CN104987421A - 抗ctla-4和pd-1的双重可变结构域免疫球蛋白 - Google Patents

抗ctla-4和pd-1的双重可变结构域免疫球蛋白 Download PDF

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Abstract

本发明公布了一种采用分子生物学方法对抗PD-1和CTLA-4抗体改造后得到特异结合PD-1和/或CTLA-4的双重可变结构域免疫球蛋白(dual variable domain immunoglobulin，DVD-Ig)。抗PD-1抗体可变结构域位于分子内部与抗CTLA-4抗体位于分子外部，抗PD-1抗体可变结构域位于分子外部与CTLA-4抗体位于分子内部，二种结构均保持结合PD-1和/或CTLA-4分子的特性。抗CTLA-4和PD-1的双重可变结构域免疫球蛋白具有潜在的治疗肿瘤的价值。

Description

抗CTLA-4和PD-1的双重可变结构域免疫球蛋白
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及了抗CTLA-4和PD-1抗体双重可变结构域免疫球蛋白(dual variable domain immunoglobulin，DVD-Ig)的构建、筛选、制备方法及其潜在的在肿瘤治疗中的应用。
背景技术
免疫检查点(immune checkpoint)是免疫系统中存在的一些抑制性信号通路，通过调节外周组织中免疫反应的持续性和强度避免组织损伤，并参与维持对于自身抗原的耐受(Pardoll DM.The blockade of immune checkpoints in cancerimmunotherapy.Nat Rev Cancer，2012，12(4)：252-264.)。研究发现，肿瘤细胞正是利用免疫检查点的抑制性信号通路抑制T淋巴细胞活性，从而逃避体内免疫系统特别是T淋巴细胞对肿瘤的杀伤效应(Yao S，Zhu Y，Chen L.Advances intargeting cell surface signaling molecules for immune modulation.Nat Rev DrugDiscov，2013，12(2)：130-146.)。重要的免疫检查点(immune checkpoint)分子主要有CTLA-4、PD-1、VISTA(Wang，L et al..VISTA，a novel mouse Ig superfamilyligand that negatively regulates T cell responses.J.Exp.Med.2011208，577-592)、LAG-3(Triebel，F et al.(LAG-3，a novel lymphocyte activation gene closely relatedto CD4.J.Exp.Med.1990，.171，1393-1405.)和TIM-3(Sakuishi et al.TargetingTim-3 and PD-1 pathways to reverse T cell exhaustion and restore anti-tumorimmunity.J.Exp.Med.2010207，2187-2194.)等。
细胞毒性T细胞相关抗原4(CTLA-4/CD 152)和CD28同为免疫球蛋白超基因家族成员，二者具有70％的同源性，均为表达于T细胞表面的跨膜受体。CD28和CTLA-4是一对具有正负调节功能的重要共刺激分子，二者竞争性结合B7分子，但CTLA4与其配体亲和力较CD28大20倍。CD28与APC上的B7-1和B7-2的结合后能够传递共刺激信号给T淋巴细胞，增强CD3/TCR复合体或CD2分子的作用，诱导T淋巴细胞活化和分泌多种细胞因子。CTLA-4则抑制T淋巴细胞的增殖、活化，诱导活化的T淋巴细胞凋亡，二者是机体免疫系统维持的关键环节。
程序性死亡蛋白-1(programmed death-1，PD-1)则是T细胞表面另一个重要的抑制性受体，与CD28和CTLA-4具有同源性，可诱导性地表达于活化的T细胞、B细胞、巨噬细胞、树突状细胞以及单核细胞，在静息的淋巴细胞表面无表达。其配体为B7-同源分子1(B7-homolog 1，B7-H1)和B7DC。B7-H1也称程序性死亡蛋白配体-1(programmed death ligand-1，PD-L1)。活化的淋巴细胞表面PD-1的表达上调能够导致获得性或者固有免疫反应的抑制。PD-1/PD-L1的结合对于调节T淋巴细胞激活和维持外周免疫耐受发挥重要作用。许多肿瘤细胞表面存在PD-1和或PD-L1的高表达，肿瘤细胞正是利用这一重要机制抑制T淋巴细胞活性，达到逃避免疫系统对其攻击。
2013年《Science》杂志将肿瘤免疫治疗列为2013年十大科学突破的首位。CTLA-4为免疫检查点分子之一，目前已有它的两种免疫融合蛋白上市，分别是Abatacept(2005年上市)和Belatacept(2011年上市)，前者为普通的CTLA-4融合蛋白，后者是对CTLA-4进行了突变，提高其对配体的亲和力，分别用于自身免疫性疾病和肾移植排异反应的治疗。CTLA-4抗体药物Ipilimumab(商品名)为全人源IgG1抗体分子，Ipilimumab不直接杀伤肿瘤细胞，其与CTLA-4结合后抑制CTLA-4的功能，解除抗原特异性T淋巴细胞的免疫耐受和TCR信号的直接抑制作用，提高IL-2的表达，从而提高T效应细胞功能，降低Treg细胞对患者免疫系统的抑制。2011年被FDA批准用于黑色素瘤的治疗。临床研究结果显示Ipilimumab用于晚期黑色素瘤患者，能够引发持续的免疫反应，客观缓解率为10％～15％，并能有效的延长患者的生存。PD-1/PD-L1通路抗体主要包括抗PD-1和PD-L1单抗，也有针对PD-L2的产品。抗PD-1抗体研究比较成熟的有BMS的Nivolumab和Merck的Lambrolizumab(Pembrolizumab)。Nivolumab(商品名)为全人源IgG4抗体分子，Lambrolizumab(商品名)为人源化IgG4抗体分子。它们与PD-1结合后抑制其与配体PD-L1和PD-L2的结合，促进T淋巴细胞增殖和细胞因子产生，解除PD-1系统对肿瘤活性T淋巴细胞免疫监视的抑制。2008年至2012年Nivolumab治疗107例晚期黑色素瘤的临床研究，结果显示，难治性晚期黑色素瘤患者接受Nivolumab治疗后，其总生存期接近17个月。停药后肿瘤缓解可维持较长时间，并且安全性高。特别值得关注的是，这些患者中有62％的患者之前接受了2至5疗程的全身性治疗，属于难治性晚期患者。33例患者(31％)获得肿瘤的客观缓解。在一项3期临床头对头比较Opdivo和多西他赛治疗之前接受过治疗的，鳞状晚期非小细胞肺癌的疗效和安全性研究中，患者被随机分配接受每2周静脉内注射3mg/kg的Nivolumab治疗(n＝135)，或每3周静脉内注射75mg/m2的多西他赛治疗(n＝137)。与多西他赛组相比，Nivolumab组的OS改善更加显著，且有统计学差异。Nivolumab组患者的中位OS为9.2个月(95％CI：7.3，13.3)，多西他赛组为6个月(95％CI：5.1，7.3)。Nivolumab对鳞性NSCLC的有效性在一项纳入了117例鳞性非小细胞肺癌的单臂试验中得到了进一步证实。该研究的参与者均为在经历了以铂为基础的治疗及至少另一项系统性治疗方案后发生了疾病进展。15％的患者产生了总缓解，其中59％的患者的缓解时间长达6个月或更久。Opdivo治疗黑色素瘤和非小细胞肺癌分别于2014年9月和2015年3月获批上市。Lambrolizumab(MK-3475)获得了FDA突破性药物资格，2014年9月治疗黑色素瘤获批，目前MK-3475的临床项目包括横跨30种不同肿瘤类型、超过24项临床试验，其中包括4项新的III期研究。
CTLA-4和PD-1均为T淋巴细胞活化抑制受体，可阻断T淋巴的活化，但二者阻断的机制完全不同。CTLA-4介导的抑制效应表现为抑制Akt的磷酸化，而PD-1介导的抑制Akt的磷酸化效应为阻碍由CD28介导的磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)的激活，PD-1抑制PI3K/Akt激活的能力依赖于位于细胞质的免疫受体酪氨酸激酶转换基序，PD-1对CD3/CD28的抑制效应比较有效(Parry RV et al.CTLA-4 and PD-1 receptors inhibit T-cell activation by distinct mechanisms.MolCell Biol 2005；25：9543-53.)。CTLA-4在免疫反应的早期就会产生作用，它受到区域淋巴结抗原提呈细胞以及未处理T细胞水平的影响。PD-1表达在激活型T细胞表面的，PD-1/PDL-1在效应T细胞发挥作用时是处于外周组织当中。CTLA-4和PD-1都可以通过抑制性抗体来加强T细胞的活化和肿瘤的免疫活性，从而成为有效的肿瘤治疗药物。由于CTLA-4和PD-1作用于免疫细胞激活的不同阶段，所以这两个药物可被用在不同的人群，甚至可以联用。抗CTLA-4和抗PD-1抗体在抑制肿瘤生长的免疫效应中中发挥互补和协同作用。在临床前B16黑色素瘤肿瘤模型研究中，将抗CTLA-4和抗PD-1抗体联合应用导致肿瘤组织中T效应细胞的浸润，肿瘤组织中T效应细胞(Teff)比T调节细胞(Treg)比例升高，抑制肿瘤的效应高于单独使用抗CTLA-4或抗PD-1抗体。抗CTLA-4和抗PD-1抗体的协同效应也表现在T效应细胞(Teff)比髓源性抑制细胞比例升高。IFN-γ表达也上升。百时美施贵宝(BMS)2015年4月公布了免疫组合疗法Opdivo+Yervoy用于黑色素瘤一线治疗临床II期的积极数据。与Yervoy单药疗法相比，Opdivo+Yervoy组合疗法取得了非常高的客观缓解率(61％vs 11％)，完全缓解率22％，疾病恶化或死亡风险降低60％。针对BRAF突变型黑色素瘤，Opdivo+Yervoy方案也取得了相似的结果，中位无进展生存期(PFS：8.5个月vs2.7个月)，疾病恶化或死亡风险降低60％。此外，客观缓解率(ORR)独立于PD-L1状态：PD-L1阳性肿瘤中ORR为58％，PD-L1阴性肿瘤中ORR为55％。
双特异性抗体是含有2种特异性抗原结合位点的人工抗体，是基因工程抗体的一种，现已成为抗体工程领域的热点，在肿瘤的免疫治疗中具有广阔的应用前景。制备方法包括：化学偶联法，杂交-杂交瘤法，基因工程抗体制备法等。基因工程抗体制备法因其制备的双特异性抗体具有均一性好，结合目前的表达技术具有高效表达的特点。其中的一种被称为双重可变结构域免疫球蛋白(DVD-Ig)，(美国专利号：7612181)该专利提供了以高亲和力结合2种或更多抗原的结合蛋白，其被称为双重可变结构域免疫球蛋白(dual variable domainimmunoglobulin，DVD-Ig)，以及有此衍生的7488802、9005612、8258268、8735546、8716450、8716450、8188237、8722855和8586714等。
发明内容：
抗PD-1和CTLA-4抗体组合在抗肿瘤治疗的临床前研究和临床研究治疗中均证实它们在肿瘤治疗中确切的疗效，特别是二者同时使用时可产生协同抗肿瘤作用。一方面为使临床患者和医生使用方便，另一方面为了使该类抗体药物更容易生产和质量控制，降低成本。本发明提供一种由抗PD-1和CTLA-4抗体演化来的可特异结合PD-1和/或CTLA-4的人源双特异新型抗体，即双重可变结构域免疫球蛋白(dual variable domain immunoglobulin，DVD-Ig)，如图1所示
两重链可变结构域间的柔性片段可为“AKTTPKLEEGEFSEAR”、“AKTTPKLEEGEFSEARV”、“SAKTTPKLEEGEFSEARV”、“AKTTPPSVTPLAP”、“ASTKGPSVFPLAP”、“GGGGSGGGGSGGGGS”、“TVAAPSVFIFPPTVAAPSVFIFPP”、“ASTKGPSVFPLAPSS”，优选“ASTKGPSVFPLAPSS”和“ASTKGPSVFPLAP”；
两轻链可变结构域间的柔性片段可为“AKTTPKLEEGEFSEAR”、“AKTTPKLEEGEFSEARV”、“SAKTTPKLEEGEFSEARV”、“AKTTPPSVTPLAP”、“ASTKGPSVFPLAP”、“GGGGSGGGGSGGGGS”、“TVAAPSVFIFPPTVAAPSVFIFPP”、“ASTKGPSVFPLAPSS”，优选“TVAAPSVFIFPPS”；
更具体地，在分析抗PD-1和CTLA-4抗体与其抗原结合可变结构域结构的基础上，本发明公布了两种既可结合PD-1又可结合CTLA-4的双特异新型抗体的结构，其中一种当抗PD-1抗体可变结构域位于分子内部，则抗CTLA-4抗体位于分子外部；另一种抗PD-1抗体可变结构域位于分子外部，则抗CTLA-4抗体位于分子内部。分别在CHO细胞中表达该2株抗体。纯化后证实两种结构均可特异性地结合PD-1和/或CTLA-4分子。均具有潜在地治疗肿瘤的价值。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种能够结合PD-1和/或CTLA-4抗原的双特异性抗体，其中所述重链包含HVD1-L1-HVD2-CH结构，其中
HVD1是第一个重链可变结构域，
L1是重链柔性接头，
HVD2是第二个重链可变结构域，
CH区是重链恒定结构域；
其中所述轻链包含LVD1-L2-LVD2-CL结构，其中
LVD1是第一个轻链可变结构域，
L2是轻链柔性接头，
LVD2是第二个轻链可变结构域，
CL是轻链恒定结构域。
本发明提供的双特异性抗体，其中的HVD1选自SEQ ID No 2，则HVD2选自SEQ ID No 4，6，8，LVD1选自SEQ ID No 1，LVD2选自SEQ ID No 3，5，7；
或其中的HVD1选自SEQ ID No 4，6，8，则HVD2选自SEQ ID No 2，LVD1选自SEQ ID No3，5，7，LVD2选自SEQ ID No 1。
本发明提供的双特异性抗体，其中的L1选自：两重链可变结构域间的柔性接头可为“AKTTPKLEEGEFSEAR”、“AKTTPKLEEGEFSEARV”、“SAKTTPKLEEGEFSEARV”、“AKTTPPSVTPLAP”、“ASTKGPSVFPLAP”、“GGGGSGGGGSGGGGS”、“TVAAPSVFIFPPTVAAPSVFIFPP”、“ASTKGPSVFPLAPSS”。优选为“ASTKGPSVFPLAPSS”和“ASTKGPSVFPLAP”。
本发明提供的双特异性抗体，其中的L2选自：两轻链可变结构域间的柔性接头可为“AKTTPKLEEGEFSEAR”、“AKTTPKLEEGEFSEARV”、“SAKTTPKLEEGEFSEARV”、“AKTTPPSVTPLAP”、“ASTKGPSVFPLAP”、“GGGGSGGGGSGGGGS”、“TVAAPSVFIFPPTVAAPSVFIFPP”、“ASTKGPSVFPLAPSS”。优选为“TVAAPSVFIFPPS”。
本发明提供的双特异性抗体，该抗体的全抗体重链类别可为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4中一种，优选IgG4。
本发明提供的双特异性抗体，该抗体的全抗体轻链型别可为κ和λ，优选κ。
本发明提供的双特异性抗体，所述抗体的抗PD-1和/或CTLA-4的可变结构域位于抗体内部或外部能保持与PD-1和/或CTLA-4的结合能力。
本发明同时提供了双特异性抗体的表达细胞可为CHO、HEK293、NS0和Per 6等哺乳动物细胞，优选CHO细胞。
本发明同时提供了所述的双特异性抗体在制备治疗肿瘤的药物中的用途。
附图说明
图1：DVD-Ig双特异抗体分子结构
图2：BY18.1和BY8.2双特异抗体SDS-PAGE电泳1，蛋白分子量标准；2，BY18.1；3，BY8.2。
图3：ELISA方法检测BY18.1和BY8.2抗体与重组人CTLA4蛋白的结合；
图4：ELISA方法检测BY18.1和BY8.2抗体与重组人PD-1蛋白的结合。
具体实施方式
本发明参考下述实施例进行更详细的描述。然而，本发明不局限于这些实施例。
实施例1、抗CTLA-4抗体和抗PD-1抗体序列
抗CTLA-4：
抗PD-1抗体序列：
实施例2、Ipi(out)-L-Niv(in)DVD-Ig双特异性抗体BY18.1基因的合成和表达载体的构建
1)依据CTLA-4抗体Ipilimumab序列，抗PD-1抗体Nivolumab序列。序列委托上海捷瑞生物工程有限公司合成Ipi-L(out)-Niv-L(in)DVD-Ig双特异性抗体轻链(L链)编码基因，并对编码基因进行优化，优化为适于CHO细胞表达的编码基因。通过XhoI-EcoRI双酶切连接至p327.7表达载体(专利申请号：201410441296.0)。命名为BY18.1L。
CTCGAGCCACCGAGACCGACACACTCCTCCTGTGGGTGCTGCTGCTGTGGGTGCCTGGCTCCACTGGCGAGATCGTGCTGACACAGTCCCCTGGCACCCTGTCTCTGTCCCCAGGCGAGCGCGCCACCCTGTCTTGCCGCGCCTCTCAGAGCGTGGGCTCCTCTTACCTCGCTTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCTCCAAGACTCCTCATCTACGGCGCTTTCAGTCGGGCTACAGGCATTCCCGACCGGTTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACAGACTTCACCCTCACTATTTCGCGCCTCGAACCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTACGGCTCTAGCCCTTGGACATTCGGCCAGGGCACAAAGGTGGAGATCAAGCGGACCGTGGCCGCCCCATCCGTGTTCATTTTCCCACCTTCCGAGATTGTGCTGACACAGTCCCCCGCTACTCTGAGCCTGAGCCCTGGCGAGAGGGCTACACTGTCTTGCAGAGCTTCTCAGTCCGTGTCTTCTTACCTCGCTTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCTCCAAGACTGCTGATCTATGACGCTTCTAACCGCGCTACAGGCATTCCTGCTAGGTTCAGCGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACACTCACAATTAGCTCTCTTGAACCTGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTCTAGCAACTGGCCTAGAACATTCGGCCAGGGCACTAAGGTGGAGATTAAGAGAACCGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCTCCCAGCGACGAGCAGCTGAAGTCTGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGCGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACTCCAAGGACAGCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGACTGTCTAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCGAATTC
其中和分别为起始和终止密码子，“GCCACC”为Kozak序列，“CTCGA”和“GAATTC”分别为XhoI-EcoRI酶切位点。编码相应的氨基酸为：
METDTLLLWVLLLWVPGSTGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVG SSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGAFSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFA VYYCQQYGSSPWTFGQGTKV EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
其中“METDTLLLWVLLLWVPGSTG”为信号肽序列，“为两可变区间的Linker，下划线序列为Ipilimumab轻链可变区序列，斜体序列为Nivolumab轻链序列，其他为轻链恒定区序列。该DVD-Ig双特异性抗体轻链为κ型。
2)同理依据CTLA-4抗体Ipilimumab序列，抗PD-1抗体Nivolumab序列。序列委托上海捷瑞生物工程有限公司合成Ipi-H(out)-Niv-H(in)DVD-Ig双特异性抗体重链(H链)编码基因，并对编码基因进行优化，优化为适于CHO细胞表达的编码基因，通过XbaI-SaII双酶切连接至已克隆BY18.1L的p327.7表达载体。命名为BY18.1。
TCTAGAGCCACCGAGACCGACACCCTGCTGCTGTGGGTGCTGCTCCTGTGGGTGCCTGGCTCCACAGGCCAGGTGCAGCTCGTGGAGTCCGGCGGCGGCGTGGTGCAGCCTGGGCGGTCCCTGAGGCTGTCTTGCGCCGCTTCTGGCTTCACATTCTCTTCCTACACCATGCACTGGGTGCGCCAGGCCCCAGGCAAGGGCTTGGAGTGGGTGACTTTCATTTCTTACGACGGCAACAACAAGTACTACGCTGACAGCGTGAAGGGCAGATTCACTATTTCCCGCGACAACTCTAAGAACACCCTGTACCTCCAGATGAACTCTCTCAGAGCCGAGGACACAGCTATCTACTACTGCGCTAGGACCGGCTGGCTCGGCCCTTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACACTCGTGACCGTGTCTAGCGCATCAACAAAGGGCCCATCTGTGTTCCCACTCGCCCCATCTTCTCAGGTGCAGCTCGTGGAGTCCGGCGGCGGCGTGGTGCAGCCCGGCAGATCCCTCAGACTGGACTGCAAGGCATCCGGCATTACATTCTCTAACTCTGGAATGCACTGGGTGAGACAGGCTCCTGGCAAGGGCCTGGAATGGGTGGCCGTGATTTGGTACGACGGCTCTAAGAGATACTACGCTGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACAATTAGCAGAGACAACTCCAAGAACACTCTGTTCCTCCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCTGTGTACTACTGCGCCACCAACGACGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTCGTGACAGTGTCTTCCGCCTCCACCAAGGGCCCTTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTGCTCCCGCTCCACCTCCGAGTCCACCGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCTGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCCGGCGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCTGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCCTCCGTGGTGACCGTGCCTTCCTCCTCCCTGGGCACCAAGACCTACACCTGCAACGTGGACCACAAGCCTTCCAACACCAAGGTGGACAAGCGCGTGGAGTCCAAGTACGGCCCTCCTTGCCCTCCTTGCCCTGCCCCTGAGTTCCTGGGCGGCCCTTCCGTGTTCCTGTTCCCTCCTAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCCCGCACCCCTGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCTGAGGTGCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTCGCGAGGAGCAGTTCAACTCCACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCTTCCTCCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGCGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCTCCTTCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCTTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACTCCCGCCTGACCGTGGACAAGTCCCGCTGGCAGGAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCCCTGGGCAAGGTCGAC
其中和分别为起始和终止密码子，“GCCACC”为Kozak序列，“TCTAGA”和“GTCGAC”分别为XbaI-SaiI酶切位点。编码相应的氨基酸为：
METDTLLLWVLLLWVPGSTGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFT FSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTL YLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSS QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
其中“METDTLLLWVLLLWVPGSTG”为信号肽序列，
“”为两重链可变区间的Linker，下划线序列为Ipilimumab重链链可变区序列，斜体序列为Nivolumab重链序列，其他为重链恒定区序列。该DVD-Ig双特异性抗体轻链为IgG4类。
实施例3、Niv(out)-L-Ipi(in)DVD-Ig双特异性抗体BY18.2基因的合成和表达载体的构建
1)同理依据CTLA-4抗体Ipilimumab序列，抗PD-1抗体Nivolumab序列。委托上海捷瑞生物工程有限公司合成Niv-L(out)-L-Ipi-L(in)DVD-Ig双特异性抗体轻链(L链)编码基因，并对编码基因进行优化，优化为适于CHO细胞表达的编码基因。通过XhoI-EcoRI双酶切连接至p327.7表达载体(专利申请号：201410441296.0)。命名为BY18.2L。
CTCGAGCCACCGAGACCGACACACTCCTCCTGTGGGTGCTGCTGCTGTGGGTGCCTGGCTCCACTGGCGAGATTGTGCTGACACAGTCCCCCGCTACTCTGAGCCTGAGCCCTGGCGAGAGGGCTACACTGTCTTGCAGAGCTTCTCAGTCCGTGTCTTCTTACCTCGCTTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCTCCAAGACTGCTGATCTATGACGCTTCTAACCGCGCTACAGGCATTCCTGCTAGGTTCAGCGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACACTCACAATTAGCTCTCTTGAACCTGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTCTAGCAACTGGCCTAGAACATTCGGCCAGGGCACTAAGGTGGAGATTAAGAGAACCGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCTCCCAGCGAGATCGTGCTGACACAGTCCCCTGGCACCCTGTCTCTGTCCCCAGGCGAGCGCGCCACCCTGTCTTGCCGCGCCTCTCAGAGCGTGGGCTCCTCTTACCTCGCTTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCTCCAAGACTCCTCATCTACGGCGCTTTCAGTCGGGCTACAGGCATTCCCGACCGGTTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACAGACTTCACCCTCACTATTTCGCGCCTCGAACCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTACGGCTCTAGCCCTTGGACATTCGGCCAGGGCACAAAGGTGGAGATCAAGCGGACCGTGGCCGCCCCATCCGTGTTCATTTTCCCACCTTCCGACGAGCAGCTGAAGTCTGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGCGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACTCCAAGGACAGCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGACTGTCTAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCGAATTC
其中和分别为起始和终止密码子，“GCCACC”为Kozak序列，“CTCGAG”和“GAATTC”分别为XhoI-EcoRI酶切位点。编码相应的氨基酸为：
METDTLLLWVLLLWVPGSTGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKR EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRA SQSVGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGAFSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRL EPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
其中“METDTLLLWVLLLWVPGSTG”为信号肽序列，“为两可变区间的Linker，下划线序列为Ipilimumab轻链可变区序列，斜体序列为Nivolumab轻链序列，其他为轻链恒定区序列。该DVD-Ig双特异性抗体轻链为κ型。
2)同理依据CTLA-4抗体Ipilimumab序列，抗PD-1抗体Nivolumab序列。序列委托上海捷瑞生物工程有限公司合成Niv-H(out)-L-Ipi-H(in)DVD-Ig双特异性抗体重链(H链)编码基因，并对编码基因进行优化，优化为适于CHO细胞表达的编码基因，通过XbaI-SaII双酶切连接至已克隆BY18.2L的p327.7表达载体。命名为BY18.2。
TCTAGAGCCACCGAGACCGACACCCTGCTGCTGTGGGTGCTGCTCCTGTGGGTGCCTGGCTCCACAGGCCAGGTGCAGCTCGTGGAGTCCGGCGGCGGCGTGGTGCAGCCCGGCAGATCCCTCAGACTGGACTGCAAGGCATCCGGCATTACATTCTCTAACTCTGGAATGCACTGGGTGAGACAGGCTCCTGGCAAGGGCCTGGAATGGGTGGCCGTGATTTGGTACGACGGCTCTAAGAGATACTACGCTGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACAATTAGCAGAGACAACTCCAAGAACACTCTGTTCCTCCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCTGTGTACTACTGCGCCACCAACGACGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTCGTGACAGTGTCTTCCGCCTCCACCAAGGGCCCTTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCTCAGGTGCAGCTCGTGGAGTCCGGCGGCGGCGTGGTGCAGCCTGGGCGGTCCCTGAGGCTGTCTTGCGCCGCTTCTGGCTTCACATTCTCTTCCTACACCATGCACTGGGTGCGCCAGGCCCCAGGCAAGGGCTTGGAGTGGGTGACTTTCATTTCTTACGACGGCAACAACAAGTACTACGCTGACAGCGTGAAGGGCAGATTCACTATTTCCCGCGACAACTCTAAGAACACCCTGTACCTCCAGATGAACTCTCTCAGAGCCGAGGACACAGCTATCTACTACTGCGCTAGGACCGGCTGGCTCGGCCCTTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACACTCGTGACCGTGTCTAGCGCATCAACAAAGGGCCCATCTGTGTTCCCACTCGCCCCATGCTCCCGCTCCACCTCCGAGTCCACCGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCTGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCCGGCGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCTGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCCTCCGTGGTGACCGTGCCTTCCTCCTCCCTGGGCACCAAGACCTACACCTGCAACGTGGACCACAAGCCTTCCAACACCAAGGTGGACAAGCGCGTGGAGTCCAAGTACGGCCCTCCTTGCCCTCCTTGCCCTGCCCCTGAGTTCCTGGGCGGCCCTTCCGTGTTCCTGTTCCCTCCTAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCCCGCACCCCTGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCTGAGGTGCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTCGCGAGGAGCAGTTCAACTCCACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCTTCCTCCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGCGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCTCCTTCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCTTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACTCCCGCCTGACCGTGGACAAGTCCCGCTGGCAGGAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCCCTGGGCAAGGTCGAC
其中和分别为起始和终止密码子，“GCCACC”为Kozak序列，“TCTAGA”和“GTCGAC”分别为XbaI-SaII酶切位点。编码相应的氨基酸为：
METDTLLLWVLLLWVPGSTGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSS QVQLVESGGGVV QPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADS VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLV TVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
其中“METDTLLLWVLLLWVPGSTG”为信号肽序列，
“”为两重链可变区间的Linker，下划线序列为Ipilimumab重链链可变区序列，斜体序列为Nivolumab重链序列，其他为重链恒定区序列。该DVD-Ig双特异性抗体重链为IgG4类。
实施例4、全抗体稳定细胞的筛选
CHO细胞在10％FBS，含4mM谷氨酰胺的CD OptiCHO(Invitrogen产品)中适应并贴壁生长；胰酶消化后调节细胞浓度，接种至75cm2培养瓶，细胞数大约为5×106/瓶；24小时后，按Lipofectin 2000(Invitrogen产品)操作说明分别转染BY18.1和BY8.2；转染24小时后，胰酶消化并收集转染细胞；调节细胞浓度，接种至96孔培养板，0.8×104/孔，筛选培养基成分10％D-FBS，CDOptiCHO，含25μM L-蛋氨酸砜亚胺(L-Methionine sulfoximine，MSX，Sigma产品)；5-7天后补加新鲜培养基50μl/孔；15天左右有克隆长出，取50μl样品双抗体夹心法ELISA方法半定量检测培养液中蛋白含量，初步筛选出蛋白表达量相对较高克隆；蛋白表达量相对较高克隆转入24孔板中悬浮培养，培养基换为不含D-FBS的CD OptiCHO培养基；数天后，同样采用ELISA方法检测24孔板中的相对蛋白表达量；进一步经6孔板、75cm2培养瓶和250ml摇瓶悬浮培养；结合ELISA半定量结果和细胞生长状态，筛选表达量较高细胞。
实施例5、BY18.1和BY8.2双特异抗体的表达和纯化
将高表达抗体细胞置无血清的CD OptiCHO中培养，一定时间后收集培养上清。用pH 7.4的PBS溶液平衡HiTrap MabSelect SuRe 1ml柱(GE HealthcareLife Sciences产品，Cat.No：11-0034-93)10个床体积，流速为0.5ml/min；培养上清液用0.45μm滤膜过滤上样，流速为0.5ml/min。用pH 7.4的PBS溶液再洗5-10个床体积，流速为0.5ml/min；用100mM柠檬酸缓冲液(pH 3.6)洗脱，流速为0.5ml/min，收集洗脱峰。纯化产物非还原电泳和还原SDS-PAGE电泳检测分子量。
纯化BY18.1和BY8.2双特异抗体还原SDS-PAGE电泳见图，；还原SDS-PAGE电泳BY18.1和BY8.2分子大小基本一致，重链约66kDa，轻链约36kDa，均大于普通抗体的50kDa和25kDa。BY18.1和BY8.2抗体理论分子量约199.0kDa，重链理论预期分子量大约62.8kDa，轻链大小约36.5kDa，实测值均与理论预期基本一致，结果如图2所示。
实施例6、ELISA方法检测BY18.1和BY8.2双特异抗体与人CTLA4蛋白和重组人PD-L1蛋白的结合
重组人CTLA4/CD152蛋白和重组人PD-L1蛋白(均购自北京义翘神州生物技术有限公司，产品号：11159-HO3H和10084-HO2H)1μg/ml和0.8μg/ml分别包被EIA 96孔板。将不同纯化出的的BY18.1和BY8.2抗体稀释至5μg/ml，然后进行5倍稀释，稀释4个梯度。50μl加入包被的96孔板中，37℃孵育2小时。洗涤3次后，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗人二抗(北京中衫金桥公司产品，产品号：ZDR-5301)，37℃孵育1h。洗涤3次后，加入TMB底物显色液(北京康为世纪生物科技有限公司，产品号：CW0050)50μl/孔。10分钟后，加入2N的H2SO4终止显色。
结果：BY18.1和BY8.2双特异抗体与人CTLA4蛋白和重组人PD-L1蛋白的结合均有较好的结合活性，见图3和图4。BY18.1和BY8.2与抗原的结合亲和力差异从结果上尚无法判断，拟进一步采用分子相互作用仪Biacore进一步检测。

Claims (11)

1.一种能够结合PD-1和/或CTLA-4抗原的双特异性抗体，其中所述重链包含HVD1-L1-HVD2-CH结构，其中
HVD1是第一个重链可变结构域，
L1是重链柔性接头，
HVD2是第二个重链可变结构域，
CH区是重链恒定结构域；
其中所述轻链包含LVD1-L2-LVD2-CL结构，其中
LVD1是第一个轻链可变结构域，
L2是轻链柔性接头，
LVD2是第二个轻链可变结构域，
CL是轻链恒定结构域。
2.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，其中的HVD1选自SEQ ID No 2，则HVD2选自SEQ ID No 4，6，8，LVD1选自SEQ ID No 1，LVD2选自SEQ ID No 3，5，7；
或其中的HVD1选自SEQ ID No 4，6，8，则HVD2选自SEQ ID No 2，LVD1选自SEQ ID No3，5，7，LVD2选自SEQ ID No 1。
3.根据权利要求2所述的双特异性抗体，其特征在于，其中的L1选自：两重链可变结构域间的柔性接头可为“AKTTPKLEEGEFSEAR”、“AKTTPKLEEGEFSEARV”、“SAKTTPKLEEGEFSEARV”、“AKTTPPSVTPLAP”、“ASTKGPSVFPLAP”、“GGGGSGGGGSGGGGS”、“TVAAPSVFIFPPTVAAPSVFIFPP”、“ASTKGPSVFPLAPSS”。
4.根据权利要求3所述的双特异性抗体，其特征在于，其中的L1选自：
两重链可变结构域间的柔性接头为“ASTKGPSVFPLAPSS”和“ASTKGPSVFPLAP”。
5.根据权利要求2所述的双特异性抗体，其特征在于，其中的L2选自：两轻链可变结构域间的柔性接头可为“AKTTPKLEEGEFSEAR”、“AKTTPKLEEGEFSEARV”、“SAKTTPKLEEGEFSEARV”、“AKTTPPSVTPLAP”、“ASTKGPSVFPLAP”、“GGGGSGGGGSGGGGS”、“TVAAPSVFIFPPTVAAPSVFIFPP”、“ASTKGPSVFPLAPSS”。
6.根据权利要求5所述的双特异性抗体，其特征在于，其中的L2选自：两轻链可变结构域间的为“TVAAPSVFIFPPS”。
7.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，该抗体的全抗体重链类别可为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4中一种，优选IgG4。
8.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，该抗体的全抗体轻链型别可为К和λ，优选К。
9.根据权利要求1-8任一所述的双特异性抗体，其特征在于，所述抗体的抗PD-1和/或CTLA-4的可变结构域位于抗体内部或外部能保持与PD-1和/或CTLA-4的结合能力。
10.根据权利要求1-8任一所述的双特异性抗体，其特征在于，所述抗体的表达细胞可为CHO、HEK293、NS0和Per 6等哺乳动物细胞，优选CHO细胞。
11.根据权利要求1-8任一所述的双特异性抗体在制备治疗肿瘤的药物中的用途。
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