KR20140107493A

KR20140107493A - 항-phf-타우 항체 및 그의 용도

Info

Publication number: KR20140107493A
Application number: KR1020147019911A
Authority: KR
Inventors: 크리스토퍼 알더퍼; 다리우스 자네키; 슈송 리우; 멜리사 머독; 솅-지운 우; 마르크 메르켄; 마르크 판더메렌; 토마스 마리아
Original assignee: 얀센 바이오테크 인코포레이티드
Priority date: 2011-12-20
Filing date: 2012-12-19
Publication date: 2014-09-04
Also published as: CY1121862T1; PL2794654T3; US20150307600A1; CN107226863B; CN104024274B; EA027975B1; IL233051A0; US9745371B2; AU2012359039A1; GT201400127A; EA201491224A1; MY186066A; DK2794654T3; JP6695317B2; CO6980627A2; BR112014015323B1; MX2014007476A; WO2013096380A2; IL233051B; EP2794654B1

Abstract

항-PHF-타우 항체 및 그의 제조 및 사용 방법이 개시된다.

Description

항-PHF-타우 항체 및 그의 용도{ANTI-PHF-TAU ANTIBODIES AND THEIR USE}

본 출원은 2011년 12월 20일자로 출원된 미국 가출원 제61/577,817호의 이익을 주장하며, 그의 전체 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.

본 발명은 항- PHF-타우 항체, 및 그의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다.

임상적으로 알츠하이머병(AD: Alzheimer's Disease)은, 기억, 인지, 사고, 판단, 및 감정적 안정성의 점진적인 상실로 인하여 점진적으로 극심한 정신 황폐(mental deterioration) 및 궁극적으로 사망에까지 이르게 하는 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌 장애이다. AD는 노인의 진행성 정신 부전(치매)의 매우 보편적인 원인이며, 미국에서는 4번째로 가장 보편적인 의학적 사망 원인을 나타내는 것으로 여겨진다. AD는 전세계적 민족 군에서 관찰되었고, 현재 및 미래의 공중 보건상의 주요 문제를 나타낸다.

AD를 앓는 개체의 뇌에는 노인성(또는 아밀로이드) 플라크, 아밀로이드 혈관병증(혈관 내 아밀로이드 침착) 및 신경섬유 농축체(neurofibrillary tangle)로 명명되는 특징적인 병변이 나타난다. 다수의 이들 병변, 특히 쌍 나선형 필라멘트의 신경섬유 농축체 및 아밀로이드 플라크가 AD를 앓는 환자에서 기억 및 인지 기능에 중요한 인간 뇌의 몇몇 영역에서 일반적으로 발견된다.

AD 및 몇몇 다른 신경변성 질환에서 신경섬유 변성의 주요 단백질 구성요소는 미세소관 결합 단백질 타우의 과인산화 형태이다. 타우 응집을 예방하거나 제거하는 치료제의 개발은 여러 해 동안 관심의 대상이었으나, 항-응집 화합물 및 키나아제 저해제를 포함하는 후보 약물이 임상 시험에 막 진입했을 뿐이다(Brunden, et al. Nat Rev Drug Discov 8:783-93, 2009).

최근에는, 형질전환 타우 마우스 모델에서 타우에 대한 능동 및 수동 면역이 치료적 잠재력을 가질 수 있다는 전임상(preclinical) 증거가 산출되었다(Chai, et al. J Biol Chem 286:34457-67, 2011, Boutajangout, et al. J Neurochem 118:658-67, 2011, Boutajangout, et al. J Neurosci 30:16559-66, 2010, Asuni, et al. J Neurosci 27:9115-29, 2007). 타우병증 전파 및 확산 가설이 최근에 기재된 바 있으며, 이는 인간 뇌에서 타우병증 진행의 브락 단계(Braak stage) 및 전임상 타우 모델에서 타우 응집체 주사 후의 타우병증 확산을 기반으로 한다(Frost, et al. J Biol Chem 284:12845-52, 2009, Clavaguera, et al. Nat Cell Biol 11:909-13, 2009). 따라서, 타우 응집 및 타우병증 진행을 예방하여 AD 및 다른 신경변성 질환을 치료하는 치료제에 대한 필요성이 존재한다.

<도 1>
도 1은 다양한 항-타우 항체에 대한 표지된 AT8의 경쟁을 나타낸다.
<도 2>
도 2 는 다양한 항-타우 항체에 대한 표지된 PT1의 경쟁을 나타낸다.
<도 3>
도 3은 다양한 항-타우 항체에 대한 표지된 PT3의 경쟁을 나타낸다.
<도 4>
도 4는 다양한 항-타우 항체에 대한 표지된 AT100의 경쟁을 나타낸다.
<도 5>
도 5는 다양한 항-타우 항체에 대한 표지된 HT7의 경쟁을 나타낸다.
<도 6a>
도 6a는 도면에 표시된 바와 같이 식염수, 마우스 IgG1, PT3, 또는 AT8로 처리한 월령 5 개월의 자성 P301L 형질전환 동물, 또는 비-처리 비-형질전환 동물(B6)의 뇌간 균질액(분획 P1)에서의 인산화 타우의 분석이다. AT8(좌측 패널) 또는 AT100(우측 패널)을 포획 항체로 사용하고, 이어서 바이오틴화-HT7 및 아비딘-HRP를 사용하여 ELISA를 실행하였다. ELISA 신호는 비-형질전환 동물(B6)로부터의 평균 샘플과 동일한 ELISA 신호를 제공하는 AD 뇌 균질액의 상대량(ng/mL)으로서 플로팅되어 있다. 데이터는 평균 +/-S.D.와 함께 개별적으로 플로팅되어 있다. PT3- 및 IgG1-처리 동물 사이의 차이에 대한 p 값이 표시되어 있다. 도 6b는 AT100을 사용한, IgG1- 또는 PT3-처리 동물로부터의 뇌간 균질액 분획 P1의 웨스턴 블롯이다. IgG1(IgG1-1 내지 IgG1-10)로 처리한 10 마리의 동물 및 PT3(PT3-1, PT3-2, PT3-7 내지 PT3-10)으로 처리한 7 마리의 동물의 균질액으로부터의 신호를 나타낸다. 액틴을 로딩 대조군으로 사용하였다.
도 7은 도면에 표시된 바와 같이 PT3 또는 동종 대조군(IgG)으로 처리한 월령 5 개월의 자성 P301L 형질전환 마우스로부터 유래된 사르코실 가용성 피질 균질액 내의 총 타우(pT4 가용성), 불용성 피질 균질액 내의 총 타우(pT4 불용성), 및 불용성 피질 균질액 내의 인산화 타우(AT8 불용성)의 수준이다. 수준은 평균 +/- SD와 함께 개별적으로 플로팅된 ELISA로부터의 신호의 측정값으로서 나타낸다. 샘플 1m inj는 타우 응집체를 주입한 P301L 마우스 뇌로부터 유래된 양성 대조군 샘플이다.
(발명의 내용)
본 발명의 일 태양은 서열 번호 35 또는 37의 중쇄 가변 영역(VH)의 항원-결합 부위, 및 서열 번호 36 또는 38의 경쇄 가변 영역(VL)의 항원-결합 부위를 포함하는 PHF-타우에 결합하는 단리된 항체이다.
본 발명의 다른 태양은 소정의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 PHF-타우에 결합하는 단리된 항체이다.
본 발명의 다른 태양은 서열 번호 35의 VH의 항원-결합 부위 및 서열 번호 36의 VL의 항원-결합 부위를 포함하는 PHF-타우에 결합하는 단리된 항체이다.
본 발명의 다른 태양은 서열 번호 37의 VH의 항원-결합 부위 및 서열 번호 38의 VL의 항원-결합 부위를 포함하는 PHF-타우에 결합하는 단리된 항체이다.
본 발명의 다른 태양은, PHF-타우 결합에 대해 서열 번호 35의 VH의 항원-결합 부위 및 서열 번호 36의 VL의 항원-결합 부위, 또는 서열 번호 37의 VH의 항원-결합 부위 및 서열 번호 38의 VL의 항원-결합 부위를 포함하는 단클론 항체와 경쟁하는 단리된 항체 또는 단편이다.
본 발명의 다른 태양은 본 발명의 항체 또는 그의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드이다.
본 발명의 다른 태양은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터이다.
본 발명의 다른 태양은 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주 세포이다.
본 발명의 다른 태양은, 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 숙주 세포에 의해 생성된 항체를 회수하는 단계를 포함하는, PHF-타우에 결합하는 항체의 제조 방법이다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 넓은 의미에 있는 것을 의미하며, 다클론 항체, 쥐과, 인간, 인간-적응화된, 인간화된, 그리고 키메라 단클론 항체를 포함하는 단클론 항체 및 항체 단편을 포함하는 면역글로불린 또는 항체 분자를 포함한다.

일반적으로, 항체는 특정 항원에 대한 결합 특이성을 나타내는 단백질 또는 펩티드 사슬이다. 항체 구조는 주지되어 있다. 면역글로불린은 중쇄 불변 도메인 아미노산 서열에 따라, 5개의 주요 분류, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM으로 정해질 수 있다. IgA 및 IgG는 동종 IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4로서 추가로 하위-분류된다. 임의의 척추동물 종의 항체 경쇄는 그들의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 명확하게 별개인 2개의 유형, 즉 카파(κ) 및 람다(λ) 중 하나로 정해질 수 있다.

용어 "항체 단편"은 온전한 항체의 부분을 의미한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')₂, 및 Fv 단편, CDR, 항원-결합 부위, 중쇄 또는 경쇄 가변 영역, 이중항체(diabody), 단일쇄 항체 분자, 및 2개 이상의 온전한 항체 또는 그의 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.

면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 가변 영역은 "항원-결합 부위"가 개재된 "프레임워크" 영역으로 구성된다. 항원-결합 부위는 하기와 같이 다양한 용어를 사용하여 정의된다: (i) 상보성 결정 영역(CDR)은 서열 가변성을 기반으로 한다(Wu and Kabat J Exp Med 132:211-50, 1970). 일반적으로, 항원-결합 부위는 각각의 가변 영역(중쇄 가변 영역(VH) 내의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3, 및 경쇄 가변 영역(VL) 내의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3) 내에 3개의 CDR을 갖는다(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991). (ii) 용어 "과가변 영역(hypervariable region)", "HVR", 또는 "HV"는 초티아(Chothia) 및 레스크(Lesk)에 의해 정의된 바와 같이 구조상 과가변성인 항체 가변 도메인의 영역을 지칭한다(Chothia and Lesk J Mol Biol 196:901-17, 1987). 일반적으로, 항원-결합 부위는 각각의 VH(H1, H2, H3) 및 VL(L1, L2, L3) 내에 3개의 과가변 영역을 갖는다. 초티아 및 레스크는 구조적으로 보존된 HV를 "정준 구조(canonical structure)"라고 지칭한다. CDR 및 HV의 주석과 더불어 번호화 시스템이 아히난단(Abhinandan) 및 마틴(Martin)에 의해 최근에 개정되었다(Abhinandan and Martin Mol Immunol 45:3832-9, 2008). (iii) 항원-결합 부위를 형성하는 영역의 다른 정의가 르프랑(Lefranc)에 의해 면역글로불린 및 T-세포 수용체로부터의 V 도메인의 비교를 기반으로 하여 제안되었다(Lefranc, et al. Dev Comp Immunol 27:55-77, 2003). 국제 면역유전학(IMGT: International ImMunoGeneTics) 데이터베이스(http:/_/www_imgt_org)는 표준화된 번호화 및 이들 영역의 정의를 제공한다. CDR, HV 및 IMGT 기술 사이의 상응성은 문헌[Lefranc et al., supra]에 기재되어 있다. (iv) 항원-결합 부위는 또한, 특이성 결정 잔기 사용(SDRU: Specificity Determining Residue Usage)을 기반으로 하여 기술될 수 있으며(Almagro J Mol Recognit 17:132-43, 2004), 여기서 특이성 결정 잔기(SDR: Specificity Determining Residue)는 항원 접촉에 직접 참여하는 면역글로불린의 아미노산 잔기를 지칭한다.

"프레임워크" 또는 "프레임워크 서열"은 항원-결합 부위 서열인 것으로 정의된 것들 외에 항체의 가변 영역 내에 남아 있는 서열이다. 항원-결합 부위의 정확한 정의는 상기와 같이 다양한 기술에 의해 결정될 수 있으므로, 정확한 프레임워크 서열은 항원-결합 부위의 정의에 따라 달라진다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "단클론 항체"(mAb)는 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 얻어지는 항체(또는 항체 단편)를 의미한다. 단클론 항체는 고도로 특이적이며, 전형적으로 단일 항원성 결정기(antigenic determinant)를 지향한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "에피토프"는 항체가 특이적으로 결합하는 항원의 부분을 의미한다. 에피토프는 통상적으로 아미노산, 인산화 아미노산, 또는 다당류 측쇄와 같은 부분의 화학적으로 활성(예를 들어, 극성, 비극성, 또는 소수성)인 표면 그룹화(grouping)로 구성되며, 특이적인 3차원 구조 특징과 더불어 특이적인 전하 특징을 가질 수 있다. 에피토프는 천연에서 선형일 수 있거나, 불연속 에피토프, 예를 들어, 선형의 일련의 아미노산보다는 항원의 비-인접 아미노산들 사이의 공간 관계에 의해 형성되는 입체형태(conformational) 에피토프일 수 있다. 입체형태 에피토프는 항원의 폴딩(folding)으로부터 야기된 에피토프를 포함하며, 여기서 항원의 선형 서열의 상이한 부분으로부터의 아미노산은 3차원 공간에서 매우 근접하게 된다.

타우는 다수의 주지 동형(isoform)을 갖는 풍부한 중추신경계 및 말초신경계 단백질이다. 인간 CNS에는, 대안적 스플라이싱으로 인해 크기가 352 내지 441 범위인 6개의 주요 타우 동형이 존재한다(Hanger, et al. Trends Mol Med 15:112-9, 2009). 이들 동형은, 0 내지 2개의 N-말단 삽입 및 3개 또는 4개의 직렬로 배열된 미세소관-결합 반복의 포함의 조절로 서로 상이하며, 0N3R(서열 번호 1), 1N3R(서열 번호 2), 2N3R(서열 번호 3), 0N4R(서열 번호 4), 1N4R(서열 번호 5), 및 2N4R(서열 번호 6)이라고 지칭된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "대조군 타우"는 인산화 및 다른 번역 후 변형이 없는 서열 번호 6의 타우 동형을 지칭한다.

타우는 미세소관에 결합하며 세포를 통한 화물의 수송 (타우 인산화에 의해 제어될 수 있는 과정)을 조절한다. AD 및 관련 장애에서는 타우의 비정상적인 인산화가 만연하며, 피브릴로의 타우의 응집(쌍 나선형 필라멘트(PHF)라고 명명됨)에 선행하고/하거나 이를 촉발하는 것으로 생각된다. PHF의 주요 성분은 과인산화 타우이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "쌍 나선형 필라멘트-타우" 또는 "PHF-타우"는 쌍 나선형 필라멘트 내의 주지의 타우 응집체를 지칭한다. 전자 현미경법에서는 PHF 구조 내의 2개의 주요 영역, 퍼지 코트(fuzzy coat) 및 코어 필라멘트(core filament)가 뚜렷하며; 퍼지 코트는 단백질 분해에 민감하고 필라멘트의 외부에 위치하며, 필라멘트의 프로테아제 저항성 코어는 PHF의 골격을 형성한다(Wischik, et al. Proc Natl Acad Sci U S A 85:4884-8, 1988).

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "PHF-타우에 결합하는 항체"는, 웨스턴 블롯 상에서 평가되는 바와 같이 PHF-타우에 결합하는 항체를 지칭한다. 전형적으로, PHF-타우에 결합하는 항체를, 5%(w/v) 탈지 분유(NFDM: nonfat dry milk) TBS-T, 0.05% 트윈(Tween)-20 중에 1 시간 블로킹한 후, 약 500 ng의 PHF-타우의 쿠마시 염색(Coomassie stain) 후에 평가할 수 있다. PHF-타우에 결합하는 항체는, PHF-타우 에피토프에 대한 선호도를 갖지 않는 타우 항체(예를 들어, 항체 HT7(일리노이주 록포드 소재의 써모사이언티픽(ThermoScientific))에 의해 대조군 타우 및 PHF-타우 양자 모두가 동일하게 검출되는 항원 로딩 조건 하에 시험할 경우에 웨스턴 블롯에 의해 측정되는 바와 같이 임의로 대조군 타우(서열 번호 6)에 결합하지 않는다(Mercken, et al. J Neurochem 58:548-53, 1992). 이러한 예시적인 항원 로딩 조건은 500 ng PHF-타우 및 200 ng 대조군 타우이다.

관용적인 주지의 1-문자 및 3-문자 아미노산 코드를 본 명세서에 사용한다.

대상 조성물

본 발명은 항-PHF-타우 항체 및 이러한 항체의 용도에 관한 것이다. 이러한 항-PHF-타우 항체는 PHF-타우 상의 인산화 에피토프에 결합하는 특성 또는 PHF-타우 상의 비-인산화 에피토프에 결합하는 특성을 가질 수 있다. 항-PHF-타우 항체는 치료제로서, 그리고 생물학적 샘플 내의(예를 들어, 조직 또는 세포 내의) PHF- 타우를 검출하기 위한 연구 시약 또는 진단 시약으로서 유용할 수 있다.

본 발명의 일 실시 형태는 서열 번호 35 또는 37의 중쇄 가변 영역(VH)의 항원-결합 부위, 또는 서열 번호 36 또는 38의 경쇄 가변 영역(VL)의 항원-결합 부위를 포함하는 PHF-타우에 결합하는 단리된 항체이다. 표 1은, 카바트(Kabat) 또는 초티아에 따라 정의된 본 발명의 예시적인 항체의 항원-결합 부위 잔기와 더불어 예시적인 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 나타낸다.

다른 실시 형태에서, 본 발명의 항체의 VH의 항원-결합 부위는 각각 서열 번호 7, 8, 및 9, 또는 13, 14, 및 15의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1(HCDR1), 2(HCDR2), 및 3(HCDR3)을 포함하거나, 본 발명의 항체의 VL의 항원-결합 부위는 각각 서열 번호 10, 11, 및 12, 또는 16, 17, 및 18의 경쇄 CDR 1(LCDR1), 2(LCDR2), 및 3(LCDR3)을 포함한다.

본 발명의 다른 실시 형태는 서열 번호 35 또는 37의 중쇄 가변 영역(VH)의 항원-결합 부위, 및 서열 번호 36 또는 38의 경쇄 가변 영역(VL)의 항원-결합 부위를 포함하는 PHF-타우에 결합하는 단리된 항체이다.

다른 실시 형태에서, 본 발명의 항체의 VH의 항원-결합 부위는 각각 서열 번호 7, 8, 및 9, 또는 13, 14, 및 15의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1(HCDR1), 2(HCDR2), 및 3(HCDR3)을 포함하고, 본 발명의 항체의 VL의 항원-결합 부위는 각각 서열 번호 10, 11, 및 12, 또는 16, 17, 및 18의 경쇄 CDR 1(LCDR1), 2(LCDR2), 및 3(LCDR3)을 포함한다.

실시예에 예시된 실시 형태가 중쇄로부터 하나, 그리고 경쇄로부터 하나의 가변 영역의 쌍을 포함할지라도, 숙련자는 대안적인 실시 형태가 단일의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있음을 인식할 것이다. 단일의 가변 영역을 사용하여, 예를 들어, PHF-타우에 결합할 수 있는 2-도메인 특이적 항원-결합 단편을 형성할 수 있는 가변 도메인에 대해 스크리닝할 수 있다. 스크리닝은 예를 들어, PCT 공보 제 WO92/01047호에 기재된 계층적 이중 조합 접근법을 사용하여, 파지 디스플레이 스크리닝 방법에 의해 달성될 수 있다. 이러한 접근법에서는, H 또는 L 쇄 클론 중 하나를 함유하는 개별적인 콜로니를 사용하여, 다른 쇄(L 또는 H)를 암호화하는 클론의 완전한 라이브러리를 감염시키고, 생성되는 2-쇄 특이적 항원-결합 도메인을 기재된 바와 같이 파지 디스플레이 기술에 따라 선택한다.

본 발명의 다른 실시 형태는 서열 번호 35의 중쇄 가변 영역(VH)의 항원-결합 부위 및 서열 번호 36의 경쇄 가변 영역(VL)의 항원-결합 부위를 포함하는 PHF-타우에 결합하는 단리된 항체이다.

본 발명의 다른 실시 형태는 서열 번호 37의 중쇄 가변 영역(VH)의 항원-결합 부위 및 서열 번호 38의 경쇄 가변 영역(VL)의 항원-결합 부위를 포함하는 PHF-타우에 결합하는 단리된 항체이다.

본 발명의 다른 실시 형태는 각각 서열 번호 7, 8, 및 9의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1(HCDR1), 2(HCDR2), 및 3(HCDR3), 및 각각 서열 번호 10, 11, 및 12의 경쇄 CDR 1(LCDR1), 2(LCDR2), 및 3(LCDR3)을 포함하는 PHF-타우에 결합하는 단리된 항체이다.

본 발명의 다른 실시 형태는 각각 서열 번호 13, 14, 및 15의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1(HCDR1), 2(HCDR2), 및 3(HCDR3), 및 각각 서열 번호 16, 17, 및 18의 경쇄 CDR 1(LCDR1), 2(LCDR2), 및 3(LCDR3)을 포함하는 PHF-타우에 결합하는 단리된 항체이다.

전기의 실시 형태 중 어느 하나에서, PHF-타우에 결합하는 단리된 항체는 인간화될 수 있다.

본 발명의 항체는, 다양한 기술, 예를 들어, 하이브리도마 방법(Kohler and Milstein Nature 256:495-7, 1975)에 의해 생성될 수 있다. 수용자 항체(전형적으로 인간과 같은 다른 포유류 종)로부터 유래된 경쇄 및 중쇄 불변 영역과 회합된 공여자 항체(전형적으로 쥐과)로부터 유래된 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 함유하는 키메라 mAb는 미국 특허 제4,816,567호에 개시된 방법에 의해 제조될 수 있다. 비-인간 공여자 면역글로불린(전형적으로 쥐과)으로부터 유래된 CDR 및 하나 이상의 인간 면역글로불린으로부터 유래된 분자의 나머지 면역글로불린-유래 부분을 갖는 CDR-이식 mAb는 미국 특허 제5,225,539호에 개시된 것과 같은 당업자에게 공지된 기술에 의해 제조될 수 있다. 임의의 비-인간 서열이 결여된 완전한 인간 mAb는 문헌[Lonberg, et al. Nature 368:856-9, 1994, Fishwild, et al. Nat Biotechnol 14:845-51, 1996, Mendez, et al. Nat Genet 15:146-56, 1997]에 언급된 기술에 의해 인간 면역글로불린 형질전환 마우스로부터 제조될 수 있다. 인간 mAb는 또한, 파지 디스플레이 라이브러리로부터 제조하고 최적화할 수 있다(Knappik, et al. J Mol Biol 296:57-86, 2000, Krebs, et al. J Immunol Methods 254:67-84, 2001, Shi, et al. J Mol Biol 397:385-96, 2010).

특이성 결정 잔기 재표면화(SDRR: specificity determining residues resurfacing)(미국 공개 제2010/0261620호), 재표면화(Padlan et al. Mol. Immunol. 28:489-98, 1991), 수퍼 인간화(국제 특허 공개 제WO04/006955호), 및 인간 스트링 함량 최적화(human string content optimization)(미국 특허 제7,657,380호)와 같은 주지의 방법을 사용하여 항체 인간화를 수행할 수 있다. 이식/인간화에 유용한 인간 프레임워크 서열은 당업자에 의해 적절한 데이터베이스로부터 선택될 수 있다. 선택된 프레임워크를 추가로 변형시켜 문헌[Queen, et al. Proc Natl Acad Sci USA 86:10029-33, 1989] 또는 미국 공개 제2011/0092372호에 개시된 것들과 같은 기술에 의해 결합 친화도를 보존 또는 증진할 수 있다.

파지 디스플레이 라이브러리로부터의 항체 단리 또는 면역화를 위해 항원으로 사용될 PHF-타우의 제조는 임의의 적합한 기술을 사용하여 실행할 수 있다. 예시적인 방법에서, PHF-타우는 문헌[Greenberg and Davies Proc Natl Acad Sci U S A 87:5827-31, 1990]에 기재된 것과 같은 주지의 프로토콜을 사용하여 AD를 가진 환자의 뇌로부터 단리된다. PHF-타우는 알츠하이머 환자의 사후 피질로부터 단리될 수 있다. PHF-타우와 반응하는 것으로 공지된 항체를 이용하여, 단리된 PHF-타우를 그의 순도 및 과인산화 상태에 대해 특성화한다. 전형적인 PHF-타우 제제에서는, 웨스턴 블롯에서 약 60, 64, 68, 및 72 kDa으로 이동하는 과인산화 밴드(Spillantini and Goedert Trends Neurosci 21:428-33, 1998)가, 과인산화 PHF-타우에는 특이적으로 결합하지만 탈인산화 PHF-타우에는 결합하지 않는 AT8 항체에 의해 검출된다.

본 발명의 항체는 서열 번호 6의 대조군 타우에 결합하지 않는 특징을 가질 수 있다. 상기 방법을 사용하고 상기와 같은 웨스턴 블롯 후의 쿠마시 염색에서 대조군 타우에 대한 항체의 결합의 결여에 대해 항체를 시험하여 이러한 항체를 생성시킬 수 있다. 표준 방법을 사용하여 대조군 타우를 재조합 발현시키고 정제할 수 있다. PHF-타우에는 결합하지만 대조군 타우에는 결합하지 않는 예시적인 항체는 항체 PT1 및 PT3이다. 예를 들어, 대조군 및 AD 뇌 절편 상의 면역조직화학 검사를 사용하여 본 발명의 항체를 그들의 특이성에 대해 추가로 평가할 수 있다.

본 발명의 항체는 약 10^-7, 10^-8, 10^-9, 10^-10, 10^-11, 또는 10^-12 M 이하의 해리 상수(K_D)를 동반하여 PHF-타우에 대한 친화도를 가질 수 있다. 주어진 분자의 PHF-타우에 대한 친화도는 임의의 적합한 방법을 사용하여 실험적으로 결정할 수 있다. 이러한 방법은 바이아코어(Biacore), 프로테온(ProteOn), 또는 킨엑사(KinExA) 기기, ELISA 또는 당업자에게 공지된 경쟁적 결합 분석을 이용할 수 있다.

본 발명의 다른 태양은 PHF-타우 결합에 대해 서열 번호 35의 중쇄 가변 영역(VH)의 항원-결합 부위 및 서열 번호 36의 경쇄 가변 영역(VL)의 항원-결합 부위, 또는 서열 번호 37의 중쇄 가변 영역(VH)의 항원-결합 부위 및 서열 번호 38의 경쇄 가변 영역(VL)의 항원-결합 부위를 포함하는 단클론 항체와 경쟁하는 단리된 항체 또는 단편이다.

PHF-타우에 대한 결합 사이의 경쟁은 주지의 방법을 사용하여 시험관내에서 분석할 수 있다. 예를 들어, 면역분석 후의 전기화학발광 검출을 사용하여, 표지되지 않은 항체의 존재 하에 MSD 설포-태그(Sulfo-Tag)(상표) NHS-에스테르-표지된 항체의 PHF-타우에 대한 결합을 평가할 수 있다.

경쟁적 결합에 부가하여 몇몇 주지의 방법론을 채용하여 본 발명의 항체의 결합 에피토프를 결정할 수 있다. 예를 들어, 개별 성분 둘 모두의 구조가 알려져 있는 경우에, 컴퓨터 모의실험(in silico) 단백질-단백질 도킹(docking)을 수행하여, 양립할 수 있는 상호작용의 부위를 동정할 수 있다. 항원 및 항체 복합체를 사용하여 수소-중수소(H/D) 교환을 수행하여, 항체에 의해 결합될 수 있는 항원 상의 영역을 맵핑(map)할 수 있다. 항원의 세그먼트 및 점 돌연변이생성을 사용하여, 항체 결합에 중요한 아미노산의 위치를 찾을 수 있다. 항체-항원 복합체의 공동-결정 구조를 사용하여, 에피토프 및 파라토프에 기여하는 잔기를 동정한다.

본 발명의 항체는 IgG, IgD, IgA, 또는 IgM 동종의 단클론 항체일 수 있다. 본 발명의 항체는 이중특이적 또는 다중특이적일 수 있다. 예시적인 이중특이적 항체는 PHF-타우 상의 별개의 2개 에피토프에 결합할 수 있거나 PHF-타우 및 아밀로이드 베타(Aβ)에δ결합할δ수δ있다. 다른 예시적인 이중특이적 항체는 PHF-타우 및 내인성 혈액-뇌 장벽 트랜스사이토시스(transcytosis) 수용체, 예를 들어, 인슐린 수용체, 트랜스페링 수용체(transferring receptor), 인슐린-유사 성장 인자-1 수용체, 및 지단백 수용체에 결합할 수 있다. 예시적인 항체는 IgG1 유형의 것이다.

당업자에게 공지된 기술에 의한 Fc 변형을 통해 본 발명의 항체의 면역 효과 특성을 증진하거나 억제할 수 있다. 이들 활성을 담당하는 Fc 내의 잔기를 변형시킴으로써, 예를 들어, C1q 결합, 보체 의존성 세포독성(CDC: complement dependent cytotoxicity), 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC: antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity), 식작용, 세포 표면 수용체의 하향 조절(예를 들어, B 세포 수용체(BCR: B cell receptor) 등과 같은 Fc 효과 작용을 제공하고/하거나 제어할 수 있다. 항체 반감기를 연장하는 Fc 도메인 내의 잔기를 돌연변이시킴으로써 약물 동태학적 특성 또한 증진될 수 있을 것이다(Strohl Curr Opin Biotechnol 20:685-91, 2009).

부가적으로, 본 발명의 항체는 글리코실화, 이성체화, 탈글리코실화(deglycosylation), 또는 비-자연 발생 공유적 변형, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 부분의 첨가(페길화(pegylation)) 및 지질화와 같은 과정에 의해 번역-후 변형될 수 있다. 이들 변형은 생체 내에서 또는 시험관 내에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 폴리에틸렌 글리콜에 접합되어(페길화(PEGylated)), 이들의 약동학적 프로파일을 개선시킬 수 있다. 접합은 당업자에게 알려져 있는 기술에 의해 수행될 수 있다. 치료 항체와 PEG의 접합은 작용을 방해하지 않으면서 약물 동력학 특성을 증진하는 것으로 나타났다(Knight, et al. Platelets 15:409-18, 2004, Leong, et al. Cytokine 16:106-19, 2001, Yang, et al. Protein Eng 16:761-70, 2003).

본 발명의 다른 실시 형태는 본 발명의 항체 또는 그의 보체, 또는 그의 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드이다. 예시적인 단리된 폴리뉴클레오티드는 각각 서열 번호 7, 8, 및 9, 또는 13, 14, 및 15에 나타낸 면역글로불린 중쇄 CDR HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 폴리펩티드, 또는 각각 서열 번호 10, 11, 및 12, 또는 16, 17, 및 18에 나타낸 면역글로불린 경쇄 CDR LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 본 발명의 항체 가변 영역을 암호화하는, 서열 번호 31 내지 34에 나타낸 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드이다. 주어진 발현 시스템 내에서 유전자 코드의 축퇴성 또는 코돈 선호도를 고려하여 본 발명의 항체를 암호화하는 다른 폴리뉴클레오티드 또한 본 발명의 범주 내에 있다. 본 발명의 단리된 핵산은 주지의 재조합 기술 또는 합성 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 단클론 항체를 암호화하는 DNA는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 용이하게 단리되고 서열분석된다. 하이브리도마가 생성될 경우, 그러한 세포는 그러한 DNA의 공급원으로서의 역할을 할 수 있다. 대안적으로, 코딩 서열 및 번역 생성물이 연결된 디스플레이 기술, 예를 들어, 파지 또는 리보솜 디스플레이 라이브러리를 사용하면, 바인더 및 핵산의 선발은 단순화된다. 파지 선발 후, 파지로부터의 항체 코딩 영역을 단리하고 이를 사용하여 인간 항체 또는 임의의 다른 원하는 항원 결합 단편을 포함하는 전 항체를 생성하고, 포유류 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모 및 박테리아를 포함하는 임의의 원하는 숙주에서 발현시킬 수 있다.

본 발명의 다른 실시 형태는 본 발명의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터이다. 이러한 벡터는 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 트랜스포존(transposon) 기반의 벡터, 또는 임의의 수단에 의해 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 주어진 유기체 또는 유전자 백그라운드(genetic bac㎏round) 내로 도입하기에 적합한 임의의 다른 벡터일 수 있다.

본 발명의 다른 실시 형태는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것을 포함하는 숙주 세포이다. 이들 숙주 세포는 진핵 세포, 박테리아 세포, 식물 세포 또는 고세균(archeal) 세포일 수 있다. 예시적인 진핵 세포는 포유류, 곤충, 조류 또는 다른 동물 기원의 것일 수 있다. 포유류 진핵 세포는 불멸화 세포주, 예를 들어, 하이브리도마 또는 골수종 세포주, 예를 들어, SP2/0(버지니아주 머내서스 소재의 ATCC(American Type Culture Collection), CRL-1581), NS0(영국 윌트셔 살리스버리 소재의 ECACC(European Collection of Cell Cultures), ECACC No. 85110503), FO(ATCC CRL-1646), 및 Ag653(ATCC CRL-1580) 쥐과 세포주를 포함한다. 예시적인 인간 골수종 세포주는 U266(ATTC CRL-TIB-196)이다. 다른 유용한 세포주는, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 예를 들어, CHO-K1SV(론자 바이올로직스(Lonza Biologics)), CHO-K1(ATCC CRL-61, 인비트로젠(Invitrogen)), 또는 DG44로부터 유래된 것들을 포함한다.

본 발명의 다른 실시 형태는, 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 숙주 세포에 의해 생성된 항체를 회수하는 단계를 포함하는, PHF-타우에 결합하는 항체의 제조 방법이다. 항체의 제조방법 및 이들의 정제방법은 해당 분야에 잘 알려져 있다.

치료 방법

Fab, (Fab')2, scFv 단편을 포함하는, 본 발명의 항-PHF-타우 항체 또는 그의 단편, 또는 본 발명의 항체의 항원-결합 부위를 포함하는 항체를 사용하여, 뇌 내에 타우의 병리학적 응집을 수반하는 신경변성 질환을 가진 환자, 예를 들어, AD 또는 임의의 다른 타우병증을 앓는 환자에서 증상을 치료하거나, 감소시키거나, 예방할 수 있다. 임의의 특정 이론에 구애되고자 하는 것은 아니나, 본 발명의 항체는 병리학적 타우 응집 및 이에 의한 뇌 내의 PHF-타우의 양을 감소시킴으로써 그들의 유익한 효과를 발휘할 수 있다. 본 발명의 항체는 임의의 분류에 속하는 동물 환자를 치료하기 위해 사용할 수 있다. 이들 동물의 예에는 포유류, 예를 들어, 인간, 설치류, 개, 고양이 및 가축이 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 AD의 치료를 위한 의약품의 제조에 유용하며, 여기서 의약품은 본 명세서에 정의된 투여량으로 투여하기 위해 제조된다.

본 발명의 다른 실시 형태는, 본 발명의 단리된 항체의 치료적 유효량을 타우의 응집을 감소시키기에 충분한 시간 동안 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 환자에서 타우의 응집을 감소시키는 방법이다.

본 발명의 다른 실시 형태는, 본 발명의 단리된 항체의 치료적 유효량을 신경변성 질환의 증상을 치료하거나 감소시키기에 충분한 시간 동안 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 타우의 응집을 수반하는 신경변성 질환의 증상을 치료하거나 감소시키는 방법이다.

상기 실시 형태 중 어느 하나에서, 타우의 응집을 수반하는 신경변성 질환은 타우병증이다.

상기 실시 형태 중 어느 하나에서, 단리된 항체는 서열 번호 35의 VH의 항원-결합 부위 및 서열 번호 36의 VL의 항원-결합 부위를 포함하는 PHF-타우에 결합하는 항체를 포함한다.

상기 실시 형태 중 어느 하나에서, 단리된 항체는 서열 번호 37의 VH의 항원-결합 부위 및 서열 번호 38의 VL의 항원-결합 부위를 포함하는 PHF-타우에 결합하는 항체를 포함한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "타우병증"은 뇌 내에 타우의 병리학적 응집을 수반하는 임의의 신경변성 질환을 포괄한다. 가족성 및 산발성 AD에 부가하여, 다른 예시적인 타우병증은 17번 염색체와 연관된 파킨슨병을 동반하는 전측두엽 치매(FTDP-17), 진행성 상핵 마비, 피질기저핵 변성, 픽병(Pick's disease), 진행성 피질하 신경교증, 농축체 단독 치매(tangle only dementia), 석회화를 동반하는 광범위 신경섬유 농축체(diffuse neurofibrillary tangles with calcification), 은친화 입자 치매(argyrophilic grain dementia), 근위축성 측삭경화증 파킨슨병-치매 복합군, 다운 증후군, 게르스트만-슈투로이슬러-샤잉커병(Gerstmann-

-Scheinker disease), 할러포르텐-스파츠병(Hallervorden-Spatz disease), 봉입체 근염, 크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeld-Jakob disease), 다계통 위축증, 니만-픽병 유형 C(Niemann-Pick disease type C), 프리온 단백질 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 아급성 경화성 범뇌염, 근긴장성 이영양증, 신경섬유 농축체를 동반하는 비-구아나미안(non-guanamian) 운동신경세포병, 뇌염후 파킨슨병, 및 만성 외상성 뇌병증, 예를 들어, 권투선수 치매(복싱병)이다.(Morris, et al. Neuron 70:410-26, 2011).

타우병증-관련 행동적 표현형은 인지 장애, 조기 인격 변조 및 탈억제, 감정둔마(apathy), 의지결여증(abulia), 무언증, 행위상실증, 보속증(perseveration), 상동성 운동/행동, 과잉구강증(hyperorality), 부조화, 순차적 임무의 계획 또는 체계화 불능, 이기심/무감각, 반사회적 특성, 공감 결여, 말더듬기(halting), 빈번한 착어증 오류를 동반하는 비문법적 담화(그러나 상대적으로 보존된 이해력), 손상된 이해력 및 단어 찾기 장애, 서서히 진행하는 보행 불안정성, 후방돌진, 동결, 자주 넘어짐, 비-레보도파 반응성 체간 강직(non-levodopa responsive axial rigidity), 상핵 주시 마비, 사각파 단수축, 느린 수직 단속성 안구운동(slow vertical saccade), 가성 연수 마비, 사지 실행증, 근육 긴장이상, 피질성 감각상실, 및 진전증을 포함한다.

치료에 순응적인 환자는 AD 또는 다른 타우병증의 위험이 있는 무증상의 개체와 더불어 현재 증상을 나타내는 환자를 포함한다. 치료에 순응적인 환자는 공지된 AD의 유전적 위험, 예를 들어, AD의 가족력 또는 게놈 내의 유전적 위험 인자의 존재를 가진 개체를 포함한다. 예시적인 위험 인자는 아밀로이드 전구체 단백질(APP: amyloid precursor protein) 내의, 특히 위치 717 및 위치 670 및 671에서의 돌연변이이다(각각 하디(Hardy) 및 스웨디시(Swedish) 돌연변이). 다른 위험 인자는 프레세닐린 유전자, PS1 및 PS2, 및 ApoE4 내의 돌연변이, 고콜레스테롤혈증 또는 죽상 동맥경화증의 가족력이다. 상기 위험 인자의 존재에 의해 현재 AD를 앓고 있는 개체를 특징적인 치매로부터 인식할 수 있다. 부가적으로, AD를 가진 개체를 동정하기 위한 다수의 진단 시험이 이용가능하다. 이들은 뇌척수액 타우 및 Aβ42 수준의 측정을 포함한다. 상승된 타우 및 감소된 Aβ42 수준은 AD의 존재를 의미한다. AD를 앓는 개체는 또한 AD 및 관련 장애 협회(AD and Related Disorders Association) 기준에 의해 진단될 수 있다.

투여/약제학적 조성물

본 발명의 항-PHF-타우 항체는, 타우의 병리학적 응집을 수반하는 신경변성 질환, 예를 들어, AD 또는 다른 타우병증의 치료 또는 예방을 위한 치료제 및 예방제 양자 모두로서 적합하다. 무증상 환자에서는, 임의의 연령(예를 들어, 약 10, 15, 20, 25, 30세)에서 치료를 시작할 수 있다. 그러나 통상적으로는, 환자가 약 40, 50, 60, 또는 70세에 도달할 때까지 치료를 시작하는 것이 필요하지 않다. 통상적으로 치료는 소정 기간에 걸쳐 다중 투여량을 수반한다. 시간의 흐름에 따라 항체, 또는 치료제에 대한 활성화된 T-세포 또는 B-세포 반응을 분석함으로써 치료를 모니터할 수 있다. 반응이 하락할 경우, 부스터 투여량이 필요하다.

예방적 응용에서는, 질환의 생화학적, 조직학적, 및/또는 행동 증상, 질환의 전개 중에 나타나는 그의 합병증 및 중간 병리학적 표현형을 포함하여, 질환의 위험을 제거 또는 감소시키거나, 중증도를 경감시키거나, 발단을 지연시키기에 충분한 양으로 약제학적 조성물 또는 의약품을 AD에 취약하거나 그 밖에 AD의 위험이 있는 환자에게 투여한다. 치료적 응용에서는, 질환의 증상 중 임의의 것(생화학적, 조직학적, 및/또는 행동)을 감소시키거나, 정지시키거나, 지연시키기에 충분한 양으로 조성물 또는 의약품을 이러한 질환이 의심되거나 이러한 질환을 이미 앓고 있는 환자에게 투여한다. 치료제의 투여는 특징적인 알츠하이머 병리현상이 아직 전개되지 않은 환자에서 경도 인지 장애를 감소시키거나 제거할 수 있다. 치료적 처치 또는 예방적 치료를 수행하기에 적절한 양은 치료적 유효 용량 또는 예방적 유효 용량으로서 정의된다. 예방 체계 및 치료 체계 양자 모두에서, 통상적으로 조성물 또는 의약품은 충분한 면역 반응이 달성될 때까지 몇몇 투여량으로 투여된다.

본 발명의 항- PHF-타우 항체 또는 그의 단편을 관련 신경변성 질환의 치료에 효과적인 다른 약제와 조합하여 투여할 수 있다. AD의 경우, 본 발명의 항체를 아밀로이드-베타(Aβ)의 침착을 감소시키거나 예방하는 약제와 조합하여 투여할 수 있다. PHF-타우 및 Aβ 병리현상은 상승적일 가능성이 있다. 그러므로, PHF-타우 및 Aβ 및 Aβ-관련 병리현상 양자 모두의 제거를 동시에 목표로 하는 병합 요법이 각각을 개별적으로 목표로 하는 것보다 더 효과적일 수 있다.

파킨슨병 및 관련 신경변성 질환의 경우, α-시누클레인 단백질의 응집된 형태를 제거하기 위한 면역 제어 또한 신형 요법이다. 타우 및 α-시누클레인 단백질 양자 모두의 제거를 동시에 목표로 하는 병합 요법은 각각의 단백질을 개별적으로 목표로 하는 것보다 더 효과적일 수 있다.

본 발명의 방법에서, 타우병증의 치료 또는 증상의 개선에 있어서 항체의 "치료적 유효량"은 표준 연구 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 당업계에 주지된 적절한 동물 모델에 약제를 투여함으로써 항체의 투여량을 결정할 수 있다.

또한, 시험관 내 분석을 임의로 사용하여, 최적의 투여량 범위를 동정하는 것을 도울 수 있다. 유효한 특정 투여량의 선택은 몇몇 인자의 고려사항에 기초하여, 당업자에 의해 결정될 수 있다.(예를 들어, 임상 시험을 통해). 이러한 인자는 치료 또는 예방되는 질환, 수반 증후, 환자의 체중, 환자의 면역 상태 및 당업자가 알고 있는 다른 인자를 포함한다. 제제에 사용되는 정확한 용량은 또한 투여 경로, 및 질환의 중증도에 좌우될 것이며, 전문의의 판단 및 각 환자의 상황에 따라 결정되어야 한다. 유효 용량은 시험관내 또는 동물 모델 검사 시스템으로부터 유래하는 용량-반응 곡선으로부터 추정될 수 있다.

본 발명의 항체의 치료적 용도를 위한 투여 방식은 약제를 숙주에게 전달하는 임의의 적합한 경로일 수 있다. 이들 항체의 약제학적 조성물은 비경구 투여(예를 들어, 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비강내, 또는 두개강내)에 유용하거나, 그들을 뇌 또는 척추의 뇌척수액 내로 투여할 수 있다.

본 발명의 항체는 약제학적으로 허용가능한 담체 중에 활성 성분으로서 항체의 유효량을 함유하는 약제학적 조성물로서 제조될 수 있다. 용어 "담체"는, 그와 함께 항체가 투여되는 희석제, 보조제, 부형제, 또는 비히클을 지칭한다. 이러한 약제학적 비히클은 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 것들, 예를 들어, 피넛유, 대두유, 광물유, 참기름 등을 포함하는 물 및 오일과 같은 액체일 수 있다. 예를 들어, 0.4% 식염수 및 0.3% 글리신을 사용할 수 있다. 이들 용액은 무균성이고 일반적으로 입자상 물질이 없다. 이들은 통상적인 잘 알려져 있는 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있다(예를 들어, 여과). 조성물은 pH 조절제 및 완충제, 안정화제, 농후제, 윤활제, 및 착색제 등과 같은, 생리학적 조건에 근접시키기 위해 필요한 약제학적으로 허용가능한 보조 물질을 함유할 수 있다. 이러한 약제학적 제형에서 본 발명의 항체의 농도는 광범위하게, 즉, 약 0.5 중량% 미만으로부터, 통상적으로는 약 1 중량% 이상 내지 15 또는 20 중량% 만큼까지로 변동될 수 있으며, 선택된 특정 투여 방식에 따라, 필요한 용량, 유체 부피, 점도 등을 기반으로 하여 주로 선택될 것이다.

치료는 단일 용량 스케줄로, 또는 다중 용량 스케줄로 주어질 수 있으며, 다중 용량 스케줄에서는 치료의 1차 코스는 1 내지 10개의 별도 용량을 동반할 수 있고, 이어서 반응을 유지하고/하거나 강화하기 위해 필요한 후속 시간 간격에, 예를 들어, 제2 용량을 위해 1 내지 4 개월에 다른 용량이 주어지며, 필요한 경우에는, 몇 개월 후에 후속 용량(들)이 주어진다. 적합한 치료 스케줄의 예는 (i) 0, 1개월 및 6개월, (ii) 0, 7일 및 1개월, (iii) 0 및 1개월, (iv) 0 및 6개월, 또는 질환 징후를 감소시키거나 질환의 중증도를 감소시킬 것으로 예상되는 바람직한 반응을 유도하기에 충분한 다른 스케줄을 포함한다.

따라서 근육내 주사를 위한 본 발명의 약제학적 조성물은 1 mL의 멸균 완충수 및 약 1 ng 내지 약 100 mg, 약 50 ng 내지 약 30 mg, 또는 약 5 mg 내지 약 25 mg의 본 발명의 항체를 함유하도록 제조될 수 있을 것이다. 마찬가지로, 정맥내 주입을 위한 본 발명의 약제학적 조성물은 약 250 mL의 멸균 링거 용액 및 약 1 mg 내지 약 30 mg 또는 약 5 mg 내지 약 25 mg의 본 발명의 항체를 함유하도록 구성될 수 있을 것이다. 비경구적으로 투여할 수 있는 조성물을 제조하기 위한 실제의 방법은 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌["Remington's Pharmaceutical Science", 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA]에 더욱 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 항체는 보관을 위해 동결건조되고, 사용 전에 적합한 담체 중에 재구성될 수 있다. 이 기술은 항체 및 다른 단백질 제제에 효과적인 것으로 나타났으며, 당업계에 공지된 동결건조 및 재구성 기술을 채용할 수 있다.

진단 방법 및 키트

대상에서 AD 또는 다른 타우병증을 진단하는 방법에 본 발명의 항체를 사용할 수 있다. 본 방법은, 본 발명의 항체 또는 그의 단편과 같은 진단 시약을 사용하여 대상에서 PHF-타우의 존재를 검출하는 단계를 수반한다.

생물학적 샘플을 진단 항체 시약과 접촉시키는 단계, 및 대상으로부터의 샘플 내의 PHF-타우에 대한 진단 항체 시약의 결합을 검출하는 단계에 의해, 대상으로부터의 생물학적 샘플(예를 들어, 혈액, 소변, 뇌척수액) 내에서 PHF-타우를 검출할 수 있다. 검출을 실행하기 위한 분석은 ELISA, 면역조직화학 검사, 웨스턴 블롯, 또는 생체내 영상화(in vivo imaging)와 같은 주지의 방법을 포함한다. 예시적인 진단 항체는 본 발명의 항체 PT1 및 PT3이며, IgG1,κ 유형의 것들이다.

진단 항체 또는 유사한 시약을 정맥내 주사에 의해 환자의 체내로 투여하거나, 상기 예시된 바와 같이 숙주에게 약제를 전달하는 임의의 적합한 경로에 의해 뇌 내로 직접 투여할 수 있다. 항체의 투여량은 치료 방법에 대한 것과 동일한 범위 이내여야 한다. 일부 방법에서는 PHF-타우에 대한 친화도를 가진 1차 항체는 표지되지 않고 1차 항체에 결합시키기 위해 2차 표지제(labeling agent)가 사용되지만, 전형적으로는, 항체는 표지된다. 표지의 선택은 검출 수단에 따라 달라진다. 예를 들어, 광학적 검출에는 형광 표지가 적합하다. 외과적 중재가 없는 단층 촬영 검출을 위해서는 상자성 표지(paramagnetic label)의 사용이 적합하다. PET 또는 SPECT를 사용하여 방사성 표지 또한 검출할 수 있다.

$$대상으로부터의 샘플에서, 또는 대상에서, 표지된 PHF-타우, 타우 응집체, 및/또는 신경섬유 농축체의 수, 크기, 및/또는 강도를 상응하는 기준선 값에 비교함으로써 진단을 수행한다. 기준선 값은 질환이 없는 개체의 집단 내의 평균 수준을 나타낼 수 있다. 기준선 값은 또한 동일한 대상에서 결정된 이전 수준을 나타낼 수 있다.

상기의 진단 방법은 또한, 치료 전, 치료 중, 또는 치료 후의 대상에서 PHF-타우의 존재를 검출함으로써 요법에 대한 대상의 반응을 모니터하기 위해 사용될 수 있다. 기준선에 비교하여 값의 감소는 치료에 대한 양성 반응을 의미한다. 병리학적 타우가 뇌로부터 제거됨에 따라 생물학적 유체에서 값이 일시적으로 증가할 수도 있다.

본 발명은 추가로, 상기 진단 방법 및 모니터링 방법을 수행하기 위한 키트에 관한 것이다. 전형적으로, 이러한 키트는 본 발명의 항체와 같은 진단 시약, 및 임의로 검출가능한 표지를 함유한다. 진단 항체 자체가 검출가능한 표지(예를 들어, 형광 분자, 바이오틴 등)를 함유할 수 있으며, 이는 직접 검출가능하거나 2차 반응(예를 들어, 스트렙타비딘과의 반응)을 통해 검출가능하다. 대안적으로, 검출가능한 표지를 함유하는 2차 시약을 이용할 수 있으며, 여기서 2차 시약은 1차 항체에 대한 결합 특이성을 갖는다. 생물학적 샘플 내의 PHF-타우를 측정하기에 적합한 진단 키트에서, 키트의 항체는 마이크로타이터 접시의 웰과 같은 고체상에 사전결합되어 공급될 수 있다.

본 출원 전체에 걸쳐 인용된 모든 인용된 참고문헌의 내용(문헌 참고문헌, 등록 특허, 공개 특허 출원, 및 공계류 중인 특허 출원 포함)은 본 명세서에 참고로 명백하게 포함된다.

실시예 1

쌍 나선형 필라멘트-타우(PHF-타우)의 정제

그린버그(Greenberg) 및 데이비스(Davies)의 변형된 방법(Greenberg and Davies Proc Natl Acad Sci U S A 87:5827-31, 1990)에 의해 PHF-타우를 부분적으로 정제하였다. 약술하면, 조직학적으로 확인된 알츠하이머 환자로부터 얻어진 피질로부터의 사후 조직을 부분적으로 정제하였다. 전형적으로, 10 부피의 차가운 완충액, 완충액 H(10 mM 트리스, 800 mM NaCl, 1 mM EGTA, 및 10% 수크로스/ pH 7.4) 내에서, 유리/테플론 포터 조직 균질화기(glass/Teflon Potter tissue homogenizer)(독일 슈타우펜 소재의 IKA 웍스 인코포레이티드(IKA Works, Inc))를 사용하여 1000 rpm에서 5 mg의 전두 피질을 균질화하였다. 균질화된 재료를 264.8 N(27000 g)에서 20 min 동안 소발(Sorvall) 로터 SS34 내에서 원심분리하였다. 펠렛을 폐기하고, 상청액을 1%(w/v) N-라우로일사르코신 및 1%(v/v) 2-머캅토에탄올의 최종 농도로 조정하고, 2 h 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 이어서, 상청액을 1059.1 N(108000 g)에서 35 min 동안 20℃에서 베크만(Beckman) 60Ti 로터 내에서 원심분리하였다. 펠렛을 PBS 내에서 신중하게 세척하고 PBS 내에 현탁시켰다. 상청액을 기재된 바와 같이 다시 원심분리하고, 최종 펠렛을 용해시키고, 소분하여 -80℃에서 동결시켰다. 12% SDS-PAGE 및 항-타우 항체 AT8 및 HT7(일리노이주 록포드 소재의 써모사이언티픽)을 이용하는 웨스턴 블롯 상에서 PHF-타우 제제의 품질을 평가하였다. AT8은 S202/T205에서 인산화된 PHF-타우를 검출하지만, 비-인산화 PHF-타우에는 결합하지 않고 야생형 타우에도 결합하지 않는다. HT7은 타우 아미노산 159 내지 163(서열 번호 6의)에서 비-인산화 에피토프에 결합하며, 타우 및 PHF-타우 양자 모두를 인식한다. 양호한 품질의 PHF-타우 제제는 AT8과 같은 과인산화 PHF-타우와 반응성인 항체를 이용하여 검출되는 웨스턴 블롯 상에서 약 60, 64, 66, 및 72 kDa의 분자량을 갖는 4개의 밴드로 구성된다. 동일한 뇌 샘플로부터 유사한 품질 및 순도를 가진 2개의 별도 PHF-타우 제제를 제조하였다. 제제 1을 면역화에 사용하였다.

실시예 2

PHF-타우에 대한 단클론 항체의 생성

표준 하이브리도마 기술을 사용하여 통상의 Balb/c 마우스에서 항- PHF-타우 항체를 생성시켰다(Kohler and Milstein Nature 256:495-7, 1975). 얻어진 하이브리도마를 96-웰 플레이트에 접종하고, 10 일 후에 하기와 같이 25 ng/웰 코팅된 PHF-타우 상에서의 직접 ELISA에서 스크리닝하였다. E. 콜라이(E. Coli) BL21 세포에서 발현된 대조군 타우(서열 번호 6)로 코팅된 10 ng/웰 상에서 양성 세포를 교차-반응성에 대해 시험하고, 열 처리 및 암모늄 설페이트 침전에 의해 정제하고, 즉시 서브클로닝하여 양성 클론을 액체 질소 내에 동결시켰다. 10% 우태아 혈청(유럽 소재의 하이클론(Hyclone)), 하이브리도마 융합 클로닝 보충제(Hybridoma Fusion Cloning Supplement)(2%)(벨기에 브뤼셀 소재의 로슈(Roche)) 2% HT(미국 소재의 시그마(Sigma)), 1 mM 소듐 피루베이트, 2 mM L-글루타민 및 페니실린(100 U/mL), 및 스트렙토마이신(50 mg/mL)으로 보충된 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium) 내에서 모든 하이브리도마를 성장시켰다.

선택된 하이브리도마 세포로부터 마우스 IgG1/IgG2/ κ 배경 상으로 항체 가변 영역을 클로닝하고, 일상적인 방법을 사용하여 발현시키고 정제하였다.

항체 선택을 위한 직접 ELISA

넌크 맥시소프(NUNC Maxisorp)(라이프 테크놀로지스(Life Technologies)) 평저 고결합(flat-bottom high-binding) 96-웰 마이크로 타이터 플레이트 내에서 25 ng/웰 PHF-타우를 50 μL/웰 코팅 완충액(10 mM 트리스, 10 mM NaCl, 및 10 mM NaN3, pH 8.5) 내에서 4℃에서 밤새 코팅하였다. 다음 날에, PBS 내에서 75 μL/웰의 0.1% 카세인으로 60 min 동안 실온에서 플레이트를 블로킹하였다. 그 다음에, 50 μL 하이브리도마 상청액을 첨가하고 1 h 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 세척 후에, 결합된 단클론 항체를 1 hr 동안 37℃에서 50 μL/웰의 호스라디쉬 퍼옥시다아제와 접합된 양-항-마우스 IgG로 검출하였다(아머샴-파마시아 바이오테크(Amersham-Pharmacia Biotech)). 양자 모두의 시약을 0.1% 카세인/PBS에 희석하였다. 플레이트를 세척하고 100 mM 시트르산 및 100 mM 다이소듐 하이드로겐 포스페이트(pH 4.3) 중의 0.42 mM 3,5,3',5'-테트라메틸-벤지딘, 0.003%(v/v) H₂O₂의 용액 50 μL를 기질로서 첨가하였다. 플레이트 진탕기 상에서 최대 15 min 동안 실온에서 반응을 진행시킨 후, 50 μL/웰의 2 N H₂SO₄로 발색을 중지시키고, 마이크로 타이터 플레이트 판독기 상에서 450 nm로 플레이트를 판독하였다(써모맥스(Thermomax), 몰리큘라 디바이시즈(Molecular Devices)).

단클론 항체의 특이성

하이브리도마 스크리닝으로부터 얻어진 선택된 항체를 그들의 재조합 발현된 대조군 타우(서열 번호 6)와의 교차 반응성에 대해 시험하였다. 500 ng의 PHF-타우 및 200 ng의 대조군 타우를 뉴페이지(NuPAGE)(등록상표) 노벡스(Novex)(등록상표)비스-트리스 4 내지 12% 겔 상에 로딩하고 아이블롯 시스템(iBlot system)(인비트로젠)을 사용하여 제조자 지침에 따라 니트로셀룰로오스 막 상에 블로팅하였다. 탈지 분유(NFDM)(5% w/v; 바이오라드(Biorad))를 함유하는 트리스-완충 식염수 트윈-20(TBS-T; 1M 트리스, 150 mM NaCl, 및 0.05% 트윈-20, pH 8.5)으로 1 시간 동안 막을 블로킹하고 TBS-T 내에서 3회 세척하였다. NFDM(5% w/v)을 함유하는 TBS-T 내에 희석된 1차 대조군 항체(1 ㎍/mL) HT7, AT8, AT100(일리노이주 록포드 소재의 써모사이언티픽), 및 BT2와 함께 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다. 10% FCS를 함유하는 배양 상청액에 하이브리도마 스크리닝으로부터 선택된 PT1, PT2, PT3, PT4, 및 PT5 단클론 항체를 첨가하였다. HRPO(TBS-T 내에 1:20000, 아머샴 바이오사이언시즈(Amersham Biosciences))와 접합된 양-항-마우스 Ig를 사용하여 웨스트 듀라(West Dura)(등록상표) 증진된 화학발광법(피어스(Pierce), 써모사이언티픽)을 통해 1차 항체를 검출하였다. 루미-이미징 시스템(Lumi-imaging system)(로슈 다이아그노스틱(Roche Diagnostic))에 의해 신호를 포착하였다. 웨스턴 블롯에서 PT1 및 PT3은 PHF-타우와 반응하였고 대조군 타우와는 반응하지 않았다. PT2는 양자 모두의 단백질과 반응성이었다. HT7 및 AT8의 결합 프로파일은 상기 기재되어 있다. AT100은 인산화 Ser212/Thr214에 결합하고 PHF-타우에 결합하나 야생형 타우에는 결합하지 않는다. BT2는 S199/S202를 포함하는 비-인산화 에피토프를 인식하며, 따라서 야생형 타우는 인식하나 PHF-타우는 인식하지 않는다.

경쟁적 에피토프 결합

PHF-타우 또는 인산화 타우 펩티드에 대한 경쟁적 결합에 대해 단클론 항체 PT1, PT2, PT3, PT4, PT5, AT8(일리노이주 록포드 소재의 써모사이언티픽), AT100(일리노이주 록포드 소재의 써모사이언티픽), 및 HT7(MN1000)(일리노이주 록포드 소재의 써모 사이언티픽)을 평가하였다. MSD(등록상표) 설포-태그 NHS 에스테르(메조 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery))를 사용하여 제조자 지침에 따라 항체를 표지하였다.

표지된 PT1, PT3, AT100, 및 HT7과의 경쟁을 위해, 5 μL(50 ㎍/mL)/웰의 보강된 PHF-타우 단백질(상기와 같이 정제됨)을 실온(RT)에서 2 hr 동안 MSD 하이바인드(HighBind) 플레이트(메릴랜드주 게이더스버그 소재의 메조 스케일 디스커버리) 상에 코팅하였다. AT8과의 경쟁을 위해, 대조군 타우 내의 S202/T205에 상응하는 잔기에서 인산화된 대조군 타우(서열 번호 6)의 잔기 194 내지 211에 상응하는 25 μL의 0.1 mg/웰 바이오틴화되고 페길화된 합성 펩티드 RSGYSSPG(pS)PG(pT)PGSRSR-OH(메사추세츠주 가드너 소재의 뉴 잉글랜드 펩티드, LLC.(New England Peptide, LLC.))(서열 번호 39)를 스트렙타비딘-차지드 플레이트(Streptavidin-charged plate)(메릴랜드주 게이더스버그 소재의 메조 스케일 디스커버리) 상에 코팅하였다. 코팅 후에, RT에서 2 hr 동안 150 μL의 5% MSD 블로커 A 완충액으로 웰을 블로킹하고, 0.1 M HEPES 완충액(pH 7.4)으로 3회 세척하였다. 표지된 개별적인 항-타우 항체(10 nM 또는 50 nM)와 다양한 표지되지 않은 경쟁자 항체의 연속 희석액(1 nM 내지 2 μM)의 혼합물 25 μL를 각각의 웰에 첨가하였다. 온화한 진탕을 동반하여 2 시간 동안 RT에서 플레이트를 인큐베이션하고 상기와 같이 3회 세척하였다. 150 μL/웰의 희석된 MSD 판독 완충액 T를 첨가하고 섹터 이미저(SECTOR Imager) 6000(메릴랜드주 게이더스버그 소재의 메조 스케일 디스커버리) 내에서 플레이트를 판독하였다.

항-타우 mAb HT7, AT100, 및 AT8의 비-중첩 에피토프는 상기 기재되어 있다. 공개된 데이터를 기반으로, 이들 항체는 타우 단백질 또는 펩티드에 대한 결합에 있어서 서로 경쟁할 것으로 예상되지 않았다.

수행된 경쟁 분석을 기반으로, 항체 중 어느 것도 결합에 대해 서로 경쟁하지 않음으로써, 그들이 모두 상이한 에피토프에 결합한다는 것을 시사하였다. 각각의 실험에서, 자기-저해가 관찰되었을 뿐이다. 도 1 내지 5는, 각각 표지된 AT8, PT1, PT3, AT100, 및 HT7을 이용하는 경쟁 분석의 결과를 나타낸다.

실시예 3

항-PHF 타우 항체는 생체내에서 PHF-타우 축적을 감소시킨다

월령 5 개월의 자성 P301L 마우스(타코닉(Taconic), cat#002508)를 마우스 IgG1, 식염수, PT3(500 ㎍/마우스), 또는 AT8(하이브리도마 ECACC로부터 발현됨, 기탁 번호 9110086)로 5 개월 동안 주 1회 처리하였다. 마우스를 마취시키고, 차가운 PBS로 관류하고, 얼음 상에서 뇌를 해부하였다. 각각의 마우스에 대해, 1개의 뇌반구를 10 부피의 H- 완충액 내에서 균질화하고, 이어서 205.9 N(21,000 g)에서 20 min 동안 4℃에서 원심분리하였다. 생성되는 상청액을 205.9 N(100,000 g)에서 60 min 동안 추가로 원심분리하였다. 원심분리 후에, 문헌[Chai et al. J Biol Chem 286:34457-67, 2011]에 기재된 바와 같이, 펠렛(분획 P1)을 회수하고 웨스턴 및 ELISA 분석을 위해 세포용해 완충액으로 재현탁하였다. 피질 샘플의 경우, 분획 P1을 1%(w/v) N-라우로일사르코신으로 추가로 처리하고 초원심분리하여 펠렛 내에 PHF-타우를 추가로 보강하였다. 웅성 P301L 마우스는 낮은 형질전환 발현을 갖는 것으로 확인되었으며 분석에 포함되지 않았다.

본질적으로 문헌[Chai et al. J Biol Chem 286:34457-67, 2011]에 기재된 바와 같이, 항체 AT8 및 AT100을 포획 항체로 사용하고, 이어서 바이오틴화 HT7 및 아비딘-HRP에 의해 검출하는 샌드위치 ELISA를 이용하여(도 6a 및 6b), 그리고 웨스턴 블롯에서 AT100을 이용하여(도 6c), 뇌간 균질액(분획 P1)에서 인산화 타우를 측정하였다. 약술하면, P1 펠렛을 세포용해 완충액(셀 시그널링(Cell Signaling))으로 재현탁하였다. P1 펠렛 샘플을 AT8 또는 AT100(써모 사이언티픽) 사전-코팅 웰 및 바이오틴 표지된 HT-7 항체 내에서 인큐베이션하였다. 이어서, 샘플을 완충액으로 5회 세척한 후, 아비딘-HRP와 함께 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후에, 샘플을 1 단계 TMB 기질(써모 사이언티픽)과 함께 30 min 동안 인큐베이션하고, 이어서 2N H₂SO₄로 처리하였다. 최종적으로, 450 nm에서 반응을 판독하고, 인간 AD 뇌 균질액으로부터 유래된 표준 곡선을 사용하여 뇌 내의 AT8- 또는 AT100- 반응성 타우의 양을 결정하고, 비-형질전환 동물(B6)로부터의 평균 샘플과 동일한 ELISA 신호를 제공하는 AD 뇌 균질액의 상대량(ng/mL)으로서 플로팅하였다.

인산화를 검출하기 위해 AT100(p=0.057) 또는 AT8(p=0.0475)을 사용하는 ELISA 분석에서, 동종 대조군 투여 동물에 비교할 경우에 인산화 타우에서의 통계적으로 유의한 감소 또는 유의성을 향한 경향이 PT3으로 처리한 P301L 형질전환 동물에서 나타났다(ELISA 신호: 식염수 군(1135±228.8); IgG1 군(1344±245.6); PT3 군(660.5±134.5); AT8 군(1271±274)).

ELISA를 이용하여 얻은 데이터를 확인하기 위하여, 웨스턴 블롯 상에서 AT100 항체를 사용하여 PHF-타우를 검출함으로써 IgG1- 또는 PT3-처리 동물로부터의 뇌간 균질액(분획 P1)을 분석하였다. 항-액틴 항체를 로딩 대조군으로 사용하여 필터를 블로팅하였다(도 6b). 웨스턴 블롯에서는, AT100 항체로 검출되는 PHF-타우 양이 IgG1으로 처리한 동물에 비교하여 감쇠된 것으로 나타냈다.

피질 분석을 위하여, 포획을 위한 팬-타우(pan-tau) 항체(PT4) 또는 포스포-타우(phospho-tau) 항체(AT8)에 이어서 바이오틴 -팬-타우 항체(hTau10)에 이어서 HRP-아비딘을 사용하는 샌드위치 ELISA에 의해, 사르코실 가용성(가용성 타우를 나타냄) 및 불용성(PHF-타우를 나타냄) 피질 분획 양자 모두를 분석하였다. PT3으로 처리한 동물은 동종 대조군 IgG1으로 처리한 동물에 비교하여 유사한 수준의 총 타우를 가졌다. N-라우로일사르코신 불용성 분획에서는 동종 대조군에 비교할 경우에 PT3으로 처리한 동물에서 더 낮은 PHF-타우 수준을 향한 경향이 뚜렷하였다(ELISA, PT4로 포획: IgG 군: 851026±261198 및 PT3 군: 585639±120498; ELISA, AT8로 포획: IgG 군: 1125886±286240(N=10) 및 pT3 군: 746582±124970(N=7)).

실시예 4

항-PHF-타우 항체의 특성화

친화도 결정

단클론 항체 PT1 및 PT3의 재조합 인간 가용성 타우 또는 PHF-타우와의 상호작용을 프로테온에 의해 연구하였다. 3 mM EDTA, 및 0.005% 트윈-20으로 보충된 PBS(pH 7.4)를 전기영동용 완충액 또는 시스템 완충액으로 사용하여 25℃에서 모든 상호작용을 연구하였다. 2개의 상이한 실험 체제를 사용하였으며, 하나는 재조합 발현된 대조군 타우와의 상호작용을 위한 것이고 다른 하나는 PHF-타우와의 상호작용을 위한 것이었다. 이들 실험에서는 마우스 항-타우 항체인 HT7(피어스, cat #MN1000)을 양성 대조군으로 사용하였다.

재조합 발현된 대조군 타우와의 상호작용을 연구하기 위하여, 아민-커플링 화학에 관한 각각의 제조자 지침을 사용하여 항-인간 또는 항-마우스 IgG Fc± 단편 특이적 항체(Ab)를 GLC(프로테온) 센서 칩의 표면에 커플링함으로써 바이오센서 표면을 제조하였다(~5000 반응 단위(RU: response unit)). 커플링 완충액은 10 mM 소듐 아세테이트(pH 4.5)였다. 항-PHF-타우 항체를 전기영동용 완충액 내에 희석하고 주입하여 60 내지 130 RU의 포획을 얻었다. 항-PFH-타우 mAb의 포획에 이어서, 재조합 발현된 대조군 타우(타우-441, 시그마 카탈로그# T0576-50 ug)를 용액 내에 주입하였다(5-배 희석액에서 0.1 내지 75 nM). 결합을 2 분 동안 모니터하였다(40 μL/min으로 80 μL 주입). 해리를 10 분 동안 모니터하였다. 0.85% H₃PO₄, 또는 0.85% H₃PO₄에 이어서 50 mM NaOH를 이용하여 센서 표면의 재생을 얻었다. 1:1 결합 모델을 사용하여 데이터를 적합시켰다. 1:1 결합 모델을 사용하여 데이터를 적합시켰다.

[표 2]

PHF-타우와의 상호작용을 연구하기 위하여 HT7을 포획 시약으로 사용하여 PHF-타우를 포획-커플링함으로써 바이오센서 표면을 제조하였다. 유체에 진입하는 불용성 재료의 양을 제한하기 위하여, 앞서 기재된 바와 같은 PHF-타우의 부가적인 제제가 프로테온에 필요하였다. 49 N(5000 g), 5℃, 10 min에서의 2회 원심분리에 의해 상기와 같은 PHF-타우를 부가적으로 제조하였으며, 여기서 제2 원심분리로부터의 상청액을 이어서 전기영동용 완충액 내에 1/20 또는 1/40 희석하였다. 칩을 제조하기 위하여, 아민-커플링 화학에 관한 각각의 제조자 지침을 사용하여 HT7을 GLC(프로테온) 센서 칩의 표면에 공유적으로 고정하였다(~3000 반응 단위(RU)). 커플링 완충액은 10 mM 소듐 아세테이트(pH 4.5)였다. HT7 고정화 후에 PHF-타우를 주입하고 HT7에 의해 포획하였다(~300 RU). 포획 후에, 아민-커플링 화학에 관한 각각의 제조자 지침을 사용하여 칩의 활성화에 의해 PHF-타우를 센서 칩에 공유적으로 고정하였다. 에탄올아민의 주입에 의해 나머지 반응성 부위를 최종적으로 블로킹하였다. PHF-타우-변형 표면 및 기준 표면(항원을 함유하지 않음)의 제조 및 안정화 후에, 항-PHF-타우 항체를 전기영동용 완충액 내에 희석하고 용액 내에 주입하였다(5-배 희석액에서 0.1 내지 75 nM). 결합을 3 분 동안 모니터하였다(40 μL/min으로 120 μL 주입). 해리를 10 분 또는 15 분 동안 모니터하였다. 10 mM Gly(pH 2)를 이용하여 센서 표면의 재생을 얻었다. 2가 결합 모델을 사용하여 데이터를 적합시켰으며, 여기서 외견적 본태성 친화도는 koff-1/kon-1의 비율로서 보고하였다.

프로테온 실험을 기반으로, PT1은 322 pM 친화도를 동반하여 PHF-타우에 결합하였으며, 시험 조건 하에서 대조군 타우에 대한 결합을 나타내지 않았다(표 2). PT3은 18 ±2 pM 친화도로 PHF-타우에 결합하였으며, 시험 조건 하의 5회 측정 중 4회에서 대조군 타우에 대한 결합을 나타내지 않았다. 5회 프로테온 측정 중 1회에서는 약한 결합이 나타났으며, 이를 사용하여 대조군 타우의 사용된 최고 농도를 기준으로 > 75 nM의 친화도를 추산할 수 있었다.

이제 본 발명을 완전히 설명하였지만, 첨부된 특허청구범위의 사상 또는 범주로부터 벗어나지 않고서 많은 변화 및 변경이 본 발명에 행해질 수 있음이 당업자에게는 명백할 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> Janssen Biotech, Inc. Christopher, Alderfer Dariusz, Janecki Xuesong, Liu Marc, Mercken Melissa, Murdock Marc, Vandermeeren Sam, Wu <120> Anti-PHF-tau Antibodies and Their Uses <130> CEN5316WOPCT <150> 61/577817 <151> 2011-12-20 <160> 39 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 352 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly 1 5 10 15 Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His 20 25 30 Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Ala Glu Glu Ala 35 40 45 Gly Ile Gly Asp Thr Pro Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val 50 55 60 Thr Gln Ala Arg Met Val Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp 65 70 75 80 Asp Lys Lys Ala Lys Gly Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro 85 90 95 Arg Gly Ala Ala Pro Pro Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg 100 105 110 Ile Pro Ala Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly 115 120 125 Glu Pro Pro Lys Ser Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser 130 135 140 Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro 145 150 155 160 Pro Thr Arg Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys 165 170 175 Ser Pro Ser Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met 180 185 190 Pro Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu 195 200 205 Lys His Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val 210 215 220 Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His 225 230 235 240 His Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp 245 250 255 Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr 260 265 270 His Val Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr 275 280 285 Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val 290 295 300 Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser 305 310 315 320 Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu 325 330 335 Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu 340 345 350 <210> 2 <211> 381 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly 1 5 10 15 Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His 20 25 30 Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu 35 40 45 Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser 50 55 60 Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly 65 70 75 80 Asp Thr Pro Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala 85 90 95 Arg Met Val Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys 100 105 110 Ala Lys Gly Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala 115 120 125 Ala Pro Pro Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala 130 135 140 Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro 145 150 155 160 Lys Ser Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr 165 170 175 Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg 180 185 190 Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser 195 200 205 Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu 210 215 220 Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln 225 230 235 240 Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser 245 250 255 Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro 260 265 270 Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp 275 280 285 Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro 290 295 300 Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu 305 310 315 320 Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser 325 330 335 Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser 340 345 350 Ser Thr Gly Ser Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu 355 360 365 Ala Asp Glu Val Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu 370 375 380 <210> 3 <211> 410 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly 1 5 10 15 Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His 20 25 30 Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu 35 40 45 Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser 50 55 60 Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val 65 70 75 80 Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr Glu 85 90 95 Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro 100 105 110 Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met Val 115 120 125 Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly 130 135 140 Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro 145 150 155 160 Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro 165 170 175 Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly 180 185 190 Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser 195 200 205 Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys 210 215 220 Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys 225 230 235 240 Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val 245 250 255 Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly 260 265 270 Gly Lys Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr 275 280 285 Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly 290 295 300 Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln 305 310 315 320 Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly 325 330 335 Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys 340 345 350 Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val 355 360 365 Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly 370 375 380 Ser Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu 385 390 395 400 Val Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu 405 410 <210> 4 <211> 383 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly 1 5 10 15 Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His 20 25 30 Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Ala Glu Glu Ala 35 40 45 Gly Ile Gly Asp Thr Pro Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val 50 55 60 Thr Gln Ala Arg Met Val Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp 65 70 75 80 Asp Lys Lys Ala Lys Gly Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro 85 90 95 Arg Gly Ala Ala Pro Pro Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg 100 105 110 Ile Pro Ala Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly 115 120 125 Glu Pro Pro Lys Ser Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser 130 135 140 Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro 145 150 155 160 Pro Thr Arg Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys 165 170 175 Ser Pro Ser Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met 180 185 190 Pro Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu 195 200 205 Lys His Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu 210 215 220 Asp Leu Ser Asn Val Gln Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys 225 230 235 240 His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp 245 250 255 Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His 260 265 270 Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe 275 280 285 Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His 290 295 300 Val Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe 305 310 315 320 Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr 325 330 335 Lys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn 340 345 350 Val Ser Ser Thr Gly Ser Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala 355 360 365 Thr Leu Ala Asp Glu Val Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu 370 375 380 <210> 5 <211> 441 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly 1 5 10 15 Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His 20 25 30 Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu 35 40 45 Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser 50 55 60 Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val 65 70 75 80 Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr Glu 85 90 95 Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro 100 105 110 Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met Val 115 120 125 Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly 130 135 140 Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro 145 150 155 160 Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro 165 170 175 Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly 180 185 190 Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser 195 200 205 Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys 210 215 220 Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys 225 230 235 240 Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val 245 250 255 Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly 260 265 270 Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln 275 280 285 Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly 290 295 300 Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser 305 310 315 320 Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln 325 330 335 Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser 340 345 350 Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn 355 360 365 Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala 370 375 380 Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser 385 390 395 400 Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser 405 410 415 Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val 420 425 430 Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu 435 440 <210> 6 <211> 441 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly 1 5 10 15 Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His 20 25 30 Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu 35 40 45 Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser 50 55 60 Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val 65 70 75 80 Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr Glu 85 90 95 Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro 100 105 110 Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met Val 115 120 125 Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly 130 135 140 Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro 145 150 155 160 Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro 165 170 175 Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly 180 185 190 Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser 195 200 205 Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys 210 215 220 Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys 225 230 235 240 Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val 245 250 255 Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly 260 265 270 Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln 275 280 285 Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly 290 295 300 Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser 305 310 315 320 Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln 325 330 335 Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser 340 345 350 Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn 355 360 365 Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala 370 375 380 Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser 385 390 395 400 Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser 405 410 415 Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val 420 425 430 Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu 435 440 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Ser Ser Trp Met Gly 1 5 <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 Asp Ile Leu Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Arg Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 9 Ser Tyr Tyr Asp Tyr Asp Arg Phe Ala Asn 1 5 10 <210> 10 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 10 Arg Ser Ser Glu Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr 1 5 10 15 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 11 Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 12 Met Gln Tyr Leu Glu Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 13 Ser Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 14 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 14 Ser Ile Ser Lys Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asn Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 15 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Gly Trp Gly Asp Tyr Gly Trp Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 16 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 16 Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Arg Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 17 Arg Ala Asn Arg Leu Leu Asp 1 5 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 18 Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Leu Thr 1 5 <210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 19 Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Ser 1 5 <210> 20 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 20 Leu Pro Gly Ser Gly Gly 1 5 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 21 Ser Tyr Tyr Asp Tyr Asp Arg Phe Ala 1 5 <210> 22 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 22 Ser Glu Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr 1 5 10 <210> 23 <211> 3 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 23 Arg Met Ser 1 <210> 24 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 24 Tyr Leu Glu Tyr Pro Leu 1 5 <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 25 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 1 5 <210> 26 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 26 Ser Lys Gly Gly Asn 1 5 <210> 27 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 27 Gly Trp Gly Asp Tyr Gly Trp Phe Ala 1 5 <210> 28 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 28 Ser Gln Asp Ile Asn Arg Tyr 1 5 <210> 29 <211> 3 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 29 Arg Ala Asn 1 <210> 30 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 30 Tyr Asp Glu Phe Pro Leu 1 5 <210> 31 <211> 357 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 31 caggttcagc tgcagcagtc tggaactgag ctgatgaagc ctggggcctc agtgaagata 60 tcctgcaagg ctactggcta cacattcagt agctcctgga tggggtgggt taagcagagg 120 cctggacatg gccttgagtg gattggagac attttacctg gaagtggtgg tactaactac 180 aatgagaggt tcaagggcaa ggcctcattc actgcagaaa catcctccaa cacagcctac 240 atgcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgccgtct attactgtgt aagaagctac 300 tatgattacg accgctttgc taactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgca 357 <210> 32 <211> 336 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 32 gatattgtga tgactcaggc tgcaccctct gtacctgtca ctcctggaga gtcagtttcc 60 atctcctgca ggtctagtga gagtctcctg catagtaatg gcaacactta cttgtattgg 120 ttcctgcaga ggccaggcca gtctcctcag ctcctgatat atcggatgtc caaccttgcc 180 tcaggagtcc cagacaggtt cagtggcagt gggtcaggaa ctgctttcac actgagaatc 240 agtagagtgg aggctgagga tgtgggtgtt tattactgta tgcaatatct agaatatccg 300 ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaa 336 <210> 33 <211> 354 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 33 gaagtgaagc tggtggagtc tgggggagac ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctatgcca tgtcttgggt tcgccagaat 120 ccagagaaga ggctggagtg ggtcgcatcc attagtaagg gtggtaacac ctactatcca 180 aacagcgtga agggccgatt caccatctcc agagataatg ccaggaacat cctgtacctg 240 caaatgagca gtctgaggtc tgaggacacg gccctttatt actgtgcaag aggctggggt 300 gattacgggt ggtttgctta ctggggccaa gtgactctgg tcactgtctc tgca 354 <210> 34 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 34 gacatcaaga tgacccagtc tccatcttcc atgtatgcat ctctaggaga gagagtcact 60 atcacttgca aggcgagtca ggacattaat aggtatttaa actggttcca gcagaaacca 120 gggaaatctc ctaagaccct gatctatcgt gcaaacagat tgctagatgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggcaagat tactctctca ccatcagcag cctggattat 240 gaagatatgg gaatttatta ttgtctacag tatgatgagt ttccgctcac gttcggtgat 300 gggaccaagc tggagctgaa a 321 <210> 35 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 35 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Ser 20 25 30 Trp Met Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asp Ile Leu Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Ser Phe Thr Ala Glu Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Ser Tyr Tyr Asp Tyr Asp Arg Phe Ala Asn Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 36 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 36 Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Glu Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Tyr 85 90 95 Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 <210> 37 <211> 118 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 37 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Asn Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ser Lys Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asn Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Trp Gly Asp Tyr Gly Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Val Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 38 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 38 Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Arg Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Leu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Asp Tyr 65 70 75 80 Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Asp Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 39 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> phosphorylated tau peptide corresponding to residues 194-211 of control tau <220> <221> Phosphorylation <222> (9)..(9) <220> <221> Phosphorylation <222> (12)..(12) <400> 39 Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg 1 5 10 15 Ser Arg

Claims

서열 번호 35 또는 37의 중쇄 가변 영역(VH: heavy chain variable region)의 항원-결합 부위, 및 서열 번호 36 또는 38의 경쇄 가변 영역(VL: light chain variable region)의 항원-결합 부위를 포함하는 PHF-타우(PHF-tau)에 결합하는, 단리된 항체.
제1항에 있어서, 상기 VH의 상기 항원-결합 부위가 각각 서열 번호 7, 8, 및 9, 또는 서열 번호 13, 14, 및 15의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1(HCDR1), 2(HCDR2), 및 3(HCDR3)을 포함하고, 상기 VL의 상기 항원-결합 부위가 각각 서열 번호 10, 11, 및 12, 또는 서열 번호 16, 17, 및 18의 경쇄 CDR 1(LCDR1), 2(LCDR2), 및 3(LCDR3)을 포함하는, 단리된 항체.
제1항 또는 제2항에 있어서, 서열 번호 35의 VH의 항원-결합 부위 및 서열 번호 36의 VL의 항원-결합 부위를 포함하는 PHF-타우에 결합하는, 단리된 항체.
제3항에 있어서, 상기 VH의 상기 항원-결합 부위가 각각 서열 번호 7, 8, 및 9의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하고, 상기 VL의 상기 항원-결합 부위가 각각 서열 번호 10, 11, 및 12의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는, 단리된 항체.
제1항 또는 제2항에 있어서, 서열 번호 37의 VH의 항원-결합 부위 및 서열 번호 38의 VL의 항원-결합 부위를 포함하는 PHF-타우에 결합하는, 단리된 항체.
제5항에 있어서, 상기 VH의 상기 항원-결합 부위가 각각 서열 번호 13, 14, 및 15의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하고, 상기 VL의 상기 항원-결합 부위가 각각 서열 번호 16, 17, 및 18의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는, 단리된 항체.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 인간화되는, 단리된 항체.
PHF-타우 결합에 대해 서열 번호 35의 VH의 항원-결합 부위 및 서열 번호 36의 VL의 항원-결합 부위, 또는 서열 번호 37의 VH의 항원-결합 부위 및 서열 번호 38의 VL의 항원-결합 부위를 포함하는 단클론 항체와 경쟁하는, 단리된 항체 또는 단편.
각각 서열 번호 7, 8, 및 9, 또는 각각 서열 번호 13, 14, 및 15의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 항체 VH를 암호화하는, 단리된 폴리뉴클레오티드.
각각 서열 번호 10, 11, 및 12, 또는 각각 서열 번호 16, 17, 및 18의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 항체 VL을 암호화하는, 단리된 폴리뉴클레오티드.
제9항 또는 제10항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 벡터.
제11항의 상기 벡터를 포함하는, 숙주 세포.
제12항의 상기 숙주 세포를 배양하는 단계 및 상기 숙주 세포에 의해 생성된 상기 항체를 회수하는 단계를 포함하는, PHF-타우에 결합하는 항체의 제조 방법.