KR20160145540A - 인산화 타우 단백질로 향하는 낙타과 동물의 단일-도메인 항체 - Google Patents

인산화 타우 단백질로 향하는 낙타과 동물의 단일-도메인 항체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인산화 타우 단백질로 향하는 낙타과 중-쇄 항체의 가변 도메인 및 이의 콘쥬게이트에 관한 것이다. 본 발명은 또한 타우병증과 같은, 신경원섬유 매듭, 신경망 실 또는 이영양성 신경돌기에 의해 매개된 장애의 치료 또는 진단하기 위한 이들 도메인 또는 콘쥬게이트의 용도에 관한 것이다.

Description

인산화 타우 단백질로 향하는 낙타과 동물의 단일-도메인 항체 {CAMELID SINGLE-DOMAIN ANTIBODY DIRECTED AGAINST phosphorylated TAU PROTEINS AND METHODS FOR PRODUCING CONJUGATES THEREOF}
본 발명은 인산화 타우 단백질 (phosphorylated tau proteins)로 향하는 항체 및 이의 콘쥬게이트 (conjugates)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 인산화 타우 단백질에 의해 매개된 장애를 치료 또는 진단하기 위한 이들 항체 콘쥬게이트 (conjugates)의 용도에 관한 것이다.
모든 경우의 치매의 약 70%는 인지를 위해 대단히 중요한 뇌 영역 및 신경 회로의 선택적 손상과 관련된 알츠하이머병 (AD)에 기인한다. 알츠하이머병은 특히 해마의 피라미드 뉴런 (pyramidal neurons) 및 다수의 아밀로이드 플라크 (amyloid plaques)에서의 신경원섬유 매듭 (neurofibrillary tangles) (NFTs)을 특징으로 한다.
AD 뇌 표본에 대한 초미세구조 연구는 NFTs가 이중 나선 필라멘트 (paired helical filaments) (PHFs)로 주로 구성되고, 이들 필라멘트는 65㎚의 일정한 주기성에서 나선 삼차원 형태를 갖는 대략 10㎚ 직경의 축의 방향으로 마주보는 원섬유 (fibrils)의 쌍이라는 것을 밝혔다 (Kidd 1963 Nature, 197, 192-3; Wisniewski et al. 1976 J Neurol Sci., 27,173-81). 1985년에서, Brion 등은 (Archives de biologie (Bruxelles), 95, 229-235) PHFs의 주성분이, 마이크로튜블린 연관 단백질 (MAP)인, 단백질 타우인 것을 입증했다. 이 결과는 몇몇 저자에 의해 확인되었다: Grundke-Iqbal et al. 1986 Proc Natl Acad Sci U.S.A., 83, 4913-7; Kosik et al. 1986 Proc Natl Acad Sci U.S.A., 83, 4044-8; Delacourte and Defossez 1986 J Neurol Sci., 76, 173-86; Wood et al. 1986 Proc Natl Acad Sci U.S.A., 83, 4040-3; Nukina and Ihara 1986 J Biochem., 99, 1541-4; Pollock et al. 1986 Lancet, 2, 1211 ; Montejo de Garcini et al. 1986 Biochem Biophys Res Commun., 141, 790-6. 이것은 그 다음 NFTs에서 단백질 타우가 비정상적으로 인산화되어 (Grundke-Iqbal and Iqbal, et al. 1986 Proc Natl Acad Sci U.S.A., 83, 4913-7; Ihara et al. 1986 J Biochem., 99, 1807-10; Iqbal et al. 1986 Lancet, 2, 421-6; Brion et al. 1986 Lancet, 2, 1098; Kopke et al. 1993 J Biol Chem., 268, 24374-84), 미세소관 (microtubules)의 분해 (disassembly)를 유발하는, 정상 타우 및 다른 MAPs의 격리 (sequestration) (Alonso et al. 1994 Proc Natl Acad Sci U.S.A., 91, 562-6; Alonso et al. 1997 Proc Natl Acad Sci U.S.A., 94, 298-303)를 유도하고, 따라서, 손상된 축삭 수송 (impaired axonal transport), 정상 뉴런 및 시냅스 기능이 제대로 발휘되지 않아, 시냅스의 손실 및 뉴런의 사멸을 유도한다. 과인산화된 (Hyperphosphorylated) 타우는 또한 불용성이 되고, 이중 나선 필라멘트 (PHFs) 및 NFTs로 자가-응집된다. 모든 이들 과정의 끝은 치매이다. 타우 인산화는 다중 키나아제와 포스포타아제 사이에서의 균형에 의해 조절된다 (Iqbal et al. 2005 Biochim Biophys Acta, 1739, 198-210; Blennow et al. 2006 Lancet, 368, 387-403). 증가된 양의 비정상적인 인산화 타우로, AD 뇌에서 타우 수준은 연령-일치된 대조구보다 약 8배 더 높다 (Khatoon et al. 1992 J Neurochem., 59, 750-3). 타우 및 NFT 형성이 AD의 원인인지 또는 결과인지는 현재 알려지지 않았다 (Blennow et al. 2006 Lancet, 368, 387-403).
타우는 70년대에서 MAP로 먼저 분리 및 확인되었고 (Weingarten et al. 1975 Proc Natl Acad Sci U.S.A., 72, 1858-62; Cleveland et al. 1977 J Mol Biol., 116, 227-47; Cleveland et al. 1977 J Mol Biol., 116, 207-25) 및 뉴런에서 주로 발현된다 (Tucker 1990 Brain Res Brain Res Rev., 15, 101-20; Schoenfeld and Obar 1994 Int Rev Cytol., 151, 67-137). 인간 타우 유전자는 크로모좀 17 상에 위치되며, 여기서 100 kb 이상 차지하고, 적어도 16 엑손 (exons)을 함유한다 (Neve et al. 1986 Brain Res., 387, 271-80; Andreadis et al. 1992 Biochemistry, 31, 10626-33; Andreadis et al. 1995 Nucleic Acids Res., 23, 3585-93). 선택적인 스플라이싱 (splicing)에 의해, 타우 유전자는 다른 mRNA를 산출하고, 6개의 타우 아이소폼 (isoforms)의 생산을 결과한다 (Goedert et al. 1989 Neuron, 3, 519-26; Him㎖er et al. 1989 Mol Cel Biol., 9, 1381-8). 6개의 타우 아이소폼은 31-32 아미노산 각각의 셋 또는 넷의 미세소관 결합 반복 (microtubule binding repeats) (R), 및 29 아미노산 각각의 1, 2, 또는 0 아미노 터미널 삽입 (amino terminal inserts) (N)의 존재에 의해 서로 달라, 0N3R, 1N3R, 2N3R, 0N4R, 1N4R, 및 2N4R 타우를 발생시킨다. 타우 단백질의 6개 아이소폼은 352 내지 441 아미노산을 포괄한다 (Goedert et al. 1989 Neuron, 3, 519-26; Him㎖er et al. 1989 Mol Cell Biol., 9, 1381-8; Goedert et al. 1989 The EMBO J., 8, 393-9). 각각의 이들 아이소폼은 이들이 발생 동안 다르게 발현되기 때문에 특별한 생물리학적 기능을 발휘할 수 있다. 예를 들어, 0N3R 타우는 태아 뇌에 존재하는 유일한 아이소폼인 반면, 모든 6개 아이소폼은 성인기 (adulthood) 동안 발현된다 (Kosik et al. 1989 Neuron, 2, 1389-97; Goedert and Jakes 1990 EMBO J., 9, 4225-30; Buee et al. 2000 Brain Res Brain Res Rev., 33, 95-130).
mRNA 및 단백질 모두에 대한 4R:3R 타우 비는 정상 뇌에서는 대략 같지만, 장애는 일반적으로 대부분의 신경퇴행성 (neurodegenerative) 타우병증 (tauopathies)에서 이들 비율을 증가시킨다 (Hanger et al. 2009 Trends Mol Med., 15, 112-9). 특별한 mAb를 사용하여, 과인산화된 (hyperphosphorylated)/병리학적 (pathological) 타우 단백질은 55 내지 74 kDa 사이의 밴드 (bands)로서 웨스턴 블럿 (western blot) 상에 가시화될 수 있다 (Buee et al. 2000 Brain Res Brain Res Rev., 33, 95-130).
타우441 (441 아미노-산)은 80개 세린/트레오닌 및 5개 티로신 추정 (putative) 인산화 부위를 함유하고, 타우의 규명된 기능은 이의 미세소관-결합 도메인 (domains) (R)을 통해 미세소관에 결합하고, 이에 의해 미세소관 어셈블리 및 안정성을 촉진시킨다 (Weingarten et al. 1975 Proc Natl Acad Sci U.S.A., 72, 1858-62; Cleveland et al. 1977 J Mol Biol., 116, 227-47; Cleveland et al. 1977 J Mol Biol., 116, 207-25; Bohm et al. 1990 Acta Histochem Suppl., 39, 357-64; Nixon and Sihag 1991 Trends Neurosci., 14, 501-6; Drechsel et al. 1992 Mol Biol Cell., 3, 1141-54; Brandt and Lee 1993 J Neurochem., 61, 997-1005). 타우의 미세소관 어셈블리-촉진 활성은 이의 인산화 정도에 의해 조절된다. 과인산화는 미세소관 어셈블리를 자극하는 타우의 능력을 억제한다 (Lindwall and Cole 1984 J Biol Chem., 259, 5301-5). 40개 세린/트레오닌 부위 이상에서 타우의 AD 과인산화는 확인되어 왔다 (Hasegawa et al. 1992 J Biol Chem, 267, 17047-54; Morishima-Kawashima et al. 1995 J Biol Chem., 270, 823-9; Hanger et al. 1998 Trends Mol Med, 15, 112-9; Vega et al. 2005 Brain Res Brain Mol Res., 138, 135-44). AT8 mAb에 의해 인지되는 에피토프인, Ser202의 인산화는, 매듭 형성 (tangle formation)과 연관되어 확인되었고, AD-타입의 타우 병리학의 초기 마커인 것으로 보고된다 (Mercken et al. 1992 Acta Neuropathol., 84, 265-72; Biernat et al. 1992 EMBO J., 11, 1593-7; Su et al. 1994 Neuroreport, 5, 2358-62; Hernandez et al. 2003 Neurob Aging., 24, 1087-94; Blazquez-Llorca et al. 2011 J Alzheimer's Dis., 26, 683-98). 타우의 C-말단 근처에서 Ser422의 인산화는 또한 NFTs의 발생과 밀접하게 연관된 것으로 보고된다. Ser422에서 타우 인산화의 양은 AD의 심각도에 따라 증가하는 것으로 확인되었고, 이 인산화 부위는 또한 AD에서 중요한 병적증상이다 (Bussiere et al. 1999 Acta Neuropathol., 97, 221-30; Augustinack et al. 2002 Acta Neuropathol., 103, 26-35; Haase et al. 2004 J Neurochem., 88, 1509-20; Pennanen and Gotz 2005 Biochem Biophys Res Commun., 337, 1097-101; Deters et al. 2008 Eur J Neurosci., 28, 137-47; Grueninger et al. 2011 Mol Cell Biochem., 357, 199-207).
아밀로이드-베타 (Aβ) 침착과 달리, NFTs은 AD 뇌에서 정형화되고 예측 가능한 패턴으로 발생한다 (Arnold et al. 1991 Cereb Cortex, 1, 103-16; Braak and Braak 1991 Acta Neuropathol., 82, 239-59; Braak et al. 2006 Acta Neuropathol., 112, 389-404). Braak 및 Braak (1991 Acta Neuropathol., 82, 239-59)은 이들의 임상병리학적 연구에서 NFTs의 진행을 설명하기 위해 6개의 단계를 제안했다. 제1 NFTs는 적절한 내후각 (entorhinal) 피질 (cortex)을 따라 비강 내통과 (transentorhinal) (코 주위 (perirhinal)) 영역에서 지속적으로 나타나고 (단계 1), 그 다음 해마 (hippocampus)의 CA1 영역에 퍼진다 (단계 2). 그 다음, NFTs는 해마체 (hippocampal formation)의 그물모양 균사체 (subiculum)와 같은 변연계 구조 (limbic structure) (단계 3), 및 편도체 (amygdala), 시상 (thalamus), 및 전장 (claustrum) (단계 4)에서 발생 및 축적된다. 마지막으로, NFTs는 연관된 영역이 사전에 및 좀 더 심각하게 영향을 받은, 모든 등피질 영역 (isocortical areas) (등피질 단계)에서 나타나고 (단계 5), 그 다음 일차 감각 (primary sensory), 운동 신경 (motor), 및 시각 영역들이 뒤따른다 (단계 6). 선상체 (striatum) 및 흑질 (substantia nigra)의 심각한 개입은 나중의 등피질 단계 동안 발생할 수 있다 (Serrano-Pozo, Frosch, et al. 2011 Cold Spring Harb Perspect Med., 1, a006189). 다른 그룹으로부터의 다중 임상병리학적 연구는 뇌에 쌓인 NET가 치매의 심각도 및 기간과 연관있다는 것을 확립하였다 (Arriagada et al. 1992 Neurology, 42, 631-9; Bierer et al. 1995 Arch Neurol., 52, 81-8; G㎛ez-Isla et al. 1997 Ann Neurol., 41, 17-2; Giannakopoulos et al. 2003 Neurology, 60, 1495-500; Ingelsson et al. 2004 Neurology, 62, 925-31). 전술된 NFTs의 선택적인 분포는 AD-타입 치매 증후군의 전형적인 계층적 신경심리학적 (neuropsychological) 프로파일과 일치한다 (Serrano-Pozo et al. 2011 Cold Spring Harb Perspect Med., 1, a006189).
알츠하이머병 (AD)에서, 과인산화되고 비정상 접힘 (misfolded) 타우의 축적은 뉴런의 소마, 수상돌기 및 액손에서 일어난다. 신경원섬유 매듭 (Neurofibrillar tangles) (NFTs)은 소마에서 응집된 타우와 연관되고, 해마, 내후각 피질 및 등피질의 층의 중간-크기 원추형 뉴런에서 원칙적으로 확인된다. 신경망 실 (Neuropil threads) (Braak et al. 1986 Neurosci Lett., 65, 351-5)은 작고, 세분화된, 길고 복잡한 과정이고, 세포체 사이에서 만들어진다. 이들 길고 복잡한 섬유 (Duyckaerts et al. 1989 Neuropathol Appl Neurobiol., 15, 233-47)는 매듭-함유 뉴런의 수상 돌기에 축적되는 PHFs를 함유한다 (Braak and Braak 1988 Neuropathol Appl Neurobiol., 14, 39-44). 신경망 실은 AD에서 신경원섬유 매듭을 언제나 수반하고, 신경원섬유의 퇴하의 초기 단계에서 나타난다 (Braak et al. 1994 Acta Neuropathol., 87, 554-67). 마지막으로, 또 다른 타우 병변인: 과인산화 타우를 함유하는 이영양성 신경돌기 (dystrophic neurites)는 신경염 플라크 (neuritic plaques) 주변에서 확인된다. 이들은 주로 이중나선 필라멘트 (PHF)에 풍부한 축삭돌기 과정 (axonal processes)으로 구성된다 (Kidd 1964 Brain, 87, 307-20). 흥미롭게도, 이영양성 신경돌기는 또한 아밀로이드 전구체 단백질 (APP), 미토콘드리아 포린 및 크로모그래닌-A (chromogranin-A)에 대하여 면역반응성이 있을 수 있다 (Su et al. 1998 Acta Neuropathol., 96, 463-71; Dickson et al. 1999 Exp Neurol., 156, 100-10; Woodhouse et al. 2006 Acta Neuropathol., 112, 429-37; Perez-Gracia et al. 2008 Acta Neuropathol., 116, 261-8).
알츠하이머병 (AD)을 제외하고, 소위 타우병증으로 불리는 연관 신경퇴행성 질병의 부류는 또한 타우-함유 신경원섬유 매듭의 침착을 특징으로 한다. 이들은 타우 돌연변이에 의해 유발된 크로모좀 17 (FTDP-17)에 연관된 파킨슨병을 갖는 진행성 핵성마비 (PSP; Steele-Richardson-Olszewski disease), 피질기저핵 변성 (CBD), 픽 병 (Pick's disease) (PD), 전측두엽 (frontotemporal) 치매를 포함한다. 이들 타우병증의 모든 것들 중에서, 신경원섬유 병리학은 비정상적으로 과인산화 타우로 구성되고, 신경피질에서 이들 병리학적 변화는 치매와 연관된다. 다른 타우 응집체 및 필라멘트는 다른 조성물의 타우 아이소폼 (타우 3R 또는 4R)에 의해 발생된, 다른 질병에 존재할 수 있다. 예를 들어, 픽 병에서, 대부분의 타우는 제2 미세소관 결합 반복 (R2)의 유전암호를 지정하는 엑손 10의 배제에 기인하는 3R 아이소폼이다. 반대로, CBD 및 PSP에서, 대부분의 타우는 4R이다 (Morris et al. 1999 Mov Dis., 14, 731-6; Sergeant et al. 2005 Biochim Biophys Acta., 1739, 179-197; Yoshida 2006 Neuropathology, 26, 457-470; Liu and Gong 2008 Mol Neurodegener., 3, 8; Zhong et al. 2012 J Biol Chem., 287, 20711-9; Avila et al. 2013 Aging Dis., 4, 23-8; Iqbal et al. 2013 Front Neurol., 4, 112).
생체 내에서 아밀로이드 플라크 및 타우 병변의 검출은 알츠하이머병 (AD) 및 다른 타우병증의 초기 진단을 수행하고, 치료의 영향을 후속 조치하는데 중요하다. 이들 병변의 최근 검출은 이들 변화에 대한 우수한 친화성 및 특이성을 갖는 분자에 기초한다. 지금까지, 인간에서, 양전자 방사 단층 촬영 (positron emission tomography) (PET) 및 자기공명 영상 (magnetic resonance imaging) (MRI)은 아밀로이드 플라크의 가시화를 가능하게 한다. 그러나, 생체 내 영상 모달리티 (imaging modalities)에 사용된 대다수의 화합물은 타우 병변을 결합하지 않는다. 따라서, 특정 타우 영상제 (imaging agents)를 개발할 필요가 있다. 최근에, Maruyama 등은 [11C]-PBB3-PET을 사용하여 AD 환자에서 생체 내에서 타우 병변을 가시화하는 가능성을 입증하였다 (Maruyama et al. 2013 Neuron., 79, 1094-108). 그럼에도 불구하고, 화합물을 방사성 동위원소를 이용하여 식별할 필요 및 낮은 공간 해상도는 PET-계 방법의 주요 단점으로 여전히 남아있다. 정반대로, MRI는 훨씬 더 높은 공간 해상도를 가지며, 동물 및 환자 영상용으로 널리 이용 가능하다. 그렇긴 하지만, MRI의 낮은 민감도는 환자에서 NFTs를 검출할 수 있는 전용 조영제 (contrast agents)의 개발을 요구한다.
종래의 면연글로불린은 약 150 kDa의 조합 분자량을 가진 두 개의 중쇄 및 두 개의 경쇄로 구성되는 이종사량체 (heterotetramer)이다. 낙타과 동물 (family Camelidae)의 일원 중에서, 상당 비율의 혈청 항체는 약 80 kD의 분자량을 갖는 동종이량체 (homodimeric) IgGs이다 (Hamers-Casterman et al. 1993 Nature, 363, 446-448). 이들 중쇄 면역글로불린 (Ig)은 세 개의 도메인을 함유하며, 이들의 가변 영역은 VHH라 칭한다. 재조합 VHHs (~12-14 kD의 크기)는 온전한 항원-결합 도메인을 구성하고, 광범위한 항원-결합 레퍼토리 (repertoire)를 나타낸다. 이들의 고가변성 영역은 확장되고, 더 친수성인 아미노산에 의하여 (종래의 항체에서 VL과 상호작용하는) 3 내지 4개의 소수성 골격 잔기들 (framework residues)의 치환과 같은, 독특한 특징을 나타낸다. 확장된 CDRs를 안정화시키기 위하여, VHHs는, 기본 디설파이드 결합 (disulfide bond)에 부가적으로, 단봉낙타에서 CDR1과 CDR3 사이 및 라마에서 CDR2와 CDR3 사이에서 추가적인 디설파이드 결합을 보유할 수 있다 (Harmsen and De Haard 2007 Appl Microbiol Biotechnol., 77, 13-22; Muyldermans 2001 J Biotechnol.,74, 277-302). 종래의 파라토프 (paratopes)는 오목 또는 편평한 구조로 제한되는 반면, 확장된 CDR3 루프는 볼록 형태를 취할 수 있다 (Muyldermans 2001 J Biotechnol., 74, 277-302). 이들 특색은 VHHs가 종래의 항체에 대해 불충분한 면역원성이 있는 특이한 에피토프 (unique epitopes)를 인지하는 것을 가능하게 한다 (Lafaye P. et al., 2009, Mol Immuno., 46:695-704; Wernery 2001, J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health., 48,561-568). 비록 VHHs가, 기본적으로 어떤 결합력 효과 (avidity effect)를 배제하는, 정의상 일가 항체일지라도, IC50 시험관 내에서 측정된 이들의 생물학적 활성은 종래의, 이가 항체 분자와 유사할 수 있다 (Thys et al. 2010 Antiviral Res., 87, 257-264).
파지 디스플레이 (phage display)와 같은 방법은, 면역된 낙타 또는 라마의 VHH 레퍼토리로부터 항원-특이적 VHH를 선택하기 위해 기재되어 왔다. VHH 유전자는 파지 디스플레이 벡터에서 복제되며, 항원 바인더는 패닝 (panning)에 의하여 획득되고 선택된 VHH는 박테리아 내에서 발현된다. 재조합 VHHs는 종래의 항체 단편 (Fab 또는 scFv)과 비교하여 다수의 장점을 갖는데, 이는 오직 하나의 도메인이 복제되어야 하고, 이들 VHHs가 잘 발현되며, 수성 환경에서 높은 용해성이고, 고온에서 안정하기 때문이다. 약 12-14　kDa인 이들의 작은 크기 때문에, VHHs는 약 60 kDa의 컷오프 (cutoff)를 갖는, 신장 필터 (renal filter)를 신속하게 통과하여, 빠른 혈액 정화 (blood clearance)를 결과한다. 부가적으로, 작은 크기는 빠른 조직 침투 (tissue penetration)를 가능케 한다. scFv에 대해 4시간 및 IgG에 대해 50시간과 비교하여, 약 2시간의 VHH의 짧은 혈청 반감기는, 사람들이 비특이적으로 결합된 VHH가 조직으로부터 빠르게 제거될 것으로 예상할 수 있음에 따라, 영상을 이용하는 생체내 진단 및 장애를 치료하기 위한 관심 물질에 결합된 VHHs의 표적화에 대해 장점이 있다. 더욱이, 적어도 8.5의 등전점 (isoelectric point)을 갖는 VHH는 미소음 세포 활동 (micropinocytosis) 및 흡수 매개 엔도시토시스 (endocytosis)에 의해 BBB (Blood-Brain Barrier: 혈액-뇌 장벽)를 가로질러 이주할 수 있다. 이러한 VHH는 관심 물질을 포유동물 혈액-뇌 장벽을 가로질러 운반하기 위한 펩티드 벡터의 제조를 위해 사용될 수 있다 (국제출원 WO 2009/004495 및 WO　2010/004432).
본 발명으로 이어지는 연구조사의 틀 내에서, 본 발명자들은 인산화된-타우 (인산-타우, 인-타우 또는 p-타우) 풍부 알츠하이머병 뇌 (해마 (hippocampal)) 추출물 및 인산-타우 단백질로 향하는 두 개의 알파카 (Lama pacos)를 면역화시켰다. VHHs 표적 인산-타우는 파지 디스플레이 라이브러리 구축 및 패닝에 의해 동정되었다. 박테리아 발현 이후에, 선택된 VHHs는, 신경병리학적으로-확인된 AD 또는 다른 타우병증에 걸린 인간의 경우로부터 및 매듭 병증이 잠복하고 있는 형질전환 마우스 모델에서 얻은 뇌 절편에 대해 시험되기 전에, p-타우 에피토프에 대한 면역블럿팅 및 ELISA에 의해 스크린되었다. 본 발명자들은, AD 인간 뇌 샘플뿐만 아니라 돌연변이된 타우 형질전환 마우스에서 소마 매듭, 신경망 실 및 이영양성 신경돌기를 면역표지한, Tau-A2 또는 A2라 칭하는, VHH을 확인하였다. 부가적으로, VHH Tau-A2는 다른 타우병증, 전측두엽 치매, 피질기저핵 변성 및 진행성 핵성마비에서 신경교의 p-타우 함유물의 검출을 가능하게 한다. 이 VHH Tau-A2는 아미노산 서열 SEQ ID NO. 1의 CDR1 (상보적인 결정 영역 1), 아미노산 서열 SEQ ID NO. 2의 CDR2 및 아미노산 서열 SEQ ID NO. 3의 CDR3을 포함하는 아미노산 서열 SEQ ID NO. 4를 갖는다. VHH Tau-A2는 C-말단 타우 인산-펩티드에서 인산화 세린 (phosphorylated serine) 422 (pS422)을 특이적으로 인지한다. 더욱이, 상자성체 제 (paramagnetic agent) 가돌리늄 (Gd) 또는 Alexa Fluor 488 형광체 (fluorophore)로 VHH Tau-A2의 표지는 부위-특이적 연결 접근법을 사용하여 수행되어, 기능적으로 유효한 VHH 콘쥬게이트를 결과한다. 형광 VHH Tau-A2의 정맥 투여 후에, 생 (live) 이-광자 현미경 관찰은 매듭에 대한 예민한 향성 (exquisite tropism)을 갖는 뇌 유조직 (brain parenchyma)에서 침투 및 혈관으로부터 VHH Tau-A2의 점진적 혈관외유출 (extravasation)을 보였다.
따라서, 본 발명은, 인산화 타우 단백질로 향하는, 바람직하게는 인산화 타우 단백질의 인산화 세린 422로 향하는 것을 특징으로 하는, 낙타과 동물의 중-쇄 항체 (camelid heavy-chain antibody)의 분리된 가변 도메인 (VHH이라 한다)을 제공한다.
여기에 사용된 바와 같은, 타우 단백질은 타우 단백질의 잘 알려진 6개 아이소폼 (Goedert et al. 1989 Neuron, 3, 519-26; Him㎖er et al. 1989 Mol Cel Biol., 9, 1381-8), 바람직하게는 4R 아이소폼과 관련이 있다.
바람직한 구체 예에서, 본 발명의 VHH는 서열 CSIDMVDS(PO3H2)PQLATLAD (SEQ ID NO. 6)의 타우 단백질의 C-말단으로부터 유래된 단일-인산-펩티드 (single phospho-peptide) 또는 사람에서 얻은 인산-타우 풍부 알츠하이머병 뇌 (바람직하게는 해마) 추출물 또는 인산화 타우 단백질의 세린 422가 인산화된, 인산화 타우 단백질과 같은 인산화 타우 단백질로, 바람직하게는 서열 CSIDMVDS(PO3H2)PQLATLAD (SEQ ID NO. 6)의 타우 단백질의 C-말단으로부터 유래된 단일 인산-펩티드로 낙타과 동물을 면역화시키는 방법에 의해 얻어질 수 있다.
전술한 특색에 부가적으로, 본 발명은, 본 발명을 예시하는 실시 예뿐만 아니라 첨부된 도면을 참조하여, 하기 상세한 설명으로부터 드러나는 다른 특색을 더욱 포함한다.
도 1은 인산-타우 및 타우 단백질에 대한 Inti 및 Rascar 혈청 (sera)의 결합을 나타낸다. 알파카 다클론성 (polyclonal) 항체는 토끼 항-알파카 항체로 검출된다.
도 2는 인산-타우, (탈인산화된) 타우 및 Ova-pS422 펩티드에 정제된 VHH Tau-A2의 결합을 나타낸다.
도 3은 다양한 타우병증: AD (도 3a), FTD (도 3b), PSP (도 3b) 및 PD (도 3c)을 갖는 경우로부터 인간 파라핀 절편 (paraffin sections) 상에 VHH Tau-A2 및 mAb AT8을 사용하는 NFTs의 면역조직화학적 염색 (immunohistochemical staining)을 나타낸다.
도 4는 Tg4510 마우스 자유-부유 절편 (free-floating sections) 상에 VHH Tau-A2 및 mAb AT8을 사용하는 NFTs의 면역조직화학적 염색을 나타낸다.
도 5는 VHH Tau-A2 및 Tau-pS422 mAb에 의해 밝혀진 AD 뇌 추출물 및 인산-타우 (p-tau)에 대한 웨스턴 블럿을 나타낸다. 레인 (Lane) 1 및 3: 각각 p-tau + Tau-A2 및 Tau-pS422 mAb. 레인 2 및 4: 각각 AD 추출물 + Tau-A2 및 Tau-pS422 mAb.
도 6은 말레이미도-DOTA/Gd)3 (화합물 1)의 고체-상 합성을 나타낸다.
도 7은 Tau-A2 및 이의 유도체의 생화학 및 조직학적 특징을 나타낸다. a: instantBlue 염색 SDS-PAGE 겔에 의한 VHH Tau-A2-SH (레인 1) 및 Tau-A2-S-AF488 (레인 2)의 단백질 프로파일 분석. b: 3-10 IEF 겔에 대한 NEPHGE에 의해 Tau-A2 유도체의 pi의 결정. c: Tg4510 파라핀 절편에 대한 Tau-A2-S-AF488에 의한 NFTs의 생체외 영상. VHH의 존재는 VHH로 향하는 토끼 다중클론 항체의 첨가에 의해 밝혀졌다. d: 음성 대조구: 토끼 항-VHH Tau-A2 만을 사용하는 TauPS2APP VHH 자유 파라핀 절편에 대한 IHC. e: Tg4510 자유 부유 절편 상에 피질에서 Tau-A2-S-AF488에 의한 NFTs의 직접 형광 염색. f: Tg4510 자유 부유 절편 상에 해마에서 Tau-A2-S-AF488에 의한 NFTs의 직접 형광 염색.
도 8은 8개월된 Tg4510 마우스에서 Tau-A2-S-AF488의 뇌 주사 이후에 NFTs의 생체 내 영상을 나타낸다. 화살표는 NFTs의 표지를 나타낸다. 스케일 바 = 50㎛.
도 9는 혈관 및 표지 NFTs로부터 확산하는 Tau-A2-S-AF488의 생체 내 이-광자 영상을 나타낸다. a: Tg4510 마우스의 피질 영역에 10mg/kg의 Tau-A2-S-AF488의 정맥 (IV) 주사 1분, 120분, 180분 이후에 형광의 최대 강도 투사. 오직 약한 비-특이 신호가 IV 주사 전에 검출될 수 있는 반면, 나무 모양의 혈관 (arborescent vessel)의 강한 염색은 IV 주사 (T1) 이후에 몇 초안에 관찰되었다. NFTs의 특이적 표지 (백색 화살표)는 120분 이후에 관찰되었으며, 180분 (3D 복원 (MIP)) 이후에 최대 강도를 갖는다. 실험은 2 마우스에서 수행되었다. b: Tau-A2-S-AF488의 IV 주사 다섯 시간 이후에, 뇌는 채취되었고, IHC는 5 ㎛-파라핀 절편 상에서 수행되었다. 토끼 다중클론 항-VHH 항체는 Tau-A2-S-AF488에 의해 NFTs의 표지 및 존재를 밝히기 위해 사용되었다.
도 10은 발현을 위한 Tau-A2-SH의 아미노산 서열의 최적화를 나타낸다. SEQ ID NO. 14의 Tau-A2-SH. SEQ ID NO. 17의 Tau-A2var-SH.
도 11은 Tau-A2 변이체의 생화학 및 조직학적 특징을 나타낸다. a: 일시적인 청색으로 염색된 SDS-PAGE 겔에 의한 VHH Tau-A2-SH (왼쪽) 및 Tau-A2var-SH (오른쪽)의 단백질 프로파일 분석. b: 3-10 IEF 겔 상에 NEPHGE에 의해 Tau-A2-SH (레인 1) 및 Tau-A2var-SH (레인 2)의 pI의 결정. c: 코팅된 인산-타우 단백질 상에 VHH Tau-A2-SH 및 VHH Tau-A2var-SH의 ELISA 결합. 음성 대조구는 관련 없는 VHH를 사용하여 수행되었다. VHH 결합은 과산화효소로 표지된 항-마우스 항체에 의해 밝혀진 마우스 항-His tag mAb의 부가에 의해 밝혀졌다. d: Tg4510 마우스에 대해 IHC에 의한 VHH Tau-A2-SH 및 VHH Tau-A2var-SH의 비교. VHH는 2 ㎍/㎖의 농도로 사용되었고, 이들의 존재는 과산화효소 표지된 항-마우스-Ig가 수반되는 항-His 마우스 mAb에 의해 밝혀진다.
도 12는 8개월된 Tg4510 마우스에서 Tau-A2var-S-(DOTA/Gd)3의 정맥 주사 이후에 NFTs의 생체 내 영상을 나타낸다. Tau-A2var-S-(DOTA/Gd)3의 IV 주사 4시간 후에, 뇌는 채취되고, IHC는 5 ㎛-파라핀 절편 상에서 수행되었다. 토끼 다중클론 항-VHH 항체는 Tau-A2var-S-(DOTA/Gd)3에 의한 NFTs의 표지 및 존재를 밝히기 위해 사용되었다.
인간으로부터 얻은 인산-타우 풍부 알츠하이머병 뇌 (바람직하게는 해마) 추출물은 Mercken et al. 1992 Acta Neuropathol., 84, 265-272에 기재된 대로 얻어질 수 있다.
유리하게, 본 발명의 VHH는:
(a) 서열 CSIDMVDS(PO3H2)PQLATLAD (SEQ ID NO. 6)의 타우 단백질의 C-말단으로부터 유래된 단일 인산-펩티드, 또는 인간으로부터 얻은 인산-타우 풍부 알츠하이머병 뇌 (바람직하게는 해마) 추출물 또는 인산화 타우 단백질의 세린 422가 인산화된 인산화 타우 단백질과 같은 인산화 타우 단백질로, 바람직하게는 서열 CSIDMVDS(PO3H2)PQLATLAD (SEQ ID NO. 6)의 타우 단백질의 C-말단으로부터 유래된 단일 인산-펩티드로, 낙타과 동물, 바람직하게는 알파카 (Lama pacos)를 면역화시키는 단계,
(b) 면역화된 낙타과 동물의 말초 임파구를 분리하는 단계, 전체 RNA를 얻는 단계 및 상응하는 cDNAs를 합성하는 단계 (이들 방법은 기술분야에서 알려짐; 예를 들어 Lafaye et al. 1995 Res Immunol., 146, 373-82; Erratum in: 1996, Res Immunol., 147, 61 참조),
(c)　VHH 도메인을 인코딩하는 cDNA 단편의 라이브러리를 구축하는 단계,
(d)　단계 (c)에서 얻은 VHH-인코딩 cDNAs를 PCR을 사용하여 mRNA로 전사하는 단계, 상기 mRNA를 리보솜 디스플레이 포맷 (ribosome display format)으로 전환하는 단계, 및 리보솜 디스플레이에 의해 VHH 도메인을 선택하는 단계, 및
(e)　상기 VHH 도메인을, 예를 들어, 적절한 벡터가 pET22 (Novagen, Cat. No. 69744-3)인, 벡터에서 발현시키는 단계, 및 선택적으로 발현된 VHH 도메인을 정제하는 단계를 포함하는 방법에 의해 얻어질 수 있다.
상기 방법의 바람직한 구체 예에서, 단계 (a)에서, 상기 낙타과 동물은 500 ㎍의 서열 CSIDMVDS(PO3H2)PQLATLAD (SEQ ID NO. 6)의 펩티드 또는 사람으로부터 얻은 인산-타우 풍부 알츠하이머병 뇌 (바람직하게는 해마) 추출물 또는 인산화 타우 단백질의 세린 422가 인산화된 인산화 타우 단백질로 0, 21 및 40일에 면역화시킨다. 결합된 낙타과 동물의 항체는 다중클론 토끼 항-낙타과 IgG (예를 들어, Muyldermans 1994 Protein Eng., 7, 1129-35 참조) 및 서양고추냉이 과산화효소-표지된 염소 항-토끼 항체로 검출될 수 있다.
상기 방법의 또 다른 바람직한 구체 예에서, 단계 (c)에서, 상기 라이브러리는 상기 VHH 도메인을 인코딩하는 DNA 단편을 PCR에 의해 증폭시키고, 및 파지 벡터 (적절한 파지 벡터의 예로는 pHEN이다; Hoogenboom et al. 1992 J Mol Biol., 227, 381-8)로 얻어진 PCR 산물을 결찰 (ligating)시켜 구축될 수 있다.
상기 단계 (c)의 특정 구체 예에서, VHH 도메인을 인코딩하는 DNA 단편은 서열 SEQ ID NO. 7 (CH2FORTA4로 지정) 및 SEQ ID NO. 8 (VHBACKA6로 지정)의 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭되고, 증폭된 산물은 서열 SEQ ID NO. 9 (VHBACKA4로 지정) 및 SEQ ID NO. 10 (VHFOR36로 지정)의 프라이머를 사용하여 2회전의 PCR에 적용된다. 이러한 방법은 국제 PCT 출원 WO 2004/044204호에 기재되었다.
리보좀 디스플레이 기술은 이를 인코딩하는 mRNA와 함께 단백질의 시험관 내 선택을 가능하게 한다. 특정 단백질, 예를 들어, VHH 단편에 대한 DNA 라이브러리 코딩은 시험관 내에서 전사된다. mRNA는 정제되고, 시험관 내에서 변역을 위해 사용된다. mRNA가 정지 코돈 (stop codon)이 없음에 따라, 리보좀은 mRNA의 말단에서 지연되고, mRNA, 리보좀 및 기능성 단백질의 3원 복합체를 발생시킨다 (Hanes and Plucktum 1997 Proc Natl Acad Sci U.S.A., 94, 4937-42). 이들 3원 복합체의 라이브러리는 잠재적 리간드에 대하여 (항체의 경우에서, 항원에 대하여) 시험된다. 리간드에 3원 복합체 (리보좀, mRNA, 단백질)의 결합은 이에 연결되고, 역전사효소-PCR (RT-PCR)에 의해 cDNA로 전사될 수 있는, 인코딩 mRNA의 복구를 가능하게 한다. 선택 및 복구의 사이클은 드문 리간드-결합 분자를 풍부하게 하고, 우수한 친화력을 갖는 분자를 선택하기 위해 반복될 수 있다. 리보솜 디스플레이 선택을 위한 방법은 기술분야에서 알려져 있다; 예를 들어, Mouratou et al. 2007 Proc Natl Acad Sci U.S.A., 104, 17983-8 참조.
본 발명의 VHH의 바람직한 구체 예에서, 이의 아미노산 서열은, N-말단에서 C-말단으로, (VHH의 CDR1에 상응하는) 아미노산 서열 SEQ ID NO. 1, (CDR2에 상응하는) 아미노산 서열 SEQ ID NO. 2 및 (CDR3에 상응하는) 아미노산 서열 SEQ ID NO. 3을 포함한다.
좀 더 바람직한 구체 예에서, 상기 VHH는:
- VHH Tau-A2의 전체-길이 형태에 상응하는, SEQ ID NO. 4, 또는
- VHH Tau-A2의 짧은 형태에 상응하는, SEQ ID NO. 5의 아미노산 서열로 이루어진다.
여기에 사용된, 용어 "분리된 (isolated)"은 VHH가 이의 천연 환경의 구성분으로부터 분리된 것을 의미한다. 몇몇 구체 예에서, VHH는, 예를 들어, 전기영동 (예를 들어, SDS-PAGE, 등전점 전기영동 (IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피 (예를 들어, 겔 여과, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의하여 결정된 것으로, 95% 초과 또는 99% 초과의 순도로 정제된다. 항체 순도의 평가를 위한 방법을 검토하기 위해, 예를 들어, Flatman et al. 2007 J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci., 848, 79-87.을 참조한다.
여기에 사용된 바와 같은, 용어 "VHH"는 낙타과 동물 (낙타, 단봉낙타, 라마, 알파카 등)의 중쇄 항체로부터 얻은 가변 항원-결합 도메인을 의미한다 (See Nguyen et al. 2000 EMBO J., 19, 921-930; Muyldermans 2001 J Biotechnol., 74, 277-302 and for review Vanlandschoot et al. 2011 Antiviral Res. 92, 389-407 참조). VHH는 또한 나노바디 (Nb)로도 불릴 수 있다.
유리하게는, 본 발명에 따른 VHH는 염기성 등전점 (isoelectric point) (pI), 바람직하게는 8.5 내지 10.5, 좀 더 바람직하게는 9.5 내지 10.5를 갖는다.
본 발명은 상기에서 정의된 천연, 재조합 또는 합성 VHHs를 포괄한다.
여기에 사용된 바와 같은, 용어 "재조합"은 상기 VHH를 생산하기 위한 유전공학적 방법 (클로닝, 증폭 (amplification))의 사용을 의미한다.
여기에 사용된 바와 같은, 용어 "합성"은 시험관 내에서 화학적 및/또는 효소적인 합성에 의하여 상기 VHH를 생산하는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 VHH는 단량체, 또는 동종이량체 또는 동종삼량체와 같은 동종다량체의 형태일 수 있다.
본 발명은 또한 서열 CSIDMVDS(PO3H2)PQLATLAD (SEQ ID NO. 6)의 타우 단백질의 C-말단으로부터 유래된 단일 인산-펩티드, 또는 인간으로부터 얻은 인산-타우 풍부 알츠하이머병 뇌 (바람직하게는 해마) 추출물, 또는 인산화 타우 단백질의 세린 422가 인산화된 인산화 타우 단백질과 같은 인산화 타우 단백질로, 낙타과 동물을 면역화시키는 단계를 포함하는, 바람직하게는 전술된 바와 같은 단계 (a) 내지 (e)를 포함하는, 전술된 바와 같은 인산화 타우 단백질로 향하는 VHH를 얻기위한 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 VHH를 포함하는, 분리된 낙타과 동물의 혈청, 바람직하게는 알파카의 혈청을 제공한다.
본 발명은 또한 SEQ ID NO. 5의 VHH Tau-A2의 분리된 변이체를 제공하고, 여기서 상기 VHH 변이체는 전술된 바와 같은 인산화 타우 단백질의 인산화 세린 422로 향하며, 여기서 상기 변이체의 아미노산 서열은 아미노산 서열 SEQ ID NO: 5와 적어도 95% 상동성 (identity), 또는 보다 우선적으로 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성을 갖는다.
특별한 언급이 없는 한, 여기에 언급된 두 서열 사이의 상동성의 퍼센트는 이들 전체 길이에 걸친 두 서열의 배열로부터 계산된다.
상기 변이체의 바람직한 구체 예에서, 이의 아미노산 서열은, N-말단으로부터 C-말단으로, 아미노산 서열 SEQ ID NO. 1, 아미노산 서열 SEQ ID NO. 2 및 아미노산 서열 SEQ ID NO. 3을 포함한다.
또 다른 바람직한 구체 예에서, 상기 변이체는 하기 돌연변이를 갖는 아미노산 서열 SEQ ID NO. 5를 갖는다:
- 아미노산 서열 SEQ ID NO. 5의 위치 3에서 글루타민 잔기 (Gin, Q)가 아스파르트산 (Asp, D) 및 글루타민산 (Glu, E)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기, 바람직하게는 Glu로 치환된 돌연변이,
- 아미노산 서열 SEQ ID NO. 5의 위치 52에서 이소루신 잔기 (Ile, I)가 알라닌 (Ala, A) 및 글리신 (Gly, G)으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기, 바람직하게는 Gly로 치환된 돌연변이,
- 아미노산 서열 SEQ ID NO. 5의 위치 86에서 발린 잔기 (Val, V)가 알라닌 (Ala, A), 세린 (Ser, S), 트레오닌 (Thr, T), 아스파라긴 (Asn, N), 글루타민 (Gin, Q), 아스파르트산 (Asp, D), 글루탐산 (Glu, E), 리신 (Lys, K), 알기닌 (Arg, R) 및 글리신 (Gly, G)으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기, 바람직하게는 Gly로 치환된 돌연변이,
- 및 선택적으로 두 개의 아미노산 잔기가 아미노산 서열 SEQ ID NO. 5의 N-말단 위치에 첨가되고, 디펩티드 글루탐산-발린 (E-V) 및 아스파르트산-발린 (D-V)으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 바람직하게는 D-V인 된 돌연변이.
특정 구체 예에서, 상기 VHH 변이체는 아미노산 서열 SEQ ID NO: 15로 이루어진다.
또 다른 특정 구체 예에서, 상기 VHH 변이체는 아미노산 서열 SEQ ID NO: 16으로 이루어진다 (이 VHH 변이체는 아미노산 서열 SEQ ID NO. 5와 비교하여 N-말단 위치에 첨가된 디펩티드를 포함하지 않는다).
본 발명은 또한 폴리펩티드에 포함된 VHH 또는 VHH 변이체가 인산화 타우 단백질, 바람직하게는 인산화 타우 단백질의 인산화 세린 422를 결합할 수 있다는 전제하에서, 본 발명에 따른 VHH 또는 VHH 변이체 (바람직하게는 SEQ ID NO. 15의 VHH 변이체)를 포함하는 폴리펩티드로 이루어진 VHH 유도체를 제공한다.
또 다른 특정 구체 예에서, 상기 VHH 유도체는 화학식 P-C-Z 또는 Z-C-P, 바람직하게는 P-C-Z을 갖는다, 여기서:
- P는 본 발명에 따른 VHH 또는 VHH 변이체로 이루어지거나 또는 포함하는 100-500, 바람직하게는 100-150 아미노산 펩티드이고, 여기서 상기 아미노산 서열은 감소된 시스테인 잔기가 없고, 바람직하게는 감소된 시스테인 잔기가 없으며,
- C는 시스테인 잔기이고,
- Z는 1-10 아미노산 스페이서 (spacer), 바람직하게는 1-10 중성 또는 음전하를 띠는 아미노산 스페이서이며, 여기서 Z의 아미노산 잔기는 같거나 다르고, 여기서 Z는 시스테인 잔기를 함유하지 않는다.
본 발명의 관점에서, "접근 가능한 감소된 시스테인 잔기가 없는"은 본 발명에 따라 정의된 바와 같은 콘쥬게이션 (conjugation) 단계에 접근 가능하지 않는 시스테인 잔기를 의미한다.
바람직한 구체 예에서, VHH 유도체는 화학식 P-C-Z 또는 Z-C-P, 바람직하게는 P-C-Z를 가지며, 여기서:
- P는 접근 가능한 감소된 시스테인 잔기가 없고, 바람직하게는 감소된 시스테인 잔기가 없는 100 내지 500, 바람직하게는 100-150인 아미노산 펩티드이고,
- C는 시스테인 잔기이며,
- Z는:
a) 2-10 아미노산 스페이서, 바람직하게는 2 아미노산 스페이서, 여기서 Z의 아미노산은 세린 (S), 알라닌 (A), 발린 (V) 및 글리신 (G)으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 좀 더 바람직하게는 세린 (S), 알라닌 (A) 및 발린 (V)으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 Z의 적어도 두 개의 아미노산 잔기는 다르며, 또는
b) 2-10 아미노산 스페이서, 바람직하게는 2-10 중성 또는 음전하를 띠는 아미노산 스페이서, 여기서 Z는 디펩티드 세린-알라닌 (S-A) 또는 세린-발린 (S-V)를 포함하고, 여기서 Z는 시스테인 잔기를 함유하지 않는다.
유리하게, 상기 시스테인 잔기 C는 입체구조적으로 접근 가능하다.
유리하게, 상기 아미노산 스페이서 Z의 아미노산 잔기는, 알라닌, 발린, 세린, 루신, 이소루신, 페닐알라닌, 글리신, 세린, 트레오닌, 티로신, 아스파라긴, 및 글루타민으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 알라닌, 발린 및 세린이다.
유리하게, Z가 a)에서 정의된 바와 같은 경우, 아미노산 스페이서 Z는 1 또는 적어도 1 세린을 포함하고, 좀 더 유리하게, 아미노산 스페이서 Z는 세린 및 알라닌 잔기만으로 또는 세린 및 발린 잔기 만으로 이루어진다.
이 VHH 유도체의 바람직한 구체 예에서, 상기 아미노산 스페이서 Z는 아미노산 서열 S-A 또는 S-V와 같은, 2 아미노산 서열로 이루어진다.
화학식 P-C-Z의 VHH 유도체의 아미노산 서열 P는 이의 C-말단에서 1 내지 10개의 아미노산 스페이서 Y를 갖고, 바람직하게는 1 내지 10개의 중성 또는 음전하를 띠는 아미노산 스페이서를 가지며, 여기서 상기 아미노산 스페이서 Y의 아미노산 잔기는 같거나 다르며, 상기 아미노산 스페이서 Y는 시스테인 잔기를 함유하지 않는다.
화학식 Z-C-P의 VHH 유도체의 아미노산 서열 P는 이의 N-말단에 1 내지 10개의 아미노산 스페이서 Y를 갖고, 바람직하게는 1 내지 10개의 중성 또는 음전하를 띠는 아미노산 스페이서를 가지며, 여기서 상기 아미노산 스페이서 Y의 아미노산 잔기는 같거나 다르며, 상기 아미노산 스페이서 Y는 시스테인 잔기를 함유하지 않는다.
유리하게, 상기 아미노산 스페이서 Y의 아미노산 잔기는, 알라닌, 발린, 세린, 루신, 이소루신, 페닐알라닌, 글리신, 세린, 트레오닌, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민, 바람직하게는 알라닌, 발린, 세린 및 글리신으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, 상기 아미노산 스페이서 Y는 아미노산 서열 G-G-G-S (SEQ ID NO. 11)와 같은, 4개의 중성 아미노산 스페이서를 나타낸다.
화학식 P-C-Z의 VHH 유도체의 아미노산 서열 P는 또한 이의 N-말단에 1 내지 50개의 아미노산 서열 X를 가질 수 있으며, 여기서 상기 아미노산 서열 X의 아미노산 잔기는 같거나 다르며, 상기 아미노산 서열 X는 시스테인 잔기를 함유하지 않는다.
화학식 Z-C-P의 VHH 유도체의 아미노산 서열 P는 또한 이의 C-말단에서 1 내지 50개의 아미노산 서열 X를 가질 수 있으며, 여기서 상기 아미노산 서열 X의 아미노산 잔기는 같거나 다르며, 상기 아미노산 서열 X는 시스테인 잔기를 함유하지 않는다.
상기 아미노산 서열 X는 6xHis 태그 (tag) (SEQ ID NO. 12)와 같은 태그 및 아미노산 서열 LVPRGS (SEQ ID NO. 13)의 트롬빈 절단 부위 (cleavage site)와 같은 효소 절단 부위를 포함할 수 있다.
바람직한 구체 예에서, 본 발명에 따른 VHH 유도체는 화학식 P'-C-Z, P'-Y-C-Z, X-P'-C-Z, X-P'-Y-C-Z, Z-C-P', Z-C-Y-P', Z-C-P'-X, 또는 Z-C-Y-P'-X를 가지며, 여기서 P'은 본 발명에 따른 VHH 또는 VHH 변이체이다.
본 발명은 또한 전술된 바와 같은 화학식 P-C-Z 또는 Z-C-P, 바람직하게는 P-C-Z의 분리된 올리고펩티드를 제공한다.
유리하게, 상기 VHH 유도체는, N-말단으로부터 C-말단으로, 6xHis 태그와 같은 아미노산 태그, 트롬빈 절단 부위와 같은 효소 절단 부위, 본 발명에 따른 VHH 또는 VHH 변이체, 아미노산 스페이서, 시스테인 및 제2 아미노산 스페이서를 포함한다. 이러한 VHH 유도체들은 화학식 X-P'-Y-C-Z의 VHH 유도체에 상응하고, 여기서 P'는 VHH 또는 VHH 변이체이다.
바람직한 구체 예에서, 상기 VHH 유도체는 아미노산 SEQ ID NO. 14 (Tau-A2-SH)을 갖는다.
또 다른 바람직한 구체 예에서, 상기 VHH 유도체는 아미노산 서열 SEQ ID NO. 17 (Tau-A2var-SH)을 갖는다. 이 VHH 유도체는 본 발명에 따른 SEQ ID NO. 15의 VHH 변이체를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른, VHH, 또는 VHH 변이체 또는 VHH 유도체를 인코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 재조합 DNA 기술 및/또는 화학적 DNA 합성의 잘-알려진 방법에 의하여 얻어질 수 있다.
본 발명은 또한 숙주 세포 내에서 폴리뉴클레오티드의 전사 조절을 가능케 하는 전사 프로모터의 제어하에서 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 카세트 (recombinant expression cassette)를 제공한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 또한 숙주 세포 내에서 이의 번역 조절을 가능케 하는 서열을 적절하게 조절하기 위해 연결될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터 (예를 들어, 재조합 발현 벡터)를 제공한다. 유리하게, 상기 재조합 벡터는 본 발명에 따른 발현 카세트를 포함하는 재조합 발현 벡터이다.
여기에 사용된 바와 같은, 용어 "벡터"는 그것이 연결된 또 다른 핵산으로 증식가능한 핵산분자를 의미한다. 상기 용어는 자기-복제 가능한 핵산 구조로서 벡터뿐만 아니라, 이것이 도입된 숙주 세포의 게놈으로 도입된 벡터를 포함한다. 어떤 벡터는 이들이 작동적으로 연결된 핵산의 발현에 관여할 수 있다. 이러한 벡터는 여기서 "발현 벡터"라고 지칭한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 재조합 발현 카세트 또는 재조합 벡터를 함유하는 숙주 세포를 제공한다. 상기 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 숙주 세포이다.
상기 용어 "숙주 세포"는 외인성 (exogenous) 핵산이 도입된 세포를 의미하며, 이들 세포의 번식체 (progeny)를 포함한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함하며, 이는 일차 형질전환된 세포 및 계대 수에 관계없이 이로부터 유래된 번식체를 포함한다. 번식체는 모세포와 핵산 조성이 완전히 동일하지 않을 수 있지만, 돌연변이를 함유할 수도 있다. 최초로 형질전환된 세포 내에서 선별되거나 또는 선택될 때 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 번식체도 여기에 포함된다.
아미노산 번호 SEQ ID NO. 4의 VHH Tau-A2를 발현하는 원핵 숙주 세포는 2014년 1월 16일에 Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), 28 rue du Dr Roux, 75724 Paris Cedex 15, France에 수탁번호 I-4835로 기탁되었다.
아미노산 서열 SEQ ID NO. 14의 VHH Tau-A2-SH를 발현하는 원핵 숙주 세포는 2014년 1월 16일에 Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), 28 rue du Dr Roux, 75724 Paris Cedex 15, France에 수탁번호 I-4836으로 기탁되었다.
아미노산 서열 SEQ ID NO. 17의 VHH Tau-A2var-SH (또한, Tau-A2-SH라 불린다)를 발현하는 원핵 숙주 세포는 2015년 1월 21일에 Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), 28 rue du Dr Roux, 75724 Paris Cedex 15, France에 수탁번호 I-4951로 기탁되었다.
본 발명은 또한 하기 단계들을 포함하여 본 발명에 따른 화학식 P-C-Z 또는 Z-C-P의 올리고펩티드를 전술된 바와 같은 숙주 세포에서 생산하기 위한 방법을 제공한다:
- 본 발명에 따른 재조합 발현 카세트 또는 재조합 벡터를 함유하는 숙주 세포를 제공하는 단계,
- 상기 숙주 세포를 배양하는 단계,
- 및 선택적으로 화학식 P-C-Z 또는 Z-C-P의 올리고펩티드를 정제하는 단계.
올리고펩티드를 정제하기 위한 방법은 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 침투 크로마토그래피 및 역상 크로마토그래피)와 같이, 기술분야에서 잘 알려져 있다.
본 발명은 또한 직접적 또는 간접적으로, 공유결합으로 또는 비-공유결합으로 관심 물질에 결합된, 본 발명에 따른 VHH 또는 VHH 유도체 (특히 전술된 바와 같은 화학식 P-C-Z 또는 Z-C-P의 VHH 유도체)를 포함하는 진단 또는 치료 시약을 제공한다.
본 발명에 따른 관심 물질은 포유동물 또는 인간 혈액-뇌 장벽을 침투할 수 있거나 또는 침투할 수 없다. 만약 관심 물질이 상기 혈액-뇌 장벽을 침투한다면, 본 발명에 따른 VHH 또는 VHH 유도체 (특히 전술된 바와 같이 화학식 P-C-Z 또는 Z-C-P의 VHH 유도체)의 사용은 관심 물질을 혈액-뇌 장벽을 가로질러 전달하는 것을 향상시킬 수 있다.
구체 예에서, 상기 관심 물질은 진단 또는 치료 화합물이다.
또 다른 구체 예에서, 상기 관심 물질은 진단 또는 치료 화합물을 포함하는 리포좀 또는 고분자체 (polymeric entity)이다 (Villaraza et al. 2010 Chem Rev., 110, 2921-2959).
유리하게, 상기 진단 화합물은:
- 서양고추냉이 과산화효소 (horseradish peroxidase), 알칼리성 인산화효소 (alkaline phosphatase), 글루코오스-6-인산화효소 또는 베타-갈락토시다아제와 같은 효소;
- 전자 검출수단 (CCD 카메라, 광전자배증관 (photomultipliers))으로 가시화될 수 있는, 녹색 형광 단백질 (GFP), 스펙트럼의 자외선 (UV) 부분의 파장에서 여기되는 청색 형광 염료 (예를 들어, AMCA (7-아미노-4-메틸쿠마린-3-아세트산); Alexa Fluor 350), 청색광에 의하여 여기되는 녹색 형광 염료 (예를 들어, FITC, Cy2, Alexa Fluor 488), 녹색광에 의하여 여기되는 적색 형광 염료 (예를 들어, 로다민 (rhodamines), Texas Red, Cy3, Alexa Fluor 염료 546, 564 및 594), 또는 원-적색광으로 여기되는 염료 (예를 들어, Cy5)와 같은 형광체 (fluorophore);
- PET 영상법에 사용될 수 있는 18F, 11C, 13N, 15O, 68Ga, 82Rb, 44Sc, 64Cu, 86Y, 89Zr, 124I, 152Tb 또는 SPECT/신티그라프 연구에 사용될 수 있는 67Ga, 81mKr, 99mTc, 111In, 123I, 125I, 133Xe, 201Tl, 155Tb, 195mPt, 또는 방사능 사진촬영 (autoradiography) 또는 인시튜 혼성화법 (in situ hybridisation)에 사용될 수 있는 14C, 3H, 35S, 32P, 125I, 또는 상기 화합물을 표지하는데 사용될 수 있는 211At-, 212Bi-, 75Br-, 76Br-, 131I-, 111In, 177Lu-, 212Pb-, 186Re-, 188Re-, 153Sm-, 90Y와 같은 방사성 동위원소;
- 가돌리늄 (Gd), 디스프로슘 (Dy) 및 망간 (Mn)인 상자성제 (paramagnetic agents), 및 (MION, SPIO 또는 USPIO와 같은) 산화철 또는 철 백금 (SIPP)에 기초한 초상자성제, 및 18F, 13C, 23Na, 17O, 15N와 같은 X-핵과 같은 NMR 또는 MRI 조영제;
- 금 나노입자 (B. Van de Broek et al., ACSNano, Vol. 5, No. 6, 4319-4328, 2011) 또는 양성자점 (A. Sukhanova et al., Nanomedicine, 8 (2012) 516-525)와 같은 나노입자로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직한 구체 예에서, 상기 진단 화합물은 형광체, 좀 더 바람직하게는 Alexa Fluor 488이거나, 또는 MRI 조영제, 좀 더 바람직하게는 가돌리늄이다.
상기 진단 시약이 검출에 사용되는 경우, 이는 신티그라프 연구용 방사성 원소, 예를 들어, 99Tc 또는 123I와 같은 방사성 원소, 또는 13C, 9F, Fe, Gd, 123I, 111In, Mn, 15N 또는 7O과 같은 핵자기공명 (NMR) 영상법 (또한 MRI로 알려짐)용 스핀 표지 (spin label)를 포함할 수 있다.
유리하게, 상기 치료 화합물은 펩티드, 효소, 핵산, 바이러스 및 화학 물질 (chemical entity)로부터 선택된다. 이것은 진통제 화합물, 항-염증제 화합물, 항우울제 화합물, 항경련제 화합물, 세포독성 (cytotoxic) 화합물 또는 항-신경퇴행성 (anti-neurodegenerative) 화합물일 수 있다.
전술된 바와 같은 관심 물질은 VHH, VHH 변이체 또는 VHH 유도체 (특히 전술된 바와 같은 화학식 P-C-Z 또는 Z-C-P의 VHH 유도체)의 말단부 (terminal ends) 중 하나 (N 또는 C 말단), 또는 상기 VHH, VHH 변이체 또는 VHH 유도체의 아미노산 중 하나의 측쇄에 본 발명에 따른 VHH, VHH 변이체 또는 VHH 유도체 (특히, 전술된 화학식 P-C-Z 또는 Z-C-P의 VHH 유도체)에 직접적으로 및 공유적으로 또는 비-공유적으로 결합될 수 있다. 상기 관심 물질은 상기 VHH, VHH 변이체 또는 VHH 유도체 (전술된 바와 같은 화학식 P-C-Z 또는 Z-C-P의 VHH 유도체)의 말단부 중 하나, 또는 상기 VHH, VHH 변이체 또는 VHH 유도체의 아미노산 중 하나의 측쇄에 스페이서의 수단에 의해 상기 VHH, VHH 변이체 또는 VHH 유도체에 간접적으로 및 공유적으로 또는 비-공유적으로 결합될 수 있다. 관심 물질을 펩티드, 특히 항체에 결합시키는 종래의 결합 방법은 기술분야에서 알려져 있다 (예를 들어, Ternynck and Avrameas, 1987, "Techniques immunoenzymatiques" Ed. INSERM, Paris; Hermanson, 2010, Bioconjugate Techniques, Academic Press)를 참조).
많은 화학적 교차-결합 방법은 또한 기술분야에서 알려져 있다. 교차-결합 제재 (reagents)는 동종이관능적 (homobifunctional) (즉, 동일한 반응을 수행하는 두 개의 작용기를 갖는 것)일 수 있으며, 또는 이종이관능적 (heterobifunctional) (즉, 두 개의 서로 다른 작용기를 갖는 것)일 수 있다. 다수의 교차-결합 제재가 상업적으로 구입 가능하다. 이들의 구체적인 사용법은 상업적인 공급자로부터 용이하게 입수할 수 있다. 폴리펩티드 교차결합 및 콘쥬게이트 제조에 대한 일반적인 문헌은: Wong, Chemistry of protein conjugation and cross-linking, CRC Press (1991)이다.
본 발명에 따른 VHH, VHH 변이체 또는 VHH 유도체 (특히 전술된 바와 같이 화학식 P-C-Z 또는 Z-C-P의 VHH 유도체)는 기술분야에서 알려진 일반적 유기 화학 기술을 사용하여 특정 방사성 동위원소 (radioisotopes) 또는 NMR 또는 MRI 조영제 또는 형광체 또는 나노입자 또는 효소로 표지될 수 있다. 예를 들어, March, J. ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY: REACTIONS, MECHANISMS, AND STRUCTURE (3rd Edition, 1985); Hermanson, 2010, Bioconjugate Techniques, Academic Press를 참조.
부가적으로, 본 발명에 따른 VHH, VHH 변이체 또는 VHH 유도체는 직접적으로 디아조늄 요오드를 통하여 디아조화된 아미노 유도체의 요오드화에 의하거나 (Greenbaum, 1936, F. Am. J. Pharm., 108:17를 참조), 또는 불안정한 디아조화된 아민을 안정한 트리아진으로 변환하는 것에 의하여, 또는 기술분야에서 잘 알려진 몇 가지 방법에 의해 요오드 화합물로 나중에 전환될 수 있는, 안정한 트리-알킬 주석 유도체로 비-방사성 할로겐화 전구체를 전환하는 것에 의하여, 131I, 125I, 또는 123I와 같은, 그러나 이에 제한되지 않는, 모든 적절한 방사성 요오드 동위원소로 표지될 수 있다. Satyamurthy and Barrio 1983 J Org Chem., 48, 4394; Goodman et al. 1984 J Org Chem., 49, 2322; Mathis et al. 1994 J Labell Comp Radiopharm., 905; Chumpradit et al. 1991 J Med Chem., 34, 877; Zhuang et al. 1994 J Med Chem., 37, 1406; Chumpradit et al. 1994 J Med Chem., 37, 4245를 참조.
특히, 본 발명에 따른 VHH, VHH 변이체 또는 VHH 유도체는 기술분야에서 알려진 몇 가지 기술 중 어떤 하나에 의하여 SPECT에 대하여 123I로 표지될 수 있다. 예를 들어, Kulkarni 1991 Int J Rad Appl Inst. (Part B) 18, 647을 참조.
본 발명에 따른 VHH, VHH 변이체 또는 VHH 유도체는 또한 Technetium-99m (99mTc)와 같은 알려진 금속 방사성 표지로 방사표지될 수 있다. 이러한 금속이온에 결합하는 리간드를 도입하기 위한 치환체의 변형은 방사성 표지 분야의 통상의 기술 중 하나로 과도한 실험 없이 효율적으로 수행될 수 있다. 본 발명에 따른 금속 방사표지된 VHH, VHH 변이체 또는 VHH 유도체는 그 후 신경원섬유 매듭, 신경망 실 또는 이영양성 신경돌기를 탐지하는데 사용될 수 있다. 99mTc의 방사표지된 유도체를 제조하는 것은 기술분야에서 잘 알려져 있다. 예를 들어, Zhuang et al. 1999 Nucl Med Biol., 26, 217-24; Oya et al. 1998 Nucl Med Biol., 25, 135-40; Horn et al. 1997 Nucl Med Biol., 24, 485-98를 참조.
본 발명은 또한 관심 물질 (기능성 콘쥬게이트 (functional conjugate))로 직접적 또는 간접적으로, 결합된 본 발명에 따른 VHH, VHH 변이체 또는 VHH 유도체 (특히 전술된 바와 같은 화학식 P-C-Z 또는 Z-C-P의 VHH 유도체)를 얻기 위한 결합 방법에 관한 것이다.
제1 전략에 따르면, 본 발명에 따른 VHH, VHH 변이체 또는 VHH 유도체는 비-부위 특이적인 접근법을 사용하여 관심 물질에 콘쥬게이트된다. 상기 비-부위 특이적인 방법은 본 발명에 따른 VHH, VHH 변이체 또는 VHH 유도체에 관심 물질의 콘쥬게이션 (conjugation) 단계를 포함한다.
관심 물질이 NMR 또는 MRI 조영제 (예를 들어, 가돌리늄 (Gd), 디스프로슘 (Dy) 및 망간 (Mn)인 상자성제, 및 산화철 또는 철 백금에 기초한 초상자성제, 및 18F, 13C, 23Na, 17O, 15N와 같은 X-핵), 또는 금속성 방사성 동위원소 (예를 들어, 90Y, 177Lu, 64Cu, 99mTc, 111In, 212Pb, 212Bi)와 같은, 금속인 경우, 상기 비-부위 특이적 방법은 킬레이트제를 실행하며, 하기 단계를 포함한다:
(i) 본 발명에 따른 VHH 또는 VHH 유도체의 리신 잔기로, 에스테르 또는 무수물의 형태로, 바람직하게는 에스터르 형태로 활성화된 킬레이트제의 콘쥬게이션 단계, 및
(ii) 관심 물질과 단계 (i)의 리간드의 킬레이팅 단계.
킬레이트제를 실행하는 비-부위 특이적 방법의 대안은 관심 물질이 킬레이트제로 "미리 킬레이트화되는" 방법이며, 이러한 방법은 하기 단계를 포함한다:
(i') 에스테르 또는 무수물의 형태로, 바람직하게는 에스테르 형태로 활성화된 킬레이트제로 관심 물질의 킬레이팅 단계, 및
(ii') 본 발명에 따른 VHH, VHH 변이체 또는 VHH 유도체의 리신 잔기로 단계 (i')의 사전-킬레이트화된 관심 물질의 콘쥬게이션 단계.
콘쥬게이션 단계 (i) 또는 (ii') 동안, 온도는 1 내지 40℃, 바람직하게는 4 내지 20℃로 변할 수 있다. 상기 용액은 1 내지 6시간 동안 교반될 수 있다. 바람직하게는, pH는 콘쥬게이션 단계 (i) 또는 (ii') 동안 7 내지 8.5로 유지된다.
상기 콘쥬게이션 단계 (i) 또는 (ii')은 이미다졸이 있거나 또는 없이 PBS/NaCl에서 수행될 수 있다.
상기 콘쥬게이션 단계 (i) 또는 (ii') 동안, 에스테르 또는 무수물의 형태로 활성화된 킬레이트제는 인산 완충 용액 (PBS)과 같은 버퍼 용액에 용해될 수 있다.
바람직한 구체 예에서, 에스테르 또는 무수물의 형태로 활성화된 킬레이트제와 VHH 또는 VHH 유도체의 리신 잔기의 아미노기 사이의 몰비는 1 내지 10, 바람직하게는 4이다.
상기 콘쥬게이션 단계 (i)와 킬레이팅 단계 (ii) 사이, 또는 킬레이팅 단계 (i')와 콘쥬게이션 단계 (ii') 사이에서, 투석여과 (diafiltration) 또는 투석용해 (dialyse)에 의한 버퍼 교환단계를 가질 수 있다. 유리하게, 상기 용액은 예를 들어, Vivaspin™ 장치로 투석여과된다. 이러한 버퍼 교환단계 동안, 배지는 1 내지 5℃로 냉각된다. 이러한 버퍼 교환단계 동안, 상기 버퍼용액은 바람직하게는 0 내지 6시간, 좀 더 바람직하게는 2 내지 3시간 동안 교반하면서, 예를 들어, 초산나트륨 용액으로, 교환된다.
킬레이팅 단계 (ii) 또는 (i') 동안, 상기 용액은 1 내지 4시간 동안, 바람직하게는 2 내지 3시간 동안 교반된다. 상기 킬레이팅 단계는 바람직하게는 1 내지 60℃에서, 더욱 바람직하게는 4℃에서 수행된다.
그 다음, 투석여과 또는 투석용해에 의한 이차 버퍼 교환단계가 수행될 수 있다. 유리하게, 상기 용액은 예를 들어, Vivaspin™으로 투석여과된다. 이러한 이차 버퍼 교환단계 동안, 상기 배지는 1 내지 5℃의 온도 범위로 냉각된다. 이러한 이차 버퍼 교환단계 동안, 상기 버퍼용액은 예를 들어, NaCl을 함유하는 PBS의 혼합물 (PBS/NaCl; 유리하게 300mM NaCl)로 교환되며, 동일한 방법 (투석여과)으로 농축될 수 있다.
리신의 수에 의존하여, VHH 또는 VHH 유도체에 대하여 관심 물질 평균 밀도는 0과 리신 숫자 +1의 사이에서 변할 수 있다. 바람직하게는, VHH 또는 VHH 유도체에 대하여 관심 물질 평균 밀도는 0 내지 6으로 변할 수 있다.
2차 전략에 따르면, 본 발명에 따른 화학식 P-C-Z 또는 Z-C-P의 VHH 유도체는 부위 특이적 접근법을 사용하여 관심 물질에 콘쥬게이트된다. 상기 부위 특이적 접근법은 하기 장점을 갖는다:
- 화학식 P-C-Z 또는 Z-C-P의 표지된 VHH 유도체는 이 방법이 사람 사용과의 관련하여 필수적인 특색 (품질관리, 안전성 등)인 뚜렷한 콘쥬게이트를 제공하는 것으로 화학적으로 정의되고,
- 상기 방법은, 관심 물질로 화학식 P-C-Z 또는 Z-C-P의 VHH 유도체를 표지하는 것이 짧은 반응시간과 일관된 절차로 단일 단계에서 수행될 수 있음에 따라 쉽고 표준적이다. 과정 도중의 모니터링이 요구되지 않으며, 표지 정도 및 결합특성 간에 달성될 상쇄 요인이 존재하지 않는다. 이러한 점들은 또 다른 최적화, 실험 반복도, 및 수율 향상을 위한 주된 장점이며,
- 상기 방법은, 화학식 P-C-Z 또는 Z-C-P의 VHH 유도체 주요 특성: 예를 들어, 최종 샘플에서 콘쥬게이트의 pI가 BBB 가로지르기를 가능하게 하는 8.5 이상에서 유지되는 특성에 영향을 미치지 않는다. 또한, 표적에 대해 콘쥬게이트와 경쟁할 수 있는 표지되지 않고 남는 화학식 P-C-Z 또는 Z-C-P의 VHH 유도체가 존재하지 않고; 생리학적 pH에서의 짧은 반응시간의 온화한 조건은 화학식 P-C-Z 또는 Z-C-P의 VHH 유도체가 잠재적 분해 및/또는 활성의 손실을 방지해주며,
- 상기 방법은 다양한 화학식 P-C-Z 또는 Z-C-P의 VHH 유도체 및 조영제, 형광체 또는 관심의 다른 분자가 별도로 제조될 수 있고, 그 다음 단일 단계에서 조합되는 유연하고 단위화된 접근법을 가능하게 하는 광범위한 활용도를 갖는다. 결과적으로, 한 세트의 콘쥬게이트는 최적화 및 IHC (immunohistochemistry) 및 MRI (magnetic resonance imaging)에 의한 최적화 및 다운스트림 평가에 대해 용이한 접근을 가능케 하고, 및 무엇보다도
- 상기 방법은 VHH의 히스티딘 또는 리신에 대한 부반응 없이, VHH의 3D 구조 및 기능의 전반적인 유지와 함께, 단계 반응의 수를 감소시키면서 전반적인 수율의 개선을 가능하게 한다.
본 발명에 따른 부위 특이적인 방법은 티올-반응성 작용기를 함유하는 관심 물질과 본 발명에 따른 화학식 P-C-Z 또는 Z-C-P의 VHH 유도체의 콘쥬게이션 단계를 포함한다. 비-부위 특이적 콘쥬게이션이 초기 버퍼 교환을 요구하는 반면, VHH, 특히 Tau-A2-SH 또는 Tau-A2var-SH, 및 관심 물질을 함유하는 티올-반응성 화합물 사이의 부위-특이적 콘쥬게이션은 PBS/NaCl/이미다졸 버퍼에서 직접 실행될 수 있다. 시스테인 상에 특이적인 티오-부가는 온화한 조건에서 효과적으로 조절될 수 있고, 상기 전략은 A. Papini et al, Int. J. Pept. Protein Res., 1992, 39, 348-355; B. Rudolf et al, J. Organomet. Chem, 1996, 522, 313-315; J. Paulech et al, Biochim. Biophys. Acta, 2013, 1834, 372-379에 이미 언급된 어떤 잠재적인 부반응 없이, 공정의 전반적인 수율의 개선 및 반응 단계의 수의 감소를 가능하게 한다.
재조합 단백질은 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피 (IMAC)에 의해 이들의 정제를 가능하기 하는 His-Tag로 일상적으로 발현된다. Ni 니트릴로트리아세트산 레진 (Ni-NTA resin)을 사용하는 경우, 이들은 통상적으로 500 mM 이미다졸을 함유하는 PBS 버퍼에서 용출된다. 비-부위 특이적 접근법에서, 이미다졸의 질소는 NHS 에스테르 가수분해 (즉, 반응성 종들을 분해)를 촉진할 수 있고, 그리고 이에 의해 콘쥬게이션을 방해한다 (G. T. Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, 2013; P. Cuatrecasas et al, Biochemistry, 1972, 1 1, 2291-2299). 버퍼 교환 단계는 따라서 이미다졸을 제거하기 위해 업스트림 친화성 정제 및 콘쥬게이션 사이의 공정에 포함되어야 한다. 이미다졸 및 말레이미드기 사이에서 부-반응은 히스티딘 측-쇄 알킬화를 나타내는 몇 가지 그룹에 의해 이전에 보고된 바와 같이 예상된다 (A. Papini et al; B. Rudolf et al; J. Paulech et al). 그럼에도 불구하고, 관심의 물질을 함유하는 티올-반응성 화합물은 제한된 초과량의 말레이미도 시약 및 큰 몰 초과의 이미다졸에도 불구하고, 친화성 컬럼 용출 버퍼에서, VHH, 특히 Tau-A2-SH 또는 Tau-A2var-SH에 직접 콘쥬게이트될 수 있다.
하기 화학식 1 또는 1'의 말레이도 화합물과 같은, 티올-반응성 화합물과 화학식 P-C-Z 또는 Z-C-P의 VHH 유도체의 시스테인 사이에서 티오-부가는 0 내지 20℃, 바람직하게는 4℃, 예를 들어 2 내지 4시간 동안 수행될 수 있다.
하기 화학식 1 또는 1'의 말레이미도 화합물와 같은 티올-반응성 화합물과 올리고펩티드의 시스테인 사이에 티올-부가는 4 내지 7.5 범위의 pH, 좀 더 바람직하게는 6.8의 pH에서 바람직하게 실현된다. pH = 4 아래에서, 반응은 최적화되지 않고, 7.5 이상에서 반응은 비 특이적이다 (리신에서 반응). 콘쥬게이션 단계는 이미다졸이 있거나 또는 없이, 바람직하게는 이미다졸이 존재하는 PBS/NaCl에서 수행될 수 있다.
그 다음, 투석여과 또는 투석용해에 의한 버퍼 교환 단계를 수행할 수 있다. 유리하게, 상기 용액은, 예를 들어, Vivaspin™ 장치로 투석여과될 수 있다. 그 다음, 상기 용액은 동일한 방법 (투석여과)에 의해 농축될 수 있다.
그러나, 콘쥬게이션 단계가 이미다졸을 갖는 PBS/NaCl에서 수행된 경우, (이미다졸을 제거하지 않기 위하여) 후속 투석여과 또는 투석용해 단계를 수행하지 않는 것이 바람직하다.
비-특이적인 방법이건 또는 특이적인 방법이건 간에, 관심 물질은 상기에서 정의된 것일 수 있다.
바람직한 구체 예에 따르면, 관심 물질은 상기에서 정의된 바와 같은 치료 또는 진단 화합물이며, 바람직하게는 상기에서 정의된 바와 같은 형광체, 방사성 동위원소 및 NMR 또는 MRI 조영제로 이루어진 군으로부터 선택되는 진단 화합물이다.
본 발명자들은, 관심 물질이 형광체, NMR 또는 MRI 조영제인 경우, 합성된 콘쥬게이트가 표지되지 않은 VHH의 중요한 기능적인 특성을 보유하는 점을 관찰하였다.
바람직한 구체 예에 따르면, 관심 물질은 청색광에 의하여 여기되는 녹색 형광 염료, 특히 FITC, Cy2, Alexa Fluor 488, 바람직하게는 Alexa Fluor 488과 같은, 형광체이다.
또 다른 바람직한 구체 예에 따르면, 상기 관심물질은, 가돌리늄 (Gd), 디스프로슘 (Dy) 및 망간 (Mn)인 상자성제, 및 (MION, SPIO 또는 USPIO와 같은) 산화철 또는 철 백금 (SIPP)에 기초한 초상자성제, 및 18F, 13C, 23Na, 17O, 15N와 같은 X-핵과 같은 NMR 또는 MRI 조영제이며, 좀 더 바람직하게는 상기 관심 물질은 상자성제인 가돌리늄 (Gd), 디스프로슘 (Dy) 및 망간 (Mn)으로부터 선택되고, 바람직하게는 가돌리늄 (Gd)인 NMR 또는 MRI 조영제이다.
킬레이트제는 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산 (DOTA), 디에틸렌 트리아민 펜타-아세트산 (DTPA), 1,4,7-트리스(카르복시메틸라자)시클로도데칸-10-아자아세틸아미드 (DO3A), 니트릴로트리아세트산 (NTA) (Chong et al. 2008 Bioconjug Chem., 19, 1439-47), D-페니실라민 (Pen), 2,3-디머캅토숙신산 (DMSA), 2,3-디머캅토-1-프로판숙신산 (DMPS) (Andersen 1999 Chem Rev., 99, 2683-2710), 2,3-디머캅토프로판올 (BAL), 트리에틸렌테트라민 (Trien), 암모늄 테트라티오몰리브데이트 (TTM) 음이온 (Brewer and Askari 2005 J Hepatol., 42, S13-S21), 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 2-(p-이소티오시안네이토벤질)-6-메틸-디에틸렌트리아민펜타아세트산 (IB4M) (Nwe et al. 2011 J Inorg Biochem., 105, 722-7), 하이드록시피리디논 (HOPO) (Villaraza et al., 2010 Chem Rev., 110, 2921-59) 중 선택될 수 있다.
상기 관심 물질이 가돌리늄인 경우, DOTA는 바람직한 킬레이트제이다.
본 발명은 또한 전술된 바와 같은 화학식 P-C-Z 또는 Z-C-P의 VHH 유도체를 제공하고, 여기서 상기 시스테인 잔기 C는 황화물 결합, 바람직하게는 티오에테르 또는 이황화물 결합을 통해 적어도 하나의 관심의 물질에 연결된다. 유리하게, 상기 시스테인 잔기 C는 상기 관심의 물질을 함유하는 티올-반응성 화합물을 통해 적어도 하나의 관심의 물질과 연결된다.
본 발명의 관점에서, 티올-반응성 화합물은 말레이미도, 할로아세틸, 알킬 할라이드 또는 아지리딘 화합물, 아크릴로일 유도체, 아크릴화제, 또는 티올-이황화물 교환 제재 (exchange reagent) (Hermanson G. T., 2010, Bioconjugate Techniques, Academic Press)이다.
본 발명의 관점에서, 말레이미도 화합물은 적어도 하나의 말레이미도 작용기, 바람직하게는 1 내지 6 말레이미도 작용기, 및 좀 더 바람직하게는 하나의 말레이미도 작용기를 함유하는 화합물이다.
바람직하게는, 상기 티올-반응성 화합물은 상기 말레이미드 작용기의 C-C 이중 결합을 통해 시스테인 잔기 C와 반응하는 말레이미도 화합물이다.
본 발명의 말레이미도 화합물은 하기와 같은 화학식 1일 수 있다:
[화학식 1]
Figure pct00001
여기서:
- B, B'1, B'2, 및 B"는, 같거나 다르게, 2 내지 12개의 옥시에틸렌 (OE) 단위를 바람직하게 갖는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 같은 폴리올, 2 내지 12개의 방향족 고리를 바람직하게 갖는 폴리올레핀, 2 내지 12개의 탄소 원자를 바람직하게 갖는 폴리알킬, 2 내지 12개의 메타아크릴레이트기를 바람직하게 갖는 폴리(알킬 메타아크릴레이트)와 같은 비닐 고분자, 2 내지 12개의 카르보닐기를 바람직하게 갖는 폴리알데히드, 2 내지 12개의 에스테르기를 바람직하게 갖는 폴리산 에스테르로부터 선택된 독립적으로 단일 결합 또는 스페이서이며,
- D, D' 및 D"는, 같거나 다르게, 아민, 아미드, 아미도-알코올, 우레아, 티오우레아, 카르밤산염, 탄산염, 에스테르, 에테르, 티오에테르, 아릴, 트리아졸과 같은 헤테로아릴, 옥심기들로부터 독립적으로 선택되고,
- A는 단일 결합 또는 킬레이트제이며,
- SI는 관심 물질이고,
- X'은 산, 아민, 아미드, 에스테르, 에테르, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴 또는 헤테로아릴 작용기이며, 및
- n = 1 내지 100이고, 바람직하게는 n = 1, 2 또는 3이다.
본 발명의 관점에서:
- 알킬기는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 2차-부틸, 3차-부틸 및 이소부틸 라디칼과 같은 (C1-C12)알킬기, 바람직하게는 (C1-C6) 알킬기 중에서 선택되고;
- 알케닐기는 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 2 내지 12 탄소 원자, 바람직하게는 2 내지 6 탄소 원자의 탄화수소 사슬 중에서 선택된다. 알케닐기의 예로는 에테닐, 프로페닐, 이소프로페닐, 2,4-펜타디에닐을 포함하며;
- 알키닐기는 적어도 하나의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는, 2 내지 12, 바람직하게는 2 내지 6 탄소 원자의 탄화수소 사슬 중에서 선택되고;
- 아릴기는 적어도 하나의 단순 방향족 고리로부터 유래된 어떤 작용기 또는 치환기를 의미하고; 방향족 고리는 비국소화된 (delocalized) π시스템을 갖는 어떤 평면 환형 화합물에 상응하고, 여기서 상기 고리의 각 원자는 p-오비탈을 포함하고, 상기 p-오비탈은 그들끼리 중첩된다. 좀 더 구체적으로는, 용어 아릴은 페닐, 비페닐, 1-나프틸, 2-나프틸, 안트라실, 피레닐, 및 이의 치환된 형태를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 아릴기는 바람직하게는 4 내지 12 탄소 원자, 및 좀 더 바람직하게는 5 또는 6 탄소 원자를 포함하고;
- 헤테로아릴기는 전술된 바와 같은 적어도 하나의 방향족 고리로부터 유래된 어떤 작용기 또는 치환체를 의미하고, P, S, O 및 N으로부터 선택된 적어도 하나의 이종원자를 함유한다. 용어 헤테로아릴은 푸란, 피리딘, 피롤, 티오펜, 이미다졸, 피라졸, 옥사졸, 이소옥사졸, 트리아졸, 티아졸, 이소티아졸, 테트라졸, 피리다졸, 피리딘, 피라진, 피리미딘, 피리다진, 벤조푸란, 이소벤조푸란, 인돌, 이소인돌, 벤조티오펜, 벤조티오펜, 벤즈이미다졸 (benzimidazole), 인다졸 (indazole), 벤조옥사졸, 벤즈이소옥사졸 (benzisoxazole), 벤조티아졸, 퀴놀린 (quinoline), 이소퀴놀린, 퀴녹살린 (quinoxaline), 퀴나졸린 (quinazoline), 시놀린 (cinnoline), 푸린 (purine) 및 아크리딘 (acridine)을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 아릴 및 헤테로아릴 기들은 바람직하게는 4 내지 12 탄소 원자, 좀 더 바람직하게는 5 또는 6 탄소 원자를 포함한다;
본 발명에 따른 산, 아민, 아미드, 에스테르, 에테르, 및 티오에테르기는 바람직하게는 1 내지 12, 좀 더 바람직하게는 1 내지 6 탄소 원자를 갖는다.
바람직한 구체 예에 따르면, A는 킬레이트제이며, 관심 물질 SI는 형광체 (예를 들어, Alexa Fluor® 488) 또는 NMR 또는 MRI 조영제 (예를 들어, 가돌리늄)이다.
유리하게, 상기 킬레이트제 A는 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산 (DOTA), 디에틸렌 트리아민 펜타아세트산 (DTPA), 1,4,7-트리스(카르복시메틸라자)시클로도데칸-10-아자아세틸아미드 (DO3A), 니트릴로트리아세트산 (NTA), D-페니실라민 (Pen), 2,3-디머캅토숙신산 (DMSA), 2,3-디머캅토-1-프로판숙신산 (DMPS), 2,3-디머캅토프로판올 (BAL), 트리에틸렌테트라민 (Trien), 암모늄 테트라티오몰리브데이트 (TTM) 음이온, 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 2-(p-이소티오시아나토벤질)-6-메틸-디에틸렌트리아민펜타아세트산 (IB4M) 또는 하이드록시피리디논 (HOPO)으로부터 선택된다.
유리하게, 관심 물질 SI는 가돌리늄이고, 킬레이트제는 DOTA이다.
특히 바람직한 구현 예에 따라, 본 발명의 말레이미도 화합물은 화학식 1'일 수 있다.
[화학식 1']
Figure pct00002
여기서, B, B'1, B'2, B", A, SI 및 n은 상기에서 정의된 바와 같다.
화학식 1 또는 1'의 말레이미도 화합물은 고-상 (solid-phase) 방법, 바람직하게는 Fmoc 화학 반응, 더욱 바람직하게는 Fmoc-Gly-Wang 레진 상에서 합성될 수 있다.
바람직한 구체 예에 따르면, 본 발명의 말레이미도 화합물은 화학식 1'일 수 있다:
[화학식 I']
Figure pct00003
여기서, B, B'1, B'2, B", A, SI 및 n은 본 발명의 일부로서 전술된 바와 같다.
본 발명의 다른 목적은 적어도 하나의 관심의 물질 (예를 들어, Alexa Fluor® 488과 같은 형광체 또는 가돌리늄과 같은 NMR 또는 MRI 조영제)에 연결된, 바람직하게는 본 발명에 따른 티올-반응성 화합물, 좀 더 바람직하게는 말레이미도 화합물을 통하여 적어도 하나의 관심의 물질에 연결된 시스테인 잔기를 갖는 화학식 P-C-Z 또는 Z-C-P의 VHH 유도체이고, 상기 화학식 P-C-Z 또는 Z-C-P의 VHH 유도체는 본 발명의 부위 특이적 방법에 따라 얻을 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 비-부위 특이적인 방법에 따라 얻을 수 있는 관심 물질에 콘쥬게이트된 VHH, 및 또한 본 발명의 부위 특이적인 방법에 따라 얻을 수 있는 관심 물질을 함유하는 화학식 1의 말레이미도 화합물과 같은 티올-반응성 화합물에 콘쥬게이트된 화학식 P-C-Z 또는 Z-C-P의 VHH 유도체를 제공한다.
상기 관심 물질이 펩티드인 경우, 본 발명에 따른 VHH, VHH 변이체 또는 VHH 유도체 및 상기 관심 물질은 유전공학을 통하여 본 발명에 따른 VHH, VHH 변이체 또는 VHH 유도체 및 적절한 펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드로 생산될 수 있다. 이 융합 폴리펩티드는 알려진 적절한 숙주 세포 내에서 편리하게 발현될 수 있다.
본 발명에 따른 VHH, VHH 변이체, VHH 유도체, 치료 또는 진단 시약은 정맥내, 동맥내, (척수액을 통하여) 척추강 내로, 복강내, 근육내 또는 피하 주사와 같은 주사로, 또는 비강내 적하에 의하여 피험자 (포유동물 또는 인간)에 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 VHH, VHH 변이체 또는 VHH 유도체가 인간 피험자에 투여되는 경우, 이는 인간에서 면역원성을 감소시키기 위하여 인간화 (humanized)될 수 있다. 인간화 항체 또는 이의 단편 생산방법은 기술분야에 알려져 있다 (Vincke et al. 2009, J Biol Chem., 284, 3273-84).
본 발명에 따른 진단 시약은 알츠하이머병 (AD), 피크 병 (Pick disease: PD), 전측두엽 치매 (FTD), 피질기저핵 변성 (CBD) 및 진행성 핵성마비 (PSP), 바람직하게는 AD, FTD, CBD 및 PSP를 포함하는, 타우병증과 같은, 신경원섬유 매듭, 신경망 실 또는 이영양성 신경돌기에 의해 매개된 장애를 진단하거나 또는 관찰하거나, 또는 뇌 영상화하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 VHH, VHH 변이체 또는 VHH 유도체 (특히 화학식 P-C-Z 또는 Z-C-P의 VHH 유도체) 및 전술된 바와 같은 관심 물질, 및 선택적으로 진단 제재를 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 진단 시약 및 진단 제재를 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 키트는 알츠하이머 병 (AD), 피크 병 (PD), 전측두엽 치매 (FTD), 피질기저핵 변성 (CBD) 및 진행성 핵성마비 (PSP), 바람직하게는 AD, FTD, CBD 및 PSP를 포함하는, 타우병증과 같은, 신경원섬유 매듭, 신경망 실 또는 이영양성 신경돌기에 의해 매개된 장애를 진단하거나 또는 관찰하거나, 또는 뇌 영상화하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 피험자에서 알츠하이머병 (AD), 피크 병 (PD), 전측두엽 치매 (FTD), 피질기저핵 변성 (CBD) 및 진행성 핵성마비 (PSP), 바람직하게는 AD, FTD, CBD 및 PSP를 포함하는, 타우병증과 같은, 신경원섬유 매듭, 신경망 실 또는 이영양성 신경돌기에 의해 매개된 장애를 진단하거나 또는 관찰하기 위한 본 발명에 따른 진단 시약의 사용을 제공한다.
여기에 사용된 바와 같은, 용어 "피험자"는 포유동물, 바람직하게는 인간, 가장 바람직하게는 알츠하이머병(AD), 피크 병 (PD), 전측두엽 치매 (FTD), 피질기저핵 변성 (CBD) 및 진행성 핵성마비 (PSP), 바람직하게는 AD, FTD, CBD 및 PSP를 포함하는, 타우병증과 같은, 신경원섬유 매듭, 신경망 실 또는 이영양성 신경돌기에 의해 매개된 질병을 갖는 것으로 의심되는 인간이다.
본 발명은 또한 피험자에서 알츠하이머병 (AD), 피크 병 (PD), 전측두엽 치매 (FTD), 피질기저핵 변성 (CBD) 및 진행성 핵성마비 (PSP), 바람직하게는 AD, FTD, CBD 및 PSP를 포함하는, 타우병증과 같은, 신경원섬유 매듭, 신경망 실 또는 이영양성 신경돌기에 의해 매개되는 질병을 진단하기 위한 시험관 내 또는 생체 외 방법을 제공하며, 상기 방법은:
a) 본 발명에 따른 진단 시약으로 시험관 내에서 상기 피험자로부터 얻은 적절한 생물학적 샘플에 접촉시키는 단계, 및
b) 상기 생물학적 샘플 내에 인산화-타우 단백질의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함하고,
상기 인산화-타우 단백질의 존재는 상기 피험자가 알츠하이머병 (AD), 피크 병 (PD), 전측두엽 치매 (FTD), 피질기저핵 변성 (CBD) 및 진행성 핵성마비 (PSP), 바람직하게는 AD, FTD, CBD 및 PSP를 포함하는, 타우병증과 같은, 신경원섬유 매듭, 신경망 실 또는 이영양성 신경돌기에 의해 매개된 질병을 갖는다는 것을 나타낸다.
단계 b)는 VHH-항원 또는 VHH 변이체-항원 복합체 (즉, 인산화-타우 단백질로 향해진 VHH)의 존재 또는 부재를 결정하여 수행될 수 있다.
본 발명은 또한 피험자에서 알츠하이머병 (AD), 피크 병 (PD), 전측두엽 치매 (FTD), 피질기저핵 변성 (CBD) 및 진행성 핵성마비 (PSP), 바람직하게는 AD, FTD, CBD 및 PSP를 포함하는, 타우병증과 같은, 신경원섬유 매듭, 신경망 실 또는 이영양성 신경돌기에 의해 매개되는 질병의 진전 또는 퇴행을 관찰하기 위한 시험관 내 또는 생체 외 방법을 제공하며, 상기 방법은:
a) 시험관 내에서 상기 피험자로부터 얻은 적절한 생물학적 샘플을 본 발명에 따른 진단 시약에 접촉시키는 단계,
b) 상기 생물학적 샘플 내에 인산화-타우 단백질의 양을 결정하는 단계, 및
c) 단계 b)에서 결정된 양을 상기 피험자에 대해 이전에 얻어진 인산화-타우 단백질의 양과 비교하는 단계를 포함하고,
인산화-타우 단백질의 양의 상당한 증가는 신경원섬유 매듭, 신경망 실 또는 이영양성 신경돌기에 의하여 매개되는 상기 질병의 진행에 대한 마커를 형성하며, 인산화-타우 단백질의 양의 상당한 감소는 신경원섬유 매듭, 신경망 실 또는 이영양성 신경돌기에 의하여 매개되는 상기 질병의 퇴행에 대한 마커를 형성한다.
여기서 사용된 바와 같은, 용어 "상당한 증가" 및 "상당한 감소"는 이전에 결정되고 참조 양으로서 사용된, 상기 피험자로부터 얻은 적절한 생물학적 샘플 내에서 인산화-타우 단백질의 양과 대하여, 적절한 생물학적 샘플 내에서 인산화-타우 단백질의 더 많거나 또는 더 적은 양 각각을 의미한다.
단계 b)는 또한 VHH-항원 또는 VHH 변이체-항원 복합체의 양을 결정함으로써 수행될 수 있다.
상기 적절한 생물학적 샘플은 뇌 생검체 또는 사후 뇌조직일 수 있다.
뇌 생검체 또는 사후 뇌조직 내에서 신경원섬유 매듭, 신경망 실 또는 이영양성 신경돌기을 탐지하기 위한 방법의 관점에 따라, 상기 방법은 본 발명에 따른 진단 시약의 용액과 함께 포르말린-고정 조직을 배양하는 단계를 포함될 수 있다. 배양 시, 진단 화합물은 조직 내에서 신경원섬유 매듭, 신경망 실 또는 이영양성 신경돌기를 표지하며, 염색 또는 표지된 신경원섬유 매듭, 신경망 실 또는 이영양성 신경돌기는 어떤 표준 방법에 의하여 검출되거나 시각화될 수 있다. 이러한 검출 수단은 명시야 (bright-field), 형광, 레이저-공초점 (laser-confocal) 및 교차-분극 (cross-polarization) 현미경과 같은 현미경 기법을 포함한다. 생검체 또는 사후 조직에서 신경원섬유 매듭, 신경망 실 또는 이영양성 신경돌기의 양을 정량하는 방법은 본 발명에 따른 진단 시약, 또는 이의 수용성, 무독성 염을 생검체 또는 사후 조직의 균질액과 함께 배양하는 단계를 포함한다. 상기 조직은 기술분야에서 알려진 방법에 의하여 얻어지며 균질화된다. 진단 화합물은 효소, 형광체, 나노입자 또는 NMR 또는 MRI 조영제와 같은 다른 진단 화합물이 사용될 수 있을지라도, 유리하게는, 상기 진단 화합물은 방사성 동위원소로 표지된 화합물이다.
본 발명은 또한 피험자에서 신경원섬유 매듭, 신경망 실 또는 이영양성 신경돌기를 생체 내 영상화하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 피험자, 바람직하게는 인간에게 본 발명에 따른 진단 시약의 검출 가능한 양을 투여하는 단계,
b) 영상화 방법에 의하여 상기 피험자 내에서 상기 진단 시약을 검출하는 단계.
본 발명에 따른 방법은 피험자, 바람직하게는 인간의 뇌에서 신경원섬유 매듭, 신경망 실 또는 이영양성 신경돌기의 존재와 위치를 결정하는 것을 가능하게 한다.
여기서 사용된 용어 "검출 가능한 양"은 투여된 진단 시약의 양이 진단 시약과 인산화-타우 단백질이 결합된 것을 검출할 수 있을 정도로 충분하다는 것을 의미한다.
여기서 사용된 용어 "유효량을 영상화하는"은 투여된 진단 시약의 양이 진단 시약과 인산화-타우 단백질이 결합된 것을 영상화할 수 있을 정도로 충분한 것을 의미한다.
영상화 방법은 생체 내에서 신경원섬유 매듭, 신경망 실 또는 이영양성 신경돌기를 수량화하기 위하여 사용된, 자기공명 분광법 (MRS) 또는 영상화 (MRI)와 같은 비침습적인 신경영상화, 또는 양성자 방사 단층촬영 (PET) 또는 단일광자방출단층촬영 (SPECT)과 같은 감마 영상화를 포함한다.
생체 내 영상화를 위한 목적으로 사용 가능한 검출 장비의 종류는 주어진 표지를 선택하는 데 있어서 주요한 요인이 된다. 예를 들어, 가돌리늄, 철 또는 망간 기반의 조영제는 관심 물질에 연결된 본 발명에 따른 VHH, VHH 변이체 또는 VHH 유도체를 자기공명 분광법 (MRS) 또는 영상화 (MRI)로 검출하기 위하여 사용될 수 있다. 19F와 같은 방사성 동위원소, Alexa Fluor 488과 같은 형광체 또는 가돌리늄과 같은 NMR 또는 MRI 조영제는 또한 본 발명의 방법에서 생체 내 영상화에 특히 적절하다. 사용될 장비의 유형은 관심 물질의 선택을 안내할 것이다. 예를 들어, 선택된 방사성핵산염 (radionucleide)은 장비의 주어진 유형에 의하여 검출 가능하게 분해되는 종류이어야 한다. 다른 고려 요인으로는 상기 조영제 또는 방사성핵산염의 반감기와 연관한다. 방사성 동위원소의 경우, 반감기는 뇌에 의해 흡수된 최대 시간에서 여전히 검출 가능할 정도로 충분히 길어야 하지만, 피험자가 유해한 방사능을 유지하지 않은 정도로 충분히 짧아야한다. 본 발명에 따른 방사표지된 VHH, VHH 변이체 또는 VHH 유도체는 적절한 파장의 방출된 감마 조사가 검출되는 감마 영상화를 이용하여 검출될 수 있다. 감마 영상화 방법은 SPECT 및 PET을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는, SPECT 검출의 경우, 선택된 방사성 동위원소는 입자 방출이 결여될 것이나, 140-200 keV 범위의 상당량의 광자를 생산할 것이다. PET 검출의 경우, 방사표지는 PET 카메라에 의하여 검출될 수 있는 두 511 keV 감마선을 형성하기 위하여 전멸시킬 19F와 같은 양성자-방출 방사핵종 (radionuclide)일 것이다.
일반적으로, 검출 가능한 진단 시약의 양은 환자의 연령, 병태, 성별 및 질병의 정도, 만약 있다면, 사용금지사유, 동시에 수반되는 치료 및 해당 분야의 의사에 의하여 조정될 다른 가변요인과 같은 고려요인에 따라 변화할 것이다. 피험자에 대한 투여는 국부적이거나 전신적일 수 있으며, 정맥내, 동맥내, (척추액을 통한) 척수내 등으로 수행될 수 있다. 투여는 또한 시험 되는 신체 부위에 의존하여, 피하로 또는 강내로 수행될 수 있다. 상기 화합물이 인산화 타우 단백질에 결합하기에 충분한 시간, 예를 들어, 30분 내지 48시간이 경과한 후에, 조사 대상이 되는 피험자의 영역이 MRS/MRI, SPECT, 평면 섬광 영성화, PET, 및 새롭게 개발되는 영상화 기법 등과 같은 통상적인 영상화기법에 의하여 검사된다. 정확한 프로토콜이 전술된 바와 같이 환자에 특이적인 요인에 의존하여, 및 검사 대상이 되는 신체 부위, 투여 방법 및 사용되는 표지의 종류에 의존하여 필수적으로 변화될 것이다.
본 발명은 또한 진단 시약으로서 본 발명에 따른 진단 화합물에 연결된, 본 발명에 따른 VHH, VHH 변이체 또는 VHH 유도체, 특히 화학식 P-C-Z 또는 Z-C-P의 VHH 유도체를 제공한다.
본 발명은 또한 상기에서 정의된 치료 시약 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
여기서 사용된 용어 "약학적으로 허용 가능한 담체"는 약학적 투여와 함께 사용 가능한 모든 용매, 분산매질, 코팅, 항세균성 및 항진균성제, 등장액 및 흡수 지연제, 및 이와 유사한 것을 포함하는 것으로 의도된다. 적절한 담체는 기술분야의 표준 참고서인 Remington's Pharmaceutical Sciences의 최신판에 기재된다. 이러한 담체 및 희석제의 바람직한 예로는 물, 염수, 링거액, 덱스트로스 용액, 및 5% 인간 혈청 알부민을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 리포좀, 양이온성 지질 및 고정된 오일과 같은 비-수용성 비히클은 또한 사용될 수 있다. 약학적 활성 물질에 대하여 이러한 매질 및 시약의 사용은 기술분야에 잘 알려져 있다. 상기에서 정의된 치료 시약과 호환 가능하지 않는 어떠한 종래의 매질 또는 시약을 제외하고는, 본 발명의 조성물에서 이의 사용은 고려된다.
본 발명은 또한 알츠하이머병 (AD), 피크 병 (PD), 전측두엽 치매 (FTD), 피질기저핵 변성 (CBD) 및 진행성 핵성마비 (PSP), 바람직하게는 AD, FTD, CBD 및 PSP를 포함하는, 타우병증과 같은, 신경원섬유 매듭, 신경망 실 또는 이영양성 신경돌기에 의해 매개된 질병의 치료에 사용하기 위한, 약제로서, 본 발명에 따른 VHH, VHH 변이체 또는 VHH 유도체, 치료 시약 또는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 알츠하이머병 (AD), 피크 병 (PD), 전측두엽 치매 (FTD), 피질기저핵 변성 (CBD) 및 진행성 핵성마비 (PSP), 바람직하게는 AD, FTD, CBD 및 PSP를 포함하는, 타우병증과 같은, 신경원섬유 매듭, 신경망 실 또는 이영양성 신경돌기에 의해 매개된 질병의 예방 또는 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 이를 필요로 하는 피험자에 본 발명에 따른 치료 시약 또는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
여기서 사용되는 용어 "치료" 또는 "치료하는"은 본 발명에 따른 VHH, VHH 변이체, VHH 유도체, 치료 시약 또는 약학적 조성물을 장애, 장애 증상 또는 장애에 대한 성향을 갖는 환자에게 장애, 장애 증상, 또는 장애의 성향을 치료, 치유, 경감, 완화, 변경, 처치, 향상, 개선하거나 또는 영향을 미치기 위한 목적으로 투여하는 것을 포함한다.
상기 용어 "방지"는 알츠하이머병 (AD), 피크 병 (PD), 전측두엽 치매 (FTD), 피질기저핵 변성 (CBD) 및 진행성 핵성마비 (PSP), 바람직하게는 AD, FTD, CBD 및 PSP를 포함하는, 타우병증과 같은, 신경원섬유 매듭, 신경망 실 또는 이영양성 신경돌기에 의해 매개된 질병의 진행이 감소되거나/또는 제거되는 것을 의미하며, 또는 알츠하이머병 (AD), 피크 병 (PD), 전측두엽 치매 (FTD), 피질기저핵 변성 (CBD) 및 진행성 핵성마비 (PSP), 바람직하게는 AD, FTD, CBD 및 PSP를 포함하는, 타우병증과 같은, 신경원섬유 매듭, 신경망 실 또는 이영양성 신경돌기에 의해 매개된 질병의 개시가 지연 또는 제거되는 것을 의미한다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 전술된 바와 같은 관심 물질을 포유류 혈액-뇌, 바람직하게는 인간 혈액-뇌 장벽을 가로질러 운반하기 위한 펩티드 벡터의 제조를 위해, 본 발명에 따른 VHH, VHH 변이체 또는 VHH 유도체, 특히 화학식 P-C-Z 또는 Z-C-P의 VHH 유도체의 사용에 관한 것이다.
본 발명은 또한 치료 시약으로서의 본 발명에 따른 치료 화합물에 연결된 화학식 P-C-Z 또는 Z-C-P의 VHH 유도체를 제공한다.
실시 예 1: Alexa Fluor 488 또는 가돌리늄 조영제에 연결된 항-인산화 타우 VHHs의 발생 및 시험관 내/ 생체 내에서 이들의 평가
물질 및 방법
1. 항-타우 특이적 VHH (타우-A2)의 생산, 선택 및 정제
1.1 알파카에서 체액성 면역 반응의 항원 제조 및 유도
피험자
AD 환자 (Braak 단계 V 및 VI)로부터 얻은 인간 피질 뇌 조직은 NeuroCEB 뇌 은행으로부터 얻어진다. 이 은행은 (France Alzheimer Association을 포함하는) 환자 협회의 컨소시엄에 의해 운영되고, 프랑스 법에 의해 요청된 바와 같은, French Ministry of Research and Universities에 대해 선언된, 뇌 기증 프로그램에 관련된다. 명확한 서면 동의는 French Bioethical Laws에 따른 뇌 기증에 대하여 얻어진다.
조직 추출은 Mercken et al. (1992 Acta Neuropathol., 84, 265-272)에 따라 수행된다. AD 뇌 (0.2g)으로부터 얻은 피질은 10 부피의 10 mM Tris, 1 mM EGTA, 10% 수크로오스를 함유하는 0.8 M NaCl pH 7.4에서 균질화되고, 4℃에서 20분 동안 27,000 x g에서 원심분리된다. 펠렛은 제거되고, 상층액은 1% N-라우릴사코신 (laurylsarcosine) 및 1% 베타-머캅토에탄올로 조정되고, 37℃에서 2.5시간 동안 회전하면서 배양된다. 상층액 혼합물은 20℃에서 35분 동안 100,000g에서 원심분리된다. 펠렛을 함유하는 PHF는 PBS로 조심스럽게 세척되고, 최종적으로 동일한 버퍼에서 재현탁된다.
한 마리의 알파카 (Inti)는 타우 펠렛으로 면역접종되고, 다른 알파카 (Rascar)는 KLH (Eurogentec)에 연결된, 서열 CSIDMVDS(PO3H2)PQLATLAD (SEQ ID NO. 6)의 타우 단백질의 C-말단으로부터 유래된 단일 인산-펩티드로 면역접종된다.
250㎕ (500㎍)의 두 항원은 일차 면역화를 위해 250㎕의 Freund 완전 보조제와 혼합되고, 후속 면역화를 위하여 250㎕의 Freund 불완전 보조제와 혼합되었다. 0, 21 및 40일의 세 번 면역접종 후, 혈청 샘플은 52일에 채취하고, 면역 반응은 재조합 인산-타우 단백질 또는 재조합 비-인산화 타우 단백질을 사용하여 ELISA에 의해 관찰된다.
1.2 라이브러리 구축 및 패닝
250㎖의 면역화된 동물 혈액을 52일째 수집하였으며, Ficoll (Pharmacia) 불연속 구배 상에서 주변 혈액 림프구를 원심분리에 의하여 분리하였고, -80℃로 사용할 때까지 저장하였다. 전체 RNA 및 cDNA는 Lafaye P. 등의 (1995, Res Immunol., 146:373-382)에 이전에 기재된 바와 같이, 얻어지고, VHH 도메인을 인코딩하는 DNA 단편은 VH 유전자의 3' 및 5'의 측면 영역 (flanking region)으로 각각 풀리는 CH2FORTA4 및 VHBACKA6 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 증폭된다. 증폭된 산물은 프라이머 VHBACKA4 및 VHFOR36을 사용하여 2회의 PCR에서 주형으로 사용되었다. 상기 프라이머는 증폭 산물의 5' 및 3' 말단과 VHH 유전자의 말단에 혼입된 SfiI 및 NotI 제한 부위에 상보적이다. PCR 산물은 용해되고, 파지 발현 벡터 pHEN1에 연결된다. 최종 라이브러리는 두 개의 서브-라이브러리로 구성되며, 하나는 타우 펠렛으로부터 유래되고, 다른 하나는 KLH에 연결된 인산 펩티드로부터 유래된다. 파지는 생산되고, 두 서브-라이브러리를 이용하여 분리되며, 이어 모아진다 (pooled).
상기 라이브러리 (>6x108 클론)는 전체-길이 인산-타우 단백질에 대해 패닝된다. Nunc Immunotubes (Maxisorp) 튜브는 PBS에서 항원 (10㎍/㎖)으로 4℃에서 밤새도록 코팅된다. 파지 (1012 형질도입 단위 (transducing unit)는 37℃에서 1시간 동안 조심스럽게 교반하면서 코팅된 튜브와 함께 배양하여 패닝된다. 다른 블로킹제는 세 회의 패닝 동안 사용된다: 2% 탈지유, 1:4로 희석된 Licor 블로킹 버퍼 (Biosciences), 및 4% BSA는 각각 사용되었다. 파지 클론은 검출을 위하여 HRP/anti-M13 단일클론 항체 콘쥬게이트 (GE Healthcare)를 사용하여 표준 ELISA 절차에 의해 스크린된다 (아래 참고). 스크린은 인산-타우 단백질 및 타우 단백질과 병행으로 수행된다.
1.3 VHHs의 발현
벡터 pHEN1에서 선별된 나노바디의 암호화 서열은 NcoI 및 NotI 제한 부위를 이용하여 6-히스티딘 태그를 함유하는 세균 발현 벡터 pET23d로 서브-클론되었다. 형질전환된 E. coli BL21 (DE3) LysS 세포는 IPTG (0.5 mM)로 16℃에서 밤새 유도된 뒤에 세포질에서 VHH를 발현한다. 정제된 VHHs는 Ni2 + (GE Healthcare)로 하전된 HiTrap 크루드 칼럼을 사용하여 제조자의 매뉴얼에 따라 세포질 추출물로부터 IMAC로 분리하였다. VHHs는 50mM 인산나트륨 버퍼, 300mM NaCl 및 500mM 이미다졸 버퍼에서 용출되고, 300 mM NaCl (PBS/NaCl)을 함유하는 PBS 버퍼에서 투석된다.
선택된 VHH의 코딩 서열은 또한 C-터미널 말단 (Skerra and Schmidt 1999 Biomol Eng., 16, 79-86)에서 Strep-태그를 함유하는 변형된 pASK IBA2 발현 벡터에 서브-클론된다. 동일한 제한 부위는 사용되었다. E. coli XL2-Blue 울트라컴피턴트 셀 (Ultracompetent cell)은 16℃에서 무수테트라시클린 (anhydrotetracycline) (AHT, 200 ㎍/l)으로 밤새 유도시킨 후 주변 세포질 (periplasm)에서 VHH를 발현하기 위해 형질전환되었다. VHH는 그 다음 제조자의 설명에 따라 Strep-Tactin 컬럼 (IBA)으로 박테리아 추출로부터 정제되었다.
2. MRI 조영제 및 형광체에 연결한 VHH Tau-A2
2.1 일반 합성 방법
특별한 언급이 없는 한, 아미노-산 유도체 및 시약은 각각 Novabiochem 및 Sigma-Aldrich에서 구매하였다. 펩티드 및 VHH 용액 (순 단백질 함량)의 농도는 20시간 동안 110℃에서 6N HCl로 화합물의 가수분해 후 Beckman 6300 분석기를 사용하여 아미노산 정량 분석 (AAA)에 의해 결정된다. RP-HPLC/MS 분석은 전자분무 이온화 (electrospray ionisation) (양의 모드 (positive mode)) 공급원 (물)을 갖는 Q-Tofmicro™ 분광계 (Micromass) 및 UV 검출기 2487 (220 nm)에 연결된 Alliance 2695 시스템에 대해 수행되었다. 샘플은 오토샘플러 (autosampler)상에 4℃로 냉각된다. 선형 구배는 10분 또는 20분에 걸쳐 아세토니트릴 + 0.025% 포름산 (A)/물+ 0.04%TFA + 0.05% 포름산 (B)으로 수행하였다. 사용된 컬럼은 XBridge™ BEH300 C18 (3.5 ㎛, 2.1x100 ㎜) (물) (구배 10-100% A)이다. 공급원 온도는 120℃에서 유지되고, 탈용매화 온도는 400℃에서 유지된다. 콘 전압 (cone voltage)은 40V이다. 샘플은 B로 첨가된 이들의 개별 버퍼에서 0.4-1 mg/㎖ 농도에서 주사된다.
말레이미도--(DOTA/Gd)3 화합물 1은 도 6에서 나타낸 바와 같은 9-플루오로에닐메톡시카르보닐 (fluorenylmethoxycarbonyl) (Fmoc) 화학제를 사용하는 고-상 펩티드 합성에 의해 제조된다.
2.2 타우-A2-Sh의 생산
Cys-유전자조작된 VHH (Tau-A2-SH)의 코딩 서열은 NcoI 및 XhoI 제한 부위를 사용하여 박테리아 발현 벡터 pET23d로 클론된다. 요약하면, Tau-A2-SH (SEQ ID NO. 14)는, N 말단으로부터 C 말단으로 6-히스티딘 태그, 트롬빈 절단 부위, G3S 스페이서가 수반되는 VHH 타우-A2 서열 및 세 개의 추가 아미노산 CSA를 포함한다. 형질전환된 E. coli BL21 (DE3) pLysS 세포는 16℃에서 IPTG (0.5 mM)로 밤새도록 유도시킨 후 세포질 (cytoplasm)에서 Tau-A2-SH를 발현한다. 정제된 VHH는, 제조자의 설명에 따라, Ni2+ (GE Healthcare)로 하전된 HiTrap 조컬럼 (crude column)을 사용하여 세포질 추출로부터 IMAC에 의해 분리하였다. 단백질은 500 mM 이미다졸을 함유하는 PBS/NaCl에 용출되고, 그 다음 PBS/NaCl에서 투석된다.
AAA: Ala 14.3 (14), Arg 9.6 (10), Asp+Asn 7.3 (6), Glu+Gln 11.2 (10), Gly 18.4 (19), His 5..7 (6), Ile 4.2 (4), Leu 8.6 (8), Lys 5.3 (5), Phe 4 (4), Pro 2.9 (2), Ser 18.9 (23), Thr 10.5 (12), Tyr 6.1 (7), Val 11.5 (11).
MS: 15495.832 (C669H1045N205O213S4 계산된 15496.174). MS는 N-말단 삭제 메티오닌 및 하나의 이황화 결합을 갖는 단백질에 상응한다.
2.3 Tau-A2-S-Alexa Fluor 488 (Tau-A2-S-AF488)의 합성
Tau-A2-SH의 C-말단 트리펩티드에 존재하는 시스테인은 말레이미도 Alexa Fluor 488 형광체 (Invitrogen)에 Tau-A2-SH를 연결하는데 사용된다. Tau-A2-SH를 함유하는 용액의 pH는 6.8 내지 7로 조정된다. 상기 용액은 그 다음 30분 동안 실온에서 10-배 몰 초과의 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP)과 함께 조심스럽게 교반되어, 어떤 내부분자 이황화 결합의 완전 환원을 가능하게 한다. 디메틸포름아미드 (DMF)에 용해된 10-배 몰 초과의 말레이미도 Alexa Fluor 488 형광체는 첨가된다. 주로, 고효율의 콘쥬게이션을 위해, 최종 용액에서 DMF의 부피 퍼센트는 5% 이하로 유지된다. 상기 콘쥬게이션은, 광으로부터 보호하에서, 실온에서 2시간 동안 수행되었다. 비-콘쥬게이트된 말레이미도 형광체는 그 다음 300mM NaCl (전체 농도)을 함유하는 PBS로 연속적 투석에 의해 제거되었다.
2.4. Tau-A2-S-(DOTA/Gd)3 의 합성
콘쥬게이션 전에, Tau-A2-SH (4.2 ㎖, PBS/NaCl에서 0.32 mg/㎖ PBS/NaCl pH 6.8)는 VHH의 이량체화를 방지하기 위해 30분 동안 TCEP (24.6㎍, 5 eq)로 처리되었다. 수성 용액 (78㎕)에 말레이미도-(DOTA/Gd)3 (0.78 mg, VHH 당 1 티올기에 대해 3.8 eq)은 단백질에 첨가되고, 상기 용액은 3시간 동안 4℃에서 교반되었다. 상기 용액은 그 다음 Slide-A-Lyzer 카세트 (Thermo Scientific) (3,500 MWCO)를 사용하여 PBS/NaCl에서 투석되었다. Tau-A2-SH 및 Tau-A2-S-(DOTA/Gd)3의 분액 (20㎕)은 RP-HPLC/MS 분석을 위해 버퍼 B (20㎕)로 희석하였다. 더욱이, 동일 화합물의 분액 (10㎕)은 ELISA 분석을 위해 20 mM Tris 버퍼 pH 7.3 (90㎕)에서 희석하였다. 4.2 ㎖의 Tau-A2-S-(DOTA/Gd)3 (0.24 mg/㎖)은 65%의 수율로 얻어진다. 이것은 예상된 양 (순 단백질 함량)으로 실제량의 최종 산물 Tau-A2-S-(DOTA/Gd)3를 나누어 계산하였다. 또 다른 실험을 위해, Tau-A2-S-(DOTA/Gd)3의 용액은 Vivaspin 2 원심분리 필터 장치 (3,000　MWCO PES)을 사용하여 4번 농축하였다.
AAA: Ala 13.4 (14), Arg 9.6 (10), Asp+Asn 8.0 (6), Glu+Gln 11.8 (10), Gly 24.4 (22), His* (6), Ile 4.2 (4), Leu 8.6 (8), Lys 18.9* (8), Phe 4 (4), Pro 2.9 (2), Ser 16.8 (23), Thr 10.7 (12), Tyr 6.1 (7), Val 11.4 (11). [*His는 암모늄과 공-용출 (co-elution)에 기인하여 결정될 수 없다. Lys은 분석의 조건에서 말레이미도 유도체와 공동-용출에 기인하여 과대평가된다].
MS: 17885.182 (C751H1172N227O244S4Gd3 계산된 17884.964).
3. 면역조직화학 및 생화학에 의한 Tau-A2, 및 Tau-A2 콘쥬게이트의 생체 내 특징
3.1 피험자
인간 뇌 조직은 NeuroCEB 뇌 은행에서 얻었다. 임상전 실험은 B6TgTg4510 (Santacruz et al. 2005 Science, 309, 476-81) 형질전환 마우스에 대해 수행하였다. 동물 실험 절차는 프랑스 및 유럽 법의 윤리 규범 (European Communities Council Directive 2010/63/EU on the protection of animals used for scientific purposes)에 따르고, 지역 동물 보호협회 및 사용 윤리위원회로부터 승인 후 엄격하게 수행하였다. 동물은 고용량의 펜토바비탈 나트륨 (100 mg/kg)을 사용하여 희생시켰고, 그 다음 10% 버퍼 포르말린으로 관류-고정 (perfusion-fixed)하였다. 이들의 뇌는 그 다음 제거되었고, 적어도 24시간 동안 포르말린에 침지시켜, 4℃에 저장하였다.
3.2 조직 추출
조직 추출은 Mercken et al. (1992 Acta Neuropathol., 84, 265-272)에 따라 수행하였다.
3.3 면역 블럿
인산-타우 단백질은 NuPAGE®LDS 샘플 버퍼 (Invitrogen)에서 재현탁되었다. 뇌 추출물은 8　M 우레아를 함유하는 NuPAGE ® LDS 샘플 버퍼 (Invitrogen)에서 재현탁되었다. NuPAGE Novex 4-12% Bis-tris 겔 (Invitrogen)을 이용한 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 (PAGE)으로 분리한 후, Hybond-C (Amersham)상에서의 반-건조 이동 및 웨스턴 블럿팅은 Xcell II 블럿 모듈 (Invitrogen)을 이용하여 수행되었다. 면역화학 반응 전에, 막은 4% 탈지유 용액에서 차단되었다. 막의 면역 블럿은 (His 또는 Strep 태그를 갖는) VHH 또는 항 p-타우 422 mAb (Grueninger et al. 2011 Mol Cell Biochem., 357, 199-207)로 달성되고, 과산화효소 표지된 염소 항-토끼 면역글로불린 (Abcam)을 수반하는 토끼 항-His 태그 (eBioscience) 다클론성 항체에 의해 또는 과산화효소 표지된 토끼 항-마우스 면역글로블린 (Bio-rad)을 수반하는 (기탁번호 I-4703호로 CNCM에 제출된 융합세포 (hybridoma)에 의해 생산된 항체 C23-21과 같은) 항-Strep 태그 단일클론 항체에 의해 밝혀졌다. 마지막으로, 과산화효소 활성은 화학형광 키트 (GE Healthcare)를 이용하여 시각화된다.
3.4 ELISA
마이크로적정 플레이트 (Nunc, Denmark)는 PBS 내에 희석된 난백 알부민 단백질에 결합된 1㎍/㎖의 SEQ ID NO. 6의 인산-타우 또는 타우 단백질 또는 인산-펩티드로 4℃에서 밤새 배양하여 코팅하였다. 상기 플레이트는 PBS 내의 버퍼 0.1% Tween 20으로 세척하였다. (His 또는 Strep 태그를 갖는) Tau-A2는 PBS 내의 버퍼 0.5% 젤라틴 0.1% Tween 20에서 희석되었다. 37℃에서 2시간 배양 후, 플레이트는 과산화효소 표지된 염소 항-토끼 면역글로불린 (Abcam)이 수반되는, 토끼 항-His 태그 다클론성 항체 (eBiosciences) 또는 과산화효소 표지된 항-마우스 면역글로블린 (Bio-rad)이 수반되는 (항체 C23-21와 같은) 항-Strep 태그 단일클론 항체를 각각 첨가하기 전에 다시 세척하였으며, 마지막으로 제조자의 프로토콜에 따라 OPD (o-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드, Dako)에 의해 밝혀졌다.
3.5 서열 분석
VHH 암호화 DNAs는 GATC Biotech로 서열 분석했으며, 서열은 Serial Cloner로 처리하였다.
3.6 pI의 결정
VHHs의 pI는 IEF 2-9 Gel (Invitrogen)를 이용한 등전점 초점법에 의해 결정하였다. pH 8.5 내지 10.5를 포함하는 염기성 범위의 겔에서 최적의 단백질 분석이 가능하기 때문에, 양극에서 샘플 응용과 함께 NEPGHE (비평형 pH 구배 겔 전기영동)는 사용되었다. 프로토콜은 SERVAGel IEF 3-10 지침서에 자세히 기술되어 있다.
3.7 면역조직화학 및 면역형광법
면역조직화학은 포르말린-고정된 조직 (파라핀-삽입 또는 냉동된 절편 또는 바이브라톰 절편 (vibratome sections)) 상에서 수행하였다. 표준 IHC 프로토콜을 적용하였으며, 각각의 조직 조건에 따라 조정하였다. 대부분의 면역염색 실험은 파라핀 절편을 사용하여 수행되기 때문에, 파라핀-삽입된 재료의 구체적인 프로토콜은 여기에 기재된다. 뇌조직의 면역염색은 4㎛ 두께의 파라핀 절편 상에서 수행하였다. 인간 및 마우스 조직 모두는 AD를 갖는 인간 환자 또는 다른 타우병증 및 Tg4510 마우스 (Santacruz et al. 2005 Science, 309, 476-481)를 사용하였다. 절편은 크실렌에서 파라핀을 제거하였고, 에탄올 (100%, 90%, 및 70%)을 통해 각각의 용액마다 5분씩 다시 수화하였으며, 최종적으로 10분간 흐르는 수돗물로 처리하였다. 그 후, 이들을 98% 포름산에서 5분간 배양하였고, 흐르는 수돗물로 다시 세척하였으며, 3% 과산화수소 및 20% 메탄올을 갖는 내재성 과산화효소로 냉각시켰고, 최종적으로 물로 세척하였다. 비-특이적인 결합은 상기 절편을 30분간 2% 소 혈청 알부민으로 TBS+0.5% Tween에서 배양함으로써 차단되었다. 그 후, 일차 항체 (His 또는 Strep 태그를 갖는 1-10 ㎍/㎖의 VHH)의 적절한 희석이 적용되었고, 슬라이스는 4℃에서 가습 챔버 내에서 밤새 배양하였다. 슬라이스는 TBS-Tween로 세척하였고, 1/1000에 대하여 이차 항체 토끼 항-His Tag 또는 직접 제작한 비오틴 결합된 항-strep mAb C23-21로 TBS-Tween에서 실온으로 1시간 동안 배양하였다. 그 후, 슬라이스는 제조자의 지침에 따라 Dako REALTM 검출 시스템의 제재, Peroxidase/DAB+와 함께 배양하였다. 발색성 (Chromogenic) (DAB) 발현은 우수한 신호-대-잡음 비가 획득될 때까지 (약 5분) 얻어졌다. TBS-Tween로 세척한 후, 슬라이스는 헤마톡실린으로 대조 염색하였다. NFTs의 표지를 위해, 바이오티닐 mAb AT8 (ThermoScientific)은 평행하게 양성 대조구로 사용되었다.
Tau-A2-S-AF488을 사용하는 NFTs의 면역형광 염색은 바이브라톰 (Leica VT1000S)을 사용하여 Tg4510 마우스로부터 얻어진 40㎛ 두께 자유 부유 절편에 대해 수행되었다. PBS에서 3 x 5분 세척 후, 절편은 BSA의 2% 함유하는 PBS-트리톤 0.2%로 15분 동안 배양시켜 차단되었고, 그 후, PBS-트리톤 0.2%에서 1㎍/㎖의 Tau-A2-S-AF488에 의해 대체되었고, 4℃에서 밤새도록 배양되었다. 절편은 최종적으로 PBS로 세척되었고, 수성 봉입제 (aqueous mounting medium) (Mowiol)로 봉입되었다.
4 이-광자 영상 및 상관관계 면역조직화학에 의해 Tau-A2 및 Tau-A2 콘쥬게이트의 생체 내 평가
4.1 피험자
Tau-A2, 및 Tau-A2-S-(DOTA/Gd)3의 생체 내 평가는 Tg4510 형질전환 마우스에 대해 수행되었다.
4.2 VHH 및 IHC 정위법을 이용한 주사
정위법을 이용한 주사는 0.5㎕/분의 비율로 주사 당 2㎕의 VHH을 갖는 Tg4510 암컷 형질전환 마취 마우스에서 수행되었다. 마우스는 이소플루란 (1-2%) 및 공기 (1 L/분)의 혼합물로 마취시켰다. 이들을 정위 틀에 올렸고, 두개골은 Dremel로 측면으로 구멍내었다. Blunt Hamilton 시린지는 MR 조영제를 주사하기 위하여 사용하였다. 각각의 마우스에 각각의 반구에서 전측 피질 및 해마에 4회 주사하였다. 전두 피질에서의 정위 좌표는 시상봉합과 관상봉합의 접합점 (bregma)으로부터 전방 +0.86㎜, 중앙선으로부터 측방 ±1.5㎜, 경뇌로부터 -0.65　㎜ 내강 쪽이었다. 해마에서 정위 좌표는 시상봉합과 관상봉합의 접합점으로부터 -2.18㎜ 후방에 있고, 중앙선으로부터 측방 ±1.5㎜, 경뇌로부터 -1.8　㎜ 내강 쪽이었다. 주사 후, 2 또는 24시간 경과 후, 마우스들을 안락사시켰고, PBS (pH 7.6) 내 4% 파라포름알데히드를 심장 내 살포하였다. 뇌는 제거되고 4℃에서 밤새도록 동일한 고정제로 후 고정하였다. 4㎛ 두께의 파라핀 절편은 제조되었다. 대뇌 조직에서 VHH의 존재는 전술된 면역조직화학 절차를 사용하여 검출되었다.
4.3 Tau-A2-S-AF488을 사용하여 Tg4510 마우스에서 이 광자 현미경 관찰
1) 두개골 절개 (craniotomy)
두 마리의 8개월된 Tg4510 마우스는 이소플루레인 (isoflurane) (순수 O2에 1% vol/vol)의 흡입에 의해 마취시켰고, 따뜻한 담요에 놓는다 (37℃). 정위 틀 (stereotaxic frame)은 운동 피질 (motor cortex)의 위치를 확인하기 위해 사용되었다. 50㎕의 2% 리도카인 (lidocaine)은 피부가 제거될 절개부 위치에 국소 마취를 위해 피하 주사되었다. 2㎜ 미만의 두개골 절개는 메스 (scalpel)를 사용하여 수행되었다. VHH Tau-A2-S-AF488의 대뇌 (intracerebral)의 주사의 경우에서, 경뇌막 (dura mater)은 절개된다. 정맥 주사의 경우에서, 경뇌막은 온전히 유지된다. 인공산물 (artifacts)의 이동을 피하기 위하여, 두개골 틈 (skull opening)은 2% 저 용융점 아가로오스 및 커버유리로 덮었다. 광학 창 (optical window)은 확보되고, 치과용 시멘트로 두개골을 봉합하여, 노출된 두개골, 상처 여백, 및 커버유리 에지 모두를 덮는다.
2) Tau-A2-S-AF488의 투여
대뇌의 주사: 1.2 ㎍ (1.5 ㎕)의 Tau-A2-S-AF488는 피질 표면으로부터 1.5㎜ 깊이에서 한 마리의 Tg4510 마우스의 뇌에 주사된다. 이-광자 영상은 그 다음 주사 후 4시간 동안 수행되었다.
정맥 주사: 270㎍ (150㎕)의 Tau-A2-S-AF488는 한 마리의 Tg4510 마우스의 미정맥 (caudal vein)에 천천히 주사된다. 이-광자 영상은 그 다음 3시간 동안 수행하였다.
3) 이-광자 영상
이-광자 영상은 이-광자 레이저-스캐닝 현미경 시스템 및 PrairieView software (Prairie Technologies, Middelton, WI, USA)로, 920nm로 조정된 2-광자 레이저 (MaiTai DeepSee, Spectra Physics, Mountain View, CA, USA)를 구비한 16x 0.9 NA 침수형 대물랜즈 (water immersion objective) (Nikon, Tokyo, Japan)을 사용하여 수행하였다. 영상은 0.5 ㎛의 픽셀 크기로 512 x 512에서 획득하였다. 조직에서 20mW 미만의 레이저 파워를 사용하는 것을 주의하여야 한다.
5. 토끼 다중클론 항-VHH 항체의 획득 (Obtention)
정제된 알파카 면역글로블린은 한 마리의 토끼를 면역화시키기 위해 사용되었다. VHH에 대한 토끼 다중클론 항체는 2 단계로 정제하였다. 제1 다중클론 항체는 단백질 A-세파로오스 4B 비드를 사용하여 면역크로마토그래피에 의해 분리하였다. 그 다음 또 다른 면역크로마토그래피는 Tau-A2var-SH로 표지된 세파로오스 4B 비드를 사용하여 실현하였다. 상기 세파로오스 표지는 제조자의 지시 (GE)에 따라 실현하였다. 최종 정제된 항체는 총 토끼 항체의 1% 미만을 나타냈고, 토끼 다중클론 항-VHH 항체라 언급된다. 이들 항체는 Tau-A2 VHH에 결합한다.
결과
1. 특이적인 항-타우 VHH의 다클론성 반응, 라이브러리 구축, 및 선택
3 면역화 이후에, Inti (뇌 추출물) 및 Rascar (tau-pS422)의 혈청은 수집되었고, 인산-타우 및 비인산화 타우에 이들의 결합는 ELISA에 의해 분석되었다 (도 1). 비록 Inti의 면역 반응이 Rascar의 면역 반응보다 더 우수한 것으로 나타날지라도, Inti 및 Rascar의 혈청은 인산화 타우 및 비 인산화 타우 모두를 인지하였다. 그러나, 전자는 인산-타우 및 비인산-타우가 두드러지게 구분되지 않았고, 후자는 인산-타우에 대한 더 높은 면역 반응을 나타내었다.
혈청에 존재하는 항 인산-타우 항체의 하나 또는 몇몇이 고정된 마우스 조직에서 타우 병변을 인식할 수 있다는 것을 보장하기 위하여, IHC는 TauPS2APP 마우스로부터 냉동 마이크로톰 (microtome) 부유 절편 및 비-냉동 바이브라톰 (vibratome) 부유 절편 모두에 대해 수행되었다. Inti의 혈청은 타우 변병의 어떤 면역 염색 (immune staining)을 나타내지 않지만, 반면 Rascar의 혈청은 마이크로톰 및 바이브라톰 절편 모두에 대해 NFTs의 특이적인 타우 염색을 입증하였다 (데이터로 나타내지 않음).
Inti 다중클론 혈청으로 IHC에서 NFTs에 대한 면역검출 (immunodetection)의 부재에도 불구하고, 이것은 이의 혈장에서 인산-타우 특이 항체의 존재를 배제할 수 없다. 실제로, IHC 신호의 결핍은, TauPS2APP 마우스의 NFTs에 존재하는 인산-타우의 에피토프 (epitope)를 인지할 수 있는, 항 인산-타우 항체의 저주파에 기인할 수 있다. 이들 두 동물로부터 얻은 두 개의 라이브러리는 패닝 실험을 위해 모아진다 (pooled).
말초 혈액 임파구 (peripheral blood lymphocytes)로부터 전체 RNA는 cDNA 합성을 위한 주형으로 사용되었다. 이러한 cDNA를 사용하여, VHH 엔코딩 서열은 그 다음 PCR에 의해 증폭하였으며, 벡터 pHEN1에서 클로닝하였다. 연속적인 형질전환으로 각각 약 3x108 클론의 두 개의 라이브러리를 구축하였다. 라이브러리 모두는 모아지고, 최상의 친화성을 나타내는 VHHs는 인산화 타우와 3회 패닝 사이클을 통하여 파지 디스플레이에 의해 선택되었다. 96 개체의 클론이 인산화 타우에 대해 및 타우 단백질에 대해 ELISA에 의하여 시험되었다. 오직 하나의 클론은 인산화 타우 (VHH Tau-A2) 상에서 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다.
이 VHHs는 벡터 pET23 또는 벡터 pASK IBA2에서 서브클론되어, 각각 His-태그 또는 스트렙타비딘-태그로, VHH의 높은 수준의 발현을 가능하게 한다. <1 mg/l의 세균 배양의 수율은 얻어진다. 단일 도메인 산물은 SDS-PAGE 및 RP-HPLC/MS에 의해 균질성에서 순수한 것으로 나타났으며 (데이터 나타나지 않음), 이의 pI 값은 9.5 이상이다. 동적 광 산란 실험 (Dynamic light scattering experiments)은 Tau-A2가 단량체 (RH=4.5 ± 0.3 nm)이고, 정제 후에 응집되지 않은 것을 나타낸다. VHH Tau-A2의 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 4로 언급된다.
2. VHH Tau-A2 의해 NFTs의 인지
2.1 C-말단 타우 펩티드에서 인산화 세린 422를 인지하는 VHH Tau-A2
몇 가지 세린 및 트레오닌은 타우의 발병의 형태 (pathogenic form)에 대해 인산화된다. 에피토프 인지에서 인산화의 역할을 평가하기 위해, ELISA는 난백 알부민 (Ova) 단백질에 결합된, 타우 단백질 (서열 CSIDMVDS(PO3H2)PQLATLAD; SEQ ID NO. 6)의 C-말단으로부터 유래된 단일 인산-펩티드 및 인산화 타우에 대해 수행된다. 인산화 타우는 S422를 포함하는 다중 부위에서 인산화된 전체-길이 타우 단백질이다. VHH Tau-A2는 두 화합물을 결합시켜, VHH Tau-A2가 인산 세린 422 (pS422)를 포함하는 에피토프를 인지했음을 의미한다 (도 2).
2.2 NFTs에 대한 VHH Tau-A2의 면역반응성
VHH-특이 면역반응성의 분포는 인간 AD 뇌, 다른 타우병증 (전측두엽 치매 [FTD], 진행성 핵성마비 [PSP] 및 픽 병 [PD])에서 얻은 조직 및 형질전환 Tg4510 마우스 뇌에서 조사되었다.
VHH Tau-A2는 AD 환자로부터 얻은 파라핀 절편에서 NFTs를 면역검출하는 우수한 능력을 보였다 (도 3a). 또한, 타우-양성 글리알 함유물 (glial inclusion)은 FTD 경우 (핍지교 코일체 (oligodendroglial coiled bodies)) 및 PSP 경우 (아스트로사이트 다발 (astrocytic tuft)에서 관찰되었다 (도 3b). 흥미롭게도, 기준 항-타우 AT8 mAb에 의해 확인된 통상적인 세포 함유물 (픽 체 (Pick bodies))은 Tau-A2에 대해 음성이어서, 약간의 특이성의 VHH를 분명히 보여준다 (도 3c). 다른 타우병증와 대조적으로, 픽 체는 3R 타우 단백질로 오직 구성된다. 그러므로, 이것은 Tau-A2는 4 반복으로 타우를 주로 인지하게 가수분해될 수 있다. 표지는 와일드 타입 마우스로부터 얻은 조직에서 관찰되지 않았다.
파라핀-포매 조직 (paraffin-embedded tissues)에 대한 병렬화 결과에서, VHH Tau-A2를 사용하는 NFT 면역검출이 마우스 자유-부유 바이브라톰 절편에서 쉽게 얻어질 수 있다는 것을 나타낸다 (도 4).
뇌 조직에 대한 VHH Tau-A2의 면역반응성을 확인하기 위해, 웨스턴-블럿 면역분석은 AD 환자로부터 얻어진 뇌 추출물에 대해 수행되었다. Tau-pS422 mAb (Grueninger et al. 2011 Mol Cell Biochem., 357, 199-207)는 기준 항체로서 사용되었다. 재조합 인산-타우 (p-tau)는 SDS-PAGE 겔 상에 병행으로 로딩되었다. 인산-타우 단백질은 VHH Tau-A2 및 Tau-pS422 mAb 모두에 의해 보여진다. 70 내지 100 kDa의 인산화 타우에 상응하는, 하나의 주 밴드는, AD 추출물에서 Tau-A2 및 Tau-pS422로 면역검출되었다. Tau-pS422 mAb로, 130 내지 150 kDa의 분자량을 갖는 두 개의 부가적인 밴드는 AD 뇌에서 응집된 tau-pS422의 존재를 나타내는 것으로 관찰되었고, 이것은 Tau-A2에 의해서는 매우 조금 보여졌다 (도 5).
3. Alexa Fluor 488 말레이미도에 결합한 Cys-유전조작된 Tau-A2 및 항체
N 말단으로부터 C 말단으로 6-히스티딘 태그, 트롬빈 절단 부위, G3S 스페이서가 수반되는 VHH Tau-A2 서열, 및 세 개의 과잉 아미노산 CSA를 함유하는 Cys-유전조작된 Tau-A2는 벡터 pET23d에서 클론되어 높은 수준으로 발현한다 (Tau-A2-SH 또는 A2-SH로 언급된다; SEQ ID NO. 14). Tau-A2-SH는 티오부가에 의해 말레이미도 Alexa Fluor® 488에 콘쥬게이트된다. 최종 산물 Tau-A2-S-AF488는 SDS-PAGE, IEF/NEPGHE (도 7a 및 7b) 및 RP-HPLC/MS에 의해 분석된다. SDS-PAGE 및 RP-HPLC/MS에 의해 균질성에서 순수한 것으로 나타났다. 모든 분석은 Tau-A2-SH가 VHH Tau-A2 상에 단일 AF488을 갖는, 뚜렷한 콘쥬게이트 (이하 Tau-A2-S-AF488로 언급됨)로 전체적으로 전환되었다는 것을 나타내었다. Tau-A2-SH는 약 10 (9.5 내지 10.5)의 pI를 보유하고, 이 값은 AF488 콘쥬게이션 이후, 다소 감소하지만, 여전히 > 9.5를 유지한다 (도 7b 참조). Tau-A2-SH 및 Tau-A2-S-AF488의 유체역학적 반경 (hydrodynamic radius) (RH)은 DLS에 의해 개별적으로 측정된다. 시간에 따른 크기 분포는 Tau-A2-SH에 대해 2.66 ± 0.0788 nm의 평균 RH 및 Tau-A2-S-AF488에 대해 3.576 ± 0.225 nm의 평균 RH를 나타내었고, 이것은 이들 모두가 용액에서 단량체 형태인 것을 의미한다.
4. VHH Tau-A2-S-AF488로 NFTs의 검출
4.1 Tg4510 마우스의 뇌 슬라이스 상에 생체 내 표지
마우스 뇌 절편으로 직접 배양 이후에, Tau-A2-S-AF488은 표준 IHC (도 7c-d) 및 직접 면역형광 염색법 (도 7e)에 의해 Tg4510 마우스에서 NFTs을 검출하는 우수한 능력을 보여준다.
4.2 대뇌 내 주사 후 이-광자 영상법
생체 내에서 Tau-A2-S-AF488의 이-광자 영상은 두개골 절개 및 경뇌막의 천공 후에 Tg4510 마우스 뇌에 1.2 ㎍ (1.5 ㎕)의 직접 대뇌 내 주사 이후에 수행되었다. 다량의 CSF는 관찰되었고, (주사 전에도) 높은 자가-형광은 관찰되었다. 적절한 이-광자 영상에 대한 이들 제한에도 불구하고, NFTs의 특이적 염색은 상부 피질 주사 후 검출되었다 (도 8).
4.3 VHH Tau-A2-S-AF488의 정맥 주사 후 이-광자 영상법
10mg/kg 투여량의 TauA2-S-AF488은 두 마리의 Tg4510 마우스의 꼬리 정맥 (270㎍, 150㎕)에 주사하였다. 이들 마우스의 BBB 온전함 (integrity)은 MRI에 의해 사전 점검되었고, 마우스에서 신호 변경의 부재는 BBB의 파괴가 없는 것을 의미한다 (나타낸 데이터 없음). 뇌에서 콘쥬게이트 혈관외 유출 (extravasation) 및 염색은 뇌 창 (brain window) (z=표면으로부터 360㎛ 깊이까지)에 대해 이-광자 현미경을 사용하여 주사 후 4시간 동안 기록하였다. 도 9a는 동일한 영역에서 180분까지 시간에 따른 Tau-A2-S-AF488의 생체 내 영상 (최대 강도 투사 - MIP)을 나타낸다. IV 주사 몇 초 후에, 강한 염색의 나무 모양의 혈관은 관찰되었고, 20분 후에 오로지 일부 모세 혈관만이 염색되어 남아 극적으로 감소된다. 이것은 순환 (10-20분)으로 콘쥬게이트된 VHH의 반감기가 짧은 것을 의미한다. IV 주사 120분 후에, NFTs은 가시화되기 시작한다. 적색 채널 (red channel)에서 신호의 부재는 형광 신호가 특이적이고 (나타낸 데이터 없음) 및 일반적인 자가형광에 기인하지 않는다는 것을 입증한다. 뇌에서 VHH Tau-A2-S-AF488 혈관외 유출 및 염색은 뇌 창 (중간 피질 표면에서 350㎛ 깊이까지)에 대해 이-광자 현미경을 사용하여 주사 후 3시간 동안 기록된다. 강한 자가-형광 배경 및 다량의 CSF (상기 참조)에 부가하여, Tg4510 마우스는 현저한 뇌 위축증 (cerebral atrophy)을 나타낸다. IV 주사 몇 초 후에, 강한 염색의 치밀하게-팩킹된 혈관은 관찰되었다 (나타낸 데이터 없음). NFTs의 특이 타우 염색은 잔여 자가형광 신호에도 불구하고 주사 2시간 후 관찰되었다. NFTs의 지속적이고 특이적 표지는, Tau-A2-S-AF488의 뇌 반감기가 몇 시간 이상으로 확장했음을 의미하는, 주사 3시간 후에 관찰되었다 (도 9a).
Tau-A2-S-AF488의 정맥 주사 4시간 후에, 뇌는 채취되고, 파라핀 절편은 준비되었다. IHC는 토끼 다중클론 항-VHH 항체로 수행되어, Tau-A2-S-AF488에 의한 NFTs의 표지 및 확산을 확인하였다 (도 9b).
6. 대조 실험
NFTs-없는 마우스에서 평가
Tau-A2-S-AF488은 와일드 타입인, NFT-없는 C57BL/6 마우스에 정맥 주사된다. 뇌 연조직에서 특이적 생체 내 염색은 이-광자 현미경 분석을 사용하여 관찰되지 않았다 (나타낸 데이터 없음).
종래의 IgG 항체와 비교
Tg4510 마우스에 AF488-콘쥬게이트된 항-Tau mAb (Grueninger et al. 2010 Neurobiol. Dis., 37, 294-306)의 IV 주사는 NFTs의 검출이 가능하지 않아 이 표준 항-Tau-pS422 면역글로빈의 상당한 혈관외 유출이 없음을 나타내었다.
7. 결론
IV 주사 후에 이-광자 현미경을 사용하여, VHH Tau-A2-S-AF488은 이의 세포질 표적에 도달하기 위해 제2 (원형질막) 배리어를 가로지른 이후에 뉴런으로 침투하고, BBB를 가로지르는 능력을 보여준다. NFTs 표지의 장-기간 검출 (3시간)은 또한 뇌에서 이 VHH의 긴 반감기를 의미한다.
8. MRI 조영제에 결합한 항체
VHH Tau-A2-SH는 킬레이트제로서 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산 (DOTA)을 사용하여 가돌리늄 (MRI 조영제)으로 표지되었다. 사용된 부위 특이 결합 전략은 합성 말레이미도-(DOTA/Gd)3 화합물에 Tau-A2-SH의 티오부가를 포함한다. Tau-A2-SH는, RP-HPLC/MS에 의해 나타낸 바와 같이, 65% 수율로, 뚜렷한 콘쥬게이트 Tau-A2-S-(DOTA/Gd)3로 전체적으로 전환되었다. Tau-A2-S-(DOTA/Gd)3의 pI는 표지되지 않은 Tau-A2-SH 중 하나와 비교하여 다소 감소되었다 (나타낸 데이터는 없음).
실시 예 2: TAU-A2-SH의 변이체의 합성: TAU-A2VAR-SH
VHH Tau-A2는 인산화 Tau를 특이적으로 검출하지만, 이의 생산 수준은 오히려 평균 150㎍/L으로, 낮고, 응집하는 경향이 있다. 따라서 개선된 특성을 갖는 VHH Tau-A2의 변이체를 제공할 필요가 있다.
SEQ ID NO. 14의 VHH Tau-A2-SH의 2 소수성 영역에 위치된 두 개의 소수성 아미노산은 돌연변이된다: 위치 76에 이소루신은 글리신에 의해 대체되고 (I76G) 및 위치 110에 발린은 글리신에 의해 대체되었다 (V110G) (도 10). 이들 돌연변이는 GRAVY 지수가 Tau-A2-SH에 대해 -0.280로부터 변이체에 대해 -0.365로 증가함에 따라 VHH의 친수성을 증가시킨다 (화합물의 상대적인 친수성 또는 소수성 지수 (hydropathicity index)인 GRAVY 또는 Grand 평균은 단백질의 용해도를 나타낸다: 양성 GRAVY (소수성), 음성 GRAVY (친수성)). 위치 26에서 글루타민은 또한 글루타민산에 의해 돌연변이되고 (Q26E), 아스파르트산 (D) 및 발린 (V)은 위치 22와 23 사이에 첨가되어 pI (덜 염기성)를 다소 감소시킨다 (도 10). 세 개의 이들 돌연변이된 아미노산 (D23, E26, 및 Gl lO)은 CDRs 밖에 위치된다. 이 돌연변이는 Tau-A2var-SH라 언급된다 (SEQ ID NO. 17).
VHH Tau-A2var-SH (SEQ ID NO. 17)는 pET23d 벡터에서 클론되고, E.coli에서 발현되었다. 이것은 이미다졸에서 용출시켜 Ni-NTA 레진 상에서 정제되었다. Tau-A2var-SH와 비교하여 Tau-A2-SH의 분석은 몇 가지 방법에 의해 수행하였다:
- SDS-PAGE는 약 15-16KDa의 겉보기 분자량에서 오직 하나의 밴드를 보여준다 (도 11a). 더 우수한 생산량의 Tau-A2var-SH는 부모 상대물 (parental counterpart)보다 5배 많은, 0.8-1 mg/L로 추정된 발현율로 관찰되었다. 더군다나, Tau-A2var-SH는 더 낮은 응집하는 경향을 갖는다. pI는 Tau-A2-SH보다 다소 덜 염기성인 9.68이다 (도 11b).
- 인산-타우를 인지하기 위한 두 VHH의 능력은 ELISA에 의해 평가되었다 (도 11c). Tau-A2var-SH 및 Tau-A2-SH의 결합 곡선의 비교는 이들의 인산-타우의 인지에 대한 어떤 차이도 나타내지 않았다 (도 11c).
- Tau-A2var-SH의 기능적인 활성을 더욱 평가하기 위해, IHC는 그 다음 NFTs의 마우스 모델 (Tg4510 마우스)로부터 얻은 조직에 대해 수행되었다. 다른 화합물로 뇌 슬라이스의 배양 및 항-His 2차 항체에 의한 발현 (revelation) 후에, NFTs의 검출은 마우스 조직에 대해 두 화합물로 관찰되었다 (도 11d). 면역염색은 Tau-A2와 비교하면 Tau-A2var를 사용하여 다소 향상되었다.
VHH Tau-A2var-SH는 친화성 컬럼 용출 후에, 비-투석된 단백질 용액에 대해 유사한 절차를 사용하여 표지되었다.
그 다음 VHH Tau-A2var-S-(DOTA/Gd)3로 NFTs의 생체 내 검출 능력은 실현되었다. Tau-A2var-S-(DOTA/Gd)3의 10mg/kg 투여량은 두 마리의 Tg4510 마우스의 테일 정맥 (270㎍, 150μL)에 주사하였다. Tau-A2var-S-(DOTA/Gd)3의 정맥 주사 후 4시간 동안, 뇌는 채취되고, 5㎛-두께 파라핀 절편은 제조되었다. IHC는 그 다음 토끼 다중클론 항-VHH 항체로 수행되었다. NFTs는 피질에서 표지되었다 (도 12). 이들 데이터는 Tau-A2var-S-(DOTA/Gd)3에 의한 NFTs의 뇌 침투, 확산 및 표지를 확인하였다.
결론
이들 결과는 Tau-A2var이 인산 타우 및 NFTs의 인지를 위해 Tau-A2와 유사한 방식에서 거동하는 것을 나타낸다. IV 주사 이후에 IHC 연구를 이용하면, VHH Tau-A2var-S-(DOTA/Gd)3는 이의 세포질 표적에 도달하기 위해 2차 (원형질막) 배리어를 가로지른 이후에 뉴런에 침투하고, BBB를 가로지르는 이의 능력을 보여준다.
SEQUENCE LISTING <110> F. HOFFMANN-LA ROCHE AG INSTITUT PASTEUR <120> CAMELID SINGLE-DOMAIN ANTIBODY DIRECTED AGAINST PHOSPHORYLATED TAU PROTEINS AND METHODS FOR PRODUCING CONJUGATES THEREOF <130> XRN/cc/F226-202 <160> 14 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 of VHH Tau-A2 <400> 1 Ala Ala Ser Gly Arg Ser Phe Ser Gly Ser Thr Met Glu 1 5 10 <210> 2 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 of VHH Tau-A2 <400> 2 Ala Ile Arg Thr Ile Ser Ser Arg Thr Tyr Tyr Val Asp 1 5 10 <210> 3 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 of VHH Tau-A2 <400> 3 Arg Phe Ser Gly Thr Ile Gly Thr Thr Ser Ser Val Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 128 <212> PRT <213> Lama pacos <220> <221> DOMAIN <222> (25)..(37) <223> CDR1 of VHH Tau-A2 <220> <221> DOMAIN <222> (52)..(64) <223> CDR2 of VHH Tau-A2 <220> <221> DOMAIN <222> (101)..(114) <223> CDR3 of VHH Tau-A2 <400> 4 Met Ala Glu Val Gln Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala 1 5 10 15 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ser Phe Ser 20 25 30 Gly Ser Thr Met Glu Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Lys 35 40 45 Phe Val Ala Ala Ile Arg Thr Ile Ser Ser Arg Thr Tyr Tyr Val Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Thr Lys Asn Thr 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Leu Asn Ser Leu Lys Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Ala Arg Phe Ser Gly Thr Ile Gly Thr Thr Ser Ser Val 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala 115 120 125 <210> 5 <211> 119 <212> PRT <213> Lama pacos <400> 5 Gln Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu 1 5 10 15 Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ser Phe Ser Gly Ser Thr Met 20 25 30 Glu Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Lys Phe Val Ala Ala 35 40 45 Ile Arg Thr Ile Ser Ser Arg Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Thr Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln 65 70 75 80 Leu Asn Ser Leu Lys Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala 85 90 95 Arg Phe Ser Gly Thr Ile Gly Thr Thr Ser Ser Val Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Gln Val Thr Val 115 <210> 6 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> single phospho-peptide derived from the C-terminus of the tau protein <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Phosphorylation of the serine <400> 6 Cys Ser Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp 1 5 10 15 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 cgccatcaag gtaccagttg a 21 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 gatgtgcagc tgcaggcgtc tggrggagg 29 <210> 9 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 catgccatga ctcgcggccc agccggccat ggccgakgts cagct 45 <210> 10 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 ggactagttg cggccgctga ggagacggtg acctg 35 <210> 11 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Spacer <400> 11 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 12 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> His tag <400> 12 His His His His His His 1 5 <210> 13 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Thrombin cleavage site <400> 13 Leu Val Pro Arg Gly Ser 1 5 <210> 14 <211> 148 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH Tau-A2-SH <220> <221> DOMAIN <222> (5)..(10) <223> 6xHis tag <220> <221> DOMAIN <222> (14)..(19) <223> Thrombin cleavage site <220> <221> DOMAIN <222> (23)..(141) <223> VHH Tau-A2 <220> <221> DOMAIN <222> (142)..(145) <223> Spacer <220> <221> DOMAIN <222> (146)..(148) <223> Spacer <400> 14 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 Arg Gly Ser Ala Ala Ala Gln Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Leu Val 20 25 30 Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ser 35 40 45 Phe Ser Gly Ser Thr Met Glu Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu 50 55 60 Arg Lys Phe Val Ala Ala Ile Arg Thr Ile Ser Ser Arg Thr Tyr Tyr 65 70 75 80 Val Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Thr Lys 85 90 95 Asn Thr Val Tyr Leu Gln Leu Asn Ser Leu Lys Val Glu Asp Thr Ala 100 105 110 Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Phe Ser Gly Thr Ile Gly Thr Thr Ser 115 120 125 Ser Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Cys Ser Ala 145

Claims (35)

  1. 서열 CSIDMVDS(PO3H2)PQLATLAD (SEQ ID NO. 6)의 타우 단백질의 C-말단으로부터 유래된 단일 인산-펩티드 또는 사람에서 얻은 인산-타우 풍부 알츠하이머병 뇌 추출물로 낙타과 동물을 면역화시키는 방법에 의해 얻어질 수 있고, 인산화 타우 단백질로 향하는 낙타과 중-쇄 항체의 분리된 가변 도메인 (VHH).
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 VHH는 인산화 타우 단백질의 인산화 세린 422를 결합시키는 낙타과 중-쇄 항체의 분리된 가변 도메인 (VHH).
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서,
    상기 방법은:
    (a)　낙타과, 바람직하게는 알파카 (Lama pacos)를 서열 CSIDMVDS(PO3H2)PQLATLAD (SEQ ID NO. 6)의 타우 단백질의 C-말단으로부터 유래된 단일 인산-펩티드 또는 사람에서 얻은 인산-타우 풍부 알츠하이머병 뇌 추출물로 면역화시키는 단계,
    (b)　면역화된 낙타과의 말초 임파구를 분리하는 단계, 전체 RNA를 얻는 단계 및 상응하는 cDNAs를 합성하는 단계,
    (c)　VHHs를 인코딩하는 cDNA 단편의 라이브러리를 구축하는 단계,
    (d)　단계 (c)에서 얻은 VHH-인코딩 cDNAs를 PCR을 사용하여 mRNA로 전사하는 단계, 상기 mRNA를 리보솜 디스플레이 포맷으로 전환하는 단계, 및 리보솜 디스플레이에 의해 VHH를 선택하는 단계, 및
    (e)　상기 VHH 도메인을 벡터에서 발현시키는 단계를 포함하는 낙타과 중-쇄 항체의 분리된 가변 도메인 (VHH).
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 낙타과는 알파카인 낙타과 중-쇄 항체의 분리된 가변 도메인 (VHH).
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 VHH 도메인의 아미노산 서열은, N-말단으로부터 C-말단으로, 아미노산 서열 SEQ ID NO. 1, 아미노산 서열 SEQ ID NO. 2 및 아미노산 서열 SEQ ID NO. 3을 포함하는 낙타과 중-쇄 항체의 분리된 가변 도메인 (VHH).
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 VHH 도메인은 아미노산 서열 SEQ ID NO. 4 또는 SEQ ID NO. 5로 이루어지는 낙타과 중-쇄 항체의 분리된 가변 도메인 (VHH).
  7. SEQ ID NO. 5의 VHH의 분리된 변이체로서, 상기 VHH 변이체는 인산화 타우 단백질의 인산화 세린 422로 향하며, 여기서 상기 변이체의 아미노산 서열은 아미노산 서열 SEQ ID NO: 5와 적어도 95% 상동성을 갖는 분리된 VHH 변이체.
  8. 청구항 7에 있어서,
    상기 분리된 VHH 변이체의 아미노산 서열은, N-말단으로부터 C-말단으로, 아미노산 서열 SEQ ID NO. 1, 아미노산 서열 SEQ ID NO. 2 및 아미노산 서열 SEQ ID NO. 3을 포함하는 분리된 VHH 변이체.
  9. 청구항 7에 있어서,
    상기 분리된 VHH 변이체는 하기 돌연변이를 갖는 아미노산 서열 SEQ ID NO. 5를 갖는 분리된 VHH 변이체:
    - 아미노산 서열 SEQ ID NO. 5의 위치 3에서 글루타민 잔기 (Gin, Q)가 아스파르트산 (Asp, D) 및 글루타민산 (Glu, E)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기, 바람직하게는 Glu로 치환된 돌연변이,
    - 아미노산 서열 SEQ ID NO. 5의 위치 52에서 이소루신 잔기 (Ile, I)가 알라닌 (Ala, A) 및 글리신 (Gly, G)으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기, 바람직하게는 Gly로 치환된 돌연변이,
    - 아미노산 서열 SEQ ID NO. 5의 위치 86에서 발린 잔기 (Val, V)가 알라닌 (Ala, A), 세린 (Ser, S), 트레오닌 (Thr, T), 아스파라긴 (Asn, N), 글루타민 (Gin, Q), 아스파르트산 (Asp, D), 글루탐산 (Glu, E), 리신 (Lys, K), 알기닌 (Arg, R) 및 글리신 (Gly, G)으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기, 바람직하게는 Gly로 치환된 돌연변이, 및
    - 선택적으로 두 개의 아미노산 잔기가 아미노산 서열 SEQ ID NO. 5의 N-말단 위치에 첨가되고, 디펩티드 글루탐산-발린 (E-V) 및 아스파르트산-발린 (D-V)으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 바람직하게는 D-V인 돌연변이.
  10. 청구항 7에 있어서,
    상기 분리된 VHH 변이체는 아미노산 서열 SEQ ID NO: 15 또는 SEQ ID NO: 16으로 이루어지는 분리된 VHH 변이체.
  11. 청구항 1 내지 6중 어느 한 항에 따른 VHH 또는 청구항 7 내지 10중 어느 한 항에 따른 VHH 변이체를 포함하는 폴리펩티드로 이루어진 VHH 유도체로서, 상기 폴리펩티드에 포함된 VHH 또는 VHH 변이체는 인산화 타우 단백질을 결합할 수 있는 VHH 유도체.
  12. 청구항 11에 있어서,
    상기 VHH 유도체는 식 P-C-Z 또는 Z-C-P를 가지며, 여기서:
    P는 청구항 1 내지 6중 어느 한 항에 따른 VHH 또는 청구항 7 내지 10중 어느 한 항에 따른 VHH 변이체를 포함하거나 또는 이루어진 100-500의 아미노산 펩티드이고, 여기서 상기 아미노산 서열은 접근 가능한 감소된 시스테인 잔기를 갖지 않고,
    C는 시스테인 잔기이며,
    Z는 1 내지 10의 아미노산 스페이서, 바람직하게는 1 내지 10의 중성 또는 음전하를 띠는 아미노산 스페이서를 나타내며, 여기서 Z의 아미노산 잔기는 같거나 다르고, Z는 시스테인 잔기를 함유하지 않는다.
  13. 청구항 1 내지 6중 어느 한 항의 VHH 또는 청구항 7 내지 10중 어느 한 항에 따른 VHH 변이체 또는 청구항 11 또는 12의 VHH 유도체를 인코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  14. 숙주 세포 내에서 폴리뉴클레오티드의 전사 조절을 가능케 하는 전사 프로모터의 제어를 받는 청구항 13의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 카세트.
  15. 청구항 13의 폴리뉴클레오티드 또는 청구항 14의 재조합 발현 카세트를 포함하는 재조합 벡터.
  16. 청구항 14의 재조합 발현 카세트 또는 청구항 15의 재조합 벡터를 함유하는 숙주 세포.
  17. 관심 물질에 직접적 또는 간접적으로, 공유결합으로 또는 비-공유결합으로 연결된, 청구항 1 내지 6중 어느 한 항의 VHH 또는 청구항 7 내지 10중 어느 한 항에 따른 VHH 변이체 또는 청구항 11 또는 12의 VHH 유도체를 포함하는 진단 또는 치료 시약.
  18. 청구항 17에 있어서,
    상기 VHH 유도체는 청구항 12에 정의된 바와 같고, 상기 VHH 유도체의 시스테인 잔기 C는 설파이드 결합을 통해 관심 물질에 연결되는 진단 또는 치료 시약.
  19. 청구항 18에 있어서,
    상기 시스테인 잔기 C는 관심 물질을 함유하는 티올-반응성 화합물을 통해 관심 물질에 연결되는 진단 또는 치료 시약.
  20. 청구항 19에 있어서,
    상기 티올-반응성 화합물은 말레이미도 화합물인 진단 또는 치료 시약.
  21. 청구항 17 내지 20중 어느 한 항에 있어서,
    상기 관심 물질은 펩티드, 효소, 핵산, 바이러스 및 화학 화합물로부터 선택되는 진단 또는 치료 시약.
  22. 청구항 17 내지 21중 어느 한 항에 있어서,
    상기 치료 화합물은 진통제 화합물, 항-염증제 화합물, 항우울제 화합물, 세포독성 화합물, 항경련제 화합물 또는 항-신경퇴행성 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 진단 또는 치료 시약.
  23. 청구항 17 내지 20중 어느 한 항에 있어서,
    상기 진단 화합물은 효소, 형광체, NMR 또는 MRI 조영제, 방사성 동위원소, 또는 나노입자로 이루어진 군으로부터 선택된 진단 또는 치료 시약.
  24. 청구항 23에 있어서,
    상기 진단 화합물은 가돌리늄 (Gd), 디스프로슘 (Dy) 및 망간 (Mn)인 상자성제, 및 산화철 또는 철 백금에 기초한 초상자성제, 및 18F, 13C, 23Na, 17O, 15N와 같은 X-핵으로부터 선택되고, 바람직하게는 가돌리늄인 NMR 또는 MRI 조영제인 진단 또는 치료 시약.
  25. 청구항 23에 있어서,
    상기 진단 화합물은, 녹색 형광 단백질 (GFP), 스펙트럼의 자외선 (UV) 부분의 파장에서 여기되는 청색 형광 염료, AMCA (7-아미노-4-메틸쿠마린-3-아세트산), Alexa Fluor 350, 청색광에 의하여 여기되는 녹색 형광 염료, FITC, Cy2, Alexa Fluor 488, 녹색광에 의하여 여기되는 적색 형광 염료, 로다민, Texas Red, Cy3, Alexa Fluor 염료 546, 564 및 594, 원-적색광으로 여기되는 염료 및 Cy5로 이루어진 군으로부터 선택된 형광체이고, 바람직하게는 Alexa Fluor 488인 진단 또는 치료 시약.
  26. 청구항 17에 있어서,
    상기 관심 물질은 청구항 21 내지 25중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 진단 또는 치료 화합물을 포함하는 리보솜 또는 중합 물질인 진단 또는 치료 시약.
  27. 청구항 1 내지 6중 어느 한 항의 VHH 또는 청구항 7 내지 10중 어느 한 항에 따른 VHH 변이체 또는 청구항 11 또는 12의 VHH 유도체와 관심 물질의 결합 단계를 포함하는, 청구항 1 내지 6중 어느 한 항의 VHH 또는 청구항 7 내지 10중 어느 한 항에 따른 VHH 변이체 또는 청구항 11 또는 12의 VHH 유도체와 관심 물질을 결합시키기 위한 비-부위 특이적 방법.
  28. 티올-반응성 작용기를 함유하는 관심 물질과 VHH 유도체의 콘쥬게이션 단계를 포함하는 청구항 12의 VHH 유도체와 관심 물질의 결합 결합시키기 위한 부위 특이적 방법.
  29. 청구항 1 내지 6중 어느 한 항의 VHH 또는 청구항 7 내지 10중 어느 한 항에 따른 VHH 변이체 또는 청구항 11 또는 12의 VHH 유도체 및 선택적으로 진단 시약, 또는 청구항 17-18 및 21-24중 어느 한 항의 진단 시약 및 진단 제재를 포함하는, 알츠하이머병 (AD), 피크 병 (PD), 전측두엽 치매 (FTD), 피질기저핵 변성 (CBD) 및 진행성 핵성마비 (PSP)를 포함하는 타우병증과 같은, 신경원섬유 매듭, 신경망 실 또는 이영양성 신경돌기에 의해 매개된 장애를 진단하거나 또는 관찰하거나, 또는 뇌 영상화를 위한 키트.
  30. 피험자에서, 알츠하이머병 (AD), 피크 병 (PD), 전측두엽 치매 (FTD), 피질기저핵 변성 (CBD) 및 진행성 핵성마비 (PSP)를 포함하는, 타우병증과 같은, 신경원섬유 매듭, 신경망 실 또는 이영양성 신경돌기에 의해 매개된 장애를 진단하거나 또는 관찰하기 위한 청구항 17-20 및 23-26 중 어느 한 항의 진단 시약의 용도.
  31. a) 시험관 내에서 피험자로부터 얻은 적절한 생물학적 샘플과 청구항 17-20 및 23-26중 어느 한 항의 진단 시약을 접촉시키는 단계, 및
    b) 상기 생물학적 샘플 내에, 인산화-타우 단백질의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함하고,
    상기 인산화-타우 단백질의 존재는 상기 피험자가, 알츠하이머병 (AD), 피크 병 (PD), 전측두엽 치매 (FTD), 피질기저핵 변성 (CBD) 및 진행성 핵성마비 (PSP)를 포함하는, 타우병증과 같은, 신경원섬유 매듭, 신경망 실 또는 이영양성 신경돌기에 의해 매개된 장애를 갖는 것을 나타내는,
    피험자에서, 알츠하이머병 (AD), 피크 병 (PD), 전측두엽 치매 (FTD), 피질기저핵 변성 (CBD) 및 진행성 핵성마비 (PSP)를 포함하는, 타우병증과 같은, 신경원섬유 매듭, 신경망 실 또는 이영양성 신경돌기에 의해 매개된 장애를 진단하거나 또는 관찰하기 위한 시험관 내 또는 생체 외 방법.
  32. a) 시험관 내에서 피험자로부터 얻은 적절한 생물학적 샘플과 청구항 17-20 및 23-26중 어느 한 항의 진단 시약을 접촉시키는 단계,
    b) 상기 생물학적 샘플 내에 인산화-타우 단백질의 양을 결정하는 단계, 및
    c) 단계 b)에서 결정된 양과 상기 피험자에 대해 사전에 얻은 인산화-타우 단백질의 양을 비교하는 단계를 포함하고,
    인산화-타우 단백질의 양의 상당한 증가는 신경원섬유 매듭, 신경망 실 또는 이영양성 신경돌기에 의해 매개된 장애의 진행의 마커를 구성하며, 및 인산화-타우 단백질의 상당한 감소는 신경원섬유 매듭, 신경망 실 또는 이영양성 신경돌기에 의해 매개된 장애의 퇴행의 마커를 구성하는,
    피험자에서, 알츠하이머병 (AD), 피크 병 (PD), 전측두엽 치매 (FTD), 피질기저핵 변성 (CBD) 및 진행성 핵성마비 (PSP)를 포함하는, 타우병증과 같은, 신경원섬유 매듭, 신경망 실 또는 이영양성 신경돌기에 의해 매개된 장애의 진행 또는 퇴행을 관찰하기 위한 시험관 내 또는 생체 외 방법.
  33. a) 피험자, 바람직하게는 사람에게 청구항 17-20 및 23-26중 어느 한 항의 진단 시약의 검출 가능한 양을 투여하는 단계, 및
    b) 영상화 방법에 의하여 상기 피험자 내에서 상기 진단 시약을 검출하는 단계를 포함하는,
    피험자에서 신경원섬유 매듭, 신경망 실 또는 이영양성 신경돌기를 생체 내에서 영상화하는 방법.
  34. 청구항 17-22 및 26중 어느 한 항의 치료 시약, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
  35. 서열 CSIDMVDS(PO3H2)PQLATLAD (SEQ ID NO. 6)의 타우 단백질의 C-말단으로부터 유래된 단일 인산-펩티드 또는 사람에서 얻은 인산-타우 풍부 알츠하이머병 뇌 추출물로 낙타과 동물을 면역화시키는 단계를 포함하는 인산화 타우 단백질로 향하는 VHH를 얻은 방법.
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