することは、特に驚くべきことである。従って、本発明の二重特異性抗体は、ＣＴＬＡ−４およびＰＤＬ−１関連疾患（例えば、自己免疫疾患、腫瘍または感染症）を治療する可能性があり、大きな臨床的価値を有する。

以下に、添付の図面および実施例を参照して本発明の実施形態について詳細に説明するが、以下の図面および実施例が単に本発明を説明するために使用され、本発明の範囲を限定することを意図しない。図面および好ましい実施形態の以下の詳細な説明によれば、本発明の様々な目的および利点は、当業者にとって明らかになるであろう。

図１は、抗ＰＤＬ−１およびＣＴＬＡ−４組換え二重特異性抗体であるＡＢ０３およびＡＢ０４の構造の図を示す。 図２は、ＡＢ０３およびＡＢ０４の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥのエレクトロフェログラムを示す。レーンは、左から右のレ−ン：ＡＢ０１還元、ＡＢ０２還元、ＡＢ０３還元、ＡＢ０４還元である。 図３は、ＰＤＬ−１に対する抗体の結合活性曲線を示す。 図４における図４Ａと図４Ｂは、異なるバッチのＣＴＬＡ４に対する抗体の結合活性曲線を示す。 図５は、抗体がＰＤＬ−１およびＣＴＬＡ−４に対して同時に結合する活性曲線を示す。 図６は、ＰＤ−１とＰＤＬ−１との結合を遮断する抗体の活性曲線を示す。 図７は、ＣＤ１６Ａａ（Ｖａｌ）に対する抗体の結合活性曲線を示す。 図８は、Ｃ１ｑに対する抗体の結合活性曲線を示す。 図９は、抗体がＰＤ１／ＰＤＬ−１細胞結合を遮断する活性曲線を示す。 図１０は、ＳＥＢで刺激されたＰＢＭＣの存在下でＴ細胞によるＩＬ−２分泌を増強する抗体の活性グラフを示す。 図１１は、非小細胞肺癌モデルにおけるＡＢ０１の治療有効性を示す。 図１２は、結腸癌のマウスモデルにおける抗体の治療有効性を示す。 図１３は、非小細胞肺癌のマウスモデルにおける抗体の治療有効性を示す。

配列情報
本発明に係る一部の配列情報を表１に示す。

本発明は、本発明を説明するため（本発明を限定することを意図しない）の以下の実施例を参照して説明される。

特に明記しない限り、本発明で使用される分子生物学的実験方法および免疫検出方法は、基本的にＪ Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９，ａｎｄ Ｆ／Ｍ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９５を参照して実施されるが、制限エンドヌクレアーゼの使用は、製品の製造元が推奨する条件に従う。実施例が例示的に本発明を説明するものであり、且つ本発明が保護を請求する範囲を限定することを意図しないことは、当業者にとって明らかである。

実施例１：抗ＰＤＬ−１／ＣＴＬＡ−４組換え二重特異性抗体をコードする発現ベクターの構築
この実施例において、表２に示す抗ＣＴＬＡ−４親抗体（ＡＢ０２）は、ブリストル・マイヤーズスクイブ社から購入した。まず、ＤＮＡ組換え技術によって表２に示す抗ＰＤＬ−１親抗体（ＡＢ０１）を得た後、第一ポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクター、および第二ポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターをそれぞれ構築し、本発明の組換え抗体であるＡＢ０３およびＡＢ０４を得た。

親抗体ＡＢ０１およびＡＢ０２それぞれの可変領域および定常領域の配列を表２に示す。親抗体（ＡＢ０１）をコードする核酸配列は、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（Ｎａｎｊｉｎｇ）によって全遺伝子として合成され、ＰＵＣ１９ベクターにクロ−ニングされた。

表３に示す各組換え抗体の構築形態に従って、該組換え抗体の第一ポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列および第二ポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を構築した。各組換え抗体におけるｓｃＦｖについて、ＶＬおよびＶＨは、ペプチドリンカーＳ２（配列番号２５、アミノ酸配列：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）を介して連結され、また、該ｓｃＦｖの親抗体におけるＶＨの４４番目およびＶＬの１００番目のアミノ酸を、それぞれＰＣＲ部位特異的突然変異法によりシステイン（Ｃｙｓ、Ｃ）に変異させ、該ｓｃＦｖにおけるＶＨとＶＬの間にジスルフィド結合を形成した。ここで、変異したＡＢ０１−ｓｃＦｖのアミノ酸配列は配列番号３１に記載され、変異したＶＬのアミノ酸配列は配列番号１０に記載され、変異したＶＨのアミノ酸配列は配列番号８に記載され、変異したＡＢ０２−ｓｃＦｖのアミノ酸配列は配列番号３２に記載され、変異したＶＬのアミノ酸配列は配列番号２２に記載され、変異したＶＨのアミノ酸配列は配列番号２０に記載される。

表３に示す各組換え抗体の構築形態を図１に例示する。

具体的には、例示的な部分組換え抗体である核酸構築物は、以下のように構築された。

ＡＢ０２−ｓｃＦｖをコードするヌクレオチド配列を、配列番号２６に記載したリンカーＳ１をコードするヌクレオチド配列を介して、ＡＢ０１のＶＨをコードするヌクレオチド配列の５’末端に連結した後、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ０１８５７の重鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列の５’末端に連結し、ＡＢ０３の第一ポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を構築した。ここで、Ｎ末端からＣ末端までのＡＢ０２−ｓｃＦｖのドメイン順序はＶＬ−Ｓ２−ＶＨであり、それによってコードされたアミノ酸配列は配列番号３２に記載された。

ＡＢ０１軽鎖をコードするヌクレオチド配列を、ＡＢ０３の第二ポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列とした。

ＡＢ０１のＶＨのヌクレオチド配列を、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１８５７の重鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列の５’末端に連結し、配列番号２７に記載されたリンカーＳ１をコードするヌクレオチド配列を介してＡＢ０２−ｓｃＦｖをコードするヌクレオチド配列の５’末端に連結し、ＡＢ０４の第一ポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を構築した。ここで、Ｎ末端からＣ末端までのＡＢ０２−ｓｃＦｖのドメイン順序はＶＬ−Ｓ２−ＶＨであり、それによってコードされたアミノ酸配列は配列番号３２に記載された。

ＡＢ０１軽鎖をコードするヌクレオチド配列は、ＡＢ０４の第二ポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列とした。

前記第一ポリペプチド鎖または第二ポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列は、ＩｇＧ−Ｋａｐｐａシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列（配列番号３０のアミノ酸配列）に連結され、相同組換えによってそれぞれにｐＴＴ５プラスミドを導入し、第一ポリペプチド鎖をコードする発現ベクター、および第二ポリペプチド鎖をコードする発現ベクターｐＴＴ５を構築した。最終的に得られた各組換え抗体のアミノ酸配列を表４に示す。

実施例２：抗ＰＤＬ−１／ＣＴＬＡ−４組換え二重特異性抗体の発現
生長良好の対数期のＣＨＯ−Ｓ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社から購入、カタログ番号：Ａ１１５５７０１）を遠心分離し、３．５×１０^６細胞／ｍｌで２５０ｍｌのＣＨＯｇｒｏ培地（ＭＩＲＵＳ社から購入）に播種した。実施例１で得られたトランスフェクションを行うプラスミドを、０．２２μｍのメンブレンフィルターで濾過することにより滅菌した。１２５μｇの第一ポリペプチド鎖組換えプラスミドおよび１２５μｇの対応する第二ポリペプチド鎖組換えプラスミドを、２５ｍｌのＣＨＯｇｒｏ複合体形成溶液（ＣＨＯｇｒｏ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、ＭＩＲＵＳ社から購入）に加え、１ｍｇ／ｍｌのＰＥＩＭＡＸ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｓ社から購入）１．２５ｍｌを添加し、３回振とうして均一に混合し、１０分間放置し、２５０ｍｌの前記細胞培養液に加えた。培養物を３７℃、５％ＣＯ_２のシェーカーに入れ、２４時間後、１０％Ｓｈｅｆｆ−ＣＨＯ ＰＦ ＡＣＦ（ＫＥＲＲＹ社から購入）２０ｍｌを加え、さらに７日間培養を続けて細胞培養物を回収した。

実施例３：抗ＰＤＬ−１／ＣＴＬＡ−４組換え二重特異性抗体の精製
先ず、実施例２で７日間発現されたＣＨＯ−Ｓ細胞培養物を低速で遠心分離して、細胞沈殿物と上清に分離した後、さらに高速で遠心分離して清澄な試料液を得た。組換え抗体の精製は、アフィニティークローマトグラフィー法（プロテインＡ）とイオン交換法との二段階方法によって行った。精製に用いられた媒介物は、それぞれＧＥ社製のＭＡＢ Ｓｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ、およびＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社製のＥｓｈｍｕｎｏ ＣＰＸであった。各組換え二重特異性抗体の発現量がほぼ同等で、いずれも４０〜８５ｍｇ／Ｌの範囲内であり、また同等の条件下での抗ＰＤＬ−１親抗体ＡＢ０１の発現レベルと一致したことは、各組換え抗体がいずれも正常に発現され、且つ高い発現効率を有することを示した。具体的な発現レベルを表５に示す。単離、精製された組換え抗体は、限外濾過チューブにより濃縮された後、ＰＢＳ溶液に溶解させた。還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥを図２に示す。図２では、ＡＢ０１およびＡＢ０２が還元された後に、それぞれ５０ｋＤａ（重鎖）および２５ｋＤａ（軽鎖）であり；二重特異性抗体ＡＢ０３およびＡＢ０４の還元バンドのサイズは、それぞれ７５ｋＤａ（第一ペプチド鎖）および２５ｋＤａ（第二ペプチド鎖）であり、且つＳＥＣ純度は、それぞれ９６．３４％および９６．０４％であった。バンドのサイズが予想と一致たことは、各組換え二重特異性抗体がいずれも効率的に発現され、正しく組み立てられたことを示した。さらに、明らかな凝集や分解がないことは、組換え二重特異性抗体の安定性が優れたことを示した。

実施例４：抗ＰＤＬ−１／ＣＴＬＡ−４組換え二重特異性抗体の抗原結合活性の測定
本実施例では、各組換え二重特異性抗体とその親抗体が同一抗原に対して結合する親和性の差、および組換え二重特異性抗体が２種類の抗原に同時に結合する相対親和性を、ＥＬＩＳＡ法でそれぞれ測定し、親抗体の能力に比べて１類種の抗原のみを遮断する能力は低くなるかどうか、２種類の抗原を同時に遮断して２つのシグナル経路を遮断することにより相乗効果を生み出すが得られるかどうかを検証する。

４．１ ＰＤＬ−１に対する組換え二重特異性抗体の結合活性の測定
１００ｎｇ／ウェルで組換えＰＤＬ−１−ｍＦｃタンパク質（Ｋｅｌｕｎ−Ｂｉｏｔｅｃｈから入手、Ｕｎｉｐｏｒｔ Ｎｏ．：Ｑ９ＮＺＱ７）を９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｔｈｅｒｍｏ社から購入）に添加し、４℃でコーティングを一晩実施した。翌日、ウェル内の溶液を廃棄し、洗浄緩衝液（０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含むリン酸緩衝液）でウェルを１回洗浄し、ウェル内の溶液を捨て、２％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液を１００μｌ／ウェルで添加し、ウェルを３７℃で２時間ブロックした後、ウェル内の溶液を捨てた。組換え二重特異性抗体であるＡＢ０３とＡＢ０４および親抗体であるＡＢ０１を、１０００ｎｇ／ｍＬから１１濃度勾配で３倍希釈して、１００μｌ／ウェルでウェルに加えた。３７℃でＥＬＩＳＡプレートを２時間インキュベートした後、ウェル内の溶液を捨て、洗浄緩衝液で３回洗浄し、１００μｌ／ウェルでＨＲＰ結合Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）溶液を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。１００μｌ／ウェルでＴＭＢ溶液を添加し、室温で反応を約５分間行った。１００μｌ／ウェルで停止溶液を添加してＥＬＩＳＡプレートリーダーにセットし、ＯＤ４５０吸光度値を読み取った。実験データについて、図３に示すように、カーブフィッティングを行い、ＥＣ５０を計算した。

ＥＣ５０の結果を表６に示す。測定したＰＤＬ−１−ｍＦｃに対する組換え二重特異性抗体の結合活性ＥＣ５０は、ＰＤＬ−１−ｍＦｃに対する親抗体ＡＢ０１の結合活性と同等である。本発明の組換え抗体は、全体としてＰＤＬ−１−ｍＦｃに対する親抗体の結合活性と同等程度に優れた結合活性を維持することを示した。

４．２ ＣＴＬＡ−４に対する組換え二重特異性抗体の結合活性の測定
２つのバッチの組換えＣＬＴＡ−４−Ｈｉｓタンパク質（Ｋｅｌｕｎ−Ｂｉｏｔｅｃｈ社から入手、Ｕｎｉｐｏｒｔ Ｎｏ．：Ｐ１６４１０）をそれぞれＰＢＳで希釈して、１００μｌ／ウェルで９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに加え、４℃でコーティングを一晩実施した。翌日、ウェル内の溶液を廃棄し、洗浄緩衝液でウェルを１回洗浄し、ウェル内の溶液を捨て、２％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液を１００μｌ／ウェルで添加し、３７℃で２時間ブロックした後、ウェル内の溶液を捨てた。組換え二重特異性抗体であるＡＢ０３とＡＢ０４および抗ＣＴＬＡ−４親抗体であるＡＢ０２を、３０ｎＭから１１濃度勾配で４倍希釈して、１００μｌ／ウェルでウェルに加えた。３７℃でＥＬＩＳＡプレートを２時間インキュベートした後、ウェル内の溶液を捨て、洗浄緩衝液で３回洗浄し、ＨＲＰ結合Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）溶液を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。ＴＭＢ溶液を添加し、室温で反応を約８分間行った。停止溶液を添加してＥＬＩＳＡプレートリーダーにセットし、ＯＤ４５０吸光度値を読み取った。実験データについて、カーブフィッティングを行い、２つのバッチの組換えＣＬＴＡ−４−Ｈｉｓ結合活性の測定結果を図４Ａと図４Ｂに示し、ＥＣ５０を計算した。

ＥＣ５０の結果を表７に示す。

実験結果によれば、測定したＣＴＬＡ−４に対する組換え二重特異性抗体ＡＢ０３のＥＣ５０は、親抗体ＡＢ０２に比べてわずかに増加したが、ＣＴＬＡ−４に対する組換え二重特異性抗体ＡＢ０４のＥＣ５０は、親抗体ＡＢ０２の約１０〜１２倍であった。ＣＴＬＡ−４に対するＡＢ０４の結合活性は、親抗体の結合活性より明らかに弱いが、ｐＭレベルの効率的な結合活性を有することが分かる。

４．３ 組換え二重特異性抗体がＰＤＬ−１およびＣＴＬＡ−４に同時に結合する活性の測定
１００ｎｇ／ウェルで組換えＰＤＬ−１−ｍＦｃタンパク質を９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに添加し、４℃でコーティングを一晩実施した。翌日、ウェル内の溶液を廃棄し、洗浄緩衝液（０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含むリン酸緩衝液）でウェルを１回洗浄し、ウェル内の溶液を捨て、２％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液を１００μｌ／ウェルで添加し、３７℃で２時間ブロックした後、ウェル内の溶液を捨てた。組換え二重特異性抗体を、１００００ｎｇ／ｍＬから１１濃度勾配で５倍希釈して、１００μｌ／ウェルでウェルに加えた。３７℃でＥＬＩＳＡプレートを２時間インキュベートした後、ウェル内の溶液を捨て、洗浄緩衝液で３回洗浄し、それぞれのウェルに１．５μｇ／ｍｌのＣＬＴＡ−４−Ｈｉｓタンパク質を１００μｌ／ウェルで加え、３７℃で２時間インキュベートし、ウェル内の溶液を捨て、洗浄緩衝液でウェルを３回洗浄した。ＨＲＰ結合Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−Ｈｉｓ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社から購入）溶液を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。ＴＭＢ溶液を添加し、室温で反応を約５分間行った。停止溶液を添加してＥＬＩＳＡプレートリーダーにセットし、ＯＤ４５０吸光度値を読み取った。実験データについて、図５に示すように、カーブフィッティングを行い、ＥＣ５０を計算した。

ＥＣ５０の結果を表８に示す。組換え二重特異性抗体ＡＢ０３およびＡＢ０４がＰＤＬ−１およびＣＴＬＡ−４の２種類の抗原に同時に結合するＥＣ５０は、いずれもｐＭレベルであった。上記の結果は、本発明の組換え二重特異性抗体が１つの抗原に結合した後、もう１つの抗原への結合に影響を与えないことを示した。ＡＢ０３やＡＢ０４などの組換え二重特異性抗体は、いずれも２種類の抗原に同時に効率的に結合でき、腫瘍免疫に重要な役割を果たすＰＤＬ−１およびＣＴＬＡ−４ターゲットを同時に遮断して、２つのシグナル経路を同時に阻害することで、腫瘍治療において薬力学的に相乗的な役割を果たすことができる。

実施例５：組換え二重特異性抗体によるＰＤ−１／ＰＤＬ−１結合の遮断の競合ＥＬＩＳＡ測定
本実施例において、競合ＥＬＩＳＡによって組換え二重特異性抗体がＰＤ１とＰＤＬ−１との結合を遮断できるかどうかを検出した。

１００ｎｇ／ウェルで組換えＰＤ１−ｈＦｃタンパク（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社から購入）を９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｔｈｅｒｍｏ社から購入）に添加し、４℃でコーティングを一晩実施した。翌日、ウェル内の溶液を廃棄し、洗浄緩衝液（０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含むリン酸緩衝液）で１回洗浄し、ウェル内の溶液を捨て、２％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液を１００μｌ／ウェルで添加し、ウェルを３７℃で２時間ブロックした後、ウェル内の溶液を捨てた。組換え二重特異性抗体であるＡＢ０３とＡＢ０４および親抗体であるＡＢ０１を、１０μｇ／ｍＬから１１濃度勾配で１．５倍希釈して、１００μｌ／ウェルでウェルに加えた。等量の１．６μｇ／ｍｌのＰＤＬ−１−ｍＦＣ（Ｋｅｌｕｎ−Ｂｉｏｔｅｃｈ社から入手）を加えて均一に混合し、室温で混合物を３０分間放置した後、１００μｌ／ウェルでＥＬＩＳＡプレートに加えた。３７℃でＥＬＩＳＡプレートを２時間インキュベートし、ウェル内の溶液を捨て、洗浄緩衝液で３回洗浄し、１００μｌ／ウェルでＨＲＰ結合Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｔｈｅｒｍｏ社から購入）溶液を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。１００μｌ／ウェルでＴＭＢ溶液を添加し、室温で反応を約５分間行った。１００μｌ／ウェルで停止溶液を添加してＥＬＩＳＡプレートリーダーにセットし、ＯＤ４５０吸光度値を読み取った。実験データについて、図６に示すように、カーブフィッティングを行い、ＥＣ５０を計算した。

ＥＣ５０の結果を表９に示す。測定した組換え二重特異性抗体ＡＢ０３やＡＢ０４がＰＤ１とＰＤＬ−１との結合を遮断する活性ＥＣ５０は、抗ＰＤＬ−１親抗体ＡＢ０１よりも強かった。本発明の二重特異性抗体は、全体として親抗体がＰＤＬ−１とＰＤ１との結合を遮断する活性と同等またはそれより良好な遮断活性を維持することを示した。

実施例６．組換え二重特異性抗体のＣＤＣ、ＡＤＣＣ活性のＥＬＩＳＡ測定
本実施例において、組換え二重特異性抗体のＡＤＣＣ、ＣＤＣ活性を検証するために、組換え二重特異性抗体とＣＤ１６ａ（Ｖａｌ）、Ｃ１ｑそれぞれとの結合をＥＬＩＳＡ実験によって測定した。

６．１ ＣＤ１６ａ（Ｖａｌ）に対する組換え二重特異性抗体の結合活性の測定
１００ｎｇ／ウェルで組換えＣＤ１６ａ（Ｖａｌ）タンパク（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社から購入）を９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｔｈｅｒｍｏ社から購入）に添加し、４℃でコーティングを一晩実施した。翌日、ウェル内の溶液を廃棄し、洗浄緩衝液（０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含むリン酸緩衝液）で１回洗浄し、ウェル内の溶液を捨て、２％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液を１００μｌ／ウェルで添加し、ウェルを２５℃で２時間ブロックした後、ウェル内の溶液を捨てた。５０μｇ／ｍｌで組換え二重特異性抗体ＡＢ０３、ＡＢ０４および親抗体ＡＢ０１、陽性対照抗体ヒトＩｇＧ１（Ｋｅｌｕｎ−Ｂｉｏｔｅｃｈ社から入手）を、それぞれＧｏａｔ Ｆ（ａｂ）_２ ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ Ｋａｐｐａ（ＢＩＯＲＡＤ社から購入）と３７℃で１時間架橋反応を行った後、１１濃度勾配で３倍希釈して、１００μｌ／ウェルで混合物をウェルに加えた。２５℃でＥＬＩＳＡプレートを２時間インキュベートした後、ウェル内の溶液を捨て、ウェルを洗浄緩衝液で３回洗浄した。１：１００００のＨＲＰ結合Ｆ（ａｂ）_２アフィニティ精製Ｆ（ａｂ’）_２断片化ヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ社から購入）を１００μｌ／ウェルでプレートに添加し、２５℃で１時間インキュベートした。ウェル内の溶液を捨て、洗浄緩衝液でウェルを５回洗浄して、１００μｌ／ウェルでＴＭＢ溶液をウェルに添加し、室温で約３０分間反応した。１００μｌ／ウェルで停止溶液を添加してＥＬＩＳＡプレートリーダーにセットし、ＯＤ４５０吸光度値を読み取った。実験データについて、図７に示すように、カーブフィッティングを行った。

結果を図７に示す。測定した組換え二重特異性抗体ＡＢ０３、ＡＢ０４は、ＣＤ１６ａ（Ｖａｌ）タンパクに対する結合活性を有し、且つヒトＩｇＧ１の結合活性に相当する。一方、ＡＢ０１は、ＣＤ１６ａ（Ｖａｌ）にほとんど結合しなかった。本発明の組換え二重特異性抗体がＡＤＣＣ活性を有することが明らかになった。

６．２ Ｃ１ｑに対する組換え二重特異性抗体の結合活性の測定
組換え二重特異性抗体ＡＢ０３、ＡＢ０４ならびに親抗体ＡＢ０１および陽性対照抗体ヒトＩｇＧ１（Ｋｅｌｕｎ−Ｂｉｏｔｅｃｈ社から入手）を、５００μｇ／ｍｌから１１濃度勾配で３倍希釈して、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに１００μｌ／ウェルで加え、４℃でコーティングを一晩実施した。翌日、ウェル内の溶液を廃棄し、洗浄緩衝液でウェルを１回洗浄し、ウェル内の溶液を捨て、２％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液を１００μｌ／ウェルで添加し、３７℃で２時間ブロックした後、ウェル内の溶液を捨てた。２％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液で３μｇ／ｍｌに希釈したＣ１ｑ（ＰＲＯＳＰＥＣ社から購入）を１００μｌ／ウェルでウェルに添加した。３７℃でＥＬＩＳＡプレートを２時間インキュベートした後、ウェル内の溶液を捨て、洗浄緩衝液で３回洗浄した。１：２００に希釈したＨＲＰ抗Ｃ１ｑ抗体（Ａｂｃａｍ社から購入）溶液を１００μｌ／ウェルで添加し、３７℃でプレートを１時間インキュベートした後、ウェル内の溶液を捨て、洗浄緩衝液で５回洗浄し、ＴＭＢ溶液を加え、室温で約５分間反応させた。停止溶液を添加してＥＬＩＳＡプレートリーダーにセットし、ＯＤ４５０吸光度値を読み取った。実験データについて、図８に示すように、カーブフィッティングを行った。

結果を図８に示す。測定した組換え二重特異性抗体ＡＢ０３、ＡＢ０４は、ヒトＩｇＧ１に比べて、強いＣ１ｑタンパクに対する結合活性を有するので、より強いＣＤＣ活性を有することが明らかになった。

実施例７：熱変性温度Ｔｍの測定
７．１ ＤＳＦ（示差走査蛍光法）による組換え二重特異性抗体のＴｍ値の測定
組換え二重特異性抗体と親抗体ＡＢ０１を、ＰＢＳ溶液で１ｍｇ／ｍＬに希釈した。ＳＹＰＲＯ（登録商標）オレンジタンパク質ゲル染色液（Ｏｒａｎｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｅｌ Ｓｔａｉｎ、Ｔｈｅｒｍｏ社から購入、Ｃａｔ＃Ｓ６６５１）を、蒸留水で４０倍希釈した。希釈サンプル１２．５μＬ、ＳＹＰＲＯ（登録商標）オレンジタンパク質ゲル染色液４．２μＬ、蒸留水８．３μＬを０．２ｍｌの遠心管に順次加えた。混合物を均一に混合した後、蛍光定量ＰＣＲ装置（Ｔｈｅｒｍｏ社から購入、モデル７５００）にセットし、反応パラメーターは、２５℃で３分間、１％の速度で９５℃に昇温し、９５℃で２分間とした。

７．２ ＤＳＣ（示差走査熱量測定法）による組換え二重特異性抗体のＴｍ値の測定
ＰＢＳ溶液で組換え二重特異性抗体を１ｍｇ／ｍＬに希釈し、９μｌ／ウェルでハイスループットタンパク質安定化アナライザー（ＵＮＣＨＡＩＮＥＤ ＬＡＢＳ社、モデルＵｎｃｌｅ）に加えた。反応パラメーターは、０．３℃／ｍｉｎの速度で２５℃〜９５℃とした。

ＤＳＦおよびＤＳＣの結果を表１０に示す。前記組換え二重特異性抗体ＡＢ０３、ＡＢ０４の熱安定性は良好である。中でも、ＡＢ０３の熱安定性は、ＡＢ０４の熱安定性よりも優れており、ＡＢ０３のＴｍ値は、親抗体ＡＢ０１、ＡＢ０２のＴｍ値に近い。全体として、本発明の組換え二重特異性抗体は良好な熱安定性を有する。

実施例８：組換え二重特異性抗体によるＰＤ１／ＰＤＬ−１の遮断の細胞活性
レポーター遺伝子アッセイ法によりＰＤ−１／ＰＤＬ−１抗体の生物活性を測定した。ＰＤＬ−１および抗ＣＤ３−ｓｃＦｖを安定して発現するＣＨＯ−ＰＤＬ−１−ＣＤ３Ｌ細胞株を標的細胞とし、ＰＤ−１およびルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）を安定して発現するＪｕｒｋａｔ−ＰＤ−１−ＮＦＡＴ細胞株をエフェクター細胞として使用した。ここで、前記ルシフェラーゼの遺伝子は、ＮＦＡＴ因子（転写因子）（ＩＬ−２プロモーター）によって制御される。ＰＤ−１とＰＤＬ−１との結合は、ＣＤ３下流シグナルの伝達を遮断することができるため、ルシフェラーゼの発現を阻害する。ＰＤ−１抗体またはＰＤＬ−１抗体を添加すると、この遮断効果が逆転され、ルシフェラーゼを発現させて蛍光シグナルを検出できるようになる。

具体的な実験手順：Ｊｕｒｋａｔ−ＰＤ１ＮＦＡＴ細胞およびＣＨＯ−Ｓ−ＯＫＴ３−ＰＤＬ１細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ社から購入）を２００ｇで５分間遠心分離し、測定緩衝液ＲＰＭＩ１６４０＋１％ＦＢＳで再懸濁した。５×１０^５／４０μｌ／ウェルでＣＨＯ−Ｓ−ＯＫＴ３−ＰＤＬ１細胞をプレートに播種した。２．５×１０^６／４０μｌ／ウェルでＪｕｒｋａｔ−ＰＤ１−ＮＦＡＴ細胞を、ＣＨＯ−Ｓ−ＯＫＴ３−ＰＤＬ１細胞をあらかじめ播種したウェルに加え、さらに、１００μｇ／ｍＬから５倍希釈された４０μＬの組換え二重特異性抗体ＡＢ０３、ＡＢ０４および抗体ＡＢ０１を加えた。６時間のコインキュベーション後、共培養物を取り出し、室温で２０分間放置し、６０μＬの検出試薬Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社から購入）を添加し、室温で５分間振とうし、ＥＬＩＳＡプレートリーダー（ＢＭＧ社、ＰＨＥＡＲｓｔａｒ ＦＳ）によって測定した。図９に示すように、実験データについて、ＧｒａｐｈＰａｄ ｐｒｉｓｍ５によってカーブフィッティングを行い、ＥＣ５０を計算した。

結果を表１１に示す。測定した組換え二重特異性抗体ＡＢ０３やＡＢ０４がＰＤ１とＰＤＬ−１との結合を遮断する細胞活性ＥＣ５０は、抗ＰＤＬ−１親抗体ＡＢ０１の細胞活性と同等である。本発明の組換え二重特異性抗体は、全体として親抗体がＰＤＬ−１とＰＤ１との結合を遮断する細胞活性と同等に優れた遮断細胞活性を維持することを示した。

実施例９：ＳＥＢで刺激されたＰＢＭＣの存在下でＴ細胞によるＩＬ−２分泌を増強する組換え二重特異性抗体の活性
ス−パ−抗原（ＳＥＢ）は、ＡＰＣ細胞におけるＭＨＣ ＩＩとＴ細胞におけるＴＣＲとを架橋させて、Ｔ細胞を活性化し、ＩＬ−２サイトカイン発現を促進することができる。Ｔ細胞におけるＰＤ１とＡＰＣ細胞におけるＰＤＬ−１との結合、およびＴ細胞におけるＣＴＬＡ−４とＡＰＣ細胞におけるＣＤ８０／ＣＤ８６との結合は、Ｔ細胞の活性化を阻害し、ＩＬ−２サイトカイン発現を減少させる。本発明の組換え二重特異性抗体は、ＰＤ１／ＰＤＬ−１およびＣＴＬＡ−４／ＣＤ８０（ＣＤ８６）の結合を遮断し、ＳＥＢで刺激されたＰＢＭＣの存在下でＴ細胞によるＩＬ−２の分泌をさらに促進することができる。

具体的な実験手順：ＰＢＭＣ細胞を蘇生し、５ｍＬのＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）で再懸濁させ、細胞生存率は８５％であり、生存細胞密度は８×１０^５細胞／ｍｌであり、ＣＯ_２インキュベーターで３７℃下、２時間以上培養した。１０^５細胞／ウェルで１２０μＬの細胞懸濁液をウェルに加えた。２．５ｎｇ／ｍＬのＳＥＢ（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含むＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳの抗体希釈液を調製し、組換え二重特異性抗体ＡＢ０３、ＡＢ０４および対照抗体ＡＢ０１、ＡＢ０２をそれぞれ希釈し、８０μＬの抗体希釈液を対応するウェルに加え、均一に混合し、３７℃のＣＯ_２インキュベーターで３日間培養した。上清を採取し、ＩＬ−２試験キット（ＣｉｓＢｉｏ社から購入）によってＩＬ−２の発現量を測定した。

結果を図１０に示す。測定した組換え二重特異性抗体ＡＢ０３およびＡＢ０４は、親抗体ＡＢ０１およびＡＢ０２と比較して、全体としていずれもＳＥＢで刺激されたＰＢＭＣにおけるＩＬ−２分泌を大幅に増加させた。さらに、高濃度の場合では、組換え二重特異性抗体および親抗体は、いずれも最大の応答値を表した。低濃度の抗体の条件下では、組換え二重特異性抗体ＡＢ０３およびＡＢ０４の機能は、親抗体ＡＢ０１およびＡＢ０２（アスタリスク付け）と比較してある程度強化された。

実施例１０：結腸癌に対するＰＤＬ−１抗体ＡＢ０１のインビボでの有効性
１．実験用薬物
ＡＢ０１、Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（登録商標）、およびヒトＩｇＧは、いずれもＳｉｃｈｕａｎ Ｋｅｌｕｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から提供された。ここで、Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（登録商標）は、Ｒｏｃｈｅ社から購入し、ヒトＩｇＧは、Ｃｈｅｎｇｄｕ Ｒｏｎｇｓｈｅｎｇ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄから購入した。

調製方法：３つの薬物は、いずれも０．１％のＢＳＡ生理食塩水で必要の濃度に希釈された。

2．実験細胞および動物
ＭＣ−３８／Ｈ−１１細胞は、マウス結腸癌ＭＣ−３８（Ｃｏｂｉｏｅｒ社から購入、カタログ番号ＣＢＰ６０８２５）細胞のマウス内因性ＰＤＬ−１をノックアウトし、ヒトＰＤＬ−１をトランスフェクトして発現させたモノクローナル細胞である。したがって、ＭＣ−３８／Ｈ−１１細胞は、高レベルのヒトＰＤＬ−１タンパクのみを発現する。

Ｃ５７ＢＬ／６マウス（７〜８週齢、メス）は、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｓｌａｃｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ Ｃｏ．、Ｌｔｄから購入した。

3．実験手順
それぞれのマウスに１×１０^５のＭＣ−３８／Ｈ−１１細胞を皮下接種した。接種の翌日（Ｄ０）に、マウスをランダムにグループ分けし、１日おきに１回（Ｑ２Ｄ）薬物を腹腔内注射（ＩＰ）した。溶媒群は、同じ体積のヒトＩｇＧ（１５ｍｇ／ｋｇ）、ＡＢ０１（１．５、５、１５ｍｇ／ｋｇ）、Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（登録商標）（１５ｍｇ／ｋｇ）を注射し、注射量は０．１ｍＬ／１０ｇ体重でした。各グループは、いずれも１０匹のマウスである。

4．実験の指標
実験の指標は、腫瘍成長に対する薬物の効果を調査するために使用される。具体的な指標は、Ｔ／Ｃ％または腫瘍抑制率ＴＧＩ（％）である。

ノギスで週に２回腫瘍の直径を測定した。腫瘍体積（Ｖ）は、式Ｖ＝１／２×ａ×ｂ^２で計算された。式中、ａ、ｂはそれぞれ長さと幅を表しす。

Ｔ／Ｃ％＝Ｔ／Ｃ×１００。Ｃ、Ｔは、それぞれ溶媒群および治療群の腫瘍体積または腫瘍重量である。

腫瘍抑制率（ＴＧＩ）（％）＝（Ｃ−Ｔ）／Ｃ×１００。Ｃ、Ｔは、それぞれ溶媒群と治療群の腫瘍体積または腫瘍重量である。

5．実験結果
実験結果を以下の表１２に示す。

ＭＣ−３８／Ｈ−１１マウスの皮下移植腫瘍に対するＡＢ０１（１．５、５、１５ｍｇ／ｋｇ）の腫瘍抑制率は、それぞれ６３．９％、７５．８％、６８．６％である（平均腫瘍体積に基づいて計算）。それぞれの群の個体差が大きいため、腫瘍体積の中央値に基づいて腫瘍抑制率を計算することが合理的であり、腫瘍抑制率が１００％、１００％、１００％に調整された。ＭＣ−３８／Ｈ−１１に対する参照薬物Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（登録商標）（１５ｍｇ／ｋｇ）の腫瘍抑制率は９３．８％である（腫瘍体積の中央値に基づいて計算）。また、腫瘍重量の中央値に基づいて計算すると、ＭＣ−３８／Ｈ−１１に対するＡＢ０１（１．５、５、１５ｍｇ／ｋｇ）の腫瘍抑制率はそれぞれ１００％、１００％、１００％であり、Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（登録商標）の腫瘍抑制率は９３．７％である。腫瘍体積の中央値による腫瘍抑制率は、腫瘍重量の中央値による腫瘍抑制率と非常に一致しており、腫瘍体積の測定法の信頼性を示した。ＡＢ０１（１．５、５、１５ｍｇ／ｋｇ）は、腫瘍の成長を阻害するだけでなく、腫瘍の形成も阻害する。実験終了時（Ｄ２７）に、ＡＢ０１（１．５、５、１５ｍｇ／ｋｇ）用量群の腫瘍形成率は４０％、４０％、４０％であったが、Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（登録商標）群の腫瘍形成率は５０％であった。担癌マウスは上記の薬物によく耐え、明らかな体重減少などの症状は発生しなかった。Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（登録商標）と比較して、ＡＢ０１（１．５、５、１５ｍｇ／ｋｇ）は、マウス結腸癌ＭＣ−３８／Ｈ−１１の皮下移植腫瘍に対してより強い抗腫瘍効果を示した。

実施例１１：肺癌に対するＰＤＬ−１抗体ＡＢ０１のインビボでの有効性
モデルの確立方法：非小細胞肺癌細胞ＨＣＣ８２７（ＡＴＣＣから購入、カタログ番号：ＣＲＬ−２８６８）をＮＯＧマウスに皮下接種して、肺癌担癌マウスモデルを確立した。腫瘍が約１００ｍｍ^３に達すると、薬物を投与する前に、ヒトの免疫系をシミュレートするために、活性化されたヒトＰＢＭＣをマウスに静脈内注射した。その後、薬物を投与した。

投与レジメン：２日に１回、合計４回、１０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内注射した。投与後、週に２回腫瘍体積を測定した。マウスは、コントロールＩｇＧ、ＡＢ０１、Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（登録商標）の３つの群に分け、それぞれの群は６匹のマウスである。

腫瘍の成長曲線を図１１に示す。

結果は、４日目から、ＡＢ０１群の腫瘍体積がＴｅｃｅｎｔｒｉｑ（登録商標）群およびＩｇＧコントロール群の腫瘍体積よりも有意に小さいことを示した。ＡＢ０１群の腫瘍成長は、ほぼ完全に抑制されたが、Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ群およびＩｇＧコントロール群の腫瘍は、継続的に成長した。ＡＢ０１抗体は、Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（登録商標）よりもインビボでの強力な抗腫瘍効果を示した。

実施例１２：遺伝子組換え結腸癌マウスモデルにおける組換え二重特異性抗体の試験
１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下でＭＣ３８−１Ｆ３細胞を培養した。指数増殖期のＭＣ３８−１Ｆ３細胞を回収し、ＰＢＳに適切な濃度に再懸濁させ、メスのＣ５７ＢＬ／６Ｊ−ｈｕＣＴＬＡ−４（Ｇｅｍｐｈａｒｍａｔｅｃｈから購入）マウスに皮下接種して、結腸癌モデルを確立した。平均腫瘍体積が約８２ｍｍ^３になると、腫瘍サイズに応じて、静脈内注射ヒト免疫グロブリン群（陰性対照群）、ＡＢ０１対照群、ＡＢ０４抗体低用量群およびＡＢ０４抗体高用量群の４つの群にマウスをランダムに群分けした。薬物を週に２回腹腔内注射し、合計３週間投与した。投与後に、マウスの腫瘍体積と体重を定期的に観察、測定した。具体的な結果を表１３および図１２に示す。

結果によると、ＭＣ３８−１Ｆ３結腸癌移植腫瘍モデルに対するＡＢ０４抗体低用量群（３ｍｇ／ｋｇ）の抗腫瘍効果はＡＢ０１よりも優れており、且つその高用量群（１０ｍｇ／ｋｇ）は低用量群よりも有意に優れた抗腫瘍効果があり、抗腫瘍効果は顕著である。観察期間において、いずれかの治療群は、動物の死亡や顕著な動物の体重減少がなく、顕著な薬物毒性を示さなかった。治療期間において、マウスはＡＢ０４抗体によく耐えた。

実施例１３：遺伝子組換え非小細胞肺癌マウスモデルにおける組換え二重特異性抗体の試験
１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下でヒト非小細胞肺癌細胞株ＨＣＣ８２７を培養した。指数増殖期のＨＣＣ８２７細胞を回収し、ＰＢＳに適切な濃度に再懸濁させ、メスのＮＳＧ免疫不全マウスに皮下接種して、移植腫瘍モデルを確立した（ｈＰＢＭＣ−ＮＳＧ（Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ）−ＨＣＣ８２７ヒト免疫再建モデル）。平均腫瘍体積が約７７ｍｍ^３になると、腫瘍サイズに応じて、生理食塩水群（陰性対照群）、ＡＢ０１対照群、ＡＢ０４抗体低用量群およびＡＢ０４抗体高用量群の４つの群にマウスをランダムに群分けした。１０％ウシ胎児血清、ＣＤ２８／ＣＤ３およびＤＮａｓｅを含むＲＰＭＩ１６４０培地で、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下でヒト末梢血単核細胞ＰＢＭＣを培養した。ＣＤ３およびＣＤ２８で３日間刺激された後、活性化されたＰＢＭＣを回収し、ＰＢＳに適切な濃度に再懸濁させ、メスのＮＳＧマウスの尾静脈に注射して免疫系を再建した。上記のように群分けした後、マウスに週２回、薬物を尾静脈注射し、合計３週間投与した。投与後に、マウスの腫瘍体積と体重を定期的に観察、測定した。具体的な結果を表１４および図１３に示す。

結果によると、ヒト非小細胞肺癌ＨＣＣ８２７細胞を皮下移植したＮＳＧ免疫再建マウスの腫瘍成長に対して、ＡＢ０４抗体低用量群（１ｍｇ／ｋｇ）は、一定の程度の阻害効果を示し、高用量群（１０ｍｇ／ｋｇ）では有意な抗腫瘍効果があった。観察期間において、いずれかの治療群は、動物の死亡や顕著な動物の体重減少がなく、顕著な薬物毒性を示さなかった。治療期間において、マウスは抗体によく耐えた。

実施例１４：組換え二重特異性抗体の毒性試験
この実験では、カニクイザルの体内における組換え二重特異性抗体の毒性を調べるために、カニクイザル（オス１匹とメス１匹）に単回投与で静脈内注射を行うことで、投与群ＡＢ０４とし、生理食塩水群を対照群とし、回復期間は１４日間であった。実験の結果は、単回静脈内注射で５００ｍｇ／ｋｇのＡＢ０４を投与した場合、カニクイザルが薬物によく耐え、ＭＴＤが５００ｍｇ／ｋｇであることを示した。５回連続で１００ｍｇ／ｋｇの用量を週に１回繰り返し投与した場合、顕著な標的臓器への毒性および投与部位への刺激が見られず、ＮＯＡＥＬ（無毒性量）は１００ｍｇ／ｋｇであった。ＦＤＡが発表した既存の研究データによると、抗ＣＴＬＡ−４抗体イピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ、商品名：Ｙｅｒｖｏｙ）を繰り返し投与した場合、ＮＯＡＥＬは１０ｍｇ／ｋｇ（この用量では、投与後に脾臓重量の減少や多臓器リンパ球浸潤などの軽度の毒性が観察された）であり、ＭＴＤは３０ｍｇ／ｋｇであった。ＡＢ０４は、ＣＴＬＡ−４抗体の毒性を軽減し、薬物の安全性をある程度改善した。

本発明の特定の実施形態を詳細に説明したが、前記開示された教示に従って、本発明に様々な変更および修正が可能であること、且つそのような変更も本発明の範囲内であることは、当業者にとって明らかである。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲およびその同等のものによって決められる。

Claims (29)

1. １）第一抗原に特異的に結合する、重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）を含む第一抗体、および
   ２）第二抗原に特異的に結合するｓｃＦｖ
   を含む、二重特異性抗体であって、
   前記ｓｃＦｖは、第一抗体の重鎖または軽鎖のＮ末端またはＣ末端に連結され、
   前記第一抗原はＣＴＬＡ−４であり、且つ前記第二抗原はＰＤＬ−１であり、或いは、前記第一抗原はＰＤＬ−１であり、且つ前記第二抗原はＣＴＬＡ−４であり、
   好ましくは、前記二重特異性抗体は、１つの前記第一抗体および２つの前記ｓｃＦｖを含み、また、前記第一抗体は２つのＨＣおよび２つのＬＣを含み、ここで、前記第一抗体の１つのＨＣのＶＨと１つのＬＣのＶＬとは、抗原結合部位を形成し、もう１つのＨＣのＶＨともう１つのＬＣのＶＬとは、抗原結合部位を形成し、
   好ましくは、１つの前記ｓｃＦｖは、前記第一抗体の重鎖または軽鎖のＮ末端に連結され、もう１つの前記ｓｃＦｖは、前記第一抗体の重鎖または軽鎖のＣ末端に連結され、
   好ましくは、前記各ｓｃＦｖは、それぞれ前記第一抗体の２つの重鎖または２つの軽鎖のＮ末端に連結され、又は、前記各ｓｃＦｖは、それぞれ前記第一抗体の２つの重鎖または２つの軽鎖のＣ末端に連結される
   ことを特徴とする、二重特異性抗体。
2. １）第一抗原に特異的に結合する、重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）を含む第一抗体、および
   ２）第二抗原に特異的に結合するｓｃＦｖ
   を含む、二重特異性抗体であって、
   前記二重特異性抗体は、１つの前記第一抗体および２つの前記ｓｃＦｖを含み、また、前記第一抗体は２つのＨＣおよび２つのＬＣを含み、ここで、前記第一抗体の１つのＨＣのＶＨと１つのＬＣのＶＬとは、抗原結合部位を形成し、もう１つのＨＣのＶＨともう１つのＬＣのＶＬとは、抗原結合部位を形成し、
   前記各ｓｃＦｖは、それぞれ前記第一抗体の２つの重鎖のＮ末端に連結され、又は、前記各ｓｃＦｖは、それぞれ前記第一抗体の２つの重鎖のＣ末端に連結され、
   前記第一抗原はＰＤＬ−１であり、且つ前記第二抗原はＣＴＬＡ−４であり、
   好ましくは、前記各ｓｃＦｖは、それぞれリンカーＳ１を介して前記第一抗体の各重鎖のＮ末端またはＣ末端に連結され、
   より好ましくは、前記ｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬは、リンカーＳ２を介して連結される
   ことを特徴とする、請求項１に記載の二重特異性抗体。
3. 前記ｓｃＦｖの構造は、ＮＨ_２−ＶＬ−Ｓ２−ＶＨ−ＣＯＯＨである
   ことを特徴とする、請求項２に記載の二重特異性抗体。
4. 前記第一抗体の重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ）を含み、且つ前記軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）を含み、
   好ましくは、前記第一抗体は完全長抗体である
   ことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
5. 前記第一抗体の重鎖は、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４などのＩｇＧアイソタイプであり、例えば、ヒトＩｇＧアイソタイプであり、および/または、前記第一抗体の軽鎖はＫａｐｐａアイソタイプであり、例えば、ヒトＫａｐｐａアイソタイプである
   ことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
6. 前記第一抗体の２つのＨＣは同じＣＤＲを含み、および／または前記第一抗体の２つのＬＣは同じＣＤＲを含み、
   好ましくは、前記第一抗体の２つのＨＣは同じＶＨを含み、および／または前記第一抗体の２つのＬＣは同じＶＬを含み、
   好ましくは、前記第一抗体の２つのＨＣは同じアミノ酸配列を有し、および／または前記第一抗体の２つのＬＣは同じアミノ酸配列を有し、
   好ましくは、２つの前記ｓｃＦｖは同じまたは異なるアミノ酸配列を有し、
   より好ましくは、２つの前記ｓｃＦｖは同じアミノ酸配列を有する
   ことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
7. 前記二重特異性抗体は、２つの第一ポリペプチド鎖および２つの第二ポリペプチド鎖を含み、前記ポリペプチド鎖のそれぞれについて：
   ａ）前記第一ポリペプチド鎖は、それぞれ独立して、前記第一抗体の重鎖（ＨＣ）および前記ｓｃＦｖを含み、
   ｂ）前記第二ポリペプチド鎖は、それぞれ独立して、前記第一抗体の軽鎖（ＬＣ）を含み、
   ここで、前記ｓｃＦｖは、リンカーＳ１を介して前記第一抗体のＨＣのＮ末端またはＣ末端に連結され；
   或いは、
   ｉ）前記第一ポリペプチド鎖は、それぞれ独立して、前記第一抗体の軽鎖（ＬＣ）および前記ｓｃＦｖを含み、
   ｉｉ）前記第二ポリペプチド鎖は、それぞれ独立して、前記第一抗体の重鎖（ＨＣ）を含み、
   ここで、前記ｓｃＦｖは、リンカーＳ１を介して前記第一抗体のＬＣのＮ末端またはＣ末端に連結され、
   好ましくは、前記ｓｃＦｖは、ＮＨ_２−ＶＨ−Ｓ２−ＶＬ−ＣＯＯＨ又はＮＨ_２−ＶＬ−Ｓ２−ＶＨ−ＣＯＯＨの構造を有し、ここで、前記Ｓ２はリンカーであり、
   好ましくは、前記二重特異性抗体は、２つの同じ第一ポリペプチド鎖および２つの同じ第二ポリペプチド鎖を含む
   ことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
8. 前記第一抗体の親抗体と比較して、同等または弱い第一抗原に対する結合活性を有し、
   好ましくは、前記ｓｃＦｖの親抗体と比較して、同等または弱い第二抗原に対する結合活性を有し、
   より好ましくは、前記第一抗体の親抗体と比較して同等または弱い第一抗原に対する結合活性を有し、且つ前記ｓｃＦｖの親抗体と比較して同等または弱い第二抗原に対する結合活性を有し、
   より好ましくは、前記第一抗体の親抗体と比較して同等の第一抗原に対する結合活性を有し、且つ前記ｓｃＦｖの親抗体と比較して弱い第二抗原に対する結合活性を有し、
   より好ましくは、ＰＤＬ−１に結合する親抗体と比較して、同等の結合活性を有し、
   より好ましくは、ＣＴＬＡ−４に結合する親抗体と比較して、弱い結合活性を有し、
   より好ましくは、ＰＤＬ−１に結合する親抗体と比較して同等の結合活性を有し、且つＣＴＬＡ−４に結合する親抗体と比較して弱い結合活性を有する
   ことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
9. 前記リンカーＳ１および／またはＳ２は、例えば、（Ｇ_ｍＳ_ｎ）_ｘで示されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカーであり、式中、ｍ、ｎは、それぞれ独立して１〜８の整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８）から選択され、ｘは、独立して１〜２０の整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０）から選択され、
   好ましくは、前記リンカーＳ１および／またはＳ２は、（Ｇ_４Ｓ）_ｘで示されるアミノ酸配列を有し、ｘは、独立して１〜６の整数から選択され、
   好ましくは、前記Ｓ１および／またはリンカーＳ２は、配列番号２５、配列番号２６、および配列番号２７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、
   好ましくは、前記リンカーＳ２は、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有し、且つ前記ｓｃＦｖが前記第一抗体の重鎖または軽鎖のＮ末端に連結される場合、前記リンカーＳ１は、配列番号２６に記載のアミノ酸配列を有し、前記ｓｃＦｖが前記第一抗体の重鎖または軽鎖のＣ末端に連結される場合、前記リンカーＳ１は、配列番号２７に記載のアミノ酸配列を有する
   ことを特徴とする、請求項２、３、７又は８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
10. 前記ｓｃＦｖのＶＨとＶＬとの間にジスルフィド結合があり、
    好ましくは、前記ｓｃＦｖにおけるＶＨの４４番目のアミノ酸およびＶＬの１００番目のアミノ酸は、それぞれシステインであり、ここで、前記アミノ酸位置は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに基き、また、前記ｓｃＦｖにおけるＶＨとＶＬは、それぞれＶＨの４４番目とＶＬの１００番目に位置する２つのシステイン残基の間に形成されたジスルフィド結合によって連結される
    ことを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
11. 前記第一抗体はＣＴＬＡ−４に特異的に結合し、且つ前記ｓｃＦｖはＰＤＬ−１に特異的に結合し、
    ここで、前記ｓｃＦｖは、配列番号１に記載のＨＣＤＲ１、配列番号２に記載のＨＣＤＲ２、配列番号３に記載のＨＣＤＲ３、配列番号４に記載のＬＣＤＲ１、配列番号５に記載のＬＣＤＲ２、および配列番号６に記載のＬＣＤＲ３を含む
    ことを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
12. 前記第一抗体はＣＴＬＡ−４に特異的に結合し、且つ前記ｓｃＦｖはＰＤＬ−１に特異的に結合し、
    ここで、前記第一抗体は、配列番号１３に記載のＨＣＤＲ１、配列番号１４に記載のＨＣＤＲ２、配列番号１５に記載のＨＣＤＲ３、配列番号１６に記載のＬＣＤＲ１、配列番号１７に記載のＬＣＤＲ２、および配列番号１８に記載のＬＣＤＲ３を含み、
    且つ、前記ｓｃＦｖは、配列番号１に記載のＨＣＤＲ１、配列番号２に記載のＨＣＤＲ２、配列番号３に記載のＨＣＤＲ３、配列番号４に記載のＬＣＤＲ１、配列番号５に記載のＬＣＤＲ２、および配列番号６に記載のＬＣＤＲ３を含む
    ことを特徴とする、請求項１１に記載の二重特異性抗体。
13. 前記ｓｃＦｖは、
    （１）配列番号７に記載のＶＨおよび配列番号９に記載のＶＬ；または
    （２）配列番号８に記載のＶＨおよび配列番号１０に記載のＶＬ
    を含む
    ことを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
14. 前記第一抗体は、配列番号１９に記載のＶＨおよび配列番号２１に記載のＶＬを含み、且つ前記ｓｃＦｖは、
    （１）配列番号７に記載のＶＨおよび配列番号９に記載のＶＬ；または
    （２）配列番号８に記載のＶＨおよび配列番号１０に記載のＶＬ
    を含む
    ことを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
15. 前記第一抗体はＰＤＬ−１に特異的に結合し、且つ前記ｓｃＦｖはＣＴＬＡ−４に特異的に結合し、
    ここで、前記第一抗体は、配列番号１に記載のＨＣＤＲ１、配列番号２に記載のＨＣＤＲ２、配列番号３に記載のＨＣＤＲ３、配列番号４に記載のＬＣＤＲ１、配列番号５に記載のＬＣＤＲ２、および配列番号６に記載のＬＣＤＲ３を含む
    ことを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
16. 前記第一抗体はＰＤＬ−１に特異的に結合し、且つ前記ｓｃＦｖはＣＴＬＡ−４に特異的に結合し、
    ここで、前記第一抗体は、配列番号１に記載のＨＣＤＲ１、配列番号２に記載のＨＣＤＲ２、配列番号３に記載のＨＣＤＲ３、配列番号４に記載のＬＣＤＲ１、配列番号５に記載のＬＣＤＲ２、および配列番号６に記載のＬＣＤＲ３を含み、
    且つ、前記ｓｃＦｖは、配列番号１３に記載のＨＣＤＲ１、配列番号１４に記載のＨＣＤＲ２、配列番号１５に記載のＨＣＤＲ３、配列番号１６に記載のＬＣＤＲ１、配列番号１７に記載のＬＣＤＲ２、および配列番号１８に記載のＬＣＤＲ３を含む
    ことを特徴とする、請求項１〜１０、または１５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
17. 前記第一抗体は、配列番号７に記載のＶＨおよび配列番号９に記載のＶＬを含む
    ことを特徴とする、請求項１〜１０、１５または１６のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
18. 前記第一抗体は、配列番号７に記載のＶＨおよび配列番号９に記載のＶＬを含み、
    且つ前記ｓｃＦｖは、
    （１）配列番号１９に記載のＶＨおよび配列番号２１に記載のＶＬ、または
    （２）配列番号２０に記載のＶＨおよび配列番号２２に記載のＶＬ
    を含む
    ことを特徴とする、請求項１〜１０、１５〜１７のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
19. 抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有し、
    好ましくは、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を有し、
    より好ましくは、前記第一抗体のＣＨは突然変異を含み、前記突然変異を含む二重特異性抗体は、増強された抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有し、
    より好ましくは、前記第一抗体のＣＨは突然変異を含み、前記突然変異を含む二重特異性抗体は、増強された補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を有する
    ことを特徴とする、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
20. 前記第一抗体は、ＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｐ０１８５７に示されるＣＨ、および/またはＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｐ０１８３４に示されるＣＬを含み、
    必要に応じて、前記ＣＨは、ＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｐ０１８５７に示されるＣＨにおける１１７、１１８、１２０番目のアミノ酸がＡに変異すること、又はＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｐ０１８５７に示されるＣＨにおける９７番目のアミノ酸がＲに変異することを含む
    ことを特徴とする、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
21. 前記二重特異性抗体は、
    （１）配列番号２８に記載の第一ポリペプチド鎖および配列番号１１に記載の第二ポリペプチド鎖、または
    （２）配列番号２９に記載の第一ポリペプチド鎖および配列番号１１に記載の第二ポリペプチド鎖
    を含むことを特徴とする、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
22. 親抗体と比較してほぼ同等の熱安定性を有する
    ことを特徴とする、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
23. 請求項１〜２２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子であって、
    好ましくは、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体の第一ポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含み、
    好ましくは、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体の第二ポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む
    ことを特徴とする、単離された核酸分子。
24. 請求項２３に記載の単離された核酸分子を含むベクター。
25. 請求項２３に記載の単離された核酸分子又は請求項２４に記載のベクターを含む宿主細胞。
26. 前記二重特異性抗体の発現を可能にする条件下で、請求項２５に記載の宿主細胞を培養すること、および、培養した宿主細胞の培養物から前記二重特異性抗体を回収することを含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を調製する方法。
27. 請求項１〜２２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体、および薬学的に許容される担体および/または賦形剤を含む医薬組成物であって、
    好ましくは、例えば、抗炎症薬または免疫抑制剤などのＣＴＬＡ−４および／またはＰＤＬ−１関連疾患の予防および／または治療のための薬物などの他の医薬活性剤をさらに含み、
    好ましくは、前記ＣＴＬＡ−４および／またはＰＤＬ−１関連疾患は、例えば、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、肉腫などの腫瘍；または、副腎、胆嚢、骨、骨髄、脳、乳房、胆管、胃腸管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、皮膚、唾液腺、脾臓、睾丸、胸腺、甲状腺、および子宮に関連する腫瘍；Ｂ型肝炎、Ａ型肝炎、およびＨＩＶなどの感染症；などの自己免疫疾患、腫瘍または感染性疾患が挙げられるが、これらに限定されない
    ことを特徴とする、医薬組成物。
28. 被験者（例えば、ヒト）におけるＣＴＬＡ−４および／またはＰＤＬ−１関連疾患（自己免疫疾患、腫瘍または感染症）の予防および／または治療、および／または生体外或いは被験者（例えば、ヒト）の生体内でのＣＴＬＡ−４および／またはＰＤＬ−１の活性の阻害のための薬物の調製への、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体または請求項２７に記載の医薬組成物の使用であって、
    好ましくは、前記ＣＴＬＡ−４および／またはＰＤＬ−１関連疾患は、例えば、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、肉腫などの腫瘍；または、副腎、胆嚢、骨、骨髄、脳、乳房、胆管、胃腸管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、皮膚、唾液腺、脾臓、睾丸、胸腺、甲状腺、および子宮に関連する腫瘍；Ｂ型肝炎、Ａ型肝炎、およびＨＩＶなどの感染症；などの自己免疫疾患、腫瘍または感染性疾患が挙げられるが、これらに限定されなく、
    好ましくは、前記被験者は、例えば、ヒトなどの哺乳動物である
    ことを特徴とする、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体または請求項２７に記載の医薬組成物の使用。
29. 必要とする被験者に有効量の請求項１〜２２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体または請求項２７に記載の医薬組成物を投与することを含む、被験者（例えば、ヒト）におけるＣＴＬＡ−４および／またはＰＤＬ−１関連疾患（例えば、炎症性疾患または自己免疫疾患）を予防および／または治療する方法、および／または生体外或いは被験者（例えば、ヒト）の生体内でＣＴＬＡ−４および／またはＰＤＬ−１の活性を阻害する方法であって、
    好ましくは、前記ＣＴＬＡ−４および／またはＰＤＬ−１関連疾患は、例えば、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、肉腫などの腫瘍；または、副腎、胆嚢、骨、骨髄、脳、乳房、胆管、胃腸管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、皮膚、唾液腺、脾臓、睾丸、胸腺、甲状腺、および子宮に関連する腫瘍；Ｂ型肝炎、Ａ型肝炎、およびＨＩＶなどの感染症；などの自己免疫疾患、腫瘍または感染性疾患が挙げられるが、これらに限定されなく、
    好ましくは、前記被験者は、例えば、ヒトなどの哺乳動物である
    ことを特徴とする、被験者（例えば、ヒト）におけるＣＴＬＡ−４および／またはＰＤＬ−１関連疾患（例えば、炎症性疾患または自己免疫疾患）を予防および／または治療する方法、および／または生体外或いは被験者（例えば、ヒト）の生体内でＣＴＬＡ−４および／またはＰＤＬ−１の活性を阻害する方法。