BR112014015323B1 - Anticorpos anti-phf-tau, seu método de produção, polinucleotídeo isolado que codifica uma vh de anticorpo, e vetor - Google Patents

Abstract

ANTICORPOS ANTI-PHF-TAU E SEUS USOS. A presente invenção refere-se a anticorpos isolados que se ligam a PHF-tau compreendendo um sítio de ligação de antígeno de uma região variável de cadeia pesada (VH) de SEQ ID NO:35 ou 37 e um sítio de ligação de antígeno de uma região variável de cadeia leve (VL) de SEQ ID NO:36 ou 38, bem como refere-se a métodos de produção e uso dos mesmos.

Description

[001] Esse pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório sob número U.S. 61/577.817, depositado em 20 de dezembro de 2011, cujo conteúdo inteiro é incorporado no presente documento a título de referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] A presente invenção refere-se a anticorpos anti-PHF-tau e métodos de produção e uso dos mesmos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] A doença de Alzheimer (DA) é uma desordem degenerativa cerebral caracterizada clinicamente por perda progressiva de memória, cognição, raciocínio, julgamento e estabilidade emocional que gradualmente leva a uma profunda deterioração mental e, finalmente, ao óbito. A DA é uma causa comum de falha mental progressiva (demência) em seres humanos idosos e acredita-se que a mesma representa a quarta causa médica mais comum de morte nos Estados Unidos da América. A DA foi observada em grupos étnicos por todo o mundo e impõe um grande problema de saúde pública no presente e porvir.

[004] O cérebro dos indivíduos acometidos pela DA exibem le sões características denominadas placas senis (ou amiloide), angiopa- tia amiloide (depósitos de amiloide em vasos sanguíneos) e emaranhados neurofibrilares. As grandes quantidades dessas lesões, particularmente placas amiloides e emaranhados neurofibrilares de filamentos helicoidais emparelhados, são encontrados, em geral, em diversas áreas do cérebro humano importantes para a memória e função cognitiva em pacientes com DA.

[005] O componente de proteína principal da degeneração neurofi- brilar in DA e diversas outras doenças neurodegenerativas é uma forma hiperfosforilada da proteína tau associada a microtúbulo. O desenvolvimento de terapêuticos que evitam ou limpam a agregação de tau foi de interesse por muitos anos, mas os fármacos candidatos, que incluem compostos anti-agregação e inibidores de quinase, acabaram de entrar no teste clínico (Brunden, et al. Nat Rev Drug Discov 8:783-93, 2009)

[006] Recentemente, evidência pré-clínica foi produzida em mode los de camundongo de tau transgênico de que imunização passiva e ativa para tau podem ter potencial terapêutico (Chai, et al. J Biol Chem 286:34457-67, 2011, Boutajangout, et al. J Neurochem 118:658-67, 2011, Boutajangout, et al. J Neurosci 30:16559-66, 2010, Asuni, et al. J Neurosci 27:9115-29, 2007). Uma transmissão de tauopatia e hipótese de espalhamento foi descrita recentemente e é baseada nos estágios de Braak da progressão de tauopatia no cérebro humano e espalhamento de tauopatia após as injeções de agregado de tau em modelos de tau préclínicos (Frost, et al. J Biol Chem 284:12845-52, 2009, Clava- guera, et al. Nat Cell Biol 11:909-13, 2009). Portanto, existe uma necessidade por terapêuticos para evitar a agregação de tau e progressão de tauopatia para tratar DA e outras doenças neurodegenerativas.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[007] A Figura 1 mostra a competição de AT8 etiquetado por vá rios anticorpos anti-tau.

[008] A Figura 2 mostra a competição de PT1 etiquetado por vá rios anticorpos anti-tau.

[009] A Figura 3 mostra a competição de PT3 etiquetado por vá rios anticorpos anti-tau.

[0010] A Figura 4 mostra a competição de AT100 etiquetado por vários anticorpos anti-tau.

[0011] A Figura 5 mostra a competição de HT7 etiquetado por vá rios anticorpos anti-tau.

[0012] A Figura 6 mostra a (A) análise de tau fosforilado em ho- mogenatos de troncoencefálico (fração P1) de animais transgênicos P301L fêmeas de 5 meses de idade tratados com solução salina, IgG1, PT3 ou AT8 de camundongo conforme indicado na Figura, ou de animais não transgênicos não tratados (B6). ELISA foi feita com o uso de AT8 (painel esquerdo) ou AT100 (painel direito) como anticorpos de captura seguidos por HT7 biotinilado e HRP de avidina. Os sinais de ELISA são plotados como uma quantidade relativa de homogenato de cérebro de DA (ng/ml) fornecendo o mesmo sinal de ELISA como uma amostra média de um animal não transgênico (B6). Os dados são plo- tados individualmente juntos com média +/-S.D. valores p para diferenças entre animais tratados por PT3 e IgG1 são indicados. (B) Western blot de fração P1 de homogenatos de troncoencefálico de animais tratados por IgG1 ou PT3 com o uso de AT100. O sinal de homogena- tos de 10 animais tratados com IgG1 (IgG1-1 a IgG1-10) e 7 animais tratado com PT3 (PT3-1, PT3-2, PT3-7 a PT3-10 são mostrados. Acti- na foi usada como um controle de carregamento.

[0013] A Figura 7 mostra níveis de tau totais em sarcosil solúvel (pT4 solúvel), tau total em insolúvel (pT4 insolúvel) e tau fosforilado em insolúvel (AT8 insolúvel) homogenatos de córtex derivados de camundongos transgênicos P301L fêmeas de 5 meses de idade tratados com PT3 ou controle de isotipo (IgG) conforme indicado na Figura. Os níveis são mostrados como uma medida de um sinal de ELISA plotada individualmente junto com a média +/- SD. A amostra 1 m inj é uma amostra de controle positiva derivada de um cérebro de camundongo P301L injetado com um agregado de tau.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0014] Um aspecto da invenção é um anticorpo isolado que liga PHF-tau que compreende um sítio de ligação de antígeno de uma região variável de cadeia pesada (VH) de SEQ ID NO:35 ou 37 e um sí- tio de ligação de antígeno de uma região variável de cadeia leve (VL) de SEQ ID NO:36 ou 38.

[0015] Outro aspecto da invenção é um anticorpo isolado que liga PHF-tau que compreende determinadas regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve e cadeia pesada.

[0016] Outro aspecto da invenção é um anticorpo isolado que liga PHF-tau que compreende um sítio de ligação de antígeno de uma VH de SEQ ID NO:35 e um sítio de ligação de antígeno de uma VL de SEQ ID NO: 36.

[0017] Outro aspecto da invenção é um anticorpo isolado que liga PHF-tau que compreende um sítio de ligação de antígeno de uma VH de SEQ ID NO:37 e um sítio de ligação de antígeno de uma VL de SEQ ID NO: 38.

[0018] Outro aspecto da invenção é um anticorpo isolado ou frag mento que compete pela ligação de PHF-tau com um anticorpo monoclonal que compreende um sítio de ligação de antígeno de uma VH de SEQ ID NO: 35 e um sítio de ligação de antígeno de uma VL de SEQ ID NO: 36, ou um sítio de ligação de antígeno de uma VH de SEQ ID NO: 37 e um sítio de ligação de antígeno de uma VL de SEQ ID NO: 38.

[0019] Outro aspecto da invenção são os polinucleotídeos que co dificam os anticorpos da invenção ou fragmentos dos mesmos.

[0020] Outro aspecto da invenção é um vetor que compreende os polinucleotídeos da invenção.

[0021] Outro aspecto da invenção é uma célula hospedeira que compreende o vetor da invenção.

[0022] Outro aspecto da invenção é um método de produção um anticorpo que liga PHF-tau que compreende cultivar a célula hospedeira da invenção e recuperar o anticorpo produzido pela célula hospedeira. DESCRIÇÃO DETALHADA

[0023] O termo "anticorpos", como usado aqui, tem um significado no sentido amplo e inclui moléculas de imunoglobulina ou moléculas de anticorpo incluindo anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais incluindo anticorpos monoclonais murinos, humanos, adaptados a humanos, humanizados e quiméricos e fragmentos de anticorpos.

[0024] Em geral, os anticorpos são proteínas ou cadeias de peptí- deos que exibem especificidade de ligação a um antígeno específico. As estruturas de anticorpo são bem conhecidas. As imunoglobulinas podem ser atribuídas a cinco classes principais, a saber, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, dependendo da sequência de aminoácidos de domínio constante de cadeia pesada. IgA e IgG são adicionalmente sub- classificados como os isotipos IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Cadeias leves de anticorpo de qualquer espécie vertebrada podem ser atribuídas a um de dois tipos claramente distintos, a saber, kappa (K) e lambda (À), com base nas sequências de aminoácidos de seus domínios constantes.

[0025] O termo "fragmentos de anticorpo" significa com uma por ção de um anticorpo intacto. Os exemplos de fragmentos de anticorpo incluem fragmentos de Fab, Fab’, F(ab’)2 e Fv, CDR, sítio de ligação de antígeno, região variável de cadeia leve ou pesada, diacorpos, moléculas de anticorpo de cadeia única e anticorpos multiespecíficos formados a partir de pelo menos dois anticorpos intactos ou fragmentos dos mesmos.

[0026] Uma região variável de cadeia pesada ou leve de imuno- globulina consiste em uma região "estrutura" interrompida pelos três "sítios de ligação ao antígeno". Os sítios de ligação ao antígeno são definidos com o uso de vários termos da seguinte forma: (i) Regiões Determinantes de Complementaridade (CDRs) se baseiam na variabilidade de sequência (Wu e Kabat J Exp Med 132:211-50, 1970). Em geral, o sítio de ligação de antígeno tem três CDRs em cada região variável (HCDR1, HCDR2 e HCDR3 na região variável de cadeia pe- sada (VH) e LCDR1, LCDR2 e LCDR3 na região variável de cadeia leve (VL)) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Edição. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991). (ii) O termo "região hipervariável", "HVR", ou "HV" se refere às regiões de um domínio variável de anticorpo que são hipervariáveis em estrutura conforme definido por Chothia e Lesk (Chothia e Lesk J Mol Biol 196:901-17, 1987). Em geral, o sítio de ligação de antígeno tem três regiões hipervariáveis em cada VH (H1, H2, H3) e VL (L1, L2, L3). Chothia e Lesk se referem a HVs estruturalmente conservadas como "estruturas canônicas". Os sistemas de numeração bem como anotação de CDRs e HVs foram revisados recentemen-te por Abhinandan and Martin (Abhinandan e Martin Mol Immunol 45:3832-9, 2008). (iii) Outra definição das regiões que formam o sítio de ligação de antígeno foi proposta por Lefranc (Lefranc, et al. Dev Comp Immunol 27:55 a 77, 2003) com base na comparação de domínios V de imunoglobulinas e receptores de célula T. A base de dados International ImMunoGeneTics (IMGT) (http://www_imgt_org) fornece uma numeração e uma definição padronizadas dessas regiões. A correspondência entre CDRs, HVs e delineações IMGT é descrita em Le- franc et al., Dev. (iv) O sítio de ligação de antígeno também pode ser delineado com base no Uso de Resíduo Determinante da Especificidade (SDRU) (Almagro J Mol Recognit 17:132-43, 2004), onde Resíduos determinantes de especificidade (SDR), refere-se aos resíduos de aminoácidos de uma imunoglobulina que estão diretamente envol-vidos em contato de antígeno.

[0027] "Armação" ou "sequência de armações" são as sequências remanescentes dentro da região variável de um anticorpo além daquelas definidas para serem as sequências de sítio de ligação de antíge- no. Porque a definição exata de um sítio de ligação de antígeno pode ser determinada por vários delineações conforme descrito acima, a sequência de armações exatas depende da definição do sítio de ligação de antígeno.

[0028] O termo "anticorpo monoclonal" (mAb), conforme usado aqui, significa um anticorpo (ou fragmento de anticorpo) obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo tipicamente direcionados contra um único determinante antigênico.

[0029] O termo "epítopo", conforme é usado aqui significa uma porção de um antígeno à qual um anticorpo se liga especificamente. Os epítopos normalmente consistem em agrupamentos de superfície quimicamente ativa (como polar, não polar ou hidrofóbica) de porções como aminoácidos, aminoácidos fosforilados ou cadeias laterais de polissacarídeos e podem ter características estruturais tridimensionais específicas, assim como características de carga específicas. Um epí- topo pode ser linear em natureza ou pode ser um epítopo descontínuo, por exemplo, um epítopo conformacional, que é formado por uma relação espacial entre aminoácidos não contíguos de um antígeno em vez de uma série linear de aminoácidos. Um epítopo conformacional inclui epítopos resultantes do dobramento de um antígeno, onde os aminoá- cidos de porções que diferem da sequência linear do antígeno estão em grande proximidade em espaço 3-dimensional.

[0030] Tau é uma proteína de sistema nervoso periférico e central abundante que tem múltiplos isoformas bem conhecidas. No CNS humano, seis isoformas de tau principaisque variam de tamanho de 352 a 441 existem devido à emenda alternativa (Hanger, et al. Trends Mol Med 15:112-9, 2009). Essas isoformas são diferentes umas das outras pela inclusão regulada de insertos N-terminal 0-2 e 3 ou 4 repetições de ligação de microtúbulo dispostas em tandem e são referidas como 0N3R (SEQ ID NO:1), 1N3R (SEQ ID NO:2), 2N3R (SEQ ID NO:3), 0N4R (SEQ ID NO:4), 1N4R (SEQ ID NO:5) e 2N4R (SEQ ID NO:6). O termo "tau de controle" conforme usado no presente documento se refere à isoforma de tau de SEQ ID NO:6 que é desprovido de fosfori- lação e outras modificações pós-traducionais.

[0031] Tau liga microtúbulos e regula o transporte de carga atra vés das células, um processo que pode ser modulado por fosforilação de tau. Na DA e distúrbios relacionados a fosforilação anormal de tau é prevalente e pensa-se preceder e/ou acionar a agregação de tau em fibrilas, denominados filamentos helicoidais emparelhados (PHF). O constituinte principal de PHF é tau hiperfosforilado. O termo "tau de filamento helicoidal emparelhado" ou "PHF-tau" conforme usado no presente documento se refere a agregados de tau bem conhecidos em filamentos helicoidais emparelhados. Duas regiões principais na estrutura de PHF são evidentes em microscopia eletrônica, a capa flocosa (fuzzy coat) e o filamento de núcleo; Em que a capa flocosa é sensível a proteólise e está localizada fora dos filamentos e do núcleo resistente a protease dos filamentos que formam a estrutura principal de PHFs (Wischik, et al. Proc Natl Acad Sci EUA 85:4884-8, 1988).

[0032] "Anticorpos que ligam PHF-tau" conforme usado no presen te documento se referem aos anticorpos que ligam PHF-tau conforme avaliado no western blot. Tipicamente, a ligação de anticorpo ao PHF- tau pode ser avaliada após a mancha de Coomassie de cerca de 500 ng de PHF-tau após bloqueio de 1 hora em 5% (peso por volume) de leite seco desnatado (NFDM) TBS-T, 0,05% de Tween-20. Os anticorpos que ligam PHF-tau opcionalmente não ligam tau de controle (SEQ ID NO:6) conforme medido por western blot quando testado sob a condição de carregamento de antígeno em que tanto tau de controle quanto PHF-tau são detectados igualmente por anticorpos de tau que não têm preferência por epítopos de PHF-tau (por exemplo anticorpo HT7, (ThermoScientific, Rockford, IL) (Mercken, et al. J Neurochem 58:548-53, 1992). Essas condições de carregamento de antígeno exemplificadoras são 500 ng de PHF-tau e 200 ng de tau de controle.

[0033] Códigos de aminoácidos de uma letra e de três letras con vencionais bem conhecidos são usados no presente documento.

COMPOSIÇÕES DE SUBSTÂNCIAS

[0034] A presente invenção se refere a anticorpos anti-PHF-tau e usos desses anticorpos. Esses anticorpos anti-PHF-tau podem ter as propriedades de ligação de um epítopo fosforilado em PHF-tau ou ligação a um epítopo não fosforilado em PHF-tau. Os anticorpos anti- PHF-tau podem úteis como terapêuticos e como reagentes de pesquisa ou diagnóstico para detectar PHF-tau em amostras biológicas, por exemplo, em tecidos ou células.

[0035] Uma modalidade da invenção é um anticorpo isolado que liga PHF-tau que compreende um sítio de ligação de antígeno de uma região variável de cadeia pesada (VH) de SEQ ID NO:35 ou 37 ou um sítio de ligação de antígeno de uma região variável de cadeia leve (VL) de SEQ ID NO:36 ou 38. A Tabela 1 mostra os resíduos de sítio de ligação de antígeno dos anticorpos exemplificadores da invenção definidos de acordo com Kabat ou Chothia bem como regiões variáveis de cadeia leve ou pesada exemplificadoras.

[0036] Em outra modalidade, o sítio de ligação de antígeno da VH dos anticorpos da invenção compreende regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (CDRs) 1 (HCDR1), 2 (HCDR2) e 3 (HCDR3) de SEQ ID NOs:7, 8 e 9 ou 13, 14 e 15, respectivamente, ou do sítio de ligação de antígeno da VL dos anticorpos da invenção compreende CDRs de cadeia leve 1 (LCDR1), 2 (LCDR2) e 3 (LCDR3) de SEQ ID NOs:10, 11 e 12 ou 16, 17 e 18, respectivamente.

[0037] Outra modalidade da invenção é um anticorpo isolado que liga PHF-tau que compreende um sítio de ligação de antígeno de uma região variável de cadeia pesada (VH) de SEQ ID NO:35 ou 37 e um sítio de ligação de antígeno de uma região variável de cadeia leve (VL) de SEQ ID NO:36 ou 38.

[0038] Em outra modalidade, o sítio de ligação de antígeno da VH dos anticorpos da invenção compreende regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (CDRs) 1 (HCDR1), 2 (HCDR2) e 3 (HCDR3) de SEQ ID NOs:7, 8 e 9 ou 13, 14 e 15, respectivamente, e do sítio de ligação de antígeno da VL dos anticorpos da invenção compreende CDRs de cadeia leve 1 (LCDR1), 2 (LCDR2) e 3 (LCDR3) de SEQ ID NOs:10, 11 e 12 ou 16, 17 e 18, respectivamente.

[0039] Embora as modalidades ilustradas nos exemplos compre- endam pares de regiões variáveis, um de uma cadeia pesada e um de uma cadeia leve, um indivíduo versado na técnica reconhecerá que modalidades alternativas podem compreender regiões variáveis únicas de cadeia pesada ou leve. A região variável única pode ser usada para triagem de domínios de variável capazes de formar um fragmento de ligação ao antígeno específico de dois domínios capaz de, por exemplo, ligar ao PHF-tau. A triagem pode ser realizada por métodos de triagem por apresentação em fago (phage display) com o uso, por exemplo, de abordagem de combinação dupla hierárquica revelada na Publicação sob n° PCT WO92/01047. Nessa abordagem, uma colônia individual que contém um clone de cadeia H ou de cadeia L é usada para infectar uma biblioteca de clones completa que codifica a outra cadeia (L ou H), e o domínio de ligação ao antígeno específico de duas cadeias resultante é selecionado de acordo com as técnicas de apresentação em fago, conforme descrito.

[0040] Outra modalidade da invenção é um anticorpo isolado que liga PHF-tau que compreende um sítio de ligação de antígeno de uma região variável de cadeia pesada (VH) de SEQ ID NO:35 ou e um sítio de ligação de antígeno de uma região variável de cadeia leve (VL) de SEQ ID NO: 36.

[0041] Outra modalidade da invenção é um anticorpo isolado que liga PHF-tau que compreende um sítio de ligação de antígeno de uma região variável de cadeia pesada (VH) de SEQ ID NO:37 ou e um sítio de ligação de antígeno de uma região variável de cadeia leve (VL) de SEQ ID NO: 38.

[0042] Outra modalidade da invenção é um anticorpo isolado que liga PHF-tau que compreende regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (CDRs) 1 (HCDR1), 2 (HCDR2) e 3 (HCDR3) de SEQ ID NOs:7, 8 e 9, respectivamente e CDRs de cadeia leve 1 (LCDR1), 2 (LCDR2) e 3 (LCDR3) de SEQ ID NOs:10, 11 e 12, respectivamente.

[0043] Outra modalidade da invenção é um anticorpo isolado que liga PHF-tau que compreende regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (CDRs) 1 (HCDR1), 2 (HCDR2) e 3 (HCDR3) de SEQ ID NOs:13, 14 e 15, respectivamente e CDRs de cadeia leve 1 (LCDR1), 2 (LCDR2) e 3 (LCDR3) de SEQ ID NOs:16, 17 e 18, respectivamente.

[0044] Em qualquer uma das modalidades precedentes, o anticor po isolado que liga PHF-tau pode ser humanizado.

[0045] Os anticorpos da presente invenção podem ser produzidos por uma variedade de técnicas, por exemplo pelo método de hibridoma (Kohler e Milstein Nature 256:495-7, 1975). Os mAbs quiméricos que contêm uma região variável de cadeia leve e de cadeia pesada derivada de um anticorpo doador (tipicamente murino) em associação com as regiões constantes de cadeias leve e pesada derivadas de um anticorpo aceitante (tipicamente outra espécie de mamífero, como o humano) podem ser preparados pelo método apresentado na patente US n° 4.816.567. Os mAbs enxertados com CDR que têm CDRs derivados de um imunoglobulina de um doador não humano (tipicamente murina) e as partes derivadas de imunoglobulina remanescentes da molécula que é derivada

[0046] de uma ou mais imunoglobulinas de humano podem ser preparadas por técnicas conhecidas pelos versados na técnica como aqueles revelados na Patente sob n° U.S. 5.225.539. Os mAbs completamente humanos que carecem de quaisquer sequências não humana podem ser preparados a partir de camundongos transgênicos com imunoglobulina humana por técnicas referidas em (Lonberg, et al. Nature 368:856-9, 1994, Fishwild, et al. Nat Biotechnol 14:845-51, 1996, Mendez, et al. Nat Genet 15:146-56, 1997). Os mAbs humanos também podem ser preparados e otimizados a partir de bibliotecas de apresentação em fago (Knappik, et al. J Mol Biol 296:57 a 86, 2000, Krebs, et al. J Immunol Methods 254:67 a 84, 2001, Shi, et al. J Mol Biol 397:385-96, 2010).

[0047] A humanização de anticorpo pode ser realizada com o uso de métodos bem conhecidos, como reconstrução de resíudos de determinação de especificidade (SDRR) (Publicação sob U.S. n° 2010/0261620), reconstrução (Padlan et al. Mol. Immunol. 28:489-98, 1991), super humanização (Publicação de Patente Internacional sob No WO04/006955) e otimização de teor de cordão humano (Patente sob U.S. n° 7.657.380). Sequências de arcabouço humanas úteis para a humanização/enxerto podem ser selecionadas a partir de bases de dados relevantes por versados na técnica. As armações selecionadas podem ser adicionalmente modificadas para preservar ou acentuar a afinidade de ligação por técnicas como aquelas reveladas em Queen et al. (Queen, et al. Proc Natl Acad Sci EUA 86:10029-33, 1989) ou na Publicação sob U.S. n° 2011/0092372.

[0048] A preparação de PHF-tau a ser usado como um antígeno para anticorpos de imunização ou isolamento a partir de bibliotecas de exibição em fago pode ser feito com o uso de qualquer técnica adequada. Em um método exemplificador, PHF-tau é isolado de cérebros de pacientes que têm DA com o uso de protocolos bem conhecidos, como aqueles descritos em Greenberg e Davies (Greenberg e Davies Proc Natl Acad Sci EUA 87:5827-31, 1990). O PHF-tau pode ser isolado do córtex pós-morte de um paciente com Alzheimer. O PHF-tau isolado é caracterizado por sua pureza e situação de hiperfosforilação com anticorpos que se sabe que reagem com PHF-tau. Em uma preparação de PHF-tau típica, as bandas hiperfosforiladas que migram em cerca de 60, 64, 68 e 72 kDa em western blot (Spillantini and Goe- dert Trends Neurosci 21:428-33, 1998) são detectadas por um anticorpo AT8 que se liga especificamente ao PHF-tau hisperfosforilado mas não ao PHF-tau defosforilado.

[0049] Os anticorpos da presente invenção podem ter característi cas de não ligação de tau de controle de SEQ ID NO:6. Esses anticorpos podem ser gerados com o uso de métodos descritos acima e testando os anticorpos por sua carência de ligação de tau de controle em western blots seguidos pela mancha de Coomassie conforme descrito acima. O tau de controle pode ser purificado e expresso de forma re- combinante com o uso de métodos padrão. Os anticorpos exemplifica- dores que ligam PHF-tau mas não tau de controle são anticorpos PT1 e PT3. Os anticorpos da invenção podem ser avaliados adicionalmente por sua especificidade, por exemplo, com o uso de imunoistoquímica em emendas de cérebro com DA e controle.

[0050] Os anticorpos da invenção podem ter em direção a PHF-tau com uma constante dissociação (KD) menor do que ou igual a cerca de 10-7, 10-8, 10-9, 10-10, 10-11 ou 10-12 M. A afinidade de uma dada molécula para PHF-tau pode ser determinada experimentalmente com o uso de qualquer método adequado. Esses métodos podem usar instrumentação, Biacore, ProteOn ou KinExA, ELISA ou testes de ligação competitiva conhecidos pelos versados na técnica.

[0051] Outro aspecto da invenção é um anticorpo isolado ou frag mento que compete pela ligação de PHF-tau com um anticorpo monoclonal que compreende um sítio de ligação de antígeno de uma região variável de cadeia pesada (VH) de SEQ ID NO:35 e um sítio de ligação de antígeno de uma região variável de cadeia leve (VL) de SEQ ID NO:36, ou um sítio de ligação de antígeno de uma região variável de cadeia pesada (VH) de SEQ ID NO:37 e um sítio de ligação de antíge- no de uma região variável de cadeia leve (VL) de SEQ ID NO:38.

[0052] A competição entre a ligação a PHF-tau pode ser testada in vitro com o uso de métodos bem conhecidos. Por exemplo, a ligação de anticorpo etiquetado de éster de NHS com MSD Sulfo-Tag™ a PHF-tau na presença de um anticorpo não etiquetado pode ser avaliada com o uso de imunoensaio seguido por detecção de eletroquimio- luminescência.

[0053] Diversas metodologias bem conhecidas além da ligação competitiva podem ser empregadas para determinar a ligação de epíto- po dos anticorpos da invenção. Por exemplo, quando as estruturas de ambos os componentes individuais são conhecidas, o acoplamento proteína-proteína in silico pode ser executado a fim de identificar sítios compatíveis de interação. A troca de hidrogênio-deutério (H/D) pode ser executada com o complexo de anticorpo e antígeno a fim de mapear as regiões no antígeno que podem ser ligadas através do anticorpo. A mu- tagênese do ponto ou segmento do antígeno pode ser usada para localizar os aminoácidos importantes para a ligação de anticorpo. A estrutura cocristalina do complexo anticorpo-antígeno é usada para identificar resíduos que contribuem para o epítopo e o parátopo.

[0054] Os anticorpos da invenção podem ser anticorpos monoclo- nais dos isotipos de IgG, IgD, IgA ou IgM. Os anticorpos da invenção podem ser biespecíficas ou multiespecíficas. Um anticorpo biespecífi- co exemplificador pode ligar dois epítopos distintos em PHF-tau ou pode ligar PHF-tau e beta amiloide (Aβ). Outro anticorpo biespecífico exemplificador pode ligar PHF-tau e um receptor de transcitose de barreira de cérebro sanguíneo endógeno como receptor de insulina, receptor de transferência, receptor de fator 1 de crescimento similar a insulina e receptor para lipoproteína. Um anticorpo exemplificador é do tipo IgG1.

[0055] As propriedades de efetor imunológico dos anticorpos da invenção podem ser acentuadas ou silenciadas através de modificações Fc por técnicas conhecidas para aqueles versados na técnica. Por exemplo, as funções de efetor de Fc como ligação de C1q, citoto- xicidade dependente de complemento (CDC), citoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC), fagocitose, regulação descendente de receptores de superfície de célula (por exemplo, receptor de célula B; BCR), etc. podem ser fornecidas e/ou controladas modificando-se resíduos no Fc responsável por essas atividades. As propriedades farmacocinéticas também poderiam ser acentuadas pela mutação dos resíduos no domínio Fc que estende a meia vida de corpo (Strohl Curr Opin Biotechnol 20:685-91, 2009).

[0056] Adicionalmente, os anticorpos da invenção podem ser mo dificados pós-traducionalmente por processos como glicosilação, iso- merização, deglicosilação ou modificação covalente de ocorrência não natural, como a adição de porções químicas de polietileno glicol (PEG) (peguilação) e lipidação. Tais modificações podem ocorrer in vivo ou in vitro. Por exemplo, os anticorpos da invenção podem ser conjugados a polietileno glicol (pegilado) para otimizar seus perfis farmacocinéticos. A conjugação pode ser realizada por técnicas conhecidas àqueles versados na técnica. Mostrou-se que a conjugação de anticorpos terapêuticos com PEG acentuam farmacodinâmicos enquanto não interfere com a função (Knight, et al. Platelets 15:409-18, 2004, Leong, et al. Cytokine 16:106-19, 2001, Yang, et al. Protein Eng 16:761-70, 2003).

[0057] Outra modalidade da invenção é um polinucleotídeo isolado que codifica os anticorpos da invenção ou seu complemento, ou fragmentos dos mesmos. Os polinucleotídeos isolados exemplificadores são polinucleotídeos que codificam polipeptídeos compreendendo CDRs de cadeia pesada de imunoglobulina HCDR1, HCDR2 e HCDR3 mostrados em SEQ ID NOs:7, 8 e 9 ou 13, 14 e 15, respectivamente, ou polipeptídeos que compreendem CDRs de cadeia leve de imuno- globulina LCDR1, LCDR2 e LCDR3 mostrado em SEQ ID NOs:10, 11 e 12 ou 16, 17 e 18, respectivamente e polinucleotídeos que têm uma sequência mostrada em SEQ ID NOs:31-34, que codificam regiões variáveis de anticorpo da invenção. Outros polinucleotídeos que, dada a degeneração do código genético ou preferências de códon em um dado sistema de expressão codificam os anticorpos da invenção também estão abrangidos no escopo da invenção. Os ácidos nucleicos isolados da presente invenção podem ser feitos com o uso de técnicas sintéticas ou recombinantes bem conhecidas. O DNA que codifica os anticorpos monoclonais é facilmente isolado sequenciado com o uso de métodos conhecidos na técnica. Quando um hibridoma é produzido, estas células podem servir como uma fonte deste DNA. Alternativamente, com o uso de técnicas de apresentação nas quais a sequência codificante e o produto de tradução são ligados, como bibliotecas de apresentação em fagos ou ribossomais, a seleção do ligante e do ácido nucleico é simplificada. Após a seleção em fago, as regiões codi- ficantes do anticorpo do fago podem ser isoladas e usadas para gerar anticorpos inteiros, incluindo anticorpos humanos, ou qualquer outro fragmento de ligação ao antígeno desejado e expressas em qualquer hospedeiro desejado, incluindo células de mamífero, células de inseto, células de planta, levedura e bactérias.

[0058] Outra modalidade da invenção é um vetor que compreende pelo menos um polinucleotídeo da invenção. Esses vetores podem ser vetores de plasmídeo, vetores virais, vetores à base de transpóson ou quaisquer outros vetores adequados para a introdução dos polinucleo- tídeos da invenção em um dado organismo ou antecedente genético por quaisquer meios.

[0059] Outra modalidade da invenção é uma célula hospedeira que compreende qualquer um dos polinucleotídeos da invenção. Tais células hospedeiras podem ser células eucarióticas, células bacteria- nas, células de planta ou células de archea. As células eucarióticas exemplificadoras podem ser de origem mamífera, de inseto, de aves ou de outra origem animal. As células eucarióticas de mamífero incluem linhagens de células imortalizadas como linhagens de células de hibridoma ou mieloma como linhagens de células de murino SP2/0 (Coleção de Cultura do Tipo Americana (ATCC), Manassas, VA, EUA CRL-1581), NS0 (Coleção Europeia de Culturas Celulares (ECACC), Salisbury, Wiltshire, Reino Unido, ECACC No. 85110503), FO (ATCC CRL-1646) e Ag653 (ATCC CRL-1580). Uma linhagem de células de mieloma de seres humanos exemplificadora é U266 (ATTC CRL-TIB- 196). Outras linhagens celulares úteis incluem aquelas derivadas de células do ovário do hamster chinês (CHO) como CHO-K1SV (Lonza Biologics), CHO-K1 (ATCC CRL-61, Invitrogen) ou DG44.

[0060] Outra modalidade da invenção é um método de produção um anticorpo que liga PHF-tau que compreende cultivar uma célula hospedeira da invenção e recuperar o anticorpo produzido pela célula hospedeira. Os métodos de fabricação de anticorpos e de purificação dos mesmos são bem conhecidos na técnica.

MÉTODOS DE TRATAMENTO

[0061] Os anticorpos anti-PHF-tau da invenção ou fragmentos dos mesmos, que incluem fragmentos Fab, (Fab’)2, scFv, ou anticorpos que compreendem sítios de ligação ao antígeno dos anticorpos da invenção podem ser usados para tratar, reduzir ou evitar sintomas em pacientes que têm uma doença neurodegenerativa que envolve a agregação patológica de tau dentro do cérebro, como pacientes que sofrem de DA ou qualquer outra tauopatia. Embora não se deseje ser preso por qualquer teoria particular, os anticorpos da invenção podem exercer seu efeito benéfico reduzindo-se a agregação de tau patológica e por conseguinte a quantidade de PHF-tau no cérebro. Os anticorpos da invenção podem ser usados para tratar um paciente animal pertencente a qualquer classificação. Exemplos de tais animais incluem mamíferos como seres humanos, roedores, cães, gatos e animais da fazenda. Por exemplo, os anticorpos da invenção são úteis, também, na preparação de um medicamento para o tratamento de DA, em que o medicamento é preparado para administração nas dosagens aqui definidas.

[0062] Outra modalidade da invenção é um método de redução de agregação de tau em pacientes com necessidade do mesmo que compreende a administração ao paciente de uma quantidade terapeu- ticamente eficaz do anticorpo isolado da invenção por tempo suficiente para reduzir a agregação de tau.

[0063] Outra modalidade da invenção é um método de tratamento ou redução de sintomas de uma doença neurodegenerativa que envolve a agregação de tau em um paciente que compreende administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo isolado da invenção por um tempo suficiente para tratar ou reduzir sintomas da doença neurodegenerativa.

[0064] Em qualquer uma das modalidades acima, a doença neu- rodegenerativa que envolve agregação de tau é uma tauopatia.

[0065] Em qualquer uma das modalidades acima, o anticorpo iso lado compreende um anticorpo que liga PHF-tau que compreende um sítio de ligação de antígeno de uma VH de SEQ ID NO:35 e um sítio de ligação de antígeno de uma VL de SEQ ID NO:36.

[0066] Em qualquer uma das modalidades acima, o anticorpo iso lado compreende um anticorpo que liga PHF-tau que compreende um sítio de ligação de antígeno de uma VH de SEQ ID NO:37 e um sítio de ligação de antígeno de uma VL de SEQ ID NO: 38.

[0067] Conforme usado no presente documento uma "tauopatia" engloba qualquer doença neurodegenerativa que envolve a agregação patológica de tau dentro do cérebro. Além da DA familiar e esporádica, outras tauopatias exemplificadoras são demência frontotemporal com parkinsonismo ligado ao cromossomo 17 (FTDP-17), paralisia su pranuclear progressiva, degeneração córticobasal, doenças de Pick, gliose subcortical progressiva, demência somente de emaranhado, emaranhados neurofibrilares difusos com calcificação, demência por grão argirofílica, complexo de demência de parkinsonismo de esclerose lateral amiotrófica, síndrome de Down, doença de Gerstmann- Straussler-Scheinker, doença Hallervorden-Spatz, miosite de corpo de conclusão, doença de Creutzfeld-Jakob, atropia múltipla de sistema, tipo C da doença de Niemann-Pick, angiopatia amilóide cerebral de proteína de príon, panencefalite esclerosante subaguda, distrofia mio- tônica, doença do neurônio motor não guanamiana com emaranhados neurofibrilares, parkinsonismo postencefalítico e chronic encefalopatia crônica, como demência pugulística (doença do boxeador). (Morris, et al. Neuron 70:410-26, 2011).

[0068] Um fenotipo comportamental relacionado a tauopatia inclui limitações cognitivas, mudança de personalidade precoce e desinibi- ção, apatia, abulia, mutismo, apraxia, perseveração, comportamen- tos/movimentos estereotipados, hiperoralidade, desorganização, incapacidade de planejar ou organizar tarefas sequenciais, egoís- mo/insensibilidade, traços antissociais, uma carência de empatia, hesi- tância, discurso agramático com erros frasais frequentes mas compreensão relativamente preservada, compreensão debilitada e déficits de apuramento de palavra, instabilidade de marcha progressiva lenta, re- tropulsões, congelamento, quedas frequentes, rigidez axial não res- ponsiva a levodopa, paralisia do olhar supranuclear, sacudidas em ondas quadradas, sacadas verticais lentas, paralisia pseudobulbar, apraxia do membro, distonia, perda sensorial corticoidal e tremor.

[0069] Os pacientes favoráveis para tratamento incluem indivíduos assintomáticos em risco de DA ou outra tauopatia, bem como pacientes que mostram atualmente os sintomas. Os pacientes favoráveis para tratamento incluem indivíduos que tem um risco genético conhecido de DA, como um histórico familiar de DA ou presença de fatores de risco genético no genoma. Os fatores de risco exemplificador são mutações na proteína precursora de amiloide (APP), especialmente na posição 717 e posições 670 e 671 (mutações de Hardy e Swedish, respectivamente). Outros fatores de risco são mutações nos genes de presenilina, PS1 e PS2 e ApoE4, histórico familiar de hipercolestero- lemia ou ateroesclerose. Os indivíduos atualmente sofrendo de DA podem ser reconhecidos a partir de demências características pela presença de fatores de risco descritos acima. Além disso, diversos testes diagnósticos estão disponíveis para identificar indivíduos que têm DA. Esses testes incluem a medição de níveis de tau de líquido cefa- lorraquidiano e Aβ42. Os níveis de Aβ42 diminuídos ou tau elevado significam a presença de DA. Os indivíduos que sofrem de DA também podem ser diagnosticados por DA e critérios de Associação de Distúrbios Relacionados.

ADMINISTRAÇÃO/COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

[0070] Os anticorpos anti-PHF-tau da invenção são adequados tanto agentes terapêuticos quanto profiláticos para tratar ou evitar doenças neurodegenerativas que envolvem a agregação patológica de tau, como DA ou outras tauopatias. Em pacientes assintomáticos, o tratamento pode começar em qualquer idade (por exemplo, em cerca de 10, 15, 20, 25, 30 anos). Geralmente, entretanto, não é necessário começar o tratamento até que um paciente atinja cerca de 40, 50, 60, ou 70 anos. O tratamento tipicamente implica múltiplas doses ao longo de um período de tempo. O tratamento pode ser monitorado avaliando-se o anticorpo, ou respostas de célula T ou célula B ativadas ao agente terapêutico ao longo do tempo. Se a resposta falhar, uma dosagem de reforçador é indicada.

[0071] Em aplicações profiláticas, as composições farmacêuticas ou medicamentos são administrados a um paciente susceptível a, ou de outro modo em risco de, DA em uma quantidade suficiente para eliminar ou reduzir o risco, diminuir a gravidade, ou atrasar o surgimento da doença, incluindo sintomas bioquímicos, histológicos e/ou comportamentais da doença, suas complicações e fenotipos patológicos intermediários apresentados durante o desenvolvimento da doença. Nas aplicações terapêuticas, as composições ou medicamentos são administrados a um paciente com suspeita de, ou que já sofrendo de uma doença, em uma quantidade suficiente para reduzir, parar, ou atrasar qualquer um dos sintomas da doença (bioquímico, histológico e/ou comportamental). Administração de um terapêutico pode reduzir ou eliminar a limitação cognitiva leve em pacientes que ainda não desenvolveram as características da patologia de Alzheimer. Uma quantidade adequada para realizar o tratamento profilático ou terapêutico é definida como uma dose profilaticamente ou terapeuticamente eficaz. Em ambos os regimes terapêutico e profilático, composições ou medicamentos são geralmente administrados em diversas dosagens até que uma resposta imunológica suficiente tenha sido alcançada.

[0072] Os anticorpos anti-PHF-tau ou fragmentos dos mesmos da invenção podem ser administrados em combinação com outros agentes que são eficazes para tratamento de doenças neurodegenerativas relacionadas. No caso de DA, os anticorpos da invenção podem ser administrada em combinação com agentes que reduzem ou evitam a deposição de amilóide-beta (Aβ). É possível que as patologias de PHF-tau e Aβ sejam sinergísticas. Portanto, a terapia de combinação que tem como objetivo a limpeza das patologias relacionadas tanto a PHF-tau quanto Aβ e Aβ ao mesmo tempo pode ser mais eficaz do que ter como objetivo cada um individualmente.

[0073] No caso de doença de Parkinson e doenças neurodegene- rativas relacionadas, modulação imunológica para limpar formas agregadas da proteína α-sinucleina também é uma terapia emergente. Uma terapia de combinação que tem como objetivo a limpeza de ambas as proteínas tau e a-sinucleína simultaneamente pode ser mais eficaz do que ter como objetivo qualquer proteína individualmente.

[0074] Nos métodos da invenção, a "quantidade terapeuticamente eficaz" do anticorpo no tratamento ou atenuação dos sintomas de uma tauopatia pode ser determinada por técnicas de pesquisa padrão. Por exemplo, a dosagem do anticorpo pode ser determinada administrando-se o agente para modelos animais relevantes bem conhecidos na técnica.

[0075] Além disso, testes in vitro podem, opcionalmente, ser em pregados para auxiliar na identificação de faixas ideais de dosagem. A seleções de uma dosagem particular eficaz pode ser determinada (por exemplo, através de testes clínicos) por versados na técnica com base na consideração de vários fatores. Tais fatores incluem a doença a ser tratada ou evitada, os sintomas envolvidos, a massa corpórea do paciente, o estado imune do paciente e outros fatores conhecidos por aque- les versados na técnica. A dosagem que precisa ser empregada na formulação também irá depender da via de administração e da severidade da doença e deve ser decidida de acordo com o julgamento do profissional e com as circunstâncias de cada paciente. As dosagens eficazes podem ser extrapoladas destas curvas de resposta à dosagem derivadas dos sistemas de teste de modelo de animal ou in vitro.

[0076] O modo de administração para uso terapêutico dos anticor pos da invenção pode ser qualquer rota adequada que distribui o agente ao hospedeiro. As composições farmacêuticas desses anticorpos são úteis para administração parenteral, por exemplo, intradérmi- ca, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutâneo, intranasal ou intracranial ou elas podem ser administradas no líquido cefalorra- quidiano do cérebro ou espinha.

[0077] O anticorpos da invenção pode ser preparado como uma composição farmacêutica que contém uma quantidade eficaz do anticorpo como um ingrediente ativo em um veículo farmaceuticamente aceitável. O termo "carreador" refere-se a um diluente, adjuvante, ex- cipiente, ou transportador com o qual o anticorpo é administrado. Tais veículos farmacêuticos podem ser líquidos, como água e óleos, inclusive aqueles derivados de petróleo, animal, origem vegetal ou sintética, como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim e similares. Por exemplo, podem ser usadas solução salina a 0,4% e glicina a 0,3%. Estas soluções são estéreis e, em geral, livres de matéria particulada. As mesmas podem ser esterilizadas através de técnicas de esterilização bem conhecidas (por exemplo, filtração). As composições podem conter substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis conforme exigido para aproximá-las das condições fisiológicas como agentes de tamponamento e de ajuste de pH, de estabilização, espessantes, lubrificantes e corantes, etc. A concentração dos anticorposagente da invenção em tal formulação farmacêutica pode variar amplamente, isto é, de menos que cerca de 0,5%, usualmente em ou pelo menos cerca de 1% até tanto quanto 15 ou 20%, em peso, e será selecionada primariamente com base na dosagem exigida, volume do fluido, viscosidades, etc., de acordo com o modo particular de administração selecionado.

[0078] O tratamento pode ser dado em um cronograma de dose única ou como um cronograma de múltiplas doses no qual um curso primário de tratamento pode ser com 1 a 10 doses separadas, seguido de outras doses dadas em intervalos de tempo subsequentes necessários para manter e/ou reforçar a resposta, por exemplo, 1 a 4 meses para uma segunda dose e, se necessário, uma dose(s) subsequen- te(s) após vários meses. Os exemplos de cronogramas de tratamento adequados incluem: (i) 0, 1 mês e 6 meses, (ii) 0, 7 dias e 1 mês, (iii) 0 e 1 mês, (iv) 0 e 6 meses, ou outros cronogramas suficientes para gerar as respostas desejadas que se destinam a reduzir os sintomas da doença, ou reduzir a severidade da doença.

[0079] Deste modo uma composição farmacêutica da invenção para injeção intramuscular poderia ser preparada para conter 1 ml de água tamponada estéril, entre cerca de 1 ng a cerca de 100 mg, por exemplo, cerca de 50 ng cerca de 30 mg ou cerca de 5 mg a cerca de 25 mg de um anticorpo antagonista da invenção De maneira similar, uma composição farmacêutica da invenção para infusão intravenosa poderia ser preparada para conter cerca de 250 ml de solução de Ringer estéril, e cerca de 1 mg a cerca de 30 mg ou cerca de 5 mg a cerca de 25 mg de um anticorpo da invenção. Os métodos atuais para preparar as composições parenteralmente administráveis são bem conhecidos e são descritos em mais detalhes em, por exemplo, "Remington's Pharmaceutical Science", 15a edição, Mack Publishing Company, Easton, PA, EUA.

[0080] Os anticorpos da invenção podem ser liofilizados para ar- mazenamento e reconstituídos em um veículo adequado antes do uso. Esta técnica mostrou-se eficaz com anticorpo e outras preparações de proteína e as técnicas de reconstituição e de liofilização conhecidas na técnica podem ser empregadas.

MÉTODOS DIAGNÓSTICOS E KITS

[0081] Os anticorpos da invenção podem ser usados nos métodos de diagnóstico de DA ou outra tauopatia em um sujeito. Esse método envolve detectar, no sujeito, a presença de PHF-tau com o uso de um reagente diagnóstico como um anticorpo ou um fragmento da mesma da presente invenção

[0082] O PHF-tau pode ser detectado em uma amostra biológica de um sujeito (por exemplo, sangue, urina, líquido cefalorraquidiano) colocando-se a amostra biológica em contato com o reagente de anticorpo diagnóstico e detectando-se a ligação do reagente de anticorpo diagnóstico a PHF-tau na amostra do sujeito. Os ensaios para executar a deleção incluem métodos bem conhecidos como ELISA, imunois- toquímica, western blot, ou imageamento in vivo. Os anticorpos diagnósticos exemplificadores são anticorpos PT1 e PT3 da invenção e são do tipo IgG1,K.

[0083] Os anticorpos diagnósticos ou reagentes semelhantes po dem ser administrados por injeção intravenosa no corpo do paciente, ou diretamente no cérebro por qualquer rota adequada que entrega o agente ao hospedeiro conforme exemplificado acima. A dosagem do anticorpo deveria estar dentro das mesmas faixas para os métodos de tratamento. Tipicamente, o anticorpo é etiquetado, embora em alguns métodos, o anticorpo primário com afinidade para PHF-tau é não etiquetado e um agente de marcação secundário é usado para se ligar ao anticorpo primário. A escolha de etiqueta depende do meio de detecção. Por exemplo, uma etiqueta fluorescente é adequada para detecção óptica. O uso de etiquetas paramagnéticas é adequada para a detecção tomográfica sem intervenção cirúrgica. As etiquetas radioativas também podem ser detectadas com o uso de PET ou SPECT.

[0084] O diagnóstico é realizado comparando-se o número, tama nho, e/ou intensidade de PHF-tau etiquetado, agregados de tau, e/ou emaranhados neurofibrilares em uma amostra do sujeito ou no sujeito, a valores de linha de base correspondentes. Os valores de linha de base podem representar os níveis médios em uma população de indivíduos sem doença. Os valores de linha de base também podem representar níveis anteriores determinados no mesmo sujeito.

[0085] Os métodos de métodos diagnóstico descritos acima tam bém podem ser usados para monitorar uma resposta do sujeito a terapia detectandose a presença de PHF-tau em um sujeito antes, durante ou após o tratamento. Uma diminuição nos valores relacionados aos linha de base sinaliza uma resposta positiva para tratamento. Os valores também podem aumentar temporariamente em fluidos biológicos conforme tau patológico está sendo limpo do cérebro.

[0086] A presente invenção é direcionada adicionalmente para um kit para realizar os métodos de monitoramento e diagnóstico descritos acima. Tipicamente, esses kits contêm um reagente diagnóstico como os anticorpos da invenção e opcionalmente uma etiqueta detectável. O próprio anticorpo diagnóstico pode conter a etiqueta detectável (por exemplo, molécula fluorescente, biotina, etc.) que é diretamente detec- tável ou detectável por meio de uma reação secundária (por exemplo, reação com estreptavidina). Alternativamente, um segundo reagente que contém a etiqueta detectável pode ser utilizada, em que o segundo reagente tem especificidade de ligação para o anticorpo primário. Em um kit diagnóstico adequado para medir PHF-tau em uma amostra biológica, os anticorpos do kit podem ser fornecidos pré-ligados a uma fase sólida, como às cavidades de um patro microtitulador.

[0087] Os conteúdos de todas as referências citadas (incluindo referências da literatura, patentes concedidas, pedidos de patente publicados e pedidos de patente copendentes) citadas neste relatório descritivo estão aqui expressamente incorporadas, por referência, na sua íntegra.

EXEMPLO 1 Á PURIFICAÇÃO DE TAU DE FILAMENTO HELICOIDAL EMPARELHADO (PHF-TAU)

[0088] PHF-tau foi parcialmente purificado por um método modifi cado de Greenberg e Davies (Greenberg e Davies Proc Natl Acad Sci EUA 87:5827-31, 1990). Brevemente, o tecido pós-morte do córtex obtido de um paciente confirmado com Alzheimer foi parcialmente purificado. Tipicamente, 5 mg de córtex frontal foi homogeneizado em 10 vol de tampão frio Tampão H (10 mM de Tris, 800 mM de NaCl, 1 mM de EGTA e 10% de sacarose/ pH 7,4) com o uso de um homogeneiza- dor de tecido de vidro/Teflon Potter (IKA Works, Inc; Staufen, Alemanha) em 1000 rpm. O material homogeneizado foi centrifugado em 264,8 N (27000 g) por 20 minutos em um rotor Sorvall SS34. A pélete foi descartada e o sobrenadante foi ajustado para uma concentração final de 1% (peso por volume) de N-lauroilsarcosina e 1% (v/v) de 2- mercapto etanol e incubado por 2 horas a 37°C. Subsequentemente o sobrenadante foi centrifugado em 1059,1 N (108000 g) por 35 minutos a 20°C em um rotor Beckman 60Ti. O pélete foi lavado com cuidado em PBS e suspenso em PBS. O sobrenadante foi centrifugado uma segunda vez conforme descrito e o pélete final foi dissolvido, aliquota- do e congelado a -80 °C. A qualidade das preparações de PHF-tau foi avaliada em um SDS-PAGE de 12% e western blot com anticorpos anti-tau AT8 e HT7 (ThermoScientific, Rockford, IL). AT8 detecta PHF- tau fosforilado em S202/T205, mas não se liga a PHF-tau não fosfori- lado nem ao tau de tipo selvagem. HT7 se liga a um epítopo não fosfo- rilado em aminoácidos de Tau 159-163 (de SEQ ID NO: 6) e reconhe- ce tanto tau quanto PHF-tau. Uma preparação de PHF-tau de boa qualidade é composta de 4 faixas que têm pesos moleculares de cerca de 60, 64, 66 e 72 kDa em um Western blot detectado com um anticorpo reativo a PHF-tau hiperfosforilado como AT8. Duas preparações de PHF-tau separadas com pureza e qualidade comparáveis foram feitas a partir da mesma amostra de cérebro. A preparação 1 foi usada para imunização.

EXEMPLO 2 GERAÇÃO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS CONTRA PHF-TAU

[0089] Os anticorpos anti-PHF-tau foram gerados com o uso de tecnologia de hibridoma padrão em camundongos Balb/c normais (Kohler e Milstein Nature 256:495-7, 1975). Hibridomas obtidos foram semeados em placas com 96 cavidades e triados após 10 dias e um ELISA direto em 25 ng/cavidade revestido por PHF-tau conforme descrito abaixo. As células positivas foram testadas por reatividade cruzada em 10 ng/cavidade revestida com tau de controle (SEQ ID NO:6) expresso em células BL21 de E. Coli e purificadas por tratamento térmico e precipitação de sulfato de amônio e foram subclonadas imediatamente e os clones positivos foram congelados em nitrogênio líquido. Todos os hibridomas foram cultivados no meio de Eagle modificado por Dulbecco complementado com 10% de soro fetal bovino (Hyclone, Europa), Complemento de Clonagem de Fusão de Hibridoma (2%) (Roche, Bruxelas, Bélgica) 2% de HT (Sigma, EUA), 1 mM de piruvato de sódio, 2 mM de L-glutamina e penicilina (100 U/ml) e estreptomicina (50 mg/ml).

[0090] As regiões variáveis de anticorpo foram clonadas para se lecionar as células de hibridoma em fundo de camundongo IgG1/IgG2/ K e expressas e purificadas com o uso de métodos de rotina.

ELISA DIRETA PARA SELEÇÃO DE ANTICORPO

[0091] 25 ng/cavidade de PHF-tau foi revestido de um dia para o outro em 4 °C em NUNC Maxisorp (Life Technologies) placas microti- tuladoras com 96 cavidades de alta ligação de fundo plano em 50 μl/cavidade de tampão de revestimento (10 mM de Tris, 10 mM de NaCl e 10 mM de NaN3, pH 8,5). No próximo dia, as placas foram bloqueadas com 75 μl/cavidade de 0,1 % de caseína em PBS por 60 min em temperatura ambiente. A seguir, 50 μl de sobrenadante de hibri- doma foi adicionado e incubado por 1 hora a 37 °C. Após lavar, os anticorpos monoclonais ligados foram detectados com 50 μl/cavidade de anti-IgG de camundongo Sheep conjugado com peroxidase de raiz- forte por 1 hora a 37 °C (Amersham-Pharmacia Biotech). Ambos os reagentes foram diluídos em 0,1 % de caseína/PBS. As placas foram lavadas e 50 μL de uma solução de 0,42 mM 3,5,3’,5’-tetrametil- benzidina, 0,003 % (v/v) H2O2 em 100 mM de ácido cítrico e 100 mM de hidrogenofosfato dissódico (pH 4,3) foi adicionado como o substrato. Permitiu-se que a reação prosseguisse por no máximo 15 minutos em um agitador de placa em temperatura ambiente, após os quais o desenvolvimento de cor foi parado com 2 N H2SO4, 50 μl/cavidade e as placas, foram lidas em um leitor de placa microtituladora em 450 nm (Thermomax, Molecular Devices).

ESPECIFICIDADE DOS ANTICORPOS MONOCLONAIS

[0092] Os anticorpos seletos obtidos a partir da triagem de hibri- doma foram testados por sua reatividade cruzada com tau de controle expresso de forma recombinante (SEQ ID NO:6). 500 ng de PHF-tau e 200 ng de tau de controle foram carregados em uma NuPAGE® Novex® Bis-Tris 4 a 12% de gel e manchadas em uma membrana de ni- trocelulose através do uso de um sistema iBlot (Invitrogen), de acordo com as instruções do fabricante. As membranas foram bloqueadas por 1 hora com solução salina Tris-tamponada Tween-20 (TBS-T; 1 M de Tris, 150 mM de NaCl e 0,05% de Tween-20, pH 8,5) que contém leite seco desnatado (NFDM) (5% peso por volume; Biorad) e lavadas três vezes em TBS-T. A incubação com os anticorpos de controle primários (1 μg/ml) HT7, AT8, AT100 (ThermoScientific, Rockford, IL) e BT2 diluídos em TBS-T que contém NFDM (5% peso por volume) foi de um dia para o outro a 4°C. Os anticorpos monoclonais PT1, PT2, PT3, PT4 e PT5 selecionado dentre a triagem de hibridoma foram adicionados no sobrenadante de cultura que contém 10 % de FCS. Os anticorpos primários foram detectados com o uso de anti-Ig de camundongo Sheep com HRPO (1:20000 em TBS-T, Amersham Biosciences) por meio de quimioluminescência acentuada por West Dura® (Pierce, Thermosci- entific). Os sinais foram capturados pelo sistema de imageamento Lu- mi (Roche Diagnostic). PT1 e PT3 reagiram com PHF-tau e não reagiram com tau de controle em western blots. PT2 foi reativa com ambas as proteínas. Os perfis de ligação de HT7 e AT8 são descritos acima. AT100 se liga a Ser212/Thr214 fosforilado e se liga a PHF-tau mas não ao tau de tipo selvagem. BT2 reconhece um epítopo não fosforila- do que compreende S199/S202 e portanto reconhece tau de tipo selvagem mas não PHF-tau.

LIGAÇÃO COMPETITIVA DE EPÍTOPO

[0093] Os anticorpos monoclonais PT1, PT2, PT3, PT4, PT5, AT8 (ThermoScientific, Rockford, IL), AT100 (ThermoScientific, Rockford, IL) e HT7 (MN1000) (Thermo Scientific, Rockford, IL) foram avaliados por ligação competitiva a PHF-tau ou pepetídeos de tau fosforilado. Os anticorpos foram etiquetados com uso de MSD® SULF0-TAG NHS Ester (Meso Scale Discovery) de acordo com a instrução do fabricante.

[0094] Para competição com PT1 etiquetado, PT3, AT100 e HT7, 5 μl (50 μg/ml)/cavidade de proteínas de PHF-tau enriquecidas (purificadas conforme descrito acima) foi revestido na placa de MSD High- Bind (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD, EUA) por 2 horas em temperatura ambiente (RT). Para competição com AT8, 25 μl de 0,1 mg/cavidade de peptídeo peguilado e biotinilado sintético RSGYSSPG (pS)PG(pT)PGSRSR-OH (Peptídeo de Nova Inglaterra, LLC., Gardner, MA) (SEQ ID NO:39) correspondentes a resíduos 194-211 de tau de controle (SEQ ID NO:6) fosforilado em resíduos correspondentes a S202/T205 no tau de controle foi revestido em placas carregadas com estreptavidina (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD, EUA). Após o revestimento, as cavidades foram bloqueadas com 150 μL de 5% de tampão de bloqueador A MSD em RT por 2 horas e lavadas três vezes com 0,1 M de tampão HEPES, pH 7,4. 25 μl de uma mistura de anticorpo anti-tau individual etiquetado (10 nM ou 50 nM) e diluições seriais de vários anticorpos competidores não etiquetados (1 nM a 2 μM) foram adicionadas em cada cavidade. As placas foram incubadas por 2 horas em RT com agitação suave e lavadas 3 vezes como acima. 150 μl/cavidade de tampão de leitura MSD T foram adicionados e as placas foram lidas em um imageador SECTOR 6000 (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD, EUA).

[0095] Epítopos não sobrepostos de mAbs anti-Tau HT7, AT100 e AT8 são descritos acima. Com base nos dados publicados, não era esperado que esses anticorpos competissem entre si na ligação a pep- tídeos ou proteínas de Tau.

[0096] Com base nos ensaios de competição realizados, nenhum dos anticorpos competiram entre si pela ligação, indicando que todos eles se ligam a epítopos diferentes. Em cada experimento, somente autoinibição foi observada. As Figuras 1 a 5 mostram resulta de ensaios de competição com AT8, PT1, PT3, AT100 e HT7 etiquetados, respectivamente.

EXEMPLO 3 ANTICORPOS ANTI-PHF-TAU ANTICORPOS REDUZEM O ACÚMULO DE PHF-TAU IN VIVO

[0097] Camundongos P301L fêmeas de 5 meses de idade (Taco- nic, cat#002508) foram tratados uma vez por mês com IgG1 de ca- mundongo, solução salina, PT3 (500 μg/camundongo) ou AT8 (expressado de hibridoma ECACC, número de depósito 9110086) por 5 meses. Os camundongos foram anestesiados, perfundido com PBS frio e os cérebros dissecados no gelo. Para cada camundongo, um hemisfério do cérebro foi homogeneizado em 10 volume de tampão H, seguido de centrifugação em 205,9 N (21.000 g) por 20 minutos a 4°C. O sobrenadante resultante foi centrifugado adicionalmente em 205,9 N (100.000 g) por 60 minutos. Após a centrifugação, o pélete (fração P1) foi recuperado e resuspenso com tampão de lise para análises de Western e ELISA, conforme descrito porChai et al. J Biol Chem 286:34457-67, 2011. Para amostras de córtex, a fração P1 foi tratado adicionalmente com 1% (peso por volume) N-lauroilsarcosina e ultra- centrifugado para enriquecer adicionalmente PHF-tau no pélete. Observou-se que os camundongos P301L machos têm expressão de transgene baixa e não foram incluídos nas análises.

[0098] O tau fosforilado foi medido em homogenatos de troncoen- cefálico (fração P1) com ELISA sanduíche com o uso de anticorpos AT8 e AT100 como anticorpos de captura seguido da detecção por HT7 biotinilado e HRP de avidina (Figura 6A e 6B) e com AT100 em um western blot (Figura 6C) essencialmente conforme descrito em Chai et al. J Biol Chem 286:34457-67, 2011. Brevemente, o pélete P1 foi ressuspenso com tampão de lise (Sinalização de Célula). As amostras de pélete P1 foram incubadas em cavidades pré-revestidas com AT8 ou AT100 (Thermo Scientific) e o anticorpo de HT-7 etiquetado com biotina. As amostras foram então lavadas 5 vezes com tampão, seguido pela incubação com HRP de avidina por uma hora. Após isso, as amostras foram incubadas com um substrato de TMB de etapas (Thermo Scientific) por 30 minutos, seguido de 2 N H2SO4. Finalmente, a reação foi lida em 450 nm e a quantidade de tau reativo a AT8 ou AT100 no cérebro foi determinado com o uso de uma curva padrão derivada de homogenatos de cérebro com DA humano e plotados como uma quantidade relativa de homogenato de cérebro de DA (ng/ml) fornecendo o mesmo sinal ELISA como uma amostra média de um animal não transgênico (B6).

[0099] Uma diminuição estatisticamente significativa ou tendência em direção à significância em tau fosforilado foi vista em animais transgênicos de P301L tratados com PT3 em comparação aos animais administrados com controle de isotipo em ensaios ELISA com o uso de AT100 (p=0,057) ou AT8 (p=0,0475) para a fosforilação detectada (sinal de ELISA: grupo de solução salina (1135±228,8); grupo IgG1 (1344±245,6); grupo PT3 (660,5±134,5); grupo AT8 (1271±274)).

[00100] Para confirmar os dados obtidos com ELISA, os homogena- tos de troncoencefálico (fração P1) de animais tratados por IgG1 ou PT3 foram analisados em western blot detectando-se PHF-tau com o uso de anticorpo de AT100. Os filtros foram manchados com o uso de anticorpo anti-actina como um controle de carregamento (Figura 6B). Western blots mostraram a quantidade de PHF-tau atenuada detectada com anticorpo de AT100 em comparação aos animais tratados com IgG1.

[00101] Para análise de córtex, tanto o sarcosil solúvel (representando tau solúvel) e insolúvel (representando PHF-tau) frações de córtex foram analisados por ELISA sanduíche com o uso de anticorpo pan-tau (PT4) ou anticorpo fosfo-tau (AT8) para a captura seguido de um anticorpo biotina-pan-tau (hTau10) seguido de HRP-avidina. Os animais tratados com PT3 tinham níveis semelhantes de tau total em comparação aos animais tratados com o controle de isotipo IgG1. Uma tendência em direção aos níveis de PHF-tau inferiores era evidentes nos animais tratados com PT3 quando comparada ao controle de iso- tipo nas frações insolúveis de N-lauroilsarcosina (captura de ELISA com PT4: grupo IgG: 851026±261198 e grupo PT3: 585639±120498; ELISA, captura com AT8: grupo IgG: 1125886±286240 (N=10) e grupo pT3: 746582±124970 (N=7)).

EXEMPLO 4 CARACTERIZAÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-PHF-TAU DETERMINAÇÃO DE AFINIDADE

[00102] As interações de anticorpos monoclonais PT1 e PT3 com tau solúvel de humano recombinante ou PHF-tau foram estudadas por ProteOn. Todas as interações foram estudadas em 25°C com o uso de PBS pH 7,4, complementado com 3 mM de EDTA e 0,005% de Tween-20 como tampão de sistema ou corrida. Dois formatos de experimento diferentes foram usados, um para a interação com tau de controle expresso de forma recombinante e outra para a interação com PHF-tau. Nesses experimentos HT7 (Pierce, cat #MN1000), um anticorpo anti-tau de camundongo foi usado como um controle positivo.

[00103] Para estudar a interação com o tau de controle expresso de forma recombinante uma superfície de biossensor foi preparada acoplando-se um anticorpo específico por fragmento de Fc± anti-IgG de humano ou camundongo (Ab) à superfície de um circuito integrado de sensor de GLC (ProteOn) com o uso das instruções de cada fabricante para química de acoplamento de amina (~5000 unidades de resposta (RU)). O tampão de acoplamento era 10 mM de acetato de sódio, pH 4,5. Os anticorpos anti-PHF-tau foram diluídos no tampão de corrida e injetados para obter uma captura de 60 a 130 RUs. A captura de mAbs anti-PFH-Tau foi seguida pela injeção de tau de controle expresso de forma recombinante (Tau-441, Sigma catalog# T0576-50 ug) em solução (0,1 a 75 nM em diluições de 5 vezes). A associação foi monitorada por 2 minutes (80 μl injetados em 40 μl/min). A disssociação foi monitorada por 10 minutos. A regeneração na superfície de sensor foi obtida com 0,85% de H3PO4, ou 0,85% de H3PO4 seguido de 50 mM de NaOH. Os dados foram ajustados com o uso de um modelo de ligação de 1:1. Os dados foram ajustados com o uso de um modelo de ligação de 1:1.

[00104] Para PHF-tau essa é a afinidade intrínseca aparente em que KD é obtida como a razão de kff1/kon-1 derivada de um ajuste realizado com o uso de um modelo de ligação bivalente.

[00105] ** Nenhuma ligação significativa

[00106] *** Nenhuma ligação em 4 de 5 experimentos

[00107] Para estudar a interação com PHF-tau um superfície de biossensor foi preparada através da captura-acoplamento de PHF-tau com o uso de HT7 como o reagente de captura. Preparação adicional do PHF- tau conforme descrita anteriormente foi requerida para ProteOn para limitar a quantidade de material insolúvel que entra nos fluidos. O PHF-tau conforme descrito acima foi preparado adicionalmente por centrifugação de 2 vezes em 49 N (5000 g), 5°C, 10 minutos em que o sobrenadante da segunda centrifugação foi então diluído 1/20 ou 1/40 em tampão de corrida. Para preparar o circuito integrado, HT7 foi imobilizado de forma covalente à superfície de um circuito integrado de sensor de GLC (Pro- teOn) com o uso das instruções de cada fabricante para a química de acoplamento de amina (~3000 unidades de resposta (RU). O tampão de acoplamento era 10 mM de acetato de sódio, pH 4,5. Após a imobilização de HT7 o PHF-tau foi injetado e capturado (~300 RU) por HT7. Após a captura, PHF-tau foi imobilizado de forma covalente ao circuito integra-do de sensor por ativação do circuito integrado com ouso das instruções de cada fabricante para química de acoplamento de amina. Os sítios reativos remanescente foram finalmente bloqueados por injeção de etano- lamina. Após a preparação e estabilização da superfície modificada por PHF-tau e superfície de referência (isento de antígeno), os anticorpos anti-PHF-tau foram diluídos no tampão de corrida e injetados na solução (0,1 a 75 nM em diluições de 5 vezes). A associação foi monitorada por 3 minutes (120 μl injetados em 40 μl/min). A disssociação foi monitorada por 10 ou 15 minutos. A regeneração da superfície de sensor foi obtida com 10 mM de Gly pH 2. Os dados foram ajustados com o uso de um modelo de ligação bivalente em que a afinidade intrínseca aparente foi relatada como a razão de koff-1/kon-1.

[00108] Com base nos experimentos de ProteOn PT1 ligou PHF-tau com afinidade de 322 pM e não mostrou ligação ao tau de controle sob as condições testadas (Tabela 2). PT3 ligou PHF-tau com afinidade de 18 ±2 pM e não mostrou ligação ao tau de controle em 4 de 5 medições sob as condições testadas. Uma dentre as 5 medições de ProteOn mostraram ligação fraca que poderia ser usada para estimar a afinidade> 75 nM com base na maior concentração de tau de controle usada.

[00109] Com a presente invenção tendo sido completamente descrita, será claro para o versado na técnica que muitas alterações e modificações podem ser feitas a ela sem se afastar do espírito e escopo das reivindicações em anexo.

Claims (7)

1. Anticorpo isolado que liga PHF-tau, caracterizado pelo fato de que compreende um sítio de ligação de antígeno de uma região variável de cadeia pesada (VH) de SEQ ID NO: 37 e um sítio de ligação de antígeno de uma região variável de cadeia leve (VL) de SEQ ID NO: 38.

2. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 1, ca-racterizado pelo fato de que o sítio de ligação de antígeno da VH compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 de SEQ ID NOs: 13, 14 e 15 ou SEQ ID NOs: 25, 26, e 27, respectivamente, e o sítio de ligação de an- tígeno da VL compreende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de SEQ ID NOs: 16, 17 e 18 ou SEQ ID NOs: 28, 29, e 30, respectivamente.

3. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é humanizado.

4. Polinucleotídeo isolado que codifica uma VH de anticorpo, caracterizado pelo fato de que compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 de SEQ ID NOs:13, 14 e 15, respectivamente, ou SEQ ID NOs: 25, 26, ou 27, respectivamente, em que o polinucleotídeo isolado compreende a SEQ ID NO: 33 ou uma sequência nucleotídica degenerada da mesma que codifica o anticorpo VH definido por compreender HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 13, 14 e 15, respectivamente, ou SEQ ID NOs: 25, 26, ou 27, respectivamente.

5. Polinucleotídeo isolado que codifica um anticorpo VL, ca-racterizado pelo fato de que compreende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de SEQ ID NOs:16, 17 e 18, respectivamente, ou SEQ ID NOs: 28, 29, e 30, respectivamente, em que o polinucleotídeo isolado compreende a SEQ ID NO: 34 ou uma sequência nucleotídica degenerada da mesma que codifica o anticorpo VL definido por compreender LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 16, 17 e 18, respectivamente, ou SEQ ID NOs: 28, 29, ou 30, respectivamente.

6. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo, como definido na reivindicação 4 e/ou 5.

7. Método de produção de um anticorpo que liga PHF-tau, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar a célula hospedeira, que compreende o polinucleotídeo isolado, como definido na reivindicação 4 e um vetor que compreende o polinucleotídeo isolado, como definido na reivindicação 5, e recuperar o anticorpo produzido pela célula hospedeira.

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