JP2019027952A - リン酸化タウタンパク質の測定方法 - Google Patents

リン酸化タウタンパク質の測定方法 Download PDF

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Abstract

【課題】採取の容易な生体試料を用いたリン酸化タウタンパク質の検出系を提供する。【解決手段】被験者から採取された生体試料中のリン酸化タウタンパク質を測定する方法であって、非捕捉ビーズの存在下で、捕捉ビーズ上に、生体試料中のリン酸化タウタンパク質と、捕捉抗体と、検出抗体との免疫複合体を形成させて、前記非捕捉ビーズと前記免疫複合体が結合した捕捉ビーズとを含む測定試料を調製する工程、及び前記測定試料中の免疫複合体に由来するシグナルを検出する工程を含み、前記調製工程において混合される捕捉ビーズと非捕捉ビーズとの個数比が、捕捉ビーズ１に対して非捕捉ビーズ１．５以上である、方法である。【選択図】なし

Description

本発明は、リン酸化タウタンパク質の測定方法、並びに前記測定方法によって取得された測定値に基づいて、被験者がアルツハイマー病に罹患しているか否かの情報を取得する方法に関する。また、本発明は、リン酸化タウタンパク質を測定するための装置、並びに前記測定方法によって取得された測定値に基づいて、被験者がアルツハイマー病に罹患しているか否かの情報を取得する装置に関する。さらに、本発明は、リン酸化タウタンパク質を測定するためのコンピュータプログラム、並びに前記測定方法によって取得された測定値に基づいて、被験者がアルツハイマー病に罹患しているか否かの情報を取得するためのコンピュータプログラムに関する。
リン酸化タウタンパク質はアルツハイマー病などの神経系疾患のバイオマーカーとして有用であると考えられている。非特許文献１には、表面プラズモン共鳴（surface plasmon resonance technology：SPR）法で血清中のリン酸化タウタンパク質を測定し、アルツハイマー病において対照群及び軽度認知障害と比較して、血清中のリン酸化タウタンパク質が高かったことが記載されている。
また特許文献１には、従来のデジタルELISA （Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）法よりも、正確性が改善されたデジタルELISA法が記載されている。
国際公開第第２０１６／１１５２５６号
PLoS One. 2016 Jul 26;11(7):e0159099. doi: 10.1371/journal.pone.0159099. eCollection 2016.
本発明は、リン酸化タウタンパク質の高感度検出系を提供することを課題とする。
本発明の課題を解決するための第１の実施態様は、被験者から採取された生体試料中のリン酸化タウタンパク質を測定する方法であって、非捕捉ビーズの存在下で、捕捉ビーズ上に、生体試料中のリン酸化タウタンパク質と、捕捉抗体と、検出抗体との免疫複合体を形成させて、前記非捕捉ビーズと前記免疫複合体が結合した捕捉ビーズとを含む測定試料を調製する工程、及び前記測定試料中の免疫複合体に由来するシグナルを検出する工程、を含み、前記非捕捉ビーズは前記免疫複合体と結合せず、前記検出抗体及び捕捉抗体の少なくとも一方は、リン酸化タウタンパク質を特異的に認識し、前記捕捉抗体のエピトープと前記検出抗体のエピトープが異なり、前記調製工程において混合される捕捉ビーズと非捕捉ビーズとの個数比が、捕捉ビーズ１に対して非捕捉ビーズ１．５以上である、方法に関する。
本発明の第２の実施態様は、第１の実施態様によって取得されたシグナルの強度に基づいて、前記被験者がアルツハイマー病に罹患しているか否かの情報を取得する方法に関する。
本発明の第３の実施態様は、被験者から採取された生体試料中のリン酸化タウタンパク質を測定する装置２０であって、前記装置２０は、処理部２１を備え、前記処理部２１は、非捕捉ビーズの存在下で、捕捉ビーズ上に、生体試料中のリン酸化タウタンパク質と、検出抗体と、捕捉抗体との免疫複合体を形成させて調製された、前記非捕捉ビーズと前記免疫複合体が結合した捕捉ビーズとを含む測定試料について、前記免疫複合体に由来するシグナルを取得し、前記非捕捉ビーズは前記免疫複合体と結合せず、前記検出抗体及び捕捉抗体の少なくとも一方は、リン酸化タウタンパク質を特異的に認識し、前記捕捉抗体のエピトープと前記検出抗体のエピトープが異なり、前記測定試料の調製において混合される捕捉ビーズと非捕捉ビーズとの個数比が、捕捉ビーズ１に対して非捕捉ビーズ１．５以上である、装置に関する。
本発明の第４の実施態様は、被験者から採取された生体試料中のリン酸化タウタンパク質に由来するシグナルの強度に基づいて、前記被験者がアルツハイマー病であるか否かの情報を取得する装置５０であって、前記装置５０は、処理部５１を備え、前記処理部５１は、非捕捉ビーズの存在下で、捕捉ビーズ上に、生体試料中のリン酸化タウタンパク質と、検出抗体と、捕捉抗体との免疫複合体を形成させて調製された、前記非捕捉ビーズと前記免疫複合体が結合した捕捉ビーズとを含む測定試料について、前記免疫複合体に由来するシグナルを取得し、前記非捕捉ビーズは前記免疫複合体と結合せず、前記検出抗体及び捕捉抗体の少なくとも一方は、リン酸化タウタンパク質を特異的に認識し、前記捕捉抗体のエピトープと前記検出抗体のエピトープが異なり、前記測定試料の調製において混合される捕捉ビーズと非捕捉ビーズとの個数比が、捕捉ビーズ１に対して非捕捉ビーズ１．５以上であり、前記シグナルの強度に基づいて、前記被験者がアルツハイマー病であるか否かの情報を取得する、装置に関する。
本発明の第５の実施態様は、コンピュータに、非捕捉ビーズの存在下で、捕捉ビーズ上に、生体試料中のリン酸化タウタンパク質と、検出抗体と、捕捉抗体との免疫複合体を形成させて調製された、前記非捕捉ビーズと前記免疫複合体が結合した捕捉ビーズとを含む測定試料について、前記免疫複合体に由来するシグナルを取得するステップであって、前記生体試料は、被験者から採取されたものであり、前記非捕捉ビーズは前記免疫複合体と結合せず、前記検出抗体及び捕捉抗体の少なくとも一方は、リン酸化タウタンパク質を特異的に認識し、前記捕捉抗体のエピトープと前記検出抗体のエピトープが異なり、前記測定試料の調製において混合される捕捉ビーズと非捕捉ビーズとの個数比が、捕捉ビーズ１に対して非捕捉ビーズ１．５以上である、ステップを実行させる、リン酸化タウタンパク質を測定するためのコンピュータプログラムに関する。
本発明の第６の実施態様は、コンピュータに、非捕捉ビーズの存在下で、捕捉ビーズ上に、生体試料中のリン酸化タウタンパク質と、検出抗体と、捕捉抗体との免疫複合体を形成させて調製された、前記非捕捉ビーズと前記免疫複合体が結合した捕捉ビーズとを含む測定試料について、前記免疫複合体に由来するシグナルを取得するステップであって、前記非捕捉ビーズは前記免疫複合体と結合せず、前記検出抗体及び捕捉抗体の少なくとも一方は、リン酸化タウタンパク質を特異的に認識し、前記捕捉抗体のエピトープと前記検出抗体のエピトープが異なり、前記測定試料の調製において混合される捕捉ビーズと非捕捉ビーズとの個数比が、捕捉ビーズ１に対して非捕捉ビーズ１．５以上である、ステップと、前記シグナルの強度に基づいて、前記生体試料を採取した被験者がアルツハイマー病であるか否かの情報を取得するステップと、を実行させる、アルツハイマー病であるか否かの情報を取得するためのコンピュータプログラムに関する。
本発明の第１、第３及び第５の実施態様によれば、生体試料中のリン酸化タウタンパク質を検出することができる。また、本発明の第２、第４及び第６の実施態様によれば、生体試料を用いて、被験者がアルツハイマー病であるか否かの情報を取得することができる。
本発明によれば、リン酸化タウタンパク質を高感度に検出することができる。
図１は、測定装置、及び情報取得装置の構成を示す図である。 図２は、測定装置、及び情報取得装置の動作のフローチャートを示す図である。 図３は、試薬の概略を示す図である。 図４は、試薬キットの一例の概略を示す図である。 図５は、試薬キットの他の例の概略を示す図である。 図６は、捕捉ビーズに抗タウタンパク質抗体を結合させて、捕捉ビーズと非捕捉ビーズの個数の最適比を検討したグラフである。 図７は、捕捉ビーズに抗リン酸化タウタンパク質抗体を結合させて、捕捉ビーズと非捕捉ビーズの個数の最適比を検討したグラフである。 図８は、捕捉ビーズと非捕捉ビーズの割合によるアルツハイマー病患者の検出率の違いを示す図である。
［１．リン酸化タウタンパク質の測定方法］
本発明の第１の実施態様は、被験者から採取された生体試料中のリン酸化タウタンパク質を測定する方法に関する。
［１−１．用語の説明］
初めに、本実施態様において使用される用語について説明する。本実施態様において使用される用語の説明は、他の実施態様の説明においても援用される。
本発明において被験者は、特に制限されず健常者又は認知障害若しくは中枢神経系の変性疾患が疑われない者であってよい。また、認知障害又は中枢神経系の変性疾患が疑われる者であってもよい。また、一定の年齢層、例えば３０歳以上、４０歳以上、５０歳以上、６０歳以上、７０歳以上、又は８０歳以上の者を被験者としてもよい。
被検者から採取される生体試料はリン酸化タウタンパク質を含み得る試料であれば特に限定されず、例えば髄液、血液試料などが挙げられる。血液試料には、全血、血漿、血清等が含まれる。好ましくは血漿又は血清であり、より好ましくは血漿である。血漿は、ヘパリン塩（好ましくはナトリウム塩）採血、クエン酸塩（好ましくはナトリウム塩）採血、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）塩（好ましくはナトリウム塩又はカリウム塩）採血された全血から分離することができる。より、好ましくは、血漿は、ＥＤＴＡ塩採血、又はヘパリン塩採血された全血から分離された血漿である。
本発明において、タウタンパク質は、Ｐａｉｒｅｄ ｈｅｌｉｃａｌ ｆｉｌａｍｅｎｔ−ｔａｕであり、例えばヒト由来のものは、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ１０６３６．５（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ／Ｐ１０６３６、２０１７年７月１５日現在）で登録されているタンパク質を挙げることができる。
リン酸化タウタンパク質は、タウタンパク質がリン酸化されている限り制限されない。例えば、リン酸化部位としては、前記アクセッション番号のアミノ酸配列の１９９番目、２０２番目、２１４番目、２６２番目、３５６番目、３９６番目、４０４番目、４０９番目、４１６番目、４２２番目、５１９番目、５１６番目、及び７１７番目よりなる群から選択される少なくとも１つのセリン残基、及び／又は１８１番目、２０５番目、２１２番目、２１７番目、２３１番目、及び５３４番目よりなる群から選択される少なくとも１つのスレオニン残基である。好ましくは、１８１番目のスレオニン、１９９番目のセリン、２３１番目のスレオニン、及び２６２番目のセリンよりなる群から選択される少なくとも１つである。
本発明において、抗体は、タウタンパク質及び／又はリン酸化タウタンパク質を認識できる限り制限されない。リン酸化タウタンパク質を認識する抗体は、好ましくはリン酸化タウタンパク質に特異的に結合する抗体（リン酸化されていないタウタンパク質とは結合しない、リン酸化タウタンパク質特異抗体）である。リン酸化タウタンパク質特異抗体（以下、「ｐ−ｔａｕ特異抗体」ともいう）は、タウタンパク質のリン酸化されたリン酸化部位を認識してもよいが、リン酸化に伴って構造が変化したタウタンパク質を認識してもよい。より好ましくは、ｐ−ｔａｕ特異抗体は、タウタンパク質のリン酸化されたリン酸化部位を認識する。
抗体としては、タウタンパク質、リン酸化タウタンパク質、又はこれらの一部を抗原としてヒト以外の動物に免疫して得られたポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、及びそれらの断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２等）のいずれも用いることができる。また、免疫グロブリンのクラス及びサブクラスは特に制限されない。また、ファージディスプレイ法等により抗体ライブラリから選択されたものを使用してもよい。
さらに、抗体は市販のものを使用してもよい。タウタンパク質を認識する抗体としては、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳＩＥＮＴＩＦＩＣ社のＴａｕ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ｃｌｏｎｅ：ＨＴ７、Ｔ４６、ＴＡＵ−５）等を使用することができる。また、リン酸化タウタンパク質を認識する抗体としては、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳＩＥＮＴＩＦＩＣ社のＰｈｏｓｐｈｏ−Ｔａｕ（Ｔｈｒ１８１） Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ｃｌｏｎｅ：５ＨＣＬＣ）、Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｔａｕ （Ｔｈｒ２３１） Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃａｔ＃：７１０５６１）、Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｔａｕ（Ｓｅｒ２１４） Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃａｔ＃：４４−７４２Ｇ）等を使用することができる。
本明細書において、捕捉抗体とは、リン酸化タウタンパク質と結合し、且つ後述のビーズ上に固定される抗体である。ビーズへの固定は、アビジン（又はストレプトアビジン）及びビオチンなどの物質を介在した間接的な固定であってもよい。
本明細書において、検出抗体とは、リン酸化タウタンパク質と結合し、好ましくは後述の標識物質を備えた抗体である。
捕捉抗体及び検出抗体の少なくとも一方は、ｐ−ｔａｕ特異抗体である。これにより、生体試料中のタウタンパク質のうち、リン酸化タウタンパク質を特異的に検出することができる。
捕捉抗体及び検出抗体のいずれもｐ−ｔａｕ特異抗体を用いる場合、これらの抗体のエピトープが異なることが好ましい。
捕捉抗体及び検出抗体の一方にｐ−ｔａｕ特異抗体を用いる場合、他方の抗体はリン酸化の有無にかかわらずタウタンパク質と結合可能な抗体であることが好ましい。
本発明においてビーズは、個々のビーズを空間的に分離することができる特性を有する限り制限されない。前記ビーズは、複数の場所（例えばウェル）に空間的に分離することができるような形態で提供されてもよい。例えば、ビーズは、球形、ディスク、リング、立方体状等の形状とすることができる。また、前記ビーズは、微粒子（例えば、液体中に懸濁される複数の粒子）、ナノチューブ等であってもよい。
ビーズのサイズ又は形状は、適宜設計することができる。例えば、ビーズの形状には、球体、立方体、楕円体、チューブ等が含まれる。ビーズの平均直径（実質的に球形の場合）、又は平均最大断面寸法（他の形状の場合）は、約０．１μｍより大きく、約１μｍより大きく、約１０μｍより大きく約１００μｍより大きい、約１ｍｍより大きい、又は同様のものを含む。またビーズの平均直径又はビーズの最大外寸は、約０．１μｍから約１００μｍ、約１μｍから約１００μｍ、約１０μｍから約１００μｍ約０．１μｍから約１ｍｍの間、約１μｍから約１０ｍｍの間、約０．１μｍから約１０μｍの間等である。本実施態様において使用するビーズの平均直径又は平均最大断面寸法は、ビーズの直径／最大断面寸法の算術平均値である。
ビーズの平均最大断面寸法は、例えばレーザー光散乱、顕微鏡法、ふるい分析、電気抵抗方式、又は他の公知の技術を使用して測定することができる。ビーズの平均直径は、レーザー回折・散乱法による粒度分布測定装置により測定される体積基準のメジアン径である。このような粒度分布測定装置としては、日機装株式会社製「マイクロトラックＭＴ３０００ＩＩ」等が挙げられる。
またビーズは、測定において使用される溶媒又は溶液に不溶性又は実質的に不溶性である。ビーズは、多孔質又は実質的に多孔質、中空、部分的に中空等であってもよいが、非多孔質固体又は実質的に非多孔質の固体（例えば、本質的に孔がない）であることが好ましい。ビーズは、溶媒を、実質的に吸収又は吸収するものであってもよいが、好ましくは非吸収、実質的に非吸収である。
さらに、ビーズの材料は、プラスチック又は合成ポリマー（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリアミド、ポリウレタン、フェノールポリマー又はニトロセルロース等）、天然由来ポリマー（ラテックスゴム、多糖類金属、又は金属化合物（例えば、金、銀、スチール、アルミニウム、銅等を含む）、無機ガラス、シリカ、及びこれらの混合物等を選択することができる。前記ビーズは、磁性材料を含むことが好ましい。さらに、前記ビーズは、光学的に検出できることが好ましい。
前記ビーズは、市販のものを使用することができる。例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のカルボキシル官能化常磁性ビーズ（直径２．７μｍ）を使用することができる。
本発明において、捕捉ビーズは、タウタンパク質及び／又はリン酸化タウタンパク質（以下、「標的タンパク質」ともいう）を含む複合体を固定化できるビーズである。例えば、上述のビーズに標的タンパク質と結合できる分子（以下、「捕捉分子」ともいう）を直接的又は間接的に固定したものを捕捉ビーズとすることができる。捕捉分子としては、上述の捕捉抗体が例示される。
捕捉ビーズの調製方法は、ビーズに捕捉分子を結合できる限り制限されない。例えば、捕捉分子が抗体である場合には、特許文献１に記載の方法により調製することができる。また、Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ社のＳｉｍｏａＴＭ Ｈｏｍｅｂｒｅｗ Ａｓｓａｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｋｉｔ等の市販キットを使用して、捕捉ビーズを調製してもよい。捕捉ビーズは、非特異的結合を抑制するため、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などでブロッキングされていてもよい。
非捕捉ビーズは、上記標的タンパク質と実質的に結合しないビーズである。非捕捉ビーズは、捕捉分子を備えていない。非捕捉ビーズに使用されるビーズの材質は、捕捉ビーズに使用されるビーズと同じものであってもよいが、異なるものであってもよい。また、非捕捉ビーズとしては、例えば、Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ社のＤｙｅ−Ｅｎｃｏｄｅｄ Ｈｅｌｐｅｒ Ｂｅａｄｓを使用してもよい。非捕捉ビーズは、非特異的結合を抑制するため、ＢＳＡなどでブロッキングされていてもよい。
［１−２．測定方法］
次に、本実施態様の測定方法について説明する。
本実施態様は、リン酸化タウタンパク質を含むサンドイッチ免疫複合体を形成し、リン酸化タウタンパク質を検出するサンドイッチイムノアッセイ方法である。本実施態様は、非捕捉ビーズの存在下で、捕捉ビーズ上に、前記被験者から採取した生体試料中の標的タンパク質であるリン酸化タウタンパク質と、捕捉抗体と、検出抗体との免疫複合体を形成させて、前記非捕捉ビーズと前記免疫複合体が結合した捕捉ビーズとを含む測定試料を調製する工程と、前記測定試料中の免疫複合体に由来するシグナルを検出する工程とを含む。
本実施態様において、捕捉ビーズ上に、生体試料中の標的タンパク質と、捕捉抗体と、検出抗体との免疫複合体を形成させる方法は、本実施態様が実現できる限り制限されない。捕捉抗体と、検出抗体とは、標的タンパク質の異なるエピトープを認識することが好ましい。例えば、捕捉ビーズ上の捕捉分子として、タウタンパク質を認識する捕捉抗体を用い、初めに捕捉抗体に生体試料中の標的タンパク質を結合させて、標的タンパク質を捕捉ビーズ上に結合させる（好ましくは、捕捉する）。次に、リン酸化タウタンパク質を認識する検出抗体を、捕捉抗体に捕捉された標的タンパク質に含まれるリン酸化タウタンパク質に結合させて免疫複合体を形成させる。あるいは、例えば、捕捉ビーズ上の捕捉分子として、リン酸化タウタンパク質を認識する捕捉抗体を用い、初めに捕捉抗体に生体試料中の標的タンパク質を結合させて、標的タンパク質を捕捉ビーズ上に結合させる（好ましくは、捕捉する）。次に、タウタンパク質を認識する検出抗体を、捕捉抗体に捕捉されたリン酸化タウタンパク質に結合させて免疫複合体を形成させる。生体試料は、例えば０．０５％（ｖ／ｖ）から０．１５％のポリエチレングリコールソルビタンモノラウラート（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０）等を含む１から５×ＰＢＳ等で希釈して用いてもよい。
また別の態様として、生体試料中のリン酸化タウタンパク質と、捕捉抗体と、検出抗体との免疫複合体を緩衝液中で形成させてから、捕捉ビーズに結合させてもよい。たとえば、アビジン又はストレプトアビジンを固定化したビーズと、ビオチン標識した捕捉抗体、リン酸化タウタンパク質及び検出抗体の複合体とを接触させることにより、免疫複合体を補足ビーズ上に固定することができる。
前記免疫複合体は、非捕捉ビーズの存在下で形成される。測定試料を調製する際の捕捉ビーズと非捕捉ビーズの個数比は、捕捉ビーズを１としたときに、約１．５以上であり、好ましくは非捕捉ビーズが約１．５から約９の範囲、より好ましくは約４から約９の範囲、最も好ましくは４前後に調整することができる。別の態様においては、測定試料を調製する際の捕捉ビーズと非捕捉ビーズの個数比は、捕捉ビーズを１としたときに、非捕捉ビーズが１．５以上であり、好ましくは非捕捉ビーズが１．５から９の範囲、より好ましくは４から９の範囲、最も好ましくは４である。生体試料又は希釈した生体試料と混合されるビーズ全体の数は、例えば、生体試料又は希釈した生体試料１００μｌに対して、１００，０００個から１，０００，０００個程度、好ましくは、４００，０００個から８００，０００個程度とすることができる。
測定試料の調製は、免疫複合体が形成可能な緩衝液（例えば１から５×ＰＢＳ）中で行うことができる。前記緩衝液は、０．０５％（ｖ／ｖ）から０．１５％（ｖ／ｖ）程度のＴｗｅｅｎ（登録商標）−２０等の界面活性剤を含んでいてもよい。また、測定試料の調製中に、捕捉抗体で生体試料中のリン酸化タウタンパク質を捕捉した後、検出抗体を結合させる前に、捕捉ビーズを前記緩衝液で洗浄してもよい。また、捕捉ビーズ上に、生体試料中のリン酸化タウタンパク質と、検出抗体と、捕捉抗体との免疫複合体を形成させた後にも、捕捉ビーズを前記緩衝液で洗浄してもよい。
検出抗体は、前記生体試料又は希釈した生体試料１００μｌに対して、終濃度で０．０５μｇ／ｍｌから１μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌから０．５μｇ／ｍｌ程度となるように添加することができる。検出抗体は、標識物質を備えることが好ましい。
リン酸化タウタンパク質の検出は、免疫複合体に含まれる標識物質を検出することにより行うことができる。前記標識物質は、検出可能なシグナルが生じる限り、特に限定されない。例えば、それ自体がシグナルを発生する物質（以下、「シグナル発生物質」ともいう）であってもよく、他の物質の反応を触媒してシグナルを発生させる物質であってもよい。シグナル発生物質としては、例えば、蛍光物質、放射性同位元素等が挙げられる。他の物質の反応を触媒して検出可能なシグナルを発生させる物質としては、例えば、酵素が挙げられる。酵素としては、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ等が挙げられる。蛍光物質としては、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）等の蛍光色素、ＧＦＰ等の蛍光タンパク質等が挙げられる。放射性同位元素としては、１２５Ｉ、１４Ｃ、３２Ｐ等が挙げられる。それらの中でも、標識物質として、酵素が好ましく、βガラクトシダーゼが特に好ましい。
酵素の基質は、該酵素の種類に応じて公知の基質から適宜選択できる。例えば、酵素としてアルカリホスファターゼを用いる場合、基質として、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）（４−クロロ−３−（メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロロ）トリクシロ［３．３．１．１３，７］デカン］−４−イル）フェニルリン酸２ナトリウム）、ＣＳＰＤ（登録商標）（３−（４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２−（５’−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン］−４−イル）フェニルリン酸２ナトリウム）等の化学発光基質、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）、５−ブロモ−６−クロロ−インドリルリン酸２ナトリウム、ｐ−ニトロフェニルリン酸等の発色基質が挙げられる。酵素としてβガラクトシダーゼを使用する場合には、レソルフィンβ−Ｄ−ガラクトピラノシドを使用することができる。酵素として、ペルオキシダーゼを用いる場合には、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＣＥ社のＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ ＥＬＩＳＡシリーズ等を使用することができる。これら酵素反応は、ビーズを後述するマイクロウェルに配置してから前に行うことが好ましいが、ビーズをマイクロウェルに配置してから酵素反応を行ってもよい。
また、検出抗体をビオチン化しておき、前記標識物質を標識したアビジン又はストレプトアビジンと結合させてから、前記シグナルを検出してもよい。
シグナルの検出は、測定試料に含まれている捕捉ビーズ及び非捕捉ビーズを含むビーズについて、その全部又は一部について行うことができる。シグナルの検出は個々のビーズについて行うことが好ましい。ここで、捕捉ビーズと、非捕捉ビーズとは、そのシグナルの有無、強弱、波長等が異なるため、これらを識別できる検出装置を使用することが好ましい。
個々のビーズのシグナルを検出する方法としては、例えばシグナルが蛍光である場合には、フローサイトメータを用いて検出することができる。
また、別の態様として、複数のマイクロウェルを有する基板に前記測定試料を接触させて、前記測定試料中の捕捉ビーズ及び非捕捉ビーズを、前記マイクロウェルに配置して、マイクロウェル内のシグナルを検出してもよい。
基板上においてマイクロウェルは、実質的に平坦な表面上に、又は非平面の３次元配列で配置され得る。マイクロウェルは、規則的なパターンで配列されていてもよいし、ランダムに分布していてもよい。好ましくは、マイクロウェルは、実質的に平坦な表面上の部位の規則的なパターンであることが好ましい。
基板に含まれるマイクロウェルの数は、１測定試料あたり１０００個から１，０００，０００個程度とすることができる。好ましくは、基板は１０，０００個から５００，０００個、より好ましくは１００，０００個から５００，０００個程度のマイクロウェルを含むことができる。
前記基板の材料は、ガラス（修飾及び／又は官能化ガラスを含む）、プラスチック（ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ）、テフロン（登録商標）、多糖類、ナイロン又はニトロセルロース等）、エラストマー（例えば、ジメチルシロキサン及びポリウレタン等））、複合材料、セラミックス、シリカ又はシリカ系材料（ケイ素及び変性シリコンを含む）、炭素、金属、光ファイバー束等から構成されうる。
個々のマイクロウェルの容量は、ビーズの大きさに合わせて、適宜設定することができる。例えば、１ウェルに収容されるビーズの数は１個から５個程度、好ましくは１から２個程度、より好ましくは１個である。このため、マイクロウェルの容積は、１ウェルに前記数のビーズが収容される大きさであることが好ましい。（例えば、米国特許出願公開第２０１１／０２１２８４８号明細書、国際公開第２０１１／１０９３６４号）。より具体的には、マイクロウェルの容積は、１００アットリットルから１ピコリットル、好ましくは１フェムトリットルから５００フェムトリットル、より好ましくは１０フェムトリットルから９０フェムトリットルの範囲である。１つの基板上に存在する複数のマイクロウェルは、それぞれがほぼ同じ容積を有することが好ましい。
前記マイクロウェルの形成方法は、所望の大きさのマイクロウェルが形成できる限り制限されない。例えば、フォトリソグラフィー、スタンピング技術、成形技術、エッチング技術等の公知の方法により形成することができる。
マイクロウェル内へのビーズの配置は、公知の方法を使用して行うことができる。 例えば、特許文献１に記載のマイクロ流体技術を用いてマイクロウェル内にビーズを配置することができる。ここで、ビーズは、基板上のマイクロウェルの全てに配置されてもよく、一部に配置されてもよい。
例えば、測定試料をマイクロウェルが設計された基板に接触させた後、基板及び溶液を遠心して、ビーズをマイクロウェル配置することができる。ビーズが磁気である場合、磁石を使用してビーズをマイクロウェルに配置してもよい。あるいは、マイクロウェルが光ファイバー束の端部に形成されている場合、光ファイバーのもう一端の周りに測定試料を接触させた後、遠心力、圧力等の力を加えて、マイクロウェルにビーズを配置してもよい。
ビーズをマイクロウェルに配置した後、マイクロウェルの周囲の基板に残った測定試料を除去し、基板の表面を洗浄及び／又は拭き取って余分な測定試料を除去してもよい。
上記マイクロウェルを含む基板としては、例えば、Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ社のＳｉｍｏａＴＭ Ｄｉｓｋを使用することができる。
また、ビーズを配置した後のマイクロウェルは、フルオラス液体、油（例えば、鉱油、フッ素化油）、強磁性流体、非水性ポリマー溶液（例えば、増粘剤）等でシールされてもよい。前記シールには、例えば、Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ社のＳｉｍｏａＴＭ Ｓｅａｌｉｎｇ Ｏｉｌを使用してもよい。
マイクロウェルに配置されたビーズの検出は、例えば標識物質が酵素や蛍光色素である場合には、ＣＣＤカメラ等で、シグナルを撮像することにより行うことができる。また、標識物質が放射性同位元素である場合には、オートラジオグラフィーを使用して検出することができる。
マイクロウェルに配置されるビーズは、捕捉ビーズ、又は非捕捉ビーズであるが、標的タンパク質を捕捉した捕捉ビーズは、前記標識物質に由来するシグナル（すなわち、前記免疫複合体に由来するシグナル）を発するのに対して、標的タンパク質を捕捉しなかったビーズ及び非捕捉ビーズは、前記標識物質に由来するシグナルを発しない。このため、前記標識物質に由来するシグナルを発するウェルの数を計数することによって、標的タンパク質を定量することができる。シグナルを検出するマイクロウェルは、基板上の全てのマイクロウェルであってもよく、一部でもよい。
前記標識物質に由来するシグナルを発するウェルの数は、例えば、Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ社のＳｉｍｏａＴＭ ＨＤ−１ Ａｎａｌｙｚｅｒで測定することができる。ＳｉｍｏａＴＭ ＨＤ−１ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用した場合、シグナルの強さは、ビーズあたりの平均酵素（ＡＥＢ）値として表される。このため、ＡＥＢ値を測定試料中の免疫複合体に由来するシグナル強度としてもよい。
また、検量線を用いて、ＡＥＢ値をリン酸化タウタンパク質の測定値に換算してもよい。ここでリン酸化タウタンパク質の測定値とは、リン酸化タウタンパク質（の量又は濃度を反映した値をいう。当該測定値を「量」で標記する場合には、モルであっても質量であってもよいが、質量で標記することが好ましい。また、値を「濃度」で表記する場合には、モル濃度であっても生体試料の一定容量あたりの質量の割合（質量／容量）であってもよいが、好ましくは質量／容量である。
本実施態様の測定方法としては、Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ社のプロトコールにしたがって、標識物質としてβガラクトシダーゼを用い、レソルフィンβ−Ｄ−ガラクトピラノシドを基質として用いることが好ましい。また、ビーズはＳｉｍｏａＴＭ Ｄｉｓｋにアプライされ、ＳｉｍｏａＴＭ ＨＤ−１ Ａｎａｌｙｚｅｒでシグナル強度を取得することが好ましい。
［２．アルツハイマー病に罹患しているか否かの情報を取得する方法］
本発明の第２の実施態様は、上記１．で取得されたリン酸化タウタンパク質のシグナルの強度に基づいて、前記被験者がアルツハイマー病に罹患しているか否かの情報を取得する。
より具体的には、前記被験者の生体試料中のリン酸化タウタンパク質に由来するシグナル強度を所定の基準値と比較し、前記被験者の生体試料中のリン酸化タウタンパク質に由来するシグナル強度が高い場合に、前記被験者がアルツハイマー病に罹患しているという情報を取得する。
ここで、所定の基準値とは、リン酸化タウタンパク質に由来するシグナル強度の基準値をいう。前記基準値は、アルツハイマー病及び／又は軽度認知症を発症していない者の生体試料中のリン酸化タウタンパク質に由来するシグナル強度（陰性対照値）に基づいて決定することができる。あるいはアルツハイマー病を発症した者の生体試料中のリン酸化タウタンパク質に由来するシグナル強度（陽性対照値）に基づいて決定することができる。また、基準値は、陰性対照値及び陽性対照値の双方から決定してもよい。例えば、複数の陽性対照値と、複数の陰性対照値とを取得し、これらの複数の値に基づいて陽性と陰性とを最も精度よく分類できる値を「基準値」とすることができる。ここで、「最も精度よく分類できる値」は、検査の目的によって感度、特異度、陽性的中率、陰性的中率等の指標に基づいて適宜設定することができる。また、別の例では、感度、特異度、陰性的中率、陽性的中率等の観点から陽性と陰性とを最も精度良く分類できる基準値を設定することができる。
ここで、前記シグナル強度に代えて、リン酸化タウタンパク質の測定値を用いて、前記被験者がアルツハイマー病に罹患しているか否かの情報を取得してもよい。
［３．リン酸化タウタンパク質を測定する装置、アルツハイマー病であるか否かの情報を取得する装置］
本発明の第３の実施態様は、少なくとも処理部２１を備える、被験者から採取された生体試料中のリン酸化タウタンパク質を測定する装置（以下、測定装置という）２０に関する。また、第３の実施態様は、測定装置２０と、測定ユニット４０とを備える、被験者から採取された生体試料中のリン酸化タウタンパク質を測定するシステム２００であってもよい。
さらに、本発明の第４の実施態様は、少なくとも処理部５１を備える、被験者から採取された生体試料中のリン酸化タウタンパク質のシグナル強度に基づいて、前記被験者がアルツハイマー病であるか否かの情報を取得する装置（以下、情報取得装置という）５０に関する。また、第４の実施態様は、情報取得装置５０と、測定ユニット４０とを備える、被験者から採取された生体試料中のリン酸化タウタンパク質のシグナル強度に基づいて、前記被験者がアルツハイマー病であるか否かの情報を取得するシステム５００であってもよい。
第３及び第４の実施態様において、上記１．及び２．で既に説明されている用語については、説明を省略するが、上記１．及び２．における各用語についての説明は、第２の実施態様にも援用される。
［３−１．測定装置の構成］
図１に、測定装置２０のハードウェアの構成を示す。測定装置２０は、入力部３０と、出力部３１と、記憶媒体３２と接続されていてもよい。
測定装置２０において、処理部（ＣＰＵ）２１と、主記憶部２２と、ＲＯＭ（ｒｅａｄ ｏｎｌｙ ｍｅｍｏｒｙ）２３と、補助記憶部２４と、通信インタフェース（Ｉ／Ｆ）２８と、入力インタフェース（Ｉ／Ｆ）２５と、出力インタフェース（Ｉ／Ｆ）２６と、メディアインターフェース（Ｉ／Ｆ）２７は、バス２９によって互いにデータ通信可能に接続されている。
ＣＰＵ２１は、測定装置２０の処理部である。ＣＰＵ２１が、補助記憶部２４又はＲＯＭ２３に記憶されているコンピュータプログラムを実行し、取得されるデータの処理を行うことにより、測定装置２０が機能する。
ＲＯＭ２３は、マスクＲＯＭ、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ等によって構成され、ＣＰＵ２１により実行されるコンピュータプログラム及びこれに用いるデータが記録されている。ＣＰＵ２１はＭＰＵ２１としてもよい。ＲＯＭ２３は、測定装置２０の起動時に、ＣＰＵ２１によって実行されるブートプログラムや測定装置２０ハードウェアの動作に関連するプログラムや設定を記憶する。
主記憶部２２は、ＳＲＡＭ又はＤＲＡＭ等のＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ ａｃｃｅｓｓ ｍｅｍｏｒｙ）によって構成される。主記憶部２２は、ＲＯＭ２３及び補助記憶部２４に記録されているコンピュータプログラムの読み出しに用いられる。また、主記憶部２２は、ＣＰＵ２１がこれらのコンピュータプログラムを実行するときの作業領域として利用される。
補助記憶部２４は、ハードディスク、フラッシュメモリ等の半導体メモリ素子、光ディスク等によって構成される。補助記憶部２４には、オペレーティングシステム及びアプリケーションプログラム等の、ＣＰＵ２１に実行させるための種々のコンピュータプログラム及びコンピュータプログラムの実行に用いる各種設定データが記憶されている。具体的には、補助記憶部２４は、後述する測定プログラム、シグナル強度の基準値、リン酸化タウタンパク質の測定値の基準値等を記憶する。
通信Ｉ／Ｆ２８は、ＵＳＢ、ＩＥＥＥ１３９４、ＲＳ−２３２Ｃ等のシリアルインタフェース、ＳＣＳＩ、ＩＤＥ、ＩＥＥＥ１２８４等のパラレルインタフェース、及びＤ／Ａ変換器、Ａ／Ｄ変換器等からなるアナログインタフェース、ネットワークインタフェースコントローラ（Ｎｅｔｗｏｒｋ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ：ＮＩＣ）等から構成される。通信Ｉ／Ｆ２８は、ＣＰＵ２１の制御下で、測定ユニット４０又は他の外部機器からのデータを受信し、必要に応じて測定装置２０が保存又は生成する情報を、測定ユニット４０又は外部に送信又は表示する。通信Ｉ／Ｆ２８は、ネットワークを介して測定ユニット４０又は他の外部機器と通信を行ってもよい。
入力Ｉ／Ｆ２５は、例えばＵＳＢ、ＩＥＥＥ１３９４、ＲＳ−２３２Ｃ等のシリアルインタフェース、ＳＣＳＩ、ＩＤＥ、ＩＥＥＥ１２８４等のパラレルインタフェース、及びＤ／Ａ変換器、Ａ／Ｄ変換器等からなるアナログインタフェース等から構成される。入力Ｉ／Ｆ２５は、入力部３０は文字入力、クリック、音声入力等を受け付ける。受け付けた入力内容は、主記憶部２２又は補助記憶部２４に記憶される。
入力部３０は、タッチパネル、キーボード、マウス、ペンタブレット、マイク等から構成され、測定装置２０に文字入力又は音声入力を行う。入力部３０は、測定装置２０の外部から接続されても、測定装置２０と一体となっていてもよい。
出力Ｉ／Ｆ２６は、例えば入力Ｉ／Ｆ２５と同様のインタフェースから構成される。出力Ｉ／Ｆ２６は、ＣＰＵ２１が生成した情報を出力部３１に出力する。出力Ｉ／Ｆ２６は、ＣＰＵ２１が生成し、補助記憶部２４に記憶した情報を、出力部３１に出力する。
出力部３１は、例えばディスプレイ、プリンター等で構成され、測定ユニット４０から送信される測定結果及び測定装置２０における各種操作ウインドウ、測定結果等を表示する。
メディアＩ／Ｆ２７は、記憶媒体３２に記憶された例えばアプリケーションソフト等を読み出す。読み出されたアプリケーションソフト等は、主記憶部２２又は補助記憶部２４に記憶される。また、メディアＩ／Ｆ２７は、ＣＰＵ２１が生成した情報を記憶媒体３２に書き込む。メディアＩ／Ｆ２７は、ＣＰＵ２１が生成し、補助記憶部２４に記憶した情報を、記憶媒体３２に書き込む。
記憶媒体３２は、フレキシブルディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、又はＤＶＤ−ＲＯＭ等で構成される。記憶媒体３２は、フレキシブルディスクドライブ、ＣＤ−ＲＯＭドライブ、又はＤＶＤ−ＲＯＭドライブ等によってメディアＩ／Ｆ２７と接続される。記憶媒体３２には、コンピュータがオペレーションを実行するためのアプリケーションプログラム等が格納されていてもよい。
ＣＰＵ２１は、測定装置２０の制御に必要なアプリケーションソフトや各種設定をＲＯＭ２３又は補助記憶部２４からの読み出しに代えて、ネットワークを介して取得してもよい。前記アプリケーションプログラムがネットワーク上のサーバコンピュータの補助記憶部２４内に格納されており、このサーバコンピュータに測定装置２０がアクセスして、コンピュータプログラムをダウンロードし、これをＲＯＭ２３又は補助記憶部２４に記憶することも可能である。
また、ＲＯＭ２３又は補助記憶部２４には、例えば米国マイクロソフト社が製造販売するＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）等のグラフィカルユーザインタフェース環境を提供するオペレーションシステムがインストールされていてもよい。第５の実施態様に係るアプリケーションプログラムは、前記オペレーティングシステム上で動作するものとする。すなわち、測定装置２０は、パーソナルコンピュータ等であり得る。また、測定装置２０は、測定ユニット４０に内蔵されていてもよい。
［３−２．情報取得装置の構成］
図１に、情報取得装置５０のハードウェアの構成を示す。情報取得装置５０は、入力部６０と、出力部６１と、記憶媒体６２と接続されていてもよい。
情報取得装置５０において、処理部（ＣＰＵ）５１と、主記憶部５２と、ＲＯＭ（ｒｅａｄ ｏｎｌｙ ｍｅｍｏｒｙ）５３と、補助記憶部５４と、通信インタフェース（Ｉ／Ｆ）５８と、入力インタフェース（Ｉ／Ｆ）５５と、出力インタフェース（Ｉ／Ｆ）５６と、メディアインターフェース（Ｉ／Ｆ）５７は、バス５９によって互いにデータ通信可能に接続されている。
各構成の詳細は、上記３−１．に記載の対応する各構成の説明をここに援用する。
［３−３．測定ユニットの構成］
測定ユニット４０は、少なくともシグナルを検出するためのＣＣＤカメラ等の撮像装置を備えた検出部１０を備え、場合によっては、さらに測定試料を調製するための試料調製部３０を備えていてもよい。また、検出部１０は、フローサイトメータであってもよい。検出部１０は、マイクロウェルに測定試料中のビーズを配置するための加圧装置、減圧装置、又は遠心装置を備えていてもよい（図示せず）。
測定ユニット４０は、測定装置２０又は情報取得装置５０と一体型となっていてもよい。検出部１０に撮像装置を備え、測定装置２０又は情報取得装置５０と一体型となった装置としては、例えば、ＳｉｍｏａＴＭ ＨＤ−１ Ａｎａｌｙｚｅｒを挙げることができる。
［３−４．測定装置、情報取得装置の動作］
図２を用いて、測定装置２０の動作について説明する。測定装置２０は、後述する測定プログラムにしたがって、処理部２１により制御される。
初めに、処理部２１は、検査者が入力部３０から行う、前記測定試料について、前記免疫複合体に由来するシグナルを取得するための入力を受け付ける（図示せず）。次に測定ユニット４０で検出された前記免疫複合体に由来するシグナルを取得する（ステップＳ１）。処理部２１は、これらの取得したシグナルの強度を補助記憶部５４等に記憶する。
次に図２を用いて、情報取得装置５０の動作について説明する。情報取得装置５０は、後述する情報取得プログラムにしたがって、処理部５１により制御される。
初めに、処理部５１は、検査者が入力部６０から行う、前記測定試料について、前記免疫複合体に由来するシグナルを取得するための入力を受け付ける（図示せず）。次に測定ユニット４０で検出された前記免疫複合体に由来するシグナルを取得する（ステップＳ１）。続いて、補助記憶部５４等に記憶されているシグナル強度の基準値と、取得したシグナル強度を比較する（ステップＳ２）。処理部５１は、ステップＳ２における比較において、前記測定試料について取得されたシグナルが基準値より高い場合には（ステップＳ３）、被験者がアルツハイマー病の可能性があると決定する（ステップＳ４）。また処理部５１は、ステップＳ２における比較において、前記測定試料について取得されたシグナルが基準値より低い場合には（ステップＳ３）、被験者がアルツハイマー病の可能性がないと決定する（ステップＳ４）。処理部５１は、これらの決定結果をアルツハイマー病であるか否かの情報として補助記憶部５４等に記憶する。処理部５１は、これらの結果を出力部６１に出力するか、あるいは記憶媒体６２に記憶してもよい。
［４．リン酸化タウタンパク質を測定するためのコンピュータプログラム、アルツハイマー病であるか否かの情報を取得するためのコンピュータプログラム］
本発明の第５の実施態様は、リン酸化タウタンパク質を測定するためのコンピュータプログラム（以下、測定プログラムという）に関する。具体的には、上記３−４で述べた、測定装置２０の動作を制御する測定プログラムである。前記測定プログラムがコンピュータに実行させる各ステップは、図２に記載のステップＳ１である。上記１．及び２．に記載の各用語の説明は、ここに援用される。
本発明の第６の実施態様は、アルツハイマー病であるか否かの情報を取得するためのコンピュータプログラム（以下、情報取得プログラムという）に関する。具体的には、上記３−４で述べた、情報取得装置５０の動作を制御する測定プログラムである。前記情報取得プログラムがコンピュータに実行させる各ステップは、図２に記載のステップＳ１からＳ５である。上記１．及び２．に記載の各用語の説明は、ここに援用される。
さらに、第５及び第６の実施態様に係るコンピュータプログラムは、ハードディスク、フラッシュメモリ等の半導体メモリ素子、光ディスク等の記憶媒体に記憶されていてもよい。前記記憶媒体へのプログラムの記憶形式は、前記情報取得装置が前記プログラムを読み取り可能である限り制限されない。前記記憶媒体への記憶は、不揮発性であることが好ましい。
［５．リン酸化タウタンパク質の検出用試薬及び試薬キット］
本発明の第７の実施態様は、リン酸化タウタンパク質を検出するための試薬に関する。図３に、本実施態様の試薬を収容した容器１５１の概略図を示す。容器１５１は、水や緩衝液（例えばＰＢＳ）などの液体と、捕捉ビーズと、非捕捉ビーズとを含む試薬が収容されている。試薬に含有される捕捉ビーズと非捕捉ビーズの個数比は、上記１−２．で述べたとおりである。
第８の実施態様は、リン酸化タウタンパク質を検出するための試薬キットに関する。図４及び図５に、本実施態様の試薬キット１５０及び試薬キット１６０の概略図を示す。
第８の実施態様の一例である試薬キット１５０は、容器１５１とリン酸化タウタンパク質検出用試薬（発光基質等）を収容した容器１５２を含む。この試薬キット１５０は、検出抗体を含有する試薬を収容する容器１５３をさらに含んでいてもよい。試薬キット１５０は、ビーズに捕捉抗体が固定化されていない場合は、捕捉抗体を含有する試薬（図示せず）をさらに含んでいてもよい。試薬キット１５０には取扱説明書あるいは取り扱い説明書を閲覧できるＵＲＬを記載した用紙１５４が含まれてもよい。さらに、試薬キット１５０には、これらの容器を納めた箱１５５が含まれていてもよい。
第８の実施態様の別の例である試薬キット１６０は、捕捉ビーズと非捕捉ビーズとが別々の容器１６１ａ及び１６１ｂに収容される。捕捉ビーズと非捕捉ビーズの個数比は上で述べたとおりである。この試薬キット１６０は、さらにリン酸化タウタンパク質検出用試薬（発光基質等）を収容した容器１６２、検出抗体を含有する試薬を収容する容器１６３をさらに含んでいてもよい。試薬キット１６０は、ビーズに捕捉抗体が固定化されていない場合は、捕捉抗体を含有する試薬（図示せず）をさらに含んでいてもよい。試薬キット１６０には取扱説明書あるいは取り扱い説明書を閲覧できるＵＲＬを記載した用紙１６４が含まれてもよい。さらに、試薬キット１６０には、これらの容器を納めた箱１６５が含まれていてもよい。
以上、本発明の各実施態様を、添付の図面を参照して詳細に説明したが、本発明における生体試料中のリン酸化タウタンパク質を測定する方法、アルツハイマー病に罹患しているか否かの情報を取得する方法、生体試料中のリン酸化タウタンパク質を測定する装置、アルツハイマー病に罹患しているか否かの情報を取得する装置、生体試料中のリン酸化タウタンパク質を測定するコンピュータプログラム、及びアルツハイマー病に罹患しているか否かの情報を取得するコンピュータプログラムは、上記に説明する具体的な実施態様に限定されるものではない。本発明の実施態様は、本明細書の記載と当業者の技術常識に基づいて変形しうる。
以下に実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、本発明は実施例に限定して解釈されるものではない。
１．ELISA法によるリン酸化タウタンパク質の検出
（１）捕捉ビーズ及びビオチン標識抗体の調製
標的タンパク質を捕捉するための抗体（補足抗体）を結合させた捕捉ビーズ、及び標的タンパク質を検出するためのビオチン標識抗体（検出抗体）は、SimoaTM Homebrew Assay Development kit（Quanterix社）を用いて、キット添付のプロトコールにしたがって調製した。また、前記調製には、キットに添付の1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride （EDC：Thermo Fisher Scientific）、ビオチン（Thermo Fisher Scientific）、遠心濾過フィルター（Merck Millipore）を使用した。
抗体は、タウタンパク質のaa.159-163を認識する抗体(Anti-Human Tau Monoclonal Antibody, Purified, clone:HT7; Thermo SCIENTIFIC)、及びリン酸化タウタンパク質のThr181のリン酸化を認識する抗体（Anti-Human PHF-Tau Monoclonal Antibody, Purified, clone:AT270, Thermo SCIENTIFIC）を使用した。以下前者をHT7抗体、後者をAT270抗体とする。
（２）イムノアッセイ
上記（１）で調製した捕捉ビーズ、及びビオチン標識抗体と、Quanterix社のDye-Encoded Helper Beads（非捕捉ビーズ）、SimoaTM Enzyme and Substrate kit、SimoaTM Disk kit、SimoaTM Sealing Oil、System buffer 1、System buffer 2、SimoaTM HD-1 Analyzerを使用し、メーカーのプロトコールにしたがって、測定を行った。測定は、測定用サンプルと、捕捉ビーズ、ビオチン標識抗体、非捕捉ビーズ等の必要な試薬をSimoaTM HD-1 Analyzerにセットし、SimoaTM HD-1 Analyzerで全ての測定工程を行った。
具体的な工程は以下の通りである。初めに、非捕捉ビーズの存在下で、捕捉ビーズに結合されている捕捉抗体と標的タンパク質とを結合させた。続いてビオチン化された検出抗体を、補足抗体と結合した標的タンパク質にさらに結合させ、捕捉ビーズ上に補足抗体と標的タンパク質とビオチン化検出抗体の免疫複合体を形成させた。前記工程後、非捕捉ビーズの存在下で捕捉ビーズとβガラクトシダーゼを結合させたストレプトアビジンとを反応させた。前記工程後、非捕捉ビーズの存在下で捕捉ビーズをβガラクトシダーゼの基質（RGP: レソルフィンβ-D-ガラクトピラノシド）と反応させた。RGPとの反応が終わった捕捉ビーズと非捕捉ビーズを、SimoaTM Diskにアプライした。その後、アプライされたビーズは、多数のフェムトリットル単位のウェルが配置されたアレイの各ウェルに一つずつ格納された。ウェルに格納された各ビーズをSimoaTM HD-1 Analyzerが撮影し、蛍光強度（AEB）を測定し蛍光強度の強いビーズの数を測定することにより、標的タンパク質を定量した。
２．実施例１
捕捉抗体としてHT7抗体を使用し、検出抗体としてAT270抗体を使用して、捕捉ビーズと非捕捉ビーズの最適比を検討した。実験は上記１．に記載の方法に準じた。検討には、リン酸化タウタンパク質であるHuman Tau [pT181] phosphoELISATMELISA kit (Thermo FisherScientific)に添付のHu Tau [pT181] Standardを0.039 pg/mlとなるようにSimoaTM Homebrew Assay Development kitに添付のSample Diluentで希釈したものを測定用サンプルとして使用した。1回の測定には、0.039 pg/ml Hu Tau [pT181] Standardを152μl使用した。
捕捉ビーズと非捕捉ビーズの合計を100％とし、非捕捉ビーズの割合を10、20、30、40、50、60、70、80、及び90％と変化させて、0.039 pg/mlのpT181を測定した際の、AEBを比較した。結果を図６に示す。結果として、非捕捉ビーズが60％以上の時に強いAEBが得られた。
このことから、リン酸化タウタンパク質を検出するためには、捕捉ビーズと捕捉ビーズの割合を40：60〜10：90の範囲、すなわち1：1.5〜1：9の範囲とすることが好ましいと考えられた。さらに、捕捉ビーズと捕捉ビーズの比を20：80〜10：90の範囲、すなわち1：4〜1：9の範囲とすることが特に好ましいと考えられた。
３．実施例２
次に、補足抗体としてAT270抗体を使用し、検出抗体としてHT7抗体を使用して、その他は実施例１と同様にして、捕捉ビーズと非捕捉ビーズの最適比を検討した。
捕捉ビーズと非捕捉ビーズの合計を100％とし、非捕捉ビーズの割合を10、20、30、40、50、60、70、80、及び90％と変化させて、0.039 pg/mlのpT181を測定した際の、AEBを比較した。結果を図７に示す。結果として、非捕捉ビーズが60％以上の時に強いAEBが得られた。
このことから、リン酸化タウタンパク質を検出するためには、捕捉ビーズと非捕捉ビーズの割合を40：60〜10：90の範囲、すなわち1：1.5〜1：9の範囲とすることが好ましいと考えられた。
４．実施例３
次に、ヒトの血漿（EDTA-2Na採血）をサンプルとして、捕捉ビーズと非捕捉ビーズの最適比を検討した。Hu Tau [pT181]の希釈液に変えて、アルツハイマー病患者２名（AD1、AD2）及び対照患者２名（Cont. 1、Cont. 2）の血漿中のリン酸化タウタンパク質を測定した。血漿はSample Diluentで4倍に希釈して、測定した。また、ブランクとしてBufferを用いた。捕捉ビーズと非捕捉ビーズの合計を100％とし、非捕捉ビーズの割合を0、50、及び80％と変化させて、アルツハイマー病患者を検出できるか否か比較した。
その結果を図７に示す。
非捕捉ビーズの割合を0％又は50％とした場合には、アルツハイマー病患者と対照患者を鑑別することはできず、80％とした場合にのみアルツハイマー病患者を検出することができた。
以上の結果から、生体試料を用いてリン酸化タウタンパク質を測定し、アルツハイマー病患者を検出する場合には、捕捉ビーズと非捕捉ビーズの割合を1：1を超える割合とすることが好ましいと考えられた。
２０ 測定装置
２１ 処理部
５０ 情報取得装置
５１ 処理部

Claims (15)

  1. 被験者から採取された生体試料中のリン酸化タウタンパク質を測定する方法であって、
    非捕捉ビーズの存在下で、捕捉ビーズ上に、生体試料中のリン酸化タウタンパク質と、捕捉抗体と、検出抗体との免疫複合体を形成させて、前記非捕捉ビーズと前記免疫複合体が結合した捕捉ビーズとを含む測定試料を調製する工程、及び
    前記測定試料中の免疫複合体に由来するシグナルを検出する工程、
    を含み、
    前記非捕捉ビーズは前記免疫複合体と結合せず、
    前記検出抗体及び捕捉抗体の少なくとも一方は、リン酸化タウタンパク質を特異的に認識し、
    前記捕捉抗体のエピトープと前記検出抗体のエピトープが異なり、
    前記調製工程において混合される捕捉ビーズと非捕捉ビーズとの個数比が、捕捉ビーズ１に対して非捕捉ビーズ１．５以上である、方法。
  2. 前記検出工程において、
    複数のマイクロウェルを有する基板に前記測定試料を接触させ、
    前記測定試料中の捕捉ビーズ及び非捕捉ビーズを、前記マイクロウェルに１ビーズずつ配置し、
    前記マイクロウェルに配置された捕捉ビーズ上の免疫複合体に由来するシグナルを検出し、
    ここで、前記マイクロウェルは、前記捕捉ビーズ又は非捕捉ビーズ１個のみを収容可能な容積を有する、請求項１に記載の方法。
  3. 前記検出工程において、シグナルの検出が前記免疫複合体に由来するシグナルを撮像することによって行われる、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 捕捉ビーズと非捕捉ビーズとの個数比が、捕捉ビーズ１に対して非捕捉ビーズ１．５から９である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 捕捉ビーズと非捕捉ビーズとの個数比が、捕捉ビーズ１に対して非捕捉ビーズ４から９である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記生体試料が、血液試料である、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記血液試料が、血清又は血漿である、請求項６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記免疫複合体が、捕捉抗体と、生体試料中のリン酸化タウタンパク質と、検出抗体との複合体であり、前記捕捉抗体が捕捉ビーズに結合する、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記免疫複合体が、非捕捉ビーズの存在下で、捕捉ビーズに結合した捕捉抗体と、リン酸化タウタンパク質を含む生体試料と、検出抗体とを混合することによって形成される、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 請求項１から９のいずれか一項に記載の方法によって取得されたシグナルの強度に基づいて、前記被験者がアルツハイマー病に罹患しているか否かの情報を取得する方法。
  11. 請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法に用いられる試薬又は試薬キットであって、
    前記捕捉ビーズ及び前記非捕捉ビーズを含み、前記捕捉ビーズと前記非捕捉ビーズの個数比が、捕捉ビーズ１に対して非捕捉ビーズ１．５以上である、前記試薬又は試薬キット。
  12. 被験者から採取された生体試料中のリン酸化タウタンパク質を測定する装置であって、
    前記装置は、処理部を備え、
    前記処理部は、
    非捕捉ビーズの存在下で、捕捉ビーズ上に、生体試料中のリン酸化タウタンパク質と、検出抗体と、捕捉抗体との免疫複合体を形成させて調製された、前記非捕捉ビーズと前記免疫複合体が結合した捕捉ビーズとを含む測定試料について、前記免疫複合体に由来するシグナルを取得し、
    前記非捕捉ビーズは前記免疫複合体と結合せず、
    前記検出抗体及び捕捉抗体の少なくとも一方は、リン酸化タウタンパク質を特異的に認識し、
    前記捕捉抗体のエピトープと前記検出抗体のエピトープが異なり、
    前記測定試料の調製において混合される捕捉ビーズと非捕捉ビーズとの個数比が、捕捉ビーズ１に対して非捕捉ビーズ１．５以上である、装置。
  13. 被験者から採取された生体試料中のリン酸化タウタンパク質に由来するシグナルの強度に基づいて、前記被験者がアルツハイマー病であるか否かの情報を取得する装置であって、
    前記装置は、処理部を備え、
    前記処理部は、
    非捕捉ビーズの存在下で、捕捉ビーズ上に、生体試料中のリン酸化タウタンパク質と、検出抗体と、捕捉抗体との免疫複合体を形成させて調製された、前記非捕捉ビーズと前記免疫複合体が結合した捕捉ビーズとを含む測定試料について、前記免疫複合体に由来するシグナルを取得し、
    前記非捕捉ビーズは前記免疫複合体と結合せず、
    前記検出抗体及び捕捉抗体の少なくとも一方は、リン酸化タウタンパク質を特異的に認識し、
    前記捕捉抗体のエピトープと前記検出抗体のエピトープが異なり、
    前記測定試料の調製において混合される捕捉ビーズと非捕捉ビーズとの個数比が、捕捉ビーズ１に対して非捕捉ビーズ１．５以上であり、
    前記シグナルの強度に基づいて、前記被験者がアルツハイマー病であるか否かの情報を取得する、
    装置。
  14. コンピュータに、
    非捕捉ビーズの存在下で、捕捉ビーズ上に、生体試料中のリン酸化タウタンパク質と、検出抗体と、捕捉抗体との免疫複合体を形成させて調製された、前記非捕捉ビーズと前記免疫複合体が結合した捕捉ビーズとを含む測定試料について、前記免疫複合体に由来するシグナルを取得するステップであって、
    前記生体試料は、被験者から採取されたものであり、
    前記非捕捉ビーズは前記免疫複合体と結合せず、
    前記検出抗体及び捕捉抗体の少なくとも一方は、リン酸化タウタンパク質を特異的に認識し、
    前記捕捉抗体のエピトープと前記検出抗体のエピトープが異なり、
    前記測定試料の調製において混合される捕捉ビーズと非捕捉ビーズとの個数比が、捕捉ビーズ１に対して非捕捉ビーズ１．５以上である、ステップ
    を実行させる、リン酸化タウタンパク質を測定するためのコンピュータプログラム。
  15. コンピュータに、
    非捕捉ビーズの存在下で、捕捉ビーズ上に、生体試料中のリン酸化タウタンパク質と、検出抗体と、捕捉抗体との免疫複合体を形成させて調製された、前記非捕捉ビーズと前記免疫複合体が結合した捕捉ビーズとを含む測定試料について、前記免疫複合体に由来するシグナルを取得するステップであって、
    前記非捕捉ビーズは前記免疫複合体と結合せず、
    前記検出抗体及び捕捉抗体の少なくとも一方は、リン酸化タウタンパク質を特異的に認識し、
    前記捕捉抗体のエピトープと前記検出抗体のエピトープが異なり、
    前記測定試料の調製において混合される捕捉ビーズと非捕捉ビーズとの個数比が、捕捉ビーズ１に対して非捕捉ビーズ１．５以上である、ステップと、
    前記シグナルの強度に基づいて、前記生体試料を採取した被験者がアルツハイマー病であるか否かの情報を取得するステップと、
    を実行させる、アルツハイマー病であるか否かの情報を取得するためのコンピュータプログラム。
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