JP2017506068A - リン酸化タウタンパク質を指向するラクダ科動物単一ドメイン抗体及びその接合体を製造する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本明細書で使用する場合、タウタンパク質とは、タウタンパク質の周知の6つのイソフォームをいい(Goedertら 1989 Neuron,3,519-26;Himmlerら 1989 Mol Cel Biol.,9,1381-8)、好ましくは4Rイソフォームをいう。
1つの好適な実施形態において、本発明のVHHは、ラクダ科動物をタウタンパク質のC末端に由来する配列CSIDMVDS(PO3H2)PQLATLAD(配列番号6)の単一リン酸化ペプチド又はリン酸化タウに富むヒトアルツハイマー病脳(好ましくは海馬)抽出物又はセリン422がリン酸化されたリン酸化タウタンパク質のようなリン酸化タウタンパク質で、好ましくはタウタンパク質のC末端に由来する配列CSIDMVDS(PO3H2)PQLATLAD(配列番号6)の単一リン酸化ペプチドで免疫することにより取得可能である。
リン酸化タウに富むヒトアルツハイマー病脳(好ましくは海馬)抽出物は、Merckenら 1992 Acta Neuropathol.,84,265-272に記載されたとおりに取得することができる。
(a)ラクダ科動物、好ましくはアルパカ(Lama pacos)をタウタンパク質のC末端に由来する配列CSIDMVDS(PO3H2)PQLATLAD(配列番号6)の単一リン酸化ペプチド又はリン酸化タウに富むヒトアルツハイマー病脳(好ましくは海馬)抽出物又はリン酸化タウタンパク質(例えばセリン422がリン酸化されたリン酸化タウタンパク質)で、好ましくはタウタンパク質のC末端に由来する配列CSIDMVDS(PO3H2)PQLATLAD(配列番号6)の単一リン酸化ペプチドで免疫する工程、
(b)免疫したラクダ科動物の末梢白血球を単離し、トータルRNAを取得し、対応するcDNAを合成する工程(方法は当該分野で公知である;例えば、Lafayeら 1995 Res Immunol.,146,373-82[1996,Res Immunol.,147,61と誤植]を参照)、
(c)VHHドメインをコードするcDNAフラグメントのライブラリを構築する工程、
(d)工程(c)で取得したVHHドメインをコードするcDNAをmRNAにPCRを用いて転写し、mRNAをリボソームディスプレイ形式に変換し、リボソームディスプレイによりVHHドメインを選択する工程、及び
(e)ベクター(例えば、適切なベクターはpET22(Novagen,Cat. No. 69744-3)である)でVHHドメインを発現させ、任意に、発現したVHHドメインを精製する工程
を含んでなる方法により取得可能である。
本方法の別の1つの好適な実施形態においては、工程(c)では、ライブラリは、VHHドメインをコードするDNAフラグメントをPCRにより増幅し、得られたPCR産物をファージベクター(適切なファージベクターの例はpHENである;Hoogenboomら 1992 J Mol Biol.,227,381-8)にライゲートすることにより構築することができる。
工程(c)の1つの特定の実施形態において、VHHドメインをコードするDNAフラグメントは、配列番号7の配列のプライマー(CH2FORTA4と呼ぶ)及び配列番号8の配列のプライマー(VHBACKA6と呼ぶ)を用いるPCRにより増幅し、増幅産物を配列番号9の配列のプライマー(VHBACKA4と呼ぶ)及び配列番号10の配列のプライマー(VHFOR36と呼ぶ)のいずれかを用いる2回目のPCRに付する。このような方法は、国際PCT出願第WO 2004/044204号に記載されている。
1つのより好適な実施形態において、VHHは、以下のアミノ酸配列:
− 配列番号4(完全長形態のVHHタウ-A2に相当)、又は
− 配列番号5(短形態のVHHタウ-A2に相当)
からなる。
本明細書で使用する場合、用語「VHH」とは、ラクダ科動物(ラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ、アルパカなど)の重鎖抗体の可変抗原結合ドメインをいう(Nguyenら 2000 EMBO J.,19,921-930;Muyldermans 2001 J Biotechnol.,74,277-302及びVanlandschootら 2011 Antiviral Res. 92,389-407の概説を参照)。VHHはナノボディ(Nb)とも呼ばれる。
本発明は、天然、組換え又は合成の上記のとおりのVHHを包含する。
本明細書で使用する場合、用語「組換え」とは、遺伝子操作法(クローニング、増幅)を用いて前記VHHを作製することをいう。
本明細書で使用する場合、用語「合成」とは、インビトロでの化学的及び/又は酵素的合成による前記VHHの作製をいう。
本発明に従うVHHは、単量体又はホモ多量体(例えば、ホモ二量体又はホモ三量体)の形態であることができる。
本発明はまた、本発明に従うVHHを含んでなる単離されたラクダ科動物血清、好ましくはアルパカ血清を提供する。
本発明はまた、上記のとおり、リン酸化タウタンパク質のリン酸化セリン422を指向し、そのアミノ酸配列が配列番号5のアミノ酸配列と少なくとも95%の同一性又は好ましさが増す順に、少なくとも96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有する、配列番号5のVHHタウ-A2の単離されたバリアントを提供する。
特に断らない限り、本明細書において言及する2つの配列間の同一性パーセントは、当該2つの配列の全長にわたるアラインメントから算出する。
本バリアントの1つの好適な実施形態において、そのアミノ酸配列は、N末端からC末端へ、配列番号1のアミノ酸配列、配列番号2のアミノ酸配列及び配列番号3のアミノ酸配列を含んでなる。
− 配列番号5のアミノ酸配列の3位のグルタミン残基(Glu,Q)がアスパラギン酸(Asp,D)及びグルタミン酸(Glu,E)からなる群より選択されるアミノ酸残基、好ましくはGluで置換されており、
− 配列番号5のアミノ酸配列の52位のイソロイシン残基(Ile,I)がアラニン(Ala,A)及びグリシン(Gly,G)からなる群より選択されるアミノ酸残基、好ましくはGlyで置換されており、
− 配列番号5のアミノ酸配列の86位のバリン残基(Val,V)がアラニン(Ala,A)、セリン(Ser,S)、チロシン(Tyr,T)、アスパラギン(Asp,N)、グルタミン(Gln、Q)、アスパラギン酸(Asp,D)、グルタミン酸(Glu,E)、リジン(Lys、K)、アルギニン(Arg、R)及びグリシン(Gly,G)からなる群より選択されるアミノ酸残基、好ましくはGlyで置換されており、
− 任意に、2つのアミノ酸残基が配列番号5のアミノ酸配列のN末端位置に付加されており、当該2つのアミノ酸残基がジペプチド グルタミン酸-バリン(E-V)及びアスパラギン酸-バリン(D-V)からなる群より選択され、好ましくはD-Vである
を有する配列番号5のアミノ酸配列を有する。
別の1つの特定の実施形態において、VHHバリアントは、配列番号16のアミノ酸配列から本質的になる(このVHHバリアントは、配列番号5のアミノ酸配列と比較して、N末端位置に追加のジペプチドを含まない)。
本発明はまた、本発明に従うVHH又はVHHバリアント(好ましくは配列番号15のVHHバリアント)を含むポリペプチドからなり、該ポリペプチドに含まれるVHH又はVHHバリアントがリン酸化タウタンパク質、好ましくはリン酸化タウタンパク質のリン酸化セリン422に結合することができるVHH誘導体を提供する。
(式中、
− Pは、本発明に従うVHH又はVHHバリアントを含んでなるか又は該VHH又はVHHバリアントからなる、100〜500アミノ酸、好ましくは100〜150アミノ酸のペプチドであって、そのアミノ酸配列が接近可能な還元型システイン残基を有しない、好ましくは還元型システイン残基を有しない、ペプチドであり、
− Cはシステイン残基であり、
− Zは、システイン残基を含有しない、1〜10アミノ酸スペーサー、好ましくは1〜10の中性又は負荷電アミノ酸のスペーサーであって、そのアミノ酸残基は同一であるか又は異なる、スペーサーである)
を有する。
本発明に関して、表現「接近可能な還元型システイン残基」とは、本発明に従って規定されるとおりの接合工程に関して接近可能なシステイン残基をいう。
(式中、
− Pは、接近可能な還元型システイン残基を有しない、好ましくは還元型システイン残基を有しない、100〜500アミノ酸、好ましくは100〜150アミノ酸のペプチドであり、
− Cはシステイン残基であり、
− Zは、
a)そのアミノ酸残基がセリン(S)、アラニン(A)、バリン(V)及びグリシン(G)からなる群、より好ましくはセリン(S)、アラニン(A)及びバリン(V)からなる群より選択される、2〜10アミノ酸スペーサー、好ましくは2アミノ酸スペーサーであって、その少なくとも2つのアミノ酸残基は異なるスペーサーを表すか、又は
b)システイン残基を含有せず、ジペプチド セリン-アラニン(S-A)及びセリン-バリン(S-V)を含んでなる、2〜10アミノ酸スペーサー、好ましくは2〜10の中性又は負荷電アミノ酸のスペーサーを表す)
を有する。
有利には、システイン残基Cは立体的に接近可能である。
有利には、アミノ酸スペーサーZのアミノ酸残基は、アラニン、バリン、セリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンからなる群より、好ましくはアラニン、バリン及びセリンからなる群より選択される。
有利には、Zがa)に規定されるとおりである場合、アミノ酸スペーサーZは1つの又は少なくとも1つのセリンを含んでなり、より有利には、アミノ酸スペーサーZはセリン及びアラニン残基のみ又はセリン及びバリン残基のみから本質的になる。
式P-C-ZのVHH誘導体のアミノ酸配列Pは、そのC末端に、1〜10アミノ酸スペーサーY、好ましくは1〜10の中性又は負荷電アミノ酸のスペーサー(ここで、前記アミノ酸スペーサーYのアミノ酸残基は同一か又は異なり、前記アミノ酸スペーサーYはシステイン残基を含有しない)を有することができる。
式Z-C-PのVHH誘導体のアミノ酸配列Pは、そのN末端に、1〜10アミノ酸スペーサーY、好ましくは1〜10の中性又は負荷電アミノ酸のスペーサー(ここで、前記アミノ酸スペーサーYのアミノ酸残基は同一か又は異なり、前記アミノ酸スペーサーYはシステイン残基を含有しない)を有することができる。
有利には、アミノ酸スペーサーYのアミノ酸残基は、アラニン、バリン、セリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンからなる群より、好ましくはアラニン、バリン、セリン及びグリシンからなる群より選択される。
好ましくは、アミノ酸スペーサーYは、4つの中性アミノ酸のスペーサー、例えばアミノ酸配列G-G-G-S(配列番号11)を表す。
式Z-C-PのVHH誘導体のアミノ酸配列Pはまた、そのC末端に、1〜50アミノ酸配列X(ここで、前記アミノ酸配列Xのアミノ酸残基は同一か又は異なり、前記アミノ酸配列Xはシステイン残基を含有しない)を有することができる。
アミノ酸配列Xは、タグ、例えば6×Hisタグ(配列番号12)、及び酵素切断部位、例えばアミノ酸配列LVPRGS(配列番号13)のトロンビン切断部位を含んでなることができる。
有利には、前記VHH誘導体は、N末端からC末端へ、アミノ酸タグ、例えば6×Hisタグ、酵素切断部位、例えばトロンビン切断部位、本発明に従うVHH又はVHHバリアント、アミノ酸スペーサー、システイン及び第2のアミノ酸スペーサーを含んでなる。このVHH誘導体は、式X-P'-Y-C-Z(式中、P'はVHH又はVHHバリアントである)のVHH誘導体に相当する。
1つの好適な実施形態において、前記VHH誘導体は配列番号14のアミノ酸配列を有する(タウ-A2-SH)。
別の1つの好適な実施形態において、前記VHH誘導体は配列番号17のアミノ酸配列を有する(タウ-A2var-SH)。このVHH誘導体は本発明に従う配列番号15のVHHバリアントを含んでなる。
本発明に従うポリヌクレオチドは、組換えDNA技術及び/又は化学的DNA合成の周知の方法により取得してもよい。
本発明はまた、本発明に従うポリヌクレオチドを、宿主細胞における前記ポリヌクレオチドの転写の調節を可能とする転写プロモーターの制御下に含んでなる組換え発現カセットを提供する。前記ポリヌクレオチドはまた、宿主細胞におけるその翻訳の調節を可能にする適切な制御配列に連結することができる。
本発明はまた、本発明に従うポリヌクレオチドを含んでなる組換えベクター(例えば、組換え発現ベクター)を提供する。有利には、前記組換えベクターは、本発明に従う発現カセットを含んでなる組換え発現ベクターである。
本発明はまた、本発明に従う組換え発現カセット又は組換えベクターを含有する宿主細胞を提供する。宿主細胞は原核生物又は真核生物宿主細胞である。
用語「宿主細胞」とは、外因性核酸が導入された細胞をいい、当該細胞の子孫を含む。宿主細胞には、「形質転換体」及び「形質転換細胞」が含まれ、形質転換細胞には、初代形質転換細胞、及び継代数にかかわらず初代形質転換細胞から誘導された子孫が含まれる。子孫は、核酸内容物が親細胞と完全に同一でなくてもよく、変異を含有してもよい。最初の形質転換細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物学的活性を有する変異体子孫もまた含まれる。
配列番号14のアミノ酸配列のVHHタウ-A2-SHを発現する真核生物宿主細胞を、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(CNCM;28 rue du Dr Roux,75724 Paris Cedex 15,France)に番号I-4836で2014年1月16日に寄託した。
配列番号17のアミノ酸配列のVHHタウ-A2var-SH(タウA2 VAR-SHとも呼ぶ)を発現する真核生物宿主細胞を、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(CNCM;28 rue du Dr Roux,75724 Paris Cedex 15,France)に番号I-4951で2015年1月21日に寄託した。
− 本発明に従う組換え発現カセット又は組換えベクターを含有する宿主細胞を提供する工程、
− 前記宿主細胞を培養する工程、
− 任意に、式P-C-Z又はZ-C-Pのオリゴペプチドを精製する工程
を含んでなる方法を提供する。
オリゴペプチドを精製する方法、例えばクロマトグラフィー(例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル透過クロマトグラフィー及び逆相クロマトグラフィー)は、当該分野において周知である。
本発明に従う興味対象の物質は、哺乳動物又はヒトの血液脳関門を透過してもしなくてもよい。興味対象の物質が血液脳関門を透過する場合、本発明に従うVHH、VHHバリアント又はVHH誘導体(特に、上記の式P-C-Z又はZ-C-PのVHH誘導体)の使用により、血液脳関門を横切る前記興味対象の物質の送達を増強させることができる。
1つの実施形態において、前記興味対象の物質は診断又は治療用化合物である。
別の1つの実施形態において、前記興味対象の物質は、診断又は治療用化合物を含んでなるリポソーム又はポリマー性物質である(Villarazaら 2010 Chem Rev.,110,2921-2959)。
− 酵素、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコース-6-ホスファターゼ又はβ-ガラクトシダーゼ;
− 蛍光体、例えば、緑色蛍光タンパク質(GFP)、紫外(UV)領域の波長で励起される青色蛍光色素(例えば、AMCA(7-アミノ-4-メチルクマリン-3-酢酸);Alexa Fluor(登録商標)350)、青色光で励起される緑色蛍光色素(例えば、FITC、Cy2、Alexa Fluor(登録商標)488)、緑色光で励起される赤色蛍光色素(例えば、ローダミン、Texas Red、Cy3、Alexa Fluor色素546、564及び594)、又は近赤外光で励起される色素(例えば、Cy5)(これらは電子検出器(CCDカメラ、光電子増倍管)で可視化される);
− 放射性同位体、例えば、PET撮像法に使用することができる18F、11C、13N、15O、68Ga、82Rb、44Sc、64Cu、86Y、89Zr、124I、152Tb、又はSPECT/シンチグラフィー研究に使用することができる67Ga、81mKr、99mTc、111In、123I、125I、133Xe、201Tl、155Tb、195mPt、又はオートラジオグラフィー若しくはインサイチュハイブリダイゼーションに使用することができる14C、3H、35S、32P、125I、又は化合物の標識に使用することができる211At-、212Bi-、75Br-、76Br-、131I-、111In、177Lu-、212Pb-、186Re-、188Re-、153Sm-、 90 Y;
− NMR又はMRI造影剤、例えば、常磁性体 ガドリニウム(Gd)、ジスプロシウム(Dy)及びマンガン(Mn)、及び酸化鉄(例えば、MION、SPIO又はUSPIO)又は鉄白金(SIPP)をベースにする超常磁性体、及びX核、例えば、18F、13C、23Na、17O、15N;
− ナノ粒子、例えば、金ナノ粒子(B. Van de Broekら,ACSNano,Vol. 5,No. 6,4319-4328,2011)又は量子ドット(A. Sukhanovaら,2012 Nanomedicine,8 516-525)
からなる群より選択される。
診断剤は、検出に使用される場合、シンチグラフィー研究用の放射性原子、例えば99Tc若しくは123I、又は核磁気共鳴(NMR)撮像(MRIとしても知られる)用のスピン標識、例えば、13C、9F、Fe、Gd、123I、111In、Mn、15N若しくは7Oを含んでなってもよい。
有利には、前記治療用化合物は、ペプチド、酵素、核酸、ウイルス及び化合物から選択される。前記治療用化合物は、鎮痛化合物、抗炎症化合物、抗抑うつ化合物、抗痙攣化合物、細胞毒性化合物又は抗神経変性化合物であることができる。
上記の興味対象の物質は、本発明に従うVHH、VHHバリアント又はVHH誘導体(特に、上記の式P-C-Z又はZ-C-PのVHH誘導体)に、該VHH、VHHバリアント若しくはVHH誘導体(特に、上記の式P-C-Z又はZ-C-PのVHH誘導体)の一方の末端部(N末端又はC末端)で又は該VHH、VHHバリアント若しくはVHH誘導体の1つのアミノ酸の側鎖で、直接に共有結合又は非共有結合していることができる。興味対象の物質はまた、前記VHH、VHHバリアント又はVHH誘導体に、該VHH、VHHバリアント若しくはVHH誘導体(特に、上記の式P-C-Z又はZ-C-PのVHH誘導体)の一方の末端部で又は該VHH、VHHバリアント若しくはVHH誘導体の1つのアミノ酸の側鎖で、スペーサーにより間接的に共有結合又は非共有結合していることができる。ペプチド(特に抗体)に興味対象の物質を結合する従来方法は当該分野において公知である(例えば、Ternynck及びAvrameas 1987 「Techniques immunoenzymatiques」 INSERM編,Paris;Hermanson,2010,Bioconjugate Techniques,Academic Pressを参照)。
本発明に従うVHH又はVHHバリアント又はVHH誘導体(特に、上記の式P-C-Z又はZ-C-PのVHH誘導体)は、当該分野に公知である一般的な有機化学技法を利用して、特定の放射性同位体、NMR若しくはMRI造影剤、蛍光体、ナノ粒子又は酵素で標識してもよい。例えば、March,J. ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY:REACTIONS,MECHANISMS,AND STRUCTURE(第3版、1985);Hermanson,2010,Bioconjugate Techniques,Academic Pressを参照。
具体的には、本発明に従うVHH、VHHバリアント又はVHH誘導体は、当該分野に公知の幾つかの技法のいずれかにより、SPECT用に123Iで標識することができる。例えば、Kulkarni 1991 Int J Rad Appl Inst. (Part B) 18,647を参照。
本発明はまた、興味対象の物質と直接又は間接に結合した本発明に従うVHH、VHHバリアント又はVHH誘導体(特に、上記の式P-C-Z又はZ-C-PのVHH誘導体)(機能的接合体)を取得するための結合方法に関する。
第1のストラテジによれば、本発明に従うVHH、VHHバリアント又はVHH誘導体を、非部位特異的アプローチを用いて興味対象の物質に接合する。前記非部位特異的方法は、興味対象の物質と本発明に従うVHH、VHHバリアント又はVHH誘導体との接合工程を含んでなる。
(i)エステル又は無水物の形態、好ましくはエステルの形態の活性化されたキレート剤を、本発明に従うVHH、VHHバリアント又はVHH誘導体のリジン残基と接合する工程、及び
(ii)工程(i)のリガンドを興味対象の物質でキレート化する工程
が含まれる。
(i')興味対象の物質を、エステル又は無水物の形態、好ましくはエステルの形態の活性化されたキレート剤でキレート化する工程、及び
(ii')工程(i')の予備キレート化した興味対象の物質を、本発明に従うVHH、VHHバリアント又はVHH誘導体のリジン残基と接合する工程
を含んでなる。
接合工程(i)又は(ii')の間、温度は、1℃から40℃まで、好ましくは4℃から20℃まで変化してもよい。溶液は1〜6時間撹拌してもよい。好ましくは、pHは接合工程(i)又は(ii')の間、7〜8.5の間で維持する。
接合工程(i)又は(ii')の間、エステル又は無水物の形態の活性化されたキレート剤は、緩衝液、例えばリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)溶液に溶解してもよい。
1つの好適な実施形態において、エステル又は無水物の形態の活性化されたキレート剤とVHH、VHHバリアント又はVHH誘導体のリジン残基のアミノ官能基との間のモル比は、1〜10の範囲であり、好ましくは4である。
接合工程(i)とキレート化工程(ii)との間、又はキレート化工程(i')と接合工程(ii')との間に、透析濾過又は透析による緩衝液交換工程が存在してもよい。有利には、溶液は、例えばVivaspinTMデバイスを用いて、透析濾過される。この緩衝液交換工程の間、媒体は1〜5℃の範囲の温度で冷却される。この緩衝液交換工程の間、緩衝液は、例えば酢酸ナトリウム溶液と、好ましくは0〜6時間、より好ましくは2〜3時間の撹拌下で、交換される。
キレート化工程(ii)又は(i')の間、溶液を1〜4時間、好ましくは2〜3時間撹拌する。キレート化工程は、好ましくは1〜60℃、より好ましくは4℃で行う。
リジン数に依存して、VHH、VHHバリアント又はVHH誘導体あたりの興味対象の物質の平均密度は、0〜(リジン数+1)の間で変化してもよい。好ましくは、VHH、VHHバリアント又はVHH誘導体あたりの興味対象の物質の平均密度は、0〜6の間で変化してもよい。
− 式P-C-Z又はZ-C-Pの標識VHH誘導体は化学的に規定されている。なぜならば、本方法により、ヒト使用の観点(品質管理、安全性など)で必須の特徴である十分に規定された接合体が得られるからである。
− この方法は容易で標準である。なぜならば、興味対象の物質での式P-C-Z又はZ-C-PのVHH誘導体の標識は、短い反応時間で単純な手順による単一工程で実施することができるからである。工程中のモニタリングの必要がなく、標識の程度と結合性との間での妥協の必要もない。これらは、更なる最適化、実験再現性及び製造規模拡大のための鍵となる利点である。
− この方法は、式P-C-Z又はZ-C-PのVHH誘導体の鍵となる特性に影響しない:例えば、接合体のpIは、BBB横断を可能にするはずである8.5を超えて維持される。更に、標的に関して接合体と競合し得る非標識の式P-C-Z又はZ-C-PのVHH誘導体が残存しない;生理学的pHでの短い反応時間という温和な条件は、式P-C-Z又はZ-C-PのVHH誘導体を、起こり得る変性及び/又は活性喪失から保護する。
− この方法は融通が利く。なぜならば、この方法によれば、種々の式P-C-Z又はZ-C-PのVHH誘導体と造影剤、蛍光体又は他の興味対象の分子とを別々に製造し、その後単一工程で組み合わせることができる柔軟なモジュール型アプローチが可能となるからである。その結果、接合体のセットについて、最適化並びにIHC(免疫組織化学)及びMRI(磁気共鳴撮像法)による川下評価を容易に行うことができる。
− とりわけ、この方法により、全体収率の向上が可能となる一方、反応工程数が減り、VHHのリジン又はヒスチジンでの副反応がなく、VHHの機能及び3D構造が全体的に維持される。
前記オリゴペプチドのシステインとチオール反応性化合物、例えば下記の式(I)又は(I')のマレイミド化合物との間でのチオ付加は、好ましくは4〜7.5の範囲のpH、より好ましくはpH6.8で行う。pHが4未満であれば、反応は進行せず、7.5を超えると、反応は非特異的となる(リジンに反応する)。接合工程は、イミダゾールを含むか又は含まないPBS/NaCl中、好ましくはイミダゾールの存在下に行うことができる。
その後、透析濾過又は透析による緩衝液交換工程が存在してもよい。有利には、溶液は、例えばVivaspinTMデバイスを用いて、透析濾過される。次いで、溶液は、同じ方法(透析濾過)により濃縮されてもよい。
しかし、接合工程をイミダゾールを含むPBS/NaCl中で行う場合、(イミダゾールを除去しないために)その後の透析濾過又は透析工程を行わないことが好ましい。
非特異的方法であっても、特異的方法であっても、興味対象の物質は上記のとおりであり得る。
1つの好適な実施形態によれば、興味対象の物質は、上記のとおりの治療用又は診断用化合物、好ましくは、上記のとおりの蛍光体、放射性同位体及びNMR又はMRI造影剤からなる群より選択される診断用化合物である。
1つの好適な実施形態によれば、興味対象の物質は、蛍光体、例えば、青色光により励起される緑色蛍光色素、具体的にはFITC、Cy2、Alexa Fluor(登録商標)488、好ましくはAlexa Fluor(登録商標)488である。
別の1つの好適な実施形態によれば、興味対象の物質は、NMR又はMRI造影剤、例えば、常磁性体 ガドリニウム(Gd)、ジスプロシウム(Dy)及びマンガン(Mn)、酸化鉄(例えば、MION、SPIO、USPIO)又は鉄白金(SIPP)をベースにする超常磁性体、及びX核、例えば、18F、13C、23Na、17O、15Nである。より好ましくは、興味対象の物質は、常磁性体 ガドリニウム(Gd)、ジスプロシウム(Dy)及びマンガン(Mn)から選択されるNMR又はMRI造影剤であり、好ましくはガドリニウム(Gd)である。
興味対象の物質がガドリニウムである場合、DOTAが好ましいキレート剤である。
本発明に関して、チオール反応性化合物は、マレイミド、ハロアセチル、アルキルハライド若しくはアジリジン化合物、アクリロイル誘導体、アリール化剤、又はチオール-ジスルフィド交換試薬(Hermanson G. T.,2010,Bioconjugate Techniques,Academic Press)である。
本発明に関して、マレイミド化合物は、少なくとも1つのマレイミド官能基、好ましくは1〜6のマレイミド官能基、より好ましくは1つのマレイミド官能基を有する化合物である。
好ましくは、チオール反応性化合物は、マレイミド官能基のC-C二重結合を介してシステイン残基Cと反応するマレイミド化合物である。
(式中:
− B、B'1、B'2及びB”は、同一か又は異なって、独立して、単結合、又はポリオール(例えば、ポリエチレングリコール(PEG)、好ましくは2〜12のオキシエチレン(OE)単位を有するもの)、ポリオレフィン(好ましくは、2〜12の芳香環を有するもの)、ポリアルキル(好ましくは、2〜12の炭素原子を有するもの)、ビニルポリマー(例えば、ポリ(アルキルメタクリレート)、好ましくは2〜12のメタクリレート基を有するもの)、ポリアルデヒド(好ましくは、2〜12のカルボニル基を有するもの)、ポリ酸エステル(好ましくは2〜12のエステル基を有するもの)から選択されるスペーサーであり、
− D、D'及びD”は、同一か又は異なって、独立して、アミン、アミド、アミノアルコール、尿素、チオ尿素、カルバメート、カルボネート、エステル、エーテル、チオエーテル、アリール、ヘテロアリール(例えば、トリアゾール)、オキシム基から選択され、
− Aは単結合又はキレート剤であり、
− SIは興味対象の物質であり、
− X'は、酸、アミン、アミド、エステル、エーテル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はヘテロアリール官能基であり、
− n=1〜100、好ましくはn=1、2又は3)
のものであり得る。
− アルキル基は、(C1〜C12)アルキル基、好ましくは(C1〜C6)アルキル基、例えばメチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、sec-ブチル、tert-ブチル及びイソブチル基から選択される;
− アルケニル基は、少なくとも1つの炭素-炭素二重結合を有する、2〜12(好ましくは2〜6)の炭素原子の炭化水素鎖から選択される。アルケニル基の例としては、エテニル、プロペニル、イソプロペニル、2,4-ペンタジエニルが挙げられる;
− アルキニル基は、少なくとも1つの炭素-炭素三重結合を有する、2〜12(好ましくは2〜6)の炭素原子の炭化水素鎖から選択される;
− アリール基は、少なくとも1つの単純な芳香環から誘導される任意の官能基又は置換基を意味し;芳香環は、環の各原子が互いに重なるp-軌道を含む非局在化π系を有する任意の平面環状化合物に相当する。より具体的には、用語 アリールは、フェニル、ビフェニル、1-ナフチル、2-ナフチル、アントラシル、ピレニル、及びその置換形態を含むが、これらに限定されない。本発明のアリール基は、好ましくは4〜12の炭素原子、より好ましくは5又は6の炭素原子を含んでなる;
本発明に従う酸、アミン、アミド、エステル、エーテル及びチオエーテル基は、好ましくは1〜12、より好ましくは1〜6の炭素原子を有する。
有利には、キレート剤Aは、1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-四酢酸(DOTA)、ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)、1,4,7-トリス(カルボキシメチルアザ)シクロドデカン-10-アザアセチルアミド(DO3A)、ニトリロ三酢酸(NTA)、D-ペニシラミン(Pen)、2,3-ジメルカプトコハク酸(DMSA)、2,3-ジメルカプト-1-プロパンスルホン酸(DMPS)、2,3-ジメルカプトプロパノール(BAL)、トリエチレンテトラミン(Trien)、テトラチオモリブデン酸アンモニウム(TTM)アニオン、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、2-(p-イソチオシアナトベンジル)-6-メチル-ジエチレントリアミン五酢酸(IB4M)又はヒドロキシピリジノン(HOPO)から選択される。
有利には、興味対象の物質SIはガドリニウムであり、キレート剤はDOTAである。
(式中、B、B'1、B'2、B”、A,SI及びnは上記と同義である)
のものであってもよい。
式(I)又は(I')のマレイミド化合物は、固相法により、好ましくはFmoc化学を用いて、より好ましくはFmoc-Gly-Wang樹脂上で合成されてもよい。
式(I')のマレイミド化合物:
(式中、B、B'1、B'2、B”、A,SI及びnは上記と同義である)
もまた本発明の一部である。
本発明はまた、本発明の非部位特異的方法に従って取得可能である、興味対象の物質に接合したVHH又はVHHバリアント、及び、本発明の部位特異的方法に従って取得可能である、興味対象の物質を有するチオール反応性化合物、例えば式(I)のマレイミド化合物に接合した式P-C-Z又はZ-C-PのVHH誘導体も提供する。
興味対象の物質がペプチドである場合、本発明に従うVHH、VHHバリアント又はVHH誘導体及び前記興味対象の物質は、本発明に従うVHH、VHHバリアント又はVHH誘導体及び適切なペプチドを含む融合ポリペプチドとして遺伝子工学により作製することができる。この融合ポリペプチドは、公知の適切な宿主細胞において、従来方法により発現させることができる。
本発明に従うVHH、VHHバリアント又はVHH誘導体は、ヒト対象者に投与する場合、ヒトにおける免疫原性を低減させるためにヒト化することができる。ヒト化抗体又はそのフラグメントを作製する方法は、当該分野において公知である(Vinckeら 2009,J Biol Chem.,284,3273-84)。
本発明に従う診断剤は、脳撮像、又は神経原線維変化、ニューロピルスレッド又はジストロフィー性神経突起により媒介される疾患、例えば、アルツハイマー病(AD)、ピック病(PD)、前頭側頭型認知症(FTD)、皮質基底核変性症(CBD)及び進行型核上性麻痺(PSP)を含むタウオパチー、好ましくはAD、FTD、CBD及びPSPの診断若しくはモニタリングに使用することができる。
本発明はまた、本発明に従うVHH、VHHバリアント又はVHH誘導体(特に、式P-C-Z又はZ-C-PのVHH誘導体)及び上記のような興味対象の物質並びに随意に診断試薬を含んでなるキットを提供する。
本発明はまた、本発明に従う診断剤及び診断試薬を含んでなるキットを提供する。
本発明に従うキットは、脳撮像、又は神経原線維変化、ニューロピルスレッド又はジストロフィー性神経突起により媒介される疾患、例えば、アルツハイマー病(AD)、ピック病(PD)、前頭側頭型認知症(FTD)、皮質基底核変性症(CBD)及び進行型核上性麻痺(PSP)を含むタウオパチー、好ましくはAD、FTD、CBD及びPSPの診断若しくはモニタリングに使用することができる。
本明細書で使用する場合、「対象者」は哺乳動物、好ましくはヒト、最も好ましくは神経原線維変化、ニューロピルスレッド又はジストロフィー性神経突起により媒介される疾患、例えば、アルツハイマー病(AD)、ピック病(PD)、前頭側頭型認知症(FTD)、皮質基底核変性症(CBD)及び進行型核上性麻痺(PSP)を含むタウオパチー、好ましくはAD、FTD、CBD及びPSPを有すると疑われるヒトである。
本発明はまた、対象者において、神経原線維変化、ニューロピルスレッド又はジストロフィー性神経突起により媒介される疾患、例えば、アルツハイマー病(AD)、ピック病(PD)、前頭側頭型認知症(FTD)、皮質基底核変性症(CBD)及び進行型核上性麻痺(PSP)を含むタウオパチー、好ましくはAD、FTD、CBD及びPSPを診断するためのインビトロ又はエキソビボ方法であって、以下の工程:
a)インビトロで、前記対象者からの適切な生物学的サンプルを本発明に従う診断剤と接触させる工程、及び
b)前記生物学的サンプルにおいて、リン酸化タウタンパク質の存否を決定する工程
を含んでなり、リン酸化タウタンパク質の存在が、対象者が神経原線維変化、ニューロピルスレッド又はジストロフィー性神経突起により媒介される疾患、例えば、アルツハイマー病(AD)、ピック病(PD)、前頭側頭型認知症(FTD)、皮質基底核変性症(CBD)及び進行型核上性麻痺(PSP)を含むタウオパチー、好ましくはAD、FTD、CBD及びPSPを有することを示す方法を提供する。
本発明はまた、対象者において、神経原線維変化、ニューロピルスレッド又はジストロフィー性神経突起により媒介される疾患、例えば、アルツハイマー病(AD)、ピック病(PD)、前頭側頭型認知症(FTD)、皮質基底核変性症(CBD)及び進行型核上性麻痺(PSP)を含むタウオパチー、好ましくはAD、FTD、CBD及びPSPの進行又は退行をモニターするためのインビトロ又はエキソビボ方法であって、以下の工程:
a)インビトロで、前記対象者からの適切な生物学的サンプルを本発明に従う診断剤と接触させる工程、
b)前記生物学的サンプルにおいて、リン酸化タウタンパク質の量を測定する工程、及び
c)工程(b)で測定した量を、前記対象者について以前に得たリン酸化タウタンパク質の量と比較する工程
を含んでなり、リン酸化タウタンパク質の量有意な増加が神経原線維変化、ニューロピルスレッド又はジストロフィー性神経突起により媒介される疾患の進行のマーカーを構成し、リン酸化タウタンパク質の有意な減少が神経原線維変化、ニューロピルスレッド又はジストロフィー性神経突起により媒介される疾患の退行のマーカーを構成する方法を提供する。
工程b)はまた、VHH-抗原複合体又はVHHバリアント-抗原複合体の量を測定することにより行うことができる。
前記適切な生物学的サンプルは、脳生検又は死後脳組織であり得る。
脳生検又は死後脳組織において神経原線維変化、ニューロピルスレッド又はジストロフィー性神経突起を検出する方法に関する本発明の観点によれば、該方法は、ホルマリン固定組織を本発明に従う診断剤の溶液とインキュベートすることを含み得る。インキュベーションに際して、診断用化合物は組織中の神経原線維変化、ニューロピルスレッド又はジストロフィー性神経突起を標識し、染色又は標識された神経原線維変化、ニューロピルスレッド又はジストロフィー性神経突起は、任意の標準的方法により検出又は可視化することができる。このような検出手段には、顕微鏡観察法、例えば明視野、蛍光、レーザ共焦点及び交差偏光顕微鏡観察が含まれる。生検又は死後組織における神経原線維変化、ニューロピルスレッド又はジストロフィー性神経突起の定量方法には、例えば、本発明に従う診断剤又はその水溶性で非毒性の塩を生検又は死後組織のホモジネートとインキュベートすることが含まれる。組織は、当該分野において周知の方法により取得し、ホモジナイズする。有利には、診断用化合物は放射性同位体標識化合物であるが、他の診断用化合物、例えば酵素、蛍光体、ナノ粒子又はNMR若しくはMRI造影剤を使用することもできる。
a)対象者、好ましくはヒトに検出可能量の本発明に従う診断剤を投与する工程、及び
b)前記対象者における診断剤を撮像法により検出する工程
を含んでなる方法を提供する。
本発明に従う方法により、対象者、好ましくはヒトの脳における神経原線維変化、ニューロピルスレッド又はジストロフィー性神経突起の存在及び位置の決定が可能になる。
本明細書で使用する場合、「検出可能量」は、投与された診断剤の量がリン酸化タウタンパク質への診断剤の結合の検出を可能にするに十分であることを意味する。
本明細書で使用する場合、「画像化有効量」は、投与された診断剤の量がリン酸化タウタンパク質への診断剤の結合の画像化を可能にするに十分であることを意味する。
インビボ画像化のためには、利用可能な検出装置のタイプは、標識選択の主因である。例えば、ガドリニウム、鉄又はマンガンをベースとする造影剤は、興味対象の物質に結合した本発明に従うVHH、VHHバリアント又はVHH誘導体を、磁気共鳴分光法(MRS)又は撮像法(MRI)により検出するために使用することができる。放射性同位体(例えば19F)、蛍光体(例えばAlexa Fluor(登録商標)488)又はNMR若しくはMRI造影剤(例えばガドリニウム)も、本発明の方法におけるインビボ画像化に特に適切である。使用する装置のタイプは、興味対象の物質の選択における指針を示す。例えば、所与の装置タイプで検出可能な様式の崩壊を示す放射性核種を選択しなければならない。造影剤又は放射性核種の半減期も考慮する。放射性同位体に関しては、半減期は、脳による最大取込み時に依然として検出可能であるように十分に長くあるべきであるが、対象者が有害な放射線を維持しないように十分に短くあるべきである。本発明に従う放射性標識VHH、VHHバリアント又はVHH誘導体は、放出された適切な波長のガンマ放射線を検出するガンマ撮像法を用いて検出することができる。ガンマ撮像法には、SPECT及びPETが含まれるがこれらに限定されない。SPECT検出のためには、好ましくは、粒子を放出しないが、140〜200keV範囲の光子を多数生じる放射性同位体が選択される。PET検出のためには、放射性標識は、陽電子放出性放射性核種、例えばPETカメラにより検出される2つの511keVガンマ線を生成して消滅する19Fである。
本発明はまた、診断剤としての、本発明に従う診断用化合物に結合した本発明に従うVHH、VHHバリアント又はVHH誘導体、特に式P-C-Z又はZ-C-PのVHH誘導体を提供する。
本発明はまた、上記のような治療剤及び医薬的に許容され得るキャリアを含んでなる医薬組成物を提供する。
本発明はまた、医薬、特に神経原線維変化、ニューロピルスレッド又はジストロフィー性神経突起により媒介される疾患、例えば、アルツハイマー病(AD)、ピック病(PD)、前頭側頭型認知症(FTD)、皮質基底核変性症(CBD)及び進行型核上性麻痺(PSP)を含むタウオパチー、好ましくはAD、FTD、CBD及びPSPの治療に使用する医薬としての、本発明に従うVHH、VHHバリアント、VHH誘導体、治療剤又は医薬組成物を提供する。
本明細書で使用する場合、用語「治療」には、疾患、疾患症状又は疾患素因を有する患者に、当該疾患、疾患症状又は疾患素因を治癒し(cure、heal)、緩和し、軽減し、変化させ、修復し(remedy)、寛解し、改善し又はそれらに影響を及ぼすことを目的として、本発明に従うVHH、VHHバリアント、VHH誘導体、治療剤又は医薬組成物を投与することが含まれる。
用語「予防」は、神経原線維変化、ニューロピルスレッド又はジストロフィー性神経突起により媒介される疾患、例えば、アルツハイマー病(AD)、ピック病(PD)、前頭側頭型認知症(FTD)、皮質基底核変性症(CBD)及び進行型核上性麻痺(PSP)を含むタウオパチー、好ましくはAD、FTD、CBD及びPSPの進行が減速し、及び/又は消失すること、或いは神経原線維変化、ニューロピルスレッド又はジストロフィー性神経突起により媒介される疾患、例えば、アルツハイマー病(AD)、ピック病(PD)、前頭側頭型認知症(FTD)、皮質基底核変性症(CBD)及び進行型核上性麻痺(PSP)を含むタウオパチー、好ましくはAD、FTD、CBD及びPSPの発症が遅延し又は生じないことを意味する。
本発明はまた、治療剤としての、本発明に従う治療用化合物に結合した式P-C-Z又はZ-C-PのVHH誘導体を提供する。
前述の特徴に加えて、本発明は、本発明を例示する実施例に言及する下記の説明並びに添付の図面から明らかになる他の特徴を更に含んでなる。
材料及び方法
1.抗タウ特異的VHH(タウ-A2)の作製、選択及び精製
1.1 抗原調製及びアルパカにおける液性免疫応答の誘導
対象者
AD患者(BraakステージV及びVI)由来のヒト皮質脳組織をNeuroCEB脳バンクから入手した。このバンクは、患者組織(フランスアルツハイマー協会を含む)のコンソーシアムにより運営されている脳献体プログラムに関係するものであり、フランス国文部科学省(Ministry of Research and Universities)に対してフランス国法律が要求するとおりに宣言している。フランス国の生命倫理に関する法律に従い、脳献体について書面による明示の同意を得た。
組織抽出をMerckenら(1992 Acta Neuropathol.,84,265-272)に従って行った。AD脳の皮質(0.2g)を、10%スクロースを含有する10容量の10mM Tris、1mM EGTA、0.8M NaCl(pH7.4)中でホモジナイズし、27,000×gにて20分間4℃で遠心分離した。ペレットを取り出し、上清を1% N-ラウリルサルコシン及び1% β-メルカプトエタノールに調整し、回転させながら2.5時間37℃でインキュベートした。上清混合物を100,000gにて35分間20℃で遠心分離した。PHF含有ペレットをPBSで穏やかに洗浄し、最後に同じ緩衝液に再懸濁した。
一匹のアルパカ(Inti)をタウペレットで、別のアルパカ(Rascar)を、KLH(Eurogentec)に結合した、タウタンパク質のC末端に由来する配列CSIDMVDS(PO3H2)PQLATLAD(配列番号6)の単一リン酸化ペプチドで免疫した。
250μll(500μg)の両抗原を、最初の免疫用には250μlのフロイント完全アジュバントと混合し、追加免疫用には250μlのフロイント不完全アジュバントと混合した。0日目、21日目及び40日目の3回の免疫後、52日目に、血清サンプルを採取し、組換えリン酸化タウタンパク質又は組換え非リン酸化タウタンパク質を用いるELISAにより免疫応答をモニターした。
免疫動物の血液250mlを52日目に採集し、末梢血白血球を、Ficoll(Pharmacia)不連続グラジエントでの遠心分離により単離し、更なる使用まで−80℃で保存した。トータルRNA及びcDNAを、以前にLafaye P.ら(1995 Res Immunol.,146,373-382)に記載されたように取得し、VHHドメインをコードするDNAフラグメントを、VH遺伝子のそれぞれ3'及び5'フランキング領域にそれぞれアニールするCH2FORTA4及びVHBACKA6プライマーを用いるPCRにより増幅した。増幅産物を、プライマーVHBACKA4及びVHFOR36のいずれかを用いる第2ラウンドのPCRにおいてテンプレートとして使用した。プライマーは、増幅産物の5'及び3'末端部に相補的であり、VHH遺伝子の末端部にSfiI及びNotI制限部位が組み込まれていた。PCR産物を消化し、ファージ発現ベクターpHEN1にライゲートした。得られたライブラリは、2つのサブライブラリ(一方はタウペレットに由来し、他方はKLHに結合したリン酸化ペプチドに由来した)から構成されていた。両方のサブライブラリを用いてファージを作製し単離した後、プールした。
ライブラリ(>6×108クローン)を、完全長のリン酸化タウタンパク質に対してパニングした。Nunc Immunotubes(Maxisorp)チューブをPBS中において抗原(10μg/ml)で4℃にて一晩コーティングした。ファージ(1012形質導入単位)を、コーティングしたチューブと37℃にて1時間、穏やかな撹拌下でインキュベートすることによりパニングした。3回のパニングの各々で異なるブロッキング剤を用いた:2%スキムミルク、1:4希釈Licorブロッキング緩衝液及び4% BSAをそれぞれ用いた。ファージクローンを、検出にHRP/抗M13モノクローナル抗体接合体(GE Healthcare)を用いる標準的なELISA手順によりスクリーニングした(下記参照)。スクリーニングはリン酸化タウタンパク質及びタウタンパク質を並行して用いて行った。
ベクターpHEN1内の選択したナノボディのコーディング配列を、NcoI及びNotI制限部位を用いて、6-ヒスチジンタグを含有する細菌発現ベクターpET23にサブクローニングした。形質転換したE. coli BL21(DE3) LysS細胞は、IPTG(0.5mM)での16℃にて一晩の誘導後、細胞質にVHHを発現する。精製VHHを、細胞質抽出物から、Ni2+を担持するHiTrapクルードカラム(GE Healthcare)を製造業者の指示に従って用いるIMACにより単離した。VHHを50mMリン酸ナトリウム緩衝液、300mM NaCl及び500mMイミダゾール緩衝液に溶出させ、300mM NaClを含有するPBS緩衝液(PBS/NaCl)において透析した。
また、選択したVHHのコーディング配列を、C末端部にStrepタグを含有する改変pASK IBA2 発現ベクターにサブクローニングした(Skerra及びSchmidt 1999 Biomol Eng.,16,79-86)。同じ制限部位を用いた。E. coli XL2-Blue超コンピテント細胞を形質転換して、無水テトラサイクリン(AHT,200μg/l)で16℃にて一晩の誘導後にVHHを周辺質に発現させた。次いで、Strep-Tactinカラム(IBA)を製造業者の指示に従って用いて、VHHを細菌抽出物から精製した。
2.1 一般的な合成法
特に断らない限り、アミノ酸誘導体及び試薬は、それぞれNovabiochem及びSigma-Aldrichから購入したものである。ペプチド及びVHH溶液の濃度(正味のタンパク質含量)は、当該化合物を6N HClで110℃にて20時間加水分解した後、Beckman 6300分析装置を用いる定量的アミノ酸分析(AAA)により測定した。RP-HPLC/MS分析は、UV検出装置2487(220nm)と、エレクトロスプレーイオン化(ポジティブモード)源(Waters)を備えたQ-TofmicroTM分光計(Micromass)とに接続したAlliance 2695システムで行った。サンプルをオートサンプラーで4℃に冷却した。線形グラジエントは、アセトニトリル+0.025%ギ酸(A)/水+0.04%TFA+0.05%ギ酸(B)を用いた10分間又は20分間にわたるものであった。用いたカラムはXBridgeTM BEH300 C18(3.5μm,2.1×100mm)(Waters)(グラジエント10〜100% A)であった。ソース温度を120℃に、脱溶媒和温度を400℃に維持した。コーン電圧は40Vであった。サンプルを、0.4〜1mg/ml濃度で、Bを添加したそれぞれの緩衝液に注入した。
マレイミド-(DOTA/Gd)3化合物1は、図6に示すとおり、9-フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)化学を用いる固相ペプチド合成により製造した。
Cys操作VHH(タウ-A2-SH)のコーディング配列を、NcoI及びXhoI制限部位を用いて細菌発現ベクターpET23dにクローニングした。まとめると、タウ-A2-SH(配列番号14)は、N末端からC末端へ、6-ヒスチジンタグ、トロンビン切断部位、VHHタウ-A2配列、続いてG3Sスペーサー及び3つの付加アミノ酸CSAを含んでなる。形質転換したE. coli BL21(DE3) pLysS細胞は、IPTG(0.5mM)での16℃にて一晩の誘導後、細胞質にタウ-A2-SHを発現する。精製VHHを、細胞質抽出物から、Ni2+を担持するHiTrapクルードカラム(GE Healthcare)を製造業者の指示に従って用いるIMACにより単離した。タンパク質を500mMイミダゾールを含有するPBS/NaClに溶出させた後、PBS/NaClに透析した。
AAA:Ala 14.3 (14),Arg 9.6 (10),Asp+Asn 7.3 (6),Glu+Gln 11.2 (10),Gly 18.4 (19),His 5.7 (6),Ile 4.2 (4),Leu 8.6 (8),Lys 5.3 (5),Phe 4 (4),Pro 2.9 (2),Ser 18.9 (23),Thr 10.5 (12),Tyr 6.1 (7),Val 11.5 (11)。
MS:15499.286(C669H1047N205O213S4 計算値15498.190)。このMSは、N末端欠失メチオニンを有するタンパク質に相当する。
タウ-A2-SHのC末端トリペプチドに存在するシステインを用いて、タウ-A2-SHをマレイミドAlexa Fluor(登録商標)488蛍光体(Invitrogen)に結合した。タウ-A2-SHを含有する溶液のpHを6.8〜7に調整した。次いで、溶液を、10倍モル過剰のトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)と共に室温にて30分間穏やかに撹拌して、分子間ジスルフィド結合を完全に還元させた。ジメチルホルムアミド(DMF)に溶解した10倍モル過剰のマレイミドAlexa Fluor(登録商標)488蛍光体を添加した。特に、高効率の接合のために、最終溶液中のDMFの体積割合を5%未満に維持した。接合を2時間室温にて遮光下で行った。次いで、300mM NaCl(全体濃度)を含有するPBSでの連続透析により接合していないマレイミド蛍光体を除去した。
接合前に、タウ-A2-SH(4.2ml,PBS/NaCl(pH6.8)中0.32mg/ml)をTCEP(24.6μg,5当量)で30分間処理して、VHHの二量体化を予防した。水溶液(78μl)中のマレイミド-(DOTA/Gd)3(0.78mg,VHH当たり1チオール基に対して3.8当量)をタンパク質に添加し、溶液を4℃にて3時間撹拌した。次いで、溶液をPBS/NaCl中、Slide-A-Lyzerカセット(Thermo Scientific)(3,500 MWCO)を用いて透析した。タウ-A2-SH及びタウ-A2-S-(DOTA/Gd)3のアリコート(20μl)をRP-HPLC/MS分析用に緩衝液B(20μl)で希釈した。更に、同じ化合物のアリコート(10μl)をELISA分析用に20mM Tris緩衝液(pH7.3)(90μl)に希釈した。4.2mlのタウ-A2-S-(DOTA/Gd)3(0.24mg/ml)を65%の収率で得た。収率は最終産物タウ-A2-S-(DOTA/Gd)3の現実の量を予想量(正味のタンパク質含量)で除して算出した。更なる実験のために、Vivaspin 2遠心分離フィルターデバイス(3,000 MWCO PES)を用いてタウ-A2-S-(DOTA/Gd)3の溶液を4倍に濃縮した。
AAA:Ala 13.4 (14),Arg 9.6 (10),Asp+Asn 8.0 (6),Glu+Gln 11.8 (10),Gly 24.4 (22),His* (6),Ile 4.2 (4),Leu 8.6 (8),Lys 18.9* (8),Phe 4 (4),Pro 2.9 (2),Ser 16.8 (23),Thr 10.7 (12),Tyr 6.1 (7),Val 11.4 (11)。[*Hisは、アンモニウムとの共溶出のために決定できない。Lysは、分析条件下ではマレイミド誘導体との共溶出のために過大評価される]。
MS:17887.549(C751H1174N227O244S4Gd3 計算値17886.980)。
3.1 対象者
ヒト脳組織をNeuroCEB脳バンクから得た。前臨床実験をTg4510(Santacruzら 2005 Science,309,476-81)トランスジェニックマウスについて行った。動物実験の手順は、フランス国及びEUの法(科学目的に使用する動物の保護についての欧州共同体理事会指令[European Communities Council Directive]2010/63/EU)の倫理標準に厳格に従い、かつ、地元の動物管理及び取扱い委員会の認可後に行った。動物は高用量のペントバルビタールナトリウム(100mg/kg)を用いて犠牲にし、その後10%緩衝化ホルマリンで灌流固定した。その後、脳を取り出し、ホルマリンに少なくとも24時間浸漬し、4℃で保存した。
3.2 組織抽出物
組織抽出はMerckenら(1992 Acta Neuropathol.,84,265-272)に従って行った。
リン酸化タウタンパク質をNuPAGE(登録商標)LDSサンプル緩衝液(Invitrogen)に再懸濁した。脳抽出物は、8M尿素を含有するNuPAGE(登録商標)LDSサンプル緩衝液(Invitrogen)に再懸濁した。NuPAGE Novex 4-12% Bis-trisゲル(Invitrogen)を用いるポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)による分離後、Hybond-C(Amersham)への半乾燥転写を行い、Xcell IIブロットモジュール(Invitrogen)を用いてウェスタンブロッティングを行った。免疫化学反応の前に、メンブレンを4%スキムミルク溶液でブロックした。メンブレンのイムノブロッティングを、VHH(His又はStrepタグを有する)又は抗p-タウ422 mAb(Grueningerら 2011 Mol Cell Biochem.,357,199-207)により行い、ウサギ抗Hisタグ(eBioscience)ポリクローナル抗体に続くペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギイムノグロブリン(Abcam)により、又は抗Strepタグモノクローナル抗体(例えば、番号I-4703でCNCMに寄託したハイブリドーマが産生する抗体C23-21)に続くペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスイムノグロブリン(Bio-rad)により顕現させた。最後に、化学発光キット(GE Healthcare)を用いてペルオキシダーゼ活性を可視化した。
マイクロタイタープレート(Nunc,Denmark)を、PBSに希釈した1μg/mlの、リン酸化タウ若しくはタウタンパク質、又はオボアルブミンタンパク質に結合した配列番号6のリン酸化ペプチドとの4℃で一晩のインキュベーションにより被覆した。プレートをPBS中0.1% Tween 20の緩衝液で洗浄した。タウ-A2(His又はStrepタグを有する)をPBS中0.5%ゼラチン、0.1% Tween 20の緩衝液で希釈した。37℃で2時間のインキュベーション後、プレートを再び洗浄し、その後、それぞれ、ウサギ抗Hisタグポリクローナル抗体(eBiosciences)に続いてペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギイムノグロブリン(Abcam)、又は抗Strepタグモノクローナル抗体(例えば抗体C23-21)に続いてペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスイムノグロブリン(Bio-rad)を加え、最後に製造業者のプロトコルに従ってOPD(o-フェニレンジアミンジヒドロクロリド,Dako)により顕色した。
3.5 配列解析
VHHをコードするDNAはGATC Biotechが配列決定した。配列をSerial Clonerで処理した。
3.6 pIの測定
VHHのpIを、IEF 2-9ゲル(Invitrogen)を用いる等電点電気泳動により測定した。アノードにサンプル適用するNEPGHE(非平衡pHグラジエントゲル電気泳動)を用いた。なぜならば、そのことにより、pH8.5〜10.5を含む塩基性範囲のゲルにおける最適なタンパク質分析が可能となるからである。プロトコルはSERVAGel IEF 3-10指示マニュアルに詳述されていた。
免疫組織化学を、ホルマリン固定組織(パラフィン包埋若しくは凍結切片又はビブラトーム切片)について行った。標準的なIHCプロトコルを適用し、各組織条件に適合させた。免疫染色実験のほとんどを、パラフィン切片を用いて行ったので、ここでは、パラフィン包埋材料についての詳細なプロトコルを記載する。脳組織の免疫染色は4μm厚のパラフィン切片で行った。ヒト組織及びマウス組織の両方を用いた(AD又は他のタウオパチーを有するヒト患者及びTg4510マウス[Santacruzら 2005 Science,309,476-481])。切片をキシレン中で脱パラフィン化し、エタノール(100%、90%及び70%)(各溶液について5分間)及び最後に10分間の流水(水道水)により再水和させた。次いで、切片を98%ギ酸中で5分間インキュベートし、流水(水道水)下で再度洗浄し、3%過酸化水素及び20%メタノールで内因性ペルオキシダーゼをクエンチし、最後に水で洗浄した。切片をTBS+0.5% Tween中2%のウシ血清アルブミン中で30分間インキュベートすることにより、非特異結合をブロックした。次いで、適切な希釈率の一次抗体(His又はStrepタグを有する1〜10μg/mlのVHH)を適用し、スライスを湿潤チャンバ内で4℃にて一晩インキュベートした。スライドをTBS-Tweenで洗浄し、TBS-Tween中の二次抗体であるウサギ抗Hisタグ(1/1000)又は自家製ビオチン化抗strep mAb C23-21と室温で1時間インキュベートした。次いで、スライドをDako REALTM検出システムの試薬、ペルオキシダーゼ/DAB+と製造業者の指示に従ってインキュベートした。良好なSN比が得られるまで(約5分間)、色素原(DAB)を発色させた。TBS-Tweenでの洗浄後、スライドをヘマトキシリンで対比染色した。NFTの標識のために、ビオチン化mAb AT8(ThermoScientific)をポジティブコントロールとして並行して用いた。
タウ-A2-S-AF488を用いるNFTの免疫蛍光染色を、Tg4510マウスからビブラトーム(Leica VT1000S)を用いて得た40μm厚の自由浮遊切片について行った。3×5分間のPBSでの洗浄後、切片を、2%のBSAを含有するPBS-Triton 0.2%と15分間インキュベートすることによりブロックした後、PBS-Triton 0.2%中1μg/mlのタウ-A2-S-AF488へ代えて、4℃にて一晩インキュベートした。最後に切片をPBSで洗浄し、水性マウンティング媒体(Mowiol)を用いてマウントした。
4.1 対象者
タウ-A2及びタウ-A2-S-(DOTA/Gd)3のインビボ評価をTg4510トランスジェニックマウスについて行った。
4.2 VHHの定位注射及びIHC
麻酔したTg4510雌性トランスジェニックマウス(n=2)に注射あたり2μlのVHHを0.5μl/分の速度で定位注射した。マウスをイソフルラン(1〜2%)と空気との混合物(1L/分)で麻酔した。マウスを定位フレームに配置し、Dremelを用いて頭蓋を両側で穿孔した。鈍い針先を備えるHamiltonシリンジを用いてMR造影剤を注射した。各マウスに、各半球で前頭皮質及び海馬の計4ヶ所で注射した。前頭皮質の定位座標は、十字縫合から+0.86mm前方、正中線から±1.5mm側方、硬膜から−0.65mm腹側であった。海馬の定位座標は、十字縫合から−2.18mm後方、正中線から±1.5mm側方、硬膜から−1.8mm腹側であった。注射の2時間後又は24時間後にマウスを安楽死させ、マウスにPBS(pH7.6)中4%パラホルムアルデヒドの心臓内灌流を行った。脳を取り出し、同じ固定液中で一晩4℃にて後固定した。4μm厚のパラフィン切片を作製した。大脳組織でのVHHの存在は、上述の免疫組織化学的手順を用いて検出した。
1)開頭術
2匹の8ヶ月齢Tg4510マウスをイソフルラン(純粋O2中1% vol/vol)の吸入により麻酔し、加温ブランケット(37℃)に配置した。定位フレームを用いて、運動皮質の位置を特定した。切開部位での局所麻酔のために50μlの2%リドカインを皮下注射し、該切開部位の皮膚を除去した。円刃刀を用いて2mm未満の開頭手術を行った。VHHタウ-A2-S-AF488の脳内注射の場合、硬膜を切開した。静脈内注射の場合、硬膜はインタクトに維持した。動きによるアーチファクトを回避するため、頭蓋開口部を2%低融点アガロース及びカバーガラスで覆った。光学的ウィンドウを確保し、歯科用セメントで頭蓋の露出部、創縁及びカバーガラスの端部を覆った。
2)タウ-A2-S-AF488の投与
脳内注射:1.2μg(1.5μL)のタウ-A2-S-AF488を、1匹のTg4510マウスの脳に、皮質表面から深さ1.5mmで注射した。次いで、注射後4時間の間、二光子撮像を行った。
静脈内注射:270μg(150μl)のタウ-A2-S-AF488を1匹のTg4510マウスの尾静脈にゆっくりと注射した。次いで、その後の3時間に二光子撮像を行った。
3)二光子撮像
二光子撮像は、二光子レーザ走査型顕微鏡システム及びPrairieViewソフトウェア(Prairie Technologies,Middelton,WI,USA)で、16× 0.9NA水浸対物レンズ(Nikon,Tokyo,Japan)を920nmにチューニングした二光子レーザ(MaiTai DeepSee,Spectra Physics,Mountain View,CA,USA)と共に用いて行った。画像は画素サイズ0.5μmにて512×512で獲得した。組織では20mW未満のレーザー出力を用いるように注意した。
精製したアルパカイムノグロブリンを用いて1匹のウサギを免疫した。VHHに対するウサギポリクローナル抗体を2工程で精製した。先ず、ポリクローナル抗体を、プロテインA-セファロース4Bビーズを用いるイムノクロマトグラフィーにより単離した。次いで、タウ-A2var-SHで標識したセファロース4Bビーズを用いる別のイムノクロマトグラフィーを行った。このセファロース標識は製造業者(GE)の指示に従って行った。得られる精製抗体は、ウサギ抗体の全量の1%未満を占めていた。この抗体をウサギポリクローナル抗VHH抗体と呼ぶ。この抗体はタウ-A2 VHHに結合する。
1.ポリクローナル応答、ライブラリの構築及び具体的な抗タウVHHの選択
3回の免疫後、Inti(脳抽出物)及びRascar(タウ-pS422)の血清を採集し、それらのリン酸化タウ及び非リン酸化タウへの結合をELISAにより分析した(図1)。Inti及びRascarの血清はリン酸化タウ及び非リン酸化タウの両方を認識したが、Intiの免疫応答はRascarのものより良好であるようであった。しかし、前者はリン酸化タウ及び非リン酸化タウを有意に識別せず、後者はリン酸化タウに関してより高い免疫応答を示した。
血清中に存在する1つ又は幾つかの抗リン酸化タウ抗体が固定マウス組織においてタウ病変を認識し得ることを確実にするために、TauPS2APP(Grueninger F.ら,2010,Neurobiol Dis.,37:294-306)からの凍結ミクロトーム浮遊切片及び非凍結ビブラトーム浮遊切片の両方についてIHCを行った。Intiの血清はタウ病変の免疫染色を示さなかった一方、Rascarの血清は、ミクロトーム切片及びビブラトーム切片の両方においてNFTの特異的タウ染色を示した(データは示さず)。
Intiポリクローナル血清はIHCでNFTを免疫検出しなかったにもかかわらず、血漿におけるリン酸化タウ特異的抗体の存在を排除できない。事実、IHCシグナルの欠如は、(TauPS2APPマウスのNFTに存在するリン酸化タウのエピトープを認識し得る)抗リン酸化タウ抗体の低頻度に起因し得る。これら2匹の動物から得た2つのライブラリをパニング実験用にプールした。
このVHHをベクターpET23又はベクターpASK IBA2にサブクローニングして、それぞれHisタグ又はストレプトアビジンタグを有するVHHを高レベルで発現させた。収量<1mg/l細菌培養物が得られた。単一ドメイン産物は、SDS-PAGE及びRP-HPLC/MSにより純粋〜均質であることが示され(データは示さず);pI値は9.5を超えていた。動的光散乱実験により、タウ-A2は、精製後に、単量体形態であり(RH=4.5±0.3nm)、凝集していないことが示された。VHHタウ-A2のアミノ酸配列を配列番号4とする。
2.1 VHHタウ-A2はC末端タウペプチドのリン酸化セリン422を認識する
幾つかのセリン及びスレオニンは、病原形態のタウにおいてリン酸化されている。エピトープ認識におけるリン酸化の役割を評価するため、ELISAを、リン酸化タウ、及びオボアルブミン(Ova)タンパク質に結合した、タウタンパク質のC末端に由来する単一リン酸化ペプチド(配列CSIDMVDS(PO3H2)PQLATLAD;配列番号6)について行った。リン酸化タウは、S422を含む複数の部位でリン酸化された完全長タウタンパク質であった。VHHタウ-A2は両化合物に結合し、このことから、リン酸化セリン422(pS422)を含むエピトープを認識したことが示唆される(図2)。
VHH特異的免疫反応性の分布をヒトAD脳、他のタウオパチー(前頭側頭型認知症[FTD]、進行型核上性麻痺[PSP]及びピック病[PD])の組織及びトランスジェニックTg4510マウス脳において調べた。
VHHタウ-A2は、AD患者のパラフィン切片においてNFTを免疫検出する良好な能力を示した(図3A)。また、タウ陽性グリア封入体をFTD症例(オリゴデンドログリアコイル小体)及びPSP症例(アストロサイト房)で観察した(図3B)。興味深いことに、参照抗タウAT8 mAbにより同定した代表的な細胞封入体(ピック小体)はタウ-A2について陰性であった(図3C)。このことから、このVHHが幾らかの特異性を示すことが示唆される。他のタウオパチーとは対照的に、ピック小体は唯一3Rタウタンパク質から構成される。よって、タウ-A2は主に4つのリピートでタウを認識するという仮説を立てることができる。野生型マウスの組織では標識は観察されなかった。
パラフィン包埋組織での結果と一致して、マウス自由浮遊ビブラトーム切片でVHHタウ-A2を用いてNFTの免疫検出を容易に達成することができることが示された(図4)。
脳組織におけるVHHタウ-A2の免疫反応性を確証するため、ウェスタンブロットイムノアッセイをAD患者から得た脳抽出物について行った。タウ-pS422 mAb(Grueningerら 2011 Mol Cell Biochem.,357,199-207)を参照抗体として用いた。並列に組換えリン酸化タウ(p-タウ)をSDS-PAGEゲルに負荷した。リン酸化タウタンパク質は、VHHタウ-A2及びタウ-pS422 mAbの両方によって明らかにされた。1つの主要なバンド(70〜100kDaのリン酸化タウに相当)が、AD抽出物においてタウ-A2及びタウ-pS422で免疫検出された。タウ-pS422 mAbでは、分子量130〜150kDaの2つの更なるバンドが観察され、AD脳におけるタウ-pS422の凝集の存在が示されたが、これらバンドはタウ-A2では非常に微かであった(図5)。
N末端からC末端へ、6-ヒスチジンタグ、トロンビン切断部位、VHHタウ-A2配列、続いてG3Sスペーサー及び3つの更なるアミノ酸CSAを含有するCys操作タウ-A2をベクターpET23dにクローニングして、高レベル発現を可能とした(タウ-A2-SH又はA2-SHと呼ぶ;配列番号14)。チオ付加によりタウ-A2-SHをマレイミドAlexa Fluor(登録商標)488に接合した。得られる産物タウ-A2-S-AF488をSDS-PAGE、IEF/NEPGHE(図7A及び7B)及びRP-HPLC/MSにより分析した。産物は、SDS-PAGE及びRP-HPLC/MSにより純粋〜均質であることが示された。全ての分析が、タウ-A2-SHは、VHHタウ-A2上に1つのAF488を有する十分に規定された接合体(タウ-A2-S-AF488と呼ぶ)に完全に変換されたことを示した。タウ-A2-SHは約10(9.5〜10.5)のpIを有しており、AF488接合後にこの値は僅かに減少したが、依然として>9.5のままであった(図7B参照)。タウ-A2-SH及びタウ-A2-S-AF488の水力学半径(RH)をDLSにより別々に測定した。経時的サイズ分布により、タウ-A2-SHについては2.66±0.0788nmの平均RH、タウ-A2-S-AF488については3.576±0.225nmの平均RHが明らかとなった。このことから、共に溶液中で単量体形態であることが示唆された。
4.1 Tg4510マウスの脳スライスにおけるインビトロ標識
マウス脳切片との直接インキュベーション後、タウ-A2-S-AF488は、標準のIHC(図7C〜7D)及び直接蛍光染色(図7E〜7F)により、Tg4510マウスにおけるNFTを検出する良好な能力を示した。
4.2 脳内注射後の二光子撮像
開頭術及び硬膜穿孔に続いてTg4510マウス脳へ1.2μg(1.5μL)を直接脳内注射した後に、タウ-A2-S-AF488のインビボ二光子撮像を行った。大量のCSFが観察され、(注射前でさえ)高い自家蛍光が観察された。適切な二光子撮像に対するこれら制限にもかかわらず、局所皮質注射後にNFTの特異的染色が検出された(図8)。
10mg/kg用量のタウA2-S-AF488を、2匹のTg4510マウスの尾静脈に注射した(270μg,150μL)。このマウスのBBBの完全性は以前にMRIにより検証されており、このマウスにおいて信号変調は見られないことから、BBBの破壊はないことが示唆された(データは示さず)。脳における接合体の血管外漏出及び染色を、脳ウィンドウで二光子顕微鏡観察により注射後4時間記録した(z=表面〜深さ360μm)。図9Aは、同一領域での180分までの経時的なタウA2-S-AF488のインビボ画像化(最大強度投影-MIP)を示す。iv注射の数秒後に樹枝状血管の強力な染色が観察されたが、20分後には劇的に低下し、数本の毛細管のみが染色されたままであった。このことから、循環における接合体化VHHの短い半減期(10〜20分)が示唆される。iv注射の120分後、NFTが可視化され始めた。赤色チャネル信号の不在により、蛍光シグナルが特異的であり(データは示さず)、一般的な自家蛍光によるものでないことが証明された。脳内におけるVHHタウA2-S-AF488の血管外遊出及び染色を、注射後の3時間、脳ウィンドウ(皮質表面直下から350μmまでの深さ)について二光子顕微鏡観察により記録した。強力な自家蛍光バックグランド及び大量のCSF(上記参照)に加えて、Tg4510マウスは顕著な脳萎縮を示した。iv注射の数秒後、密集した血管の強い染色を観察した。注射の2時間後には、自家蛍光シグナルの残存にもかかわらず、NFTの特異的タウ染色を観察した。注射の3時間後でさえもNFTの持続的で特異的な標識が観察された(図9A)。このことから、タウA2-S-AF488の脳半減期は数時間わたるまで延長したことが示唆された。
タウA2-S-AF488の静脈内注射の4時間後、脳を採集して、5μm厚パラフィン切片を作製した。次いで、ウサギポリクローナル抗VHH抗体を用いてIHCを行い、タウA2-S-AF488の拡散及びタウA2-S-AF488によるNFTの標識を確証した(図9B)。
NFTフリーマウスにおける評価
タウA2-S-AF488を野生型NFTフリーC57BL/6マウスに静脈内注射した。二光子顕微鏡観察アッセイにより、脳実質において特異的なインビボ染色は観察されなかった(データは示さず)。
従来型IgG抗体との比較
Tg4510マウスへのAF488接合抗タウmAb(Grueninger F.ら,2010,Neurobiol Dis.,37:294-306)のiv注射により、NFTの検出はできなかった。このことから、この標準的な抗タウ-pS422イムノグロブリンは有意に血管外漏出しないことが示された。
iv注射後の二光子顕微鏡観察により、VHHタウA2-S-AF488は、BBBを横切り、更に2つめの関門(原形質膜)を横切ってニューロン内に浸透して細胞質内の標的に到達する能力が明らかとなった。NFT標識の長期検出(3時間)によっても、脳内におけるこのVHHの長い半減期が示唆される。
1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-四酢酸(DOTA)をキレート剤として用いて、VHHタウ-A2-SHをガドリニウム(MRI造影剤)で標識した。合成マレイミド-(DOTA/Gd)3化合物へのタウ-A2-SHのチオ付加を含む部位特異的結合ストラテジを用いた。タウ-A2-SHは、RP-HPLC/MSにより示されるように、十分に規定された接合体タウ-A2-S-(DOTA/Gd)3に完全に変換された(収率65%)。タウ-A2-S-(DOTA/Gd)3のpIは、非標識タウ-A2-SHのものと比較して僅かに低下していた(データは示さず)。
VHHタウ-A2はリン酸化タウを特異的に検出したが、その生産レベルはかなり低く、平均150μg/Lであり、凝集する傾向がある。したがって、特性が改善されたVHHタウ-A2のバリアントを提供する必要があった。
配列番号14のVHHタウ-A2-SHの2つの疎水性領域に位置する2つの疎水性アミノ酸を変異させた:76位のイソロイシンをグリシンと置換し(I76G)、110位のバリンをグリシンと置換した(V110G)(図10)。これら変異によりVHHの親水性が増大し、GRAVY指数が、タウ-A2-SHについての−0.280から該バリアントについての−0.365に増大した(GRAVY又はハイドロパシー指数の総平均はタンパク質の溶解性を示す:正のGRAVY(疎水性)、負のGRAVY(親水性))。26位のグルタミンもグルタミン酸で変異し(Q26E)、22位と23位との間にアスパラギン酸(D)及びバリン(V)を付加して、pIを僅かに低下させた(塩基性がより低い)(図10)。これら3つの変異アミノ酸(D23、E26及びG110)はCDRの外側に位置する。この変異体をタウ-A2var-SHと呼ぶ(配列番号17)。
− SDS-PAGEにより、見かけの分子量約15〜16KDaに唯1つのバンドが明らかとなった(図11A)。親の対応物より5倍以上である0.8〜1mg/Lと推定される発現レベルを有するタウ-A2var-SHの良好な産生が観察された。更に、タウ-A2var-SHは凝集する傾向がより低い。pIは9.68であり、タウ-A2-SHより塩基性が僅かに低い(図11B)。
− リン酸化タウを認識する両VHHの能力をELISAにより評価した(図11C)。タウ-A2var-SH及びタウ-A2-SHの結合極性を比較しても、リン酸化タウの認識に差は見られなかった(図11C)。
− タウ-A2var-SHの機能的活性を更に評価するため、NFTのマウスモデル(Tg4510マウス)の組織についてIHCを行った。異なる化合物との脳スライスのインキュベーション及び抗His二次抗体により顕色の後、マウス組織上で両化合物によるNFTの検出が観察された(図11D)。タウ-A2varを用いる免疫染色は、タウ-A2を用いる場合と比較して僅かではあるが増強していた。
その後、VHHタウ-A2var-S-(DOTA/Gd)3によるNFTのインビボ検出能力を調べた。10mg/kg用量のタウ-A2var-S-(DOTA/Gd)3を2匹のTg4510マウスの尾静脈に注射した(270μg、150μL)。タウ-A2var-S-(DOTA/Gd)3の静脈内注射の4時間後、脳を採集し、5μm厚パラフィン切片を作製した。次いで、ウサギポリクローナル抗VHH抗体を用いるIHCを行った。皮質でNFTが標識された(図12)。これらデータにより、タウ-A2var-S-(DOTA/Gd)3の脳透過、拡散及びタウ-A2var-S-(DOTA/Gd)3によるNFTの標識が確証される。
これら結果は、タウ-A2varがリン酸化タウ及びNFTの認識に関してタウ-A2と類似する様式で挙動することを証明している。iv注射後のIHCにより、VHHタウ-A2var-S-(DOTA/Gd)3は、BBBを横切り、更に2つめの関門(原形質膜)を横切ってニューロン内に浸透して細胞質内の標的に到達する能力が明らかとなった。
Claims (35)
- リン酸化タウタンパク質を指向し、ラクダ科動物をタウタンパク質のC末端に由来する配列CSIDMVDS(PO3H2)PQLATLAD(配列番号6)の単一リン酸化ペプチド又はリン酸化タウに富むヒトアルツハイマー病脳抽出物で免疫することにより取得可能であることを特徴とする単離されたラクダ科動物重鎖抗体可変ドメイン(VHH)。
- リン酸化タウタンパク質のリン酸化セリン422に結合することを特徴とする請求項1に記載のVHH。
- 取得方法が以下の工程:
(a)ラクダ科動物、好ましくはアルパカ(Lama pacos)をタウタンパク質のC末端に由来する配列CSIDMVDS(PO3H2)PQLATLAD(配列番号6)の単一リン酸化ペプチド又はリン酸化タウに富むヒトアルツハイマー病脳抽出物で免疫する工程、
(b)免疫したラクダ科動物の末梢白血球を単離し、トータルRNAを取得し、対応するcDNAを合成する工程、
(c)VHHをコードするcDNAフラグメントのライブラリを構築する工程、
(d)工程(c)で取得したVHHをコードするcDNAをmRNAにPCRを用いて転写し、mRNAをリボソームディスプレイ形式に変換し、リボソームディスプレイによりVHHを選択する工程、及び
(e)VHHドメインをベクターで発現させる工程
を含んでなることを特徴とする請求項1又は2に記載のVHH。 - ラクダ科動物がラマであることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載のVHH。
- そのアミノ酸配列が、N末端からC末端へ、配列番号1のアミノ酸配列、配列番号2のアミノ酸配列及び配列番号3のアミノ酸配列を含んでなることを特徴とする請求項1〜4のいずれか1項に記載のVHH。
- 配列番号4又は配列番号5のアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項5に記載のVHH。
- リン酸化タウタンパク質のリン酸化セリン422を指向し、そのアミノ酸配列が配列番号5のアミノ酸配列と少なくとも95%の同一性を有する、配列番号5のVHHの単離されたバリアント。
- そのアミノ酸配列が、N末端からC末端へ、配列番号1のアミノ酸配列、配列番号2のアミノ酸配列及び配列番号3のアミノ酸配列を含んでなることを特徴とする請求項7に記載の単離されたバリアント。
- 以下の変異:
− 配列番号5のアミノ酸配列の3位のグルタミン残基(Glu,Q)がアスパラギン酸(Asp,D)及びグルタミン酸(Glu,E)からなる群より選択されるアミノ酸残基、好ましくはGluで置換されており、
− 配列番号5のアミノ酸配列の52位のイソロイシン残基(Ile,I)がアラニン(Ala,A)及びグリシン(Gly,G)からなる群より選択されるアミノ酸残基、好ましくはGlyで置換されており、
− 配列番号5のアミノ酸配列の86位のバリン残基(Val,V)がアラニン(Ala,A)、セリン(Ser,S)、チロシン(Tyr,T)、アスパラギン(Asp,N)、グルタミン(Gln、Q)、アスパラギン酸(Asp,D)、グルタミン酸(Glu,E)、リジン(Lys、K)、アルギニン(Arg、R)及びグリシン(Gly,G)からなる群より選択されるアミノ酸残基、好ましくはGlyで置換されており、
− 任意に、2つのアミノ酸残基が配列番号5のアミノ酸配列のN末端位置に付加されており、当該2つのアミノ酸残基がジペプチド グルタミン酸-バリン(E-V)及びアスパラギン酸-バリン(D-V)からなる群より選択され、好ましくはD-Vである
を有する配列番号5のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項7に記載の単離されたバリアント。 - 配列番号15又は配列番号16のアミノ酸配列から本質的になることを特徴とする請求項7に記載の単離されたVHHバリアント。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載のVHH又は請求項7〜10のいずれか1項に記載のVHHバリアントを含むポリペプチドからなり、該ポリペプチドに含まれるVHH又はVHHバリアントはリン酸化タウタンパク質に結合することができるVHH誘導体。
- 式P-C-Z又はZ-C-P
(式中:
Pは、請求項1〜6のいずれか1項に記載のVHHを含んでなるか又は該VHHからなる100〜500アミノ酸ペプチドであって、そのアミノ酸配列は接近可能な還元型システイン残基を有しておらず、好ましくは還元型システイン残基を有しておらず、
Cはシステイン残基であり、
Zは1〜10アミノ酸スペーサー、好ましくは1〜10の中性又は負荷電アミノ酸のスペーサーを表し、ここで、Zのアミノ酸残基は同一であるか又は異なり、Zはシステイン残基を含有しない)
を有することを特徴とする請求項11に記載のVHH誘導体。 - 請求項1〜6のいずれか1項に記載のVHH又は請求項7〜10のいずれか1項に記載のVHHバリアント又は請求項11若しくは12に記載のVHH誘導体をコードする単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項13に記載のポリヌクレオチドを、宿主細胞における該ポリヌクレオチドの転写の調節を可能にする転写プロモーターの制御下に含んでなる組換え発現カセット。
- 請求項13に記載のポリヌクレオチド又は請求項14に記載の組換え発現カセットを含んでなる組換えベクター。
- 請求項14に記載の組換え発現カセット又は請求項15に記載の組換ベクターを含有する宿主細胞。
- 興味対象の物質に直接又は間接に共有結合又は非共有結合した請求項1〜6のいずれか1項に記載のVHH又は請求項7〜10のいずれか1項に記載のVHHバリアント又は請求項11若しくは12に記載のVHH誘導体を含んでなる診断剤又は治療剤。
- VHH誘導体が請求項12に規定するとおりであり、該VHH誘導体のシステイン残基Cが興味対象の物質にスルフィド結合により結合していることを特徴とする請求項17に記載の診断剤又は治療剤。
- システイン残基Cが興味対象の物質に該興味対象の物質を有するチオール反応性化合物により結合していることを特徴とする請求項18に記載の診断剤又は治療剤。
- チオール反応性化合物がマレイミド化合物であることを特徴とする請求項19に記載の診断剤又は治療剤。
- 興味対象の物質がペプチド、酵素、核酸、ウイルス及び化合物から選択されることを特徴とする請求項17〜20のいずれか1項に記載の治療剤。
- 治療用化合物が鎮痛化合物、抗炎症化合物、抗抑うつ化合物、細胞毒性化合物、抗痙攣化合物又は抗神経変性化合物からなる群より選択されることを特徴とする請求項17〜21のいずれか1項に記載の治療剤。
- 診断用化合物が酵素、蛍光体、NMR若しくはMRI造影剤、放射性同位体又はナノ粒子からなる群より選択されることを特徴とする請求項17〜29のいずれか1項に記載の診断剤。
- 診断用化合物が常磁性体 ガドリニウム(Gd)、ジスプロシウム(Dy)及びマンガン(Mn)、酸化鉄又は鉄白金をベースとする超常磁性体、並びにX核、例えば18F、13C、23Na、17O、15Nからなる群より選択されるNMR又はMRI造影剤、好ましくはガドリニウムであることを特徴とする請求項23に記載の診断剤。
- 診断用化合物が緑色蛍光タンパク質(GFP)、紫外(UV)領域の波長で励起される青色蛍光色素、AMCA(7-アミノ-4-メチルクマリン-3-酢酸)、Alexa Fluor(登録商標) 350、青色光で励起される緑色蛍光色素、FITC、Cy2、Alexa Fluor(登録商標) 488、緑色光で励起される赤色蛍光色素、ローダミン、Texas Red、Cy3、Alexa Fluor(登録商標)色素546、564及び594、近赤外光で励起される色素及びCy5からなる群より選択される蛍光体、好ましくはAlexa Fluor(登録商標) 488であることを特徴とする請求項23に記載の診断剤。
- 興味対象の物質が請求項21〜25のいずれか1項に規定されるとおりの診断用又は治療用化合物を含んでなるリポソーム又はポリマー性物質であることを特徴とする請求項17に記載の診断剤又は治療剤。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載のVHH又は請求項7〜10のいずれか1項に記載のVHHバリアント又は請求項11若しくは12に記載のVHH誘導体と興味対象の物質とを結合する非部位特異的方法であって、興味対象の物質と請求項1〜6のいずれか1項に記載のVHH又は請求項7〜10のいずれか1項に記載のVHHバリアント又は請求項11若しくは12に記載のVHH誘導体との接合工程を含んでなる方法。
- 興味対象の物質と請求項12に記載のVHH誘導体とを結合する部位特異的方法であって、前記VHH誘導体とチオール反応性官能基を有する興味対象の物質との接合工程を含んでなる方法。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載のVHH又は請求項7〜10のいずれか1項に記載のVHHバリアント又は請求項11若しくは12に記載のVHH誘導体及び診断剤を少なくとも含んでなり任意に診断試薬も含んでなるか、或いは請求項17、18及び21〜24のいずれか1項に記載の診断剤及び診断試薬を少なくとも含んでなる、脳撮像のため、又は神経原線維変化、ニューロピルスレッド若しくはジストロフィー性神経突起により媒介される疾患、例えば、アルツハイマー病(AD)、ピック病(PD)、前頭側頭型認知症(FTD)、皮質基底核変性症(CBD)及び進行型核上性麻痺(PSP)を包含するタウオパチーの診断若しくはモニタリングのためのキット。
- 対象者における神経原線維変化、ニューロピルスレッド又はジストロフィー性神経突起により媒介される疾患、例えば、アルツハイマー病(AD)、ピック病(PD)、前頭側頭型認知症(FTD)、皮質基底核変性症(CBD)及び進行型核上性麻痺(PSP)を包含するタウオパチーの診断又はモニタリングのための請求項17〜20及び23〜26のいずれか1項に記載の診断剤の使用。
- 対象者における神経原線維変化、ニューロピルスレッド又はジストロフィー性神経突起により媒介される疾患、例えば、アルツハイマー病(AD)、ピック病(PD)、前頭側頭型認知症(FTD)、皮質基底核変性症(CBD)及び進行型核上性麻痺(PSP)を包含するタウオパチーの診断又はモニタリングのためのインビトロ又はエキソビボ法であって、以下の工程:
a)インビトロで該対象者の適切な生物学的サンプルを請求項17〜20及び23〜26のいずれか1項に記載の診断剤と接触させる工程、及び
b)前記生物学的サンプルにおけるリン酸化タウタンパク質の存否を決定する工程
を含んでなり、リン酸化タウタンパク質の存在は、該対象者が神経原線維変化、ニューロピルスレッド又はジストロフィー性神経突起により媒介される疾患、例えば、アルツハイマー病(AD)、ピック病(PD)、前頭側頭型認知症(FTD)、皮質基底核変性症(CBD)及び進行型核上性麻痺(PSP)を包含するタウオパチーを有することを示す、方法。 - 対象者における神経原線維変化、ニューロピルスレッド又はジストロフィー性神経突起により媒介される疾患、例えば、アルツハイマー病(AD)、ピック病(PD)、前頭側頭型認知症(FTD)、皮質基底核変性症(CBD)及び進行型核上性麻痺(PSP)を包含するタウオパチーの進行又は退行のモニタリングのためのインビトロ又はエキソビボ法であって、以下の工程:
a)インビトロで該対象者の適切な生物学的サンプルを請求項14〜20及び23〜26のいずれか1項に記載の診断剤と接触させる工程、
b)前記生物学的サンプルにおけるリン酸化タウタンパク質の量を測定する工程、及び
c)工程(b)で測定した量を、該対象者について以前に取得したリン酸化タウタンパク質の量と比較する工程
を含んでなり、リン酸化タウタンパク質の量の有意な増加が神経原線維変化、ニューロピルスレッド又はジストロフィー性神経突起により媒介される疾患の進行のマーカーを構成し、リン酸化タウタンパク質の有意な減少が神経原線維変化、ニューロピルスレッド又はジストロフィー性神経突起により媒介される疾患の退行のマーカーを構成する、方法。 - 対象者における神経原線維変化、ニューロピルスレッド又はジストロフィー性神経突起のインビボ画像化法であって、以下の工程:
a)検出可能量の請求項17〜20及び23〜26のいずれか1項に記載の診断剤を対象者、好ましくはヒトに投与する工程、及び
b)該対象者において診断剤を撮像法により検出する工程
を含んでなる方法。 - 請求項17〜22及び26のいずれか1項に記載の治療剤及び医薬的に許容され得るキャリアを含んでなる医薬組成物。
- ラクダ科動物をタウタンパク質のC末端に由来する配列CSIDMVDS(PO3H2)PQLATLAD(配列番号6)の単一リン酸化ペプチド又はリン酸化タウに富むヒトアルツハイマー病脳抽出物で免疫する工程を含んでなる、リン酸化タウタンパク質を指向するVHHの取得方法。
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