CN109071639B - Pd1/ctla4结合剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了结合PD1和CTLA4的多特异性分子，例如包含多于一种ISVD或纳米抗体。这些分子已经被工程改造以减少施用这种分子的受试者体内预先存在抗体的结合的发生。提供了用这样的分子增加免疫应答、治疗癌症和/或治疗感染性疾病的方法。

Description

PD1/CTLA4结合剂
本申请要求2015年11月18日提交的美国临时专利申请号62/256,985的权益；所述申请以其整体通过引用并入本文。
计算机可读格式的核苷酸/氨基酸序列表以其整体通过引用并入。含有所述序列表的文件是353k字节ASCII文本文件，其创建于2016年11月15日且名为“24236WOPCTSEQ”。
发明领域
本发明部分涉及结合程序性细胞死亡蛋白1(“PD1”)和细胞毒性T-淋巴细胞相关蛋白4(“CTLA4”)的双特异性多肽。具体而言，本发明部分涉及包含至少一个(诸如一个或两个)结合PD1的重链免疫球蛋白单一可变结构域(在本文中也称为“ISV”或“ISVD”)和至少一个(诸如一个或两个)结合CTLA4的重链免疫球蛋白单一可变结构域的双特异性多肽。
发明背景
消除免疫调节分子(诸如细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA4))代表通过操纵免疫系统诱导肿瘤消退、稳定疾病和延长存活的新的且有前景的策略。抗CTLA4抗体伊匹单抗(ipilimumab)目前销售用于适应症，包括黑色素瘤。已经在接受CTLA4抗体的具有黑色素瘤的患者中看到肿瘤消退和至进展的时间延长的证据，并已用伊匹单抗，在具有黑色素瘤、卵巢癌、前列腺癌和肾细胞癌的患者中观察到持久应答。
程序性死亡受体1(PD1)是主要在活化的T和B细胞上表达的免疫抑制性受体。与其配体的相互作用已显示体外和体内减弱T细胞应答。PD1与其配体之一PD-L1之间的相互作用的阻断已显示增强肿瘤特异性CD8+T细胞免疫且可因此有助于通过免疫系统清除肿瘤细胞。
PD1/PD-L1相互作用的阻断可导致肿瘤特异性T细胞免疫增强且因此有助于通过免疫系统清除肿瘤细胞。为了理解决该问题，进行了许多研究。在侵袭性胰腺癌的鼠模型中，T.Nomi等人(Clin.Cancer Res.13：2151-2157(2007))证实了PD1/PD-L1阻断的治疗效力。针对PD1或PD-L1的抗体的施用显著抑制肿瘤生长。抗体阻断有效促进肿瘤反应性CD8+T细胞浸润至肿瘤中，导致抗肿瘤效应子(包括IFNγ、颗粒酶B和穿孔蛋白)的上调。另外，作者显示PD1阻断可以有效地与化学疗法组合以产生协同效应。在另一项研究中，使用小鼠中的鳞状细胞癌的模型，PD1或PD-L1的抗体阻断显著抑制肿瘤生长(Tsushima F.等人，OralOncol.42：268-274(2006))。
抑制CTLA4和PD1介导的免疫应答的下调的一种方法是通过使其与多特异性纳米抗体结合，来干扰其与其配体的相互作用。存在下述的可能性，即源于美洲驼的纳米抗体可引起不需要的抗药物免疫应答，例如通过患者血清中预先存在的抗体与纳米抗体的结合。因此，使纳米抗体人源化以便减少或消除这种应答的新型方法是尤其有价值的，通过此类方法产生的纳米抗体也是如此。
发明概述
本发明提供了PD1/CTLA4结合剂或多特异性免疫球蛋白单一可变结构域(ISVD)(诸如纳米抗体)，其通过在以下残基VRVTVL(SEQ ID NO：195的氨基酸33-38)、ADSQVTEVC(SEQ ID NO：195的氨基酸41-49)和CKVELMYPPPYYLG(SEQ ID NO：195的氨基酸93-106)中的一个或多个(例如所有三个位点)处接触人类CTLA4而结合人PD1和人CTLA4。例如，所述结合剂防止所述残基在氘源(诸如D2O)存在的情况下进行氢-氘交换。在本发明的一个实施方案中，所述ISVD结合人CTLA4且生成基本上如图17中所述的结合热图(例如如在氢-氘交换测定中所生成)。
本发明还提供了PD1/CTLA4结合剂，其包含：一个或多个结合PD1的ISVD，其包含：包含氨基酸序列IHAMG(SEQ ID NO：3)或GSIASIHAMG(SEQ ID NO：6)的CDR1；包含氨基酸序列VITXSGGITYYADSVKG(SEQ ID NO：4；其中X是W或V)或VITWSGGITY(SEQ ID NO：7)的CDR2；和包含氨基酸序列DKHQSSXYDY(SEQ ID NO：5；其中X是W或F)的CDR3；以及一个或多个结合CTLA4的ISVD，其包含：包含氨基酸序列FYGMG(SEQ ID NO：10)或GGTFSFYGMG(SEQ ID NO：13)的CDR1；包含氨基酸序列DIRTSAGRTYYADSVKG(SEQ ID NO：11)或DIRTSAGRTY(SEQ IDNO：14)的CDR2；和包含氨基酸序列EXSGISGWDY(SEQ ID NO：12；其中X是M或P)的CDR3；以及，任选地，半衰期延长剂和/或C端延长剂。在本发明的一个实施方案中，在所述结合剂中的各ISVD之间存在肽接头，例如，35GS接头。
本发明还提供了PD1/CTLA4结合剂，其包括：结合PD1的ISVD，其包含氨基酸序列：
Figure BPA0000258853690000031
Figure BPA0000258853690000032
其中X1是D或E，且其中X2是S、V、G、R、Q、M、H、T、D、E、W、F、K、A、Y或P；和，任选地，半衰期延长剂和/或C端延长剂。在本发明的一个实施方案中，在所述结合剂中的各ISVD之间存在肽接头，例如，35GS接头。
本发明还提供了PD1/CTLA4结合剂，其包含：
·PD1 ISVD，其包含SEQ ID NO：135中所述的氨基酸序列；
·35GS接头，其包含SEQ ID NO：86中所述的氨基酸序列；
·CTLA4 ISVD，其包含SEQ ID NO：143(D1E)中所述的氨基酸序列；
·35GS接头，其包含SEQ ID NO：86中所述的氨基酸序列；
·HSA ISVD，其包含SEQ ID NO：144中所述的氨基酸序列；和
·C端丙氨酸。
或者：
·PD1 ISVD，其包含SEQ ID NO：135中所述的氨基酸序列；
·35GS接头，其包含SEQ ID NO：86中所述的氨基酸序列；
·PD1 ISVD，其包含SEQ ID NO：135中所述的氨基酸序列；
·35GS接头，其包含SEQ ID NO：86中所述的氨基酸序列；
·CTLA4 ISVD，其包含SEQ ID NO：143中所述的氨基酸序列；
·35GS接头，其包含SEQ ID NO：86中所述的氨基酸序列；
·HSA ISVD，其包含SEQ ID NO：144中所述的氨基酸序列；和
·C端丙氨酸。
或者
·PD1 ISVD，其包含SEQ ID NO：135中所述的氨基酸序列；
·35GS接头，其包含SEQ ID NO：86中所述的氨基酸序列；
·CTLA4 ISVD，其包含SEQ ID NO：143(D1E)中所述的氨基酸序列；
·35GS接头，其包含SEQ ID NO：86中所述的氨基酸序列；
·CTLA4 ISVD，其包含SEQ ID NO：143(D1E)中所述的氨基酸序列；
·35GS接头，其包含SEQ ID NO：86中所述的氨基酸序列；
·HSA ISVD，其包含SEQ ID NO：144中所述的氨基酸序列；和
·C端丙氨酸。
或者
·PD1 ISVD，其包含SEQ ID NO：135中所述的氨基酸序列；
·35GS接头，其包含SEQ ID NO：86中所述的氨基酸序列；
·PD1 ISVD，其包含SEQ ID NO：135(D1E)中所述的氨基酸序列；
·35GS接头，其包含SEQ ID NO：86中所述的氨基酸序列；
·CTLA4 ISVD，其包含SEQ ID NO：143(D1E)中所述的氨基酸序列；
·35GS接头，其包含SEQ ID NO：86中所述的氨基酸序列；
·CTLA4 ISVD，其包含SEQ ID NO：143(D1E)中所述的氨基酸序列；
·35GS接头，其包含SEQ ID NO：86中所述的氨基酸序列；
·HSA ISVD，其包含SEQ ID NO：144中所述的氨基酸序列；和
·C端丙氨酸。
例如，本发明提供了包含SEQ ID NO：146、149、151或153中所述的氨基酸序列的PD1/CTLA4结合剂。
在本发明的一个实施方案中，所述PD1/CTLA4结合剂包含半衰期延长剂，例如，HSA结合剂，例如，人血清白蛋白ISVD，其包含：包含氨基酸序列GFTFSSFGMS(SEQ ID NO：177)的CD1；包含氨基酸序列SISGSGSDTL(SEQ ID NO：178)的CDR2；和包含氨基酸序列GGSLSR(SEQID NO：179)的CDR3，例如，包含氨基酸序列：
Figure BPA0000258853690000051
此外，本发明提供了交叉阻断本文所述的PD1/CTLA4结合剂结合PD1和/或CTLA4的结合剂(例如，抗体、其抗原结合片段、ISVD或纳米抗体)。
本发明提供了结合PD1和CTLA4的PD1/CTLA4结合剂或多特异性结合剂(例如多特异性ISVD，诸如纳米抗体)，其包含：(i)结合PD1的结合部分，其包含SEQ ID NO：1或2中所述的氨基酸序列，但相对于SEQ ID NO：1或2中的氨基酸序列，在位置11、89、110和112中的一个或多个处进一步包含突变，其中所述位置根据Kabat编号，且任选地进一步包含本文或另外所述的任何数目的额外突变，例如最多达10(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)个额外突变(例如点突变、取代、缺失、插入)；和(ii)结合CTLA4的结合部分，其包含SEQ ID NO：9中所述的氨基酸序列，但相对于SEQ ID NO：9中的氨基酸序列，在位置11、89、110和112中的一个或多个处进一步包含突变，其中所述位置根据Kabat编号，任选地进一步包含本文或另外所述的任何数目的额外突变，例如最多达10(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)个额外突变(例如点突变、取代、缺失、插入)。在本发明的一个实施方案中，结合PD1的结合部分相对于SEQ IDNO：1或2的氨基酸序列包含一个或多个突变，其中：位置11处的氨基酸残基选自L或V；位置89处的氨基酸残基选自T、V、I或L；位置110处的氨基酸残基选自T、K或Q；和/或位置112处的氨基酸残基选自S、K或Q；且其中结合CTLA4的结合部分相对于SEQ ID NO：9的氨基酸序列包含一个或多个突变，其中：位置11处的氨基酸残基选自L或V；位置89处的氨基酸残基选自T、V或L；位置110处的氨基酸残基选自T、K或Q；和/或位置112处的氨基酸残基选自S、K或Q。在本发明的一个实施方案中，结合PD1的结合部分相对于SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列包含一个或多个突变，其中：位置89是L且位置11是V；或位置89是L且位置110是K或Q；或位置89是L且位置112是K或Q；或位置89是L且位置11是V且位置110是K或Q；或位置89是L且位置11是V且位置112是K或Q；或位置11是V且位置110是K或Q；或位置11是V且位置112是K或Q；和/或其中结合CTLA4的结合部分相对于SEQ ID NO：9的氨基酸序列包含一个或多个突变，其中：位置89是L且位置11是V；或位置89是L且位置110是K或Q；或位置89是L且位置112是K或Q；或位置89是L且位置11是V且位置110是K或Q；或位置89是L且位置11是V且位置112是K或Q；或位置11是V且位置110是K或Q；或位置11是V且位置112是K或Q。在本发明的一个实施方案中，所述多特异性结合剂相对于SEQ ID NO：1、2和/或9在位置11、89、110和112处包含突变，其如下表中所述的那些中的任一个：
Figure BPA0000258853690000061
在本发明的一个实施方案中，(i)结合PD1的结合部分相对于SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列在选自1、14、41、74、83和87的位置处进一步包含一个或多个突变，其中所述位置根据Kabat编号；和/或(ii)结合CTLA4的结合部分相对于SEQ ID NO：9的氨基酸序列在选自1、14、41、74、83和87的位置处进一步包含一个或多个突变，其中所述位置根据Kabat编号。在本发明的一个实施方案中，所述多特异性结合剂包含例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的C端延伸。例如，在本发明的一个实施方案中，所述C端延伸具有式-X(n)，其中X和n如下：(a)n＝1且X＝Ala；(b)n＝2且各X＝Ala；(c)n＝3且各X＝Ala；(d)n＝2且至少一个X＝Ala且其中剩余氨基酸残基X独立地选自任何天然存在的氨基酸；(e)n＝3且至少一个X＝Ala且其中剩余氨基酸残基X独立地选自任何天然存在的氨基酸；(f)n＝3且至少两个X＝Ala且其中剩余氨基酸残基X独立地选自任何天然存在的氨基酸；(g)n＝1且X＝Gly；(h)n＝2且各X＝Gly；(i)n＝3且各X＝Gly；(j)n＝2且至少一个X＝Gly，其中剩余氨基酸残基X独立地选自任何天然存在的氨基酸；(k)n＝3且至少一个X＝Gly，其中剩余氨基酸残基X独立地选自任何天然存在的氨基酸；(l)n＝3且至少两个X＝Gly，其中剩余氨基酸残基X独立地选自任何天然存在的氨基酸；(m)n＝2且各X＝Ala或Gly；(n)n＝3且各X＝Ala或Gly；(o)n＝3且至少一个X＝Ala或Gly，其中剩余氨基酸残基X独立地选自任何天然存在的氨基酸；或(p)n＝3且至少两个X＝Ala或Gly，其中剩余氨基酸残基X独立地选自任何天然存在的氨基酸，例如C端延伸选自A、AA、AAA、G、GG、GGG、AG、GA、AAG、AGG、AGA、GGA、GAA和GAG。
本发明还包含多特异性结合剂(例如多特异性ISVD，诸如纳米抗体)，其包含(i)结合PD1的结合部分，其包含与选自SEQ ID NO：1、2和16-47的成员中所述的氨基酸序列具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％)序列同一性的氨基酸序列，其包含含有SEQ IDNO：1或2中所述的氨基酸序列的免疫球蛋白的CDR1、CDR2和CDR3，其中所述结合部分相对于SEQ ID NO：1或2中所述的氨基酸序列包含至少一个突变，其中所述至少一个突变在选自11、89、110和112的位置处，其中所述位置根据Kabat编号；和/或(ii)结合CTLA4的结合部分，其包含与选自SEQ ID NO：9和48-83的成员中所述的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，其包含含有SEQ ID NO：9中所述的氨基酸序列的免疫球蛋白的CDR1、CDR2和CDR3，其中所述结合部分相对于SEQ ID NO：9中所述的氨基酸序列包含至少一个突变，其中所述至少一个突变在选自11、89、110和112的位置处，其中所述位置根据Kabat编号。
本发明提供了包含选自SEQ ID NO：16-83和103-134的氨基酸序列的多特异性结合剂或多肽。
本发明包括多特异性结合剂，其包含：(i)结合PD1的结合部分，其包含选自SEQ IDNO：16-47的氨基酸序列，和(ii)结合CTLA4的结合部分，其包含选自SEQ ID NO：48-83的氨基酸序列。
在本发明的一个实施方案中，所述多特异性结合剂(例如多特异性ISVD，诸如纳米抗体)进一步连接至一个或多个免疫球蛋白单一可变结构域、纳米抗体、抗体或其抗原结合片段。在本发明的一个实施方案中，所述多特异性结合剂包括一个或多个其它结合部分(例如免疫球蛋白单一可变结构域、纳米抗体、抗体或其抗原结合片段)，其结合CD27、LAG3、PD1、BTLA、TIM3、ICOS、B7-H3、B7-H4、CD137、GITR、PD-L1、PD-L2、ILT1、ILT2CEACAM1、CEACAM5、TIM3、TIGIT、VISTA、ILT3、ILT4、ILT5、ILT6、ILT7、ILT8、CD40、OX40、CD137、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3、NKG2A、NKG2C、NKG2E、IL-10、IL-17或TSLP。
本发明包括PD1/CTLA4结合剂或多特异性结合剂与另外的治疗剂(诸如派姆单抗(pembrolizumab))的组合。本发明还包括注射装置或容器，其包含PD1/CTLA4结合剂或多特异性结合剂，且任选地与另外的治疗剂(诸如派姆单抗)组合。本发明还提供了编码如本文所述的PD1/CTLA4结合剂或多特异性结合剂的多核苷酸(例如，包含SEQ ID NO：145、148、150或152中所述的核苷酸序列)，以及包含此类多核苷酸的载体和包括此类多核苷酸和载体的宿主细胞(例如CHO细胞或毕赤酵母(Pichia)细胞)。
本发明提供了用于制备如本文所述的PD1/CTLA4结合剂或多特异性结合剂的方法，其包括将编码免疫球蛋白的多核苷酸引入宿主细胞中，和在培养基中在有利于从所述多核苷酸表达所述免疫球蛋白的条件下培养宿主细胞(例如CHO细胞或毕赤酵母细胞)，和任选地，从所述宿主细胞和/或所述培养基纯化免疫球蛋白。通过此类方法产生的PD1/CTLA4结合剂或多特异性结合剂是本发明的一部分。
本发明还提供了用于防止PD1结合PD-L1和/或PD-L2和用于防止T细胞上的CTLA4结合抗原呈递细胞上的CD80和/或CD86的方法，其包括使PD1接触如本文所述的所述PD1/CTLA4结合剂或多特异性结合剂，任选地与另外的治疗剂组合。
本发明提供了用于增强受试者(例如哺乳动物，诸如人)中的免疫应答的方法，其包括向所述受试者施用有效量的如本文所述的PD1/CTLA4结合剂或多特异性结合剂，任选地与另外的治疗剂组合。
本发明还提供了用于治疗或预防受试者中的癌症或感染性疾病的方法，其包括向所述受试者施用有效量的如本文所述的PD1/CTLA4结合剂或多特异性结合剂，任选地与另外的治疗剂组合。例如，在本发明的一个实施方案中，所述癌症是转移性癌症、实体瘤、血液癌症、白血病、淋巴瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、神经母细胞瘤、肾癌、白血病、肾移行细胞癌、膀胱癌、Wilm氏癌、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、骨癌、肺癌、非小细胞肺癌、胃癌、结直肠癌、宫颈癌、滑膜肉瘤、头颈癌、鳞状细胞癌、多发性骨髓瘤、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、肝母细胞瘤、肝细胞癌、黑素瘤、肾横纹肌样瘤、尤因氏肉瘤、软骨肉瘤、脑癌、胶质母细胞瘤、脑膜瘤、垂体腺瘤、前庭神经鞘瘤、原始性神经外胚层肿瘤、成神经管细胞瘤、星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、室管膜瘤、脉络丛乳头状瘤、真性红细胞增多症、血小板增多症、特发性骨髓纤维化、软组织肉瘤、甲状腺癌、子宫内膜癌、类癌或肝癌、乳腺癌或胃癌。在本发明的一个实施方案中，所述感染性疾病是细菌感染、病毒感染或真菌感染。在本发明的一个实施方案中，其中向所述受试者施用另外的治疗剂和/或治疗程序与PD1/CTLA4结合剂或多特异性结合剂的组合。
附图描述
图1：列出将在本文中特别提及的一些氨基酸位置和其根据一些替代编号系统(诸如Aho和IMGT)的编号的表格。
图2：纳米抗体102C12和参考A序列(参见WO 2008/071447，SEQ ID NO：348)。
图3(A-B)：(A)本发明的PD1结合部分的序列。(B)PD1结合部分与SEQ ID NO：1和2的氨基酸序列的比对。
图4(A-B)：(A)本发明的CTLA4结合部分的序列。(B)CTLA4结合部分与SEQ ID NO：9的氨基酸序列的比对。
图5：可连接至本发明的结合剂的序列。
图6：本发明的PD1/CTLA4结合剂的序列。
图7：在中国仓鼠卵巢细胞中(CHO N-连接的聚糖)和在工程改造的酵母细胞中(工程改造的酵母N-连接的聚糖)产生的单克隆抗体的优势N-连接的聚糖：正方形：N-乙酰基葡糖胺(GlcNac)；圆形：甘露糖(Man)；菱形：半乳糖(Gal)；三角形：岩藻糖(Fuc)。
图8：纳米抗体F023700925、F023700918和F023700912和对照纳米抗体(IRR00051；抗HER2/ERBB2(具有连接至白蛋白结合剂的35GS的二价抗HER2))与表达人CTLA4的CHO-K1细胞的结合。
图9：纳米抗体F023700925、F023700912和对照纳米抗体(IRR00051)与表达人PD1的CHO-K1细胞的结合。
图10(A-B)：通过F023700906、F023701051、F023701054和F023701061阻断人CTLA4(在CHO-K1细胞上)与(A)人CD80或(B)人CD86的结合。
图11(A-H)：纳米抗体F023700912或F023700925或对照纳米抗体(IRR00051)与(A)阴性对照L细胞、(B)阴性对照CHO-K1细胞、(C)huCD28+L细胞、(D)huCD8α+L细胞、(E)huLag-3+CHO-K1细胞、(F)huBTLA+CHO-K1细胞、(G)huCTLA-4+CHO-K细胞或(H)huPD-1+CHO-K1细胞的结合。
图12(A-B)：通过纳米抗体F02370906、F02371051、F023701054或F023701061阻断人CTLA4(在CHO-K1细胞上)与(A)人CD80或(B)人CD86的结合。
图13(A-J)：平均panc08/.13肿瘤体积±SEM(A)，和第37天的个体肿瘤体积(B)，和用(C)同种型对照抗体、(D)伊匹单抗(N297A)、(E)伊匹单抗、(F)派姆单抗、(G)伊匹单抗+派姆单抗、(H)CTLA4纳米抗体F023700912(5mpk)、(I)CTLA4纳米抗体F023700912(15mpk)或(J)派姆单抗+CTLA4纳米抗体F023700912(15mpk)处理的小鼠，在实验过程的人源化小鼠个体中的肿瘤体积。
图14(A-B)：来自(a)健康和(b)癌症患者的预先存在的抗体与纳米抗体F023700912、F023700925或三价对照纳米抗体T013700112(缺乏降低预先存在的抗体结合的突变)的结合。
图15(A-D)：本发明的序列。
图16(A-B)：本发明的结合剂构建体的描述。
图17：通过F023700912 CTLA4结合剂的人CTLA4结合的氘标记差异热图。
发明详述
本发明提供了包含突变的ISVD，所述突变阻断预先存在的抗体(预抗体)对ISVD内的新表位的反应性。新表位是当蛋白被突变(例如截短)或其折叠被改变时呈现的蛋白内的表位。预先存在的抗体是在接受ISVD前患者体内存在的抗体。本发明的ISVD部分基于其C端恒定结构域已经移除的美洲骆抗体；因此，所得VHH的C端中的新表位暴露于预抗体结合。已发现残基11和89的突变的组合(例如L11V和I89L或V89L)导致预抗体结合的令人惊讶的缺乏。残基112中的突变也已显示显著减少预抗体结合。Buyse&Boutton(WO2015/173325)包括显示L11V和V89L突变的组合与仅L11V突变或仅V89L突变相比在减少预抗体结合中提供显著改善的数据。例如，Buyse&Boutton在第97页的表H显示仅具有V89L突变的ISVD(有或无C端延伸)和具有V89L突变与L11V突变的组合的相同ISVD(再次，有或无C端延伸)的比较数据。此外，尽管在两个单独实验中生成，与表B中对于仅L11V突变(在相同ISVD中)给出的数据相比，表H中对于L11V/V89L组合显示的数据显示通过L11V/V89L组合获得的预抗体结合减少大于仅L11V突变。因为已知美洲骆抗体支架结构是非常高度保守的，对于任何ISVD，位置11和89处的突变的效果非常可能都存在。事实上，在图14中，使用本发明结合剂F023700912、F023700925证实了所述效果，其显示展示出非常低水平的预抗体结合。
在本申请中，免疫球蛋白重链可变结构域中的氨基酸残基/位置将用根据Kabat的编号指示。为了方便起见，图1给出表格，其列出了将在本文中特别提及的一些氨基酸位置和其根据一些替代编号系统(诸如Aho和IMGT。注释：除非另外明确指示，否则对于本说明书和权利要求，Kabat编号是决定性的；其它编号系统仅为了参考而给出)的编号。
关于CDR，如本领域中众所周知，存在多种定义和描述VH或VHH片段的CDR的惯例，诸如Kabat定义(其基于序列变异性且最常用)和Chotia定义(其基于结构环区的位置)。参考例如网站www.bioinf.org.uk/abs/。出于本说明书和权利要求的目的，即使也可提及根据Kabat的CDR，CDR最优选基于Abm定义(其基于Oxford Molecular的AbM抗体建模软件)来定义，因为这被视为Kabat和Chotia定义之间的最佳折衷。再次参考网站www.bioinf.org.uk/abs/。参见Sequences of Proteins of Immunological Interest，Kabat，等人；National Institutes of Health，Bethesda，Md.；第5版；NIH公开号91-3242(1991)；Kabat(1978)Adv.Prot.Chem.32：1-75；Kabat，等人，(1977)J.Biol.Chem.252：6609-6616；Chothia，等人，(1987)J Mol.Biol.196：901-917或Chothia，等人，(1989)Nature 342：878-883；Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196：901-917；Elvin A.Kabat，TaiTe Wu，Carl Foeller，Harold M.Perry，Kay S.Gottesman(1991)Sequences of Proteinsof Immunological Interest；Protein Sequence and Structure Analysis of AntibodyVariable Domains.于：Antibody Engineering Lab Manual(编辑：Duebel，S.和Kontermann，R.，Springer-Verlag，Heidelberg)。在本发明的一个实施方案中，根据Kabat确定CDR，例如，其中VHH的FR1包含位置1-30处的氨基酸残基，VHH的CDR1包含位置31-35处的氨基酸残基，VHH的FR2包含位置36-49处的氨基酸，VHH的CDR2包含位置50-65处的氨基酸残基，VHH的FR3包含位置66-94处的氨基酸残基，VHH的CDR3包含位置95-102处的氨基酸残基，且VHH的FR4包含位置103-113处的氨基酸残基。
在本发明的一个实施方案中，根据Kontermann和D ü bel(编辑，AntibodyEngineering，vol 2，Springer Verlag Heidelberg Berlin，Martin，Chapter 3，pp.33-51，2010)确定CDR。
本发明旨在提供改进的PD1/CTLA4结合剂，具体而言，改进的PD1/CTLA4双特异性ISVD且更具体而言，改进的抗PD1/CTLA4双特异性纳米抗体。本发明的PD1/CTLA4结合剂包括下述那些，其包括CTLA4结合部分和PD1结合部分(以任一顺序)，所述CTLA4结合部分包括作为包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的多肽的变体的多肽，其在位置1、11、14、45、73、74、83、89、96、108、110和/或112处突变；所述PD1结合部分包括作为包含SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列的多肽的变体的多肽，其在位置1、11、14、52a、73、74、83、89、100a、110和/或112处突变。本发明提供的改进的PD1/CTLA4双特异性结合物在本文中也称为“本发明的PD1/CTLA4双特异性结合剂”或“PD1/CTLA4双特异性结合剂”或“PD1/CTLA4结合剂”。这些术语涵盖包括如本文所述的CTLA4结合部分和PD1结合部分的任何分子。例如，该术语包括这样的分子，其包括CTLA4结合部分(例如，包含选自SEQ ID NO：143或196的成员中所述的氨基酸序列的ISVD)和PD1结合部分(例如包含选自SEQ ID NO：103-134、135、136、137、140、141和142的成员中所述的氨基酸序列的ISVD)，其可以是融合蛋白，和/或可以连接至常规抗体或其抗原结合片段。PD1/CTLA4结合剂包括任何多特异性结合剂，其包含CTLA4结合部分(例如，包括选自SEQ ID NO：143或196的成员中所述的氨基酸序列)和PD1结合部分(例如，包括选自SEQ ID NO：103-134、135、136、137、140、141和142的成员中所述的氨基酸序列)，其还结合另一个表位诸如CD27、LAG3，CTLA4的不同表位，PD1的不同表位、BTLA、TIM3、ICOS、B7-H3、B7-H4、CD137、GITR、PD-L1、PD-L2、ILT1、ILT2 CEACAM1、CEACAM5、TIM3、TIGIT、VISTA、ILT3、ILT4、ILT5、ILT6、ILT7、ILT8、CD40、OX40、CD137、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3、NKG2A、NKG2C、NKG2E、IL-10、IL-17和/或TSLP。
如所讨论，本发明的“PD1结合剂”是本文描述的结合PD1的分子中的任一种(例如ISVD，诸如纳米抗体)以及结合PD1且包括本文描述的PD1结合部分中的任一种的任何抗体或其抗原结合片段。PD1结合剂可以对于PD1是选择性的或其可以额外包括结合LAG3、CD27、CTLA4、HSA、BTLA、TIM3、ICOS、B7-H3、B7-H4、CD137、GITR、PD-L1、PD-L2、ILT1、ILT2CEACAM1、CEACAM5、TIM3、TIGIT、VISTA、ILT3、ILT4、ILT5、ILT6、ILT7、ILT8、CD40、OX40、CD137、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3、NKG2A、NKG2C、NKG2E、IL-10、IL-17、TSLP的结合剂，例如包含LAG3结合部分和CTLA4结合部分；LAG3结合部分和BTLA结合部分；1或2个PD1结合部分、1或2个LAG3结合部分和HSA结合部分；或LAG3结合部分和BTLA结合部分。如果单个PD1结合剂是较大分子(例如多价分子，诸如F023700910、F023700918、F023700920或F023700925)的一部分，则其可称为PD1结合部分。
如所讨论，本发明的“CTLA4结合剂”是本文描述的结合CTLA4的分子中的任一种(例如ISVD，诸如纳米抗体)以及结合CTLA4且包括本文描述的CTLA4结合部分中的任一种的任何抗体或其抗原结合片段。CTLA4结合剂可以包括结合PD1、LAG3、CD27、HSA、BTLA、TIM3、ICOS、B7-H3、B7-H4、CD137、GITR、PD-L1、PD-L2、ILT1、ILT2CEACAM1、CEACAM5、TIM3、TIGIT、VISTA、ILT3、ILT4、ILT5、ILT6、ILT7、ILT8、CD40、OX40、CD137、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3、NKG2A、NKG2C、NKG2E、IL-10、IL-17、TSLP的结合剂，例如包含LAG3结合部分和PD1结合部分；LAG3结合部分和BTLA结合部分；1或2个PD1结合部分、1或2个LAG3结合部分和HSA结合部分；或LAG3结合部分和BTLA结合部分。如果单个CTLA4结合剂是较大分子(例如多价分子，诸如F023700910、F023700918、F023700920或F023700925)的一部分，则其可称为CTLA4结合部分。
通常，基本抗体结构单元包含四聚体。每个四聚体包括两个相同的多肽链对，每对具有一个“轻”链(约25kDa)和一个“重”链(约50-70kDa)。每条链的氨基端部分包括主要负责抗原识别的约100-110个或更多个氨基酸的可变区。重链的羧基端部分可以限定主要负责效应子功能的恒定区。通常，将人轻链分类为κ和λ轻链。此外，通常将人重链分类为μ、δ、γ、α或ε，并将抗体的同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区由约12个或更多个氨基酸的“J”区域连接，其中重链还包括约10个更多氨基酸的“D”区域。通常参见Fundamental Immunology第7章(Paul，W.，编，第2版Raven Press，N.Y.(1989)。抗原结合片段的实例包括，但不限于，Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段以及单链Fv分子。
术语“免疫球蛋白单一可变结构域”(也称为“ISV”或“ISVD”)通常用于指可以在不与另一可变结构域相互作用的情况下(例如在没有如常规4-链单克隆抗体的VH和VL结构域之间所需要的VH/VL相互作用的情况下)，形成功能性抗原结合位点的免疫球蛋白可变结构域(其可以是重链或轻链结构域，包括VH、VHH或VL结构域)。ISVD的实例将是技术人员清楚的且例如包括纳米抗体(包括VHH、人源化VHH和/或骆驼化VH，诸如骆驼化人VH)、IgNAR、结构域、作为VH结构域或衍生自VH结构域的(单结构域)抗体(诸如dAbsTM)和作为VL结构域或衍生自VL结构域的(单结构域)抗体(诸如dAbsTM)。基于和/或衍生自重链可变结构域(诸如VH或VHH结构域)的ISVD通常是优选的。最优选地，ISVD将是纳米抗体。
术语“纳米抗体”通常如WO 2008/020079或WO 2009/138519中所定义，且因此在一个特定方面，通常表示VHH、人源化VHH或骆驼化VH(诸如骆驼化人VH)，或通常表示序列优化的VHH(诸如例如，针对化学稳定性和/或溶解性、与已知人骨架区的最大重叠和最大表达进行优化)。应注意术语纳米抗体(Nanobody或Nanobodies)是Ablynx N.V.的注册商标且因此也可称为
Figure BPA0000258853690000151
和/或
Figure BPA0000258853690000152
)。
多特异性结合剂是包含第一和第二CTLA4和PD1(或PD1和CTLA4)结合部分(例如ISVD或纳米抗体)和任选地，一个或多个(例如1、2、3、4、5个)结合除了CTLA4和PD1结合部分的表位以外的表位(例如CD27、LAG3和/或BTLA)的额外结合部分(例如ISVD或纳米抗体)的分子。例如F023700910、F023700918、F023700920和F023700925是包括HSA结合剂的多特异性PD1/CTLA4结合剂。
结合部分或结合结构域或结合单元是结合抗原的分子，诸如ISVD或纳米抗体。结合部分或结合结构域或结合单元可以是包括多于一个部分、结构域或单元和/或包含另一个功能元件(诸如例如半衰期延长剂(HLE)、靶向单元和/或小分子(诸如聚乙二醇(PEG))的较大分子(诸如多价或多特异性结合剂)的一部分。例如，102C12(E1D、L11V、A14P、A74S、K83R、I89L)是F023700910的PD1结合部分ISVD。
单价CTLA4或PD1结合剂(例如ISVD，诸如纳米抗体)是包含单一抗原结合结构域的分子。二价CTLA4/PD1结合剂(例如ISVD，诸如纳米抗体)包含两个结合CTLA4和PD1的抗原结合结构域(例如包括双特异性抗体的常规抗体)。多价结合剂包含多于一个抗原结合结构域。三价结合剂包含三个抗原结合结构域。
单特异性CTLA4或PD1结合剂(例如ISVD，诸如纳米抗体)结合单一抗原(CTLA4或PD1)；双特异性CTLA4/PD1结合剂结合两种不同抗原(PD1和CTLA4)且多特异性结合剂结合多于一种抗原。三特异性结合剂结合三种不同抗原(例如PD1和CTLA4和例如，CD27、LAG3或BTLA)。
双互补位结合剂(例如ISVD，诸如纳米抗体)是单特异性的，但结合同一抗原的两个不同表位。多互补位结合剂结合同一抗原，但结合抗原中的多于一个表位。
此外，如本文中已指示，纳米抗体的氨基酸残基根据用于VH的通用编号来编号，所述通用编号由Kabat等人(“Sequence of proteins of immunological interest”，USPublic Health Services，NIH Bethesda，MD，公开号91)给出，如在Riechmann和Muyldermans，J.Immunol.Methods2000 Jun 23；240(1-2)：185-195的文章中应用于来自骆驼的VHH结构域；或在本文中提及。
将VH结构域的氨基酸残基编号的替代方法(所述方法也可以类似方式应用于来自骆驼的VHH结构域和纳米抗体)是由Chothia等人(Nature 342，877-883(1989))描述的方法，所谓的“AbM定义”和所谓的“接触定义”。然而，在本说明书、方面和附图中，除非另外指示，否则将遵循如Riechmann和Muyldermans应用于VHH结构域的根据Kabat的编号。
如本文关于结合剂(诸如PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))所用的术语“半衰期”可以通常如WO 2008/020079的第57页的段落o)中所述来定义，并且如其中所提及的，是指氨基酸序列、化合物或多肽的血清浓度在体内减少50％所花费的时间，例如由于通过天然机制，序列或PD1/CTLA4结合剂的降解和/或序列或PD1/CTLA4结合剂的清除或隔离(sequestration)。本发明的PD1/CTLA4结合剂的体内半衰期可以本身已知的任何方式，诸如通过药代动力学分析测定。合适的技术将是本领域技术人员清楚的，且可例如通常如WO 2008/020079的第57页的段落o)中所述。如还在WO 2008/020079的第57页的段落o)中提及，半衰期可以使用诸如t1/2-α、t1/2-β和曲线下面积(AUC)的参数表示。在这方面，应注意如本文所用的术语“半衰期”尤其是指t1/2-β或终端半衰期(其中可不考虑t1/2-α和/或AUC或两者)。参考例如以下实验部分，以及标准手册，诸如Kenneth，A等人：Chemical Stability of Pharmaceuticals：A Handbook forPharmacists和Peters等人，Pharmacokinete analysis：A Practical Approach(1996)。还参考″Pharmacokinetics″，M Gibaldi&D Perron，由Marcel Dekker出版，第2修订版(1982)。类似地，术语“半衰期增加”或“增加的半衰期”也如WO 2008/020079的第57页的段落o)中所定义且尤其是指t1/2-β增加，伴随或不伴随t1/2-α和/或AUC或两者增加。
短语“控制序列”是指可操作连接的编码序列在特定宿主生物体中的表达所必需的多核苷酸。适合于原核生物的控制序列例如包括启动子、任选操纵子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞使用启动子、多腺苷酸化信号和增强子。
当核酸或多核苷酸与另一个多核苷酸发生功能关联时，所述核酸或多核苷酸是“可操作连接的”。例如，如果其表达为参与多肽分泌的前蛋白，则前序列或分泌前导序列的DNA与所述多肽的DNA可操作连接；如果其影响序列的转录，则启动子或增强子与编码序列可操作连接；或如果其被定位为促进翻译，则核糖体结合位点与编码序列可操作连接。通常，但不总是，“可操作连接的”意指，所连接的DNA序列是连续的，且在分泌前导序列的情况下，是连续的且在阅读相中。然而，增强子不必须是连续的。连接通过在方便的限制性位点处的连接来实现。如果此类位点不存在，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸适体或接头。
“分离的”PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))、多肽、多核苷酸和载体至少部分地不含有来自产生它们的细胞或细胞培养物的其它生物分子。此类生物分子包括核酸、蛋白、脂质、碳水化合物或其它材料诸如细胞碎片和生长培养基。“分离的”PD1/CTLA4结合剂还可以至少部分地不含有表达系统组分诸如来自宿主细胞的生物分子或其生长培养基的生物分子。通常，术语“分离的”不意图指此类生物分子的完全不存在，或水、缓冲剂或盐的不存在，或包括抗体或片段的药物制剂的组分。
还应注意，除非本文中另外明确指示，否则附图、任何序列表和实验部分/实施例仅为了进一步说明本发明而给出，且不应解释或理解为以任何方式限制本发明和/或所附权利要求的范围。
当术语在本文中未特别定义时，其具有其在本领域中的常用含义，其将是技术人员清楚的。参考例如标准手册，诸如Sambrook等人，″Molecular Cloning：A LaboratoryManual″(第2版)，第1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)；F.Ausubel等人，编，″Current protocols in molecular biology″，Green Publishing and WileyInterscience，New York(1987)；Lewin，“Genes II”，John Wiley&Sons，New York，N.Y.，(1985)；Old等人.，“Principles of Gene Manipulation：An Introduction to GeneticEngineering”，第2版，University of California Press，Berkeley，CA(1981)；Roitt等人.，“Immunology”(第6版)，Mosby/Elsevier，Edinburgh(2001)；Roitt等人.，Roitt’sEssential Immunology，第10版Blackwell Publishing，UK(2001)；和Janeway等人.，“Immunobiology”(第6版)，Garland Science Publishing/Churchill Livingstone，NewYork(2005)，以及本文中引用的通用背景技术。
以下特征与PD1结合剂102C12中的所示突变相关：
E1D：防止在构建体E1的第一氨基酸中形成焦谷氨酸
L11V：减少预抗体结合
A14P：人源化
W52aV：防止W52a的氧化
N73P：防止N73脱酰胺
N73Q：防止N73脱酰胺
N73S：防止N73脱酰胺
A74S：人源化
K83R：人源化
I89L：减少预抗体结合
W100aF：防止W100a的氧化，
或者与CTLA4结合剂11F1中的所示突变相关：
E1D：防止在构建体E1的第一氨基酸中形成焦谷氨酸
L11V：减少预抗体结合
A14P：人源化
Q45R：突变以增加稳定性
A74S：人源化
K83R：人源化
I89L：减少预抗体结合
M96P、Q或R：防止M96的氧化
Q108L：人源化。
本发明的范围包括多价PD1/CTLA4结合剂，其在图15中阐述或包含图16中阐述的部分的排列。本发明的范围还包括PD1/CTLA4结合剂，其包含图15中阐述的PD1结合剂中的任一种(或任何包含这种PD1结合剂的CDR1、CDR2和CDR3的PD1结合剂)或包含图16中阐述的PD1结合部分的排列的多价PD1结合剂中的任一种(或其任何PD1结合部分中的一种或多种)和/或图15中阐述的任何CTLA4结合剂(或任何包含这种LAG3结合剂的CDR1、CDR2和CDR3的CTLA4结合剂)或包含图16中阐述的CTLA4结合部分的排列的多价CTLA4结合剂中的任一种(或其任何CTLA4结合部分中的一种或多种)。在本发明的一个实施方案中，图15中阐述的结合剂不包括C端延长剂(例如A)、其中的FLAG和/或HIS标签(例如HHHHHH(SEQ ID NO：176的氨基酸148-153)；AAHHHHHH(SEQ ID NO：176的氨基酸146-153)；或AAADYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKGAAHHHHHH(SEQ ID NO：176的氨基酸120-153))。在本发明的一个实施方案中，任何这种结合剂或CDR可以是图15中所述序列的变体，例如包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个点突变(例如保守取代或缺失)。
在本发明的一个实施方案中，CTLA4是人CTLA4。在本发明的一个实施方案中，人CTLA4包含氨基酸序列：
Figure BPA0000258853690000191
在本发明的一个实施方案中，PD1是人PD1。在本发明的一个实施方案中，人PD1包含氨基酸序列：
Figure BPA0000258853690000192
PD1结合部分
本发明的PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))中存在的一个或多个(诸如一个或两个)PD1结合部分优选如本文所述(还应注意，当两个或更多个PD1结合部分存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂中时，它们可以相同或不同，并且当它们不同时，它们优选都含有在如本文所述的位置1、11、14、52a、73、74、83、89、100a、110和/或112处的突变的合适组合，且优选还具有与本文所述的相同的CDR。可以存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂中的PD1结合部分的一些优选、但非限制性实例的氨基酸序列列于图3A中。图3B给出这些PD1结合部分与SEQ ID NO：1和2的氨基酸序列的比对。
如所提及，存在于本文描述的本发明的PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))中的PD1结合部分可以结合(且特别是，可以特异性结合)PD1。具体而言，它们可以结合PD1且抑制PD1和PD-L1和/或PD-L2之间的结合。例如，在本发明的一个实施方案中，本发明的PD1/CTLA4结合剂结合PD1且使T细胞免于PD1途径介导的对T细胞介导的免疫应答的抑制(例如通过使T细胞免于PD1介导的对增殖和细胞因子产生的抑制)。
如本文进一步描述，在本发明的一个实施方案中，在本发明的PD1/CTLA4结合剂中的本发明的PD1结合剂优选具有与存在于102C12或参考A或包含102C12或参考A的序列(SEQID NO：1或2)的结合剂中相同的CDR的组合(即CDR1、CDR2和CDR3)。参见表A-1。
本发明还包括PDC1结合剂，其为102C12的变体，其包含下表A-2中所述的氨基酸序列。本发明的范围包括PD1结合剂，其包括下面表A-2中所述的所述变体的CDR1、CDR2和CDR3。
此外，本发明包括PD1/CTLA4结合剂，其包含PD1结合部分，其包括102C12或下面表A-2中所述的其变体之一的CDR1、CDR2和CDR3或氨基酸序列。
表A-1：PD1结合剂102C12。
Figure BPA0000258853690000211
表A-2：序列优化的变体102C12 PD1结合剂
Figure BPA0000258853690000212
Figure BPA0000258853690000221
Figure BPA0000258853690000231
本发明包括这样的实施方案，其中PD1结合剂的CDR中的一个、两个或三个在上文在表A-1或A-2(例如其中结合剂包含SEQ ID NO：1、2、135、136、137、138、139、140、141、142或16-47的氨基酸序列))或图3中所述，其中相对于表A-1或A-2中阐述的CDR序列，各CDR包含0、1、2、3、4或5个氨基酸取代，例如保守性取代，和/或包含100％、99％、98％、97％、96％或95％序列同一性，其中具有此类CDR的PD1结合剂保留结合PD1的能力。在本发明的一个实施方案中，本发明的PD1结合剂的第一个氨基酸是E。在本发明的一个实施方案中，本发明的PD1结合剂的第一个氨基酸是D。
表A-1中阐述的PD1 ISVD的某些残基的Kabat残基编号显示于以下序列中：
Figure BPA0000258853690000232
ISVD 102C12(E1D、L11V、A14P、A74S、K83R、I89L)的某些残基的Kabat残基编号显示于以下序列中：
Figure BPA0000258853690000241
WO 2008/071447描述了可以结合PD1的纳米抗体和其用途。WO 2008/071447的SEQID NO：348公开了PD1特异性纳米抗体，称作102C12，其序列在本文中作为SEQ ID NO：1给出。该序列和其CDR还在下表A中给出(还参见图2)。SEQ ID NO：2是基于SEQ ID NO：1、但具有人源化Q108L突变的参考序列。
突变可在本文中提及且由如上所示的其Kabat编号指定。
WO 2008/071447还描述了可以结合CTLA4的纳米抗体和其用途。WO 2008/071447的SEQ ID NO：1306公开了CTLA4特异性纳米抗体，称作11F01，其序列在本文中作为SEQ IDNO：9给出(还参见图2)。该序列及其CDR也在下表B中给出。
在本发明的一个实施方案中，PD1/CTLA4结合剂具有以下特性中的一种或多种：
·结合CTLA4(例如人和/或食蟹猴CTLA4)(例如CTLA4-Fc融合蛋白)，例如以约1nM(例如约1.2nM)的KD；
·结合细胞(例如CHO细胞)的表面上的CTLA4(例如人CTLA4)；
·结合细胞(例如CHO细胞)的表面上的PD1(例如人PD1)；
·阻断CD80和/或CD86与CTLA4，例如细胞表面表达的CTAL4(例如在CHO细胞表面上)的结合；
·不结合CD28(例如人)、CD8α(例如人)、LAG3(例如人)或BTLA(例如人)(例如在细胞诸如CHO细胞的表面上)；
·结合人、恒河猴和/或猴血清白蛋白(当结合剂包括血清白蛋白结合剂诸如ALB11002时)；
·抑制(例如，胰腺肿瘤，例如携带人免疫细胞的小鼠中的人胰腺肿瘤的)肿瘤生长。
本发明包括PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))，所述PD1/CTLA4结合剂包含一个或多个PD1结合部分，其为SEQ ID NO：1或2(102C12，WO 2008/071447：SEQ ID NO：348；参考A)的变体，所述变体包含SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列，但相对于SEQ ID NO：1或2的序列包含以下突变中的一种或多种：
-1D或1E；
-11V；
-14P；
-52aV；
-73Q、73P或73S；
-74S；
-83R；
-89T；
-89L；或
-100aF；
例如，其中PD1结合部分包含以下突变集合中的一种或多种：
-1D或1E与11V、14P、74S、83R和89L的组合；
-1D与11V、14P、52aV、73S或73Q或73P、74S、83R、89L和100aF的组合；
-1E与11V、14P、52aV、73S或73Q或73P、74S、83R、89L和100aF的组合；
-89L与11V、14P、52aV、73S或73Q或73P、74S、83R和100aF和任选1D的组合；
-89L与11V的组合；
-89L与110K或110Q的组合；
-89L与112K或112Q的组合；
-89L与11V、14P、74S、83R和任选1D的组合；
-110K或110Q与11V、14P、52aV、73S或73Q或73P、74S、83R、89L和100aF和1D或1E的组合；
-112K或112Q与11V、14P、52aV、73S或73Q或73P、74S、83R、89L和100aF和1D或1E的组合；
-1D或1E与11V、14P、74S、83R和89L的组合；和112K或112Q的组合；
-1D或1E与11V、14P、74S、83R和89L的组合；和110K或110Q的组合；
-89L与11V和110K或110Q的组合；
-89L与11V和112K或112Q的组合；
-11V与110K或110Q的组合；或
-11V与112K或112Q的组合。
具体而言，存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂(例如，包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))中的PD1结合部分包含SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列，其中：
-位置1处的氨基酸残基选自E和D；
-位置11处的氨基酸残基选自L和V；
-位置14处的氨基酸残基选自A和P；
-位置52a处的氨基酸残基选自W和V；
-位置73处的氨基酸残基选自P、S、N和Q；
-位置74处的氨基酸残基选自A和S；
-位置83处的氨基酸残基选自K和R；
-位置89处的氨基酸残基选自T、V、I和L；
-位置100a处的氨基酸残基选自W和F；
-位置110处的氨基酸残基选自T、K和Q；且
-位置112处的氨基酸残基选自S、K和Q；
使得，例如，以下中的一种或多种是真实的：
(i)位置1是D；
(ii)位置1是E；
(iii)位置11是V；
(iv)位置14是P；
(v)位置52a是V；
(vi)位置73是Q、P或S；
(vii)位置74是S；
(viii)位置83是R；
(ix)位置89是T；
(x)位置89是L；
(xi)位置100a是F；
例如，其中，相对于SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列，在PD1结合部分中包含以下突变集合中的一种或多种：
a.位置1是D或E，位置11是V，位置14是P，位置74是S，位置83是R；且位置89是L；
b.位置1是D或E，位置11是V，位置14是P，位置52a是V；位置73是Q、P或S；位置74是S，位置83是R；位置89是L；且位置100a是F；
c.位置89是L且位置11是V；
d.位置89是L且位置110是K或Q；
e.位置89是L且位置112是K或Q；
f.位置1是D或E，位置11是V，位置14是P，位置52a是V；位置73是Q，P或S；位置74是S，位置83是R；位置89是L；位置100a是F且位置110是K或Q；
g.位置1是D或E，位置11是V，位置14是P，位置52a是V；位置73是Q，P或S；位置74是S，位置83是R；位置89是L；位置100a是F且位置112是K或Q；
h.位置1是D或E，位置11是V，位置14是P，位置74是S，位置83是R；位置89是L且位置110是K或Q；
i.位置1是D或E，位置11是V，位置14是P，位置74是S，位置83是R；位置89是L；且位置112是K或Q；
j.位置89是L且位置11是V且位置110是K或Q；
k.位置89是L且位置11是V且位置112是K或Q；
l.位置11是V且位置110是K或Q；或
m.位置11是V且位置112是K或Q。
在具体实施方案中，本发明的PD1结合剂(例如ISVD，诸如纳米抗体)包含作为SEQID NO：1或SEQ ID NO：2的变体的氨基酸序列，其中位置89是T或L；或其中1是D或E，11是V，14是P，52a是V；73是S、Q或P；74是S，83是R且89是L和/或100a是F；或其中1是D或E，11是V，14是P，74是S，83是R且89是L；或其中位置11是V且位置89是L(任选地与110K或110Q突变和/或112K或112Q突变合适的组合，且特别是与110K或110Q突变组合)是尤其优选的。本发明包括这样的氨基酸序列，其中位置11是V且位置89是L，任选地具有110K或110Q突变。
存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂中的PD1结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)优选包含以下CDR(根据Kabat惯例)：
-CDR1(根据Kabat)，其为氨基酸序列IHAMG(SEQ ID NO：3)；和
-CDR2(根据Kabat)，其为氨基酸序列VITXSGGITYYADSVKG(SEQ ID NO：4；其中X是W或V)；和
-CDR3(根据Kabat)，其为氨基酸序列DKHQSSXYDY(SEQ ID NO：5；其中X是W或F)。
或者，当根据Abm惯例给出CDR时，存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂中的PD1结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)优选包含以下CDR：
-CDR1(根据Abm)，其为氨基酸序列GSIASIHAMG(SEQ ID NO：6)；和
-CDR2(根据Abm)，其为氨基酸序列VITWSGGITY(SEQ ID NO：7)；和
-CDR3(根据Abm)，其为氨基酸序列DKHQSSXYDY(SEQ ID NO：8，其与SEQ ID NO：5相同；其中X是W或F)。
以上优选CDR与102C12(SEQ ID NO：1)、参考A(SEQ ID NO：2)或包含SEQ ID NO：16-47或135-142的氨基酸序列的结合剂中存在的相同。具有此类结合剂的CDR1、CDR2和CDR3的结合剂是本发明的一部分。
本发明的一个实施方案中，存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂中的PD1结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)也具有：
-当通过BLAST算法进行比较时，与SEQ ID NO：1或2的参考氨基酸序列的至少85％、优选至少90％、更优选至少95％的序列同一性程度(其中对于测定序列同一性程度，不考虑CDR、任何可以存在的C端延伸以及涉及的特定方面所需的在位置1、11、14、52a、73、74、83、89、100a、110和/或112处的突变)，其中选择所述算法的参数以产生在各个参考序列的整个长度上在各个序列之间的最大匹配(例如，预期阈值：10；字长：3；在查询范围内的最大匹配：0；BLOSUM 62矩阵；间隙成本：存在11，延伸1；条件性组成评分矩阵调节)；和/或
-不超过7个，诸如不超过5个，优选不超过3个，诸如仅3、2或1个与SEQ ID NO：1或2的参考氨基酸序列的“氨基酸差异”(如本文所定义，且不考虑以上列出的可以存在的在位置1、11、14、52a、73、74、83、89、100a、110和/或112处的突变中的任一个，且不考虑任何可以存在的C端延伸)(其中所述氨基酸差异，如果存在，可以存在于骨架和/或CDR中，但优选仅存在于骨架中且不存在于CDR中)。
关于存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂中的PD1结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)的各个方面和优选方面，就相对于SEQ ID NO：1或2的序列同一性程度和/或可以存在于本发明的此类结合剂中(即与SEQ ID NO：1或2的序列相比)的“氨基酸差异”的数目和种类而论，应注意，当据称：
(i)PD1结合部分与SEQ ID NO：1或2的序列具有至少85％、优选至少90％、更优选至少95％的序列同一性程度(其中对于测定序列同一性程度，不考虑CDR、任何可以存在的C端延伸以及涉及的特定方面所需的在位置1、11、14、52a、73、74、83、89、100a、110和/或112处的突变)时；和/或当据称
(ii)PD1结合部分与SEQ ID NO：1或2的序列具有不超过7个，优选不超过5个，诸如仅3、2或1个“氨基酸差异”(再次，不考虑任何可以存在的C端延伸且不考虑涉及的特定方面所需的在位置1、11、14、52a、73、74、83、89、100a、110和/或112处的突变)时，
则这还包括，除了涉及的特定方面所需的在位置1、11、14、52a、73、74、83、89、100a、110和/或112处的突变和任何可以存在的C端延伸以外，与SEQ ID NO：1或2的序列不具有氨基酸差异的序列。
因此，在本发明的一个特定方面，存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂中的PD1结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)可以与SEQ ID NO：1或2具有100％序列同一性(包括CDR，但不考虑在本文公开的位置1、11、14、52a、73、74、83、89、100a、110和/或112处的突变或突变组合和/或任何可以存在的C端延伸)和/或可以不具有与SEQ ID NO：1或2的氨基酸差异(即除了在本文公开的位置1、11、14、52a、73、74、83、89、100a、110和/或112处的突变或突变组合和任何可以存在的C端延伸以外)。
当存在任何氨基酸差异(即除了任何C端延伸和涉及的本发明的特定方面所需的在位置1、11、14、52a、73、74、83、89、100a、110和/或112处的突变以外)时，这些氨基酸差异可以存在于CDR和/或骨架区中，但其优选仅存在于骨架区中(如由Abm惯例所定义，即不在如根据Abm惯例所定义的CDR中)，即，使得存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂中的PD1结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)具有与SEQ ID NO：1或2中存在的相同的CDR(根据Abm惯例定义)。
此外，当存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂中的PD1结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)与SEQ ID NO：1或2的序列具有一个或多个氨基酸差异(除了涉及的特定方面所需的在位置1、11、14、52a、73、74、83、89、100a、110和/或112处的突变以外)时，则可以存在的此类突变/氨基酸差异(即与SEQ ID NO：1或2的序列相比)的一些特定、但非限制性实例为例如P41A、P41L、P41S或P41T(且特别是P41A)和/或T87A。突变的其它实例是一种或多种合适的“人源化”取代(的合适组合)；参考例如WO 2009/138519(或在WO 2009/138519中引用的现有技术中)和WO 2008/020079(或在WO 2008/020079中引用的现有技术中)，以及来自WO2008/020079的表A-3至A-8(其为显示可能人源化取代的列表)。
此外，当PD1结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)存在于和/或形成本发明的PD1/CTLA4结合剂的N端部分时，则其优选在位置1处含有D(即与参考A或102C12相比的E1D突变)。此类N端PD1结合部分的优选但非限制性实例作为SEQ ID NO：31给出(尽管也可以使用其它具有E1D突变的PD1结合部分)。类似地，当SEQ ID NO：31的PD1结合部分不存在于N端末端、但存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂中的其它某处时，其优选含有D1E突变)。因此，在一个进一步方面，本发明涉及本发明的在其N端末端具有PD1结合部分(其如本文进一步描述)的PD1/CTLA4结合剂(其如本文进一步描述)，其中所述PD1结合部分在位置1处具有D，且优选为SEQ ID NO：31、135、140、141或142。
根据本文描述的方面，存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂中的PD1结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)优选使得其含有L11V突变、A14P突变、A74S突变、K83R突变和/或I89L突变和任选地E1D突变的合适的组合，且优选这些突变中的任何两者的合适的组合，诸如所有这些突变。当PD1结合部分存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂的N端末端时，优选地，还存在相对于SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列的E1D突变。借助于优选、但非限制性实例，SEQ IDNO：30、31、46、47、135、136、137、138、139、140、141或142是具有与SEQ ID NO：1或2的进一步氨基酸差异，即，A14P、A74S和K83R的PD1结合部分的实例(此外，如先前段落中所示，SEQ IDNO：31和47和135是还具有E1D突变的那些的实例)。
因此，在第一个方面，存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂中的PD1结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)具有：
-CDR1(根据Kabat)，其为氨基酸序列IHAMG(SEQ ID NO：3)；和
-CDR2(根据Kabat)，其为氨基酸序列VITXSGGITYYADSVKG(SEQ ID NO：4；其中X是W或V)；和
-CDR3(根据Kabat)，其为氨基酸序列DKHQSSXYDY(SEQ ID NO：5；其中X是W或F)；
且具有：
-当通过BLAST算法进行比较时，与SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列的至少85％、优选至少90％、更优选至少95％的序列同一性程度(其中对于测定序列同一性程度，不考虑CDR、任何可以存在的C端延伸以及涉及的特定方面所需的在位置1、11、14、52a、73、74、83、89、100a、110和/或112处的突变)，其中选择所述算法的参数以产生在各个参考序列的整个长度上在各个序列之间的最大匹配(例如，预期阈值：10；字长：3；在查询范围内的最大匹配：0；BLOSUM 62矩阵；间隙成本：存在11，延伸1；条件性组成评分矩阵调节)；
和/或具有：
-不超过7个；诸如不超过5个，优选不超过3个，诸如仅3、2或1个与SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列的“氨基酸差异”(如本文所定义，且不考虑以上列出的可以存在的在位置1、11、14、52a、73、74、83、89、100a、110和/或112处的突变中的任一个且不考虑任何可以存在的C端延伸)(其中所述氨基酸差异，如果存在，可以存在于骨架和/或CDR中，但优选仅存在于骨架中且不存在于CDR中)；
且当存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂的C端末端时优选具有：
-C端延伸(X)n，其中n是1至10，优选1至5，诸如1、2、3、4或5(且优选1或2，诸如1)；且各X是独立地选择的(优选天然存在的)氨基酸残基，且优选独立地选自丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)或异亮氨酸(I)；
且当存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))的N端末端时，优选在位置1处具有D(即与SEQ ID NO：1或2相比的E1D突变)，
其中：
-PD1结合部分的位置1处的氨基酸残基选自E或D；
-PD1结合部分的位置11处的氨基酸残基选自L或V；
-PD1结合部分的位置14处的氨基酸残基选自A或P；
-PD1结合部分的位置52a处的氨基酸残基选自W或V；
-PD1结合部分的位置73处的氨基酸残基选自N、P、S或Q；
-PD1结合部分的位置74处的氨基酸残基选自A或S；
-PD1结合部分的位置83处的氨基酸残基选自K或R；
-PD1结合部分的位置89处的氨基酸残基选自T、V、I或L；
-PD1结合部分的位置100a处的氨基酸残基选自W或F；
-PD1结合部分的位置110处的氨基酸残基选自T、K或Q；且
-PD1结合部分的位置112处的氨基酸残基选自S、K或Q；
使得例如PD1结合部分具有以下中的一种或多种：
(i)位置1是E或D；
(ii)位置11是V；
(iii)位置14是P；
(iv)位置52a是V；
(v)位置73是Q、P或S；
(vi)位置74是S；
(vii)位置83是R；
(viii)位置89是L或T；或
(ix)位置100a是F；
例如，其中在PD1结合部分中包含以下突变集合中的一种或多种：
a.位置89是L且位置11是V；
b.位置89是L且位置110是K或Q；
c.位置89是L且位置112是K或Q；
d.位置1是D或E，位置11是V，位置14是P，位置52a是V；位置73是S、Q或P；位置74是S，位置83是R，位置89是L且位置100a是F；
e.位置1是D，位置11是V，位置14是P，位置74是S，位置83是R且位置89是L；
f.位置1是E，位置11是V，位置14是P，位置74是S，位置83是R且位置89是L；
g.位置89是L且位置11是V且位置110是K或Q；
h.位置89是L且位置11是V且位置112是K或Q；
i.位置1是D，位置11是V，位置14是P，位置74是S，位置83是R，位置89是L且位置112是K或Q；
j.位置1是E，位置11是V，位置14是P，位置74是S，位置83是R，位置89是L且位置112是K或Q；
k.位置1是D，位置11是V，位置14是P，位置74是S，位置83是R，位置89是L，且位置110是K或Q；
l.位置1是D或E，位置11是V，位置14是P，位置52a是V，位置73是S，Q或P，位置74是S，位置83是R，位置89是L，位置100a是F且位置110是K或Q；
m.位置1是D或E，位置11是V，位置14是P，位置52a是V，位置73是S，Q或P，位置74是S，位置83是R，位置89是L，位置100a是F且位置112是K或Q；
n.位置1是E，位置11是V，位置14是P，位置74是S，位置83是R，位置89是L且位置112是K或Q；
o.位置11是V且位置110是K或Q；或
p.位置11是V且位置112是K或Q。
在一个进一步方面，存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂中的PD1结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)具有：
-CDR1(根据Kabat)，其为氨基酸序列IHAMG(SEQ ID NO：3)；和
-CDR2(根据Kabat)，其为氨基酸序列VITXSGGITYYADSVKG(SEQ ID NO：4；其中X是W或V)；和
-CDR3(根据Kabat)，其为氨基酸序列DKHQSSXYDY(SEQ ID NO：5；其中X是W或F)；
且具有：
-当通过BLAST算法进行比较时，与SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列的至少85％、优选至少90％、更优选至少95％的序列同一性程度(其中对于测定序列同一性程度，不考虑CDR、任何可以存在的C端延伸以及涉及的特定方面所需的在位置1、11、14、52a、73、74、83、89、100a、110和/或112处的突变)，其中选择所述算法的参数以产生在各个参考序列的整个长度上在各个序列之间的最大匹配(例如，预期阈值：10；字长：3；在查询范围内的最大匹配：0；BLOSUM 62矩阵；间隙成本：存在11，延伸1；条件性组成评分矩阵调节)；
和/或具有：
-不超过7个，诸如不超过5个，优选不超过3个，诸如仅3、2或1个与SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列的“氨基酸差异”(如本文所定义，且不考虑以上列出的可以存在的在位置1、11、14、52a、73、74、83、89、100a、110和/或112处的突变中的任一个且不考虑任何可以存在的C端延伸)(其中所述氨基酸差异，如果存在，可以存在于骨架和/或CDR中，但优选仅存在于骨架中且不存在于CDR中)；
且当存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))的C端末端时优选具有：
-C端延伸(X)n，其中n是1至10，优选1至5，诸如1、2、3、4或5(且优选1或2，诸如1)；且各X是独立地选择的(优选天然存在的)氨基酸残基，且优选独立地选自丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)或异亮氨酸(I)；
且当存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂的N端末端时，优选在位置1处具有D(即与SEQ ID NO：1或2相比的E1D突变)，
使得所述PD1结合部分在所提及的位置(根据Kabat编号)处包含以下氨基酸残基中的一个或多个(即与SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列相比的突变)：
-89T或89L；
-1D或1E；
-14P；
-52aV；
-73Q、73S或73P；
-74S；
-83R；
-89L；或
-100aF；
例如，其中，PD1结合部分包含以下突变集合中的一种或多种：
-89L与1D、11V、14P、74S和83R的组合；
-89L与1E、11V、14P、74S和83R的组合；
-89L与1D、11V、14P、52aV、73S或73Q或73P；74S、83R和/或100aF的组合；
-89L与1E、11V、14P、52aV、73S或73Q或73P；74S、83R和/或100aF的组合；
-89L与11V的组合；
-89L与110K或110Q的组合；
-89L与112K或112Q的组合；
-89L与11V和110K或110Q的组合；
-89L与11V和112K或112Q的组合；
-112K或112Q与1D、11V、14P、74S、83R和89L的组合；
-110K或110Q与1D、11V、14P、74S、83R和89L的组合；
-112K或112Q与1E、11V、14P、74S、83R和89L的组合；
-110K或110Q与1E、11V、14P、74S、83R和89L的组合；
-112K或112Q与1D、11V、14P、52aV、73S或73P或73Q、74S、83R、89L、100aF的组合；
-110K或110Q与1D、11V、14P、52aV、73S或73P或73Q、74S、83R、89L、100aF的组合；
-112K或112Q与1E、11V、14P、52aV、73S或73P或73Q、74S、83R、89L、100aF的组合；
-110K或110Q与1E、11V、14P、52aV、73S或73P或73Q、74S、83R、89L、100aF的组合；
-11V与110K或110Q的组合；或
-11V与112K或112Q的组合。
如所提及，当PD1结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂(在C端末端)时，PD1结合部分(且因此，所得本发明的PD1/CTLA4结合剂)优选具有如本文所述和/或如WO 2012/175741或PCT/EP2015/060643(WO2015/173325)中所述的C端延伸X(n)。
如所提及，在本发明中，优选这样的PD1结合部分：其中位置1是E或D，位置11是V，位置14是P，位置74是S，位置83是R，且位置89是L；或其中位置89是T或其中位置1是E或D，位置11是V，位置14是P，位置52a是V，位置73是S、Q或P，位置74是S，位置83是R，位置89是L和/或位置100a是F；或其中位置11是V且位置89是L(任选地与110K或110Q突变和/或112K或112Q突变合适的组合，且特别是与110K或110Q突变组合)。甚至更优选这样的PD1结合部分，其中位置11是V且位置89是L，任选地具有110K或110Q突变。
因此，在一个优选方面，存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂中的PD1结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)具有：
-CDR1(根据Kabat)，其为氨基酸序列IHAMG(SEQ ID NO：3)；和
-CDR2(根据Kabat)，其为氨基酸序列VITXSGGITYYADSVKG(SEQ ID NO：4；其中X是W或V)；和
-CDR3(根据Kabat)，其为氨基酸序列DKHQSSXYDY(SEQ ID NO：5；其中X是W或F)；
且具有：
-当通过BLAST算法进行比较时，与SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列的至少85％、优选至少90％、更优选至少95％的序列同一性程度(其中对于测定序列同一性程度，不考虑CDR、任何可以存在的C端延伸以及涉及的特定方面所需的在位置1、11、14、52a、73、74、83、89、100a、110和/或112处的突变)，其中选择所述算法的参数以产生在各个参考序列的整个长度上在各个序列之间的最大匹配(例如，预期阈值：10；字长：3；在查询范围内的最大匹配：0；BLOSUM 62矩阵；间隙成本：存在11，延伸1；条件性组成评分矩阵调节)；
和/或具有：
-不超过7个，诸如不超过5个，优选不超过3个，诸如仅3、2或1个与SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列的“氨基酸差异”(如本文所定义，且不考虑以上列出的可以存在的在位置1、11、14、52a、73、74、83、89、100a、110和/或112处的突变中的任一个且不考虑任何可以存在的C端延伸)(其中所述氨基酸差异，如果存在，可以存在于骨架和/或CDR中，但优选仅存在于骨架中且不存在于CDR中)；
且当存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂的C端末端时优选具有：
-C端延伸(X)n，其中n是1至10，优选1至5，诸如1、2、3、4或5(且优选1或2，诸如1)；且各X是独立地选择的(优选天然存在的)氨基酸残基，且优选独立地选自丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)或异亮氨酸(I)；
且当存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂的N端末端时，优选在位置1处具有D(即与SEQ ID NO：1或2相比的E1D突变)，
其中：
-PD1结合部分的位置1处的氨基酸残基选自E和D；
-PD1结合部分的位置11处的氨基酸残基选自L和V；
-PD1结合部分的位置14处的氨基酸残基选自A和P；
-PD1结合部分的位置52a处的氨基酸选自W和V；
-PD1结合部分的位置73处的氨基酸选自N、P、S和Q；
-PD1结合部分的位置74处的氨基酸残基选自A和S；
-PD1结合部分的位置83处的氨基酸残基选自K和R；
-PD1结合部分的位置89处的氨基酸残基选自T、L、I和V；
-位置100a处的氨基酸优选选自W和F；
-PD1结合部分的位置110处的氨基酸残基选自T、K和Q(且优选为T)；且
-PD1结合部分的位置112处的氨基酸残基选自S、K和Q(且优选为S)。
在另一个优选方面，存在于本发明的结合PD1和CTLA4的PD1/CTLA4结合剂中的PD1结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)具有：
-CDR1(根据Kabat)，其为氨基酸序列IHAMG(SEQ ID NO：3)；和
-CDR2(根据Kabat)，其为氨基酸序列VITXSGGITYYADSVKG(SEQ ID NO：4；其中X是W或V)；和
-CDR3(根据Kabat)，其为氨基酸序列DKHQSSXYDY(SEQ ID NO：5；其中X是W或F)；
且具有：
-当通过BLAST算法进行比较时，与SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列的至少85％、优选至少90％、更优选至少95％的序列同一性程度(其中对于测定序列同一性程度，不考虑CDR、任何可以存在的C端延伸以及涉及的特定方面所需的在位置1、11、14、52a、73、74、83、89、100a、110和/或112处的突变)，其中选择所述算法的参数以产生在各个参考序列的整个长度上在各个序列之间的最大匹配(例如，预期阈值：10；字长：3；在查询范围内的最大匹配：0；BLOSUM 62矩阵；间隙成本：存在11，延伸1；条件性组成评分矩阵调节)；
和/或具有：
-不超过7个，诸如不超过5个，优选不超过3个，诸如仅3、2或1个与SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列的“氨基酸差异”(如本文所定义，且不考虑以上列出的可以存在的在位置1、11、14、52a、73、74、83、89、100a、110和/或112处的突变中的任一个且不考虑任何可以存在的C端延伸)(其中所述氨基酸差异，如果存在，可以存在于骨架和/或CDR中，但优选仅存在于骨架中且不存在于CDR中)；
且当存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂的C端末端时优选具有：
-C端延伸(X)n，其中n是1至10，优选1至5，诸如1、2、3、4或5(且优选1或2，诸如1)；且各X是独立地选择的(优选天然存在的)氨基酸残基，且优选独立地选自丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)或异亮氨酸(I)；
且当存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂的N端末端时，优选在位置1处具有D(即与SEQ ID NO：1或2相比的E1D突变)，其中，以下中的一种或多种是真实的：
-PD1部分的位置1处的氨基酸残基是E或D；
-PD1部分的位置11处的氨基酸残基是V；
-PD1部分的位置14处的氨基酸残基是P；
-PD1部分的位置52a处的氨基酸残基是V；
-PD1部分的位置73处的氨基酸残基是S、Q或P；
-PD1部分的位置74处的氨基酸残基是S；
-PD1部分的位置83处的氨基酸残基是R；
-PD1部分的位置89处的氨基酸残基是L；
-PD1部分的位置100a处的氨基酸残基是F；
-PD1部分的位置110处的氨基酸残基优选选自T、K或Q；或
-PD1部分的位置112处的氨基酸残基优选选自S、K或Q。
在一个特定、但非限制性方面，存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂中的PD1部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)在所提及的位置(根据Kabat编号)处包含以下突变集合(即与SEQID NO：1或2的序列相比的突变)：
-11V与89L的组合；
-11V与89L、1E、14P、52aV、73S或73Q或73P、74S、83R和100aF的组合；
-11V与89L、1D、14P、52aV、73S或73Q或73P、74S、83R和100aF的组合；
-11V与89L、1D、14P、74S和83R的组合；
-11V与89L、1E、14P、74S和83R的组合；
-11V与110K或110Q的组合；
-11V与112K或112Q的组合；
-11V与89L、1D、14P、74S、83R和110K或110Q的组合；
-11V与89L、1D、14P、74S、83R和112K或112Q的组合；
-11V与89L、1E、14P、74S、83R和110K或110Q的组合；
-11V与89L、1E、14P、74S、83R和112K或112Q的组合；
-11V与89L、1E、14P、52aV、73S或73Q或73P、74S、83R、100aF和110K或110Q的组合；
-11V与89L、1E、14P、52aV、73S或73Q或73P、74S、83R、100aF和112K或112Q的组合；
-11V与89L、1D、14P、52aV、73S或73Q或73P、74S、83R、100aF和110K或110Q的组合；
-11V与89L、1D、14P、52aV、73S或73Q或73P、74S、83R、100aF和112K或112Q的组合；
-11V与89L和110K或110Q的组合；或
-11V与89L和112K或112Q的组合；
且具有CDR诸如SEQ ID NO：1、2、16-47或135-142中阐述的那些CDR(例如根据Kabat)且具有与如本文所述的SEQ ID NO：1、2、16-47或135-142的氨基酸序列的整体序列同一性程度。
在另一个特定、但非限制性方面，存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂中的PD1结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)在所提及的位置(根据Kabat编号)处包含以下突变集合(即与SEQ ID NO：1或2的序列相比的突变)：
-89L与11V的组合；
-89L与89L、1D、11V、14P、74S和83R的组合；
-89L与89L、1E、11V、14P、74S和83R的组合；
-89L与11V、14P、52aV、73S或73Q或73P、74S、83R、100aF和/或1D或1E的组合；
-89L与110K或110Q的组合；
-89L与112K或112Q的组合；
-89L与89L、1D、11V、14P、74S、83R；和110K或110Q的组合；
-89L与89L、1E、11V、14P、74S、83R；和112K或112Q的组合；
-89L与11V、14P、52aV、73S或73Q或73P、74S、83R、89L、100aF、110K或110Q和/或1D或1E的组合；
-89L与11V、14P、52aV、73S或73Q或73P、74S、83R、89L、100aF、112K或112Q和/或1D或1E的组合；
-89L与11V和110K或110Q的组合；或
-89L与11V和112K或112Q的组合；
且具有CDR诸如SEQ ID NO：1、2、16-47或135-142中阐述的那些(例如根据Kabat)且具有与如本文所述的SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列的整体序列同一性程度。
在另一个特定、但非限制性方面，存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂中的PD1结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)在所提及的位置(根据Kabat编号)处包含以下突变集合(即与SEQ ID NO：1或2的序列相比的突变)：
-110K或110Q与1E的组合；
-110K或110Q与1D的组合；
-110K或110Q与11V的组合；
-110K或110Q与14P的组合；
-110K或110Q与52aV的组合；
-110K或110Q与73S或73Q或73P的组合；
-110K或110Q与74S的组合；
-110K或110Q与83R的组合；
-110K或110Q与89L的组合；
-110K或110Q与100aF的组合；或
-110K或110Q与11V和89L的组合；
且具有CDR诸如SEQ ID NO：1、2、116-47或135-142中阐述的那些(例如根据Kabat)且具有与如本文所述的SEQ ID NO：1、2、16-47或135-142的氨基酸序列的整体序列同一性程度。
在另一个特定、但非限制性方面，存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂中的PD1结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)在所提及的位置(根据Kabat编号)处包含以下突变集合(即与SEQ ID NO：1或2的序列相比的突变)：
-112K或112Q与1D的组合；
-112K或112Q与1E的组合；
-112K或112Q与11V的组合；
-112K或112Q与14P的组合；
-112K或112Q与52aV的组合；
-112K或112Q与73S或73Q或73P的组合；
-112K或112Q与74S的组合；
-112K或112Q与83R的组合；
-112K或112Q与89L的组合；
-112K或112Q与100aF的组合；或
-112K或112Q与11V和89L的组合；
且具有CDR诸如SEQ ID NO：1、2、16-47或135-142中阐述的那些(例如根据Kabat)且具有与如本文所述的SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列的整体序列同一性程度。
在另一个方面，存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂中的PD1结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)在位置89处包含T且具有CDR诸如SEQ ID NO：1、2、16-47或135-142中阐述的那些(例如根据Kabat)且具有与如本文所述的SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列的整体序列同一性程度。
在另一个方面，存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂中的PD1结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)包含位置11处的V和位置89处的L且具有CDR诸如SEQ ID NO：1、2、16-47或135-142中阐述的那些(例如根据Kabat)且具有与如本文所述的SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列的整体序列同一性程度。
如所提及，根据本文描述的方面的存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂中的PD1结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)优选使得其含有L11V突变、A14P突变、A74S突变、K83R突变和/或I89L突变和任选地E1D突变的合适的组合，且优选这些突变中的任何两者的合适的组合，诸如所有这些突变(并且再次，当PD1结合部分存在于本发明的多肽的N端末端时，优选地，还存在E1D突变)(相对于SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列)。
在另一个方面，存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂(例如，包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如，纳米抗体))中的PD1结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)具有：
-CDR1(根据Abm)，其为氨基酸序列GSIASIHAMG(SEQ ID NO：6)；和
-CDR2(根据Abm)，其为氨基酸序列VITXSGGITY(SEQ ID NO：7；其中X是W或V)；和
-CDR3(根据Abm)，其为氨基酸序列DKHQSSXYDY(SEQ ID NO：5；其中X是W或F)；
且具有：
-当通过BLAST算法进行比较时，与SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列的至少85％、优选至少90％、更优选至少95％的序列同一性程度(其中对于测定序列同一性程度，不考虑CDR、任何可以存在的C端延伸以及涉及的特定方面所需的在位置1、11、14、52a、73、74、83、89、100a、110和/或112处的突变)，其中选择所述算法的参数以产生在各个参考序列的整个长度上在各个序列之间的最大匹配(例如，预期阈值：10；字长：3；在查询范围内的最大匹配：0；BLOSUM 62矩阵；间隙成本：存在11，延伸1；条件性组成评分矩阵调节)；
和/或具有：
-不超过7个，诸如不超过5个，优选不超过3个，诸如仅3、2或1个与SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列的“氨基酸差异”(如本文所定义，且不考虑以上列出的可以存在的在位置1、11、14、52a、73、74、83、89、100a、110和/或112处的突变中的任一个且不考虑任何可以存在的C端延伸)(其中所述氨基酸差异，如果存在，可以存在于骨架和/或CDR中，但优选仅存在于骨架中且不存在于CDR中)；
且当存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂的C端末端时优选具有：
-C端延伸(X)n，其中n是1至10，优选1至5，诸如1、2、3、4或5(且优选1或2，诸如1)；且各X是独立地选择的(优选天然存在的)氨基酸残基，且优选独立地选自丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)或异亮氨酸(I)；
且当存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂的N端末端时，优选在位置1处具有D(即与SEQ ID NO：1或2相比的E1D突变)，
其中：
-PD1结合部分的位置1处的氨基酸残基选自E或D；
-PD1结合部分的位置11处的氨基酸残基选自L或V；
-PD1结合部分的位置14处的氨基酸残基选自A或P；
-PD1结合部分的位置52a处的氨基酸残基选自W和V；
-PD1结合部分的位置73处的氨基酸残基选自P、S、N和Q；
-PD1结合部分的位置74处的氨基酸残基选自A或S；
-PD1结合部分的位置83处的氨基酸残基选自K或R；
-PD1结合部分的位置89处的氨基酸残基选自T、V、I或L；
-PD1结合部分的位置100a处的氨基酸残基选自W和F；
-PD1结合部分的位置110处的氨基酸残基选自T、K或Q；且
-PD1结合部分的位置112处的氨基酸残基选自S、K或Q；
使得，例如在PD1结合部分中包含以下突变或突变集合中的一种或多种：
(i)位置89是T或L；
(ii)位置89是L且位置11是V；
(iii)位置1是D，位置11是V，位置14是P，位置74是S，位置83是R且位置89是L；
(iv)位置1是E，位置11是V，位置14是P，位置74是S，位置83是R且位置89是L；
(v)位置1是D或E，位置11是V，位置14是P，位置52a是V，位置73是S，Q或P，位置74是S，位置83是R，位置89是L且位置100a是F；
(vi)位置89是L且位置110是K或Q；
(vii)位置89是L且位置112是K或Q；
(viii)位置89是L且位置11是V且位置110是K或Q；
(ix)位置89是L且位置11是V且位置112是K或Q；
(x)位置1是D，位置11是V，位置14是P，位置74是S，位置83是R，位置89是L；且位置110是K或Q；
(xi)位置1是E，位置11是V，位置14是P，位置74是S，位置83是R，位置89是L；且位置110是K或Q；
(xii)位置1是D，位置11是V，位置14是P，位置74是S，位置83是R，位置89是L；且位置112是K或Q；
(xiii)位置1是E，位置11是V，位置14是P，位置74是S，位置83是R，位置89是L；且位置112是K或Q；
(xiv)位置1是D或E，位置11是V，位置14是P，位置52a是V，位置73是S，P或Q，位置74是S，位置83是R，位置89是L；位置100a是F且位置110是K或Q；
(xv)位置1是D或E，位置11是V，位置14是P，位置52a是V，位置73是S，P或Q，位置74是S，位置83是R，位置89是L；位置100a是F且位置112是K或Q；
(xvi)位置11是V且位置110是K或Q；或
(xvii)位置11是V且位置112是K或Q。
在一个进一步方面，存在于本发明的结合部分中的PD1结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)具有：
-CDR1(根据Abm)，其为氨基酸序列GSIASIHAMG(SEQ ID NO：6)；和
-CDR2(根据Abm)，其为氨基酸序列VITXSGGITY(SEQ ID NO：7；其中X是W或V)；和
-CDR3(根据Abm)，其为氨基酸序列DKHQSSXYDY(SEQ ID NO：5；其中X是W或F)；
且具有：
-当通过BLAST算法进行比较时，与SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列的至少85％、优选至少90％、更优选至少95％的序列同一性程度(其中对于测定序列同一性程度，不考虑CDR、任何可以存在的C端延伸以及涉及的特定方面所需的在位置1、11、14、52a、73、74、83、89、100a、110和/或112处的突变)，其中选择所述算法的参数以产生在各个参考序列的整个长度上在各个序列之间的最大匹配(例如，预期阈值：10；字长：3；在查询范围内的最大匹配：0；BLOSUM 62矩阵；间隙成本：存在11，延伸1；条件性组成评分矩阵调节)；
和/或具有：
-不超过7个，诸如不超过5个，优选不超过3个，诸如仅3、2或1个与SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列的“氨基酸差异”(如本文所定义，且不考虑以上列出的可以存在的在位置1、11、14、52a、73、74、83、89、100a、110和/或112处的突变中的任一个且不考虑任何可以存在的C端延伸)(其中所述氨基酸差异，如果存在，可以存在于骨架和/或CDR中，但优选仅存在于骨架中且不存在于CDR中)；
且当存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂的C端末端时优选具有：
-C端延伸(X)n，其中n是1至10，优选1至5，诸如1、2、3、4或5(且优选1或2，诸如1)；且各X是独立地选择的(优选天然存在的)氨基酸残基，且优选独立地选自丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)或异亮氨酸(I)；
且当存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂的N端末端时，优选在位置1处具有D(即与SEQ ID NO：1或2相比的E1D突变)，
使得所述PD1结合部分在所提及的位置(根据Kabat编号)处包含以下突变集合(即与SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列相比的突变)：
-89T或89L；
-89L与11V的组合；
-89L与1D、11V、14P、74S和83R的组合；
-89L与1E、11V、14P、74S和83R的组合；
-89L与1D、11V、14P、52aV、73S或73P或73Q、74S、83R和100aF的组合；
-89L与1E、11V、14P、52aV、73S或73Q或73P、74S、83R和100aF的组合；
-89L与110K或110Q的组合；
-89L与112K或112Q的组合；
-89L与11V和110K或110Q的组合；
-89L与11V和112K或112Q的组合；
-89L与1D、11V、14P、74S、83R和110K或110Q的组合；
-89L与1E、11V、14P、74S、83R和110K或110Q的组合；
-89L与1D、11V、14P、74S、83R和112K或112Q的组合；
-89L与1E、11V、14P、74S、83R和112K或112Q的组合；
-89L与1E、11V、14P、52aV、73S或73P或73Q、74S、83R、100aF和110K或110Q的组合；
-89L与1D、11V、14P、52aV、73S或73P或73Q、74S、83R、100aF和112K或112Q的组合；
-11V与110K或110Q的组合；或
-11V与112K或112Q的组合。
如所提及，当存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂中的PD1结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)以单价形式使用和/或存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂(如本文所定义)的C端末端时，PD1结合部分(且因此所得本发明的PD1/CTLA4结合剂)优选具有C端延伸X(n)，所述C端延伸可以如本文中关于本发明的PD1/CTLA4结合剂所述和/或如WO 2012/175741或PCT/EP2015/060643(WO2015/173325)中所述。
如所提及，在本发明中，优选这样的PD1结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)：其中位置1是E或D，位置11是V，位置14是P，位置74是S，位置83是R且位置89是L，或其中位置89是T，或其中位置1是E或D，位置11是V，位置14是P，位置52a是V，位置73是S、P或Q，位置74是S，位置83是R，位置89是L和/或位置100a是F，或其中位置11是V且位置89是L(任选地与110K或110Q突变和/或112K或112Q突变合适的组合，且特别是与110K或110Q突变组合)。还优选这样的PD1结合部分，其中位置11是V且位置89是L，任选地具有110K或110Q突变(相对于SEQID NO：1或2的氨基酸序列)。
因此，在一个优选方面，存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂中的PD1结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)具有：
-CDR1(根据Abm)，其为氨基酸序列GSIASIHAMG(SEQ ID NO：6)；和
-CDR2(根据Abm)，其为氨基酸序列VITXSGGITY(SEQ ID NO：7；其中X是W或V)；和
-CDR3(根据Abm)，其为氨基酸序列DKHQSSXYDY(SEQ ID NO：5；其中X是W或F)；
且具有：
-当通过BLAST算法进行比较时，与SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列的至少85％、优选至少90％、更优选至少95％的序列同一性程度(其中对于测定序列同一性程度，不考虑CDR、任何可以存在的C端延伸以及涉及的特定方面所需的在位置1、11、14、52a、73、74、83、89、100a、110和/或112处的突变)，其中选择所述算法的参数以产生在各个参考序列的整个长度上在各个序列之间的最大匹配(例如，预期阈值：10；字长：3；在查询范围内的最大匹配：0；BLOSUM 62矩阵；间隙成本：存在11，延伸1；条件性组成评分矩阵调节)；
和/或具有：
-不超过7个，诸如不超过5个，优选不超过3个，诸如仅3、2或1个与SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列的“氨基酸差异”(如本文所定义，且不考虑以上列出的可以存在的在位置1、11、14、52a、73、74、83、89、100a、110和/或112处的突变中的任一个且不考虑任何可以存在的C端延伸)(其中所述氨基酸差异，如果存在，可以存在于骨架和/或CDR中，但优选仅存在于骨架中且不存在于CDR中)；
且当存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂的C端末端时优选具有：
-C端延伸(X)n，其中n是1至10，优选1至5，诸如1、2、3、4或5(且优选1或2，诸如1)；且各X是独立地选择的(优选天然存在的)氨基酸残基，且优选独立地选自丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)或异亮氨酸(I)；
且当存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂的N端末端时，优选在位置1处具有D(即与SEQ ID NO：1或2相比的E1D突变)，
其中
-PD1结合部分的位置1处的氨基酸残基选自E或D；
-PD1结合部分的位置11处的氨基酸残基选自L或V；
-PD1结合部分的位置14处的氨基酸残基选自A或P；
-PD1结合部分的位置52a处的氨基酸残基选自W和V；
-PD1结合部分的位置73处的氨基酸残基选自P、N、S和Q；
-PD1结合部分的位置74处的氨基酸残基选自A或S；
-PD1结合部分的位置83处的氨基酸残基选自K或R；
-PD1结合部分的位置89处的氨基酸残基是T、V、I或L；
-PD1结合部分的位置100a处的氨基酸残基选自W和F；
-PD1结合部分的位置110处的氨基酸残基选自T、K或Q(且优选为T)；且
-PD1结合部分的位置112处的氨基酸残基选自S、K或Q(且优选为S)。
在另一个优选方面，存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂中的PD1结合部分具有：
-CDR1(根据Abm)，其为氨基酸序列GSIASIHAMG(SEQ ID NO：6)；和
-CDR2(根据Abm)，其为氨基酸序列VITXSGGITY(SEQ ID NO：7；其中X是W或V)；和
-CDR3(根据Abm)，其为氨基酸序列DKHQSSXYDY(SEQ ID NO：5；其中X是W或F)；
且具有：
-当通过BLAST算法进行比较时，与SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列的至少85％、优选至少90％、更优选至少95％的序列同一性程度(其中对于测定序列同一性程度，不考虑CDR、任何可以存在的C端延伸以及涉及的特定方面所需的在位置1、11、14、52a、73、74、83、89、100a、110和/或112处的突变)，其中选择所述算法的参数以产生在各个参考序列的整个长度上在各个序列之间的最大匹配(例如，预期阈值：10；字长：3；在查询范围内的最大匹配：0；BLOSUM 62矩阵；间隙成本：存在11，延伸1；条件性组成评分矩阵调节)；
和/或具有：
-不超过7个，诸如不超过5个，优选不超过3个，诸如仅3、2或1个与SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列的“氨基酸差异”(如本文所定义，且不考虑以上列出的可以存在的在位置1、11、14、52a、73、74、83、89、100a、110和/或112处的突变中的任一个且不考虑任何可以存在的C端延伸)(其中所述氨基酸差异，如果存在，可以存在于骨架和/或CDR中，但优选仅存在于骨架中且不存在于CDR中)；
且当存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂的C端末端时优选具有：
-C端延伸(X)n，其中n是1至10，优选1至5，诸如1、2、3、4或5(且优选1或2，诸如1)；且各X是独立地选择的(优选天然存在的)氨基酸残基，且优选独立地选自丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)或异亮氨酸(I)；
且当存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂的N端末端时，优选在位置1处具有D(即与SEQ ID NO：1或2相比的E1D突变)，
其中，以下中的一种或多种是真实的：
-PD1结合部分的位置1处的氨基酸残基是D或E；
-PD1结合部分的位置11处的氨基酸残基是V；
-PD1结合部分的位置14处的氨基酸残基是P；
-PD1结合部分的位置52a处的氨基酸残基是V；
-PD1结合部分的位置73处的氨基酸残基是S、P或Q；
-PD1结合部分的位置74处的氨基酸残基是S；
-PD1结合部分的位置83处的氨基酸残基是R；
-PD1结合部分的位置89处的氨基酸残基是L；
-PD1结合部分的位置100a处的氨基酸残基是F；
-PD1结合部分的位置110处的氨基酸残基选自T、K和Q；或
-PD1结合部分的位置112处的氨基酸残基选自S、K和Q。
在一个特定、但非限制性方面，存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))中的PD1结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)在所提及的位置(根据Kabat编号)处包含以下突变集合(即与SEQ ID NO：1或2的序列相比的突变)：
-11V与89L的组合；
-11V与1D、14P、74S、83R和89L的组合；
-11V与1E、14P、74S、83R和89L的组合；
-11V与14P、52aV、73S或73Q或73P、74S、83R、89L、100aF和1E或1D的组合；
-11V与110K或110Q的组合；
-11V与112K或112Q的组合；
-11V与14P、52aV、73S或73Q或73P、74S、83R、89L、100aF、110K或110Q和1E或1D的组合；
-11V与14P、52aV、73S或73Q或73P、74S、83R、89L、100aF、112K或112Q和1E或1D的组合；
-11V与89L和110K或110Q的组合；
-11V与89L和112K或112Q的组合；
-110K或110Q与1D、11V，14P、74S、83R和89L的组合；
-110K或110Q与1E、11V、14P、74S、83R和89L的组合；
-112K或112Q与1D、11V，14P、74S、83R和89L的组合；或
-112K或112Q与1E、11V、14P、74S、83R和89L，
且具有CDR诸如SEQ ID NO：1、2、16-47或135-142中阐述的那些(例如根据Abm)且具有与如本文所述的SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列的整体序列同一性程度。
在另一个特定、但非限制性方面，存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂中的PD1结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)在所提及的位置(根据Kabat编号)处包含以下突变集合(即与SEQ ID NO：1或2的序列相比的突变)：
-89L与11V的组合；
-89L与1E、11V、14P、74S和83R的组合；
-89L与1D、11V、14P、74S和83R的组合；
-89L与11V、14P、52aV、73S或73Q或73P、74S、83R、100aF和1E或1D的组合；
-89L与110K或110Q的组合；
-89L与112K或112Q的组合；
-89L与1E、11V、14P、74S、83R和110K或110Q的组合；
-89L与1D、11V、14P、74S、83R和110K或110Q的组合；
-89L与1E、11V、14P、74S、83R和112K或112Q的组合；
-89L与1D、11V、14P、74S、83R和112K或112Q的组合；
-89L与11V、14P、52aV、73S或73Q或73P、74S、83R、100aF、110K或110Q和1E或1D的组合；
-89L与11V、14P、52aV、73S或73Q或73P、74S、83R、100aF、112K或112Q和1E或1D的组合；
-89L与11V和110K或110Q的组合；或
-89L与11V和112K或112Q的组合；
且具有CDR诸如SEQ ID NO：1、2、16-47或135-142中阐述的那些(例如根据Abm)且具有与如本文所述的SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列的整体序列同一性程度。
在另一个特定、但非限制性方面，存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂中的PD1结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)在所提及的位置(根据Kabat编号)处包含以下突变集合(即与SEQ ID NO：2的序列相比的突变)：
-110K或110Q与11V的组合；
-110K或110Q与1E、11V、14P、74S、83R和89L的组合；
-110K或110Q与1D、11V、14P、74S、83R和89L的组合；
-110K或110Q与11V、14P、52aV、73S或73Q或73P、74S、83R、89L和100aF和1E或1D.
-110K或110Q与89L的组合；或
-110K或110Q与11V和89L的组合；
且具有CDR诸如SEQ ID NO：1、2、16-47或135-142中阐述的那些(例如根据Abm)且具有与如本文所述的SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列的整体序列同一性程度。
在另一个特定、但非限制性方面，存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))中的PD1结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)在所提及的位置(根据Kabat编号)处包含以下突变集合(即与SEQ ID NO：1或2的序列相比的突变)：
-112K或112Q与11V的组合；
-112K或112Q与1E、11V、14P、74S、83R和89L的组合；
-112K或112Q与1D、11V、14P、74S、83R和89L的组合；
-112K或112Q与11V、14P、52aV、73S或73Q或73P、74S、83R、89L和100aF和1E或1D的组合；
-112K或112Q与89L的组合；或
-112K或112Q与11V和89L的组合；
且具有CDR诸如SEQ ID NO：1、2、16-47或135-142中阐述的那些(例如根据Abm)且具有与如本文所述的SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列的整体序列同一性程度。
在另一个方面，存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))中的PD1结合剂在位置89处包含T或L且具有CDR诸如SEQ ID NO：1、2、16-47或135-142中阐述的那些(例如根据Abm)且具有与如本文所述的SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列的整体序列同一性程度。
在另一个方面，存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂中的PD1结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)包含位置11处的V和位置89处的L且具有CDR诸如SEQ ID NO：1、2、16-47或135-142中阐述的那些(例如根据Abm)且具有与如本文所述的SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列的整体序列同一性程度。
如所提及，根据本文描述的方面，存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂中的PD1结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)优选使得其含有任选的E1D突变、L11V突变、A14P突变、A74S突变、K83R突变和/或I89L突变的合适的组合；且优选这些突变中的任何两者的合适的组合，诸如这些突变中的所有五个或六个(当PD1结合部分存在于本发明的多肽的N端末端时，优选地，还存在E1D突变)(相对于SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列)。
可以存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂中的PD1结合部分的一些优选、但非限制性实例以SEQ ID NO：16-47或135-142给出，且本发明的合适地包含这些序列中的一个或多个的PD1/CTLA4结合剂形成本发明的进一步方面。
可以存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂中的一些优选PD1结合部分是SEQ ID NO：30、31、16-47或135-142的序列。在这些中，SEQ ID NO：31尤其适合于存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂的N端末端，且SEQ ID NO：46尤其适合于存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂的C端末端。
当PD1结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)存在于和/或形成本发明的PD1/CTLA4结合剂的C端末端时，其优选具有式(X)n的C端延伸，其中n是1至10，优选1至5，诸如1、2、3、4或5(且优选1或2，诸如1)；且各X是(优选天然存在的)氨基酸残基，其独立地选自天然存在的氨基酸残基(尽管根据一个优选方面，其不包含任何半胱氨酸残基)，且优选独立地选自丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)或异亮氨酸(I)。
根据此类C端延伸X(n)的一些优选、但非限制性实例，X和n可以如本文中关于本发明的PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))进一步描述。
在本发明的一个实施方案中，当存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))中的PD1结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)在位置110或112处含有突变(相对于SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列)(任选地与如本文所述的位置1、11、14、74、83和/或89处的突变组合)时，骨架4的5个C端氨基酸残基(从位置109开始)可以如下取代：
(i)如果不存在C端延伸：VTVKS(SEQ ID NO：88)、VTVQS(SEQ ID NO：89)、VKVSS(SEQ ID NO：90)或VQVSS(SEQ ID NO：91)；或
(ii)如果存在C端延伸：VTVKSX(n)(SEQ ID NO：92)、VTVQSX(n)(SEQ ID NO：93)、VKVSSX(n)(SEQ ID NO：94)或VQVSSX(n)(SEQ ID NO：95)，诸如VTVKSA(SEQ ID NO：96)、VTVQSA(SEQ ID NO：97)、VKVSSA(SEQ ID NO：98)或VQVSSA(SEQ ID NO：99)。
在本发明的一个实施方案中，当存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))中的PD1结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)在位置110或112处不含突变(但仅在如本文所述的位置1(任选地)、11、14、74、83和/或89处含有突变)(相对于SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列)时，骨架4的C端5个氨基酸残基(从位置109开始)将通常如下取代：
(i)当不存在C端延伸时：VTVSS(SEQ ID NO：100)(如在SEQ ID NO：2的序列中)；或
(ii)当存在C端延伸时：VTVSSX(n)(SEQ ID NO：101)，诸如VTVSSA(SEQ ID NO：102)。在这些C端序列中，X和n如本文关于C端延伸所定义。
CTLA4结合部分
存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))中的一个或多个(诸如一个或两个)CTLA4结合部分优选如下(还应注意，当两个或更多个CTLA4结合部分存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂中时，它们可以相同或不同，并且当它们不同时，它们优选都含有在如本文所述的位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110和/或112处的突变(的合适组合)，且优选还具有与本文所述的相同的CDR)(相对于SEQ ID NO：9的氨基酸序列)。可以存在于本发明的多肽(例如，PD1/CTLA4结合剂)中的CTLA4结合剂的一些优选、但非限制性实例的氨基酸序列列于图4A中。图4B给出这些CTLA4结合部分与SEQ IDNO：9的序列的比对。
如本文进一步描述，在本发明的一个实施方案中，在本发明的PD1/CTLA4结合剂中的本发明的CTLA4结合剂优选具有与存在于11F1或包含11F1的序列(SEQ ID NO：9)的结合剂中相同的CDR的组合(即CDR1、CDR2和CDR3)。参见表B-1。
本发明还包括CTLA4结合剂，其为11F1的变体，其包含下表B-2中所述的氨基酸序列。本发明的范围包括CTLA4结合剂，其包括下面表B-2中所述的所述变体的CDR1、CDR2和CDR3。
此外，本发明包括PD1/CTLA4结合剂，其包含CTLA4结合部分，其包括11F1或下面表B-2中所述的其变体之一的CDR1、CDR2和CDR3或氨基酸序列。
表B-1.CTLA4结合剂11F1(11F01)
Figure BPA0000258853690000541
表B-2.CTLA4结合剂11F1变体
Figure BPA0000258853690000551
*CDR加下划线和/或粗体。
本发明包括这样的实施方案，其中CTLA4结合剂的CDR中的一个、两个或三个在上文表B-1或B-2中阐述(例如11F01或11F01(E1D、L11V、A14P、Q45R、A74S、K83R、V89L、M96P、Q108L)的那些)，其中相对于表B-1或B-2中阐述的CDR序列，各CDR包含0、1、2、3、4或5个氨基酸取代，例如保守性取代，和/或包含100％、99％、98％、97％、96％或95％序列同一性，其中具有此类CDR的CTLA4结合剂保留结合CTLA4的能力。在本发明的一个实施方案中，本发明的CTLA4结合剂的第一个氨基酸是E。在本发明的一个实施方案中，本发明的PD1结合剂的第一个氨基酸是D。
SEQ ID NO：104的残基1可以是D或E。如果残基1是D，则CTLA4结合剂可称为1D且如果残基1是E，则CTLA4结合剂可称为1E。
本文所述的基于纳米抗体11F01的CTLA4结合剂(例如ISVD，诸如纳米抗体)的某些残基的Kabat残基编号显示于以下序列中：
Figure BPA0000258853690000561
本文所述的CTLA4结合剂11F01(E1D、L11V、A14P、Q45R、A74S、K83R、V89L、M96P、Q108L)的某些残基的Kabat残基编号显示于以下序列中：
Figure BPA0000258853690000562
突变可在本文中提及且由如上所示的其Kabat编号指定。
在本发明的一个实施方案中，CTLA4结合剂11F01在位置73处包含突变，例如N73X，其中X是S、V、G、R、Q、M、H、T、D、E、W、F、K、A、Y或P(或除了N以外的任何氨基酸)。
如所提及，存在于本文描述的本发明的PD1/CTLA4结合剂中的CTLA4结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)可以结合(且特别是，可以特异性结合)CTLA4。具体而言，它们可以结合CTLA4且由此防止例如抗原呈递细胞上的CD80和/或CD86结合例如T细胞上的CTLA4。在本发明的一个实施方案中，所得的CTLA4信号传导的阻断延长T细胞活化，恢复T细胞增殖，且因此扩增T细胞介导的免疫性，其理论上增强患者建立抗肿瘤免疫应答的能力。
通常，存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂中的CTLA4结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)是SEQ ID NO：9(11F01，WO 2008/071447：SEQ ID NO：1306)的变体，其包含以下突变或突变集合(即与SEQ ID NO：9的序列相比的突变)：
-89T或89L；
-89L与1D、11V、14P、45R、74S、83R、96P和108L的组合；
-89L与1E、11V、14P、45R、74S、83R、96P和108L的组合；
-89L与11V的组合；
-89L与110K或110Q的组合；
-89L与112K或112Q的组合；
-89L与11V和110K或110Q的组合；
-89L与11V和112K或112Q的组合；
-89L与1D、11V、14P、45R、74S、83R、89L、96P、108L和110K或110Q的组合；
-89L与1E、11V、14P、45R、74S、83R、89L、96P、108L和110K或110Q的组合；
-89L与1D、11V、14P、45R、74S、83R、89L、96P、108L和112K或112Q的组合；或
-89L与1E、11V、14P、45R、74S、83R、89L、96P、108L和112K或112Q的组合；
-11V与110K或110Q的组合；或
-11V与112K或112Q的组合。
在本发明的一个实施方案中，在存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂中的CTLA4结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)中：
-位置1处的氨基酸残基选自E或D；
-位置11处的氨基酸残基选自L或V；
-位置14处的氨基酸残基选自A或P；
-位置45处的氨基酸残基选自Q或R；
-位置74处的氨基酸残基选自A或S；
-位置83处的氨基酸残基选自K或R；
-位置89处的氨基酸残基选自T、V或L；
-位置96处的氨基酸残基选自M或P；
-位置108处的氨基酸残基选自Q或L；
-位置110处的氨基酸残基选自T、K或Q；且
-位置112处的氨基酸残基选自S、K或Q；
使得，例如，CTLA4结合部分包含以下突变或突变集合中的一种或多种：
(i)位置89是T或L；
(ii)位置89是L且位置11是V；
(iii)位置89是L，位置1是D，位置11是V，位置14是P，位置45是R，位置74是S，位置83是R，位置96是P且位置108是L；
(iv)位置89是L，位置1是E，位置11是V，位置14是P，位置45是R，位置74是S，位置83是R，位置96是P且位置108是L；
(v)位置89是L且位置110是K或Q；
(vi)位置89是L且位置112是K或Q；
(vii)位置89是L且位置11是V且位置110是K或Q；
(viii)位置89是L且位置11是V且位置112是K或Q；
(ix)位置89是L，位置1是D，位置11是V，位置14是P，位置45是R，位置74是S，位置83是R，位置96是P，位置108是L且位置110是K或Q；
(x)位置89是L，位置1是E，位置11是V，位置14是P，位置45是R，位置74是S，位置83是R，位置96是P，位置108是L且位置110是K或Q；
(xi)位置89是L，位置1是D，位置11是V，位置14是P，位置45是R，位置74是S，位置83是R，位置96是P，位置108是L且位置112是K或Q；
(xii)位置89是L，位置1是E，位置11是V，位置14是P，位置45是R，位置74是S，位置83是R，位置96是P，位置108是L且位置112是K或Q；
(xiii)位置11是V且位置110是K或Q；或
(xiv)位置11是V且位置112是K或Q。
优选存在这样的CTLA4结合部分：其中位置89是T或其中位置1是E或D，位置11是V，位置14是P，位置45是R，位置74是S，位置83是R，位置89是L，位置96是P，位置108是L，或其中位置11是V且位置89是L(任选地与110K或110Q突变和/或112K或112Q突变合适的组合，且特别是与110K或110Q突变组合)。还优选这样的CTLA4结合部分，其中位置11是V且位置89是L，任选地具有110K或110Q突变。
存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂中的CTLA4结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)优选包含以下CDR(根据Kabat惯例)：
-CDR1(根据Kabat)，其为氨基酸序列FYGMG(SEQ ID NO：10)；和
-CDR2(根据Kabat)，其为氨基酸序列DIRTSAGRTYYADSVKG(SEQ ID NO：11)；和
-CDR3(根据Kabat)，其为氨基酸序列EXSGISGWDY(SEQ ID NO：12；其中X是M或P)。
或者，当根据Abm惯例给出CDR时，存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂中的CTLA4结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)优选包含以下CDR：
-CDR1(根据Abm)，其为氨基酸序列GGTFSFYGMG(SEQ ID NO：13)；和
-CDR2(根据Abm)，其为氨基酸序列DIRTSAGRTY(SEQ ID NO：14)；和
-CDR3(根据Abm)，其为氨基酸序列EXSGISGWDY(SEQ ID NO：15，其与SEQ ID NO：4相同；其中X是M或P)。
以上优选的CDR与11F01(SEQ ID NO：9)中存在的相同。
存在于PD1/CTLA4结合剂中的CTLA4结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)优选还具有：
-当通过BLAST算法进行比较时，与SEQ ID NO：9的氨基酸序列的至少85％、优选至少90％、更优选至少95％的序列同一性程度(其中对于测定序列同一性程度，不考虑CDR、任何可以存在的C端延伸以及涉及的特定方面所需的在位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110和/或112处的突变)，其中选择所述算法的参数以产生在各个参考序列的整个长度上在各个序列之间的最大匹配(例如，预期阈值：10；字长：3；在查询范围内的最大匹配：0；BLOSUM 62矩阵；间隙成本：存在11，延伸1；条件性组成评分矩阵调节)；和/或
-不超过7个，诸如不超过5个，优选不超过3个，诸如仅3、2或1个与SEQ ID NO：9的氨基酸序列的“氨基酸差异”(如本文所定义，且不考虑以上列出的可以存在的在位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110和/或112处的突变中的任一个且不考虑任何可以存在的C端延伸)(其中所述氨基酸差异，如果存在，可以存在于骨架和/或CDR中，但优选仅存在于骨架中且不存在于CDR中)。
关于当通过BLAST算法(其中选择所述算法的参数以产生在本发明提供的本发明的各个参考序列的整个长度上在各个序列之间的最大匹配(例如，预期阈值：10；字长：3；在查询范围内的最大匹配：0；BLOSUM 62矩阵；间隙成本：存在11，延伸1；条件性组成评分矩阵调节))进行比较时的各个方面和优选方面，就相对于SEQ ID NO：9的序列同一性程度和/或本发明的此类结合剂中可以存在(即与SEQ ID NO：9的序列相比)的“氨基酸差异”的数目和种类而论，应注意，当据称
(i)CTLA4结合部分与SEQ ID NO：9的序列具有至少85％、优选至少90％、更优选至少95％的序列同一性程度(其中对于测定序列同一性程度，不考虑CDR、任何可以存在的C端延伸以及涉及的特定方面所需的在位置1、11、14、45、74、8389、96、108、110和/或112处的突变)时；和/或当据称
(ii)CTLA4结合部分与SEQ ID NO：9的序列具有不超过7个，优选不超过5个，诸如仅3、2或1个“氨基酸差异”(再次，不考虑任何可以存在的C端延伸且不考虑涉及的特定方面所需的在位置1、11、14、45、74、8389、96、108、110和/或112处的突变)时，
则这还包括，除了涉及的特定方面所需的在位置1、11、14、45、74、8389、96、108、110和/或112处的突变和任何可以存在的C端延伸以外，与SEQ ID NO：9的序列不具有氨基酸差异的序列。
因此，在本发明的一个特定方面，存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂中的CTLA4结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)可以与SEQ ID NO：9具有100％序列同一性(包括CDR，但不考虑在本文公开的位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110和/或112处的突变或突变组合和/或任何可以存在的C端延伸)和/或可以不具有与SEQ ID NO：9的氨基酸差异(即除了在本文公开的位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110和/或112处的突变或突变组合和任何可以存在的C端延伸以外)。
当存在任何氨基酸差异(即除了任何C端延伸和涉及的本发明的特定方面所需的在位置1、11、14、45、74、8389、96、108、110和/或112处的突变以外)时，这些氨基酸差异可以存在于CDR和/或骨架区中，但其优选仅存在于骨架区中(如由Abm惯例所定义，即不在如根据Abm惯例所定义的CDR中)，即，使得存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂中的CTLA4结合部分具有与SEQ ID NO：48-83或143中存在的相同的CDR(根据Abm惯例定义)。
此外，根据本发明的任何方面，当存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂中的CTLA4结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)与SEQ ID NO：9的序列具有一个或多个氨基酸差异(除了涉及的特定方面所需的在位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110和/或112处的突变以外)时，则可以存在的此类突变/氨基酸差异(即与SEQ ID NO：9的序列相比)的一些特定、但非限制性实例为例如P41A、P41L、P41S或P41T(且特别是P41A)和/或T87A(相对于SEQ ID NO：9的氨基酸序列)。突变的其它实例是一种或多种合适的“人源化”取代，诸如Q108L(的合适组合)；参考例如WO 2009/138519(或在WO 2009/138519中引用的现有技术中)和WO 2008/020079(或在WO 2008/020079中引用的现有技术中)，以及来自WO 2008/020079的表A-3至A-8(其为显示可能人源化取代的列表)。优选地，存在于本发明的多肽中的CTLA4结合剂至少含有Q108L人源化取代。此外，位置96(Kabat编号)处的甲硫氨酸残基可以被另一个天然存在的氨基酸残基(诸如Pro)(除了Cys、Asp或Asn以外)置换。
此外，当CTLA4结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)存在于和/或形成本发明的PD1/CTLA4结合剂的N端部分时，则其优选在位置1处含有D(即与SEQ ID NO：9相比的E1D突变)。此类N端CTLA4结合部分的优选但非限制性实例作为SEQ ID NO：64和65和143给出(尽管也可以使用其它具有E1D突变的CTLA4结合部分)。类似地，当SEQ ID NO：64或65或143的CTLA结合部分不存在于N端末端、但存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂中的其它某处时，其优选含有D1E突变(1E)。因此，在一个进一步方面，本发明涉及本发明的在其N端末端具有CTLA4结合部分(其如本文进一步描述)的PD1/CTLA4结合剂(其如本文进一步描述)，其中所述CTLA4结合部分在位置1处具有D(1D)，且优选为SEQ ID NO：64或65或143。
根据本文描述的方面，存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))中的CTLA4结合部分优选使得其含有任选的E1D突变、L11V突变、A14P突变、Q45R突变、A74S突变、K83R突变、V89L突变、M96P突变和Q108L突变的合适的组合。在本发明的一个实施方案中，此类CTLA4结合部分包含Q108L与其它E1D(任选地)、L11V、A14P、Q45R、A74S、K83R、V89L、M96P、Q108L突变中的任一个的合适的组合。优选地，CTLA4结合部分包含此类突变的任意组合，例如这些其它突变中的任何两个，更优选具有这些突变中的任何三个(诸如具有组合A14P、A74S和K83R)，诸如具有这些突变中的所有四个或九个或10个(并且再次，当CTLA4结合部分是单价或存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂的N端末端时，优选地，还存在E1D突变)(相对于SEQ ID NO：9的氨基酸序列)。此外，在本发明的一个实施方案中，CTLA4结合部分的位置96(Kabat编号)处的甲硫氨酸残基可以被另一个天然存在的氨基酸残基(诸如Pro)(除了例如Cys、Asp或Asn以外)置换。借助于优选、但非限制性实例，SEQ ID NO：62至65和80至83和143是具有与SEQ ID NO：9的进一步氨基酸差异，例如，E1D(任选地)、L11V、A14P、Q45R、A74S、K83R、V89L、M96P和Q108L的CTLA4结合部分的实例(此外，如先前段落中所示，SEQ ID NO：64、65和82和83还具有E1D突变)。
因此，在第一个方面，存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂中的CTLA4结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)具有：
-CDR1(根据Kabat)，其为氨基酸序列FYGMG(SEQ ID NO：10)；和
-CDR2(根据Kabat)，其为氨基酸序列DIRTSAGRTYYADSVKG(SEQ ID NO：11)；和
-CDR3(根据Kabat)，其为氨基酸序列EXSGISGWDY(SEQ ID NO：12；其中X是M或P)；
且具有：
-当通过BLAST算法进行比较时，与SEQ ID NO：9的氨基酸序列的至少85％、优选至少90％、更优选至少95％的序列同一性程度(其中对于测定序列同一性程度，不考虑CDR、任何可以存在的C端延伸以及涉及的特定方面所需的在位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110和/或112处的突变)，其中选择所述算法的参数以产生在各个参考序列的整个长度上在各个序列之间的最大匹配(例如，预期阈值：10；字长：3；在查询范围内的最大匹配：0；BLOSUM 62矩阵；间隙成本：存在11，延伸1；条件性组成评分矩阵调节)；
和/或具有：
-不超过7个，诸如不超过5个，优选不超过3个，诸如仅3、2或1个与SEQ ID NO：9的氨基酸序列的“氨基酸差异”(如本文所定义，且不考虑以上列出的可以存在的在位置11、89、110或112处的突变中的任一个且不考虑任何可以存在的C端延伸)(其中所述氨基酸差异，如果存在，可以存在于骨架和/或CDR中，但优选仅存在于骨架中且不存在于CDR中)；
且当存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂的C端末端时优选具有：
-C端延伸(X)n，其中n是1至10，优选1至5，诸如1、2、3、4或5(且优选1或2，诸如1)；且各X是独立地选择的(优选天然存在的)氨基酸残基，且优选独立地选自丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)或异亮氨酸(I)；
且当存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂的N端末端时，优选在位置1处具有D(即与SEQ ID NO：9相比的E1D突变)，
其中：
-CTLA4结合部分的位置1处的氨基酸残基选自E或D；
-CTLA4结合部分的位置11处的氨基酸残基选自L或V；
-CTLA4结合部分的位置14处的氨基酸残基选自A或P；
-CTLA4结合部分的位置45处的氨基酸残基选自Q或R；
-CTLA4结合部分的位置74处的氨基酸残基选自A或S；
-CTLA4结合部分的位置83处的氨基酸残基选自K或R；
-CTLA4结合部分的位置89处的氨基酸残基选自T、V或L；
-CTLA4结合部分的位置96处的氨基酸残基选自M或P；
-CTLA4结合部分的位置108处的氨基酸残基选自Q或L；
-CTLA4结合部分的位置110处的氨基酸残基选自T、K或Q；且
-CTLA4结合部分的位置112处的氨基酸残基选自S、K或Q；
使得，例如，CTLA4结合部分具有以下突变中的一种或多种：
(i)位置1是E或D；
(ii)位置11是V；
(iii)位置14是P；
(iv)位置45是R；
(v)位置74是S；
(vi)位置83是R；
(vii)位置89是L或T；
(viii)位置96是P；
(ix)位置108是L；
例如，其中，CTLA4结合部分包含以下突变集合中的一种或多种：
a.位置89是L且位置11是V；
b.位置89是L且位置110是K或Q；
c.位置89是L且位置112是K或Q；
d.位置89是L且位置11是V且位置110是K或Q；
e.位置89是L且位置11是V且位置112是K或Q；
f.位置1是D，位置11是V，位置14是P，位置45是R，位置74是S，位置83是R，位置89是L，位置96是P且位置108是L；
g.位置1是E，位置11是V，位置14是P，位置45是R，位置74是S，位置83是R，位置89是L，位置96是P且位置108是L；
h.位置1是D，位置11是V，位置14是P，位置45是R，位置74是S，位置83是R，位置89是L，位置96是P，位置108是L且位置110是K或Q；
i.位置1是E，位置11是V，位置14是P，位置45是R，位置74是S，位置83是R，位置89是L，位置96是P，位置108是L且位置110是K或Q；
j.位置1是D，位置11是V，位置14是P，位置45是R，位置74是S，位置83是R，位置89是L，位置96是P，位置108是L且位置112是K或Q；
k.位置1是E，位置11是V，位置14是P，位置45是R，位置74是S，位置83是R，位置89是L，位置96是P，位置108是L且位置112是K或Q；
l.位置11是V且位置110是K或Q；或
m.位置11是V且位置112是K或Q。
在一个进一步方面，存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))中的CTLA4结合部分具有：
-CDR1(根据Kabat)，其为氨基酸序列FYGMG(SEQ ID NO：10)；和
-CDR2(根据Kabat)，其为氨基酸序列DIRTSAGRTYYADSVKG(SEQ ID NO：11)；和
-CDR3(根据Kabat)，其为氨基酸序列EXSGISGWDY(SEQ ID NO：12；其中X是M或P)；
且具有：
-当通过BLAST算法进行比较时，与SEQ ID NO：9的氨基酸序列的至少85％、优选至少90％、更优选至少95％的序列同一性程度(其中对于测定序列同一性程度，不考虑CDR、任何可以存在的C端延伸以及涉及的特定方面所需的在位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110和/或112处的突变)，其中选择所述算法的参数以产生在各个参考序列的整个长度上在各个序列之间的最大匹配(例如，预期阈值：10；字长：3；在查询范围内的最大匹配：0；BLOSUM 62矩阵；间隙成本：存在11，延伸1；条件性组成评分矩阵调节)；
和/或具有：
-不超过7个，诸如不超过5个，优选不超过3个，诸如仅3、2或1个与SEQ ID NO：9的氨基酸序列的“氨基酸差异”(如本文所定义，且不考虑以上列出的可以存在的在位置11、89、110或112处的突变中的任一个且不考虑任何可以存在的C端延伸)(其中所述氨基酸差异，如果存在，可以存在于骨架和/或CDR中，但优选仅存在于骨架中且不存在于CDR中)；
且当存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂的C端末端时优选具有：
-C端延伸(X)n，其中n是1至10，优选1至5，诸如1、2、3、4或5(且优选1或2，诸如1)；且各X是独立地选择的(优选天然存在的)氨基酸残基，且优选独立地选自丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)或异亮氨酸(I)；
且当存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂的N端末端时，优选在位置1处具有D(即与SEQ ID NO：9相比的E1D突变)，
使得所述CTLA4结合部分在所提及的位置(根据Kabat编号)处包含以下氨基酸残基中的一个或多个(即与SEQ ID NO：9的氨基酸序列相比的突变)：
-1D或1E；
-11V；
-14P；
-45R；
-74S；
-83R；
-89L或8T；
-96P；
-108L；
例如，其中CTLA4结合部分包含以下突变集合中的一种或多种：
-1E与11V；14P；45R；74S；83R；89L；96P；和108L的组合；
-1D与11V；14P；45R；74S；83R；89L；96P；和108L的组合；
-89L与11V的组合；
-89L与110K或110Q的组合；
-89L与112K或112Q的组合；
-89L与11V和110K或110Q的组合；
-89L与11V和112K或112Q的组合；
-1E与11V；14P；45R；74S；83R；89L；96P；108L和110K或110Q的组合；
-1D与11V；14P；45R；74S；83R；89L；96P；108L和110K或110Q的组合；
-1E与11V；14P；45R；74S；83R；89L；96P；108L和112K或112Q的组合；
-1D与11V；14P；45R；74S；83R；89L；96P；108L和112K或112Q的组合；
-11V与110K或110Q的组合；或
-11V与112K或112Q。
如所提及，当存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂中的CTLA4结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)以单价形式使用和/或存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂(如本文所定义)的C端末端时，CTLA4结合部分(且因此所得本发明的PD1/CTLA4结合剂)优选具有如所述和/或如WO 2012/175741或PCT/EP2015/060643(WO2015/173325)中所述的C端延伸X(n)。
如所提及，在本发明中，优选这样的CTLA4结合部分：其中位置89是T或其中位置1是E或D，位置11是V；位置14是P；位置45是R；位置74是S；位置83是R；位置89是L；位置96是P；且位置108是L，或其中位置11是V且位置89是L(任选地与110K或110Q突变和/或112K或112Q突变合适的组合，且特别是与110K或110Q突变组合)。还优选这样的CTLA4部分，其中位置11是V且位置89是L，任选地具有110K或110Q突变。
因此，在一个优选方面，存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂中的CTLA4结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)具有：
-CDR1(根据Kabat)，其为氨基酸序列FYGMG(SEQ ID NO：10)；和
-CDR2(根据Kabat)，其为氨基酸序列DIRTSAGRTYYADSVKG(SEQ ID NO：11)；和
-CDR3(根据Kabat)，其为氨基酸序列EXSGISGWDY(SEQ ID NO：12；其中X是M或P)；
且具有：
-当通过BLAST算法进行比较时，与SEQ ID NO：9的氨基酸序列的至少85％、优选至少90％、更优选至少95％的序列同一性程度(其中对于测定序列同一性程度，不考虑CDR、任何可以存在的C端延伸以及涉及的特定方面所需的在位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110和/或112处的突变)，其中选择所述算法的参数以产生在各个参考序列的整个长度上在各个序列之间的最大匹配(例如，预期阈值：10；字长：3；在查询范围内的最大匹配：0；BLOSUM 62矩阵；间隙成本：存在11，延伸1；条件性组成评分矩阵调节)；
和/或具有：
-不超过7个，诸如不超过5个，优选不超过3个，诸如仅3、2或1个与SEQ ID NO：9的氨基酸序列的“氨基酸差异”(如本文所定义，且不考虑以上列出的可以存在的在位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110和/或112处的突变中的任一个且不考虑任何可以存在的C端延伸)(其中所述氨基酸差异，如果存在，可以存在于骨架和/或CDR中，但优选仅存在于骨架中且不存在于CDR中)；
且当存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂的C端末端时优选具有：
-C端延伸(X)n，其中n是1至10，优选1至5，诸如1、2、3、4或5(且优选1或2，诸如1)；且各X是独立地选择的(优选天然存在的)氨基酸残基，且优选独立地选自丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)或异亮氨酸(I)；
且当存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂的N端末端时，优选在位置1处具有D(即与SEQ ID NO：9相比的E1D突变)，
其中：
-CTLA4结合部分的位置1处的氨基酸残基选自E或D
-CTLA4结合部分的位置11处的氨基酸残基选自L或V；
-CTLA4结合部分的位置14处的氨基酸残基选自A或P；
-CTLA4结合部分的位置45处的氨基酸残基选自Q或R；
-CTLA4结合部分的位置74处的氨基酸残基选自A或S；
-CTLA4结合部分的位置83处的氨基酸残基选自K或R；
-CTLA4结合部分的位置89处的氨基酸残基选自T、V或L；
-CTLA4结合部分的位置96处的氨基酸残基选自M或P；
-CTLA4结合部分的位置108处的氨基酸残基选自Q或L；
-CTLA4结合部分的位置110处的氨基酸残基优选选自T、K或Q(且优选为T)；且
-CTLA4结合部分的位置112处的氨基酸残基优选选自S、K或Q(且优选为S)。
在另一个优选方面，存在于PD1/CTLA4结合剂中的CTLA4结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)具有：
-CDR1(根据Kabat)，其为氨基酸序列FYGMG(SEQ ID NO：10)；和
-CDR2(根据Kabat)，其为氨基酸序列DIRTSAGRTYYADSVKG(SEQ ID NO：11)；和
-CDR3(根据Kabat)，其为氨基酸序列EXSGISGWDY(SEQ ID NO：12；其中X是M或P)；
且具有：
-当通过BLAST算法进行比较时，与SEQ ID NO：9的氨基酸序列的至少85％、优选至少90％、更优选至少95％的序列同一性程度(其中对于测定序列同一性程度，不考虑CDR、任何可以存在的C端延伸以及涉及的特定方面所需的在位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110和/或112处的突变)，其中选择所述算法的参数以产生在各个参考序列的整个长度上在各个序列之间的最大匹配(例如，预期阈值：10；字长：3；在查询范围内的最大匹配：0；BLOSUM 62矩阵；间隙成本：存在11，延伸1；条件性组成评分矩阵调节)；
和/或具有：
-不超过7个，诸如不超过5个，优选不超过3个，诸如仅3、2或1个与SEQ ID NO：9的氨基酸序列的“氨基酸差异”(如本文所定义，且不考虑以上列出的可以存在的在位置11、89、110或112处的突变中的任一个且不考虑任何可以存在的C端延伸)(其中所述氨基酸差异，如果存在，可以存在于骨架和/或CDR中，但优选仅存在于骨架中且不存在于CDR中)；
且当存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂的C端末端时优选具有：
-C端延伸(X)n，其中n是1至10，优选1至5，诸如1、2、3、4或5(且优选1或2，诸如1)；且各X是独立地选择的(优选天然存在的)氨基酸残基，且优选独立地选自丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)或异亮氨酸(I)；
且当存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂的N端末端时，优选在位置1处具有D(即与SEQ ID NO：9相比的E1D突变)，其中，以下中的一种或多种是真实的：
-CTLA4结合部分的位置1处的氨基酸残基是E或D；
-CTLA4结合部分的位置11处的氨基酸残基是V；
-CTLA4结合部分的位置14处的氨基酸残基是P；
-CTLA4结合部分的位置45处的氨基酸残基是R；
-CTLA4结合部分的位置74处的氨基酸残基是S；
-CTLA4结合部分的位置83处的氨基酸残基是R；
-CTLA4结合部分的位置89处的氨基酸残基是L；
-CTLA4结合部分的位置96处的氨基酸残基是P；
-CTLA4结合部分的位置108处的氨基酸残基是L；
-CTLA4结合部分的位置110处的氨基酸残基选自T、K或Q；或
-CTLA4结合部分的位置112处的氨基酸残基选自S、K或Q。
在一个特定、但非限制性方面，存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂中的CTLA4结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)在所提及的位置(根据Kabat编号)处包含以下突变集合(即与SEQ ID NO：9的序列相比的突变)：
-11V与89L的组合；
-11V与1D、14P、45R、74S、83R、89L、96P和108L的组合；
-11V与1E、14P、45R、74S、83R、89L、96P和108L的组合；
-11V与110K或110Q的组合；
-11V与112K或112Q的组合；
-11V与1D、14P、45R、74S、83R、89L、96P、108L和110K或110Q的组合；
-11V与1E、14P、45R、74S、83R、89L、96P、108L和110K或110Q的组合；
-11V与1D、14P、45R、74S、83R、89L、96P、108L和112K或112Q的组合；
-11V与1E、14P、45R、74S、83R、89L、96P、108L和112K或112Q的组合；
-11V与89L和110K或110Q的组合；或
-11V与89L和112K或112Q的组合；
且具有CDR诸如SEQ ID NO：9或48-83或143中阐述的那些(例如根据Kabat)且具有与如本文所述的SEQ ID NO：9的氨基酸序列的整体序列同一性程度。
在另一个特定、但非限制性方面，存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂中的CTLA4结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)在所提及的位置(根据Kabat编号)处包含以下突变集合(即与SEQ ID NO：9的序列相比的突变)：
-89L与11V的组合；
-89L与1D、11V、14P、45R、74S、83R、96P和108L的组合；
-89L与1E、11V、14P、45R、74S、83R、96P和108L的组合；
-89L与110K或110Q的组合；
-89L与112K或112Q的组合；
-89L与1D、11V、14P、45R、74S、83R、96P、108L和110K或110Q的组合；
-89L与1E、11V、14P、45R、74S、83R、96P、108L和110K或110Q的组合；
-89L与1D、11V、14P、45R、74S、83R、96P、108L和112K或112Q的组合；
-89L与1E、11V、14P、45R、74S、83R、96P、108L和112K或112Q的组合；
-89L与11V和110K或110Q的组合；或
-89L与11V和112K或112Q的组合；
且具有CDR诸如SEQ ID NO：9或48-83或143中阐述的那些(例如根据Kabat)且具有与如本文所述的SEQ ID NO：9的氨基酸序列的整体序列同一性程度。
在另一个特定、但非限制性方面，存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂中的CTLA4结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)在所提及的位置(根据Kabat编号)处包含以下突变集合(即与SEQ ID NO：9的序列相比的突变)：
-110K或110Q与11V的组合；
-110K或110Q与1D、11V、14P、45R、74S、83R、89L 96P和108L的组合；
-110K或110Q与1E、11V、14P、45R、74S、83R、89L 96P和108L的组合；
-110K或110Q与89L的组合；或
-110K或110Q与11V和89L的组合；
且具有CDR诸如SEQ ID NO：9或48-83或143中阐述的那些(例如根据Kabat)且具有与如本文所述的SEQ ID NO：9的氨基酸序列的整体序列同一性程度。
在另一个特定、但非限制性方面，存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂中的CTLA4结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)在所提及的位置(根据Kabat编号)处包含以下突变集合(即与SEQ ID NO：9的序列相比的突变)：
-112K或112Q与11V的组合；
-112K或112Q与1D、11V、14P、45R、74S、83R、89L 96P和108L的组合；
-112K或112Q与1E、11V、14P、45R、74S、83R、89L 96P和108L的组合；
-112K或112Q与89L的组合；或
-112K或112Q与11V和89L的组合；
且具有CDR诸如SEQ ID NO：9或48-83或143中阐述的那些(例如根据Kabat)且具有与如本文所述的SEQ ID NO：9的氨基酸序列的整体序列同一性程度。
在另一个方面，存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂中的CTLA4结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)在位置89处包含T或L(例如，1D或1E、11V、14P、45R、74S、83R、89L 96P和108L)且具有CDR诸如SEQ ID NO：9或48-83或143中阐述的那些(根据Kabat)且具有与如本文所述的SEQ ID NO：9的氨基酸序列的整体序列同一性程度。
在另一个方面，存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂中的CTLA4结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)包含位置11处的V和位置89处的L(例如，1D或1E、11V、14P、45R、74S、83R、89L96P和108L)且具有CDR诸如SEQ ID NO：9或48-83或143中阐述的那些(例如根据Kabat)且具有与如本文所述的SEQ ID NO：9的氨基酸序列的整体序列同一性程度。
如所提及，根据本文描述的方面，存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂中的CTLA4结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)优选使得其含有任选的E1D突变、L11V突变、A14P突变、Q45R突变、A74S突变、K83R突变、V89L突变、M96P突变和/或Q108L突变的合适的组合，且优选Q108L与其它A14P、Q45R、A74S和K83R突变中的任一个的合适的组合，且优选与这些其它突变中的任何两个的组合，更优选与这些突变中的任何三个(诸如与组合A14P、A74S和K83R)，诸如与这些突变中的所有四个的合适的组合(并且再次，当CTLA4结合剂是单价或存在于本发明的化合物或多肽的N端末端时，优选地，还存在E1D突变)(相对于SEQ ID NO：9的氨基酸序列)。此外，位置96(Kabat编号)处的甲硫氨酸残基可以被另一个天然存在的氨基酸残基(诸如Pro)(除了Cys、Asp或Asn以外)置换。
在另一个方面，存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂中的CTLA4结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)具有：
-CDR1(根据Abm)，其为氨基酸序列GGTFSFYGMG(SEQ ID NO：13)；和
-CDR2(根据Abm)，其为氨基酸序列DIRTSAGRTY(SEQ ID NO：14)；和
-CDR3(根据Abm)，其为氨基酸序列EXSGISGWDY(SEQ ID NO：12；其中X是M或P)；
且具有：
-当通过BLAST算法进行比较时，与SEQ ID NO：9的氨基酸序列的至少85％、优选至少90％、更优选至少95％的序列同一性程度(其中对于测定序列同一性程度，不考虑CDR、任何可以存在的C端延伸以及涉及的特定方面所需的在位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110和/或112处的突变)，其中选择所述算法的参数以产生在各个参考序列的整个长度上在各个序列之间的最大匹配(例如，预期阈值：10；字长：3；在查询范围内的最大匹配：0；BLOSUM 62矩阵；间隙成本：存在11，延伸1；条件性组成评分矩阵调节)；
和/或具有：
-不超过7个，诸如不超过5个，优选不超过3个，诸如仅3、2或1个与SEQ ID NO：9的氨基酸序列的“氨基酸差异”(如本文所定义，且不考虑以上列出的可以存在的在位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110和/或112处的突变中的任一个且不考虑任何可以存在的C端延伸)(其中所述氨基酸差异，如果存在，可以存在于骨架和/或CDR中，但优选仅存在于骨架中且不存在于CDR中)；
且当存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂的C端末端时优选具有：
-C端延伸(X)n，其中n是1至10，优选1至5，诸如1、2、3、4或5(且优选1或2，诸如1)；且各X是独立地选择的(优选天然存在的)氨基酸残基，且优选独立地选自丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)或异亮氨酸(I)；
且当存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂的N端末端时，优选在位置1处具有D(即与SEQ ID NO：9相比的E1D突变)，
其中：
-CTLA4结合部分的位置1处的氨基酸残基选自E或D；
-CTLA4结合部分的位置11处的氨基酸残基选自L或V；
-CTLA4结合部分的位置14处的氨基酸残基选自A或P；
-CTLA4结合部分的位置45处的氨基酸残基选自Q或R；
-CTLA4结合部分的位置74处的氨基酸残基选自A或S；
-CTLA4结合部分的位置83处的氨基酸残基选自K或R；
-CTLA4结合部分的位置89处的氨基酸残基选自T、V或L；
-CTLA4结合部分的位置96处的氨基酸残基选自M或P；
-CTLA4结合部分的位置108处的氨基酸残基选自Q或L；
-CTLA4结合部分的位置110处的氨基酸残基选自T、K或Q；且
-CTLA4结合部分的位置112处的氨基酸残基选自S、K或Q；
使得例如，以下中的一种或多种是真实的：
(i)位置1是E或D；
(ii)位置11是V；
(iii)位置14是P；
(iv)位置45是R；
(v)位置74是S；
(vi)位置83是R；
(vii)位置89是L或T；
(viii)位置96是P；
(ix)位置108是L；
例如，其中CTLA4结合剂包含以下突变集合中的一种或多种：
a.位置89是L且位置11是V；
b.位置89是L且位置110是K或Q；
c.位置89是L且位置112是K或Q；
d.位置89是L且位置11是V且位置110是K或Q；
e.位置89是L且位置11是V且位置112是K或Q；
f.位置1是D，位置11是V，位置14是P，位置45是R，位置74是S，位置83是R，位置89是L，位置96是P且位置108是L；
g.位置1是E，位置11是V，位置14是P，位置45是R，位置74是S，位置83是R，位置89是L，位置96是P且位置108是L；
h.位置1是D，位置11是V，位置14是P，位置45是R，位置74是S，位置83是R，位置89是L，位置96是P，位置108是L且位置110是K或Q；
i.位置1是E，位置11是V，位置14是P，位置45是R，位置74是S，位置83是R，位置89是L，位置96是P，位置108是L且位置110是K或Q；
j.位置1是D，位置11是V，位置14是P，位置45是R，位置74是S，位置83是R，位置89是L，位置96是P，位置108是L且位置112是K或Q；
k.位置1是E，位置11是V，位置14是P，位置45是R，位置74是S，位置83是R，位置89是L，位置96是P，位置108是L且位置112是K或Q；
l.位置11是V且位置110是K或Q；或
m.位置11是V且位置112是K或Q。
在一个进一步方面，存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂中的CTLA4结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)具有：
-CDR1(根据Abm)，其为氨基酸序列GGTFSFYGMG(SEQ ID NO：13)；和
-CDR2(根据Abm)，其为氨基酸序列DIRTSAGRTY(SEQ ID NO：14)；和
-CDR3(根据Abm)，其为氨基酸序列EXSGISGWDY(SEQ ID NO：12；其中X是M或P)；
且具有：
-当通过BLAST算法进行比较时，与SEQ ID NO：9的氨基酸序列的至少85％、优选至少90％、更优选至少95％的序列同一性程度(其中对于测定序列同一性程度，不考虑CDR、任何可以存在的C端延伸以及涉及的特定方面所需的在位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110和/或112处的突变)，其中选择所述算法的参数以产生在各个参考序列的整个长度上在各个序列之间的最大匹配(例如，预期阈值：10；字长：3；在查询范围内的最大匹配：0；BLOSUM 62矩阵；间隙成本：存在11，延伸1；条件性组成评分矩阵调节)；
和/或具有：
-不超过7个，诸如不超过5个，优选不超过3个，诸如仅3、2或1个与SEQ ID NO：9的氨基酸序列的“氨基酸差异”(如本文所定义，且不考虑以上列出的可以存在的在位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110和/或112处的突变中的任一个且不考虑任何可以存在的C端延伸)(其中所述氨基酸差异，如果存在，可以存在于骨架和/或CDR中，但优选仅存在于骨架中且不存在于CDR中)；
且当存在于本发明的多肽的C端末端时优选具有：
-C端延伸(X)n，其中n是1至10，优选1至5，诸如1、2、3、4或5(且优选1或2，诸如1)；且各X是独立地选择的(优选天然存在的)氨基酸残基，且优选独立地选自丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)或异亮氨酸(I)；
且当存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂的N端末端时，优选在位置1处具有D(即与SEQ ID NO：9相比的E1D突变)，
使得所述CTLA4结合部分在所提及的位置(根据Kabat编号)处包含以下氨基酸残基中的一个或多个(即与SEQ ID NO：9的氨基酸序列相比的突变)：
-1E或1D；
-11V；
-14P；
-45R；
-74S；
-83R；
-89L或89T；
-96P；或
-108L；
例如，其中CTLA4结合部分包含以下突变集合中的一种或多种：
-89L与11V的组合；
-89L与110K或110Q的组合；
-89L与112K或112Q的组合；
-89L与11V和110K或110Q的组合；
-89L与11V和112K或112Q的组合；
-1E与11V；14P；45R；74S；83R；89L；96P；和108L的组合；
-1D与11V；14P；45R；74S；83R；89L；96P；和108L的组合；
-1E与11V；14P；45R；74S；83R；89L；96P；108L和110K或110Q的组合；
-1D与11V；14P；45R；74S；83R；89L；96P；108L和110K或110Q的组合；
-1E与11V；14P；45R；74S；83R；89L；96P；108L和112K或112Q的组合；
-1D与11V；14P；45R；74S；83R；89L；96P；108L和112K或112Q的组合；
-11V与110K或110Q的组合；或
-11V与112K或112Q的组合。
如所提及，当存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂中的CTLA4部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)以单价形式使用和/或存在于本发明的多肽(如本文所定义)的C端末端时，CTLA4结合剂(且因此所得本发明的多肽)优选具有C端延伸X(n)，所述C端延伸可以如本文中关于本发明的多肽中存在的CTLA4结合剂所述和/或如WO 2012/175741或PCT/EP2015/060643(WO2015/173325)中所述。
如所提及，在本发明中，优选这样的CTLA4部分：其中位置89是T或其中位置11是V且位置89是L(任选地与110K或110Q突变和/或112K或112Q突变合适的组合，且特别是与110K或110Q突变组合)。还优选是这样的CTLA4结合剂，其中位置11是V且位置89是L，任选地具有110K或110Q突变；或其中位置1是D或E，位置11是V；位置14是P；位置45是R；位置74是S；位置83是R；位置89是L；位置96是P且位置108是L。
因此，在一个优选方面，存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂中的CTLA4部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)具有：
-CDR1(根据Abm)，其为氨基酸序列GGTFSFYGMG(SEQ ID NO：13)；和
-CDR2(根据Abm)，其为氨基酸序列DIRTSAGRTY(SEQ ID NO：14)；和
-CDR3(根据Abm)，其为氨基酸序列EXSGISGWDY(SEQ ID NO：12；其中X是M或P)；
且具有：
-当通过BLAST算法进行比较时，与SEQ ID NO：9的氨基酸序列的至少85％、优选至少90％、更优选至少95％的序列同一性程度(其中对于测定序列同一性程度，不考虑CDR、任何可以存在的C端延伸以及涉及的特定方面所需的在位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110和/或112处的突变)，其中选择所述算法的参数以产生在各个参考序列的整个长度上在各个序列之间的最大匹配(例如，预期阈值：10；字长：3；在查询范围内的最大匹配：0；BLOSUM 62矩阵；间隙成本：存在11，延伸1；条件性组成评分矩阵调节)；
和/或具有：
-不超过7个，诸如不超过5个，优选不超过3个，诸如仅3、2或1个与SEQ ID NO：9的氨基酸序列的“氨基酸差异”(如本文所定义，且不考虑以上列出的可以存在的在位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110和/或112处的突变中的任一个且不考虑任何可以存在的C端延伸)(其中所述氨基酸差异，如果存在，可以存在于骨架和/或CDR中，但优选仅存在于骨架中且不存在于CDR中)；
且当存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂的C端末端时优选具有：
-C端延伸(X)n，其中n是1至10，优选1至5，诸如1、2、3、4或5(且优选1或2，诸如1)；且各X是独立地选择的(优选天然存在的)氨基酸残基，且优选独立地选自丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)或异亮氨酸(I)；
且当存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂的N端末端时，优选在位置1处具有D(即与SEQ ID NO：9相比的E1D突变)，
其中
-CTLA4结合部分的位置1处的氨基酸残基选自E和D；
-CTLA4结合部分的位置11处的氨基酸残基选自L和V；
-CTLA4结合部分的位置14处的氨基酸残基选自A和P；
-CTLA4结合部分的位置45处的氨基酸残基选自Q和R；
-CTLA4结合部分的位置74处的氨基酸残基选自A和S；
-CTLA4结合部分的位置83处的氨基酸残基选自K和R；
-CTLA4结合部分的位置89处的氨基酸残基选自T、V和L；
-CTLA4结合部分的位置96处的氨基酸残基选自M和P；
-CTLA4结合部分的位置108处的氨基酸残基选自Q和L；
-CTLA4结合部分的位置110处的氨基酸残基选自T、K和Q(且优选为T)；且
-CTLA4结合部分的位置112处的氨基酸残基选自S、K和Q(且优选为S)。
在另一个优选方面，存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂中的CTLA4结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)具有：
-CDR1(根据Abm)，其为氨基酸序列GGTFSFYGMG(SEQ ID NO：13)；和
-CDR2(根据Abm)，其为氨基酸序列DIRTSAGRTY(SEQ ID NO：14)；和
-CDR3(根据Abm)，其为氨基酸序列EXSGISGWDY(SEQ ID NO：12；其中X是M或P)；
且具有：
-当通过BLAST算法进行比较时，与SEQ ID NO：9的氨基酸序列的至少85％、优选至少90％、更优选至少95％的序列同一性程度(其中对于测定序列同一性程度，不考虑CDR、任何可以存在的C端延伸以及涉及的特定方面所需的在位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110和/或112处的突变)，其中选择所述算法的参数以产生在各个参考序列的整个长度上在各个序列之间的最大匹配(例如，预期阈值：10；字长：3；在查询范围内的最大匹配：0；BLOSUM 62矩阵；间隙成本：存在11，延伸1；条件性组成评分矩阵调节)；
和/或具有：
-不超过7个，诸如不超过5个，优选不超过3个，诸如仅3、2或1个与SEQ ID NO：9的氨基酸序列的“氨基酸差异”(如本文所定义，且不考虑以上列出的可以存在的在位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110和/或112处的突变中的任一个且不考虑任何可以存在的C端延伸)(其中所述氨基酸差异，如果存在，可以存在于骨架和/或CDR中，但优选仅存在于骨架中且不存在于CDR中)；
且当存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂的C端末端时优选具有：
-C端延伸(X)n，其中n是1至10，优选1至5，诸如1、2、3、4或5(且优选1或2，诸如1)；且各X是独立地选择的(优选天然存在的)氨基酸残基，且优选独立地选自丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)或异亮氨酸(I)；
且当存在于本发明的多肽的N端末端时，优选在位置1处具有D(即与SEQ ID NO：9相比的E1D突变)，
其中，以下中的一种或多种是真实的：
-CTLA4结合部分的位置1处的氨基酸残基是E或D；
-CTLA4结合部分的位置11处的氨基酸残基是V；
-CTLA4结合部分的位置14处的氨基酸残基是P；
-CTLA4结合部分的位置45处的氨基酸残基是R；
-CTLA4结合部分的位置74处的氨基酸残基是S；
-CTLA4结合部分的位置83处的氨基酸残基是R；
-CTLA4结合部分的位置89处的氨基酸残基是L；
-CTLA4结合部分的位置96处的氨基酸残基是P；
-CTLA4结合部分的位置108处的氨基酸残基是L；
-CTLA4结合部分的位置110处的氨基酸残基优选选自T、K和Q；或
-CTLA4结合部分的位置112处的氨基酸残基优选选自S、K和Q。
在一个特定、但非限制性方面，存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))中的CTLA4结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)在所提及的位置(根据Kabat编号)处包含以下突变集合(即与SEQ ID NO：9的序列相比的突变)：
-11V与89L的组合；
-11V与1D、14P、45R、74S、83R、89L、96P和108L的组合；
-11V与1E、14P、45R、74S、83R、89L、96P和108L的组合；
-11V与110K或110Q的组合；
-11V与112K或112Q的组合；
-11V与1D、14P、45R、74S、83R、89L、96P、108L和110K或110Q的组合；
-11V与1E、14P、45R、74S、83R、89L、96P、108L和110K或110Q的组合；
-11V与1D、14P、45R、74S、83R、89L、96P、108L和112K或112Q的组合；
-11V与1E、14P、45R、74S、83R、89L、96P、108L和112K或112Q的组合；
-11V与89L和110K或110Q的组合；或
-11V与89L和112K或112Q的组合；
且具有CDR诸如SEQ ID NO：9或48-83或143中阐述的那些(例如根据Abm)且具有与如本文所述的SEQ ID NO：9的氨基酸序列的整体序列同一性程度。
在另一个特定、但非限制性方面，存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂中的CTLA4结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)在所提及的位置(根据Kabat编号)处包含以下突变集合(即与SEQ ID NO：9的序列相比的突变)：
-89L与11V的组合；
-89L与1D、11V、14P、45R、74S、83R、96P和108L的组合；
-89L与1E、11V、14P、45R、74S、83R、96P和108L的组合；
-89L与110K或110Q的组合；
-89L与112K或112Q的组合；
-89L与1D、11V、14P、45R、74S、83R、96P、108L和110K或110Q的组合；
-89L与1E、11V、14P、45R、74S、83R、96P、108L和110K或110Q的组合；
-89L与1D、11V、14P、45R、74S、83R、96P、108L和112K或112Q的组合；
-89L与1E、11V、14P、45R、74S、83R、96P、108L和112K或112Q的组合；
-89L与11V和110K或110Q的组合；或
-89L与11V和112K或112Q的组合；
且具有CDR诸如SEQ ID NO：9或48-83或143中阐述的那些(例如根据Abm)且具有与如本文所述的SEQ ID NO：9的氨基酸序列的整体序列同一性程度。
在另一个特定、但非限制性方面，存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂中的CTLA4结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)在所提及的位置(根据Kabat编号)处包含以下突变集合(即与SEQ ID NO：9的序列相比的突变)：
-110K或110Q与11V的组合；
-110K或110Q与1D、11V、14P、45R、74S、83R、89L 96P和108L的组合；
-110K或110Q与1E、11V、14P、45R、74S、83R、89L 96P和108L的组合；
-110K或110Q与89L的组合；或
-110K或110Q与11V和89L的组合；
且具有CDR诸如SEQ ID NO：9或48-83或143中阐述的那些(例如根据Abm)且具有与如本文所述的SEQ ID NO：9的氨基酸序列的整体序列同一性程度。
在另一个特定、但非限制性方面，存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂中的CTLA4结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)在所提及的位置(根据Kabat编号)处包含以下突变集合(即与SEQ ID NO：9的序列相比的突变)：
-112K或112Q与11V的组合；
-112K或112Q与1D、11V、14P、45R、74S、83R、89L 96P和108L的组合；
-112K或112Q与1E、11V、14P、45R、74S、83R、89L 96P和108L的组合；
-112K或112Q与89L的组合；或
-112K或112Q与11V和89L的组合；
且具有CDR诸如SEQ ID NO：9或48-83或143中阐述的那些(例如根据Abm)且具有与如本文所述的SEQ ID NO：9的氨基酸序列的整体序列同一性程度。
在另一个方面，存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂中的CTLA4结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)在位置89处包含T或L(例如，1D或1E、11V、14P、45R、74S、83R、89L、96P和108L)且具有CDR诸如SEQ ID NO：9或48-83或143中阐述的那些(例如，根据Abm)且具有与如本文所述的SEQ ID NO：9的氨基酸序列的整体序列同一性程度。
在另一个方面，存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂中的CTLA4结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)包含位置11处的V和位置89处的L(例如，1D或1E、11V、14P、45R、74S、83R、89L、96P和108L)且具有CDR诸如SEQ ID NO：9或48-83或143中阐述的那些(例如根据Abm)且具有与如本文所述的SEQ ID NO：9的氨基酸序列的整体序列同一性程度。
如所提及，根据本文描述的方面，存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂中的CTLA4结合部分优选使得其含有任选的E1D突变、L11V突变、A14P突变、Q45R突变、A74S突变、K83R突变、V89L突变、M96P突变和Q108L突变的合适的组合，且优选Q108L与其它A14P、Q45R、A74S和K83R突变中的任一个的合适的组合，且优选与这些其它突变中的任何两个的组合，更优选与这些突变中的任何三个(诸如与组合A14P、A74S和K83R)，诸如与这些突变中的所有四个的合适的组合(并且再次，当CTLA4结合部分是单价或存在于本发明的化合物或多肽的N端末端时，优选地，还存在E1D突变)(相对于SEQ ID NO：9的氨基酸序列)。此外，位置96(Kabat编号)处的甲硫氨酸残基可以被另一个天然存在的氨基酸残基(诸如Pro)(除了Cys、Asp或Asn以外)置换。
可以存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂中的CTLA4结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)的一些优选、但非限制性实例以SEQ ID NO：50至83和143给出，且本发明的合适地包含这些序列中的一个或多个的PD1/CTLA4结合剂形成本发明的进一步方面。
可以存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂中的CTLA4结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)的实例是SEQ ID NO：62至65和80至83和143的序列。在这些中，SEQ ID NO：64和65尤其适合于存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂的N端末端，且SEQ ID NO：80和81尤其适合于存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂的C端末端。
当CTLA4结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)存在于和/或形成它们存在的PD1/CTLA4结合剂的C端末端时(或当它们另外在此类PD1/CTLA4结合剂中具有“暴露的”C端末端时，其通常意味着ISVD的C端末端不与恒定结构域(诸如CH1结构域域)结合或连接；再次参考WO 2012/175741和PCT/EP2015/60643(WO2015173325))，优选地还具有式(X)n的C端延伸，其中n是1至10，优选1至5，诸如1、2、3、4或5(且优选1或2，诸如1)；且各X是(优选天然存在的)氨基酸残基，其独立地选自天然存在的氨基酸残基(尽管根据一个优选方面，其不包含任何半胱氨酸残基)，且优选独立地选自丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)或异亮氨酸(I)。
根据此类C端延伸X(n)的一些优选、但非限制性实例，X和n可以如本文中关于本发明的PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))进一步描述。
当存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂中的CTLA4结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)在位置110或112处含有突变(任选地与如本文所述的位置11和/或89处的突变组合)(相对于SEQ ID NO：9的氨基酸序列)时，骨架4的5个C端氨基酸残基(从位置109开始)可以如下取代：
(i)如果不存在C端延伸：VTVKS(SEQ ID NO：88)、VTVQS(SEQ ID NO：89)、VKVSS(SEQ ID NO：90)或VQVSS(SEQ ID NO：91)；或
(ii)如果存在C端延伸：VTVKSX(n)(SEQ ID NO：92)、VTVQSX(n)(SEQ ID NO：93)、VKVSSX(n)(SEQ ID NO：94)或VQVSSX(n)(SEQ ID NO：95)，诸如VTVKSA(SEQ ID NO：96)、VTVQSA(SEQ ID NO：97)、VKVSSA(SEQ ID NO：98)或VQVSSA(SEQ ID NO：99)。
当存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂中的CTLA4结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)在位置110或112处不含突变(但仅在如本文所述的位置1、11、14、45、74、83、89、96和/或108处含有突变)时，骨架4的C端氨基酸残基(从位置109开始)将通常为：
(i)当不存在C端延伸时：VTVSS(SEQ ID NO：100)(如SEQ ID NO：2的序列中)；或
(ii)当存在C端延伸时：VTVSSX(n)(SEQ ID NO：101)，诸如VTVSSA(SEQ ID NO：102)。在这些C端序列中，X和n如本文关于C端延伸所定义。
PD1/CTLA4结合剂
如本文进一步描述，本发明提供的PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))包含至少一个(诸如一个或两个)如本文所述的PD1结合部分和至少一个(诸如一个或两个)如本文所述的CTLA4结合部分和任选地，半衰期延长剂，诸如结合血清蛋白(诸如血清白蛋白，例如人类血清白蛋白(HSA))的ISVD(例如ALB11002)。本发明提供了如本文所述的PD1/CTLA4结合剂F023700910、F023700918、F023700920和F023700925。
本发明旨在提供改进的PD1/CTLA4结合剂，具体而言，改进的PD1/CTLA4双特异性ISVD且更具体而言，改进的抗PD1/CTLA4双特异性纳米抗体。本发明的PD1/CTLA4结合剂包括那些，其包括CTLA4结合部分，其包括作为包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的多肽的变体且在位置11、14、45、74、83、89、96、108、110和/或112处突变的多肽(例如SEQ ID NO：143)；和PD1结合部分，其包括作为包含SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列的多肽的变体且在位置1、11、14、52a、73、74、83、89、100a、110和/或112处突变的多肽(例如SEQ ID NO：135、136、137、138、139、140、141或142)。在本发明的一个实施方案中，PD1/CTLA4结合剂包含SEQ ID NO：103-134、146、149、151或153中所述的氨基酸序列。
具体而言，本发明的多肽中存在的PD1结合剂以及本发明的多肽中存在的CTLA4结合剂两者均将包含在位置11、89、110和/或112处的如本文进一步描述(使用Kabat编号)的突变的组合。
在本发明的一个实施方案中，本发明的PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))还包含如本文进一步描述的C端延伸X(n)。如WO 2012/175741中(以及例如WO 2013/024059和PCT/EP2015/060643(WO2015/173325中))所述，C端丙氨酸延长部分可以防止所谓的“预先存在的抗体”(假设为IgG)与位于PD1/CTLA4结合剂(例如ISVD，例如纳米抗体)的C端区的推定表位结合。假设该表位尤其包括C端序列VTVSS(SEQ ID NO：100)的表面暴露的氨基酸残基以及位置14处的氨基酸残基(和在氨基酸序列中紧接着/接近其的氨基酸残基，诸如位置11、13和15)且也可以包含位置83处的氨基酸残基(和在氨基酸序列中紧接着/接近其的氨基酸残基，诸如位置82、82a、82b和84)和/或位置108处的氨基酸残基(和在氨基酸序列中紧接着/接近其的氨基酸残基，诸如位置107)。
然而，尽管这种C端丙氨酸(或通常C端延伸)的存在可以大大地减少(并且在一些情况下，基本上完全防止)可以在来自一系列受试者(健康受试者和患者)的血清中发现的“预先存在的抗体”的结合，已发现来自一些受试者的血清(诸如来自具有一些免疫疾病(诸如SLE)的患者的血清)可以含有可以结合ISVD的C端区(当暴露这种区域时)的预先存在的抗体，甚至当ISVD含有这种C端丙氨酸(或更通常，这种C端延伸)时。再次参考受让人在2015年5月13日申请且名称为“Improved immunoglobulin variable domains”的共同在审的未预先公开的PCT申请PCT/EP2015/060643(WO2015/173325)。
因此，本发明的一个特定目标是提供具有与所谓“预先存在的抗体”且特别是PCT/EP2015/060643(WO2015/173325)中描述的种类的抗体(例如，甚至在C端延伸存在的情况下可以结合ISV的暴露的C端区的那些预先存在的抗体)的低(或减少的)结合的PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))。
根据本发明，该目标通过以下实现：
(i)在本发明的PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))中，存在C端延伸X(n)；以及
(ii)在本发明的PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体)中的一种或多种且优选所有中，在PD1/CTLA4结合剂的位置11、89、110和/或112处存在某些氨基酸残基/突变(相对于上文所述的SEQ ID NO：1、2和9)，所述残基/突变如本文进一步描述。优选地，所述突变存在于至少本发明的PD1/CTLA4结合剂的C端PD1或CTLA4结合部分中，且更优选存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂中的所有结合部分中，即PD1结合部分中和CTLA4结合部分中以及血清白蛋白结合部分(如果存在)中。
表C列出了可存在于本发明的多肽中存在的PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))的位置11、89、110和112处的氨基酸残基的一些优选、但非限制性的可能组合。
表C：SEQ ID NO：1、2和/或9的PD1和CTLA4结合部分中的氨基酸位置11、89、110和112处的突变的可能组合。
Figure BPA0000258853690000861
在本发明的一个实施方案中，结合PD1和/或CTLA4的结合部分包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多个额外突变，例如各自独立地选自取代、插入和缺失。
本发明的PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))中存在的C端延伸可以如WO 2012/175741和PCT/EP2015/60643(WO2015/173325)中所描述，且优选具有式(X)n，其中n是1至10，优选1至5，诸如1、2、3、4或5(且优选1或2，诸如1)；且各X是(优选天然存在的)氨基酸残基，其独立地选自天然存在的氨基酸残基(尽管根据一个优选方面，其不包含任何半胱氨酸残基)，且优选独立地选自丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)或异亮氨酸(I)。
根据此类C端延伸X(n)的一些优选、但非限制性实例，X和n可以如下：
(a)n＝1且X＝Ala；
(b)n＝2且各X＝Ala；
(c)n＝3且各X＝Ala；
(d)n＝2且至少一个X＝Ala(其中剩余氨基酸残基X独立地选自任何天然存在的氨基酸，但优选独立地选自Val、Leu和/或Ile)；
(e)n＝3且至少一个X＝Ala(其中剩余氨基酸残基X独立地选自任何天然存在的氨基酸，但优选独立地选自Val、Leu和/或Ile)；
(f)n＝3且至少两个X＝Ala(其中剩余氨基酸残基X独立地选自任何天然存在的氨基酸，但优选独立地选自Val、Leu和/或Ile)；
(g)n＝1且X＝Gly；
(h)n＝2且各X＝Gly；
(i)n＝3且各X＝Gly；
(j)n＝2且至少一个X＝Gly(其中剩余氨基酸残基X独立地选自任何天然存在的氨基酸，但优选独立地选自Val、Leu和/或Ile)；
(k)n＝3且至少一个X＝Gly(其中剩余氨基酸残基X独立地选自任何天然存在的氨基酸，但优选独立地选自Val、Leu和/或Ile)；
(l)n＝3且至少两个X＝Gly(其中剩余氨基酸残基X独立地选自任何天然存在的氨基酸，但优选独立地选自Val、Leu和/或Ile)；
(m)n＝2且各X＝Ala或Gly；
(n)n＝3且各X＝Ala或Gly；
(o)n＝3且至少一个X＝Ala或Gly(其中剩余氨基酸残基X独立地选自任何天然存在的氨基酸，但优选独立地选自Val、Leu和/或Ile)；或
(p)n＝3且至少两个X＝Ala或Gly(其中剩余氨基酸残基X独立地选自任何天然存在的氨基酸，但优选独立地选自Val、Leu和/或Ile)；
其中优选方面(a)、(b)、(c)、(g)、(h)、(i)、(m)和(n)，优选其中n＝1或2的方面且优选其中n＝1的方面。
还应注意，优选地，本发明的PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))中存在的任何C端延伸不含有(游离)半胱氨酸残基(除非所述半胱氨酸残基用于或意欲用于进一步官能化，例如用于PEG化)。
可用的C端延伸的一些特定、但非限制性实例是以下氨基酸序列：A、AA、AAA、G、GG、GGG、AG、GA、AAG、AGG、AGA、GGA、GAA或GAG。
在本发明的一个实施方案中，本发明的PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))还在位置1处包含天冬氨酸残基(D)(即在多肽的N端处的第一氨基酸残基优选为D)。
在本发明的一个实施方案中，半衰期延长剂是结合血清蛋白(诸如血清白蛋白，例如人血清白蛋白(HSA))的ISVD(例如纳米抗体)。具体而言，这种结合血清白蛋白的ISVD或纳米抗体可以是如例如EP 2 139 918、WO 2011/006915、WO 2012/175400、WO 2014/111550中所述的针对人血清白蛋白的(单)结构域抗体或dAb，且可以具体而言是如WO 2004/041865、WO 2006/122787、WO 2012/175400或PCT/EP2015/060643(WO2015/173325)中所述的结合血清白蛋白的纳米抗体。优选的结合血清白蛋白的ISVD是纳米抗体Alb-1(参见WO2006/122787)或其人源化变体(诸如Alb-8(WO 2006/122787，SEQ ID NO：62)、Alb-23(WO2012/175400，SEQ ID NO：1))和Alb-1的其它人源化(且优选还序列优化的)变体和/或Alb-8或Alb-23的变体(或更通常具有与Alb-1、Alb-8和Alb-23基本上相同的CDR的ISVD)。可存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂中的一些优选但非限制性血清白蛋白结合剂的氨基酸序列在图5中作为SEQ ID NO：84和85给出。在本发明的一个实施方案中，结合HSA的ISVD是ALB11002。
当存在时，这种结合血清白蛋白的ISVD可以在其序列内含有一种或多种减少预先存在的抗体的结合的骨架突变。具体而言，当这种结合血清白蛋白的ISVD是纳米抗体或作为VH结构域、基本上由VH结构域组成和/或衍生自VH结构域的(单)结构域抗体时，结合血清白蛋白的ISVD可以含有如PCT/EP2015/060643(WO2015/173325)中所描述和/或基本上如本文关于存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))中的CTLA4和PD1结合部分所述的在位置11、89、110和/或112处的氨基酸残基/突变(其合适的组合)。例如，PCT/EP2015/060643(WO2015/173325)描述了许多Alb-1、Alb-8和Alb-23变体，其含有在位置11、89、110和/或112处的减少预先存在抗体的结合且可以在本发明的化合物中使用的氨基酸残基/突变。
当这种结合血清白蛋白的ISVD存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))的C端末端时，在本发明的一个实施方案中，结合血清白蛋白的ISVD(且因此，本发明的化合物)具有C端延伸X(n)，所述C端延伸可以如本文关于存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂中的PD1或CTLA4结合部分所述和/或如WO 2012/175741或PCT/EP2015/060643(WO2015/173325)中所述。在本发明的一个实施方案中，其还具有减少预先存在抗体的结合的突变，如PCT/EP2015/060643(WO2015/173325)中描述的在位置11、89、110和/或112处的氨基酸残基/突变(其合适的组合)。
尽管存在/使用结合血清白蛋白的ISVD是提供具有增加的半衰期的本发明的PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))的优选方式，其它增加本发明的PD1/CTLA4结合剂的半衰期的方式(诸如使用其它结合血清白蛋白的结合结构域、使用结合其它血清蛋白(诸如转铁蛋白或IgG)的ISVD、PEG化、融合至人白蛋白(例如HSA)或其合适的片段或使用合适的血清白蛋白结合肽)也包括于本发明的范围中。
因此，在一个进一步方面，本发明涉及包含至少一个(诸如一个或两个)如本文所述的PD1结合部分和至少一个(诸如一个或两个)如本文所述的CTLA4结合部分和任选地，一个或多个(诸如一个或两个)半衰期延长剂(诸如一个或两个结合血清蛋白(诸如血清白蛋白，例如HSA)的ISVD(例如ALB11002))的PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))，其中所述PD1/CTLA4结合剂具有在人受试者中至少1天、优选至少3天、更优选至少7天(诸如至少10天)的半衰期(如本文所定义)。
如所提及，本发明的PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))优选还具有增加的半衰期(如本文所定义)，其通常意味着多肽具有为本发明的多肽中存在的单价PD1结合剂的半衰期的至少2倍、优选至少5倍、例如至少10倍或大于20倍的半衰期(如本文所定义)以及为本发明的PD1/CTLA4结合剂中的单价CTLA4结合部分的半衰期的至少2倍、优选至少5倍、例如至少10倍或大于20倍的半衰期(如本文所定义)(如在人和/或合适的动物模型，诸如小鼠或食蟹猴中所测量)。
在本发明的一个实施方案中，所述半衰期延长剂是结合人血清白蛋白的ISVD(例如纳米抗体)，例如ALB11002，下面概述于表D或图5中。
表D.人血清白蛋白(HSA)结合剂ALB11002
Figure BPA0000258853690000901
*CDR加下划线和/或粗体。任选地，ALB11002缺乏C端丙氨酸。任选地，HSA结合剂包含在SEQ ID NO：144中所述但包含11L和/或93V的氨基酸序列，例如，
Figure BPA0000258853690000911
在本发明的一个实施方案中，半衰期延长剂是包含以下的HSA ISVD(例如纳米抗体)：
-包含氨基酸序列GFTFSSFGMS(SEQ ID NO：199)或SFGMS(SEQ ID NO：199的氨基酸6-10)的CDR1；和
-包含氨基酸序列SISGSGSDTL(SEQ ID NO：200)或SISGSGSDTL(SEQ ID NO：200的氨基酸1-10)的CDR2；和
-包含氨基酸序列GGSLSR(SEQ ID NO：201)的CDR3；
且，任选地，具有：
-与SEQ ID NO：84、85或144的氨基酸序列的至少85％、优选至少90％、更优选至少95％的序列同一性程度(其中对于测定序列同一性程度，不考虑任何可以存在的C端延伸以及CDR)；
和/或
-不超过7个，诸如不超过5个，优选不超过3个，诸如仅3、2或1个与SEQ ID NO：84、85或144的氨基酸序列的“氨基酸差异”(其中所述氨基酸差异，如果存在，可以存在于骨架和/或CDR中，但优选仅存在于骨架中且不存在于CDR中)；
且任选地具有：
-C端延伸(X)n，其中n是1至10，优选1至5，诸如1、2、3、4或5(且优选1或2，诸如1)；且各X是独立地选择的(优选天然存在的)氨基酸残基，且优选独立地选自丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)或异亮氨酸(I)。
在本发明的PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))中，PD1结合部分、CTLA4结合部分(和血清白蛋白结合ISV，如果存在)可以与彼此直接连接或经由一个或多个合适的接头连接。一些优选但非限制性接头是9GS、15GS或35GS接头(9、15或35个G和S氨基酸的任何组合，诸如，例如，GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS)(SEQ ID NO：86)。在本发明的一个实施方案中，所述接头是(GGGGS)n(SEQ ID NO：180)，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
本发明包括本发明的PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))，其除了一个或多个PD1结合部分、一个或多个CTLA4结合部分和任选的血清白蛋白结合ISVD(如果存在)以外，可以含有一个或多个其它氨基酸序列、化学实体或部分。这些其它氨基酸序列、化学实体或部分可以为本发明的(所得)PD1/CTLA4结合剂赋予一种或多种期望特性和/或可以以期望方式改变本发明的(所得)PD1/CTLA4结合剂的特性，例如以便为本发明的(所得)PD1/CTLA4结合剂提供期望生物和/或治疗活性(例如以与PD1和CTLA4相比，为所得本发明的化合物提供针对另一种治疗相关靶标的亲和力且优选功效，使得就PD1、CTLA4和该其它治疗相关靶标而言，所得化合物变为“三特异性”，以改变或改善药代动力学和/或药效动力学特性，以将本发明的PD1/CTLA4结合剂靶向至特定细胞、组织或器官(包括癌细胞和癌组织)，以提供细胞毒性效果和/或充当可检测标签或标记。此类其它氨基酸序列、化学实体或部分的一些非限制性实例是：
-一个或多个针对除了PD1和CTLA4以外的治疗相关靶标的结合结构域或结合单元(即以便提供本发明的对PD1、CTLA4和其它治疗相关靶标(例如CD27、LAG3、BTLA、TIM3、ICOS、B7-H3、B7-H4、CD137、GITR、PD-L1、PD-L2、ILT1、ILT2 CEACAM1、CEACAM5、TIM3、TIGIT、VISTA、ILT3、ILT4、ILT5、ILT6、ILT7、ILT8、CD40、OX40、CD137、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3、NKG2A、NKG2C、NKG2E、IL-10、IL-17或TSLP)三特异性的PD1/CTLA4结合剂)；和/或
-一个或多个将本发明的PD1/CTLA4结合剂靶向至期望细胞、组织或器官(诸如癌细胞)的结合结构域或结合单元；和/或
-一个或多个提供针对PD1的增加的特异性的结合结构域或结合单元(通常，这些将能够结合PD1但将通常自身基本上针对PD1无功能性)；和/或
-一个或多个提供针对CTLA4的增加的特异性的结合结构域或结合单元(通常，这些将能够结合CTLA4但将通常自身基本上针对CTLA4无功能性)；和/或
-允许本发明的PD1/CTLA4结合剂内化至(期望)细胞中的结合结构域、结合单元或其它化学实体(例如，如WO 2005/044858中所述的内化抗EGFR纳米抗体)；和/或
-有效载荷，诸如细胞毒性有效载荷；和/或
-可检测标签或标记，诸如放射性标记或荧光标记；和/或
-可帮助本发明的PD1/CTLA4结合剂的固定化、检测和/或纯化的标签，诸如HIS或FLAG3标签；和/或
-可官能化的标签，诸如C端GGC或GGGC标签。
本发明的范围包括本发明的PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))也可含有(优选人)常规抗体的一个或多个部分或片段(诸如Fc部分或其功能片段或一个或多个恒定结构域)和/或骆驼仅重链抗体的一个或多个部分或片段(诸如一个或多个恒定结构域)。
当本发明的PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))含有一个或多个其它结合结构域或结合单元(例如如先前段落中所述)时，这些其它结合结构域或结合单元优选包含一种或多种ISVD，且更优选所有ISVD。例如且非限制性地，这一个或多个其它结合结构域或结合单元可以是一种或多种纳米抗体(包括VHH、人源化VHH和/或骆驼化VH，诸如骆驼化人VH)、作为VH结构域或衍生自VH结构域的(单结构域)抗体、作为VH结构域或基本上由VH结构域组成或衍生自VH结构域的dAb或甚至作为VL结构域或基本上由VL结构域组成的(单)结构域抗体或dAb。具体而言，当存在时，这一个或多个结合结构域或结合单元可包含一种或多种纳米抗体，且更具体而言都是纳米抗体。
当本发明的PD1/CTLA4结合剂在其C端末端具有ISVD(所述C端结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)可以是PD1结合部分、CTLA4结合部分、人血清白蛋白结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体，例如ABL1002)或另一种如先前段落中所提及的ISVD)时，则本发明的PD1/CTLA4结合剂(即所述C端ISVD)优选具有如本文所述的C端延伸X(n)。
当本发明的PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))除了一个或多个PD1结合部分、一个或多个CTLA4结合部分和结合血清白蛋白的结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)(如果存在)以外，含有任何其它结合部分(例如ISVD)(如先前段落中所提及)时，且当此类其它ISVD是纳米抗体或者是作为VH序列、基本上由VH序列组成和/或衍生自VH序列的ISVD时，则根据本发明的一优选方面，存在于本发明的PD1/CTLA4结合剂中的此类ISVD中的所述一种或多种(且优选所有)将在其序列内含有一种或多种减少预先存在抗体的结合的骨架突变。具体而言，根据本发明的该方面，此类其它ISVD可以含有如PCT/EP2015/060643(WO2015/173325)中所述和/或基本上如本文关于PD1结合部分和CTLA4结合部分所述的在位置11、89、110和/或112处的氨基酸残基/突变(其合适的组合)。在一个特定方面，当本发明的多肽在其C端末端具有ISVD(所述C端ISVD可以是PD1结合剂、CTLA4结合部分、结合血清白蛋白的部分(例如ISVD)或如在先前段落中所提及的另一种ISVD)时，则至少存在于和/或形成C端的所述ISVD具有减少预先存在抗体的结合的此类骨架突变(且所述C端ISVD将优选还具有如本文所述的C端延伸X(n))。
在另一个方面，本发明涉及包含至少一个PD1结合部分(例如ISVD)和至少一个CTLA4结合部分(例如ISVD)的PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVDs(例如纳米抗体))(所述PD1/CTLA4结合剂如本文进一步描述)，其中PD1结合部分(例如ISVD)选自SEQ ID NO：16至47和135-142且其中CTLA4结合部分(例如ISVD)选自SEQ ID NO：50至83、143和196。
在另一个方面，本发明涉及包含至少一个PD1结合部分(例如ISVD)和至少一个CTLA4结合部分(例如ISVD)的PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVDs(例如纳米抗体))(所述PD1/CTLA4结合剂如本文进一步描述)，其中PD1结合部分(例如ISVD)选自SEQ ID NO：30、31、46、47和135且其中CTLA4结合部分(例如ISVD)选自SEQ ID NO：62至65和/或80至83和/或143。
再次，所有这些PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVDs(例如纳米抗体))优选含有C端延伸X(n)(如本文所述)和位置1的D，且如本文进一步描述，可以含有结合血清白蛋白的部分(例如ISVD)。
将从本文的公开内容清楚的是，本发明的PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))包含至少两个结合部分(例如ISVD，诸如纳米抗体)(即至少二价)且至少针对PD1和CTLA4(即至少双特异性)。PD1/CTLA4结合剂可以进一步具有不同“形式”，即基本上是二价、三价或多价，可以是双特异性、三特异性或多特异性，且可以相对于PD1和/或CTLA4是双互补位的(如本文和例如WO 2009/068625中所定义)。例如且非限制性地，本发明的PD1/CTLA4结合剂可以：
-基本上由一个PD1结合部分(如本文所述)和一个CTLA结合部分(如本文所述)组成；
-基本上由两个PD1结合部分(如本文所述)和一个CTLA结合部分(如本文所述)组成；
-基本上由一个PD1结合部分(如本文所述)和两个CTLA结合部分(如本文所述)组成；
-基本上由两个PD1结合部分(如本文所述)和两个CTLA结合部分(如本文所述)组成；
-基本上由一个PD1结合部分(如本文所述)、一个CTLA结合部分(如本文所述)和一个针对人血清白蛋白的结合部分(例如ISVD)(如本文所述)组成；
-基本上由两个PD1结合部分(如本文所述)、一个CTLA结合部分(如本文所述)和一个针对人血清白蛋白的ISVD结合部分(例如ISVD)(如本文所述)组成；
-基本上由一个PD1结合部分(如本文所述)、两个CTLA结合部分(如本文所述)和一个针对人血清白蛋白的结合部分(例如ISVD)(如本文所述)组成；
-基本上由两个PD1结合部分(如本文所述)、两个CTLA结合部分(如本文所述)和一个针对人血清白蛋白的结合部分(例如ISVD)(如本文所述)组成；
-基本上由一个PD1结合部分(如本文所述)、一个CTLA结合部分(如本文所述)和一个进一步针对PD1的结合部分(例如ISVD)(就PD1而言，其可以有功能或可以没有功能)组成；
-基本上由一个PD1结合部分(如本文所述)、一个CTLA结合部分(如本文所述)和一个进一步针对CTLA4的结合部分(例如ISVD)(就CTLA4而言，其可以有功能或可以没有功能)组成；
-基本上由一个PD1结合部分(如本文所述)、一个CTLA结合部分(如本文所述)、一个进一步针对PD1的结合部分(例如ISVD)(就PD1而言，其可以有功能或可以没有功能)和一个针对人血清白蛋白的结合部分(例如ISVD)(如本文所述)组成；或
-基本上由一个PD1结合部分(如本文所述)、一个CTLA结合部分(如本文所述)、一个进一步针对CTLA4的结合部分(例如ISVD)(就CTLA4而言，其可以有功能或可以没有功能)和一个针对人血清白蛋白的结合部分(例如ISVD)(如本文所述)组成。
本发明的PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))的其它合适形式将是技术人员基于本文的公开内容清楚的。
如技术人员将清楚，当本发明的PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))意欲用于局部用途(即皮肤上或眼睛中)或例如意欲在例如胃肠道中(即在经口施用或通过栓剂施用之后)或在肺中(即在通过吸入施用之后)某处具有(局部)治疗作用或另外意欲直接施用至其预期作用位置(例如，通过直接注射)时，本发明的PD1/CTLA4结合剂将通常不需要半衰期延长。在这些情况下，可以优选使用无半衰期延长的本发明的二价双特异性PD1/CTLA4结合剂或本发明的另一种PD1/CTLA4结合剂。
无半衰期延长的本发明的多肽的一些优选、但非限制性实例示意性表示在下表C-1中，且这些中的每一种形成本发明的一个进一步方面。本发明的无半衰期延长的合适多肽的其它实例将是技术人员基于本文的公开内容清楚的。再次，这些多肽优选在位置1处具有D。
表C-1.本发明的无半衰期延长ISVD的CTLA4/PD1结合剂的示意性代表。
Figure BPA0000258853690000971
Figure BPA0000258853690000981
如技术人员将清楚，当本发明的PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))意欲用于全身性施用和/或预防和/或用于治疗慢性疾病或病症时，将通常优选本发明的所述PD1/CTLA4结合剂具有增加的半衰期(如本文所定义)，即与本发明的这种PD1/CTLA4结合剂中存在的CTLA4和PD1结合部分相比。更优选地，本发明的这种PD1/CTLA4结合剂将含有延长半衰期的结合部分，诸如优选地，结合人血清白蛋白的ISVD且特别是详言之纳米抗体(如本文所述)。
本发明的此类PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))的一些优选、但非限制性实例示意性地表示在下表C-2中，且这些各自形成本发明的另一个方面。本发明的具有半衰期延长的合适PD1/CTLA4结合剂的其它实例将是技术人员基于本文的公开内容清楚的。通常，对于本发明的具有半衰期延长的PD1/CTLA4结合剂，存在C端延伸优选得多。再次，这些多肽优选在位置1处具有D。
表C-2.本发明的具有半衰期延长部分的CTLA4/PD1结合剂的示意性代表。
Figure BPA0000258853690000991
在本发明的一个实施方案中，所述PD1/CTLA4结合剂包含以下结构：
·[PD1结合部分]-[PD1结合部分]-[CTLA4结合部分]-[CTLA4结合部分]-[白蛋白结合部分]；
·[CTLA4结合部分]-[CTLA4结合部分]-[PD1结合部分]-[PD1结合部分]-[白蛋白结合部分]；
·[PD1结合部分]-[CTLA4结合部分]-[白蛋白结合部分]；
·[CTLA4结合部分]-[PD1结合部分]-[白蛋白结合部分]；
·[PD1结合部分]-[CTLA4结合部分]-[CTLA4结合部分]-[白蛋白结合部分]；
·[CTLA4结合部分]-[CTLA4结合部分]-[PD1结合部分]-[白蛋白结合部分]；
·[PD1结合部分]-[PD1结合部分]-[CTLA4结合部分]-[白蛋白结合部分]；或
·[CTLA4结合部分]-[PD1结合部分]-[PD1结合部分]-[白蛋白结合部分]；
各自任选地，包括C端丙氨酸。
本发明的PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))的一些优选、但非限制性实例在图6或SEQ ID NO：103-134、146、149、151或153中给出。
在本发明的一个实施方案中，本发明的PD1/CTLA4结合剂是如下F023700910、F023700918、F023700920或F023700925。
F023700910可以由包含以下核苷酸序列的多核苷酸编码：
Figure BPA0000258853690001001
Figure BPA0000258853690001011
Figure BPA0000258853690001021
F023700910包含氨基酸序列：
Figure BPA0000258853690001022
Figure BPA0000258853690001031
(SEQ ID NO：146)；其任选地包含信号肽，诸如
Figure BPA0000258853690001032
F023700910包含以下部分：
·PD1结合剂102C12(E1D、L11V、A14P、A74S、K83R、I89L)；
·肽接头；
·CTLA4结合剂11F01(L11V、A14P、Q45R、A74S、K83R、V89L、M96P、Q108L)；
·肽接头；
·人血清白蛋白结合剂ALB11002；
·C端延长剂丙氨酸。
例如：
·PD1结合剂SEQ ID NO：135；
·35GS接头SEQ ID NO：86；
·CTLA4结合剂SEQ ID NO：143(任选地，D1E)；
·35GS接头SEQ ID NO：86；
·HSA结合剂SEQ ID NO：144；
·丙氨酸。
F023700918可以由包含以下核苷酸序列的多核苷酸编码：
Figure BPA0000258853690001033
Figure BPA0000258853690001041
Figure BPA0000258853690001051
Figure BPA0000258853690001061
F023700918包含氨基酸序列：
Figure BPA0000258853690001062
Figure BPA0000258853690001071
其任选地包含信号肽，诸如
Figure BPA0000258853690001072
F023700918包含以下部分：
·PD1结合剂102C12(E1D、L11V、A14P、A74S、K83R、I89L)；
·肽接头；
·PD1结合剂102C12(L11V、A14P、A74S、K83R、I89L)；
·肽接头；
·CTLA4结合剂11F01(L11V、A14P、Q45R、A74S、K83R、V89L、M96P、Q108L)；
·肽接头；
·人血清白蛋白结合剂ALB11002；
·C端延长剂丙氨酸。
例如：
·PD1结合剂SEQ ID NO：135(任选地，D1E)；
·35GS接头SEQ ID NO：86；
·PD1结合剂SEQ ID NO：135(任选地，D1E)；
·35GS接头SEQ ID NO：86；
·CTLA4结合剂SEQ ID NO：143(任选地，D1E)；
·35GS接头SEQ ID NO：86；
·HSA结合剂SEQ ID NO：144；
·丙氨酸。
F023700920可以由包含以下核苷酸序列的多核苷酸编码：
Figure BPA0000258853690001073
Figure BPA0000258853690001081
Figure BPA0000258853690001091
Figure BPA0000258853690001101
F023700920包含氨基酸序列：
Figure BPA0000258853690001111
其任选地包含信号肽，诸如
Figure BPA0000258853690001112
F023700920包含以下部分：
·PD1结合剂102C12(E1D、L11V、A14P、A74S、K83R、I89L)；
·肽接头；
·CTLA4结合剂11F01(L11V、A14P、Q45R、A74S、K83R、V89L、M96P、Q108L)；
·肽接头；
·CTLA4结合剂11F01(L11V、A14P、Q45R、A74S、K83R、V89L、M96P、Q108L)；
·肽接头；
·人血清白蛋白结合剂ALB11002；
·C端延长剂丙氨酸
例如：
·PD1结合剂SEQ ID NO：135；
·35GS接头SEQ ID NO：86；
·CTLA4结合剂SEQ ID NO：143(任选地，D1E)；
·35GS接头SEQ ID NO：86；
·CTLA4结合剂SEQ ID NO：143(任选地，D1E)；
·35GS接头SEQ ID NO：86；
·HSA结合剂SEQ ID NO：144；
·丙氨酸。
F023700925可以由包含以下核苷酸序列的多核苷酸编码：
Figure BPA0000258853690001121
Figure BPA0000258853690001131
Figure BPA0000258853690001141
Figure BPA0000258853690001151
F023700925包含氨基酸序列：
Figure BPA0000258853690001152
Figure BPA0000258853690001161
其任选地包含信号肽，诸如
Figure BPA0000258853690001162
F023700925包含以下部分：
·PD1结合剂102C12(E1D、L11V、A14P、A74S、K83R、I89L)；
·肽接头；
·PD1结合剂102C12(L11V、A14P、A74S、K83R、I89L)；
·肽接头；
·CTLA4结合剂11F01(L11V、A14P、Q45R、A74S、K83R、V89L、M96P、Q108L)；
·肽接头；
·CTLA4结合剂11F01(L11V、A14P、Q45R、A74S、K83R、V89L、M96P、Q108L)；
·肽接头；
·人血清白蛋白结合剂ALB11002；
·C端延长剂丙氨酸。
例如：
·PD1结合剂SEQ ID NO：135；
·35GS接头SEQ ID NO：86；
·PD1结合剂SEQ ID NO：135(任选地，D1E)；
·35GS接头SEQ ID NO：86；
·CTLA4结合剂SEQ ID NO：143(任选地，D1E)；
·35GS接头SEQ ID NO：86；
·CTLA4结合剂SEQ ID NO：143(任选地，D1E)；
·35GS接头SEQ ID NO：86；
·HSA结合剂SEQ ID NO：144；
·丙氨酸。
本发明包括任何包含F023700910、F023700918、F023700920或F023700925的PD1、CTLA4和HSA结合部分的结合剂。
本发明包括这样的实施方案，其中相对于SEQ ID NO：146、149、151或153中阐述的序列，本发明的PD1/CTLA4结合剂包含0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代(例如保守性氨基酸取代)和/或包含80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，例如，其中具有此类取代和/或序列同一性的PD1/CTLA4结合剂保留结合PD1和CTLA4的能力。在本发明的一个实施方案中，本发明的PD1/CTLA4结合剂的第一个氨基酸是E。在本发明的一个实施方案中，本发明的PD1/CTLA4结合剂的第一个氨基酸是D。
本发明还提供了注射装置，其包含本文所述的PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))、多肽或多核苷酸或其药物组合物中的任一种。注射装置是经由胃肠外途径(例如，肌肉内、皮下或静脉内)将物质引入患者体内的装置。例如，注射装置可以是注射器(例如，预填充了药物组合物，诸如自动注射器)，其例如包括用于容纳待注射的流体(例如，包含所述PD1/CTLA4结合剂或其药物组合物)的筒或桶，用于刺穿皮肤和/或血管以注射所述流体的针头；和用于将所述流体推出所述筒并穿过所述针头腔的柱塞。在本发明的一个实施方案中，包含PD1/CTLA4结合剂或其药物组合物的注射装置是静脉内(IV)注射装置。这种装置包括在插管或套针/针头中的所述PD1/CTLA4结合剂或其药物组合物，所述插管或套针/针头可以连接至管，所述管可以连接至用于容纳流体(例如，盐水；或含乳酸盐的林格溶液，其包含NaCl、乳酸钠、KCl、CaCl2且任选地包括葡萄糖)的袋或蓄池，所述流体通过所述插管或套针/针头引入受试者体内。在本发明的一个实施方案中，一旦将所述套针和插管插入受试者的静脉中并将所述套针从插入的插管取出，可以将所述PD1/CTLA4结合剂或其药物组合物引入所述装置中。例如，可以将IV装置插入周围静脉(例如，在手或臂中)；上腔静脉或下腔静脉，或在心脏的右心房内(例如，中枢IV)；或插入锁骨下、颈内静脉或股静脉，且，例如，朝向心脏前进直到它到达上腔静脉或右心房(例如，中央静脉系)。在本发明的一个实施方案中，注射装置是自动注射器；喷射注射器或外部输液泵。喷射注射器使用液体的高压狭窄喷射，其穿透表皮以将所述PD1/CTLA4结合剂或其药物组合物引入患者的身体。外部输液泵是将所述PD1/CTLA4结合剂或其药物组合物以受控的量递送进患者的身体的医疗装置。外部输液泵可以由电或机械提供动力。不同的泵以不同的方式操作，例如，注射泵将流体容纳在注射器的蓄池中，且可移动的活塞控制流体递送，弹性体泵将流体容纳在有弹性的囊蓄池中，且来自所述囊的弹性壁的压力驱动流体递送。在蠕动泵中，一组滚子沿着柔性管道的长度向下挤压，从而向前推动流体。在多通道泵中，可以以多个速率从多个蓄池递送流体。
表位结合和交叉阻断
本发明提供本发明的PD1/CTLA4结合剂(例如F023700910、F023700918、F023700920或F023700925)以及结合此类结合剂的相同PD1和/或CTLA4表位的结合剂(例如ISVD(例如纳米抗体))和抗体和其抗原结合片段。例如，本发明包括通过接触与F023700912(SEQ ID NO：193)相同的残基结合人类CTLA4或接触与其CTLA4结合部分(11F01(E1D、L11V、A14P、Q45R、A74S、K83R、V89L、M96P、Q108L))相同的残基的结合剂。例如，本发明提供了在人CTLA4的残基VRVTVL(SEQ ID NO：195的残基33-38)、ADSQVTEVC(SEQ ID NO：195的残基41-49)和/或CKVELMYPPPYYLG(SEQ ID NO：195的残基93-106)(例如所有三个位点)处结合人CTLA4的结合剂。在本发明的一个实施方案中，所述结合剂在氢-氘交换测定中表明在这些残基处的与人CTLA4的结合，例如防止残基在氘(诸如D2O)存在的情况下用氢交换氘，例如如由基本上如图17中所述的结合热图所示。
本发明还提供了能够交叉阻断本文公开的结合剂(例如F023700910、F023700918、F023700920或F023700925)中的任一种的结合的交叉阻断结合剂。此类交叉阻断结合剂可以是任何表现出此类交叉阻断的分子，例如ISVD、纳米抗体、抗体或其抗原结合片段。
通常，“交叉阻断”参考结合剂或与参考结合剂“交叉竞争”的结合剂(例如ISVD，诸如纳米抗体)或抗体或其抗原结合片段(例如F023700910、F023700918、F023700920或F023700925))是指在交叉阻断测定中将参考结合剂与其抗原的结合阻断50％或更多的结合剂(例如ISVD，诸如纳米抗体)或抗体或其抗原结合片段，且相反，参考结合剂在交叉阻断测定中将结合剂(例如ISVD，诸如纳米抗体)或抗体或其抗原结合片段与其抗原的结合阻断50％或更多。交叉阻断可以使用本领域中已知的任何测定(包括表面等离振子共振(SPR)、ELISA和流式细胞术)测定。
在本发明的一个实施方案中，交叉阻断通过使用Biacore测定法测定。为了方便起见，参考两种结合剂，本发明的范围包括交叉阻断本发明的结合剂的抗体和其抗原结合片段，例如Fab片段。根据制造商的推荐操作Biacore机器(例如Biacore 3000)。
因此，在一个交叉阻断测定中，使用标准胺偶联化学法将PD1或CTLA4偶联至CM5Biacore芯片以生成PD1或LAG3包被的表面。例如，200-800共振单位的PD1或CTLA4将偶联至芯片(或给出结合的可容易测量的水平、但可容易通过使用的测试试剂的浓度饱和的任何量)。
将待评价其彼此交叉阻断的能力的两种结合剂(称为A*和B*)在合适的缓冲液中以结合位点的1∶1摩尔比混合以产生测试混合物。
各结合剂在测试混合物中的浓度应足够高以容易地使在Biacore芯片上捕获的PD1或CTLA4分子上该结合剂的结合位点饱和。混合物中的结合剂在相同摩尔浓度下。
还制备仅含有结合剂A*和仅含有结合剂B*的单独溶液。这些溶液中的结合剂A*和结合剂B*应在相同缓冲液中并在与测试混合物中相同的浓度下。
将测试混合物穿过PD1或CTLA4包被的Biacore芯片并记录总结合量。然后以使得移除结合的结合剂而不损坏芯片结合的PD1或CTLA4的方式处理芯片。在本发明的一个实施方案中，这通过用30mM HCl处理芯片60秒来进行。
然后将仅结合剂A*的溶液穿过PD1或CTLA4包被的表面并记录结合量。再次处理芯片以移除所有结合的结合剂而不损坏芯片结合的PD1或CTLA4。
然后将仅结合剂B*的溶液穿过PD1或CTLA4包被的表面并记录结合量。
接下来计算结合剂A*和结合剂B*的混合物的最大理论结合，并且是当仅穿过PD1或CTLA4表面时各结合剂的结合的总和。如果混合物的实际记录的结合小于该理论最大值，则两种结合剂彼此交叉阻断。
因此，通常，根据本发明的交叉阻断结合剂是这样的结合剂，其将在以上Biacore交叉阻断测定中结合PD1或CTLA4，使得在测定期间和在第二结合剂存在的情况下，记录的结合在组合的两种结合剂的例如最大理论结合的80％和0.1％之间(例如80％至4％)，例如最大理论结合的75％和0.1％之间(例如75％至4％)，例如最大理论结合的70％和0.1％之间(例如70％至4％)(正如上文所定义)。
在本发明的一个实施方案中，ELISA测定用于确定根据本发明的PD1和/或CTLA4结合剂是否交叉阻断或能够交叉阻断。
测定的通用原理是将抗PD1或CTLA4结合剂包被至ELISA板的孔上。以溶液(即不结合至ELISA板)添加过量的第二、潜在交叉阻断的抗PD1或CTLA4结合剂。然后向孔中添加有限量的PD1或CTLA4。包被的结合剂和溶液中的结合剂竞争有限数目的PD1或CTLA4分子的结合。洗涤板以移除尚未由包被的结合剂结合的PD1或CTLA4且还移除第二、溶液相结合剂以及任何在第二、溶液相结合剂和PD1或CTLA4之间形成的复合物。然后使用适当的PD1或CTLA4检测试剂测量结合的PD1或CTLA4的量。能够交叉阻断包被的结合剂的溶液中的结合剂将能够相对于包被的结合剂可以在第二、溶液相结合剂不存在的情况下结合的PD1或CTLA4分子的数目，引起包被的结合剂可以结合的PD1或CTLA4分子的数目减少。
表达方法
本发明包括用于制备本发明的PD1/CTLA4结合剂(例如ISVD，诸如纳米抗体)(例如F023700910、F023700918、F023700920或F023700925)的重组方法，其包括(i)引入编码所述PD1/CTLA4结合剂的氨基酸序列的多核苷酸，例如，其中所述多核苷酸是在载体中和/或可操作连接至启动子；(ii)在有利于多核苷酸的表达的条件下培养宿主细胞(例如，CHO或毕赤酵母属或巴斯德毕赤酵母)，和，(iii)任选地，从所述宿主细胞和/或所述宿主细胞在其中生长的培养基分离PD1/CTLA4结合剂。参见例如，WO 04/041862、WO 2006/122786、WO2008/020079、WO 2008/142164或WO 2009/068627。
本发明还涉及编码本文所述的PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))(例如F023700910、F023700918、F023700920或F023700925)的多核苷酸。在本发明的一个实施方案中，多核苷酸可操作连接至一个或多个控制序列。多核苷酸可以呈质粒或载体的形式。再次，此类多核苷酸可以通常如Ablynx N.V.的公开的专利申请，诸如例如WO 04/041862、WO 2006/122786、WO 2008/020079、WO 2008/142164或WO 2009/068627中所述。
本发明还涉及编码本发明的PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))(例如F023700910、F023700918、F023700920或F023700925)的核苷酸序列或核酸。本发明进一步包括遗传构建体，其包括前述核苷酸序列或核酸和一种或多种本身已知的用于遗传构建体的元件。遗传构建体可以呈质粒或载体的形式。再次，此类构建体可以通常如Ablynx N.V.的公开的专利申请，诸如例如WO 2004/041862、WO 2006/122786、WO2008/020079、WO 2008/142164或WO 2009/068627中所述。
本发明还涉及含有此类核苷酸序列或核酸和/或表达(或能够表达)本发明的PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))(例如F023700910、F023700918、F023700920或F023700925)的宿主或宿主细胞。再次，此类宿主细胞可以通常如Ablynx N.V.的公开的专利申请，诸如WO 2004/041862、WO 2006/122786、WO 2008/020079、WO 2008/142164或WO 2009/068627中所述。
本文所述的PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))(例如F023700910、F023700918、F023700920或F023700925)、多肽、化合物和多核苷酸(例如载体)优选向循环施用。因此，其可以以允许PD1/CTLA4结合剂、多肽、化合物和多核苷酸进入循环的任何合适的方式(诸如静脉内、经由注射或输注)施用，或以允许PD1/CTLA4结合剂、多肽、化合物和多核苷酸进入循环的任何其他合适的方式(包括经口施用、皮下施用、肌肉内施用、通过皮肤施用、鼻内施用、经由肺施用等)施用。合适的施用方法和途径将是技术人员清楚的，同样例如还从Ablynx N.V.的公开的专利申请，诸如WO 04/041862、WO 2006/122786、WO 2008/020079、WO 2008/142164或WO 2009/068627的教导是清楚的。
真核和原核宿主细胞(包括哺乳动物细胞，作为用于表达PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体)(例如F023700910、F023700918、F023700920或F023700925))的宿主)是本领域众所周知的，且包括许多可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)得到的永生化的细胞系。这些尤其包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NSO、SP2细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如，Hep G2)、A549细胞、3T3细胞、HEK-293细胞和许多其它细胞系。哺乳动物宿主细胞包括人、小鼠、大鼠、狗、猴、猪、山羊、牛、马和仓鼠细胞。通过确定哪些细胞系具有高表达水平，选择特别优选的细胞系。可以使用的其它细胞系是昆虫细胞系(例如，草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)或粉纹夜蛾(Trichoplusia ni))、两栖动物细胞、细菌细胞、植物细胞和真菌细胞。真菌细胞包括酵母和丝状真菌细胞，包括，例如，巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)、芬兰毕赤酵母(Pichiafinlandica)、喜海藻糖毕赤酵母(Pichia trehalophila)、Pichia koclamae、膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)、微小毕赤酵母(Pichia minuta)(Ogataea minuta，Pichialindneri)、仙人掌毕赤酵母(Pichia opuntiae)、耐热毕赤酵母(Pichiathermotolerans)、柳毕赤酵母(Pichia salictaria)、栎毕赤酵母(Pichia guercuum)、皮杰普氏毕赤酵母(Pichia pijperi)、具柄毕赤酵母(Pichia stiptis)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、毕赤酵母属种(Pichia sp.)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、酵母属种(Saccharomyces sp.)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、克鲁维酵母属种(Kluyveromyces sp.)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、白色念珠菌(Candida albicans)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、拉氏金孢菌(Chrysosporium lucknowense)、镰孢菌属种(Fusarium sp.)、禾谷镰孢菌(Fusariumgramineum)、镰孢霉(Fusarium venenatum)、小立碗藓(Physcomitrella patens)和粗糙链孢霉(Neurospora crassa)、毕赤酵母属种(Pichia sp.)、任何酵母属种(Saccharomycessp.)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、任何克鲁维酵母属种(Kluyveromycessp.)、白色念珠菌(Candida albicans)、任何曲霉菌属种(Aspergillus sp.)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、拉氏金孢菌(Chrysosporium lucknowense)、任何镰孢菌属种(Fusarium sp.)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)和粗糙链孢霉(Neurosporacrassa)。
此外，使用许多已知技术，可以增强PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))(例如，F023700910、F023700918、F023700920或F023700925)从生产细胞系的表达。例如，谷氨酰胺合成酶基因表达系统(GS系统)是用于增强在特定条件下的表达的常见方案。与欧洲专利号0 216 846、0 256 055和0 323 997和欧洲专利申请号89303964.4关联地完整地或部分地讨论了GS系统。因此，在本发明的一个实施方案中，所述哺乳动物宿主细胞(例如，CHO)缺乏谷氨酰胺合成酶基因，并在没有谷氨酰胺存在下在培养基中生长，然而，其中，编码免疫球蛋白链的多核苷酸包含谷氨酰胺合成酶基因，其补充宿主细胞中该基因的缺乏。
本发明包括用于纯化PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))(例如，F023700910、F023700918、F023700920或F023700925)的方法，其包括将包含所述PD1/CTLA4结合剂的样品(例如，培养基、细胞裂解物或细胞裂解物级分，例如，裂解物的可溶性级分)引入纯化介质(例如，阳离子交换介质、阴离子交换介质、疏水交换介质、亲和纯化介质(例如，蛋白-A、蛋白-G、蛋白-A/G、蛋白-L))，和从不结合所述介质的所述样品的流通级分收集纯化的PD1/CTLA4结合剂；或者，丢弃所述流通级分并从所述介质洗脱结合的PD1/CTLA4结合剂和收集所述洗脱液。在本发明的一个实施方案中，所述介质是在所述样品所应用的柱中。在本发明的一个实施方案中，在宿主细胞中重组表达抗体或片段之后进行所述纯化方法，例如，其中首先裂解所述宿主细胞，并任选地在介质上纯化之前纯化裂解物的不溶物；或其中宿主细胞将PD1/CTLA4结合剂分泌进培养基中并将所述介质或其级分应用于纯化介质。
通常，在特点细胞系或转基因动物中产生的糖蛋白将具有在所述细胞系或转基因动物中产生的糖蛋白所特有的糖基化模式。因此，PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体)(例如F023700910、F023700918、F023700920或F023700925)的特点糖基化模式将取决于用于产生所述PD1/CTLA4结合剂的特定细胞系或转基因动物。仅包含未岩藻糖基化的N-聚糖的PD1/CTLA4结合剂是本发明的一部分，并且可能是有利的，因为未岩藻糖基化的抗体已经被显示通常在体外和在体内表现出比它们的岩藻糖基化的相应物更有效的效力(参见例如，Shinkawa等人，J.Biol.Chem.278：3466-3473(2003)；美国专利号6,946,292和7,214,775)。这些具有未岩藻糖基化的N-聚糖的PD1/CTLA4结合剂不可能是免疫原性的，因为它们的碳水化合物结构是存在于人血清IgG中的群体的正常组分。
本发明包括包含N-连接的聚糖的PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))(例如，F023700910、F023700918、F023700920或F023700925)，所述N-连接的聚糖通常添加至在中国仓鼠卵巢细胞中产生的免疫球蛋白(CHO N-连接的聚糖)或添加至工程改造的酵母细胞(工程改造的酵母N-连接的聚糖)，例如，巴斯德毕赤酵母。例如，在本发明的一个实施方案中，所述PD1/CTLA4结合剂包含在图7中所示的“工程改造的酵母N-连接的聚糖”或“CHO N-连接的聚糖”中的一种或多种(例如，G0和/或G0-F和/或G1和/或G1-F和/或和/或G2-F和/或Man5)。在本发明的一个实施方案中，所述PD1/CTLA4结合剂包含工程改造的酵母N-连接的聚糖，即，G0和/或G1和/或G2，任选地，还包括Man5。在本发明的一个实施方案中，所述PD1/CTLA4结合剂包含CHO N-连接的聚糖，即，G0-F、G1-F和G2-F，任选地，还包括G0和/或G1和/或G2和/或Man5。在本发明的一个实施方案中，在PD1/CTLA4结合剂上的所有N-连接的聚糖的约80％至约95％(例如，约80-90％、约85％、约90％或约95％)是工程改造的酵母N-连接的聚糖或CHO N-连接的聚糖。参见Nett等人.Yeast.28(3)：237-252(2011)；Hamilton等人.Science.313(5792)：1441-1443(2006)；Hamilton等人.CurrOpin Biotechnol.18(5)：387-392(2007)。例如，在本发明的一个实施方案中，工程改造的酵母细胞是GFI5.0或YGLY8316或在美国专利号7,795,002或Zha等人.Methods MolBiol.988：31-43(2013)中所述的菌株。也参见国际专利申请公开号WO2013/066765。
组合
在具体实施方案中，PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))(例如，F023700910、F023700918、F023700920或F023700925)可以单独使用，或与其它另外治疗剂和/或治疗操作组合使用，用于治疗或预防需要这种治疗或预防的受试者中的任何疾病诸如癌症，例如，如本文所讨论。组合物或试剂盒，例如，包含药学上可接受的载体、包含与其它治疗剂组合的此类结合剂的药物组合物也是本发明的一部分。
术语“与......组合”指示，所述组分PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))(例如，F023700910、F023700918、F023700920或F023700925)与另一种药剂诸如派姆单抗或尼鲁单抗一起可以配制成单一组合物(例如，用于同时递送)，或单独配制成两种或更多种组合物(例如，试剂盒)。每种组分可以在施用其它组分时不同的时间施用于受试者；例如，可以在给定时间段内间隔性地非同时地(例如，单独地或依次地)给予每次施用。此外，可以将单独组分通过相同或不同的途径施用于受试者(例如，其中胃肠外地施用本发明的PD1/CTLA4结合剂，且口服施用紫杉醇)。
在具体实施方案中，所述PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))(例如，F023700910、F023700918、F023700920或F023700925)可以与抗癌治疗剂或免疫调节性药物诸如免疫调节性受体抑制剂(例如，特异性结合所述受体的抗体或其抗原结合片段)组合使用。
在本发明的一个实施方案中，PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))(例如，F023700910、F023700918、F023700920或F023700925)与一种或多种抑制剂(例如，小有机分子或抗体或其抗原结合片段)组合，所述抑制剂诸如：MTOR(雷帕霉素的哺乳动物靶标)抑制剂、细胞毒性剂、铂试剂、BRAF抑制剂、CDK4/6抑制剂、EGFR抑制剂、VEGF抑制剂、微管稳定剂、紫杉烷、CD20抑制剂、CD52抑制剂、CD30抑制剂、RANK(核因子κ-B的受体活化剂)抑制剂、RANKL(核因子κ-B配体的受体活化剂)抑制剂、ERK抑制剂、MAP激酶抑制剂、AKT抑制剂、MEK抑制剂、PI3K抑制剂、HER1抑制剂、HER2抑制剂、HER3抑制剂、HER4抑制剂、Bcl2抑制剂、CD22抑制剂、CD79b抑制剂、ErbB2抑制剂或法呢基蛋白转移酶抑制剂。
在本发明的一个实施方案中，PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))(例如，F023700910、F023700918、F023700920或F023700925)与以下中的一种或多种组合：抗CTLA4抗体或其抗原结合片段(例如伊匹单抗)、抗PD1抗体或其抗原结合片段(例如，派姆单抗、尼鲁单抗、CT-011)、抗-PDL1、抗-CTLA4、抗-TIM3、抗-CS1、(例如，依洛珠单抗)、抗-KIR2DL1/2/3(例如，利瑞鲁单抗)、抗-CD27、抗-CD137(例如，乌鲁单抗(urelumab))、抗-GITR(例如，TRX518)、抗-PD-L1(例如，BMS-936559、MSB0010718C或MPDL3280A)、抗-PD-L2、抗-ILT1、抗-ILT2、抗-ILT3、抗-ILT4、抗-ILT5、抗-ILT6、抗-ILT7、抗-ILT8、抗-CD40、抗-OX40、抗-CD137、抗-KIR2DL1、抗-KIR2DL2/3、抗-KIR2DL4、抗-KIR2DL5A、抗-KIR2DL5B、抗-KIR3DL1、抗-KIR3DL2、抗-KIR3DL3、抗-NKG2A、抗-NKG2C、抗-NKG2E或这样的靶标的任何小有机分子抑制剂；IL-10、抗-IL10、抗-TSLP(胸腺间质淋巴细胞生成素)或PEG化的IL-10。
在本发明的一个实施方案中，在PEG化的IL-10分子上的聚乙二醇(PEG)部分的分子量是约12,000道尔顿或约20,000道尔顿。在本发明的一个实施方案中，聚乙二醇化的IL-10(例如，聚乙二醇化的人IL-10)包含一个或多个聚乙二醇分子，所述聚乙二醇分子通过接头(例如，C2-12烷基诸如--CH2CH2CH2--)共价地连接至IL-10的单个亚基的单个氨基酸残基，其中所述氨基酸残基是N-端氨基酸残基的α氨基或赖氨酸残基的ε氨基。在本发明的一个实施方案中，聚乙二醇化的IL-10是：(PEG)b-L-NH-IL-10；其中b是1-9且L是共价地连接至IL-10的单个氨基酸残基的氮(N)的C2-12烷基接头部分。在本发明的一个实施方案中，聚乙二醇化的IL-10的IL-10具有下式：[X--O(CH2CH2O)n]b-L-NH-IL-10，其中X是H或C1-4烷基；n是20-2300；b是1-9；且L是共价地连接至在一个IL-10亚基的氨基端处的α氨基的氮(N)的C1-11烷基接头部分；前提条件是，当b大于1时，n的总和不超过2300。参见US7,052,686。
在本发明的一个实施方案中，所述抗IL-10抗体或其抗原结合片段(例如，人源化抗体)包含下述的CDR：
Figure BPA0000258853690001271
(参见US7,662,379)。
在本发明的一个实施方案中，所述抗TSLP抗体或其抗原结合片段(例如，人源化抗体)包含下述的CDR：
Figure BPA0000258853690001272
(参见WO2008/76321)。
在本发明的一个实施方案中，所述抗CD27抗体或其抗原结合片段(例如，人源化抗体)包含下述的CDR：
Figure BPA0000258853690001273
(参见WO2012/04367)。
因此，本发明包括组合物，其包含与派姆单抗组合的PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))(例如，F023700910、F023700918、F023700920或F023700925)；以及用于治疗或预防受试者中的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用与派姆单抗(例如，以200mg每3周1次施用派姆单抗)组合的有效量的PD1/CTLA4结合剂。任选地，还与另一种其它治疗剂组合地施用于受试者。
在本发明的一个实施方案中，PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))(例如，F023700910、F023700918、F023700920或F023700925)与派姆单抗抗体组合，所述派姆单抗抗体包含含有以下氨基酸序列的免疫球蛋白重链(或其CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)：
Figure BPA0000258853690001281
和含有以下氨基酸序列的免疫球蛋白轻链(或其CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)：
Figure BPA0000258853690001282
在本发明的一个实施方案中，PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))(例如，F023700910、F023700918、F023700920或F023700925)与抗体组合，所述抗体包含含有以下氨基酸序列的免疫球蛋白重链(或其CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)：
Figure BPA0000258853690001283
和含有以下氨基酸序列的免疫球蛋白轻链(或其CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)：
Figure BPA0000258853690001284
在本发明的一个实施方案中，PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))(例如，F023700910、F023700918、F023700920或F023700925)与以下中的任何一种或多种组合：13-顺式-视黄酸、3-[5-(甲基磺酰基哌啶甲基)-吲哚基]-喹诺酮、4-羟基他莫昔芬、5-脱氧尿苷、5′-脱氧-5-氟尿苷、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、7-羟基星形孢菌素、A-443654、醋酸阿比特龙、abraxane、ABT-578、阿考比芬、ADS-100380、阿柏西普、ALT-110、六甲蜜胺、阿米福汀、氨鲁米特、氨柔比星、安吖啶、阿那格雷、阿那曲唑、血管生成抑制因子、AP-23573、ARQ-197、阿佐昔芬、AS-252424、AS-605240、天门冬酰胺酶、ATI3387、AT-9263、阿曲生坦、阿昔替尼、AZD1152、卡介苗(BCG)疫苗、巴他布林、BC-210、besodutox、贝伐珠单抗、BGJ398、比卡鲁胺、Bio111、BIO140、BKM120、博来霉素、BMS-214662、BMS-247550、BMS-275291、BMS-310705、硼替佐米、布舍瑞林、白消安、骨化三醇、喜树碱、卡纽替尼、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、CC8490、CEA(重组牛痘-癌胚抗原疫苗)、西地尼布、CG-1521、CG-781、查米多星、苯丁酸氮芥、氯毒素、西仑吉肽、西咪替丁、顺铂、克拉屈滨、氯膦酸盐、cobimetnib、COL-3、CP-724714、环磷酰胺、环丙孕酮、乙酸环丙孕酮、阿糖胞苷、胞嘧啶阿糖胞苷、达拉菲尼、达卡巴嗪、达西司他、更生霉素、dalotuzumab、达鲁舍替、达沙替尼、道诺霉素、地卡塔尼(decatanib)、鱼藤素、地尼白介素、脱氧助间型霉素、缩酚酸肽、二芳基丙腈、己烯雌酚、diftitox、DNE03、多西他赛、多韦替尼、多柔比星、屈洛昔芬、艾特咔林、钇-90标记的艾多替德、艾多替德、EKB-569、EMD121974、encorafenib、内皮抑素、恩杂鲁胺、恩扎妥林，表柔比星、埃博霉素B、ERA-923、爱必妥、厄洛替尼、雌二醇、雌氮芥、依托泊苷、依维莫司、依西美坦、ficlatuzumab、非那雄胺、夫拉平度、氟尿苷、氟达拉滨、氟氢可的松、氟甲睾酮、氟他胺、FOLFOX方案、氟维司群、galeterone、ganetespib、吉非替尼、吉西他滨、吉马替康、吡喃葡萄糖基脂质A、戈舍瑞林、乙酸戈舍瑞林、棉酚、GSK461364、GSK690693、HMR-3339、己酸羟孕酮、羟基脲、IC87114、伊达比星、idoxyfene、异环磷酰胺、IM862、伊马替尼、IMC-1C11、咪喹莫特、INC280、INCB24360、INO1001、干扰素、白介素-2、白介素-12、伊匹单抗、伊立替康、JNJ-16241199、酮康唑、KRX-0402、拉帕替尼、拉索昔芬、LEE011、来曲唑、亚叶酸、亮丙瑞林、醋酸亮丙瑞林、左旋咪唑、脂质体包覆的紫杉醇、洛莫司汀、氯那法尼、硫蒽酮、LY292223、LY292696、LY293646、LY293684、LY294002、LY317615、LY3009120、马立马司他、氮芥、甲羟孕酮乙酸酯、甲地孕酮乙酸酯、MEK162、美法仑、巯基嘌呤、美司钠、甲氨蝶呤、普卡霉素、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、热杀死的奥布分枝杆菌的混悬液、陶扎色替、MLN8054、癌立消(neovastat)、新伐司他、来那替尼、neuradiab、尼洛替尼、尼鲁米特、诺拉曲塞、NVP-BEZ235、奥利美生、奥曲肽、奥法木单抗、奥戈伏单抗、ornatuzumab、orteronel、奥沙利铂、紫杉醇、帕博西尼、帕米膦酸盐、帕尼单抗、帕唑帕尼、PD0325901、PD184352、PEG-干扰素、培美曲塞、喷司他丁、哌立福新、苯丙氨酸氮芥、PI-103、pictilisib、PIK-75、哌喷昔芬、PKI-166、普卡霉素、聚-ICLC、卟菲尔钠、泼尼松、丙卡巴肼、孕酮、PSK蛋白结合的多糖(源自担子菌纲杂色革盖菌(Basidiomycete杂色革盖菌))、PLX8394、PX-866、R-763、雷洛昔芬、雷替曲塞、雷佐生、地磷莫司、利妥昔单抗、罗米地新、RTA744、鲁比替康、scriptaid、Sdx102、塞利西利、司美替尼、司马沙尼(semaxanib)、SF1126、西罗莫司、SN36093、索拉非尼、螺内酯、角鲨胺、SR13668、链脲菌素、SU6668、辛二酰苯胺异羟肟酸(suberoylanalide hydroxamicacid)、舒尼替尼、合成的雌激素、他仑帕奈、塔利拉维(talimogene laherparepvec)、他莫昔芬、替莫唑胺、坦罗莫司、替尼泊苷、替米利芬、睾酮、粉防己碱、TGX-221、沙利度胺、6-硫鸟嘌呤、噻替派、替西木单抗、替吡法尼、替沃扎尼(tivozanib)、TKI-258、TLK286、TNFα(肿瘤坏死因子α)、拓朴替康、柠檬酸托瑞米芬、曲贝替定、曲美替尼、曲妥珠单抗、维甲酸、曲古抑菌素A、曲西立滨磷酸盐单水合物、双羟萘酸曲普瑞林、TSE-424、尿嘧啶氮芥、丙戊酸、戊柔比星、凡德他尼、瓦他拉尼、VEGF捕获物、威罗菲尼、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、vitaxin、vitespan、伏立诺他(vorinostat)、VX-745、渥曼青霉素、Xr311、结核杆菌的Z-100热水提取物、扎木单抗、ZK186619、ZK-304709、ZM336372或ZSTK474。
在本发明的一个实施方案中，PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))(例如，F023700910、F023700918、F023700920或F023700925)与一种或多种止吐药组合，所述止吐药包括，但不限于：卡索匹坦(GlaxoSmithKline)、奈妥吡坦(Netupitant)(MGI-Helsinn)和其它NK-1受体拮抗剂、帕洛诺司琼(由MGI Pharma作为Aloxi销售)、阿瑞匹坦(由Merck and Co.作为Emend销售；Rahway，NJ)、苯海拉明(由Pfizer作为
Figure BPA0000258853690001311
销售；New York，NY)、安泰乐(由Pfizer作为
Figure BPA0000258853690001312
销售；New York，NY)、甲氧氯普胺(由AH Robins Co.作为
Figure BPA0000258853690001313
销售；Richmond，VA)、劳拉西泮(由Wyeth作为
Figure BPA0000258853690001314
销售；Madison，NJ)、阿普唑仑(由Pfizer作为
Figure BPA0000258853690001315
销售；New York，NY)、氟哌啶醇(由Ortho-McNeil作为
Figure BPA0000258853690001316
销售；Raritan，NJ)、氟哌利多
Figure BPA0000258853690001317
屈大麻酚(由Solvay Pharmaceuticals，Inc.作为
Figure BPA0000258853690001318
销售；Marietta，GA)、地塞米松(由Merck and Co.作为
Figure BPA0000258853690001319
销售；Rahway，NJ)、甲基泼尼龙(由Pfizer作为
Figure BPA00002588536900013110
销售；New York，NY)；丙氯拉嗪(由Glaxosmithkline作为
Figure BPA00002588536900013111
销售；Research Triangle Park，NC)、格拉司琼(由Hoffmann-La RocheInc.作为
Figure BPA00002588536900013112
销售；Nutley，NJ)、昂丹司琼(由Glaxosmithkline作为
Figure BPA00002588536900013113
销售；Research Triangle Park，NC)、多拉司琼(由Sanofi-Aventis作为
Figure BPA00002588536900013114
销售；NewYork，NY)、托烷司琼(由Novartis作为
Figure BPA00002588536900013115
销售；East Hanover，NJ)。
癌症治疗的其它副作用包括红和白血细胞缺乏。因此，在本发明的一个实施方案中，PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))(例如，F023700910、F023700918、F023700920或F023700925)与治疗或预防这种缺乏的药剂(例如，非格司亭、PEG-非格司亭、促红细胞生成素、阿法依泊汀(epoetin alfa)或阿法达贝泊汀(darbepoetin alfa))组合。
在本发明的一个实施方案中，PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))(例如，F023700910、F023700918、F023700920或F023700925)与疫苗组合。在本发明的一个实施方案中，所述疫苗是抗癌疫苗、肽疫苗或DNA疫苗。例如，在本发明的一个实施方案中，所述疫苗是肿瘤细胞(例如，照射的肿瘤细胞)或树突细胞(例如，用肿瘤肽脉冲处理的树突细胞)。
在本发明的一个实施方案中，PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))(例如，F023700910、F023700918、F023700920或F023700925)与治疗程序组合施用。治疗程序是由医师或临床医师在治疗受试者中进行的一个或多个步骤，其意图减轻治疗的受试者中的一种或多种症状(例如，癌症和/或传染性疾病的一种或多种症状)，无论是通过诱导此类症状的消退或消除，还是通过抑制此类症状(例如，癌症症状诸如肿瘤生长或转移)的进展，达到任何临床上可测量的程度。
在本发明的一个实施方案中，治疗程序是抗癌辐射疗法。例如，在本发明的一个实施方案中，所述辐射疗法是外线束疗法(EBT)：一种用于将高能X-射线束递送至肿瘤位置的方法。所述束在患者外产生(例如，由直线加速器)且在肿瘤部位处靶向。这些X-射线可以破坏癌细胞，且小心的治疗计划允许豁免周围的正常组织。在患者体内没有放置放射源。在本发明的一个实施方案中，所述辐射疗法是质子束疗法：一类用质子而不是X-射线轰击患病组织的适形疗法。在本发明的一个实施方案中，所述辐射疗法是适形外线束辐射疗法：一种使用高级技术根据个体的身体结构定制辐射疗法的操作。
在本发明的一个实施方案中，所述辐射疗法是短距离放射治疗：将放射性物质暂时放置在体内，经常用于向一个区域提供额外剂量-或增强剂量-的辐射。
在本发明的一个实施方案中，与PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))组合施用的外科手术是外科手术肿瘤切除术。
治疗用途
本发明包括用于预防和/或治疗至少一种可以通过使用本发明的PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))(例如F023700910、F023700918、F023700920或F023700925)，任选地与另外的治疗剂或治疗程序的组合，来预防或治疗的疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用药学活性量的PD1/CTLA4结合剂和/或包含其的药物组合物。
“治疗(Treat)”或“治疗(treating)”是指将本发明的PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))(例如，F023700910、F023700918、F023700920或F023700925)施用于具有疾病的一种或多种症状的受试者(例如哺乳动物诸如人)，所述PD1/CTLA4结合剂对所述疾病是有效的，例如，在具有癌症或传染性疾病、或者被怀疑具有癌症或传染性疾病的受试者的治疗中，所述药剂对所述癌症或传染性疾病具有治疗活性。通常，以会减轻治疗的受试者或群体中的一种或多种症状(例如，癌症或传染性疾病的一种或多种症状)的“有效量”或“有效剂量”施用所述PD1/CTLA4结合剂，无论是通过诱导此类症状的消退或消除，还是通过抑制此类症状(例如，癌症症状诸如肿瘤生长或转移)的进展，达到任何临床上可测量的程度。所述PD1/CTLA4结合剂的有效量可以随诸如以下的因素变化：患者的疾病阶段、年龄和重量，和药物在受试者中引起期望的应答的能力。
待治疗的受试者可以是任何温血动物，但具体而言为哺乳动物，且更具体而言为人类。如技术人员将清楚，待治疗的受试者将具体而言是患有本文提及的疾病和病症或处于其风险下的受试者。
为了制备本发明的PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))(例如，F023700910、F023700918、F023700920或F023700925)的药物组合物或无菌组合物，将所述PD1/CTLA4结合剂与药学上可接受的载体或赋形剂混合。参见，例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences and U.S.Pharmacopeia：National Formulary，Mack Publishing Company，Easton，PA(1984)。此类组合物是本发明的一部分。
本发明的范围包括干燥的(例如，冷冻干燥的)包含PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))(例如，F023700910、F023700918、F023700920或F023700925)的组合物或其药物组合物，所述药物组合物包括药学上可接受的载体，但是基本上缺乏水。
可以通过与可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合以例如冻干的粉剂、浆、水溶液或混悬液的形式制备治疗剂和诊断剂的制剂(参见，例如，Hardman，等人(2001)Goodman andGilman′s The Pharmacological Basis of Therapeutics，McGraw-Hill，New York，NY；Gennaro(2000)Remington：The Science and Practice of Pharmacy，Lippincott，Williams，and Wilkins，New York，NY；Avis，等人(编)(1993)Pharmaceutical DosageForms：Parenteral Medications，Marcel Dekker，NY；Lieberman，等人(编)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms：Tablets，Marcel Dekker，NY；Lieberman，等人(编)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms：Disperse Systems，Marcel Dekker，NY；Weiner和Kotkoskie(2000)Excipient Toxicity and Safety，Marcel Dekker，Inc.，New York，NY)。
通常，为了预防和/或治疗本文提及的疾病和病症且取决于待治疗的特定疾病或病症、待使用的PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))(例如F023700910、F023700918、F023700920或F023700925)的功效和/或半衰期、使用的特定给药途径和特定药物制剂或组合物，本发明的PD1/CTLA4结合剂将通常以每日每千克体重1克和0.01微克之间，优选每日每千克体重0.1克和0.1微克之间，诸如每日每千克体重约1、10、100或1000微克的量持续(例如通过输注)、作为单一日剂量或作为在一天期间的多个分剂量施用。临床医师将通常能够根据本文提及的因素确定合适的日剂量。还将清楚，在特定情况下，临床医师可以例如基于上文所引用的因素和其专业判断选择偏离这些量。通常，一些关于待施用的量的指南可以获得自经由基本上相同途径施用的针对相同靶标的相当常规抗体或抗体片段通常所施用的量，然而考虑亲和力/亲合力、效力、生物分布、半衰期的差异和技术人员众所周知的类似因素。
向受试者施用PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))(例如，F023700910、F023700918、F023700920或F023700925)的模式可以变化。施用途径包括口服、直肠、透粘膜、肠、胃肠外；肌肉内、皮下、真皮内、骨髓内、鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内、眼内、吸入、吹入法、局部、皮肤、透皮或动脉内。
适当剂量的确定由临床医师做出，例如，使用本领域已知或疑似影响治疗的参数或因素。通常，在确定剂量时，所述剂量开始于稍微小于最适剂量的量，并且它在此后增加小增量，直到与任何负面副作用相比达到期望的或最适的效果。重要的诊断措施包括例如炎症的症状的诊断措施或产生的炎症性细胞因子的水平的诊断措施。通常，合乎需要的是，要使用的生物剂源自与治疗的靶向动物相同的物种，由此使对所述药剂的任何免疫应答最小化。在人受试者的情况下，例如，嵌合抗体、人源化抗体和全人抗体可能是合乎需要的。在选择适当剂量中的指导是可得到的(参见，例如，Wawrzynczak(1996)Antibody Therapy，Bios Scientific Pub.Ltd，Oxfordshire，UK；Kresina(编)(1991)MonoclonalAntibodies，Cytokines and Arthritis，Marcel Dekker，New York，NY；Bach(编)(1993)Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases，MarcelDekker，New York，NY；Baert等人(2003)New Engl.J.Med.348：601-608；Milgrom等人(1999)New Engl.J.Med.341：1966-1973；Slamon等人(2001)New Engl.J.Med.344：783-792；Beniaminovitz等人(2000)New Engl.J.Med.342：613-619；Ghosh等人(2003)NewEngl.J.Med.348：24-32；Lipsky等人(2000)New Engl.J.Med.343：1594-1602)。
疾病症状是否已经减轻，可以通过医师或其他熟练的健康护理提供者通常使用的任何临床测量来评价，以评价该症状的严重程度或进展状态。尽管本发明的一个实施方案(例如，治疗方法或制品)可能不会有效地减轻每个受试者中的靶疾病症状，但其应当减轻统计上显著数目的受试者中的靶疾病症状，如通过本领域已知的任何统计检验来确定，诸如Student氏t-检验、chi2-检验、根据Mann和Whitney的U-检验、Kruskal-Wallis检验(H-检验)、Jonckheere-Terpstra-检验和Wilcoxon-检验。
待治疗的受试者可以是任何哺乳动物，诸如狗、猫、马、兔、小鼠、母牛、猴或大猩猩，优选为人。如技术人员将理解，待治疗的受试者将尤其是患有本文中提及的疾病和病症或处于其风险下的人。
通常，将遵循治疗方案，直至实现期望的治疗效果和/或持续与维持期望治疗效果一样长的时间。再次，这可以由临床医师确定。
由于本发明的PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))(例如，F023700910、F023700918、F023700920或F023700925)能够结合PD1和CTLA4，它们尤其可用于治疗或预防癌症、转移性癌症、实体瘤、血液癌症、白血病、淋巴瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、神经母细胞瘤、肾癌、白血病、肾移行细胞癌、膀胱癌、Wilm氏癌、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、骨癌、肺癌、非小细胞肺癌、胃癌、结直肠癌、宫颈癌、滑膜肉瘤、头颈癌、鳞状细胞癌、多发性骨髓瘤、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、肝母细胞瘤、肝细胞癌、黑素瘤、肾横纹肌样瘤、尤因氏肉瘤、软骨肉瘤、脑癌、胶质母细胞瘤、脑膜瘤、垂体腺瘤、前庭神经鞘瘤、原始性神经外胚层肿瘤、成神经管细胞瘤、星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、室管膜瘤、脉络丛乳头状瘤、真性红细胞增多症、血小板增多症、特发性骨髓纤维化、软组织肉瘤、甲状腺癌、子宫内膜癌、类癌或肝癌、乳腺癌和胃癌。
本发明的PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))(例如，F023700910、F023700918、F023700920或F023700925)可用于治疗或预防感染性疾病，诸如例如病毒感染、细菌感染、真菌感染或寄生虫感染。在本发明的一个实施方案中，所述病毒感染是选自以下病毒的病毒感染：人免疫缺陷病毒(HIV)、埃博拉病毒、肝炎病毒(甲型、乙型或丙型)、疱疹病毒(例如，VZV、HSV-I、HAV-6、HSV-II和CMV、爱泼斯坦-巴尔病毒)、腺病毒、流感病毒、黄病毒、艾柯病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、冠状病毒、呼吸道合胞体病毒、腮腺炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、细小病毒、牛痘病毒、HTLV病毒、登革热病毒、乳头状瘤病毒、软疣病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒或虫媒病毒性脑炎病毒。在本发明的一个实施方案中，所述细菌感染是选自以下细菌的细菌感染：衣原体属(Chlamydia)、立克次氏体属细菌、分枝杆菌属(mycobacteria)、葡萄球菌属(staphylococci)、链球菌属(streptococci)、肺炎球菌属(pneumonococci)、脑膜炎球菌(meningococci)和淋球菌(gonococci)、克雷伯氏菌属(klebsiella)、变形菌属(proteus)、沙雷氏菌属(serratia)、假单胞菌属(pseudomonas)、军团杆菌属(Legionella)、白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、沙门氏菌属(Salmonella)、芽胞杆菌(bacilli)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、破伤风梭菌(Clostridium tetan)、肉毒梭状芽孢杆菌(Clostridium botulinum)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthricis)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、弥漫型麻风分枝杆菌(Mycobacterium lepromatosis)和Borriella。在本发明的一个实施方案中，所述真菌感染是选自以下真菌的真菌感染：念珠菌属(Candida)(白色念珠菌(Candida albicans)、克鲁斯氏念珠菌(Candida krusei)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、热带念珠菌(Candidatropicalis)等)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、曲霉菌属(Aspergillus)(烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、黑曲霉(Aspergillusniger)等)、毛霉菌属(Mucorales)(mucor、absidia、rhizopus)、申克孢子丝菌(Sporothrix schenkii)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)和荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)。在本发明的一个实施方案中，所述寄生虫感染是选自以下寄生虫的寄生虫感染：溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、结肠小袋纤毛虫(Balantidium coli)、福氏耐格里原虫(Naegleria fowleri)、棘阿米巴属(Acanthamoeba)、篮氏贾第鞭毛虫(Giardia lambia)、隐孢子虫属(Cryptosporidium)、卡氏肺孢子虫(Pneumocystis carinii)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、微小巴贝虫(Babesia microti)、布鲁斯锥虫(Trypanosomabrucei)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、巴西日本圆线虫(Nippostrongylus brasiliensis)。
本发明还涉及治疗前述疾病和病症的方法，其通常包括向有需要(即患有前述疾病之一)的受试者施用治疗有效量的本发明的PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))(例如F023700910、F023700918、F023700920或F023700925)。本发明还涉及PD1/CTLA4结合剂(例如包含结合PD1和CTLA4的ISVD(例如纳米抗体))，其用于预防或治疗前述疾病或病症之一。
本发明的其它方面、实施方案、优点和应用将从本文中的进一步描述变得显而易见。
实施例
这些实施例意图举例说明本发明而不是本发明的限制。在实施例中阐述的组合物和方法形成本发明的一部分。
实施例1：F023700906纳米抗体与CTLA-4-Fc的结合
单价F023700906纳米抗体(CTLA4结合剂11F01(L11V、A14P、Q45R、A74S、K83R、V89L、M96P、Q108L)-FLAG3-HIS6)(F023700925的构建嵌段)表现出与来自人和食蟹猴的CTLA-4-Fc融合分子的结合。使用人和食蟹猴CTLA4-hFc测定缔合速率、解离速率和亲和力(下表)。
表E.F023700906与人和食蟹猴CTLA4的结合
Figure BPA0000258853690001371
实施例2：F023700918和F023700925与人CTLA-4的结合
F023700918和F023700925表现出与在细胞表面上表达的人CTLA-4的结合。通过流式细胞术研究F023700918(实心正方形)、F023700925(实心三角形)、F023700912(实心圆)和无关纳米抗体(菱形)与过表达hCTLA4的CHO-K1细胞的结合。经由结合ALB11的mABABH0074检测纳米抗体。在该实验中生成的流式细胞术数据在图8中。
实施例3：F023700925的人PD-1细胞表面结合
F023700925表现出与细胞表面上表达的人PD-1的结合。通过流式细胞术研究F023700925(实心正方形)和F023700912(实心圆)和无关纳米抗体IRR00051(实心三角形)的批次与过表达hPD1的CHO-K1细胞的结合。经由结合ALB11的mAb ABH0074检测纳米抗体。在该实验中生成的流式细胞术数据在图9中。
实施例4：人CTLA-4/CD80和CD86阻断测定
F023700906(F023700925的构建嵌段)以及F023701051、F023701054和F023701061阻断人CTLA-4与其配体CD80和CD86的结合。过表达hCTLA4的CHO-K1细胞上，使用固定浓度(EC30)的(A)hCD80-hFc或(B)hCD86-hFc，纳米抗体F023700906(实心圆)的N73X变体(实心正方形、实心三角形、实心倒三角形)的发现批次的流式细胞术分析。经由人IgG Fc融合蛋白检测配体。在该实验中生成的流式细胞术数据在图10(A-B)中。
实施例5：结合特异性测定
特异性评价F023700925预测与CTLA-4和PD-1的选择性结合。在过表达细胞上使用流式细胞术进行针对BTLA、CD8、CTLA4、LAG3和CD28的特异性评价，而ICOS结合在ELISA中作为重组蛋白(hICOS-hFc)评估。经由直接标记的靶标特异性抗体评价BTLA、CD8、PD1、CTLA4、LAG3、CD28的表达。抗hICOS和抗hCTLA4/抗hPD1阳性对照均为阳性。在ELISA测定中未观察到与hICOS的结合。图11(a-h)分别显示与阴性对照L细胞、阴性对照CHO-K1细胞、huCD28+L细胞、huCD8α+L细胞、huLag-3+CHO-K1细胞、huBTLA+CHO-K1细胞、huCTLA-4+CHO-K细胞和huPD-1+CHO-K1细胞的结合。对于F023700925，没能观察到与BTLA、CD8、LAG3、CD28的结合，而在PD-1+或CTLA-4+CHO-K1细胞上观察到F023700925的有效结合。在该实验中生成的流式细胞术数据在图11(A-H)中。
实施例6：血清白蛋白结合测定
F023700925与人、恒河猴和小鼠白蛋白结合，预测当与非白蛋白结合纳米抗体相比时延长的半衰期。当使用表面等离子共振(SPR)分析时，观察到与人、恒河猴和小鼠血清白蛋白的结合。
表F.F023700925与人、恒河猴和小鼠血清白蛋白的结合分析
Figure BPA0000258853690001391
人血清白蛋白：目录号A3782，Sigma，批号SLBD7204V
恒河猴血清白蛋白：BioWorld，目录号22070099-1，批号L15091001DA，
小鼠血浆白蛋白：Innovative Research，批号1012，
仪器和传感器芯片：Biacore T100(GE Healthcare)；CM5(ID T160713-2，GEHealthcare，批号10242599
F023700912是11F01(E1D、L11V、A14P、Q45R、A74S、K83R、V89L、M96P、Q108L)-35GS-11F01(L11V、A14P、Q45R、A74S、K83R、V89L、M96P、Q108L)-35GS-ALB11002-A。
实施例7：变体的结合动力学分析
生成F023700906(F023700925的构建嵌段)在位置N73处的几种变体以避免该位点处的脱酰胺。连同目前SO F023700906，以解离速率评价所有可能的取代(表G)。比较变体F023701051[11F01(L11V、A14P、Q45R、N73Q、A74S、K83R、V89L、M96P、Q108L)-FLAG3-HIS6]、F023701054[11F01(L11V、A14P、Q45R、N73T、A74S、K83R、V89L、M96P、Q108L)-FLAG3-HIS6]和F023701061[11F01(L11V、A14P、Q45R、N73Y、A74S、K83R、V89L、M96P、Q108L)-FLAG3-HIS6]与F023700906的阻断(A)CD80或(B)CD86与表达CTLA-4的CHO-K1细胞的结合的能力。所有这些变体都能够阻断CD80和CD84与CTLA-4的结合。在该实验中生成的流式细胞术数据在图12(A-B)中。
实施例8：F023700912根除人源化小鼠中的确立的实体瘤
将Panc 08.13肿瘤细胞植入人源化小鼠(Jackson Laboratories)。如下处理具有确立的肿瘤(～100mm3，n＝9-10/组)的小鼠：1-同种型对照(hIgG1-2mg/kg和hIgG4-3mg/kg)；2-伊匹单抗-N297A(3mg/kg)；3-伊匹单抗(3mg/kg)；4-派姆单抗(2mg/kg)；5-伊匹单抗(3mg/kg)+派姆单抗(2mg/kg)；6-F023700912(5mg/kg；表示为CTLA4-Nab 5)，7-F023700912(15mg/kg；表示为CTLA4-Nab-15)，和8-F023700912(15mg/kg)+派姆单抗(2mg/kg)。所有抗体每7天皮下注射持续6个剂量。F023700912每3.5天皮下施用持续11个剂量。每4-5天测量肿瘤体积和体重。显示了平均肿瘤体积±SEM(A)、第37天的个体肿瘤体积(B)和在实验过程中小鼠个体中的肿瘤体积(C)。还显示各处理组中的平均(平均值±SEM)(D)和个体(E)体重变化。发现死亡或由于体重减轻而人道安乐死的小鼠的数目指示为“#”。“↑”指示抗体且
Figure BPA0000258853690001401
指示纳米抗体给药时程。在该实验中生成的肿瘤体积数据在图13(A-J)中。这些数据证实F023700912在抑制肿瘤生长方面高度有效。
实施例9：F023700912和F023700925与来自健康受试者和癌症患者的预先存在抗体的结合
三价参考纳米抗体013700112(未经修饰用于减少预先存在抗体的结合)表现出与来源于(图14A)健康受试者或(图14B)癌症患者的几种血清样品的结合。类似尺寸的序列优化的三价纳米抗体F023700912表现出与相同血清样品的较低频率的结合。F023700925包含与F023700912相同的构建嵌段。尽管尺寸较大，但五价F023700925纳米抗体表现出不超过参考纳米抗体013700112的与预先存在抗体的结合。使用ProteOn XPR36(Bio-RadLaboratories，Inc.)评价预先存在抗体与在人类血清白蛋白(HSA)上捕获的纳米抗体的结合。使用PBS/Tween(磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4，0.005％Tween20)作为运行缓冲液，并在25℃下进行实验。用EDC/NHS(流动速率30μl/min)活化ProteOn GLC传感器芯片的配体泳道，且注射ProteOn乙酸盐缓冲液pH 4.5(流动速率100μl/min)中10μg/ml的HSA，以给出近似3600RU的固定化水平。在固定化之后，表面用乙醇胺HCl(流动速率30μl/min)去活化。在HSA表面上以45μl/min注射纳米抗体持续2分钟以使得三价F023700912的纳米抗体捕获水平为近似600RU且五价F023700925的纳米抗体捕获水平为近似1000RU。含有预先存在抗体的样品在PBS-Tween20(0.005％)中1∶10稀释，然后以45μl/min注射2分钟，接下来为随后400秒解离步骤。在各循环之后(即在新纳米抗体捕获和血液样品注射步骤之前)，用45μl/min的2分钟HCl(100mM)注射，再生HSA表面。用ProteOn管理器3.1.0(Bio-Rad Laboratories，Inc.)进行传感图处理和数据分析。通过减去1)纳米抗体-HSA解离和2)与仅含有HSA的参考配体泳道的非特异性结合，在双重参考之后，获得显示预先存在抗体结合的传感图。通过将报道点设定在125秒(缔合结束之后5秒)来测定预先存在抗体的结合水平。作为参考，还测试含有预先存在抗体的样品与未经修饰用于减少这些预先存在抗体的结合的三价纳米抗体(T013700112)的结合。
实施例10：通过氢氘交换质谱进行的抗hCTLA4纳米抗体的表位作图
通过使用氢氘交换质谱(HDX-MS)分析测定抗hCTLA4纳米抗体F023700912之间的接触区域。HDX-MS测量氘至蛋白的酰胺骨架中的并入且该并入的变化受氢的溶剂暴露影响。进行仅抗原样品与纳米抗体结合样品中的氘交换水平的比较，以鉴定可与纳米抗体接触的抗原区域。
受纳米抗体F023700912最强保护免于氘化的人CTLA4残基为VRVTVL(SEQ ID NO：195的残基33-38)、ADSQVTEVC(SEQ ID NO：195的残基41-49)和CKVELMYPPPYYLG(SEQ IDNO：195的残基93-106)。
表G.氨基酸序列(SEQ ID NO：195)
Figure BPA0000258853690001411
Figure IPA0000258853640000011
Figure IPA0000258853640000021
Figure IPA0000258853640000031
Figure IPA0000258853640000041
Figure IPA0000258853640000051
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Figure IPA0000258853640000321
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Claims (30)

1.包含一个或多个免疫球蛋白单一可变结构域(ISVD)的PD1-CTLA4结合剂，其中结合PD1的ISVD由以下氨基酸序列所示：
DVQLVESGGG VVQPGGSLRL SCAASGSIAS IHAMGWFRQA PGKEREFVAV ITWSGGITYYADSVKGRFTI SRDNSKNTVY LQMNSLRPED TALYYCAGDK HQSSWYDYWG QGTLVTVSS
(SEQ ID NO: 135)；并且
结合CTLA4的ISVD由以下氨基酸序列所示：
DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGGTFSFYGMG
WFRQAPGKEREFVADIRTSAGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAAEPSGISGWDYWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO: 143)，或SEQ ID NO: 143的变体，其中D1被E取代；
或者结合CTLA4的ISVD由以下氨基酸序列所示：
X1VQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGGTFSFYGMGWFRQAPGKEREFVADIRTSAGRTYYADSVKGRFTISRDX2SKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAAEPSGISGWDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 196)，其中X1是E且其中X2是Q、T或Y。
2.权利要求1的PD1-CTLA4结合剂，进一步包含半衰期延长剂和/或C端延长剂。
3.权利要求1-2中任一项的PD1-CTLA4结合剂，其包含各ISVD之间的肽接头。
4.权利要求1-2中任一项的PD1-CTLA4结合剂，其包含：
• PD1 ISVD，其由SEQ ID NO:135的氨基酸序列所示；
• 35GS接头，其由SEQ ID NO:86的氨基酸序列所示；
• CTLA4 ISVD，其由SEQ ID NO:143或SEQ ID NO: 143的变体的氨基酸序列所示，所述变体中D1被E取代；
• 35GS接头，其由SEQ ID NO:86的氨基酸序列所示；
• HSA ISVD，其由SEQ ID NO:144的氨基酸序列所示；和
• C端丙氨酸。
5.权利要求1-2中任一项的PD1-CTLA4结合剂，其包含：
• PD1 ISVD，其由SEQ ID NO:135的氨基酸序列所示；
• 35GS接头，其由SEQ ID NO:86的氨基酸序列所示；
• PD1 ISVD，其由SEQ ID NO:135 或SEQ ID NO: 135的变体的氨基酸序列所示，所述变体中D1被E取代；
• 35GS接头，其由SEQ ID NO:86的氨基酸序列所示；
• CTLA4 ISVD，其由SEQ ID NO:143或SEQ ID NO: 143的变体的氨基酸序列所示，所述变体中D1被E取代；
• 35GS接头，其由SEQ ID NO:86的氨基酸序列所示；
• HSA ISVD，其由SEQ ID NO:144的氨基酸序列所示；和
• C端丙氨酸。
6.权利要求1-2中任一项的PD1-CTLA4结合剂，其包含：
• PD1 ISVD，其由SEQ ID NO:135的氨基酸序列所示；
• 35GS接头，其由SEQ ID NO:86的氨基酸序列所示；
• CTLA4 ISVD，其由SEQ ID NO:143 或SEQ ID NO: 143的变体的氨基酸序列所示，所述变体中D1被E取代；
• 35GS接头，其由SEQ ID NO:86的氨基酸序列所示；
• CTLA4 ISVD，其由SEQ ID NO:143或SEQ ID NO: 143的变体的氨基酸序列所示，所述变体中D1被E取代；
• 35GS接头，其由SEQ ID NO:86的氨基酸序列所示；
• HSA ISVD，其由SEQ ID NO:144的氨基酸序列所示；和
• C端丙氨酸。
7.权利要求1-2中任一项的PD1-CTLA4结合剂，其包含：
• PD1 ISVD，其由SEQ ID NO:135的氨基酸序列所示；
• 35GS接头，其由SEQ ID NO:86的氨基酸序列所示；
• PD1 ISVD，其由SEQ ID NO:135或SEQ ID NO: 135的变体的氨基酸序列所示，所述变体中D1被E取代；
• 35GS接头，其由SEQ ID NO:86的氨基酸序列所示；
• CTLA4 ISVD，其由SEQ ID NO:143或SEQ ID NO: 143的变体的氨基酸序列所示，所述变体中D1被E取代；
• 35GS接头，其由SEQ ID NO:86的氨基酸序列所示；
• CTLA4 ISVD，其由SEQ ID NO:143或SEQ ID NO: 143的变体的氨基酸序列所示，所述变体中D1被E取代；
• 35GS接头，其由SEQ ID NO:86的氨基酸序列所示；
• HSA ISVD，其由SEQ ID NO:144的氨基酸序列所示；和
• C端丙氨酸。
8.权利要求1-2中任一项的PD1-CTLA4结合剂，其包含肽接头，其中所述肽接头由氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 86)所示。
9.权利要求1-2中任一项的PD1-CTLA4结合剂，其由SEQ ID NO:146、149、151或153的氨基酸序列所示。
10.权利要求1-2中任一项的PD1-CTLA4结合剂，其包含半衰期延长剂，所述半衰期延长剂是人血清白蛋白ISVD，其包含：
由氨基酸序列GFTFSSFGMS (SEQ ID NO:199)所示的CDR1；
由氨基酸序列SISGSGSDTL (SEQ ID NO:200)所示的CDR2；和
由氨基酸序列GGSLSR (SEQ ID NO:201)所示的CDR3。
11.权利要求1-2中任一项的PD1-CTLA4结合剂，其包含半衰期延长剂，所述半衰期延长剂是结合人血清白蛋白的ISVD，且由以下氨基酸序列所示：
EVQLVESGGG XVQPGNSLRL SCAASGFTFS SFGMSWVRQA PGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTI SRDNAKTTLY LQMNSLRPED TAXYYCTIGG SLSRSSQGTL VTVSSA
(SEQ ID NO: 144)。
12.权利要求1-2中任一项的PD1-CTLA4结合剂，其包含C端延长剂，所述C端延长剂是丙氨酸。
13.权利要求1-2中任一项的PD1-CTLA4结合剂，其与CTLA4和/或PD1结合。
14.注射装置或容器，其包含权利要求1-13中任一项的PD1-CTLA4结合剂。
15.权利要求14的注射装置或容器，进一步包含另外的治疗剂。
16.多核苷酸，其编码权利要求1-15中任一项的PD1-CTLA4结合剂。
17.权利要求16的多核苷酸，其由SEQ ID NO:145、148、150或152的核苷酸序列所示。
18.载体，其包含权利要求16-17中任一项的多核苷酸。
19.宿主细胞，其包含权利要求16或17的多核苷酸或权利要求18的载体。
20.用于制备权利要求1-13中任一项的PD1-CTLA4结合剂的方法，其包括将编码所述PD1-CTLA4结合剂的多核苷酸引入宿主细胞中，和在培养基中在有利于从所述多核苷酸表达所述PD1-CTLA4结合剂的条件下培养所述宿主细胞。
21.权利要求20的方法，进一步包括从所述宿主细胞和/或所述培养基纯化所述PD1-CTLA4结合剂。
22.通过权利要求20或21的方法产生的PD1-CTLA4结合剂。
23.用于防止PD1结合PD-L1和/或PD-L2的方法，其包括使所述PD1接触权利要求1-13和22中任一项的PD1-CTLA4结合剂，其中所述方法不是用于疾病的治疗。
24.权利要求23的方法，其中所述PD1-CTLA4结合剂与另外的治疗剂组合。
25.用于防止CTLA4结合CD80和/或CD86的方法，其包括使所述CTLA4接触权利要求1-13和22中任一项的PD1-CTLA4结合剂，其中所述方法不是用于疾病的治疗。
26.权利要求25的方法，其中所述PD1-CTLA4结合剂与另外的治疗剂组合。
27.权利要求1-13和22中任一项的PD1-CTLA4结合剂在制备用于治疗受试者中的胰腺癌的药物中的用途。
28.权利要求27的用途，其中所述药物进一步包含另外的治疗剂或与另外的治疗剂组合使用。
29.权利要求27-28中任一项的用途，其中向所述受试者施用另外的治疗剂或治疗程序与所述PD1-CTLA4结合剂的组合。
30.组合物，其包含权利要求1-13和22中任一项的PD1-CTLA4结合剂和药学可接受的载体。
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