KR20180083418A - Pd1/ctla4 결합제 - Google Patents

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에드워드 보우만
마리벨 뷰몬트
마리-안헤 뷔세
카를로 보우톤
브루노 돔브레크트
비에른 빅터
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로버트 에이. 카스텔레인
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Abstract

본 발명은 PD1 및 CTLA4에 결합하는, 하나를 초과하는 ISVD 또는 나노바디를 예를 들어 포함하는 다중특이적 분자를 제공한다. 이러한 분자는 이러한 분자가 투여된 대상체의 신체 내의 선재하는 항체에 의한 결합의 발생률을 감소시키도록 조작되었다. 이러한 분자로 면역 반응을 증가시키고/거나, 암을 치료하고/거나 감염성 질환을 치료하는 방법이 제공된다.

Description

PD1/CTLA4 결합제
본 출원은 2015년 11월 18일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/256,985의 이익을 주장하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
컴퓨터로 판독가능한 포맷의 뉴클레오티드/아미노산 서열 목록은 그 전문이 참조로 포함된다. 이러한 서열 목록을 함유하는 파일은 파일명이 "24236WOPCTSEQ"인 2016년 11월 15일에 생성된 353 kb ASCII 텍스트 파일이다.
발명의 분야
본 발명은, 부분적으로, 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1 ("PD1") 및 세포독성 T-림프구-연관 단백질 4 ("CTLA4")에 결합하는 이중특이적 폴리펩티드에 관한 것이다. 특히, 본 발명은, 부분적으로, PD1에 결합하는 적어도 하나 (예컨대 1개 또는 2개)의 중쇄 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인 (본원에서 "ISV" 또는 "ISVD"로도 지칭됨) 및 CTLA4에 결합하는 적어도 하나 (예컨대 1개 또는 2개)의 중쇄 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 이중특이적 폴리펩티드에 관한 것이다.
면역 조절 분자 예컨대 세포독성 T 림프구 항원 4 (CTLA4)를 폐지시키는 것은 면역계 조작에 의해 종양 퇴행을 유도하고, 질환을 안정화시키며, 생존을 연장하기 위한 새로운 유망한 전략을 나타낸다. 항-CTLA4 항체인 이필리무맙은 현재 흑색종을 포함하는 적응증에 대해 판매되고 있다. CTLA4 항체가 제공된 흑색종 환자에서 진행까지의 시간 연장과 함께 종양 퇴행의 증거가 나타났고, 흑색종, 난소암, 전립선암, 및 신세포암 환자에서 이필리무맙으로 지속성 반응이 관찰되었다.
프로그래밍된 사멸 수용체 1 (PD1)은 활성화된 T 및 B 세포에서 주로 발현되는 면역억제 수용체이다. 그의 리간드와의 상호작용은 시험관내 및 생체내 둘 다에서 T-세포 반응을 약화시키는 것으로 나타났다. PD1과 그의 리간드 중 하나인 PD-L1 사이의 상호작용의 차단이 종양-특이적 CD8+ T-세포 면역을 증강시키는 것으로 나타났고, 따라서 면역계에 의한 종양 세포의 소거에 도움이 될 수 있다.
PD1/PD-L1 상호작용의 차단은 종양-특이적 T-세포 면역 증강에 이를 수 있고, 따라서 면역계에 의한 종양 세포의 소거에 도움이 될 수 있다. 이러한 이슈를 다루기 위해, 다수의 연구가 수행되었다. 공격적인 췌장암의 뮤린 모델에서, 티. 노미(T. Nomi) 등 (Clin. Cancer Res. 13: 2151-2157 (2007))은 PD1/PD-L1 차단의 치료 효능을 실연하였다. PD1 또는 PD-L1에 지시된 항체의 투여가 종양 성장을 유의하게 억제하였다. 항체 차단이 종양 반응성 CD8+ T 세포의 종양 내로의 침윤을 효과적으로 촉진하여, IFN 감마, 그랜자임 B 및 퍼포린을 포함하는 항-종양 이펙터의 상향-조절을 초래하였다. 추가적으로, 저자들은 PD1 차단이 화학요법과 효과적으로 조합되어 상승작용성 효과를 산출할 수 있다는 것을 나타냈다. 또 다른 연구에서, 마우스에서의 편평 세포 암종의 모델을 사용하여, PD1 또는 PD-L1의 항체 차단이 종양 성장을 유의하게 억제하였다 (Tsushima F. et al., Oral Oncol. 42: 268-274 (2006)).
면역 반응의 CTLA4 및 PD1-매개 하향조절을 억제하는 한 방법은 이들을 다중특이적 나노바디((Nanobody)와 결합시킴으로써 이들과 이들의 리간드의 상호작용을 방해하는 것에 의한 것이다. 라마에서 기원하는 나노바디가, 예를 들어, 환자의 혈청 내의 선재하는 항체에 의한 나노바디의 결합에 의해, 원치 않는 항-약물 면역 반응을 야기할 수 있는 가능성이 존재한다. 따라서, 이러한 반응을 감소시키거나 제거하도록 나노바디를 인간화하는 신규 방법이 특히 가치가 있고, 이러한 방법으로 생성된 나노바디도 그러하다.
본 발명은 하기 잔기 VRVTVL (서열식별번호(SEQ ID NO): 195의 아미노산 33-38), ADSQVTEVC (서열식별번호: 195의 아미노산 41-49) 및 CKVELMYPPPYYLG (서열식별번호: 195의 아미노산 93-106) 중 하나 이상, 예를 들어, 3개의 부위 모두에서 인간 CTLA4와 접촉함으로써 인간 PD1 및 인간 CTLA4에 결합하는 PD1/CTLA4 결합제 또는 다중특이적 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인 (ISVD) 예컨대 나노바디를 제공한다. 예를 들어, 이러한 결합제는 중수소 공급원 예컨대 D2O의 존재 하에서의 수소-중수소 교환으로부터 이러한 잔기들을 보호한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 이러한 ISVD는 인간 CTLA4에 결합하고, 본질적으로 도 17에 기재된 바와 같은 결합 히트 맵 (예를 들어, 수소-중수소 교환 검정법에서 생성된 바와 같음)을 생성시킨다.
본 발명은 아미노산 서열 IHAMG (서열식별번호: 3) 또는 GSIASIHAMG (서열식별번호: 6)를 포함하는 CDR1; 아미노산 서열 VITXSGGITYYADSVKG (서열식별번호: 4; 여기서 X는 W 또는 V임) 또는 VITWSGGITY (서열식별번호: 7)를 포함하는 CDR2; 및 아미노산 서열 DKHQSSXYDY (서열식별번호: 5; 여기서 X는 W 또는 F임)를 포함하는 CDR3을 포함하는, PD1에 결합하는 하나 이상의 ISVD; 및 아미노산 서열 FYGMG (서열식별번호: 10) 또는 GGTFSFYGMG (서열식별번호: 13)를 포함하는 CDR1; 아미노산 서열 DIRTSAGRTYYADSVKG (서열식별번호: 11) 또는 DIRTSAGRTY (서열식별번호: 14)를 포함하는 CDR2; 및 아미노산 서열 EXSGISGWDY (서열식별번호: 12; 여기서 X는 M 또는 P임)를 포함하는 CDR3을 포함하는, CTLA4에 결합하는 하나 이상의 ISVD; 및, 임의적으로, 반감기 연장제 및/또는 C-말단 연장제를 포함하는 PD1/CTLA4 결합제를 또한 제공한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 결합제 내의 각각의 ISVD 사이에 펩티드 링커, 예를 들어, 35GS 링커가 있다.
본 발명은 하기 아미노산 서열을 포함하는 PD1에 결합하는 ISVD: DVQLVESGGG VVQPGGSLRL SCAASGSIAS IHAMGWFRQA PGKEREFVAV ITWSGGITYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTVY LQMNSLRPED TALYYCAGDK HQSSWYDYWG QGTLVTVSS (서열식별번호: 135); 및 하기 아미노산 서열을 포함하는 CTLA4에 결합하는 ISVD:
XVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGGTFSFYGMG
WFRQAPGKEREFVADIRTSAGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAAEPSGISGWDYWGQGTLVTVSS (서열식별번호: 143), 여기서 X는 D 또는 E임; 또는
X1VQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGGTFSFYGMGWFRQAPGKEREFVADIRTSAGRTYYADSVKGRFTISRDX2SKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAAEPSGISGWDYWGQGTLVTVSS (서열식별번호: 196); 여기서 X1은 D 또는 E이고, X2는 S, V, G, R, Q, M, H, T, D, E, W, F, K, A, Y 또는 P임; 및, 임의적으로, 반감기 연장제 및/또는 C-말단 연장제를 포함하는 PD1/CTLA4 결합제를 또한 제공한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 결합제 내의 각각의 ISVD 사이에 펩티드 링커, 예를 들어, 35GS 링커가 있다.
본 발명은 하기를 포함하는 PD1/CTLA4 결합제를 또한 제공한다:
ㆍ 서열식별번호: 135에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 PD1 ISVD;
ㆍ 서열식별번호: 86에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 35GS 링커;
ㆍ 서열식별번호: 143 (D1E)에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CTLA4 ISVD;
ㆍ 서열식별번호: 86에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 35GS 링커;
ㆍ 서열식별번호: 144에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 HSA ISVD; 및
ㆍ C-말단 알라닌
또는
ㆍ 서열식별번호: 135에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 PD1 ISVD;
ㆍ 서열식별번호: 86에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 35GS 링커;
ㆍ 서열식별번호: 135에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 PD1 ISVD;
ㆍ 서열식별번호: 86에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 35GS 링커;
ㆍ 서열식별번호: 143에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CTLA4 ISVD;
ㆍ 서열식별번호: 86에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 35GS 링커;
ㆍ 서열식별번호: 144에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 HSA ISVD; 및
ㆍ C-말단 알라닌
또는
ㆍ 서열식별번호: 135에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 PD1 ISVD;
ㆍ 서열식별번호: 86에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 35GS 링커;
ㆍ 서열식별번호: 143 (D1E)에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CTLA4 ISVD;
ㆍ 서열식별번호: 86에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 35GS 링커;
ㆍ 서열식별번호: 143 (D1E)에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CTLA4 ISVD;
ㆍ 서열식별번호: 86에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 35GS 링커;
ㆍ 서열식별번호: 144에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 HSA ISVD; 및
ㆍ C-말단 알라닌
또는
ㆍ 서열식별번호: 135에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 PD1 ISVD;
ㆍ 서열식별번호: 86에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 35GS 링커;
ㆍ 서열식별번호: 135 (D1E)에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 PD1 ISVD;
ㆍ 서열식별번호: 86에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 35GS 링커;
ㆍ 서열식별번호: 143 (D1E)에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CTLA4 ISVD;
ㆍ 서열식별번호: 86에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 35GS 링커;
ㆍ 서열식별번호: 143 (D1E)에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CTLA4 ISVD;
ㆍ 서열식별번호: 86에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 35GS 링커;
ㆍ 서열식별번호: 144에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 HSA ISVD; 및
ㆍ C-말단 알라닌.
예를 들어, 본 발명은 서열식별번호: 146, 149, 151 또는 153에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 PD1/CTLA4 결합제를 제공한다.
본 발명의 한 실시양태에서, PD1/CTLA4 결합제는 반감기 연장제, 예를 들어, HSA 결합제, 예를 들어 하기를 포함하는 인간 혈청 알부민 ISVD를 포함한다:
아미노산 서열 GFTFSSFGMS (서열식별번호: 177)를 포함하는 CDR1; 아미노산 서열 SISGSGSDTL (서열식별번호: 178)을 포함하는 CDR2; 및 아미노산 서열 GGSLSR (서열식별번호: 179)을 포함하는 CDR3을 포함하고, 예를 들어, 아미노산 서열: EVQLVESGGG VVQPGNSLRL SCAASGFTFS SFGMSWVRQA PGKGLEWVSS ISGSGSDTLY ADSVKGRFTI SRDNAKTTLY LQMNSLRPED TALYYCTIGG SLSRSSQGTL VTVSSA (서열식별번호: 144).
추가적으로, 본 발명은 본원에 기재된 PD1/CTLA4 결합제가 PD1 및/또는 CTLA4에 결합하는 것을 교차-차단하는 결합제 (예를 들어, 항체, 그의 항원-결합 단편, ISVD 또는 나노바디)를 제공한다.
본 발명은 (i) 서열식별번호: 1 또는 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하지만, 서열식별번호: 1 또는 2의 아미노산 서열에 관련하여 위치 11, 89, 110 및 112 중 하나 이상에서의 돌연변이를 추가로 포함하며, 여기서 상기 위치는 카바트(Kabat)에 따라 번호가 매겨지며, 임의의 개수의 추가적인 본원에 기재된 돌연변이 또는 다르게는 예를 들어 10개 이하 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개)의 추가적인 돌연변이 (예를 들어, 점 돌연변이, 치환, 결실, 삽입)를 임의적으로 추가로 포함하는 PD1에 결합하는 결합 모이어티; 및 (ii) 서열식별번호: 9에 기재된 아미노산 서열을 포함하지만, 서열식별번호: 9의 아미노산 서열에 관련하여 위치 11, 89, 110 및 112 중 하나 이상에서의 돌연변이를 추가로 포함하며, 여기서 상기 위치는 카바트에 따라 번호가 매겨지며, 임의의 개수의 추가적인 본원에 기재된 돌연변이 또는 다르게는 예를 들어 10개 이하 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개)의 추가적인 돌연변이 (예를 들어, 점 돌연변이, 치환, 결실, 삽입)를 임의적으로 추가로 포함하는 CTLA4에 결합하는 결합 모이어티를 포함하는, PD1 및 CTLA4에 결합하는 PD1/CTLA4 결합제 또는 다중특이적 결합제 (예를 들어, 다중특이적 ISVD 예컨대 나노바디)를 제공한다. 본 발명의 한 실시양태에서, PD1에 결합하는 결합 모이어티는 서열식별번호: 1 또는 2의 아미노산 서열에 관련하여 하나 이상의 돌연변이를 포함하고, 여기서 위치 11에서의 아미노산 잔기는 L 또는 V로부터 선택되고/거나; 위치 89에서의 아미노산 잔기는 T, V, I 또는 L로부터 선택되고/거나; 위치 110에서의 아미노산 잔기는 T, K 또는 Q로부터 선택되고/거나; 위치 112에서의 아미노산 잔기는 S, K 또는 Q로부터 선택되고; CTLA4에 결합하는 결합 모이어티는 서열식별번호: 9의 아미노산 서열에 관련하여 하나 이상의 돌연변이를 포함하고, 여기서 위치 11에서의 아미노산 잔기는 L 또는 V로부터 선택되고/거나; 위치 89에서의 아미노산 잔기는 T, V 또는 L로부터 선택되고/거나; 위치 110에서의 아미노산 잔기는 T, K 또는 Q로부터 선택되고/거나; 위치 112에서의 아미노산 잔기는 S, K 또는 Q로부터 선택된다. 본 발명의 한 실시양태에서, PD1에 결합하는 결합 모이어티는 서열식별번호: 1 또는 2의 아미노산 서열에 관련하여 하나 이상의 돌연변이를 포함하고, 여기서 위치 89는 L이고 위치 11은 V이거나; 위치 89는 L이고 위치 110은 K 또는 Q이거나; 위치 89는 L이고 위치 112는 K 또는 Q이거나; 위치 89는 L이고 위치 11은 V이고 위치 110은 K 또는 Q이거나; 위치 89는 L이고 위치 11은 V이고 위치 112는 K 또는 Q이거나; 위치 11은 V이고 위치 110은 K 또는 Q이거나; 위치 11은 V이고 위치 112는 K 또는 Q이고/거나; CTLA4에 결합하는 결합 모이어티는 서열식별번호: 9의 아미노산 서열에 관련하여 하나 이상의 돌연변이를 포함하고, 여기서 위치 89는 L이고 위치 11은 V이거나; 위치 89는 L이고 위치 110은 K 또는 Q이거나; 위치 89는 L이고 위치 112는 K 또는 Q이거나; 위치 89는 L이고 위치 11은 V이고 위치 110은 K 또는 Q이거나; 위치 89는 L이고 위치 11은 V이고 위치 112는 K 또는 Q이거나; 위치 11은 V이고 위치 110은 K 또는 Q이거나; 위치 11은 V이고 위치 112는 K 또는 Q이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 다중특이적 결합제는 하기 표에 기재된 것 중 임의의 것과 같이 서열식별번호: 1, 2 및/또는 9에 관련하여 위치 11, 89, 110 및 112에서의 돌연변이를 포함한다:
Figure pct00001
본 발명의 한 실시양태에서, (i) PD1에 결합하는 결합 모이어티는 서열식별번호: 1 또는 2의 아미노산 서열에 관련하여 1, 14, 41, 74, 83 및 87로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 하나 이상의 돌연변이를 추가로 포함하며, 여기서 상기 위치는 카바트에 따라 번호가 매겨지고/거나; (ii) CTLA4에 결합하는 결합 모이어티는 서열식별번호: 9의 아미노산 서열에 관련하여 1, 14, 41, 74, 83 및 87로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 하나 이상의 돌연변이를 추가로 포함하며, 여기서 상기 위치는 카바트에 따라 번호가 매겨진다. 본 발명의 한 실시양태에서, 다중특이적 결합제는 C-말단 연장, 예를 들어, 아미노산 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 연장을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 한 실시양태에서, C-말단 연장은 화학식이 -X(n)이고, 여기서 X 및 n은 하기와 같으며: (a) n = 1 및 X = Ala; (b) n = 2 및 각각의 X = Ala; (c) n = 3 및 각각의 X = Ala; (d) n = 2 및 적어도 하나의 X = Ala이고, 나머지 아미노산 잔기(들) X는 임의의 천연 발생 아미노산으로부터 독립적으로 선택됨; (e) n = 3 및 적어도 하나의 X = Ala이고, 나머지 아미노산 잔기(들) X는 임의의 천연 발생 아미노산으로부터 독립적으로 선택됨; (f) n = 3 및 적어도 2개의 X = Ala이고, 나머지 아미노산 잔기(들) X는 임의의 천연 발생 아미노산으로부터 독립적으로 선택됨; (g) n = 1 및 X = Gly; (h) n = 2 및 각각의 X = Gly; (i) n = 3 및 각각의 X = Gly; (j) n = 2 및 적어도 하나의 X = Gly이고, 나머지 아미노산 잔기(들) X는 임의의 천연 발생 아미노산으로부터 독립적으로 선택됨; (k) n = 3 및 적어도 하나의 X = Gly이고, 나머지 아미노산 잔기(들) X는 임의의 천연 발생 아미노산으로부터 독립적으로 선택됨; (l) n = 3 및 적어도 2개의 X = Gly이고, 나머지 아미노산 잔기(들) X는 임의의 천연 발생 아미노산으로부터 독립적으로 선택됨; (m) n = 2 및 각각의 X = Ala 또는 Gly; (n) n = 3 및 각각의 X = Ala 또는 Gly; (o) n = 3 및 적어도 하나의 X = Ala 또는 Gly이고, 나머지 아미노산 잔기(들) X는 임의의 천연 발생 아미노산으로부터 독립적으로 선택됨; 또는 (p) n = 3 및 적어도 2개의 X = Ala 또는 Gly이고, 나머지 아미노산 잔기(들) X는 임의의 천연 발생 아미노산으로부터 독립적으로 선택됨; 예를 들어, C-말단 연장은 A, AA, AAA, G, GG, GGG, AG, GA, AAG, AGG, AGA, GGA, GAA 및 GAG로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명은 (i) 서열식별번호: 1 또는 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 서열식별번호: 1, 2 및 16-47로 이루어진 군으로부터 선택된 구성원에 기재된 아미노산 서열과의 적어도 85% (예를 들어, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 99.9 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 PD1에 결합하는 결합 모이어티이며, 여기서 상기 결합 모이어티가 서열식별번호: 1 또는 2에 기재된 아미노산 서열에 관련하여 적어도 하나의 돌연변이를 포함하며, 여기서 상기 적어도 하나의 돌연변이가 11, 89, 110 및 112로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 있으며, 여기서 상기 위치는 카바트에 따라 번호가 매겨지는 결합 모이어티; 및/또는 (ii) 서열식별번호: 9에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 서열식별번호: 9 및 48-83으로 이루어진 군으로부터 선택된 구성원에 기재된 아미노산 서열과의 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CTLA4에 결합하는 결합 모이어티이며, 여기서 상기 결합 모이어티가 서열식별번호: 9에 기재된 아미노산 서열에 관련하여 적어도 하나의 돌연변이를 포함하며, 여기서 상기 적어도 하나의 돌연변이가 11, 89, 110 및 112로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 있으며, 여기서 상기 위치는 카바트에 따라 번호가 매겨지는 결합 모이어티를 포함하는 다중특이적 결합제 (예를 들어 다중특이적 ISVD 예컨대 나노바디)를 또한 포함한다.
본 발명은 서열식별번호: 16-83 및 103-134로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 다중특이적 결합제 또는 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명은 (i) 서열식별번호: 16-47로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 PD1에 결합하는 결합 모이어티, 및 (ii) 서열식별번호: 48-83으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CTLA4에 결합하는 결합 모이어티를 포함하는 다중특이적 결합제를 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 다중특이적 결합제 (예를 들어 다중특이적 ISVD 예컨대 나노바디)는 하나 이상의 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인, 나노바디, 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 추가로 연결된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 다중특이적 결합제는 CD27, LAG3, PD1, BTLA, TIM3, ICOS, B7-H3, B7-H4, CD137, GITR, PD-L1, PD-L2, ILT1, ILT2 CEACAM1, CEACAM5, TIM3, TIGIT, VISTA, ILT3, ILT4, ILT5, ILT6, ILT7, ILT8, CD40, OX40, CD137, KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL3, NKG2A, NKG2C, NKG2E, IL-10, IL-17 또는 TSLP에 결합하는 하나 이상의 다른 결합 모이어티 (예를 들어, 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인, 나노바디, 항체 또는 그의 항원-결합 단편)를 포함한다.
본 발명은 PD1/CTLA4 결합제 또는 다중특이적 결합제를 추가 치료제 예컨대 펨브롤리주맙과 연합하여 포함한다. 본 발명은 PD1/CTLA4 결합제 또는 다중특이적 결합제를 임의적으로 추가 치료제 예컨대 펨브롤리주맙과 연합하여 포함하는 주사 장치 또는 용기를 또한 포함한다. 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 PD1/CTLA4 결합제 또는 다중특이적 결합제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 서열식별번호: 145, 148, 150 또는 152에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함함), 뿐만 아니라 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 및 이러한 폴리뉴클레오티드 및 벡터를 포함하는 숙주 세포 (예를 들어, CHO 세포 또는 피키아(Pichia) 세포)를 또한 제공한다.
본 발명은 이뮤노글로불린을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하는 것 및 숙주 세포 (예를 들어, CHO 세포 또는 피키아 세포)를 상기 폴리뉴클레오티드로부터의 상기 이뮤노글로불린의 발현에 유리한 조건 하에 배지에서 배양하는 것, 및 임의적으로, 상기 숙주 세포 및/또는 상기 배지로부터 이뮤노글로불린을 정제하는 것을 포함하는, 본원에 기재된 바와 같은 PD1/CTLA4 결합제 또는 다중특이적 결합제를 제조하는 방법을 제공한다. 이러한 방법에 의해 생산된 PD1/CTLA4 결합제 또는 다중특이적 결합제는 본 발명의 일부이다.
본 발명은 PD1을 임의적으로 추가 치료제와 연합된 본원에 기재된 바와 같은 상기 PD1/CTLA4 결합제 또는 다중특이적 결합제와 접촉시키는 것을 포함하는, PD1이 PD-L1 및/또는 PD-L2에 결합하는 것을 방지하고 T-세포 상의 CTLA4가 항원-제시 세포 상의 CD80 및/또는 CD86에 결합하는 것을 방지하는 방법을 또한 제공한다.
본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 PD1/CTLA4 결합제 또는 다중특이적 결합제의 유효량을 임의적으로 추가 치료제와 연합하여 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체 (예를 들어, 포유동물 예컨대 인간)에서 면역 반응을 증강시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 PD1/CTLA4 결합제 또는 다중특이적 결합제의 유효량을 임의적으로 추가 치료제와 연합하여 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 암 또는 감염성 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 또한 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 한 실시양태에서, 암은 전이성 암, 고형 종양, 혈액암, 백혈병, 림프종, 골육종, 횡문근육종, 신경모세포종, 신장암, 백혈병, 신장 이행 세포암, 방광암, 윌름스 암, 난소암, 췌장암, 유방암, 전립선암, 골암, 폐암, 비소세포 폐암, 위암, 결장직장암, 자궁경부암, 활막 육종, 두경부암, 편평 세포 암종, 다발성 골수종, 신세포암, 망막모세포종, 간모세포종, 간세포성 암종, 흑색종, 신장의 횡문근양 종양, 유잉 육종, 연골육종, 뇌암, 교모세포종, 수막종, 뇌하수체 선종, 전정 슈반세포종, 원시 신경외배엽 종양, 수모세포종, 성상세포종, 역형성 성상세포종, 핍지교종, 상의세포종, 맥락총 유두종, 진성 다혈구혈증, 혈소판혈증, 특발성 골수섬유증, 연부 조직 육종, 갑상선암, 자궁내막암, 카르시노이드 암 또는 간암, 유방암 또는 위암이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 감염성 질환은 박테리아 감염, 바이러스 감염 또는 진균 감염이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 대상체에게 추가 치료제 및/또는 치료 절차를 PD1/CTLA4 결합제 또는 다중특이적 결합제와 연합하여 투여한다.
도 1. 본원에서 구체적으로 지칭될 아미노산 위치 중 일부 및 일부 대안적인 넘버링 시스템 (예컨대 아호(Aho) 및 IMGT)에 따른 이들의 넘버링이 열거된 표.
도 2. 나노바디 102C12 및 참조 A 서열 (WO 2008/071447, 서열식별번호: 348 참조).
도 3 (a-b). (a) 본 발명의 PD1 결합 모이어티의 서열. (b) PD1 결합 모이어티와 서열식별번호: 1 및 2의 아미노산 서열의 정렬.
도 4 (a-b). (a) 본 발명의 CTLA4 결합 모이어티의 서열. (b) CTLA4 결합 모이어티와 서열식별번호: 9의 아미노산 서열의 정렬.
도 5. 본 발명의 결합제에 연결될 수 있는 서열.
도 6. 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제의 서열.
도 7. 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO N-연결 글리칸) 및 조작된 효모 세포 (조작된 효모 N-연결 글리칸)에서 생산된 모노클로날 항체에 대한 우세한 N-연결 글리칸: 사각형: N-아세틸글루코사민 (GlcNac); 원: 만노스 (Man); 다이아몬드: 갈락토스 (Gal); 삼각형: 푸코스 (Fuc).
도 8. 인간 CTLA4를 발현하는 CHO-K1 세포에 대한 나노바디 F023700925, F023700918 및 F023700912 및 대조군 나노바디 (IRR00051; 항-HER2/ERBB2 (알부민 결합제에 연결된 35GS가 있는 2가 항-HER2))의 결합.
도 9. 인간 PD1을 발현하는 CHO-K1 세포에 대한 나노바디 F023700925, F023700912 및 대조군 나노바디 (IRR00051)의 결합.
도 10 (a-b ). F023700906, F023701051, F023701054 및 F023701061에 의한 (a) 인간 CD80 또는 (b) 인간 CD86에 대한 인간 CTLA4 (CHO-K1 세포 상)의 결합의 차단.
도 11 (a-h). (a) 음성 대조군 L 세포, (b) 음성 대조군 CHO-K1 세포, (c) huCD28+ L 세포, (d) huCD8알파+ L 세포, (e) huLag-3+ CHO-K1 세포, (f) huBTLA+ CHO-K1 세포, (g) huCTLA-4+ CHO-K 세포, 또는 (h) huPD-1+ CHO-K1 세포에 대한 나노바디 F023700912 또는 F023700925 또는 대조군 나노바디 (IRR00051)의 결합.
도 12 (a-b ). 나노바디 F02370906, F02371051, F023701054 또는 F023701061에 의한 (a) 인간 CD80 또는 (b) 인간 CD86에 대한 인간 CTLA4 (CHO-K1 세포 상)의 결합의 차단.
도 13 (a-j ). 평균 panc08/.13 종양 부피 ±SEM (a), 및 제37일의 개별적인 종양 부피 (b), 및 (c) 이소형 대조군 항체, (d) 이필리무맙 (N297A), (e) 이필리무맙, (f) 펨브롤리주맙, (g) 이필리무맙 + 펨브롤리주맙, (h) CTLA4 나노바디 F023700912 (5 mpk), (i) CTLA4 나노바디 F023700912 (15 mpk) 또는 (j) 펨브롤리주맙 + CTLA4 나노바디 F023700912 (15 mpk)로 처리된 마우스에서의 실험 과정에 걸친 개별적인 인간화 마우스에서의 종양 부피.
도 14 (a-b ). 나노바디 F023700912, F023700925 또는 3가 대조군 나노바디 T013700112 (선재하는 항체 결합을 감소시키는 돌연변이가 결여됨)에 대한 (a) 건강한 환자 및 (b) 암 환자로부터의 선재하는 항체의 결합.
도 15 (a-d ). 본 발명의 서열.
도 16 (a-b ). 본 발명의 결합제 구축물의 설명.
도 17. F023700912 CTLA4 결합제에 의한 인간 CTLA4 결합의 중수소 표지 차이 히트 맵.
본 발명은 ISVD 내의 네오-에피토프에 대한 선재하는 항체 (프리-항체)의 반응성을 차단하는 돌연변이를 포함하는 ISVD를 제공한다. 네오에피토프는 단백질이 돌연변이되거나 (예를 들어, 말단절단되거나) 또는 그의 폴딩이 변경될 때 드러나는 단백질 내의 에피토프이다. 선재하는 항체는 ISVD가 제공되기 전에 환자의 신체 내에 존재하는 항체이다. 본 발명의 ISVD는, 부분적으로, C-말단 불변 도메인이 제거된 라마 항체를 기초로 하고, 따라서, 생성된 VHH의 C-말단 내의 네오-에피토프를 프리-항체 결합에 노출시킨다. 잔기 11 및 89의 돌연변이의 조합 (예를 들어, L11V 및 I89L 또는 V89L)이 프리-항체 결합의 놀라운 결여에 이르렀다는 것이 발견되었다. 잔기 112에서의 돌연변이 또한 프리-항체 결합을 현저하게 감소시키는 것으로 나타났다. 부이세(Buyse) & 부통(Boutton) (WO2015/173325)은 L11V 및 V89L 돌연변이의 조합이 프리-항체 결합을 감소시키는 것에서 L11V 돌연변이 단독 또는 V89L 돌연변이 단독과 비교하여 현저한 개선을 제공하였음을 나타내는 데이터를 포함하였다. 예를 들어, 부이세 & 부통의 97면의 표 H는 V89L 돌연변이 단독이 (C-말단 연장과 함께 또는 C-말단 연장 없이) 있는 ISVD 및 L11V 돌연변이와 조합된 V89L 돌연변이가 (마찬가지로, C-말단 연장과 함께 또는 C-말단 연장 없이) 있는 동일한 ISVD에 대한 비교 데이터를 나타냈다. 또한, 2개의 별개의 실험에서 생성되었지만, L11V 돌연변이 단독 (동일한 ISVD 내에 있음)에 대한 표 B에서 제공된 데이터에 비교된 바와 같은 L11V/V89L 조합에 대한 표 H에서 제시된 데이터는 L11V/V89L 조합에 의해 수득되는 프리-항체 결합 감소가 L11V 돌연변이 단독에 대한 것보다 더 컸다는 것을 나타냈다. 라마 항체 스캐폴드 구조는 매우 고도로 보존되는 것으로 공지되어 있기 때문에, 위치 11 및 89에서의 돌연변이의 효과는 임의의 ISVD에 대해 존재할 가능성이 매우 높다. 실제로, 도 14에서, 이러한 효과가 본 발명의 결합제인 F023700912, F023700925로 실연되었고, 이들은 매우 낮은 수준의 프리-항체 결합을 나타내는 것으로 나타났다.
본 출원에서, 이뮤노글로불린 중쇄 가변 도메인 내의 아미노산 잔기/위치는 카바트에 따른 넘버링으로 지시될 것이다. 편의상, 도 1은 본원에서 구체적으로 지칭될 아미노산 위치 중 일부 및 일부 대안적인 넘버링 시스템 (예컨대 아호 및 IMGT. 주: 달리 명시적으로 지시되지 않는 한, 본 설명 및 청구범위에 대해, 카바트 넘버링이 결정적이고, 다른 넘버링 시스템은 참조로만 제공됨)에 따른 이들의 넘버링을 열거하는 표를 제공한다.
CDR과 관련하여, 관련 분야에 널리 공지된 바와 같이, VH 또는 VHH 단편의 CDR을 규정 및 기재하기 위한 다수의 관례, 예컨대 카바트 정의 (이는 서열 가변성을 기초로 하고, 가장 통상적으로 사용됨) 및 코티아(Chothia) 정의 (이는 구조적 루프 영역의 위치를 기초로 함)가 있다. 예를 들어, 웹사이트 www.bioinf.org.uk/abs/를 참조한다. 본 명세서 및 청구범위의 목적을 위해, 카바트에 따른 CDR이 또한 언급될 수 있더라도, CDR은 가장 바람직하게는 Abm 정의 (이는 옥스포드 몰레큘라(Oxford Molecular)의 AbM 항체 모델링 소프트웨어를 기초로 함)를 기초로 정의되는데, 이것이 카바트 정의와 코티아 정의 사이의 최적의 절충안으로 간주되기 때문이다. 웹사이트 www.bioinf.org.uk/abs/를 또 다시 참조한다. 문헌 [Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat, et al.; National Institutes of Health, Bethesda, Md.; 5th ed.; NIH Publ. No. 91-3242 (1991)]; [Kabat (1978) Adv. Prot. Chem. 32:1-75]; [Kabat, et al., (1977) J. Biol. Chem. 252:6609-6616]; [Chothia, et al., (1987) J Mol. Biol. 196:901-917] 또는 [Chothia, et al., (1989) Nature 342:878-883]; [Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917]; [Elvin A. Kabat, Tai Te Wu, Carl Foeller, Harold M. Perry, Kay S. Gottesman (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest; Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. In: Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S. and Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg)]을 참조한다. 본 발명의 한 실시양태에서, CDR 결정은 카바트에 따르고, 예를 들어, VHH의 FR1은 위치 1-30의 아미노산 잔기를 포함하고, VHH의 CDR1은 위치 31-35의 아미노산 잔기를 포함하고, VHH의 FR2는 위치 36-49의 아미노산 잔기를 포함하고, VHH의 CDR2는 위치 50-65의 아미노산 잔기를 포함하고, VHH의 FR3은 위치 66-94의 아미노산 잔기를 포함하고, VHH의 CDR3은 위치 95-102의 아미노산 잔기를 포함하며, VHH의 FR4는 위치 103-113의 아미노산 잔기를 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, CDR은 문헌 [Kontermann and Duebel, Eds., Antibody Engineering, vol 2, Springer Verlag Heidelberg Berlin, Martin, Chapter 3, pp. 33-51, 2010]에 따라 결정된다.
본 발명은 개선된 PD1/CTLA4 결합제, 특히 개선된 PD1/CTLA4 이중특이적 ISVD, 더욱 특히 개선된 항-PD1/CTLA4 이중특이적 나노바디를 제공하는 것을 목표로 한다. 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제는 위치 1, 11, 14, 45, 73, 74, 83, 89, 96, 108, 110 및/또는 112에서 돌연변이된 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 변이체인 폴리펩티드를 포함하는 CTLA4 결합 모이어티; 및 위치 1, 11, 14, 52a, 73, 74, 83, 89, 100a, 110 및/또는 112에서 돌연변이된 서열식별번호: 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 변이체인 폴리펩티드를 포함하는 PD1 결합 모이어티를 (임의의 순서로) 포함하는 것들을 포함한다. 본 발명이 제공하는 개선된 PD1/CTLA4 이중특이적 결합제는 본원에서 "본 발명의 PD1/CTLA4 이중특이적 결합제" 또는 "PD1/CTLA4 이중특이적 결합제" 또는 "PD1/CTLA4 결합제"로도 지칭된다. 이러한 용어들은 본원에 기재된 바와 같은 CTLA4 결합 모이어티 및 PD1 결합 모이어티를 포함하는 임의의 분자를 포괄한다. 예를 들어, 이러한 용어들은 융합 단백질일 수 있고/거나 통상적인 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 부착될 수 있는 CTLA4 결합 모이어티 (예를 들어, 서열식별번호: 143 또는 196으로부터 선택된 구성원에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 ISVD) 및 PD1 결합 모이어티 (예를 들어, 서열식별번호: 103-134, 135, 136, 137, 140, 141 및 142로 이루어진 군으로부터 선택된 구성원에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 ISVD)를 포함하는 분자를 포함한다. PD1/CTLA4 결합제는 또 다른 에피토프 예컨대 CD27, LAG3, CTLA4의 상이한 에피토프, PD1의 상이한 에피토프, BTLA, TIM3, ICOS, B7-H3, B7-H4, CD137, GITR, PD-L1, PD-L2, ILT1, ILT2 CEACAM1, CEACAM5, TIM3, TIGIT, VISTA, ILT3, ILT4, ILT5, ILT6, ILT7, ILT8, CD40, OX40, CD137, KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL3, NKG2A, NKG2C, NKG2E, IL-10, IL-17 및/또는 TSLP에 또한 결합하는, CTLA4 결합 모이어티 (예를 들어, 서열식별번호: 143 또는 196으로 이루어진 군으로부터 선택된 구성원에 기재된 아미노산 서열을 포함함) 및 PD1 결합 모이어티 (예를 들어, 서열식별번호: 103-134, 135, 136, 137, 140, 141 및 142로 이루어진 군으로부터 선택된 구성원에 기재된 아미노산 서열을 포함함)를 포함하는 임의의 다중특이적 결합제를 포함한다.
논의된 바와 같이, 본 발명의 "PD1 결합제"는 PD1에 결합하는 본원에 기재된 분자들 중 임의의 것 (예를 들어, ISVD 예컨대 나노바디), 뿐만 아니라 PD1에 결합하고 본원에 기재된 PD1 결합 모이어티 중 임의의 것을 포함하는 임의의 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다. PD1 결합제는 PD1에 대해 선택적일 수 있거나, 또는 LAG3, CD27, CTLA4, HSA, BTLA, TIM3, ICOS, B7-H3, B7-H4, CD137, GITR, PD-L1, PD-L2, ILT1, ILT2 CEACAM1, CEACAM5, TIM3, TIGIT, VISTA, ILT3, ILT4, ILT5, ILT6, ILT7, ILT8, CD40, OX40, CD137, KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL3, NKG2A, NKG2C, NKG2E, IL-10, IL-17, TSLP에 결합하는 결합제를 추가적으로 포함할 수 있고, 예를 들어, LAG3 결합 모이어티 및 CTLA4 결합 모이어티; LAG3 결합 모이어티 및 BTLA 결합 모이어티; 1 또는 2개의 PD1 결합 모이어티, 1 또는 2개의 LAG3 결합 모이어티, 및 HSA 결합 모이어티; 또는 LAG3 결합 모이어티 및 BTLA 결합 모이어티를 포함한다. 개별적인 PD1 결합제는 더 큰 분자, 예를 들어, 다가 분자 예컨대 F023700910, F023700918, F023700920 또는 F023700925의 일부분인 경우 PD1 결합 모이어티를 지칭할 수 있다.
논의된 바와 같이, 본 발명의 "CTLA4 결합제"는 CTLA4에 결합하는 본원에 기재된 분자들 중 임의의 것 (예를 들어, ISVD 예컨대 나노바디), 뿐만 아니라 CTLA4에 결합하고 본원에 기재된 CTLA4 결합 모이어티 중 임의의 것을 포함하는 임의의 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다. CTLA4 결합제는 PD1, LAG3, CD27, HSA, BTLA, TIM3, ICOS, B7-H3, B7-H4, CD137, GITR, PD-L1, PD-L2, ILT1, ILT2 CEACAM1, CEACAM5, TIM3, TIGIT, VISTA, ILT3, ILT4, ILT5, ILT6, ILT7, ILT8, CD40, OX40, CD137, KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL3, NKG2A, NKG2C, NKG2E, IL-10, IL-17, TSLP에 결합하는 결합제를 포함할 수 있고, 예를 들어, LAG3 결합 모이어티 및 PD1 결합 모이어티; LAG3 결합 모이어티 및 BTLA 결합 모이어티; 1 또는 2개의 PD1 결합 모이어티, 1 또는 2개의 LAG3 결합 모이어티, 및 HSA 결합 모이어티; 또는 LAG3 결합 모이어티 및 BTLA 결합 모이어티를 포함한다. 개별적인 CTLA4 결합제는 더 큰 분자, 예를 들어, 다가 분자 예컨대 예컨대 F023700910, F023700918, F023700920 또는 F023700925의 일부분인 경우 CTLA4 결합 모이어티를 지칭할 수 있다.
일반적으로, 기본적인 항체 구조 단위는 사량체를 포함한다. 각각의 사량체는 2개의 동일한 폴리펩티드 사슬 쌍을 포함하고, 각각의 쌍에는 1개의 "경쇄" (약 25 kDa) 및 1개의 "중쇄" (약 50-70 kDa)가 있다. 각각의 사슬의 아미노-말단 부분은 항원 인식을 주로 담당하는, 약 100 내지 110개 또는 이를 초과하는 개수의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 중쇄의 카르복시-말단 부분은 이펙터 기능을 주로 담당하는 불변 영역을 규정한다. 전형적으로, 인간 경쇄는 카파 및 람다 경쇄로 분류된다. 추가로, 인간 중쇄는 전형적으로 뮤, 델타, 감마, 알파, 또는 엡실론으로 분류되고, 각각 항체의 이소형을 IgM, IgD, IgG, IgA, 및 IgE로 정의한다. 경쇄 및 중쇄 내에서, 가변 및 불변 영역은 아미노산 약 12개 이상의 "J" 영역에 의해 연결되고, 중쇄는 아미노산 약 10개 이상의 "D" 영역을 또한 포함한다. 일반적으로, 문헌 [Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)]을 참조한다. 항원-결합 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편, 및 단일쇄 Fv 분자를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일반적으로 "이뮤노글로불린 단일 가변 도메인" ("ISV" 또는 ISVD"로도 지칭됨)이라는 용어는 또 다른 가변 도메인과의 상호작용 없이 (예를 들어, 통상적인 4-쇄 모노클로날 항체의 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 연구되는 바와 같은 VH/VL 상호작용 없이) 기능적인 항원 결합 부위를 형성할 수 있는 이뮤노글로불린 가변 도메인 (VH, VHH 또는 VL 도메인을 포함하는 중쇄 또는 경쇄 도메인일 수 있음)을 지칭하도록 사용된다. ISVD의 예는 통상의 기술자에게 명백할 것이고, 예를 들어, 나노바디 (VHH, 인간화 VHH 및/또는 낙타화 VH 예컨대 낙타화 인간 VH를 포함함), IgNAR, 도메인, VH 도메인이거나 또는 VH 도메인으로부터 유래된 (단일 도메인) 항체 (예컨대 dAbs™) 및 VL 도메인이거나 또는 VL 도메인으로부터 유래된 (단일 도메인) 항체 (예컨대 dAbs™)를 포함한다. 중쇄 가변 도메인 (예컨대 VH 또는 VHH 도메인)을 기초로 하고/거나 이로부터 유래된 ISVD가 일반적으로 바람직하다. 가장 바람직하게는, ISVD는 나노바디일 것이다.
"나노바디"라는 용어는 일반적으로 WO 2008/020079 또는 WO 2009/138519에 정의된 바와 같고, 따라서 구체적인 측면에서 일반적으로 VHH, 인간화 VHH 또는 낙타화 VH (예컨대 낙타화 인간 VH)를 나타내거나 또는 일반적으로 서열 최적화 VHH (예를 들어, 화학적 안정성 및/또는 용해도, 공지된 인간 프레임워크 영역과의 최대 중첩, 및 최대 발현을 위해 최적화됨)를 나타낸다. 나노바디 또는 나노바디스라는 용어는 아블링스 엔.브이.(Ablynx N.V.)의 등록 상표이고, 따라서 나노바디® 및/또는 나노바디스®를 또한 지칭할 수 있음을 주목한다.
다중특이적 결합제는 제1 및 제2 CTLA4 및 PD1 (또는 PD1 및 CTLA4) 결합 모이어티 (예를 들어, ISVD 또는 나노바디), 및 CTLA4 및 PD1 결합 모이어티의 것 이외의 에피토프 (예를 들어, CD27, LAG3 및/또는 BTLA)에 결합하는 임의적인 1개 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개)의 추가적인 결합 모이어티 (예를 들어, ISVD 또는 나노바디)를 포함하는 분자이다. 예를 들어, F023700910, F023700918, F023700920 및 F023700925은 HSA 결합제를 포함하는 다중특이적 PD1/CTLA4 결합제이다.
결합 모이어티 또는 결합 도메인 또는 결합 단위는 항원에 결합하는 분자 예컨대 ISVD 또는 나노바디이다. 결합 모이어티 또는 결합 도메인 또는 결합 단위는 1개를 초과하는 모이어티, 도메인 또는 단위를 포함하고/거나 또 다른 기능 요소, 예를 들어, 반감기 연장제 (HLE), 표적화 단위 및/또는 소형 분자 예컨대 폴리에틸렌글리콜 (PEG)을 포함하는 더 큰 분자 예컨대 다가 또는 다중특이적 결합제의 일부분일 수 있다. 예를 들어, 102C12 (E1D,L11V,A14P,A74S,K83R,I89L)는 F023700910의 PD1 결합 모이어티 ISVD이다.
1가 CTLA4 또는 PD1 결합제 (예를 들어, ISVD 예컨대 나노바디)는 단일 항원 결합 도메인을 포함하는 분자이다. 2가 CTLA4/PD1 결합제 (예를 들어, ISVD 예컨대 나노바디)는 CTLA4 및 PD1에 결합하는 2개의 항원 결합 도메인 (예를 들어, 이중특이적 항체를 포함하는 통상적인 항체)를 포함한다. 다가 결합제는 1개를 초과하는 항원-결합 도메인을 포함한다. 3가 결합제는 3개의 항원-결합 도메인을 포함한다.
단일특이적 CTLA4 또는 PD1 결합제 (예를 들어, ISVD 예컨대 나노바디)는 단일 항원 (CTLA4 또는 PD1)에 결합하고, 이중특이적 CTLA4/PD1 결합제는 2개의 상이한 항원 (PD1 및 CTLA4)에 결합하며, 다중특이적 결합제는 1개를 초과하는 항원에 결합한다. 삼중특이적 결합제는 3개의 상이한 항원 (예를 들어, PD1 및 CTLA4, 및, 예를 들어, CD27, LAG3 또는 BTLA)에 결합한다.
이중파라토프 결합제 (예를 들어, ISVD 예컨대 나노바디)는 단일특이적이지만, 동일한 항원의 2개의 상이한 에피토프에 결합한다. 다중파라토프 결합제는 동일한 항원에 결합하지만, 항원 내의 1개를 초과하는 에피토프에 결합한다.
또한, 이미 본원에서 지시된 바와 같이, 나노바디의 아미노산 잔기는 논문 [Riechmann and Muyldermans, J. Immunol. Methods 2000 Jun 23; 240 (1-2): 185-195]에서 낙타류로부터의 VHH 도메인에 적용된 바와 같이 또는 본원에서 지칭된 바와 같이, 카바트 등 ("Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91)이 제공한 VH에 대한 일반적인 넘버링에 따라 번호가 매겨진다.
VH 도메인의 아미노산 잔기의 번호를 매기기 위한 대안적인 방법으로, 유사한 방식으로 낙타류로부터의 VHH 도메인 및 나노바디에 또한 적용될 수 있는 방법은 코티아 등 (Nature 342, 877-883 (1989))이 기재한 방법, 소위 "AbM 정의" 및 소위 "접촉 정의"이다. 그러나, 본 설명, 측면 및 도면에서는, 달리 지시되지 않는 한, 리히만(Riechmann) 및 뮤이더만스(Muyldermans)가 VHH 도메인에 적용한 바와 같은 카바트에 따른 넘버링을 따를 것이다.
결합제 예컨대 PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함)와 관련하여 본원에서 사용된 바와 같은 "반감기"라는 용어는 일반적으로 WO 2008/020079의 57면의 o) 단락에서 기재된 바와 같이 정의될 수 있고, 상기 특허 출원에 언급된 바와 같이 아미노산 서열, 화합물 또는 폴리펩티드의 혈청 농도가, 예를 들어 서열 또는 PD1/CTLA4 결합제의 분해 또는 천연 메커니즘에 의한 서열 또는 PD1/CTLA4 결합제의 클리어런스 또는 격리로 인해, 생체 내에서 50%만큼 감소되는데 걸리는 시간을 지칭한다. 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제의 생체 내 반감기를 그 자체로 공지된 임의의 방식으로, 예컨대 약동학 분석에 의해 결정할 수 있다. 적합한 기술이 관련 분야의 기술자에게 명백할 것이고, 일반적으로, 예를 들어, WO 2008/020079의 57면의 o) 단락에 기재된 바와 같을 것이다. WO 2008/020079의 57면의 o) 단락에 또한 언급된 바와 같이, 반감기는 t1/2-알파, t1/2-베타 및 곡선하면적 (AUC)과 같은 파라미터를 사용하여 표현될 수 있다. 이와 관련하여, 본원에서 사용된 바와 같은 "반감기"라는 용어는 특히 t1/2-베타 또는 최종 반감기를 지칭한다는 것을 주목하여야 한다 (t1/2-알파 및/또는 AUC 또는 둘 다가 고려되지 않을 수 있음). 예를 들어, 하기의 실험 파트, 뿐만 아니라 표준 안내서, 예컨대 문헌 [Kenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists] 및 [Peters et al., Pharmacokinete analysis: A Practical Approach (1996)]을 참조한다. 또한 문헌 ["Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron, Marcel Dekker, 2nd Rev. edition (1982)]을 참조한다. 유사하게, "반감기가 증가된다" 또는 "반감기 증가"라는 용어 또한 WO 2008/020079의 57면의 o) 단락에서 정의된 바와 같고, 특히, t1/2-알파 및/또는 AUC 또는 둘 다의 증가와 함께 또는 그의 증가 없이 t1/2-베타의 증가를 지칭한다.
"제어 서열"이라는 구절은 특정 숙주 생물에서의 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필수적인 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 원핵생물에 적합한 제어 서열은, 예를 들어, 프로모터, 임의적으로는 오퍼레이터 서열, 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵생물 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호, 및 인핸서를 사용하는 것으로 공지되어 있다.
핵산 또는 폴리뉴클레오티드는 또 다른 폴리뉴클레오티드와 기능적인 관계에 놓여 있을 때 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들어, 전구서열 또는 분비 리더에 대한 DNA가 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전구단백질로서 발현되는 경우에 이러한 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되거나; 프로모터 또는 인핸서가 코딩 서열의 전사에 영향을 미치는 경우에 이러한 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보솜 결합 부위가 번역을 용이하게 하도록 놓이는 경우에 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 항상은 아니지만 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결되어 있는 DNA 서열들이 인접한다는 것을 의미하고, 분비 리더의 경우에는 인접하고 판독 상에 있는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접할 필요가 없다. 편리한 제한 부위에서의 결찰에 의해 연결이 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 통상적인 관행에 따라 사용된다.
"단리된" PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함), 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 및 벡터는 이들이 생산되는 세포 또는 세포 배양물로부터의 다른 생물학적 분자가 적어도 부분적으로 없다. 이러한 생물학적 분자는 핵산, 단백질, 지질, 탄수화물, 또는 다른 물질 예컨대 세포 잔해물 및 성장 배지를 포함한다. "단리된" PD1/CTLA4 결합제는 추가로 발현 시스템 성분 예컨대 숙주 세포로부터의 생물학적 분자 또는 그의 성장 배지가 적어도 부분적으로 없을 수 있다. 일반적으로, "단리된"이라는 용어는 이러한 생물학적 분자의 완전한 부재 또는 물, 완충제 또는 염의 부재 또는 항체 또는 단편을 포함하는 제약 제형의 성분을 지칭하도록 의도되지 않는다.
본원에서 명확하게 달리 지시되지 않는 한, 도면, 임의의 서열 목록 및 실험 파트/실시예가 본 발명을 추가로 설명하기 위해 제공될 뿐이고, 어떠한 방식으로도 본 발명 및/또는 첨부된 청구범위의 범주를 제한하는 것으로 이해 또는 해석되지 않아야 한다는 것을 주목하여야 한다.
용어가 본원에서 구체적으로 정의되지 않은 경우, 이는 관련 분야에서의 일반적인 의미를 지니고, 이는 기술자에게 명백할 것이다. 예를 들어, 표준 안내서, 예컨대 문헌 [Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2nd.Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]; [F. Ausubel et al., eds., "Current protocols in molecular biology", Green Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)]; [Lewin, "Genes II", John Wiley & Sons, New York, N.Y., (1985)]; [Old et al., "Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering", 2nd edition, University of California Press, Berkeley, CA (1981)]; [Roitt et al., "Immunology" (6th. Ed.), Mosby/Elsevier, Edinburgh (2001)]; [Roitt et al., Roitt's Essential Immunology, 10th Ed. Blackwell Publishing, UK (2001)]; 및 [Janeway et al., "Immunobiology" (6th Ed.), Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, New York (2005)], 뿐만 아니라 본원에서 인용된 일반적인 배경 기술을 참조한다.
하기의 성질들은 PD1 결합제 102C12 내의 지시된 돌연변이:
E1D: 구축물 E1의 제1 아미노산에서의 피로글루탐산 형성을 방지함
L11V: 프리-항체 결합을 감소시킴
A14P: 인간화
W52aV: W52a의 산화를 방지함
N73P: N73 탈아미드화를 방지함
N73Q: N73 탈아미드화를 방지함
N73S: N73 탈아미드화를 방지함
A74S: 인간화
K83R: 인간화
I89L: 프리-항체 결합을 감소시킴
W100aF: W100a의 산화를 방지함
또는 CTLA4 결합제 11F1 내의 지시된 돌연변이와 연관된다:
E1D: 구축물 E1의 제1 아미노산에서의 피로글루탐산 형성을 방지함
L11V: 프리-항체 결합을 감소시킴
A14P: 인간화
Q45R: 안정성을 증가시키도록 돌연변이됨
A74S: 인간화
K83R: 인간화
I89L: 프리-항체 결합을 감소시킴
M96P,Q 또는 R: M96의 산화를 방지함
Q108L: 인간화
본 발명의 범주는 도 15에 기재된 또는 도 16에 기재된 모이어티의 배열을 포함하는 다가 PD1/ CTLA4 결합제를 포함한다. 본 발명의 범주는 도 15에 기재된 PD1 결합제 중 임의의 것 (또는 이러한 PD1 결합제의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 임의의 PD1 결합제) 또는 도 16에 기재된 PD1 결합 모이어티의 배열을 포함하는 다가 PD1 결합제 중 임의의 것 (또는 그의 임의의 PD1 결합 모이어티 중 하나 이상), 및/또는 도 15에 기재된 임의의 CTLA4 결합제 (또는 이러한 LAG3 결합제의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 임의의 CTLA4 결합제) 또는 도 16에 기재된 CTLA4 결합 모이어티의 배열을 포함하는 다가 CTLA4 결합제 중 임의의 것 (또는 그의 임의의 CTLA4 결합 모이어티 중 하나 이상)을 포함하는 PD1/CTLA4 결합제를 또한 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 도 15에 기재된 결합제는 C-말단 연장제 (예를 들어, A), FLAG 및/또는 HIS 태그 (예를 들어, HHHHHH (서열식별번호: 176의 아미노산 148-153); AAHHHHHH (서열식별번호: 176의 아미노산 146-153); 또는 AAADYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKGAAHHHHHH (서열식별번호: 176의 아미노산 120-153))를 내부에 포함하지 않는다. 본 발명의 한 실시양태에서, 임의의 이러한 결합제 또는 CDR은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 점 돌연변이 (예를 들어, 보존적 치환 또는 결실)을 예를 들어 포함하는, 도 15에 기재된 것의 변이체일 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, CTLA4는 인간 CTLA4이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 인간 CTLA4는 하기의 아미노산 서열을 포함한다:
MACLGFQRHK AQLNLATRTW PCTLLFFLLF IPVFCKAMHV AQPAVVLASS
RGIASFVCEY ASPGKATEVR VTVLRQADSQ VTEVCAATYM MGNELTFLDD
SICTGTSSGN QVNLTIQGLR AMDTGLYICK VELMYPPPYY LGIGNGTQIY
VIDPEPCPDS DFLLWILAAV SSGLFFYSFL LTAVSLSKML KKRSPLTTGV
YVKMPPTEPE CEKQFQPYFI PIN
(서열식별번호: 197)
본 발명의 한 실시양태에서, PD1은 인간 PD1이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 인간 PD1은 하기의 아미노산 서열을 포함한다:
MQIPQAPWPV VWAVLQLGWR PGWFLDSPDR PWNPPTFSPA LLVVTEGDNA
TFTCSFSNTS ESFVLNWYRM SPSNQTDKLA AFPEDRSQPG QDCRFRVTQL
PNGRDFHMSV VRARRNDSGT YLCGAISLAP KAQIKESLRA ELRVTERRAE
VPTAHPSPSP RPAGQFQTLV VGVVGGLLGS LVLLVWVLAV ICSRAARGTI
GARRTGQPLK EDPSAVPVFS VDYGELDFQW REKTPEPPVP CVPEQTEYAT
IVFPSGMGTS SPARRGSADG PRSAQPLRPE DGHCSWPL
(서열식별번호: 198)
PD1 결합 모이어티
본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함) 내에 존재하는 하나 이상 (예컨대 1개 또는 2개)의 PD1 결합 모이어티는 바람직하게는 하기와 같다 (2개 이상의 PD1 결합 모이어티가 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재하는 경우, 이들은 동일하거나 상이할 수 있고, 이들이 상이한 경우, 바람직하게는 이들 모두가 본원에 기재된 바와 같은 위치 1, 11, 14, 52a, 73, 74, 83, 89, 100a, 110 및/또는 112에서의 돌연변이의 적합한 조합을 함유하고, 바람직하게는 본원에 기재된 것과 동일한 CDR을 또한 갖는다는 것을 또한 주목하여야 한다. 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재할 수 있는 PD1 결합 모이어티의 일부 바람직하지만 비제한적인 예의 아미노산 서열이 도 3a에서 열거된다. 도 3b는 PD1 결합 모이어티와 서열식별번호: 1 및 2의 아미노산 서열의 정렬을 제공한다.
언급된 바와 같이, 본원에 기재된 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함) 내에 존재하는 PD1 결합 모이어티는 PD1에 결합할 수 있다 (특히, 특이적으로 결합할 수 있음). 특히, 이는 PD1에 결합할 수 있고, PD1과 PD-L1 및/또는 PD-L2 사이의 결합을 억제할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제는 PD1에 결합하고, (예를 들어, 증식 및 시토카인 생산의 PD1 매개 억제로부터 T-세포를 방출시킴으로써) T-세포 매개 면역 반응의 PD1 경로-매개 억제로부터 T-세포를 방출시킨다.
본원에서 추가로 기재된 바와 같이, 본 발명의 한 실시양태에서 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 있는 본 발명의 PD1 결합제는 바람직하게는 102C12 또는 참조 A 내에 또는 102C12 또는 참조 A의 서열 (서열식별번호: 1 또는 2)을 포함하는 결합제 내에 존재하는 것과 CDR (즉 CDR1, CDR2 및 CDR3)의 조합이 동일하다. 표 A-1을 참조한다.
본 발명은 하기 표 A-2에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 102C12의 변이체인 PD1 결합제를 또한 포함한다. 본 발명의 범주는 하기 표 A-2에 기재된 상기 변이체의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 PD1 결합제를 포함한다.
추가적으로, 본 발명은 102C12 또는 하기 표 A-2에 기재된 그의 변이체 중 하나의 CDR1, CDR2 및 CDR3 또는 아미노산 서열을 포함하는 PD1 결합 모이어티를 포함하는 PD1/CTLA4 결합제를 포함한다.
표 A-1. PD1 결합제 102C12 .
Figure pct00002
표 A-2. 최적화 변이체 102C12 PD1 결합제의 서열
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
본 발명은 PD1 결합제의 CDR 중 1개, 2개 또는 3개가 상기 표 A-1 또는 A-2 (예를 들어, 결합제가 서열식별번호: 1, 2, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142 또는 16-47의 아미노산 서열을 포함함) 또는 도 3에 기재되고, 여기서 각각의 CDR이 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 치환, 예를 들어, 보존적 치환을 포함하고/거나 표 A-1 또는 A-2에 기재된 CDR 서열에 비교하여 100, 99, 98, 97, 96 또는 95% 서열 동일성을 포함하고, 이러한 CDR을 갖는 PD1 결합제가 PD1에 결합하는 능력을 유지하는 실시양태를 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 PD1 결합제의 제1 아미노산은 E이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 PD1 결합제의 제1 아미노산은 D이다.
표 A-1에 기재된 PD1 ISVD 세트의 특정 잔기에 대한 카바트 잔기 번호가 하기 서열에서 제시된다:
E 1 VQLVESGGGL 11 V 12 Q 13 A 14 GGSLRLSCAASG 26 S 27 I 28 A 29 S 30 IHAMGW 36 F 37 R 38 Q 39 AP 41 GKERE 46 F 47 V 48 A 49 VITWSGGITYYADSVKGR 66 F 67 T 68 I 69 S 70 RDNA 74 KNTVYLQM 82 N 82a S 82b L 82c K 83 P 84 EDT 87 A 88 I 89 Y 90 Y 91 CAGDKHQSSWYDYW 103 G 104 Q 105 G 106 T 107 L 108 V 109 T 110 V 111 S 112 S 113 (서열식별번호: 2)
ISVD 102C12 (E1D, L11V, A14P, A74S, K83R, I89L)의 특정 잔기에 대한 카바트 잔기 번호가 하기 서열에서 제시된다:
D 1 VQLVESGGG V 11 VQP 14 GGSLRL SCAASGSIAS IHAMGWFRQA PGKEREFVAV ITWSGGITYY ADSVKGRFTI SRDNS 74 KNTVY LQMNSLR 83 PED TAL 89 YYCAGDK HQSSWYDYWG QGTLVTVSS
(서열식별번호: 135)
WO 2008/071447은 PD1에 결합할 수 있는 나노바디 및 그의 용도를 기재한다. WO 2008/071447의 서열식별번호: 348은 102C12로 칭해지는 PD1 특이적 나노바디를 개시하였고, 그의 서열이 본원에서 서열식별번호: 1로서 제공된다. 이러한 서열 및 그의 CDR이 하기 표 A에서 또한 제공된다 (도 2를 또한 참조). 서열식별번호: 2는 서열식별번호: 1을 기초로 하지만 인간화 Q108L 돌연변이가 있는 기준 서열이다.
돌연변이가 본원에서 지칭될 수 있고, 상기 제시된 바와 같이 그의 카바트 번호에 의해 지정된다.
WO 2008/071447은 CTLA4에 결합할 수 있는 나노바디 및 그의 용도를 또한 기재한다. WO 2008/071447의 서열식별번호: 1306은 11F01로 칭해지는 CTLA4 특이적 나노바디를 개시하였고, 그의 서열이 본원에서 서열식별번호: 9로서 제공된다 (도 2를 또한 참조). 이러한 서열 및 그의 CDR이 하기 표 B에서 또한 제공된다.
본 발명의 한 실시양태에서, PD1/CTLA4 결합제는 하기 성질 중 하나 이상을 갖는다:
ㆍ 예를 들어, 약 1 nM (예를 들어, 약 1.2 nM)의 KD로, CTLA4 (예를 들어, 인간 및/또는 시노몰거스 원숭이 CTLA4) (예를 들어, CTLA4-Fc 융합 단백질)에 결합한다;
ㆍ 세포, 예를 들어, CHO 세포의 표면 상의 CTLA4 (예를 들어, 인간 CTLA4)에 결합한다;
ㆍ 세포, 예를 들어, CHO 세포의 표면 상의 PD1 (예를 들어, 인간 PD1)에 결합한다;
ㆍ 예를 들어, CHO 세포 표면 상에서, CD80 및/또는 CD86가 CTLA4, 예를 들어, 세포 표면에 발현된 CTAL4에 결합하는 것을 차단한다;
ㆍ 예를 들어, 세포 예컨대 CHO 세포의 표면 상에서, CD28 (예를 들어, 인간), CD8 알파 (예를 들어, 인간), LAG3 (예를 들어, 인간) 또는 BTLA (예를 들어, 인간)에 결합하지 않는다;
ㆍ 인간, 리서스 원숭이 및/또는 원숭이 혈청 알부민에 결합한다 (결합제가 혈청 알부민 결합제 예컨대 ALB11002를 포함하는 경우);
ㆍ 종양 성장 (예를 들어, 췌장 종양, 예를 들어, 인간 면역 세포를 보유하는 마우스 내의 인간 췌장 종양의 성장)을 억제한다.
본 발명은 서열식별번호: 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함하지만 서열식별번호: 1 또는 2의 서열에 비교하여 하기 돌연변이 중 하나 이상을 포함하는 서열식별번호: 1 또는 2 (102C12, WO 2008/071447: 서열식별번호: 348; 참조 A)의 변이체인 하나 이상의 PD1 결합 모이어티를 포함하는 PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함)를 포함하며,
- 1D 또는 1E;
- 11V;
- 14P;
- 52aV;
- 73Q, 73P 또는 73S;
- 74S;
- 83R;
- 89T;
- 89L; 또는
- 100aF;
예를 들어, PD1 결합 모이어티는 하기 돌연변이 세트 중 하나 이상을 포함한다:
- 1D 또는 1E와 11V, 14P, 74S, 83R 및 89L의 조합;
- 1D와 11V, 14P, 52aV, 73S 또는 73Q 또는 73P, 74S, 83R, 89L 및 100aF의 조합;
- 1E와 11V, 14P, 52aV, 73S 또는 73Q 또는 73P, 74S, 83R, 89L 및 100aF의 조합;
- 89L과 11V, 14P, 52aV, 73S 또는 73Q 또는 73P, 74S, 83R 및 100aF, 및 임의적으로 1D의 조합;
- 89L과 11V의 조합;
- 89L과 110K 또는 110Q의 조합;
- 89L과 112K 또는 112Q의 조합;
- 89L과 11V, 14P,74S, 83R, 및 임의적으로 1D의 조합;
- 110K 또는 110Q와 11V, 14P, 52aV, 73S 또는 73Q 또는 73P, 74S, 83R, 89L 및 100aF 및 1D 또는 1E의 조합;
- 112K 또는 112Q와 11V, 14P, 52aV, 73S 또는 73Q 또는 73P, 74S, 83R, 89L 및 100aF 및 1D 또는 1E의 조합;
- 1D 또는 1E와 11V, 14P, 74S, 83R 및 89L; 및 112K 또는 112Q의 조합;
- 1D 또는 1E와 11V, 14P, 74S, 83R 및 89L; 및 110K 또는 110Q의 조합;
- 89L과 11V 및 110K 또는 110Q의 조합;
- 89L과 11V 및 112K 또는 112Q의 조합;
- 11V와 110K 또는 110Q의 조합; 또는
- 11V와 112K 또는 112Q의 조합.
특히, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함) 내에 존재하는 PD1 결합 모이어티는 서열식별번호: 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서
- 위치 1에서의 아미노산 잔기가 E 및 D로부터 선택되고;
- 위치 11에서의 아미노산 잔기가 L 및 V로부터 선택되고;
- 위치 14에서의 아미노산 잔기가 A 및 P로부터 선택되고;
- 위치 52a에서의 아미노산 잔기가 W 및 V로부터 선택되고;
- 위치 73에서의 아미노산 잔기가 P, S, N 및 Q로부터 선택되고;
- 위치 74에서의 아미노산 잔기가 A 및 S로부터 선택되고;
- 위치 83에서의 아미노산 잔기가 K 및 R로부터 선택되고;
- 위치 89에서의 아미노산 잔기가 T, V, I 및 L로부터 선택되고;
- 위치 100a에서의 아미노산 잔기가 W 및 F로부터 선택되고;
- 위치 110에서의 아미노산 잔기가 T, K 및 Q로부터 선택되며;
- 위치 112에서의 아미노산 잔기가 S, K 및 Q로부터 선택되어,
예를 들어, 하기 중 하나 이상이 사실이며,
(i) 위치 1이 D임;
(ii) 위치 1이 E임;
(iii) 위치 11이 V임;
(iv) 위치 14가 P임;
(v) 위치 52a가 V임;
(vi) 위치 73이 Q, P 또는 S임;
(vii) 위치 74가 S임;
(viii) 위치 83이 R임;
(ix) 위치 89가 T임;
(x) 위치 89가 L임;
(xi) 위치 100a가 F임;
예를 들어, PD1 결합 모이어티는 서열식별번호: 1 또는 2의 아미노산 서열에 비교하여 하기 돌연변이 세트 중 하나 이상을 포함한다:
a. 위치 1이 D 또는 E이고, 위치 11이 V이고, 위치 14가 P이고, 위치 74가 S이고, 위치 83이 R이고, 위치 89가 L임;
b. 위치 1이 D 또는 E이고, 위치 11이 V이고, 위치 14가 P이고, 위치 52a가 V이고, 위치 73이 Q, P 또는 S이고, 위치 74가 S이고, 위치 83이 R이고, 위치 89가 L이고, 위치 100a가 F임;
c. 위치 89가 L이고, 위치 11이 V임;
d. 위치 89가 L이고, 위치 110이 K 또는 Q임;
e. 위치 89가 L이고, 위치 112가 K 또는 Q임;
f. 위치 1이 D 또는 E이고, 위치 11이 V이고, 위치 14가 P이고, 위치 52a가 V이고, 위치 73이 Q, P 또는 S이고, 위치 74가 S이고, 위치 83이 R이고, 위치 89가 L이고, 위치 100a가 F이고, 위치 110이 K 또는 Q임;
g. 위치 1이 D 또는 E이고, 위치 11이 V이고, 위치 14가 P이고, 위치 52a가 V이고, 위치 73이 Q, P 또는 S이고, 위치 74가 S이고, 위치 83이 R이고, 위치 89가 L이고, 위치 100a가 F이고, 위치 112가 K 또는 Q임;
h. 위치 1이 D 또는 E이고, 위치 11이 V이고, 위치 14가 P이고, 위치 74가 S이고, 위치 83이 R이고, 위치 89가 L이고, 위치 110이 K 또는 Q임;
i. 위치 1이 D 또는 E이고, 위치 11이 V이고, 위치 14가 P이고, 위치 74가 S이고, 위치 83이 R이고, 위치 89가 L이고, 위치 112가 K 또는 Q임;
j. 위치 89가 L이고, 위치 11이 V이고, 위치 110이 K 또는 Q임;
k. 위치 89가 L이고, 위치 11이 V이고, 위치 112가 K 또는 Q임;
l. 위치 11이 V이고, 위치 110이 K 또는 Q임; 또는
m. 위치 11이 V이고, 위치 112가 K 또는 Q임.
특정한 실시양태에서, 본 발명의 PD1 결합제 (예를 들어, ISVD 예컨대 나노바디)가 (임의적으로, 110K 또는 110Q 돌연변이 및/또는 112K 또는 112Q 돌연변이와 적합하게 조합되어, 특히 110K 또는 110Q 돌연변이와 조합되어) 위치 89가 T 또는 L이거나; 또는 1이 D 또는 E이고/거나, 11이 V이고/거나, 14가 P이고/거나, 52a가 V이고/거나, 73이 S, Q 또는 P이고/거나, 74가 S이고/거나, 83이 R이고/거나, 89가 L이고/거나 100a가 F이거나; 또는 1이 D 또는 E이고/거나, 11이 V이고/거나, 14가 P이고/거나, 74가 S이고/거나, 83이 R이고/거나 89가 L이거나; 또는 위치 11이 V이고, 위치 89가 L인 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2의 변이체인 아미노산 서열을 포함하는 것이 특히 바람직하다. 본 발명은 위치 11이 V이고 위치 89가 L이며, 임의적으로 110K 또는 110Q 돌연변이가 있는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재하는 PD1 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)는 바람직하게는 하기의 CDR (카바트 관례에 따름)을 포함한다:
- 아미노산 서열 IHAMG (서열식별번호: 3)인 CDR1 (카바트에 따름); 및
- 아미노산 서열 VITXSGGITYYADSVKG (서열식별번호: 4; 여기서 X는 W 또는 V임)인 CDR2 (카바트에 따름); 및
- 아미노산 서열 DKHQSSXYDY (서열식별번호: 5; 여기서 X는 W 또는 F임)인 CDR3 (카바트에 따름).
대안적으로, CDR이 Abm 관례에 따라 제공되는 경우, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재하는 PD1 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)는 바람직하게는 하기의 CDR을 포함한다:
- 아미노산 서열 GSIASIHAMG (서열식별번호: 6)인 CDR1 (Abm에 따름); 및
- 아미노산 서열 VITWSGGITY (서열식별번호: 7)인 CDR2 (Abm에 따름); 및
- 아미노산 서열 DKHQSSXYDY (서열식별번호: 8 (서열식별번호: 5와 동일함); 여기서 X는 W 또는 F임)인 CDR3 (Abm에 따름).
상기 바람직한 CDR은 102C12 (서열식별번호: 1), 참조 A (서열식별번호: 2), 또는 서열식별번호: 16-47 또는 135-142의 아미노산 서열을 포함하는 결합제 내에 존재하는 것과 동일하다. 이러한 결합제들의 CDR1, CDR2 및 CDR3이 있는 결합제는 본 발명의 일부이다.
본 발명의 한 실시양태에서 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재하는 PD1 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)는 또한 하기를 갖는다:
- 각각의 기준 서열의 전체 길이에 걸쳐 각각의 서열 사이의 최대 매치를 제공하도록 알고리즘의 파라미터가 선택된 BLAST 알고리즘으로 비교를 수행했을 때 (예를 들어, 예상 역치: 10; 워드 크기: 3; 질의 범위 내의 최대 매치: 0; BLOSUM 62 매트릭스; 갭 비용: 존재 11, 연장 1; 조건부 구성 점수 매트릭스 조정), 서열식별번호: 1 또는 2의 기준 아미노산 서열과의 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성의 정도 (CDR, 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장, 뿐만 아니라 수반되는 특정 측면에 의해 요구되는 위치 1, 11, 14, 52a, 73, 74, 83, 89, 100a, 110 및/또는 112에서의 돌연변이는 서열 동일성의 정도를 결정하는데 고려되지 않음); 및/또는
- 서열식별번호: 1 또는 2의 기준 아미노산 서열과의 7개 이하, 예컨대 5개 이하, 바람직하게는 3개 이하, 예컨대 단지 3, 2 또는 1개의 "아미노산 차이" (본원에서 정의된 바와 같고, 존재할 수 있는 위치(들) 1, 11, 14, 52a, 73, 74, 83, 89, 100a, 110 및/또는 112에서의 상기 열거된 돌연변이 중 임의의 것을 고려하지 않으며, 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장을 고려하지 않음) (상기 아미노산 차이는, 존재하는 경우, 프레임워크 및/또는 CDR 내에 존재할 수 있지만, 바람직하게는 프레임워크 내에만 존재하고, CDR 내에는 존재하지 않음).
본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재하는 PD1 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)의 다양한 측면 및 바람직한 측면과 관련하여, 서열식별번호: 1 또는 2에 관한 서열 동일성의 정도 및/또는 이러한 본 발명의 결합제 내에 존재할 수 있는 (즉, 서열식별번호: 1 또는 2의 서열에 비교된) "아미노산 차이"의 개수 및 종류에 대해서, 하기를 주목하여야 한다:
(i) PD1 결합 모이어티가 서열식별번호: 1 또는 2의 서열과의 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성의 정도 (CDR, 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장, 뿐만 아니라 수반되는 특정 측면에 의해 요구되는 위치 1, 11, 14, 52a, 73, 74, 83, 89, 100a, 110 및/또는 112에서의 돌연변이는 서열 동일성의 정도를 결정하는데 고려되지 않음)를 갖는다라고 할 때; 및/또는
(ii) PD1 결합 모이어티가 서열식별번호: 1 또는 2의 서열과의 7개 이하, 바람직하게는 5개 이하이고, 예컨대 단지 3, 2 또는 1개의 "아미노산 차이" (마찬가지로, 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장은 고려하지 않고, 수반되는 특정 측면에 의해 요구되는 위치 1, 11, 14, 52a, 73, 74, 83, 89, 100a, 110 및/또는 112에서의 돌연변이는 고려하지 않음)를 갖는다라고 할 때,
이는 수반되는 특정 측면에 의해 요구되는 위치 1, 11, 14, 52a, 73, 74, 83, 89, 100a, 110 및/또는 112에서의 돌연변이 및 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장 이외의 서열식별번호: 1 또는 2의 서열과의 아미노산 차이가 없는 서열을 또한 포함한다.
따라서, 본 발명의 한 구체적인 측면에서, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재하는 PD1 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)는 서열식별번호: 1 또는 2와의 서열 동일성이 100%일 수 있고/거나 (CDR을 포함하지만, 본원에 개시된 위치 1, 11, 14, 52a, 73, 74, 83, 89, 100a, 110 및/또는 112에서의 돌연변이(들) 또는 돌연변이 조합 및/또는 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장을 고려하지 않음), 서열식별번호: 1 또는 2와의 아미노산 차이 (즉, 본원에 개시된 위치 1, 11, 14, 52a, 73, 74, 83, 89, 100a, 110 및/또는 112에서의 돌연변이(들) 또는 돌연변이 조합 및/또는 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장 이외의 차이)가 없을 수 있다.
임의의 아미노산 차이가 존재하는 경우 (즉, 수반되는 본 발명의 특정 측면에 의해 요구되는 위치 1, 11, 14, 52a, 73, 74, 83, 89, 100a, 110 및/또는 112에서의 돌연변이 및 임의의 C-말단 연장 이외의 것), 이러한 아미노산 차이는 CDR 내에 및/또는 프레임워크 영역 내에 존재할 수 있지만, 바람직하게는 프레임워크 영역 내에만 존재하여 (Abm 관례에 의해 정의된 바와 같고, 즉, Abm 관례에 따라 정의된 바와 같은 CDR 내에 존재하지 않음), 즉, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재하는 PD1 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)는 서열식별번호: 1 또는 2 내에 존재하는 것과 동일한 CDR (Abm 관례에 따라 정의됨)을 갖는다.
또한, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재하는 PD1 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)에 (수반되는 특정 측면에 의해 요구되는 위치 1, 11, 14, 52a, 73, 74, 83, 89, 100a, 110 및/또는 112에서의 돌연변이 이외에) 서열식별번호: 1 또는 2의 서열과의 하나 이상의 아미노산 차이가 있는 경우, 존재할 수 있는 (즉, 서열식별번호: 1 또는 2의 서열에 비교된) 이러한 돌연변이/아미노산 차이의 구체적이지만 비제한적인 일부 예는 예를 들어 P41A, P41L, P41S 또는 P41T (특히 P41A) 및/또는 T87A이다. 돌연변이의 다른 예는 하나 이상의 적합한 "인간화" 치환 (그의 적합한 조합)이다; 예를 들어, WO 2009/138519 (또는 WO 2009/138519에 인용된 선행 기술) 및 WO 2008/020079 (또는 WO 2008/020079에 인용된 선행 기술), 뿐만 아니라 WO 2008/020079의 표 A-3 내지 A-8 (가능한 인간화 치환을 나타내는 목록)을 참조한다.
또한, PD1 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)가 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제의 N-말단 부분에 존재하고/거나 N-말단 부분을 형성하는 경우, 이는 바람직하게는 위치 1에 D를 함유한다 (즉, 참조 A 또는 102C12에 비교하여 E1D 돌연변이). (E1D 돌연변이가 있는 다른 PD1 결합 모이어티가 또한 사용될 수 있지만) 이러한 N-말단 PD1 결합 모이어티의 바람직하지만 비제한적인 예가 서열식별번호: 31로서 제공된다. 유사하게, 서열식별번호: 31의 PD1 결합 모이어티가 N-말단 단부가 아니라, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내의 다른 어떤 곳에 존재하는 경우, 이는 바람직하게는 D1E 돌연변이를 함유한다. 따라서, 추가 측면에서, 본 발명은 그의 N-말단 단부에 PD1 결합 모이어티 (본원에서 추가로 기재된 바와 같음)가 있으며, 여기서 상기 PD1 결합 모이어티가 위치 1에 D를 갖고, 바람직하게는 서열식별번호: 31, 135, 140, 141 또는 142인 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 (본원에서 추가로 기재된 바와 같음)에 관한 것이다.
본원에 기재된 측면에 따른 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재하는 PD1 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)는 바람직하게는 L11V 돌연변이, A14P 돌연변이, A74S 돌연변이, K83R 돌연변이, 및/또는 I89L 돌연변이 및 임의적인 E1D 돌연변이의 적합한 조합, 바람직하게는 이러한 돌연변이들 중 임의의 2개의 적합한 조합, 예컨대 이러한 돌연변이 모두를 함유하도록 하는 것이다. PD1 결합 모이어티가 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제의 N-말단 단부에 존재하는 경우, 바람직하게는 서열식별번호: 1 또는 2의 아미노산 서열에 비교하여 E1D 돌연변이가 또한 존재한다. 바람직하지만 비제한적인 예로서, 서열식별번호: 30, 31, 46, 47, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141 또는 142는 서열식별번호: 1 또는 2와의 추가의 아미노산 차이, 즉, A14P, A74S 및 K83R이 있는 PD1 결합 모이어티의 예이다 (추가적으로, 이전 단락들에서 지시된 바와 같이, 서열식별번호: 31 및 47 및 135는 E1D 돌연변이도 있는 것들의 예임).
따라서, 제1 측면에서, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재하는 PD1 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)는
- 아미노산 서열 IHAMG (서열식별번호: 3)인 CDR1 (카바트에 따름); 및
- 아미노산 서열 VITXSGGITYYADSVKG (서열식별번호: 4; 여기서 X는 W 또는 V임)인 CDR2 (카바트에 따름); 및
- 아미노산 서열 DKHQSSXYDY (서열식별번호: 5; 여기서 X는 W 또는 F임)인 CDR3 (카바트에 따름)
을 갖고;
- 각각의 기준 서열의 전체 길이에 걸쳐 각각의 서열 사이의 최대 매치를 제공하도록 알고리즘의 파라미터가 선택된 BLAST 알고리즘으로 비교를 수행했을 때 (예를 들어, 예상 역치: 10; 워드 크기: 3; 질의 범위 내의 최대 매치: 0; BLOSUM 62 매트릭스; 갭 비용: 존재 11, 연장 1; 조건부 구성 점수 매트릭스 조정), 서열식별번호: 1 또는 2의 아미노산 서열과의 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%서열 동일성의 정도 (CDR, 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장, 뿐만 아니라 수반되는 특정 측면에 의해 요구되는 위치 1, 11, 14, 52a, 73, 74, 83, 89, 100a, 110 및/또는 112에서의 돌연변이는 서열 동일성의 정도를 결정하는데 고려되지 않음)
를 갖고/거나;
- 서열식별번호: 1 또는 2의 아미노산 서열과의 7개 이하, 예컨대 5개 이하, 바람직하게는 3개 이하, 예컨대 단지 3, 2 또는 1개의 "아미노산 차이" (본원에서 정의된 바와 같고, 존재할 수 있는 위치(들) 1, 11, 14, 52a, 73, 74, 83, 89, 100a, 110 및/또는 112에서의 상기 열거된 돌연변이 중 임의의 것을 고려하지 않으며, 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장을 고려하지 않음) (상기 아미노산 차이는, 존재하는 경우, 프레임워크 및/또는 CDR 내에 존재할 수 있지만, 바람직하게는 프레임워크 내에만 존재하고, CDR 내에는 존재하지 않음)
를 갖고;
본 발명의 PD1/CTLA4 결합제의 C-말단 단부에 존재하는 경우, 바람직하게는
- C-말단 연장 (X)n (여기서 n은 1 내지 10, 바람직하게는 1 내지 5, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5 (바람직하게는 1 또는 2, 예컨대 1)이고; 각각의 X는 독립적으로 선택되는, 바람직하게는 알라닌 (A), 글리신 (G), 발린 (V), 류신 (L) 또는 이소류신 (I)으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 (바람직하게는 천연 발생) 아미노산 잔기임)
을 갖고;
본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함)의 N-말단 단부에 존재하는 경우, 바람직하게는 위치 1에 D를 갖고 (즉, 서열식별번호: 1 또는 2에 비교하여 E1D 돌연변이),
여기서
- PD1 결합 모이어티의 위치 1에서의 아미노산 잔기는 E 또는 D로부터 선택되고;
- PD1 결합 모이어티의 위치 11에서의 아미노산 잔기는 L 또는 V로부터 선택되고;
- PD1 결합 모이어티의 위치 14에서의 아미노산 잔기는 A 또는 P로부터 선택되고;
- PD1 결합 모이어티의 위치 52a에서의 아미노산 잔기는 W 또는 V로부터 선택되고;
- PD1 결합 모이어티의 위치 73에서의 아미노산 잔기는 N, P, S 또는 Q로부터 선택되고;
- PD1 결합 모이어티의 위치 74에서의 아미노산 잔기는 A 또는 S로부터 선택되고;
- PD1 결합 모이어티의 위치 83에서의 아미노산 잔기는 K 또는 R로부터 선택되고;
- PD1 결합 모이어티의 위치 89에서의 아미노산 잔기는 T, V, I 또는 L로부터 선택되고;
- PD1 결합 모이어티의 위치 100a에서의 아미노산 잔기는 W 또는 F로부터 선택되고;
- PD1 결합 모이어티의 위치 110에서의 아미노산 잔기는 T, K 또는 Q로부터 선택되며;
- PD1 결합 모이어티의 위치 112에서의 아미노산 잔기는 S, K 또는 Q로부터 선택되어;
예를 들어, PD1 결합 모이어티는 하기 중 하나 이상을 갖며,
(i) 위치 1이 E 또는 D임;
(ii) 위치 11이 V임;
(iii) 위치 14가 P임;
(iv) 위치 52a가 V임;
(v) 위치 73이 Q, P 또는 S임;
(vi) 위치 74가 S임
(vii) 위치 83이 R임;
(viii) 위치 89가 L 또는 T임; 또는
(ix) 위치 100a가 F임;
예를 들어, PD1 결합 모이어티는 하기 돌연변이 세트 중 하나 이상을 포함한다:
a. 위치 89가 L이고, 위치 11이 V임;
b. 위치 89가 L이고, 위치 110이 K 또는 Q임;
c. 위치 89가 L이고, 위치 112가 K 또는 Q임;
d. 위치 1이 D 또는 E이고, 위치 11이 V이고, 위치 14가 P이고, 위치 52a가 V이고, 위치 73이 S, Q 또는 P이고, 위치 74가 S이고, 위치 83이 R이고, 위치 89가 L이고, 위치 100a가 F임;
e. 위치 1이 D이고, 위치 11이 V이고, 위치 14가 P이고, 위치 74가 S이고, 위치 83이 R이고, 위치 89가 L임;
f. 위치 1이 E이고, 위치 11이 V이고, 위치 14가 P이고, 위치 74가 S이고, 위치 83이 R이고, 위치 89가 L임;
g. 위치 89가 L이고, 위치 11이 V이고, 위치 110이 K 또는 Q임;
h. 위치 89가 L이고, 위치 11이 V이고, 위치 112가 K 또는 Q임;
i. 위치 1이 D이고, 위치 11이 V이고, 위치 14가 P이고, 위치 74가 S이고, 위치 83이 R이고, 위치 89가 L이고, 위치 112가 K 또는 Q임;
j. 위치 1이 E이고, 위치 11이 V이고, 위치 14가 P이고, 위치 74가 S이고, 위치 83이 R이고, 위치 89가 L이고, 위치 112가 K 또는 Q임;
k. 위치 1이 D이고, 위치 11이 V이고, 위치 14가 P이고, 위치 74가 S이고, 위치 83이 R이고, 위치 89가 L이고, 위치 110이 K 또는 Q임;
l. 위치 1이 D 또는 E이고, 위치 11이 V이고, 위치 14가 P이고, 위치 52a가 V이고, 위치 73이 S, Q 또는 P이고, 위치 74가 S이고, 위치 83이 R이고, 위치 89가 L이고, 위치 100a가 F이고, 위치 110이 K 또는 Q임;
m. 위치 1이 D 또는 E이고, 위치 11이 V이고, 위치 14가 P이고, 위치 52a가 V이고, 위치 73이 S, Q 또는 P이고, 위치 74가 S이고, 위치 83이 R이고, 위치 89가 L이고, 위치 100a가 F이고, 위치 112가 K 또는 Q임;
n. 위치 1이 E이고, 위치 11이 V이고, 위치 14가 P이고, 위치 74가 S이고, 위치 83이 R이고, 위치 89가 L이고, 위치 112가 K 또는 Q임;
o. 위치 11이 V이고, 위치 110이 K 또는 Q임; 또는
p. 위치 11이 V이고, 위치 112가 K 또는 Q임.
추가 측면에서, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재하는 PD1 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)는
- 아미노산 서열 IHAMG (서열식별번호: 3)인 CDR1 (카바트에 따름); 및
- 아미노산 서열 VITXSGGITYYADSVKG (서열식별번호: 4; 여기서 X는 W 또는 V임)인 CDR2 (카바트에 따름); 및
- 아미노산 서열 DKHQSSXYDY (서열식별번호: 5; 여기서 X는 W 또는 F임)인 CDR3 (카바트에 따름)
을 갖고;
- 각각의 기준 서열의 전체 길이에 걸쳐 각각의 서열 사이의 최대 매치를 제공하도록 알고리즘의 파라미터가 선택된 BLAST 알고리즘으로 비교를 수행했을 때 (예를 들어, 예상 역치: 10; 워드 크기: 3; 질의 범위 내의 최대 매치: 0; BLOSUM 62 매트릭스; 갭 비용: 존재 11, 연장 1; 조건부 구성 점수 매트릭스 조정), 서열식별번호: 1 또는 2의 아미노산 서열과의 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성의 정도 (CDR, 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장, 뿐만 아니라 수반되는 특정 측면에 의해 요구되는 위치 1, 11, 14, 52a, 73, 74, 83, 89, 100a, 110 및/또는 112에서의 돌연변이는 서열 동일성의 정도를 결정하는데 고려되지 않음)
를 갖고/거나;
- 서열식별번호: 1 또는 2의 아미노산 서열과의 7개 이하, 예컨대 5개 이하, 바람직하게는 3개 이하, 예컨대 단지 3, 2 또는 1개의 "아미노산 차이" (본원에서 정의된 바와 같고, 존재할 수 있는 위치(들) 1, 11, 14, 52a, 73, 74, 83, 89, 100a, 110 및/또는 112에서의 상기 열거된 돌연변이 중 임의의 것을 고려하지 않으며, 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장을 고려하지 않음) (상기 아미노산 차이는, 존재하는 경우, 프레임워크 및/또는 CDR 내에 존재할 수 있지만, 바람직하게는 프레임워크 내에만 존재하고, CDR 내에는 존재하지 않음)
를 갖고;
본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함)의 C-말단 단부에 존재하는 경우, 바람직하게는
- C-말단 연장 (X)n (여기서 n은 1 내지 10, 바람직하게는 1 내지 5, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5 (바람직하게는 1 또는 2, 예컨대 1)이고; 각각의 X는 독립적으로 선택되는, 바람직하게는 알라닌 (A), 글리신 (G), 발린 (V), 류신 (L) 또는 이소류신 (I)으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 (바람직하게는 천연 발생) 아미노산 잔기임)
을 갖고;
본 발명의 PD1/CTLA4 결합제의 N-말단 단부에 존재하는 경우, 바람직하게는 위치 1에 D를 가져 (즉, 서열식별번호: 1 또는 2에 비교하여 E1D 돌연변이),
상기 PD1 결합 모이어티는 언급된 위치 (카바트에 따른 넘버링)에 하기 아미노산 잔기 (즉, 서열식별번호: 1 또는 2의 아미노산 서열에 비교된 돌연변이) 중 하나 이상을 포함하며,
- 89T 또는 89L;
- 1D 또는 1E;
- 14P;
- 52aV;
- 73Q, 73S 또는 73P;
- 74S;
- 83R;
- 89L; 또는
- 100aF;
예를 들어, PD1 결합 모이어티는 하기 돌연변이 세트 중 하나 이상을 포함한다:
- 89L과 1D, 11V, 14P, 74S 및 83R의 조합;
- 89L과 1E, 11V, 14P, 74S 및 83R의 조합;
- 89L과 1D, 11V, 14P, 52aV, 73S 또는 73Q 또는 73P, 74S, 83R 및/또는 100aF의 조합;
- 89L과 1E, 11V, 14P, 52aV, 73S 또는 73Q 또는 73P, 74S, 83R 및/또는 100aF의 조합;
- 89L과 11V의 조합;
- 89L과 110K 또는 110Q의 조합;
- 89L과 112K 또는 112Q의 조합;
- 89L과 11V 및 110K 또는 110Q의 조합;
- 89L과 11V 및 112K 또는 112Q의 조합;
- 112K 또는 112Q와 1D, 11V, 14P, 74S, 83R 및 89L의 조합;
- 110K 또는 110Q와 1D, 11V, 14P, 74S, 83R 및 89L의 조합;
- 112K 또는 112Q와 1E, 11V, 14P, 74S, 83R 및 89L의 조합;
- 110K 또는 110Q와 1E, 11V, 14P, 74S, 83R 및 89L의 조합;
- 112K 또는 112Q와 1D, 11V, 14P, 52aV, 73S 또는 73P 또는 73Q, 74S, 83R, 89L, 100aF의 조합;
- 110K 또는 110Q와 1D, 11V, 14P, 52aV, 73S 또는 73P 또는 73Q, 74S, 83R, 89L, 100aF의 조합;
- 112K 또는 112Q와 1E, 11V, 14P, 52aV, 73S 또는 73P 또는 73Q, 74S, 83R, 89L, 100aF의 조합;
- 110K 또는 110Q와 1E, 11V, 14P, 52aV, 73S 또는 73P 또는 73Q, 74S, 83R, 89L, 100aF의 조합;
- 11V와 110K 또는 110Q의 조합; 또는
- 11V와 112K 또는 112Q의 조합.
언급된 바와 같이, PD1 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)가 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 C-말단 단부에 존재할 때, PD1 결합 모이어티 (그리고, 결과적으로, 생성된 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제)는 바람직하게는 본원에 기재된 바와 같고/거나 WO 2012/175741 또는 PCT/EP2015/060643 (WO2015/173325)에 기재된 바와 같은 C-말단 연장 X(n)을 갖는다.
언급된 바와 같이, 본 발명에서, (임의적으로, 110K 또는 110Q 돌연변이 및/또는 112K 또는 112Q 돌연변이와 적합하게 조합되어, 특히 110K 또는 110Q 돌연변이와 조합되어) 위치 1이 E 또는 D이고, 위치 11이 V이고, 위치 14가 P이고, 위치 74가 S이고, 위치 83이 R이고, 위치 89가 L이거나; 또는 위치 89가 T이거나, 또는 위치 1이 E 또는 D이고/거나, 위치 11이 V이고/거나, 위치 14가 P이고/거나, 위치 52a가 V이고/거나, 위치 73이 S, Q 또는 P이고/거나, 위치 74가 S이고/거나, 위치 83이 R이고/거나, 위치 89가 L이고/거나 위치 100a이 F이거나; 또는 위치 11이 V이고, 위치 89가 L인 PD1 결합 모이어티가 바람직하다. 위치 11이 V이고 위치 89가 L이며, 임의적으로 110K 또는 110Q 돌연변이가 있는 PD1 결합 모이어티가 더욱 더 바람직하다.
따라서, 한 바람직한 측면에서, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재하는 PD1 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)는
- 아미노산 서열 IHAMG (서열식별번호: 3)인 CDR1 (카바트에 따름); 및
- 아미노산 서열 VITXSGGITYYADSVKG (서열식별번호: 4; 여기서 X는 W 또는 V임)인 CDR2 (카바트에 따름); 및
- 아미노산 서열 DKHQSSXYDY (서열식별번호: 5; 여기서 X는 W 또는 F임)인 CDR3 (카바트에 따름)
을 갖고;
- 각각의 기준 서열의 전체 길이에 걸쳐 각각의 서열 사이의 최대 매치를 제공하도록 알고리즘의 파라미터가 선택된 BLAST 알고리즘으로 비교를 수행했을 때 (예를 들어, 예상 역치: 10; 워드 크기: 3; 질의 범위 내의 최대 매치: 0; BLOSUM 62 매트릭스; 갭 비용: 존재 11, 연장 1; 조건부 구성 점수 매트릭스 조정), 서열식별번호: 1 또는 2의 아미노산 서열과의 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성의 정도 (CDR, 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장, 뿐만 아니라 수반되는 특정 측면에 의해 요구되는 위치 1, 11, 14, 52a, 73, 74, 83, 89, 100a, 110 및/또는 112에서의 돌연변이는 서열 동일성의 정도를 결정하는데 고려되지 않음)
를 갖고/거나;
- 서열식별번호: 1 또는 2의 아미노산 서열과의 7개 이하, 예컨대 5개 이하, 바람직하게는 3개 이하, 예컨대 단지 3, 2 또는 1개의 "아미노산 차이" (본원에서 정의된 바와 같고, 존재할 수 있는 위치(들) 1, 11, 14, 52a, 73, 74, 83, 89, 100a, 110 및/또는 112에서의 상기 열거된 돌연변이 중 임의의 것을 고려하지 않으며, 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장을 고려하지 않음) (상기 아미노산 차이는, 존재하는 경우, 프레임워크 및/또는 CDR 내에 존재할 수 있지만, 바람직하게는 프레임워크 내에만 존재하고, CDR 내에는 존재하지 않음)
를 갖고;
본 발명의 PD1/CTLA4 결합제의 C-말단 단부에 존재하는 경우, 바람직하게는
- C-말단 연장 (X)n (여기서 n은 1 내지 10, 바람직하게는 1 내지 5, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5 (바람직하게는 1 또는 2, 예컨대 1)이고; 각각의 X는 독립적으로 선택되는, 바람직하게는 알라닌 (A), 글리신 (G), 발린 (V), 류신 (L) 또는 이소류신 (I)으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 (바람직하게는 천연 발생) 아미노산 잔기임)
을 갖고;
본 발명의 PD1/CTLA4 결합제의 N-말단 단부에 존재하는 경우, 바람직하게는 위치 1에 D를 갖고 (즉, 서열식별번호: 1 또는 2에 비교하여 E1D 돌연변이),
여기서
- PD1 결합 모이어티의 위치 1에서의 아미노산 잔기는 E 및 D로부터 선택되고;
- PD1 결합 모이어티의 위치 11에서의 아미노산 잔기는 L 및 V로부터 선택되고;
- PD1 결합 모이어티의 위치 14에서의 아미노산 잔기는 A 및 P로부터 선택되고;
- PD1 결합 모이어티의 위치 52a에서의 아미노산 잔기는 W 및 V로부터 선택되고;
- PD1 결합 모이어티의 위치 73에서의 아미노산 잔기는 N, P, S 및 Q로부터 선택되고;
- PD1 결합 모이어티의 위치 74에서의 아미노산 잔기는 A 및 S로부터 선택되고;
- PD1 결합 모이어티의 위치 83에서의 아미노산 잔기는 K 및 R로부터 선택되고;
- PD1 결합 모이어티의 위치 89에서의 아미노산 잔기는 T, L, I 및 V로부터 선택되고;
- PD1 결합 모이어티의 위치 100a에서의 아미노산 잔기는 W 및 F로부터 선택되고;
- PD1 결합 모이어티의 위치 110에서의 아미노산 잔기는 T, K 및 Q로부터 선택되며 (바람직하게는 T임);
- PD1 결합 모이어티의 위치 112에서의 아미노산 잔기는 S, K 및 Q로부터 선택된다 (바람직하게는 S임).
또 다른 바람직한 측면에서, PD1 및 CTLA4에 결합하는 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재하는 PD1 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)는
- 아미노산 서열 IHAMG (서열식별번호: 3)인 CDR1 (카바트에 따름); 및
- 아미노산 서열 VITXSGGITYYADSVKG (서열식별번호: 4; 여기서 X는 W 또는 V임)인 CDR2 (카바트에 따름); 및
- 아미노산 서열 DKHQSSXYDY (서열식별번호: 5; 여기서 X는 W 또는 F임)인 CDR3 (카바트에 따름)
을 갖고;
- 각각의 기준 서열의 전체 길이에 걸쳐 각각의 서열 사이의 최대 매치를 제공하도록 알고리즘의 파라미터가 선택된 BLAST 알고리즘으로 비교를 수행했을 때 (예를 들어, 예상 역치: 10; 워드 크기: 3; 질의 범위 내의 최대 매치: 0; BLOSUM 62 매트릭스; 갭 비용: 존재 11, 연장 1; 조건부 구성 점수 매트릭스 조정), 서열식별번호: 1 또는 2의 아미노산 서열과의 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성의 정도 (CDR, 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장, 뿐만 아니라 수반되는 특정 측면에 의해 요구되는 위치 1, 11, 14, 52a, 73, 74, 83, 89, 100a, 110 및/또는 112에서의 돌연변이는 서열 동일성의 정도를 결정하는데 고려되지 않음)
를 갖고/거나;
- 서열식별번호: 1 또는 2의 아미노산 서열과의 7개 이하, 예컨대 5개 이하, 바람직하게는 3개 이하, 예컨대 단지 3, 2 또는 1개의 "아미노산 차이" (본원에서 정의된 바와 같고, 존재할 수 있는 위치(들) 1, 11, 14, 52a, 73, 74, 83, 89, 100a, 110 및/또는 112에서의 상기 열거된 돌연변이 중 임의의 것을 고려하지 않으며, 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장을 고려하지 않음) (상기 아미노산 차이는, 존재하는 경우, 프레임워크 및/또는 CDR 내에 존재할 수 있지만, 바람직하게는 프레임워크 내에만 존재하고, CDR 내에는 존재하지 않음)
를 갖고;
본 발명의 PD1/CTLA4 결합제의 C-말단 단부에 존재하는 경우, 바람직하게는
- C-말단 연장 (X)n (여기서 n은 1 내지 10, 바람직하게는 1 내지 5, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5 (바람직하게는 1 또는 2, 예컨대 1)이고; 각각의 X는 독립적으로 선택되는, 바람직하게는 알라닌 (A), 글리신 (G), 발린 (V), 류신 (L) 또는 이소류신 (I)으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 (바람직하게는 천연 발생) 아미노산 잔기임)
을 갖고;
본 발명의 PD1/CTLA4 결합제의 N-말단 단부에 존재하는 경우, 바람직하게는 위치 1에 D를 갖고 (즉, 서열식별번호: 1 또는 2에 비교하여 E1D 돌연변이), 여기서 하기 중 하나 이상이 사실이다:
- PD1 모이어티의 위치 1에서의 아미노산 잔기가 E 또는 D임;
- PD1 모이어티의 위치 11에서의 아미노산 잔기가 V임;
- PD1 모이어티의 위치 14에서의 아미노산 잔기가 P임;
- PD1 모이어티의 위치 52a에서의 아미노산 잔기가 V임;
- PD1 모이어티의 위치 73에서의 아미노산 잔기가 S, Q 또는 P임;
- PD1 모이어티의 위치 74에서의 아미노산 잔기가 S임;
- PD1 모이어티의 위치 83에서의 아미노산 잔기가 R임;
- PD1 모이어티의 위치 89에서의 아미노산 잔기가 L임;
- PD1 모이어티의 위치 100a에서의 아미노산 잔기가 F임;
- PD1 모이어티의 위치 110에서의 아미노산 잔기가 바람직하게는 T, K 또는 Q로부터 선택됨; 또는
- PD1 모이어티의 위치 112에서의 아미노산 잔기가 바람직하게는 S, K 또는 Q로부터 선택됨.
한 특정하지만 비제한적인 측면에서, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재하는 PD1 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)는 언급된 위치 (카바트에 따른 넘버링)에 하기의 돌연변이 세트 (즉, 서열식별번호: 1 또는 2의 서열에 비교된 돌연변이)를 포함하며,
- 11V와 89L의 조합;
- 11V와 89L, 1E, 14P, 52aV, 73S 또는 73Q 또는 73P, 74S, 83R 및 100aF의 조합;
- 11V와 89L, 1D, 14P, 52aV, 73S 또는 73Q 또는 73P, 74S, 83R 및 100aF의 조합;
- 11V와 89L, 1D, 14P, 74S 및 83R의 조합;
- 11V와 89L, 1E, 14P, 74S 및 83R의 조합;
- 11V와 110K 또는 110Q의 조합;
- 11V와 112K 또는 112Q의 조합;
- 11V와 89L, 1D, 14P, 74S, 83R 및 110K 또는 110Q의 조합;
- 11V와 89L, 1D, 14P, 74S, 83R 및 112K 또는 112Q의 조합;
- 11V와 89L, 1E, 14P, 74S, 83R 및 110K 또는 110Q의 조합;
- 11V와 89L, 1E, 14P, 74S, 83R 및 112K 또는 112Q의 조합;
- 11V와 89L, 1E, 14P, 52aV, 73S 또는 73Q 또는 73P, 74S, 83R, 100aF 및 110K 또는 110Q의 조합;
- 11V와 89L, 1E, 14P, 52aV, 73S 또는 73Q 또는 73P, 74S, 83R, 100aF 및 112K 또는 112Q의 조합;
- 11V와 89L, 1D, 14P, 52aV, 73S 또는 73Q 또는 73P, 74S, 83R, 100aF 및 110K 또는 110Q의 조합;
- 11V와 89L, 1D, 14P, 52aV, 73S 또는 73Q 또는 73P, 74S, 83R, 100aF 및 112K 또는 112Q의 조합;
- 11V와 89L 및 110K 또는 110Q의 조합; 또는
- 11V와 89L 및 112K 또는 112Q의 조합;
서열식별번호: 1, 2, 16-47 또는 135-142에 기재된 것들과 같은 CDR (예를 들어, 카바트에 따름)을 갖고, 본원에 기재된 바와 같은 서열식별번호: 1, 2, 16-47 또는 135-142의 아미노산 서열과의 전반적인 서열 동일성 정도를 갖는다.
또 다른 특정하지만 비제한적인 측면에서, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재하는 PD1 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)는 언급된 위치 (카바트에 따른 넘버링)에 하기의 돌연변이 세트 (즉, 서열식별번호: 1 또는 2의 서열에 비교된 돌연변이)를 포함하며,
- 89L과 11V의 조합;
- 89L과 89L, 1D, 11V, 14P, 74S 및 83R의 조합;
- 89L과 89L, 1E, 11V, 14P, 74S 및 83R의 조합;
- 89L과 11V, 14P, 52aV, 73S 또는 73Q 또는 73P, 74S, 83R, 100aF 및/또는 1D 또는 1E의 조합;
- 89L과 110K 또는 110Q의 조합;
- 89L과 112K 또는 112Q의 조합;
- 89L과 89L, 1D, 11V, 14P, 74S, 83R; 및 110K 또는 110Q의 조합;
- 89L과 89L, 1E, 11V, 14P, 74S, 83R; 및 112K 또는 112Q의 조합;
- 89L과 11V, 14P, 52aV, 73S 또는 73Q 또는 73P, 74S, 83R, 89L, 100aF, 110K 또는 110Q 및/또는 1D 또는 1E의 조합;
- 89L과 11V, 14P, 52aV, 73S 또는 73Q 또는 73P, 74S, 83R, 89L, 100aF, 112K 또는 112Q 및/또는 1D 또는 1E의 조합;
- 89L과 11V 및 110K 또는 110Q의 조합; 또는
- 89L과 11V 및 112K 또는 112Q의 조합;
서열식별번호: 1, 2, 16-47 또는 135-142에 기재된 것들과 같은 CDR (예를 들어, 카바트에 따름)을 갖고, 본원에 기재된 바와 같은 서열식별번호: 1 또는 2의 아미노산 서열과의 전반적인 서열 동일성 정도를 갖는다.
또 다른 특정하지만 비제한적인 측면에서, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재하는 PD1 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)는 언급된 위치 (카바트에 따른 넘버링)에 하기의 돌연변이 세트 (즉, 서열식별번호: 1 또는 2의 서열에 비교된 돌연변이)를 포함하며,
- 110K 또는 110Q와 1E의 조합;
- 110K 또는 110Q와 1D의 조합;
- 110K 또는 110Q와 11V의 조합;
- 110K 또는 110Q와 14P의 조합;
- 110K 또는 110Q와 52aV의 조합;
- 110K 또는 110Q와 73S 또는 73Q 또는 73P의 조합;
- 110K 또는 110Q와 74S의 조합;
- 110K 또는 110Q와 83R의 조합;
- 110K 또는 110Q와 89L의 조합;
- 110K 또는 110Q와 100aF의 조합; 또는
- 110K 또는 110Q와 11V 및 89L의 조합;
서열식별번호: 1, 2, 116-47 또는 135-142에 기재된 것들과 같은 CDR (카바트에 따름)을 갖고, 본원에 기재된 바와 같은 서열식별번호: 1, 2, 16-47 또는 135-142의 아미노산 서열과의 전반적인 서열 동일성 정도를 갖는다.
또 다른 특정하지만 비제한적인 측면에서, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재하는 PD1 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)는 언급된 위치 (카바트에 따른 넘버링)에 하기의 돌연변이 세트 (즉, 서열식별번호: 1 또는 2의 서열에 비교된 돌연변이)를 포함하며,
- 112K 또는 112Q와 1D의 조합;
- 112K 또는 112Q와 1E의 조합;
- 112K 또는 112Q와 11V의 조합;
- 112K 또는 112Q와 14P의 조합;
- 112K 또는 112Q와 52aV의 조합;
- 112K 또는 112Q와 73S 또는 73Q 또는 73P의 조합;
- 112K 또는 112Q와 74S의 조합;
- 112K 또는 112Q와 83R의 조합;
- 112K 또는 112Q와 89L의 조합;
- 112K 또는 112Q와 100aF의 조합; 또는
- 112K 또는 112Q와 11V 및 89L의 조합;
서열식별번호: 1, 2, 16-47 또는 135-142에 기재된 것들과 같은 CDR (예를 들어, 카바트에 따름)을 갖고, 본원에 기재된 바와 같은 서열식별번호: 1 또는 2의 아미노산 서열과의 전반적인 서열 동일성 정도를 갖는다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재하는 PD1 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)는 위치 89에 T를 포함하고, 서열식별번호: 1, 2, 16-47 또는 135-142에 기재된 것들과 같은 CDR (예를 들어, 카바트에 따름)을 갖고, 본원에 기재된 바와 같은 서열식별번호: 1 또는 2의 아미노산 서열과의 전반적인 서열 동일성 정도를 갖는다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재하는 PD1 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)는 위치 11에 V를, 위치 89에 L을 포함하고, 서열식별번호: 1, 2, 16-47 또는 135-142에 기재된 것들과 같은 CDR (예를 들어, 카바트에 따름)을 갖고, 본원에 기재된 바와 같은 서열식별번호: 1 또는 2의 아미노산 서열과의 전반적인 서열 동일성 정도를 갖는다.
언급된 바와 같이, 본원에 기재된 측면에 따른 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재하는 PD1 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)는 바람직하게는 (서열식별번호: 1 또는 2의 아미노산 서열에 비교하여) L11V 돌연변이, A14P 돌연변이, A74S 돌연변이 K83R 돌연변이 및/또는 I89L 돌연변이 및 임의적인 E1D 돌연변이의 적합한 조합, 바람직하게는 이러한 돌연변이들 중 임의의 2개의 적합한 조합, 예컨대 이러한 돌연변이 모두를 함유하도록 (그리고 마찬가지로, PD1 결합 모이어티가 본 발명의 폴리펩티드의 N-말단 단부에 존재하는 경우, 바람직하게는 E1D 돌연변이를 또한 함유하도록) 하는 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함) 내에 존재하는 PD1 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)는
- 아미노산 서열 GSIASIHAMG (서열식별번호: 6)인 CDR1 (Abm에 따름); 및
- 아미노산 서열 VITXSGGITY (서열식별번호: 7; 여기서 X는 W 또는 V임)인 CDR2 (Abm에 따름); 및
- 아미노산 서열 DKHQSSXYDY (서열식별번호: 5; 여기서 X는 W 또는 F임)인 CDR3 (Abm에 따름)
을 갖고;
- 각각의 기준 서열의 전체 길이에 걸쳐 각각의 서열 사이의 최대 매치를 제공하도록 알고리즘의 파라미터가 선택된 BLAST 알고리즘으로 비교를 수행했을 때 (예를 들어, 예상 역치: 10; 워드 크기: 3; 질의 범위 내의 최대 매치: 0; BLOSUM 62 매트릭스; 갭 비용: 존재 11, 연장 1; 조건부 구성 점수 매트릭스 조정), 서열식별번호: 1 또는 2의 아미노산 서열과의 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성의 정도 (CDR, 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장, 뿐만 아니라 수반되는 특정 측면에 의해 요구되는 위치 1, 11, 14, 52a, 73, 74, 83, 89, 100a, 110 및/또는 112에서의 돌연변이는 서열 동일성의 정도를 결정하는데 고려되지 않음)
를 갖고/거나;
- 서열식별번호: 1 또는 2의 아미노산 서열과의 7개 이하, 예컨대 5개 이하, 바람직하게는 3개 이하, 예컨대 단지 3, 2 또는 1개의 "아미노산 차이" (본원에서 정의된 바와 같고, 존재할 수 있는 위치(들) 1, 11, 14, 52a, 73, 74, 83, 89, 100a, 110 및/또는 112에서의 상기 열거된 돌연변이 중 임의의 것을 고려하지 않으며, 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장을 고려하지 않음) (상기 아미노산 차이는, 존재하는 경우, 프레임워크 및/또는 CDR 내에 존재할 수 있지만, 바람직하게는 프레임워크 내에만 존재하고, CDR 내에는 존재하지 않음)
를 갖고;
본 발명의 PD1/CTLA4 결합제의 C-말단 단부에 존재하는 경우, 바람직하게는
- C-말단 연장 (X)n (여기서 n은 1 내지 10, 바람직하게는 1 내지 5, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5 (바람직하게는 1 또는 2, 예컨대 1)이고; 각각의 X는 독립적으로 선택되는, 바람직하게는 알라닌 (A), 글리신 (G), 발린 (V), 류신 (L) 또는 이소류신 (I)으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 (바람직하게는 천연 발생) 아미노산 잔기임)
을 갖고;
본 발명의 PD1/CTLA4 결합제의 N-말단 단부에 존재하는 경우, 바람직하게는 위치 1에 D를 갖고 (즉, 서열식별번호: 1 또는 2에 비교하여 E1D 돌연변이),
여기서:
- PD1 결합 모이어티의 위치 1에서의 아미노산 잔기는 E 또는 D로부터 선택되고;
- PD1 결합 모이어티의 위치 11에서의 아미노산 잔기는 L 또는 V로부터 선택되고;
- PD1 결합 모이어티의 위치 14에서의 아미노산 잔기는 A 또는 P로부터 선택되고;
- PD1 결합 모이어티의 위치 52a에서의 아미노산 잔기는 W 및 V로부터 선택되고;
- PD1 결합 모이어티의 위치 73에서의 아미노산 잔기는 P, S, N 및 Q로부터 선택되고;
- PD1 결합 모이어티의 위치 74에서의 아미노산 잔기는 A 또는 S로부터 선택되고;
- PD1 결합 모이어티의 위치 83에서의 아미노산 잔기는 K 또는 R로부터 선택되고;
- PD1 결합 모이어티의 위치 89에서의 아미노산 잔기는 T, V, I 또는 L로부터 선택되고;
- PD1 결합 모이어티의 위치 100a에서의 아미노산 잔기는 W 및 F로부터 선택되고;
- PD1 결합 모이어티의 위치 110에서의 아미노산 잔기는 T, K 또는 Q로부터 선택되며;
- PD1 결합 모이어티의 위치 112에서의 아미노산 잔기는 S, K 또는 Q로부터 선택되어;
예를 들어, PD1 결합 모이어티는 하기의 돌연변이 또는 돌연변이 세트 증 하나 이상을 포함한다:
(i) 위치 89가 T 또는 L임;
(ii) 위치 89가 L이고, 위치 11이 V임;
(iii) 위치 1이 D이고, 위치 11이 V이고, 위치 14가 P이고, 위치 74가 S이고, 위치 83이 R이고, 위치 89가 L임;
(iv) 위치 1이 E이고, 위치 11이 V이고, 위치 14가 P이고, 위치 74가 S이고, 위치 83이 R이고, 위치 89가 L임;
(v) 위치 1이 D 또는 E이고, 위치 11이 V이고, 위치 14가 P이고, 위치 52a가 V이고, 위치 73이 S, Q 또는 P이고, 위치 74가 S이고, 위치 83이 R이고, 위치 89가 L이고, 위치 100a가 F임;
(vi) 위치 89가 L이고, 위치 110이 K 또는 Q임;
(vii) 위치 89가 L이고, 위치 112가 K 또는 Q임;
(viii) 위치 89가 L이고, 위치 11이 V이고, 위치 110이 K 또는 Q임;
(ix) 위치 89가 L이고, 위치 11이 V이고, 위치 112가 K 또는 Q임;
(x) 위치 1이 D이고, 위치 11이 V이고, 위치 14가 P이고, 위치 74가 S이고, 위치 83이 R이고, 위치 89가 L이고, 위치 110이 K 또는 Q임;
(xi) 위치 1이 E이고, 위치 11이 V이고, 위치 14가 P이고, 위치 74가 S이고, 위치 83이 R이고, 위치 89가 L이고, 위치 110이 K 또는 Q임;
(xii) 위치 1이 D이고, 위치 11이 V이고, 위치 14가 P이고, 위치 74가 S이고, 위치 83이 R이고, 위치 89가 L이고, 위치 112가 K 또는 Q임;
(xiii) 위치 1이 E이고, 위치 11이 V이고, 위치 14가 P이고, 위치 74가 S이고, 위치 83이 R이고, 위치 89가 L이고, 위치 112가 K 또는 Q임;
(xiv) 위치 1이 D 또는 E이고, 위치 11이 V이고, 위치 14가 P이고, 위치 52a가 V이고, 위치 73이 S, P 또는 Q이고, 위치 74가 S이고, 위치 83이 R이고, 위치 89가 L이고, 위치 100a가 F이고, 위치 110이 K 또는 Q임;
(xv) 위치 1이 D 또는 E이고, 위치 11이 V이고, 위치 14가 P이고, 위치 52a가 V이고, 위치 73이 S, P 또는 Q이고, 위치 74가 S이고, 위치 83이 R이고, 위치 89가 L이고, 위치 100a가 F이고, 위치 112가 K 또는 Q임;
(xvi) 위치 11이 V이고, 위치 110이 K 또는 Q임; 또는
(xvii) 위치 11이 V이고, 위치 112가 K 또는 Q임.
추가 측면에서, 본 발명의 결합 모이어티 내에 존재하는 PD1 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)는
- 아미노산 서열 GSIASIHAMG (서열식별번호: 6)인 CDR1 (Abm에 따름); 및
- 아미노산 서열 VITXSGGITY (서열식별번호: 7; 여기서 X는 W 또는 V임)인 CDR2 (Abm에 따름); 및
- 아미노산 서열 DKHQSSXYDY (서열식별번호: 5; 여기서 X는 W 또는 F임)인 CDR3 (Abm에 따름)
을 갖고;
- 각각의 기준 서열의 전체 길이에 걸쳐 각각의 서열 사이의 최대 매치를 제공하도록 알고리즘의 파라미터가 선택된 BLAST 알고리즘으로 비교를 수행했을 때 (예를 들어, 예상 역치: 10; 워드 크기: 3; 질의 범위 내의 최대 매치: 0; BLOSUM 62 매트릭스; 갭 비용: 존재 11, 연장 1; 조건부 구성 점수 매트릭스 조정), 서열식별번호: 1 또는 2의 아미노산 서열과의 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성의 정도 (CDR, 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장, 뿐만 아니라 수반되는 특정 측면에 의해 요구되는 위치 1, 11, 14, 52a, 73, 74, 83, 89, 100a, 110 및/또는 112에서의 돌연변이는 서열 동일성의 정도를 결정하는데 고려되지 않음)
를 갖고/거나;
- 서열식별번호: 1 또는 2의 아미노산 서열과의 7개 이하, 예컨대 5개 이하, 바람직하게는 3개 이하, 예컨대 단지 3, 2 또는 1개의 "아미노산 차이" (본원에서 정의된 바와 같고, 존재할 수 있는 위치(들) 1, 11, 14, 52a, 73, 74, 83, 89, 100a, 110 및/또는 112에서의 상기 열거된 돌연변이 중 임의의 것을 고려하지 않으며, 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장을 고려하지 않음) (상기 아미노산 차이는, 존재하는 경우, 프레임워크 및/또는 CDR 내에 존재할 수 있지만, 바람직하게는 프레임워크 내에만 존재하고, CDR 내에는 존재하지 않음);
및 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제의 C-말단 단부에 존재하는 경우, 바람직하게는
- C-말단 연장 (X)n (여기서 n은 1 내지 10, 바람직하게는 1 내지 5, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5 (바람직하게는 1 또는 2, 예컨대 1)이고; 각각의 X는 독립적으로 선택되는, 바람직하게는 알라닌 (A), 글리신 (G), 발린 (V), 류신 (L) 또는 이소류신 (I)으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 (바람직하게는 천연 발생) 아미노산 잔기임)
을 갖고;
본 발명의 PD1/CTLA4 결합제의 N-말단 단부에 존재하는 경우, 바람직하게는 위치 1에 D를 가져 (즉, 서열식별번호: 1 또는 2에 비교하여 E1D 돌연변이),
상기 PD1 결합 모이어티는 언급된 위치 (카바트에 따른 넘버링)에 하기의 돌연변이 세트 (즉, 서열식별번호: 1 또는 2의 아미노산 서열에 비교된 돌연변이)를 포함한다:
- 89T 또는 89L;
- 89L과 11V의 조합;
- 89L과 1D, 11V, 14P, 74S 및 83R의 조합;
- 89L과 1E, 11V, 14P, 74S 및 83R의 조합;
- 89L과 1D, 11V, 14P, 52aV, 73S 또는 73P 또는 73Q, 74S, 83R 및 100aF의 조합;
- 89L과 1E, 11V, 14P, 52aV, 73S 또는 73Q 또는 73P, 74S, 83R 및 100aF의 조합;
- 89L과 110K 또는 110Q의 조합;
- 89L과 112K 또는 112Q의 조합;
- 89L과 11V 및 110K 또는 110Q의 조합;
- 89L과 11V 및 112K 또는 112Q의 조합;
- 89L과 1D, 11V, 14P, 74S, 83R 및 110K 또는 110Q의 조합;
- 89L과 1E, 11V, 14P, 74S, 83R 및 110K 또는 110Q의 조합;
- 89L과 1D, 11V, 14P, 74S, 83R 및 112K 또는 112Q의 조합;
- 89L과 1E, 11V, 14P, 74S, 83R 및 112K 또는 112Q의 조합;
- 89L과 1E, 11V, 14P, 52aV, 73S 또는 73P 또는 73Q, 74S, 83R, 100aF 및 110K 또는 110Q의 조합;
- 89L과 1D, 11V, 14P, 52aV, 73S 또는 73P 또는 73Q, 74S, 83R, 100aF 및 112K 또는 112Q의 조합;
- 11V와 110K 또는 110Q의 조합; 또는
- 11V와 112K 또는 112Q의 조합.
언급된 바와 같이, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재하는 PD1 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)가 1가 포맷으로 사용되고/거나 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 (본원에서 정의된 바와 같음)의 C-말단 단부에 존재하는 경우, 바람직하게는 PD1 결합 모이어티 (그리고, 결과적으로, 생성된 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제)는 C-말단 연장 X(n)을 갖고, 이러한 C-말단 연장은 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제에 대해 본원에 기재된 바와 같고/거나 WO 2012/175741 또는 PCT/EP2015/060643 (WO2015/173325)에 기재된 바와 같다.
언급된 바와 같이, 본 발명에서, (임의적으로, 110K 또는 110Q 돌연변이 및/또는 112K 또는 112Q 돌연변이와 적합하게 조합되어, 특히 110K 또는 110Q 돌연변이와 조합되어) 위치 1이 E 또는 D이고, 위치 11이 V이고, 위치 14가 P이고, 위치 74가 S이고, 위치 83이 R이고 위치 89가 L이거나, 또는 위치 89가 T이거나, 또는 위치 1이 E 또는 D이고/거나, 위치 11이 V이고/거나, 위치 14가 P이고/거나, 위치 52a가 V이고/거나, 위치 73이 S, P 또는 Q이고/거나, 위치 74가 S이고/거나, 위치 83이 R이고/거나, 위치 89가 L이고/거나 위치 100a가 F이거나, 또는 위치 11이 V이고 위치 89가 L인 PD1 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)가 바람직하다. 위치 11이 V이고 위치 89가 L이며, 임의적으로 (서열식별번호: 1 또는 2의 아미노산 서열에 비교하여) 110K 또는 110Q 돌연변이가 있는 PD1 결합 모이어티가 또한 바람직하다.
따라서, 한 바람직한 측면에서, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재하는 PD1 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)는
- 아미노산 서열 GSIASIHAMG (서열식별번호: 6)인 CDR1 (Abm에 따름); 및
- 아미노산 서열 VITXSGGITY (서열식별번호: 7; 여기서 X는 W 또는 V임)인 CDR2 (Abm에 따름); 및
- 아미노산 서열 DKHQSSXYDY (서열식별번호: 5; 여기서 X는 W 또는 F임)인 CDR3 (Abm에 따름)
을 갖고;
- 각각의 기준 서열의 전체 길이에 걸쳐 각각의 서열 사이의 최대 매치를 제공하도록 알고리즘의 파라미터가 선택된 BLAST 알고리즘으로 비교를 수행했을 때 (예를 들어, 예상 역치: 10; 워드 크기: 3; 질의 범위 내의 최대 매치: 0; BLOSUM 62 매트릭스; 갭 비용: 존재 11, 연장 1; 조건부 구성 점수 매트릭스 조정), 서열식별번호: 1 또는 2의 아미노산 서열과의 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성의 정도 (CDR, 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장, 뿐만 아니라 수반되는 특정 측면에 의해 요구되는 위치 1, 11, 14, 52a, 73, 74, 83, 89, 100a, 110 및/또는 112에서의 돌연변이는 서열 동일성의 정도를 결정하는데 고려되지 않음)
를 갖고/거나;
- 서열식별번호: 1 또는 2의 아미노산 서열과의 7개 이하, 예컨대 5개 이하, 바람직하게는 3개 이하, 예컨대 단지 3, 2 또는 1개의 "아미노산 차이" (본원에서 정의된 바와 같고, 존재할 수 있는 위치(들) 1, 11, 14, 52a, 73, 74, 83, 89, 100a, 110 및/또는 112에서의 상기 열거된 돌연변이 중 임의의 것은 고려하지 않으며, 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장은 고려하지 않음) (상기 아미노산 차이는, 존재하는 경우, 프레임워크 및/또는 CDR 내에 존재할 수 있지만, 바람직하게는 프레임워크 내에만 존재하고, CDR 내에는 존재하지 않음);
및 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제의 C-말단 단부에 존재하는 경우, 바람직하게는
- C-말단 연장 (X)n (여기서 n은 1 내지 10, 바람직하게는 1 내지 5, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5 (바람직하게는 1 또는 2, 예컨대 1)이고; 각각의 X는 독립적으로 선택되는, 바람직하게는 알라닌 (A), 글리신 (G), 발린 (V), 류신 (L) 또는 이소류신 (I)으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 (바람직하게는 천연 발생) 아미노산 잔기임)
을 갖고;
본 발명의 PD1/CTLA4 결합제의 N-말단 단부에 존재하는 경우, 바람직하게는 위치 1에 D를 갖고 (즉, 서열식별번호: 1 또는 2에 비교하여 E1D 돌연변이),
여기서
- PD1 결합 모이어티의 위치 1에서의 아미노산 잔기는 E 또는 D로부터 선택되고;
- PD1 결합 모이어티의 위치 11에서의 아미노산 잔기는 L 또는 V로부터 선택되고;
- PD1 결합 모이어티의 위치 14에서의 아미노산 잔기는 A 또는 P로부터 선택되고;
- PD1 결합 모이어티의 위치 52a에서의 아미노산 잔기는 W 및 V로부터 선택되고;
- PD1 결합 모이어티의 위치 73에서의 아미노산 잔기는 P, N, S 및 Q로부터 선택되고;
- PD1 결합 모이어티의 위치 74에서의 아미노산 잔기는 A 또는 S로부터 선택되고;
- PD1 결합 모이어티의 위치 83에서의 아미노산 잔기는 K 또는 R로부터 선택되고;
- PD1 결합 모이어티의 위치 89에서의 아미노산 잔기는 T, V I 또는 L이고;
- PD1 결합 모이어티의 위치 100a에서의 아미노산 잔기는 W 및 F로부터 선택되고;
- PD1 결합 모이어티의 위치 110에서의 아미노산 잔기는 T, K 또는 Q로부터 선택되며 (바람직하게는 T임);
- PD1 결합 모이어티의 위치 112에서의 아미노산 잔기는 S, K 또는 Q로부터 선택된다 (바람직하게는 S임).
또 다른 바람직한 측면에서, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재하는 PD1 결합 모이어티는
- 아미노산 서열 GSIASIHAMG (서열식별번호: 6)인 CDR1 (Abm에 따름); 및
- 아미노산 서열 VITXSGGITY (서열식별번호: 7; 여기서 X는 W 또는 V임)인 CDR2 (Abm에 따름); 및
- 아미노산 서열 DKHQSSXYDY (서열식별번호: 5; 여기서 X는 W 또는 F임)인 CDR3 (Abm에 따름)
을 갖고;
- 각각의 기준 서열의 전체 길이에 걸쳐 각각의 서열 사이의 최대 매치를 제공하도록 알고리즘의 파라미터가 선택된 BLAST 알고리즘으로 비교를 수행했을 때 (예를 들어, 예상 역치: 10; 워드 크기: 3; 질의 범위 내의 최대 매치: 0; BLOSUM 62 매트릭스; 갭 비용: 존재 11, 연장 1; 조건부 구성 점수 매트릭스 조정), 서열식별번호: 1 또는 2의 아미노산 서열과의 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성의 정도 (CDR, 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장, 뿐만 아니라 수반되는 특정 측면에 의해 요구되는 위치 1, 11, 14, 52a, 73, 74, 83, 89, 100a, 110 및/또는 112에서의 돌연변이는 서열 동일성의 정도를 결정하는데 고려되지 않음)
를 갖고/거나;
- 서열식별번호: 1 또는 2의 아미노산 서열과의 7개 이하, 예컨대 5개 이하, 바람직하게는 3개 이하, 예컨대 단지 3, 2 또는 1개의 "아미노산 차이" (본원에서 정의된 바와 같고, 존재할 수 있는 위치(들) 1, 11, 14, 52a, 73, 74, 83, 89, 100a, 110 및/또는 112에서의 상기 열거된 돌연변이 중 임의의 것은 고려하지 않으며, 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장은 고려하지 않음) (상기 아미노산 차이는, 존재하는 경우, 프레임워크 및/또는 CDR 내에 존재할 수 있지만, 바람직하게는 프레임워크 내에만 존재하고, CDR 내에는 존재하지 않음);
및 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제의 C-말단 단부에 존재하는 경우, 바람직하게는
- C-말단 연장 (X)n (여기서 n은 1 내지 10, 바람직하게는 1 내지 5, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5 (바람직하게는 1 또는 2, 예컨대 1)이고; 각각의 X는 독립적으로 선택되는, 바람직하게는 알라닌 (A), 글리신 (G), 발린 (V), 류신 (L) 또는 이소류신 (I)으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 (바람직하게는 천연 발생) 아미노산 잔기임)
을 갖고;
본 발명의 PD1/CTLA4 결합제의 N-말단 단부에 존재하는 경우, 바람직하게는 위치 1에 D를 갖고 (즉, 서열식별번호: 1 또는 2에 비교하여 E1D 돌연변이),
여기서 하기 중 하나 이상이 사실이다:
- PD1 결합 모이어티의 위치 1에서의 아미노산 잔기가 D 또는 E임;
- PD1 결합 모이어티의 위치 11에서의 아미노산 잔기가 V임;
- PD1 결합 모이어티의 위치 14에서의 아미노산 잔기가 P임;
- PD1 결합 모이어티의 위치 52a에서의 아미노산 잔기가 V임;
- PD1 결합 모이어티의 위치 73에서의 아미노산 잔기가 S, P 또는 Q임;
- PD1 결합 모이어티의 위치 74에서의 아미노산 잔기가 S임;
- PD1 결합 모이어티의 위치 83에서의 아미노산 잔기가 R임;
- PD1 결합 모이어티의 위치 89에서의 아미노산 잔기가 L임;
- PD1 결합 모이어티의 위치 100a에서의 아미노산 잔기가 F임;
- PD1 결합 모이어티의 위치 110에서의 아미노산 잔기가 T, K 및 Q로부터 선택됨; 또는
- PD1 결합 모이어티의 위치 112에서의 아미노산 잔기가 S, K 및 Q로부터 선택됨.
한 특정하지만 비제한적인 측면에서, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함) 내에 존재하는 PD1 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)는 언급된 위치 (카바트에 따른 넘버링)에 하기의 돌연변이 세트 (즉, 서열식별번호: 1 또는 2의 서열에 비교된 돌연변이)를 포함하며,
- 11V와 89L의 조합;
- 11V와 1D, 14P, 74S, 83R 및 89L의 조합;
- 11V와 1E, 14P, 74S, 83R 및 89L의 조합;
- 11V와 14P, 52aV, 73S 또는 73Q 또는 73P, 74S, 83R, 89L, 100aF 및 1E 또는 1D의 조합;
- 11V와 110K 또는 110Q의 조합;
- 11V와 112K 또는 112Q의 조합;
- 11V와 14P, 52aV, 73S 또는 73Q 또는 73P, 74S, 83R, 89L, 100aF, 110K 또는 110Q 및 1E 또는 1D의 조합;
- 11V와 14P, 52aV, 73S 또는 73Q 또는 73P, 74S, 83R, 89L, 100aF, 112K 또는 112Q 및 1E 또는 1D의 조합;
- 11V와 89L 및 110K 또는 110Q의 조합;
- 11V와 89L 및 112K 또는 112Q의 조합;
- 110K 또는 110Q와 1D, 11V,14P, 74S, 83R 및 89L의 조합;
- 110K 또는 110Q와 1E, 11V, 14P, 74S, 83R 및 89L의 조합;
- 112K 또는 112Q와 1D, 11V,14P, 74S, 83R 및 89L의 조합; 또는
- 112K 또는 112Q와 1E, 11V, 14P, 74S, 83R 및 89L의 조합
서열식별번호: 1, 2, 16-47 또는 135-142에 기재된 것들과 같은 CDR (예를 들어, Abm에 따름)을 갖고, 본원에 기재된 바와 같은 서열식별번호: 1 또는 2의 아미노산 서열과의 전반적인 서열 동일성 정도를 갖는다.
또 다른 특정하지만 비제한적인 측면에서, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재하는 PD1 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)는 언급된 위치 (카바트에 따른 넘버링)에 하기의 돌연변이 세트 (즉, 서열식별번호: 1 또는 2의 서열에 비교된 돌연변이)를 포함하며,
- 89L과 11V의 조합;
- 89L과 1E, 11V, 14P, 74S 및 83R의 조합;
- 89L과 1D, 11V, 14P, 74S 및 83R의 조합;
- 89L과 11V, 14P, 52aV, 73S 또는 73Q 또는 73P, 74S, 83R, 100aF 및 1E 또는 1D의 조합;
- 89L과 110K 또는 110Q의 조합;
- 89L과 112K 또는 112Q의 조합;
- 89L과 1E, 11V, 14P, 74S, 83R 및 110K 또는 110Q의 조합;
- 89L과 1D, 11V, 14P, 74S, 83R 및 110K 또는 110Q의 조합;
- 89L과 1E, 11V, 14P, 74S, 83R 및 112K 또는 112Q의 조합;
- 89L과 1D, 11V, 14P, 74S, 83R 및 112K 또는 112Q의 조합;
- 89L과 11V, 14P, 52aV, 73S 또는 73Q 또는 73P, 74S, 83R, 100aF, 110K 또는 110Q 및 1E 또는 1D의 조합;
- 89L과 11V, 14P, 52aV, 73S 또는 73Q 또는 73P, 74S, 83R, 100aF, 112K 또는 112Q 및 1E 또는 1D의 조합;
- 89L과 11V 및 110K 또는 110Q의 조합; 또는
- 89L과 11V 및 112K 또는 112Q의 조합;
서열식별번호: 1, 2, 16-47 또는 135-142에 기재된 것들과 같은 CDR (예를 들어, Abm에 따름)을 갖고, 본원에 기재된 바와 같은 서열식별번호: 1 또는 2의 아미노산 서열과의 전반적인 서열 동일성 정도를 갖는다.
또 다른 특정하지만 비제한적인 측면에서, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재하는 PD1 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)는 언급된 위치 (카바트에 따른 넘버링)에 하기의 돌연변이 세트 (즉, 서열식별번호: 2의 서열에 비교된 돌연변이)를 포함하며,
- 110K 또는 110Q와 11V의 조합;
- 110K 또는 110Q와 1E, 11V, 14P, 74S, 83R 및 89L의 조합;
- 110K 또는 110Q와 1D, 11V, 14P, 74S, 83R 및 89L의 조합;
- 110K 또는 110Q와 11V, 14P, 52aV, 73S 또는 73Q 또는 73P, 74S, 83R, 89L 및 100aF, 및 1E 또는 1D의 조합;
- 110K 또는 110Q와 89L의 조합; 또는
- 110K 또는 110Q와 11V 및 89L의 조합;
서열식별번호: 1, 2, 16-47 또는 135-142에 기재된 것들과 같은 CDR (예를 들어, Abm에 따름)을 갖고, 본원에 기재된 바와 같은 서열식별번호: 1 또는 2의 아미노산 서열과의 전반적인 서열 동일성 정도를 갖는다.
또 다른 특정하지만 비제한적인 측면에서, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함) 내에 존재하는 PD1 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)는 언급된 위치 (카바트에 따른 넘버링)에 하기의 돌연변이 세트 (즉, 서열식별번호: 1 또는 2의 서열에 비교된 돌연변이)를 포함하며,
- 112K 또는 112Q와 11V의 조합;
- 112K 또는 112Q와 1E, 11V, 14P, 74S, 83R 및 89L의 조합;
- 112K 또는 112Q와 1D, 11V, 14P, 74S, 83R 및 89L의 조합;
- 112K 또는 112Q와 11V, 14P, 52aV, 73S 또는 73Q 또는 73P, 74S, 83R, 89L 및 100aF, 및 1E 또는 1D의 조합;
- 112K 또는 112Q와 89L의 조합; 또는
- 112K 또는 112Q와 11V 및 89L의 조합;
서열식별번호: 1, 2, 16-47 또는 135-142에 기재된 것들과 같은 CDR (예를 들어, Abm에 따름)을 갖고, 본원에 기재된 바와 같은 서열식별번호: 1 또는 2의 아미노산 서열과의 전반적인 서열 동일성 정도를 갖는다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함) 내에 존재하는 PD1 결합제(들)는 위치 89에 T 또는 L을 포함하고, 서열식별번호: 1, 2, 16-47 또는 135-142에 기재된 것들과 같은 CDR (예를 들어, Abm에 따름)을 갖고, 본원에 기재된 바와 같은 서열식별번호: 1 또는 2의 아미노산 서열과의 전반적인 서열 동일성 정도를 갖는다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재하는 PD1 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)는 위치 11에 V를, 위치 89에 L을 포함하고, 서열식별번호: 1, 2, 16-47 또는 135-142에 기재된 것들과 같은 CDR (예를 들어, Abm에 따름)을 갖고, 본원에 기재된 바와 같은 서열식별번호: 1 또는 2의 아미노산 서열과의 전반적인 서열 동일성 정도를 갖는다.
언급된 바와 같이, 본원에 기재된 측면에 따른 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재하는 PD1 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)는 바람직하게는 (서열식별번호: 1 또는 2의 아미노산 서열에 비교하여) 임의적인 E1D 돌연변이, L11V 돌연변이, A14P 돌연변이, A74S 돌연변이, K83R 돌연변이, 및/또는 I89L 돌연변이의 적합한 조합, 바람직하게는 이러한 돌연변이들 중 임의의 2개의 적합한 조합, 예컨대 이러한 돌연변이 중 5개 또는 6개 모두를 함유하도록 (PD1 결합 모이어티가 본 발명의 폴리펩티드의 N-말단 단부에 존재하는 경우, 바람직하게는 E1D 돌연변이를 또한 함유하도록) 하는 것이다.
본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재할 수 있는 PD1 결합 모이어티의 일부 바람직하지만 비제한적인 예가 서열식별번호: 16 내지 47 또는 135-142에서 제공되고, 이러한 서열 중 하나 이상을 적합하게 포함하는 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제가 본 발명의 추가 측면을 형성한다.
본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재할 수 있는 일부 바람직한 PD1 결합 모이어티는 서열식별번호: 30, 31, 16-47 또는 135-142의 서열이다. 이들 중에서, 서열식별번호: 31이 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제의 N-말단 단부에 존재하기에 특히 적합하고, 서열식별번호: 46이 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제의 C-말단 단부에 존재하기에 특히 적합하다.
PD1 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)가 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제의 C-말단 단부에 존재하고/거나 이를 형성하는 경우, 이는 바람직하게는 화학식 (X)n (여기서 n은 1 내지 10, 바람직하게는 1 내지 5, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5 (바람직하게는 1 또는 2, 예컨대 1)이고; 각각의 X는 (한 바람직한 측면에 따르면, 어떠한 시스테인 잔기도 포함하지 않지만) 천연 발생 아미노산 잔기로부터 독립적으로 선택되고, 바람직하게는 알라닌 (A), 글리신 (G), 발린 (V), 류신 (L) 또는 이소류신 (I)으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 (바람직하게는 천연 발생) 아미노산 잔기임)의 C-말단 연장이 있다.
이러한 C-말단 연장 X(n)의 일부 바람직하지만 비제한적인 예에 따르면, X 및 n은 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함)에 대해 본원에서 추가로 기재된 바와 같을 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함) 내에 존재하는 PD1 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)가 (서열식별번호: 1 또는 2의 아미노산 서열에 비교하여) 위치 110 또는 112에서의 돌연변이를 함유하는 경우 (임의적으로, 본원에 기재된 바와 같은 위치 1, 11, 14, 74, 83 및/또는 89에서의 돌연변이와 조합됨), 프레임워크 4 (위치 109에서 시작됨)의 5개의 C-말단 아미노산 잔기는 하기와 같이 치환될 수 있다:
(i) C-말단 연장이 존재하지 않는 경우: VTVKS (서열식별번호: 88), VTVQS (서열식별번호: 89), VKVSS ( 서열식별번호: 90) 또는 VQVSS ( 서열식별번호: 91); 또는
(ii) C-말단 연장이 존재하는 경우: VTVKSX(n) ( 서열식별번호: 92), VTVQSX(n) (서열식별번호: 93), VKVSSX(n) (서열식별번호: 94) 또는 VQVSSX(n) (서열식별번호: 95), 예컨대 VTVKSA (서열식별번호: 96), VTVQSA (서열식별번호: 97), VKVSSA (서열식별번호: 98) 또는 VQVSSA (서열식별번호: 99).
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함) 내에 존재하는 PD1 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)가 (서열식별번호: 1 또는 2의 아미노산 서열에 비교하여) 위치 110 또는 112에서의 돌연변이를 함유하지 않는 경우 (본원에 기재된 바와 같은 위치 1 (임의적), 11, 14, 74, 83 및/또는 89에서의 돌연변이만 함유함), 프레임워크 4 (위치 109에서 시작됨)의 C-말단의 5개의 아미노산 잔기는 일반적으로 하기와 같이 치환될 것이다:
(i) C-말단 연장이 존재하지 않는 경우: VTVSS (서열식별번호: 100) (서열식별번호: 2의 서열에서와 같음); 또는
(ii) C-말단 연장이 존재하는 경우: VTVSSX(n) (서열식별번호: 101) 예컨대 VTVSSA (서열식별번호: 102). 이러한 C-말단 서열에서, X 및 n은 본원에서 C-말단 연장에 대해 정의된 바와 같다.
CTLA4 결합 모이어티
본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함) 내에 존재하는 하나 이상 (예컨대 1개 또는 2개)의 CTLA4 결합 모이어티는 바람직하게는 (서열식별번호: 9의 아미노산 서열과 비교하여) 하기와 같다 (2개 이상의 CTLA4 결합 모이어티가 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재하는 경우, 이들은 동일하거나 상이할 수 있고, 이들이 상이한 경우, 바람직하게는 이들 모두가 본원에 기재된 바와 같은 위치 1, 11, 14, 45, 74, 83 89, 96, 108, 110 및/또는 112에서의 돌연변이 (돌연변이의 적합한 조합)을 함유하고, 바람직하게는 본원에 기재된 것과 동일한 CDR을 또한 갖는다는 것을 또한 주목하여야 함). 본 발명의 폴리펩티드 (예를 들어, PD1/CTLA4 결합제) 내에 존재할 수 있는 CTLA4 결합제의 일부 바람직하지만 비제한적인 예의 아미노산 서열이 도 4a에서 열거된다. 도 4b는 CTLA4 결합 모이어티와 서열식별번호: 9의 아미노산 서열의 정렬을 제공한다.
본원에서 추가로 기재된 바와 같이, 본 발명의 한 실시양태에서 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재하는 본 발명의 CTLA4 결합제는 바람직하게는 11F1 또는 11F1의 서열 (서열식별번호: 9)을 포함하는 결합제 내에 존재하는 것과 CDR (즉 CDR1, CDR2 및 CDR3)의 조합이 동일하다. 표 B-1을 참조한다.
본 발명은 하기 표 B-2에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 11F1의 변이체인 CTLA4 결합제를 또한 포함한다. 본 발명의 범주는 하기 표 B-2에 기재된 상기 변이체의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 CTLA4 결합제를 포함한다.
추가적으로, 본 발명은 11F1 또는 하기 표 B-2에 기재된 그의 변이체 중 하나의 CDR1, CDR2 및 CDR3 또는 아미노산 서열을 포함하는 CTLA4 결합 모이어티를 포함하는 PD1/CTLA4 결합제를 포함한다.
표 B-1. CTLA4 결합제 11F1 (11F01)
Figure pct00008
표 B-2. CTLA4 결합제 11F1 변이체
Figure pct00009
*CDR: 밑줄 및/또는 볼드체.
본 발명은 CTLA4 결합제의 CDR 중 1개, 2개 또는 3개가 상기 표 B-1 또는 B-2에 기재되고 (예를 들어, 11F01 또는 11F01 (E1D, L11V, A14P, Q45R, A74S, K83R, V89L, M96P, Q108L)의 것), 여기서 각각의 CDR이 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 치환, 예를 들어, 보존적 치환을 포함하고/거나 표 B-1 또는 B-2에 기재된 CDR 서열에 비교하여 100, 99, 98, 97, 96 또는 95% 서열 동일성을 포함하고, 이러한 CDR을 갖는 CTLA4 결합제가 CTLA4에 결합하는 능력을 유지하는 실시양태를 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 CTLA4 결합제의 제1 아미노산은 E이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 PD1 결합제의 제1 아미노산은 D이다.
서열식별번호: 104의 잔기 1은 D 또는 E일 수 있다. 잔기 1이 D이면, CTLA4 결합제가 1D로 지정될 수 있고, 잔기 1이 E이면, CTLA4 결합제가 1E로 지정될 수 있다.
본원에 기재된 나노바디 11F01을 기초로 하는 CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD 예컨대 나노바디)의 특정 잔기에 대한 카바트 잔기 번호가 하기 서열에서 제시된다:
E 1 VQLVESGGGL 11 V 12 Q 13 A 14 GGSLRLSCAASG 26 G 27 T 28 F 29 S 30 FYGMGW 36 F 37 R 38 Q 39 APGKEQ 45 E 46 F 47 V 48 A 49 DIRTSAGRTYYADSVKGR 66 F 67 T 68 I 69 S 70 RDN 73 A 74 KNTVYLQMN 82a S 82b L 82c K 83 P 84 EDT 87 A 88 V 89 Y 90 Y 91 CAAEM 96 SGISGWDYW 103 G 104 Q 105 G 106 TQ 108 V 109 T 110 V 111 S 112 S 113
(서열식별번호: 9)
본원에 기재된 CTLA4 결합제 11F01 (E1D, L11V, A14P, Q45R, A74S, K83R, V89L, M96P, Q108L)의 특정 잔기에 대한 카바트 잔기 번호가 하기 서열에서 제시된다:
D 1 VQLVESGGGV 11 VQP 14 GGSLRLSCAASGGTFSFYGMG
WFRQAPGKER 45 EFVADIRTSAGRTYYADSVKGRFTISRDN 73 S 74 KNTVYLQMNSLR 83 PEDTAL 89 YYCAAEP 96 SGISGWDYWGQGTL 108 VTVSS
(서열식별번호: 143)
돌연변이가 본원에서 지칭될 수 있고, 상기 제시된 바와 같이 그의 카바트 번호에 의해 지정된다.
본 발명의 한 실시양태에서, CTLA4 결합제 11F01은 위치 73에서의 돌연변이, 예를 들어, N73X (여기서 X는 S, V, G, R, Q, M, H, T, D, E, W, F, K, A, Y 또는 P (또는 N 이외의 임의의 아미노산)임)를 포함한다.
언급된 바와 같이, 본원에 기재된 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재하는 CTLA4 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)는 CTLA4에 결합할 수 있다 (특히, 특이적으로 결합할 수 있음). 특히, 이는 CTLA4에 결합함으로써, CD80 및/또는 CD86 (예를 들어, 항원-제시 세포 상에 있음)이 CTLA4 (예를 들어, T 세포 상에 있음)에 결합하는 것을 방지할 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, CTLA4 신호전달의 차단이 초래되는 것은 T-세포 활성화를 연장하고, T-세포 증식을 복구하며, 따라서 T-세포-매개 면역을 증폭시키고, 이론적으로 이는 환자가 항종양 면역 반응에 착수하는 능력을 증강시킨다.
일반적으로, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재하는 CTLA4 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)는 하기의 돌연변이 또는 돌연변이 세트 (즉, 서열식별번호: 9의 서열에 비교된 돌연변이)를 포함하는 서열식별번호: 9 (11F01, WO 2008/071447: 서열식별번호: 1306)의 변이체이다:
- 89T 또는 89L;
- 89L과 1D, 11V, 14P, 45R, 74S, 83R, 96P 및 108L의 조합;
- 89L과 1E, 11V, 14P, 45R, 74S, 83R, 96P 및 108L의 조합;
- 89L과 11V의 조합;
- 89L과 110K 또는 110Q의 조합;
- 89L과 112K 또는 112Q의 조합;
- 89L과 11V 및 110K 또는 110Q의 조합;
- 89L과 11V 및 112K 또는 112Q의 조합;
- 89L과 1D, 11V, 14P, 45R, 74S, 83R, 89L, 96P, 108L 및 110K 또는 110Q의 조합;
- 89L과 1E, 11V, 14P, 45R, 74S, 83R, 89L, 96P, 108L 및 110K 또는 110Q의 조합;
- 89L과 1D, 11V, 14P, 45R, 74S, 83R, 89L, 96P, 108L 및 112K 또는 112Q의 조합; 또는
- 89L과 1E, 11V, 14P, 45R, 74S, 83R, 89L, 96P, 108L 및 112K 또는 112Q의 조합;
- 11V와 110K 또는 110Q의 조합; 또는
- 11V와 112K 또는 112Q의 조합.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재하는 CTLA4 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)에서:
- 위치 1에서의 아미노산 잔기가 E 또는 D로부터 선택되고;
- 위치 11에서의 아미노산 잔기가 L 또는 V로부터 선택되고;
- 위치 14에서의 아미노산 잔기가 A 또는 P로부터 선택되고;
- 위치 45의 아미노산 잔기가 Q 또는 R로부터 선택되고;
- 위치 74에서의 아미노산 잔기가 A 또는 S로부터 선택되고;
- 위치 83에서의 아미노산 잔기가 K 또는 R로부터 선택되고;
- 위치 89에서의 아미노산 잔기가 T, V 또는 L로부터 선택되고;
- 위치 96의 아미노산 잔기가 M 또는 P로부터 선택되고;
- 위치 108의 아미노산 잔기가 Q 또는 L로부터 선택되고;
- 위치 110에서의 아미노산 잔기가 T, K 또는 Q로부터 선택되고;
- 위치 112에서의 아미노산 잔기가 S, K 또는 Q로부터 선택되어;
예를 들어, CTLA4 결합 모이어티는 하기 돌연변이 또는 돌연변이 세트 중 하나 이상을 포함한다:
(i) 위치 89가 T 또는 L임;
(ii) 위치 89가 L이고, 위치 11이 V임;
(iii) 위치 89가 L이고, 위치 1이 D이고, 위치 11이 V이고, 위치 14가 P이고, 위치 45가 R이고, 위치 74가 S이고, 위치 83이 R이고, 위치 96이 P이고, 위치 108이 L임;
(iv) 위치 89가 L이고, 위치 1이 E이고, 위치 11이 V이고, 위치 14가 P이고, 위치 45가 R이고, 위치 74가 S이고, 위치 83이 R이고, 위치 96이 P이고, 위치 108이 L임;
(v) 위치 89가 L이고, 위치 110이 K 또는 Q임;
(vi) 위치 89가 L이고, 위치 112가 K 또는 Q임;
(vii) 위치 89가 L이고, 위치 11이 V이고, 위치 110이 K 또는 Q임;
(viii) 위치 89가 L이고, 위치 11이 V이고, 위치 112가 K 또는 Q임;
(ix) 위치 89가 L이고, 위치 1이 D이고, 위치 11이 V이고, 위치 14가 P이고, 위치 45가 R이고, 위치 74가 S이고, 위치 83이 R이고, 위치 96이 P이고, 위치 108이 L이고, 위치 110이 K 또는 Q임;
(x) 위치 89가 L이고, 위치 1이 E이고, 위치 11이 V이고, 위치 14가 P이고, 위치 45가 R이고, 위치 74가 S이고, 위치 83이 R이고, 위치 96이 P이고, 위치 108이 L이고, 위치 110이 K 또는 Q임;
(xi) 위치 89가 L이고, 위치 1이 D이고, 위치 11이 V이고, 위치 14가 P이고, 위치 45가 R이고, 위치 74가 S이고, 위치 83이 R이고, 위치 96이 P이고, 위치 108이 L이고, 위치 112가 K 또는 Q임;
(xii) 위치 89가 L이고, 위치 1이 E이고, 위치 11이 V이고, 위치 14가 P이고, 위치 45가 R이고, 위치 74가 S이고, 위치 83이 R이고, 위치 96이 P이고, 위치 108이 L이고, 위치 112가 K 또는 Q임;
(xiii) 위치 11이 V이고, 위치 110이 K 또는 Q임; 또는
(xiv) 위치 11이 V이고, 위치 112가 K 또는 Q임.
(임의적으로, 110K 또는 110Q 돌연변이 및/또는 112K 또는 112Q 돌연변이와 적합하게 조합되어, 특히 110K 또는 110Q 돌연변이와 조합되어) 위치 89가 T이거나, 또는 위치 1이 E 또는 D이고, 위치 11이 V이고, 위치 14가 P이고, 위치 45가 R이고, 위치 74가 S이고, 위치 83이 R이고, 위치 89가 L이고, 위치 96이 P이고, 위치 108이 L이거나, 또는 위치 11이 V이고 위치 89가 L인 CTLA4 결합 모이어티의 존재가 바람직하다. 위치 11이 V이고, 위치 89가 L이며, 임의적으로 110K 또는 110Q 돌연변이가 있는 CTLA4 결합 모이어티가 또한 바람직하다.
본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재하는 CTLA4 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)는 바람직하게는 하기 CDR (카바트 관례에 따름)을 포함한다:
- 아미노산 서열 FYGMG (서열식별번호: 10)인 CDR1 (카바트에 따름); 및
- 아미노산 서열 DIRTSAGRTYYADSVKG (서열식별번호: 11)인 CDR2 (카바트에 따름); 및
- 아미노산 서열 EXSGISGWDY (서열식별번호: 12; 여기서 X는 M 또는 P임)인 CDR3 (카바트에 따름).
대안적으로, CDR이 Abm 관례에 따라 제공되는 경우, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재하는 CTLA4 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)는 바람직하게는 하기 CDR을 포함한다:
- 아미노산 서열 GGTFSFYGMG (서열식별번호: 13)인 CDR1 (Abm에 따름); 및
- 아미노산 서열 DIRTSAGRTY (서열식별번호: 14)인 CDR2 (Abm에 따름); 및
- 아미노산 서열 EXSGISGWDY (서열식별번호: 15 (서열식별번호: 4와 동일함); 여기서 X는 M 또는 P임)인 CDR3 (Abm에 따름).
상기 바람직한 CDR은 11F01 (서열식별번호: 9) 내에 존재하는 것과 동일하다.
PD1/CTLA4 결합제 내에 존재하는 CTLA4 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)는 바람직하게는 또한 하기를 갖는다:
- 각각의 기준 서열의 전체 길이에 걸쳐 각각의 서열 사이의 최대 매치를 제공하도록 알고리즘의 파라미터가 선택된 BLAST 알고리즘으로 비교를 수행했을 때 (예를 들어, 예상 역치: 10; 워드 크기: 3; 질의 범위 내의 최대 매치: 0; BLOSUM 62 매트릭스; 갭 비용: 존재 11, 연장 1; 조건부 구성 점수 매트릭스 조정), 서열식별번호: 9의 아미노산 서열과의 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성의 정도 (CDR, 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장, 뿐만 아니라 수반되는 특정 측면에 의해 요구되는 위치 1, 11, 14, 45, 74, 83 89, 96, 108, 110 및/또는 112에서의 돌연변이는 서열 동일성의 정도를 결정하는데 고려되지 않음); 및/또는
- 서열식별번호: 9의 아미노산 서열과의 7개 이하, 예컨대 5개 이하, 바람직하게는 3개 이하, 예컨대 단지 3, 2 또는 1개의 "아미노산 차이" (본원에서 정의된 바와 같고, 존재할 수 있는 위치(들) 1, 11, 14, 45, 74, 83, 89, 96, 108, 110 및/또는 112에서의 상기 열거된 돌연변이 중 임의의 것을 고려하지 않으며, 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장을 고려하지 않음) (상기 아미노산 차이는, 존재하는 경우, 프레임워크 및/또는 CDR 내에 존재할 수 있지만, 바람직하게는 프레임워크 내에만 존재하고, CDR 내에는 존재하지 않음).
본 발명이 제공하는 본 발명의 각각의 기준 서열의 전체 길이에 걸쳐 각각의 서열 사이의 최대 매치를 제공하도록 알고리즘의 파라미터가 선택된 BLAST 알고리즘으로 비교를 수행했을 때 (예를 들어, 예상 역치: 10; 워드 크기: 3; 질의 범위 내의 최대 매치: 0; BLOSUM 62 매트릭스; 갭 비용: 존재 11, 연장 1; 조건부 구성 점수 매트릭스 조정)의 다양한 측면 및 바람직한 측면과 관련하여, 서열식별번호:9에 관한 서열 동일성의 정도 및/또는 이러한 본 발명의 결합제 내에 존재할 수 있는 (즉, 서열식별번호: 9의 서열에 비교된) "아미노산 차이"의 개수 및 종류에 대해서,
(i) CTLA4 결합 모이어티가 서열식별번호: 9의 서열과의 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성의 정도 (CDR, 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장, 뿐만 아니라 수반되는 특정 측면에 의해 요구되는 위치 1, 11, 14, 45, 74, 83 89, 96, 108, 110 및/또는 112에서의 돌연변이는 서열 동일성의 정도를 결정하는데 고려되지 않음)를 갖는다라고 할 때; 및/또는
(ii) CTLA4 결합 모이어티가 서열식별번호: 9의 서열과의 7개 이하, 바람직하게는 5개 이하이고, 예컨대 단지 3, 2 또는 1개의 "아미노산 차이" (마찬가지로, 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장은 고려하지 않고, 수반되는 특정 측면에 의해 요구되는 위치 1, 11, 14, 45, 74, 83 89, 96, 108, 110 및/또는 112에서의 돌연변이는 고려하지 않음)를 갖는다라고 할 때,
이는 수반되는 특정 측면에 의해 요구되는 위치 1, 11, 14, 45, 74, 83 89, 96, 108, 110 및/또는 112에서의 돌연변이 및 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장 이외의 서열식별번호: 9의 서열과의 아미노산 차이가 없는 서열을 또한 포함한다는 것을 주목하여야 한다.
따라서, 본 발명의 한 구체적인 측면에서, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재하는 CTLA4 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)는 서열식별번호: 9와의 서열 동일성이 100%일 수 있고/거나 (CDR을 포함하지만, 본원에 개시된 위치 1, 11, 14, 45, 74, 83, 89, 96, 108, 110 및/또는 112에서의 돌연변이(들) 또는 돌연변이 조합 및/또는 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장을 고려하지 않음), 서열식별번호: 9와의 아미노산 차이 (즉, 본원에 개시된 위치 1, 11, 14, 45, 74, 83, 89, 96, 108, 110 및/또는 112에서의 돌연변이(들) 또는 돌연변이 조합 및/또는 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장 이외의 차이)가 없을 수 있다.
임의의 아미노산 차이가 존재하는 경우 (즉, 수반되는 본 발명의 특정 측면에 의해 요구되는 위치 1, 11, 14, 45, 74, 83 89, 96, 108, 110 및/또는 112에서의 돌연변이 및 임의의 C-말단 연장 이외의 것), 이러한 아미노산 차이는 CDR 내에 및/또는 프레임워크 영역 내에 존재할 수 있지만, 바람직하게는 프레임워크 영역 내에만 존재하여 (Abm 관례에 의해 정의된 바와 같고, 즉, Abm 관례에 따라 정의된 바와 같은 CDR 내에 존재하지 않음), 즉, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재하는 CTLA4 결합 모이어티는 서열식별번호: 48-83 또는 143 내에 존재하는 것과 동일한 CDR (Abm 관례에 따라 정의됨)을 갖는다.
또한, 본 발명의 임의의 측면에 따른 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재하는 CTLA4 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)에 (수반되는 특정 측면에 의해 요구되는 위치 1, 11, 14, 45, 74, 83 89, 96, 108, 110 및/또는 112에서의 돌연변이 이외에) 서열식별번호: 9의 서열과의 하나 이상의 아미노산 차이가 있는 경우, 존재할 수 있는 (즉, 서열식별번호: 9의 서열에 비교된) 이러한 돌연변이/아미노산 차이의 구체적이지만 비제한적인 일부 예는 (서열식별번호: 9의 아미노산 서열에 비교하여) 예를 들어 P41A, P41L, P41S 또는 P41T (특히 P41A) 및/또는 T87A이다. 돌연변이의 다른 예는 하나 이상의 적합한 "인간화" 치환 예컨대 Q108L (그의 적합한 조합)이다; 예를 들어, WO 2009/138519 (또는 WO 2009/138519에 인용된 선행 기술) 및 WO 2008/020079 (또는 WO 2008/020079에 인용된 선행 기술), 뿐만 아니라 WO 2008/020079의 표 A-3 내지 A-8 (가능한 인간화 치환을 나타내는 목록)을 참조한다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드 내에 존재하는 CTLA4 결합제(들)는 적어도 Q108L 인간화 치환을 함유한다. 또한, 위치 96 (카바트 넘버링)의 메티오닌 잔기가 또 다른 천연 발생 아미노산 잔기 예컨대 Pro (Cys, Asp 또는 Asn 제외)로 교체될 수 있다.
또한, CTLA4 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)가 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제의 N-말단 부분에 존재하고/거나 N-말단 부분을 형성하는 경우, 이는 바람직하게는 위치 1에 D를 함유한다 (즉, 서열식별번호: 9에 비교하여 E1D 돌연변이). (E1D 돌연변이가 있는 다른 CTLA4 결합 모이어티가 또한 사용될 수 있지만) 이러한 N-말단 CTLA4 결합 모이어티의 바람직하지만 비제한적인 예가 서열식별번호: 64 및 65 및 143로서 제공된다. 유사하게, 서열식별번호: 64 또는 65 또는 143의 CTLA 결합 모이어티가 N-말단 단부가 아니라, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내의 다른 어떤 곳에 존재하는 경우, 이는 바람직하게는 D1E 돌연변이 (1E)를 함유한다. 따라서, 추가 측면에서, 본 발명은 그의 N-말단 단부에 CTLA4 결합 모이어티 (본원에서 추가로 기재된 바와 같음)가 있으며, 여기서 상기 CTLA4 결합 모이어티가 위치 1에 D를 갖고 (1D), 바람직하게는 서열식별번호: 64 또는 65 또는 143인 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 (본원에서 추가로 기재된 바와 같음)에 관한 것이다.
본원에 기재된 측면에 따른 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함) 내에 존재하는 CTLA4 결합 모이어티는 바람직하게는 이들이 임의적인 E1D 돌연변이, L11V 돌연변이, A14P 돌연변이, Q45R 돌연변이, A74S 돌연변이, K83R 돌연변이, V89L 돌연변이, M96P 돌연변이 및 Q108L 돌연변이의 적합한 조합을 함유하도록 하는 것이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 이러한 CTLA4 결합 모이어티는 Q108L과 다른 E1D (임의적), L11V, A14P, Q45R, A74S, K83R, V89L, M96P, Q108L 돌연변이 중 임의의 하나의 적합한 조합을 포함한다. 바람직하게는, CTLA4 결합 모이어티는 (서열식별번호: 9의 아미노산 서열에 비교하여) 이러한 돌연변이 중 임의의 것의 조합, 예를 들어 이러한 다른 돌연변이 중 임의의 2개의 조합, 더욱 바람직하게는 이러한 돌연변이 중 임의의 3개와의 조합 (예컨대 조합 A14P, A74S 및 K83R과의 조합), 예컨대 이러한 돌연변이 중 4개 모두와의 조합 또는 9개 또는 10개를 포함한다 (마찬가지로, CTLA4 결합 모이어티가 1가이거나 또는 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제의 N-말단 단부에 존재하는 경우, 바람직하게는 또한 E1D 돌연변이를 포함함). 또한, 본 발명의 한 실시양태에서, 위치 96 (카바트 넘버링)에서의 CTLA4 결합 모이어티의 메티오닌 잔기가 또 다른 천연 발생 아미노산 잔기 예컨대 Pro (Cys, Asp 또는 Asn 제외)로 교체될 수 있다. 바람직하지만 비제한적인 예로서, 서열식별번호: 62 내지 65 및 80 내지 83 및 143은 서열식별번호: 9와의 추가의 아미노산 차이, 예를 들어, E1D (임의적), L11V, A14P, Q45R, A74S, K83R, V89L, M96P 및 Q108L이 있는 CTLA4 결합 모이어티의 예이다 (추가적으로, 이전 단락들에서 지시된 바와 같이, 서열식별번호: 64, 65 및 82 및 83는 E1D 돌연변이도 있음).
따라서, 제1 측면에서, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재하는 CTLA4 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)는
- 아미노산 서열 FYGMG (서열식별번호: 10)인 CDR1 (카바트에 따름); 및
- 아미노산 서열 DIRTSAGRTYYADSVKG (서열식별번호: 11)인 CDR2 (카바트에 따름); 및
- 아미노산 서열 EXSGISGWDY (서열식별번호: 12; 여기서 X는 M 또는 P임)인 CDR3 (카바트에 따름)
를 갖고;
- 각각의 기준 서열의 전체 길이에 걸쳐 각각의 서열 사이의 최대 매치를 제공하도록 알고리즘의 파라미터가 선택된 BLAST 알고리즘으로 비교를 수행했을 때 (예를 들어, 예상 역치: 10; 워드 크기: 3; 질의 범위 내의 최대 매치: 0; BLOSUM 62 매트릭스; 갭 비용: 존재 11, 연장 1; 조건부 구성 점수 매트릭스 조정), 서열식별번호: 9의 아미노산 서열과의 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성의 정도 (CDR, 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장, 뿐만 아니라 수반되는 특정 측면에 의해 요구되는 위치 1, 11, 14, 45, 74, 83 89, 96, 108, 110 및/또는 112에서의 돌연변이는 서열 동일성의 정도를 결정하는데 고려되지 않음)
를 갖고/거나;
- 서열식별번호: 9의 아미노산 서열과의 7개 이하, 예컨대 5개 이하, 바람직하게는 3개 이하, 예컨대 단지 3, 2 또는 1개의 "아미노산 차이" (본원에서 정의된 바와 같고, 존재할 수 있는 위치(들) 11, 89, 110 또는 112에서의 상기 열거된 돌연변이 중 임의의 것을 고려하지 않으며, 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장을 고려하지 않음) (상기 아미노산 차이는, 존재하는 경우, 프레임워크 및/또는 CDR 내에 존재할 수 있지만, 바람직하게는 프레임워크 내에만 존재하고, CDR 내에는 존재하지 않음);
및 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제의 C-말단 단부에 존재하는 경우, 바람직하게는
- C-말단 연장 (X)n (여기서 n은 1 내지 10, 바람직하게는 1 내지 5, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5 (바람직하게는 1 또는 2, 예컨대 1)이고; 각각의 X는 독립적으로 선택되는, 바람직하게는 알라닌 (A), 글리신 (G), 발린 (V), 류신 (L) 또는 이소류신 (I)으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 (바람직하게는 천연 발생) 아미노산 잔기임)
을 갖고;
본 발명의 PD1/CTLA4 결합제의 N-말단 단부에 존재하는 경우, 바람직하게는 위치 1에 D를 갖고 (즉, 서열식별번호: 9에 비교하여 E1D 돌연변이),
여기서
- CTLA4 결합 모이어티의 위치 1에서의 아미노산 잔기는 E 또는 D로부터 선택되고;
- CTLA4 결합 모이어티의 위치 11에서의 아미노산 잔기는 L 또는 V로부터 선택되고;
- CTLA4 결합 모이어티의 위치 14에서의 아미노산 잔기는 A 또는 P로부터 선택되고;
- CTLA4 결합 모이어티의 위치 45의 아미노산 잔기는 Q 또는 R로부터 선택되고;
- CTLA4 결합 모이어티의 위치 74에서의 아미노산 잔기는 A 또는 S로부터 선택되고;
- CTLA4 결합 모이어티의 위치 83에서의 아미노산 잔기는 K 또는 R로부터 선택되고;
- CTLA4 결합 모이어티의 위치 89에서의 아미노산 잔기는 T, V 또는 L로부터 선택되고;
- CTLA4 결합 모이어티의 위치 96의 아미노산 잔기는 M 또는 P로부터 선택되고;
- CTLA4 결합 모이어티의 위치 108의 아미노산 잔기는 Q 또는 L로부터 선택되고;
- CTLA4 결합 모이어티의 위치 110에서의 아미노산 잔기는 T, K 또는 Q로부터 선택되며;
- CTLA4 결합 모이어티의 위치 112에서의 아미노산 잔기는 S, K 또는 Q로부터 선택되어;
예를 들어, CTLA4 결합 모이어티는 하기 돌연변이 중 하나 이상을 포함하며,
(i) 위치 1이 E 또는 D임;
(ii) 위치 11이 is V임;
(iii) 위치 14가 P임;
(iv) 위치 45가 R임;
(v) 위치 74가 S임;
(vi) 위치 83이 R임;
(vii) 위치 89가 L 또는 T임;
(viii) 위치 96이 P임;
(ix) 위치 108이 L임;
예를 들어, CTLA4 결합 모이어티는 하기 돌연변이 세트 중 하나 이상을 포함한다:
a. 위치 89가 L이고, 위치 11이 V임;
b. 위치 89가 L이고, 위치 110이 K 또는 Q임;
c. 위치 89가 L이고, 위치 112가 K 또는 Q임;
d. 위치 89가 L이고, 위치 11이 V이고, 위치 110이 K 또는 Q임;
e. 위치 89가 L이고, 위치 11이 V이고, 위치 112가 K 또는 Q임;
f. 위치 1이 D이고, 위치 11이 V이고, 위치 14가 P이고, 위치 45가 R이고, 위치 74가 S이고, 위치 83이 R이고, 위치 89가 L이고, 위치 96이 P이고, 위치 108이 L 위치임;
g. 위치 1이 E이고, 위치 11이 V이고, 위치 14가 P이고, 위치 45가 R이고, 위치 74가 S이고, 위치 83이 R이고, 위치 89가 L이고, 위치 96이 P이고, 위치 108이 L임;
h. 위치 1이 D이고, 위치 11이 V이고, 위치 14가 P이고, 위치 45가 R이고, 위치 74가 S이고, 위치 83이 R이고, 위치 89가 L이고, 위치 96이 P이고, 위치 108이 L 위치이고, 위치 110이 K 또는 Q임;
i. 위치 1이 E이고, 위치 11이 V이고, 위치 14가 P이고, 위치 45가 R이고, 위치 74가 S이고, 위치 83이 R이고, 위치 89가 L이고, 위치 96이 P이고, 위치 108이 L 위치이고, 위치 110이 K 또는 Q임;
j. 위치 1이 D이고, 위치 11이 V이고, 위치 14가 P이고, 위치 45가 R이고, 위치 74가 S이고, 위치 83이 R이고, 위치 89가 L이고, 위치 96이 P이고, 위치 108이 L이고, 위치 112가 K 또는 Q임;
k. 위치 1이 E이고, 위치 11이 V이고, 위치 14가 P이고, 위치 45가 R이고, 위치 74가 S이고, 위치 83이 R이고, 위치 89가 L이고, 위치 96이 P이고, 위치 108이 L이고, 위치 112가 K 또는 Q임;
l. 위치 11이 V이고, 위치 110이 K 또는 Q임; 또는
m. 위치 11이 V이고, 위치 112가 K 또는 Q임.
추가 측면에서, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함) 내에 존재하는 CTLA4 결합 모이어티는
- 아미노산 서열 FYGMG (서열식별번호: 10)인 CDR1 (카바트에 따름); 및
- 아미노산 서열 DIRTSAGRTYYADSVKG (서열식별번호: 11)인 CDR2 (카바트에 따름); 및
- 아미노산 서열 EXSGISGWDY (서열식별번호: 12; 여기서 X는 M 또는 P임)인 CDR3 (카바트에 따름)
를 갖고;
- 각각의 기준 서열의 전체 길이에 걸쳐 각각의 서열 사이의 최대 매치를 제공하도록 알고리즘의 파라미터가 선택된 BLAST 알고리즘으로 비교를 수행했을 때 (예를 들어, 예상 역치: 10; 워드 크기: 3; 질의 범위 내의 최대 매치: 0; BLOSUM 62 매트릭스; 갭 비용: 존재 11, 연장 1; 조건부 구성 점수 매트릭스 조정), 서열식별번호: 9의 아미노산 서열과의 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성의 정도 (CDR, 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장, 뿐만 아니라 수반되는 특정 측면에 의해 요구되는 위치 1, 11, 14, 45, 74, 83 89, 96, 108, 110 및/또는 112에서의 돌연변이는 서열 동일성의 정도를 결정하는데 고려되지 않음)
를 갖고/거나;
- 서열식별번호: 9의 아미노산 서열과의 7개 이하, 예컨대 5개 이하, 바람직하게는 3개 이하, 예컨대 단지 3, 2 또는 1개의 "아미노산 차이" (본원에서 정의된 바와 같고, 존재할 수 있는 위치(들) 11, 89, 110 또는 112에서의 상기 열거된 돌연변이 중 임의의 것을 고려하지 않으며, 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장을 고려하지 않음) (상기 아미노산 차이는, 존재하는 경우, 프레임워크 및/또는 CDR 내에 존재할 수 있지만, 바람직하게는 프레임워크 내에만 존재하고, CDR 내에는 존재하지 않음);
및 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제의 C-말단 단부에 존재하는 경우, 바람직하게는
- C-말단 연장 (X)n (여기서 n은 1 내지 10, 바람직하게는 1 내지 5, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5 (바람직하게는 1 또는 2, 예컨대 1)이고; 각각의 X는 독립적으로 선택되는, 바람직하게는 알라닌 (A), 글리신 (G), 발린 (V), 류신 (L) 또는 이소류신 (I)으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 (바람직하게는 천연 발생) 아미노산 잔기임)
을 갖고;
본 발명의 PD1/CTLA4 결합제의 N-말단 단부에 존재하는 경우, 바람직하게는 위치 1에 D를 가져 (즉, 서열식별번호: 9에 비교하여 E1D 돌연변이),
상기 CTLA4 결합 모이어티는 언급된 위치 (카바트에 따른 넘버링)에 하기의 아미노산 잔기 중 하나 이상 (즉, 서열식별번호: 9의 아미노산 서열에 비교된 돌연변이)을 포함하며,
- 1D 또는 1E;
- 11V;
- 14P;
- 45R;
- 74S;
- 83R;
- 89L 또는 8T;
- 96P;
- 108L;
예를 들어, CTLA4 결합 모이어티는 하기 돌연변이 세트 중 하나 이상을 포함한다:
- 1E와 11V; 14P; 45R; 74S; 83R; 89L; 96P; 및 108L의 조합;
- 1D와 11V; 14P; 45R; 74S; 83R; 89L; 96P; 및 108L의 조합;
- 89L과 11V의 조합;
- 89L과 110K 또는 110Q의 조합;
- 89L과 112K 또는 112Q의 조합;
- 89L과 11V 및 110K 또는 110Q의 조합;
- 89L과 11V 및 112K 또는 112Q의 조합;
- 1E와 11V; 14P; 45R; 74S; 83R; 89L; 96P; 108L 및 110K 또는 110Q의 조합;
- 1D와 11V; 14P; 45R; 74S; 83R; 89L; 96P; 108L 및 110K 또는 110Q의 조합;
- 1E와 11V; 14P; 45R; 74S; 83R; 89L; 96P; 108 L 및 112K 또는 112Q의 조합;
- 1D와 11V; 14P; 45R; 74S; 83R; 89L; 96P; 108L 및 112K 또는 112Q의 조합;
- 11V와 110K 또는 110Q의 조합; 또는
- 11V와 112K 또는 112Q의 조합.
언급된 바와 같이, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재하는 CTLA4 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)가 1가 포맷으로 사용되고/거나 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 (본원에서 정의된 바와 같음)의 C-말단 단부에 존재하는 경우, 바람직하게는 CTLA4 결합 모이어티 (그리고, 결과적으로, 생성된 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제)는 기재된 바와 같고/거나 WO 2012/175741 또는 PCT/EP2015/060643 (WO2015/173325)에 기재된 바와 같은 C-말단 연장 X(n)을 갖는다.
언급된 바와 같이, 본 발명에서, (임의적으로 110K 또는 110Q 돌연변이 및/또는 112K 또는 112Q 돌연변이와 적합하게 조합되어, 특히 110K 또는 110Q 돌연변이와 조합되어) 위치 89가 T이거나, 또는 위치 1이 E 또는 D이고, 위치 11이 V이고, 위치 14가 P이고, 위치 45가 R이고, 위치 74가 S이고, 위치 83이 R이고, 위치 89가 L이고, 위치 96이 P이며 위치 108이 L이거나, 또는 위치 11이 V이고 위치 89가 L인 CTLA4 결합 모이어티가 바람직하다. 위치 11이 V이고, 위치 89가 L이며, 임의적으로 110K 또는 110Q 돌연변이가 있는 CTLA4 모이어티가 또한 바람직하다.
따라서, 한 바람직한 측면에서, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재하는 CTLA4 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)는
- 아미노산 서열 FYGMG (서열식별번호: 10)인 CDR1 (카바트에 따름); 및
- 아미노산 서열 DIRTSAGRTYYADSVKG (서열식별번호: 11)인 CDR2 (카바트에 따름); 및
- 아미노산 서열 EXSGISGWDY (서열식별번호: 12; 여기서 X는 M 또는 P임)인 CDR3 (카바트에 따름)
를 갖고;
- 각각의 기준 서열의 전체 길이에 걸쳐 각각의 서열 사이의 최대 매치를 제공하도록 알고리즘의 파라미터가 선택된 BLAST 알고리즘으로 비교를 수행했을 때 (예를 들어, 예상 역치: 10; 워드 크기: 3; 질의 범위 내의 최대 매치: 0; BLOSUM 62 매트릭스; 갭 비용: 존재 11, 연장 1; 조건부 구성 점수 매트릭스 조정), 서열식별번호: 9의 아미노산 서열과의 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성의 정도 (CDR, 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장, 뿐만 아니라 수반되는 특정 측면에 의해 요구되는 위치 1, 11, 14, 45, 74, 83 89, 96, 108, 110 및/또는 112에서의 돌연변이는 서열 동일성의 정도를 결정하는데 고려되지 않음)
를 갖고/거나;
- 서열식별번호: 9의 아미노산 서열과의 7개 이하, 예컨대 5개 이하, 바람직하게는 3개 이하, 예컨대 단지 3, 2 또는 1개의 "아미노산 차이" (본원에서 정의된 바와 같고, 존재할 수 있는 위치(들) 1, 11, 14, 45, 74, 83 89, 96, 108, 110 및/또는 112에서의 상기 열거된 돌연변이 중 임의의 것을 고려하지 않으며, 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장을 고려하지 않음) (상기 아미노산 차이는, 존재하는 경우, 프레임워크 및/또는 CDR 내에 존재할 수 있지만, 바람직하게는 프레임워크 내에만 존재하고, CDR 내에는 존재하지 않음);
및 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제의 C-말단 단부에 존재하는 경우, 바람직하게는
- C-말단 연장 (X)n (여기서 n은 1 내지 10, 바람직하게는 1 내지 5, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5 (바람직하게는 1 또는 2, 예컨대 1)이고; 각각의 X는 독립적으로 선택되는, 바람직하게는 알라닌 (A), 글리신 (G), 발린 (V), 류신 (L) 또는 이소류신 (I)으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 (바람직하게는 천연 발생) 아미노산 잔기임)
을 갖고;
본 발명의 PD1/CTLA4 결합제의 N-말단 단부에 존재하는 경우, 바람직하게는 위치 1에 D를 갖고 (즉, 서열식별번호: 9에 비교하여 E1D 돌연변이),
여기서
- CTLA4 결합 모이어티의 위치 1에서의 아미노산 잔기는 E 또는 D로부터 선택되고;
- CTLA4 결합 모이어티의 위치 11에서의 아미노산 잔기는 L 또는 V로부터 선택되고;
- CTLA4 결합 모이어티의 위치 14에서의 아미노산 잔기는 A 또는 P로부터 선택되고;
- CTLA4 결합 모이어티의 위치 45의 아미노산 잔기는 Q 또는 R로부터 선택되고;
- CTLA4 결합 모이어티의 위치 74에서의 아미노산 잔기는 A 또는 S로부터 선택되고;
- CTLA4 결합 모이어티의 위치 83에서의 아미노산 잔기는 K 또는 R로부터 선택되고;
- CTLA4 결합 모이어티의 위치 89에서의 아미노산 잔기는 T, V 또는 L로부터 선택되고;
- CTLA4 결합 모이어티의 위치 96의 아미노산 잔기는 M 또는 P로부터 선택되고;
- CTLA4 결합 모이어티의 위치 108의 아미노산 잔기는 Q 또는 L로부터 선택되고;
- CTLA4 결합 모이어티의 위치 110에서의 아미노산 잔기는 바람직하게는 T, K 또는 Q로부터 선택되며 (바람직하게는 T임);
- CTLA4 결합 모이어티의 위치 112에서의 아미노산 잔기는 바람직하게는 S, K 또는 Q로부터 선택된다 (바람직하게는 S임).
또 다른 바람직한 측면에서, PD1/CTLA4 결합제 내에 존재하는 CTLA4 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)는
- 아미노산 서열 FYGMG (서열식별번호: 10)인 CDR1 (카바트에 따름); 및
- 아미노산 서열 DIRTSAGRTYYADSVKG (서열식별번호: 11)인 CDR2 (카바트에 따름); 및
- 아미노산 서열 EXSGISGWDY (서열식별번호: 12; 여기서 X는 M 또는 P임)인 CDR3 (카바트에 따름)
를 갖고;
- 각각의 기준 서열의 전체 길이에 걸쳐 각각의 서열 사이의 최대 매치를 제공하도록 알고리즘의 파라미터가 선택된 BLAST 알고리즘으로 비교를 수행했을 때 (예를 들어, 예상 역치: 10; 워드 크기: 3; 질의 범위 내의 최대 매치: 0; BLOSUM 62 매트릭스; 갭 비용: 존재 11, 연장 1; 조건부 구성 점수 매트릭스 조정), 서열식별번호: 9의 아미노산 서열과의 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성의 정도 (CDR, 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장, 뿐만 아니라 수반되는 특정 측면에 의해 요구되는 위치 1, 11, 14, 45, 74, 83 89, 96, 108, 110 및/또는 112에서의 돌연변이는 서열 동일성의 정도를 결정하는데 고려되지 않음)
를 갖고/거나;
- 서열식별번호: 9의 아미노산 서열과의 7개 이하, 예컨대 5개 이하, 바람직하게는 3개 이하, 예컨대 단지 3, 2 또는 1개의 "아미노산 차이" (본원에서 정의된 바와 같고, 존재할 수 있는 위치(들) 11, 89, 110 또는 112에서의 상기 열거된 돌연변이 중 임의의 것을 고려하지 않으며, 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장을 고려하지 않음) (상기 아미노산 차이는, 존재하는 경우, 프레임워크 및/또는 CDR 내에 존재할 수 있지만, 바람직하게는 프레임워크 내에만 존재하고, CDR 내에는 존재하지 않음);
및 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제의 C-말단 단부에 존재하는 경우, 바람직하게는
- C-말단 연장 (X)n (여기서 n은 1 내지 10, 바람직하게는 1 내지 5, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5 (바람직하게는 1 또는 2, 예컨대 1)이고; 각각의 X는 독립적으로 선택되는, 바람직하게는 알라닌 (A), 글리신 (G), 발린 (V), 류신 (L) 또는 이소류신 (I)으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 (바람직하게는 천연 발생) 아미노산 잔기임)
을 갖고;
본 발명의 PD1/CTLA4 결합제의 N-말단 단부에 존재하는 경우, 바람직하게는 위치 1에 D를 갖고 (즉, 서열식별번호: 9에 비교하여 E1D 돌연변이), 여기서 하기 중 하나 이상이 사실이다:
- CTLA4 결합 모이어티의 위치 1에서의 아미노산 잔기가 E 또는 D임;
- CTLA4 결합 모이어티의 위치 11에서의 아미노산 잔기가 V임;
- CTLA4 결합 모이어티의 위치 14에서의 아미노산 잔기가 P임;
- CTLA4 결합 모이어티의 위치 45의 아미노산 잔기가 R임;
- CTLA4 결합 모이어티의 위치 74에서의 아미노산 잔기가 S임;
- CTLA4 결합 모이어티의 위치 83에서의 아미노산 잔기가 R임;
- CTLA4 결합 모이어티의 위치 89에서의 아미노산 잔기가 L임;
- CTLA4 결합 모이어티의 위치 96의 아미노산 잔기가 P임;
- CTLA4 결합 모이어티의 위치 108의 아미노산 잔기가 L임;
- CTLA4 결합 모이어티의 위치 110에서의 아미노산 잔기가 T, K 또는 Q로부터 선택됨; 또는
- CTLA4 결합 모이어티의 위치 112에서의 아미노산 잔기가 S, K 또는 Q로부터 선택됨.
한 특정하지만 비제한적인 측면에서, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재하는 CTLA4 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)는 언급된 위치 (카바트에 따른 넘버링)에 하기의 돌연변이 세트 (즉, 서열식별번호: 9의 서열에 비교된 돌연변이)를 포함하며,
- 11V와 89L의 조합;
- 11V와 1D, 14P, 45R, 74S, 83R, 89L, 96P 및 108L의 조합;
- 11V와 1E, 14P, 45R, 74S, 83R, 89L, 96P 및 108L의 조합;
- 11V와 110K 또는 110Q의 조합;
- 11V와 112K 또는 112Q의 조합;
- 11V와 1D, 14P, 45R, 74S, 83R, 89L, 96P, 108L 및 110K 또는 110Q의 조합;
- 11V와 1E, 14P, 45R, 74S, 83R, 89L, 96P, 108L 및 110K 또는 110Q의 조합;
- 11V와 1D, 14P, 45R, 74S, 83R, 89L, 96P, 108L 및 112K 또는 112Q의 조합;
- 11V와 1E, 14P, 45R, 74S, 83R, 89L, 96P, 108L 및 112K 또는 112Q의 조합;
- 11V와 89L 및 110K 또는 110Q의 조합; 또는
- 11V와 89L 및 112K 또는 112Q의 조합;
서열식별번호: 9 또는 48-83 또는 143에 기재된 것들과 같은 CDR (예를 들어, 카바트에 따름)을 갖고, 본원에 기재된 바와 같은 서열식별번호: 9의 아미노산 서열과의 전반적인 서열 동일성 정도를 갖는다.
또 다른 특정하지만 비제한적인 측면에서, PD1/CTLA4 결합제 내에 존재하는 CTLA4 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)는 언급된 위치 (카바트에 따른 넘버링)에 하기의 돌연변이 세트 (즉, 서열식별번호: 9의 서열에 비교된 돌연변이)를 포함하며,
- 89L과 11V의 조합;
- 89L과 1D, 11V, 14P, 45R, 74S, 83R, 96P 및 108L의 조합;
- 89L과 1E, 11V , 14P, 45R, 74S, 83R, 96P 및 108L의 조합;
- 89L과 110K 또는 110Q의 조합;
- 89L과 112K 또는 112Q의 조합;
- 89L과 1D, 11V, 14P, 45R, 74S, 83R, 96P, 108L 및 110K 또는 110Q의 조합;
- 89L과 1E, 11V , 14P, 45R, 74S, 83R, 96P, 108L 및 110K 또는 110Q의 조합;
- 89L과 1D, 11V, 14P, 45R, 74S, 83R, 96P, 108L 및 112K 또는 112Q의 조합;
- 89L과 1E, 11V , 14P, 45R, 74S, 83R, 96P, 108L 및 112K 또는 112Q의 조합;
- 89L과 11V 및 110K 또는 110Q의 조합; 또는
- 89L과 11V 및 112K 또는 112Q의 조합;
서열식별번호: 9 또는 48-83 또는 143에 기재된 것들과 같은 CDR (예를 들어, 카바트에 따름)을 갖고, 본원에 기재된 바와 같은 서열식별번호: 9의 아미노산 서열과의 전반적인 서열 동일성 정도를 갖는다.
또 다른 특정하지만 비제한적인 측면에서, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재하는 CTLA4 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)는 언급된 위치 (카바트에 따른 넘버링)에 하기의 돌연변이 세트 (즉, 서열식별번호: 9의 서열에 비교된 돌연변이)를 포함하며,
- 110K 또는 110Q와 11V의 조합;
- 110K 또는 110Q와 1D, 11V, 14P, 45R, 74S, 83R, 89L 96P 및 108L의 조합;
- 110K 또는 110Q와 1E, 11V, 14P, 45R, 74S, 83R, 89L 96P 및 108L의 조합;
- 110K 또는 110Q와 89L의 조합; 또는
- 110K 또는 110Q와 11V 및 89L의 조합;
서열식별번호: 9 또는 48-83 또는 143에 기재된 것들과 같은 CDR (예를 들어, 카바트에 따름)을 갖고, 본원에 기재된 바와 같은 서열식별번호: 9의 아미노산 서열과의 전반적인 서열 동일성 정도를 갖는다.
또 다른 특정하지만 비제한적인 측면에서, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재하는 CTLA4 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)는 언급된 위치 (카바트에 따른 넘버링)에 하기의 돌연변이 세트 (즉, 서열식별번호: 9의 서열에 비교된 돌연변이)를 포함하며,
- 112K 또는 112Q와 11V의 조합;
- 112K 또는 112Q와 1D, 11V, 14P, 45R, 74S, 83R, 89L 96P 및 108L의 조합;
- 112K 또는 112Q와 1E, 11V, 14P, 45R, 74S, 83R, 89L 96P 및 108L의 조합;
- 112K 또는 112Q와 89L의 조합; 또는
- 112K 또는 112Q와 11V 및 89L의 조합;
서열식별번호: 9 또는 48-83 또는 143에 기재된 것들과 같은 CDR (예를 들어, 카바트에 따름)을 갖고, 본원에 기재된 바와 같은 서열식별번호: 9의 아미노산 서열과의 전반적인 서열 동일성 정도를 갖는다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재하는 CTLA4 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)는 위치 89에 T 또는 L을 포함하고 (예를 들어, 1D 또는 1E, 11V, 14P, 45R, 74S, 83R, 89L 96P 및 108L), 서열식별번호: 9 또는 48-83 또는 143에 기재된 것들과 같은 CDR (카바트에 따름)을 갖고, 본원에 기재된 바와 같은 서열식별번호: 9의 아미노산 서열과의 전반적인 서열 동일성 정도를 갖는다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재하는 CTLA4 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)는 위치 11에 V를, 위치 89에 L을 포함하고 (예를 들어, 1D 또는 1E, 11V, 14P, 45R, 74S, 83R, 89L 96P 및 108L), 서열식별번호: 9 또는 48-83 또는 143에 기재된 것들과 같은 CDR (예를 들어, 카바트에 따름)을 갖고, 본원에 기재된 바와 같은 서열식별번호: 9의 아미노산 서열과의 전반적인 서열 동일성 정도를 갖는다.
언급된 바와 같이, 본원에 기재된 측면에 따른 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재하는 CTLA4 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)는 바람직하게는 (서열식별번호: 9의 아미노산 서열에 비교하여) 이들이 임의적인 E1D 돌연변이, L11V 돌연변이, A14P 돌연변이, Q45R 돌연변이, A74S 돌연변이, K83R 돌연변이, V89L 돌연변이, M96P 돌연변이 및/또는 Q108L 돌연변이의 적합한 조합, 바람직하게는 Q108L과 다른 A14P, Q45R, A74S 및 K83R 돌연변이 중 임의의 1개, 바람직하게는 이러한 다른 돌연변이 중 임의의 2개, 더욱 바람직하게는 이러한 돌연변이 중 임의의 3개의 적합한 조합 (예컨대 조합 A14P, A74S 및 K83R과의 조합), 예컨대 이러한 돌연변이 4개 모두의 조합을 함유하도록 (그리고 마찬가지로, CTLA4 결합제가 1가이거나 또는 본 발명의 화합물 또는 폴리펩티드의 N-말단 단부에 존재하는 경우, 바람직하게는 또한 E1D 돌연변이를 함유하도록) 한다. 또한, 위치 96 (카바트 넘버링)의 메티오닌 잔기가 또 다른 천연 발생 아미노산 잔기 예컨대 Pro (Cys, Asp 또는 Asn 제외)로 교체될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재하는 CTLA4 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)는
- 아미노산 서열 GGTFSFYGMG (서열식별번호: 13)인 CDR1 (Abm에 따름); 및
- 아미노산 서열 DIRTSAGRTY (서열식별번호: 14)인 CDR2 (Abm에 따름); 및
- 아미노산 서열 EXSGISGWDY (서열식별번호: 12; 여기서 X는 M 또는 P임)인 CDR3 (Abm에 따름)
를 갖고;
- 각각의 기준 서열의 전체 길이에 걸쳐 각각의 서열 사이의 최대 매치를 제공하도록 알고리즘의 파라미터가 선택된 BLAST 알고리즘으로 비교를 수행했을 때 (예를 들어, 예상 역치: 10; 워드 크기: 3; 질의 범위 내의 최대 매치: 0; BLOSUM 62 매트릭스; 갭 비용: 존재 11, 연장 1; 조건부 구성 점수 매트릭스 조정), 서열식별번호: 9의 아미노산 서열과의 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성의 정도 (CDR, 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장, 뿐만 아니라 수반되는 특정 측면에 의해 요구되는 위치 1, 11, 14, 45, 74, 83 89, 96, 108, 110 및/또는 112에서의 돌연변이는 서열 동일성의 정도를 결정하는데 고려되지 않음)
를 갖고/거나;
- 서열식별번호: 9의 아미노산 서열과의 7개 이하, 예컨대 5개 이하, 바람직하게는 3개 이하, 예컨대 단지 3, 2 또는 1개의 "아미노산 차이" (본원에서 정의된 바와 같고, 존재할 수 있는 위치(들) 1, 11, 14, 45, 74, 83 89, 96, 108, 110 및/또는 112에서의 상기 열거된 돌연변이 중 임의의 것을 고려하지 않으며, 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장을 고려하지 않음) (상기 아미노산 차이는, 존재하는 경우, 프레임워크 및/또는 CDR 내에 존재할 수 있지만, 바람직하게는 프레임워크 내에만 존재하고, CDR 내에는 존재하지 않음);
및 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제의 C-말단 단부에 존재하는 경우, 바람직하게는
- C-말단 연장 (X)n (여기서 n은 1 내지 10, 바람직하게는 1 내지 5, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5 (바람직하게는 1 또는 2, 예컨대 1)이고; 각각의 X는 독립적으로 선택되는, 바람직하게는 알라닌 (A), 글리신 (G), 발린 (V), 류신 (L) 또는 이소류신 (I)으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 (바람직하게는 천연 발생) 아미노산 잔기임)
을 갖고;
본 발명의 PD1/CTLA4 결합제의 N-말단 단부에 존재하는 경우, 바람직하게는 위치 1에 D를 갖고 (즉, 서열식별번호: 9에 비교하여 E1D 돌연변이),
여기서
- CTLA4 결합 모이어티의 위치 1에서의 아미노산 잔기는 E 또는 D로부터 선택되고;
- CTLA4 결합 모이어티의 위치 11에서의 아미노산 잔기는 L 또는 V로부터 선택되고;
- CTLA4 결합 모이어티의 위치 14에서의 아미노산 잔기는 A 또는 P로부터 선택되고;
- CTLA4 결합 모이어티의 위치 45의 아미노산 잔기는 Q 또는 R로부터 선택되고;
- CTLA4 결합 모이어티의 위치 74에서의 아미노산 잔기는 A 또는 S로부터 선택되고;
- CTLA4 결합 모이어티의 위치 83에서의 아미노산 잔기는 K 또는 R로부터 선택되고;
- CTLA4 결합 모이어티의 위치 89에서의 아미노산 잔기는 T, V 또는 L로부터 선택되고;
- CTLA4 결합 모이어티의 위치 96의 아미노산 잔기는 M 또는 P로부터 선택되고;
- CTLA4 결합 모이어티의 위치 108의 아미노산 잔기는 Q 또는 L로부터 선택되고;
- CTLA4 결합 모이어티의 위치 110에서의 아미노산 잔기는 T, K 또는 Q로부터 선택되며;
- CTLA4 결합 모이어티의 위치 112에서의 아미노산 잔기는 S, K 또는 Q로부터 선택되어;
예를 들어, 하기 중 하나 이상이 사실이며,
(i) 위치 1이 E 또는 D임;
(ii) 위치 11이 V임;
(iii) 위치 14가 P임;
(iv) 위치 45가 R임;
(v) 위치 74가 S임;
(vi) 위치 83이 R임;
(vii) 위치 89가 L 또는 T임;
(viii) 위치 96이 P임;
(ix) 위치 108이 L임;
예를 들어, CTLA4 결합제는 하기 돌연변이 세트 중 하나 이상을 포함한다:
a. 위치 89가 L이고, 위치 11이 V임;
b. 위치 89가 L이고, 위치 110이 K 또는 Q임;
c. 위치 89가 L이고, 위치 112가 K 또는 Q임;
d. 위치 89가 L이고, 위치 11이 V이고, 위치 110이 K 또는 Q임;
e. 위치 89가 L이고, 위치 11이 V이고, 위치 112가 K 또는 Q임;
f. 위치 1이 D이고, 위치 11이 V이고, 위치 14가 P이고, 위치 45가 R이고, 위치 74가 S이고, 위치 83이 R이고, 위치 89가 L이고, 위치 96이 P이고, 위치 108이 L 위치임;
g. 위치 1이 E이고, 위치 11이 V이고, 위치 14가 P이고, 위치 45가 R이고, 위치 74가 S이고, 위치 83이 R이고, 위치 89가 L이고, 위치 96이 P이고, 위치 108이 L임;
h. 위치 1이 D이고, 위치 11이 V이고, 위치 14가 P이고, 위치 45가 R이고, 위치 74가 S이고, 위치 83이 R이고, 위치 89가 L이고, 위치 96이 P이고, 위치 108이 L 위치이고, 위치 110이 K 또는 Q임;
i. 위치 1이 E이고, 위치 11이 V이고, 위치 14가 P이고, 위치 45가 R이고, 위치 74가 S이고, 위치 83이 R이고, 위치 89가 L이고, 위치 96이 P이고, 위치 108이 L 위치이고, 위치 110이 K 또는 Q임;
j. 위치 1이 D이고, 위치 11이 V이고, 위치 14가 P이고, 위치 45가 R이고, 위치 74가 S이고, 위치 83이 R이고, 위치 89가 L이고, 위치 96이 P이고, 위치 108이 L이고, 위치 112가 K 또는 Q임;
k. 위치 1이 E이고, 위치 11이 V이고, 위치 14가 P이고, 위치 45가 R이고, 위치 74가 S이고, 위치 83이 R이고, 위치 89가 L이고, 위치 96이 P이고, 위치 108이 L이고, 위치 112가 K 또는 Q임;
l. 위치 11이 V이고, 위치 110이 K 또는 Q임; 또는
m. 위치 11이 V이고, 위치 112가 K 또는 Q임.
추가 측면에서, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재하는 CTLA4 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)는
- 아미노산 서열 GGTFSFYGMG (서열식별번호: 13)인 CDR1 (Abm에 따름); 및
- 아미노산 서열 DIRTSAGRTY (서열식별번호: 14)인 CDR2 (Abm에 따름); 및
- 아미노산 서열 EXSGISGWDY (서열식별번호: 12; 여기서 X는 M 또는 P임)인 CDR3 (Abm에 따름)
를 갖고;
- 각각의 기준 서열의 전체 길이에 걸쳐 각각의 서열 사이의 최대 매치를 제공하도록 알고리즘의 파라미터가 선택된 BLAST 알고리즘으로 비교를 수행했을 때 (예를 들어, 예상 역치: 10; 워드 크기: 3; 질의 범위 내의 최대 매치: 0; BLOSUM 62 매트릭스; 갭 비용: 존재 11, 연장 1; 조건부 구성 점수 매트릭스 조정), 서열식별번호: 9의 아미노산 서열과의 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성의 정도 (CDR, 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장, 뿐만 아니라 수반되는 특정 측면에 의해 요구되는 위치 1, 11, 14, 45, 74, 83 89, 96, 108, 110 및/또는 112에서의 돌연변이는 서열 동일성의 정도를 결정하는데 고려되지 않음)
를 갖고/거나;
- 서열식별번호: 9의 아미노산 서열과의 7개 이하, 예컨대 5개 이하, 바람직하게는 3개 이하, 예컨대 단지 3, 2 또는 1개의 "아미노산 차이" (본원에서 정의된 바와 같고, 존재할 수 있는 위치(들) 1, 11, 14, 45, 74, 83 89, 96, 108, 110 및/또는 112에서의 상기 열거된 돌연변이 중 임의의 것을 고려하지 않으며, 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장을 고려하지 않음) (상기 아미노산 차이는, 존재하는 경우, 프레임워크 및/또는 CDR 내에 존재할 수 있지만, 바람직하게는 프레임워크 내에만 존재하고, CDR 내에는 존재하지 않음);
본 발명의 폴리펩티드의 C-말단 단부에 존재하는 경우, 바람직하게는
- C-말단 연장 (X)n (여기서 n은 1 내지 10, 바람직하게는 1 내지 5, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5 (바람직하게는 1 또는 2, 예컨대 1)이고; 각각의 X는 독립적으로 선택되는, 바람직하게는 알라닌 (A), 글리신 (G), 발린 (V), 류신 (L) 또는 이소류신 (I)으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 (바람직하게는 천연 발생) 아미노산 잔기임)
을 갖고;
본 발명의 PD1/CTLA4 결합제의 N-말단 단부에 존재하는 경우, 바람직하게는 위치 1에 D를 가져 (즉, 서열식별번호: 9에 비교하여 E1D 돌연변이),
상기 CTLA4 결합 모이어티는 언급된 위치 (카바트에 따른 넘버링)에 하기의 아미노산 잔기 중 하나 이상 (즉, 서열식별번호: 9의 아미노산 서열에 비교된 돌연변이)을 포함하며,
- 1E 또는 1D;
- 11V;
- 14P;
- 45R;
- 74S;
- 83R;
- 89L 또는 89T;
- 96P; 또는
- 108L;
예를 들어, CTLA4 결합 모이어티는 하기 돌연변이 세트 중 하나 이상을 포함한다:
- 89L과 11V의 조합;
- 89L과 110K 또는 110Q의 조합;
- 89L과 112K 또는 112Q의 조합;
- 89L과 11V 및 110K 또는 110Q의 조합;
- 89L과 11V 및 112K 또는 112Q의 조합;
- 1E와 11V; 14P; 45R; 74S; 83R; 89L; 96P; 및 108L의 조합;
- 1D와 11V; 14P; 45R; 74S; 83R; 89L; 96P; 및 108L의 조합;
- 1E와 11V; 14P; 45R; 74S; 83R; 89L; 96P; 108L 및 110K 또는 110Q의 조합;
- 1D와 11V; 14P; 45R; 74S; 83R; 89L; 96P; 108L 및 110K 또는 110Q의 조합;
- 1E와 11V; 14P; 45R; 74S; 83R; 89L; 96P; 108 L 및 112K 또는 112Q의 조합;
- 1D와 11V; 14P; 45R; 74S; 83R; 89L; 96P; 108L 및 112K 또는 112Q의 조합;
- 11V와 110K 또는 110Q의 조합; 또는
- 11V와 112K 또는 112Q의 조합.
언급된 바와 같이, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재하는 CTLA4 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)가 1가 포맷으로 사용되고/거나 본 발명의 폴리펩티드 (본원에서 정의된 바와 같음)의 C-말단 단부에 존재하는 경우, 바람직하게는 CTLA4 결합제 (그리고, 결과적으로, 생성된 본 발명의 폴리펩티드)는 C-말단 연장 X(n)을 갖고, 이러한 C-말단 연장은 본 발명의 폴리펩티드 내에 존재하는 CTLA4 결합제(들)에 대해 본원에 기재된 바와 같고/거나 WO 2012/175741 또는 PCT/EP2015/060643 (WO2015/173325)에 기재된 바와 같을 수 있다.
언급된 바와 같이, 본 발명에서, (임의적으로, 110K 또는 110Q 돌연변이 및/또는 112K 또는 112Q 돌연변이와 적합하게 조합되고, 특히 110K 또는 110Q 돌연변이와 조합되어) 위치 89가 T이거나, 또는 위치 11이 V이고 위치 89가 L인 CTLA4 모이어티가 바람직하다. 위치 11이 V이고, 위치 89가 L이며, 임의적으로 110K 또는 110Q 돌연변이가 있거나; 또는 위치 1이 D 또는 E이고, 위치 11이 V이고, 위치 14가 P이고, 위치 45가 R이고, 위치 74가 S이고, 위치 83이 R이고, 위치 89가 L이고, 위치 96이 P이고, 위치 108이 L인 CTLA4 결합제가 또한 바람직하다.
따라서, 한 바람직한 측면에서, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재하는 CTLA4 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)는
- 아미노산 서열 GGTFSFYGMG (서열식별번호: 13)인 CDR1 (Abm에 따름); 및
- 아미노산 서열 DIRTSAGRTY (서열식별번호: 14)인 CDR2 (Abm에 따름); 및
- 아미노산 서열 EXSGISGWDY (서열식별번호: 12; 여기서 X는 M 또는 P임)인 CDR3 (Abm에 따름)
를 갖고;
- 각각의 기준 서열의 전체 길이에 걸쳐 각각의 서열 사이의 최대 매치를 제공하도록 알고리즘의 파라미터가 선택된 BLAST 알고리즘으로 비교를 수행했을 때 (예를 들어, 예상 역치: 10; 워드 크기: 3; 질의 범위 내의 최대 매치: 0; BLOSUM 62 매트릭스; 갭 비용: 존재 11, 연장 1; 조건부 구성 점수 매트릭스 조정), 서열식별번호: 9의 아미노산 서열과의 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성의 정도 (CDR, 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장, 뿐만 아니라 수반되는 특정 측면에 의해 요구되는 위치 1, 11, 14, 45, 74, 83 89, 96, 108, 110 및/또는 112에서의 돌연변이는 서열 동일성의 정도를 결정하는데 고려되지 않음)
를 갖고/거나;
서열식별번호: 9의 아미노산 서열과의 7개 이하, 예컨대 5개 이하, 바람직하게는 3개 이하, 예컨대 단지 3, 2 또는 1개의 "아미노산 차이" (본원에서 정의된 바와 같고, 존재할 수 있는 위치(들) 1, 11, 14, 45, 74, 83 89, 96, 108, 110 및/또는 112에서의 상기 열거된 돌연변이 중 임의의 것을 고려하지 않으며, 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장을 고려하지 않음) (상기 아미노산 차이는, 존재하는 경우, 프레임워크 및/또는 CDR 내에 존재할 수 있지만, 바람직하게는 프레임워크 내에만 존재하고, CDR 내에는 존재하지 않음);
및 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제의 C-말단 단부에 존재하는 경우, 바람직하게는
- C-말단 연장 (X)n (여기서 n은 1 내지 10, 바람직하게는 1 내지 5, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5 (바람직하게는 1 또는 2, 예컨대 1)이고; 각각의 X는 독립적으로 선택되는, 바람직하게는 알라닌 (A), 글리신 (G), 발린 (V), 류신 (L) 또는 이소류신 (I)으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 (바람직하게는 천연 발생) 아미노산 잔기임)
을 갖고;
본 발명의 PD1/CTLA4 결합제의 N-말단 단부에 존재하는 경우, 바람직하게는 위치 1에 D를 갖고 (즉, 서열식별번호: 9에 비교하여 E1D 돌연변이),
여기서
- CTLA4 결합 모이어티의 위치 1에서의 아미노산 잔기는 E 및 D로부터 선택되고;
- CTLA4 결합 모이어티의 위치 11에서의 아미노산 잔기는 L 및 V로부터 선택되고;
- CTLA4 결합 모이어티의 위치 14에서의 아미노산 잔기는 A 및 P로부터 선택되고;
- CTLA4 결합 모이어티의 위치 45의 아미노산 잔기는 Q 및 R로부터 선택되고;
- CTLA4 결합 모이어티의 위치 74에서의 아미노산 잔기는 A 및 S로부터 선택되고;
- CTLA4 결합 모이어티의 위치 83에서의 아미노산 잔기는 K 및 R로부터 선택되고;
- CTLA4 결합 모이어티의 위치 89에서의 아미노산 잔기는 T, V 및 L로부터 선택되고;
- CTLA4 결합 모이어티의 위치 96의 아미노산 잔기는 M 및 P로부터 선택되고;
- CTLA4 결합 모이어티의 위치 108의 아미노산 잔기는 Q 및 L로부터 선택되고;
- CTLA4 결합 모이어티의 위치 110에서의 아미노산 잔기는 T, K 및 Q로부터 선택되며 (바람직하게는 T임);
- CTLA4 결합 모이어티의 위치 112에서의 아미노산 잔기는 S, K 및 Q로부터 선택된다 (바람직하게는 S임).
또 다른 바람직한 측면에서, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재하는 CTLA4 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)는
- 아미노산 서열 GGTFSFYGMG (서열식별번호: 13)인 CDR1 (Abm에 따름); 및
- 아미노산 서열 DIRTSAGRTY (서열식별번호: 14)인 CDR2 (Abm에 따름); 및
- 아미노산 서열 EXSGISGWDY (서열식별번호: 12; 여기서 X는 M 또는 P임)인 CDR3 (Abm에 따름)
를 갖고;
- 각각의 기준 서열의 전체 길이에 걸쳐 각각의 서열 사이의 최대 매치를 제공하도록 알고리즘의 파라미터가 선택된 BLAST 알고리즘으로 비교를 수행했을 때 (예를 들어, 예상 역치: 10; 워드 크기: 3; 질의 범위 내의 최대 매치: 0; BLOSUM 62 매트릭스; 갭 비용: 존재 11, 연장 1; 조건부 구성 점수 매트릭스 조정), 서열식별번호: 9의 아미노산 서열과의 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성의 정도 (CDR, 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장, 뿐만 아니라 수반되는 특정 측면에 의해 요구되는 위치 1, 11, 14, 45, 74, 83 89, 96, 108, 110 및/또는 112에서의 돌연변이는 서열 동일성의 정도를 결정하는데 고려되지 않음)
를 갖고/거나;
- 서열식별번호: 9의 아미노산 서열과의 7개 이하, 예컨대 5개 이하, 바람직하게는 3개 이하, 예컨대 단지 3, 2 또는 1개의 "아미노산 차이" (본원에서 정의된 바와 같고, 존재할 수 있는 위치(들) 1, 11, 14, 45, 74, 83 89, 96, 108, 110 및/또는 112에서의 상기 열거된 돌연변이 중 임의의 것을 고려하지 않으며, 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장을 고려하지 않음) (상기 아미노산 차이는, 존재하는 경우, 프레임워크 및/또는 CDR 내에 존재할 수 있지만, 바람직하게는 프레임워크 내에만 존재하고, CDR 내에는 존재하지 않음);
및 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제의 C-말단 단부에 존재하는 경우, 바람직하게는
- C-말단 연장 (X)n (여기서 n은 1 내지 10, 바람직하게는 1 내지 5, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5 (바람직하게는 1 또는 2, 예컨대 1)이고; 각각의 X는 독립적으로 선택되는, 바람직하게는 알라닌 (A), 글리신 (G), 발린 (V), 류신 (L) 또는 이소류신 (I)으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 (바람직하게는 천연 발생) 아미노산 잔기임)
을 갖고;
본 발명의 폴리펩티드의 N-말단 단부에 존재하는 경우, 바람직하게는 위치 1에 D를 갖고 (즉, 서열식별번호: 9에 비교하여 E1D 돌연변이),
여기서 하기 중 하나 이상이 사실이다:
- CTLA4 결합 모이어티의 위치 1에서의 아미노산 잔기가 E 또는 D임;
- CTLA4 결합 모이어티의 위치 11에서의 아미노산 잔기가 V임;
- CTLA4 결합 모이어티의 위치 14에서의 아미노산 잔기가 P임;
- CTLA4 결합 모이어티의 위치 45의 아미노산 잔기가 R임;
- CTLA4 결합 모이어티의 위치 74에서의 아미노산 잔기가 S임;
- CTLA4 결합 모이어티의 위치 83에서의 아미노산 잔기가 R임;
- CTLA4 결합 모이어티의 위치 89에서의 아미노산 잔기가 L임;
- CTLA4 결합 모이어티의 위치 96의 아미노산 잔기가 P임;
- CTLA4 결합 모이어티의 위치 108의 아미노산 잔기가 L임;
- CTLA4 결합 모이어티의 위치 110에서의 아미노산 잔기가 바람직하게는 T, K 및 Q로부터 선택됨; 또는
- CTLA4 결합 모이어티의 위치 112에서의 아미노산 잔기가 바람직하게는 S, K 및 Q로부터 선택됨.
한 특정하지만 비제한적인 측면에서, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함) 내에 존재하는 CTLA4 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)는 언급된 위치 (카바트에 따른 넘버링)에 하기의 돌연변이 세트 (즉, 서열식별번호: 9의 서열에 비교된 돌연변이)를 포함하며,
- 11V와 89L의 조합;
- 11V와 1D, 14P, 45R, 74S, 83R, 89L, 96P 및 108L의 조합;
- 11V와 1E, 14P, 45R, 74S, 83R, 89L, 96P 및 108L의 조합;
- 11V와 110K 또는 110Q의 조합;
- 11V와 112K 또는 112Q의 조합;
- 11V와 1D, 14P, 45R, 74S, 83R, 89L, 96P, 108L 및 110K 또는 110Q의 조합;
- 11V와 1E, 14P, 45R, 74S, 83R, 89L, 96P, 108L 및 110K 또는 110Q의 조합;
- 11V와 1D, 14P, 45R, 74S, 83R, 89L, 96P, 108L 및 112K 또는 112Q의 조합;
- 11V와 1E, 14P, 45R, 74S, 83R, 89L, 96P, 108L 및 112K 또는 112Q의 조합;
- 11V와 89L 및 110K 또는 110Q의 조합; 또는
- 11V와 89L 및 112K 또는 112Q의 조합;
서열식별번호: 9 또는 48-83 또는 143에 기재된 것들과 같은 CDR (예를 들어, Abm에 따름)을 갖고, 본원에 기재된 바와 같은 서열식별번호: 9의 아미노산 서열과의 전반적인 서열 동일성 정도를 갖는다.
또 다른 특정하지만 비제한적인 측면에서, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재하는 CTLA4 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)는 언급된 위치 (카바트에 따른 넘버링)에 하기의 돌연변이 세트 (즉, 서열식별번호: 9의 서열에 비교된 돌연변이)를 포함하며,
- 89L과 11V의 조합;
- 89L과 1D, 11V, 14P, 45R, 74S, 83R, 96P 및 108L의 조합;
- 89L과 1E, 11V , 14P, 45R, 74S, 83R, 96P 및 108L의 조합;
- 89L과 110K 또는 110Q의 조합;
- 89L과 112K 또는 112Q의 조합;
- 89L과 1D, 11V, 14P, 45R, 74S, 83R, 96P, 108L 및 110K 또는 110Q의 조합;
- 89L과 1E, 11V , 14P, 45R, 74S, 83R, 96P, 108L 및 110K 또는 110Q의 조합;
- 89L과 1D, 11V, 14P, 45R, 74S, 83R, 96P, 108L 및 112K 또는 112Q의 조합;
- 89L과 1E, 11V , 14P, 45R, 74S, 83R, 96P, 108L 및 112K 또는 112Q의 조합;
- 89L과 11V 및 110K 또는 110Q의 조합; 또는
- 89L과 11V 및 112K 또는 112Q의 조합;
서열식별번호: 9 또는 48-83 또는 143에 기재된 것들과 같은 CDR (예를 들어, Abm에 따름)을 갖고, 본원에 기재된 바와 같은 서열식별번호: 9의 아미노산 서열과의 전반적인 서열 동일성 정도를 갖는다.
또 다른 특정하지만 비제한적인 측면에서, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재하는 CTLA4 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)는 언급된 위치 (카바트에 따른 넘버링)에 하기의 돌연변이 세트 (즉, 서열식별번호: 9의 서열에 비교된 돌연변이)를 포함하며,
- 110K 또는 110Q와 11V의 조합;
- 110K 또는 110Q와 1D, 11V, 14P, 45R, 74S, 83R, 89L 96P 및 108L의 조합;
- 110K 또는 110Q와 1E, 11V, 14P, 45R, 74S, 83R, 89L 96P 및 108L의 조합;
- 110K 또는 110Q와 89L의 조합; 또는
- 110K 또는 110Q와 11V 및 89L의 조합;
서열식별번호: 9 또는 48-83 또는 143에 기재된 것들과 같은 CDR (예를 들어, Abm에 따름)을 갖고, 본원에 기재된 바와 같은 서열식별번호: 9의 아미노산 서열과의 전반적인 서열 동일성 정도를 갖는다.
또 다른 특정하지만 비제한적인 측면에서, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재하는 CTLA4 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)는 언급된 위치 (카바트에 따른 넘버링)에 하기의 돌연변이 세트 (즉, 서열식별번호: 9의 서열에 비교된 돌연변이)를 포함하며,
- 112K 또는 112Q와 11V의 조합;
- 112K 또는 112Q와 1D, 11V, 14P, 45R, 74S, 83R, 89L 96P 및 108L의 조합;
- 112K 또는 112Q와 1E, 11V, 14P, 45R, 74S, 83R, 89L 96P 및 108L의 조합;
- 112K 또는 112Q와 89L의 조합; 또는
- 112K 또는 112Q와 11V 및 89L의 조합;
서열식별번호: 9 또는 48-83 또는 143에 기재된 것들과 같은 CDR (예를 들어, Abm에 따름)을 갖고, 본원에 기재된 바와 같은 서열식별번호: 9의 아미노산 서열과의 전반적인 서열 동일성 정도를 갖는다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재하는 CTLA4 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)는 위치 89에 T 또는 L을 포함하고 (예를 들어, 1D 또는 1E, 11V, 14P, 45R, 74S, 83R, 89L 96P 및 108L), 서열식별번호: 9 또는 48-83 또는 143에 기재된 것들과 같은 CDR (Abm에 따름)을 갖고, 본원에 기재된 바와 같은 서열식별번호: 9의 아미노산 서열과의 전반적인 서열 동일성 정도를 갖는다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재하는 CTLA4 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)는 위치 11에 V를, 위치 89에 L을 포함하고 (예를 들어, 1D 또는 1E, 11V, 14P, 45R, 74S, 83R, 89L 96P 및 108L), 서열식별번호: 9 또는 48-83 또는 143에 기재된 것들과 같은 CDR (Abm에 따름)을 갖고, 본원에 기재된 바와 같은 서열식별번호: 9의 아미노산 서열과의 전반적인 서열 동일성 정도를 갖는다.
언급된 바와 같이, 본원에 기재된 측면에 따른 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재하는 CTLA4 결합 모이어티는 바람직하게는 (서열식별번호: 9의 아미노산 서열에 비교하여) 이들이 임의적인 E1D 돌연변이, L11V 돌연변이, A14P 돌연변이, Q45R 돌연변이, A74S 돌연변이, K83R 돌연변이, V89L 돌연변이, M96P 돌연변이 및 Q108L 돌연변이의 적합한 조합, 바람직하게는 Q108L과 다른 A14P, Q45R, A74S 및 K83R 돌연변이 중 임의의 1개, 바람직하게는 이러한 다른 돌연변이 중 임의의 2개, 더욱 바람직하게는 이러한 돌연변이 중 임의의 3개의 적합한 조합 (예컨대 조합 A14P, A74S 및 K83R과의 조합), 예컨대 이러한 돌연변이 4개 모두의 조합을 함유하도록 (그리고 마찬가지로, CTLA4 결합 모이어티가 1가이거나 또는 본 발명의 화합물 또는 폴리펩티드의 N-말단 단부에 존재하는 경우, 바람직하게는 또한 E1D 돌연변이를 함유하도록) 한다. 또한, 위치 96 (카바트 넘버링)의 메티오닌 잔기가 또 다른 천연 발생 아미노산 잔기 예컨대 Pro (Cys, Asp 또는 Asn 제외)로 교체될 수 있다.
본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재할 수 있는 CTLA4 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)의 일부 바람직하지만 비제한적인 예가 서열식별번호: 50 내지 83 및 143에서 제공되고, 이러한 서열 중 하나 이상을 적합하게 포함하는 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제가 본 발명의 추가 측면을 형성한다.
본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재할 수 있는 CTLA4 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)의 예는 서열식별번호: 62 내지 65 및 80 내지 83 및 143의 서열이다. 이들 중에서, 서열식별번호: 64 및 65가 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제의 N-말단 단부에 존재하기에 특히 적합하고, 서열식별번호: 80 및 81이 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제의 C-말단 단부에 존재하기에 특히 적합하다.
CTLA4 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)가 이들이 존재하는 PD1/CTLA4 결합제의 C-말단 단부에 존재하고/거나 이를 형성하는 경우 (또는 이러한 PD1/CTLA4 결합제에서 다른 방식으로 이들이 "노출된" C-말단 단부를 갖는 경우 (ISVD의 C-말단 단부가 불변 도메인 (예컨대 CH1 도메인)과 회합되지 않거나 또는 이에 연결되지 않는다는 것을 의미함); 마찬가지로 WO 2012/175741 및 PCT/EP2015/60643 (WO2015173325)을 참조), 이는 바람직하게는 화학식 (X)n (여기서 n은 1 내지 10, 바람직하게는 1 내지 5, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5 (바람직하게는 1 또는 2, 예컨대 1)이고; 각각의 X는 (한 바람직한 측면에 따르면, 어떠한 시스테인 잔기도 포함하지 않지만) 천연 발생 아미노산 잔기로부터 독립적으로 선택되고, 바람직하게는 알라닌 (A), 글리신 (G), 발린 (V), 류신 (L) 또는 이소류신 (I)으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 (바람직하게는 천연 발생) 아미노산 잔기임)의 C-말단 연장이 또한 있다.
이러한 C-말단 연장 X(n)의 일부 바람직하지만 비제한적인 예에 따르면, X 및 n은 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함)에 대해 본원에서 추가로 기재된 바와 같을 수 있다.
본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재하는 CTLA4 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)가 (서열식별번호: 9의 아미노산 서열에 비교하여) 위치 110 또는 112에서의 돌연변이를 함유하는 경우 (임의적으로, 본원에 기재된 바와 같은 위치 11 및/또는 89에서의 돌연변이와 조합됨), 프레임워크 4 (위치 109에서 시작됨)의 5개의 C-말단 아미노산 잔기는 하기와 같이 치환될 수 있다:
(i) C-말단 연장이 존재하지 않는 경우: VTVKS (서열식별번호: 88), VTVQS (서열식별번호: 89), VKVSS (서열식별번호: 90) 또는 VQVSS (서열식별번호: 91); 또는
(ii) C-말단 연장이 존재하는 경우: VTVKSX(n) (서열식별번호: 92), VTVQSX(n) (서열식별번호: 93), VKVSSX(n) (서열식별번호: 94) 또는 VQVSSX(n) (서열식별번호: 95), 예컨대 VTVKSA (서열식별번호: 96), VTVQSA (서열식별번호: 97), VKVSSA (서열식별번호: 98) 또는 VQVSSA (서열식별번호: 99).
본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재하는 CTLA4 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD 예컨대 나노바디)가 위치 110 또는 112에서의 돌연변이를 함유하지 않는 경우 (본원에 기재된 바와 같은 위치 1, 11, 14, 45, 74, 83, 89, 96 및/또는 108에서의 돌연변이만 함유함), 프레임워크 4 (위치 109에서 시작됨)의 C-말단 아미노산 잔기는 일반적으로 하기의 것일 것이다:
(i) C-말단 연장이 존재하지 않는 경우: VTVSS (서열식별번호: 100) (서열식별번호: 2의 서열에서와 같음); 또는
(ii) C-말단 연장이 존재하는 경우: VTVSSX(n) (서열식별번호: 101) 예컨대 VTVSSA (서열식별번호: 102). 이러한 C-말단 서열에서, X 및 n은 본원에서 C-말단 연장에 대해 정의된 바와 같다.
PD1/ CTLA4 결합제
본원에서 추가로 기재된 바와 같이, 본 발명이 제공하는 PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함)는 적어도 하나 (예컨대 1개 또는 2개)의 본원에 기재된 바와 같은 PD1 결합 모이어티 및 적어도 하나 (예컨대 1개 또는 2개)의 본원에 기재된 바와 같은 CTLA4 결합 모이어티를 포함하고, 임의적으로, 혈청 단백질 예컨대 혈청 알부민, 예를 들어, 인간 혈청 알부민 (HSA), 예를 들어, ALB11002에 결합하는 반감기 연장제 예컨대 ISVD를 포함한다. 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 PD1/CTLA4 결합제 F023700910, F023700918, F023700920 및 F023700925를 제공한다.
본 발명은 개선된 PD1/CTLA4 결합제, 특히 개선된 PD1/CTLA4 이중특이적 ISVD, 더욱 특히 개선된 PD1/CTLA4 이중특이적 나노바디를 제공하는 것을 목표로 한다. 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제는 위치 11, 14, 45, 74, 83, 89, 96, 108, 110 및/또는 112에서 돌연변이된 서열식별번호: 9의 아미노산 서열 (예를 들어, 서열식별번호: 143)을 포함하는 폴리펩티드의 변이체인 폴리펩티드를 포함하는 CTLA4 결합 모이어티; 및 위치 1, 11, 14, 52a, 73, 74, 83, 89, 100a, 110 및/또는 112에서 돌연변이된 서열식별번호: 1 또는 2의 아미노산 서열 (예를 들어, 서열식별번호: 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141 또는 142)을 포함하는 폴리펩티드의 변이체인 폴리펩티드를 포함하는 PD1 결합 모이어티를 포함하는 것들을 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, PD1/CTLA4 결합제는 서열식별번호: 103-134, 146, 149, 151 또는 153에 기재된 아미노산 서열을 포함한다.
특히, 본 발명의 폴리펩티드 내에 존재하는 PD1 결합제(들), 뿐만 아니라 본 발명의 폴리펩티드 내에 존재하는 CTLA4 결합제(들) 둘 다 본원에 추가로 기재된 바와 같은 위치 11, 89, 110 및/또는 112에서의 돌연변이 (돌연변이의 조합)을 포함할 것이다 (카바트 넘버링을 사용함).
본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함)는, 본 발명의 한 실시양태에서, 본원에 추가로 기재된 바와 같은 C-말단 연장 X(n)을 또한 포함한다. WO 2012/175741 (또한 예를 들어 WO 2013/024059 및 PCT/EP2015/060643 (WO2015/173325))에 기재된 바와 같이, C-말단 알라닌 연장은 소위 "선재하는 항체" (IgG인 것으로 가정됨)가 PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD, 예를 들어, 나노바디)의 C-말단 영역에 위치하는 추정 에피토프에 결합하는 것을 방지할 수 있다. 이러한 에피토프는, 잔기 중에서도 특히, C-말단 서열 VTVSS (서열식별번호: 100)의 표면-노출 아미노산 잔기, 뿐만 아니라 위치 14에서의 아미노산 잔기 (및 아미노산 서열 내의 동일물 옆의/동일물에 인접한 아미노산 잔기, 예컨대 위치 11, 13 및 15)를 포함하는 것으로 가정되고, 위치 83에서의 아미노산 잔기 (및 아미노산 서열 내의 동일물 옆의/동일물에 인접한 아미노산 잔기, 예컨대 위치 82, 82a, 82b 및 84) 및/또는 위치 108의 아미노산 잔기 (및 아미노산 서열 내의 동일물 옆의/동일물에 인접한 아미노산 잔기, 예컨대 위치 107)를 또한 포함할 수 있다.
그러나, 이러한 C-말단 알라닌 (또는 일반적으로 C-말단 연장)의 존재가 광범위한 대상체 (건강한 대상체 및 환자 둘 다)로부터의 혈청에서 발견될 수 있는 "선재하는 항체"의 결합을 크게 감소시킬 수 있지만 (일부 경우에는, 본질적으로 완전히 방지할 수 있지만), 일부 대상체로부터의 혈청 (예컨대 일부 면역 질환 예컨대 SLE에 걸린 환자로부터의 혈청)은 ISVD가 이러한 C-말단 알라닌 (또는 더욱 일반적으로는 이러한 C-말단 연장)을 함유할 때에도 ISVD의 C-말단 영역 (이러한 영역이 노출되었을 때)에 결합할 수 있는 선재하는 항체를 함유할 수 있다는 것이 발견되었다. 2015년 5월 13일에 출원되고 발명의 영문 명칭이 "Improved immunoglobulin variable domains"인, 양수인의 공동-계류 중인 비-예비공개 PCT 출원 PCT/EP2015/060643 (WO2015/173325)을 또 다시 참조한다.
따라서, 본 발명의 한 특정 목표는 소위 "선재하는 항체", 특히 PCT/EP2015/060643 (WO2015/173325)에 기재된 종류의 것 (예를 들어, C-말단 연장의 존재 하에서도 ISV의 노출된 C-말단 영역에 결합할 수 있는 선재하는 항체)에 의한 결합이 낮은 (또는 감소된) PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함)를 제공하는 것이다.
본 발명에 따르면, 이러한 목표는 하기의 조합에 의해 달성된다:
(i) 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함) 내에 C-말단 연장 X(n)이 존재하는 것과
(ii) 하나 이상, 바람직하게는 모든 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함) 내에, (상기 기재된 서열식별번호: 1, 2 및 9에 비교하여) PD1/CTLA4 결합제의 위치 11, 89, 110 및/또는 112에 특정 아미노산 잔기/돌연변이 (이러한 잔기/돌연변이는 본원에 추가로 기재된 바와 같음)가 존재하는 것. 바람직하게는, 상기 돌연변이는 적어도 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제의 C-말단 PD1 또는 CTLA4 결합 모이어티 내에, 더욱 바람직하게는 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재하는 모든 결합 모이어티 내에, 즉 PD1 결합 모이어티 및 CTLA4 결합 모이어티 및 또한 혈청 알부민 결합 모이어티 (존재하는 경우) 내에 존재한다.
표 C는 본 발명의 폴리펩티드 내에 존재하는 PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함)의 위치 11, 89, 110 및 112에 존재할 수 있는 아미노산 잔기의 일부 바람직하지만 비제한적인 가능한 조합을 열거한다.
표 C: 서열식별번호: 1, 2 및/또는 9의 PD1 및 CTLA4 결합 모이어티 내의 아미노산 위치 11, 89, 110 및 112에서의 돌연변이의 가능한 조합.
Figure pct00010
본 발명의 한 실시양태에서, PD1 및/또는 CTLA4에 결합하는 결합 모이어티는 예를 들어 각각 치환, 삽입 및 결실로부터 독립적으로 선택되는, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상의 추가적인 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함) 내에 존재하는 C-말단 연장은 WO 2012/175741 및 PCT/EP2015/60643 (WO2015/173325)에 기재된 바와 같을 수 있고, 바람직하게는 화학식 (X)n (여기서 n은 1 내지 10, 바람직하게는 1 내지 5, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5 (바람직하게는 1 또는 2, 예컨대 1)이고; 각각의 X는 (한 바람직한 측면에 따르면, 어떠한 시스테인 잔기도 포함하지 않지만) 천연 발생 아미노산 잔기로부터 독립적으로 선택되고, 바람직하게는 알라닌 (A), 글리신 (G), 발린 (V), 류신 (L) 또는 이소류신 (I)으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 (바람직하게는 천연 발생) 아미노산 잔기임)의 것이다.
이러한 C-말단 연장 X(n)의 일부 바람직하지만 비제한적인 예에 따르면, X 및 n은 하기와 같을 수 있며,
(a) n = 1 및 X = Ala;
(b) n = 2 및 각각의 X = Ala;
(c) n = 3 및 각각의 X = Ala;
(d) n = 2 및 적어도 하나의 X = Ala (나머지 아미노산 잔기(들) X는 임의의 천연 발생 아미노산으로부터 독립적으로 선택되지만, 바람직하게는 Val, Leu 및/또는 Ile으로부터 독립적으로 선택됨);
(e) n = 3 및 적어도 하나의 X = Ala (나머지 아미노산 잔기(들) X는 임의의 천연 발생 아미노산으로부터 독립적으로 선택되지만, 바람직하게는 Val, Leu 및/또는 Ile으로부터 독립적으로 선택됨);
(f) n = 3 및 적어도 2개의 X = Ala (나머지 아미노산 잔기(들) X는 임의의 천연 발생 아미노산으로부터 독립적으로 선택되지만, 바람직하게는 Val, Leu 및/또는 Ile으로부터 독립적으로 선택됨);
(g) n = 1 및 X = Gly;
(h) n = 2 및 각각의 X = Gly;
(i) n = 3 및 각각의 X = Gly;
(j) n = 2 및 적어도 하나의 X = Gly (나머지 아미노산 잔기(들) X는 임의의 천연 발생 아미노산으로부터 독립적으로 선택되지만, 바람직하게는 Val, Leu 및/또는 Ile으로부터 독립적으로 선택됨);
(k) n = 3 및 적어도 하나의 X = Gly (나머지 아미노산 잔기(들) X는 임의의 천연 발생 아미노산으로부터 독립적으로 선택되지만, 바람직하게는 Val, Leu 및/또는 Ile으로부터 독립적으로 선택됨);
(l) n = 3 및 적어도 2개의 X = Gly (나머지 아미노산 잔기(들) X는 임의의 천연 발생 아미노산으로부터 독립적으로 선택되지만, 바람직하게는 Val, Leu 및/또는 Ile으로부터 독립적으로 선택됨);
(m) n = 2 및 각각의 X = Ala 또는 Gly;
(n) n = 3 및 각각의 X = Ala 또는 Gly;
(o) n = 3 및 적어도 하나의 X = Ala 또는 Gly (나머지 아미노산 잔기(들) X는 임의의 천연 발생 아미노산으로부터 독립적으로 선택되지만, 바람직하게는 Val, Leu 및/또는 Ile으로부터 독립적으로 선택됨); 또는
(p) n = 3 및 적어도 2개의 X = Ala 또는 Gly (나머지 아미노산 잔기(들) X는 임의의 천연 발생 아미노산으로부터 독립적으로 선택되지만, 바람직하게는 Val, Leu 및/또는 Ile으로부터 독립적으로 선택됨);
측면 (a), (b), (c), (g), (h), (i), (m) 및 (n)이 바람직하고, n =1 또는 2인 측면이 바람직하며, n = 1인 측면이 바람직하다.
바람직하게는, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함) 내에 존재하는 임의의 C-말단 연장이 (유리) 시스테인 잔기를 (상기 시스테인 잔기가 추가 관능화, 예를 들어 PEG화)에 사용되지 않는 한) 함유하지 않는다는 것을 또한 주목하여야 한다.
유용한 C-말단 연장의 일부 특정하지만 비제한적인 예는 하기의 아미노산 서열이다: A, AA, AAA, G, GG, GGG, AG, GA, AAG, AGG, AGA, GGA, GAA 또는 GAG.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함)는 위치 1에 아스파르트산 잔기 (D)를 또한 포함한다 (즉, 폴리펩티드의 N-말단 단부의 첫 번째 아미노산 잔기가 바람직하게는 D임).
본 발명의 한 실시양태에서, 반감기 연장제는 혈청 단백질 예컨대 혈청 알부민, 예를 들어, 인간 혈청 알부민 (HSA)에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)이다. 특히, 이러한 혈청 알부민 결합 ISVD 또는 나노바디는 예를 들어 EP 2 139 918, WO 2011/006915, WO 2012/175400, WO 2014/111550에 기재된 바와 같은 인간 혈청 알부민에 대한 (단일) 도메인 항체 또는 dAb일 수 있고, 특히 WO 2004/041865, WO 2006/122787, WO 2012/175400 또는 PCT/EP2015/060643 (WO2015/173325)에 기재된 바와 같은 혈청 알부민 결합 나노바디일 수 있다. 바람직한 혈청 알부민 결합 ISVD는 나노바디 Alb-1 (WO 2006/122787 참조) 또는 그의 인간화 변이체 예컨대 Alb-8 (WO 2006/122787, 서열식별번호: 62), Alb-23 (WO 2012/175400, 서열식별번호: 1) 및 Alb-1의 다른 인간화 (바람직하게는 또한 서열-최적화) 변이체 및/또는 Alb-8 또는 Alb-23의 변이체 (또는 더욱 일반적으로는 본질적으로 Alb-1, Alb-8 및 Alb-23와 동일한 CDR이 있는 ISVD)이다. 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재할 수 있는 일부 바람직하지만 비제한적인 혈청 알부민 결합제의 아미노산 서열이 도 5에서 서열식별번호: 84 및 85로서 제공된다. 본 발명의 한 실시양태에서, HSA 결합 ISVD는 ALB11002이다.
이러한 혈청 알부민 결합 ISVD는, 존재하는 경우, 선재하는 항체에 의한 결합을 감소시키는 하나 이상의 프레임워크 돌연변이를 그의 서열 내에 함유할 수 있다. 특히, 이러한 혈청 알부민 결합 ISVD가 본질적으로 VH 도메인으로 이루어지고/거나 이로부터 유래된 나노바디 또는 (단일) 도메인 항체인 경우, 혈청 알부민 결합 ISVD는 PCT/EP2015/060643 (WO2015/173325)에 기재된 바와 같고/거나 본질적으로 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함) 내에 존재하는 CTLA4 및 PD1 결합 모이어티에 대해 기재된 바와 같은 위치 11, 89, 110 및/또는 112에서의 아미노산 잔기/돌연변이 (그의 적합한 조합)를 함유할 수 있다. 예를 들어, PCT/EP2015/060643 (WO2015/173325)은 본 발명의 화합물에서 사용될 수 있는 선재하는 항체에 의한 결합을 감소시키는 위치 11, 89, 110 및/또는 112에서의 아미노산 잔기/돌연변이를 함유하는 Alb-1, Alb-8 및 Alb-23의 다수의 변이체를 기재한다.
이러한 혈청 알부민 결합 ISVD가 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함)의 C-말단 단부에 존재하는 경우, 본 발명의 한 실시양태에서, 혈청 알부민 결합 ISVD (그리고 결과적으로 본 발명의 화합물)는 C-말단 연장 X(n)을 갖고, 이러한 C-말단 연장은 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재하는 PD1 또는 CTLA4 결합 모이어티에 대해 본원에 기재된 바와 같고/거나 WO 2012/175741 또는 PCT/EP2015/060643 (WO2015/173325)에 기재된 바와 같을 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 이는 선재하는 항체의 결합을 감소시키는 돌연변이, 예컨대 PCT/EP2015/060643 (WO2015/173325)에 기재된 위치 11, 89, 110 및/또는 112에서의 아미노산 잔기/돌연변이 (그의 적합한 조합)도 있다.
혈청 알부민 결합 ISVD의 존재/사용이 반감기가 증가된 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함)를 제공하는 바람직한 방식이지만, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제의 반감기를 증가시키는 다른 수단, 예컨대 혈청 알부민에 결합하는 다른 결합 도메인의 사용, 다른 혈청 단백질 예컨대 트랜스페린 또는 IgG에 결합하는 ISVD의 사용, PEG화, 인간 알부민 (예를 들어, HSA) 또는 그의 적합한 단편과의 융합, 또는 적합한 혈청 알부민-결합 펩티드의 사용이 본 발명의 범주에 또한 포함된다.
따라서, 추가 측면에서, 본 발명은 적어도 하나 (예컨대 1개 또는 2개)의 본원에 기재된 바와 같은 PD1 결합 모이어티 및 적어도 하나 (예컨대 1개 또는 2개)의 본원에 기재된 바와 같은 CTLA4 결합 모이어티를 포함하고, 임의적으로, 하나 이상 (예컨대 1개 또는 2개)의 반감기 연장제, 예컨대 혈청 단백질 예컨대 혈청 알부민, 예를 들어, HSA에 결합하는 1개 또는 2개의 ISVD (예를 들어, ALB11002)를 포함하며, PD1/CTLA4 결합제의 인간 대상체에서의 반감기가 적어도 1일, 바람직하게는 적어도 3일, 더욱 바람직하게는 적어도 7일, 예컨대 적어도 10일인 PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함)에 관한 것이다.
언급된 바와 같이, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함)는 바람직하게는 또한 반감기 (본원에서 정의된 바와 같음)가 증가되었고, 일반적으로 이는 폴리펩티드가 본 발명의 폴리펩티드 내에 존재하는 1가 PD1 결합제의 반감기보다 적어도 2배, 바람직하게는 적어도 5배, 예를 들어 적어도 10배 또는 20배 초과로 더 큰 반감기 (본원에서 정의된 바와 같음), 뿐만 아니라 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재하는 1가 CTLA4 결합 모이어티의 반감기보다 적어도 2배, 바람직하게는 적어도 5배, 예를 들어 적어도 10배 또는 20배 초과로 더 큰 반감기 (본원에서 정의된 바와 같음)를 갖는다는 것을 의미한다 (인간 및/또는 적합한 동물 모델, 예컨대 마우스 또는 시노몰구스 원숭이에서 측정된 바와 같음).
본 발명의 한 실시양태에서, 반감기 연장제는 인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)이고, 예를 들어, ALB11002가 하기 표 D 또는 도 5에서 요약된다.
표 D. 인간 혈청 알부민 ( HSA ) 결합제 ALB11002
Figure pct00011
* CDR: 밑줄 및/또는 볼드체. 임의적으로, ALB11002는 C-말단 알라닌이 결여된다.
임의적으로, HSA 결합제는 서열식별번호: 144에 기재되었지만 11L 및/또는 93V를 포함하는 아미노산 서열, 예를 들어, 하기를 포함한다:
EVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS (서열식별번호: 144)
본 발명의 한 실시양태에서, 반감기 연장제는
- 아미노산 서열 GFTFSSFGMS (서열식별번호: 199) 또는 SFGMS (서열식별번호: 199의 아미노산 6-10)를 포함하는 CDR1; 및
- 아미노산 서열 SISGSGSDTL (서열식별번호: 200) 또는 SISGSGSDTL (서열식별번호: 200의 아미노산 1-10)을 포함하는 CDR2; 및
- 아미노산 서열 GGSLSR (서열식별번호: 201)을 포함하는 CDR3;
을 포함하고,
임의적으로,
- 서열식별번호: 84, 85 또는 144의 아미노산 서열과의 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성의 정도 (존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장, 뿐만 아니라 CDR은 서열 동일성의 정도를 결정하는데 고려되지 않음);
및/또는
- 서열식별번호: 84, 85 또는 144의 아미노산 서열과의 7개 이하, 예컨대 5개 이하, 바람직하게는 3개 이하, 예컨대 단지 3, 2 또는 1개의 "아미노산 차이" (상기 아미노산 차이는, 존재하는 경우, 프레임워크 및/또는 CDR 내에 존재할 수 있지만, 바람직하게는 프레임워크 내에만 존재하고, CDR 내에는 존재하지 않음)
를 갖고;
임의적으로
- C-말단 연장 (X)n (여기서 n은 1 내지 10, 바람직하게는 1 내지 5, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5 (바람직하게는 1 또는 2, 예컨대 1)이고; 각각의 X는 독립적으로 선택되는, 바람직하게는 알라닌 (A), 글리신 (G), 발린 (V), 류신 (L) 또는 이소류신 (I)으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 (바람직하게는 천연 발생) 아미노산 잔기임)
을 갖는
HSA ISVD (예를 들어, 나노바디)이다.
본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함)에서, PD1 결합 모이어티, CTLA4 결합 모이어티 (및 존재하는 경우의 혈청 알부민 결합 ISV)는 서로 직접적으로 또는 하나 이상의 적합한 링커를 통해 연결될 수 있다. 링커의 일부 바람직하지만 비제한적인 예는 9GS, 15GS 또는 35GS 링커 (9, 15 또는 35개의 G 및 S 아미노산의 임의의 조합, 예를 들어, GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS) (서열식별번호: 86)이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 링커는 (GGGGS)n (서열식별번호: 180) (여기서 n은 1, 2, 3, 4 ,5, 6, 7, 8, 9 또는 10임)이다.
본 발명은 하나 이상의 PD1 결합 모이어티, 하나 이상의 CTLA4 결합 모이어티 및 임의적인 혈청 알부민 결합 ISVD (존재하는 경우) 이외에, 하나 이상의 다른 아미노산 서열, 화학 물질 또는 모이어티를 함유할 수 있는 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함)를 포함한다. 이러한 다른 아미노산 서열, 화학 물질 또는 모이어티는, 예를 들어 원하는 생물학적 및/또는 치료 활성이 있는 (생성된) 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제를 제공하도록 (예를 들어, PD1 및 CTLA4 이외의 또 다른 치료적으로 관련된 표적에 대한 친화력 및 바람직하게는 효능이 있는 생성된 본 발명의 화합물을 제공하여, 생성된 화합물이 PD1, CTLA4 및 이러한 다른 치료적으로 관련된 표적과 관련하여 "삼중특이적"이도록, 약동학 및/또는 약역학 성질을 변형시키거나 개선하도록, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제를 특정 세포, 조직 또는 기관 (암 세포 및 암 조직을 포함함)로 표적화하도록, 세포독성 효과를 제공하도록 및/또는 검출가능한 태그 또는 표지로서의 역할을 하도록, 하나 이상의 원하는 성질을 (생성된) 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제에 부여할 수 있고/거나 (생성된) 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제의 성질을 원하는 방식으로 변경시킬 수 있다. 이러한 다른 아미노산 서열, 화학 물질 또는 모이어티의 일부 비제한적인 예는 하기의 것들이다:
- PD1 및 CTLA4 이외의 치료적으로 관련된 표적에 대해 지시된 하나 이상의 결합 도메인 또는 결합 단위 (즉, PD1, CTLA4 및 다른 치료적으로 관련된 표적, 예를 들어, CD27, LAG3, BTLA, TIM3, ICOS, B7-H3, B7-H4, CD137, GITR, PD-L1, PD-L2, ILT1, ILT2 CEACAM1, CEACAM5, TIM3, TIGIT, VISTA, ILT3, ILT4, ILT5, ILT6, ILT7, ILT8, CD40, OX40, CD137, KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL3, NKG2A, NKG2C, NKG2E, IL-10, IL-17 또는 TSLP에 대해 삼중특이적인 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제를 제공하도록); 및/또는
- 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제를 원하는 세포, 조직 또는 기관 (예컨대 암 세포)로 표적화하는 하나 이상의 결합 도메인 또는 결합 단위; 및/또는
- PD1에 대한 증가된 특이성을 제공하는 하나 이상의 결합 도메인 또는 결합 단위 (통상적으로, 이는 PD1에 결합할 수 있을 것이지만, 일반적으로 독자적으로는 본질적으로 PD1에 대해 기능적이지 않을 것임); 및/또는
- CTLA4에 대한 증가된 특이성을 제공하는 하나 이상의 결합 도메인 또는 결합 단위 (통상적으로, 이는 CTLA4에 결합할 수 있을 것이지만, 일반적으로 독자적으로는 본질적으로 CTLA4에 대해 기능적이지 않을 것임); 및/또는
- 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제가 (원하는) 세포 내로 내재화되게 허용하는 결합 도메인, 결합 단위 또는 다른 화학 물질 (예를 들어, WO 2005/044858에 기재된 바와 같은 내재화 항-EGFR 나노바디); 및/또는
- 페이로드 예컨대 세포독성 페이로드; 및/또는
- 검출가능한 표지 또는 태그, 예컨대 방사성 표지 또는 형광 표지; 및/또는
- 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제의 고정, 검출 및/또는 정제를 도울 수 있는 태그, 예컨대 HIS 또는 FLAG3 태그; 및/또는
- 관능화될 수 있는 태그, 예컨대 C-말단 GGC 또는 GGGC 태그.
본 발명의 범주는 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함)가 통상적인 항체 (바람직하게는 인간 항체)의 하나 이상의 부분 또는 단편 (예를 들어 Fc 부분 또는 그의 기능성 단편 또는 하나 이상의 불변 도메인) 및/또는 낙타류 중쇄 단독 항체로부터의 것 (예컨대 하나 이상의 불변 도메인)을 또한 함유할 수 있는 것을 포함한다.
본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함)가 하나 이상의 추가 결합 도메인 또는 결합 단위 (예를 들어, 이전 단락들에 기재된 바와 같음)를 함유하는 경우, 이러한 다른 결합 도메인 또는 결합 단위는 바람직하게는 하나 이상의 ISVD를 포함하고, 더욱 바람직하게는 모두 ISVD이다. 예를 들어, 그리고 비제한적으로, 이러한 하나 이상의 추가 결합 도메인 또는 결합 단위는 하나 이상의 나노바디 (VHH, 인간화 VHH 및/또는 낙타화 VH 예컨대 낙타화 인간 VH를 포함함), VH 도메인이거나 또는 VH 도메인으로부터 유래된 (단일 도메인) 항체, VH 도메인이거나 또는 본질적으로 VH 도메인으로 이루어지거나 또는 VH 도메인으로부터 유래된 dAb, 또는 심지어 VL 도메인이거나 또는 본질적으로 VL 도메인으로 이루어진 (단일) 도메인 항체 또는 dAb일 수 있다. 특히, 이러한 하나 이상의 결합 도메인 또는 결합 단위는, 존재하는 경우, 하나 이상의 나노바디를 포함할 수 있고, 더욱 특히 모두 나노바디이다.
본 발명의 PD1/CTLA4 결합제가 그의 C-말단 단부에 ISVD가 있는 경우 (이러한 C-말단 결합 모이어티 (예를 들어, ISVD 예컨대 나노바디)는 PD1 결합 모이어티, CTLA4 결합 모이어티, 인간 혈청 알부민 결합 모이어티 (예를 들어, ISVD 예컨대 나노바디, 예를 들어, ABL1002) 또는 이전 단락들에서 지칭된 바와 같은 또 다른 ISVD일 수 있음), 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 (즉, 상기 C-말단 ISVD)는 바람직하게는 본원에 기재된 바와 같은 C-말단 연장 X(n)을 갖는다.
본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함)가 하나 이상의 PD1 결합 모이어티, 하나 이상의 CTLA4 결합 모이어티 및 혈청 알부민 결합 결합 모이어티 (예를 들어, ISVD 예컨대 나노바디) (존재하는 경우)에 더하여 임의의 추가 결합 모이어티 (예를 들어, ISVD) (이전 단락들에서 기재된 바와 같음)를 함유하고, 이러한 추가 ISVD가 VH 서열이고/거나, 본질적으로 VH 서열로 이루어지고/거나 VH 서열로부터 유래된 ISVD이거나 또는 나노바디인 경우, 본 발명의 바람직한 측면에 따르면, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재하는 상기 하나 이상의 (바람직하게는 모든) 이러한 ISVD는 선재하는 항체에 의한 결합을 감소시키는 하나 이상의 프레임워크 돌연변이를 그의 서열 내에 함유할 것이다. 특히, 본 발명의 이러한 측면에 따르면, 이러한 추가 ISVD는 PCT/EP2015/060643 (WO2015/173325)에 기재된 바와 같고/거나 본질적으로 PD1 결합 모이어티 및 CTLA4 결합 모이어티에 대해 본원에 기재된 바와 같은 위치 11, 89, 110 및/또는 112에서의 아미노산 잔기/돌연변이 (그의 적합한 조합)를 함유할 수 있다. 한 구체적 측면에서, 본 발명의 폴리펩티드가 그의 C-말단 단부에 ISVD가 있는 경우 (이러한 C-말단 ISVD는 PD1 결합제, CTLA4 결합 모이어티, 혈청 알부민 결합 모이어티 (예를 들어, ISVD) 또는 이전 단락들에서 지칭된 바와 같은 또 다른 ISVD일 수 있음), 적어도 C-말단에 존재하고/거나 이를 형성하는 상기 ISVD는 선재하는 항체에 의한 결합을 감소시키는 프레임워크 돌연변이가 있다 (그리고, 바람직하게는 상기 C-말단 ISVD는 본원에 기재된 바와 같은 C-말단 연장 X(n)도 있을 것임).
또 다른 측면에서, 본 발명은 적어도 하나의 PD1 결합 모이어티 (예를 들어, ISVD) 및 적어도 하나의 CTLA4 결합 모이어티 (예를 들어, ISVD)를 포함하고, 여기서 PD1 결합 모이어티 (예를 들어, ISVD)는 서열식별번호: 16 내지 47 및 135-142로부터 선택되고, CTLA4 결합 모이어티 (예를 들어, ISVD)는 서열식별번호: 50 내지 83, 143 및 196으로부터 선택되는 PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함) (이러한 PD1/CTLA4 결합제는 본원에서 추가로 기재된 바와 같음)에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 적어도 하나의 PD1 결합 모이어티 (예를 들어, ISVD) 및 적어도 하나의 CTLA4 결합 모이어티 (예를 들어, ISVD)를 포함하고, 여기서 PD1 결합 모이어티 (예를 들어, ISVD)는 서열식별번호: 30, 31, 46, 47 및 135로부터 선택되고, CTLA4 결합 모이어티 (예를 들어, ISVD)는 서열식별번호: 62 내지 65 및/또는 80 내지 83 및/또는 143으로부터 선택되는 PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함) (이러한 PD1/CTLA4 결합제는 본원에서 추가로 기재된 바와 같음)에 관한 것이다.
마찬가지로, 모든 이러한 PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함)는 바람직하게는 C-말단 연장 X(n) (본원에 기재된 바와 같음) 및 위치 1의 D를 함유하고, 본원에 추가로 기재된 바와 같이, 혈청 알부민 결합 모이어티 (예를 들어 ISVD)를 함유할 수 있다.
본원의 개시내용으로부터 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함)가 적어도 2개의 결합 모이어티 (예를 들어, ISVD 예컨대 나노바디)를 포함하고 (즉, 적어도 2가이고), 적어도 PD1 및 CTLA4에 대해 지시된다 (즉, 적어도 이중특이적임)는 것이 명백할 것이다. PD1/CTLA4 결합제는 추가로 상이한 "포맷"을 가질 수 있고, 즉, 본질적으로 2가, 3가 또는 다가일 수 있고, 이중특이적, 삼중특이적 또는 다중특이적일 수 있으며, PD1 및/또는 CTLA4와 관련하여 이중파라토프성 (본원 및 예를 들어 WO 2009/068625에서 정의된 바와 같음)일 수 있다. 예를 들어, 그리고 비제한적으로, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제는:
- 본질적으로 1개의 PD1 결합 모이어티 (본원에 기재된 바와 같음) 및 1개의 CTLA 결합 모이어티 (본원에 기재된 바와 같음)로 이루어지거나;
- 본질적으로 2개의 PD1 결합 모이어티 (본원에 기재된 바와 같음) 및 1개의 CTLA 결합 모이어티 (본원에 기재된 바와 같음)로 이루어지거나;
- 본질적으로 1개의 PD1 결합 모이어티 (본원에 기재된 바와 같음) 및 2개의 CTLA 결합 모이어티 (본원에 기재된 바와 같음)로 이루어지거나;
- 본질적으로 2개의 PD1 결합 모이어티 (본원에 기재된 바와 같음) 및 2개의 CTLA 결합 모이어티 (본원에 기재된 바와 같음)로 이루어지거나;
- 본질적으로 1개의 PD1 결합 모이어티 (본원에 기재된 바와 같음), 1개의 CTLA 결합 모이어티 (본원에 기재된 바와 같음) 및 인간 혈청 알부민에 대한 1개의 결합 모이어티 (예를 들어, ISVD) (본원에 기재된 바와 같음)로 이루어지거나;
- 본질적으로 2개의 PD1 결합 모이어티 (본원에 기재된 바와 같음), 1개의 CTLA 결합 모이어티 (본원에 기재된 바와 같음) 및 인간 혈청 알부민에 대한 1개의 ISVD 결합 모이어티 (예를 들어, ISVD) (본원에 기재된 바와 같음)로 이루어지거나;
- 본질적으로 1개의 PD1 결합 모이어티 (본원에 기재된 바와 같음), 2개의 CTLA 결합 모이어티 (본원에 기재된 바와 같음) 및 인간 혈청 알부민에 대한 1개의 결합 모이어티 (예를 들어, ISVD) (본원에 기재된 바와 같음)로 이루어지거나;
- 본질적으로 2개의 PD1 결합 모이어티 (본원에 기재된 바와 같음), 2개의 CTLA 결합 모이어티 (본원에 기재된 바와 같음) 및 인간 혈청 알부민에 대한 1개의 결합 모이어티 (예를 들어, ISVD) (본원에 기재된 바와 같음)로 이루어지거나;
- 본질적으로 1개의 PD1 결합 모이어티 (본원에 기재된 바와 같음), 1개의 CTLA 결합 모이어티 (본원에 기재된 바와 같음) 및 PD1에 대한 1개의 추가 결합 모이어티 (예를 들어, ISVD) (PD1과 관련하여 기능성일 수 있거나 또는 기능성이지 않을 수 있음)로 이루어지거나;
- 본질적으로 1개의 PD1 결합 모이어티 (본원에 기재된 바와 같음), 1개의 CTLA 결합 모이어티 (본원에 기재된 바와 같음) 및 CTLA4에 대한 1개의 추가 결합 모이어티 (예를 들어, ISVD) (CTLA4와 관련하여 기능성일 수 있거나 또는 기능성이지 않을 수 있음)로 이루어지거나;
- 본질적으로 1개의 PD1 결합 모이어티 (본원에 기재된 바와 같음), 1개의 CTLA 결합 모이어티 (본원에 기재된 바와 같음), PD1에 대한 1개의 추가 결합 모이어티 (예를 들어, ISVD) (PD1과 관련하여 기능성일 수 있거나 또는 기능성이지 않을 수 있음) 및 인간 혈청 알부민에 대한 1개의 결합 모이어티 (예를 들어, ISVD) (본원에 기재된 바와 같음)로 이루어지거나; 또는
- 본질적으로 1개의 PD1 결합 모이어티 (본원에 기재된 바와 같음), 1개의 CTLA 결합 모이어티 (본원에 기재된 바와 같음), CTLA4에 대한 1개의 추가 결합 모이어티 (예를 들어, ISVD) (CTLA4와 관련하여 기능성일 수 있거나 또는 기능성이지 않을 수 있음) 및 인간 혈청 알부민에 대한 1개의 결합 모이어티 (예를 들어, ISVD) (본원에 기재된 바와 같음)로 이루어진다.
본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함)에 대한 다른 적합한 포맷이 본원의 개시내용을 기초로 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
통상의 기술자에게 명백할 바와 같이, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함)가 국소 용도용 (즉, 피부 또는 눈)으로 의도되거나, 또는, 예를 들어, 예를 들어 GI 관 (즉, 경구 투여 또는 좌약에 의한 투여 후) 또는 폐 (즉, 흡입에 의한 투여 후) 내의 어딘가에서 (국소화된) 치료 작용을 가질 예정이거나, 또는 다르게는 그의 의도되는 작용 장소로 (예를 들어 직접적인 주사에 의해) 직접적으로 적용될 예정인 경우, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제는 일반적으로 반감기 연장을 필요로 하지 않을 것이다. 이러한 경우에, 반감기 연장이 없는 본 발명의 2가 이중특이적 PD1/CTLA4 결합제 또는 본 발명의 또 다른 PD1/CTLA4 결합제의 사용이 바람직할 수 있다.
반감기 연장이 없는 본 발명의 폴리펩티드의 일부 바람직하지만 비제한적인 예가 하기 표 C-1에서 개략적으로 표현되고, 이들 각각은 본 발명의 추가 측면을 형성한다. 반감기 연장이 없는 적합한 본 발명의 폴리펩티드의 다른 예가 본원의 개시내용을 기초로 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 마찬가지로, 이러한 폴리펩티드들은 바람직하게는 위치 1에 D가 있다.
표 C-1. 반감기 연장 ISVD가 없는 본 발명의 CTLA4 /PD1 결합제의 개략적인 표현.
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
통상의 기술자에게 명백할 바와 같이, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함)가 전신 투여용으로 및/또는 만성 질환 또는 장애의 예방 및/또는 치료용으로 의도되는 경우, 상기 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제의 반감기 (본원에서 정의된 바와 같음)가 증가된 것이, 즉 이러한 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 내에 존재하는 CTLA4 및 PD1 결합 모이어티에 비교하여 증가된 것이 일반적으로 바람직할 것이다. 더욱 바람직하게는, 이러한 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제는 반감기 연장 결합 모이어티 예컨대 바람직하게는 ISVD, 특히 인간 혈청 알부민에 결합하는 나노바디 (본원에 기재된 바와 같음)를 함유할 것이다.
이러한 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함)의 일부 바람직하지만 비제한적인 예가 하기 표 C-2에서 개략적으로 표현되고, 이들 각각은 본 발명의 추가 측면을 형성한다. 반감기 연장이 있는 적합한 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제의 다른 예가 본원의 개시내용을 기초로 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 일반적으로, 반감기 연장이 있는 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제에 대해, C-말단 연장의 존재가 더욱 바람직하다. 마찬가지로, 이러한 폴리펩티드들은 바람직하게는 위치 1에 D가 있다.
표 C-2. 반감기 연장 모이어티가 있는 본 발명의 일부 CTLA4 /PD1 결합제의 개략적인 표현.
Figure pct00015
Figure pct00016
본 발명의 한 실시양태에서, PD1/CTLA4 결합제는 하기의 구조를 포함하며,
ㆍ [PD1 결합 모이어티]-[PD1 결합 모이어티]-[CTLA4 결합 모이어티]-[CTLA4 결합 모이어티]-[알부민 결합 모이어티];
ㆍ [CTLA4 결합 모이어티]-[CTLA4 결합 모이어티]-[PD1 결합 모이어티]-[PD1 결합 모이어티]-[알부민 결합 모이어티];
ㆍ [PD1 결합 모이어티]-[CTLA4 결합 모이어티]-[알부민 결합 모이어티];
ㆍ [CTLA4 결합 모이어티]-[PD1 결합 모이어티]-[알부민 결합 모이어티];
ㆍ [PD1 결합 모이어티]-[CTLA4 결합 모이어티]-[CTLA4 결합 모이어티]-[알부민 결합 모이어티];
ㆍ [CTLA4 결합 모이어티]-[CTLA4 결합 모이어티]-[PD1 결합 모이어티]-[알부민 결합 모이어티];
ㆍ [PD1 결합 모이어티]-[PD1 결합 모이어티]-[CTLA4 결합 모이어티]-[알부민 결합 모이어티]; 또는
ㆍ [CTLA4 결합 모이어티]-[PD1 결합 모이어티]-[PD1 결합 모이어티]-[알부민 결합 모이어티];
각각은 임의적으로 C-말단 알라닌을 포함한다.
본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함)의 일부 바람직하지만 비제한적인 예가 도 6 또는 서열식별번호: 103-134, 146, 149, 151 또는 153에서 제공된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제는 하기와 같은 F023700910, F023700918, F023700920 또는 F023700925이다.
F023700910은 하기 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있다:
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
(서열식별번호: 145)
F023700910은 하기 아미노산 서열을 포함하며,
DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSIAS IHAMG
WFRQAPGKEREFVA VITWSGGITY YADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYY
CAG DKHQSSWYDY WGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSE
VQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGGTFS FYGMG WFRQAPGKEREFVADIRTSAGRTYYA
DSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAA EPSGISGWDY WGQGTLVTVSSGG
GGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGF
TFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLR
PEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA
(서열식별번호: 146); 임의적으로 신호 펩티드 예컨대 하기를 포함한다:
MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKR (서열식별번호: 147)
F023700910은 하기 모이어티를 포함한다:
ㆍ PD1 결합제 102C12 (E1D,L11V,A14P,A74S,K83R,I89L);
ㆍ 펩티드 링커;
ㆍ CTLA4 결합제 11F01 (L11V,A14P,Q45R,A74S,K83R,V89L,M96P,Q108L);
ㆍ 펩티드 링커;
ㆍ 인간 혈청 알부민 결합제 ALB11002;
ㆍ C-말단 연장제 알라닌.
예를 들어:
ㆍ PD1 결합제 서열식별번호: 135;
ㆍ 35GS 링커 서열식별번호: 86;
ㆍ CTLA4 결합제 서열식별번호: 143 (임의적으로, D1E);
ㆍ 35GS 링커 서열식별번호: 86;
ㆍ HSA 결합제 서열식별번호: 144;
ㆍ 알라닌.
F023700918은 하기 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있다:
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
(서열식별번호: 148)
F023700918은 하기 아미노산 서열을 포함하며,
DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSIAS IHAMG
WFRQAPGKEREFVA VITWSGGITY YADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYY
CAG DKHQSSWYDY WGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSE
VQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSIAS IHAMG WFRQAPGKEREFVAVITWSGGITYYA
DSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAG DKHQSSWYDY WGQGTLVTVSSGG
GGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGG
TFS FYGMG WFRQAPGKEREFVA DIRTSAGRTY YADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLR
PEDTALYYCAA EPSGISGWDY WGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGG
GSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISG
SGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTV
SSA
(서열식별번호: 149); 임의적으로 신호 펩티드 예컨대 하기를 포함한다:
MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKR (서열식별번호: 147)
F023700918은 하기 모이어티를 포함한다:
ㆍ PD1 결합제 102C12 (E1D,L11V,A14P,A74S,K83R,I89L);
ㆍ 펩티드 링커;
ㆍ PD1 결합제 102C12 (L11V,A14P,A74S,K83R,I89L);
ㆍ 펩티드 링커;
ㆍ CTLA4 결합제 11F01 (L11V,A14P,Q45R,A74S,K83R,V89L,M96P,Q108L);
ㆍ 펩티드 링커;
ㆍ 인간 혈청 알부민 결합제 ALB11002;
ㆍ C-말단 연장제 알라닌.
예를 들어:
ㆍ PD1 결합제 서열식별번호: 135 (임의적으로, D1E);
ㆍ 35GS 링커 서열식별번호: 86;
ㆍ PD1 결합제 서열식별번호: 135 (임의적으로, D1E);
ㆍ 35GS 링커 서열식별번호: 86;
ㆍ CTLA4 결합제 서열식별번호: 143 (임의적으로, D1E);
ㆍ 35GS 링커 서열식별번호: 86;
ㆍ HSA 결합제 서열식별번호: 144;
ㆍ 알라닌
F023700920은 하기 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있다:
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
(서열식별번호: 150)
F023700920은 하기 아미노산 서열을 포함하며,
DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSIAS IHAMG
WFRQAPGKEREFVA VITWSGGITY YADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYY
CAG DKHQSSWYDY WGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSE
VQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGGTFS FYGMG WFRQAPGKEREFVADIRTSAGRTYYA
DSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAA EPSGISGWDY WGQGTLVTVSSGG
GGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGG
TFS FYGMG WFRQAPGKEREFVA DIRTSAGRTY YADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLR
PEDTALYYCAA EPSGISGWDY WGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGG
GSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISG
SGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTV
SSA
(서열식별번호: 151); 임의적으로 신호 펩티드 예컨대 하기를 포함한다:
MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKR (서열식별번호: 147)
F023700920은 하기 모이어티를 포함한다:
ㆍ PD1 결합제 102C12 (E1D,L11V,A14P,A74S,K83R,I89L);
ㆍ 펩티드 링커;
ㆍ CTLA4 결합제 11F01 (L11V,A14P,Q45R,A74S,K83R,V89L,M96P,Q108L);
ㆍ 펩티드 링커;
ㆍ CTLA4 결합제 11F01 (L11V,A14P,Q45R,A74S,K83R,V89L,M96P,Q108L);
ㆍ 펩티드 링커;
ㆍ 인간 혈청 알부민 결합제 ALB11002;
ㆍ C-말단 연장제 알라닌
예를 들어:
ㆍ PD1 결합제 서열식별번호: 135;
ㆍ 35GS 링커 서열식별번호: 86;
ㆍ CTLA4 결합제 서열식별번호: 143 (임의적으로, D1E);
ㆍ 35GS 링커 서열식별번호: 86;
ㆍ CTLA4 결합제 서열식별번호: 143 (임의적으로, D1E);
ㆍ 35GS 링커 서열식별번호: 86;
ㆍ HSA 결합제 서열식별번호: 144;
ㆍ 알라닌
F023700925는 하기 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있다:
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
(서열식별번호: 152)
F023700925는 하기 아미노산 서열을 포함하며,
DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSIAS IHAMG
WFRQAPGKEREFVA VITWSGGITY YADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYY
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VQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSIAS IHAMG WFRQAPGKEREFVA VITWSGGITY YA
DSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAG DKHQSSWYDY WGQGTLVTVSSGG
GGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGG
TFS FYGMG WFRQAPGKEREFVA DIRTSAGRTY YADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLR
PEDTALYYCAA EPSGISGWDY WGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGG
GSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGGTFS FYGMG WFRQAPGKEREFVADIRT
SAGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAA EPSGISGWDY WGQGT
LVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGNSLR
LSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTL
YLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA
(서열식별번호: 153); 임의적으로 신호 펩티드 예컨대 하기를 하기를 포함한다:
MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKR (서열식별번호: 147)
F023700925는 하기 모이어티를 포함한다:
ㆍ PD1 결합제 102C12 (E1D, L11V, A14P, A74S, K83R, I89L);
ㆍ 펩티드 링커;
ㆍ PD1 결합제 102C12 (L11V, A14P, A74S, K83R, I89L);
ㆍ 펩티드 링커;
ㆍ CTLA4 결합제 11F01 (L11V, A14P, Q45R, A74S, K83R, V89L, M96P, Q108L);
ㆍ 펩티드 링커;
ㆍ CTLA4 결합제 11F01 (L11V, A14P, Q45R, A74S, K83R, V89L, M96P, Q108L);
ㆍ 펩티드 링커;
ㆍ 인간 혈청 알부민 결합제 ALB11002;
ㆍ C-말단 연장제 알라닌.
예를 들어:
ㆍ PD1 결합제 서열식별번호: 135;
ㆍ 35GS 링커 서열식별번호: 86;
ㆍ PD1 결합제 서열식별번호: 135 (임의적으로, D1E);
ㆍ 35GS 링커 서열식별번호: 86;
ㆍ CTLA4 결합제 서열식별번호: 143 (임의적으로, D1E);
ㆍ 35GS 링커 서열식별번호: 86;
ㆍ CTLA4 결합제 서열식별번호: 143 (임의적으로, D1E);
ㆍ 35GS 링커 서열식별번호: 86;
ㆍ HSA 결합제 서열식별번호: 144;
ㆍ 알라닌.
본 발명은 F023700910, F023700918, F023700920 또는 F023700925의 PD1, CTLA4 및 HSA 결합 모이어티를 포함하는 임의의 결합제를 포함한다.
본 발명은 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제가 서열식별번호: 146, 149, 151 또는 153에 기재된 서열에 비교하여 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 치환, 예를 들어, 보존적 아미노산 치환을 포함하고/거나 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 서열 동일성을 포함하는, 예를 들어, 이러한 치환 및/또는 서열 동일성이 있는 PD1/CTLA4 결합제가 PD1 및 CTLA4에 결합하는 능력을 유지하는 실시양태를 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제의 첫 번째 아미노산은 E이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제의 첫 번째 아미노산은 D이다.
본 발명은 본원에 기재된 PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함), 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것 또는 그의 제약 조성물을 포함하는 주사 장치를 또한 제공한다. 주사 장치는 비경구 경로, 예를 들어, 근육내, 피하 또는 정맥내 경로를 통해 환자의 신체 내로 물질을 도입하는 장치이다. 예를 들어, 주사 장치는 주사될 유체 (예를 들어, PD1/CTLA4 결합제 또는 그의 제약 조성물을 포함함)를 보유하기 위한 실린더 또는 배럴, 유체 주사를 위해 피부 및/또는 혈관을 관통하기 위한 바늘, 및 실린더 밖으로 바늘 구멍을 통해 유체를 밀어내기 위한 플런저를 예를 들어 포함하는 주사기 (예를 들어, 제약 조성물이 예비-충전됨, 예컨대 자동 주사기)일 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, PD1/CTLA4 결합제 또는 그의 제약 조성물을 포함하는 주사 장치는 정맥내 (IV) 주사 장치이다. 이러한 장치는 캐뉼라 또는 트로카르/바늘을 통해 대상체의 신체 내로 도입되는 유체 (예를 들어, 염수; 또는 NaCl, 락트산나트륨, KCl, CaCl2를 포함하는 락테이트화 링거 용액 (임의적으로 글루코스를 포함함))를 보유하기 위한 백 또는 저장소에 부착될 수 있는 튜브에 부착될 수 있는 캐뉼라 또는 트로카르/바늘 내의 PD1/CTLA4 결합제 또는 그의 제약 조성물을 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 트로카르 및 캐뉼라가 대상체의 정맥 내로 삽입되고, 삽입된 캐뉼라로부터 트로카르가 제거되면, PD1/CTLA4 결합제 또는 그의 제약 조성물이 장치 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, IV 장치는 말초 정맥 (예를 들어, 손 또는 팔 내) 내로; 상대정맥 또는 하대정맥 내로, 또는 우심방 내에 (예를 들어, 중심 IV); 또는 쇄골하정맥, 내경정맥, 또는 대퇴정맥 내로, 예를 들어, 상대정맥 또는 우심방에 도달할 때까지 심장을 향해 나아가도록 (예를 들어, 중심 정맥 라인) 삽입될 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 주사 장치는 자동주사기; 분사 주사기 또는 외부 주입 펌프이다. 분사 주사기는 PD1/CTLA4 결합제 또는 그의 제약 조성물을 환자의 신체로 도입하도록 표피를 투과하는 액체의 좁은 고압 분사기를 사용한다. 외부 주입 펌프는 PD1/CTLA4 결합제 또는 그의 제약 조성물을 제어된 양으로 환자의 신체 내로 전달하는 의료 장치이다. 외부 주입 펌프는 전기적으로 또는 기계적으로 구동될 수 있다. 상이한 펌프는 상이한 방식으로 작동되고, 예를 들어, 주사기 펌프는 유체를 주사기의 저장소 내에 보유하고, 이동가능한 피스톤은 유체 전달을 제어하고, 엘라스토머성 펌프는 신축성이 있는 풍선 저장소에 유체를 보유하며, 풍선의 탄성 벽으로부터의 압력은 유체 전달을 구동시킨다. 연동식 펌프에서는, 롤러 세트가 가요성 튜빙의 길이에 조여져서, 유체를 앞으로 밀어낸다. 다중 채널 펌프에서는, 유체가 다중 속도로 다중 저장소로부터 전달될 수 있다.
에피토프 결합 및 교차-차단
본 발명은 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, F023700910, F023700918, F023700920 또는 F023700925), 뿐만 아니라 이러한 결합제와 동일한 PD1 및/또는 CTLA4 에피토프에 결합하는 결합제, 예를 들어, ISVD (예를 들어, 나노바디) 및 항체 및 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 F023700912 (서열식별번호: 193)와 동일한 잔기와 접촉함으로써 인간 CTLA4에 결합하거나 또는 그의 CTLA4 결합 모이어티 (11F01 (E1D,L11V, A14P,Q45R,A74S,K83R,V89L,M96P,Q108L))와 동일한 잔기와 접촉하는 결합제를 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 인간 CTLA4의 잔기 VRVTVL (서열식별번호: 195의 잔기 33 - 38), ADSQVTEVC (서열식별번호: 195의 잔기 41-49) 및/또는 CKVELMYPPPYYLG (서열식별번호: 195의 잔기 93-106), 예를 들어, 3개 부위 모두에서 인간 CTLA4에 결합하는 결합제를 제공한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 이러한 결합제는 수소-중수소 교환 검정법에서 이러한 잔기에서 인간 CTLA4에 결합하는 것을 실연하고, 예를 들어, 중수소 예컨대 D2O의 존재 하에 수소가 중수소로 교환되는 것으로부터, 예를 들어, 본질적으로 도 17에 기재된 바와 같은 결합 히트 맵에 의해 나타나는 바와 같이, 이러한 잔기를 보호한다.
본 발명은 본원에 개시된 결합제 (예를 들어, F023700910, F023700918, F023700920 또는 F023700925) 중 임의의 것의 결합을 교차-차단할 수 있는 교차-차단 결합제를 또한 제공한다. 이러한 교차-차단 결합제는 이러한 교차-차단을 나타내는 임의의 분자, 예를 들어, ISVD, 나노바디, 항체 또는 그의 항원-결합 단편일 수 있다.
일반적으로, 기준 결합제 (예를 들어, F023700910, F023700918, F023700920 또는 F023700925)를 "교차-차단"하거나 또는 기준 결합제와 "교차 경쟁"하는 결합제 (예를 들어, ISVD 예컨대 나노바디) 또는 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 기준 결합제가 그의 항원에 결합하는 것을 교차-차단 검정법에서 50% 이상만큼 차단하는 결합제 (예를 들어, ISVD 예컨대 나노바디) 또는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 지칭하고, 반대로, 기준 결합제는 이러한 결합제 (예를 들어, ISVD 예컨대 나노바디) 또는 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 그의 항원에 결합하는 것을 교차-차단 검정법에서 50% 이상만큼 차단한다. 표면 플라즈몬 공명 (SPR), ELISA 및 유동 세포측정법을 포함하는 관련 분야에 공지된 임의의 검정법을 사용하여 교차-차단을 결정할 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 비아코어(Biacore) 검정법을 사용함으로써 교차-차단이 결정된다. 편리를 위해, 2개의 결합제가 언급되고, 본 발명의 범주는 본 발명의 결합제를 교차-차단하는 항체 및 그의 항원 결합 단편, 예를 들어, Fab 단편을 포함한다. 제조사의 권고사항에 따라 비아코어 기계 (예를 들어 비아코어 3000)가 작동된다.
따라서, 한 교차-차단 검정법에서, PD1 또는 CTLA4를 표준 아민 커플링 화학을 사용하여 CM5 비아코어 칩에 커플링시켜, PD1 또는 LAG3-코팅 표면을 생성시킨다. 예를 들어, 200-800 공명 단위의 PD1 또는 CTLA4가 칩에 커플링될 수 있다 (또는 용이하게 측정가능한 수준의 결합을 제공하지만 사용되는 테스트 시약의 농도에 의해 쉽게 포화될 수 있는 임의의 양).
서로를 교차-차단하는 능력에 대해 평가될 2개의 결합제 (A* 및 B*로 명명됨)를 적합한 완충제 내에서 1 대 1의 결합 부위 몰비로 혼합하여 테스트 혼합물을 생성시킨다.
테스트 혼합물 내의 각각의 결합제의 농도는 비아코어 칩 상에 포획된 PD1 또는 CTLA4 분자 상의 이러한 결합제에 대한 결합 부위를 쉽게 포화시키도록 충분히 높아야 한다. 혼합물 내의 결합제들은 동일한 몰 농도이다.
결합제 A* 단독 및 결합제 B* 단독을 함유하는 별개의 용액을 또한 제조한다. 이러한 용액 내의 결합제 A* 및 결합제 B*는 동일한 완충제 내에 있어야 하고, 테스트 혼합물에서와 동일한 농도여야 한다.
테스트 혼합물을 PD1 또는 CTLA4-코팅 비아코어 칩에 통과시키고, 총 결합량을 기록한다. 그 후, 결합된 결합제를 칩에 결합된 PD1 또는 CTLA4를 손상시키지 않으면서 제거하는 방식으로 칩을 처리한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 이는 칩을 30 mM HCl로 60초 동안 처리함으로써 행해진다.
그 후, 결합제 A* 단독의 용액을 PD1 또는 CTLA4-코팅 표면에 통과시키고, 결합량을 기록한다. 결합된 결합제 모두를 칩에 결합된 PD1 또는 CTLA4를 손상시키지 않으면서 제거하도록 칩을 다시 처리한다.
그 후, 결합제 B* 단독의 용액을 PD1 또는 CTLA4-코팅 표면에 통과시키고, 결합량을 기록한다.
다음으로, 결합제 A* 및 결합제 B*의 혼합물의 최대 이론적 결합을 계산하고, 이는 PD1 또는 CTLA4 표면에 단독으로 통과시켰을 때의 각각의 결합제의 결합의 합계이다. 혼합물의 실제 기록된 결합이 이러한 이론적 최대값보다 적으면, 2개의 결합제가 서로를 교차-차단한다.
따라서, 일반적으로, 본 발명에 따른 교차-차단 결합제는 검정법 동안, 그리고 제2 결합제의 존재 하에, 기록된 결합이 예를 들어 조합된 2개의 결합제의 최대 이론적 결합 (상기 정의된 바와 같음)의 80% 내지 0.1% (예를 들어, 80% 내지 4%), 예를 들어 최대 이론적 결합의 75% 내지 0.1% (예를 들어, 75% 내지 4%), 예를 들어, 최대 이론적 결합의 70% 내지 0.1% (예를 들어, 70% 내지 4%)이도록 상기 비아코어 교차-차단 검정법에서 PD1 또는 CTLA4에 결합할 차단제이다.
본 발명의 한 실시양태에서, ELISA 검정법이 PD1 및/또는 CTLA4 결합제가 본 발명에 따라 교차-차단하는지 또는 교차-차단할 수 있는지 여부를 결정하는데 사용된다.
이러한 검정법의 일반적인 원리는 PD1 또는 CTLA4 결합제를 ELISA 플레이트의 웰 상에 코팅하는 것이다. 과량의 잠재적으로 교차-차단성인 제2의 항-PD1 또는 CTLA4 결합제는 용액에 첨가된다 (즉, ELISA 플레이트에 결합되지 않음). 그 후, 제한된 양의 PD1 또는 CTLA4를 웰에 첨가한다. 코팅된 결합제 및 용액 내의 결합제가 제한된 수의 PD1 또는 CTLA4 분자에 결합하는 것에 대해 경쟁한다. 플레이트를 세정하여, 코팅된 결합제가 결합하지 않은 PD1 또는 CTLA4를 제거하고, 또한 제2의 용액 상 결합제, 뿐만 아니라 제2의 용액 상 결합제와 PD1 또는 CTLA4 사이에 형성된 임의의 복합체를 또한 제거한다. 그 후, 결합된 PD1 또는 CTLA4의 양을 적절한 PD1 또는 CTLA4 검출 시약을 사용하여 측정한다. 코팅된 결합제를 교차-차단할 수 있는 용액 내의 결합제는 코팅된 결합제가 제2의 용액 상 결합제의 부재 하에 결합할 수 있는 PD1 또는 CTLA4 분자의 수에 비교하여 코팅된 결합제가 결합할 수 있는 PD1 또는 CTLA4 분자의 수의 감소를 야기할 수 있을 것이다.
발현 방법
본 발명은 (i) PD1/CTLA4 결합제의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하며, 예를 들어, 여기서 폴리뉴클레오티드는 벡터 내에 있고/거나 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인 단계; (ii) 숙주 세포 (예를 들어, CHO 또는 피키아(Pichia) 또는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris))를 폴리뉴클레오티드의 발현에 유리한 조건 하에 배양하는 단계, 및 (iii) 임의적으로, PD1/CTLA4 결합제를 숙주 세포 및/또는 숙주 세포가 성장된 배지로부터 단리하는 단계를 포함하는, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, ISVD 예컨대 나노바디) (예를 들어, F023700910, F023700918, F023700920 또는 F023700925)를 제조하기 위한 재조합 방법을 포함한다. 예를 들어, WO 04/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 또는 WO 2009/068627을 참조한다.
본 발명은 본원에 기재된 PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함) (예를 들어, F023700910, F023700918, F023700920 또는 F023700925)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 또한 관련된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 이러한 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 제어 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 플라스미드 또는 벡터의 형태일 수 있다. 마찬가지로, 이러한 폴리뉴클레오티드는 일반적으로 아블링스 엔.브이.의 특허 출원 공개, 예를 들어 WO 04/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 또는 WO 2009/068627에 기재된 바와 같을 수 있다.
본 발명은 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함) (예를 들어, F023700910, F023700918, F023700920 또는 F023700925)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 핵산에 또한 관련된다. 본 발명은 상기 뉴클레오티드 서열 또는 핵산 및 그 자체로 공지된 유전자 구축물에 대한 하나 이상의 요소를 포함하는 유전자 구축물을 추가로 포함한다. 이러한 유전자 구축물은 플라스미드 또는 벡터의 형태일 수 있다. 마찬가지로, 이러한 구축물은 일반적으로 아블링스 엔.브이.의 특허 출원 공개, 예를 들어 WO 2004/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 또는 WO 2009/068627에 기재된 바와 같을 수 있다.
본 발명은 이러한 뉴클레오티드 서열 또는 핵산을 함유하고/거나 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함) (예를 들어, F023700910, F023700918, F023700920 또는 F023700925)를 발현하는 (또는 발현할 수 있는) 숙주 또는 숙주 세포에 또한 관련된다. 마찬가지로, 이러한 숙주 세포는 일반적으로 아블링스 엔.브이.의 특허 출원 공개, 예를 들어 WO 2004/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 또는 WO 2009/068627에 기재된 바와 같을 수 있다.
본원에 기재된 PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함) (예를 들어, F023700910, F023700918, F023700920 또는 F023700925), 폴리펩티드, 화합물, 및 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 벡터)는 바람직하게는 순환계로 투여된다. 따라서, 이는 PD1/CTLA4 결합제, 폴리펩티드, 화합물 및 폴리뉴클레오티드가 순환계로 진입하게 허용하는 임의의 적합한 방식으로, 예컨대 정맥 내로, 주사 또는 주입을 통해, 또는 PD1/CTLA4 결합제, 폴리펩티드, 화합물 및 폴리뉴클레오티드가 순환계로 진입하게 허용하는 임의의 다른 적합한 방식 (경구 투여, 피하 투여, 근육내 투여, 피부를 통한 투여, 비강내 투여, 폐를 통한 투여 등을 포함함)으로 투여될 수 있다. 마찬가지로 예를 들어 또한 아블링스 엔.브이.의 특허 출원 공개, 예를 들어 WO 04/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 또는 WO 2009/068627의 교시내용으로부터, 적합한 투여 방법 및 경로가 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함 (예를 들어, F023700910, F023700918, F023700920 또는 F023700925))의 발현을 위한 숙주로서의 포유동물 세포를 포함하는 진핵생물 및 원핵생물 숙주 세포가 관련 분야에 널리 공지되어 있고, 아메리칸 타입 컬처 컬렉션(American Type Culture Collection) (ATCC)으로부터 입수가능한 다수의 불멸화 세포주를 포함한다. 이는, 특히, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, NSO, SP2 세포, HeLa 세포, 새끼 햄스터 신장 (BHK) 세포, 원숭이 신장 세포 (COS), 인간 간세포성 암종 세포 (예를 들어, Hep G2), A549 세포, 3T3 세포, HEK-293 세포 및 다수의 다른 세포주를 포함한다. 포유동물 숙주 세포는 인간, 마우스, 래트, 개, 원숭이, 돼지, 염소, 소, 말 및 햄스터 세포를 포함한다. 특히 바람직한 세포주는 어느 세포주가 발현 수준이 높은지를 결정하는 것을 통해 선택된다. 사용될 수 있는 다른 세포주는 곤충 세포주 (예를 들어, 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 또는 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni)), 양서류 세포, 박테리아 세포, 식물 세포 및 진균 세포이다. 진균 세포는 피키아 파스토리스, 피키아 핀란디카(Pichia finlandica ), 피키아 트레할로필라(Pichia trehalophila), 피키아 코클라마에(Pichia koclamae), 피키아 멤브라나에파시엔스(Pichia membranaefaciens), 피키아 미누타(Pichia minuta) (오가타에아 미누타(Ogataea minuta), 피키아 린드네리(Pichia lindneri)), 피키아 오푼티아에(Pichia opuntiae), 피키아 테르모톨레란스(Pichia thermotolerans), 피키아 살릭타리아(Pichia salictaria), 피키아 구에르쿠움(Pichia guercuum), 피키아 피이페리(Pichia pijperi), 피키아 스팁티스(Pichia stiptis), 피키아 메탄올리카(Pichia methanolica), 피키아 종, 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스(Saccharomyces) 종, 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 종, 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스페르길루스 니거(Aspergillus niger), 아스페르길루스 오리자에(Aspergillus oryzae), 트리코데르마 레에세이 (Trichoderma reesei), 크리소스포리움 루크노웬세(Chrysosporium lucknowense), 푸사리움(Fusarium) 종, 푸사리움 그라미네움(Fusarium gramineum), 푸사리움 베네나툼(Fusarium venenatum), 피스코미트렐라 파텐스(Physcomitrella patens) 및 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa), 피키아 종, 임의의 사카로마이세스 종, 한세눌라 폴리모르파, 임의의 클루이베로마이세스 종, 칸디다 알비칸스, 임의의 아스페르길루스(Aspergillus) 종, 트리코데르마 레에세이, 크리소스포리움 루크노웬세, 임의의 푸사리움 종, 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 및 뉴로스포라 크라사를 예를 들어 포함하는 효모 및 필라멘트형 진균류 세포를 포함한다
추가로, 생산 세포주로부터의 PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함) (예를 들어, F023700910, F023700918, F023700920 또는 F023700925)의 발현을 다수의 공지된 기술을 사용하여 증강시킬 수 있다. 예를 들어, 글루타민 신세타제 유전자 발현 시스템 (GS 시스템)은 특정 조건 하에서의 발현을 증강시키기 위한 통상적인 접근법이다. GS 시스템은 유럽 특허 번호 0 216 846, 0 256 055, 및 0 323 997 및 유럽 특허 출원 번호 89303964.4와 관련하여 전체적으로 또는 부분적으로 논의되어 있다. 따라서, 본 발명의 한 실시양태에서, 포유동물 숙주 세포 (예를 들어, CHO)는 글루타민 신세타제 유전자가 결여되고, 배지 내의 글루타민의 부재 하에 성장되지만, 이뮤노글로불린 사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포 내의 이러한 유전자의 결여를 보완하는 글루타민 신세타제 유전자를 포함한다.
본 발명은 PD1/CTLA4 결합제를 포함하는 샘플 (예를 들어, 배양 배지, 세포 용해물 또는 세포 용해물 분획, 예를 들어, 용해물의 가용성 분획)을 정제 배지 (예를 들어, 양이온-교환 배지, 음이온 교환 배지, 소수성 교환 배지, 친화력 정제 배지 (예를 들어, 단백질-A, 단백질-G, 단백질-A/G, 단백질-L))에 도입하는 것, 및 정제된 PD1/CTLA4 결합제를 배지에 결합하지 않은 상기 샘플의 관류 분획으로부터 정제하거나, 또는 관류 분획을 폐기하고 결합된 PD1/CTLA4 결합제를 배지로부터 용출시키고 용출액을 수집하는 것을 포함하는, PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함) (예를 들어, F023700910, F023700918, F023700920 또는 F023700925)를 정제하는 방법을 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 배지는 샘플이 적용되는 칼럼 내에 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 숙주 세포에서의 항체 또는 단편의 재조합 발현 후에 정제 방법이 수행되고, 예를 들어, 먼저 숙주 세포를 용해시키고, 임의적으로, 배지 상에서의 정제 전에 용해물에서 불용성 물질을 정제하거나, 또는 PD1/CTLA4 결합제가 숙주 세포에 의해 배양 배지 내로 분비되고, 배지 또는 그의 분획을 정제 배지에 적용한다.
일반적으로, 특정 세포주 또는 트랜스제닉 동물에서 생산된 당단백질은 이러한 세포주 또는 트랜스제닉 동물에서 생산된 당단백질에 대해 특징적인 글리코실화 패턴이 있을 것이다. 따라서, PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디) (예를 들어, F023700910, F023700918, F023700920 또는 F023700925)를 포함함)의 특정 글리코실화 패턴은 PD1/CTLA4 결합제를 생산하는데 사용된 특정 세포주 또는 트랜스제닉 동물에 좌우될 것이다. 비-푸코실화 N-글리칸만 포함하는 PD1/CTLA4 결합제가 본 발명의 일부이고 유리할 수 있는데, 이는 비-푸코실화 항체는 전형적으로 시험관내 및 생체내 둘 다에서 그의 푸코실화 대응물보다 더욱 강력한 효능을 나타내는 것으로 나타났기 때문이다 (예를 들어, 문헌 [Shinkawa et al., J. Biol. Chem. 278: 3466-3473 (2003)]; 미국 특허 번호 6,946,292 및 7,214,775 참조). 비-푸코실화 N-글리칸이 있는 이러한 PD1/CTLA4 결합제는 그의 탄수화물 구조가 인간 혈청 IgG 내에 존재하는 집단의 정상 성분이기 때문에 면역원성이지 않을 것이다.
본 발명은 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO N-연결 글리칸) 또는 조작된 효모 세포 (조작된 효모 N-연결 글리칸), 예를 들어, 피키아 파스토리스에서 생산된 이뮤노글로불린에 전형적으로 부가되는 N-연결 글리칸을 포함하는 PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함) (예를 들어, F023700910, F023700918, F023700920 또는 F023700925)를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 한 실시양태에서, PD1/CTLA4 결합제는 도 7에 기재된 "조작된 효모 N-연결 글리칸" 또는 "CHO N-연결 글리칸" (예를 들어, G0 및/또는 G0-F 및/또는 G1 및/또는 G1-F 및/또는 및/또는 G2-F 및/또는 Man5) 중 하나 이상을 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, PD1/CTLA4 결합제는 조작된 효모 N-연결 글리칸, 즉, G0 및/또는 G1 및/또는 G2를 포함하고, 임의적으로 Man5를 추가로 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, PD1/CTLA4 결합제는 CHO N-연결 글리칸, 즉, G0-F, G1-F 및 G2-F를 포함하고, 임의적으로, G0 및/또는 G1 및/또는 G2 및/또는 Man5를 추가로 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, PD1/CTLA4 결합제 상의 모든 N-연결 글리칸의 약 80% 내지 약 95% (예를 들어, 약 80-90%, 약 85%, 약 90% 또는 약 95%)가 조작된 효모 N-연결 글리칸 또는 CHO N-연결 글리칸이다. 문헌 [Nett et al. Yeast. 28(3): 237-252 (2011)]; [Hamilton et al. Science. 313(5792): 1441-1443 (2006)]; [Hamilton et al. Curr Opin Biotechnol. 18(5): 387-392 (2007)]을 참조한다. 예를 들어, 본 발명의 한 실시양태에서, 조작된 효모 세포는 GFI5.0 또는 YGLY8316 또는 미국 특허 7,795,002 또는 문헌 [Zha et al. Methods Mol Biol. 988:31-43 (2013)]에 기재된 균주이다. 국제 특허 출원 공개 번호 WO2013/066765를 또한 참조한다.
조합물
특정한 실시양태에서, PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함) (예를 들어, F023700910, F023700918, F023700920 또는 F023700925)는 단독으로, 또는 다른 추가 치료제 및/또는 치료 절차와 연합하여, 예를 들어, 본원에 논의된 바와 같이, 임의의 질환 예컨대 암을 치료 또는 예방하기 위해 이러한 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 사용될 수 있다. 이러한 결합제를 추가 치료제와 연합하여 포함하는 조성물 또는 키트, 예를 들어, 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물이 또한 본 발명의 일부이다.
용어 "와 연합하여"는 또 다른 작용제 예컨대 펨브롤리주맙 또는 니볼루맙과 함께인 PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함) (예를 들어, F023700910, F023700918, F023700920 또는 F023700925)인 성분들이, 예를 들어, 동시 전달을 위해, 단일 조성물 내로 제형될 수 있거나, 또는 2개 이상의 조성물로 별개로 제형될 수 있다 (예를 들어 키트)는 것을 가리킨다. 각각의 성분은 다른 성분이 투여되는 시간과 상이한 시간에 대상체에게 투여될 수 있다; 예를 들어, 각각의 투여는 소정의 기간에 걸친 간격으로 동시적이지 않게 (예를 들어, 별개로 또는 순차적으로) 제공될 수 있다. 또한, 별개의 성분들은 동일한 경로 또는 상이한 경로에 의해 대상체에게 투여될 수 있다 (예를 들어, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제는 비경구로 투여되고, 파클리탁셀은 경구로 투여됨).
특정한 실시양태에서, PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함) (예를 들어, F023700910, F023700918, F023700920 또는 F023700925)는 항암 치료제 또는 면역조정 약물 예컨대 면역조정 수용체 억제제, 예를 들어, 수용체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 연합하여 사용될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함) (예를 들어, F023700910, F023700918, F023700920 또는 F023700925)는 하기와 같은 억제제 (예를 들어, 소형 유기 분자 또는 항체 또는 그의 항원-결합 단편) 중 하나 이상과 연합된다: MTOR (라파마이신의 포유동물 표적) 억제제, 세포독성제, 백금 작용제, BRAF 억제제, CDK4/6 억제제, EGFR 억제제, VEGF 억제제, 미세관 안정화제, 탁산, CD20 억제제, CD52 억제제, CD30 억제제, RANK (핵 인자 카파-B의 수용체 활성화제) 억제제, RANKL (핵 인자 카파-B 리간드의 수용체 활성화제) 억제제, ERK 억제제, MAP 키나제 억제제, AKT 억제제, MEK 억제제, PI3K 억제제, HER1 억제제, HER2 억제제, HER3 억제제, HER4 억제제, Bcl2 억제제, CD22 억제제, CD79b 억제제, ErbB2 억제제, 또는 파르네실 단백질 트랜스퍼라제 억제제.
본 발명의 한 실시양태에서, PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함) (예를 들어, F023700910, F023700918, F023700920 또는 F023700925)는 하기 중 하나 이상과 연합된다: 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 이필리무맙), 항-PD1 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 펨브롤리주맙, 니볼루맙, CT-011), 항-PDL1, 항-CTLA4, 항-TIM3, 항-CS1, (예를 들어, 엘로투주맙), 항-KIR2DL1/2/3 (예를 들어, 리릴루맙), 항-CD27, 항-CD137 (예를 들어, 우렐루맙), 항-GITR (예를 들어, TRX518), 항-PD-L1 (예를 들어, BMS-936559, MSB0010718C 또는 MPDL3280A), 항-PD-L2, 항-ILT1, 항-ILT2, 항-ILT3, 항-ILT4, 항-ILT5, 항-ILT6, 항-ILT7, 항-ILT8, 항-CD40, 항-OX40, 항-CD137, 항-KIR2DL1, 항-KIR2DL2/3, 항-KIR2DL4, 항-KIR2DL5A, 항-KIR2DL5B, 항-KIR3DL1, 항-KIR3DL2, 항-KIR3DL3, 항-NKG2A, 항-NKG2C, 항-NKG2E, 또는 이러한 표적의 임의의 소형 유기 분자 억제제; IL-10, 항-IL10, 항-TSLP (흉선 기질 림포포이에틴) 또는 PEG화 IL-10.
본 발명의 한 실시양태에서, PEG화 IL-10 분자 상의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 모이어티의 분자량은 약 12,000 돌턴 또는 약 20,000 돌턴이다. 본 발명의 한 실시양태에서, PEG화 IL-10 (예를 들어, PEG화 인간 IL-10)은 링커 (예를 들어, C2-12 알킬 예컨대 --CH2CH2CH2--)를 통해 IL-10의 단일 서브유닛의 단일 아미노산 잔기에 공유결합으로 부착된 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜 분자를 포함하고, 여기서 상기 아미노산 잔기는 N-말단 아미노산 잔기의 알파 아미노 기 또는 리신 잔기의 엡실론 아미노 기이다. 본 발명의 한 실시양태에서, PEG화 IL-10은 (PEG)b-L-NH-IL-10 (여기서 b는 1-9이고, L은 IL-10의 단일 아미노산 잔기의 질소 (N)에 공유결합으로 부착된 C2-12 알킬 링커 모이어티임)이다. 본 발명의 한 실시양태에서, PEG화 IL-10의 IL-10은 화학식 [X--O(CH2CH2O)n]b-L-NH-IL-10 (여기서 X는 H 또는 C1-4 알킬이고; n은 20 내지 2300이고; b는 1 내지 9이며; L은 1개의 IL-10 서브유닛의 아미노 말단에서 알파 아미노 기의 질소 (N)에 공유결합으로 부착된 C1-11 알킬 링커 모이어티이고; 단, b가 1을 초과하는 경우, 총 n은 2300을 초과하지 않음)을 갖는다. US7,052,686을 참조한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 항-IL-10 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 인간화 항체)은 하기 기재된 CDR을 포함한다:
CDR-L1: KTSQNIFENLA (서열식별번호: 154);
CDR-L2: NASPLQA (서열식별번호: 155);-
CDR-L3: HQYYSGYT (서열식별번호: 156);
CDR-H1: GFTFSDYHMA (서열식별번호: 157);
CDR-H2: SITLDATYTYYRDSVRG (서열식별번호: 158);
CDR-H3: HRGFSVWLDY (서열식별번호: 159)
(US7,662,379 참조)
본 발명의 한 실시양태에서, 항-TSLP 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 인간화 항체)은 하기 기재된 CDR을 포함한다:
CDR-H1: GYIFTDYAMH (서열식별번호: 160);
CDR-H2: TFIPLLDTSDYNQNFK (서열식별번호: 161);
CDR-H3: MGVTHSYVMDA (서열식별번호: 162);
CDR-L1: RASQPISISVH (서열식별번호: 163);
CDR-L2: FASQSIS (서열식별번호: 164);
CDR-L3: QQTFSLPYT (서열식별번호: 165)
(WO2008/76321 참조)
본 발명의 한 실시양태에서, 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 인간화 항체)은 하기 기재된 CDR을 포함한다:
CDR-H1: GFIIKATYMH (서열식별번호: 166);
CDR-H2: RIDPANGETKYDPKFQV (서열식별번호: 167);
CDR-H3: YAWYFDV (서열식별번호: 168);
CDR-L1: RASENIYSFLA (서열식별번호: 169);
CDR-L2: HAKTLAE (서열식별번호: 170);
CDR-L3: QHYYGSPLT (서열식별번호: 171);
(WO2012/04367 참조).
따라서, 본 발명은 PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디) (예를 들어, F023700910, F023700918, F023700920 또는 F023700925)를 포함함)를 펨브롤리주맙과 연합하여 포함하는 조성물; 뿐만 아니라 유효량의 PD1/CTLA4 결합제를 펨브롤리주맙 (예를 들어, 3주마다 1회 200 mg으로 투약되는 펨브롤리주맙)과 연합하여 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 암을 치료 또는 예방하는 방법을 포함한다. 임의적으로, 또한 대상체는 또 다른 추가 치료제와 연합하여 투여받는다.
본 발명의 한 실시양태에서, PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함) (예를 들어, F023700910, F023700918, F023700920 또는 F023700925)는 하기 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 (또는 그의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3):
QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (서열식별번호: 172) 및 하기 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 (또는 그의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3):
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열식별번호: 173)
를 포함하는 펨브롤리주맙 항체와 연합된다.
본 발명의 한 실시양태에서, PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함) (예를 들어, F023700910, F023700918, F023700920 또는 F023700925)는 하기 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 (또는 그의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3):
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (서열식별번호: 174); 및 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 (또는 그의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3):
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열식별번호: 175)
를 포함하는 항체와 연합된다.
본 발명의 한 실시양태에서, PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함) (예를 들어, F023700910, F023700918, F023700920 또는 F023700925)는 하기 중 임의의 하나 이상과 연합된다: 13-시스-레티노산, 3-[5-(메틸술포닐피페라딘메틸)-인돌릴]-퀴놀론, 4-히드록시타목시펜, 5-데옥시우리딘, 5'-데옥시-5-플루오로우리딘, 5-플루오로우라실, 6-메르캅토퓨린, 7-히드록시스타우로스포린, A-443654, 아비라테론아세테이트, 아브락산, ABT-578, 아콜비펜, ADS-100380, 아플리베르셉트, ALT-110, 알트레타민, 아미포스틴, 아미노글루테티미드, 암루비신, 암사크린, 아나그렐리드, 아나스트로졸, 안지오스타틴, AP-23573, ARQ-197, 아르족시펜, AS-252424, AS-605240, 아스파라기나제, ATI3387, AT-9263, 아트라센탄, 악시티닙, AZD1152, 바실루스 칼메트-게랑(Bacillus Calmette - Guerin) (BCG) 백신, 바타불린, BC-210, 베소두톡스, 베바시주맙, BGJ398, 비칼루타미드, Bio111, BIO140, BKM120, 블레오마이신, BMS-214662, BMS-247550, BMS-275291, BMS-310705, 보르테지밉, 부세렐린, 부술판, 칼시트리올, 캄프토테신, 카네르티닙, 카페시타빈, 카르보플라틴, 카르무스틴, CC8490, CEA (재조합 백시니아-암배아 항원 백신), 세디라닙, CG-1521, CG-781, 클라미도신, 클로람부실, 클로로톡신, 실렌기티드, 시미티딘, 시스플라틴, 클라드리빈, 클로드로네이트, 코비메트닙, COL-3, CP-724714, 시클로포스파미드, 시프로테론, 시프로테론아세테이트, 시타라빈, 시토신아라비노시드, 다브라페닙, 다카르바진, 다시노스타트, 닥티노마이신, 달로투주맙, 다누세르팁, 다사타닙, 다우노루비신, 데카타닙, 데구엘린, 데닐류킨, 데옥시코포르마이신, 뎁시펩티드, 디아릴프로피오니트릴, 디에틸스틸베스트롤, 디프티톡스, DNE03, 도세탁셀, 도비티닙, 독소루비신, 드롤록시펜, 에도테카린, 이트륨-90 표지-에도트레오티드, 에도트레오티드, EKB-569, EMD121974, 엔코라페닙, 엔도스타틴, 엔잘루타미드, 엔자스타우린, 에피루비신, 에피틸론 B, ERA-923, 에르비툭스, 에를로티닙, 에스트라디올, 에스트라무스틴, 에토포시드, 에베롤리무스, 엑세메스탄, 피클라투주맙, 피나스테리드, 플라보피리돌, 플록스우리딘, 플루다라빈, 플루드로코르티손, 플루옥시메스테론, 플루타미드, FOLFOX 요법, 풀베스트란트, 갈레테론, 가네테스핍, 게피티닙, 겜시타빈, 기마테칸, 글루코피라노실 지질 A, 고세렐린, 고세렐린 아세테이트, 고시폴, GSK461364, GSK690693, HMR-3339, 히드록시프로게스테론카프로에이트, 히드록시우레아, IC87114, 이다루비신, 이독시펜, 이포스파미드, IM862, 이마티닙, IMC-1C11, 이미퀴모드, INC280, INCB24360, INO1001, 인터페론, 인터루킨-2, 인터루킨-12, 이필리무맙, 이리노테칸, JNJ-16241199, 케토코나졸, KRX-0402, 라파티닙, 라소폭시펜, LEE011, 레트로졸, 류코보린, 류프롤리드, 류프롤리드 아세테이트, 레바미솔, 리포솜-포획 파클리탁셀, 로무스틴, 로나파르닙, 루칸톤, LY292223, LY292696, LY293646, LY293684, LY294002, LY317615, LY3009120, 마리마스탯, 메클로르에타민, 메드록시프로게스테론아세테이트, 메게스트롤아세테이트, MEK162, 멜팔란, 메르캅토퓨린, 메스나, 메토트렉세이트, 미트라마이신, 미토마이신, 미토탄, 미톡산트론, 열-사망 미코박테리움 오부엔세(Mycobacterium obuense)의 현탁액, 토자세르팁, MLN8054, 나티토클락스, 네오바스탯, 네라티닙, 뉴라디압, 닐로티닙, 닐루티미드, 놀라트렉세드, NVP-BEZ235, 오블리메르센, 옥트레오티드, 오파투무맙, 오레고보맙, 오르나투주맙, 오르테로넬, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 팔보시클립, 파미드로네이트, 파니투무맙, 파조파닙, PD0325901, PD184352, PEG-인터페론, 페메트렉세드, 펜토스타틴, 페리포신, 페닐알라닌무스타드, PI-103, 픽틸리십, PIK-75, 피펜독시펜, PKI-166, 플리카마이신, 폴리-ICLC, 포르피머, 프레드니손, 프로카르바진, 프로게스틴, PSK 단백질-결합 다당류 (바시디오미세테 코리올루스 베르시콜로르(Basidiomycete coriolus versicolor)로부터 유래됨), PLX8394, PX-866, R-763, 랄록시펜, 랄티트렉세드, 라족신, 리다포롤리무스, 리툭시맙, 로미뎁신, RTA744, 루비테칸, 스크립타이드, Sdx102, 셀리시클립, 셀루메티닙, 세막사닙, SF1126, 시롤리무스, SN36093, 소라페닙, 스피로놀락톤, 스쿠알라민, SR13668, 스트렙토조신, SU6668, 수베로일아날리드 히드록삼산, 수니티닙, 합성 에스트로겐, 탈람파넬, 탈리모겐 라헤르파렙벡, 타목시펜, 테모졸로미드, 템시롤리무스, 테니포시드, 테스밀리펜, 테스토스테론, 테트란드린, TGX-221, 탈리도미드, 6-티오구아닌, 티오테파, 티실리무맙, 티피파르닙, 티보자닙, TKI-258, TLK286, TNFα (종양 괴사 인자 알파), 토포테칸, 토레미펜 시트레이트, 트라벡테딘, 트라메티닙, 트라스투주맙, 트레티노인, 트리코스타틴 A, 트리시리빈포스페이트 1수화물, 트립토렐린 파모에이트, TSE-424, 우라실 무스타드, 발프로산, 발루비신, 반데타닙, 바탈라닙, VEGF 트랩, 베무라페닙, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 비노렐빈, 비탁신, 비테스판, 보리노스탯, VX-745, 워트만닌, Xr311, 바실루스 투베르쿨로시스(Bacillus tuberculosis)의 Z-100 온수 추출물, 자놀리무맙, ZK186619, ZK-304709, ZM336372 또는 ZSTK474.
본 발명의 한 실시양태에서, PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함) (예를 들어, F023700910, F023700918, F023700920 또는 F023700925)는 하기를 포함하지만 이에 제한되지 않는 하나 이상의 항구토제와 연합된다: 카소피탄트 (글락소스미스클라인(GlaxoSmithKline)), 네투피탄트 (MGI-헬신(MGI-Helsinn)) 및 다른 NK-1 수용체 길항제, 팔로노세트론 (MGI 파마(MGI Pharma)가 알록시(Aloxi)로서 판매함), 아프레피탄트 (머크 앤 캄파니(Merck and Co.) (뉴저지주 로웨이)가 에멘드(Emend)로서 판매함), 디펜히드라민 (화이자(Pfizer) (뉴욕주 뉴욕)가 베나드릴(Benadryl)®로서 판매함), 히드록시진 (화이자 (뉴욕주 뉴욕)가 아타락스(Atarax)®로서 판매함), 메토클로프라미드 (AH 로빈스 캄파니(AH Robins Co.) (버지니아주 리치몬드)가 레글란(Reglan)®으로서 판매함), 로라제팜 (와이어스(Wyeth) (뉴저지주 매디슨)가 아티반(Ativan)®으로서 판매함), 알프라졸람 (화이자 (뉴욕주 뉴욕)가 재낵스(Xanax)®로서 판매함), 할로페리돌 (오르토-맥네일(Ortho-McNeil) (뉴저지주 래리턴)이 할돌(Haldol)®로서 판매함), 드로페리돌 (이납신(Inapsine)®), 드로나비놀 (솔베이 파마슈티칼스, 인크.(Solvay Pharmaceuticals, Inc.) (조지아주 매리에타)가 마리놀(Marinol)®로서 판매함), 덱사메타손 (머크 앤 캄파니(뉴저지주 로웨이)가 데카드론(Decadron)®으로서 판매함), 메틸프레드니솔론 (화이자 (뉴욕주 뉴욕)가 메드롤(Medrol)®로서 판매함), 프로클로르페라진 (글락소스미스클라인 (노스캐롤라이나주 리서치 트라이앵글 파크)이 콤파진(Compazine)®으로서 판매함), 그라니세트론 (호프만-라 로슈 인크.(Hoffmann-La Roche Inc.) (미국 뉴저지주 너틀리)가 키트릴(Kytril)®로서 판매함), 온단세트론 (글락소스미스클라인 (노스캐롤라이나주 리서치 트라이앵글 파크)이 조프란(Zofran)®으로서 판매함), 돌라세트론 (사노피-아벤티스(Sanofi-Aventis) (뉴욕주 뉴욕)가 안제메트(Anzemet)®로서 판매함), 트로피세트론 (노바티스(Novartis) (뉴저지주 이스트 하노버)가 나보반(Navoban)®으로서 판매함).
암 치료의 다른 부작용은 적혈구 및 백혈구 결핍증을 포함한다. 따라서, 본 발명의 한 실시양태에서, PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함) (예를 들어, F023700910, F023700918, F023700920 또는 F023700925)는 이러한 결핍증을 치료 또는 예방하는 작용제, 예를 들어, 필그라스팀, PEG-필그라스팀, 에리트로포이에틴, 에포에틴 알파 또는 다르베포에틴 알파와 연합된다.
본 발명의 한 실시양태에서, PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함) (예를 들어, F023700910, F023700918, F023700920 또는 F023700925)는 백신과 연합된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 백신은 항암 백신, 펩티드 백신, RNA 백신 또는 DNA 백신이다. 예를 들어, 본 발명의 한 실시양태에서, 백신은 종양 세포 (예를 들어, 방사선이 조사된 종양 세포) 또는 수지상 세포 (예를 들어, 종양 펩티드가 펄싱된 수지상 세포)이다.
본 발명의 한 실시양태에서, PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함) (예를 들어, F023700910, F023700918, F023700920 또는 F023700925)는 치료 절차와 연합하여 투여된다. 치료 절차는 치료된 대상체에서 하나 이상의 증상 (예를 들어, 암 및/또는 감염성 질환의 증상)을 이러한 증상의 퇴행 또는 제거를 유도함으로써든 또는 이러한 증상(들), 예를 들어, 암 증상 예컨대 종양 성장 또는 전이의 진행을 임의의 임상적으로 측정가능한 정도만큼 억제함으로써든 완화하도록 의도되는 대상체 치료에서 의사 또는 임상의가 수행하는 하나 이상의 단계이다.
본 발명의 한 실시양태에서, 치료 절차는 항암 방사선 요법이다. 예를 들어, 본 발명의 한 실시양태에서, 방사선 요법은 고에너지 X선의 빔을 종양 위치에 전달하는 방법인 외부 빔 요법 (EBT)이다. 이러한 빔은 환자의 외부에서 (예를 들어, 선형 가속기에 의해) 생성되어, 종양 부위에 표적화된다. 이러한 X선은 암 세포를 파괴할 수 있고, 조심스러운 치료 계획은 주위의 정상 조직이 해를 입지 않게 한다. 방사성 공급원이 환자 신체의 내부에 놓이지 않는다. 본 발명의 한 실시양태에서, 방사선 요법은 X선 대신 양성자로 질병 조직을 포격하는 공초점 요법의 유형인 양성자 빔 요법이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 방사선 요법은 첨단 기술을 사용하여 방사선 요법을 개체의 신체 구조에 맞추는 절차인 공초점 외부 빔 조사 요법이다.
본 발명의 한 실시양태에서, 방사선 요법은 방사성 물질을 일시적으로 신체 내에 위치시키는 근접요법이고, 일반적으로 추가 선량 - 또는 부스트 -의 방사선을 구역에 제공하도록 사용된다.
본 발명의 한 실시양태에서, PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함)와 연합하여 투여되는 외과 절차는 외과적 종양절제술이다.
치료 용도
본 발명은, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함) (예를 들어, F023700910, F023700918, F023700920 또는 F023700925)를 임의적으로는 추가 치료제 또는 치료 절차와 연합하여 사용함으로써 예방 또는 치료될 수 있는 적어도 하나의 질환 또는 장애를 예방 및/또는 치료하는 방법이고, 이를 필요로 하는 대상체에게 제약상 활성인 양의 PD1/CTLA4 결합제 또는 이를 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법을 포함한다.
"치료하다" 또는 "치료하는"은, 예를 들어, 작용제가 이에 대한 치료적 활성이 있는 암 또는 감염성 질환에 걸렸거나 또는 암 또는 감염성 질환에 걸렸을 것으로 추정되는 대상체의 치료에서, 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함) (예를 들어, F023700910, F023700918, F023700920 또는 F023700925)를 PD1/CTLA4 결합제가 효과적인 질환의 하나 이상의 증상이 있는 대상체 (예를 들어, 포유동물 예컨대 인간)에게 투여하는 것을 의미한다. 전형적으로, PD1/CTLA4 결합제는 치료된 대상체 또는 집단에서 하나 이상의 증상 (예를 들어, 암 또는 감염성 질환의 증상)을 이러한 증상의 퇴행 또는 제거를 유도함으로써든 또는 이러한 증상(들), 예를 들어, 암 증상 예컨대 종양 성장 또는 전이의 진행을 임의의 임상적으로 측정가능한 정도만큼 억제함으로써든 완화시킬 "유효량" 또는 "유효 용량"으로 투여된다. PD1/CTLA4 결합제의 유효량은 환자의 질환 병기, 연령 및 체중, 및 약물이 대상체에서 원하는 반응을 유발하는 능력과 같은 요인들에 따라 변할 수 있다.
치료될 대상체는 임의의 온혈 동물일 수 있지만, 특히 포유동물, 더욱 특히 인간이다. 통상의 기술자에게 명백할 바와 같이, 치료될 대상체는 특히 본원에서 언급된 질환 및 장애를 앓고 있거나 또는 그의 위험이 있는 사람일 것이다.
본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함) (예를 들어, F023700910, F023700918, F023700920 또는 F023700925)의 제약 또는 멸균 조성물을 제조하기 위해, PD1/CTLA4 결합제를 제약상 허용되는 담체 또는 부형제와 혼합한다. 예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences] 및 [U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, PA (1984)]을 참조한다. 이러한 조성물은 본 발명의 일부이다.
본 발명의 범주는 PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함) (예를 들어, F023700910, F023700918, F023700920 또는 F023700925)를 포함하는 건조, 예를 들어, 동결-건조 조성물, 또는 제약상 허용되는 담체를 포함하지만 실질적으로 물이 결여된 그의 제약 조성물을 포함한다.
예를 들어, 동결건조 분말, 슬러리, 수성 용액 또는 현탁액의 형태로, 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제와 혼합함으로써 치료제 및 진단제의 제형을 제조할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Hardman, et al. (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, NY]; [Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, NY]; [Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY]; [Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY]; [Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY]; [Weiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, NY]을 참조).
일반적으로, 본원에서 언급된 질환 및 장애의 예방 및/또는 치료를 위해, 그리고 치료될 특정 질환 또는 장애, 사용될 PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함) (예를 들어, F023700910, F023700918, F023700920 또는 F023700925)의 효능 및/또는 반감기, 특정 투여 경로, 및 사용된 특정 제약 제형 또는 조성물에 따라, 일반적으로 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제는 1 그램 내지 0.01 마이크로그램/체중 kg/일, 바람직하게는 0.1 그램 내지 0.1 마이크로그램/체중 kg/일, 예컨대 약 1, 10, 100 또는 1000 마이크로그램/체중 kg/일의 양으로 연속적으로 (예를 들어, 주입에 의해), 단일 일일 용량으로서, 또는 하루 동안 다중 분할 용량으로서 투여될 것이다. 일반적으로 임상의는 본원에 언급된 요인들에 따라 적합한 일일 용량을 결정할 수 있을 것이다. 특정 사례에서, 예를 들어 상기 언급된 요인들 및 임상의의 숙련된 판단을 기초로, 임상의가 이러한 양으로부터 벗어나도록 선택할 수 있다는 것이 또한 명백할 것이다. 일반적으로, 투여되는 양에 대한 일부 지침을 본질적으로 동일한 경로를 통해 투여되는 동일한 표적에 대한 유사한 통상적인 항체 또는 항체 단편에 대해 일반적으로 투여되는 양으로부터 수득할 수 있지만, 친화력/결합력, 효능, 생체분포, 반감기 및 통상의 기술자에게 널리 공지된 유사 요인에서의 차이를 고려한다.
PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함) (예를 들어, F023700910, F023700918, F023700920 또는 F023700925)를 대상체에게 투여하는 양식은 다양할 수 있다. 투여 경로는 경구, 직장, 경점막, 장내, 비경구; 근육내, 피하, 피내, 수질내, 척추강내, 직접 뇌실내, 정맥내, 복강내, 비내, 안내, 흡입, 취입, 국소, 피부, 경피 또는 동맥내를 포함한다.
적절한 용량의 결정은, 예를 들어, 치료에 영향을 미치는 것으로 관련 분야에 공지되어 있거나 관련 분야에서 추정되는 파라미터 또는 요인을 사용하여, 임상의에 의해 이루어진다. 일반적으로, 용량을 결정하는 것에서, 용량은 최적 용량보다 다소 적은 양으로 시작되고, 그 후 임의의 음성적인 부작용과 비교하여 원하는 또는 최적인 효과가 달성될 때까지 소량씩 증가된다. 중요한 진단 척도는 예를 들어 염증의 증상 또는 생산된 염증성 시토카인의 수준의 것을 포함한다. 일반적으로, 사용될 생물제제가 치료에 표적화된 동물과 동일한 종으로부터 유래됨으로써, 시약에 대한 임의의 면역 반응을 최소화하는 것이 바람직하다. 인간 대상체의 경우, 예를 들어, 예를 들어, 키메라 항체, 인간화 항체 및 완전 인간 항체가 바람직할 수 있다. 적절한 용량을 선택하는 것에서의 지침이 이용가능하다 (예를 들어, 문헌 [Wawrzynczak (1996) Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK]; [Kresina (ed.) (1991) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, NY]; [Bach (ed.) (1993) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, NY]; [Baert et al. (2003) New Engl. J. Med. 348:601-608]; [Milgrom et al. (1999) New Engl. J. Med. 341:1966-1973]; [Slamon et al. (2001) New Engl. J. Med. 344:783-792]; [Beniaminovitz et al. (2000) New Engl. J. Med. 342:613-619]; [Ghosh et al. (2003) New Engl. J. Med. 348:24-32]; [Lipsky et al. (2000) New Engl. J. Med. 343:1594-1602]을 참조).
질환 증상이 완화되었는지 여부를 이러한 증상의 중증도 또는 진행 상태를 평가하기 위해 의사 또는 다른 통상의 의료 제공자가 전형적으로 사용하는 임의의 임상 측정에 의해 평가할 수 있다. 본 발명의 한 실시양태 (예를 들어, 치료 방법 또는 제조 물품)가 모든 대상체에서 표적 질환 증상(들)을 완화하는데 효과적이지 않을 수 있지만, 이는 관련 분야에 공지된 임의의 통계적 테스트 예컨대 스튜던트(Student) t 테스트, chi2-테스트, 만 & 휘트니(Mann & Whitney)에 따른 U-테스트, 크루스칼-왈리스(Kruskal-Wallis) 테스트 (H-테스트), 존키어-테릅스트라(Jonckheere-Terpstra)-테스트 및 윌콕슨(Wilcoxon)-테스트에 의해 결정된 바와 같이 통계적으로 유의한 수의 대상체에서 표적 질환 증상(들)을 완화하여야 한다.
치료될 대상체는 임의의 포유동물, 예컨대 개, 고양이, 말, 토끼, 마우스, 소, 원숭이 또는 고릴라, 바람직하게는 인간일 수 있다. 통상의 기술자에게 명백할 바와 같이, 치료될 대상체는 특히 본원에 언급된 질환 및 장애를 앓고 있거나 또는 그의 위험이 있는 사람일 것이다.
일반적으로, 원하는 치료 효과가 달성될 때까지 및/또는 원하는 치료 효과가 유지되어야 하는 한 치료 체계가 계속될 것이다. 마찬가지로, 이는 임상의에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함) (예를 들어, F023700910, F023700918, F023700920 또는 F023700925)가 PD1 및 CTLA4에 결합할 수 있으므로, 이는 암, 전이성 암, 고형 종양, 혈액암, 백혈병, 림프종, 골육종, 횡문근육종, 신경모세포종, 신장암, 백혈병, 신장 이행 세포암, 방광암, 윌름스 암, 난소암, 췌장암, 유방암, 전립선암, 골암, 폐암, 비소세포 폐암, 위암, 결장직장암, 자궁경부암, 활막 육종, 두경부암, 편평 세포 암종, 다발성 골수종, 신세포암, 망막모세포종, 간모세포종, 간세포성 암종, 흑색종, 신장의 횡문근양 종양, 유잉 육종, 연골육종, 뇌암, 교모세포종, 수막종, 뇌하수체 선종, 전정 슈반세포종, 원시 신경외배엽 종양, 수모세포종, 성상세포종, 역형성 성상세포종, 핍지교종, 상의세포종, 맥락총 유두종, 진성 다혈구혈증, 혈소판혈증, 특발성 골수섬유증, 연부 조직 육종, 갑상선암, 자궁내막암, 카르시노이드 암 또는 간암, 유방암 및 위암의 치료 또는 예방에 특히 사용될 수 있다.
본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함) (예를 들어, F023700910, F023700918, F023700920 또는 F023700925)는 감염성 질환, 예를 들어, 바이러스 감염, 박테리아 감염, 진균 감염 또는 기생충 감염의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 바이러스 감염은 인간 면역결핍증 바이러스 (HIV), 에볼라 바이러스, 간염 바이러스 (A형, B형, 또는 C형), 헤르페스 바이러스 (예를 들어, VZV, HSV-I, HAV-6, HSV-II, 및 CMV, 엡스타인 바 바이러스), 아데노바이러스, 인플루엔자 바이러스, 플라비바이러스, 에코바이러스, 리노바이러스, 콕사키 바이러스, 코로나바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 볼거리 바이러스, 로타바이러스, 홍역 바이러스, 풍진 바이러스, 파보바이러스, 백시니아 바이러스, HTLV 바이러스, 뎅기 바이러스, 유두종 바이러스, 연속종 바이러스, 폴리오바이러스, 광견병 바이러스, JC 바이러스 또는 아르보바이러스성 뇌염 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스로의 감염이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 박테리아 감염은 클라미디아 (Chlamydia), 리케치아 박테리아, 미코박테리아, 스타필로코쿠스, 스트렙토코쿠스, 뉴모노코쿠스, 메닝고코쿠스 및 고노코쿠스, 클레브시엘라, 프로테우스, 세라티아, 슈도모나스, 레지오넬라(Legionella), 코리네박테리움 디프테리아에(Corynebacterium diphtheriae), 살모넬라(Salmonella), 바실루스, 비브리오 콜레라에(Vibrio cholerae), 클로스트리디움 테탄(Clostridium tetan), 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum), 바실루스 안트리시스(Bacillus anthricis), 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis), 미코박테리움 레프라에(Mycobacterium leprae), 미코박테리움 레프로마토시스(Mycobacterium lepromatosis), 및 보리엘라(Borriella)로 이루어진 군으로부터 선택된 박테리아로의 감염이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 진균 감염은 칸디다(Candida) (알비칸스(albicans), 크루세이(krusei), 글라브라타(glabrata), 트로피칼리스(tropicalis) 등), 크립토코쿠스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 아스페르길루스 (푸미가투스(fumigatus), 니거(niger) 등), 무코랄레스(Mucorales) 속 (무코르(mucor), 압시디아(absidia), 리조푸스(rhizopus)), 스포로트릭스 스켄키이(Sporothrix schenkii), 블라스토마이세스 데르마티티디스(Blastomyces dermatitidis), 파라코시디오이데스 브라실리엔시스(Paracoccidioides brasiliensis), 코시디오이데스 임미티스(Coccidioides immitis) 및 히스토플라스마 캅술라툼(Histoplasma capsulatum)으로 이루어진 군으로부터 선택된 진균으로의 감염이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 기생충 감염은 엔타모에바 히스톨리티카(Entamoeba histolytica), 발란티디움 콜리(Balantidium coli), 나에글레리아 포울레리(Naegleria fowleri), 아칸타모에바(Acanthamoeba), 기아르디아 람비아(Giardia lambia), 크립토스포리디움(Cryptosporidium), 뉴모시스티스 카리니이(Pneumocystis carinii), 플라스모디움 비박스(Plasmodium vivax), 바베시아 미크로티(Babesia microti), 트리파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei), 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi), 리슈마니아 도노바니(Leishmania donovani), 톡소플라스마 곤디이(Toxoplasma gondii), 닙포스트롱길루스 브라실리엔시스(Nippostrongylus brasiliensis)로 이루어진 군으로부터 선택된 기생충으로의 감염이다.
본 발명은 상기 언급된 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체 (즉, 상기 언급된 질환 중 하나를 앓고 있음)에게 치료적 유효량의 본 발명의 PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함) (예를 들어, F023700910, F023700918, F023700920 또는 F023700925)를 투여하는 것을 일반적으로 포함하는, 상기 언급된 질환 또는 장애의 치료 방법에 또한 관련된다. 본 발명은 상기 언급된 질환 또는 장애 중 하나의 예방 또는 치료에서 사용하기 위한 PD1/CTLA4 결합제 (예를 들어, PD1 및 CTLA4에 결합하는 ISVD (예를 들어, 나노바디)를 포함함)에 또한 관련된다.
본 발명의 다른 측면, 실시양태, 장점 및 용도가 본원의 추가 설명으로부터 명백해질 것이다.
실시예
이러한 실시예들은 본 발명을 예시하도록 의도되고, 그의 제한이 아니다. 실시예에 기재된 조성물 및 방법은 본 발명의 일부를 형성한다.
실시예 1 : CTLA -4- Fc에 대한 F023700906 나노바디 결합.
F023700925의 빌딩 블록인 1가 F023700906 나노바디 (CTLA4 결합제 11F01 (L11V,A14P,Q45R,A74S,K83R,V89L,M96P,Q108L)-FLAG3-HIS6)가 인간 및 시노몰구스 원숭이 둘 다로부터의 CTLA-4-Fc 융합 분자에 대한 결합을 실연하였다. 온-속도, 오프-속도 및 친화력을 인간 및 시노몰구스 원숭이 CTLA4-hFc를 사용하여 결정하였다 (하기 표).
표 E. 인간 및 시노몰구스 원숭이 CTLA4에 대한 F023700906의 결합
Figure pct00032
실시예 2 : 인간 CTLA -4에 대한 F023700918 및 F023700925 결합.
F023700918 및 F023700925가 세포 표면 상에서 발현된 인간 CTLA-4에 대한 결합을 실연하였다. hCTLA4-과다발현 CHO-K1 세포에 대한 F023700918 (흑색 사각형), F023700925 (흑색 삼각형), F023700912 (흑색 원) 및 관련되지 않은 Nb (다이아몬드)의 결합을 유동 세포측정법으로 연구하였다. ALB11-결합 mAB ABH0074를 통해 나노바디를 검출하였다. 도 8에 이러한 실험에서 생성된 유동 세포측정법 데이터가 있다.
실시예 3 : F023700925에 의한 인간 PD-1 세포 표면 결합.
F023700925가 세포 표면 상에 발현된 인간 PD-1에 대한 결합을 실연하였다. hPD1-과다발현 CHO-K1 세포에 대한 F023700925 (흑색 사각형) 및 F023700912 (흑색 원) 및 관련되지 않은 Nb IRR00051 (흑색 삼각형)의 뱃치의 결합을 유동 세포측정법으로 연구하였다. ALB11-결합 mAB ABH0074를 통해 Nb를 검출하였다. 도 9에 이러한 실험에서 생성된 유동 세포측정법 데이터가 제시된다.
실시예 4 : 인간 CTLA -4/CD80 및 CD86 차단 검정법.
F023700925의 빌딩 블록인 F023700906, 뿐만 아니라 F023701051, F023701054 및 F023701061이 인간 CTLA-4가 그의 리간드인 CD80 및 CD86에 결합하는 것을 차단하였다. hCTLA4-과다발현 CHO-K1 세포 상에서의 고정 농도 (EC30)의 (a) hCD80-hFc 또는 (b) hCD86-hFc로의 Nb F023700906 (흑색 원)의 N73X 변이체 (흑색 사각형, 흑색 삼각형, 흑색 역삼각형)의 발견 뱃치의 유동 세포측정법 분석. 인간 IgG Fc 융합 단백질을 통해 리간드를 검출하였다. 도 10 (a-b)에 이러한 실험에서 생성된 유동 세포측정법 데이터가 있다.
실시예 5 : 결합 특이성 검정법.
특이성 평가 F023700925는 CTLA-4 및 PD-1에 대한 선택적 결합이 예상되었다. BTLA, CD8, CTLA4, LAG3, 및 CD28에 대한 특이성 평가는 유동 세포측정법을 사용하여 과다발현 세포 상에서 수행한 반면, ICOS 결합은 재조합 단백질 (hICOS-hFc)로서 ELISA에서 평가하였다. BTLA, CD8, PD1, CTLA4, LAG3, CD28의 발현을 직접적으로 표지된 표적-특이적 Ab를 통해 평가하였다. 항-hICOS 및 항-hCTLA4 / 항-hPD1 양성 대조군이 모두 양성이었다. hICOS에 대한 결합이 ELISA 검정법에서 관찰되지 않았다. 도 11 (a-h)은 각각 음성 대조군 L 세포, 음성 대조군 CHO-K1 세포, huCD28+ L 세포, huCD8알파+ L 세포, huLag-3+ CHO-K1 세포, huBTLA+ CHO-K1 세포, huCTLA-4+ CHO-K 세포, 및 huPD-1+ CHO-K1 세포에 대한 결합을 나타냈다. F023700925에 대해 BTLA, CD8, LAG3, CD28에 대한 결합이 관찰될 수 없었던 반면, F023700925의 강력한 결합이 PD-1+ 또는 CTLA-4+ CHO-K1 세포 상에서 관찰되었다. 도 11 (a-h)에 이러한 실험에서 생성된 유동 세포측정법 데이터가 있다.
실시예 6 : 혈청 알부민 결합 검정법.
F023700925가 인간, 리서스 원숭이 및 마우스 알부민에 결합하여, 알부민에 결합하지 않는 나노바디에 비교했을 때 연장된 반감기가 예상되었다. 표면 플라즈몬 공명 (SPR)을 사용하여 분석했을 때, 인간, 리서스 원숭이 및 마우스 혈청 알부민에 결합하는 것이 관찰되었다.
표 F. 인간, 리서스 원숭이 및 마우스 혈청 알부민에 대한 F023700925의 결합 분석
Figure pct00033
인간 혈청 알부민: 카탈로그 A3782, 시그마(Sigma), 로트. SLBD7204V
리서스 원숭이 혈청 알부민: 바이오월드(BioWorld), 카탈로그 22070099-1, 로트 L15091001DA,
마우스 혈장 알부민: 이노베이티브 리서치(Innovative Research), 로트 1012,
기기 및 센서 칩: 비아코어 T100 (GE 헬스케어(GE Healthcare)); CM5 (ID T160713-2, GE 헬스케어, 로트 10242599
F023700912는 11F01 (E1D, L11V, A14P, Q45R, A74S, K83R, V89L, M96P, Q108L)-35GS-11F01 (L11V, A14P, Q45R, A74S, K83R, V89L, M96P, Q108L)-35GS- ALB11002-A이다.
실시예 7 : 변이체의 결합 동역학 분석.
F023700925의 빌딩 블록인 F023700906의 위치 N73에서의 여러 변이체를 이러한 부위에서의 탈아미드화를 피하기 위해 생성시켰다. 모든 가능한 치환을 현행 SO F023700906 (표 G)과 함께 오프-속도에서 평가하였다. 변이체 F023701051 [11F01 (L11V,A14P,Q45R,N73Q,A74S,K83R,V89L,M96P,Q108L)-FLAG3-HIS6], F023701054 [11F01 (L11V,A14P,Q45R,N73T,A74S,K83R,V89L,M96P,Q108L)-FLAG3-HIS6], 및 F023701061 [11F01 (L11V,A14P,Q45R,N73Y, A74S,K83R,V89L,M96P,Q108L)-FLAG3-HIS6]을 (A) CD80 또는 (B) CD86이 CTLA-4 발현 CHO-K1 세포에 결합하는 것을 차단하는 이들의 능력에 대해 F023700906에 비교하였다. 모든 이러한 변이체가 CD80 및 CD84가 CTLA-4에 결합하는 것을 차단할 수 있었다. 도 12 (a-b)에 이러한 실험에서 생성된 유동 세포측정법 데이터가 있다.
실시예 8 : F023700912가 인간화 마우스에서 확립된 고형 종양을 근절한다.
인간화 마우스 (잭슨 래보러토리즈(Jackson Laboratories))에 Panc 08.13 종양 세포를 이식하였다. 확립된 종양 (~100 ㎣)이 있는 마우스 (n=9-10마리/군)를 하기와 같이 처리하였다: 1-이소형 대조군 (hIgG1-2 mg/kg 및 hIgG4-3 mg/kg); 2-이필리무맙-N297A (3 mg/kg); 3-이필리무맙 (3 mg/kg); 4-펨브롤리주맙 (2 mg/kg); 5-이필리무맙 (3 mg/kg) + 펨브롤리주맙 (2 mg/kg); 6-F023700912 (5 mg/kg; CTLA4-Nab 5로 지시됨), 7-F023700912 (15 mg/kg; CTLA4-Nab-15로 지시됨), 및 8-F023700912 (15 mg/kg) + 펨브롤리주맙 (2 mg/kg). 모든 항체를 6회 용량에 대해 7일마다 피하 주사하였다. F023700912를 11회의 용량에 대해 3.5일마다 피하 주사하였다. 종양 부피 및 체중을 4-5일마다 측정하였다. 평균 종양 부피 ± SEM (A), 제37일의 개별적인 종양 부피 (B), 및 실험 과정에 걸친 개별적인 마우스에서의 종양 부피 (C)가 제시된다. 각각의 처리 군에서의 평균 체중 (평균 ± SEM) (D) 및 개별적인 체중 (E) 변화가 또한 제시된다. 사망한 것으로 발견되었거나 또는 체중 감소로 인해 인도적으로 안락사된 마우스의 수가 '#'로서 지시된다. '흑색 화살표'는 항체, '백색 화살표'는 나노바디 투약 일정을 가리킨다. 도 13 (a-j)에 이러한 실험에서 생성된 종양 부피 데이터가 있다. 이러한 데이터들은 F023700912가 종양 성장을 억제하는 것에서 고도로 효과적이었음을 실연하였다.
실시예 9 : 건강한 대상체 및 암 환자로부터의 선재하는 항체에 대한 F023700912 및 F023700925의 결합
3가 기준 나노바디인 013700112 (선재하는 항체의 결합을 감소시키기 위해 변형되지 않음)는 (도 14a) 건강한 대상체 또는 (도 14b) 암 환자로부터 유래된 여러 혈청 샘플에 대한 결합을 실연하였다. 유사한 크기의 서열 최적화 3가 나노바디인 F023700912는 동일한 혈청 샘플에 대한 더 낮은 빈도의 결합을 실연하였다. F023700925는 F023700912와 동일한 빌딩 블록을 포함하였다. 더 큰 크기에도 불구하고, 5가 F023700925 나노바디는 선재하는 Ab에 대해 기준 나노바디 013700112보다 더 많은 결합을 나타내지 않았다. 인간 혈청 알부민 (HSA) 상에 포착된 나노바디에 대한 선재하는 항체의 결합을 프로테온(ProteOn) XPR36 (바이오-라드 래보러토리즈, 인크.(Bio-Rad Laboratories, Inc.))을 사용하여 평가하였다. PBS/트윈(Tween) (포스페이트 완충 염수, pH 7.4, 0.005% 트윈20)을 러닝 완충제로서 사용하였고, 25℃에서 실험을 수행하였다. 프로테온 GLC 센서 칩의 리간드 레인을 EDC/NHS (유속 30μl/분)로 활성화시키고, HSA를 프로테온 아세테이트 완충제 pH 4.5 내의 10μg/ml (유속 100μl/분)로 주입하여, 고정화 수준이 약 3600 RU이게 하였다. 고정 후, 표면을 에탄올아민 HCl (유속 30μl/분)로 탈활성화시켰다. 나노바디를 HSA 표면 상에 45μl/분으로 2분 동안 주입하여, 나노바디 포착 수준이 3가 F023700912에 대해서는 약 600 RU, 5가 F023700925에 대해서는 약 1000 RU이게 하였다. 선재하는 항체를 함유하는 샘플을 PBS-트윈20 (0.005%)에서 1:10 희석한 후, 45μl/분으로 2분 동안 주입하였고, 후속 400초의 해리 단계가 이어졌다. 각각의 사이클 후에 (즉, 새로운 나노바디 포착 및 혈액 샘플 주입 단계 전에), 45μl/분으로 2분 동안 HCl (100 mM)을 주입하여 HSA 표면을 재생시켰다. 센서그램 프로세싱 및 데이터 분석을 프로테온 매니저 3.1.0 (바이오-라드 래보러토리즈, 인크.)으로 수행하였다. 1) 나노바디-HSA 해리 및 2) HSA만 함유하는 기준 리간드 레인에 대한 비-특이적 결합을 차감하는 것에 의한 이중 참조 후에 선재하는 항체 결합을 나타내는 센서그램을 수득하였다. 보고 지점을 125초 (회합 종료 5초 후)로 설정함으로써 선재하는 항체의 결합 수준을 결정하였다. 참조로서, 선재하는 항체를 함유하는 샘플을 이러한 선재하는 항체의 결합을 감소시키기 위해 변형되지 않은 3가 나노바디(T013700112)에 결합하는 것에 대해 또한 테스트하였다.
실시예 10 : 수소 중수소 교환 질량 분광법에 의한 항- hCTLA4 나노바디의 에 피토프 맵핑
항-hCTLA4 나노바디 F023700912 사이의 접촉 면적을 수소 중수소 교환 질량 분광법 (HDX-MS) 분석을 사용하여 결정하였다. HDX-MS는 단백질의 아미드 백본 내로의 중수소 혼입을 측정하였고, 이러한 혼입의 변화는 수소의 용매 노출에 영향을 받는다. 항원-단독 샘플 및 나노바디-결합 샘플에서의 중수소 교환 수준을 비교하여, 나노바디와 접촉할 수 있는 항원 영역을 확인하였다.
나노바디 F023700912에 의해 중수소화로부터 가장 강하게 보호된 인간 CTLA4 잔기는 VRVTVL (서열식별번호: 195의 잔기 33 - 38), ADSQVTEVC (서열식별번호: 195의 잔기 41-49) 및 CKVELMYPPPYYLG (서열식별번호: 195의 잔기 93-106)였다.
표 G. 아미노산 서열 (서열식별번호: 195)
Figure pct00034
SEQUENCE LISTING <110> Merck, Sharp & Dohme Corp. <120> PD1/CTLA4 Binders <130> 24236 <150> 62/256,985 <151> 2015-11-18 <160> 201 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized lama <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Ala Ser Ile His 20 25 30 Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Val Ile Thr Trp Ser Gly Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Gly Asp Lys His Gln Ser Ser Trp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized lama <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Ala Ser Ile His 20 25 30 Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Val Ile Thr Trp Ser Gly Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Gly Asp Lys His Gln Ser Ser Trp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Lama <400> 3 Ile His Ala Met Gly 1 5 <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Lama <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> X is W or V <400> 4 Val Ile Thr Xaa Ser Gly Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Lama <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X is W or F <400> 5 Asp Lys His Gln Ser Ser Xaa Tyr Asp Tyr 1 5 10 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Lama <400> 6 Gly Ser Ile Ala Ser Ile His Ala Met Gly 1 5 10 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Lama <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> X is W or V <400> 7 Val Ile Thr Xaa Ser Gly Gly Ile Thr Tyr 1 5 10 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Lama <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X is W or F <400> 8 Asp Lys His Gln Ser Ser Xaa Tyr Asp Tyr 1 5 10 <210> 9 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized lama <400> 9 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Phe Tyr 20 25 30 Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Gln Glu Phe Val 35 40 45 Ala Asp Ile Arg Thr Ser Ala Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Glu Met Ser Gly Ile Ser Gly Trp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 10 <211> 5 <212> PRT <213> Lama <400> 10 Phe Tyr Gly Met Gly 1 5 <210> 11 <211> 17 <212> PRT <213> Lama <400> 11 Asp Ile 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ctactggggg caagggaccc tggtcacggt ctcctccgga 360 ggcggtgggt caggtggcgg aggcagcggt ggaggaggta gtggcggtgg cggtagtggg 420 ggtggaggca gcggaggcgg aggcagtggg ggcggtggat ccgaggtgca gttggtggag 480 tctgggggag gagtggtgca gccggggggc tctctgagac tctcctgtgc agcctctggt 540 ggcaccttca gtttctatgg catgggctgg ttccgccagg ctccagggaa ggagcgcgag 600 tttgtagcag atattagaac cagtgctggt aggacatact atgcagactc cgtgaagggc 660 cgattcacca tctccagaga caacagcaag aacacggtgt atctgcaaat gaacagcctg 720 cgccctgagg acacggccct gtattactgt gcagcagagc caagtggaat aagtggttgg 780 gactactggg gccaggggac cctggtcacg gtctcgagcg gaggcggtgg gtcaggtggc 840 ggaggcagcg gtggaggagg tagtggcggt ggcggtagtg ggggtggagg cagcggaggc 900 ggaggcagtg ggggcggtgg ctcagaggta caactagtgg agtctggagg tggcgttgtg 960 caaccgggta acagtctgcg ccttagctgc gcagcgtctg gctttacctt cagctccttt 1020 ggcatgagct gggttcgcca ggctccggga aaaggactgg aatgggtttc gtctattagc 1080 ggcagtggta gcgatacgct ctacgcggac tccgtgaagg gccgtttcac catctcccgc 1140 gataacgcca aaactacact gtatctgcaa atgaatagcc tgcgtcctga agatacggcc 1200 ctgtattact gtactattgg tggctcgtta agccgttctt cacagggtac cctggtcacc 1260 gtctcctcag cg 1272 <210> 146 <211> 424 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized lama <400> 146 Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Ala Ser Ile His 20 25 30 Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Val Ile Thr Trp Ser Gly Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Gly Asp Lys His Gln Ser Ser Trp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 130 135 140 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu 145 150 155 160 Ser Gly Gly Gly Val Val Gln 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ccggtggtat tacttactac 180 gctgatagcg ttaagggccg gtttacaatt tcccgtgata atagcaaaaa taccgtctat 240 ctgcaaatga acagtctgcg cccggaagat accgccctgt attactgtgc gggcgataaa 300 catcagtcct catggtatga ctactggggg caagggaccc tggtcacggt ctcctccgga 360 ggcggtgggt caggtggcgg aggcagcggt ggaggaggta gtggcggtgg cggtagtggg 420 ggtggaggca gcggaggcgg aggcagtggg ggcggtggat cagaggtgca gttggtggag 480 tctggtggcg gagttgtcca gcctggcggc agtctgcggt tatcttgcgc cgcttctggc 540 agcattgcca gtattcacgc tatgggttgg ttcaggcagg ctcctggtaa agaacgtgag 600 tttgtggctg tgattacttg gtccggtggt attacttact acgctgatag cgttaagggc 660 cggtttacaa tttcccgtga taatagcaaa aataccgtct atctgcaaat gaacagtctg 720 cgcccggaag ataccgccct gtattactgt gcgggcgata aacatcagtc ctcatggtat 780 gactactggg ggcaagggac cctggtcacg gtctcctcag gaggcggtgg gtcaggtggc 840 ggaggcagcg gtggaggagg tagtggcggt ggcggtagtg ggggtggagg cagcggaggc 900 ggaggcagtg ggggcggtgg atccgaggtg cagttggtgg agtctggggg aggagtggtg 960 cagccggggg gctctctgag actctcctgt gcagcctctg gtggcacctt 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Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val 65 70 75 Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile 80 85 90 Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly 95 100 105 Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser 110 115 120 125 Asp Phe Leu Leu Trp Ile Leu Ala Ala Val Ser Ser Gly Leu Phe Phe 130 135 140 Tyr Ser Phe Leu Leu Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met Leu Lys Lys 145 150 155 Arg Ser Pro Leu Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys Met Pro Pro Thr Glu 160 165 170 Pro Glu Cys Glu Lys Gln Phe Gln Pro Tyr Phe Ile Pro Ile Asn 175 180 185 <210> 198 <211> 288 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> mat_peptide <222> (21)..(288) <400> 198 Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln -20 -15 -10 -5 Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp -1 1 5 10 Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp 15 20 25 Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val 30 35 40 Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala 45 50 55 60 Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg 65 70 75 Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg 80 85 90 Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu 95 100 105 Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val 110 115 120 Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro 125 130 135 140 Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly 145 150 155 Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys 160 165 170 Ser Arg Ala Ala Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro 175 180 185 Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly 190 195 200 Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val Pro 205 210 215 220 Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly 225 230 235 Met Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg 240 245 250 Ser Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu 255 260 265 <210> 199 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lama Sp. <400> 199 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser 1 5 10 <210> 200 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lama Sp. <400> 200 Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 201 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lama Sp. <400> 201 Gly Gly Ser Leu Ser Arg 1 5

Claims (29)

  1. 인간 PD1에 결합하는 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인 (ISVD) 및 하기 잔기 세트 중 하나 이상에서 인간 CTLA4에 결합하는 ISVD를 포함하며,
    ㆍ VRVTVL (서열식별번호: 195의 아미노산 33-38),
    ㆍ ADSQVTEVC (서열식별번호: 195의 아미노산 41-49); 및
    ㆍ CKVELMYPPPYYLG (서열식별번호: 195의 아미노산 93-106);
    여기서 CTLA4에 결합하는 ISVD 및/또는 PD1에 결합하는 ISVD는 잔기 11 및 89에서의 돌연변이를 포함하며, 여기서 상기 잔기 번호는 카바트(Kabat) 잔기 번호이고;
    여기서 PD1/CTLA4 결합제는 임의적으로 반감기 연장제 및/또는 C-말단 연장제를 포함하는 것인
    PD1/CTLA4 결합제.
  2. ㆍ 하기를 포함하는, PD1에 결합하는 하나 이상의 ISVD:
    아미노산 서열 IHAMG (서열식별번호: 3) 또는 GSIASIHAMG (서열식별번호: 6)를 포함하는 CDR1;
    아미노산 서열 VITXSGGITYYADSVKG (서열식별번호: 4; 여기서 X는 W 또는 V임) 또는 VITWSGGITY (서열식별번호: 7)를 포함하는 CDR2; 및
    아미노산 서열 DKHQSSXYDY (서열식별번호: 5; 여기서 X는 W 또는 F임)를 포함하는 CDR3; 및
    ㆍ 하기를 포함하는, CTLA4에 결합하는 하나 이상의 ISVD:
    아미노산 서열 FYGMG (서열식별번호: 10) 또는 GGTFSFYGMG (서열식별번호: 13)를 포함하는 CDR1;
    아미노산 서열 DIRTSAGRTYYADSVKG (서열식별번호: 11) 또는 DIRTSAGRTY (서열식별번호: 14)를 포함하는 CDR2; 및
    아미노산 서열 EXSGISGWDY (서열식별번호: 12; 여기서 X는 M 또는 P임)를 포함하는 CDR3;
    및, 임의적으로, 반감기 연장제 및/또는 C-말단 연장제
    를 포함하는 PD1/CTLA4 결합제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, PD1에 결합하는 ISVD가 하기 아미노산 서열을 포함하는 것이고,
    DVQLVESGGG VVQPGGSLRL SCAASGSIAS IHAMGWFRQA PGKEREFVAV ITWSGGITYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTVY LQMNSLRPED TALYYCAGDK HQSSWYDYWG QGTLVTVSS
    (서열식별번호: 135);
    CTLA4에 결합하는 ISVD가 하기 아미노산 서열을 포함하는 것이며,
    XVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGGTFSFYGMG
    WFRQAPGKEREFVADIRTSAGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAAEPSGISGWDYWGQGTLVTVSS
    (서열식별번호: 143); 여기서 X는 D 또는 E임;
    또는
    X1VQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGGTFSFYGMGWFRQAPGKEREFVADIRTSAGRTYYADSVKGRFTISRDX2SKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAAEPSGISGWDYWGQGTLVTVSS (서열식별번호: 196), 여기서 X1은 D 또는 E이고, X2는 S, V, G, R, Q, M, H, T, D, E, W, F, K, A, Y 또는 P임;
    임의적으로, 반감기 연장제 및/또는 C-말단 연장제를 포함하는
    PD1/CTLA4 결합제.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 ISVD 사이의 펩티드 링커를 포함하는 PD1/CTLA4 결합제.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    ㆍ 서열식별번호: 135에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 PD1 ISVD;
    ㆍ 서열식별번호: 86에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 35GS 링커;
    ㆍ 서열식별번호: 143 (D1E)에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CTLA4 ISVD;
    ㆍ 서열식별번호: 86에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 35GS 링커;
    ㆍ 서열식별번호: 144에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 HSA ISVD; 및
    ㆍ C-말단 알라닌
    을 포함하는 PD1/CTLA4 결합제.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    ㆍ 서열식별번호: 135에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 PD1 ISVD;
    ㆍ 서열식별번호: 86에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 35GS 링커;
    ㆍ 서열식별번호: 135 (D1E)에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 PD1 ISVD;
    ㆍ 서열식별번호: 86에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 35GS 링커;
    ㆍ 서열식별번호: 143 (D1E)에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CTLA4 ISVD;
    ㆍ 서열식별번호: 86에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 35GS 링커;
    ㆍ 서열식별번호: 144에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 HSA ISVD; 및
    ㆍ C-말단 알라닌
    을 포함하는 PD1/CTLA4 결합제.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    ㆍ 서열식별번호: 135에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 PD1 ISVD;
    ㆍ 서열식별번호: 86에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 35GS 링커;
    ㆍ 서열식별번호: 143 (D1E)에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CTLA4 ISVD;
    ㆍ 서열식별번호: 86에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 35GS 링커;
    ㆍ 서열식별번호: 143 (D1E)에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CTLA4 ISVD;
    ㆍ 서열식별번호: 86에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 35GS 링커;
    ㆍ 서열식별번호: 144에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 HSA ISVD; 및
    ㆍ C-말단 알라닌
    을 포함하는 PD1/CTLA4 결합제.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    ㆍ 서열식별번호: 135에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 PD1 ISVD;
    ㆍ 서열식별번호: 86에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 35GS 링커;
    ㆍ 서열식별번호: 135 (D1E)에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 PD1 ISVD;
    ㆍ 서열식별번호: 86에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 35GS 링커;
    ㆍ 서열식별번호: 143 (D1E)에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CTLA4 ISVD;
    ㆍ 서열식별번호: 86에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 35GS 링커;
    ㆍ 서열식별번호: 143 (D1E)에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CTLA4 ISVD;
    ㆍ 서열식별번호: 86에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 35GS 링커;
    ㆍ 서열식별번호: 144에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 HSA ISVD; 및
    ㆍ C-말단 알라닌
    을 포함하는 PD1/CTLA4 결합제.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 서열 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (서열식별번호: 86)를 포함하는 펩티드 링커를 포함하는 PD1/CTLA4 결합제.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 서열식별번호: 146, 149, 151 또는 153에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 PD1/CTLA4 결합제.
  11. 제1항 내지 제4항 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    아미노산 서열 GFTFSSFGMS (서열식별번호: 199) 또는 SFGMS (서열식별번호: 199의 아미노산 6-10)를 포함하는 CDR1;
    아미노산 서열 SISGSGSDTL (서열식별번호: 200) 또는 SISGSGSDTL (서열식별번호: 200의 아미노산 1-10)을 포함하는 CDR2; 및
    아미노산 서열 GGSLSR (서열식별번호: 201)을 포함하는 CDR3
    을 포함하는 인간 혈청 알부민 ISVD인 반감기 연장제를 포함하는 PD1/CTLA4 결합제.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 혈청 알부민에 결합하고 하기 아미노산 서열을 포함하는 ISVD인 반감기 연장제를 포함하는 PD1/CTLA4 결합제:
    EVQLVESGGG VVQPGNSLRL SCAASGFTFS SFGMSWVRQA PGKGLEWVSS ISGSGSDTLY ADSVKGRFTI SRDNAKTTLY LQMNSLRPED TALYYCTIGG SLSRSSQGTL VTVSSA
    (서열식별번호: 144).
  13. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 알라닌인 C-말단 연장제를 포함하는 PD1/CTLA4 결합제.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, CTLA4 및/또는 PD1에 결합되어 있는 PD1/CTLA4 결합제.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 PD1/CTLA4 결합제가 PD1 및 CTLA4에 결합하는 것을 교차-차단하는 결합제.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 PD1/CTLA4 결합제를 임의적으로 추가 치료제와 연합하여 포함하는 주사 장치 또는 용기.
  17. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 PD1/CTLA4 결합제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  18. 제17항에 있어서, 서열식별번호: 145, 148, 150 또는 152에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  19. 제17항 또는 제18항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  21. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 PD1/CTLA4 결합제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하는 것 및 숙주 세포를 상기 폴리뉴클레오티드로부터의 상기 PD1/CTLA4 결합제의 발현에 유리한 조건 하에 배지에서 배양하는 것, 및 임의적으로, 상기 숙주 세포 및/또는 상기 배지로부터 PD1/CTLA4 결합제를 정제하는 것을 포함하는, 상기 PD1/CTLA4 결합제를 제조하는 방법.
  22. 제21항의 방법에 의해 생산된 PD1/CTLA4 결합제.
  23. PD1을 임의적으로 추가 치료제와 연합된 제1항 내지 제15항 및 제21항 중 어느 한 항의 PD1/CTLA4 결합제와 접촉시키는 것을 포함하는, PD1이 PD-L1 및/또는 PD-L2에 결합하는 것을 방지하는 방법.
  24. CTLA4를 임의적으로 추가 치료제와 연합된 제1항 내지 제15항 및 제21항 중 어느 한 항의 PD1/CTLA4 결합제와 접촉시키는 것을 포함하는, CTLA4가 CD80 및/또는 CD86에 결합하는 것을 방지하는 방법.
  25. 제1항 내지 제15항 및 제21항 중 어느 한 항의 PD1/CTLA4 결합제의 유효량을 임의적으로 추가 치료제와 연합하여 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 증강시키는 방법.
  26. 제1항 내지 제15항 및 제21항 중 어느 한 항의 PD1/CTLA4 결합제의 유효량을 임의적으로 추가 치료제와 연합하여 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 암 또는 감염성 질환을 치료 또는 예방하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 암이 전이성 암, 고형 종양, 혈액암, 백혈병, 림프종, 골육종, 횡문근육종, 신경모세포종, 신장암, 백혈병, 신장 이행 세포암, 방광암, 윌름스 암, 난소암, 췌장암, 유방암, 전립선암, 골암, 폐암, 비소세포 폐암, 위암, 결장직장암, 자궁경부암, 활막 육종, 두경부암, 편평 세포 암종, 다발성 골수종, 신세포암, 망막모세포종, 간모세포종, 간세포성 암종, 흑색종, 신장의 횡문근양 종양, 유잉 육종, 연골육종, 뇌암, 교모세포종, 수막종, 뇌하수체 선종, 전정 슈반세포종, 원시 신경외배엽 종양, 수모세포종, 성상세포종, 역형성 성상세포종, 핍지교종, 상의세포종, 맥락총 유두종, 진성 다혈구혈증, 혈소판혈증, 특발성 골수섬유증, 연부 조직 육종, 갑상선암, 자궁내막암, 카르시노이드 암 또는 간암, 유방암 또는 위암인 방법.
  28. 제26항에 있어서, 감염성 질환이 박테리아 감염, 바이러스 감염 또는 진균 감염인 방법.
  29. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 추가 치료제 또는 치료 절차를 PD1/CTLA4 결합제와 연합하여 투여받는 것인 방법.
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