KR20070084170A - 알쯔하이머병 등의 퇴행성 신경 질환의 치료 및 진단을위한 단일 도메인 카멜리드 항-아밀로이드 베타 항체 및이를 포함하는 폴리펩타이드 - Google Patents

알쯔하이머병 등의 퇴행성 신경 질환의 치료 및 진단을위한 단일 도메인 카멜리드 항-아밀로이드 베타 항체 및이를 포함하는 폴리펩타이드 Download PDF

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데르 아우베라 잉그리트 반
슈테판 베라
파스칼 머치어스
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Abstract

본 발명은 A-베타 또는 이의 기능부전에 의해 매개되거나 아밀로이드 플라크 형성에 의해 매개되는 질환 또는 장애의 치료를 위한, A-베타에 대해 지시된 나노바디 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 항-A-베타 폴리펩타이드에 관한 것이다.
나노바디, 아밀로이드-베타, 아밀로이드 플라크, 단백질 tau, 신경퇴행성 질환, 알쯔하이머병, 골격 영역, 상보성 결정 영역

Description

알쯔하이머병 등의 퇴행성 신경 질환의 치료 및 진단을 위한 단일 도메인 카멜리드 항-아밀로이드 베타 항체 및 이를 포함하는 폴리펩타이드{Single domain Camelide anti-amyloid beta antibodies and polypeptides comprising the same for the treatment and diagnosis of degenerative neural diseases such as Alzheimer's disease}
본 발명은 아밀로이드-베타(본원에서 "A-베타", "베타-아밀로이드 펩타이드/단백질" 또는 "베타-AP"로도 언급됨)에 대한 나노바디™(Nanobodies™) 뿐만 아니라, A-베타에 대한 나노바디 하나 이상을 포함하거나 이로써 본질적으로 이루어진 폴리펩타이드에 관한 것이다. [주: Nanobody™, Nanobodies™ 및 Nanoclone™은 아블린쓰 엔.브이(Ablynx N.V.)의 상표명이다]
본 발명은 또한 이러한 나노바디 및 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산; 이러한 나노바디 및 폴리펩타이드의 제조방법; 이러한 나노바디 또는 폴리펩타이드를 발현하거나 발현할 수 있는 숙주 세포; 이러한 나노바디, 폴리펩타이드, 핵산 및/또는 숙주 세포를 포함하는 조성물, 특히 약제학적 조성물; 및 본원에서 언급되는 예방, 치료 또는 진단 목적과 같은 예방, 치료 또는 진단 목적을 위한 이러한 나노바디, 폴리펩타이드, 핵산, 숙주 세포 및/또는 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 다른 측면, 양태, 장점 및 적용은 본원의 추가 기술로부터 명백해 질 것이다.
본 출원의 우선일 후에 공개된 문헌[Weksler M, Immunity and Ageing, 2004, 1:2]은 알쯔하이머병의 면역치료를 위한 현행 방법 및 기술의 검토를 제공한다.
AD 및 다른 신경퇴행성 질환의 동물 모델은 당업계에 공지되어 있다. 한 예는 문헌[참조: Games et al., Nature,, 1995, 373:523-527]에 의해 기술된 APP 유전자전이된(transgenic) 마우스 모델이다.
수가지 퇴행성 신경 질환은 단백질의 부적절한 폴딩 또는 프로세싱에 의해 또는 프리온에 의해 유발되며, 이들 둘다 아밀로이드 플라크(amyloid plaque)로서 알려진 침습성 신경 침착을 야기한다. 가장 널리 공지된 퇴행성 신경 질환은 아마도 알쯔하이머병(AD)일 것이다. 다른 신경퇴행성 질환 및 장애의 예는 당업자에게 명백할 것이다.
AD의 발생은 급박하고 충족되지 않은 의학적 요구를 보장한다: 65세 내지 85세의 모든 사람들 중 10 내지 40%에서 AD가 발생한다. 게다가, 이러한 집단중 일부에서는 기하급수적으로 증가한다. 따라서, 인도적 관점뿐만 아니라 사회적 및 경제적 관점에서 이러한 악질적 질병을 효과적으로 진단 및 치료하는 방법을 찾아내는 것이 중요하다. 치료법과 관련하여, 약물은 질환 진행을 둔화 또는 중단시키는 것 뿐만 아니라 AD의 초기 병기 동안(진단 전) 이미 발생한 뇌 손상을 회복시키는 것이 요구된다. 현재로서는 조기 진단이나 치료 요법 어느 것도 효과적이지 않다.
AD는 뇌속의, 주로 아밀로이드 펩타이드로 이루어진 세포외 아밀로이드 플 라스크의 존재 및 단백질 tau로 주로 이루어진 세포내 신경원섬유 엉킴(intracellular neurofibrillary tangles; NFT)과 동시에 일어나는 치매로서 정의된다.
아밀로이드 플라크의 주요 성분은 베타 쉬트 구조를 취하고 올리고머화되고 단백질 응집체를 형성하는 경향이 강한 39 내지 43개 아미노산 길이의 매우 불용성 펩타이드인 베타 아밀로이드 펩타이드(베타-AP)이다. 베타-AP의 생산은 아밀로이드 폴리펩타이드 전구체가 특정 프로테아제, 세크레타제로 알려진 그룹에 의해 절단되는 경우에 발생한다. 베타 아밀로이드 펩타이드의 아미노 말단에서 베타-세크레타제에 의한 절단 및 잔기 39 내지 43(가장 흔히 잔기 42)에서 감마-세크레타제 의한 절단은 이 펩타이드가 생산되도록 하는 수단을 구성한다. 알파-세크레타제(및 기타 메탈로프로테아제)에 의한 절단은 베타 아밀로이드 펩타이드의 잔기 16과 17 사이를 절단함으로써 가용성 절단 생성물을 제공한다. 이러한 경로는 가용성 생성물을 생성시킴으로써 베타-AP의 잠재적 축적을 감소시킨다.
A-베타 단백질은 알쯔하이머병(AD)의 특징적인 노인성 플라크의 주 성분이다. A-베타는 2가지 단백질분해성 사건에 의해 A-베타 전구체 단백질(APP)로부터 생산된다. 베타-세크레타제 활성은 아미노산 Met-671과 Asp-672 사이(APP의 770-aa 동종형의 번호매김을 사용함)의 A-베타(베타-부위)의 N 말단에서 APP를 절단한다. 베타-부위에서의 절단은 99　aa(C99)의 막-결합된 APP 단편을 생성시킨다. 이어서, C99의 트랜스막 도메인 내의 두번째 부위(감마 부위)는 39 내지 42개 aa의 펩타이드인 A-베타를 방출하는 감마-세크레타제에 의해 절단될 수 있다. 또는, APP는 이의 A-베타 영역 내, 주로 APP의 알파-세크레타제 절단 부위에서 절단되어 83 aa(C83)의 C-말단 APP 단편을 생성할 수 있고, 이것이 감마-세크레타제에 의해 추가 절단되어 소형의 분비된 펩타이드인 p3가 생성될 수도 있다. APP는 APLP1 및 APLP2(APLP 또는 APP-유사 단백질로 지칭됨)과 밀접하게 관련된다.
세포내 및 세포외 A-베타는 β-쉬트 입체형태를 취하며 ADDL(아밀로이드 유래의 확산성 리간드)라 불리는 중간체 및 원시섬유를 형성하고, 최종적으로 아밀로이드 플라크로 조립되는 아밀로이드 섬유의 형태로 침전된다. 이러한 과정에서, 보다 소수성인 A-베타-42 펩타이드는 기핵제(nucleating agent)로서 작용하고 이 기핵제 주변에서 플라크가 꾸준히 성장하는 것으로 추정된다.
APP에서의 다수의 미스센스 돌연변이는 가족성 AD의 조기 발병 형태와 연루되었다. 이들 모두는 APP의 정준(canonical) 절단 부위 중 하나에서 또는 이 부근에서 일어난다. 따라서, 스웨덴 이중 돌연변이(K670N/M671L)는 베타-절단 부위에 바로 인접해 있으며 베타-세크레타제 활성의 효율을 증가시켜 전체 A-베타를 보다 많이 생성시킨다. 감마 부위 부근에 있는 APP 잔기 717에서의 임의의 3가지 돌연변이는 보다 통상적인 40-잔기 형태[A-베타 (1-40)]과 비교해 보다 아밀로이드형성성인, A-베타의 42-aa 형태 [A-베타 (1-42)]의 비율을 증가시킨다.
알파-부위에 가깝지만 인접하지는 않은 APP의 2가지 추가 돌연변이가 기술되었다. 플랑드르인 가족에서의 돌연변이(A692G, A-베타 잔기 21) 및 네덜란드인 가족에서의 돌연변이(E693Q, A-베타 잔기 22)는 희귀 형태의 가족성 AD와 연루되었다. 특히, 플랑드르인 돌연변이는 반복적 뇌내 출혈 증후군 또는 AD형 치매를 나 타낸다. 신경병리 소견에는 피질 및 해마내 노인성 플라크 및 통상적으로 대뇌 미세혈관 벽 내의 다수의 아밀로이드 침착물이 포함된다.
최근에는 막-결합된 아스파르틸 프로테아제인 BACE(베타-세크레타제 또는 Asp2로도 칭명됨)가 베타-세크레타제로 예상되는 특성들을 나타내는 것으로 제시되었다. 상기 효소는 베타-부위 및 A-베타 영역의 Tyr-10과 Glu-11 사이에서 APP를 유사한 효율로 절단한다. 후자 부위에서 절단된 A-베타 단편은 AD의 아밀로이드 플라크 및 APP-형질감염된 HEK293 사람 배아 신장 세포의 배지에서 관찰되었다. 몇몇 그룹은 BACE(이하, BACE1로 언급됨)의 가까운 상동체인 추가의 아스파르틸 프로테아제, BACE2(Asp1로도 지칭됨)의 데이타베이스에서도 그 존재를 관찰하였다.
BACE2는 베타-부위에서 및 보다 효율적으로는 A-베타의 Phe-19 및 Phe-20 다음에 있는, APP의 A-베타 영역내 부위에서 APP를 절단한다. 이들 내부 A-베타-부위는 잔기 21에서의 플랑드르인 APP 돌연변이에 인접해 있으며, 이 돌연변이는 BACE2에 의해 생성된 베타-부위 절단 생성물의 비율을 현저하게 증가시킨다. 베타-세크레타제 활성을 증가시키거나(스웨덴 돌연변이) 억제하는(M671V) APP의 보존적 베타-부위 돌연변이도 BACE1 및 BACE2 활성에 유사하게 영향을 준다. BACE2는 BACE1과 유사하게 산성 pH에서 APP를 최대로 단백질가수분해한다. 또한, 두 효소 모두에 통상적인 단일 Arg의 변경은, APP의 베타-부위에서는 절단하지만 A-베타 내부의 이의 개별적 부위에서는 절단하지 않는 능력을 차단한다. 베타-부위 절단에 중요한 별개의 BACE1 및 BACE2 특이성 및 주요 활성 부위 잔기의 동정은 베타-세크레타제 활성을 선택적으로 억제하기 위한 전략을 시사할 수 있다. A-베타 영역내 의 야생형 APP의 BACE2 절단은 BACE2-발현 조직에서 온전한 A-베타의 생산을 제한할 수 있다.
BACE1과 마찬가지로, BACE2는 APP의 A-베타 영역 내부의 부위를 효율적으로 절단한다. 두 효소 모두가 A-베타 내부를 절단하지만, 이들 내부 절단에 의해 생산된 A-베타의 단편은 상이한 임상적 결과를 가질 수 있다. A-베타의 Glu-11에서 시작하는 BACE1-생성된 A-베타 단편은 노인성 플라크에서 관찰되었으며, 이러한 크기의 단편은 전체길이 A-베타에 비해서 보다 아밀로이드형성성이며 보다 신경독성이다. 전체길이 A-베타와 마찬가지로 BACE1-생성된 A-베타 단편은 노인성 플라크에서 발견되는 황산화된 프로테오글리칸과 관련될 수 있는 A-베타의 HHQK 설페이트-결합 영역을 포함한다. 대조적으로, BACE2-절단된 내부 단편(A-베타 Phe-19 및 Phe-20에서 시작)은 HHQK 도메인이 결여되어 있으며, 현재까지는 노인성 플라크에서 관찰되지 않았다. 또한, p3(A-베타 Leu-17에서 시작) 이하 크기의 단편은 조직 배양물에서 덜 아밀로이드형성성이고 신경독성인 것으로 보인다. BACE2는 BACE1에 비해서 A-베타 내부의 절단에 보다 효율적이며 C99를 생성시키는데는 덜 효율적이다. 게다가, BACE2는 C99를 효율적으로 분해시킬 수 있다. 이러한 관찰은 BACE2가, BACE1 및 BACE2 둘다를 발현하는 세포에서 A-베타의 병원성 형태(즉, Asp-1 또는 Glu-11에서 시작하는 단편)의 생산을 제한할 수 있음을 암시한다.
단백질 tau는 세포질의 미세관-결합 단백질로서, 이의 미세관에 대한 친화성은 인산화에 의해 조절된다. 과인산화된 tau는 AD 환자의 뇌속에서 쌍을 이룬 나 선형 필라멘트(PHF-tau)로서 발견된다. PHF-tau는 심지어 시험관내에서도 형성된다. PHF-tau는 미세관에 대한 감소된 친화성을 가지며, NFT의 초기 및 주요 성분인 것으로 사료된다. tau를 암호하하는 유전자의 돌연변이는 다른 유형의 치매, 즉 파킨슨증을 동반한 전두측두엽 치매-17(Frontotemporal Dementia with Parkinsonism-17; FTDP-17)을 유도하나 AD는 유도하지 않는다.
tau는 신경세포의 세포골격을 안정화시키고 소포 수송 및 축삭 극성에 관여하는 미세관-관련 단백질이다. 뇌에는, 17번 염색체에 위치하는 단일 유전자의 선택적 mRNA 스플라이싱에 의해 생성되는 tau의 6가지 동종형이 있다. tau에서의 병리학적 변경은 알쯔하이머병, 핵상 마비 및 파킨슨증을 동반한 전두측두엽 치매를 포함하는 몇몇 신경퇴행성 장애에서 일어난다.
AD에서, 과인산화된 tau 형태로 이루어진 불용성 신경원섬유 엉킴(NFT)은 초기에는 내후각 피질 및 해마의 CA1 세부영역내에 축적된다. 최근의 연구는 입체형태적 변화 및 과인산화를 포함하는 신경퇴행을 초래하는 tau 변경의 순서를 명백히 밝혀내기 시작하였다. tau에서의 비정상적 폴딩된 입체형태적 변화는 가장 초기의 tau 병리 사건 중 하나인 것으로 보인다. 이러한 tau에서의 변경은 미세관에 대한 이의 친화성을 감소시켜 미세관의 탈중합을 유도하고 AD에서 관찰되는 신경 손실에 기여한다.
카스파제는 아폽토시스(apoptosis)에 결정적으로 관여하는 시스테인 아스파르테이트 프로테아제이다. 이 효소는 대체로 개시자 및 실행자 카스파제로 나뉘며, 전자는 실행자 카스파제를 활성화시킴으로써 아폽토시스를 개시하는 작용을 하 며 후자는 아폽토시스의 진행 및 세포 수축, 핵 단편화 및 막 수포화와 같은 특징적인 형태학적 변화를 야기하는 하류 이펙터 기질에 작용한다. 증가되는 카스파제가 AD 뇌에서 활성화됨을 시사한다. 게다가, tau를 포함하여 신경세포의 세포골격의 성분은 아폽토시스 자극 후에 카스파제에 의해 표적화된다. 현재, 최근의 증거는 신경원섬유 엉킴 병리상태에서의 tau의 카스파제-절단을 내포한다.
최근의 연구[참조: Rissman et al., J. Clin. Invest., 114(1), 121-130, 2004]는 tau의 카스파제-절단이 AD에서 엉킴 형성의 초기 사건임을 시사한다. 카스파제-절단된 tau는 필라멘트 형성을 촉매하고 초기 상태의 엉킴에서 발견되는 입체형태를 취하며, 과인산화될 수 있다. tau의 카스파제-절단은 또한 유전자전이된 마우스 및 AD 뇌에서 A-베타 및 발생중인 엉킴과 공동 국소화된다. 초기 피질 뉴론에서는, A-베타 유도된 카스파제 활성화는 tau 절단을 유도하며 엉킴-유사 형태를 생성시킨다. 이는 카스파제 활성화가 A-베타에 의해 유발될 수 있는 NFT 형성의 초기 사건이며 카스파제 활성화가 AD의 중요한 특징적 병변에 기여할 수 있음을 시사한다. 세포내 A-베타 및 세포외 A-베타는 둘다 tau의 카스파제-절단을 유도할 수 있다.
과인산화가 PHF-자가 조립을 촉진할 수 있기 때문에, tau의 과인산화는 신경원섬유 엉킴 병리상태의 발생에 있어 우세한 가설이다. tau가 카스파제-절단 후에 과인산화될 수 있음이 입증되었으며, 이는 tau의 생산이 후속적 과인산화를 방해하지 않음을 시사한다.
APP 유전자 또는 PS1("감마-세크레타제")에서의 돌연변이는 조기 발병 가족 성 AD를 유발한다. APP 돌연변이의 예는 각각 β- 및 감마-세크레타제 절단 부위 부근에 위치하는 "스웨덴" 및 "런던" 돌연변이이다. 이러한 돌연변이들은 A-베타 펩타이드 및 특히 A-베타-42의 형성을 증가시키고 이에 따라 아밀로이드 응집체 및 플라크의 형성을 증가시킨다. 초기에는 플라크가 AD의 발병에 대한 주요 유발인자로서 사료되었지만, 현재의 연구는 주요 독성 인자로서의 원시섬유 및 ADDL의 역할을 강조한다[참조: Walsh et al. (2002) Nature 416, 535-539; Lambert et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 6448-6453; Dewachter and Van Leuven, Lancet Neurology, 1(7), 409-416, 2002]. 심지어 플라크는 신경독성 펩타이드가 실제로 생물학적으로 불활성이 되도록 하는 기전인 것으로 예상될 수 있다.
최근의 연구는 아밀로이드의 제거가 아밀로이드 플라크와 신경원섬유 엉킴 둘다가 발생한 마우스에서 조기 상태 tau 병리상태를 제거하였음을 입증하였다[참조: Oddo et al. (2004) Neuron 43, 321-332. 항-엉킴 항체는 초기의 엉킴을 제거하였지만, 플라크는 제거하지 않았으며, 진행기 엉킴에 영향을 주지 않았다.
AD의 가장 최근의 치료법은 아세틸콜린에스테라제 억제제(시판원: Reminyl of J&J, Exelon of Novartis, Aricept of Pfizer)를 사용하여 아세틸콜린 결핍을 표적으로 한다[참조: Auld et al. (2002) Progress in Neurobiology 68, 209-245]. 아세틸콜린 결핍은 전뇌 기저부의 콜린작용성 뉴론의 퇴행을 반영하며 질환의 신경정신의학적 징후와 매우 상관관계가 있는 것으로 보인다. 따라서, 아세틸콜린에스테라제 억제제를 이용한 치료는 다소 유리한 효과가 있지만, 신경퇴행의 병인이 치료되지 않은 상태로 남기 때문에 당해 질환을 치유하거나 질환의 진행을 중단시키 지는 못한다.
메만틴(Memantine)은 인지 저하를 둔화시키고 중간 내지 중증 인지 손상을 갖는 AD 환자에서의 진행을 지연시키는 NMDA 수용체 길항제(Merz Pharmaceuticals)이다[참조: Phase III clinical trials, Reisberg et al (2003) N Engl. J. Med. 348, 1333-1341]. 상기 약물이 단기간 동안 또는 가까운 장래의 신규 유형 및 심지어 전도유망한 치료요법을 대표한다 해도, 여전히 증후적 요법이며 질환을 치유하지 못하며 질환의 진행을 중단시키지 못한다.
몇몇 현행 치료 전략은 표적으로서 A-베타에 중점을 두고 있다. 다음과 같은 3가지 주요 조사 노선이 있다:
a) 아밀로이드 펩타이드 응집체의 베타-쉬트 구조를 간섭하도록 설계된 베타-쉬트 파괴자로서 명명된 소분자(흔히 펩티도-미메틱(peptido-mimetics))의 개발. 안정한 "베타-쉬트 파괴자"는 AD의 유전자전이된 마우스 모델에게 투여된 경우에 혈뇌 장벽을 통과하고 플라크의 수를 감소시키는 것으로 입증되었다[참조: Permanne et al. (2002) FASEB J. 16, 860-862]. 이러한 접근법이 인지 보호 및/또는 회복을 야기하는지 여부는 아직 입증되지 않았다. AD의 가용성 원시섬유 형태의 독성이 있다면, 아밀로이드 플라크의 효율적 용해 및 동시적인, 가용성 소형 응집체의 증가는 신경독성을 더욱 악화시킨다.
b) APP의 아밀로이드 펩타이드의 단백질분해성 프로세싱을 억제하는 소분자의 개발. 베타- 또는 감마-세크레타제의 억제제는 A-베타의 형성을 효율적으로 차단함으로써 아밀로이드의 신경독성 효과로부터 뇌를 보호한다. 가장 잘 연구된 억 제제는 감마-세크레타제 억제제 DAPT로서, 이의 투여는 어린 동물 및 CSF에서 뇌 A-베타 수준을 감소시킨다. 이는 또한 노령 동물(플라크 함유)에서 뇌속 수준이 아니라 혈장 중 A-베타 수준을 감소시킨다[참조: Lanz et al. (2003) J. Pharmacol. Exp. Ther. in press; Dovey et al. (2001) J. Neurochem. 76, 173-181]. 감마-세크레타제가 Notch-시그날전달과 같은 많은 세포성 과정에 관여하기 때문에 여전히 이들 제제의 세포독성과 관련된 주된 의문이 남아있다[참조: Francis et al (2002) Dev. Cell 3, 85-97]. 게다가, 감마-세크레타제의 필수적 서브유닛을 암호화하는 PS1 유전자의 넉-아웃(knock-out)은 치명적이다. 반면에, PS1의 "뉴론 특이적 넉-아웃"을 갖는 마우스는 생존성이며 플라크 형성을 방지하는 현저히 감소된 A-베타 수준을 가졌다. 그럼에도 불구하고, 이는 인지 결함을 예방하지 않으며 심지어 이를 악화시킨다: 그 이유는 A-베타의 직접적 전구체이며 전체 아밀로이드 서열을 함유하는 APP의 신경독성 C-말단 단편(β- CTF 또는 C99)의 축적으로 설명될 수 있다[참조: Dewachter et al, J. Neurosci., 22(9), 3445-53, 2002].
c) A-베타에 대한 수동 및 능동 백신 접종. 당해 조사 노선은 유전자전이된 AD 마우스에게 A-베타-42를 백신접종하면 아밀로이드의 플라크의 형성이 방지되었다는 관찰[참조: Schenk et al. (1999) Nature 400, 173-177]로 출발하였다. 제1 실험에서, 어린 성체 마우스(6주령)의 매달 백신접종은 플라크 형성 및 동시적인, 뇌에서의 염증반응을 본질적으로 방지하였다. 즉 아밀로이드 플라크, 성상교세포증 및 미세아교세포증의 부재. 보다 늦은 연령에서 개시한 백신접종은 아밀로이드 플라크가 이미 확립된 경우에, 부분적 제거를 야기하였다. 이어서, 다른 그룹은 A-베타로의 백신접종이 수중 미로 기억 시험에서 측정된 바에 따르면 행동 장애 및 기억 장애를 향상시켰음을 독립적으로 입증하였다[참조: Janus et al. (2000) Nature 408, 979-982; Morgan et al. (2000) Nature 408, 982-985].
전체 A-베타로의 백신 접종시에 부작용이 있었기 때문에, 대안적인 보다 짧은 펩타이드, 즉 K6-A-베타-1-30[참조: Sigurdsson et al. (2001) Am. J. Pathol. 159, 439-447] 및 A-베타-4-10[참조: McLaurin et al., Nat. Med., 8(11), 1263-69, (2002)] 및 심지어 EFRH 에피토프로서 A-베타-3-6 서열을 발현하는 박테리오파아지[참조: Frenkel et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 11455-11459]가 설계되어, 유전자전이된 마우스를 백신접종하는데 사용되었다.
우수한 전임상 데이타에 따라서, A-베타-42 펩타이드로의 백신접종의 안정성 및 독성을 평가하고 이의 효능을 시험하기 위해 임상 시험에 개시되었다(Elan). 백신접종은 표면-활성 사포닌 QS-21 보조제와 함께 전-응집된 합성 A-베타-42를 i.m.(근육내로) 주사하여 수행되었다[참조: Hock et al. (2002) Nature Med. 8, 1270-1275; Nicoll et al. (2003) Nature Med. in press]. I기 독성 시험이 어떠한 문제도 드러내지 않은 반면에, 후속적 II기 시험은 심각한 합병증으로 인해 조기 중단되었다. 306명의 백신접종된 환자 중 16명에서 염증성 수막뇌염 반응이 발생하였다. 이러한 유해 반응은, A-베타-42 펩타이드 잔기가 천연적으로 체내에 존재한다는 사실을 고려하면 자가면역 반응에 기인한다.
상기 유해한 자가면역 반응은 수동 면역화, 즉 A-베타에 대해 지시된 항체의 투여에 의해 명백히 회피될 수 있다. 당해 접근법은 유전자전이된 AD 마우스에서 뇌 A-베타 부하량을 감소시키는데 있어 성공적인 것으로 나타났다[참조: DeMattos et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 8850-8855]. 항체가 혈뇌 장벽을 통과하여 뇌속에 존재하는 플라크로 표적화될 가능성이 없는 것으로 사료되었기 때문에 기본적 기작은 여전히 고찰해볼 필요가 있다. 따라서, 저자들은 항체가 뇌의 A-베타를 적정하는 혈장중에서 "A-베타 침몰(sink)"를 생성시켰음을 시사하였다. 후속적으로, 겔솔린과 GM1을 사용한 경우에, 어떠한 A-베타-결합 리간드라도 혈뇌 장벽을 통과하지 않고 유전자 전이된 AD 마우스의 아밀로이드 부하량을 감소시킬 수 있는 잠재성을 갖고 있음이 입증되었다[참조: Matsuoka et al. (2003) J. Neuroscience 23, 29-33].
단기간(24시간)의 수동 면역화는 심지어 총 아밀로이드 부하량에 영향을 주지 않으면서도 유전자전이된 AD 마우스의 인지 결함을 회복시킨 것으로 나타났다[참조: Dodart et al. (2002) Nature Neuroscience 5, 452-457]. 이러한 결과는 A-베타의 보다 작은 여전히 가용성인 응집체가 우선 일부 항체에 의해 표적화되고 이러한 응집체가 A-베타의 가장 독성 형태임을 시사할 수 있다. 따라서, 원시섬유 A-베타의 제거는 적어도 유전자전이된 APP-마우스에서 기억력을 회복시킬 수 있다. 기억력 회복과 동시에, 증가된 혈장 및 CSF A-베타 수준이 관찰되었으며, 이는 "침몰" 가설을 뒷받침한다.
자가면역 반응이 명백히 부재하고 기억력에 대한 신속한 양성 효과가 있으며 A-베타에 대한 미리 정해진 친화성을 갖는 어떠한 적합한 유형의 항체라도 사용이 가능하기 때문에 능동 면역화가 아닌 수동 면역화가 가장 흥미로운 것으로 보인다. 본 발명의 폴리펩타이드는 이의 생산 용이성, 높은 특이성 및 친화성, 높은 안정성과 함께 낮은 항원성과 낮은 분자량을 고려하면 이러한 작업에 매우 적합하다.
AD의 명확한 진단은 아밀로이드 플라크, 신경원섬유 엉킴, 시냅스 손실, 뉴론 퇴행의 존재를 입증하기 위해 뇌의 사후 병리 검사를 여전히 필요로 한다. 이는 1906년에 알쯔하이머 박사에 의해 정의된 바와 본질적으로 동일한 과정이다.
1984년에서, 신경, 의사소통 장애 및 뇌졸중 연구소 및 뇌졸중 및 알쯔하이머 및 연관질환 협회(National Institute of Neurological and Communicative Disorders and Stroke and the Alzheimer's disease and Related Disorders Association, NINCDS-ADRDA)는 AD의 진단을 위한 공식적 기준을 정립하였다(문헌[참조: Petrella et al. (2003) Radiology 226, 315-336]에 검토됨). 다음 기준을 모두 충족하는 환자들은 가능성 높은(probable) AD로 진단된다:
- 검사 및 시험으로 증명된 치매(예: 간이 정신 검사(Mini-Mental Test), 임상 치매 등급(Blessed Dementia Scale), 또는 유사 시험)
- 기억 및 하나 이상의 기타 인지 기능의 손상
- 정상적 의식
- 40세 내지 90세에 발병
- 치매를 유발하는 다른 질환의 징후의 부재(배제 기준).
원인 불명의 점진적인 진행성 인지 손상은 가능성이 있는(possible) AD로서 진단될 것이다. 가능성 높은 AD는 경미한(조기), 중간(중간) 또는 중증(후기) 치 매이다.
치매의 대안적 원인을 객관적으로 정의하거나 배제하기 위해 실험실 분석이 사용된다. ApoE4(유전적 소인)에 대한 유전형 검사와 병용된 척수액(CSF)중의 A-베타-42 및 포스포-tau의 ELISA 분석은 민감하고 특이적인 것으로 보인다. 그러나, 당해 방법은 침습적 CSF 천자로 인해 널리 적용될 수 없고 이는 당해 방법이 통상적 스크리닝법이 될 수 없게 한다.
신경사 단백질(AD7C-NTP)에 대한 ELISA(Nymox에 의해 개발됨)는 AD 환자로부터의 뇨 중의 수준이 비-AD 치매 환자 또는 건강한 대조군에 비해서 높음을 입증하였다[참조: Munzar et al. (2002) Neurol. Clin. Neurophysiol. 1, 2-8]. 그러나, 평균 수준은 조기 AD 환자에서 현저하게 낮았으며, 이는 시험이 AD의 조기 발병을 시험하기에 신뢰할만하지 않음을 시사한다.
아직까지 어떠한 화학적 방법도 AD의 초기 병기의 확실한 진단에 적합하지 않으며, 단지 진행된 사례의 임상적 진단을 확인하는데 도움이 될 뿐이다. 명백히, 비가역적 뇌 손상을 알려주는 임상 증상이 발생하기 전에 조기에 진단하기 위해서는 보다 진보된 기술이 요구된다. 이는 본 발명의 목적 중 하나이다.
신경퇴행성 질환 및 이 질환에서의 A-베타의 역할에 관한 보다 많은 정보에 대해서는 특히 문헌[참조: Anguiano et al. (2001) Neurobiol Aging 22, 335, Benveniste et al. (1999). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 14079-14084, DeMattos et al. (2002) Science 295, 2264-2267, Herms et al. (2002) J. Biol. Chem. 278, 2484-2489, Muruganandam et al (2002) FASEB J.16, 240-242, Poduslo et al. (2002) J. Neurochem. 81, 61, Small et al. (2001) Alzheimer's disease. Neurobiol Aging 22, 335, Vanhoutte, Dewachter, Borghgraef, Van Leuven, Van der Linden (2003) (제출됨)]을 참조한다.
본 발명의 또 다른 목적은 종래 기술의 문제점을 극복하고 알쯔하이머병을 진단 및 치료하기 위한, 사람 A-베타에 대해 지시된 하나 이상의 나노바디를 포함하는 항-A-베타 폴리펩타이드, 이러한 폴리펩타이드의 상동체 및/또는 이러한 폴리펩타이드의 기능적 부분 뿐만 아니라, 이들을 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는 것이다. 상기 폴리펩타이드는 알쯔하이머병 진행을 둔화 또는 중단시키고/시키거나 뇌 손상, 기억 및 인지를 회복시킴으로써, A-베타에 의해 매개된 장애, 예를 들면, 알쯔하이머병으로부터 보호하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드는 진단 목적으로 사용될 수 있다.
추가의 목적은 상기 항-A-베타 폴리펩타이드의 생산 방법 및 A-베타 또는 이의 기능부전에 의해 매개되는 질환 및 장애의 스크리닝을 위한 방법 및 키트 및 진단 및 조사용 키트를 제공하는 것이다.
일반적으로, 본 발명의 목적은 AD와 같은 신경퇴행성 질환 및 본원에서 언급하는 추가의 질환 및 장애의 진단, 예방 및/또는 치료에서 사용될 수 있는, 약리학적 활성 제제 및 이를 포함하는 조성물 및 이러한 제제 및 조성물의 사용 및/또는 투여를 포함하는 이러한 질환 및 장애의 진단, 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다.
특히, 본 발명의 목적은 당업계에서 통상적으로 사용되고/되거나 공지된 제 제, 조성물 및/또는 방법과 비교해 특정한 장점을 제공하는 이러한 약리학적으로 활성인 제제, 조성물 및/또는 방법을 제공하는 것이다.
보다 특히, 본 발명의 목적은 약리학적 활성 제제로서 사용될 수 있는 치료학적 단백질 및 이를 포함하는, AD와 같은 신경퇴행성 질환 및 본원에서 언급하는 추가의 질환 및 장애의 진단, 예방 및/또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명에서, 이들 치료학적 단백질은 하기에서 추가로 기술하는 바와 같은 (단일) 도메인 항체 및 특히 NanobodiesTM 및/또는 이에 기초하거나 이를 포함하는 단백질이다.
본 발명에서, 일반적으로, 이러한 목적들은 본원에 제공된 나노바디 및 폴리펩타이드의 사용에 의해 성취된다.
따라서, 본 발명의 목적 중 하나는 A-베타, 특히 온혈 동물로부터의 A-베타, 보다 특히 포유동물로부터의 A-베타 및 특히 사람 A-베타에 대한 나노바디를 제공하고, 이러한 나노바디 하나 이상을 포함하거나 이로써 본질적으로 이루어진 단백질 및 폴리펩타이드를 제공하는 것이다.
특히, 본 발명의 목적은 온혈 동물, 특히 포유동물, 보다 특히 사람에서의 예방, 치료 및/또는 진단용으로 적합한, 이러한 나노바디 및 이러한 단백질 및/또는 폴리펩타이드를 제공하는 것이다.
보다 특히, 본 발명의 목적은 온혈 동물, 특히 포유동물, 보다 특히 사람에서 A-베타와 관련되고/되거나 A-베타에 의해 매개되는 하나 이상의 질환, 장애 또는 상태(예를 들면, 본원에서 언급하는 질환, 장애 및 상태)의 예방, 치료, 경감 및/또는 진단을 위해 사용될 수 있는, 이러한 나노바디 및 이러한 단백질 및/또는 폴리펩타이드를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 온혈 동물, 특히 포유동물, 보다 특히 사람에서 A-베타와 관련되고/되거나 A-베타에 의해 매개되는 하나 이상의 질환, 장애 또는 상태(예를 들면, 본원에서 언급하는 질환, 장애 및 상태)의 예방, 치료, 경감 및/또는 진단을 위해 사용될 수 있는, 이러한 나노바디 및 이러한 단백질 및/또는 폴리펩타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 한가지 구체적이지만 비제한적인 목적은 A-베타에 대한 통상적 항체 또는 이의 단편, 예를 들면, Fab' 단편, F(ab')2 단편, ScFv 작제물, "디아바디(diabody)" 및/또는 기타 (단일) 도메인 항체, 예를 들면, 워드(Ward) 등(상기 참조)에 의해 기술된 "dAb와 비교해 향상된 치료학적 및/또는 약리학적 특성 및/또는 기타 유리한 특성(예를 들면, 개선된 제조 용이성 및/또는 감소된 제품 비용)을 갖는 나노바디, 단백질 및/또는 폴리펩타이드를 제공하는 것이다. 이러한 개선된 및 유리한 특성들은 본원의 추가 설명으로부터 명백해질 것이다.
이러한 목적들은 본원에서 기술하는 나노바디, 단백질 및 폴리펩타이드에 의해 성취된다. 이러한 나노바디는 본원에서 "본 발명의 나노바디"로도 언급되며, 이들 단백질 및 폴리펩타이드는 총칭하여 "본 발명의 폴리펩타이드"로도 언급된다.
따라서, 첫번째 측면에서, 본 발명은 A-베타에 대한 나노바디, 특히 온혈 동물로부터의 A-베타에 대한 나노바디, 보다 특히 포유동물로부터의 A-베타에 대한 나노바디 및 특히 사람 A-베타에 대한 나노바디에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 이러한 A-베타에 대한 나노바디 하나 이상을 포함하거나 이로써 본질적으로 이루어진 단백질 또는 폴리펩타이드에 관한 것이다.
약제학적 용도를 위해, 본 발명의 나노바디 및 폴리펩타이드는 바람직하게는 사람 A-베타에 대해 지시되는 반면에, 수의학적 목적상, 바람직하게는 본 발명의 나노바디 및 폴리펩타이드는 치료될 종으로부터의 A-베타에 대해 지시됨이 당업자에게 명백할 것이다.
본 발명의 나노바디 및 폴리펩타이드, 및 이를 포함하는 조성물의 효능은 해당되는 특정 질환 또는 장애에 따라서 임의의 적합한 시험관내 검정, 세포 기반 검정, 생체내 검정 및/또는 공지된 동물 모델 또는 이들의 임의의 배합물을 사용하여 시험할 수 있다. 적합한 검정 및 동물 모델은 당업자에게 명백할 것이며, 예를 들면, 하기 실시예에서 사용되는 검정 및 동물 모델을 포함한다. 또한, 아밀로이드 플라크의 형성에 대한 본 발명의 나노바디 및 폴리펩타이드의 영향을, 임의로 적합한 염색 후에 현미경을 사용하여 뇌 조직 샘플상에서 가시적으로 측정할 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다.
또한, 본 발명에 따라서, 온혈 동물의 제1 종으로부터의 A-베타에 대해 지시된 나노바디 및 폴리펩타이드는 온혈 동물의 하나 이상의 다른 종으로부터의 A-베타와의 교차반응성을 나타낼 수 있거나 나타내지 않을 수 있다. 예를 들면, 사람 A-베타에 대해 지시된 나노바디 및 폴리펩타이드는 영장류의 하나 이상의 다른 종으로부터의 A-베타 및/또는 질환에 대한 동물 모델(예를 들면, 마우스, 랫트, 토끼, 돼지 또는 개), 특히, A-베타와 관련된 질환 및 장애에 대한 동물 모델(예를 들면, 본원에서 언급하는 종 및 동물 모델)에서 흔히 사용되는 동물의 하나 이상의 종으로부터의 A-베타와의 교차반응성을 나타낼 수 있거나 나타내지 않을 수 있다. 이러한 점에서, 상기 교차반응성은 존재한다면, 사람 A-베타에 대한 나노바디 및 폴리펩타이드를 상기 모델에서 시험할 수 있도록 하기 때문에, 약물 개발 관점에서 장점을 가질 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다.
보다 일반적으로, 본 발명의 범주내에서, 하나의 동물 종으로부터의 A-베타에 대해 지시된 나노바디 및 폴리펩타이드(예를 들면, 사람 A-베타에 대한 나노바디 및 폴리펩타이드)는 당해 나노바디 및/또는 폴리펩타이드가 치료하고자 하는 종에서 목적하는 효과를 제공하는 한 다른 동물 종의 치료에서도 사용되는 것으로 의도된다.
본 발명은 이의 가장 광의적 의미에서 본 발명의 나노바디 및 폴리펩타이드가 지시되는 A-베타의 특정 항원 결정기, 에피토프, 부분, 도메인, 서브유닛 또는 입체형태(경우에 따라)로 특별히 제한되거나 이에 의해 한정되지 않는다. 본 발명의 나노바디 및 폴리펩타이드가 지시될 수 있는 A-베타의 바람직한 에피토프 및 항원 결정기의 몇가지는 AD의 면역치료, 특히 수동 면역치료용으로 사용되는 에피토프이다. 예를 들면, 웩슬러(Weksler)의 논문(상기 참조) 및 여기서 인용된 종래 기술에 언급된 바와 같이, A-베타상에는 3가지 주요 에피토프, 즉 N-말단 에피토프(아미노산 1-6), 중심 에피토프(아미노산 15-25) 및 C-말단 영역이 있는 것으로 공지되어 있다. 본 발명의 나노바디는 이들 에피토프 중 어느 하나에 대해 지시될 수 있다. 그러나, 통상의 항체를 이용한 AD의 수동 면역치료에서, N-말단 에피토 프에 대해 지시된 항체는 APP 유전자전이된 마우스에서 대뇌 출혈을 유발할 수 있는 반면에, C-말단 영역에 대한 통상의 항체는 APP 유전자전이된 마우스에서 치료학적 효과가 결여된 것으로 보고되었다(웩슬러 논문에 인용된 참조문헌 참조). 그러나, 이러한 점에서, 일반적으로 나노바디와 통상의 항체 간의 차이(본원에서 추가로 언급됨)로 인해 나노바디는 통상의 항체가 효능을 나타내지 않거나 불충분한 효능을 나타내는 상황에서 (증가된) 효능을 나타낼 수 있고/있거나 (예를 들면, 나노바디가 크기가 작고/작거나 나노바디 및 나노바디를 포함하는 폴리펩타이드가 Fc-부분 및/또는 이펙터(effector) 기능 없이 고안될 수 있기 때문에) 나노바디는 통상의 항체보다 합병증 및 부작용을 덜 유발할 수 있음이 주지되어야 한다. 따라서, 본 발명에서 사용될 나노바디 및 폴리펩타이드를 선별할 경우에 당업자는 A-베타의 N-말단 에피토프 및 C-말단 영역 각각에 대한 통상의 항체에 대해 당업계에서 언급된 단점들을 고려해야만 하지만, 본 발명의 범주내에서 A-베타의 N-말단 에피토프 및 C-말단 영역 각각에 대한 나노바디는 상응하는 통상의 항체에 대해 당업계에서 기술된 단점을 갖지 않는(또는 이러한 단점들을 덜 갖는) 것들이 가능하게 포함된다.
본 발명의 바람직하지만 비제한적인 양태에 따라서, 본 발명의 나노바디 및 폴리펩타이드는 A-베타의 N-말단 에피토프에 대해 지시된다.
또한, A-베타가 생체내에서 APP의 절단에 의해 형성됨에 따라 본 발명의 나노바디 및 폴리펩타이드는 APP 또는 이의 특정 부분 또는 에피토프에도 결합할 수 있음이 주지되어야 한다. 예를 들면, 당업계에 A-베타의 N-말단 또는 중심 영역에 대한 통상의 항체가 APP에도 결합한다는 것이 보고된 바 있다[참조: 웩슬러의 논문 및 여기서 인용된 참조문헌]. 게다가, A-베타의 C-말단 영역에 대한 통상의 항체는 APP에 결합할 수 없다고 보고되었지만, C-말단 에피토프에 대한 본 발명의 나노바디 및 폴리펩타이드는 이의 작은 크기 및 "강(cavity) 결합" 특성으로 인해 APP에도 결합할 수 있음이 배제되지 않아야 한다.
따라서, 광의적 의미에서, 본 발명은 본 발명의 나노바디 및 폴리펩타이드의 임의의 특정 작용 기작 또는 표적으로 제한되지 않으며, 특히 본 발명의 범주내에서, 본 발명의 나노바디 및 폴리펩타이드는 A-베타, APP 또는 이들 둘다에 결합함으로써 목적하는 예방학적 및/또는 치료학적 작용을 제공함이 포함된다. 예를 들면, 본 발명의 나노바디 및 폴리펩타이드는 (또한 또는 추가로) APP의 절단 양 및/또는 절단율을 감소시킴으로써 A-베타의 형성을 감소시킨다는 것은 본 발명의 범주로부터 배제되지 않는다.
또한, 본 발명의 범주내에서, 경우에 따라, 본 발명의 나노바디는 A-베타의 2개 이상의 항원 결정기, 에피토프, 부분, 서브유닛 또는 입체형태에 결합할 수 있다. 이러한 경우, 본 발명의 나노바디 및/또는 폴리펩타이드가 결합하는 A-베타의 항원 결정기, 에피토프, 부분, 서브유닛 또는 입체형태는 본질적으로 동일할 수 있거나(예를 들면, A-베타가 반복된 구조 모티프를 함유하거나 다량체로서 존재하는 경우) 상이할 수 있다(후자의 경우, 본 발명의 나노바디 및 폴리펩타이드는 동일하거나 상이한 친화성 및/또는 특이성으로 이러한 A-베타의 상이한 항원 결정기, 에피토프, 부분, 서브유닛 또는 입체형태에 결합할 수 있다). 또한, 예를 들면, A- 베타가 활성화된 입체형태 및 불활성 입체형태로 존재하는 경우, 본 발명의 나노바디 및 폴리펩타이드는 이들 입체형태중 어느 하나에 결합할 수 있거나 이들 입체형태 둘다에 결합할 수 있다(즉, 동일하거나 상이한 친화성 및/또는 특이성으로 결합할 수 있다). 또한, 예를 들면, 본 발명의 나노바디 및 폴리펩타이드는 적절한 리간드에 결합되는 A-베타의 입체형태에 결합할 수 있거나, 적절한 리간드에 결합되지 않는 A-베타의 입체형태에 결합할 수 있거나, 이러한 입체형태 둘다에 결합할 수 있다(동일하거나 상이한 친화성 및/또는 특이성으로 결합할 수 있다).
또한, 본 발명의 나노바디 및 폴리펩타이드는 일반적으로 A-베타의 모든 천연 발생 또는 합성 유사체, 변이체, 돌연변이체, 대립유전자, 부분 및 단편, 또는 적어도, 본 발명의 나노바디 및 폴리펩타이드가 결합하는 A-베타(즉, 야생형 A-베타)내의 항원 결정기(들) 또는 에피토프(들)과 본질적으로 동일한 하나 이상의 항원 결정기 또는 에피토프를 함유하는 A-베타의 유사체, 변이체, 돌연변이체, 대립유전자, 부분 및 단편에 결합할 것으로 예상된다. 이러한 경우에, 본 발명의 나노바디 및 폴리펩타이드는 본 발명의 나노바디가 (야생형) A-베타에 결합하는 친화성 및 특이성과 동일하거나 상이한(즉, 이보다 높거나 낮은) 친화성 및/또는 특이성으로 이러한 유사체, 변이체, 돌연변이체, 대립유전자, 부분 및 단편에 결합할 수 있다. 또한, 본 발명의 범주내에서, 본 발명의 나노바디 및 폴리펩타이드는 A-베타의 일부 유사체, 변이체, 돌연변이체, 대립유전자, 부분 및 단편에는 결합하지만 나머지에는 결합하지 않음이 포함된다.
A-베타가 단량체 형태 및 하나 이상의 다량체 형태로 존재하는 경우, 본 발 명의 범주내에서 본 발명의 나노바디 및 폴리펩타이드는 오직 단량체 형태의 A-베타에만 결합하거나, 본 발명의 나노바디 및 폴리펩타이드는 이러한 다량체 형태 중 하나 이상에도 결합한다. 또한, A-베타가 다른 단백질 또는 폴리펩타이드와 연합하여 단백질 복합체를 형성할 수 있는 경우, 본 발명의 범주내에서 본 발명의 나노바디 및 폴리펩타이드는 비-연합된 상태로 A-베타에 결합하거나, 연합된 상태로 A-베타에 결합하거나, 이들 둘다의 상태로 A-베타에 결합한다. 이러한 모든 경우에, 본 발명의 나노바디 및 폴리펩타이드는 본 발명의 나노바디 및 폴리펩타이드가 단량체 및 비-연합된 상태로 A-베타에 결합하는 친화성 및/또는 특이성과 동일하거나 상이할 수 있는(즉, 보다 높거나 낮은) 친화성 및/또는 특이성으로 이러한 다량체 또는 연합된 단백질에 결합할 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 나노바디 및 폴리펩타이드는 당업자에게 명백한 바와 같이, 적어도, 생물학적 및/또는 치료학적 관점에서 가장 적절한 형태(단량체, 다량체 및 연합된 형태를 포함)에 결합할 것이다.
또한, 본 발명의 범주내에서, 본원에서 의도된 용도에 적합한 한, 본 발명의 나노바디 및 폴리펩타이드의 부분, 단편, 유사체, 돌연변이체, 변이체, 대립유전자 및/또는 유도체를 사용하고/하거나, 이들을 포함하거나 이들로 본질적으로 이루어진 단백질 또는 폴리펩타이드를 사용한다. 이러한 부분, 단편, 유사체, 돌연변이체, 변이체, 대립유전자, 유도체, 단백질 및/또는 폴리펩타이드는 본원의 추가 설명에 기술될 것이다.
본원에서 보다 상세히 논의되는 바와 같이, 본 발명의 나노바디는 일반적으 로 "골격(framework) 서열" 또는 "FR"(이는 본원에서 일반적으로 기술되는 바와 같다) 및 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"을 포함하는 것으로 고려될 수 있는 단일 아미노산 쇄를 포함한다. 본 발명의 나노바디 내에 존재하는 일부 바람직한 CDR은 본원에서 기술되는 바와 같다. 보다 일반적으로, 본원에 제공된 추가의 정의를 참조로 하여, 본 발명의 나노바디 내에 존재하는 CDR 서열은
a) (i) 낙타과(Camelidae)에 속하는 포유동물을 A-베타 또는 이의 부분 또는 단편으로 면역화시켜 A-베타에 대한 면역반응 및/또는 항체(및 특히 중쇄 항체)를 생성시키는 단계; (ii) 이렇게 면역화된 포유동물로부터, A-베타에 대해 지시된 중쇄 항체 서열 및/또는 VHH 서열을 포함하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계; 및 (iii) 상기 생물학적 샘플로부터 A-베타에 대해 지시된 중쇄 항체 서열 및/또는 VHH 서열을 수득(예를 들면, 분리)하는 단계를 포함하는 방법 및/또는 (i) 중쇄 항체 서열 및/또는 VHH 서열을 포함하는 라이브러리를 A-베타에 대해 지시된 중쇄 항체 서열 및/또는 VHH 서열에 대해 스크리닝하는 단계; 및 (ii) 상기 라이브러리로부터 A-베타에 대해 지시된 중쇄 항체 서열 및/또는 VHH 서열을 수득(예를 들면, 분리)하는 단계를 포함하는 방법에 의해 A-베타에 대해 지시된 하나 이상의 VHH 도메인을 제공하는 단계; 및
b) 임의로, 이렇게 수득된 A-베타에 대한 중쇄 항체 서열 및/또는 VHH 서열을 친화성 돌연변이, 돌연변이유발(예를 들면, 랜덤 돌연변이유발 또는 부위-지시 된 돌연변이유발) 및/또는 A-베타에 대한 중쇄 항체 서열 및/또는 VHH 서열의 친화성 및/또는 친화성을 증가시키는 임의의 기타 기술(들)에 적용시키는 단계;
c) 이렇게 수득된 A-베타에 대한 중쇄 항체 서열 및/또는 VHH 서열의 CDR의 서열을 측정하는 단계; 및 임의로
d) 하나 이상, 바람직하게는 2개 이상, 보다 바람직하게는 3개의 모든 CDR(즉, CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 특히 적어도 CDR3)이 단계 c)에서 측정된 서열을 갖는 나노바디를 제공하는 단계
를 포함하는 방법에 의해 수득가능하고/하거나 수득될 수 있다.
일반적으로, 단계 d)에서, 본 발명의 나노바디 내에 존재하는 모든 CDR 서열은 동일한 중쇄 항체 또는 VHH 서열로부터 유래될 수 있다. 그러나, 본 발명은 이의 가장 광의적 의미에서 이에 제한되지 않는다. 예를 들면, (비록 덜 바람직하다 해도) 본 발명의 나노바디 내에서 A-베타에 대한 2개 또는 3개의 상이한 중쇄 항체 또는 VHH 서열로부터의 CDR들을 적합하게 조합하고/하거나 본 발명의 나노바디 내에서 중쇄 항체 또는 VHH 서열로부터 유래된 하나 이상의 CDR들(특히 적어도 CDR3)을 상이한 공급원으로부터 유래된 하나 이상의 CDR들(예를 들면, 합성 CDR 또는 사람 항체 또는 VH 도메인 유래의 CDR)과 적합하게 조합할 수도 있다.
본 발명의 비제한적이지만 바람직한 양태에 따라서, 본 발명의 나노바디 내의 CDR 서열은 본 발명의 나노바디가 10-5 내지 10-12 몰/리터 이하, 바람직하게는 10-7 내지 10-12 몰/리터 이하, 보다 바람직하게는 10-8 내지 10-12 몰/리터 이하의 해리 상수(KD) 및/또는 107 M-1 이상, 바람직하게는 108 M-1 이상, 보다 바람직하게는 109 M-1 이상, 예를 들면, 1012 M-1 이상의 결합 친화성 및/또는 500 nM 미만, 바람직하게는 200 nM 미만, 보다 바람직하게는 10 nM 미만, 예를 들면, 500 pM 미만의 친화성으로 A-베타에 결합하도록 한다. A-베타에 대한 본 발명의 나노바디는 공지된 방식으로, 예를 들면, 본원에서 기술하는 검정으로 측정할 수 있다.
바람직하지만 비제한적 측면에서, 본 발명은
4개의 골격 영역(각각, FR1 내지 FR4)과 3개의 상보성 결정 영역(각각, CDR1 내지 CDR3)으로 이루어지고,
i) CDR1이
GGTFSSVGMG [서열번호 37], GFTFSNYGMI [서열번호 38], GGTFSSIGMG [서열번호 39], GFTFSNYWMY [서열번호 40], GFTLSSITMT [서열번호 41], GRTFSIYNMG [서열번호 42], GRTFTSYNMG [서열번호 43], GFTFSNYWMY [서열번호 44], GGTFSSIGMG [서열번호 45], GGIYRVNTVN [서열번호 46], GFTFSNYWMY [서열번호 47] 및 GFTLSSITMT [서열번호 48]로 이루어진 그룹 또는
상기 아미노산 서열 중 하나와 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성(본원에서 정의하는 바와 같음)을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 그룹[여기서, i) 임의의 아미 노산 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환(본원에서 정의하는 바와 같음)이고/이거나, ii) 상기 아미노산 서열은 바람직하게는, 상기 아미노산 서열(들)과 비교하여 오직 아미노산 치환만을 함유하고 아미노산 결실 또는 삽입을 함유하지 않는다]; 및/또는
상기 아미노산 서열 중 하나와 2개 또는 오직 1개의 아미노산 차이(들)만을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 그룹[여기서, i) 임의의 아미노산 치환이 바람직하게는 보존적 아미노산 치환(본원에서 정의하는 바와 같음)이고/이거나, ii) 상기 아미노산 서열은 바람직하게는, 상기 아미노산 서열(들)과 비교하여 오직 아미노산 치환만을 함유하고 아미노산 결실 또는 삽입을 함유하지 않는다]으로부터 선택된 아미노산 서열이고/이거나;
ii) CDR2가
AISRSGDSTYYAGSVKG [서열번호 49], GISDGGRSTSYADSVKG [서열번호 50], AISRSGDSTYYADSVKG [서열번호 51], TISPRAAVTYYADSVKG [서열번호 52], TINSGGDSTTYADSVKG [서열번호 53], TITRSGGSTYYADSVKG [서열번호 54], TISRSGGSTYYADSVKG [서열번호 55], TISPRAGSTYYADSVKG [서열번호 56], AISRSGDSTYYADSVKG [서열번호 57], TITRAGSTNYVESVKG [서열번호 58], TISPRAANTYYADSVKG [서열번호 59] 및 TINSGGDSTTYADSVKG [서열번호 60]로 이루어진 그룹,
상기 아미노산 서열 중 하나와 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성(본원에서 정 의하는 바와 같음)을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 그룹[여기서, i) 임의의 아미노산 치환이 바람직하게는 보존적 아미노산 치환(본원에서 정의하는 바와 같음)이고/이거나, ii) 상기 아미노산 서열은 바람직하게는, 상기 아미노산 서열(들)과 비교하여 오직 아미노산 치환만을 함유하고 아미노산 결실 또는 삽입을 함유하지 않는다] 및/또는
상기 아미노산 서열 중 하나와 3개, 2개 또는 오직 1개의 아미노산 차이(들)(본원에서 정의하는 바와 같음)만을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 그룹[여기서, i) 임의의 아미노산 치환이 바람직하게는 보존적 아미노산 치환(본원에서 정의하는 바와 같음)이고/이거나, ii) 상기 아미노산 서열은 바람직하게는, 상기 아미노산 서열(들)과 비교하여 오직 아미노산 치환만을 함유하고 아미노산 결실 또는 삽입을 함유하지 않는다]으로부터 선택된 아미노산 서열이고/이거나;
iii) CDR3이
RPAGTPINIRRAYNY [서열번호 61], AYGRGTYDY [서열번호 62], RPAGTAINIRRSYNY [서열번호 63], SLKYWHRPQSSDFAS [서열번호 64], GTYYSRAYYR [서열번호 65], ARIGAAVNIPSEYDS [서열번호 66], RPAGTPINIRRAYNY [서열번호 67], SLIYKARPQSSDFVS [서열번호 68], RPAGTAINIRRSYNY [서열번호 69], NGRWRSWSSQRDY [서열번호 70], SLRYRDRPQSSDFLF [서열번호 71] 및 GTYYSRAYYR [서열번호 72]로 이루어진 그룹, 또는
상기 아미노산 서열 중 하나와 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성(본원에서 정 의하는 바와 같음)을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 그룹[여기서, i) 임의의 아미노산 치환이 바람직하게는 보존적 아미노산 치환(본원에서 정의하는 바와 같음)이고/이거나, ii) 상기 아미노산 서열은 바람직하게는, 상기 아미노산 서열(들)과 비교하여 오직 아미노산 치환만을 함유하고 아미노산 결실 또는 삽입을 함유하지 않는다], 및/또는
상기 아미노산 서열 중 하나와 3개, 2개 또는 오직 1개의 아미노산 차이(들)(본원에서 정의하는 바와 같음)만을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 그룹[여기서, i) 임의의 아미노산 치환이 바람직하게는 보존적 아미노산 치환(본원에서 정의하는 바와 같음)이고/이거나, ii) 상기 아미노산 서열은 바람직하게는, 상기 아미노산 서열(들)과 비교하여 오직 아미노산 치환만을 함유하고 아미노산 결실 또는 삽입을 함유하지 않는다]으로부터 선택된 아미노산 서열인, A-베타에 대한 나노바디(본원에서 정의하는 바와 같음)에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 나노바디 내에 존재하는 일부 특히 바람직하지만 비제한적인 CDR 서열 및 CDR 서열의 조합은 하기 표 A-1에 기재되어 있다.
[표 A-1]
Figure 112007034854195-PCT00001
따라서, 본 발명의 나노바디에서, 존재하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열 중 하나 이상은 각각 표 A-1에 기재된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열로 이루어진 그룹; 또는 각각 표 A-1에 기재된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열 중 하나 이상과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99% 이상의 "서열 동일성"(본원에서 정의하는 바와 같음)을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열; 및/또는 각각 표 A-1에 기재된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열 중 하나 이상과 3개, 2개 또는 오직 1개의 "아미노산 차이(들)"(본원에서 정의하는 바와 같음)를 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특히, 본 발명의 나노바디에서, 존재하는 적어도 CDR3은 표 A-1에 기재된 CDR3 서열로 이루어진 그룹 또는 표 A-1에 기재된 CDR3 서열 중 하나 이상과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 CDR3 서열로 이루어진 그룹; 및/또는 표 A-1에 기재된 CDR3 서열 중 하나 이상과 3개, 2개 또는 오직 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 CDR3 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
바람직하게는, 본 발명의 나노바디에서, 존재하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열 중 2개 이상은 각각 표 A-1에 기재된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열로 이루어진 그룹; 또는 각각 표 A-1에 기재된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열 중 하나 이상과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열; 및/또는 각각 표 A-1에 기재된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열 중 하나 이상과 3개, 2개 또는 오직 1개의 "아미노산 차이(들)"를 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특히, 본 발명의 나노바디에서, 존재하는 적어도 CDR3은 표 A-1에 기재된 CDR3 서열로 이루어진 그룹 또는 표 A-1에 기재된 CDR3 서열 중 하나 이상과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 CDR3 서열의 그룹으로부터 선택되고; 존재하는 CDR1 및 CDR2 서열은 각각 표 A-1에 기재된 CDR1 및 CDR2 서열로 이루어진 그룹 또는 각각 표 A-1에 기재된 CDR1 및 CDR2 서열과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 CDR1 및 CDR2 서열의 그룹; 및/또는 각각 표 A-1에 기재된 CDR1 및 CDR2 서열 중 하나 이상과 3개, 2개 또는 오직 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 CDR1 및 CDR2 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
가장 바람직하게는, 본 발명의 나노바디에서, 존재하는 모든 3개의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 각각 표 A-1에 기재된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열로 이루어진 그룹 또는 각각 표 A-1에 기재된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열 중 하나 이상과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열; 및/또는 각각 표 A-1에 기재된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열 중 하나 이상과 3개, 2개 또는 오직 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
보다 더욱 바람직하게는, 본 발명의 나노바디에서, 존재하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열 중 하나 이상은 각각 표 A-1에 기재된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 바람직하게는, 상기 양태에서, 존재하는 나머지 2개의 CDR 서열 중 하나 이상 또는 바람직하게는 둘다는 각각 표 A-1에 기재된 상응하 는 CDR 서열 중 하나 이상과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 CDR 서열로부터 선택된다.
특히, 본 발명의 나노바디에서, 존재하는 적어도 CDR3 서열은 표 A-1에 기재된 CDR3로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 바람직하게는, 상기 양태에서, 존재하는 CDR1 및 CDR2 서열 중 하나 이상 및 바람직하게는 둘다는 각각 표 A-1에 기재된 CDR1 및 CDR2 서열과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 CDR1 및 CDR2 서열의 그룹; 및/또는 각각 표 A-1에 기재된 CDR1 및 CDR2 서열 중 하나 이상과 3개, 2개 또는 오직 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 CDR1 및 CDR2 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
보다 더욱 바람직하게는, 본 발명의 나노바디에서, 존재하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열 중 2개 이상은 각각 표 A-1에 기재된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 바람직하게는, 상기 양태에서, 존재하는 나머지 CDR 서열은 표 A-1에 기재된 상응하는 CDR 서열 중 하나 이상과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 CDR 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.; 및/또는 표 A-1에 기재된 상응하는 서열 중 하나 이상의 하나 이상과 3개, 2개 또는 오직 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 CDR 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특히, 본 발명의 나노바디에서, 적어도 CDR3 서열은 표 A-1에 기재된 CDR3 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, CDR1 서열 또는 CDR2 서열 중 하나는 각각 표 A-1에 기재된 CDR1 및 CDR2 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 바람직하게는, 상기 양태에서, 존재하는 나머지 CDR 서열은 표 A-1에 기재된 상응하는 CDR 서열 중 하나 이상과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 CDR 서열로 이루어진 그룹 및/또는 표 A-1에 기재된 상응하는 CDR 서열과 3개, 2개 또는 오직 1개의 아미노산 차이(들)을 갖는 CDR 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
보다 더욱 바람직하게는, 본 발명의 나노바디에서, 존재하는 모든 3개의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 각각 표 A-1에 기재된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
또한, 일반적으로, 표 A-1에 기재된 CDR들의 조합(즉, 표 A-에 기재된 동일한 행에서 언급된 것)이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 나노바디내의 CDR이 표 A-1에 언급된 CDR 서열이거나 표 A-1에 기재된 CDR 서열과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 CDR 서열로 이루어진 그룹 및/또는 표 A-1에 기재된 CDR 서열과 3개, 2개 또는 오직 1개의 아미노산 차이(들)을 갖는 CDR 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 경우, 나머지 CDR들 중 하나 이상 및 바람직하게는 둘다는 표 A-1의 동일한 조합(즉, 표 A-1의 동일한 행에서 언급된 것)에 속하는 CDR 서열로부터 선택되거나, 동일한 조합에 속하는 CDR 서열(들)과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성 을 갖는 CDR 서열의 그룹 또는 동일한 조합에 속하는 CDR 서열(들)과 3개, 2개 또는 오직 1개의 아미노산 차이(들)을 갖는 CDR 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것이 일반적으로 바람직하다. 상기 단락에서 나타난 다른 바람직함은 표 A-1에 언급된 CDR들의 조합에도 적용된다.
따라서, 비제한적 예로서, 본 발명의 나노바디는 예를 들면, 표 A-1에 언급된 CDR1 서열 중 하나와 80%의 서열 동일성을 갖는 CDR1 서열, 표 A-1에 언급된 CDR2 서열 중 하나와 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 CDR2 서열(그러나 상이한 조합에 속하는) 및 CDR3 서열을 포함한다.
본 발명의 일부 바람직한 나노바디는 (1) 표 A-1에 언급된 CDR1 서열 중 하나와 80% 초과의 서열 동일성을 갖는 CDR1 서열; 표 A-1에 언급된 CDR2 서열 중 하나와 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 CDR2 서열(그러나, 상이한 조합에 속하는); 및 표 A-1에 언급된 CDR3 서열 중 하나와 80% 초과의 동일성을 갖는 CDR3 서열(그러나, 상이한 조합에 속하는) 또는 (2) 표 A-1에 언급된 CDR1 서열 중 하나와 80% 초과의 동일성을 갖는 CDR1 서열; CDR2 서열, 및 표 A-1에 기재된 CDR3 서열 중 하나; 또는 (3) CDR1 서열; 표 A-1에 기재된 CDR2 서열 중 하나와 80% 초과의 서열 동일성을 갖는 CDR2 서열; 및 CDR2 서열과 동일한 조합에 속하는 표 A-1에 언급된 CDR3 서열과 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 CDR3 서열을 포함한다.
본 발명의 일부 특히 바람직한 나노바디는 예를 들면, (1) 표 A-1에 언급된 CDR1 서열 중 하나와 80% 초과의 서열 동일성을 갖는 CDR1 서열; 동일한 조합에 속 하는 표 A-1에 언급된 CDR2 서열과 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 CDR2 서열; 및 동일한 조합에 속하는 표 A-1에 언급된 CDR3 서열과 80% 초과의 서열 동일성을 갖는 CDR3 서열; (2) CDR1 서열; 표 A-1에 기재된 CDR 2 및 표 A-1에 기재된 CDR3 서열(여기서, CDR2 서열 및 CDR3 서열은 상이한 조합에 속할 수 있다)을 포함할 수 있다.
본 발명의 일부 보다 더욱 바람직한 나노바디는 예를 들면, (1) 표 A-1에 언급된 CDR1 서열 중 하나와 80% 초과의 동일성을 갖는 CDR1 서열; 동일한 조합에 속하는 표 A-1에 기재된 CDR2 서열; 및 상이한 조합에 속하는 표 A-1에 언급된 CDR3 서열 또는 (2) 표 A-1에 언급된 CDR1 서열; 동일한 조합에 속하는 표 A-1에 언급된 CDR2 서열과 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 CDR2 서열; 및 동일한 상이한 조합에 속하는 표 A-1에 기재된 CDR3 서열과 80% 초과의 서열 동일성을 갖는 CDR3 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 특히 바람직한 나노바디는 예를 들면, 표 A-1에 언급된 CDR1 서열, 동일한 조합에 속하는 표 A-1에 언급된 CDR2 서열과 80% 초과의 서열 동일성을 갖는 CDR2 서열 및 동일한 조합에 속하는 표 A-1에 언급된 CDR3 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 가장 바람직한 나노바디에서, 존재하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 각각 표 A-1에 기재된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열의 조합 중 하나로부터 선택된다.
바람직하게는, CDR 서열이 표 A-1에 기재된 CDR 서열 중 하나와 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99% 이상 서열의 서열 동일성(본원에서 정의하는 바와 같음)을 갖는 CDR 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 경우 및/또는 CDR 서열이 표 A-1에 기재된 CDR 서열 중 하나와 3개, 2개 또는 오직 1개의 아미노산 차이(들)을 갖는 CDR 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 경우,
i) 임의의 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환(본원에서 정의하는 바와 같음)이고/이거나,
ii) 상기 아미노산 서열은 바람직하게는 표 A-1에 기재된 CDR 서열과 비교하여 오직 아미노산 치환만을 함유하고 아미노산 결실 또는 삽입은 함유하지 않는다.
본 발명의 비제한적이지만 바람직한 양태에 따라서, 본 발명의 나노바디 내의 CDR 서열은 상기 정의한 바와 같고 또한, 본 발명의 나노바디는 10-5 내지 10-12 몰/리터 이하, 바람직하게는 10-7 내지 10-12 몰/리터 이하, 보다 바람직하게는 10-8 내지 10-12 몰/리터의 해리 상수(KD), 및/또는 107 M-1 이상, 바람직하게는 108 M-1 이상, 보다 바람직하게는 109 M-1 이상, 예를 들면, 1012 M-1 이상의 결합 친화성, 및/또는 500 nM 미만, 바람직하게는 200 nM 미만, 보다 바람직하게는 10 nM 미만, 예를 들면, 500 pM 미만의 친화성으로 A-베타에 결합되는 것이다. A-베타에 대한 본 발명의 나노바디의 친화성은 공지된 방식으로 예를 들면, 본원에 기술된 검정을 사용하여 측정할 수 있다.
본 발명의 다른 바람직하지만 비제한적 양태에 따라서, (a) CDR1은 1개 내지 12개 아미노산 잔기, 통상적으로 2 내지 9개의 아미노산 잔기, 예를 들면, 5개, 6개 또는 7개의 아미노산 잔기의 길이를 갖고/갖거나, (b) CDR2는 13개 내지 24개의 아미노산 잔기의 길이, 통상적으로 15개 내지 21개 아미노산 잔기, 예를 들면, 16개 내지 17개의 아미노산 잔기의 길이를 갖고/갖거나, (c) CDR3은 2개 내지 35개의 아미노산 잔기, 통상적으로 3 내지 30개의 아미노산 잔기, 예를 들면, 6 내지 23개의 아미노산 잔기의 길이를 갖는다.
상기 CDR 서열을 갖는 나노바디는 바람직하게는 본원에서 추가로 정의되는 골격 서열을 갖는다.
다른 측면에서, 본 발명은 서열번호 73 내지 105로 이루어진 그룹 또는 서열번호 73 내지 105의 아미노산 서열 중 하나 이상과 80% 초과, 바람직하게는 90% 초과, 보다 바람직하게는 95% 초과, 예를 들면 99% 이상의 서열 동일성(본원에서 정의된 바와 같음)을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 나노바디에 관한 것이다.
구체적이지만 비제한적인 양태에 따라서, 후자의 아미노산 서열은 본원에서 추가 기술되는 바와 같이 "사람화"되었다. 이러한 사람화된 나노바디의 일부 바람직하지만 비제한적 예는 서열번호 85 내지 105로 제시된다.
본 발명에서, 서열번호 80 내지 84의 나노바디 및 이의 사람화 변이체가 특히 바람직하다.
본 발명의 폴리펩타이드는 본 발명의 나노바디 하나 이상을 포함하거나 이로 써 본질적으로 이루어진다.
일반적으로, 단일 나노바디(예를 들면, 본 발명의 단일 나노바디)를 포함하거나 이로써 본질적으로 이루어진 단백질 또는 폴리펩타이드는 본원에서 "일가" 단백질 또는 폴리펩타이드 또는 "일가 작제물"로서 언급될 것이다. 본 발명의 나노바디 2개 이상(예를 들면, 본 발명의 나노바디 2개 이상 또는 본 발명의 나노바디 하나 이상 및 또 다른 나노바디 하나 이상)을 포함하거나 이로써 본질적으로 이루어진 단백질 또는 폴리펩타이드는 "다가" 단백질 또는 폴리펩타이드 또는 "다가 작제물"로서 언급될 것이며, 이들은 본 발명의 상응하는 일가 나노바디와 비교해서 특정한 장점을 제공할 수 있다. 이러한 다가 작제물의 일부 비제한적 예는 본원의 추가 설명으로부터 명백해질 것이다.
다른 구체적이지만 비제한적 양태에 따라서, 본 발명의 폴리펩타이드는 본 발명의 나노바디 하나 이상과 또 다른 나노바디 하나 이상(즉, 다른 에피토프, 항원, 표적, 단백질 또는 폴리펩타이드에 대해 지시된)를 포함하거나 이로써 본질적으로 이루어진다. 이러한 단백질 또는 폴리펩타이드는 본원에서 "다중특이적" 단백질 또는 폴리펩타이드 또는 "다중특이적 작제물"로서 언급되며, 이들은 본 발명의 상응하는 일가 나노바디와 비교해서 특정한 장점을 제공할 수 있다. 다시, 이러한 다중특이적 작제물의 일부 비제한적 예는 본원의 추가 설명으로부터 명백해질 것이다.
또 다른 구체적이지만 비제한적 양태에 따라서, 본 발명의 폴리펩타이드는 하나 이상의 본 발명의 나노바디, 임의로 하나 이상의 추가 나노바디, 및 본 발명 의 나노바디 및/또는 수득되는 융합 단백질에 하나 이상의 목적하는 특성을 부여하는하나 이상의 다른 아미노산 서열(예를 들면, 단백질 또는 폴리펩타이드)을 포함하거나 이로써 본질적으로 이루어진다. 다시, 이러한 융합 단백질은 본 발명의 상응하는 일가 나노바디와 비교해서 특정한 장점을 제공할 수 있다. 이러한 아미노산 서열 및 이러한 융합 작제물의 일부 비제한적 예는 본원의 추가 설명으로부터 명백해질 것이다.
또한, 상기 양태중 2개 이상을 조합하여, 예를 들면, 2개의 본 발명의 나노바디와 하나의 또 다른 나노바디 및 임의로 하나 이상의 다른 아미노산 서열을 포함하는 삼가 이특이적 작제물을 제공할 수 있다. 이러한 작제물 뿐만 아니라 본 발명의 범주에서 특히 바람직한 일부 작제물의 추가의 비제한적 예는 본원의 추가 설명으로부터 명백해질 것이다.
상기 작제물에서, 하나 이상의 나노바디 및/또는 다른 아미노산 서열은 직접 연결되거나 하나 이상의 링커 서열을 통해 연결될 수 있다. 이러한 링커의 일부 적합하지만 비제한적 예는 본원의 추가 설명으로부터 명백해질 것이다.
본 발명의 하나의 바람직한 양태에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 본 발명의 수득된 폴리펩타이드가 혈뇌 장벽을 가로질러 통과할 수 있도록 하는 하나 이상(예를 들면, 2개 및 바람직하게는 1개)의 아미노산 서열에 (임의로 하나 이상의 적합한 링커 서열을 통해) 연결된 하나 이상(예를 들면, 2개 또는 바람직하게는 1개)의 본 발명의 나노바디를 포함한다. 특히, 본 발명의 수득된 폴리펩타이드가 혈뇌 장벽을 가로질러 통과할 수 있도록 하는 상기 하나 이상의 아미노산 서열은 하나 이 상(예를 들면, 2개, 바람직하게는 1개)의 나노바디, 예를 들면, WO 02/057445에 기재된 나노바디일 수 있으며, 이중 FC44 (서열번호 189) 및 FC5(서열번호 190)가 일부 바람직한 비제한적 예이다.
본 발명의 다른 바람직한 양태에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 본 발명의 수득된 폴리펩타이드에 증가된 생체내 반감기를 부여하는 하나 이상(예를 들면, 2개 및 바람직하게는 1개)의 아미노산 서열에 (임의로 하나 이상의 적합한 링커 서열을 통해) 연결된 하나 이상(예를 들면, 2개 또는 바람직하게는 1개)의 본 발명의 나노바디를 포함한다. 특히, 본 발명의 수득된 폴리펩타이드에 증가된 생체내 반감기를 부여하는 상기 아미노산 서열은 하나 이상(예를 들면, 2개, 바람직하게는 1개)의 나노바디, 특히 사람 혈청 알부민과 같은 사람 혈청 단백질에 대해 지시된 나노바디이며, 이중에서 서열번호 110 내지 116은 일부 비제한적 예이며 PMP6A6 ("ALB-1", 서열번호 34), ALB-8(AlB-1의 사람화 버젼, 서열번호 35) 및 PMP6A8 ("ALB-2", 서열번호 36)은 일부 바람직한 비제한적 예이다.
본 발명의 또 다른 바람직한 양태에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 하나 이상(예를 들면, 2개 또는 바람직하게는 1개)의 본 발명의 나노바디, 본 발명의 수득된 폴리펩타이드가 혈뇌 장벽을 가로질러 통과할 수 있도록 하는 하나 이상(예를 들면, 2개 및 바람직하게는 1개)의 아미노산 서열 및 본 발명의 수득된 폴리펩타이드에 증가된 생체내 반감기를 부여하는 하나 이상(예를 들면, 2개 및 바람직하게는 1개)의 아미노산 서열(임의로 하나 이상의 적합한 링커 서열을 통해 연결됨)을 포함한다. 다시, 본 발명의 수득된 폴리펩타이드가 혈뇌 장벽을 가로질러 통과할 수 있도록 하는 상기 하나 이상의 아미노산 서열은 하나 이상(예를 들면, 2개 및 바람직하게는 1개)의 나노바디(본원에 언급한 바와 같음)일 수 있고, 본 발명의 수득된 폴리펩타이드에 증가된 생체내 반감기를 부여하는 상기 아미노산 서열은 하나 이상(예를 들면, 2개 및 바람직하게는 1개)의 나노바디(또한, 본원에서 언급한 바와 같음)일 수 있다.
본 발명의 비제한적이지만 바람직한 양태에 따라서, 본 발명의 폴리펩타이드는 바람직하게는 이들이 10-5 내지 10-12 몰/리터 이하, 바람직하게는 10-7 내지 10-12 몰/리터 이하, 보다 바람직하게는 10-8 내지 10-12 몰/리터 이하의 해리 상수(KD) 및/또는 107 M-1 이상, 바람직하게는 108 M-1 이상, 보다 바람직하게는 109 M-1 이상, 예를 들면, 1012 M-1 이상의 결합 친화성 및/또는 500 nM 미만, 바람직하게는 200 nM 미만, 보다 바람직하게는 10 nM 미만, 예를 들면, 500 pM 미만의 친화성으로 A-베타에 결합하도록 한다. A-베타에 대한 본 발명의 폴리펩타이드의 친화성은 공지된 방식으로, 예를 들면, 본원에 기술된 검정을 사용하여 측정할 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드의 일부 바람직하지만 비제한적 예는
- 서열번호 150 내지 165이 본 발명의 다가(및 특히 이가) 폴리펩타이드의 일부 예이고;
- 서열번호 117 내지 149 및 서열번호 166 내지 173이 1개 또는 2개의 본 발명의 나노바디와 혈청 알부민(각각 사람 또는 마우스)에 대해 지시된 나노바디를 포함하는 본 발명의 이특이적 폴리펩타이드의 일부 예이고;
- 서열번호 174 내지 177이 1개 또는 2개의 본 발명의 나노바디와 본 발명의 폴리펩타이드가 혈뇌 장벽을 가로질러 통과할 수 있도록 하는 나노바디를 포함하는 본 발명의 이특이적 폴리펩타이드의 일부 예이고;
- 서열번호 178 내지 183이 1개 또는 2개의 본 발명의 나노바디, 사람 혈청 알부민에 대해 지시된 나노바디 및 본 발명의 폴리펩타이드가 혈뇌 장벽을 가로질러 통과할 수 있도록 하는 나노바디를 포함하는 본 발명의 삼특이적 폴리펩타이드이드의 일부 예인, 서열번호 117 내지 183의 폴리펩타이드이다.
본 발명의 다른 폴리펩타이드는 예를 들면, 서열번호 117 내지 183의 아미노산 서열 중 하나 이상과 80% 초과, 바람직하게는 90% 초과, 보다 바람직하게는 95% 초과, 예를 들면, 99% 이상의 "서열 동일성"(본원에서 정의된 바와 같음)을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있으며, 여기서, 상기 아미노산 서열내에 포함된 나노바디는 바람직하게는 본원에서 정의되는 바와 같다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 나노바디 및/또는 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산에 관한 것이다. 이러한 핵산은 본원에서 "본 발명의 핵산"으로도 언급될 것이며, 예를 들면, 본원에서 정의하는 바와 같은 유전자 작제물의 형태일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 나노바디 및/또는 본 발명의 폴리펩타이드를 발현하거나 발현할 수 있고/있거나 본 발명의 핵산을 함유하는 숙주 또는 숙주 세포에 관한 것이다. 이러한 숙주 또는 숙주 세포의 일부 바람직하지만 비제 한적 예는 본원의 추가 설명으로부터 명백해질 것이다.
본 발명은 또한, 하나 이상의 본 발명의 나노바디, 하나 이상의 본 발명의 폴리펩타이드 및/또는 하나 이상의 본 발명의 핵산, 및 임의로 공지된, 즉 조성물의 의도된 용도에 따라서 조성물의 하나 이상의 추가 성분을 함유하거나 포함하는 생성물 또는 조성물에 관한 것이다. 이러한 생성물 또는 조성물의 일부 바람직하지만 비제한적 예는 본원의 추가 설명으로부터 명백해질 것이다.
본 발명은 또한, 본원에 기술된 나노바디, 폴리펩타이드, 핵산, 숙주 세포, 생성물 및 조성물을 제조하거나 생성시키는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법의 일부 바람직하지만 비제한적 예는 본원의 추가 설명으로부터 명백해질 것이다.
본 발명은 또한 본원에 기술된 나노바디, 폴리펩타이드, 핵산, 숙주 세포, 생성물 및 조성물의 적용 및 용도 뿐만 아니라, A-베타와 관련된 질환 및 장애의 예방 및/또는 치료 방법에 관한 것이다. 일부 바람직하지만 비제한적 적용 및 용도는 본원의 추가 설명으로부터 명백해질 것이다.
본 발명의 다른 측면, 양태, 장점 및 적용도 또한 하기의 추가 설명으로부터 명백해질 것이다.
본 발명의 상기 및 다른 측면, 양태 및 장점은 하기의 추가 설명으로부터 명백해질 것이다:
a) 달리 언급하거나 정의하지 않는 한, 사용되는 모든 용어는 당업자에게 명백할 수 있는 당업계에서 통상적인 의미를 갖는다. 예를 들면, 문헌[Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" ( 2nd.Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); F. Ausubel et al, eds., "Current protocols in molecular biology", Green Publishing and Wiley Interscience, New York (1987); Lewin, "Genes II", John Wiley & Sons, New York, N.Y., (1985); Old et al., "Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering", 2nd edition, University of California Press, Berkeley, CA (1981); Roitt et al., "Immunology" (6th. Ed.), Mosby/Elsevier, Edinburgh (2001); Roitt et al., Roitt's Essential Immunology, 10th Ed. Blackwell Publishing, UK (2001); and Janeway et al., "Immunobiology" (6th Ed.), Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, New York (2005)]과 같은 표준 편람 및 본원에 인용된 일반적 배경기술을 참조한다.
b) 달리 언급하지 않는 한, "면역글로불린 서열"이란 용어는 본원에서 중쇄 항체를 언급하는지 또는 통상의 4-쇄 항체를 언급하는데 사용되는지 여부와 관계없이- 일반적 용어로서 전체길이 항체, 이의 개별적 쇄 뿐만 아니라 이의 부분, 도메인 또는 단편(각각, VHH 도메인 또는 VH/VL 도메인과 같은 항원-결합 도메인 또는 단편을 포함하나 이에 제한되지 않음)을 포함하기 위해 사용된다. 또한, 본원에서 사용되는 "서열"이란 용어(예를 들면, "면역글로불린 서열", "항체 서열", "가변성 도메인 서열", "VHH 서열" 또는 "단백질 서열")는, 문맥상 보다 제한된 해석을 요구하지 않는 한, 관련 아미노산 서열 뿐만 아니라 이를 암호화하는 핵산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것으로 일반적으로 이해되어야 한다.
c) 달리 언급하지 않는 한, 상세히 구체적으로 기술되지 않는 모든 방법, 단계, 기술 및 조작은 당업자에게 명백할 수 있는 공지된 방법으로 수행될 수 있고 수행되었다. 예를 들면, 표준 편람 및 본원에 언급된 일반적 배경기술 및 여기서 인용된 추가의 참조문헌을 참조한다;
d) 아미노산 잔기는 표 A-2에 언급된 표준 3문자 또는 1문자 아미노산 코드에 따라서 표시될 수 있다;
[표 A-2]
Figure 112007034854195-PCT00002
e) 2개 이상의 뉴클레오타이드 서열을 비교하기 위해, 제1 뉴클레오타이드 서열과 제2 뉴클레오타이드 서열 간의 "서열 동일성"의 %는 [제2 뉴클레오타이드 서열내의 상응하는 위치의 뉴클레오타이드와 동일한 제1 뉴클레오타이드 서열내의 뉴클레오타이드의 수]를 [제1 뉴클레오타이드 서열내 뉴클레오타이드의 총 수]로 나누고 여기에 [100%]를 곱하여 계산할 수 있으며, 여기서 제2 뉴클레오타이드 서열내 뉴클레오타이드의 결실, 삽입, 치환 또는 부가는 각각 제1 뉴클레오타이드 서열과 비교한 단일 뉴클레오타이드(위치)에서의 차이로서 고려된다.
대안으로, 2개 이상의 뉴클레오타이드 서열 간의 서열 동일성 정도는 표준 설정치를 사용하여 NCBI Blast v2.0과 같은 서열 정렬용의 공지된 컴퓨터 알고리듬을 사용하여 계산할 수 있다.
서열 동일성 정도를 측정하기 위한 몇가지 다른 기술, 컴퓨터 알고리듬 및 설정치는 예를 들면, WO 04/037999, EP 0 967 284, EP 1 085 089, WO 00/55318, WO 00/78972, WO 98/49185 및 GB 2 357 768-A에 기술되어 있다.
통상적으로, 상기 개요된 계산 방법에 따라서 두 서열 간의 서열 동일성 %를 측정하기 위한 목적상, 가장 큰 수의 뉴클레오타이드를 갖는 뉴클레오타이드 서열은 "제1" 뉴클레오타이드 서열로서 고려될 것이며, 다른 뉴클레오타이드 서열은 "제2" 뉴클레오타이드 서열로서 고려될 것이다.
f) 2개 이상의 아미노산 서열을 비교하기 위한 목적상, 제1 아미노산 서열과 제2 아미노산 서열 간의 "서열 동일성"의 %는 [제2 아미노산 서열내의 상응하는 위치의 아미노산 잔기와 동일한 제1 아미노산 서열내 잔기의 수]를 [제1 아미노산 서열내 뉴클레오타이드의 총 수]로 나누고 [100%]를 곱하여 계산할 수 있으며, 여기서 제2 아미노산 서열내 아미노산의 각각의 결실, 삽입, 치환 또는 부가는 단일 아미노산 잔기(위치)에서의 차이, 즉 본원에서 정의한 바와 같은 "아미노산 차이"로서 고려된다.
대안으로, 두 아미노산 서열 간의 서열 동일성 정도는 표준 설정치를 사용하여 뉴클레오타이드 서열에 대한 서열 동일성 정도의 측정에 대해 상기 언급한 바와 같은 공지된 컴퓨터 알고리듬을 사용하여 계산할 수 있다.
통상적으로, 상기 개요한 계산 방법에 따라서 두 아미노산 서열 간의 서열 동일성의 %를 측정하기 위한 목적상, 가장 큰 수의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열은 "제1" 아미노산 서열로서 고려될 것이며, 다른 아미노산 서열은 "제2" 아미노산 서열로서 고려될 것이다.
또한, 두 아미노산 서열 간의 서열 동일성 정도를 측정하는데 있어, 당업자는 아미노산 잔기가 유사한 화학적 구조의 다른 아미노산 잔기로 치환되고 기능, 활성 또는 다른 생물학적 특성에 거의 영향을 주지 않거나 본질적으로 전혀 주지 않는 아미노산 치환으로서 일반적으로 기술될 수 있는 소위 "보존적" 아미노산 치환을 고려할 수 있다. 이러한 보존적 아미노산 치환은 당업계, 예를 들면, WO 04/037999, GB-A-2 357 768, WO 98/49185, WO 00/46383 및 WO 01/09300에 익히 공지되어 있으며, 이러한 치환의 (바람직한) 유형 및/또는 조합은 WO 04/037999 및 WO 98/49185 및 상기 문헌에 인용된 추가 참조문헌의 적절한 교시를 근거로 하여 선택할 수 있다.
이러한 보존적 치환은 바람직하게는 다음 그룹 (a) 내지 (e) 내의 하나의 아미노산이 동일한 그룹 내의 다른 아미노산 잔기로 치환되는 치환이다: (a) 소형 지방족, 비극성 또는 다소 극성인 잔기: Ala, Ser, Thr, Pro 및 Gly; (b) 극성, 음하전된 잔기 및 이의 (비하전) 아미드: Asp, Asn, Glu 및 G1n; (c) 극성, 양하전된 잔기: His, Arg 및 Lys; (d) 거대 지방족, 비극성 잔기: Met, Leu, Ile, Val 및 Cys; 및 (e) 방향족 잔기: Phe, Tyr 및 Trp.
특히 바람직한 보존적 치환은 다음과 같다: Ala에서 Gly 또는 Ser로의 치환; Arg에서 Lys로의 치환; Asn에서 Gln 또는 His로의 치환; Asp에서 Glu로의 치환; Cys에서 Ser로의 치환; Gln에서 Asn로의 치환; Glu에서 Asp로의 치환; Gly에서 Ala 또는 Pro로의 치환; His에서 Asn 또는 Gln로의 치환; Ile에서 Leu 또는 Val로의 치환; Leu에서 Ile 또는 Val로의 치환; Lys에서 Arg, Gln 또는 Glu로의 치환; Met에서 Leu, Tyr 또는 Ile로의 치환; Phe에서 Met, Leu 또는 Tyr로의 치환; Ser에서 Thr로의 치환; Thr에서 Ser로의 치환; Trp에서 Tyr로의 치환; Tyr에서 Trp로의 치환; 및/또는 Phe에서 Val, Ile 또는 Leu로의 치환.
또한, 본원에 기술된 폴리펩타이드에 적용된 임의의 아미노산 치환은 문헌[참조: Schulz et al., Principles of 단백질 Structure, Springer-Verlag, 1978]에 의해 개발된 상이한 종의 상동성 단백질 간의 아미노산 변이의 빈도 분석, 문헌[참조: Chou and Fasman, Biochemistry 13: 211, 1974 and Adv. Enzymol., 47: 45-149, 1978]에 의해 개발된 구조 형성 잠재성의 분석 및 문헌[참조: Eisenberg et al., Proc. Nad. Acad Sci. USA 81: 140-144, 1984; Kyte & Doolittle; J Molec. Biol. 157: 105-132, 198 1, 및 Goldman et al., Ann. Rev. Biophys. Chem. 15: 321-353, 1986; 모두 전문이 본원에서 참조로 인용된다]에 의해 개발된 단백질에서의 소수성 패턴의 분석에 근거할 수 있다. 본원의 설명 및 상기 인용된 일반적 배경기술에 기재된 나노바디의 1차, 2차 및 3차 구조에 관한 정보. 또한, 이러한 목적을 위해, 라마로부터의 VHH 도메인의 결정 구조는 예를 들면, 문헌[참조: Desmyter et al., Nature Structural Biology, Vol. 3, 9, 803 (1996); Spinelli et al., Natural Structural Biology (1996); 3, 752-757; and Decanniere et al., Structure, Vol. 7, 4, 361 (1999)]에 의해 제공된다. 통상의 VH 도메인내에서 VH/VL 경계면을 형성하는 일부 아미노산 잔기 및 이들 위치상의 잠재적 카멜화(camelizing) 치환에 관한 추가 정보;
g) 아미노산 서열 및 핵산 서열은 이들이 이들의 전체 길이에 걸쳐서 100% 서열 동일성(본원에서 정의된 바와 같음)를 갖는 경우에 "정확히 동일"하다고 언급된다;
h) 두 아미노산 서열을 비교하는 경우, "아미노산 차이"란 용어는 제2 서열과 비교한 제1 서열의 위치에서의 단일 아미노산 잔기의 삽입, 결실 또는 치환을 의미하며, 두 아미노산 서열은 1개 또는 2개 이상의 이러한 아미노산 차이를 함유할 수 있는 것으로 이해된다;
i) 핵산 서열 또는 아미노산 서열은 예를 들면, 이것이 일반적으로 공급원 또는 배지 중에서 함께 결합되어 있는 다른 하나 이상의 성분, 예를 들면, 다른 핵산, 다른 단백질/폴리펩타이드, 다른 생물학적 성분 또는 거대분자 또는 하나 이상의 오염원, 불순물 또는 소량 성분으로부터 분리된 경우에, 이것이 수득되어진 천연의 생물학적 공급원 및/또는 반응 매질 또는 배양 배지와 비교하여, "본질적으로 분리된(본질적으로 분리된 형태인)" 것으로 고려된다. 특히, 핵산 서열 또는 아미노산 서열은 2배 이상, 특히 10배 이상, 보다 특히 100배 이상 내지 1000배 이상까지 정제된 경우에 "본질적으로 분리된" 것으로 고려된다. "본질적으로 분리된 형태인" 핵산 서열 또는 아미노산 서열은 바람직하게는 적합한 크로마토그래피 기술, 예를 들면, 폴리아크릴아미드-겔 전기영동을 사용하여 측정한 바에 따라 본질적으로 균질하다;
j) 본원에서 사용되는 "도메인"이란 용어는 일반적으로 항체 쇄의 전체 영역, 특히 중쇄 항체의 전체 영역 또는 이러한 전체 영역으로 본질적으로 이루어진 폴리펩타이드를 의미한다. 일반적으로, 이러한 도메인은 예를 들면, 쉬트(sheet)로서 또는 이황화 결합에 의해 안정화된 펩타이드 루프(예를 들면, 3 또는 4개의 펩타이드 루프)를 포함할 것이다.
k) '항원 결정기'란 용어는 항원-결합 분자(예를 들면, 본 발명의 나노바디 또는 폴리펩타이드), 특히 이러한 분자의 항원-결합 부위에 의해 인식되는 항원상의 에피토프를 의미한다. "항원 결정기" 및 "에피토프"는 본원에서 상호교환적으로 사용될 수도 있다.
l) 특정 항원 결정기, 에피토프, 항원 또는 단백질(또는 이의 하나 이상의 부분, 단편 또는 에피토프)에 결합할 수 있고/있거나, 이에 대해 친화성을 갖고/갖거나, 이에 대해 특이성을 갖는 아미노산 서열(예를 들면, 본 발명의 나노바디, 항체, 폴리펩타이드, 또는 일반적으로 이의 항원 결합 단백질 또는 폴리펩타이드 또는 단편)은 상기 항원 결정기, 에피토프, 항원 또는 단백질에 "대한" 또는 "대해 지시된다"로 언급된다.
m) "특이성"은 특정 항원-결합 분자 또는 항원-결합 단백질(예를 들면, 본 발명의 나노바디 또는 폴리펩타이드)이 결합될 수 있는 상이한 유형의 항원 또는 항원 결정기의 수를 의미한다. 항원-결합 단백질의 특이성은 친화성(affinity) 및/또는 항원항체결합력(avidity)에 근거하여 측정할 수 있다. 항원과 항원-결합 단백질의 해리에 대한 평형상수(KD)로 표현되는 친화성은 항원 결정기와 항원-결합 단백질상의 항원-결합 부위 간의 결합 강도에 대한 척도이다: KD 값이 작을수록 항원 결정기와 항원-결합 분자 간의 결합 강도가 강하다(또는, 친화성은 친화성 상수(KA)로서 표현될 수 있으며, 이는 1/KD이다). 당업자에게 명백한 바와 같이(예를 들면, 본원의 추가 기술내용에 근거하여), 친화성은 공지된 방식으로, 관심대상의 특이적 항원에 따라서 측정할 수 있다. 항원항체결합력은 항원-결합 분자(예를 들면, 본 발명의 나노바디 또는 폴리펩타이드)와 적절한 항원 간의 결합 강도의 척도이다. 항원항체결합력은 항원 결정기와 항원-결합 분자상의 항원 결합 부위 간의 친화성 및 항원-결합 분자상에 존재하는 적절한 결합 부위의 수 둘다와 관련된다. 전형적으로, 항원-결합 단백질(예를 들면, 본 발명의 나노바디 및/또는 폴리펩타이드)은 10-5 내지 10-12 몰/리터 이하, 바람직하게는 10-7 내지 10-12 몰/리터 이하, 보다 바람직하게는 10-8 내지 10-12 몰/리터의 해리 상수(KD) 및/또는 107 M-1 이상, 바람직하게는 108 M-1 이상, 보다 바람직하게는 109 M-1 이상, 예를 들면, 1012 M-1 이상의 결합 친화성으로 결합할 것이다. 10-4 리터/mol 초과의 임의의 KD 값은 비특이적 결합을 나타내는 것으로 일반적으로 고려된다. 바람직하게는, 본 발명의 나노바디 또는 폴리펩타이드는 500nM 미만, 바람직하게는 200nM 미만, 보다 바람직하게는 10nM 미만, 예를 들면, 500pM 미만의 친화성으로 목적하는 항원에 결합할 것이다. 항원 또는 항원 결정기에 대한 항원-결합 단백질의 특이적 결합은 예를 들면, 스켓처드(Scatchard) 분석 및/또는 경쟁적 결합 검정(예: 방사선면역검정(RIA), 효소 면역검정(EIA) 및 샌드위치 경쟁 검정) 및 당업계에 공지된 이들의 상이한 변형법을 포함하는 공지된 임의의 적합한 방식으로 측정할 수 있다.
n) 본원에서 추가 기술되는 바와 같이, 나노바디의 아미노산 서열 및 구조는, 이로써 제한됨이 없이, 4개의 골격 영역 또는 "FR"으로 이루어지는 것으로 고려되며, 이 골격 영역은 당업계 및 본원에서 각각 "골격 영역 1" 또는 "FR1"; "골격 영역 2" 또는 "FR2"; "골격 영역 3" 또는 "FR3"; 및 "골격 영역 4" 또는 "FR4"로서 지칭되며, 골격 영역은 당업계에서 각각 "상보성 결정 영역 1" 또는 "CDR1"; "상보성 결정 영역 2" 또는 "CDR2"; 및 "상보성 결정 영역 3" 또는 "CDR3"으로 지칭되는 3개의 상보성 결정 영역 또는 "CDR"에 의해 차단된다.
o) 본원에서 추가 기술되는 바와 같이, 나노바디내의 아미노산 잔기의 총 수는 110 내지 120개일 수 있으며, 바람직하게는 112 내지 115개, 가장 바람직하게는 113개이다. 그러나, 나노바디의 부분, 단편, 유사체 또는 유도체(본원에서 추가 기술됨)는 이러한 부분, 단편, 유사체 또는 유도체가 본원에 개요된 추가 요건을 만족하고 또한 바람직하게는 본원에 기술된 목적에 적합한 한, 이의 길 및/또는 크기가 특별히 제한되지 않음이 주지되어야 한다.
p) 나노바디의 아미노산 잔기는 상기 언급한 리치만(Riechmann) 및 무일데르만스(Muyldermans)의 논문에서 카멜리드(Camelid)로부터의 VHH 도메인에 적용되는 바와 같이 카뱃(Kabat) 등[참조: "Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91]에 의해 제공된 VH 도메인에 대한 일반적 번호매김에 따라 번호가 매겨진다(예를 들면, 상기 참조문헌의 도 2를 참조). 이러한 번호매김에 따라, 나노바디의 FR1은 위치 1 내지 30의 아미노산 잔기를 포함하며, 나노바디의 CDR1은 위치 31 내지 36의 아미노산 잔기를 포함하고, 나노바디의 FR2는 위치 36 내지 49의 아미노산을 포함하며, 나노바디의 CDR2는 위치 50 내지 65의 아미노산 잔기를 포함하고, 나노바디의 FR3은 위치 66 내지 94의 아미노산 잔기를 포함하고, 나노바디의 CDR3은 위치 95 내지 102의 아미노산 잔기를 포함하고, 나노바디의 FR4는 위치 103 내지 113의 아미노산 잔기를 포함한다[이와 관련하여, VH 도메인 및 VHH 도메인에 대해 당업계에 널리 공지되어 있는 바와 같이, 각각의 CDR 내의 아미노산 잔기의 총 수는 다양할 수 있으며, 카뱃 번호매김으로 명시된 아미노산 잔기의 총 수에 상응하지 않을 수 있다(즉, 카뱃 번호매김에 따른 하나 이상의 위치는 실제 서열내에 위치하지 않을 수 있거나, 실제 서열은 카뱃 번호매김에 의해 허용되는 수보다 많은 아미노산 잔기를 함유할 수 있다). 이는 일반적으로 카뱃에 따른 번호매김이 실제 서열내 아미노산 잔기의 실제 번호매김에 상응할 수 있거나 상응하지 않을 수 있음을 의미한다. 그러나, 일반적으로, 카뱃 번호매김에 따라서, CDR내 아미노산 잔기의 수와 관계없이, 카뱃 번호매김에 따른 위치 36은 FR2의 개시부에 상응하고 그 반대일 수도 있고, 카뱃 번호매김에 따른 위치 66은 FR3의 개시부에 상응하고 그 반대일 수도 있으며, 카뱃 번호매김에 따른 위치 103은 FR4의 개시부에 상응하며 그 반대일 수도 있다].
카멜리드로부터의 VHH 도메인 및 나노바디에 유사한 방식으로 적용될 수도 있는, VH 도메인의 아미노산 잔기의 번호를 매기는 대안적 방법은 쵸티아(Chothia) 등에 의해 기술된 방법[참조: Nature 342, 877-883 (1989)], 소위 "AbM 정의" 및 소위 "접촉 정의"이다. 그러나, 본 명세서, 청구항 및 도면에서는, 달리 언급하지 않는 한, 리치만 및 무일데르만스에 의한 VHH 도메인에 적용되는 카뱃에 따른 번호매김에 따를 것이다;
q) 도면, 서열 목록 및 실시예는 오로지 본 발명을 추가로 예시하기 위해 제공되며, 본원에서 달리 명백히 명시하지 않는 한 어떠한 방식으로도 본 발명 및/또는 첨부된 청구의 범위를 제한하는 것으로 해석되거나 의도되지 않아야 한다.
중쇄 항체 및 이의 가변 영역에 관한 일반적 설명에 대해서는 특히, 배경기술에서 언급한 다음 문헌들을 참조한다: WO 94/04678, WO 95/04079 및 WO 96/34103 of the Vrije Universiteit Brussel; WO 94/25591, WO 99/37681, WO 00/40968, WO 00/43507, WO 00/65057, WO 01/40310, WO 01/44301, EP 1134231 및 WO 02/48193( Unilever); WO 97/49805, WO 01/21817, WO 03/035694, WO 03/054016 and WO 03/055527(Vlaams Instituut voor Biotechnologie (VIB)); WO 03/050531( Algonomics N.V. 및 출원인); WO 01/90190(National Research Council of Canada); WO 03/025020 (= EP 1 433 793)(Institute of Antibodies); 및 WO 04/041867, WO 04/041862, WO04/041865, WO 04/041863, WO 04/062551(출원인 및 출원인에 의한 추가의 공개 특허 출원); Hamers-Casterman et al., Nature 1993 June 3; 363 (6428): 446-8; Davies and Riechmann, FEBS Lett. 1994 Feb 21; 339(3): 285-90; Muyldermans et al., Protein Eng. 1994 Sep; 7(9): 1129-3; Davies and Riechmann, Biotechnology (NY) 1995 May; 13(5): 475-9; Gharoudi et al.,　 9th Forum of Applied Biotechnology, Med. Fac. Landbouw Univ. 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상기 참조문헌들에서 사용되는 용어에 따라서, 천연 발생 중쇄 항체에 존재하는 가변 도메인은 이를 통상의 4-쇄 항체에 존재하는 중쇄 가변 도메인(이는 하기에서 "VH 도메인"으로 언급될 것이다) 및 통상의 4-쇄 항체에 존재하는 경쇄 가변 도메인(이는 하기에서 "VL 도메인"으로 언급될 것이다)과 구별하기 위해 "VHH 도메인"으로도 언급될 것이다.
상기 기술한 종래 기술에서 언급한 바와 같이, VHH 도메인은 분리된 VHH 도메인(뿐만 아니라, 천연 발생 VHH 도메인과 구조적 특징 및 기능적 특성을 공유하는, 이에 기초한 나노바디) 및 단백질이 기능적 항원-결합 도메인 또는 단백질과 동일하게 사용상 매우 유리하게 만드는 수많은 고유한 구조적 특징과 기능적 특성을 갖고 있다. 특히, 이에 제한됨이 없이, VHH 도메인(이는 경쇄 가변 도메인의 부재하에 및 경쇄 가변 도메인과의 어떠한 상호작용 없이도 항원에 기능적으로 결합하도록 천연적으로 "설계"되었다) 및 나노바디는 1개의 비교적 작은 기능적 항원-결합 구조 단위, 도메인 또는 단백질로서 작용할 수 있다. 이는, 그 자체로는 일반적으로 단일 항원-결합 단백질 또는 도메인으로서의 실제적 적용에 적합하지 않고 기능적 항원-결합 단위(예를 들면, Fab 단편과 같은 통상의 항체 단편; VL 도메인에 공유 결합된 VH 도메인으로 이루어진 ScFv 단편에서와 같은)를 제공하기 위해서는 일부 형태 또는 다른 형태로 조합될 필요가 있는 통상의 4-쇄 항체의 VH 및 VL 도메인로부터 VHH 도메인을 구별짓는다.
이러한 고유한 특성 때문에, 단일 항원-결합 단백질 또는 항원-결합 도메인으로서(즉, 거대 단백질 또는 폴리펩타이드의 부분으로서)의 VHH 도메인 및 나노바디의 사용은 통상의 VH 및 VL 도메인, scFv 또는 통상의 항체 단편(예를 들면, Fab- 또는 F(ab')2-단편)의 사용보다 현저한 수많은 장점을 제공한다:
- 항원에 고 친화성 및 고 선택성으로 결합하기 위해 오직 단일 도메인만이 요구되므로, 2개의 개별적 도메인이 존재할 필요도 없을 뿐만 아니라 이러한 2개의 도메인이 올바른 공간적 입체형태 및 배위(즉, scFv를 사용한 경우와 같은 특별히 설계된 링커의 사용을 통해)로 존재할 필요도 없다;
- VHH 도메인 및 나노바디는 단일 유전자로부터 발현될 수 있으며 해독후 폴딩 및 변형을 요구하지 않는다;
- VHH 도메인 및 나노바디는 용이하게 다가 및 다중특이적 포맷(본원에서 추가 논의됨)으로 조작될 수 있다;
- VHH 도메인 및 나노바디는 매우 가용성이며 응집되는 경향이 없다(문헌[참조: Ward et al., Nature, Vol.341, 1989, p. 544]에 기술된 마우스 유래의 항원-결합 도메인을 사용한 경우와 같이);
- VHH 도메인 및 나노바디는 열, pH, 프로테아제 및 기타 변성제 또는 조건에 매우 안정하다[참조: Ewert et al, 상기];
- VHH 도메인 및 나노바디는 제조에 요구되는 규모에서도 제조가 용이하고 비교적 저렴하다. 예를 들면, VHH 도메인, 나노바디 및 이를 함유하는 단백질/폴리펩타이드는 미생물 발효(예를 들어, 하기에서 추가로 기술됨)을 사용하여 제조할 수 있으며 통상의 항체 단편을 사용한 경우와 같은 포유동물 발현 시스템의 사용을 요구하지 않는다;
- VHH 도메인 및 나노바디는 통상의 4-쇄 항체 및 이의 항원-결합 단편에 비해서 비교적 작고(약15 kDa이거나, 통상의 IgG보다 10배 작다), 따라서 이러한 통상의 4-쇄 항체 및 이의 항원-결합 단편보다 높은 조직(고형 종양 및 다른 조밀 종양을 포함하나 이에 제한되지 않는다)내로의 투과성을 나타낸다;
- VHH 도메인 및 나노바디는 소위 강-결합 특성(특히, 통상의 VH 도메인과 비교하여 연장된 이의 CD3 루프로 인해서)을 나타낼 수 있고, 따라서 통상의 4-쇄 항체 및 이의 항원-결합 단편이 접근할 수 없는 표적 및 에피토프에 접근할 수 있다. 예를 들면, VHH 도메인 및 나노바디는 효소를 억제할 수 있는 것으로 나타났다[참조: WO 97/49805; Transue et al., (1998), supra; and Lauwereys et al., (1998), supra].
상기 언급한 바와 같이, 본 발명은 일반적으로 본원에서 기술하는 예방, 치료 및/또는 진단 목적용으로 사용될 수 있는, A-베타에 대해 지시된 나노바디 뿐만 아니라, 이러한 나노바디 하나 이상을 포함하거나 이로써 본질적으로 이루어진 폴리펩타이드에 관한 것이다.
본원에서 추가로 기술되는 바와 같이, 본 발명은 또한 이러한 나노바디 및 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 이러한 나노바디 및 폴리펩타이드의 제조방법, 이러한 나노바디 또는 폴리펩타이드를 발현하거나 발현할 수 있는 숙주 세포, 이러한 나노바디, 폴리펩타이드, 핵산 또는 숙주 세포를 포함하는 조성물, 이러한 나노바디, 폴리펩타이드, 핵산, 숙주 세포 또는 조성물의 용도에 관한 것이다.
일반적으로, 본원에서 사용되는 나노바디란 용어는 이의 가장 광의적 의미에서 특정 생물학적 공급원 또는 특정 제조방법으로 제한되지 않는다. 예를 들면, 하기에서 보다 상세히 논의되는 바와 같이, 본 발명의 나노바디는 일반적으로 (1) 천연 발생 중쇄 항체의 VHH 도메인에 의해; (2) 천연 발생 VHH 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 발현에 의해; (3) 천연 발생 VHH 도메인의 사람화(본원에서 기술하는 바와 같음)에 의해 또는 이러한 사람화된 VHH 도메인을 암호화하는 핵산의 발현에 의해; (4) 임의의 동물 종, 특히 포유동물의 종, 예를 들면, 사람으로부터 천연 발생 VHH 도메인의 "카멜화"(본원에서 기술하는 바와 같음)에 의해 또는 카멜화된 VH 도메인을 암호화하는 핵산의 발현에 의해; (5) 워드 등(상기)에 의해 기술된 "도메인 항체" 또는 "Dab"의 카멜화에 의해 또는 이러한 카멜화된 VH 도메인을 암호화하는 핵산의 발현에 의해; (6) 단백질, 폴리펩타이드 또는 기타 공지된 아미노산 서열의 제조용 합성 또는 반합성 기술의 사용에 의해; (7) 공지된 핵산 합성용 기술을 사용한 나노바디를 암호화하는 핵산의 제조에 이어서 이렇게 수득된 핵산의 발현에 의해; 및/또는 (8) 상기한 것들 중 하나 이상의 임의의 조합에 의해 수득할 수 있다. 상기한 것들을 실시하기에 적합한 방법 및 기술은 본원의 개시내용에 근거하여 당업자에게 명백할 것이며 예를 들면, 본원에서 보다 상세히 기술하는 방법 및 기술을 포함한다.
한가지 바람직한 나노바디 부류는 A-베타에 대해 지시된 천연 발생 중쇄 항체의 VHH 도메인에 상응한다. 본원에서 추가 기술되는 바와 같이, 이러한 VHH 서열은 일반적으로 카멜리드의 종을 A-베타로 적합하게 면역화시키고(즉, A-베타에 대해 지시된 면역반응 및/또는 중쇄 항체를 발생시키도록), 상기 카멜리드로부터 적합한 생물학적 샘플(예를 들면, 혈액 샘플, 혈청 샘플 또는 B-세포 샘플)을 수득하고, 상기 샘플로부터 출발하여 임의의 적합한 공지된 기술을 사용하여 A-베타에 대해 지시된 VHH 서열을 생성시킴으로써 생성시키거나 수득할 수 있다. 이러한 기술들은 당업자에게 명백할 것이고/이거나 본원에서 추가 기술된다.
대안으로, 이러한 A-베타에 대한 천연 발생 VHH 도메인은 예를 들면, 하나 이상의 공지된 스크리닝 기술을 사용하여 A-베타 또는 이의 하나 이상의 부분, 단편, 항원 결정기 또는 에피토프를 사용하여 카멜리드 VHH 서열의 천연 라이브러리를 스크리닝함으로써 이러한 라이브러리로부터 수득할 수 있다. 이러한 라이브러리 및 기술은 예를 들면, WO 99/37681, WO 01/90190, WO 03/025020 및 WO 03/035694에 기재되어 있다. 대안으로, 천연 VHH 라이브러리 유래의 개선된 합성 또는 반합성 라이브러리를 사용할 수 있으며, 예로는 예를 들면 WO 00/43507에 기술된 랜덤 돌연변이유발 및/또는 CDR 셔플링(shuffling)과 같은 기술에 의해 천연 VHH 라이브러리로부터 수득된 VHH 라이브러리가 있다.
A-베타에 대해 지시된 VHH 서열을 수득하기 위한 또 다른 기술은 유전자전이된 포유동물을 적합하게 면역화시키고(즉, A-베타에 대해 지시된 면역반응 및/또는 중쇄 항체를 발생시키도록), 유전자전이된 동물로부터 적합한 생물학적 샘플(예를 들면, 혈액 샘플, 혈청 샘플 또는 B-세포 샘플)을 수득하고, 상기 샘플로부터 출발하여, 임의의 적합한 공지된 기술을 사용하여 A-베타에 대해 지시된 VHH 서열을 생성시킴을 포함한다. 예를 들면, 이러한 목적을 위해 중쇄 항체-발현 마우스와 WO 02/085945 및 WO 04/049794에 기술된 추가의 방법 및 기술을 사용할 수 있다.
본 발명의 특히 바람직한 나노바디 부류는 천연 발생 VHH 도메인의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖지만, 사람화된, 즉 상기 천연 발생 VHH 서열 (및 특히 골격 서열)의 아미노산 서열내 하나 이상의 아미노산 잔기가 사람의 통상의 4-쇄 항체로부터의 VH 도메인내의 상응하는 위치(들)에서 발생하는 하나 이상의 아미노산 잔기로 대체된 나노바디를 포함한다. 이는 예를 들면, 본원의 추가 기술 및 본원에서 인용된 사람화에 관한 종래 기술에 기초하여 당업자에게 명백한 공지된 방법을 사용하여 실시할 수 있다. 다시, 이러한 본 발명의 사람화 나노바디는 공지된 어떠한 적합한 방법(즉, 상기 (1) 내지 (8)하에 명시함)으로도 수득될 수 있고 따라서 출발 물질로서 천연 발생 VHH 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 사용하여 수득된 폴리펩타이드로 엄격하게 제한되지 않음이 주지되어야 한다.
본 발명의 또 다른 특히 바람직한 나노바디 부류는 천연 발생 VHH 도메인의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖지만, 카멜화된, 즉 통상의 4-쇄 항체로부터의 천연 발생 VH 도메인의 아미노산 서열내 하나 이상의 아미노산 잔기가 중쇄 항체의 VHH 도메인내의 상응하는 위치(들)에서 발생하는 하나 이상의 아미노산 잔기로 대체된 나노바디를 포함한다. 이는 예를 들면, 본원의 추가 기술에 기초하여 당업자에게 명백한 공지된 방법으로 실시할 수 있다. 이러한 "카멜화" 치환은 바람직하게는 VH-VL 경계면을 형성하고/하거나 VH-VL 경계면에 존재하는 아미노산 위치에 및/또는 본원에 정의된 소위 낙타과 지표 잔기[참조: WO 94/04678 및 Davies and Riechmann (1994 and 1996), 상기]에 삽입된다. 바람직하게는, 카멜화된 나놉다를 생성 또는 설계하기 위한 출발 물질 또는 출발점으로서 사용되는 VH 서열은 바람직하게는 포유동물로부터의 VH 서열, 보다 바람직하게는 사람으로부터의 VH 서열, 예를 들면, VH3 서열이다. 그러나, 이러한 본 발명의 카멜화된 나노바디는 공지된 어떠한 적합한 방법(즉, 상기 (1) 내지 (8)하에 명시함)으로도 수득될 수 있고 따라서 출발 물질로서 천연 발생 VH 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 사용하여 수득된 폴리펩타이드로 엄격하게 제한되지 않음이 주지되어야 한다.
예를 들면, 본원에서 추가 기술되는 바와 같이, 사람화 및 카멜화는 둘다, 각각 천연 발생 VHH 도메인 또는 VH 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 제공한 다음, 이러한 뉴클레오타이드 서열내의 하나 이상의 코돈을 공지된 방법으로 변화시켜 새로운 뉴클레오타이드 서열이 각각 본 발명의 "사람화" 또는 "카멜화" 나노바디를 암호화하도록 함으로써 실시할 수 있다. 대안으로, 각각 천연 발생 VHH 도메인 또는 VH 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 목적하는 본 발명의 사람화 또는 카멜화 나노바디의 아미노산 서열을 각각 설계한 다음, 공지된 펩타이드 합성 기술을 사용하여 신생(de novo) 합성할 수 있다. 또한, 각각 천연 발생 VHH 도메인 또는 VH 도메인의 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열에 기초하여, 목적하는 본 발명의 사람화 또는 카멜화 나노바디를 각각 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 설계한 다음, 공지된 핵산 합성 기술을 사용하여 신생 합성하고, 후에 이렇게 수득된 핵산을 공지된 방식으로 발현시켜 본 발명의 목적하는 나노바디를 제공할 수 있다.
천연 발생 VH 서열 또는 바람직하게는 VHH 서열에서 출발하여, 본 발명의 나노바디 및/또는 이를 암호화하는 핵산을 수득하기 위한 다른 적합한 방법 및 기술은당업자에게 명백할 것이며, 예를 들면, 하나 이상의 천연 발생 VH 서열(예를 들면, 하나 이상의 FR 서열 및/또는 CDR 서열), 하나 이상의 천연 발생 VHH 서열의 하나 이상의 부분(예를 들면, 하나 이상의 FR 서열 또는 CDR 서열) 및/또는 하나 이상의 합성 또는 반합성 서열을, 본 발명의 나노바디 또는 이를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 또는 핵산을 제공하도록 적합한 방식으로 조합함을 포함할 수 있다.
본 발명의 하나의 바람직하지만 비제한적 측면에 따라서, 나노바디는 이의 가장 광의적 의미에서
(a) 카뱃 번호매김에 따른 위치 108의 아미노산가 Q인, 3개의 상보성 결정 영역/서열에 의해 차단된 4개의 골격 영역/서열로 이루어진 아미노산 서열;
및/또는:
(b) 카뱃 번호매김에 따른 위치 45가 하전된 아미노산 (본원에서 정의된 바와 같음) 또는 시스테인 잔기이고 위치 44가 바람직하게는 E인, 3개의 상보성 결정 영역/서열에 의해 차단된 4개의 골격 영역/서열로 이루어진 아미노산 서열; 및/또는:
(c) 카뱃 번호매김에 따른 위치 103의 아미노산 잔기가 P, R 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 특히 R 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 3개의 상보성 결정 영역/서열에 의해 차단된 4개의 골격 영역/서열로 이루어진 아미노산 서열
을 포함하는 폴리펩타이드로서 일반적으로 정의될 수 있다.
따라서, 바람직하지만 비제한적 첫번째 측면에서, 본 발명의 나노바디는
FR1 내지 FR4가 각각 골격 영역 1 내지 4을 의미하고,
CDR1 내지 CDR3이 각각 상보성 결정 영역 1 내지 3을 의미하고,
(a) 카뱃 번호매김에 따른 위치 108의 아미노산이 Q이고/이거나;
(b) 카뱃 번호매김에 따른 위치 45가 하전된 아미노산 또는 시스테인 잔기이고 카뱃 번호매김에 따른 위치 44의 아미노산 잔기가 바람직하게는E이고/이거나;
(c) 카뱃 번호매김에 따른 위치 103의 아미노산 잔기가 P, R 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 특히 R 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
(d) CDR1, CDR2 및 CDR3이 본원에서 정의되는 바와 같고, 바람직하게는 본원의 바람직한 양태 중 하나에 따라 정의되고, 보다 바람직하게는 본원의 보다 바람직한 양태 중 하나에 따라 정의되는 FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4의 구조를 가질 수 있다.
특히, 나노바디는 이의 가장 광의적 의미에서
(a) 카뱃 번호매김에 따른 위치 108의 아미노산가 Q인, 3개의 상보성 결정 영역/서열에 의해 차단된 4개의 골격 영역/서열로 이루어진 아미노산 서열;
및/또는:
(b) 카뱃 번호매김에 따른 위치 44가 E이고, 카뱃 번호매김에 따른 위치 45가 R인, 3개의 상보성 결정 영역/서열에 의해 차단된 4개의 골격 영역/서열로 이루어진 아미노산 서열; 및/또는:
(c) 카뱃 번호매김에 따른 위치 103의 아미노산 잔기가 P, R 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 특히 R 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 3개의 상보성 결정 영역/서열에 의해 차단된 4개의 골격 영역/서열로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드로서 일반적으로 정의될 수 있다.
따라서, 바람직하지만 비제한적 측면에 따라서, 본 발명의 나노바디는
FR1 내지 FR4가 각각 골격 영역 1 내지 4을 의미하고,
CDR1 내지 CDR3이 각각 상보성 결정 영역 1 내지 3을 의미하고,
(e) 카뱃 번호매김에 따른 위치 108의 아미노산은 Q이고/이거나;
(f) 카뱃 번호매김에 따른 위치 44는 E이고, 카뱃 번호매김에 따른 위치 45의 아미노산 잔기는 바람직하게는 R이고/이거나;
(g) 카뱃 번호매김에 따른 위치 103의 아미노산 잔기는 P, R 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 특히 R 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
(h) CDR1, CDR2 및 CDR3은 본원에서 정의되는 바와 같고, 바람직하게는 본원의 바람직한 양태 중 하나에 따라 정의되고, 보다 바람직하게는 본원의 보다 바람직한 양태 중 하나에 따라 정의되는 FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4의 구조를 가질 수 있다.
특히, 본 발명에 따른 A-베타에 대한 나노바디는
FR1 내지 FR4가 각각 골격 영역 1 내지 4을 의미하고,
CDR1 내지 CDR3이 각각 상보성 결정 영역 1 내지 3을 의미하고,
(a) 카뱃 번호매김에 따른 위치 108의 아미노산은 Q이고/이거나;
(b) 카뱃 번호매김에 따른 위치 44는 E이고 카뱃 번호매김에 따른 위치 45의 아미노산 잔기는 R이고/이거나;
(c) 카뱃 번호매김에 따른 위치 103의 아미노산 잔기는 P, R 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 특히 R 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
(d) CDR1, CDR2 및 CDR3은 본원에서 정의되는 바와 같고, 바람직하게는 본원의 바람직한 양태 중 하나에 따라 정의되고, 보다 바람직하게는 본원의 보다 바람직한 양태 중 하나에 따라 정의되는 FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4의 구조를 가질 수 있다.
특히, 본 발명의 하나의 바람직하지만 비제한적 측면에 따라서, 나노바디는 일반적으로
(a-1) 카뱃 번호매김에 따른 위치 44의 아미노산 잔기는 A, G, E, D, G, Q, R, S 및 L로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 바람직하게는 G, E 및 Q로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
(a-2) 카뱃 번호매김에 따른 위치 45의 아미노산 잔기는 L, R 및 C로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 바람직하게는 L 및 R로 이루어진 그룹으로부터 선택되며;
(a-3) 카뱃 번호매김에 따른 위치 103의 아미노산 잔기는 W, R 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 바람직하게는 W 및 R로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 가장 바람직하게는 W이고;
(a-4) 카뱃 번호매김에 따른 위치 108의 아미노산 잔기는 Q이거나;
(b-1) 카뱃 번호매김에 따른 위치 44의 아미노산 잔기는 E 및 Q로 이루어진 그룹으로부터 선택되며;
(b-2) 카뱃 번호매김에 따른 위치 45의 아미노산 잔기 R이고;
(b-3) 카뱃 번호매김에 따른 위치 103의 아미노산 잔기는 W, R 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 바람직하게는 W이며;
(b-4) 카뱃 번호매김에 따른 위치 108의 아미노산 잔기는 Q 및 L로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 바람직하게는 Q이거나;
(c-1) 카뱃 번호매김에 따른 위치 44의 아미노산 잔기는 A, G, E, D, Q, R, S 및 L로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 바람직하게는 G, E 및 Q로 이루어진 그룹으로부터 선택되며;
(c-2) 카뱃 번호매김에 따른 위치 45의 아미노산 잔기는 L, R 및 C로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 바람직하게는 L 및 R로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
(c-3) 카뱃 번호매김에 따른 위치 103의 아미노산 잔기는 P, R 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 특히 R 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되며;
(c-4) 카뱃 번호매김에 따른 위치 108의 아미노산 잔기는 Q 및 L로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 바람직하게는 Q이고,
(d) CDR1, CDR2 및 CDR3이 본원에서 정의되는 바와 같고, 바람직하게는 본원의 바람직한 양태 중 하나에 따라 정의되고, 보다 바람직하게는 본원의 보다 바람직한 양태 중 하나에 따라 정의되는, 3개의 상보성 결정 영역/서열에 의해 차단된 4개의 골격 영역/서열로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드로서 정의될 수 있다.
따라서, 다른 바람직하지만 비제한적 측면에서, 본 발명의 나노바디는
FR1 내지 FR4가 각각 골격 영역 1 내지 4을 의미하고,
CDR1 내지 CDR3이 각각 상보성 결정 영역 1 내지 3을 의미하고,
(a) 카뱃 번호매김에 따른 위치 44의 아미노산 잔기가 A, G, E, D, G, Q, R, S 및 L로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 바람직하게는 G, E 및 Q로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
(b) 카뱃 번호매김에 따른 위치 45의 아미노산 잔기가 L, R 및 C로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 바람직하게는 L 및 R로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
(c) 카뱃 번호매김에 따른 위치 103의 아미노산 잔기가 W, R 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 바람직하게는 W 또는 R이고, 가장 바람직하게는 W이며;
(d) 카뱃 번호매김에 따른 위치 108의 아미노산 잔기가 Q이고;
(e) CDR1, CDR2 및 CDR3이 본원에서 정의되는 바와 같고, 바람직하게는 본원의 바람직한 양태 중 하나에 따라 정의되고, 보다 바람직하게는 본원의 보다 바람직한 양태 중 하나에 따라 정의되는 FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4의 구조를 가질 수 있다.
또 다른 바람직하지만 비제한적 측면에서, 본 발명의 나노바디는
FR1 내지 FR4가 각각 골격 영역 1 내지 4을 의미하고,
CDR1 내지 CDR3이 각각 상보성 결정 영역 1 내지 3을 의미하고,
(a) 카뱃 번호매김에 따른 위치 44의 아미노산 잔기는 E 및 Q로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
(b) 카뱃 번호매김에 따른 위치 45의 아미노산 잔기는 R이며;
(c) 카뱃 번호매김에 따른 위치 103의 아미노산 잔기는 W, R 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 바람직하게는 W이고;
(d) 카뱃 번호매김에 따른 위치 108의 아미노산 잔기는 Q이며;
(e) CDR1, CDR2 및 CDR3이 본원에서 정의되는 바와 같고, 바람직하게는 본원의 바람직한 양태 중 하나에 따라 정의되고, 보다 바람직하게는 본원의 보다 바람직한 양태 중 하나에 따라 정의되는 FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4의 구조를 가질 수 있다.
또 다른 바람직하지만 비제한적 측면에서, 본 발명의 나노바디는
FR1 내지 FR4가 각각 골격 영역 1 내지 4을 의미하고,
CDR1 내지 CDR3이 각각 상보성 결정 영역 1 내지 3을 의미하고,
(a) 카뱃 번호매김에 따른 위치 44의 아미노산 잔기가 A, G, E, D, Q, R, S 및 L로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 바람직하게는 G, E 및 Q로 이루어진 그룹으로부터 선택되며;
(b) 카뱃 번호매김에 따른 위치 45의 아미노산 잔기가 L, R 및 C로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 바람직하게는 L 및 R로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
(c) 카뱃 번호매김에 따른 위치 103의 아미노산 잔기가 P, R 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 특히 R 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되며;
(d) 카뱃 번호매김에 따른 위치 108의 아미노산 잔기가 Q 및 L로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 바람직하게는 Q이며;
(e) CDR1, CDR2 및 CDR3이 본원에서 정의되는 바와 같고, 바람직하게는 본원의 바람직한 양태 중 하나에 따라 정의되고, 보다 바람직하게는 본원의 보다 바람직한 양태 중 하나에 따라 정의되는 FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4의 구조를 가질 수 있다.
본 발명의 나노바디의 2가지 특히 바람직하지만 비제한적 그룹은
a) 카뱃 번호매김에 따른 위치 44 내지 47의 아미노산 잔기가 서열 GLEW(또는 본원에서 정의하는 바와 같은 GLEW-유사 서열)을 형성하고 위치 108의 아미노산 잔기가 Q이거나;
b) 카뱃 번호매김에 따른 위치 43 내지 46의 아미노산 잔기가 서열 KERE 또는 KQRE(또는 KERE-유사 서열)을 형성하고, 위치 108의 아미노산 잔기가 Q 또는 L이고, 바람직하게는 Q인, 상기 a)에 따르는; 상기 (a-1) 내지 (a-4)에 따르는; 상기 b)에 따르는; 상기 (b-1) 내지 (b-4)에 따르는; 상기 (c)에 따르는; 및/또는 상기 (c-1) 내지 (c-4)에 따르는 것이다.
따라서, 또 다른 바람직하지만 비제한적 측면에서, 본 발명의 나노바디는
FR1 내지 FR4가 각각 골격 영역 1 내지 4을 의미하고,
CDR1 내지 CDR3이 각각 상보성 결정 영역 1 내지 3을 의미하고,
(a) 카뱃 번호매김에 따른 위치 44 내지 47의 아미노산 잔기가 서열 GLEW(또는 본원에서 정의하는 바와 같은 GLEW-유사 서열)을 형성하고 위치 108의 아미노산 잔기가 Q이고;
(b) CDR1, CDR2 및 CDR3이 본원에서 정의되는 바와 같고, 바람직하게는 본원의 바람직한 양태 중 하나에 따라 정의되고, 보다 바람직하게는 본원의 보다 바람직한 양태 중 하나에 따라 정의되는 FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4의 구조를 가질 수 있다.
또 다른 바람직하지만 비제한적 측면에서, 본 발명의 나노바디는
FR1 내지 FR4가 각각 골격 영역 1 내지 4을 의미하고,
CDR1 내지 CDR3이 각각 상보성 결정 영역 1 내지 3을 의미하고,
(a) 카뱃 번호매김에 따른 위치 43 내지 46의 아미노산 잔기가 서열 KERE 또는 KQRE(또는 KERE-유사 서열)을 형성하고, 위치 108의 아미노산 잔기가 Q 또는 L이고, 바람직하게는 Q이고;
(b) CDR1, CDR2 및 CDR3이 본원에서 정의되는 바와 같고, 바람직하게는 본원의 바람직한 양태 중 하나에 따라 정의되고, 보다 바람직하게는 본원의 보다 바람직한 양태 중 하나에 따라 정의되는 FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4의 구조를 가질 수 있다.
본 발명의 나노바디에서, 카뱃 번호매김에 따른 위치 43 내지 46의 아미노산 잔기는 서열 KERE 또는 KQRE을 형성하고, 위치 37의 아미노산 잔기는 가장 바람직하게는 F이다. 본 발명의 나노바디에서, 카뱃 번호매김에 따른 위치 44 내지 47의 아미노산 잔기는 서열 GLEW을 형성하고, 위치 37의 아미노산 잔기는 Y, H, I, L, V 및 F로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 가장 바람직하게는 F이다.
따라서, 어떠한 방식으로도 제한됨이 없이, 상기 언급한 위치에 존재하는 아미노산 잔기에 기초하여, 본 발명의 나노바디는 일반적으로 다음의 세 그룹에 기초하여 분류될 수 있다:
a) "GLEW-그룹": 카뱃 번호매김에 따른 위치 44 내지 47의 아미노산 서열 GLEW 및 카뱃 번호매김에 따른 위치 108의 Q를 갖는 나노바디. 본원에서 추가로 기술되는 바와 같이, 당해 그룹내의 나노바디는 통상적으로 위치 37에 V를 가지며, 위치 103에 W, P, R 또는 S를 가질 수 있으며, 바람직하게는 위치 103에 W를 갖는다. GLEW 그룹은 또한 하기 표 A-3에 언급된 바와 같은 일부 GLEW-유사 서열을 또한 포함한다;
b) "KERE-그룹": 카뱃 번호매김에 따른 위치 43 내지 46의 아미노산 서열 KERE 또는 KQRE 및 카뱃 번호매김에 따른 위치 108의 Q 또는 L을 갖는 나노바디. 본원에서 추가로 기술되는 바와 같이, 당해 그룹내의 나노바디는 통상적으로 위치 37에 F, 위치 47에 L 또는 F를 갖고, 위치 103에 W, P, R 또는 S를 가질 수 있으며바람직하게는 위치 103에 W를 갖는다;
c) "103 P, R, S-그룹": 위치 103에 P, R 또는 S를 갖는 나노바디. 이들 나노바디는 카뱃 번호매김에 따른 위치 44 내지 47에 아미노산 서열 GLEW를 가질 수 있거나 카뱃 번호매김에 따른 위치 43 내지 46에 아미노산 서열 KERE 또는 KQRE를 가질 수 있으며, 후자의 경우에 가장 바람직하게는 위치 37의 F 및 위치 47의 L 또는 F(KERE-그룹에 대해 정의한 바와 같음)를 함께 가지며; 카뱃 번호매김에 따른 위치 108에 Q 또는 L을 가질 수 있고 바람직하게는 Q를 갖는다.
따라서, 또 다른 바람직하지만 비제한적 측면에서, 본 발명의 나노바디는 CDR1, CDR2 및 CDR3이 본원에서 정의되는 바와 같고, 바람직하게는 본원의 바람직한 양태 중 하나에 따라 정의되고, 보다 바람직하게는 본원의 보다 바람직한 양태 중 하나에 따라 정의되는 GLEW-그룹(본원에서 정의된 바와 같음)에 속하는 나노바디일 수 있다.
또 다른 바람직하지만 비제한적 측면에서, 본 발명의 나노바디는 CDR1, CDR2 및 CDR3이 본원에서 정의되는 바와 같고, 바람직하게는 본원의 바람직한 양태 중 하나에 따라 정의되고, 보다 바람직하게는 본원의 보다 바람직한 양태 중 하나에 따라 정의되는 KERE-그룹(본원에서 정의된 바와 같음)에 속하는 나노바디일 수 있다.
따라서, 또 다른 바람직하지만 비제한적 측면에서, 본 발명의 나노바디는 CDR1, CDR2 및 CDR3이 본원에서 정의되는 바와 같고, 바람직하게는 본원의 바람직한 양태 중 하나에 따라 정의되고, 보다 바람직하게는 본원의 보다 바람직한 양태 중 하나에 따라 정의되는 103 P, R, S-그룹(본원에서 정의된 바와 같음)에 속하는 나노바디일 수 있다.
또한, 보다 일반적으로, 상기 언급한 108Q, 43E/44R 및 103P,R,S 잔기 이외에, 본 발명의 나노바디는 통상의 VH 도메인내에서 VH/VL 경계면(이의 부분)을 형성할 수 있는 하나 이상의 위치에, 상응하는 천연 발생 VH 서열내의 동일한 위치에서 천연적으로 발생하는 아미노산 잔기보다 고도로 하전된 하나 이상의 잔기, 특히 하나 이상의 하전된 아미노산 잔기(표 A-2에 언급한 바와 같음)를 함유할 수 있다. 이러한 치환에는 예를 들면, 위치 108의 Q와 함께 위치 44 내지 47의 KLEW를 갖는 나노바디를 수득하도록 하는, 하기 표 A-3에 언급한 GLEW-유사 서열 뿐만 아니라 소위 "마이크로바디(microbody)"에 대해 국제공보 제 WO 00/29004에 기술된 치환이 포함된다. 이러한 위치들에서의 다른 가능한 치환은 본원의 개시내용에 기초하여 당업자에게 명백할 것이다.
본 발명의 나노바디의 한 양태에서, 위치 83의 아미노산 잔기는 L, M, S, V 및 W로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 바람직하게는 L이다.
또한, 본 발명의 나노바디의 한 양태에서, 위치 83의 아미노산 잔기는 R, K, N, E, G, I, T 및 Q로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 가장 바람직하게는 K 또는 E(천연 발생 VHH 도메인에 상응하는 나노바디의 경우)이거 R(본원에서 기술하는 바와 같은 "사람화된" 나노바디의 경우)이다. 위치 84의 아미노산 잔기는 한 양태에서 P, A, R, S, D, T 및 V로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 가장 바람직하게는 P(천연 발생 VHH 도메인에 상응하는 나노바디의 경우) 또는 R(본원에서 기술하는 바와 같은 "사람화된" 나노바디의 경우)이다.
추가로, 본 발명의 나노바디의 한 양태에서, 위치 104의 아미노산 잔기는 G 및 D로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 가장 바람직하게는 G이다.
종합하면, 상기 언급한 바와 같은 나노바디내에 있는 위치 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 및 108의 아미노산 잔기도 또한 본원에서 "지표 잔기"로서 언급될 것이다. 지표 잔기 및 가장 밀접하게 관련된 VH 도메인, VH3의 상응하는 위치의 사람 아미노산 잔기는 표 A-3에 요약되어 있다.
천연 발생 VHH 도메인에서 발생하는 이들 지표 잔기의 일부 특히 바람직하지만 비제한적 조합은 표 A-4에 언급되어 있다. 비교를 위해, DP-47로 지칭되는 사람 VH3의 상응하는 아미노산 잔기는 이탤릭체로 표시되었다.
[표 A-2]
Figure 112007034854195-PCT00003
[표 A-3]
Figure 112007034854195-PCT00004
나노바디에서, 지표 잔기 이외의 임의의 위치의 각 아미노산 잔기는 천연 발생 VHH 도메인의 상응하는 위치(카뱃 번호매김에 따름)에서 천연적으로 발생하는 어떠한 아미노산 잔기라도 될 수 있다.
이러한 아미노산 잔기는 당업자에게 명백할 것이다. 표 A4 내지 A7에는 천연 발생 VHH 도메인의 FR1, FR2, FR3 및 FR4의 각 위치(카뱃 번호매김에 따름)에 존재할 수 있는 일부 비제한적 잔기가 기재되어 있다. 각 위치에 있어, 천연 발생 VHH 도메인의 각 위치에서 가장 빈번하게 발생하는(그리고 나노바디내의 상기 위치에 대해 가장 바람직한 아미노산 잔기인) 아미노산 잔기는 볼드체로 표시되어 있으며, 각 위치에 대한 다른 바람직한 아미노산 잔기는 밑줄로 표시되어 있다(주: 천연 발생 VHH 도메인의 위치 26-30는 이들 위치의 잔기들이 이미 CDR1의 일부분을 형성한다는 쵸티아 번호매김(상기)에 근거하는 가설을 뒷받침한다).
표 A4 내지 A7에는, 사람 VH3 도메인의 각 위치에 존재할 수 있는 몇몇 비제한적 잔기가 또한 기재되어 있다. 다시, 각 위치에 있어, 천연 발생 사람 VH3 도메인의 각 위치에서 가장 빈번하게 발생하는 아미노산 잔기는 볼드체로 표시되어 있으며, 다른 바람직한 아미노산 잔기는 밑줄로 표시되었다.
오직 참조용으로, 표 A-5는 또한 1118개 VHH 서열의 개별적 샘플에 대한 각 아미노산 위치에서의 엔트로피("VHH Ent.") 및 VHH 변이도("VHH Var.")에 관한 데이타를 포함한다(데이타는 친절하게 데이비드(David Lutje Hulsing) 및 위트레흐트 대학교의 테오(Theo Verrips) 교수에 의해 제공되었다). VHH 엔트로피 및 VHH 변이도의 값은 분석되는 1118개 VHH 서열 간의 아미노산 잔기의 변이도 및 보존 정도에 대한 척도를 제공한다: 낮은 값(즉 <1, 예를 들면, < 0.5)은 아미노산 잔기가 VHH 서열 간에 고도로 보존되어 있음(즉, 낮은 변이도)을 나타낸다. 예를 들면, 위치 8의 G 및 위치 9의 G는 각각 0.1 및 0의 VHH 엔트로피 값을 갖고, 이는 이들 잔기가 고도로 보존되고 매우 낮은 변이도(및 위치 9의 경우에 분석되는 모든 1118개 서열에서 G이다)를 가짐을 나타내는 반면에, CDR의 일부분을 형성하는 잔기에 있어 일반적으로 1.5 이상의 값이 발견된다(데이타는 제시하지 않음). (1) 표 A-5의 두번째 열에 기재된 아미노산 잔기는 마지막 2개의 열에서 언급된 VHH 엔트로피 및 VHH 변이도를 측정하기 위해 분석된 1118개 VHH 서열보다 큰 샘플에 기초하며, (2) 하기 제시된 데이타는 위치 27 내지 30 및 아마도 심지어 위치 93 및 94의 아미노산 잔기가 CDR의 일부분을 이미 형성한다는 가설(상기 언급한 바와 같이 본 발명이 임의의 특정 가설 또는 설명으로 제한되지 않는다 해도, 본원에서 카뱃에 따른 번호매김이 사용된다)을 뒷받침한다는 것이 주지된다. 서열 엔트로피, 서열 변이도 및 이들의 측정 방법에 관한 일반적 설명은 문헌[참조: Oliveira et al., PROTEINS: Structure, Function and Genetics, 52: 544-552 (2003)]을 참조한다.
[표 A-4a]
Figure 112007034854195-PCT00005
[표 A-4b]
Figure 112007034854195-PCT00006
[표 A-5]
Figure 112007034854195-PCT00007
[A-6a]
Figure 112007034854195-PCT00008
[표 A-6b]
Figure 112007034854195-PCT00009
[표 A-7]
Figure 112007034854195-PCT00010
따라서, 또 다른 바람직하지만 비제한적 측면에서, 본 발명의 나노바디는
FR1 내지 FR4가 각각 골격 영역 1 내지 4을 의미하고,
CDR1 내지 CDR3이 각각 상보성 결정 영역 1 내지 3을 의미하고,
(a) 지표 잔기가 본원에서 정의한 바와 같고,
(b) CDR1, CDR2 및 CDR3이 본원에서 정의되는 바와 같고, 바람직하게는 본원의 바람직한 양태 중 하나에 따라 정의되고, 보다 바람직하게는 본원의 보다 바람직한 양태 중 하나에 따라 정의되는 FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4의 구조를 가질 수 있다.
또 다른 바람직하지만 비제한적 측면에서, 본 발명의 나노바디는
FR1 내지 FR4가 각각 골격 영역 1 내지 4을 의미하고,
CDR1 내지 CDR3이 각각 상보성 결정 영역 1 내지 3을 의미하고,
(a) FR1이
아미노산 서열 [1] QVQLQESGGGXVQAGGSLRLSCAASG [26] [서열번호 1]로 이루어진 그룹 또는
상기 아미노산 서열과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성(본원에서 정의하는 바와 같음)을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 그룹[여기서, i) 지표 위치 이외의 임의의 위치에서의 임의의 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환(본원에서 정의하는 바와 같음) 및/또는 표 A-5에 정의된 아미노산 치환이고/이거나, ii) 상기 아미노산 서열은 바람직하게는, 상기 아미노산 서열(들)과 비교하여 오직 아미노산 치환만을 함유하고 아미노산 결실 또는 삽입을 함유하지 않는다] 및/또는
상기 아미노산 서열들 중 하나와 3, 2 또는 오직 1개의 "아미노산 차이(들)"을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 그룹[여기서, i) 지표 위치 이외의 임의의 위치에서의 임의의 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환(본원에서 정의하는 바와 같음) 및/또는 표 A-5에 정의된 아미노산 치환이고/이거나, ii) 상기 아미노산 서열은 바람직하게는, 상기 아미노산 서열(들)과 비교하여 오직 아미노산 치환만을 함유하고 아미노산 결실 또는 삽입을 함유하지 않는다]으로부터 선택되고;
(b) FR2가
아미노산 서열 [36] WXRQAPGKXXEXVA [49] [서열번호 2]로 이루어진 그룹 또는
상기 아미노산 서열과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성(본원에서 정의하는 바와 같음)을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 그룹[여기서, i) 지표 위치 이외의 임의의 위치에서의 임의의 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환(본원에서 정의하는 바와 같음) 및/또는 표 A-6에 정의된 아미노산 치환이고/이거나, ii) 상기 아미노산 서열은 바람직하게는, 상기 아미노산 서열(들)과 비교하여 오직 아미노산 치환만을 함유하고 아미노산 결실 또는 삽입을 함유하지 않는다] 및/또는
상기 아미노산 서열들 중 하나와 3, 2 또는 오직 1개의 "아미노산 차이(들)"을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 그룹[여기서, i) 지표 위치 이외의 임의의 위치에서의 임의의 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환(본원에서 정의하는 바와 같음) 및/또는 표 A-6에 정의된 아미노산 치환이고/이거나, ii) 상기 아미노산 서열은 바람직하게는, 상기 아미노산 서열(들)과 비교하여 오직 아미노산 치환만을 함유하고 아미노산 결실 또는 삽입을 함유하지 않는다]으로부터 선택되고;
(c) FR3이
아미노산 서열 [66] RFTISRDNAKNTVYLQMNSLXXEDTAVYYCAA [94] [서열번호 3]로 이루어진 그룹 또는
상기 아미노산 서열과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성(본원에서 정의하는 바와 같음)을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 그룹[여기서, i) 지표 위치 이외의 임의의 위치에서의 임의의 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환(본원에서 정의하는 바와 같음) 및/또는 표 A-7에 정의된 아미노산 치환이고/이거나, ii) 상기 아미노산 서열은 바람직하게는, 상기 아미노산 서열(들)과 비교하여 오직 아미노산 치환만을 함유하고 아미노산 결실 또는 삽입을 함유하지 않는다] 및/또는
상기 아미노산 서열들 중 하나와 3, 2 또는 오직 1개의 "아미노산 차이(들)"을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 그룹[여기서, i) 지표 위치 이외의 임의의 위치에서의 임의의 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환(본원에서 정의하는 바와 같음) 및/또는 표 A-7에 정의된 아미노산 치환이고/이거나, ii) 상기 아미노산 서열은 바람직하게는, 상기 아미노산 서열(들)과 비교하여 오직 아미노산 치환만을 함유하고 아미노산 결실 또는 삽입을 함유하지 않는다]으로부터 선택되고;
(d) FR4가
아미노산 서열 [103] XXQGTXVTVSS [113] [서열번호 4]로 이루어진 그룹 또는
상기 아미노산 서열과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성(본원에서 정의하는 바와 같음)을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 그룹[여기서, i) 지표 위치 이외의 임의의 위치에서의 임의의 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환(본원에서 정의하는 바와 같음) 및/또는 표 A-8에 정의된 아미노산 치환이고/이거나, ii) 상기 아미노산 서열은 바람직하게는, 상기 아미노산 서열(들)과 비교하여 오직 아미노산 치환만을 함유하고 아미노산 결실 또는 삽입을 함유하지 않는다] 및/또는
상기 아미노산 서열들 중 하나와 3, 2 또는 오직 1개의 "아미노산 차이(들)"을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 그룹[여기서, i) 지표 위치 이외의 임의의 위치에서의 임의의 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환(본원에서 정의하는 바와 같음) 및/또는 표 A-8에 정의된 아미노산 치환이고/이거나, ii) 상기 아미노산 서열은 바람직하게는, 상기 아미노산 서열(들)과 비교하여 오직 아미노산 치환만을 함유하고 아미노산 결실 또는 삽입을 함유하지 않는다]으로부터 선택되고;
(e) CDR1, CDR2 및 CDR3이 본원에서 정의되는 바와 같고, 바람직하게는 본원의 바람직한 양태 중 하나에 따라 정의되고, 보다 바람직하게는 본원의 보다 바람직한 양태 중 하나에 따라 정의되고;
지표 잔기가 "X"로 표시되고 상기 정의한 바와 같으며, 괄호([ ]) 안의 숫자가 카뱃 번호매김에 따른 아미노산 위치를 의미하는 FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4의 구조를 가질 수 있다.
또 다른 바람직하지만 비제한적인 측면에서, 본 발명의 나노바디는
FR1 내지 FR4가 각각 골격 영역 1 내지 4을 의미하고,
CDR1 내지 CDR3이 각각 상보성 결정 영역 1 내지 3을 의미하고,
(a) FR1이
아미노산 서열 [1] QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASG [26] [서열번호 5]로 이루어진 그룹 또는
상기 아미노산 서열과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성(본원에서 정의하는 바와 같음)을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 그룹[여기서, i) 지표 위치 이외의 임의의 위치에서의 임의의 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환(본원에서 정의하는 바와 같음) 및/또는 표 A-5에 정의된 아미노산 치환이고/이거나, ii) 상기 아미노산 서열은 바람직하게는, 상기 아미노산 서열(들)과 비교하여 오직 아미노산 치환만을 함유하고 아미노산 결실 또는 삽입을 함유하지 않고, iii) 위치의 지표 잔기는 상기 서열에 표시된 바와 같다] 및/또는
상기 아미노산 서열들 중 하나와 3, 2 또는 오직 1개의 "아미노산 차이(들)"을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 그룹[여기서, i) 지표 위치 이외의 임의의 위치에서의 임의의 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환(본원에서 정의하는 바와 같음) 및/또는 표 A-5에 정의된 아미노산 치환이고/이거나, ii) 상기 아미노산 서열은 바람직하게는, 상기 아미노산 서열(들)과 비교하여 오직 아미노산 치환만을 함유하고 아미노산 결실 또는 삽입을 함유하지 않고, iii) 위치의 지표 잔기는 상기 서열에 표시된 바와 같다]으로부터 선택되고;
(b) FR2가 아미노산 서열
[36] WFRQAPGKERELVA [49] [서열번호 6]
[36] WFRQAPGKEREFVA [49] [서열번호 7]
[36] WFRQAPGKEREGA [49] [서열번호 8]
[36] WFRQAPGKQRELVA [49] [서열번호 9]
[36] WFRQAPGKQREFVA [49] [서열번호 10] 및
[36] WYRQAPGKGLEWA [49] [서열번호 11]로 이루어진 그룹 또는
상기 아미노산 서열과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성(본원에서 정의하는 바와 같음)을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 그룹[여기서, i) 지표 위치 이외의 임의의 위치에서의 임의의 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환(본원에서 정의하는 바와 같음) 및/또는 표 A-6에 정의된 아미노산 치환이고/이거나, ii) 상기 아미노산 서열은 바람직하게는, 상기 아미노산 서열(들)과 비교하여 오직 아미노산 치환만을 함유하고 아미노산 결실 또는 삽입을 함유하지 않고, iii) 위치 37, 44, 45 및 47의 지표 잔기는 상기 서열 각각에 표시된 바와 같다] 및/또는
상기 아미노산 서열들 중 하나와 3, 2 또는 오직 1개의 "아미노산 차이(들)"을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 그룹[여기서, i) 지표 위치 이외의 임의의 위치에서의 임의의 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환(본원에서 정의하는 바와 같음) 및/또는 표 A-6에 정의된 아미노산 치환이고/이거나, ii) 상기 아미노산 서열은 바람직하게는, 상기 아미노산 서열(들)과 비교하여 오직 아미노산 치환만을 함유하고 아미노산 결실 또는 삽입을 함유하지 않고, iii) 위치 37, 44, 45 및 47의 지표 잔기는 상기 서열 각각에 표시된 바와 같다]으로부터 선택되고;
(c) FR3이
아미노산 서열 [66] RFTISRDNAKNTVYLQMNSLXXEDTAVYYCAA [94] [서열번호 12]로 이루어진 그룹 또는
상기 아미노산 서열과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성(본원에서 정의하는 바와 같음)을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 그룹[여기서, i) 지표 위치 이외의 임의의 위치에서의 임의의 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환(본원에서 정의하는 바와 같음) 및/또는 표 A-7에 정의된 아미노산 치환이고/이거나, ii) 상기 아미노산 서열은 바람직하게는, 상기 아미노산 서열(들)과 비교하여 오직 아미노산 치환만을 함유하고 아미노산 결실 또는 삽입을 함유하지 않고, iii) 위치 83 및 84의 지표 잔기는 상기 서열 각각에 표시된 바와 같다] 및/또는
상기 아미노산 서열들 중 하나와 3, 2 또는 오직 1개의 "아미노산 차이(들)"을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 그룹[여기서, i) 지표 위치 이외의 임의의 위치에서의 임의의 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환(본원에서 정의하는 바와 같음) 및/또는 표 A-7에 정의된 아미노산 치환이고/이거나, ii) 상기 아미노산 서열은 바람직하게는, 상기 아미노산 서열(들)과 비교하여 오직 아미노산 치환만을 함유하고 아미노산 결실 또는 삽입을 함유하지 않고, iii) 위치 83 및 84의 지표 잔기는 상기 서열 각각에 표시된 바와 같다]으로부터 선택되고;
(d) FR4가 아미노산 서열
[103] WGQGTQVTVSS [113] [서열번호 13] 및
[103] WGQGTLVTVSS [113] [서열번호 14]로 이루어진 그룹 또는
상기 아미노산 서열과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성(본원에서 정의하는 바와 같음)을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 그룹[여기서, i) 지표 위치 이외의 임의의 위치에서의 임의의 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환(본원에서 정의하는 바와 같음) 및/또는 표 A-8에 정의된 아미노산 치환이고/이거나, ii) 상기 아미노산 서열은 바람직하게는, 상기 아미노산 서열(들)과 비교하여 오직 아미노산 치환만을 함유하고 아미노산 결실 또는 삽입을 함유하지 않고, iii) 위치 103, 104 및 108의 지표 잔기는 상기 서열 각각에 표시된 바와 같다] 및/또는
상기 아미노산 서열들 중 하나와 3, 2 또는 오직 1개의 "아미노산 차이(들)"을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 그룹[여기서, i) 지표 위치 이외의 임의의 위치에서의 임의의 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환(본원에서 정의하는 바와 같음) 및/또는 표 A-8에 정의된 아미노산 치환이고/이거나, ii) 상기 아미노산 서열은 바람직하게는, 상기 아미노산 서열(들)과 비교하여 오직 아미노산 치환만을 함유하고 아미노산 결실 또는 삽입을 함유하지 않고, iii) 위치 103, 104 및 108의 지표 잔기는 상기 서열 각각에 표시된 바와 같다]으로부터 선택되고;
(e) CDR1, CDR2 및 CDR3이 본원에서 정의되는 바와 같고, 바람직하게는 본원의 바람직한 양태 중 하나에 따라 정의되고, 보다 바람직하게는 본원의 보다 바람직한 양태 중 하나에 따라 정의된 바와 같은 구조 FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4를 가질 수 있다.
또 다른 바람직하지만 비제한적인 측면에서, 본 발명의 나노바디는
FR1 내지 FR4가 각각 골격 영역 1 내지 4을 의미하고,
CDR1 내지 CDR3이 각각 상보성 결정 영역 1 내지 3을 의미하고,
(a) FR1이
아미노산 서열 [1] QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASG [26] [서열번호 5]로 이루어진 그룹 및/또는
상기 아미노산 서열들 중 하나와 3, 2 또는 오직 1개의 "아미노산 차이(들)"을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 그룹[여기서, i) 지표 위치 이외의 임의의 위치에서의 임의의 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환(본원에서 정의하는 바와 같음) 및/또는 표 A-5에 정의된 아미노산 치환이고/이거나, ii) 상기 아미노산 서열은 바람직하게는, 상기 아미노산 서열(들)과 비교하여 오직 아미노산 치환만을 함유하고 아미노산 결실 또는 삽입을 함유하지 않고, iii) 위치의 지표 잔기는 상기 서열내에 표시된 바와 같다]으로부터 선택되고;
(b) FR2가 아미노산 서열
[36] WFRQAPGKERELVA [49] [서열번호 6]
[36] WFRQAPGKEREFVA [49] [서열번호 7]
[36] WFRQAPGKEREGA [49] [서열번호 8]
[36] WFRQAPGKQRELVA [49] [서열번호 9] 및
[36] WFRQAPGKQREFVA [49] [서열번호 10]로 이루어진 그룹 및/또는
상기 아미노산 서열들 중 하나와 2 또는 오직 1개의 "아미노산 차이(들)"을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 그룹[여기서, i) 지표 위치 이외의 임의의 위치에서의 임의의 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환(본원에서 정의하는 바와 같음) 및/또는 표 A-6에 정의된 아미노산 치환이고/이거나, ii) 상기 아미노산 서열은 바람직하게는, 상기 아미노산 서열(들)과 비교하여 오직 아미노산 치환만을 함유하고 아미노산 결실 또는 삽입을 함유하지 않고, iii) 위치 37, 44, 45 및 47의 지표 잔기는 상기 서열 각각에 표시된 바와 같다]으로부터 선택되고;
(c) FR3이
아미노산 서열 [66] RFTISRDNAKNTVYLQMNSLXXEDTAVYYCAA [94] [서열번호 12]로 이루어진 그룹 및/또는
상기 아미노산 서열들 중 하나와 3, 2 또는 오직 1개의 "아미노산 차이(들)"을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 그룹[여기서, i) 지표 위치 이외의 임의의 위치에서의 임의의 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환(본원에서 정의하는 바와 같음) 및/또는 표 A-7에 정의된 아미노산 치환이고/이거나, ii) 상기 아미노산 서열은 바람직하게는, 상기 아미노산 서열(들)과 비교하여 오직 아미노산 치환만을 함유하고 아미노산 결실 또는 삽입을 함유하지 않고, iii) 위치 83 및 84의 지표 잔기는 상기 서열 각각에 표시된 바와 같다]으로부터 선택되고;
(d) FR4가 아미노산 서열
[103] WGQGTQVTVSS [113] [서열번호 13] 및
[103] WGQGTLVTVSS [113] [서열번호 14]로 이루어진 그룹 및/또는
상기 아미노산 서열들 중 하나와 3, 2 또는 오직 1개의 "아미노산 차이(들)"을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 그룹[여기서, i) 지표 위치 이외의 임의의 위치에서의 임의의 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환(본원에서 정의하는 바와 같음) 및/또는 표 A-7에 정의된 아미노산 치환이고/이거나, ii) 상기 아미노산 서열은 바람직하게는, 상기 아미노산 서열(들)과 비교하여 오직 아미노산 치환만을 함유하고 아미노산 결실 또는 삽입을 함유하지 않고, iii) 위치 103, 104 및 108의 지표 잔기는 상기 서열 각각에 표시된 바와 같다]으로부터 선택되고;
(e) CDR1, CDR2 및 CDR3이 본원에서 정의되는 바와 같고, 바람직하게는 본원의 바람직한 양태 중 하나에 따라 정의되고, 보다 바람직하게는 본원의 보다 바람직한 양태 중 하나에 따라 정의된 바와 같은 구조 FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4를 가질 수 있다.
또 다른 바람직하지만 비제한적인 측면에서, 본 발명의 나노바디는
FR1 내지 FR4가 각각 골격 영역 1 내지 4을 의미하고,
CDR1 내지 CDR3이 각각 상보성 결정 영역 1 내지 3을 의미하고,
(a) FR1이
아미노산 서열 [1] QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASG [26] [서열번호 5]로 이루어진 그룹 및/또는
상기 아미노산 서열들 중 하나와 3, 2 또는 오직 1개의 "아미노산 차이(들)"을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 그룹[여기서, i) 지표 위치 이외의 임의의 위치에서의 임의의 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환(본원에서 정의하는 바와 같음) 및/또는 표 A-5에 정의된 아미노산 치환이고/이거나, ii) 상기 아미노산 서열은 바람직하게는, 상기 아미노산 서열(들)과 비교하여 오직 아미노산 치환만을 함유하고 아미노산 결실 또는 삽입을 함유하지 않고, iii) 위치의 지표 잔기는 상기 서열내에 표시된 바와 같다]으로부터 선택되고;
(b) FR2가
아미노산 서열 [36] WYRQAPGKGLEWA [49] [서열번호 11]로 이루어진 그룹 및/또는
상기 아미노산 서열들 중 하나와 2 또는 오직 1개의 "아미노산 차이(들)"을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 그룹[여기서, i) 지표 위치 이외의 임의의 위치에서의 임의의 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환(본원에서 정의하는 바와 같음) 및/또는 표 A-6에 정의된 아미노산 치환이고/이거나, ii) 상기 아미노산 서열은 바람직하게는, 상기 아미노산 서열(들)과 비교하여 오직 아미노산 치환만을 함유하고 아미노산 결실 또는 삽입을 함유하지 않고, iii) 위치 37, 44, 45 및 47의 지표 잔기는 상기 서열 각각에 표시된 바와 같다]으로부터 선택되고;
(c) FR3이
아미노산 서열 [66] RFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAA [94] [서열번호 12]로 이루어진 그룹 및/또는
상기 아미노산 서열들 중 하나와 3, 2 또는 오직 1개의 "아미노산 차이(들)"을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 그룹[여기서, i) 지표 위치 이외의 임의의 위치에서의 임의의 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환(본원에서 정의하는 바와 같음) 및/또는 표 A-7에 정의된 아미노산 치환이고/이거나, ii) 상기 아미노산 서열은 바람직하게는, 상기 아미노산 서열(들)과 비교하여 오직 아미노산 치환만을 함유하고 아미노산 결실 또는 삽입을 함유하지 않고, iii) 위치 83 및 84의 지표 잔기는 상기 서열 각각에 표시된 바와 같다]으로부터 선택되고;
(d) FR4가 아미노산 서열
[103] WGQGTQVTVSS [113] [서열번호 13]로 이루어진 그룹 및/또는
상기 아미노산 서열들 중 하나와 3, 2 또는 오직 1개의 "아미노산 차이(들)"(본원에 정의됨)을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 그룹[여기서, i) 지표 위치 이외의 임의의 위치에서의 임의의 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환(본원에서 정의하는 바와 같음) 및/또는 표 A-8에 정의된 아미노산 치환이고/이거나, ii) 상기 아미노산 서열은 바람직하게는, 상기 아미노산 서열(들)과 비교하여 오직 아미노산 치환만을 함유하고 아미노산 결실 또는 삽입을 함유하지 않고, iii) 위치 103, 104 및 108의 지표 잔기는 상기 서열 각각에 표시된 바와 같다]으로부터 선택되고;
(e) CDR1, CDR2 및 CDR3이 본원에서 정의되는 바와 같고, 바람직하게는 본원의 바람직한 양태 중 하나에 따라 정의되고, 보다 바람직하게는 본원의 보다 바람직한 양태 중 하나에 따라 정의된 바와 같은 구조 FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4를 가질 수 있다.
본 발명의 나노바디에 존재할 수 있는 일부 다른 골격 서열은 상기 언급한 유럽 특허 EP 656 946에서 찾아볼 수 있다(또한, 허여된 미국 등가 특허 제5,759,808호를 참조한다),
또 다른 바람직하지만 비제한적 측면에서, 본 발명의 나노바디는
FR1 내지 FR4가 각각 골격 영역 1 내지 4을 의미하고,
CDR1 내지 CDR3이 각각 상보성 결정 영역 1 내지 3을 의미하고,
(a) FR1이
서열번호 73 내지 105의 나노바디에 존재하는 FR1 서열로 이루어진 그룹 또는 서열번호 85 내지 105의 사람화된 나노바디에 존재하는 FR1 서열로 이루어진 그룹 또는
(b) 상기 FR1 서열 중 하나와 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성(본원에서 정의하는 바와 같음)을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 그룹[여기서, i) 지표 위치 이외의 임의의 위치에서의 임의의 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환(본원에서 정의하는 바와 같음) 및/또는 표 A-5에 정의된 아미노산 치환이고/이거나, ii) 상기 아미노산 서열은 바람직하게는, 상기 FR1 서열과 비교하여 오직 아미노산 치환만을 함유하고 아미노산 결실 또는 삽입을 함유하지 않고, iii) 위치의 지표 잔기는 상기 FR1 서열에 표시된 바와 같다] 및/또는
상기 FR1 서열 중 하나와 3, 2 또는 오직 1개의 "아미노산 차이(들)"을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 그룹[여기서, i) 지표 위치 이외의 임의의 위치에서의 임의의 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환(본원에서 정의하는 바와 같음) 및/또는 표 A-5에 정의된 아미노산 치환이고/이거나, ii) 상기 아미노산 서열은 바람직하게는, 상기 FR1 서열과 비교하여 오직 아미노산 치환만을 함유하고 아미노산 결실 또는 삽입을 함유하지 않고, iii) 위치의 지표 잔기는 상기 FR1 서열에 표시된 바와 같다]으로부터 선택되고;
(c) FR2가
서열번호 73 내지 105의 나노바디에 존재하는 FR2 서열로 이루어진 그룹 또는 서열번호 85 내지 105의 사람화된 나노바디에 존재하는 FR2 서열로 이루어진 그룹 또는
상기 FR2 서열 중 하나와 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성(본원에서 정의하는 바와 같음)을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 그룹[여기서, i) 지표 위치 이외의 임의의 위치에서의 임의의 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환(본원에서 정의하는 바와 같음) 및/또는 표 A-6에 정의된 아미노산 치환이고/이거나, ii) 상기 아미노산 서열은 바람직하게는, 상기 FR2 서열과 비교하여 오직 아미노산 치환만을 함유하고 아미노산 결실 또는 삽입을 함유하지 않고, iii) 위치 37, 44, 45 및 47의 지표 잔기는 상기 FR2 서열에 표시된 바와 같다] 및/또는
상기 FR2 서열 중 하나와 3, 2 또는 오직 1개의 "아미노산 차이(들)"을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 그룹[여기서, i) 지표 위치 이외의 임의의 위치에서의 임의의 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환(본원에서 정의하는 바와 같음) 및/또는 표 A-6에 정의된 아미노산 치환이고/이거나, ii) 상기 아미노산 서열은 바람직하게는, 상기 FR2 서열과 비교하여 오직 아미노산 치환만을 함유하고 아미노산 결실 또는 삽입을 함유하지 않고, iii) 위치 37, 44, 45 및 47의 지표 잔기는 상기 FR2 서열에 표시된 바와 같다]으로부터 선택되고;
(d) FR3이
서열번호 73 내지 105의 나노바디에 존재하는 FR3 서열로 이루어진 그룹 또는 서열번호 85 내지 105의 사람화된 나노바디에 존재하는 FR3 서열로 이루어진 그룹 또는
상기 FR3 서열 중 하나와 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성(본원에서 정의하는 바와 같음)을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 그룹[여기서, i) 지표 위치 이외의 임의의 위치에서의 임의의 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환(본원에서 정의하는 바와 같음) 및/또는 표 A-7에 정의된 아미노산 치환이고/이거나, ii) 상기 아미노산 서열은 바람직하게는, 상기 FR3 서열과 비교하여 오직 아미노산 치환만을 함유하고 아미노산 결실 또는 삽입을 함유하지 않고, iii) 위치 83 및 84의 지표 잔기는 상기 FR3 서열에 표시된 바와 같다] 및/또는
상기 FR3 서열 중 하나와 3, 2 또는 오직 1개의 "아미노산 차이(들)"을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 그룹[여기서, i) 지표 위치 이외의 임의의 위치에서의 임의의 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환(본원에서 정의하는 바와 같음) 및/또는 표 A-7에 정의된 아미노산 치환이고/이거나, ii) 상기 아미노산 서열은 바람직하게는, 상기 FR3 서열과 비교하여 오직 아미노산 치환만을 함유하고 아미노산 결실 또는 삽입을 함유하지 않고, iii) 위치 83 및 84의 지표 잔기는 상기 FR3 서열에 표시된 바와 같다]으로부터 선택되고;
(e) FR4가
서열번호 73 내지 105의 나노바디에 존재하는 FR4 서열로 이루어진 그룹 또는 서열번호 85 내지 105의 사람화된 나노바디에 존재하는 FR4 서열로 이루어진 그룹 또는
상기 FR4 서열 중 하나와 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성(본원에서 정의하는 바와 같음)을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 그룹[여기서, i) 지표 위치 이외의 임의의 위치에서의 임의의 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환(본원에서 정의하는 바와 같음) 및/또는 표 A-8에 정의된 아미노산 치환이고/이거나, ii) 상기 아미노산 서열은 바람직하게는, 상기 FR4 서열과 비교하여 오직 아미노산 치환만을 함유하고 아미노산 결실 또는 삽입을 함유하지 않고, iii) 위치 103, 104 및 108의 지표 잔기는 상기 FR4 서열에 표시된 바와 같다] 및/또는
상기 FR4 서열 중 하나와 3, 2 또는 오직 1개의 "아미노산 차이(들)"을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 그룹[여기서, i) 지표 위치 이외의 임의의 위치에서의 임의의 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환(본원에서 정의하는 바와 같음) 및/또는 표 A-8에 정의된 아미노산 치환이고/이거나, ii) 상기 아미노산 서열은 바람직하게는, 상기 FR4 서열과 비교하여 오직 아미노산 치환만을 함유하고 아미노산 결실 또는 삽입을 함유하지 않고, iii) 위치 103, 104 및 108의 지표 잔기는 상기 FR4 서열에 표시된 바와 같다]으로부터 선택되고;
(f) CDR1, CDR2 및 CDR3이 본원에서 정의되는 바와 같고, 바람직하게는 본원의 바람직한 양태 중 하나에 따라 정의되고, 보다 바람직하게는 본원의 보다 바람직한 양태 중 하나에 따라 정의된 바와 같은 구조 FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4를 가질 수 있다.
본 발명의 일부 특히 바람직한 나노바디는 서열번호 73 내지 105의 아미노산 서열, 특히 서열번호 85 내지 105의 사람화된 나노바디의 아미노산 서열로 이루어진 그룹 또는 서열번호 73 내지 105의 아미노산 서열(바람직하게는, 서열번호 85 내지 105의 아미노산 서열)과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성(본원에서 정의하는 바와 같음)을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있고, 여기서
i) 지표 잔기가 상기 표 A-3에 표시된 바와 같을 수 있고;
ii) 지표 위치 이외의 임의의 위치에서의 임의의 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환(본원에서 정의된 바와 같음) 및/또는 표 5 내지 8에 정의된 바와 같은 아미노산 치환이고/이거나;
iii) 상기 아미노산 서열은 바람직하게는 상기 아미노산 서열(들)과 비교하여 오직 아미노산 치환만을 함유하고 아미노산 결실 또는 삽입을 함유하지 않는다.
본 발명의 일부 보다 더욱 특히 바람직한 나노바디는 서열번호 73 내지 105의 아미노산 서열, 특히 서열번호 85 내지 105의 사람화된 나노바디내의 아미노산 서열로 이루어진 그룹 또는 서열번호 73 내지 105의 아미노산 서열(바람직하게는, 서열번호 85 내지 105의 아미노산 서열)과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성(본원에서 정의하는 바와 같음)을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있고, 여기서
(1) 지표 잔기는 서열번호 73 내지 105(및 바람직하게는 서열번호 85 내지 105)로부터 선택된 적절한 서열내에 표시된 바와 같고/같거나;
(2) 지표 위치 이외의 임의의 위치에서의 임의의 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환(본원에서 정의된 바와 같음) 및/또는 표 5 내지 8에 정의된 바와 같은 아미노산 치환이고/이거나;
(3) 상기 아미노산 서열은 바람직하게는 서열번호 73 내지 105(및 바람직하게는 서열번호 85 내지 105)로부터 선택된 적절한 서열과 비교하여 오직 아미노산 치환만을 함유하고 아미노산 결실 또는 삽입을 함유하지 않는다.
본 발명의 일부 가장 바람직한 나노바디는 서열번호 73 내지 105 및 서열번호 85 내지 105, 특히 서열번호 85 내지 105의 사람화된 나노바디의 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 나노바디내의 CDR 서열 및 FR 서열은 본 발명의 나노바디가 10-5 내지 10-12 몰/리터 이하, 바람직하게는 10-7 내지 10-12 몰/리터 이하, 보다 바람직하게는 10-8 내지 10-12 몰/리터 이하의 해리 상수(KD) 및/또는 107 M-1 이상, 바람직하게는 108 M-1 이상, 보다 바람직하게는 109 M-1 이상, 예를 들면, 1012 M-1 이상의 결합 친화성 및/또는 500 nM 미만, 바람직하게는 200 nM 미만, 보다 바람직하게는 10 nM 미만, 예를 들면, 500 pM 미만의 친화성으로 A-베타에 결합하도록 한다. A-베타에 대한 본 발명의 나노바디의 친화성은 공지된 방식으로, 예를 들면, 본원에 기술된 검정을 사용하여 측정할 수 있다.
본 발명의 하나의 비제한적 측면에 따라서, 나노바디는 본원에서 정의한 바와 같을 수 있지만, 단 천연 발생 사람 VH 도메인의 상응하는 골격 영역과 비교하여, 특히 DP-47의 상응하는 골격 영역과 비교하여 하나 이상의 골격 영역내에 적어도 "하나의 아미노산 차이"(본원에서 정의된 바와 같음)를 갖는다. 보다 구체적으로는, 본 발명의 하나의 비제한적 측면에 따라서, 나노바디는 본원에서 정의한 바와 같을 수 있지만, 단 천연 발생 사람 VH 도메인의 상응하는 골격 영역과 비교하여, 특히 DP-47의 상응하는 골격 영역과 비교하여, 하나 이상의 지표 잔기(위치 108, 103 및/또는 45의 잔기를 포함)에서의 적어도 "하나의 아미노산 차이"(본원에서 정의된 바와 같음)를 갖는다. 통상적으로, 나노바디는 FR2 및/또는 FR4 중 하나 이상 내에, 특히 FR2 및/또는 FR4 중 하나 이상 내의 하나 이상의 지표 잔기(위치 108, 103 및/또는 45의 잔기를 포함)에 천연 발생 VH 도메인과의 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 것이다.
또한, 사람화된 본 발명의 나노바디는 본원에서 정의한 바와 같을 수 있지만, 단 천연 발생 VHH 도메인의 상응하는 골격 영역과 비교하여, 하나 이상의 골격 영역내에 적어도 "하나의 아미노산 차이"(본원에서 정의된 바와 같음)를 갖는다. 보다 구체적으로는, 본 발명의 하나의 비제한적 측면에 따라서, 나노바디는 본원에서 정의한 바와 같을 수 있지만, 단 천연 발생 VHH 도메인의 상응하는 골격 영역과 비교하여, 하나 이상의 지표 잔기(위치 108, 103 및/또는 45의 잔기를 포함)에서의 적어도 "하나의 아미노산 차이"(본원에서 정의된 바와 같음)를 갖는다. 통상적으로, 나노바디는 FR2 및/또는 FR4 중 하나 이상 내에, 특히 FR2 및/또는 FR4 중 하나 이상 내의 하나 이상의 지표 잔기(위치 108, 103 및/또는 45의 잔기를 포함)에 천연 발생 VHH 도메인과의 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 것이다.
본 발명의 하나의 양태는 A-베타에 대해 지시된 하나 이상의 중쇄 항체 또는 이의 기능적 단편(이의 사람화된 기능적 단편을 포함)을 포함하는 폴리펩타이드이다.
본 발명의 다른 양태는 A-베타에 대해 지시된 하나 이상의 중쇄 항체 또는 이의 기능적 단편이 Nanobody™ 또는 이의 기능적 단편인 상기 정의한 바와 같은 폴리펩타이드이다.
본 발명의 또 다른 양태는 A-베타에 대해 지시된 하나 이상의 중쇄 항체 또는 이의 기능적 단편이 서열번호 73-105, 바람직하게는 서열번호 85 내지 105에 제시된 서열에 상응하는 상기 정의한 바와 같은 폴리펩타이드이다.
본 발명의 또 다른 양태는 A-베타에 대해 지시된 나노바디 또는 이의 기능적 단편의 수가 2개 이상인 상기 정의한 바와 같은 폴리펩타이드이다.
본 발명의 또 다른 양태는 생체내에서 당해 폴리펩타이드의 반감기를 향상시키도록 지시된 하나 이상의 중쇄 항체 또는 이의 기능적 단편을 추가로 포함하는 상기 정의한 바와 같은 폴리펩타이드이다.
본 발명의 또 다른 양태는 반감기를 향상시키도록 지시된 상기 중쇄 항체 또는 이의 기능적 단편이 혈청 단백질에 대해 지시된 중쇄 항체 또는 이의 기능적 단편인 상기 정의한 바와 같은 폴리펩타이드이다.
본 발명의 또 다른 양태는 하나 이상의 중쇄 항체 또는 이의 기능적 단편이 뇌 또는 체내 다른 부분으로부터 아밀로이드 플라크를 제거할 수 있는 상기 정의한 바와 같은 폴리펩타이드이다.
본 발명의 또 다른 양태는 하나 이상의 중쇄 항체 또는 이의 기능적 단편이 A-베타와 다른 A-베타 간의 상호작용을 억제할 수 있는 상기 정의한 바와 같은 폴리펩타이드이다.
본 발명의 또 다른 양태는 하나 이상의 중쇄 항체 또는 이의 기능적 단편의 하나 이상의 아미노산이 항원 결합 능력을 실질적으로 변경시키지 않으면서 치환된 상기 정의한 바와 같은 폴리펩타이드이다.
본 발명의 또 다른 양태는 하나 이상의 중쇄 항체 또는 나노바디가 전체길이 중쇄 항체 또는 나노바디의 상동 서열, 기능적 부분 또는 상동 서열의 기능적 부분인 상기 정의한 바와 같은 폴리펩타이드이다.
본 발명의 또 다른 양태는 하나 이상의 중쇄 항체 또는 이의 기능적 단편이 APP 및 APLP의 세크레타제 매개된 절단 또는 A-베타 절단 산물을 초래하는 임의의 다른 절단 후에 생성되거나 노출된 신생-에피토프에 결합할 수 있는 상기 정의한 바와 같은 폴리펩타이드이다.
본 발명의 또 다른 양태는 서열번호 117 내지 183 중 어느 하나에 제시된 서열에 상응하는 상기 정의한 바와 같은 폴리펩타이드이다.
본 발명의 또 다른 양태는 반감기를 향상시키도록 지시된 하나 이상의 중쇄 항체 또는 이의 기능적 단편이 페길화(pegylation)에 의해 변형되는 상기 정의한 바와 같은 폴리펩타이드이다.
본 발명의 또 다른 양태는 혈청 단백질에 대해 지시된 상기 중쇄 항체 또는 이의 기능적 단편이 나노바디 또는 이의 기능적 단편인 상기 정의한 바와 같은 폴리펩타이드이다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 혈청 단백질이 혈청 알부민, 혈청 면역글로불린, 티록신-결합 단백질, 트랜스페린 또는 피브리노겐 중 어느 하나인 상기 정의한 바와 같은 폴리펩타이드이다.
본 발명의 또 다른 양태는 혈청 단백질에 대해 지시된 상기 중쇄 항체 또는 이의 기능적 단편, 또는 나노바디 또는 이의 기능적 단편이 사람화된 상기 정의한 바와 같은 폴리펩타이드이다.
본 발명의 또 다른 양태는 혈청 단백질이 혈청 단백질의 단편인 상기 정의한 바와 같은 폴리펩타이드이다.
본 발명의 또 다른 양태는 단백질 tau에 대해 지시된 중쇄 항체 또는 이의 기능적 단편을 추가로 포함하는 상기 정의한 바와 같은 폴리펩타이드이다.
본 발명의 또 다른 양태는 단백질 tau에 대해 지시된 상기 중쇄 항체 또는 이의 기능적 단편이 나노바디인 상기 정의한 바와 같은 폴리펩타이드이다.
본 발명의 또 다른 양태는 단백질 tau에 대해 지시된 상기 중쇄 항체 또는 이의 이의 기능적 단편이 사람화되는 상기 정의한 바와 같은 폴리펩타이드이다.
본 발명의 또 다른 양태는 단백질 tau가 단백질 tau의 단편인 상기 정의한 바와 같은 폴리펩타이드이다.
본 발명의 또 다른 양태는 하나 이상의 링커 서열을 추가로 포함하는 상기 정의한 바와 같은 폴리펩타이드이다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 A-베타가 A-베타의 단편인 상기 정의한 바와 같은 폴리펩타이드이다.
본 발명의 또 다른 양태는 하나 이상의 중쇄 항체 또는 이의 기능적 단편이 아미노산 잔기가 실질적으로 항원 결합 능력을 변경시키지 않으면서 치환된 VH인 상기 정의한 바와 같은 폴리펩타이드이다.
본 발명의 또 다른 양태는 하나 이상의 중쇄 항체 또는 이의 기능적 단편이 하나 이상의 아미노산 잔기가 특이적 나노바디 서열 또는 아미노산 잔기로 치환된 VH인 상기 정의한 바와 같은 폴리펩타이드이다.
본 발명의 또 다른 양태는 하나 이상의 중쇄 항체 또는 이의 기능적 단편이 사람화된 상기 정의한 바와 같은 폴리펩타이드이다.
본 발명의 또 다른 양태는 하나 이상의 중쇄 항체 또는 이의 기능적 단편이 사람 골격 서열을 포함하는 상기 정의한 바와 같은 폴리펩타이드이다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 사람 골격 서열이 사람 배선(germline) 항체 유전자 절편에 의해 암호화된 골격 영역에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 상기 정의한 바와 같은 폴리펩타이드이다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 사람 골격 서열이 DP-29, DP-47 및 DP-51 중 어느 하나의 골격 영역의 어느 하나내에 포함되어 있는 상기 정의한 바와 같은 폴리펩타이드이다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 사람 골격 서열이 FR1, FR2 또는 FR3 중 하나 이상이고, 나머지 골격 영역이 중쇄 항체의 등가 FR1, FR2 및 FR3 골격으로부터 선택되는 상기 정의한 바와 같은 폴리펩타이드이다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 정의한 바와 같은 폴리펩타이드를 암호화할 수 있는 핵산이다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 정의한 바와 같은 폴리펩타이드 및/또는 핵산을 포함하는 조성물이다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 정의한 바와 같은 폴리펩타이드 및/또는 핵산 및 하나 이상의 항엉킴제(anti-tangle agent)를 포함하는, 피험체에게 동시, 개별적 또는 순차적 투여하기 위한 조성물이다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 항엉킴제가 상기 폴리펩타이드에 공유 또는 비공유 결합되는 상기 정의한 바와 같은 조성물이다.
본 발명의 또 다른 양태는 약제학적으로 허용되는 비히클을 추가로 포함하는 상기 정의한 바와 같은 조성물이다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 정의한 바와 같거나, 의약으로서 사용하기 위한 상기 정의한 바와 같은 핵산 또는 상기 정의한 바와 같은 조성물이다.
본 발명의 또 다른 양태는 아밀로이드 플라크 형성에 의해 매개되는 장애의 치료, 예방 및/또는 경감에서 사용하기 위한 상기 정의한 바와 같은 폴리펩타이드, 상기 정의한 바와 같은 핵산 또는 상기 정의한 바와 같은 조성물이다.
본 발명의 또 다른 양태는 아밀로이드 플라크 형성에 의해 매개되는 장애의 치료, 예방 및/또는 경감을 위한 상기 정의한 바와 같은 폴리펩타이드, 상기 정의한 바와 같은 핵산 또는 상기 정의한 바와 같은 조성물의 용도이다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 장애가 알쯔하이머병인 상기 정의한 바와 같은 폴리펩타이드, 핵산 또는 조성물 또는 이들의 용도이다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 폴리펩타이드가 정맥내, 피하, 경구, 설하, 비강 또는 흡입에 의해 투여되는 상기 정의한 바와 같은 폴리펩타이드, 핵산 또는 조성물 또는 상기 정의한 바와 같은 이들의 용도이다.
본 발명의 또 다른 양태는 환자에게 상기 정의한 조성물의 유효량을 투여함을 포함하는, 알쯔하이머병의 예방학적 또는 치료학적 처치 방법이다.
본 발명의 또 다른 양태는
a) 상기 정의한 폴리펩타이드를 암호화할 수 있는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 당해 폴리펩타이드가 발현될 수 있는 조건하에 배양하는 단계 및
b) 배양물로부터 생산된 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는, 상기 정의한 폴리펩타이드의 생산 방법이다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 숙주 세포가 세균 또는 효모인, 상기 정의된 방법이다. 본 발명의 또 다른 양태는
a) 샘플을 상기 정의된 폴리펩타이드와 접촉시키는 단계,
b) 상기 샘플에 대한 상기 폴리펩타이드의 결합을 검출하는 단계 및
c) 단계(b)에서 검출된 결합을 표준과 비교하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 샘플과 비교한 결합에서의 차이가 아밀로이드 플라크 형성을 특징으로 하는 질환 또는 장애의 진단지표가 되는, 아밀로이드 플라크 형성에 의해 매개되는 질환 또는 장애의 진단 방법이다.
본 발명의 또 다른 양태는
a) 샘플을 상기 정의된 폴리펩타이드와 접촉시키는 단계,
b) 상기 샘플에서 A-베타의 양을 측정하는 단계 및
c) 단계(b)에서 측정된 양을 표준과 비교하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 샘플과 비교한 양에서의 차이가 아밀로이드 플라크 형성을 특징으로 하는 질환 또는 장애의 진단지표가 되는, 아밀로이드 플라크 형성에 의해 매개되는 질환 또는 장애의 진단 방법이다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 정의된 방법에서 사용하기 위한 아밀로이드 플라크 형성에 의해 매개되는 질환 또는 장애 진단용 키트이다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 정의된 폴리펩타이드를 포함하는, 아밀로이드 플라크 형성에 의해 매개되는 질환 또는 장애 진단용 키트이다.
본 발명의 또 다른 양태는 하나 이상의 생체내 영상제(imaging agent)를 추가로 포함하는 폴리펩타이드이다.
본 발명은 아밀로이드-베타(A-베타)에 대해 지시된 하나 이상의 나노바디 또는 이의 단편을 포함하는 항-A-베타 폴리펩타이드에 관한 것이다. 본 발명자들은 이러한 폴리펩타이드가 신경퇴행성 질환 환자, 예를 들면, AD 환자의 뇌속의 아밀로이드 플라크 및/또는 신경원섬유 엉킴의 제거에 효과를 미친다는 것을 밝혀냈다.
본 발명은 명백히 본 발명의 항-A-베타 폴리펩타이드가 APP 유전자전이된 마우스에서 유익한 효과를 가짐을 보여준다.
본 발명의 폴리펩타이드가 효과를 미칠 수 있는 A-베타 관련 질환은 침습성 신경 침착과 관련된 퇴행성 신경 질환이다.
본 발명의 한 양태는 뇌 또는 체내 다른 부분으로부터 아밀로이드 플라크를 제거할 수 있는 하나 이상의 나노바디를 포함하는 폴리펩타이드에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는 A-베타와 다른 A-베타 또는 A-베타의 단편 간의 상호작용을 억제할 수 있는 하나 이상의 나노바디를 포함하는 폴리펩타이드에 관한 것이다.
본 발명의 한 측면에 따라서, 본 발명의 폴리펩타이드는 침습성 신경 침착과 관련된 퇴행성 질환의 증상을 치료 또는 경감시키는데 사용될 수 있다.
본 발명의 한 측면에 따라서, 본 발명의 폴리펩타이드는 침습성 신경 침착과 관련된 퇴행성 질환을 예방하는데, 즉 예방적 용도로 사용될 수 있다. 이러한 용도는 환자가 예를 들면, 조기 발병 가족성 AD에 걸릴 위험이 높은 경우에 적용될 수 있다.
이들 신경 질환 및 다른 관련된 비-신경 질환에는 성인 다운 증후군, 알쯔하이머병, 근육위축성 측삭경화증/파킨슨병 치매 복합증, 아밀로이드 다발신경병증, 아밀로이드 심근병증, 투석 환자에서의 아밀로이드, 베타2-마이크로글로불린, 근육 소모성 질환에서의 베타2-아밀로이드 침착, 피질-기저핵 변성, 크레이츠펠트-야콥병, 권투선수치매, 치명적 가족성 불면증, 게르슈트만-슈트라우슬러-샤인커(Gerstamnn-Straussler-Scheinker) 증후군, 괌-파킨슨병 치매 복합증, 할러포르텐-스파츠병, 아밀로이드증을 동반한 유전성 뇌출혈, 특발성 골수종, 봉입체 근염, 랑게르한스섬 2형 당뇨병 인슐린증, 쿠루병, 갑상선 수질 암종, 지중해열, 머클-웰스 증후군, 신경내장 지질 저장 질환, 파킨슨병, 피크병, 또는 헌팅턴병, 케네디병 및 연장된 폴리글루타민관(polyglutamine tract)과 관련된 모든 형태의 척수소뇌성 운동실조증을 포함하는 폴리글루타민 질환, 진행성 핵상마비, 아급성 경화성 범뇌염, 전신성 노인성 아밀로이드증, 스크래피가 포함되나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 한 양태는 하나 이상의 본 발명의 폴리펩타이드 및 하나 이상의 약제학적 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
하나의 바람직하지만 비제한적 양태에 따라서, 상기 약제학적 조성물은 경구 투여에 적합하다.
본 발명의 항-A-베타 폴리펩타이드는 A-베타에 결합한다. 본 발명의 한 측면에 따라서, 항-A-베타 폴리펩타이드는 표적 A-베타에 결합하고 이 표적 A-베타와 하나 이상의 다른 A-베타와의 상호작용을 억제한다. 표적 A-베타는 플라크의 일부분으로서, 현탁액 또는 용액 또는 이중 하나 이상에 존재할 수 있다. 다른 A-베타도 또한 플라크의 일부분으로서 현탁액 또는 용액 또는 이중 하나 이상에 존재할 수 있다.
항-A-베타 폴리펩타이드의 결합을 측정하기 위한 ELISA 검정은 널리 공지되어 있다.
항-A-베타 폴리펩타이드의 억제 작용 정도를 측정하기 위한 검정에는 예를 들면, 응집된 A-베타로부터 바이오티닐화된(biotinylated) A-베타의 방출을 측정하는 탈중합 검정이 있다.
본 발명의 한 측면에 따라서, 항-A-베타 폴리펩타이드는 이의 존재가 폴리펩타이드의 부재하에서의 A-베타 - A-베타 결합과 비교하여 A-베타와 다른 A-베타 간의 결합을 감소시키는 경우에 억제 작용을 나타내는 것이다. 본 발명의 한 측면에 따라서, 항-베타 폴리펩타이드의 존재하에서의 결합은 상기 폴리펩타이드의 부재하에서의 결합과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 또는 75% 이상 감소된다.
본 발명의 한 측면에 따라서, 나노바디는 골격 영역과 상보성 결정 영역이 단일 도메인 폴리펩타이드의 일부분인 중쇄 항체로부터 유래된다. 이러한 중쇄 항체의 예로는 경쇄가 결여된 천연 발생 면역글로불린이 포함되나 이로 제한되지 안흔ㄴ다. 이러한 면역글로불린은 예를 들면, WO 94/04678에 개시되어 있다.
이러한 중쇄 항체의 상기 비통상적 부류의 항원-결합 부위는 단일 가변 도메인을 포함하는 독특한 구조를 갖고 있다. 명료성의 이유로, 천연적으로 경쇄가 결여된 중쇄 항체로부터 유래된 가변 도메인은 본원에서 VHH 또는 VHH 도메인 또는 나노바디로서 공지된다. 이러한 VHH 도메인 펩타이드는 낙타과 종, 예를 들면, 낙타, 단봉낙타, 라마, 알파카 및 구아나코에서 생성되는 항체로부터 유래될 수 있다. 낙타과 이외의 다른 종(예를 들면, 상어, 복어)도 천연적으로 경쇄가 결여된 기능적 항원-결합 중쇄 항체를 생산할 수 있다. 이러한 VHH 도메인은 본 발명의 범주내에 있다.
낙타과 항체는 경쇄가 결여된 기능적 중쇄 항체의 독특한 광범위한 레퍼토리를 발현한다. 낙타과 항체 유래의 VHH 분자는 공지된 가장 작은 온전한 항원-결합 도메인(대략 15 kDa 또는 통상의 IgG보다 10배 작은)이며 따라서 조질한 조직으로의 전달 및 거대분자 간의 제한된 공간으로의 접근에 매우 적합하다.
중쇄 항체의 다른 예에는 하나 이상의 아미노산 잔기를 낙타과-특이적 잔기로 치환시킴(소위 카멜화, WO 94/04678)에 의해 변형된 통상의 4쇄 항체로부터 유래된 중쇄 항체가 포함된다. 이러한 위치는 우선적으로 VH-VL 경계면 및 위치 37, 44, 45, 47, 103 및 108을 포함하는 소위 낙타과 지표 잔기(WO 94/04678)에서 발생할 수 있다.
이러한 중쇄 항체의 VHH 단편은 단일 면역글로불린(Ig) 도메인에 의해 형성된 소형의 강건하고 효율적인 인식 단위에 상응한다.
본원에 개시된 항-A-베타 폴리펩타이드 및 이의 유도체는 낮은 독성 및 높은 선택성과 같은 통상의 항체의 유리한 특성들을 지니고 있을 뿐만 아니라 부가적 특성들을 또한 나타낸다. 당해 항-A-베타 폴리펩타이드는 보다 가용성이고, 이에 따라 이들은 통상의 항체와 비교하여 보다 고 농도로 저장 및/또는 투여될 수 있다.
통상의 항체는 실온에서 저장할 수 없고 제조 및 저장을 위해서는 냉동되어야 하며, 시간 및 비용의 원인이 되는 필수적인 냉동 실험실 장비, 저장 및 운송을 요한다. 본 발명의 항-A-베타 폴리펩타이드는 실온에서 저장할 수 있으며, 이에 따라 이들은 비용, 시간 및 환경적 조건을 제약하는 냉동 장비의 사용 없이 제조, 저장 및/또는 운반될 수 있다. 게다가, 통상의 항체는 생물학적 활성-온도 범위를 벗어나는 온도(예를 들면, 37±20℃)에서 실시되는 검정 또는 키트에서 사용하기에 적합하지 않다.
통상의 항체와 비교하여 유리한, 본원에서 기술되는 항-A-베타 폴리펩타이드의 다른 특성은 예를 들면, 알부민-커플링 또는 혈청 단백질(예: 혈청 알부민)에 대해 지시된 하나 이상의 나노바디에의 커플링에 의해 본 발명에 따라 조절될 수 있는 순환 반감기의 조절을 포함한다. 본 발명의 다른 측면은 본원에서 참조로 인용되는 WO04/041865에 기술된 바와 같은, 혈청 단백질(예; 혈청 알부민)에 대한 하나의 특이성과 표적에 대한 다른 특이성을 갖는 이특이적 항-A-베타 폴리펩타이드이다. 반감기를 증진시키는 다른 수단은 Fc 또는 A-베타에 대해 지시된 다른 나노바디에 대한 본 발명의 폴리펩타이드의 커플링(즉, 다가 나노바디- 이가, 삼가 나노바디 등을 생성시킴) 또는 폴리에틸렌 글리콜에 대한 커플링을 포함한다. 조절 가능한 반감기는 즉각적 효과를 갖는 용량을 조절하는데 바람직하다.
통상의 항체는 통상의 생리학적 pH 범위를 벗어나는 환경에서 사용하기에 적합하지 않다. 이들 통상의 항체는 낮은 또는 높은 pH에서 불안정하고 따라서 경구 투여에 적합하지 않다. 낙타과 항체는 극단적 pH, 변성 시약 및 고온과 같은 가혹한 조건에 내성이 있어, 본원에 기술되는 항-A-베타 폴리펩타이드는 경구 투여에 의한 전달에 적합하다. 낙타과 항체는 프로테아제의 작용에 대해 내성이 있으며, 이는 통상의 항체에 대해서는 드문 경우이다.
통상의 항체의 발현 수율은 매우 낮으며, 생산 방법은 노동 집약적이다. 게다가, 온전한 및 활성 항체의 발현을 위해 필수적인 포유동물 세포 시스템이 시간 및 장비의 측면에서 높은 수준의 원조를 요구하기 때문에 상기 항체의 제조 또는 소규모 생산은 비용이 많이 들고, 수율이 매우 낮다. 본 발명의 항-A-베타 폴리펩타이드는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 및 효모와 같은 통상의 재조합 숙주 유기체에서 발효를 통해 비용-효율적으로 생산될 수 있다; 고비용의 포유동물 세포 배양 설비를 요하는 통상의 항체와 달리, 성취가능한 발현 수준이 높다. 본 발명의 폴리펩타이드의 수율의 예는 1 내지 10mg/ml(이. 콜라이) 및 최대 1g/l(효모)이다.
본 발명의 항-A-베타 폴리펩타이드는 광범위한 상이한 항체 유형에 대한 높은 결합 친화성 및 통상의 항체에 의해 인식되지 않는 에피토프에 결합하는 능력을 나타내며, 예를 들면, 이들은 강내로의 침투 잠재성을 갖는 긴 CDR3 루프를 나타낸다.
본 발명의 항-A-베타 폴리펩타이드는 WO96/34103(본원에서 참조로 인용됨)에 기술된 바와 같은 (머리-꼬리)(head-to-tail) 융합에 의해 이작용성 또는 다중작용성 분자의 직접적 생성을 나타낸다.
본 발명의 항-A-베타 폴리펩타이드는 이의 작은 크기를 통해서, 통상의 항체보다 우수한 조직 투과 및 신체의 모든 부분에 도달하는 능력을 나타낸다.
라마 단일-도메인 항체는 사람 혈뇌 장벽을 가로질러 이동할 수 있다. 본 발명의 하나의 양태에서, 항-A-베타 폴리펩타이드는 혈뇌 장벽을 투과할 수 있다. 본 발명의 다른 양태에서, 항-A-베타 폴리펩타이드는 혈뇌 장벽을 투과할 수 없다.
본원에 기술된 항-A-베타 폴리펩타이드는 통상의 항체보다 덜 면역원성이다. 사람 VH 골격 영역에 대해 95% 아미노산 서열 상동성을 나타내는 낙타과 항체의 아부류가 발견된 바 있다. 이는 사람 환자에서 투여시의 면역원성이 보다 적거나 심지어 존재하지 않을 수 있다고 예상될 수 있음을 시사한다. 대안으로, 요구된다면, 나노바디의 사람화는 놀랍게도 오직 소수개의 잔기만이 치환되는 것을 필요로 한다.
본 발명의 한 측면은 하나 이상의 항-A-베타 중쇄 항체, 특히 이로부터 유래된 나노바디를 포함하는 항-A-베타 폴리펩타이드이다. 본 발명의 한 측면은 이러한 폴리펩타이드가 부가적 성분을 포함할 수 있다는 것이다. 이러한 성분들은 폴리펩타이드 서열, 예를 들면, 하나 이상의 항-A-베타 나노바디, 하나 이상의 항-혈청 알부민 나노바디, 하나 이상의 항-tau 나노바디일 수 있다. 다른 융합 단백질은 본 발명의 범주내에 있으며, 예를 들면, 운반체 폴리펩타이드, 신호전달 분자, 태그 및 효소와의 융합체를 포함할 수 있다. 다른 성분예는 예를 들면, 방사선표지, 유기 염료, 형광성 화합물이 포함될 수 있다.
하나의 항-A-베타 나노바디를 포함하는 본 발명의 항-A-베타 폴리펩타이드의 예로는 서열번호 117 내지 183 중 어느 하나에 제시된 서열에 상응하는 폴리펩타이드가 있다.
하나의 바람직하지만 비제한적 양태에 따라서, 본 발명의 폴리펩타이드는 4 내지 11의 등전점을 갖는다.
바람직하게는, 본 발명의 폴리펩타이드는 5 내지 10의 등전점을 갖는다.
하나의 바람직하지만 비제한적 양태에 따라서, 본 발명의 폴리펩타이드는 공유 연결된 2개의 아미노산 쇄(본원에서는 "중쇄"로 지칭됨)을 포함한다.
본 발명의 중쇄는 바람직하게는 이황화 결합을 통해 연결된다.
보다 바람직하게는, 본 발명의 중쇄는 이황화 결합을 형성하는 시스테인 잔기를 통해 연결된다.
하나의 바람직하지만 비제한적 양태에 따라서, 본 발명의 중쇄는 35 kdal 내지 50 kdal의 대략적 분자량을 갖는다. 분자량은 문헌[참조; Hamers-Casterman et al. (Nature 1993)]에 기술된 바와 같이 측정된다.
바람직하게는, 본 발명의 중쇄는 40 kdal 내지 50 kdal의 분자량을 갖는다.
보다 바람직하게는, 본 발명의 중쇄는 41 kdal 내지 49 kdal, 42 kdal 내지 48 kdal, 43 내지 47 kdal 또는 44 kdal 내지 46 kdal의 분자량을 갖는다.
가장 바람직하게는, 본 발명의 중쇄는 43 kdal 내지 46 kdal의 분자량을 갖는다.
하나의 바람직하지만 비제한적 양태에 따라서, 본 발명의 중쇄는 43 kdal의 분자량을 갖는다.
또 다른 바람직하지만 비제한적인 양태에 따라서, 본 발명의 중쇄는 46 kdal의 분자량을 갖는다.
본 발명의 다른 측면에 따라서, 항-A-베타 폴리펩타이드는 2개 이상의 항-A-베타 나노바디를 포함할 수 있다. 본 발명의 한 측면은 이러한 폴리펩타이드가 상기한 바와 같은 부가적 성분을 포함할 수 있다는 것이다.
본 발명의 추가적 측면에 따라서, 본 발명의 항-A-베타 폴리펩타이드는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 또는 15개 초과의, A-베타에 대해 지시된 나노바디를 포함할 수 있다.
본 발명의 측면에 따라서, 본 발명의 항-A-베타 폴리펩타이드는 2개 이상의 동일한 또는 동일하지 않은 항-A-베타 나노바디 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 한 측면은 2개 이상의 상기한 서열이 A-베타에 대한 동등한 친화성을 가져서 약한 친화성 및 높은 친화성 결합 서열을 겸비한 항-A-베타 폴리펩타이드를 형성한다는 것일 수 있다.
이가 폴리펩타이드의 작제 방법은 당업계에 공지되어 있고(예를 들면, US 2003/0088074), 하기에서도 기술된다.
본 발명의 항-A-베타 폴리펩타이드를 이펙터 기능에 대해 변형시켜 이의 치료 효능을 증진시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 특정 Fc 도메인, 특히 사람 기원의 Fc 도메인과의 나노바디-융합체가 유리할 수 있다.
본 발명은 또한 피험체의 혈청 단백질에 대해 각각 지시된 하나 이상의 나노바디를 포함하는 본원에서 추가로 기술하는 항-A-베타 폴리펩타이드가, 놀랍게도 상기 폴리펩타이드의 일부가 아닌 경우의 항-A-베타 나노바디(들)의 순환 반감기와 비교해서 상기 피험체의 순환계에서 현저하게 연장된 반감기를 갖는다는 발견에 관한 것이다. 게다가, 상기 항-A-베타 폴리펩타이드는 상기한 바와 같은 나노바디의 동일한 유리한 특성들, 예를 들면, 마우스에서 온전한 상태를 유지하는 높은 안정성, 극단적 pH 내성, 고온 안정성 및 높은 표적 특이성 및 친화성을 나타내는 것으로 밝혀졌다.
따라서, A-베타에 대해 지시된 하나 이상의 나노바디와 혈청 단백질에 대한 특이성을 갖는 하나 이상의 나노바디를 포함하는 본원에서 기술하는 항-A-베타 폴리펩타이드는 오직 A-베타를 표적으로 하는 폴리펩타이드보다 훨씬 더 효과적이다.
혈청 단백질은 피험체의 혈청에서 발견되는 임의의 적합한 단백질 또는 이의 단편일 수 있다. 본 발명의 한 측면에서, 혈청 단백질은 혈청 알부민, 혈청 면역글로불린, 티록신-결합 단백질, 트랜스페린 또는 피브리노겐 중 어느 하나일 수 있다. 피험체는 예를 들면, 토끼, 염소, 마우스, 랫트, 소, 송아지, 낙타, 라마, 원숭이, 당나귀, 기니아 피그, 닭, 양, 개, 고양이, 말 및 바람직하게는 사람일 수 있다. 효과적 치료 및/또는 표적 항원의 구획화(compartmentalization)를 위해 요구되는 반감기와 같은 의도된 용도에 따라서, 나노바디 파트너가 상기 혈청 단백질들 중 하나로 지시될 수 있다.
본 발명의 한 측면에 따라서, 본 발명의 항-A-베타 폴리펩타이드 내의 혈청 단백질에 대해 지시된 나노바디의 수는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 또는 15개 초과일 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 당해 폴리펩타이드의 생체내 반감기를 향상시키도록 지시된 공유 (연결된) 또는 비공유 결합된 하나 이상의 물질을 추가로 포함하는 항-A-베타 폴리펩타이드이다. 반감기를 향상시키는 물질의 예는 당업계에 공지되어 있으며 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜 및 혈청 알부민을 포함한다.
나노바디와 다른 물질을 연결시켜 이특이적 및 다중특이적 폴리펩타이드를 형성시키는 방법은 당업자에게 공지되어 있으며 하기 기술된다.
반감기를 증가시키도록 본 발명에 따라 변형되지 않은 본 발명의 폴리펩타이드는 신체로부터의 신속한 제거 특성을 갖는다. 환원하면, A-베타에 대해 지시된 하나 이상의 나노바디와 하나 이상의 항-혈청 단백질 나노바디를 포함하는 이특이적 폴리펩타이드는 피험자의 혈청중에서 수일 동안 순환함으로써, 치료 빈도를 감소시키고, 체내 기능적 활성의 지속 시간을 증가시키고, 환자의 불편함을 감소시키고 치료 비용을 감소시킬 수 있다. 동일한 유리한 특성들은 반감기의 향상을 목적으로 하는 다른 물질을 포함하는 본 발명의 폴리펩타이드에서도 관찰될 수 있다. 또한, 본 발명의 한 측면은 본원에 기술된 항-A-베타 폴리펩타이드의 반감기를 당해 폴리펩타이드내의 항-혈청 단백질 나노바디의 수에 의해 조절할 수 있다는 것이다. 조절 가능한 반감기는 몇가지 상황하에, 예를 들면, 치료학적 항-A-베타 폴리펩타이드의 시한 투여(timed dose)의 적용시에 요망된다.
약동학 분석 및 반감기 측정을 위한 방법은 당업자에게 친숙하다. 세부 사항은 문헌[참조; Kenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists and in Peters et al, Pharmacokinete analysis: A Practical Approach (1996)]에서 찾아볼 수 있다. 또한, 문헌[참조: "Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron, published by Marcel Dekker, 2 nd Rev. ex edition (1982)]을 참조할 수 있다.
본 발명의 한 측면에 따라서, 폴리펩타이드는 생체내 폴리펩타이드의 반감기를 증가시킬 수 있는 하나 이상의 분자에 결합할 수 있다.
반감기는 폴리펩타이드의 혈청 농도가 예를 들면, 리간드의 분해 및/또는 천연 기전에 의한 리간드의 제거 또는 격리로 인해서 생체내에서 50%까지 감소되는데 소요되는 시간이다. 본 발명의 폴리펩타이드는 생체내에서 안정화되며 이의 반감기는 분해 및/또는 제거 또는 격리에 대해 내성이 있는 분자에 결합됨으로써 증가된다. 전형적으로, 이러한 분자는 자체로 생체내 반감기가 긴 천연 발생 단백질이다.
본 발명의 폴리펩타이드의 반감기는, 생체내에서 이의 기능적 활성이 반감기 증가성 분자에 대해 특이적이지 않은 유사 폴리펩타이드보다 긴 기간 동안 유지되는 경우, 증가된다. 따라서, HSA에 대해 특이적인 본 발명의 폴리펩타이드 및 표적 분자는 HSA에 대해 특이성이 존재하지 않는, 즉 HSA에 결합하지 않고 다른 분자에 결합하는 동일한 폴리펩타이드와 비교된다. 예를 들면, 이는 표적 분자상의 제2 에피토프에 결합할 수 있다. 전형적으로, 반감기는 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 이상 증가된다. 반감기의 2배, 3배, 4배, 5배, l0배, 20배, 30배, 40배, 50배 이상 범위의 증가가 가능하다. 대안으로 또는 추가로, 반감기의 최대 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배, 150배 범위의 증가가 가능한다.
전형적으로, 생체내에서 폴리펩타이드의 반감기를 증가시킬 수 있는 분자는 생체내에서 천연적으로 발생하고 유리체로부터 원치않는 물질을 제거하는 내인성 기작에 의한 분해 또는 제거에 대해 내성이 있는 폴리펩타이드이다. 예를 들면, 유기체의 반감기를 증가시키는 분자는 다음으로부터 선택될 수 있다: (i) 세포외 매트릭스로부터의 단백질, 예를 들면, 콜라겐, 라미닌, 인테그린 및 피브로넥. 콜라겐은 세포외 매트릭스의 주요 단백질이다. 약 15종의 콜라겐 분자가 현재 공지되어 있으며, 신체의 상이한 부분에서 발견되는데, 예를 들면, 뼈, 피부, 건, 인대, 각막, 내부 기관에서 발견되는 I형 콜라겐(신체 콜라겐의 90%를 차지함) 또는 연골, 척추내 디스크, 척삭, 안구의 유리체액에서 발견되는 II형 콜라겐이 있다; (ii) 혈중에서 발견되는 단백질 혈장 단백질, 예를 들면, 피브린, 알파-2 마크로글로불린, 혈청 알부민, 피브리노겐 A, 피브리노겐 B, 혈청 아밀로이드 단백질 A, 헵타글로빈, 프로필린, 유비퀴틴, 우테로글로불린(uteroglobulin) 및 베타-2-마이크로글로불린; (iii) 효소 및 억제제, 예를 들면, 플라스미노겐, 리소자임, 시스타틴 C, 알파-1-안티트립신 및 이자의 트립신 억제제. 플라스미노겐은 트립신-유사 세린 프로테아제 플라스민의 불활성 전구체이다. 이것은 정상적으로는 혈류를 통해 순환하는 것으로 발견된다. 플라스미노겐이 활성화되어 플라스민으로 전환되면, 혈액 세포를 혈병으로 엉키게 하는 피브리노겐 섬유를 용해시키는 이의 잠재적 효소 도메인의 폴딩이 풀린다(unfold). 이는 섬유소용해로 지칭된다; (iv) 면역계 단백질, 예를 들면, IgE, IgG, IgM; (v) 수송 단백질, 예를 들면, 레티놀 결합 단백질, 알파-1 마이크로글로불; 데페신, 예를 들면, 베타-데페신 1, 호중성 데페신 1,2 및 3; (vi) 혈뇌 장벽 또는 신경 조직에서 발견되는 단백질, 예를 들면, 멜라노코르틴 수용체, 미엘린, 아스코르베이트 운반체; (vii) 트랜스페린 수용체 특이적 리간드-신경약제 융합 단백질[참조: US5977307]; (viii) 뇌 모세관 내피 세포 수용체, 트랜스페린, 트랜스페린 수용체, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자 1(IGF 1) 수용체, 인슐린-유사 성장 인자 2(IGF 2) 수용체, 인슐린 수용체; (ix) 신장으로 국소화된 단백질, 예를 들면, 폴리시스틴, IV형 콜라겐, 유기 음이온 수송체 KI, 헤이만(Heymann) 항원; (x) 간으로 국소화된 단백질, 예를 들면, 알코올 데하이드로게나제, G250; (xi) 혈액 응고 인자 X, 알파1 안티트립신, HNF 1알파; (xii) 폐로 국소화된 단백질, 예를 들면, 분비성 성분(IgA에 결합함); (xiii) 심장으로 국소화된 단백질, 예를 들면, HSP 27. 이는 팽창성 심근병증과 관련된다; (xiv) 피부로 국소화된 단백질, 예를 들면, 케라틴; (xv) 골원성 활성을 나타내는 전환 성장 인자 베타 슈퍼패밀리의 서브세트인 골 특이적 단백질, 예를 들면, 골 형태발생 단백질(bone morphogenic protein, BMP). 예로는 BMP-2, -4, -5, -6, -7(또는 골원성 단백질(OP-1) 및 -8 (OP-2)로 지칭됨)이 포함된다; (xvi) 사람 영양막 항원, 헤르셉틴 수용체, 에스트로겐 수용체, 카텝신 eg 카텝신 B(간 및 비장에서 발견됨)을 포함하는 종양 특이적 단백질; (xvii) LAG-3(림프구 활성화 유전자), 오스테오프로테게린 리간드(OPGL), OX40 (TNF 수용체 패밀리의 구성원, 활성화된 T 세포 및 사람 T 세포 백혈병 바이러스 I형(HTLV-I)-생산 세포에서 특이적으로 상향 조절되는 것으로 공지된 오직 공자극성 T 세포 분자에서 발현됨)을 포함하여, 질환 특이적 단백질, 예를 들면, 활성화된 T-세포에서만 발현되는 항원; CG6512 초파리(Drosophila), 사람 파라플레긴, 사람 FtsH, 사람 AFG3L2, 쥐 ftsH를 포함하는 메탈로프로테아제(관절염/암과 관련); 산성 섬유모세포 성장(FGF-1), 염기성 섬유모세포 성장 인자(FGF-2), 혈관 내피 성장 인자/혈관 투과성 인자(VEGF/VPF), 전환 성장 인자-a(TGF a), 종양 괴사 인자-알파(TNF-알파), 안지오게닌, 인터류킨-3 (IL-3), 인터류킨-8 (IL-8), 혈소판 유래의 내피 성장 인자(PD-ECGF), 태반 성장 인자(P1GF), 미드카인(midkine) 혈소판 유래의 성장 인자-BB (PDGF), 프락타카인(fractalkine)을 포함하는 항원성 성장 인자; (xix) 스트레스 단백질(열 쇼크 단백질); (xx) 정상적으로는 세포내에서 발견되는 HSP. HSP가 세포외에서 발견되는 경우, 이는 세포가 사멸하여 이의 내용물이 유출되었다는 지표이다. 이러한 프로그램되지 않은 세포 사멸(괴사)은 오직 외상, 질환 또는 손상의 결과로서만 일어나며, 이에 따라 생체내에서 세포외 HSP는 감염 및 질환에 대항할 수 있는 면역계로부터의 반응을 개시한다. 세포외 HSP에 결합하는 이중 특이적 인자는 질환 부위로 국소화될 수 있다. (xxi) Fc 수송에 관여하는 단백질: 브람벨(Brambell) 수용체(FcRB로서도 공지됨). 상기 Fc 수용체는 2가지 기능을 가지며, 이들 두 기능은 모두 운반에 잠재적으로 유용하다. 그 기능은 태반을 경유하여 모체로부터 태아로 IgG를 운반하는 기능 및 분해로부터 IgG를 보호하여 IgG의 혈청 반감기를 연장시키는 기능이다. 수용체는 엔도좀으로부터 IgG를 재순환시키는 것으로 사료된다[참조: Holliger et al, Nat Biotechnol 1997 Jul; 1 5(7):632-6].
본 발명에 따른 폴리펩타이드는 어떠한 생체내 반감기의 증가도 요구하지 않거나 생체내 반감기를 증가시키지 않으면서 상기 표적에 대해 특이적이도록 설계될 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 조직-특이적인 상기한 것으로부터 선택된 표적에 대해 특이적이 됨으로써, 어떠한 반감기의 증가와도 관계없이(이것이 초래될 수 있다해도) 당해 폴리펩타이드의 조직-특이적 표적화가 가능할 수 있다. 게다가, 폴리펩타이드가 신장 또는 간으로 표적화되는 경우, 당해 폴리펩타이드가 생체내에서 대안적 제거 경로로 방향이 바뀌어 지시되게 할 수 있다(예를 들면, 폴리펩타이드는 간 제거 경로로부터 벗어나서 신장 제거 경로로 지시될 수 있다).
본 발명의 또 다른 양태는 하나 이상의 항엉킴제를 추가로 포함하는 본원에 기술된 항-A-베타 폴리펩타이드이다. 이러한 항엉킴제는 공유 부착되거나 비공유 부착될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 항-tau 나노바디인 하나 이상의 항엉킴제를 추가로 포함하는 본원에 기술된 항-A-베타 폴리펩타이드이다.
항엉킴제의 예로는 항-tau, 항-인산화 및/또는 항-카스파제 제제 또는 항체 또는 이의 단편이 포함될 수 있다.
항-A-베타 나노바디가 플라크 및 초기 단계의 엉킴을 제거할 수 있는 반면, 항엉킴제는 진행된 엉킴을 제거할 수 있다.
이러한 항-A-베타/항엉킴제 배합물은 플라크와 원섬유 엉킴 둘다를 표적화하여 상승 작용, 즉 개별적 치료 방식과 비교하여 증가된 치료 효과를 유도한다. 이러한 병용 치료요법(combined therapy)은 후기 단계 AD에서 특히 효과적일 수 있다.
본 발명의 한 측면은 tau에 대해 지시된 하나 이상의 나노바디를 추가로 포함하는 본원에 기술된 항-A-베타 폴리펩타이드이다.
본 발명의 다른 측면은 A-베타에 대해 지시된 하나 이상의 나노바디와 tau에 대해 지시된 하나 이상의 나노바디를 포함하는 항-A-베타 폴리펩타이드이다. 상기 나노바디들은 링커에 의해 또는 링커 없이 연결될 수 있다.
본 발명의 한 측면에 따라서, 본 발명의 항-A-베타 폴리펩타이드 내의 단백질 tau에 대해 지시된 나노바디의 수는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 또는 15 초과일 수 있다. 질환의 진행 또는 병기(病期)에 따라서, 진행기 또는 후기 엉킴을 제거하거나 엉킴의 재형성을 방지하기 위해 보다 많은 항-tau 나노바디를 부가할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 A-베타에 대해 지시된 하나 이상의 나노바디와 tau에 대해 지시된 하나 이상의 나노바디를 포함하고, 반감기를 연장하기 위해 혈청 단백질에 대해 지시된 하나 이상의 나노바디를 추가로 포함하는 항-A-베타 폴리펩타이드이다.
본 발명의 추가의 측면은 본원에 기술된 하나 이상의 항-A-베타 폴리펩타이드와 하나 이상의 항엉킴제를 포함하는, 피험체에게 동시에, 개별적 또는 순차적 투여하기 위한 조성물이다.
본 발명의 다른 추가의 측면은 유효량의 하나 이상의 본 발명의 항-A-베타 폴리펩타이드와 하나 이상의 항엉킴제를 개체에게 동시에, 개별적으로 또는 순차적으로 투여함을 포함하는, AD의 치료방법이다.
동시 투여란, 항-A-베타 폴리펩타이드와 항엉킴제를 피험체에게 동시에 투여함을 의미한다. 예를 들면, 상기 폴리펩타이드와 항엉킴제의 혼합물로서 또는 상기 폴리펩와 항엉킴제를 포함하는 조성물로서 투여할 수 있다. 예로는 정맥내 투여되는 용제, 정제, 액제, 국소 크림 등이 포함되나 이에 제한되지 않으며, 각각의 제제는 당해 폴리펩타이드와 관심대상의 제제를 포함한다.
개별적 투여란, 항-A-베타 폴리펩타이드와 항엉킴제를 피험체에게 동시에 또는 대체로 동시에 투여함을 의미한다. 상기 폴리펩타이드와 항엉킴제는 별개의, 혼합되지 않은 제제로서 투여된다. 예를 들면, 상기 폴리펩타이드와 항엉킴제는 개개의 정제로서 키트내에 존재할 수 있다. 정제는 피험체가 두 정제 모두를 동시에 삼키거나 한 정제 직후에 나머지 정제를 삼킴으로써 피험체에게 투여될 수 있다.
순차적 투여란, 항-A-베타 폴리펩타이드와 항엉킴제를 피험체에게 순차적으로 투여함을 의미한다. 상기 폴리펩타이드와 항엉킴제는 별개의, 혼합되지 않은 제제로서 키트내에 존재한다. 투여 간에 시간 간격이 있다. 예를 들면, 폴리펩타이드는 항엉킴제 투여한지 최대 336, 312, 288, 264, 240, 216, 192, 168, 144, 120, 96, 72, 48, 24, 20, 16, 12, 8, 4, 2, 1시간 또는 0.5시간 후에 투여되거나 그 반대일 수 있다.
순차적 투여에서, 폴리펩타이드는 항엉킴제 투여 전 및/또는 후에 각종 용량으로서 1회 또는 임의의 횟수로 투여될 수 있다. 순차적 투여는 동시 투여 또는 순차적 투여와 병용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 하나 이상의 나노바디가 사람화된 본원에 기술된 항-A-베타 폴리펩타이드이다. 사람화된 나노바디는 항-A-베타 나노바디, 항-혈청 알부민, 항-단백질 tau, 본 발명에 따라 유용한 기타 나노바디 또는 이들의 배합물일 수 있다.
본 발명의 한 양태는 하나 이상의 사람화 항-A-베타 나노바디와 하나 이상의 사람화 항-사람 혈청 알부민 나노바디를 포함하는 항-A-베타 폴리펩타이드 나노바디이다.
사람화란, 사람 환자에게 투여시 잠재적 면역원성이 보다 적거나 전혀 존재하지 않도록 돌연변이시킴을 의미한다. 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 사람화는, 폴리펩타이드가 이의 특유의 특성을 상실하지 않도록 하면서, 하나 이상의 비-사람 면역글로불린 아미노산을 사람 컨센서스(concensus) 서열 또는 사람 배선 유전자 서열에서 발견되는 이의 사람 대응물로 대체시키는 단계를 포함하며, 즉 사람화는 수득되는 폴리펩타이드의 결합 성능에 실질적으로 영향을 주지 않는다.
본 발명의 한 측면에 따라서, 사람화된 나노바디는 사람 골격 영역과 50% 이상의 상동성(예를 들면, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 100%)을 갖는 나노바디로서 정의된다.
본 발명자들은 비상동성 종과 관련된 면역원성을 감소시키기 위해 천연의 친화성을 저하시키지 않으면서 변형될 수 있는 나노바디의 아미노산 잔기를 결정하였다.
본 발명자들은 또한, 나노바디 폴리펩타이드의 사람화가 급격한 결합 및/또는 억제 활성의 상실 없이 단일 폴리펩타이드 쇄내의 제한된 수의 아미노산의 도입 및 돌연변이유발을 필요로 함을 밝혀냈다. 이는 2개의 쇄, 즉 경쇄 및 중쇄 내의 아미노산 변화의 도입 및 두 쇄 모두의 어셈블리의 보존을 필요로 하는 scFv, Fab, (Fab)2 및 IgG의 사람화와 상반되는 것이다.
본 발명자들은 놀랍게도, DP29, DP47 및 DP51과 같은 사람 배선 서열과 매우 상동인 골격 서열을 포함하는 본 발명의 나노바디가 매우 효과적이라는 것을 밝혀냈다. 이들은 낙타과의 종과 같은 일부 종에서 천연적으로 발생된다. 이러한 나노바디는 위치 45에 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 세린, 트레오닌, 아스파라긴 또는 글루타민으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산, 예를 들면, L45를 보유함을 특징으로 하다. 또한, 이러한 나노바디는 카뱃 번호매김에 따른 위치 103에 사람 배선 'J' 트립토판을 보유할 수 있다. 본 발명에서 기술되는 신규한 나노바디 부류는 서열번호 3, 4 및 5로 대표된다. 이러한 부류의 낙타과 항체, 또는 이러한 부류의 하나 이상의 골격 서열을 보유한 다른 돌연변이된 나노바디는 본 발명의 범주내에 있다.
이와 같이 상기 언급한 부류에 속하는 나노바디 또는 이러한 부류의 돌연변이를 보유한 나노바디는 사람 VH 골격 영역에 대한 높은 아미노산 서열 상동성을 나타내며, 이러한 나노바디를 포함하는 본 발명의 폴리펩타이드는 이로부터의 원치않는 면역반응이 예상되지 않으며 추가의 사람화의 부담감 없이 사람에게 직접 투여될 수 있다. 본 발명은 또한 상기 폴리펩타이드를 암호화할 수 있는 핵산에 관한 것이다.
사람화 기술은 임의의 나노바디 잔기를 단독으로 또는 조합하여 배선 VH 유전자(예를 들면, DP 47, DP 29 및 DP 51)의 상응하는 골격 1, 2 및 3(FR1, FR2 및 FR3) 잔기로 대체시킴을 포함하는 방법에 의해 실시할 수 있다.
본 발명의 한 측면에 따라서, 나노바디의 사람화는 상기 나노바디 내의 하기하는 위치의 하나 이상의 아미노산을 배선 VH 유전자의 골격으로부터의 상응하는 아미노산으로 치환시킴으로써 실시하며, 이때 번호매김은 카뱃 번호매김에 따른다:
- FR1 아미노산 잔기 1, 3, 5, 14 및 24,
- FR2 아미노산 잔기 44, 45 및 49,
- FR3 아미노산 잔기 74, 77, 78, 83 및 84
- FR4(배선 J 절편으로부터 유래) 아미노산 위치 104 및 105.
본 발명의 측면에 따라서, 치환되지 않은 나노바디의 골격 영역은 본래의 나노바디 골격으로서 유지된다.
본 발명의 한 측면에 따라서, FR1, FR2 및 FR3 중 하나 이상의 잔기는 상기 계획에 따라 치환된다.
본 발명의 한 측면에 따라서, FR1의 적어도 1, 2, 3개 또는 모든 잔기는 상기 계획에 따라 치환된다.
본 발명의 한 측면에 따라서, FR2의 적어도 1, 2, 3개 또는 모든 잔기는 상기 계획에 따라 치환된다.
본 발명의 한 측면에 따라서, FR3의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6개 또는 모든 잔기는 상기 계획에 따라 치환된다.
본 발명의 한 측면에 따라서, FR4의 적어도 1, 2, 3개 또는 모든 잔기는 상기 계획에 따라 치환된다.
본 발명의 다른 양태에서, 사람화된 나노바디는 나노바디 CDR 영역의 모두 또는 일부분을 배선 사람 VH 골격 스캐폴드(scaffold)상으로 이식(grafting)함으로써 수득된다.
본 발명의 한 측면에 따라서, 나노바디의 사람화는 상기 나노바디의 CDR1, CDR2 및 CDR3 중 하나 이상을 배선 사람 VH 골격 스캐폴드로 치환시킴으로써 실시한다. 적합한 골격 스캐폴드의 예로는 DP47, DP29 및 DP51의 골격 스캐폴드가 포함된다.
본 발명의 나노바디 본 발명의 일부분인 상기 언급한 사람화 방법에 따라 수득된다.
A-베타 또는 단백질에 대해 지시된 통상의 4쇄 항체는 카멜화, 즉 경쇄가 제거되고 하나 이상의 아미노산 잔기가 낙타과-특이적 잔기로 치환되도록 돌연변이될 수 있다[참조: 본원에서 참조로 인용되는 WO 94/04678]. 이러한 위치는 우선적으로 VH-VL 경계면 및 위치 37, 44, 45, 47, 103 및 108을 포함하는 소위 낙타과 지표 잔기에서 발생할 수 있다. 이러한 카멜화된 항체는 본 발명에 따른 나노바디이다. 하나 이상의 나노바디가, 하나 이상의 아미노산 잔기가 나노바디의 특이적 서열 또는 아미노산 잔기로 부분적으로 치환된 VH인 폴리펩타이드는 본 발명에 따른 나노바디이다.
상기한 나노바디를 당업계에 공지된 방법을 사용하여 연결시켜, 하나 이상의 나노바디를 포함하는 본원에서 기술한 임의의 항-A-베타 폴리펩타이드를 형성시킬 수 있다. 예를 들면, 상기한 나노바디를, 아미노산 잔기를 문헌[참조: Blattler et al, Biochemistry 24, 1517-1524; EP294703]에 기술된 바와 같은 유기 유도체화제와 반응시킴으로써 화학적 가교결합에 의해 융합시킬 수 있다. 대안으로, 나노바디를 DNA 수준에서 유전적으로 융합시킬 수 있는데, 하나 이상의 항-A-베타 나노바디 및 임의로 하나 이상의 항-혈청 단백질 나노바디, 및 임의로 하나 이상의 항-단백질 tau 나노바디를 포함하는 완전한 항-A-베타 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 형성시킨다. 이가 또는 다가 나노바디의 제조 방법은 PCT 특허 출원 제WO 96/34103호에 개시되어 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따라서, 나노바디는 직접적으로 또는 링커 서열을 통해서 서로 연결될 수 있다. 이러한 작제물은 대형(bulky) 서브유닛의 입체적 장해로 인해서 기능성이 손실되거나 크게 감소될 수 있기 때문에 통상의 항체로는 제조가 곤란하다. 본 발명의 나노바디로 알 수 있는 바와 같이, 기능성은, 이들 나노바디가 함께 연결되는 경우에, 일가 항-A-베타 폴리펩타이드와 비교하여 상당히 증가된다.
본 발명의 한 측면에 따라서, 나노바디는 직접적으로 링커의 사용 없이 서로 연결된다. 두 서브유닛에서 결합 활성을 유지시키기 위해 링커 서열이 요구되는 대형의 통상적 항체를 연결시킬 때와는 대조적으로, 본 발명의 폴리펩타이드를 직접 연결시킴으로써 링커 서열의 잠재적 문제점, 예를 들면, 사람 피험체에게 투여되는 경우의 항원성 또는 서브유닛의 해리를 초래하는 링커 서열의 불안정성을 피할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따라서, 나노바디는 펩타이드 링커 서열을 통해서 서로 연결된다. 이러한 링커 서열은 천연 발생 서열 또는 비-천연 발생 서열일 수 있다. 링커 서열은 항-A-베타 폴리펩타이드가 투여되는 피험체에서 비-면역원성인 것으로 예상된다. 링커 서열은 단백질분해성 분해에 대한 내성이 있는 동시에 다가 항-A-베타 폴리펩타이드에 충분한 유연성(flexibility)을 제공할 것으로 예상된다. 링커 서열의 비제한적 예는 WO 96/34103에 기술된 나노바디의 힌지 영역으로부터 유래될 수 있는 링커 서열이다. 다른 예는 링커 서열 3a(Ala-Ala-Ala)이다.
이특이적 및 이가 항-A-베타 폴리펩타이드의 융합을 위한 본 발명에 의해 작제된 대안적 링커 서열은 계류중인 국제 출원 제PCT/EP2004/004928호에 기재되어 있다. 한가지 링커 서열은 라마 상단 긴 힌지 영역(llama upper long hinge region)이다. 다른 링커는 상이한 길이의 Gly/Ser 링커이다. 상기 서열 링커를 사용하여 본 발명의 임의의 2개의 일가 서열을 융합시킬 수 있음은 당업자에게 명백하다.
본 발명의 한 측면에 따라서, 항-A-베타 폴리펩타이드는 전체길이 항-A-베타 폴리펩타이드의 상동 서열일 수 있다. 본 발명의 다른 측면에 따라서, 항-A-베타 폴리펩타이드는 전체길이 항-A-베타 폴리펩타이드의 기능적 부분일 수 있다. 본 발명의 또 다른 측면에 따라서, 항-A-베타 폴리펩타이드는 전체길이 항-A-베타 폴리펩타이드의 상동 서열의 기능적 부분일 수 있다. 본 발명의 한 측면에 따라서, 항-A-베타 폴리펩타이드는 항-A-베타 폴리펩타이드의 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 한 측면에 따라서, 항-A-베타 폴리펩타이드를 형성하는데 사용되는 나노바디는 완전한 나노바디(예를 들면, 나노바디) 또는 이의 상동 서열일 수 있다. 본 발명의 또 다른 측면에 따라서, 항-A-베타 폴리펩타이드를 형성하는데 사용되는 나노바디는 완전한 나노바디의 기능적 부분일 수 있다. 본 발명의 또 다른 측면에 따라서, 항-A-베타 폴리펩타이드를 형성하는데 사용되는 나노바디는 완전한 나노바디의 상동 서열일 수 있다. 본 발명의 또 다른 측면에 따라서, 항-A-베타 폴리펩타이드를 형성하는데 사용되는 나노바디는 완전한 나노바디의 상동 서열의 기능적 부분일 수 있다. 다른 부분에서 언급되는 바와 같이, 중쇄 항체는 나노바디일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 본 발명의 상동 서열은 본 발명의 폴리펩타이드의 기능적 특성을 변경시키는, 하나 이상의 아미노산의 부가, 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 결실 또는 치환되는 아미노산 수는 바람직하게는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 또는 70개 아미노산이다.
본 발명에 따른 상동 서열은 아미노산의 부가, 결실 또는 치환에 의해 변형된 항-A-베타 폴리펩타이드일 수 있으며, 이때 상기 변형은 변형되지 않은 폴리펩타이드와 비교해 기능적 특성을 실질적으로 변경시키지 않는다.
본 발명에 따른 상동 서열은 기타 낙타과 종, 예를 들면, 낙타, 단봉낙타, 라마, 알파카 및 구아나코 등에 존재하는 서열일 수 있다.
상동 서열이 서열 동일성을 나타내는 경우, 이는 모 서열과 높은 서열 동일성(70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 이상의 서열 동일성)을 나타내고 바람직하게는 모 서열의 유사한 특성, 즉 동일 표적에 대한 결함을 특징으로 하는 서열을 의미한다.
본 발명에 따른 상동 뉴클레오타이드 서열은 엄중한 하이브리드화(stringent hybridisation) 조건(예를 들면, 문헌[참조: Sambrook et al., Molecular Cloning, Laboratory Manuel, Cold Spring, Harbor Laboratory press, New York]에 기술된 조건)하에 모 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 역-상보체와 하이브리드화할 수 있는 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 800 또는 1000개 이상의 뉴클레오타이드 서열을 지칭할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 기능적 부분은 관심대상의 상호작용이 1 x 10-6 M 이상의 친화성으로 유지되도록 하기에 충분한 크기의 중쇄 항체 또는 나노바디의 서열을 지칭한다.
대안으로서, 기능적 부분은 완전한 아미노산 서열의 부분적 결실을 포함하고 표적의 결합 및 표적과의 상호작용을 위해 필수적인 결합 부위(들) 및 단백질 도메인(들)을 여전히 유지한다.
대안으로서, 중쇄 항체 또는 본 발명의 나노바디의 기능적 부분은 완전한 아미노산 서열의 부분적 결실을 포함하고 여전히 표적의 결합 및 표적과의 상호작용을 위해 필수적인 결합 부위(들) 및 단백질 도메인(들)을 유지한다.
대안으로, 서열번호 73 내지 105 또는 117 내지 183에 제시된 임의의 서열의 기능적 부분은 완전한 아미노산 서열의 부분적 결실을 포함하고 A-베타의 다른 A-베타에 대한 결합의 억제를 위해 필수적인 결합 부위(들) 및 단백질 도메인(들)을 여전히 유지하는 폴리펩타이드이다.
대안으로, 서열번호 73 내지 105 또는 117 내지 183로 나타내지는 임의의 서열의 기능적 부분은 완전한 아미노산 서열의 부분적 결실을 포함하고 A-베타의 결합 및 A-베타와의 상호작용을 위해 필수적인 결합 부위(들) 및 단백질 도메인(들)을 여전히 유지하는 폴리펩타이드이다.
대안으로, 기능적 부분은 완전한 아미노산 서열의 부분적 결실을 포함하고 발생된 항원의 결합 및 발생된 항원과의 상호작용을 위해 필수적인 결합 부위(들) 및 단백질 도메인(들)을 여전히 유지하는 폴리펩타이드이다. 이는 나노바디를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 기능적 부분은 완전한 서열의 100% 미만(예를 들면, 99%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1% 등)을 지칭하지만, 5개 이상의 아미노산 또는 15개 이상의 뉴클레오타이드를 포함한다.
본 발명의 상동 서열은 사람화된 항-A-베타 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 본 발명의 상동 서열은 사람화된 항-tau 폴리펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. 신규 나노바디 부류의 항체의 사람화는 투여시 사람 개체에서 원치않는 면역반응의 가능성을 추가로 감소시킬 수 있다.
중쇄 항체 또는 나노바디의 또 다른 예는 항원 결합에서 기능적인 단편을 의미하는 "기능적 단편"(WO03/035694에 기술된 바와 같음)을 포함한다. 이러한 단편은 활성 항원 결합 영역을 포함한다. 이러한 단편은 상기한 바와 같은 중쇄 항체 또는 나노바디의 단편, 기능적 중쇄 항체 또는 나노바디와 유사하게 거동하는 분자의 단편, 기능화된 항체의 단편 또는 하나 이상의 아미노산 잔기를 낙타과-특이적 잔기로 치환시킴에 의해 변형된 통상의 4쇄 항체로부터 유래된 중쇄 항체의 단편일 수 있다.
중쇄 항체, 나노바디, VH 도메인 또는 이들의 단편과 관련하여 "기능적"은 이들이 생체내에서의 결합과 비교하여 이의 에피토프에 대한 현저한 결합(마이크로몰 범위 이상의 해리 상수)을 보유하고 응집을 나타내지 않거나 제한된 응집(1 mg/ml 이상에서 가용성이고 응집되지 않음)을 나타내어, 당해 항체를 결합제로서 사용할 수 있도록 함을 의미한다.
중쇄 항체, 나노바디 또는 이들의 단편과 관련하여 "기능화된"은 상기 중쇄 항체, 나노바디 또는 이들의 단편이 기능적이 되도록 함을 의미한다.
기능적 단편의 의미에서 사용되는 "이의 단편"이란, 해당 서열의 95% 초과, 90% 초과, 85% 초과, 80% 초과, 75% 초과, 70% 초과, 65% 초과, 60% 초과, 55% 초과 또는 50% 초과에 상응하는 부분을 의미한다.
본 발명에 따라서, 표적은 A-베타, tau 또는 혈청 단백질 중 어느 하나이다. 상기 표적은 포유동물의 것이며, 토끼, 마우스, 랫트, 소, 송아지, 낙타, 라마, 원숭이, 당나귀, 기니아 피그, 닭, 양, 개, 고양이, 말 및 바람직하게는 사람으로부터 유래된다.
A-베타, tau 및 혈청 단백질(예: 혈청 알부민, 혈청 면역글로불린, 티록신-결합 단백질, 트랜스페린, 피브리노겐)과 같은 본원에 언급된 표적은 상기 표적들의 단편일 수 있다. 따라서, 표적은 또한 면역반응을 유도할 수 있는 상기 표적의 단편이다. 표적은 또한 전체길이 표적에 대해 발생된 중쇄 항체 또는 나노바디에 결합할 수 있는 상기 표적의 단편이다.
표적에 대해 지시된 중쇄 항체 또는 나노바디는 10-6M 초과의 친화성으로 표적에 결합할 수 있는 중쇄 항체 또는 나노바디를 의미한다.
A-베타는 전체길이 A-베타 또는 A-베타의 임의의 단편으로서 이해될 것이다. A-베타 단편은 APP 및 APLP의 세크레타제 매개된 절단 후에 생성된 임의의 A-베타 또는 임의의 다른 경루에 의해 직접 또는 간접적으로 생성된 임의의 다른 A-베타이다. A-베타 단편의 예에는 상기 배경기술 단락에서 기술한 절단 후에 수득된 단편이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 단편의 예에는 A-베타 (1-42) 및 A-베타 (1-40)이 포함된다.
본원에서 사용되는 단편은 해당 서열의 100% 미만(예를 들면, 99%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 등)을 지칭하지만, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25개 이상의 아미노산을 포함한다. 단편은 관심대상의 상호작용이 1 x 10-6M 이상의 친화성으로 유지되도록 하기에 충분한 길이이다.
본원에서 사용되는 단편은 또한 야생형 표적에 대해 발생된 나노바디에 결합하는 표적의 능력을 실질적으로 변경하지 않는 하나 이상의 아미노산의 임의의 삽입, 결실 및 치환을 지칭한다. 아미노산 삽입, 결실 또는 치환의 수는 바람직하게는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 또는 70개의 아미노산이다.
본 발명의 하나의 양태는 하나 이상의 아미노산 잔기가 항원 결합 능력을 실질적으로 변경하지 않으면서 치환된 하나 이상의 나노바디를 포함하는 폴리펩타이드에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는 APP 및 APLP의 세크레타제 매개된 절단 또는 A-베타 절단 산물, 예를 들면, BACE1 또는 BACE2에 의한 절단 산물을 초래하는 임의의 다른 절단 후에 생성되거나 노출된 A-베타 신생-에피토프에 결합할 수 있는 하나 이상의 나노바디를 포함하는 폴리펩타이드에 관한 것이다.
A-베타, tau 및 혈청 단백질과 같은 본원에 언급된 표적은 마우스, 사람, 낙타, 라마, 상어, 복어, 염소, 토끼, 소를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 종에 존재할 수 있는 서열일 수 있다.
표적은 완전한 표적의 상동 서열일 수 있다. 표적은 완전한 표적의 상동 서열의 단편일 수 있다.
당업자라면 본 발명의 항-A-베타 및 항-tau 폴리펩타이드가 변형될 수 있고, 이러한 변형이 본 발명의 범주내에 있음을 인지할 것이다. 예를 들면, 폴리펩타이드는 약물 담체로서 사용될 수 있으며, 이 경우에 이들은 치료학적으로 활성인 제제에 융합될 수 있거나 이들의 가용화도 특성은 이온성/이극성 그룹에 대한 융합에 의해 변경될 수 있거나, 이들은 적절한 영상화 마커에 대한 융합에 의해 영상화에서 사용될 수 있거나, 이들은 변형된 아미노산 등을 포함할 수 있다. 이들은 염으로서 제조될 수도 있다. A-베타 및/또는 단백질 tau에 대한 결합을 본질적으로 보유하는 이러한 변형은 본 발명의 범주내에 있다.
본원의 개시내용으로부터 명백한 바와 같이, 본원에 정의된 본 발명의 나노바디의 천연 또는 합성 유사체, 돌연변이체, 변이체, 대립형질 유전자, 상동체 및 동족체(ortholog)(본원에서 "유사체"로서 총칭됨), 특히 서열번호 73 내지 105의 나노바디의 유사체를 사용하는 것도 또한 본 발명의 범주내에 있다. 따라서, 본 발명의 한 양태에 따라서, "본 발명의 나노바디"란 용어는 이의 가장 광의적 의미에서 이러한 유사체를 또한 포함한다.
일반적으로, 이러한 유사체에서, 하나 이상의 아미노산 잔기가 본원에 정의된 본 발명의 나노바디와 비교하여, 치환, 결실 및/또는 부가될 수 있다. 이러한 치환, 삽입 또는 결실이 하나 이상의 골격 영역 및/또는 하나 이상의 CDR 내에서 이루어질 수 있는 경우, 지표 잔기에서의 치환, 삽입 또는 결실이 일반적으로 덜 바람직하지만(본원에서 기술한 적합하나 사람화 치환이 아닌 경우) 이러한 치환, 삽입 또는 결실은 하나 이상의 지표 잔기 및/또는 골격 잔기내 하나 이상의 다른 위치에서 이루어질 수 있다.
비제한적 예로서, 본 발명은 일반적으로 이에 제한되지 않지만, 치환은 예를 들면, 보존적 치환(본원에 기술된 바와 같음)일 수 있고/있거나 아미노산 잔기는 다른 VHH 도메인내의 동일한 위치에서 천연적으로 발생하는 다른 아미노산 잔기로 치환될 수 있다(이러한 치환에 대한 일부 비제한적 예에 대해서는 표 4 내지 7을 참조). 따라서, 본 발명의 나노바디의 특성을 향상시키거나 적어도 본 발명의 나노바디의 바람직한 특성 또는 바람직한 특성의 균형 또는 조합을 너무 많이(즉, 당해 나노바디가 이의 의도된 용도에 더이상 적합하지 않은 정도로) 손상시키지 않는 임의의 하나 이상의 치환, 결실 또는 삽입, 또는 이들의 조합은 본 발명의 범주내에 포함된다. 당업자는 일반적으로 본원의 개시내용에 기초하여, 임의로 예를 들면, 제한된 수의 가능한 치환을 도입하고 이렇게 수득된 나노바디의 특성에 대한 영향을 측정함을 포함할 수 있는 제한된 정도의 통상적 실험 후에, 적합한 치환, 결실 또는 삽입, 또는 이들의 적합한 조합을 결정할 수 있다.
예를 들면, 본 발명의 나노바디 또는 폴리펩타이드를 발현하는데 사용되는 숙주에 따라서, 이러한 결실 및/또는 치환은 당업자의 능력 범위 내에 있는 바와 같이 해독후 변형을 위한 하나 이상의 부위(예를 들면, 하나 이상의 글리코실화 부위)가 제거되도록 하는 방식으로 설계될 수 있다. 대안으로, 치환 또는 삽입은 기능 그룹(본원에 기술된 바와 같음)의 부착을 위한 하나 이상의 부위가 도입되도록, 예를 들면, 부위-특이적 페길화(본원에 기술된 바와 같음)가 허용되도록 설계될 수 있다.
상기 표 4 내지 7에 기재된 VHH 엔트로피 및 VHH 변이도에 관한 데이타로부터 알 수 있는 바와 같이, 골격 영역내의 일부 아미노산 잔기는 다른 잔기보다 보존된다. 일반적으로, 본 발명이 이의 가장 광의적 의미에서 이로 제한되지 않지만, 임의의 치환, 결실 또는 삽입은 바람직하게는 덜 보존된 위치에서 이루진다. 또한, 일반적으로, 아미노산 치환이 아미노산 결실 또는 삽입보다 바람직하다.
유사체는 바람직하게는 10-5 내지 10-12 몰/리터 이하, 바람직하게는 10-7 내지 10-12 몰/리터 이하, 보다 바람직하게는 10-8 내지 10-12 몰/리터의 해리 상수(KD), 및/또는 107 M-1 이상, 바람직하게는 108 M-1 이상, 보다 바람직하게는 109 M-1 이상, 예를 들면, 1012 M-1 이상의 결합 친화성, 및/또는 500 nM 미만, 바람직하게는 200 nM 미만, 보다 바람직하게는 10 nM 미만, 예를 들면, 500 pM 미만의 친화성으로 A-베타에 결합한다. A-베타에 대한 유사체의 친화성은 공지된 방법으로, 예를 들면, 본원에 기술된 검정을 사용하여 측정할 수 있다.
유사체는 바람직하게는 본원에 기술된 나노바디의 바람직한 특성을 보유한다.
또한, 하나의 바람직한 양태에 따라서, 유사체는 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 예를 들면, 95% 이상 또는 99% 이상의 서열 동일성 정도를 갖고/갖거나, 바람직하게는 서열번호 73 내지 105의 나노바디 중 하나와 최대 20개, 바람직하게는 최대 10개, 보다 더욱 바람직하게는 최대 5개, 예를 들면, 4개, 3개, 2개 또는 오직 1개의 아미노산 차이(본원에서 정의된 바와 같음)를 갖는다.
또한, 유사체의 골격 서열 및 CDR은 바람직하게는 본원에 정의된 바람직한 양태에 따르도록 한다. 보다 일반적으로, 본원에 기술된 바와 같이, 유사체는 (a) 위치 108의 Q 및/또는 (b) 위치 45의 하전된 아미노산 또는 시스테인 잔기, 바람직하게는 위치의 E, 보다 바람직하게는 위치 44의 E 및 위치 45의 R 및/또는 (c) 위치 103의 P, R 또는 S를 가질 수 있다.
본 발명의 나노바디의 유사체의 하나의 바람직한 부류는 사람화된(즉, 천연 발생 본 발명의 나노바디의 서열과 비교하여) 나노바디를 포함한다. 본원에 인용된 배경 기술에서 언급된 바와 같이, 이러한 사람화는 일반적으로 천연 발생 VHH의 서열내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 사람 VH3 도메인과 같은 사람 VH 도메인내의 동일한 위치에서 발생하는 아미노산 잔기로 치환시킴을 포함한다. 가능한 사람화 치환 또는 사람화 치환의 조합의 예는 본원의 표, 본원에 인용된 배경기술에 언급된 가능한 사람화 치환 및/또는 나노바디의 서열과 천연 발생 사람 VH 도메인의 서열 간의 비교로부터 당업자에게 명백할 것이다.
사람화 치환은 수득되는 사람화된 나노바디가 본원에 정의된 나노바디의 바람직한 특성을 여전히 보유하도록, 보다 바람직하게는 수득되는 사람화된 나노바디가 앞의 단락에서 유사체에 대해 기술한 바와 같도록 선택되어야 한다. 당업자라면 일반적으로 본원의 개시내용에 기초하여, 임의로 예를 들면, 제한된 수의 가능한 치환을 도입하고 이렇게 수득된 나노바디의 특성에 대한 영향을 측정함을 포함할 수 있는 제한된 정도의 통상적 실험 후에 적합한 사람화 치환 또는 사람화 치환의 적합한 조합을 결정하고 선별할 수 있을 것이다.
본 발명의 사람화된 나노바디의 일부 바람직하지만 비제한적인 예는 서열번호 85 내지 105에 기재된다.
일반적으로, 사람화의 결과로서, 본 발명의 나노바디는 본원에 기술된 본 발명의 나노바디의 바람직한 특성을 여전히 보유하면서 보다 "사람-유사"할 수 있다. 그 결과로서, 이러한 사람화된 나노바디는 상응하는 천연 발생 VHH 도메인과 비교하여 감소된 항원성과 같은 몇가지 장점을 가질 수 있다. 다시, 본원의 개시내용에 기초하여, 임의로 제한된 정도의 통상적 실험 후에, 당업자는 사람화 치환에 의해 제공된 바람직한 특성 및 천연 발생 VHH 도메인의 바람직한 특성 간의 목적하는 또는 적합한 균형을 최적화하거나 달성하는 사람화 치환 또는 사람화 치환의 적합한 조합을 선별할 수 있을 것이다.
사람화 및 다른 유사체, 및 이들을 암호화하는 핵산 서열은 공지된 방식으로 제공될 수 있다. 예를 들면, 유사체는, 천연 발생 VHH 도메인을 암호화하는 핵산을 제공하고, 치환될 하나 이상의 아미노산 잔기에 대한 코돈을 상응하는 목적하는 아미노산 잔기에 대한 코돈으로 치환시키고(예를 들면, 부위 지시된 돌연변이유발 또는 적합한 미스매치 프라이머를 사용한 PCR에 의해), 이렇게 수득된 핵산/뉴클레오타이드 서열를 적합한 숙주 또는 발현 시스템에서 발현시키고, 임의로, 이렇게 수득된 유사체를 분리 및/또는 정제하여 상기 유사체를 본질적으로 분리된 형태(예를 들면, 본원에 추가로 기술된 바와 같음)로 수득함으로써 수득될 수 있다. 이는 일반적으로 본원에 인용된 교과서 및 참조문헌으로부터 당업자에게 명백할 수 있는 공지된 방법 및 기술을 사용하여 수행할 수 있다. 대안으로, 목적하는 유사체를 암호화하는 핵산은 공지된 방식으로(예를 들면, 미리 결정된 아미노산 서열을 갖는 핵산 서열을 합성하기 위한 자동화 장치를 사용하여) 합성할 수 있고 이어서 본원에 기술된 바와 같이 발현시킬 수 있다. 또 다른 기술은 각각 목적하는 유사체의 부분을 암호하하는 하나 이상의 천연 발생 핵산 서열 및/또는 합성 핵산 서열을 조합한 다음, 조합된 핵산 서열을 본원에 기술된 바와 같이 발현시킴을 포함할 수 있다. 또한, 유사체는 본원에 언급된 바와 같은 공지된 펩타이드 합성용 기술을 사용하여 적절한 아미노산 서열의 화학적 합성을 사용하여 제공할 수 있다.
이러한 점에서, 본 발명의 나노바디(이의 유사체를 포함)를, 본 발명의 나노바디의 서열을 제공하도록 및/또는 이렇게 수득된 서열에 나노바디의 바람직한 특성을 부여하도록 하나 이상의 카멜화 치환을 도입킴으로써(즉, 상기 사람 VH 도메인의 아미노산 서열내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 VHH 도메인내의 상응하는 위치에서 발생하는 아미노산 잔기로 변경함으로써) 사람 VH 서열(즉, 아미노산 서열 또는 상응하는 뉴클레오타이드 서열), 예를 들면, DP-47, DP-51 또는 DP-29와 같은 사람 VH3 서열로부터 설계하고/하거나 제조할 수 있다는 것도 또한 당업자에게 명백할 것이다. 다시, 이는 일반적으로 출발점으로서 사람 VH 도메인에 대한 아미노산 서열 및/또는 뉴클레오타이드 서열을 사용한, 상기 단락에 언급된 각종 방법 및 기술을 사용하여 수행할 수 있다.
일부 바람직하지만 비제한적인 카멜화 치환은 표 4 내지 7로부터 유도될 수 있다. 지표 잔기에서의 치환 및 다른 아미노산 위치에서의 치환 둘다 및 이들의 적합한 조합이 본 발명의 범주내에 있다해도, 하나 이상의 지표 잔기에서의 카멜화 치환은 목적하는 특성에 하나 이상의 다른 아미노산 위치에서의 치환보다 더 큰 영향을 줄 수 있음이 또한 명백할 것이다. 예를 들면, 적어도 몇가지 목적하는 특성을 이미 부여하는 하나 이상의 카멜화 치환을 도입한 다음, 상기 특성을 추가로 향상시키고/시키거나 부가적인 바람직한 특성을 부여하는 추가의 카멜화 치환을 도임할 수 있다. 다시, 당업자라면 일반적으로 본원의 개시내용에 기초하여, 임의로 예를 들면, 제한된 수의 가능한 치환을 도입하고 나노바디의 바람직한 특성이 수득되었는지 향상되었는지를 결정함을 포함할 수 있는 제한된 정도의 통상적 실험 후에 적합한 카멜화 치환 또는 카멜화 치환의 적합한 조합을 결정하고 선별할 수 있을 것이다(예를 들면, 원래의 VH 도메인에 비해).
그러나, 일반적으로 이러한 카멜화 치환은 바람직하게는 수득되는 아미노산 서열이 적어도 (a) 위치 108의 Q 및/또는 (b) 위치 45의 하전된 아미노산 또는 시스테인 잔기, 바람직하게는 위치의 E, 보다 바람직하게는 위치 44의 E 및 위치 45의 R 및/또는 (c) 위치 103의 P, R 또는 S 및 임의로 하나 이상의 추가의 카멜화 치환을 함유하도록 한다. 보다 바람직하게는, 카멜화 치환은 본 발명의 나노바디 및/또는 이의 유사체(본원에서 정의된 바와 같음), 예를 들면, 앞의 단락에서 정의된 바와 같은 사람화된 유사체 및/또는 바람직하게는 유사체가 수득되도록 한다.
본원의 개시내용으로부터 또한 명백한 바와 같이, 본원에 정의된 본 발명의 나노바디의 부분 또는 단편, 또는 2개 이상의 부분 또는 단편의 조합 및 특히, 서열번호 73 내지 105의 나노바디의 부분 또는 단편을 사용하는 것도 또한 본 발명의 범주내에 있다. 따라서, 본 발명에 따라서, "본 발명의 나노바디"란 용어는 이의 가장 광의적 의미에서 이러한 부분 또는 단편을 또한 포함한다.
일반적으로, 이러한 본 발명의 나노바디의 부분 또는 단편(이의 유사체를 포함)은 상응하는 전체길이 본 발명의 나노바디(또는 이의 유사체)의 아미노산 서열과 비교하여, N-말단의 하나 이상의 아미노산 잔기, C-말단의 하나 이상의 아미노산 잔기, 하나 이상의 연속된 내부 아미노산 잔기 또는 이들의 임의의 배합물이 결실 및/또는 제거된 아미노산 서열을 갖는다.
부분 또는 단편은 바람직하게는 10-5 내지 10-12 몰/리터 이하, 바람직하게는 10-7 내지 10-12 몰/리터 이하, 보다 바람직하게는 10-8 내지 10-12 몰/리터의 해리 상수(KD), 및/또는 107 M-1 이상, 바람직하게는 108 M-1 이상, 보다 바람직하게는 109 M-1 이상, 예를 들면, 1012 M-1 이상의 결합 친화성, 및/또는 500 nM 미만, 바람직하게는 200 nM 미만, 보다 바람직하게는 10 nM 미만, 예를 들면, 500 pM 미만의 친화성으로 A-베타에 결합할 수 있다. A-베타에 대한 유사체의 친화성은 공지된 방식으로, 예를 들면, 본원에 기술된 검정을 사용하여 측정할 수 있다.
임의의 부분 또는 단편은 바람직하게는 본 발명의 상응하는 전체길이 나노바디의 아미노산 서열의 10개 이상의 연속된 아미노산 잔기, 바람직하게는 20개 이상의 연속된 아미노산 잔기, 보다 바람직하게는 30개 이상의 연속된 아미노산 잔기, 예를 들면, 40개 이상의 연속된 아미노산 잔기를 포함한다.
또한, 임의의 부분 또는 단편은 바람직하게는 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 중 하나 이상 또는 이의 적어도 일부분(및 특히 적어도 CDR3 또는 이의 적어도 일부분)을 포함한다. 보다 바람직하게는, 임의의 부분 또는 단편은 바람직하게는 적합한 골격 서열(들) 또는 이의 적어도 일부분에 의해 연결된, CDR중 하나 이상(및 바람직하게는 적어도 CDR3 또는 이의 일부분) 및 하나 이상의 다른 CDR(즉, CDR1 또는 CDR2) 또는 이의 적어도 일부분을 포함한다. 보다 바람직하게는, 임의의 부분 또는 단편은 바람직하게는 적합한 골격 서열(들) 또는 이의 적어도 일부분에 의해 연결된, CDR중 하나 이상(및 바람직하게는 적어도 CDR3 또는 이의 일부분) 및 2개의 나머지 CDR을 포함한다.
다른 특히 바람직하지만 비제한적인 양태에 따라서, 이러한 부분 또는 단편은 국제 출원 제WO 03/050531호(Lasters 등)에 기술된 바와 같이 적어도 CDR3, 예를 들면, 본 발명의 상응하는 전체길이 나노바디의 예를 들면, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다.
앞에서 이미 언급한 바와 같이, 또한 이러한 부분 또는 단편(즉, 동일하거나 상이한 본 발명의 나노바디로부터의) 2개 이상을 조합하여 유사체(본원에서 정의된 바와 같음)를 제공하고/하거나 본 발명의 나노바디의 추가의 부분 또는 단편(본원에서 정의된 바와 같음)을 제공할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 나노바디의 하나 이상의 부분 또는 단편을 사람 VH 도메인의 하나 이상의 부분 또는 단편을 조합할 수도 있다.
하나의 바람직한 양태에 따라서, 부분 또는 단편은 서열번호 73 내지 105의 나노바디 중 하나와 50% 이상, 바람직하게는 60% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 예를 들면, 95% 이상 또는 99% 이상의 서열 동일성 정도를 갖는다.
부분 및 단편, 이들을 암호화하는 핵산이 제공될 수 있으며, 임의로 임의의 공지된 방식으로 조합될 수 있다. 예를 들면, 이러한 부분 또는 단편은 전체길이의 본 발명의 나노바디를 암호화하는 핵산에 종결 코돈을 삽입한 다음, 이렇게 수득된 핵산을 공지된 방식(예를 들면, 본원에 기술된 바와 같음)으로 발현시켜 수득할 수 있다. 대안으로, 이러한 부분 또는 단편을 암호화하는 핵산은 전체길이의 본 발명의 나노바디를 암호화하는 핵산을 적합하게 한정하거나 이러한 핵산을 공지된 방식으로 합성함으로써 수득할 수 있다. 부분 또는 단편은 또한 공지된 펩타이드 합성용 기술을 사용하여 제공될 수도 있다.
본 발명은 이의 가장 광의적 의미에서, 본 발명의 나노바디의 유도체를 또한 포함한다. 이러한 유도체는 일반적으로 본 발명의 나노바디 및/또는 본 발명의 나노바디를 형성하는 하나 이상의 아미노산 잔기의 변형, 특히 화학적 및/또는 생물학적(예: 효소적) 변형에 의해 수득될 수 있다.
이러한 변형의 예 및 이러한 변형을 도입하는데 사용될 수 있는 방식(즉, 단백질 주쇄, 그러나 바람직하게는 측쇄상에서), 방법 및 기술로 변형될 수 있는 나노바디 서열내 아미노산 잔기의 예 및 이러한 변형의 잠재적 용도 및 장점은 당업자에게 명백할 것이다.
예를 들면, 이러한 변형은 하나 이상의 작용 그룹, 잔기 또는 일부, 특히 본 발명의 나노바디에 하나 이상의 목적하는 특성 또는 기능성을 부여하는 하나 이상의 작용 그룹, 잔기 또는 일부를 본 발명의 나노바디로 도입(예를 들면, 공유 연결 또는 다른 적합한 방식에 의한 도입)시킴을 포함할 수 있다. 이러한 작용 그룹의 예는 당업자에게 명백할 것이다.
예를 들면, 이러한 변형은 본 발명의 나노바디의 반감기, 가용성 및/또는 흡착을 증가시키고, 본 발명의 나노바디의 면역원성 및/또는 독성을 감소시키고, 본 발명의 나노바디의 임의의 원치않는 부작용을 제거하거나 감쇠시키고/시키거나 다른 유리한 특성을 본 발명의 나노바디 및/또는 폴리펩타이드에 부여하고/하거나 본 발명의 나노바디 및/또는 폴리펩타이드의 원치않는 특성을 감소시키는 도입(예를 들면, 공유 연결 또는 다른 적합한 방식에 의한 도입) 또는 상기한 것 2가지 이상의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 이러한 작용 그룹 및 이들을 도입시키는 기술은 당업자에게 명백할 것이며, 일반적으로 상기 인용된 일반적 배경기술에서 언급된 모든 작용 그룹 및 기술 뿐만 아니라 약제학적 단백질의 변형, 특히 항체 또는 항체 단편(ScFv 및 단일 도메인 항체를 포함)의 변형용으로 공지된 작용 그룹 및 기술을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 문헌[참조: Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1980)]을 참조한다. 이러한 작용 그룹은 당업자에게 명백한 바와 같이, 예를 들면, 본 발명의 나노바디에 직접적으로 연결(예를 들면, 공유 연결)되거나, 임의로 적합한 링커 또는 스페이서를 통해 연결될 수 있다.
약제학적 단백질의 반감기를 증가시키고/시키거나 면역원성을 감소시키기 위해 널리 사용되는 기술중 하나는 적합한 약리학적으로 허용되는 중합체, 예를 들면, 폴리(에틸렌글리콜)(PEG) 또는 이의 유도체(예: 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 또는 mPEG)의 부착을 포함한다. 일반적으로, 항체 및 항체 단편((단일) 도메인 항체 및 ScFv를 포함하나 이에 제한되지 않음)에 대해 당업계에서 사용되는 페길화와 같은 페길화의 임의의 적합한 형태가 사용될 수 있으며, 예를 들면, 문헌[참조: Chapman, Nat. Biotechnol., 54, 531-545 (2002); Veronese and Harris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 453-456 (2003), Harris and Chess, Nat. Rev. Drug. Discov., 2, (2003) 및 WO 04/060965]을 참조한다. 단백질의 페길화를 위한 각종 시약은 예를 들면, 넥타 테라퓨틱스(Nektar Therapeutics, USA)로부터 상업적으로 입수할 수도 있다.
바람직하게는, 특히 시스테인-잔기를 통한 부위-지시된 페길화[참조: Yang et al., Protein Engineering, 16, 10, 761-770 (2003)]가 사용된다. 예를 들면, 이러한 목적으로, 모두 당업자에게 공지된 단백질 공학 기술을 사용하여, PEG를 본 발명의 나노바디에서 천연적으로 발생하는 시스테인 잔기에 부착시킬 수 있거나, 본 발명의 나노바디를 PEG의 부착을 위한 하나 이상의 시스틴 잔기를 적합하게 도입하도록 변형시킬 수 있거나, PEG의 부착을 위한 하나 이상의 시스틴 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 본 발명의 나노바디의 N- 및/또는 C-말단에 융합시킬 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 나노바디 및 단백질에 있어, 5000 이상, 예를 들면, 10,000 초과 및 200,000 미만, 예를 들면, 100,000 미만의 분자량, 예를 들면, 20,000 내지 80,000 범위의 분자량을 갖는 PEG가 사용된다.
다른, 통상적으로 덜 바람직한 변형은 본 발명의 나노바디 또는 단백질의 발현을 위해 사용되는 숙주 세포에 따라서, 통상적으로 공동 해독 및/또는 해독후 변형의 부분으로서 N-연결된 또는 O-연결된 글리코실화를 포함한다.
또 다른 변형은 표지된 나노바디의 의도된 용도에 따라서, 하나 이상의 검출가능한 표지 또는 다른 신호-생성 그룹 또는 잔기의 도입을 포함할 수 있다. 적합한 표지 및 이를 부착, 사용 및 검출하기 위한 기술은 형광 표지(예: 플루오레세인, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리트린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프트알데히드 및 플루오레스카민 및 형광성 금속, 예를 들면, 152Eu 또는 란탄계로부터의 기타 금속), 인광 표지, 화학발광 표지 또는 생물발광 표지(예: 루미날, 이소루미놀, 테로매틱(theromatic) 아크리디늄 에스테르, 이미다졸, 아크리디늄 염, 옥살레이트 에스테르, 디옥세탄 또는 GFP 및 이의 유사체), 방사선 동위원소(예: 3H, 125I, 32P, 35S, 14C, 51Cr, 36Cl, 57Co, 58Co, 59Fe 및 75Se), 금속, 금속 킬레이트 또는 금속성 양이온(예: 99mTc, 123I, 111In, 131I, 97Ru, 67Cu, 67Ga 및 68Ga와 같은 금속성 양이온) 또는 생체내, 시험관내 또는 원위치 진단 및 영상화에서 사용하기에 특히 적합한 기타 금속 금속 또는 금속성 양이온(예: 157Gd, 55Mn, 162Dy, 52Cr, 및 56Fe) 뿐만 아니라, 발색단 및 효소(예; 말레이트 데하이드로게나제, 스파필로코커스 뉴클레아제, 델타-V-스테로이드 이소머라제, 효모 알코올 데하이드로게나제, 알파-글리세로포스페이트 데하이드로게나제, 트리오스 포스페이트 이소머라제, 바이오틴아비딘 퍼옥시다제, 서양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 아스파라기나제, 글루코스 옥시다제, β-갈락토시다제, 리보뉴클레아제, 우레아제, 카탈라제, 글루코스-VI-포스페이트 데하이드로게나제, 글루코아밀라제 및 아세틸콜린 에스테라제)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 다른 적합한 표지는 당업자에게 명백할 것이며 NMR 또는 ESR 분광분석법을 사용하여 검출될 수 있는 잔기를 포함한다.
이러한 표지된 본 발명의 나노바디 및 폴리펩타이드는 예를 들면, 시험관내, 생체내 또는 원위치(in situ) 검정(ELISA, RIA, EIA 및 다른 "샌드위치 검정" 등을 포함)뿐만 아니라, 특이적 표지의 선택에 따라서 생체내 진단 및 영상화 목적에서 사용될 수 있다.
당업자에게 명백한 바와 같이, 다른 변형은 상기 언급된 금속 또는 금속성 양이온 중 하나를 킬레이트화시키기 위한 킬레이트 그룹의 도입을 포함할 수 있다. 적합한 킬레이트화 그룹에는 예를 들면, 제한됨이 없이, 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA) 또는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)이 포함된다.
또 다른 변형은 바이오틴-(스트렙트)아비딘 결합 쌍과 같은 특이적 결합 쌍 중 한 부분인 작용 그룹의 도입을 포함할 수 있다. 이러한 작용 그룹은 본 발명의 나노바디를 결합 쌍의 형성을 통해서 결합 쌍의 나머지 절반에 결합되는 다른 단백질, 폴리펩타이드 또는 화합물에 연결시키는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 나노바디는 바이오틴에 접합될 수 있고, 아비딘 또는 스트렙타비딘에 접합된다른 단백질, 폴리펩타이드, 화합물 또는 담체에 연결될 수 있다. 예를 들면, 이러한 접합된 나노바디는 예를 들면, 검출가능한 신호-생성 제제가 아비딘 또는 스트렙타비딘에 접합되는 진단 시스템에서 리포터(reporter)로서 사용될 수 있다. 이러한 결합 쌍은 예를 들면, 본 발명의 나노바디를 약제학적 목적에 적합한 담체를 포함하는 담체에 결합시키는데 사용될 수 있다. 한가지 비제한적 예는 문헌[참조: Cao and Suresh, Journal of Drug Targetting, 8, 4, 257 (2000)]에 기술된 리포좀 제형이다. 이러한 결합 쌍은 또한 치료학적 활성제를 본 발명의 나노바디에 연결시키는데 사용될 수도 있다.
다른 잠재적 화학적 및 효소적 변형은 당업자에게 명백할 것이다. 이러한 변형은 조사 목적을 위해(예를 들면, 기능-활성 관련성을 연구하기 위해) 도입될 수 있다. 예를 들면, 문헌[참조: Lundblad and Bradshaw, Biotechnol. Appl. Biochem., 26, 143-151 (1997)]을 참조한다.
바람직하게는, 유도체는 10-5 내지 10-12 몰/리터 이하, 바람직하게는 10-7 내지 10-12 몰/리터 이하, 보다 바람직하게는 10-8 내지 10-12 몰/리터 이하의 해리 상수(KD), 및/또는 107 M-1 이상, 바람직하게는 108 M-1 이상, 보다 바람직하게는 109 M-1 이상, 예를 들면, 1012 M-1 이상의 결합 친화성 및/또는 500 nM 미만, 바람직하게는 200 nM 미만, 보다 바람직하게는 10 nM 미만, 예를 들면, 500 pM 미만의 친화성으로 A-베타에 결합한다. A-베타에 대한 본 발명의 나노바디의 유도체의 친화성은 공지된 방식으로, 예를 들면, 본원에 기술된 검정을 사용하여 측정할 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명은 또한 하나 이상의 본 발명의 나노바디로이루어지거나 이를 포함하는 단백질 또는 폴리펩타이드에 관한 것이다. "본질적으로 이루어진"이란, 본 발명의 폴리펩타이드의 아미노산 서열이 본 발명의 나노바디의 아미노산 서열과 정확히 동일하거나, 당해 나노바디의 아미노산 서열의 아미노 말단, 카복시 말단 또는 아미노 말단과 카복시 말단 둘다에 제한된 수의 아미노산 잔기, 예를 들면, 1 내지 20개의 아미노산 잔기, 예를 들면, 1 내지 10개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 1 내지 6개의 아미노산 잔기, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5개 또는 6개의 아미노산 잔기가 부가된 본 발명의 나노바디의 아미노산 서열에 상응하는 것을 의미한다.
상기 아미노산 잔기는 나노바디의 (생물학적) 특성을 변화시키거나, 변경시키거나 또는 그밖에 영향을 줄 수 있거나 주지 않을 수 있거나, 당해 나노바디에 추가의 기능성을 부가할 수 있다. 예를 들면, 이러한 아미노산 잔기는
a) 이종 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서의 발현의 결과로서, N-말단 Met 잔기를 포함할 수 있다;
b) 합성시 숙주 세포로부터 나노바디의 분비를 지시하는 시그날 서열 또는 리더 서열을 형성할 수 있다. 적합한 분비성 리더 펩타이드는 당업자에게 명백할 것이며, 본원에서 추가 기술되는 바와 같다. 본 발명이 이의 가장 광의적 의미에서 이로 제한되지 않지만, 통상적으로 이러한 리더 서열은 나노바디의 N-말단에 연결될 것이다;
c) 나노바디가 특정 기관, 조직, 세포 또는 세포의 부분 또는 구획을 향해 지시되고/되거나 이들 내로 투과하거나 진입하도록 하고/하거나, 나노바디가 세포 막, 세포 층(예를 들면, 상피 세포의 층), 고형 종양을 포함하는 종양 또는 혈뇌 장벽과 같은 생물학적 장벽을 투과하거나 가로지를 수 있도록 하는 서열 또는 시그날을 형성할 수 있다. 이러한 아미노산 서열의 예는 당업자에게 명백할 것이다. 일부 비제한적 예는 문헌[참조: WO 03/026700 및 Temsamani et al., Expert Opin. Biol. Ther., 1, 773 (2001); Temsamani and Vidal, Drug Discov. Today, 9, 1012 (004) and Rousselle, J. Pharmacol. Exp. Ther., 296, 124-131 (2001)]에 기술된 소형 펩타이드 벡터("Pep-trans 벡터") 및 문헌[참조: Zhao et al., Apoptosis, 8, 631-637 (2003)]에 기술된 막 전위 서열이다. 항체 단편의 세포내 표적화를 위한 C-말단 및 N-말단 아미노산 서열은 예를 들면, 문헌[참조: Cardinale et al., Methods, 34, 171 (2004)]에 기술되어 있다. 세포내 표적화를 위한 다른 적합한 기술은 하기 언급하는 본 발명의 나노바디를 포함하는 소위 "내부체(intrabody)"의 발현 및/또는 사용을 포함한다;
d) 예를 들면, 당해 서열 또는 잔기에 대해 지시된 친화성 기술을 사용하여 "태그", 예를 들면, 나노바디의 정제를 가능하게 하거나 촉진하는 아미노산 서열 또는 잔기를 형성할 수 있다. 이후에, 상기 서열 또는 잔기를 제거하여(예를 들면, 화학적 또는 효소적 절단에 의해) 나노바디 서열을 제공할 수 있다(이러한 목적을 위해, 태그는 임의로 절단가능한 링커 서열을 통해 나노바디 서열에 연결되거나 절단가능한 모티프를 함유할 수 있다). 이러한 잔기의 일부 바람직하지만 비제한적인 예는 다중 히스티딘 잔기, 글루타티온 잔기 및 myc-태그, 예를 들면, AAAEQKLISEEDLNGAA [서열번호 31]이다;
e) 작용화되고/되거나 작용 그룹의 부착을 위한 부위로서 사용될 수 있는 하나 이상의 아미노산 잔기일 수 있다. 적합한 아미노산 잔기 및 작용 그룹은 당업자에게 명백할 것이며, 본 발명의 나노바디의 유도체에 대해 본원에 언급된 아미노산 잔기 및 작용 그룹을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
다른 양태에 따라서, 본 발명의 폴리펩타이드는 이의 아미노 말단, 이의 카복시 말단 또는 아미노 말단과 카복시 말단 둘다에 하나 이상의 추가 아미노산 서열을 갖는, 즉, 상기 본 발명의 나노바디와 하나 이상의 추가 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 제공하도록 하는 본 발명의 나노바디를 포함한다.
하나 이상의 추가 아미노산 서열은 어떠한 적합한 및/또는 목적하는 아미노산 서열이라도될 수 있다. 추가 아미노산 서열은 나노바디의 (생물학적) 특성을 변화시키거나, 변경시키거나 또는 그밖에 영향을 줄 수 있거나 주지 않을 수 있거나, 당해 나노바디에 추가의 기능성을 부가할 수 있다. 바람직하게는, 추가 아미노산 서열은 본 발명의 나노바디 또는 폴리펩타이드에 하나 이상의 목적하는 특성 또는 기능성을 부여한다.
이러한 아미노산 서열의 예는 당업자에게 명백할 것이며, 일반적으로 통상의 항체 및 이의 단편(ScFv 및 단일 도메인 항체를 포함하나 이에 제한되지 않음)에 기초하는 펩타이드 융합에서 사용되는 모든 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 논문[참조: Holliger and Hudson, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136 (2005)]을 참조한다.
예를 들면, 이러한 아미노산 서열은, 본 발명의 나노바디 자체와 비교하여, 본 발명의 폴리펩타이드의 반감기, 가용성 또는 흡착을 증가시키고, 면역원성 또는 독성을 감소시키고, 원치않는 부작용을 제거하거나 감쇠시키고/시키거나 다른 유리한 특성을 부여하고/하거나 원치않는 특성을 감소시키는 아미노산 서열일 수 있다. 이러한 아미노산 서열의 일부 비제한적 예는 혈청 알부민[참조: WO 00/27435] 또는 합텐 분자[예를 들면, 항체 순환에 의해 인식되는 합텐, 참조: WO 98/22141]와 같은 혈청 단백질이다.
추가 아미노산 서열은 또한 어떠한 목적하는 단백질, 폴리펩타이드, 항원, 항원 결정기 또는 에피토프(본 발명의 나노바디가 지시되는 동일한 단백질, 폴리펩타이드, 항원, 항원 결정기 또는 에피토프를 포함하나 이에 제한되지 않음)에 대해서도 지시될 수 있는 제2 결합 부위를 제공할 수 있다. 예를 들면, 추가 아미노산 서열은 혈청 단백질(예를 들면, 사람 혈청 알부민 또는 IgG와 같은 기타 혈청 단백질),에 대해 지시되어 혈청중의 증가된 반감기를 제공하는 제2 결합 부위를 제공할 수 있다. 예를 들면, EP 0 368 684, WO 91/01743, WO 01/45746 및 WO 04/003019(여기에는 혈청 단백질이 언급되어 있다) 뿐만 아니라, 문헌[참조: Harmsen et al., Vaccine, 23 (41); 4926-42]을 참조한다.
다른 양태에 따라서, 하나 이상의 추가 아미노산 서열은 통상의 4쇄 항체(특히, 사람 항체) 및/또는 중쇄 항체의 하나 이상의 부분, 단편 또는 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들면, 통상적으로 덜 바람직하지만, 본 발명의 나노바디는 임의로 링커 서열(워드 등에 의해 기술된 dAp와 같은 다른 (단일) 도메인 항체를 포함하나 이에 제한되지 않음)을 통해 통상의 (바람직하게는 사람) VH 또는 VL 도메인 도메인, 또는 VH 또는 VL 도메인의 천연 또는 합성 유사체에 연결될 수 있다.
하나 이상의 나노바디는 또한 임의로 링커 서열을 통해 하나 이상의 (바람직하게는 사람) CH1, CH2 및/또는 CH3 도메인에 연결될 수도 있다. 예를 들면, 적합한 CH1 도메인에 연결된 나노바디는 예를 들면, 적합한 경쇄와 함께 사용되어, 통상의 Fab 단편 또는 F(ab')2 단편과 유사하지만, 통상의 VH 도메인 중 하나 또는 (F(ab')2 단편의 경우) 둘다가 본 발명의 나노바디로 대체된 항체 단편/구조를 생성시킨다. 또한, 2개의 나노바디는 CH3 도메인에 연결되어(임의로 링커를 통해) 생체내 반감기가 증가된 작제물을 제공할 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드의 하나의 구체적 양태에 따라서, 하나 이상의 본 발명의 나노바디는 본 발명의 폴리펩타이드에 하나 이상의 이펙터 기능을 부여하고/하거나 하나 이상의 Fc 수용체에 결합하는 능력을 부여할 수 있는 하나 이상의 항체 부분, 단편 또는 도메인에 연결될 수 있다. 예를 들면, 이러한 목적을 위해, 이에 제한됨이 없이, 하나 이상의 추가 아미노산 서열은 예를 들면, 중쇄 항체(본원에 기술된 바와 같음), 보다 바람직하게는 통상의 사람 4쇄 항체로부터의 항체의 하나 이상의 CH2 및/또는 CH3 도메인을 포함할 수 있고/있거나, 예를 들면, IgG, IgE 또는 다른 사람 Ig로부터의 Fc 영역(이의 부분)을 형성할 수 있다. 예를 들면, WO 94/04678에는 각각 나노바디와 사람 CH2 및 CH3 도메인(그러나 CH1 도메인은 포함하지 않음)을 포함하는 2개의 중쇄로 이루어지고 어떠한 경쇄의 부재하에서도 작용할 수 있는 면역글로불린을 제공하도록 낙타과 CH2 및/또는 CH3 도메인이 사 람 CH2 및 CH3 도메인으로 대체되어진 카멜리드 VHH 도메인을 포함하는 중쇄 항체 또는 이의 사람화된 유도체(즉, 나노바디)가 기재되어 있다. 본 발명의 나노바디에 연결되어 이펙터 기능을 제공하는 다른 아미노산 서열은 당업자에게 명백할 것이며, 목적하는 이펙터 기능(들)에 기초하여 선택될 수 있다. 예를 들면, WO 04/058820, WO 99/42077 및 WO 05/017148, 뿐만 아니라, 상기 홀리거(Holliger) 및 허드슨(Hudson)의 논문을 참조한다. Fc 부분에 대한 본 발명의 나노바디의 커플링은 또한 상응하는 본 발명의 나노바디와 비교하여 증가된 반감기를 유도할 수 있다. 일부 적용에 있어, 어떠한 생물학적 현저한 이펙터 기능 없이 증가된 반감기를 부여하는 Fc 부분 및/또는 불변 도메인(즉, CH2 및/또는 CH3 도메인)의 사용도 또한 적합하거나 보다 바람직할 수 있다. 생체내에서 증가된 반감기를 갖는 하나 이상의 나노바디와 하나 이상의 불변 도메인을 포함하는 다른 작제물은 당업자에게 명백할 것이고, 예를 들면 임이로 링커 서열을 통해 CH3 도메인에 연결된 2개의 나노바디를 포함할 수 있다.
일반적으로, 증가된 반감기를 갖는 임의의 융합 단백질 또는 유도체는 바람직하게는 신장 흡수를 위한 컷-오프 값인 50 kD 초과의 분자량을 갖는다.
추가 아미노산 서열도 또한, (예를 들면, 본 발명의 폴리펩타이드를 발현하는데 사용되는 숙주 세포에 따라서, 본 발명의 폴리펩타이드의 프리-, 프로- 또는 프리프로-형태를 제공하기 위해) 합성시 숙주 세포로부터의 본 발명의 나노바디 또는 폴리펩타이드의 분비를 지시하는 시그날 서열 또는 리더 서열을 형성할 수 있다.
추가 아미노산 서열은 또한, 본 발명의 나노바디 또는 폴리펩타이드가 특정 기관, 조직, 세포 또는 세포의 부분 또는 구획을 향해 지시되고/되거나 이들 내로 투과하거나 진입하도록 하고/하거나, 본 발명의 나노바디 또는 폴리펩타이드가 세포 막, 세포 층(예를 들면, 상피 세포의 층), 고형 종양을 포함하는 종양 또는 혈뇌 장벽과 같은 생물학적 장벽을 투과하거나 가로지를 수 있도록 하는 서열 또는 시그날 서열을 형성할 수 있다. 이러한 아미노산 서열 당업자에게 명백할 것이고, 예를 들면, 상기 언급한 "Peptrans" 벡터, 카디날(Cardinale) 등에 의해 기술된 서열, 본 발명의 나노바디 및 폴리펩타이드를 예를 들면, WO 94/02610, WO 95/22618, US-A-6004940, WO 03/014960, WO 99/07414; WO 05/01690; EP 1 512 696; 및 문헌[참조: Cattaneo, A. & Biocca, S. (1997) Intracellular Antibodies: Development and Applications. Landes and Springer-Verlag; and in Kontermann, Methods 34, (2004), 163-170] 및 상기 문헌들에 기술된 추가의 참조문헌에 기술된 소위 "내부체"로서 발현하거나 생성하는데 사용될 수 있는 공지된 아미노산 서열 및 항체 단편을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
하나의 바람직하지만 비제한적 양태에 따라서, 상기 하나 이상의 추가 아미노산 서열은 하나 이상의 추가 나노바디를 포함하여, 2개 이상, 예를 들면, 3개, 4개, 5개 이상의 나노바디를 포함하는 본 발명의 폴리펩타이드를 제공할 수 있으며, 이때 상기 나노바디는 임의로 하나 이상의 링커 서열(본원에서 정의된 바와 같음)을 통해 연결될 수 있다. 이중 하나 이상이 본 발명의 나노바디인 2개 이상의 나노바디를 포함하는 본 발명의 폴리펩타이드는 본원에서 본 발명의 "다가" 폴리펩타이드로서 또한 언급될 것이며, 이러한 폴리펩타이드내에 존재하는 나노바디는 본원에서 "다가 포맷"으로서 또한 언급될 것이다. 예를 들면, 본 발명의 "이가" 폴리펩타이드는 임의로 링커 서열을 통해 연결된 2개의 나노바디를 포함하고, 본 발명의 "삼가" 폴리펩타이드는 임의로 2개의 링커 서열을 통해 연결된 3개의 나노바디를 포함하며, 이때 폴리펩타이드내에 존재하는 나노바디중 하나 이상 내지 폴리펩타이드내에 존재하는 모든 나노바디는 본 발명의 나노바디이다.
본 발명의 다가 폴리펩타이드에서, 2개 이상의 나노바디는 동일하거나 상이할 수 있으며, 동일한 항원 또는 항원 결정기에 대해(예를 들면, 동일한 부분(들) 또는 에피토프(들) 또는 상이한 부분 또는 에피토프에 대해) 지시될 수 있거나, 또는 상이한 항원 또는 항원 결정기 또는 이들의 적합한 배합물에 대해 지시될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 이가 폴리펩타이드는 (a) 2개의 동일한 나노바디; (b) 단백질 또는 항원의 제1 항원 결정기에 대해 지시된 제1 나노바디 및 제1 나노바디와 상이한 상기 단백질의 동일한 항원 결정기에 대해 지시된 제2 나노바디; (c) 단백질 또는 항원의 제1 항원 결정기에 대해 지시된 제1 나노바디 및 상기 단백질 또는 하원의 다른 항원 결정기에 대해 지시된 제2 나노바디; 또는 (d) 제1 단백질 또는 항원에 대해 지시된 제1 나노바디 및 제2 단백질 또는 항원(즉, 상기 제1 항원과 상이한)에 대해 지시된 제2 나노바디를 포함할 수 있다. 유사하게, 본 발명의 삼가 폴리펩타이드는, 예를 들면, 이에 제한됨이 없이, (a) 3개의 동일한 나노바디; (b) 항원의 제1 항원 결정기에 대해 지시된 2개의 동일한 나노바디 및 동일한 항원의 상이한 항원 결정기에 대해 지시된 제3 나노바디; (c) 항원의 제1 항원 결정기에 대해 지시된 2개의 동일한 나노바디 및 상기 제1 항원과 상이한 제2 항원에 대해 지시된 제3 나노바디; (d) 제1 항원의 제1 항원 결정기에 대해 지시된 제1 나노바디, 상기 제1 항원의 제2 항원 결정기에 대해 지시된 제2 나노바디 및 상기 제1 항원과 상이한 제2 항원에 대해 지시된 제3 나노바디; 또는 (e) 제1 항원에 대해 지시된 제1 나노바디, 상기 제1 항원과 상이한 제2 항원에 대해 지시된 제2 나노바디 및 상기 제1 및 제2 항원과 상이한 제3 항원에 대해 지시된 제3 나노바디를 포함할 수 있다.
하나 이상의 나노바디가 제1 항원(즉, A-베타)에 대해 지시되고 하나 이상의 나노바디가 제2 항원(즉, A-베타와 상이한 항원)에 대해 지시된 2개 이상의 나노바디를 포함하는 본 발명의 폴리펩타이드는 또한 본 발명의 "다중특이적" 폴리펩타이드로서도 언급될 것이며, 이러한 폴리펩타이드내에 존재하는 나노바디는 또한 "다가 포맷"으로서 언급될 것이다. 따라서, 예를 들면, 본 발명의 "이특이적" 폴리펩타이드는 제1 항원(즉, A-베타)에 대해 지시된 하나 이상의 나노바디와 제2 항원(즉, A-베타와 상이한 항원)에 대해 지시된 하나 이상의 추가 나노바디를 포함하는 나노바디이며, 본 발명의 "삼특이적" 폴리펩타이드는 제1 항원(즉, A-베타)에 대해 지시된 하나 이상의 나노바디, 제2 항원(즉, A-베타와 상이한 항원)에 대해 지시된 하나 이상의 추가 나노바디 및 제3 항원(A-베타 및 제2 항원 둘다와 상이한 항원)에 대해 지시된 하나 이상의 추가 나노바디를 포함하는 폴리펩타이드이다.
따라서, 가장 단순한 형태로서, 본 발명의 이특이적 폴리펩타이드는 A-베타에 대해 지시된 제1 나노바디와 제2 항원에 대해 지시된 제2 나노바디를 포함하고 상기 제1 및 제2 나노바디가 임의로 링커 서열(본원에서 정의된 바와 같음)을 통해 연결될 수 있는 본 발명의 이가 폴리펩타이드(본원에서 정의된 바와 같음)이고, 본 발명의 삼특이적 폴리펩타이드는 이의 가장 단순한 형태로서, A-베타에 대해 지시된 제1 나노바디, 제2 항원에 대해 지시된 제2 나노바디와 제3항원 대해 지시된 제3 나노바디를 포함하고 상기 제1, 제2 및 제3 나노바디가 임의로 하나 이상, 특히 1개 및 2개 이상의 링커 서열을 통해 연결될 수 있는 본 발명의 삼가 폴리펩이드(본원에서 정의된 바와 같음)이다.
그러나, 상기 기술내용으로부터 명백한 바와 같이, 본 발명의 다중특이적 폴리펩타이드가 A-베타에 대해 지시된 하나 이상의 나노바디와 A-베타와 상이한 하나 이상의 항원에 대해 지시된 임의의 수의 나노바디를 포함할 수 있다는 점에서, 본 발명은 상기 기술내용으로 제한되지 않는다.
게다가, 본 발명의 범주내에 본 발명의 폴리펩타이드내의 다양한 나노바디의 특정 순서 또는 정렬은 본 발명의 최종 폴리펩타이드의 특성(A-베타 또는 하나 이상의 다른 항원에 대한 친화성, 특이성 또는 항원항체결합력을 포함하나 이에 제한되지 않음)에 다소 영향을 줄 수 있고, 상기 순서 또는 정렬은 통상적으로 중요하지 않으며, 임의로 본원의 기술내용에 기초한 몇회의 제한된 통상적 실험 후에 당업자에 의해 적합하게 선택될 수 있다. 따라서, 본 발명의 특이적 다가 또는 다중특이적 폴리펩타이드를 언급하는 경우, 달리 언급하지 않는 한, 이것이 관련 나노바디의 임의의 순서 또는 정렬을 포함한다는 것이 주지되어야 한다.
마지막으로, 본 발명의 범주내에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 2개 이상의 나노바디와 하나 이상의 추가 아미노산 서열(상기 언급한 바와 같음)을 함유한다.
하나 이상의 VHH 도메인을 포함하는 다가 및 다중특이적 폴리펩타이드 및 이의 제조법에 대해서는, 문헌[참조: Conrath et al., J. Biol. Chem., Vol. 276, 10. 7346-7350, 2001] 및 예를 들면 WO 96/34103 및 WO 99/23221을 참조한다. 본 발명의 일부 특이적 다중특이적 및/또는 다가 폴리펩타이드의 일부 다른 예는 본원에 언급된 출원인에 의한 출원에서 찾아볼 수 있다.
본 발명의 다중특이적 폴리펩타이드의 한가지 바람직하지만 비제한적인 예는 하나 이상의 본 발명의 나노바디 및 증가된 반감기를 제공하는 하나 이상의 나노바디를 포함한다. 이러한 나노바디의 일부 바람직하지만 비제한적인 예에는 사람 혈청 알부민, 티록신-결합 단백질, (사람) 트랜스페린, 피브리노겐, 면역글로불린(예: IgG, IgE 또는 IgM) 또는 본원 또는WO 04/003019에 기재된 다른 혈청 단백질중 하나와 같은 혈청 단백질에 대해 지시된 나노바디가 포함된다.
바람직하게는, 증가된 반감기를 제공하는 상기 나노바디는 바람직하게는 혈청 알부민, 특히 포유동물 혈청 알부민에 대해 지시된 나노바디이다. 통상적으로, 약제학적 용도로, 사람 혈청 알부민에 대해 지시된 나노바디가 바람직할 수 있지만, 예를 들면, 마우스, 랫트, 돼지 또는 개에서의 실험에서는, 각각 마우스 혈청 알부민(MSA), 랫트 혈청 알부민, 돼지 혈청 알부민 또는 개 혈청 알부민이 사용될 수 있다. 또한, 몇가지 상이한 포유동물 종으로부터의 혈청 알부민에 대해 지시된 나노바디를 사용할 수도 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 하나 이상의 (사람) 혈청 단백질이 (사람) 혈청 알부민, (사람) 혈청 면역글로불린, (사람) 중 어느 하나인 상기한 바와 같은 폴리펩타이드 작제물이다. 본 발명의 구체적이지만 비제한적 측면에 따라서, 본 발명의 폴리펩타이드는 본 발명의 하나 이상의 나노바디 이외에, 사람 혈청 알부민에 대해 지시된 하나 이상의 나노바디를 함유한다. 이들 사람 혈청 알부민에 대한 나노바디가 상기 인용된 출원인에 의한 출원[참조: 예를 들면, W04/062551]에서 일반적으로 기술된 바와 같을 수 있지만, 특히 바람직하지만 비제한적인 양태에 따라서, 상기 사람 혈청 알부민에 대한 나노바디는
i) CDR1이
SFGMS [서열번호 15]
LNLMG [서열번호 16]
INLLG [서열번호 17]
NYWMY [서열번호 18]로 이루어진 그룹 및/또는
상기 아미노산 서열과 2개 또는 오직 1개의 "아미노산 차이(들)"(본원에서 정의된 바와 같음)을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 그룹[여기서, (1) 임의의 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환(본원에서 정의된 바와 같음)이고/이거나, (2) 상기 아미노산 서열은 바람직하게는 상기 아미노산 서열과 비교하여 오직 아미노산 치환만을 함유하고 아미노산 결실 또는 삽입을 함유하지 않는다]으로부터 선택된 아미노산 서열이고,
ii) CDR2가
SISGSGSDTLYADSVKG [서열번호 19]
TITVGDSTNYADSVKG [서열번호 20]
TITVGDSTSYADSVKG [서열번호 21]
SINGRGDDTRYADSVKG [서열번호 22]
AISADSSTKNYADSVKG [서열번호 23]
AISADSSDKRYADSVKG [서열번호 24] 및
RISTGGGYSYYADSVKG [서열번호 25]로 이루어진 그룹 또는
상기 아미노산 서열 중 하나와 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성(본원에서 정의하는 바와 같음)을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 그룹[여기서, (1) 임의의 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환(본원에서 정의하는 바와 같음)이고/이거나, (2) 상기 아미노산 서열은 바람직하게는, 상기 아미노산 서열(들)과 비교하여 오직 아미노산 치환만을 함유하고 아미노산 결실 또는 삽입을 함유하지 않는다] 및/또는
상기 아미노산 서열 중 하나와 3개, 2개 또는 오직 1개의 "아미노산 차이(들)"(본원에 정의된 바와 같음)를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 그룹[여기서, (1) 임의의 아미노산 치환이 바람직하게는 보존적 아미노산 치환(본원에서 정의하는 바와 같음)이고/이거나, (2) 상기 아미노산 서열은 바람직하게는, 상기 아미노산 서열과 비교하여 오직 아미노산 치환만을 함유하고 아미노산 결실 또는 삽입을 함유하지 않는다]으로부터 선택된 아미노산 서열이고,
iii) CDR3이
DREAQVDTLDFDY [서열번호 26]로 이루어진 그룹 또는
상기 아미노산 서열 중 하나와 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성(본원에서 정의하는 바와 같음)을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 그룹[여기서, (1) 임의의 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환(본원에서 정의하는 바와 같음)이고/이거나, (2) 상기 아미노산 서열은 바람직하게는, 상기 아미노산 서열(들)과 비교하여 오직 아미노산 치환만을 함유하고 아미노산 결실 또는 삽입을 함유하지 않는다] 및/또는
상기 아미노산 서열 중 하나와 3개, 2개 또는 오직 1개의 "아미노산 차이(들)"(본원에 정의된 바와 같음)를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 그룹[여기서, (1) 임의의 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환(본원에서 정의하는 바와 같음)이고/이거나, (2) 상기 아미노산 서열은 바람직하게는, 상기 아미노산 서열과 비교하여 오직 아미노산 치환만을 함유하고 아미노산 결실 또는 삽입을 함유하지 않는다]; 또는
GGSLSR [서열번호 27]
RRTWHSEL [서열번호 28]
GRSVSRS [서열번호 29] 및
GRGSP [서열번호 30]로 이루어진 그룹 및/또는
상기 아미노산 서열 중 하나와 3개, 2개 또는 오직 1개의 "아미노산 차이(들)"(본원에 정의된 바와 같음)를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 그룹[여기서, (1) 임의의 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환(본원에서 정의하는 바와 같음)이고/이거나, (2) 상기 아미노산 서열은 바람직하게는, 상기 아미노산 서열과 비교하여 오직 아미노산 치환만을 함유하고 아미노산 결실 또는 삽입을 함유하지 않는다]으로부터 선택된 아미노산 서열인, 3개의 상보성 결정 영역(각각, CDR1 내지 CDR3)과 4개의 골격 영역(각각, FR1 내지 FR4)으로 이루어진다.
다른 측면에서, 본 발명은 4개의 골격 영역(각각, FR1 내지 FR4)과 3개의 상보성 결정 영역(각각, CDR1 내지 CDR3)으로 이루어진, 사람 혈청 알부민에 대해 지시된 나노바디에 관한 것으로, 당해 나노바디는 각각 다음과 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3의 조합 중 하나를 갖는 나노바디로 이루어진 그룹으로부터 선택된다:
- CDR1: SFGMS; CDR2: SISGSGSDTLYADSVKG; CDR3: GGSLSR;
- CDR1: LNLMG; CDR2: TITVGDSTNYADSVKG; CDR3: RRTWHSEL;
- CDR1: INLLG; CDR2: TITVGDSTSYADSVKG; CDR3: RRTWHSEL;
- CDR1: SFGMS; CDR2: SINGRGDDTRYADSVKG; CDR3: GRSVSRS;
- CDR1: SFGMS; CDR2: AISADSSDKRYADSVKG; CDR3: GRGSP;
- CDR1: SFGMS; CDR2: AISADSSDKRYADSVKG; CDR3: GRGSP;
- CDR1: NYWMY; CDR2: RISTGGGYSYYADSVKG; CDR3: DREAQVDTLDFDY.
상기 언급한 CDR의 조합을 포함하는 본 발명의 나노바디에서, 각각의 CDR은
상기한 CDR과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성(본원에서 정의하는 바와 같음)을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 그룹[여기서, (1) 임의의 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환(본원에서 정의하는 바와 같음)이고/이거나, (2) 상기 아미노산 서열은 바람직하게는, 상기 아미노산 서열과 비교하여 오직 아미노산 치환만을 함유하고 아미노산 결실 또는 삽입을 함유하지 않는다] 및/또는
상기 언급한 CDR(들) 중 하나의 아미노산 서열과 3개, 2개 또는 오직 1개의 "아미노산 차이(들)"(본원에 정의된 바와 같음)를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 그룹[여기서, (1) 임의의 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환(본원에서 정의하는 바와 같음)이고/이거나, (2) 상기 아미노산 서열은 바람직하게는, 상기 아미노산 서열과 비교하여 오직 아미노산 치환만을 함유하고 아미노산 결실 또는 삽입을 함유하지 않는다]으로부터 선택된 CDR로 대체될 수 있다.
그러나, 상기 언급한 CDR의 조합을 포함하는 본 발명의 나노바디 중에서, 상기 기재된 CDR들 중 하나 이상을 포함하는 나노바디가 특히 바람직하고, 상기 기재된 CDR들 중 2개 이상을 포함하는 나노바디가 보다 특히 바람직하고, 상기 기재된 CDR들 중 3개 이상을 포함하는 나노바디가 가장 특히 바람직하다.
이러한 사람 혈청 알부민에 대한 나노바디에서, 골격 영역 FR1 내지 FR4는 바람직하게는 본 발명의 나노바디에 대해 상기 정의한 바와 같다.
본 발명에서 사용될 수 있는 사람 혈청 알부민에 대해 지시된 나노바디의 일부 바람직하지만 비제한적인 예는 하기 표 A-9에 기재되어 있다. 일부 대안적 혈청 알부민 결합제(마우스 혈청 알부민에 대한, 사람 혈청 알부민에 대한 및 사람 혈청 알부민에 대한 사람화된 나노바디)는 표 3, 4 및 5에 각각 기재되어 있다.
[표 A-9]
Figure 112007034854195-PCT00011
일반적으로, 증가된 반감기를 갖는 본 발명의 임의의 유도체 및/또는 폴리펩타이드(예를 들면, 페길화된 본 발명의 나노바디 또는 폴리펩타이드, A-베타 및 (사람) 혈청 알부민에 대해 지시된 다중특이적 나노바디, 또는 Fc 부분에 융합된 나노바디, 본원에 기술된 모든 나노바디)는 상응하는 본 발명의 나노바디의 반감기의 1.5배 이상, 바람직하게는 2배 이상, 예를 들면, 5배 이상, 예를 들면 10배 이상 또는 20배 초과인 반감기를 갖는다.
또한, 증가된 반감기를 갖는 본 발명의 임의의 유도체 또는 폴리펩타이드는바람직하게는 1시간 초과, 바람직하게는 2시간 초과, 보다 바람직하게는 6시간 초과, 예를 들면, 12시간 초과 및 예를 들면, 약 1일, 2일, 1주, 2주 또는 3주, 및 바람직하게는 2개월 미만의 반감기를 갖지만, 후자는 덜 중요할 수 있다.
반감기는 일반적으로 폴리펩타이드의 혈청 농도가 예를 들면, 리간드의 분해 및/또는 천연 기전에 의한 리간드의 제거 또는 격리로 인해서 생체내에서 50%까지 감소되는데 소요되는 시간으로서 정의될 수 있다. 상세한 것은 문헌[참조: Kenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists and in Peters et al, Pharmacokinete analysis: A Practical Approach (1996)]에서 찾아볼 수 있다. 또한, 문헌[참조: "Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron, published by Marcel Dekker, 2 nd Rev. ex edition (1982)]을 참조한다.
본 발명의 다중특이적 폴리펩타이드의 다른 바람직하지만 비제한적인 예는 하나 이상의 본 발명의 나노바디와, 본 발명의 폴리펩이드에 대해 지시되고/되거나 본 발명의 폴리펩이드가 특정 기관, 조직, 세포 또는 세포의 부분 또는 구획을 향해 지시되고/되거나 이들 내로 투과하거나 진입하도록 하고/하거나, 본 발명의 폴리펩이드가 세포 막, 세포 층(예를 들면, 상피 세포의 층), 고형 종양을 포함하는 종양 또는 혈뇌 장벽과 같은 생물학적 장벽을 투과하거나 가로지를 수 있도록 하는 하나 이상의 나노바디를 포함한다. 이러한 나노바디의 예로는 목적하는 기관, 조직 또는 세포의 특정 세포 표면 단백질, 마커 또는 에피토프(예를 들면, 종양 세포와 관련된 세포 표면 마커) 방향으로 지시되는 나노바디 및 WO 02/057445에 기술된 단일-도메인 뇌 표적화 항체 단편가 포함되며, 이중 본원에서 사용되는 FC44(서열번호 189) 및 FC5 (서열번호 190)가 바람직한 예이다.
본 발명의 폴리펩타이드에서, 하나 이상의 나노바디와 하나 이상의 폴리펩타이드는 서로 직접 연결될 수 있고/있거나(예를 들면, WO 99/23221에 기술된 바와 같이) 하나 이상의 적합한 스페이서 또는 링커를 통해 서로 연결될 수 있거나, 이들을 임의로 병용할 수 있다.
다가 및 다중특이적 폴리펩타이드에서 사용하기 위한 적합한 스페이서 또는 링커는 당업자에게 명백할 것이고, 일반적으로 당업계에서 아미노산 서열을 연결하기 위해 사용되는 임의의 링커 또는 스페이서일 수 있다. 바람직하게는, 상기 링커 또는 스페이서는 약제용으로 의도된 단백질 또는 폴리펩타이드를 작제하는데 사용하기에 적합하다.
일부 특히 바람직한 스페이서에는 당업계에서 항체 단편 또는 항체 도메인을 연결시키는데 사용되는 스페이서 및 링커가 포함된다. 이러한 링커에는 상기 인용된 일반적 배경기술에서 언급된 링커 및 예를 들면 당업계에서 디아바디(diabody) 또는 ScFv 단편을 작제하는데 사용되는 링커가 포함된다(그러나, 이와 관련하여, 디아바디 및 ScFv 단편에서는 사용되는 링커 서열이 적절한 VH 및 VL 도메인이 함께 완전한 항원-결합 부위를 형성하도록 하는 길이, 유연성 정도 및 기타 특성을 지녀야하는 반면에, 각각의 나노바디 자체가 완전한 항원-결합 부위를 형성하기 때문에, 본 발명의 폴리펩타이드에서 사용되는 링커의 길이 또는 유연성에는 특별한 제한이 없다는 것이 주지되어야 한다).
예를 들면, 링커는 적합한 아미노산 서열, 특히 1 내지 50개, 바람직하게는 1 내지 30개, 예를 들면, 1 내지 10개의 아미노산 잔기의 아미노산 서열일 수 있다. 이러한 아미노산 서열의 일부 바람직한 예로는 예를 들면 유형 (glyxsery)z의 gly-ser 링커, 예를 들면, WO 99/42077에 기술된 (gly4ser)3 또는 (gly3ser2)3, 천연 발생 중쇄 항체의 힌지 영역과 같은 힌지-유사 영역 또는 유사 서열(예: WO 94/04678에 기술된 서열)이 포함된다.
몇가지 다른 특히 바람직한 링커는 폴리-알라닌(예를 들면, AAA), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS ("GS30", 서열번호 32) 및 GGGGSGGGS ("GS9", 서열번호 33)이며, AAA 및 GS9가 특히 바람직하다. 몇가지 다른 링커 서열은 표 7에 기술되어 있다.
다른 적합한 링커는 일반적으로 유기 화합물 또는 중합체, 특히 약제용 단백질에서 사용하기에 적합한 것들을 포함한다. 예를 들면, 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기가 항체 도메인을 연결시키는데 사용되었다[참조: WO 04/081026].
사용되는 링커(들)의 길이, 유연성 정도 및/또는 다른 특성(결정적이지는 않지만, ScFv 단편에서 사용되는 링커에 대해 통상적인)은 A-베타 또는 하나 이상의 다른 항원에 대한 친화성, 특이성 또는 항원항체결합력을 포함하나 이에 제한되지 않는 본 발명의 최종 폴리펩타이드의 특성에 다소 영향을 줄 수 있다는 것은 본 발명의 범주내에 포함된다. 본원의 기술내용에 기초하여, 당업자라면 임의로 일부 제한된 통상의 실험 후에 본 발명의 특이적 폴리펩타이드에서 사용하기 위한 최적의 링커(들)을 결정할 수 있을 것이다.
예를 들면, 다량체 항원(예를 들면, 다량체 수용체 또는 다른 단백질)에 대해 지시된 본 발명의 다가 폴리펩타이드에서, 링커의 길이 및 유연성은 바람직하게는 당해 폴리펩타이드내의 각각의 본 발명의 나노바디가 이 다량체의 서브유닛 각각의 항원 결정기에 결합할 수 있도록 하는 정도이다. 유사하게, 동일한 항원상의 2개 이상의 상이한 항원 결정기(예를 들면, 항원의 상이한 에피토프 및/또는 다량체 수용체, 채널 또는 단백질의 상이한 서브유닛)에 대해 지시된 나노바디를 포함하는 본 발명의 다중특이적 폴리펩타이드에서, 링커의 길이 및 유연성은 바람직하게는 각각의 나노바디가 이의 의도된 항원 결정기에 결합할 수 있도록 하는 정도이다. 다시, 본원의 기술내용에 기초하여, 당업자라면 임의로 일부 제한된 통상의 실험 후에 본 발명의 특이적 폴리펩타이드에서 사용하기 위한 최적의 링커(들)을 결정할 수 있을 것이다.
또한, 본 발명의 범주내에서, 사용되는 링커(들)은 하나 이상의 다른 유리한 특성 또는 기능성을 본 발명의 폴리펩타이드에 제공하고/하거나 유도체의 형성 및/또는 작용 그룹의 부착을 위한 하나 이상의 부위(예를 들면, 본 발명의 나노바디의 유도체에 대해 기술한 바와 같음)를 제공한다. 예를 들면, 하나 이상의 하전된 아미노산 잔기(상기 표 A-2 참조)를 함유하는 링커는 향상된 친수성 특성을 제공할 수 있는 반면에, 소형 에피토프 또는 태그를 형성하거나 함유하는 링커는 검출, 동정 및/또는 정제 목적을 위해 사용될 수 있다. 다시, 본원의 개시내용에 기초하여, 당업자라면 임의로 일부 제한된 통상의 실험 후에 본 발명의 특이적 폴리펩타이드에서 사용하기 위한 최적의 링커(들)을 결정할 수 있을 것이다.
마지막으로, 2개 이상의 링커가 본 발명의 폴리펩타이드에서 사용되는 경우, 이들 링커는 동일하거나 상이할 수 있다. 다시, 본원의 개시내용에 기초하여, 당업자라면 임의로 일부 제한된 통상의 실험 후에 본 발명의 특이적 폴리펩타이드에서 사용하기 위한 최적의 링커(들)을 결정할 수 있을 것이다.
통상적으로, 발현 및 생산의 용이성을 위해, 본 발명의 폴리펩타이드는 선형 폴리펩타이드일 것이다. 그러나, 본 발명은 이의 가장 광의적 의미에서, 이로써 제한되지 않는다. 예를 들면, 본 발명의 폴리펩타이드가 3개 이상의 나노바디를 포함하는 경우, 각각의 "암(arm)"이 나노바디에 연결되는 3개 이상의 "암"을 갖는 링커를 사용하여 나노바디들을 연결시켜 "성상(star-shaped)" 작제물을 제공할 수도 있다. 또한, 통상적으로 덜 바람직하지만 환형 작제물을 사용할 수도 있다.
본 발명의 또한, 본 발명의 나노바디의 유도체와 본질적으로 유사할 수 있는, 즉 본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 폴리펩타이드의 유도체를 포함한다.
본 발명의 또한, 본 발명의 폴리펩타이드로 "본질적으로 이루어진" 단백질 또는 폴리펩타이드를 포함한다(여기서, "본질적으로 이루어진"이란 용어는 상기 명시한 바와 본질적으로 동일하다).
본 발명의 한 양태에 따라서, 본 발명의 폴리펩타이드는 본원에 정의된 바와 같이 본질적으로 분리된 형태된다.
본 발명의 나노바디, 폴리펩타이드 및 핵산은 본원의 추가 기술로부터 당업자에게 명백한 바와 같이 공지된 방식으로 제조될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 나노바디 및 폴리펩타이드는 항체의 제조 및 특히 항체 단편((단일) 도메인 항체 및 ScFv 단편을 포함하나 이에 제한되지 않음)의 제조를 위한 공지된 임의의 방식으로 제조할 수 있다. 나노바디, 폴리펩타이드 및 핵산의 일부 바람직하지만 비제한적인 제조 방법은 본원에 기술된 방법 및 기술을 포함한다.
당업자에게 명백한 바와 같이, 본 발명의 나노바디 및/또는 폴리펩타이드를 제조하기 위한 한가지 특히 유용한 방법은 다음 단계를 포함한다:
- 상기 본 발명의 나노바디 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산(본원에서 "본 발명의 핵산"으로서도 언급됨)을 적합한 숙주 세포 또는 숙주 유기체(본원에서 "본 발명의 숙주"로서도 언급됨) 또는 다른 적합한 발현 시스템에서 발현시키는 단계, 임의로 이어서,
- 이렇게 수득된 본 발명의 나노바디 또는 폴리펩타이드의 분리 및/또는 정제하는 단계.
특히, 이러한 방법은 다음 단계를 포함한다:
- 본 발명의 숙주를, 본 발명의 숙주가 하나 이상의 본 발명의 나노바디 및/또는 폴리펩타이드를 발현 및/또는 생산하도록 하는 조건하에 배양 및/또는 유지시키는 단계; 임의로, 이어서,
- 이렇게 수득된 본 발명의 나노바디 또는 폴리펩타이드를 분리시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 핵산은 일본쇄 또는 이본쇄 DNA 또는 RNA일 수 있으며, 바람직하게는 이본쇄 DNA의 형태이다. 예를 들면, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 게놈DNA, cDNA 또는 합성 DNA(예를 들면, 의도된 숙주 세포 또는 숙주 유기에서의 발현을 위해 특이적으로 적합화된 코돈 용법(codon usage)을 갖는 DNA)일 수 있다.
본 발명의 한 양태에 따라서, 본 발명의 핵산은 본원에 정의된 바와 같이 본질적으로 분리된 형태이다.
본 발명의 핵산은 또한 예를 들면, 본질적으로 분리된 형태일 수 있는 플라스미드, 코스미드 또는 YAC와 같은 벡터내에 존재하고/하거나 벡터의 일부분인 형태일 수 있다.
본 발명의 핵산은 본원에 제공된 본 발명의 폴리펩타이드의 아미노산 서열에 관한 정보에 기초하여 공지된 방식으로 제조되거나 수득될 수 있고/있거나 적합한 천연 공급원으로부터 분리될 수 있다. 유사체를 제공하기 위해, 천연 발생 VHH 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 예를 들면, 부위-지시된 돌연변이유발 처리하여 상기 유사체를 암호화하는 본 발명의 핵산을 제공할 수 있다. 또한, 당업자에게 명백한 바와 같이, 본 발명의 핵산을 제조하기 위해, 나노바디를 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열과 같은 몇가지 뉴클레오타이드 서열 및 예를 들면 하나 이상의 링커를 암호화하는 핵산을 적합한 방식으로 함께 연결시킬 수 있다.
본 발명의 핵산을 제조하기 위한 기술은 당업자에게 명백할 것이고, 예를 들면 자동화 DNA 합성; 부위-지시된 돌연변이유발; 2개 이상의 천연 발생 및/또는 합성 서열(또는 이의 부분 2개 이상)의 조합, 절두된 발현 산물의 발현을 유도하는 돌연변이의 도입; 하나 이상의 제한 부위의 도입(예를 들면, 적합한 제한 효소를 사용하여 용이하게 분해 및/또는 연결시킬 수 있는 카셋트(cassette) 및/또는 영역을 생성시키기 위해); 및/또는 하나 이상의 "미스매치된" 프라이머를 사용하고 예를 들면, 주형으로서 천연 발생 GPCR을 사용한 PCR 반응에 의한 돌여변이의 도입을포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 이러한 및 기타 기술은 당업자에게 명백할 것이고, 상기 및 하기 실시예에서 언급된 문헌[참조: Sambrook et al. and Ausubel et al.]과 같은 표준 교과를 참조한다.
본 발명의 핵산은 또한 당업자에게 명백한 바와 같이 유전자 작제물내에 존재하고/하거나 유전자 작제물의 일부분인 형태일 수 있다. 이러한 유전자 작제물은 일반적으로, 임의로 공지된 유전자 작제물의 하나 이상의 요소, 예를 들면 하나 이상의 적합한 조절 요소(예: 적합한 프로모터(들), 인핸서(들), 터미네이터(들) 등) 및 본원에 언급된 유전자 작제물의 추가 요소에 연결된 하나 이상의 본 발명의 핵산을 포함한다. 하나 이상의 본 발명의 핵산을 포함하는 이러한 유전자 작제물은 본원에서 "본 발명의 유전자 작제물"로서 또한 언급될 것이다.
본 발명의 유전자 작제물은 DNA 또는 RNA일 수 있고, 바람직하게는 이본쇄 DNA이다. 본 발명의 유전자 작제물은 또한 의도된 숙주 세포 또는 숙주 유기체의 형질전환에 적합한 형태, 의도된 숙주 세포의 게놈 DNA내로의 통합에 적합한 형태 또는 의도된 숙주 유기체에서의 독립적 복제, 유지 및/또는 유전에 적합한 형태일 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 유전자 작제물은 예를 들면 플라스미드, 코스미드, YAC, 바이러스 벡터 또는 트랜스포존(transposon)과 같은 벡터의 형태일 수 있다. 특히, 벡터는 발현 벡터, 즉 시험관내 및/또는 생체내(예를 들면, 적합한 숙주 세포, 숙주 유기체 및/또는 발현 시스템내)에서의 발현을 제공할 수 있는 벡터일 수 있다.
바람직하지만 비제한적 양태에서, 본 발명의 유전자 작제물은
a) 하기 (b) 및 (c)에 작동적으로 연결된 하나 이상의 본 발명의 핵산;
b) 프로모터 및 임의로 적합한 터미네이터와 같은 하나 이상의 조절 요소; 및 임의로,
c) 공지된 유전자 작제물의 하나 이상의 추가 요소를 포함하며, 이때, "조절 요소", "프로모터", "터미네이터" 및 "작동적으로 연결된"이란 용어들은 당업게에서 통상적인 의미(본원에서 추가 기술됨)를 가지며, 유전자 작제물에 존재하는 상기 "추가 요소"는 예를 들면, 3' 또는 5' UTR 서열, 리더 서열, 선별 마커, 발현 마커/리포터 유전자, 및/또는 형질전환 또는 통합(이의 효율)을 촉진 또는 증가시킬 수 있는 요소일 수 있다. 이러한 유전자 작제물에 대한 상기 및 기타 적합한 요소는 당업자에게 명백할 것이고, 예를 들면, 사용되는 작제물의 유형, 의도된 숙주 세포 또는 숙주 유기체, 발현될 관심대상의 본 발명의 뉴클레오타이드 서열(예를 들면, 구성적(constitutive), 일시적 또는 유도성 발현); 및/또는 사용될 형질전환 기술에 의존할 수 있다. 예를 들면, 항체 및 항체 단편((단일) 도메인 항체 및 ScFv 단편을 포함하나 이에 제한되지 않음)의 발현 및 제조용으로 공지된 조절 서열, 프로모터 및 터미네이터를 본질적으로 유사한 방식으로 사용할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 유전자 작제물에서, 상기 본 발명의 하나 이상의 핵산 및 상기 조절 요소 및 임의로 상기 하나 이상의 추가 요소는 서로 "작동적으로 연결"되며, 이는 일반적으로 이들이 서로 기능적 관련성이 있음을 의미한다. 예를 들면, 프로모터는, 상기 프로모터가 암호화 서열의 전사 및/또는 발현을 개시 또는 제어/조절할 수 있는 경우(여기서, 상기 암호화 서열은 상기 프로모터의 "제어하에" 있는 것으로 이해되어야 한다)에 암호화 서열에 작동적으로 연결된 것으로 고려된다. 일반적으로, 2개의 뉴클레오타이드 서열이 작동적으로 연결된 경우, 이들은 동일한 배향으로 있을 수 있고 또한 통상적으로 동일한 판독 프레임(reading frame)내에 있을 것이다. 요구되지 않을 수도 있지만, 이들은 또한 통상적으로 본질적으로 연속될 것이다.
바람직하게는, 본 발명의 유전자 작제물의 조절 요소 및 추가 요소는 의도된 숙주 세포 또는 숙주 유기체내에서 이들의 의도된 생물학적 기능을 제공할 수 있어야 한다.
예를 들면, 프로모터, 인핸서 또는 터미네이터는 의도된 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서 "작동성"이어야 하며, 이는 (예를 들면) 상기 프로모터가, 이 프로모터에 작동적으로 연결되는(본원에 정의한 바와 같음) 뉴클레오타이드 서열, 예를 들면, 암호화 서열의 전사 및/또는 발현을 개시 또는 제어/조절할 수 있음을 의미한다.
일부 특히 바람직한 프로모터에는 본원에 언급된 숙주 세포에서의 발현용으로 공지된 프로모터, 특히 본원에 언급된 바와 같고/같거나 실시예에서 사용된 바와 같은 세균 세포에서의 발현용 프로모터가 포함되나 이에 제한되지 않는다.
선별 마커는, 적절한 선별 조건하에, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열로 (성공적으로) 형질전환된 숙주 세포 및/또는 숙주 유기체를 (성공적으로) 형질전환되지 않은 숙주 세포/유기체로부터 구별할 수 있도록 해야 한다. 이러한 마커의 일부 바람직하지만 비제한적인 예는 항생제에 대한 내성을 제공하는 유전자(예를 들면, 카나마이신 또는 암피실린), 내온성을 제공하는 유전자 또는 숙주 세포 또는 숙주 유기체가 비-형질전환된 세포 또는 유기체의 생전에 필수적인 배지내에서 특정 인자, 화합물 및/또는 (식품) 성분의 부재하에서 유지될 수 있도록 하는 유전자이다.
리더 서열은 의도된 숙주 세포 또는 숙주 유기체내에서 목적하는 해독후 변형을 가능하게 하고/하거나 전사된 mRNA를 세포의 목적하는 부분 또는 소기관으로 지시되도록 해야 한다. 리더 서열은 또한 상기 세포로부터 발현 산물이 분비될 수 있도록 한다. 그 자체로, 리더 서열은 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서 작동성일 수 있는 프로-, 프리- 또는 프리프로-서열일 수 있다. 리더 서열은 세균 세포에서의 발현을 위해 요구되지 않을 수 있다. 예를 들면, 항체 및 항체 단편(단일 도메인 항체 및 ScFv 단편을 포함하나 이에 제한되지 않음)의 발현 및 생산용으로 공지된 리더 서열은 본질적으로 유사한 방식으로 사용될 수 있다.
발현 마커 또는 리포터 유전자는 숙주 세포 또는 숙주 유기체내에서 유전자 작제물(여기에 존재하는 유전자 또는 뉴클레오타이드 서열)의 발현을 검출할 수 있도록 해야 한다. 발현 마커는 임의로, 발현 산물이 예를 들면, 세포의 특정 부분 또는 소기관 및/또는 다세포 유기체의 특정 세포(들), 조직(들), 기관(들)내에 국소화되도록 할 수도 있다. 이러한 리포터 유전자는 또한 본 발명의 아미노산 서열과의 단백질 융합체로서 발현될 수 있다. 일부 바람직하지만 비제한적인 예에는 GFP와 같은 형광성 단백질이 포함된다.
적합한 프로모터, 터미네이터 및 추가 요소의 바람직하지만 비제한적인 예에는 본원에 언급된 숙주 세포에서의 발현을 위해 사용되는 것들, 특히 본원에 언급된 바와 같고/같거나 실시예에서 사용된 바와 같은 세균 세포에서의 발현에 적합한 것들이 포함된다. 본 발명의 유전자 작제물내에 존재하거나 본 발명의 유전자 작제물에서 사용될 수 있는 프로모터, 선별 마커, 리더 서열, 발현 마커 및 추가 요소, 예를 들면, 터미네이터, 전사 및/또는 해독 인핸서 및/또는 통합 인자의 몇가지 (추가) 비제한적 예에 대해서는 상기 언급된 문헌[참조: Sambrook et al. and Ausubel et al.]과 같은 일반적 편람 및 WO 95/07463, WO 96/23810, WO 95/07463, WO 95/21191, WO 97/11094, WO 97/42320, WO 98/06737, WO 98/21355, US-A-6,207,410, US-A- 5,693,492 및 EP 1 085 089에 기재된 예시를 참조한다. 다른 예들은 당업자에게 명백할 것이다. 또한, 상기 인용된 일반적 배경기술 및 본원에 인용된 추가의 참조문헌을 참조한다.
본 발명의 유전자 작제물은 일반적으로 상기 언급된 문헌[참조: Sambrook et al. and Ausubel et al.]과 같은 일반적 편람에 기재된 기술을 사용하여 본 발명의 뉴클레오타이드 서열(들)을 상기한 하나 이상의 추가 요소에 적합하게 연결시킴으로써 제공하 수 있다.
흔히, 본 발명의 유전자 작제물은 본 발명의 뉴클레오타이드 서열을 공지된 적합한 (발현) 벡터내로 삽입시켜 수득될 것이다. 적합한 발현 벡터의 일부 바람직하지만 비제한적인 예로는 하기 실시예에서 사용되는 벡터 뿐만 아니라 본원에 언급될 벡터가 있다.
본 발명의 핵산 및/또는 본 발명의 유전자 작제물은 숙주 세포 또는 숙주 유기체을 형질전환시키기 위해, 즉, 본 발명의 나노바디 또는 폴리펩타이드의 발현 및/또는 생산을 위해 사용될 수 있다. 적합한 숙주 또는 숙주 세포는 당업자에게 명백할 것이고, 예를 들면, 임의의 적합한 진균, 원핵성 또는 진핵성 세포 또는 세포주 또는 임의의 적합한 진균, 진핵성 또는 원핵성 유기체일 수 있으며, 예를 들면 다음과 같다:
- 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli); 프로테우스(Proteus), 예를 들면, 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis); 유도모나스(Pseudomonas), 예를 들면 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens)의 균주와 같은 그램-음성 균주; 및 바실루스(Bacillus), 예를 들면, 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 또는 바실루스 브레비스(Bacillus brevis); 스트렙토마이세스(Streptomyces), 예를 들면, 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans); 스타필로코커스(Staphylococcus), 예를 들면, 스타필로코커스 카르노수스(Staphylococcus carnosus); 및 락토코커스(Lactococcus), 예를 들면, 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)와 같은 그램-양성 균주를 포함하나 이에 제한되지 않는 세균 균주;
- 트리코데르마(Trichoderma)의 종, 예를 들면, 트리코데르마 리세이(Trichoderma reesei); 뉴로스포라(Neurospora), 예를 들면, 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa); 소르다리아(Sordaria), 예를 들면, 소르다리아 마크로스포라(Sordaria macrospora); 아스퍼질루스(Aspergillus), 예를 들면, 아스퍼질루스 니거(Aspergillus niger) 또는 아스퍼질루스 소재(Aspergillus sojae); 또는 기타 사상균으로부터의 세포를 포함하나 이에 제한되지 않는 진균 세포;
- 사카로마이세스(Saccharomyces)의 종, 예를 들면, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae); 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 예를 들면, 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe); 피치아(Pichia), 예를 들면, 피치아 프라스토리스(Pichia pastoris) 또는 피치아 메타놀리카(Pichia methanolica); 한세눌라(Hansenula), 예를 들면, 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha); 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 예를 들면, 클루이베로마이스세스 락티스(Kluyveromyces lactis); 아륵술라(Arxula), 예를 들면, 아륵술라 아데니니보란스(Arxula adeninivorans); 야로위아(Yarrowia), 예를 들면, 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)를 포함하나 이에 제한되지 않는 효모 세포;
- 양서동물 세포 또는 세포주, 예를 들면, 제노푸스(Xenopus) 난모세포;
- 스포도프테라(Spodoptera) SF9 및 Sf21 세포 또는 드로소필라(Drosophila) 유래의 세포/세포주, 예를 들면, 슈나이더(Schneider) 및 Kc 세포를 포함하나 이에 제한되지 않는 곤충 유래의 세포 또는 세포주, 예를 들면, 인시목 유래의 세포/세포주;
- 식물 또는 식물 세포, 예를 들면, 담배 식물; 및/또는
- 포유동물 세포 또는 세포주, 예를 들면, CHO-세포, BHK-세포(예를 들면, BHK-21 세포) 및 HeLa, COS(예를 들면, COS-7) 및 PER.C6 세포와 같은 사람 세포 또는 세포주를 포함하나 이에 제한되지 않는 사람, 포유동물으로부터 유래된 세포 또는 세포주;
및 당업자에게 명백한 항체 및 항체 단편((단일) 도메인 항체 및 ScFv를 포함하나 이에 제한되지 않음)의 발현 및 생산용으로 공지된 기타 숙주 또는 숙주 세포. 또한, 상기 인용된 일반적 배경기술 및 예를 들면, 문헌[참조: WO 94/29457; WO 96/34103; WO 99/42077; Frenken et al., (1998), supra; Riechmann and Muyldermans, (1999), supra; van der Linden, (2000), supra; Thomassen et al., (2002), supra; Joosten et al., (2003), supra; Joosten et al., (2005), supra] 및 본원에 인용된 추가의 참조문헌을 참조한다.
또한, 본 발명의 나노바디 및 폴리펩타이드는 예를 들면, 예방 및/또는 치료 목적(예를 들면, 유전자 치료요법)으로 다세포 유기체의 하나 이상의 세포, 조직 또는 기관내에 도입되거나 발현될 수 있다. 이러한 목적으로, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 예를 들면 그 자체로서(예를 들면, 리포좀을 사용) 또는 적합한 유전자 치료요법 벡터(예를 들면, 아데노바이러스와 같은 레트로바이러스 또는 아데노-관련 바이러스(adeno-associated virus)로부터 유래된 벡터)내로 삽입된 후에, 임의의 적합한 방식으로 세포 또는 조직내로 도입될 수 있다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 이러한 유전자 치료요법을, 본 발명의 핵산 또는 이를 암호화하는 적합한 유전자 치료요법 벡터를 환자 또는 환자의 특정 조직 또는 기관으로 투여함으로써 생체내 및/또는 환자 체내의 원위치에서 수행할 수 있거나, 적합한 세포(흔히, 외식된 림프구, 골수 추출물 또는 조직 생검과 같이 치료될 환자의 신체로부터 채취된다)를 시험관내에서 본 발명의 뉴클레오타이드 서열로 처리한 다음, 환자의 체내로 적합한 (재)도입시킬 수 있다. 이러한 모든 것은 당업자에게 공지된 유전자 치료요법, 기술 및 전달 시스템을 사용하여 수행할 수 있다[참조: Culver, K. W., "Gene Therapy", 1994, p. xii, Mary Ann Liebert, Inc., Publishers, New York, N.Y). Giordano, Nature F Medicine 2 (1996), 534-539; Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911-919; Anderson, Science 256 (1992),808-813; Verma, Nature 389 (1994),239; Isner, Lancet 348 (1996),370-374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995),1077-1086; Onodera, Blood 91; (1998),30- 36; Verma, Gene Ther. 5 (1998),692-699; Nabel, Ann. N.Y. Acad. Sci. : 811 (1997), 289-292; Verzeletti, Hum. Gene Ther. 9 (1998), 2243-51; Wang, Nature Medicine 2 (1996),714-716; WO 94/29469; WO 97/00957, US 5,58O,859; 1 US 5,5895466; 또는 Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640]. 예를 들면, ScFv 단편[참조: Afanasieva et al., Gene Ther., 10, 1850-1859 (2003)] 및 디아바디[참조: Blanco et al., J. Immunol, 171, 1070-1077 (2003)]의 원위치 발현은 당업계에 기술된 바 있다.
세포에서의 나노바디의 발현을 위해, 이들 나노바디는 예를 들면, WO 94/02610, WO 95/22618 및 US-A-6004940; WO 03/014960, 문헌[참조: Cattaneo, A. & Biocca, S. (1997) Intracellular Antibodies: Development and Applications. Landes and Springer-Verlag; 및 Kontermann, Methods 34, (2004), 163-170]에 기술된 바와 같은 소위 "내부체"로서 발현시킬 수도 있다.
생산을 위해, 본 발명의 나노바디 및 폴리펩타이드는 예를 들면, 유전자전이된 포유동물의 유즙, 예를 들면, 토끼, 소, 염소 또는 양의 유즙(포유동물로의 형질전환유전자(transgene)의 도입을 위한 일반적 기술에 대해서는 US-A-5,741,957, US-A-5,304,489 및 US-A-5,849,992을 참조한다), 식물, 또는 이의 잎, 꽃, 과실, 종자, 뿌리 또는 덩이 줄기를 포함하는 식물의 부분(예를 들면, 담배, 옥수수, 대두 또는 알팔파) 또는 예를 들면 누애 봄빅스 모리(Bombix mori)에서 생산될 수 있다.
게다가, 본 발명의 나노바디 및 폴리펩타이드는 또한 세포 비함유(cell-free) 발현 시스템에서 발현 및/또는 생산될 수 있고, 이러한 시스템의 적합한 예는 당업자에게 명백할 것이다. 몇가지 바람직하지만 비제한적인 예로는 밀 배아 시스템, 토끼 망상적혈구 용해물 또는 이. 콜라이 쥬베이(Zubay) 시스템이 포함된다.
상기 언급한 바와 같이, 나노바디 사용시 장점 중 하나는 이에 기초한 폴리펩타이드를 적합한 세균 시스템을 통해 제조할 수 있다는 것이며, 적합한 세균 발현 시스템, 벡터, 숙주 세포, 조절 요소 등은 상기 인용된 참조문헌으로부터 당업자에게 명백할 것이다. 그러나, 본 발명은 이의 가장 광의적 의미에서 세균 시스템에서의 발현으로 제한되지 않음이 주지되어야 한다.
바람직하게는, 본 발명에서는, 본 발명의 폴리펩타이드를 약제용으로 적합한 형태로 제공하는 세균 발현 시스템과 같은 (생체내 또는 시험관내) 발현 시스템을 사용하고, 이러한 발현 시스템은 당업자에게 명백할 것이다. 또한 당업자에게 명백한 바와 같이, 약제용으로 적합한 본 발명의 폴리펩타이드는 펩타이드 합성용 기술을 사용하여 제조할 수 있다.
산업적 규모에서의 생산을 위해, 나노바디 또는 나노바디 함유 단백질 치료제의 (산업적) 생산에 바람직한 이종 숙주는 대규모 발현/생산/발효, 특히 대규모 약제학적 발현/생산/발효에 적합한 이. 콜라이, 피치아 파스토리스, 에스. 세레비지애를 포함한다. 이러한 균주의 적합한 예는 당업자에게 명백할 것이고. 이러한 균주 및 생산/발현 시스템은 Biovitrum (Uppsala, Sweden)과 같은 업체로부터 입수할 수도 있다.
대안으로, 대규모 발현/생산/발효, 특히 대규모 약제학적 발현/생산/발효를 위해 포유동물 세포주, 특히 중국 햄스터 난소(CHO) 세포를 사용할 수 있다. 다시, 이러한 발현/생산 시스템은 상기 언급한 업체로부터 입수할 수 있다.
특정 발현 시스템의 선택은 부분적으로는 특정한 해독후 변형, 보다 구체적으로 글리코실화에 대한 요건에 의존할 수 있다. 글리코실화가 요망되거나 요구되는 나노바디-함유 재조합 단백질의 생산은 발현된 단백질을 글리코실화시킬 수 있는 능력을 갖는 포유동물 발현 시스템의 사용을 필요로 할 수 있다. 이와 관련하여, 수득된 글리코실화 패턴(즉, 부착된 잔기의 종류, 수 및 위치)이 발현을 위해 사용되는 세포 또는 세포주에 의존할 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 바람직하게는, 사람 세포 또는 세포주가 사용되거나(즉, 본질적으로 사람 글리코실화 패턴을 갖는 단백질을 유도하기 위해), 사람 글리코실화와 본질적으로 및/또는 기능적으로 동일하거나 적어도 사람 글리코실화 패턴과 흡사한 글리코실화 패턴을 제공할 수 있는 다른 포유동물 세포주가 사용된다. 일반적으로, 이. 콜라이와 같은 원핵성 숙주는 단백질을 글리코실화시키는 능력을 갖지 않고, 효모와 같은 하등 원핵생물의 사용은 통상적으로 사람 글리코실화와 상이한 글리코실화 패턴을 유도한다. 그럼에도 불구하고, 수득될 바람직한 나노바디 또는 단백질에 따라서, 모든 상기한 숙주 세포 및 발현 시스템을 본 발명에서 사용할 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
따라서, 본 발명의 한가지 비제한적 양태에 따라서, 본 발명의 나노바디 또는 폴리펩타이드는 글리코실화된다. 본 발명의 다른 비제한적 양태에 따라서, 본 발명의 나노바디 또는 폴리펩타이드는 글리코실화되지 않는다.
본 발명의 하나의 바람직하지만 비제한적인 양태에 따라서, 본 발명의 나노바디 또는 폴리펩타이드는 세균 세포, 특히 상기한 언급한 균주의 세포와 같은 대규모 약제 생산에 적합한 세균 세포에서 생산된다.
본 발명의 다른 바람직하지만 비제한적인 양태에 따라서, 본 발명의 나노바디 또는 폴리펩타이드는 효모 세포, 특히 상기한 종의 세포와 같은 대규모 약제 생산에 적합한 효모 세포에서 생산된다.
본 발명의 다른 바람직하지만 비제한적인 양태에 따라서, 본 발명의 나노바디 또는 폴리펩타이드는 포유동물 세포, 특히 사람 세포 또는 사람 세포주의 세포, 보다 특히, 상기 언급한 세포주와 같은 대규모 약제 생산에 적합한 사람 세포 또는 사람 세포주의 세포에서 생산된다.
숙주 세포에서의 발현을 사용하여 본 발명의 나노바디 및 단백질을 생산하는 경우, 본 발명의 나노바디 및 단백질은 세포내에서(즉, 세포질내, 원형질(periplasma)내 또는 봉입체내) 생산한 다음, 숙주 세포로부터 분리시키고 임의로 추가 정제하거나, 세포외에서(예를 들면, 숙주 세포가 배양되는 배지내에서) 생산한 다음, 배양 배지로부터 분리하고 임의로 추가로 정제할 수 있다. 진핵성 숙주 세포가 사용되는 경우, 세포외 생산이 수득된 나노바디 및 단백질의 추가 정제 및 하류 가공이 상당히 촉진하기 때문에 세포외 생산이 통상적으로 바람직하다. 상기 언급한 이. 콜라이의 균주와 같은 세균 세포는 독소 및 용혈소와 같은 몇가지 단백질 부류를 제외하고는 정상적으로는 단백질을 세포외에서 분비하지 않으며, 이. 콜라이에서의 분비성 생산은 단백질이 내막을 가로질러 원형질 공간으로 전위되었음을 의미한다. 원형질성 생산은 세포질 생산보다 우수한 몇가지 장점을 제공한다. 예를 들면, 분비된 산물의 N-말단 아미노산 서열은 특이적 시그날 펩티다제에 의한 분비 시그날 서열의 절단 후에 천연 유전자 산물과 동일할 수 있다. 또한, 원형질에서의 프로테아제 활성은 세포질에서보다 훨씬 덜한 것으로 보인다. 또한, 원형질에 오염성 단백질이 적기 때문에 단백질 정제가 보다 단순하다. 다른 장점은 원형질이 세포질보다 산화성 환경을 제공하기 때문에 올바른 이황화 결합이 형성될 수 있다는 점이다. 이. 콜라이에서 과발현된 단백질은 흔히 불용성 응집체, 소위 봉입체내에서 발견된다. 이러한 봉입체는 세포질내 또는 원형질내에 위치할 수 있다: 이들 봉입체로부터 생물학적 활성 단백질의 회수는 변성/재폴딩(refolding) 과정을 요구한다. 치료학적 단백질을 포함하는 많은 재조합 단백질은 봉입체로부터 회수된다. 대안으로, 당업자에게 명백한 바와 같이, 목적하는 단백질, 특히 본 발명의 나노바디 또는 폴리펩타이드를 분비하도록 유전적으로 변형시킨 세균의 재조합 균주가 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 하나의 비제한적 양태에 따라서, 본 발명의 나노바디 또는 폴리펩타이드는 세포내에서 생산되었고 숙주 세포, 특히 세균 세포 또는 세균 세포내 봉입체로부터 분리된 나노바디 또는 폴리펩타이드이다. 본 발명의 다른 비제한적 양태에 따라서, 본 발명의 나노바디 또는 폴리펩타이드는 세포외에서 생산되었고 숙주 세포가 배양되는 배지로부터 분리된 나노바디 또는 폴리펩타이드이다.
이들 숙주 세포와 함께 사용하기 위한 몇가지 바람직하지만 비제한적인 프로모터는 다음을 포함한다:
- 이. 콜라에서의 발현을 위해: lac 프로모터(및 이의 유도체, 예를 들면, lacUV5 프로모터); 아라비노스 프로모터; 파아지 람다의 좌측(PL) 및 우측(PR) 프로모터; trp 오페론의 프로모터; 하이브리드 lac/trp 프로모터(tac 및 trc); T7-프로모터(보다 구체적으로, T7-파아지 유전자 10의 프로모터) 및 기타 T-파아지 프로모터; Tn10 테트라사이클린 내성 유전자의 프로모터; 외인성 조절 오퍼레이터 서열의 하나 이상의 복사체를 포함하는 상기 프로모터의 조작된 변이체;
- 에스. 세레비지애에서의 발현을 위해: ADH1(알코올 데하이드로게나제 1), ENO(에놀라제), CYC1(시토크롬 c 이소-1), GAPDH(글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제); PGK1(포스포글리세레이트 키나제), PYK1(피루베이트 키나제); 조절된: GAL1,10,7(갈락토스 대사 효소), ADH2(알코올 데하이드로게나제 2), PHO5 (산 포스파타제), CUP1(구리 메탈로티오네인); 이종: CaMV(컬리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터);
- 피치아 파스토리스에서의 발현을 위해: AOX1 프로모터(알코올 옥시다제 I);
- 포유동물 세포에서의 발현을 위해: 사람 사이토메갈로바이러스(hCMV) 즉각적 조기(immediate early) 인핸서/프로모터; 당해 프로모터가 Tet 레프레서에 의해 조절될 수 있도록 하는 2개의 테트라사이클린 오퍼레이터 서열을 함유하는 사람 사이토메갈로바이러스(hCMV) 즉각적 조기 프로모터 변이체; 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제(TK) 프로모터; 라우스 육종 바이러스 긴 말단 반복부(RSV LTR) 인핸서/프로모터; 사람, 침팬지, 마우스 또는 랫트로부터의 연장 인자 1 알파 (hEF-1 알파) 프로모터; SV40 조기 프로모터; HIV-1 긴 말단 반복부 프로모터; 베타-액틴 프로모터.
이들 숙주 세포와 함께 사용하기 위한 몇가지 바람직하지만 비제한적인 벡터는 다음을 포함한다:
-포유동물 세포에서의 발현을 위한 벡터: pMAMneo (Clontech), pcDNA3 (Invitrogen), pMC1neo (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EBO-pSV2-neo (ATCC 37593), pBPV-1 (8-2) (ATCC 37110), pdBPV-MMTneo (342-12) (ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC37199), pRSVneo (ATCC37198), pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460) 및 1ZD35 (ATCC 37565) 뿐만 아니라, 아데노바이러스에 기반한 시스템과 같은 바이러스-기반 발현 시스템;
- 세균 세포에서의 발현을 위한 벡터: pET 벡터(Novagen) 및 pQE 벡터(Qiagen);
- 효모 또는 다른 진균 세포에서의 발현을 위한 벡터: pYES2 (Invitrogen) 및 피치아 발현 벡터(Invitrogen);
- 곤충 세포에서의 발현을 위한 벡터: pBlueBacII (Invitrogen) 및 기타 배뮬로바이러스 벡터;
- 식물 또는 식물 세포에서의 발현을 위한 벡터: 예를 들면, 컬리플라워 모자이크 바이러스 또는 담배 모자이크 바이러스, 아그로박테리움의 적합한 균주에 기반한 벡터 또는 Ti-플라스미드 기반 벡터.
이들 숙주 세포와 함께 사용하기 위한 몇가지 바람직하지만 비제한적인 분비 서열은 다음을 포함한다:
- 이. 콜라이와 같은 세균 세포에서 사용하기 위해: PelB, Bla, OmpA, OmpC, OmpF, OmpT, StII, PhoA, PhoE, MalE, Lpp, LamB 등; TAT 시그날 펩타이드, 용혈소 C-말단 부비 시그날;
- 효모에서 사용하기 위해: 알파-교배 인자, 프리프로-서열, 포스파타제(pho1), 인버타제(Suc) 등;
- 포유동물 세포에서 사용하기 위해: 표적 단백질이 진핵성 기원인 경우에 고유한 시그날; 쥐 Ig 카파-쇄 V-J2-C 시그날 펩타이드 등.
본 발명의 숙주 또는 숙주 세포를 형질전환시키기 위한 적합한 기술은 당업자에게 명백할 것이고, 의도된 숙주 세포/숙주 유기체 및 사용되는 유전자 작제물에 의존할 수 있다. 다시, 상기 언급한 편람 및 특허 출원을 참조한다.
형질전환 후, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열/유전자 작제물로 성공적으로 형질전환된 숙주 세포 또는 숙주 유기체를 검출 및 선별하는 단계를 수행할 수 있다. 이는 예를 들면, 본 발명의 유전자 작제물에 존재하는 선별가능한 마커에 기초한 선별 단계 또는 특이적 항체를 사용한 본 발명의 아미노산 서열의 검출을 포함하는 단계일 수 있다.
형질전환된 숙주 세포(안정한 세포주의 형태일 수 있다) 또는 숙주 유기체(안정한 돌연변이 세포주 또는 균주의 형태일 수 있다)는 본 발명의 추가 측면을 형성한다.
바람직하게는, 이들 숙주 세포 또는 숙주 유기체는 (예를 들면, 적합한 조건하에) 본 발명의 아미노산 서열을 (숙주 유기체의 경우: 이의 하나 이상의 세포, 부분, 조직 또는 기관내에서) 발현하거나 (적어도) 발현할 수 있다.
본 발명은 세포 분열 또는 유성 또는 무성 생식에 의해 수득될 수 있는 본 발명의 숙주 세포 또는 숙주 유기체 추가 세대, 자손 및/또는 후손을 포함한다.
본 발명의 아미노산 서열을 생산하고/이의 발현을 수득하기 위해, 형질전환된 숙주 세포 또는 형질전환된 숙주 유기체를 일반적으로 (목적하는) 본 발명의 아미노산 서열이 발현/생산되도록 하는 조건하에 저장, 유지 및/또는 배양할 수 있다. 적합한 조건은 당업자에게 명백할 것이고, 사용되는 숙주 세포/숙주 유기체 뿐만 아니라 본 발명의 (적절한) 뉴클레오타이드 서열의 발현을 제어하는 조절 요소에 따라 좌우될 것이다. 다시, 본 발명의 유전자 작제물에 대한 단락에서 상기 언급한 편람 및 특허 출원은 참조한다.
일반적으로, 적합한 조건은 적합한 배지, 적합한 식품 공급원 및/또는 적합한 영양소, 적합한 온도의 사용 및 임의로 적합한 유도 인자 또는 화합물의 존재(예를 들면, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열이 유도성 프로모터의 제어하에 있는 경우)를 포함할 수 있으며, 이들 모두 당업자에 의해 선별될 수 있다. 다시, 이러한 조건하에, 본 발명의 아미노산 서열은 구성적 방식, 일시적 방식으로 또는 오직 적합하게 유도된 경우에만 발현될 수 있다.
또한, 본 발명의 아미노산 서열을 (먼저) 미성숙 형태(상기 언급한 바와 같음)로 생성시키고, 이어서, 사용되는 숙주 세포/숙주 유기체에 따라서, 이를 해독후 변형에 적용할 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 또한, 본 발명의 아미노산 서열은 사용되는 숙주 세포/숙주 유기체에 따라서 글리코실화될 수 있다.
이어서, 본 발명의 아미노산 서열을 (분취용) 크로마토그래피 및/또는 전기영동 기술, 차등적 침전 기술, 친화성 기술(예를 들면, 본 발명의 아미노산 서열과 융합된 특이적 절단가능한 아미노산 서열을 사용함) 및/또는 분취용 면역학적 기술(즉, 분리될 아미노산 서열에 대한 항체를 사용함)과 같은 공지된 단백질 분리 및/또는 정제 기술을 사용하여 숙주 세포/숙주 유기체로부터 또는 상기 숙주 세포 또는 숙주 유기체가 배양된 배지로부터 분리할 수 있다.
일반적으로, 약제학적 용도로, 본 발명의 나노바디 또는 폴리펩타이드는 하나 이상의 본 발명의 폴리펩타이드 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제 및/또는 보조제 및 임의로 하나 이상의 추가의 약제학적 활성 폴리펩타이드 및/또는 화합물을 포함하는 약제학적 제제로서 제형화될 수 있다. 비제한적 예로서, 이러한 제형은 경구 투여, 비경구 투여(예를 들면, 정맥내, 근육내 또는 피하 주사 또는 정맥내 주입에 의한), 국소 투여, 흡입, 피부 팻치, 임플란트, 좌제 등에 의한 투여에 적합한 형태일 수 있다. 투여 방식 뿐만 아니라 이의 제조시 사용되는 방법 및 담체에 따라 고체, 반고체 또는 액체일 수 있는 이러한 적합한 형태는 당업자에게 명백할 것이고 본원에 추가로 기술된다.
따라서, 추가의 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 본 발명의 나노바디 또는 하나 이상의 본 발명의 폴리펩타이드 및 하나 이상의 적합한 담체, 희석제 또는 부형제(즉, 적합한 약제학적 사용을 위한) 및 임의로 하나 이상의 추가 활성 물질을 함유하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
일반적으로, 본 발명의 나노바디 및 폴리펩타이드는 임의의 적합한 공지된 방식으로 제형화되고 투여될 수 있으며, 예를 들면, 상기 인용된 일반적 배경술(특히, WO 04/041862, WO 04/041863, WO 04/041865 및 WO 04/041867) 및 문헌[참조: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Company, USA (1990) 또는 Remington, the Science and Practice of Pharmacy, 21th Edition, Lippincott Williams and Wilkins (2005)]을 참조한다.
예를 들면, 본 발명의 나노바디 및 폴리펩타이드는 통상의 항체 및 항체 단편(ScFv 및 디아바디를 포함함) 및 기타 약제학적 활성 단백질에 대해 공지된 임의의 방식으로 제형화하고 투여할 수 있다. 이러한 제형 및 이의 제조방법은 당업자에게 명백할 것이고, 예를 들면 비경구 투여(예를 들면, 정맥내, 복강내, 피하, 근육내, 강내(intraluminal), 동맥내 또는 경막내 투여) 또는 국소(즉, 경피 또는 진피내) 투여에 적합한 제제를 포함한다.
비경구 투여용 제제는 예를 들면, 주입 또는 주사에 적합한 멸균된 용제, 현탁제, 분산제 또는 에멀젼일 수 있다. 이러한 제제에 적합한 담체 또는 희석제는 제한됨이 없이, 멸균수 및 약제학적으로 허용되는 수성 완충액 및 용액, 예를 들면, 생리학적 포스페이트 완충 염수, 링거액, 덱스트로스액 및 행크액; 물; 오일; 글리세롤; 에탄올; 글리콜, 예를 들면, 프로필렌 글리콜 또는 광유 및 식물성 오일, 예를 들면, 땅콩유, 대두유 및 이들의 혼합물을 포함한다. 통상적으로, 수성 용액 또는 현탁액이 바람직할 것이다.
본 발명의 나노바디는 적합한 데포우(depot) 또는 서방출 제형(예를 들면, 주사에 적합한)을 사용하여, 피부 밑에 이식하기 위한 서방출 장치를 사용하여 및/또는 계량식 펌프 또는 약제학적 활성 물질 또는 성분의 투여용으로 공지된 기타 장치를 사용하여 투여할 수도 있다. 이러한 장치 및 장치의 적합한 예는 당업자에게 명백할 것이다.
또한, 통상의 항체 또는 항체 단편과 비교하여, 본 발명의 나노바디 및 폴리펩타이드의 한가지 주요 장점은 당해 나노바디 및 폴리펩타이드를 비경구 투여 이외의 다른 경로를 통해서 용이하게 투여될 수 있고 이러한 투여를 위해 용이하게 제형화될 수 있다는 점이다. 예를 들면, 국제 출원 WO 04/041867 및 상기 언급된 추가의 종래기술에 기재되어 있는 바와 같이, 나노바디 및 나노바디 작제물은 경구, 비강내, 폐내 및 경피 투여용으로 제형화될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기한 바와 같은 폴리펩타이드 작제물, 핵산 또는 조성물 또는 상기한 바와 같은 폴리펩타이드 작제물의 용도이며, 이때 상기 폴리펩타이드 작제물은 정맥내, 피하, 경구, 설하, 국소, 비강, 질, 직장 또는 흡입에 의해 투여된다.
본 발명의 또 다른 양태는
(a) 상기한 폴리펩타이드 작제물을 이의 표적에 상응하는 폴리펩타이드 또는 이의 단편과, 상기 폴리펩타이드들의 결합을 허용되는 조건하에 후보 조절제의 존재 및 부재하에 접촉시키는 단계 및
(b) 단계(a)의 폴리펩타이드 간의 결합을 측정하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 후보 조절제의 부재하에서의 결합과 비교해서 상기 후보 조절제의 존재하에 결합이 감소되었음은 상기 후보 조절제가 혈소판-매개된 응집을 조절하는 제제임을 동정해주는, 혈소판-매개된 응집을 조절하는 제제를 동정하는 방법.
본 발명의 또 다른 양태는 상기한 바와 같은 방법에 따른 혈소판-매개된 응집을 조절하는 제제의 스크리닝을 위한 키트이다.
본 발명의 또 다른 양태는
(a) 샘플을 상기한 폴리펩타이드 작제물과 접촉시키는 단계,
(b) 상기 샘플에 대한 상기 폴리펩타이드 작제물의 결합을 검출하는 단계 및
(c) 단계(b)에서 검출된 결합을 표준과 비교하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 샘플과 비교한 결합에서의 차이가 혈소판-매개된 응집의 기능장애를 특징으로 하는 질환 또는 장애의 진단지표가 되는, 혈소판-매개된 응집의 기능장애를 특징으로 하는 질환 또는 장애의 진단 방법이다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 언급한 혈소판-매개된 응집의 기능장애를 특징으로 하는 질환 또는 장애를 진단하기 위한 키트이다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기한 폴리펩타이드 작제물를 포함하는 상기한 키트이다.
동시 투여란, 폴리펩타이드와 혈전용해제를 피험체에게 동시에 투여함을 의미한다. 예를 들면, 상기 성분들을 포함하는 혼합물 또는 조성물로서 투여할 수 있다. 예로는 정맥내 투여되는 용제, 정제, 액제, 국소 크림 등이 포함되나 이에 제한되지 않으며, 각각의 제제는 당해 폴리펩타이드와 관심대상의 제제를 포함한다.
본 발명의 나노바디는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 연결시켜, 하나 이상의 본 발명의 나노바디를 포함하는 본원에서 기술한 임의의 본 발명의 폴리펩타이드를 형성시킬 수 있다. 예를 들면, 상기한 나노바디를, 아미노산 잔기를 문헌[참조: Blattler et al, Biochemistry 24, 1517-1524; EP294703]에 기술된 바와 같은 유기 유도체화제와 반응시킴으로써 화학적 가교결합에 의해 융합시킬 수 있다.
본 발명의 나노바디 및 폴리펩타이드 낮은 독성 및 높은 선택성과 같은 통상의 항체의 유리한 특성들을 지니고 있을 뿐만 아니라 부가적 특성들을 또한 나타낸다. 이들은 보다 가용성이고, 이는 이들을 통상의 항체와 비교하여 보다 고 농도로 저장 및/또는 투여될 수 있음을 의미한다. 이들은 실온에서 안정하고, 이는 이들을 비용, 시간 및 환경적 조건을 제약하는 냉동 장비의 사용 없이 제조, 저장 및/또는 운반될 수 있음을 의미한다.
예를 들면, 제한된 시간 동안 혈소판-매개된 응집의 억제를 필요로 하는 외과술 과정을 위해서는 짧은 및 조절가능한 반감기가 바람직하다. 또한, 출혈 문제 또는 다른 합병증이 일어난 경우, 용량을 즉각적으로 감소시킬 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드는 또한 통상의 생리학적 범위를 벗어나는 pH 및 온도에서 결합 활성을 보유하며, 이는 당해 폴리펩타이드가 위 수술, 위 출혈의 조절, 실온등에서 수행되는 검정에서와 같은 혈소판-매개된 응집의 조절을 필요로 하는 극단적 pH 및 온도의 상황하에 유용할 수 있음을 의미한다. 본 발명의 폴리펩타이드는 또한 극단적 pH에서 연장된 안정성을 나타내며, 이는 당해 폴리펩타이드가 경구 투여에 의한 전달에 적합할 수 있음을 의미한다. 본 발명의 폴리펩타이드는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 및 효모와 같은 통상의 재조합 숙주 유기체에서 발효를 통해 비용-효율적으로 생산될 수 있다; 고비용의 포유동물 세포 배양 설비를 요하는 통상의 항체와 달리, 성취가능한 발현 수준이 높다. 본 발명의 폴리펩타이드의 수율의 예는 1 내지 10mg/ml(이. 콜라이) 및 최대 1g/l(효모)이다. 본 발명의 폴리펩타이드는 또한 광범위한 상이항 항원 유형에 대한 높은 결합 친화성 및 통상의 항체에 의해 인식되지 않는 에피토프에 결합하는 능력을 나타내며, 예를 들면, 이들은 강내로의 침투 잠재성을 갖는 긴 CDR-기반 루프 구조를 나타내며 효소 작용 억제를 나타낸다. 게다가, 결합은 흔히 CDR3 루프를 통해서만 일어나기 때문에, CDR3 유래의 펩타이드가 치료학적으로 사용될 수 있는 것으로 예상된다[참조: Desmyter et al., J Biol Chem, 2001, 276: 26285-90].
본원에서 사용되는 바와 같이, 기능적 부분은 관심대상의 상호작용이 1 x 10-6 M 이상의 친화성으로 유지되도록 하기에 충분한 크기의 본 발명의 나노바디를 지칭한다.
대안으로, 본 발명의 나노바디의 기능적 부분은 완전한 아미노산 서열의 부분적 결실을 포함하고 표적의 결합 및 표적과의 상호작용을 위해 필수적인 결합 부위(들) 및 단백질 도메인(들)을 여전히 유지한다.
본 발명의 한 측면은 주사할 필요가 없는 본 발명에 따른 본 발명의 폴리펩타이드의 투여다. 통상의 항체-기본 치료제는 이들의 표적에 대한 적절한 특이성 및 낮은 내재 독성을 갖기 때문에 약물로서 상당한 잠재성을 갖고 있지만, 이는 중요한 단점을 갖고 있는데, 즉 이는 비교적 불안정하고 프로테아제 의한 분해에 민감하다. 이는 통상의 항체 약물을 경구, 설하, 국소, 비강, 질내, 직장 또는 흡입에 의해 투여할 수 없음을 의미하며, 이는 이러한 통상의 항체 약물이 이들 부위에서 낮은 pH, 이들 부위 및 혈중의 프로테아제 작용에 대해 내성이 없고/없거나 이의 크기가 작기 때문이다. 통상의 항체 약물은 이러한 문제점 중 일부를 극복하기 위해 주사에 의해(정맥내, 피하 투여 등) 투여되어야 한다. 주사에 의한 투여는 피하주사용 주사기 또는 바늘을 정확하고 안전하게 사용하기 위해 전문적 훈련을 필요로 한다. 게다가, 이는 멸균 장치, 치료학적 펩타이드의 액체 제형, 상기 폴리펩타이드의 멸균되고 안전한 형태로의 바이알 포장, 피험체, 바늘이 도입되기 위한 적합한 부위를 필요로 한다. 또한, 피험체는 주사로 투여 전 및 투여시에 신체적 및 생리학적 스트레스를 경험한다.
본 발명의 한 측면은 본 발명의 폴리펩타이드 작제물을 제공함으로써 이러한 종래 기술의 문제점들을 해결하는 것이다. 상기 작제물은 활성의 손실 없이 경구, 설하, 국소, 비강, 질, 직장 또는 흡입에 의해 전달되기에 충분한 정도로 소형이고, 내성이며 안정하다. 본 발명의 폴리펩타이드 작제물은 주사할 필요가 없으며, 비용/시간 절약적일 뿐만 아니라 피험체에게 보다 적절하며 편리하다.
비제한적 예로서, 본 발명에 따른 제형은 겔, 크림, 좌제, 필름의 형태 또는 스폰지의 형태로서 또는 시간에 걸쳐서 활성 성분을 서서히 방출하는 질내 링(vaginal ring)의 형태로서 본 발명의 나노바디 또는 폴리펩타이드를 포함한다(이러한 제형은 EP 707473, EP 684814, US 5629001에 기재되어 있다).
이러한 과정은 본 발명의 추가 측면- 능동 수송 운반체의 사용에 의해 보다 더욱 증진된다. 본 발명의 이러한 측면에서, VHH는 장 벽(intestinal wall)을 통한 혈류로의 수송을 증진시키는 운반체에 융합된다. 비제한적 예로서, 이러한 "운반체"는 치료학적 VHH에 융합된 제2 VHH이다. 이러한 융합 작제물은 당업계에 공지된 방법으로 제조한다. "운반체" VHH는 장 벽을 통한 능동 수송을 유도하는 장 벽상의 수용체에 특이적으로 결합한다.
이러한 과정은 본 발명의 추가 측면- 능동 수송 운반체의 사용에 의해 보다 더욱 증진된다. 본 발명의 이러한 측면에서, 본원에 기재된 본 발명의 나노바디 또는 폴리펩타이드는 장 벽을 통한 혈류로의 수송을 증진시키는 운반체에 융합된다. 비제한적 예로서, 이러한 "운반체"는 상기 폴리펩타이드에 융합된 VHH이다. 이러한 융합 작제물은 당업계에 공지된 방법으로 제조한다. "운반체" VHH는 장 벽을 통한 능동 수송을 유도하는 장 벽상의 수용체에 특이적으로 결합한다.
상기 본 발명의 나노바디 또는 폴리펩타이드의 제형, 예를 들면, 크림, 필름, 스프레이, 점적제, 팻치는 피부 위에 놓여지고 이를 통과한다.
본 발명의 다른 양태에서, 본 발명의 나노바디 또는 폴리펩타이드는 상기 본 발명의 나노바디 또는 폴리펩타이드의 폐 내강을 통한 혈액으로의 수송을 위한 능동 수송 운반체로서 작용하는 본 발명의 운반체 나노바디(예: VHH)를 추가로 포함한다.
본 발명의 나노바디 또는 폴리펩타이드는 점막 표면(기관지 상피 세포)상에 존재하는 수용체에 특이적으로 결합하여 당해 폴리펩타이드의 폐 내강으로부터 혈액으로의 수송을 야기하는 운반체를 추가로 포함한다. 본 발명의 운반체 나노바디 는 본 발명의 나노바디 또는 폴리펩타이드에 융합될 수 있다. 이러한 융합 작제물은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조되며 본원에 기술된다. 본 발명의 "운반체" 나노바디는 표면을 통한 능동 수송을 유도하는 점막 표면상의 수용체에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 다른 측면은 본 발명의 나노바디(예: VHH)가 비강 투여시 혈류로 능동적으로 수송되는지를 측정하는 방법이다.
폐 내강으로부터 혈류로의 능동 수송을 위한 수송체의 비제한적 예는 Fc 수용체 N(FcRn)이다.
본 발명의 한 측면에 따라서, 항-A-베타 폴리펩타이드는 경구 투여용으로 사용될 수 있다. 통상의 항체-기본 치료제는 이들의 표적에 대한 적절한 특이성 및 낮은 내재 독성을 갖기 때문에 약물로서 상당한 잠재성을 갖고 있지만, 이는 중요한 단점을 갖고 있는데, 즉 이는 비교적 불안정하고 프로테아제 의한 분해에 민감하다. 이는 통상의 항체 약물을 경구, 설하, 국소, 비강, 질내, 직장 또는 흡입에 의해 투여할 수 없음을 의미하며, 이는 이러한 통상의 항체 약물이 이들 부위에서 낮은 pH, 이들 부위 및 혈중의 프로테아제 작용에 대해 내성이 없고/없거나 이의 크기가 작기 때문이다. 통상의 항체 약물은 이러한 문제점 중 일부를 극복하기 위해 주사에 의해(정맥내, 피하 투여 등) 투여되어야 한다. 주사에 의한 투여는 피하주사용 주사기 또는 바늘을 정확하고 안전하게 사용하기 위해 전문적 훈련을 필요로 한다. 게다가, 이는 멸균 장치, 치료학적 펩타이드의 액체 제형, 상기 폴리펩타이드의 멸균되고 안전한 형태로의 바이알 포장, 피험체, 바늘이 도입되기 위한 적합한 부위를 필요로 한다. 또한, 피험체는 통상적으로 주사로 투여 전 및 투여시에 신체적 및 생리학적 스트레스를 경험한다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 폴리펩타이드는 주사를 통한 투여를 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 한 측면은 본 발명의 항-A-베타 폴리펩타이드를 제공함으로써 이러한 종래 기술의 문제점들을 해결하는 것이다. 상기 폴리펩타이드는 활성의 손실 없이 경구, 설하, 국소, 비강, 질, 직장 또는 흡입에 의해 전달되기에 충분한 정도로 소형이고, 내성이며 안정하다. 본 발명의 폴리펩타이드는 주사할 필요가 없으며, 비용/시간 절약적일 뿐만 아니라 피험체에게 보다 적절하며 편리하다.
본 발명의 한 양태는 불활성화됨이 없이 위 환경을 통해 통과할 수 있는, A-베타를 조절하는 물질에 의한 조절에 민감한 장애의 증상을 치료, 예방 및/또는 경감시키는데 사용하기 위한 본원에 기술된 항-A-베타 폴리펩타이드이다.
당업자에 의해 공지된 바와 같이, 일단 상기 폴리펩타이드가 소유된다면, 제형 기술을 적용하여 최대 양의 폴리펩타이드를 올바른 위치(위, 결장 등)에서 방출시킬 수 있다. 이러한 전달 방법은 그 표적이 내장 시스템에 위치하는 장애의 증상을 치료, 예방 및/또는 경감시키는데 있어 중요하다.
본 발명의 한 측면은 피험체에게 본원에 기술된 항-A-베타 폴리펩타이드를 경구 투여하여, 불활성화됨이 없이 위 환경을 통해 통과할 수 있는, A-베타를 조절하는 물질에 의한 조절에 민감한 장애의 증상을 치료, 예방 및/또는 경감시키는 방법이다.
본 발명의 또 다른 양태는 불활성화됨이 없이 위 환경을 통해 통과할 수 있는, A-베타를 조절하는 물질에 의한 조절에 민감한 장애의 증상을 치료, 예방 및/또는 경감시키기 위한 의약의 제조를 위한 항-A-베타 폴리펩타이드의 용도이다.
본 발명의 한 측면은 피험체에게 본원에 기술된 항-A-베타 폴리펩타이드를 경구 투여하여, A-베타를 조절하는 물질을 당해 물질을 불활성화시키지 않으면서 내장 시스템으로 전달하는 방법이다.
본 발명의 한 측면은 피험체에게 본원에 기술된 항-A-베타 폴리펩타이드를 경구 투여하여, A-베타를 조절하는 물질을 당해 물질을 불활성화시키지 않으면서 혈류로 전달하는 방법이다.
본 발명의 또 다른 양태는 코, 상기도 및/또는 폐로 전달된 A-베타를 조절하는 물질에 의한 조절에 민감한 장애의 증상을 치료, 예방 및/또는 경감시키는데 사용하기 위한 본원에 기술된 항-A-베타 폴리펩타이드이다.
비제한적 예로서, 본 발명에 따른 제형은, 비강 스프레이(예: 에어로졸) 또는 흡입제로의 형태로 본원에 기술된 항-A-베타 폴리펩타이드를 포함한다. 당해 폴리펩타이드가 작기 때문에, 이는 치료학적 IgG 분자보다 훨씬 더 효율적으로 이의 표적에 도달할 수 있다.
본 발명의 한 측면은 본원에 기술된 항-A-베타 폴리펩타이드를 피험체에게 구강 또는 비강을 통한 흡입에 의해 투여하여, 코, 상기도 및/또는 폐로 전달된 A-베타를 조절하는 물질에 의한 조절에 민감한 장애의 증상을 치료, 예방 및/또는 경감시키는 방법이다.
본 발명의 또 다른 양태는 당해 폴리펩타이드가 불활성화되지 않으면서 코, 상기도 및/또는 폐로 전달된 A-베타를 조절하는 물질에 의한 조절에 민감한 장애의 증상을 치료, 예방 및/또는 경감시키기 위한 의약의 제조를 위한 항-A-베타 폴리펩타이드의 용도이다.
본 발명의 한 측면은 본원에 기술된 항-A-베타 폴리펩타이드를 피험체의 코, 상기도 및/또는 폐로 투여하여, A-베타를 조절하는 물질을 불활성화 없이 코, 상기도 및/또는 폐로 전달하는 방법이다.
본 발명의 한 측면은 본원에 기술된 항-A-베타 폴리펩타이드를 피험체의 코, 상기도 및/또는 폐로 투여하여, A-베타를 조절하는 물질을 불활성화 없이 혈류로 전달하는 방법이다.
본 발명의 한 양태는 혀 아래의 조직을 통해 효율적으로 통과할 수 있는, A-베타를 조절하는 물질에 의한 조절에 민감한 장애의 증상을 치료, 예방 및/또는 경감시키는데 사용하기 위한 본원에 기술된 항-A-베타 폴리펩타이드이다. 본원에 기술된 상기 폴리펩타이드의 제형, 예를 들면, 정제, 스프레이, 점적제는 혀 아래에 놓여져서 점막을 통해서 혀 아래의 모세혈관 네트워크로 흡수된다.
본 발명의 한 측면은 본원에 기술된 항-A-베타 폴리펩타이드를 피험체에게 설하 투여하여, 혀 아래의 조직을 통해 효율적으로 통과할 수 있는, A-베타를 조절하는 물질에 의한 조절에 민감한 장애의 증상을 치료, 예방 및/또는 경감시키는 방법이다.
본 발명의 또 다른 양태는 혀 아래의 조직을 통해 효율적으로 통과할 수 있는, A-베타를 조절하는 물질에 의한 조절에 민감한 장애의 증상을 치료, 예방 및/또는 경감시키기 위한 의약의 제조를 위한 본원에 기술된 항-A-베타 폴리펩타이드의 용도이다.
본 발명의 한 측면은 본원에 기술된 항-A-베타 폴리펩타이드를 피험체에게 설하 투여하여, A-베타를 조절하는 물질을 불활성화 없이 혀 아래의 조직으로 전달하는 방법이다.
본 발명의 한 측면은 본원에 기술된 항-A-베타 폴리펩타이드를 피험체에게 경구 투여하여, A-베타를 조절하는 물질을 불활성화 없이 혈류로 전달하는 방법이다.
본 발명의 한 양태는 장 점막으로 전달된 A-베타를 조절하는 물질에 의한 조절에 민감하고 장 점막의 투과성을 증가시키는 장애의 증상을 치료, 예방 및/또는 경감시키는데 사용하기 위한 본원에 기술된 항-A-베타 폴리펩타이드이다. 이의 작은 크기로 인해, 본원에 기술된 항-A-베타 폴리펩타이드는 장 점막의 투과성의 증가를 유발하는 장애를 앓는 피험체에서 장 점막을 통과하여 보다 효율적으로 혈류에 도달할 수 있다.
본 발명의 한 측면은 본원에 기술된 항-A-베타 폴리펩타이드를 피험체에게 경구 투여하여, 장 점막으로 전달된 A-베타를 조절하는 물질에 의한 조절에 민감하고 장 점막의 투과성을 증가시키는 장애의 증상을 치료, 예방 및/또는 경감시키는 방법이다.
이러한 과정은 본 발명의 추가 측면- 능동 수송 운반체의 사용에 의해 보다 더욱 증진된다. 본 발명의 이러한 측면에서, 중쇄 항체는 장 벽을 통한 혈류로의 수송을 증진시키는 운반체에 융합된다. 비제한적 예로서, 이러한 "운반체"는 치료학적 중쇄 항체에 융합된 제2 중쇄 항체이다. 이러한 융합 폴리펩타이드는 당업계에 공지된 방법으로 제조한다. "운반체" 중쇄 항체는 장 벽을 통한 능동 수송을 유도하는 장 벽상의 수용체에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 다른 양태는 장 점막으로 전달된 A-베타를 조절하는 물질에 의한 조절에 민감하고 장 점막의 투과성을 증가시키는 장애의 증상을 치료, 예방 및/또는 경감시키기 위한 의약의 제조를 위한 본원에 기술된 항-A-베타 폴리펩타이드의 용도이다.
본 발명의 한 측면은 본원에 기술된 항-A-베타 폴리펩타이드를 피험체에게 경구 투여하여, A-베타를 조절하는 물질을 불활성화 없이 장 점막으로 전달하는 방법이다.
본 발명의 한 측면은 본원에 기술된 항-A-베타 폴리펩타이드를 피험체에게 경구 투여하여, A-베타를 조절하는 물질을 불활성화 없이 혈류로 전달하는 방법이다.
이러한 과정은 본 발명의 추가 측면- 능동 수송 운반체의 사용에 의해 보다 더욱 증진된다. 본 발명의 이러한 측면에서, 본원에 기술된 항-A-베타 폴리펩타이드는 장 벽을 통한 혈류로의 수송을 증진시키는 운반체에 융합된다. 비제한적 예로서, 이러한 "운반체"는 상기 폴리펩타이드에 융합된 나노바디이다. 이러한 융합 폴리펩타이드는 당업계에 공지된 방법으로 제조한다. "운반체" 나노바디는 장 벽을 통한 능동 수송을 유도하는 장 벽상의 수용체에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 다른 양태에서, 본원에 기술된 항-A-베타 폴리펩타이드는 상기 폴리펩타이드의 폐 내강을 통한 혈액으로의 수송을 위한 능동 수송 운반체로서 작용하는 운반체 중쇄 항체(예: 나노바디)를 추가로 포함한다.
항-A-베타 폴리펩타이드는 점막 표면(기관지 내피 세포)상에 존재하는 수용체에 특이적으로 결합하여 당해 폴리펩타이드의 폐 내강으로부터 혈액으로의 수송을 야기하는 운반체를 추가로 포함한다. 운반체 중쇄 항체는 당해 폴리펩타이드에 융합될 수 있다. 이러한 융합 폴리펩타이드는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조되며 본원에 기술된다. "운반체" 중쇄 항체는 표면을 통한 능동 수송을 유도하는 점막 표면상의 수용체에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 다른 측면은 운반체 중쇄 항체(예: 나노바디)가 비강 투여시 혈류로 능동적으로 수송되는지를 측정하는 방법이다. 유사하게, 천연 또는 면역 나노바디 파아지 라이브러를 비강 투여하고, 투여 후 상이한 시점 후에 혈액 또는 기관을 분리시켜, 혈류로 능동적으로 수송된 파아지를 회수할 수 있다. 폐 내강으로부터 혈액으로의 수송을 위한 수용체의 비제한적 예는 Fc 수용체 N(FcRn)이다. 본 발명의 한 측면은 당해 방법으로 동정된 나노바디를 포함한다. 이러한 나노바디는 후속적으로 비강 투여시 혈류 중의 상응하는 표적으로 치료학적 나노바디를 전달하기 위한 운반체 나노바디로서 사용될 수 있다.
본 발명의 한 양태는 A-베타 또는 이의 기능장애에 의해 매개되거나 아밀로이드 플라크 형성에 의해 매개되는 장애의 증상을 치료, 예방 및/또는 경감시키는데 사용하기 위한 본원에 기술된 항-A-베타 폴리펩타이드이다.
본원에 언급된 장애에는 성인 다운 증후군, 알쯔하이머병, 근육위축성 측삭경화증/파킨슨병 치매 복합증, 아밀로이드 다발신경병증, 아밀로이드 심근병증, 투석 환자에서의 아밀로이드, 베타2-마이크로글로불린, 근육 소모성 질환에서의 베타2-아밀로이드 침착, 피질-기저핵 변성, 크레이츠펠트-야콥병, 권투선수치매, 치명적 가족성 불면증, 게르슈트만-슈트라우슬러-샤인커(Gerstamnn-Straussler-Scheinker) 증후군, 괌-파킨슨병 치매 복합증, 할러포르텐-스파츠병, 아밀로이드증을 동반한 유전성 뇌출혈, 특발성 골수종, 봉입체 근염, 랑게르한스섬 2형 당뇨병 인슐린증, 쿠루병, 갑상선 수질 암종, 지중해열, 머클-웰스 증후군, 신경내장 지질 저장 질환, 파킨슨병, 피크병, 또는 헌팅턴병, 케네디병 및 연장된 폴리글루타민관(polyglutamine tract)과 관련된 모든 형태의 척수소뇌성 운동실조증을 포함하는 폴리글루타민 질환, 진행성 핵상마비, 아급성 경화성 범뇌염, 전신성 노인성 아밀로이드증, 스크래피가 포함된다.
본 발명의 한 측면 A-베타 또는 이의 기능장애에 의해 매개되거나 아밀로이드 플라크 형성에 의해 매개되는 장애 또는 상태를 치료, 예방 및/또는 경감시키는데 사용하기 위한, 정맥내, 피하, 경구, 설하, 비강 또는 흡입에 의해 투여되는 본원에 기술된 항-A-베타 폴리펩타이드이다.
본 발명의 또 다른 측면은 A-베타 또는 이의 기능장애에 의해 매개되거나 아밀로이드 플라크 형성에 의해 매개되는 장애 또는 상태를 치료, 예방 및/또는 경감시키는데 사용하기 위한 본원에 기술된 항-A-베타 폴리펩타이드이다.
본 발명의 또 다른 측면은 A-베타 또는 이의 기능장애에 의해 매개되거나 아밀로이드 플라크 형성에 의해 매개되는 장애 또는 상태를 치료, 예방 및/또는 경감을 위한 의약의 제조를 위한, 정맥내, 피하, 경구, 설하, 비강 또는 흡입에 의해 투여되는 본원에 기술된 항-A-베타 폴리펩타이드의 용도이다.
본 발명의 또 다른 측면은 A-베타 또는 이의 기능장애에 의해 매개되거나 아밀로이드 플라크 형성에 의해 매개되는 장애 또는 상태를 치료, 예방 및/또는 경감을 위한 의약의 제조를 위한 본원에 기술된 항-A-베타 폴리펩타이드의 용도이다.
본 발명의 또 다른 측면은 본원에 기술된 항-A-베타 폴리펩타이드를 피험체에게 투여함을 포함하고, 여기서 상기 폴리펩타이드가 정맥내, 피하, 경구, 설하, 비강 또는 흡입에 의해 투여되는, A-베타 또는 이의 기능장애에 의해 매개되거나 아밀로이드 플라크 형성에 의해 매개되는 장애 또는 상태를 치료, 예방 및/또는 경감시키는 방법이다.
본 발명의 또 다른 측면은 A-베타 또는 이의 기능장애에 의해 매개되거나 아밀로이드 플라크 형성에 의해 매개되는 장애 또는 상태를 치료, 예방 및/또는 경감시키는 방법이다.
한 양태는 A-베타를 표적화하는 화합물로 치료한 후의 피험체에서 해독제로서 사용하기 위한 본 발명의 항-A-베타 폴리펩타이드이다.
본 발명의 또 다른 양태는 본원에 기술된 항-A-베타 폴리펩타이드 및/또는 항-단백질 tau 중쇄 항체를 사용하여 피험체에서 A-베타 및/또는 단백질 tau 또는 이의 기능부전에 의해 매개되거나 아밀로이드 플라크 형성에 의해 매개되는 장애의 검출하기 위한 방법 및 키트이다. 따라서, 당해 방법 및 키트는 피험자에게 치료법을 처방하는데도 유용할 수 있다. 적합한 치료법은 이러한 장애의 발생을 지연 또는 예방하도록 고안될 수 있다. 본 발명은 또한 처방된 치료법의 유효성을 모니터링하는데도 유용하다.
본 발명의 한 양태는
(a) 피험체로부터 샘플을 수득하는 단계; 및
(b) 본 발명의 A-베타 폴리펩타이드 및/또는 항-단백질 tau 중쇄 항체를 사용하여 상기 샘플 중의 A-베타 및/또는 tau를 측정하는 단계를 포함하는, A-베타 및/또는 단백질 tau 또는 이의 기능부전에 의해 매개되거나 아밀로이드 플라크 형성에 의해 매개되는 장애의 진단 방법이다.
본 발명의 다른 양태는
a) 샘플을 항-A-베타 폴리펩타이드 및/또는 항-단백질 tau 중쇄 항체와 접촉시키는 단계,
b) 상기 샘플에 대한 상기 폴리펩타이드 또는 항체의 양을 측정하는 단계 및
c) 단계(b)에서 검출된 결합을 표준과 비교하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 샘플과 비교한 결합에서의 차이가 아밀로이드 플라크 형성 또는 원섬유 엉킴의 형성을 특징으로 하는 장애의 진단지표가 되는, A-베타 및/또는 단백질 tau 또는 이의 기능부전에 의해 매개되거나 아밀로이드 플라크 형성에 의해 매개되는 장애의 진단 방법이다.
본 발명의 또 다른 양태는
(a) 샘플을 상기 기술한 항-A-베타 폴리펩타이드 및/또는 및/또는 항-단백질 tau 중쇄 항체와 접촉시키는 단계,
(b) 샘플 중의 A-베타 및/또는 단백질 tau의 양을 측정하는 단계 및
(c) 단계(b)에서 측정된 양을 표준과 비교하고, 여기서 상기 샘플과 비교한 양에서의 차이가 아밀로이드 플라크 형성 또는 원섬유 엉킴의 형성을 특징으로 하는 장애의 진단지표가 되는, A-베타 및/또는 단백질 tau 또는 이의 기능부전에 의해 매개되거나 아밀로이드 플라크 형성에 의해 매개되는 장애의 진단 방법이다.
본 발명의 한 양태에서, 샘플은 A-베타 및/또는 단백질 tau 또는 이의 기능부전에 의해 매개되거나 아밀로이드 플라크 형성에 의해 매개되는 장애에 대해 시험될 피험체로부터 수득되거나 수거된다. 피험체는 이러한 장애를 갖는 것으로 의심되거나 의심되지 않을 수 있다. 샘플은 천연 A-베타 및/또는 단백질 tau의 양을 측정하는데 사용될 수 있는 피험체로부터 수득된 임의의 표본이다. 바람직한 샘플은 A-베타 및/또는 단백질 tau의 양을 측정하는데 사용될 수 있는 체액(바람직하게는 CSF)이다. 당업자라면 적절한 샘플을 용이하게 동정할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "접촉"이란 용어는 A-베타 또는 단백질 tau를 추정상 함유하는 샘플을, 예를 들면, 당해 샘플을 각각의 폴리펩타이드(들)과 배합하거나 혼합함으로써 각각 항-A-베타 폴리펩타이드 또는 항-단백질 tau 중쇄 항체로 도입시킴을 의미한다. A-베타 및/또는 단백질 tau가 샘플 중에 존재한다면, 이어서 복합체가 형성된다; 이러한 복합체를 검출할 수 있다. 검출은 정량적, 정성적 또는 준정성적이다. 각각의 항-A-베타 폴리펩타이드 또는 항-단백질 tau 중쇄 항체에 대한 샘플 중의 A-베타 및/또는 단백질의 결합은 복합체를 형성하기에 적합한 조건하에 달성된다. 이러한 조건(예: 적절한 농도, 완충액, 온도, 반응 시간) 뿐만 아니라 이러한 조건을 최적화시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 결합은 효소 면역검정(예: ELISA), 면역침전, 면역블롯 검정 및 예를 들면, 문헌[참조; Sambrook et al., supra, and Harlow et al., Antibodies, a Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Labs Press, 1988)]에 기술된 기타 면역검정을 포함하나 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 다양한 표준 방법을 사용하여 결합을 측정할 수 있다. 이들 참조문헌은 복합체 형성 조건의 예를 또한 제공한다.
하나의 양태에서, 상기한 복합체는 용액 중에서 형성될 수 있다. 다른 양태에서, 상기한 복합체가 형성될 수 있다. 하나의 성분(예: A-베타, 단백질 tau, 항-A-베타 폴리펩타이드, 항-단백질 tau 중쇄 항체)이 기재에 고정화(예를 들면, 피복)되어 있는 상기한 복합체가 형성될 수 있다. 고정화 기술은 당업자에게 공지되어 있다. 적합한 기재 물질에는 플라스틱, 유리, 겔. 셀룰로이드, 섬유, 종이 및 미립자 물질이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 기재 물질의 예로는 라텍스, 폴리스티렌, 나일론, 니트로셀룰로즈, 아가로스, 면, PVDF(폴리-비틸리덴-플루오라이드) 및 마그네틱 수지가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 기재 물질의 적합한 모양에는 벽(예: 미세역가 디쉬 웰), 미세역가 플레이트, 딥스틱, 스트립, 비이드, 측면 유동(lateral flow) 장치, 막, 필터, 튜브, 디쉬, 셀룰로이드형 매트릭스, 마그네틱 입자 및 기타 미립자가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 특히 바람직한 기재에는, 예를 들면, ELISA 플레이트, 딥스틱, 면역돗트 스트립, 방사선면역검정 플레이트, 아가로스 비이드, 플라스틱 비이드, 라텍스 비이드, 스폰지, 면사, 플라스틱 칩, 면역블롯 막, 면역블롯 종이 및 통류 막(flow-through membrane)이 포함된다. 하나의 양태에서, 미립자와 같은 기재는 검출가능한 마커를 포함할 수 있다. 기재 물질의 예의 설명에 대해서는 문헌[참조: Kemeny, D. M. (1991) A Practical Guide to ELISA, Pergamon Press, Elmsford, NY pp 33-44, and Price, C. and Newman, D. eds. Principles and Practice of Immunoassay, 2nd edition(1997) Stockton Press, NY, NY, 둘다 전문이 본원에서 참조로 인용된다]을 참조한다.
바람직한 양태에서, 항-A-베타 폴리펩타이드 및/또는 항-단백질 tau 중쇄 항체는 미세역가 디쉬 웰, 딥스틱, 면역돗트 스트립 또는 측면 유동 장치와 같은 기재에 고정화된다. 피험체로부터 수거된 샘플을 상기 기재에 적용하고, 상기 기재에 결합된 복합체가 형성되도록 하기에 적합한(즉, 충분한) 조건하에 항온처리한다.
본 발명에 따라서, 복합체는 일단 형성되면, 검출된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "복합체 형성을 검출하다"란 용어는 A-베타에 복합체화된 항-A-베타 폴리펩타이드 및/또는 단백질 tau에 복합체화된 항-단백질 tau 중쇄 항체의 존재를 동정함을 의미한다. 복합체가 형서된 경우, 형성된 복합체의 양은 정량할 수 있지만, 필수적이지는 않다. 복합체 형성 또는 선택적 결합은 당업계의 다양한 표준 방법[참조: Sambrook et al. supra.]을 사용하여 측정(즉, 검출, 측정)할 수 있으며, 이러한 방법의 예는 본원에 기술되어 있다. 복합체는 다음 검정 중 하나 이상의 사용을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 방식으로 검출할 수 있다: 효소 연계 면역검정, 경쟁적 효소 연계 면역검정, 방사선 면역검정, 형광 면역검정, 화학발광 검정, 측면 유동 검정, 통류 검정, 응집 검정, 미립자 기반 검정(미립자, 예를 들면, 이에 제한됨이 없이, 마그네틱 입자 또는 플라스틱 중합체, 예를 들면, 라텍스 또는 폴리스티렌 비이드를 사용함), 면역침전 검정, BioCore 검정(예를 들면, 콜로이드성 금을 사용함), 면역돗트 검정(예: CMG's Immunodot System, Fribourg, Switzerland) 및 면역블롯 검정(예: 웨스턴 블롯), 인광 검정, 통류 검정, 미립자 기반 검정, 크로마토그래피 검정, PAGE-기반 검정, 표면 플라스몬 공명 검정, 분광광도측정 검정 및 전자 감각 검정. 이러한 검정들은 당업자에게 널리 공지되어 있다.
당해 검정이 사용되는 방식에 따라서, 검정을 사용하여 정량적 또는 정성적 결과를 제공할 수 있다. 검정 결과는 전체 A-베타 및/또는 단백질 tau 분자 또는 단편, 분해 산물 또는 이의 반응 산물을 검출하는데 기초할 수 있다. 응집, 미립자 분리 및 면역침전과 같은 검정은 검출가능한 마커의 필요없이 가시적으로(예를 들면, 육안 또는 기계, 예를 들면, 농도계 또는 분광광도측정계에 의해) 관찰될 수 있다.
다른 검정에서, 항-A-베타 폴리펩타이드, 항-단백질 tau 중쇄 항체 또는 이의 표적에 대한 검출가능한 마커의 접합은 복합체 형성을 검출하는데 도움이 된다. 예를 들면, 검출가능한 마커는 항-A-베타 폴리펩타이드 또는 항-단백질 tau 중쇄 항체가 이들 각각의 표적에 결합하는 능력을 방해하지 않는 부위에서 항-A-베타 폴리펩타이드 또는 항-단백질 tau 중쇄 항체에 접합될 수 있다. 접합 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 검출가능한 마커의 예에는 방사능 표지, 형광 표지, 화학발광 표지, 발색단 표지, 효소 표지, 인광 표지, 전자 표지, 금속성 표지, 착색된 비이드, 물리적 표지 또는 리간드가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 바람직한 검출가능한 마커에는 플루오레세인, 방사선동위원소, 포스페이트(예: 알칼리성 포스파타제), 바이오틴, 아비딘, 퍼옥시다제(예: 서양고추냉이 퍼옥시다제), 베타-갈락토시다제 및 바이오틴 관련 화합물 또는 아비딘 관련 화합물(예: 스트렙타비딘 또는 ImmunoPure NeutrAvidin)가 포함되나 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 지시 분자의 존재를 검출할 수 있는 2차 분자 또는 기타 결합 분자의 하나 이상의 층 및/또는 유형을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, 항-A-베타 폴리펩타이드 또는 항-단백질 tau 중쇄 항체에 선택적으로 결합하는, 태그되지 않은(즉, 검출가능한 마커에 접합되지 않은) 2차 항체는 당해 2차 항체에 선택적으로 결합하는 태그된 제3 항체에 결합될 수 있다. 적합한 2차, 3차 및 기타 2차 또는 3차 분자는 당업자에 의해 용이하게 선별될 수 있다. 바람직한 3차 분자는 또한 2차 분자의 특징에 기초하여 당업자에 의해 선별될 수 있다. 동일한 전략은 후속적 층에 적용될 수 있다.
검정에 따라서, 발색제를 부가하고, 기질을 분석용 검출 장치에 적용한다. 일부 프로토콜에서는, 과량의 시약을 제거하기 위해, 하나 또는 2개의 복합체 형성 단계 후에 세척 단계를 부가한다. 이러한 단계가 사용되는 경우, 이러한 단계에는, 과량의 시약은 제거되지만 복합체는 보유되는 것으로 당업자에게 공지된 조건이 관여된다.
A-베타 및/또는 단백질 tau의 수준이 일단 측정되면, A-베타 및/또는 단백질 tau 또는 이의 기능부전에 의해 매개되거나 아밀로이드 플라크 형성에 의해 매개되는 장애가 존재하는지를 평가할 수 있다. 이러한 장애의 존재의 평가는 시험 샘플 중의 A-베타 및/또는 단백질의 수준을 건강한 피험체에서 발견되는 수준과 비교함을 포함한다. 신경 기능의 변화가 없는 상태에서 샘플 중의 A-베타 및/또는 단백질 tau의 존재는 이러한 장애의 지표가 된다.
본 발명에 따른 진단 키트는 항-A-베타 폴리펩타이드(예를 들면, 본원에 기술된 하나 이상의 나노바디 또는 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드) 및/또는 항-단백질 tau 중쇄 항체와의 상호작용에 의한 A-베타 및/또는 단백질 tau 또는 이의 단편의 검출을 수행하기 위해 필수적인 모든 수단 및 매질을 포함한다. 키트는 A-베타, 단백질 tau, 이의 기능부전 또는 아밀로이드 플라크의 형성에 의해 매개되는 질환 또는 장애의 진단에 유용하다.
본 발명의 한 측면에 따라서, 진단 키트는 본원에 기술된 본 발명의 항-A-베타 나노바디 또는 폴리펩타이드 하나 이상을 포함한다. 본 발명의 한 측면에 따라서, 진단 키트는 하나 이상의 본 발명의 항-단백질 tau 나노바디를 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에 따라서, 진단 키트는 항-A-베타 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 발현하는 하나 이상의 본 발명의 재조합 세포를 포함한다. 본 발명의 또 다른 측면에 따라서, 진단 키트는 항-단백질 tau 중쇄 항체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 발현하는 하나 이상의 본 발명의 재조합 세포를 포함한다.
본 발명에 따른 유용한 키트는 분리된 항-A-베타 폴리펩타이드 및/또는 항-단백질 tau 중쇄 항체, 이의 상동체 또는 이의 기능성 부분을 포함한다. 본 발명에 따른 키트는 상기 폴리펩타이드를 발현하도록 형질전환된 세포를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 유용한 키트는 분리된 A-베타 또는 이의 단편을 포함할 수 있다. 대안으로 또는 추가로, 키트는 A-베타 또는 이의 단편을 발현하도록 형질전환된 세포를 포함할 수 있다. 추가의 양태에서, 본 발명에 따른 키트는 A-베타 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 다른 추가의 양태에서, 본 발명에 따른 키트는 A-베타 또는 이의 단편의 증폭에 유용한 특이적 프라이머를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 모든 키트는 언급한 품목 및 품목들의 배합물 및 이를 위한 포장 물질을 포함할 것이다. 키트는 사용 지침서를 또한 포함할 것이다.
A-베타, 단백질 tau, 항-A-베타 폴리펩타이드 및/또는 항-단백질 tau 중쇄 항체는 예를 들면, 미세역가 플레이트, 고처리량 스크리닝에 적합한 유리 칩, 마그네틱 비이드 또는 불용성 고체 지지체상에 고정화된 상태로 공급될 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드는 단일 투여량 또는 다중 투여량으로서, 예를 들면, 1일 이상에 걸쳐서 1일 1회 이상, 목적하는 치료학적 및/또는 예방학적 작용을 달성하기에 충분한 치료학적 유효량 및/또는 예방학적 유효량으로 투여된다.
일반적으로 "치료학적 유효량", "치료학적 유효 투여량" 및 "유효량"은 목적하는 결과(A-베타의 치료 또는 예방)를 성취하기 위해 필요한 양을 의미한다. 당업자는 효능 및 이에 따른 "유효량"은 본 발명에 사용되는 A-베타를 억제하는 다양한 화합물에 대해 다양할 수 있다는 것을 인지하고 있다. 당업자는 용이하게 화합물의 효능을 평가할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "화합물"은 본원에 기재된 항-A-베타 나노바디 또는 폴리펩타이드 또는 당해 폴리펩타이드, 폴리펩타이드의 염 또는 하나 이상의 변형된 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화할 수 있는 핵산을 의미한다.
"약제학적으로 허용되는"은 생물학적으로 또는 바람직하지 않은 물질을 의미한다. 즉, 물질이 바람직하지 않은 생물학적 효과를 야기하지 않고, 또는 해로운 방법으로 포함되는 약제학적 조성물의 다른 성분과 상호작용하지 않고, 화합물과 함께 개체에 투여할 수 있다.
치료학적으로 효과적인 투여를 성취하는데 필요한 양은 질환의 중증도 및 환자의 면역 체계의 일반적인 상태에 의존할 수 있지만, 일반적으로 체중 1kg당 0.005 내지 5.0mg의 범위이고, 바람직하게는 0.05 내지 2.0mg/kg/투여형이다. 예방 적용을 위해, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 이의 칵테일을 포함하는 조성물을 또한 유사하거나 약간 낮은 투여량으로 투여할 수 있다.
본원에 기재된 발명은 본 발명의 약제학적 유효량의 화합물 또는 조성물을 투여함을 포함하여, 환자에서 A-베타 또는 이의 기능부전에 의해 매개되거나 아밀로이드 플라크 형성에 의해 매개되는 상태를 치료 또는 예방하는데 유용하다.
본 발명의 하나의 양태는 약제학적 유효량의 화합물을, 예를 들면, A-베타 단편 제형에 관련된 하나 이상의 효소를 억제할 수 있는 제제와 함께 배합하여 투여함을 포함하는, 환자에서 A-베타 또는 이의 기능부전에 의해 매개되거나 아밀로이드 플라크 형성에 의해 매개되는 상태의 치료 또는 예방을 위한 본 발명의 화합물의 용도이다.
본 발명의 하나의 양태는 약제학적 유효량의 화합물을, 예를 들면, 항엄킴제와 배합하여 투여함을 포함하는, 환자에서 A-베타 또는 이의 기능부전에 의해 매개되거나 아밀로이드 플라크 형성에 의해 매개되는 상태를 치료 또는 예방하는 본 발명의 화합물의 용도이다.
본 발명은 본 발명의 단일 화합물을 포함하는 제형의 투여로 제한되지 않는다. 본 발명의 범위내에서, 병용 치료를 제공하고, 여기서, 본 발명의 하나 이상의 화합물을 포함하는 제형이 이를 필요로 하는 환자에게 투여된다.
A-베타 또는 이의 기능부전에 의해 매개되거나 아밀로이드 플라크 형성에 의해 매개되는 상태는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 상기 기재된 것을 포함한다.
본 발명에서 유용한 화합물은 약제학적 조성물로서 제형화될 수 있고, 포유류 숙주, 예를 들면, 사람 환자 또는 가축에 선택된 투여 경로, 즉, 경구 또는 비경구, 흡입에 의해 비내, 정맥내, 근육내, 국소 또는 피하 경로로 적용된 다양한 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 화합물은 또한 유전자 전달 치료방법을 사용하여 투여할 수 있다[참조: 미국 특허 제5,399,346호]. 유전자 전달 치료방법을 사용하여, 본 발명의 폴리펩타이드의 경우 유전자로 형질전환된 1차 세포는 추가로 특정 기관, 조직, 이식편, 종양 또는 세포를 표적화하는 조직 특이적 프로모터로 형질전환될 수 있다.
따라서, 당해 화합물을 전신에, 예를 들면, 경구로 약제학적으로 허용되는 비히클, 예를 들면, 불활성 희석제 또는 혼화성 식용 담체와 배합하여 투여할 수 있다. 당해 화합물은 경성 또는 연성 쉘 젤라틴 캡슐제로 밀봉되거나, 정제로 압축되거나, 환자의 식이 식품에 직접 혼입될 수 있다. 경구 치료학적 투여에서, 화합물을 하나 이상의 부형제와 배합할 수 있고, 섭취 정제, 구강 정제, 트로키제, 캡슐제, 엘릭서제, 현탁제, 시럽제, 웨이퍼 등의 형태로 사용할 수 있다. 당해 조성물 및 제형은 0.1%(중량/중량) 이상의 화합물을 포함할 수 있다. 조성물 및 제형의 %는 물론 다양할 수 있고, 통상적으로 주어진 단위 투여형의 약 2 내지 약 60%(중량/중량)일 수 있다. 치료학적으로 유용한 조성물에서 화합물의 양은 효과적인 투여 수준이 수득될 수 있는 양이다.
정제, 트로키제, 환제, 캡슐제 등은 다음을 포함할 수 있다: 결합제, 예를 들면, 검 트라가칸트, 아라비아 고무, 옥수수 전분 또는 젤라틴; 부형제, 예를 들면, 디칼슘 포스페이트; 붕해제, 예를 들면, 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산 등; 윤활제, 예를 들면, 마그네슘 스테아레이트; 및 감미제, 예를 들면, 수크로스, 프럭토스, 락토스, 또는 아스파르탐 또는 향미제, 예를 들면, 페파민트, 윈터그린 오일, 또는 체리향 향미제를 첨가할 수 있다. 단위 투여형이 캡슐제인 경우, 또한 상기한 종류의 물질에 액체 담체, 예를 들면, 식물성 유지 또는 폴리에틸렌 글리콜을 포함할 수 있다. 다양한 다른 물질이 피복제로서 존재할 수 있고, 그렇지 않으면 고체 단위 투여형의 물리적인 형태를 변형할 수 있다. 예를 들면, 정제, 환제, 또는 캡슐제는 젤라틴, 왁스, 쉘락 또는 당 등으로 피복될 수 있다. 시럽제 또는 엘릭서제는 활성 폴리펩타이드, 수크로스 또는 프럭토스를 감미제로서 포함하고, 메틸 및 프로필파라벤을 보존제로서 포함하고, 염료 및 향미제, 예를 들면, 체리향 또는 오렌지향을 포함할 수 있다. 물론, 단위 투여형을 제조하는데 사용되는 물질은 사용되는 양에서 약제학적으로 허용되고 실질적으로 비독성이어야 한다. 또한, 활성 화합물은 지연된-방출 제제 및 장치에 혼입될 수 있다.
활성 화합물은 또한 정맥내 또는 복막내로 주입 또는 주사에 의해 투여될 수 있다. 활성 화합물 또는 이의 염의 용제는 임의로 비독성 계면활성제와 혼합된 물에서 제조될 수 있다. 분산제는 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 트리아세틴 및 이의 혼합물 및 오일 중에 제조될 수 있다. 보관 및 사용 조건 하에서, 이들 제형은 미생물의 성장을 방지하는 보존제를 포함할 수 있다.
주사 또는 주입에 적합한 약제학적 투여형은 멸균 주사가능한 또는 주입가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조에 적합하고, 임의로 리포좀에 캡슐화된 활성 성분을 포함하는 멸균 수용액 또는 분산제 또는 멸균 분말을 포함할 수 있다. 모든 경우에서, 최종 투여형은 제조 및 보관 조건하에서 멸균성, 유동성 및 안정성이어야 한다. 액체 담체 또는 비히클은, 예를 들면, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 식물성 유지, 비독성 글리세롤 에스테르 및 적합한 이의 혼합물을 포함하는 용매 또는 액체 분산 매질일 수 있다. 적합한 유동성은, 예를 들면, 리포솜의 제형에 의해, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물의 활성은 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 예방될 수 있다. 다수의 경우, 등장성제, 예를 들면, 당, 완충제 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 주사가능한 조성물은 흡착 지연제의 조성물, 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴에서 사용하여 지연 흡수시킬 수 있다.
멸균 주사용 용제는 활성 화합물을 요구되는 양으로 적합한 용매 중에 상기한 다양한 다른 성분과 함께 혼입하고, 필요한 경우, 여과 멸균하여 제조한다. 멸균 주사용 용제의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조방법은 진공 건조 및 냉동건조법이고, 이로서 멸균-여과된 용액에 존재하는 활성 성분과 추가의 목적하는 성분의 분말을 수득할 수 있다.
국소 투여의 경우, 본 발명의 화합물은 액체로 존재하는 경우 순수한 형태로 적용될 수 있다. 그러나, 일반적으로 당해 화합물을 고체 또는 액체일 수 있는 피부학적으로 적용되는 담체와 배합하여 피부에 조성물 또는 제형으로서 투여하는 것이 바람직할 수 있다.
유용한 고체 담체는 미분된 고체, 예를 들면, 탈크, 점토, 미세결정성 셀룰로스, 실리카, 알루미나 등을 포함한다. 유용한 액체 담체는 물, 하이드록시알킬 또는 글리콜 또는 물-알콜/글리콜 블렌드를 포함하고, 여기서, 본 발명의 화합물은 효과적인 수준에서 임의로 비독성 계면활성제와 함께 용해되거나 분산될 수 있다. 보조제, 예를 들면, 방향제 및 추가의 항균제를 주어진 용도의 특성을 최적화하기 위해 첨가할 수 있다. 수득한 액체 조성물을 붕대 및 다른 드레싱을 함침시키는데 사용되는 흡착 패드로부터 적용할 수 있거나, 펌프형 또는 에어로졸 스프레이를 사용하는 유효한 영역으로 도포될 수 있다.
증점제, 예를 들면, 합성 중합체, 지방산, 지방산 염 및 에스테르, 지방 알콜, 개질된 셀룰로스 또는 개질된 광물질을 또한 액체 담체와 함께 사용하여 사용자의 피부에 직접 적용하는 살포성 페이스트, 겔, 연고, 비누 등을 제조할 수 있다.
화합물을 피부에 전달하는데 사용할 수 있는 유용한 피부학적 조성물의 예는 당해 기술분야에 공지되어 있다[참조: Jacquet et al.(미국 특허 제4,608,392호), Geria(미국 특허 제4,992,478호), Smith et al.(미국 특허 제4,559,157호) 및 Wortzman(미국 특허 제4,820,508호)].
화합물의 유용한 투여형은 시험관내 활성을 동물 모델의 생체내 활성과 비교하여 측정할 수 있다. 마우스 및 다른 동물, 사람에서 유효한 투여의 추정방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다[참조: 미국 특허 제4,938,949호]
일반적으로, 액체 조성물, 예를 들면, 로션에서 화합물의 농도는 약 0.1-25중량%, 바람직하게는 약 0.5-10중량%일 수 있다. 반고형 또는 고형 조성물, 예를 들면, 겔 또는 분말 중 농도는 약 0.1-5중량%, 바람직하게는 약 0.5-2.5중량%일 수 있다.
치료에 사용하기 위해 요구되는 화합물 또는 이의 활성 염 또는 유도체의 양은 선택되는 특정 염 뿐만 아니라, 투여 경로, 치료될 상태의 특성, 및 환자의 연령 및 상태에 따라 다양할 수 있고, 궁극적으로 수행하는 의사 또는 전문의에 의해 결정될 수 있다. 또한, 화합물의 투여형은 표적 세포, 종양, 조직, 이식편 또는 기관에 좌우되어 다양하다.
목적하는 투여량은 용이하게 단일 투여형 또는 적합한 간격으로 투여되는, 예를 들면, 1일 2회, 3회, 4회 또는 그 이상의 하위-투여되는 분리된 투여형으로 존재할 수 있다. 하위-투여 자체는 추가로, 예를 들면, 다수의 분리된 느슨한 간격의 투여로; 예를 들면, 흡입기로부터 다중 흡입하거나, 다수의 점적제를 눈에 적용하여 분리할 수 있다.
투여 방식은 장기, 일일 처리를 포함한다. "장기간"은 2주 이상, 바람직하게는, 수주, 수개월 또는 수년을 의미한다. 이러한 투여 범위의 필요한 변형은 본원에 교시된 단지 일반적인 시험을 사용하여 당해 기술분야의 숙련가에 의해 결정될 수 있다[참조: Remington's Pharmaceutical Sciences (Martin, E.W., ed. 4), Mack Publishing Co., Easton, PA]. 투여형은 또한 복잡한 경우 각자의 전문의에 의해 조절될 수 있다.
추가의 측면에서, 본 발명은 본원에 정의된 중쇄 항체를 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자를 제공한다.
다가 또는 다중특이적 중쇄 항체는 단일 핵산 분자상에 암호화될 수 있고, 또는 각각의 중쇄 항체가 별도의 핵산 분자에 의해 암호화될 수 있다. 다가 또는 다중특이적 중쇄 항체가 단일 핵산 분자에 의해 암호화되는 경우, 이의 일부분을 형성하는 나노바디는 scFv 분자의 방식으로 융합 폴리펩타이드로서 발현시킬 수 있거나, 개별적으로 발현시키고 후속적으로 예를 들면, 화학적 가교결합제를 사용하여 함께 연결될 수 있다. 개별적 핵산으로부터 발현된 다가 또는 다중특이적 나노바디는 적절한 수단을 사용하여 연결시킬 수 있다.
핵산은 발현시 숙주 세포로부터 폴리펩타이드의 배출을 위한 시그날 서열을 추가로 암호화할 수 있고 발현시 필라멘트상 박테리오파아지 입자의 표면 성분(또는 선별 디스플레이(display) 시스템의 다른 성분)과 융합될 수 있다.
추가의 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 암호하하는 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
다른 추가의 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 암호화하는 벡터로 형질감염된 숙주 세포를 제공한다.
이러한 벡터의 발현은 예를 들면, 박테리오파아지 입자의 표면에서 선별용 나노바디를 생산하도록 구성될 수 있다. 이로써 디스플레이된 나노바디를 선별하고 본 발명의 방법을 사용하여 폴리펩타이드를 선별할 수 있다.
본 발명은 본 발명에 따른 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명에 따라 유용한 세포는 예를 들면, 이. 콜라이와 같은 임의의 세균 세포, 에스. 세레비지애 및 피. 파스토리스와 같은 효모 세포, 곤충 세포, 포유동물 세포 또는 아스퍼질루스 또는 트리코데르마 속에 속하는 진균류이다.
본 발명에 따라 유용한 세포는 본 발명의 나노바디 또는 폴리펩타이드 또는 본 발명에 따른 항-A-베타 나노바디 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열이 도입되어져서 폴리펩타이드가 본원에서 정의한 바와 같은 천연 수준으로 또는 천연 수준 이상으로 발현될 수 있는 임의의 세포일 수 있다. 바람직하게는, 세포에서 발현되는 본 발명의 폴리펩타이드는 본원에 정의된 바와 같은 정상적 또는 정상에 가까운 약리작용을 나타낸다. 가장 바람직하게는, 세포에서 발현되는 본 발명의 폴리펩타이드 본 발명에 따른 나노바디 및 폴리펩타이드를 암호화할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 발명의 바람직한 양태에 따라서, 세포는 COS7-세포, CHO 세포, LM(TK-) 세포, NIH-3T3 세포, HEK-293 세포, K-562 세포 또는 1321N1 성상교세포증 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되지만, 다른 형질전환가능한 세포주일 수도 있다.
영상화 기술은 이러한 진단력을 제공할 수 있다. 통상의 CT 및 MR 영상화는 치매의 다른 사례를 제외시키고 뇌 위축 정도를 평가하기 위해 주로 사용된다. SPECT, PET 및 fMRI는 장애의 초기 병기 동안의 미묘한 병리학적 변활르 동정하는데 있어 큰 잠재성을 갖고 있다. SPECT, PET 또는 MRI과 표지된 항-A-베타 폴리펩타이드를 병용함으로써 각 환자에 대한 'A-베타 뇌 스캔' 및 개별적 위험 평가가 가능할 수 있다.
본 발명의 한 측면은 하나 이상의 영상제를 추가로 포함하는 본원에 기술된 항-A-베타 폴리펩타이드이다. 영상제는 99mTc, 111인듐, 123요오드를 포함하나 이에 제한되지 않는 생체내 사용에 적합한 임의의 제제이다. 자기 공명 영상화에 적합한 다른 영상제는 상자성 화합물, MR 상자성 킬레이트를 포함한다. 다른 영상제는 광학 염료를 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 생체내 영상화를 위한, 하나 이상의 영상제를 추가로 포함하는 항-A-베타 폴리펩타이드의 용도이다.
본원에 기술된 항-A-베타 폴리펩타이드는 A-베타 및 단백질 tau의 동시 영상화를 위해 하나 이상의 항-단백질 tau 나노바디를 추가로 포함할 수 있다.
항-A-베타 폴리펩타이드는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 영상제로 표지할 수 있다.
본 발명의 한 측면은 표지된 폴리펩타이드가 미립자, 초음파 버블, 미세구체, 에멀젼 또는 리포좀내로 혼입된다는 것이다. 이러한 제제들은 보다 효과적 전달을 가능하게 한다.
다른 측면에서, 본 발명은 약제학적으로 활성인 양의 본 발명의 나노바디, 본 발명의 폴리펩타이드 및/또는 이들을 포함하는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 피험체에게 투여함을 포함하는, A-베타와 관련된 하나 이상의 질환 또는 장애, 아밀로이드 플라크의 원치않는 형성 또는 침착과 관련된 하나 이상의 질환 또는 장애 및/또는 하나 이상의 신경퇴행성 질환의 예방 및/또는 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명의 범주에서, "예방 및/또는 치료"는 질환을 예방 및/또는 치료하는 것을 포함할 뿐만 아니라, 질환의 개시의 예방, 질환의 진행의 둔화 또는 역전, 질환과 관련된 하나 이상의 증상의 개시의 예방 또는 둔화, 질환과 관련된 하나 이상의 증상의 감소 및/또는 경감, 질환 및/또는 이와 관련된 임의의 증상의 중증도 및/또는 지속기간의 감소, 질환에 의해 유발된 임의의 생리학적 손상의 예방, 감소 또는 역전 및 일반적으로 치료되는 환자에게 유익한 임의의 약리학적 작용을 포함한다.
치료될 피험체는 임의의 온혈 동물일 수 있지만, 특히 포유동물, 보다 특히 사람이다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 치료될 피험체는 특히 본원에 언급된 질환 및 장애를 앓고 있거나 위험에 쳐한 사람일 것이다.
본 발명은 또한 약제학적으로 활성인 양의 본 발명의 나노바디, 본 발명의 폴리펩타이드 및/또는 이를 포함하는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 피험체에게 투여함을 포함하는, 본 발명의 나노바디 또는 폴리펩타이드를 피험체에게 투여함으로써 예방 및/또는 치료될 수 있는 하나 이상의 질환 또는 장애의 예방 및/또는 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 약제학적으로 활성인 양의 본 발명의 나노바디, 본 발명의 폴리펩타이드 및/또는 이를 포함하는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 피험체에게 투여함을 포함하는, 환자에서 A-베타 및/또는 아밀로이드 플라크의 (원치않는) 형성 또는 침착을 조절, 감소 및/또는 역전시킴으로써 예방 및/또는 치료될 수 있는 하나 이상의 질환 또는 장애의 예방 및/또는 치료 방법에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 약제학적으로 활성인 양의 본 발명의 나노바디, 본 발명의 폴리펩타이드 및/또는 이를 포함하는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 피험체에게 투여함을 포함하는, 하나 이상의 신경퇴행성 질환 또는 장애의 예방 및/또는 치료 방법에 관한 것이다.
보다 특히, 본 발명은 약제학적으로 활성인 양의 본 발명의 나노바디, 본 발명의 폴리펩타이드 및/또는 이를 포함하는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 피험체에게 투여함을 포함하는, 본원에 기재된 질환 및 장애로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 질환 또는 장애의 예방 및/또는 치료 방법에 관한 것이다.
하나의 구체적 양태에 따라서, 본 발명은 약제학적으로 활성인 양의 본 발명의 나노바디, 본 발명의 폴리펩타이드 및/또는 이를 포함하는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 피험체에게 투여함을 포함하는, 알쯔하이머병의 예방 및/또는 치료 방법에 관한 것이다.
다른 구체적 양태에서, 본 발명은 약제학적으로 활성인 양의 본 발명의 나노바디, 본 발명의 폴리펩타이드 및/또는 이를 포함하는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 피험체에게 투여함을 포함하는, 인지 저하의 예방 및/또는 치료 방법 및/또는 인지 기능의 회복 방법 및/또는 인지 기능의 개선 방법에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 약제학적으로 활성인 양의 본 발명의 나노바디, 본 발명의 폴리펩타이드 및/또는 이를 포함하는 약제학적 조성물을 본원에 기재된 질환 및 장애를 앓고 있거나 위험에 쳐한 피험체에게 투여함을 포함하는, 면역치료, 특히 수동 면역치료 방법에 관한 것이다.
따라서, 예를 들면, 본 발명의 방법은 AD와 같은 신경퇴행성 질환 및 본원에 기재된 질환 및 장애의 개시를 지연시키고, 이의 진행을 둔화시키고/시키거나 이를 역전시키기 위한 수동 면역치료; 인지 저하와 같은 관련 증상의 개시를 지연시키고, 이의 진행을 둔화시키고/시키거나 이를 역전시키기 위한 수동 면역치료; 유해한 A-베타 축적을 예방, 둔화, 감소 및/또는 역전시키기 위한 수동 면역치료; 및/또는 아밀로이드 플라크(예를 들면, AD와 관련된 아밀로이드 플라크)의 형성을 예방하고, 이의 성장을 둔화시키고, 이의 크기를 감소시키고/시키거나 이를 제거하기 위한 수동 면역치료에서 사용될 수 있다.
상기한 방법에서, 본 발명의 나노바디 및/또는 폴리펩타이드 및/또는 이를 포함하는 조성물은 사용되는 특정한 약제학적 제형 또는 조성물에 따라서 임의의 방식으로 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명의 나노바디 및/또는 폴리펩타이드 및/또는 이를 포함하는 조성물은 사용되는 특정한 약제학적 제형 또는 조성물에 따라서 경구, 복강내(예를 들면, 정맥내, 피하, 근육내 또는 위장관을 우회하는 임의의 기타 투여 경로를 통해), 비강내, 경피, 국소, 좌제에 의해, 흡입에 의해 투여될 수 있다. 임상의는 예방 또는 치료될 질환 또는 장애 및 임상의에게 익히 공지된 다른 요인에 따라서, 이러한 투여에서 사용될 적합한 투여 경로 및 적합한 약제학적 제형 또는 조성물을 선택할 수 있다.
본 발명의 나노바디 및/또는 폴리펩타이드 및/또는 이들을 포함하는 조성물은 예방 또는 치료될 질환 또는 장애를 예방 및/또는 치료하기에 적합한 치료 방식에 따라서 투여된다. 임상의는 일반적으로 예방 또는 치료될 질환 또는 장애, 치료될 질환의 중증도 및/또는 이의 증상의 중증도, 사용되는 본 발명의 특정 나노바디 또는 폴리펩타이드, 사용될 특정 투여 경로 및 약제학적 제형 또는 조성물, 환자의 연령, 성별, 체중, 식이, 전반적 상태 및 임상의에게 익히 공지된 유사한 요인과 같은 요인에 따라서 적합한 치료 방식을 결정할 수 있다.
일반적으로, 치료 방식은 하나 이상의 본 발명의 나노바디 및/또는 폴리펩타이드 또는 이들을 포함하는 하나 이상의 조성물을 약제학적 유효한 양 또는 투여량으로 투여함을 포함한다. 투여될 구체적 양(들) 또는 투여량은 상기 언급한 요인에 기초하여 임상의에 의해 결정될 수 있다.
일반적으로, 본원에 언급된 질환 및 장애의 예방 및/또는 치료를 위해, 치료될 특정 질환 또는 장애, 사용될 특정한 본 발명의 나노바디 및 폴리펩타이드, 사용되는 특정 투여 경로 및 특정 약제학적 제형 또는 조성물에 따라서, 본 발명의 나노바디 및 폴리펩타이드는 일반적으로 연속적으로(예를 들면, 주입에 의해), 단일 1일 투여량으로서 또는 1일 동안 다수의 세분된 투여량으로서 1일당 체중당 1g 내지 0.01㎍, 바람직하게는 1일당 체중당 0.1g 내지 0.1㎍, 예를 들면, 1일당 체중당 약 1, 10, 100 또는 1000㎍의 양으로 투여될 것이다. 임상의는 일반적으로 본원에 언급된 요인에 따라서, 적합한 1일 투여량을 결정할 수 있다. 또한, 특정 경우에, 임상의가 예를 들면, 상기 언급된 요인 및 그의 전문가적 판단에 기초하여 상기한 양에서 벗어나는 양을 선택할 수 있다는 것도 명백할 것이다. 일반적으로, 투여될 양에 관한 동일한 지침은 본질적으로 동일한 경로를 통해 투여되는 동일한 표적에 대한 필적하는 통상의 항체 또는 항체 단편의 경우에 통상적으로 투여되는 양으로부터 수득될 수 있지만, 당업자에게 공지된 친화성/항원항체결합력, 효능, 생체분해, 반감기 및 유사한 요인을 고려해야만 한다.
통상적으로, 상기한 방법에서, 1개의 본 발명의 나노바디 또는 폴리펩타이드가 사용될 것이다. 그러나, 본 발명의 범주내에서 2개 이상의 본 발명의 나노바디 및/또는 폴리펩타이드를 배합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 나노바디 및 폴리펩타이드는 또한 하나 이상의 추가의 약제학적 활성 화합물 또는 성분과 배합하여, 즉, 병용 치료 방식으로서 사용될 수 있으며, 이는 상승작용 효과를 유도하거자 유도하지 않을 수 있다. 다시, 임상의는 상기 언급된 요인 및 그의 전문가적 판단에 기초하여 이러한 추가 화합물 또는 성분 뿐만 아니라, 적합한 병용 치료 방식을 선택할 수 있다.
특히, 본 발명의 나노바디 및 폴리펩타이드는 본원에 언급된 질환 및 장애의 예방 및/또는 치료를 위해 사용될 수 있는 또 다른 약제학적 활성 화합물 또는 성분과 배합하여 사용될 수 있으며, 이러한 결과로서 상승작용 효과가 수득될 수 있거나 수득되지 않을 수 있다. 이러한 화합물 및 성분의 예 뿐만 아니라, 이들을 투여하기 위한 경로, 방법 및 약제학적 제형 또는 조성물은 임상의에게 명백할 것이다. 몇가지 바람직하지만 비제한적인 에에는 본원에 언급된 질환 및 장애의 예방 및 치료용으로 시판되고 있거나 임상 개발중에 있는 활성 물질 및 성분(즉, 소분자 및 생물학적제제, 예를 들면, 항체 및 항체 단편), 예를 들면, 콜린에스테라제 억제제(예: Donepezil (Aricept™); Rivastigmine(Exelon™); Galantamine (Reminyl™); Tacrine (Cognex™)), NMDA 길항제(예: Memantine (Namenda™; Exura™)), 베타-세크레타제(BACE) 및 감마-세크레타제와 같은 세크레타제의 억제제 및 신경퇴행성 질환 및 인지능력의 저하를 예방 또는 치료하기 위한 기타 제제가 포함된다.
2개 이상의 물질 또는 성분이 병용 치료 방식의 일부분으로서 사용되는 경우, 이들 물질 또는 성분은 동일한 투여 경로 또는 상이한 투여 경로를 통해서 본질적으로 동일한 시점 또는 상이한 시점(예를 들면, 본질적으로 동시에, 연속적으로 또는 변경되는 방식에 따라서)에서 투여될 수 있다. 물질 또는 성분이 동일한 투여 경로를 통해 투여되는 경우, 이들 물질 또는 성분은 당업자에게 명백한 바와 같이, 상이한 약제학적 제형 또는 조성물 또는 배합된 약제학적 제형 또는 조성물의 일부분으로서 투여될 수 있다.
또한, 2개 이상의 물질 또는 성분이 병용 치료 방식의 일부분으로서 사용되는 경우, 각각의 물질 또는 성분은 당해 화합물 또는 성분이 단독으로 사용되는 경우와 동일한 양으로 동일한 방식에 따라서 투여될 수 있고, 이러한 2개 이상의 활성 물질 또는 성분의 배합 사용은 상승작용 효과를 유도할 수 있다. 그러나, 2개 이상의 활성 물질 또는 성분의 배합 사용이 상승작용 효과를 유도하는 경우, 투여될 물질 또는 성분 중 하나 이상 또는 모두의 양을 감소킬 수도 있다. 이는 예를 들면, 목적하는 약제학적 또는 치료학적 효과를 여전히 수득하면서, 하나 이상의 물질 또는 성분이 이들의 통상적 양으로 사용되는 경우에 이들의 사용과 관련된 임의의 원치않는 부작용을 회피하거나, 제한하거나, 감소시키는데 유용할 수 있다.
본 발명에 따라 사용되는 치료 방식의 효능은 임상의에게 명백한 바와 같이, 관련된 질환 또는 장애에 대해 공지된 임의의 방식으로 측정하고/하거나 이에 따를 수 있다. 임상의는 또한, 경우에 따라 및/또는 개개의 사례에 따라, 특정한 치료 방식을 변화시키거나 변형시켜, 목적하는 치료 효과를 달성하고, 원치않는 부작용을 회피하거나, 제한하거나 감소시키고/시키거나, 목적하는 치료 효과의 성취와 원치않는 부작용의 회피, 제한 또는 감소 간의 적절한 균형을 달성할 수 있다.
일반적으로, 치료 방식은 목적하는 치료 효과가 달성될 때까지 및/또는 목적하는 치료 효과가 유지되는 동안 수행할 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 A-베타와 관련된 하나 이상의 질환 또는 장애, 아밀로이드 플라크의 원치않는 형성 또는 침착과 관련된 하나 이상의 질환 또는 장애 및/또는 하나 이상의 신경퇴행성 질환의 예방 및/또는 치료용 약제학적 조성물의 제조에서의 본 발명의 나노바디 또는 폴리펩타이드의 용도에 관한 것이다.
치료될 피험체는 임의의 온혈 동물일 수 있지만, 특히 포유동물, 보다 특히 사람이다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 치료될 피험체는 특히 본원에 언급된 질환 및 장애를 앓고 있거나 위험에 쳐한 사람일 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 나노바디 또는 폴리펩타이드를 환자에게 투여하여 예방 및/또는 치료될 수 있는 하나 이상의 질환 또는 장애의 예방 및/또는 치료용약제학적 조성물의 제조에서의 본 발명의 나노바디 또는 폴리펩타이드의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 특히, 환자에서 A-베타 및/또는 아밀로이드 플라크의 (원치않는) 형성 또는 침착을 조절, 감소 및/또는 역전시킴으로써 예방 및/또는 치료될 수 있는 하나 이상의 질환 또는 장애의 예방 및/또는 치료용 약제학적 조성물의 제조에서의 본 발명의 나노바디 또는 폴리펩타이드의 용도에 관한 것이다.
보다 특히, 본 발명은 하나 이상의 신경퇴행성 질환 또는 장애의 예방 및/또는 치료, 특히 본원에 기재된 질환 및 장애 중 하나 이상의 예방 및 치료용 약제학적 조성물의 제조에서의 본 발명의 나노바디 또는 폴리펩타이드의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 매우 구체적 양태는 알쯔하이머병의 예방 및/또는 치료용 약제학적 조성물의 제조에서의 본 발명의 나노바디 또는 폴리펩타이드의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 인지 저하의 예방 및/또는 치료 및/또는 인지 기능의 회복 및/또는 인지 기능의 개선용 약제학적 조성물의 제조에서의 본 발명의 나노바디 또는 폴리펩타이드의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 추가로, 면역치료, 특히 수동 면역치료, 보다 특히 AD와 같은 신경퇴행성 질환 및 본원에 기재된 질환 및 장애의 개시를 지연시키고, 이의 진행을 둔화시키고/시키거나 이를 역전시키기 위한 수동 면역치료; 인지 저하와 같은 관련 증상의 개시를 지연시키고, 이의 진행을 둔화시키고/시키거나 이를 역전시키기 위한 수동 면역치료; 유해한 A-베타 축적을 예방, 둔화, 감소 및/또는 역전시키기 위한 수동 면역치료; 및/또는 아밀로이드 플라크(예를 들면, AD와 관련된 아밀로이드 플라크)의 형성을 예방하고, 이의 성장을 둔화시키고, 이의 크기를 감소시키고/시키거나 이를 제거하기 위한 수동 면역치료용 약제학적 조성물의 제조에서의 본 발명의 나노바디 또는 폴리펩타이드의 용도에 관한 것이다.
다시, 이러한 약제학적 조성물에서, 하나 이상의 본 발명의 나노바디 또는 폴리펩타이드는 하나 이상의 다른 활성 성분과 적합하게 배합될 수도 있다.
마지막으로, 본 발명의 나노바디(본원에서 정의된 바와 같음) 및 본 발명의 폴리펩타이드의 사용이 가장 바람직하지만, 본원의 기술내용에 기초하여, 당업자는 유사한 방식으로, A-베타에 대한 다른 (단일) 도메인 항체 뿐만 아니라 이러한 (단일) 도메인 항체를 포함하는 폴리펩타이드(여기서, "도메인 항체" 및 "단일 도메인 항체"는 당업계의 통상의 의미를 갖는다. 예를 들면, 본원에 언급된 종래 기술을 참조한다)를 설계 및/또는 제조할 수 있다.
따라서, 본 발명의 하나의 추가 측면은 A-베타에 대한 도메인 항체 또는 단일 도메인 항체 및 이러한 (단일) 도메인 항체 하나 이상을 포함하고/하거나 이러한 (단일) 도메인 항체로 본질적으로 이루어진 폴리펩타이드에 관한 것이다.
특히, 이러한 A-베타에 대한 (단일) 도메인 항체는 CDR이 본 발명의 나노바디에 대해 상기 정의한 바와 같은 3개의 CDR을 포함한다. 예를 들면, 이러한 (단일) 도메인 항체는 예를 들면, 워드 등(상기 참조)에 의해 기술된 바와 같지만 본 발명의 나노바디에 대해 상기 정의한 바와 같은 CDR을 갖는 "dAb"로서 공지된 단일 도메인 항체일 수 있다. 그러나, 상기 언급한 바와 같이, 이러한 "dAb"의 사용은 본 발명의 상응하는 나노바디의 사용과 비교하여 몇가지 단점이 있을 수 있다. 따라서, 본 발명의 이러한 측면에 따른 A-베타에 대한 임의의 (단일) 도메인 항체는 A-베타는 바람직하게는, 본 발명의 나노바디와 실질적으로 동등하게 만드는 특성을 이들 A-베타에 대한 (단일) 도메인 항체에 제공하는 골격 영역을 가질 수 있다.
본 발명의 상기 측면은 또한 이러한 (단일) 도메인 항체 및/또는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 및 이러한 (단일) 도메인 항체, 폴리펩타이드 또는 핵산을 포함하는 조성물, 이러한 (단일) 도메인 항체 또는 폴리펩타이드를 발현하는(발현할 수 있는) 숙주 세포, 및 이러한 (단일) 도메인 항체, 폴리펩타이드 또는 핵산의 제조 및 사용 방법을 포함하며, 이들은 본 발명의 나노바디에 대해 상기 기술한 폴리펩타이드, 핵산, 조성물, 숙주 세포, 방법 및 용도와 본질적으로 유사할 수 있다.
게다가, 본 발명의 나노바디에 대해 상기 언급한 하나 이상의 "CDR"을, 사람 스캐폴드 또는 비-면역글로불린 스캐폴드를 포함하나 이에 제한되지 않는 "스캐폴드"상으로 "이식"할 수 있음이 또한 당업자에게 명백할 것이다. 이러한 CDR 이식에 적합한 스캐폴드 및 기술은 당업자에게 명백할 것이고 당업계에 익히 공지되어 있다[참조: US-A-6,180,370, WO 01/27160, EP 0 605 522, EP 0 460 167, US-A-6,054,297, Nicaise et al., Protein Science (2004), 13:1882-1891; Ewert et al., Methods, 2004 Oct; 34(2):184-199; Kettleborough et al., Protein Eng. 1991 Oct; 4(7): 773-783; O'Brien and Jones, Methods Mol. Biol. 2003: 207: 81-100; and Skerra, J. Mol. Recognit. 2000: 13: 167-187, and Saerens et al., J. Mol. Biol. 2005 Sep 23;352(3):597-607, 및 이들 문헌에 인용된 추가의 참고문헌]. 예를 들면, 마우스 또는 랫트 CDR를 사람 골격 및 스캐폴드로 이식하기 위한 공지된 기술을 유사한 방식으로 사용하여 본 발명의 나노바디의 CDR 하나 이상과 사람 골격 영역 또는 서열 하나 이상을 포함하는 키메릭 단백질을 제공할 수 있다.
따라서, 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 나노바디에 대해 본원에서 언급한 바와 같은 CDR1 서열, CDR2 서열 및 CDR3 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 CDR 서열을 포함하는 키메릭 폴리펩타이드를 포함한다. 바람직하게는, 이러한 키메릭 폴리펩타이드는 본 발명의 나노바디에 대해 본원에서 언급한 바와 같은 CDR3 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 CDR 서열 및 임의로 본 발명의 나노바디에 대해 본원에서 언급한 CDR1 서열 및 CDR2 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 CDR 서열을 포함한다. 예를 들면, 이러한 키메릭 폴리펩타이드는 본 발명의 나노바디에 대해 본원에서 언급한 바와 같은 CDR3 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택 1개의 CDR 서열, 본 발명의 나노바디에 대해 본원에서 언급한 바와 같은 CDR1 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택 1개의 CDR 서열, 및 본 발명의 나노바디에 대해 본원에서 언급한 바와 같은 CDR1 및 CDR2 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택 1개의 CDR 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 나노바디에 대해 바람직한 것으로 본원에 언급된 CDR의 조합이 이들 키메릭 폴리펩타이드에 대해서도 바람직할 것이다.
상기 키메릭 폴리펩타이드에서, CDR은 추가 아미노산 서열 서열에 연결될 수 있고/있거나 아미노산 서열 통해서 서로 연결될 수 있으며, 이때 상기 아미노산 서열은 바람직하게는 골격 서열이거나 골격 서열로서 작용하는 아미노산 서열이거나, 함께 CDR을 제시하기 위한 스캐폴드를 형성한다. 마지막 단락에 언급된 종래 기술을 참조한다. 하나의 바람직한 양태에 따라서, 아미노산 서열은 사람 골격 서열, 예를 들면 VH3 골격 서열이다. 그러나, 비-사람, 합성, 반합성 또는 비-면역글로불린 골격 서열이 또한 사용될 수 있다. 바람직하게는, 사용되는 골격 서열은 (1) 키메릭 폴리펩타이드이 상응하는 본 발명의 나노바디에의 친화성의 1% 이상, 바람직하게는 5% 이상, 보다 바람직하게는 10% 이상, 예를 들면, 25% 이상 및 최대 50% 또는 90% 이상인 친화성으로 A-베타에 결합할 수 있도록 하고; (2) 키메릭 폴리펩타이드가 약제학적 용도에 적합하도록 하고; (3) 키메릭 폴리펩타이드가 바람직하게는 이의 약제용으로 의도된 조건(즉, 증상, 투여 모드, 투여량 및 치료 방식)(이는 본 발명의 나노바디의 용도에 대해 기술된 조건과 본질적으로 유사할 수 있다)하에 본질적으로 비-면역성이 되도록 한다.
하나의 비제한적 양태에 따라서, 키메릭 폴리펩타이드는 하나 이상의 골격 서열을 통해 연결된 2개 이상의 CDR 서열(상기 언급한 바와 같음)을 포함하며, 이때 바람직하게는 2개의 CDR 서열 중 하나 이상은 CDR3 서열이며, 나머지 CDR 서열은 CDR1 또는 CDR2 서열이다. 바람직하지만 비제한적인 양태에 따라서, 키메릭 폴리펩타이드는 2개 이사의 골격 서열을 통해 연결된 2개 이상의 CDR 서열(상기 언급한 바와 같음)을 포함하며, 이때 바람직하게는 3개의 CDR 서열 중 하나 이상은 CDR3 서열이며 나머지 2개의 CDR 서열은 CDR1 또는 CDR2 서열이고, 바람직하게는 1개의 CDR1 서열 및 1개의 CDR2 서열이다. 하나의 특히 바람직하지만 비제한적인 양태에 따라서, 키메릭 폴리펩타이드는 CDR1, CDR2 및 CDR3이 본 발명의 나노바디의 CDR에 대해 정의한 바와 같고, FR1', FR2', FR3' 및 FR4'이 골격 서열인 FR1'- CDR1 - FR2'- CDR2 - FR3'- CDR3 - FR4'의 구조를 갖는다. FR1', FR2', FR3' 및 FR4'은 특히, 각각 사람 항체(예를 들면, VH3 서열)의 골격 1, 골격 2, 골격 3 및 골격 4 및/또는 이러한 골격 서열의 부분 또는 단편일 수 있다. FR1'- CDR1 - FR2'- CDR2 - FR3'- CDR3 - FR4의 구조를 갖는 키메릭 폴리펩타이드의 부분 또는 단편을 사용할 수도 있다. 바람직하게는, 이러한 부분 또는 단편은 상기 단락에 제시된 기준을 충족한다.
본 발명은 또한 이러한 키메릭 폴리펩타이드를 포함하고/하거나 본질적으로 이루어진 단백질 및 폴리펩타이드, 이러한 단백질 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산; 이러한 단백질 및 폴리펩타이드의 제조방법; 이러한 단백질 또는 폴리펩타이드를 발현하거나 발현할 수 있는 숙주 세포; 이러한 단백질 또는 폴리펩타이드, 핵산 또는 숙주 세포를 포함하는 조성물, 특히 약제학적 조성물; 및 특히, 본원에 언급된 예방, 치료 또는 진단 목적과 같은 예방, 치료 또는 진단 목적을 위한, 이러한 단백질 또는 폴리펩타이드, 핵산, 숙주 세포 및/또는 이러한 조성물의 용도에 관한 것이다. 예를 들면, 이러한 단백질, 폴리펩타이드, 핵산, 방법, 숙주 세포, 조성물 및 용도는 본 발명의 나노바디에 대해 상기 기술한 단백질, 폴리펩타이드, 핵산, 방법, 숙주 세포, 조성물 및 용도와 유사할 수 있다.
또한, 본 발명의 나노바디가 상기 언급한 바람직한 CDR 서열 이외의 하나 이상의 다른 CDR 서열을 함유하는 경우, 이들 CDR 서열은, 예를 들면, 나노바디(바람직한), 통상의 항체(특히, 사람 항체)로부터의 VH 도메인, 중쇄 항체, 통상의 4쇄 항체(예를 들면, 통상의 사람 4쇄 항체) 또는 A-베타에 대해 지시된 다른 면역글로불린 서열로부터 임의의 공지된 방식으로 수득될 수 있다. A-베타에 대해 지시된 이러한 면역글로불린 서열은 당업자에게 명백한 바와 같은 임의의 공지된 방식으로, 즉 A-베타로의 면역화에 의해 또는 면역글로불린 서열의 적합한 라이브러리를 A-베타로 스크리닝하거나 이들의 임의의 적합한 병용에 의해 생성될 수 있다. 임의로, 이는 랜덤 또는 부위 지시된 돌연변이유발과 같은 기술 및/또는 공지된 친화성 성숙화를 위한 기타 기술을 사용하여 수행할 수 있다. 이러한 면역글로불린 서열을 생성시키기에 적합한 기술은 서열 당업자에게 명백할 것이고, 예를 들면, 문헌[참조: Hoogenboom, Nature Biotechnology, 23, 9, 1105-1116 (2005)]에 검토된 스크리닝 기술을 포함한다. 특정화된 표적에 대한 면역글로불린을 생성시키기 위한 다른 기술은 예를 들면, 나노클론(Nanoclone) 기술(예를 들면, 미공개 미국 가특허 출원 제60/648,922호에 기재됨), 소위 SLAM 기술(예를 들면, 유럽 특허 출원 0 542 810에 기재됨), 사라 면역글로불린을 발현하는 유전자전이된 마우스 또는 익히 공지된 하이브리도마 기술의 사용[참조: Larrick et al, Biotechnology, Vol.7, 1989, p. 934]을 포함한다. 이러한 모든 기술들은 A-베타에 대한 면역글로불린을 생성시키는데 사용될 수 있고, 이러한 면역글로불린의 CDR은 상기 개요한 바와 같이 본 발명의 나노바디에서 사용될 수 있다. 예를 들면, 이러한 CDR의 서열을 결정, 합성 및/또는 분리시키고, 본원에 기술된 바와 같은 공지된 기술을 사용하여 본 발명의 나노바디의 서열내로 삽입시키거나(예를 들면, 상응하는 천연 CDR을 대체하도록), 이러한 CDR을 함유하는 본 발명의 나노바디(또는 이를 암호화하는 핵산)를 본원에 언급된 기술을 사용하여 신생 합성할 수 있다.
이제 본 발명을 하기 비제한적 실시예 및 도면에 의해 추가로 기술할 것이며, 도면은 다음을 도시한다:
도 1: 고체상에 피복된 합성 펩타이드 Aβ0(도 1a) 및 Aβ2 (도 1b)에 대한 결합. 7개의 나노바디의 조(crude) 원형질 추출물을, 1/5 , 1/25 , 1/125 및 1/625 희석율에서, 마이크로플레이트의 개개 웰에 부가하였다. 100㎕의 발색성 기질(pH 9.6 완충액 중의 2% 파라 니트로페닐 포스페이트)을 부가한 후에 시그날을 405nm에서 5분 동안 측정하였다.
도 2: 10㎍/ml에서 출발하여 상이한 농도에서의 정제된 나노바디의 고체상에 피복된 합성 펩타이드 Aβ0(도 2a) 및 Aβ2 (도 2b)에 대한 결합. 시그날을 405nm에서 측정하였다.
도 3: 유전자전이된 마우스 뇌속에서 아밀로이드 플라크의 검출. 화살표는 짙은 갈색으로 염색된 영역을 가리킨다.
도 4: 암컷 비-유전자전이된 대조군(F1)과 비교한, 비히클 처리된(C), 나노바디 처리된(B, D) 암컷 APP 유전자전이된 마우스의 대상 인식 지수(B,D,C). 모든 마우스는 연령이 일치되었다.
도 5A 및 B: 몇가지 본 발명의 나노바디의 서열 정렬 및 사람 VH3 배선 서열 DP-29, DP-47 및 DP-51.
실시예 1: 항원 특이적 나노바디
서열번호 73 내지 84에 제시된 서열(표 3)은 응집된 합성 펩타이드로 면역화된 라마로부터 수득된 나노바디이다. 나노바디를 생성하기 위해, 합성 펩타이드, Aβ40(서열번호 187) 및 Aβ42(서열번호 188)를 면역원으로서 사용하였다. 라마에게 스페콜-보조제 중에서 제형화된 시험관내 응집된 합성 Aβ40 또는 Aβ42 제제를 주사하였다. 동물은 1주 간격으로 6회의 피하 주사(100㎍/투여량)로 면역화시켰다. 마지막 부스트(boost)후 1주째에, 혈청을 수거하여, Aβ40 및 Aβ42에 대한 항체 역가를 ELISA에 의해 측정하였다. 당해 ELISA에서는, 문헌[참조: Bohrmann et al (1999) J. Biol. Chem. 247, 15990-15995]에 기술된 프로토콜에 따라서 96웰 플레이트(Maxisorp; Nunc)를 펩타이드로 피복시켰다. 희석된 혈청 샘플을 차단 및 부가한 후, 항-A-베타 나노바디의 존재를 토끼 항-라마 면역글로불린 항혈청 및 항-토끼 면역글로불린 알칼리성 포스파타제 접합체를 사용하여 입증하였다. 역가는 3마리 동물의 경우 12800을 초과하였다.
나노바디를 이. 콜라이내에서 카복시 말단에 헥사히스티딘 태그 및 myc-태그를 보유한 가용성 원형질 단백질로서 생산하였다. 헥사히스티딘 태그의 존재는 IMAC 크로마토그래피에 의한 1단계 정제에 유용하다. myc-태그는 면역학적 방법에 의해 용이하게 검출될 수 있게 한다. 서열번호 73 내지 84 및 85 내지 105로 나타내지는 재조합 단백질의 합성 펩타이드에 대한 결합은 ELISA에 의해 입증되었다. 당해 ELISA에서는, 상기한 바와 같이 96웰 플레이트를 펩타이드로 피복하였다. 플레이트를 2% 카제인으로 차단한 후, 조 원형질 추출물 또는 정제된 나노바디를 몇가지 희석율에서 개개의 웰에 부가하였다. 1시간 동안 항온처리한 후, 웰을 세척한 다음, 마우스 항-myc 모노클로날 항체 및 토끼 항-마우스-알칼리성 포스파타제 접합체(Sigma A 1902)를 사용하여 결합된 나노바디를 검출하였다.
도 1a 및 1b에는, Aβ40 또는 Aβ42 펩타이드 둘다에 대한, 원형질 추출물(표 3에 기재된 나노바디)의 4가지 희석액에서 수득된 ELISA 시그날이 플롯팅되어 있다. 심지어 추출물의 1/625 희석율에서도 모든 클론에 있어 특이적 결합이 나타났다. 항원이 피복되지 않은 플레이트상에서 원형질 추출물을 1/5 희석율에서 시험한 경우, 시그날은 나타나지 않았다. 단백질을 또한 IMAC 크로마토그래피로로 정제하고, Aβ40 및 Aβ42 펩타이드에 대해 ELISA로 시험하였다. 정제후 나노바디의 단백질 농도를 이의 계산된 분자량 및 소광계수(extinction coefficient)를 사용하여 280nm에서 분광광도측정에 의해 측정하였다. 도 2에 도시된 바와 같이, 당해 ELISA 실험은 표 3에 열거된 나노바디가 고체상 피복된 Aβ40 및 Aβ42 펩타이드를 매우 동등하게 인식함을 입증한다.
실시예 2: 응집된 A-베타 펩타이드에 특이적인 나노바디는 아밀로이드 플라크를 인식한다
A-베타 펩타이드에 대해 지시된 나노바디는 APP 유전자전이된 마우스 뇌를 잘라낸 조직 절편내의 아밀로이드 플라크를 검출하는 프로브로서 유용하다. 이들APP 유전자전이된 마우스는 사람 APP를 발현하고, 뇌속에 Ab40 및 Ab42 펩타이드를 축적하며, 사람 AD 환자 뇌속의 미만성 및 노인성 플라크와 매우 유사한 뇌 아밀로이드 플라크를 나타내고, 기억력 결핍 및 사람 AD의 아밀로이드 병리상태의 기타 특징들을 나타낸다[참조: Moechars et al., (1999) J. Biol. Chem. 274, 6483-6492]. 아밀로이드 플라크 함유 마우스의 뇌를 고정시키고, 40μM 절편으로 절단하고, 항-A-베타 나노바디를 예를 들면, 퍼옥시다제와 함께 1차 프라이머로서 사용한다. 이러한 방식으로, 본 발명자들은 아밀로이드 플라크를 염색하는 표지된 2차 항체를 사용하여 플라크를 염색할 수 있었다. 도 3에서 관찰될 수 있는 바와 같이, 아밀로이드 플라크는 나노바디에 의해 특이적으로 인식된다.
실시예 3: 응집된 A-베타 펩타이드에 특이적인 나노바디는 치료용으로 효과적이다.
항-A-베타 나노바디를 유전자전이된 ADPP 마우스에게 복강내(50㎍/동물) 주사하고, APP 유전자전이된 마우스의 대조군은 비히클로만 처리한다. 3일 연속하여 주사한다. 2일 및 3일째에, 대상 인식 시험(object recognition test)을 수행하였다. 당해 시험에서, 마우스를 박스 아래에 위치한 램프로 희미하게 조명하면서 1시간 동안 흑색의 수직 벽 및 투명한 바닥을 갖는 Plexiglas 개방영역(open field) 박스(52 x 52 x 40 cm)에 친숙하게 하였다. 다음날, 동물을 동일한 박스에 위치시 키고 10분 동안 획득 시험에 적용하였다. 이 시험 동안, 마우스를 대상 A(청색 공 또는 적색 큐브, 약 4cm의 유사한 크기의)의 존재하에 개방 영역에 개별적으로 위치시키고, 대상 A에 대한 노출 빈도(동물의 주둥이가 1cm 미만의 거리에서 대상을 향하고 마우스가 대상의 방향으로 활발하게 냄새를 맡는 경우)를 기록하였다(Freq AA). 3시간 후에 수행된 10분간의 체류 시험(2차 시험) 동안, 신규 대상(대상 B, 적색 큐브 또는 청색 공)을 친숙한 대상(대상 B)과 함께 개방 영역안에 놓았다. 동물이 두 대상을 탐색하는 빈도를 기록하였다(Freq A 및 Freq B).
두 대상이 모두 탐색된 빈도에 대한 신규 대상이 탐색된 빈도의 비[Freq B / (Freq A + Freq B) x 100]로서 정의된 인식 지수(RI)를 사용하여 비-공간 기억을 측정하였다.
도 4에서 알 수 있는 바와 같이, 항-A-베타 나노바디로 처리된 마우스는 증가된 인지 지표를 나타낸다.
도 3 및 도 4로부터의 결과와, 문헌[참조: Hock et al ((2003) Neuron, 38, 547-554]에 의해 관찰과 함께, 항체를 발현하는 환자에서 관찰된 유익한 임상적 효과는 유전자전이된 마우스 뇌 절편내의 아밀로이드 플라크를 인식하며, 이는 본원에 기술된 항-A-베타 나노바디에 대한 치료학적 잠재성을 나타낸다.
실시예 4: 약력학의 조절
정맥내 또는 복강내 투여시 나노바디의 혈청 반감기를 연장시키기 위해, 이 특이적 분자 항체를 작제하였다. 상기 분자의 예는 표 8에 기재되어 있다. 이들 폴리펩타이드에서, 하나 이상의 A-베타 특이적 나노바디는 일반적으로 MSA21 및 HSA MP13 B11과 같은 혈청 단백질에 특이적인 나노바디에 연결된다. 적합한 링커 서열의 비제한적 예로서, 당해 3개의 알라닌이 사용되었다.
실시예 5: A-베타 MP1 B12의 사람화
1) 항-A-베타 서열 및 사람 배선 중쇄 V-영역 DP-29, DP-47 및 DP-51 간의 상동성
몇몇 본 발명의 나노바디의 및 사람 VH3 배선 서열 DP-29, DP-47 및 DP-51의 정렬로, AA 변화가 다음 위치에서 일어날 수 있음이 밝혀졌다:
위치 1, 3, 5, 14 및 24에서 FR1내 AA 변화
위치 44, 45 및 49에서 FR2내 AA 변화
위치 74, 77, 78, 83 및 84에서 FR3내 AA 변화
위치 104 및 105에서 FR4(배선 J 절편 유래)내 AA 변화
2) Aβ MP1 B12의 돌연변이유발
Aβ MP1 B12(서열번호 77)를 문헌[참조: Chen and Ruffner (Nucleics Research, 1998)]에 기술된 부위 지시된 돌연변이유발법을 사용하여 돌연변이시켰다. 목적하는 돌연변이(들)을 도입하는 2개의 돌연유발성 프라이머와 함께 플라스미드 DNA를 주형으로서 사용하였다. 2개의 프라이머는 각각 주형 플라스미드 DNA 의 반대편 쇄에 상보적이다. Pfu DNA 폴리머라제를 사용한 폴리머라제 반응에서, 제한된 수의 사이클을 사용한 사이클링 프로그램 동안에 프라이머 서열로부터 각각의 쇄가 신장된다. 이는 야생형과 돌연변이된 쇄의 혼합물을 생성시킨다. 오직 주형 쇄만이 분해에 민감하기 때문에, DpnI로 분해시켜, 돌연변이된 시험관내 합성된 DNA 쇄를 선별할 수 있다. DNA를 침전시키고 XL-Gold 초적격성(ultracompetent) 세포내로 형질전환시켰고, 서열 분석에 의해 요구되는 돌연변이에 대해 분석하였다.
플라스미드를 XL-Gold 초적격성 세포내에서 돌연변이 클론으로부터 제조하고 WK-6 전기적격성(electrocompetent) 세포내로 형질전환시켰다. 단일 콜로니를 2% 글루코스 및 100㎍/ml을 함유한 LB에 접종시켜 밤새 배양을 시작하였다. 상기 밤새 배양한 배양물을 100㎍/ml를 함유하는 300ml TB 배지에 100배 희석시키고, 1mM IPTG (최종 농도)를 부가한 경우 OD600nm이 2가 될 때까지 37℃에서 항온처리하고, 배양물을 37℃에서 3시간 동안 또는 28℃에서 밤새 항온처리하였다. 배양물을 4,500rpm에서 15분 동안 원심분리하였다. 펠렛을 밤새 또는 -20℃에서 1시간 동안 동결시켰다. 그 다음, 펠렛을 실온에서 40분 동안 해동시키고, 15ml peri 완충액(50mM NaHPO4, 300mM NaCl)에 재현탁시키고 1시간 동안 진탕시켰다. 원형질 분획을 20분 동안 14000rpm에서 원심분리하여 분리시켰다. 나노바디를 함유한 상청액을 TALON(ClonTech)에 부하하고 균질해질 때까지 정제하였다. 나노바디의 수율을 계산된 소광계수를 사용하여 측정하였다.
모든 돌연변이체 나노바디는 야생형과 유사하게 발현되었다. 당해 돌연변이 체를 실시예 1에 기술된 바와 같은 시험관내 결합 검정으로 이의 결합 활성에 대해 분석하였다.
실시예 5:
본 발명의 나노바디 및 폴리펩타이드를 2가지의 생체내 동물 시험, 신규 대상 인식 시험 및 모리스 수중 미로(Morris Water Maze) 시험으로 시험한다. .
a) 신규 대상 인식 시험
사용되는 프로토콜은 문헌[참조: Dewachter I. et al (Journal of Neuroscience, 2002, 22(9):3445-3453]에 기술된 방법에 따른다. 마우스를 박스 아래에 위치한 램프로 희미하게 조명하면서 1시간 동안 흑색의 수직 벽 및 투명한 바닥을 갖는 Plexiglas 개방영역 박스(52 x 52 x 40 cm)에 친숙하게 한다. 다음날, 동물을 동일한 박스에 위치시키고 10분 동안 획득 시험에 적용한다. 이 시험 동안, 마우스를 2x 대상 A(청색 공 또는 적색 큐브, 약 4cm의 유사한 크기의)의 존재하에 개방 영역에 개별적으로 위치시키고, 대상 A에 노출되는 기간(시간AA) 및 빈도(FreqAA)(동물의 주둥이가 1cm 초과의 거리에서 대상를 향하고 마우스가 대상의 방향으로 활발하게 냄새를 맡는 경우)를 컴퓨터화 시스템[참조: Ethovision, Noldus information Technology, Wageningen, the Netherlands]에 의해 기록한다. 3시간 후에 수행된 10분간의 체류 시험(2차 시험) 동안, 신규 대상(대상 B, 적색 큐브 또는 청색 공)을 친숙한 대상(대상 B)과 함께 개방 영역안에 놓는다(Freq A 및 Freq 및 시간A 및 시간 B, 각각). 두 대상이 모두 탐색되는 기간에 대한 신규 대상이 탐색되는 기간의 비로서 정의된 인식 지수(RI)[시간 B/(시간 A+ 시간 B)×100]를 사용하여 비-공간 기억을 측정한다. 획득 시험 동안에 대상 A가 탐색되는 기간 및 빈도(시간AA 및 FreqAA)를 사용하여 호기심을 측정한다.
구 대상과 신규 대상을 구별하지 않은 마우스는 50의 인식 지수를 갖는다. 구 대상을 인식하는 마우스는 바람직하게는 신규 대상을 탐색하고 따라서 50 초과의 인식 지수를 갖는다. 오로지 신규 대상만을 탐색하는 마우스는 100의 인식 지수를 갖는다.
당해 시험에서, 대조군으로서 PBS로 처리된 야생형 마우스는 66.4 +/- 3.2의 인식 지수(언급된 모든 값은 10마리 마우스에 대한 평균이다); 비처리된 APP 마우스는 50.7 +/- 3.8의 인식 지수를 나타냈고, 링커 서열 GGGGSGAGGA [서열번호 191]을 통해 C-말단에서 혈뇌 장벽 통과 나노바디 FC44[서열번호 189]에 연결된 H6 A-베타 나노바디[서열번호 76]에 기초한 나노바디 작제물로 처리된 APP 마우스는 62.0 +/- 2.4의 인식 지수를 나타냈다.
b) 모리스 수중 미로 시험
풀(1m 직경의 백색 원형 용기)는 탈출 플랫폼(물 수준보다 1cm 아래)을 은폐하기 위한 무취의 비독성 첨가제를 함유한 20℃의 물을 함유한다. 각 마우스의 수영을 비디오로 촬영하고 분석하였다(Ethovision, Noldus information Technology, Wageningen, the Netherlands). 훈련 전에, 각 마우스를 15초 동안 플랫폼의 상단 에 위치시킨다. 위치 탐색 시험을 위해, 마우스를 3일에 걸쳐서 3회 시험으로 은폐된 플랫폼을 찾아내도록 훈련시킨다. 각 시험은 최대 120초 간의 집중된 수영 시험 및 이어서 60초 동안의 휴식기로 이루어진다. 각 마우스가 플랫폼을 찾아내는데 필요한 시간을 측정한다. 5회의 연속적 시험으로 학습 곡선을 작성한다. 마지막 훈련 24시간 후, 플랫폼을 제거하여 각 동물을 기억능력 시험(probe trial)한다. 마우스는 60초 동안 탐색할 수 있게 하고, 4분원 탐색 시간 및 본래 플랫폼 위치를 교차한 횟수를 측정한다. 수영 및 플랫폼 탐색을 거부하고 대신에 실험 시행자가 풀 밖으로 꺼내줄 때까지 기다린 마우스, 소위 "부유 동물"은 분석에서 배제한다. 최종 기억능력 시험 동안에는, 플랫폼을 제거한 후 60초 동안 마우스가 이전의 플랫폼 위치를 탐색할 수 있게 한다.
당해 시험의 결과는 하기 표 13에 요약된 바와 같다. 사용된 나노바디 작제물은 링커 서열 GGGGSGAGGA [서열번호 191]을 통해 C-말단에서 혈뇌 장벽 통과 나노바디 FC44[서열번호 189]에 연결된 H6 A-베타 나노바디[서열번호 76]였다.
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Figure 112007034854195-PCT00034
<110> ABLYNX N.V. <120> Single domain Camelide anti-amyloid beta antibodies and polypeptides comprising the same for the treatment and diagnosis of degenerative neural diseases such as Alzheimer's disease <130> ABL-021-PCT <140> PCT/EP2005/011018 <141> 2005-10-13 <150> 60/618,148 <151> 2004-10-13 <150> 60/718,617 <151> 2005-09-20 <160> 192 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> FR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Hallmark residue : L, M, S, V or W; preferably L <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Xaa Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 20 25 <210> 2 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> FR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Hallmark residue: F, H, I, L, Y or V; preferably F or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Hallmark residue: G, E, A, D, Q, R, S or L; preferably G, E or Q; most preferably G or E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Hallmark residue: L, R, C, I, L, P, Q or V; preferably L or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Hallmark residue: W, L, F, A, G, I, M, R, S, V or Y; preferably W, L, F or R <400> 2 Trp Xaa Arg Gln Ala Pro Gly Lys Xaa Xaa Glu Xaa Val Ala 1 5 10 <210> 3 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> FR3 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Hallmark residue: R, K, N, E, G, I, M, Q or T; preferably K or R; most preferably R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> Hallmark residue: P, A, D, L, R, S, T or V; preferably P <400> 3 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Xaa Xaa Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala 20 25 30 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> FR4 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Hallmark residue: W, P, R or S; preferably W <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Hallmark residue: G or D; preferably G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Hallmark residue: Q, L or R; preferably Q or L <400> 4 Xaa Xaa Gln Gly Thr Xaa Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 5 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> FR1 <400> 5 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 20 25 <210> 6 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> FR2 <400> 6 Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val Ala 1 5 10 <210> 7 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> FR2 <400> 7 Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala 1 5 10 <210> 8 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> FR2 <400> 8 Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Ala 1 5 10 <210> 9 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> FR2 <400> 9 Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala 1 5 10 <210> 10 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> FR2 <400> 10 Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Phe Val Ala 1 5 10 <210> 11 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> FR2 <400> 11 Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ala 1 5 10 <210> 12 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> FR3 <400> 12 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala 20 25 30 <210> 13 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> FR4 <400> 13 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 14 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> FR4 <400> 14 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 15 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR1 <400> 15 Ser Phe Gly Met Ser 1 5 <210> 16 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR1 <400> 16 Leu Asn Leu Met Gly 1 5 <210> 17 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR1 <400> 17 Ile Asn Leu Leu Gly 1 5 <210> 18 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR1 <400> 18 Asn Tyr Trp Met Tyr 1 5 <210> 19 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR2 <400> 19 Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 20 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR2 <400> 20 Thr Ile Thr Val Gly Asp Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 21 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR2 <400> 21 Thr Ile Thr Val Gly Asp Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 22 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR2 <400> 22 Ser Ile Asn Gly Arg Gly Asp Asp Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 23 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR2 <400> 23 Ala Ile Ser Ala Asp Ser Ser Thr Lys Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 24 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR2 <400> 24 Ala Ile Ser Ala Asp Ser Ser Asp Lys Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 25 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR2 <400> 25 Arg Ile Ser Thr Gly Gly Gly Tyr Ser Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 26 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 <400> 26 Asp Arg Glu Ala Gln Val Asp Thr Leu Asp Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 27 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 <400> 27 Gly Gly Ser Leu Ser Arg 1 5 <210> 28 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 <400> 28 Arg Arg Thr Trp His Ser Glu Leu 1 5 <210> 29 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 <400> 29 Gly Arg Ser Val Ser Arg Ser 1 5 <210> 30 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 <400> 30 Gly Arg Gly Ser Pro 1 5 <210> 31 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Myc Tag <400> 31 Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala 1 5 10 15 Ala <210> 32 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 32 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 30 <210> 33 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 33 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 34 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> FR1 <400> 34 Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Pro Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Gln Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 35 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> FR2 <400> 35 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 36 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> FR2 <400> 36 Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Ala Ser Glu Arg Ile Phe Asp Leu Asn 20 25 30 Leu Met Gly Trp Tyr Arg Gln Gly Pro Gly Asn Glu Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Thr Cys Ile Thr Val Gly Asp Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Met Asp Tyr Thr Lys Gln Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu His Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Lys Ile Arg Arg Thr Trp His Ser Glu Leu Trp Gly Gln Gly Thr Gln 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 37 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR1 <400> 37 Gly Gly Thr Phe Ser Ser Val Gly Met Gly 1 5 10 <210> 38 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR1 <400> 38 Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Gly Met Ile 1 5 10 <210> 39 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR1 <400> 39 Gly Gly Thr Phe Ser Ser Ile Gly Met Gly 1 5 10 <210> 40 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR1 <400> 40 Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Trp Met Tyr 1 5 10 <210> 41 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR1 <400> 41 Gly Phe Thr Leu Ser Ser Ile Thr Met Thr 1 5 10 <210> 42 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR1 <400> 42 Gly Arg Thr Phe Ser Ile Tyr Asn Met Gly 1 5 10 <210> 43 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR1 <400> 43 Gly Arg Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met Gly 1 5 10 <210> 44 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR1 <400> 44 Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Trp Met Tyr 1 5 10 <210> 45 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR1 <400> 45 Gly Gly Thr Phe Ser Ser Ile Gly Met Gly 1 5 10 <210> 46 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR1 <400> 46 Gly Gly Ile Tyr Arg Val Asn Thr Val Asn 1 5 10 <210> 47 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR1 <400> 47 Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Trp Met Tyr 1 5 10 <210> 48 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR <400> 48 Gly Phe Thr Leu Ser Ser Ile Thr Met Thr 1 5 10 <210> 49 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR2 <400> 49 Ala Ile Ser Arg Ser Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala Gly Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 50 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR2 <400> 50 Gly Ile Ser Asp Gly Gly Arg Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 51 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 <400> 51 Ala Ile Ser Arg Ser Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 52 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 <400> 52 Thr Ile Ser Pro Arg Ala Ala Val Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 53 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 <400> 53 Thr Ile Asn Ser Gly Gly Asp Ser Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 54 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 <400> 54 Thr Ile Thr Arg Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 55 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR2 <400> 55 Thr Ile Ser Arg Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 56 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR2 <400> 56 Thr Ile Ser Pro Arg Ala Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 57 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR2 <400> 57 Ala Ile Ser Arg Ser Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 58 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR2 <400> 58 Thr Ile Thr Arg Ala Gly Ser Thr Asn Tyr Val Glu Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 59 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR2 <400> 59 Thr Ile Ser Pro Arg Ala Ala Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 60 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR2 <400> 60 Thr Ile Asn Ser Gly Gly Asp Ser Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 61 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 <400> 61 Arg Pro Ala Gly Thr Pro Ile Asn Ile Arg Arg Ala Tyr Asn Tyr 1 5 10 15 <210> 62 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 <400> 62 Ala Tyr Gly Arg Gly Thr Tyr Asp Tyr 1 5 <210> 63 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 <400> 63 Arg Pro Ala Gly Thr Ala Ile Asn Ile Arg Arg Ser Tyr Asn Tyr 1 5 10 15 <210> 64 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 <400> 64 Ser Leu Lys Tyr Trp His Arg Pro Gln Ser Ser Asp Phe Ala Ser 1 5 10 15 <210> 65 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 <400> 65 Gly Thr Tyr Tyr Ser Arg Ala Tyr Tyr Arg 1 5 10 <210> 66 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 <400> 66 Ala Arg Ile Gly Ala Ala Val Asn Ile Pro Ser Glu Tyr Asp Ser 1 5 10 15 <210> 67 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 <400> 67 Arg Pro Ala Gly Thr Pro Ile Asn Ile Arg Arg Ala Tyr Asn Tyr 1 5 10 15 <210> 68 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 <400> 68 Ser Leu Ile Tyr Lys Ala Arg Pro Gln Ser Ser Asp Phe Val Ser 1 5 10 15 <210> 69 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 <400> 69 Arg Pro Ala Gly Thr Ala Ile Asn Ile Arg Arg Ser Tyr Asn Tyr 1 5 10 15 <210> 70 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 <400> 70 Asn Gly Arg Trp Arg Ser Trp Ser Ser Gln Arg Asp Tyr 1 5 10 <210> 71 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 <400> 71 Ser Leu Arg Tyr Arg Asp Arg Pro Gln Ser Ser Asp Phe Leu Phe 1 5 10 15 <210> 72 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 <400> 72 Gly Thr Tyr Tyr Ser Arg Ala Tyr Tyr Arg 1 5 10 <210> 73 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Nanobody <400> 73 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Val 20 25 30 Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Gly Ala Ile Ser Arg Ser Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala Gly Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Gly Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Arg Pro Ala Gly Thr Pro Ile Asn Ile Arg Arg Ala Tyr Asn 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 74 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Nanobody <400> 74 Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Arg Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Asp Gly Gly Arg Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Arg Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Tyr Gly Arg Gly Thr Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Gln Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 75 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Nanobody <400> 75 Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Ile 20 25 30 Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Gly Ala Ile Ser Arg Ser Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Gly Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Gly Arg Pro Ala Gly Thr Ala Ile Asn Ile Arg Arg Ser Tyr Asn 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 76 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Nanobody <400> 76 Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Ser Pro Arg Ala Ala Val Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Glu Pro Asp Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr 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Gln Ala Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly 260 265 270 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Val Arg Thr Phe Ser Ile 275 280 285 Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe 290 295 300 Val Ala Gly Ile Asn Arg Ser Gly Asp Val Thr Lys Tyr Ala Asp Phe 305 310 315 320 Val Lys Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Met Val 325 330 335 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr 340 345 350 Cys Ala Ala Thr Trp Ala Tyr Asp Thr Val Gly Ala Leu Thr Ser Gly 355 360 365 Tyr Asn Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 370 375 380 <210> 183 <211> 379 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Nanobody construct <400> 183 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu 115 120 125 Gln Ala Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu 130 135 140 Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Lys Ile Thr His Tyr Thr Met Gly Trp 145 150 155 160 Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ser Arg Ile Thr 165 170 175 Trp Gly Gly Asp Asn Thr Phe Tyr Ser Asn Ser Val Lys Gly Arg Phe 180 185 190 Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn 195 200 205 Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Ser 210 215 220 Thr Ser Thr Ala Thr Pro Leu Arg Val Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr 225 230 235 240 Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln 245 250 255 Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser 260 265 270 Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Trp 275 280 285 Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 290 295 300 Thr Ile Ser Pro Arg Ala Ala Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 305 310 315 320 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 325 330 335 Gln Met Asn Ser Leu Glu Pro Asp Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala 340 345 350 Lys Ser Leu Arg Tyr Arg Asp Arg Pro Gln Ser Ser Asp Phe Leu Phe 355 360 365 Trp Arg Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 370 375 <210> 184 <211> 379 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Nanobody construct <400> 184 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu 115 120 125 Gln Ala Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu 130 135 140 Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Lys Ile Thr His Tyr Thr Met Gly Trp 145 150 155 160 Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ser Arg Ile Thr 165 170 175 Trp Gly Gly Asp Asn Thr Phe Tyr Ser Asn Ser Val Lys Gly Arg Phe 180 185 190 Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn 195 200 205 Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Ser 210 215 220 Thr Ser Thr Ala Thr Pro Leu Arg Val Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr 225 230 235 240 Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln 245 250 255 Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser 260 265 270 Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Trp 275 280 285 Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 290 295 300 Thr Ile Ser Pro Arg Ala Ala Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 305 310 315 320 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 325 330 335 Gln Met Asn Ser Leu Glu Pro Asp Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala 340 345 350 Lys Ser Leu Arg Tyr Arg Asp Arg Pro Gln Ser Ser Asp Phe Leu Phe 355 360 365 Trp Arg Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 370 375 <210> 185 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 185 Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Pro Ala Ala Ala 1 5 10 <210> 186 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 186 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 187 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 187 Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 <210> 188 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> A-BETA protein <400> 188 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val 35 40 <210> 189 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> A-BETA protein <400> 189 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala 35 40 <210> 190 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Nanobody <400> 190 Glu Val Gln Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Val Arg Thr Phe Ser Ile Tyr 20 25 30 Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Gly Ile Asn Arg Ser Gly Asp Val Thr Lys Tyr Ala Asp Phe Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Met Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Thr Trp Ala Tyr Asp Thr Val Gly Ala Leu Thr Ser Gly Tyr 100 105 110 Asn Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 191 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Nanobody <400> 191 Glu Val Gln Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Lys Ile Thr His Tyr 20 25 30 Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ser Arg Ile Thr Trp Gly Gly Asp Asn Thr Phe Tyr Ser Asn Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Asp Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Gly Ser Thr Ser Thr Ala Thr Pro Leu Arg Val Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 192 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 192 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala Gly Gly Ala 1 5 10

Claims (27)

  1. A-베타에 대해 지시된 하나 이상의 나노바디(Nanobody) 또는 이의 기능적 단편을 포함하거나 이로써 본질적으로 이루어진 폴리펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, A-베타에 대해 지시된 나노바디가 4개의 골격(framework) 영역(각각 FR1 내지 FR4) 및 3개의 상보성 결정 영역(각각, CDR1 내지 CDR3)으로 이루어지고, 이때
    a) CDR1이
    GGTFSSVGMG [서열번호 37], GFTFSNYGMI [서열번호 38], GGTFSSIGMG [서열번호 39], GFTFSNYWMY [서열번호 40], GFTLSSITMT [서열번호 41], GRTFSIYNMG [서열번호 42], GRTFTSYNMG [서열번호 43], GFTFSNYWMY [서열번호 44], GGTFSSIGMG [서열번호 45], GGIYRVNTVN [서열번호 46], GFTFSNYWMY [서열번호 47] 및 GFTLSSITMT [서열번호 48]로 이루어진 그룹 또는
    상기 아미노산 서열 중 하나와 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성(본원에서 정의하는 바와 같음)을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 그룹[여기서, i) 임의의 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환(본원에서 정의하는 바와 같음)이고/이거나, ii) 상기 아미노산 서열은 바람직하게는, 상기 아미노산 서열(들)과 비교하여 오직 아미노산 치환만을 함유하고 아미노산 결실 또는 삽입을 함유하지 않 는다]; 및/또는
    상기 아미노산 서열 중 하나와 2개 또는 오직 1개의 "아미노산 차이(들)"만을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 그룹[여기서, i) 임의의 아미노산 치환이 바람직하게는 보존적 아미노산 치환(본원에서 정의하는 바와 같음)이고/이거나, ii) 상기 아미노산 서열은 바람직하게는, 상기 아미노산 서열(들)과 비교하여 오직 아미노산 치환만을 함유하고 아미노산 결실 또는 삽입을 함유하지 않는다]으로부터 선택된 아미노산 서열이고/이거나;
    b) CDR2가
    AISRSGDSTYYAGSVKG [서열번호 49], GISDGGRSTSYADSVKG [서열번호 50], AISRSGDSTYYADSVKG [서열번호 51], TISPRAAVTYYADSVKG [서열번호 52], TINSGGDSTTYADSVKG [서열번호 53], TITRSGGSTYYADSVKG [서열번호 54], TISRSGGSTYYADSVKG [서열번호 55], TISPRAGSTYYADSVKG [서열번호 56], AISRSGDSTYYADSVKG [서열번호 57], TITRAGSTNYVESVKG [서열번호 58], TISPRAANTYYADSVKG [서열번호 59] 및 TINSGGDSTTYADSVKG [서열번호 60]로 이루어진 그룹 또는
    상기 아미노산 서열 중 하나와 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성(본원에서 정의하는 바와 같음)을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 그룹[여기서, i) 임의의 아미노산 치환이 바람직하게는 보존적 아미노산 치환(본원에서 정의하는 바와 같음)이고/이거나, ii) 상기 아미노산 서열은 바람직하게는, 상기 아미노산 서열(들)과 비 교하여 오직 아미노산 치환만을 함유하고 아미노산 결실 또는 삽입을 함유하지 않는다] 및/또는
    상기 아미노산 서열 중 하나와 3개, 2개 또는 오직 1개의 "아미노산 차이(들)"(본원에서 정의하는 바와 같음)만을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 그룹[여기서, i) 임의의 아미노산 치환이 바람직하게는 보존적 아미노산 치환(본원에서 정의하는 바와 같음)이고/이거나, ii) 상기 아미노산 서열은 바람직하게는, 상기 아미노산 서열(들)과 비교하여 오직 아미노산 치환만을 함유하고 아미노산 결실 또는 삽입을 함유하지 않는다]으로부터 선택된 아미노산 서열이고/이거나;
    c) CDR3이
    RPAGTPINIRRAYNY [서열번호 61], AYGRGTYDY [서열번호 62], RPAGTAINIRRSYNY [서열번호 63], SLKYWHRPQSSDFAS [서열번호 64], GTYYSRAYYR [서열번호 65], ARIGAAVNIPSEYDS [서열번호 66], RPAGTPINIRRAYNY [서열번호 67], SLIYKARPQSSDFVS [서열번호 68], RPAGTAINIRRSYNY [서열번호 69], NGRWRSWSSQRDY [서열번호 70], SLRYRDRPQSSDFLF [서열번호 71] 및 GTYYSRAYYR [서열번호 72]로 이루어진 그룹 또는
    상기 아미노산 서열 중 하나와 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성(본원에서 정의하는 바와 같음)을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 그룹[여기서, i) 임의의 아미노산 치환이 바람직하게는 보존적 아미노산 치환(본원에서 정의하는 바와 같음)이고/이거나, ii) 상기 아미노산 서열은 바람직하게는, 상기 아미노산 서열(들)과 비 교하여 오직 아미노산 치환만을 함유하고 아미노산 결실 또는 삽입을 함유하지 않는다] 및/또는
    상기 아미노산 서열 중 하나와 3개, 2개 또는 오직 1개의 아미노산 차이(들)(본원에서 정의하는 바와 같음)만을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 그룹[여기서, i) 임의의 아미노산 치환이 바람직하게는 보존적 아미노산 치환(본원에서 정의하는 바와 같음)이고/이거나, ii) 상기 아미노산 서열은 바람직하게는, 상기 아미노산 서열(들)과 비교하여 오직 아미노산 치환만을 함유하고 아미노산 결실 또는 삽입을 함유하지 않는다]으로부터 선택된 아미노산 서열인 폴리펩타이드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 하나 이상의 나노바디 또는 이의 기능적 단편이 사람화된 나노바디 또는 이의 단편인 폴리펩타이드.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 나노바디 또는 이의 기능적 단편이 서열번호 73 내지 105 중 어느 하나에 제시된 서열 또는 이의 기능적 단편에 상응하는 폴리펩타이드.
  5. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, A-베타에 대해 지시된 나노바디 또는 이의 기능적 단편의 수가 2개 이상인 폴리펩타이드.
  6. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 생체내에서 당해 폴리펩타이드 의 반감기를 향상시키도록 지시된, 하나 이상의 폴리펩타이드, 바람직하게는 하나 이상의 나노바디 또는 이의 기능적 단편을 추가로 포함하는 폴리펩타이드.
  7. 제6항에 있어서, 생체내에서 당해 폴리펩타이드의 반감기를 향상시키도록 지시된 하나 이상의 폴리펩타이드가 혈청 단백질에 대해 지시된, 폴리펩타이드, 바람직하게는 하나 이상의 나노바디 또는 이의 기능적 단편인 폴리펩타이드.
  8. 제7항에 있어서, 하나 이상의 폴리펩타이드 또는 나노바디가 혈청 알부민, 혈청 면역글로불린, 티록신-결합 단백질, 트랜스페린 또는 피브리노겐에 대해 지시된 폴리펩타이드.
  9. 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 당해 폴리펩타이드가 혈뇌 장벽을 통과할 수 있도록 하는, 하나 이상의 폴리펩타이드, 바람직하게는 하나 이상의 나노바디 또는 이의 기능적 단편을 추가로 포함하는 폴리펩타이드.
  10. 제9항에 있어서, 나노바디 FC44 또는 FC5를 포함하는 폴리펩타이드.
  11. 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, A-베타에 대해 지시된 하나 이상의 나노바디 또는 이의 기능적 단편이 뇌 또는 체내 다른 부분으로부터 아밀로이드 플라크를 제거할 수 있는 폴리펩타이드.
  12. 제1항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 있어서, A-베타에 대해 지시된 하나 이상의 나노바디 또는 이의 기능적 단편이 A-베타와 다른 A-베타 간의 상호작용을 억제할 수 있는 폴리펩타이드.
  13. 제1항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, A-베타에 대해 지시된 하나 이상의 나노바디 또는 이의 기능적 단편의 하나 이상의 아미노산이 항원 결합 능력이 실질적으로 변경되지 않으면서 치환된 폴리펩타이드.
  14. 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, A-베타에 대해 지시된 하나 이상의 나노바디 또는 이의 기능적 단편이 APP 및 APLP의 세크레타제 매개된 절단 또는 A-베타 절단 산물을 초래하는 임의의 다른 절단 후에 생성되거나 노출된 신생-에피토프에 결합할 수 있는 폴리펩타이드.
  15. 제1항 내지 제14항 중의 어느 한 항에 있어서, 서열번호 117 내지 183 중 어느 하나에 제시된 서열에 상응하는 폴리펩타이드.
  16. 제1항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 있어서, 페길화된(pegylated) 폴리펩타이드.
  17. 제1항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산.
  18. 제1항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드 및/또는 제17항에 따른 핵산을 포함하는 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 임의로 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물인 조성물.
  20. 아밀로이드 플라크 형성에 의해 매개되는 장애를 치료, 예방 및/또는 경감시키는데 사용하기 위한, 제1항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드, 제17항에 따른 핵산 또는 제18항 또는 제19항에 따른 조성물.
  21. 아밀로이드 플라크 형성에 의해 매개되는 장애의 치료, 예방 및/또는 경감용 의약의 제조를 위한, 제1항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드 또는 제17항에 따른 핵산의 용도.
  22. a) 제1항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 당해 폴리펩타이드가 발현될 수 있는 조건하에 배양하는 단계,
    b) 배양물로부터 생산된 폴리펩타이드를 회수하는 단계 및
    c) 임의로, 상기 폴리펩타이드를 페길화시키는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드의 제조 방법.
  23. 제22항에 있어서, 숙주 세포가 세균 세포 또는 효모 세포인 방법.
  24. a) 샘플을 제1항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드와 접촉시키는 단계,
    b) 상기 샘플에 대한 상기 폴리펩타이드의 결합을 검출하는 단계 및
    c) 단계(b)에서 검출된 결합을 표준과 비교하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 샘플과 비교한 결합에서의 차이가 아밀로이드 플라크 형성을 특징으로 하는 질환 또는 장애의 진단지표가 되는, 아밀로이드 플라크 형성에 의해 매개되는 질환 또는 장애의 진단 방법.
  25. a) 샘플을 제1항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드와 접촉시키는 단계,
    b) 상기 샘플에서 A-베타의 양을 측정하는 단계 및
    c) 단계(b)에서 측정된 양을 표준과 비교하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 샘플과 비교한 양에서의 차이가 아밀로이드 플라크 형성을 특징으로 하는 질환 또는 장애의 진단지표가 되는, 아밀로이드 플라크 형성에 의해 매개되는 질환 또는 장애의 진단 방법.
  26. 제24항 또는 제25항에 따른 방법에서 사용하기 위한, 아밀로이드 플라크 형성에 의해 매개된 질환 또는 장애 진단용 키트.
  27. 제1항 내지 제17항 중의 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 생체내 영상제(imaging agent)를 추가로 포함하는 폴리펩타이드.
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