JPH09506771A - Phf−タウに特異的なモノクローナル抗体、これらを分泌するハイブリドーマ、これらの抗体による抗原認識及びこれらの応用 - Google Patents
Phf−タウに特異的なモノクローナル抗体、これらを分泌するハイブリドーマ、これらの抗体による抗原認識及びこれらの応用Info
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- 【特許請求の範囲】 1.下記アミノ酸配列: を有する143〜254位にわたる領域に存在する、異常にリン酸化されたタウ 蛋白(PHF−タウ)に属する抗原のリン酸化エピトープと免疫複合体を形成す るモノクローナル抗体であって、脳脊髄液(CSF)中の異常にリン酸化された タウ蛋白(PHF−タウ)を特異的に検出することができることを特徴とするモ ノクローナル抗体。 2.− 請求項1記載の配列(配列番号1)内に位置するリン酸化エピトープ; 又は − それ自体請求項1記載のヒトタウ蛋白領域(配列番号1)内に位置するリ ン酸化エピトープと複合体を形成することができるモノクローナル抗体との免疫 複合体を形成することができる任意の他のリン酸化ペプチドとの免疫複合体を形 成することを特徴とする、請求項1記載のモノクローナル抗体。 3.1992年12月22日に第92122204号としてECACCに寄託さ れたハイブリドーマにより分泌される、請求項1又は2のモノクローナル抗体A T180。 4.1993年7月7日に第93070774号としてECACCに寄託された ハイブリドーマにより分泌される、請求項1又は2のモノクローナル抗体AT2 70。 5.請求項1〜4のいずれか1項記載のモノクローナル抗体を分泌するハイブリ ドーマ、更に詳しくは、1992年12月22日に第92122204号として ECACCに寄託されたハイブリドーマ、又は1993年7月7日に第9307 0774号としてECACCに寄託されたモノクローナル抗体。 6.請求項1〜4のいずれか1項記載の任意のモノクローナル抗体と特異的に免 疫複合体を形成することができ、リン酸化型であり、6〜100個のアミノ酸を 含むペプチドであって、 − ペプチドの配列が、配列番号1に示される配列のリン酸化部分を含むか、又 はこの部分よりなるか、あるいは、 − ペプチドの配列が、請求項1〜4のいずれか1項記載のモノクローナル抗体 と免疫複合体を形成することができるペプチドの配列を含むか、又はこの配列よ りなるペプチド。 7.下記配列: (配列中、Thrは、リン酸化されている)よりなるか、又は、そのアミノ酸配 列中にこの配列を含む、請求項3記載のモノクローナル抗体と特異的に免疫複合 体を形成することを特徴とする、請求項6記載のペプチド。 8.下記配列: (配列中、Thrは、リン酸化されている)よりなるか、又は、そのアミノ酸配 列中にこの配列を含む、請求項4記載のモノクローナル抗体と特異的に免疫複合 体を形成することを特徴とする、請求項6記載のペプチド。 9.免疫化により請求項1〜4のいずれか1項記載のモノクローナル抗体を生成 することができる、請求項6〜8のいずれか1項記載のリン酸化ペプチド。 10.請求項1〜4のいずれか1項記載のモノクローナル抗体を分泌する、請求 項5記載のハイブリドーマを取得し単離する方法であって、以下の工程: − 抗原、好適には請求項1〜4のいずれか1項記載のモノクローナル抗体によ り認識される、異常にリン酸化されたタウ(PHF−タウ)又は請求項6〜9の いずれか1項記載のリン酸化ペプチドである抗原で、前もってインビボ免疫した 動物(例えば、マウス又はラット)の脾臓細胞から、又は、同抗原で前もってイ ンビトロ免疫したこのような動物の脾臓細胞から出発して; − この免疫された細胞を、ハイブリドーマ形成条件下でミエローマ細胞と融合 させて;そして − 脳脊髄液(CSF)中の異常にリン酸化されたタウ(PHF−タウ)のリン 酸化エピトープを特異的に認識するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドー マを選択すること を含むことを特徴とする方法。 11.− 請求項1〜4のいずれか1項記載のモノクローナル抗体により認識さ れる、異常にリン酸化されたタウ(PHF−タウ)、又は請求項6〜9のいずれ か1項記載のリン酸化タウペプチドで、前もってインビト ロ免疫したマウスの脾臓細胞から出発して; − この免疫された細胞を、ハイブリドーマ形成条件下でミエローマ細胞と融合 させて;そして − PHF−タウを特異的に認識し、CSF中のPHF−タウを特異的に検出す ることができるモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを選択することを 含むことを特徴とする、請求項10記載の方法により得られる、請求項1〜4の いずれか1項記載のモノクローナル抗体。 12.− 請求項5記載の選択されたハイブリドーマ又は請求項9の方法により 得られるハイブリドーマを、適切な培地中で培養し;そして − この選択されたハイブリドーマにより排出されるモノクローナル抗体を回収 するか;又は代わりに − 請求項5記載の選択されたハイブリドーマ又は請求項9の方法により得られ るハイブリドーマを、マウスの腹腔中に注入し、そしてマウスに腹水が産生され た時、この腹水から生成したモノクローナル抗体を回収することを含む、請求項 1〜4のいずれか1項記載のモノクローナル抗体を産生する方法。 13.アルツハイマー病のようなPHF−タウ蛋白が関与する脳/神経疾患の死 後の検出又は診断の方法であって、少なくとも下記工程: − 請求項1〜4のいずれか1項記載のモノクローナル抗体を、抗原抗体複合 体が生成するのに適した条件下で、アルツハイマー病、又は異常にリン酸化され たタウ(PHF−タウ)が関与する任意の他の疾患であった患者から単離したN FTの調製物又は界面活性剤で抽出した脳ホモジネートと接触させて; − この脳ホモジネートへのこの抗体の免疫学的結合を検出し、そして場合に よってはこの複合体から抗原を分離して、精製された形で目的の抗 原を回収する工程 を含む方法。 14.アルツハイマー病のような異常にリン酸化されたタウ蛋白が関与する脳疾 患のインビトロの検出又は診断の方法であって、 − PHF−タウが関与する神経疾患、より詳しくはアルツハイマー病の疑い がある患者からのCSFの試料、好適には未濃縮CSF、血清の試料、又はこれ らから抽出した蛋白若しくはポリペプチドを、抗原抗体複合体を生成するのに適 したインビトロ条件下で、請求項1〜4のいずれか1項記載のモノクローナル抗 体と接触させて;そして − 脳脊髄液又は血清、又はこれらの抽出物の試料へのこの抗体の免疫学的結 合を検出すること を含む方法。 15.アルツハイマー病、ダウン症候群、ピック病及び異常にリン酸化されたタ ウ蛋白又はらせんフィラメント対(paired helical filaments)が関係する他の 神経疾患のいずれかの疾患のインビトロ診断用キットであって、 − マイクロプレートに入れた請求項1〜4のいずれか1項記載の少なくとも 1つのモノクローナル抗体; − インビトロ診断すべき試料(CSF、血清又はこれらから抽出した蛋白) を含む調製物; − 二次抗体 〔* 異常にリン酸化されたタウ蛋白のエピトープ、又はPHF−タウのエ ピトープを有する任意のリン酸化タウペプチドのエピトープ(これらのエピトー プは本発明のエピトープとは異なる)を認識するモノクローナル抗体であり得る か、あるいは * 異常にリン酸化されたタウを認識するポリクローナル抗体、又はPH F−タウのエピトープを有するペプチドを認識するポリクローナル抗体(このポ リクローナル抗体は、本発明のエピトープとは異なるエピトープと免疫複合体を 形成することができ、好適には固定化タウ蛋白を使用する免疫親和性クロマトグ ラフィーにより精製されている)であり得る〕; − 特異的標識付けのため又は二次抗体とカップリングするためのマーカー; − 一方では本発明のモノクローナル抗体と試料との間、他方では結合した二 次抗体とマーカーとの間の免疫反応を行うための適切な緩衝液; − 場合によっては、標準物質の目的のため又は目的の抗原に関する競合物質 の目的のための、請求項1記載の領域(配列番号1)に含まれるPHF−タウの エピトープを有するペプチド を含むことを特徴とするキット。 16.アルツハイマー病のような異常にリン酸化されたタウ蛋白が関与する脳/ 神経疾患のインビトロの検出又は診断のための、請求項13〜15のいずれか1 項記載の方法又はキットであって、少なくとも1つの下記モノクローナル抗体の 組合せ: − 請求項1〜4のいずれか1項記載の少なくとも2つのモノクローナル抗体を 含む混合物; − 請求項1〜4のいずれか1項記載の少なくとも1つのモノクローナル抗体と 共に、タウ又はPHF−タウを認識する少なくとも1つの他のモノクローナル抗 体を含む混合物 を含む、方法又はキット。 17.更に、請求項1〜4のいずれか1項記載の少なくとも1つの抗体よ りなるコーティング抗体と、エピトープが、請求項1〜4のいずれか1項記載の 任意のモノクローナル抗体のエピトープとは異なる、正常及び/又は異常にリン 酸化されたヒトタウの両方を検出することができる少なくとも1つのモノクロー ナル抗体よりなる検出用抗体とを含むサンドイッチ検出フォーマットであること を特徴とする、請求項16記載の方法又はキット。
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