ES2738007T3 - Anticuerpos anti-PHF-tau y sus utilizacines - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo aislado que se une a PHF-tau que comprende un VH de SEQ ID NO: 37 y un VL de SEQ ID NO: 38, o una versión humanizada del mismo, en donde dicha versión humanizada tiene afinidad hacia PHF-tau con una constante de disociación (KD) menor o igual que 10-10 M, según lo determinado por ProteOn.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos anti-PHF-tau y sus utilizacines

Campo de la invención

[0001] La presente invención se refiere a anticuerpos anti-PHF-tau, y métodos de fabricación y uso de los mismos.

Antecedentes de la invención

[0002] La enfermedad de Alzheimer (EA) es un trastorno cerebral degenerativo caracterizado clínicamente por la pérdida progresiva de la memoria, la cognición, el razonamiento, el juicio y la estabilidad emocional que conduce gradualmente a un profundo deterioro mental y finalmente a la muerte. La EA es una causa muy común de insuficiencia mental progresiva (demencia) en humanos de edad avanzada y se cree que representa la cuarta causa médica más común de muerte en los Estados Unidos. La EA se ha observado en grupos étnicos de todo el mundo y presenta un importante problema de salud pública presente y futuro.

[0003] Los cerebros de individuos con EA muestran lesiones características denominadas placas seniles (o amiloides), angiopatía amiloide (depósitos de amiloide en los vasos sanguíneos) y ovillos neurofibrilares. Un gran número de estas lesiones, en particular las placas amiloides y los ovillos neurofibrilares de filamentos helicoidales apareados, se encuentran generalmente en varias áreas del cerebro humano importantes para la memoria y la función cognitiva en pacientes con EA.

[0004] El componente de proteína principal de la degeneración neurofibrilar en EA y varias otras enfermedades neurodegenerativas es una forma hiperfosforilada de la tau asociada a microtúbulos de proteínas. El desarrollo de terapias para prevenir o eliminar la agregación de tau ha sido de interés durante muchos años, pero los fármacos candidatos, incluidos los compuestos antiagregación e inhibidores de la quinasa, acaban de comenzar ensayos clínicos (Brunden, et al. Nat Rev Drug Discov 8: 783). 93, 2009).

[0005] El documento WO 93/08302 describe anticuerpos monoclonales dirigidos contra la proteína tau asociada a microtúbulos. El documento WO 95/17429 describe anticuerpos monoclonales específicos para PHF-tau. El documento WO 96/04309 describe anticuerpos monoclonales específicos para un epítopo de una subclase particular o forma de tau fosforilada. El documento WO 2010/144711 describe la selección inmunológica de proteínas tau patológicas. Brion et al. (1993) Journal of Neurochemistry 60 (4): 1372-1382 informa que los anticuerpos monoclonales de neurofilamentos RT97 y 8D8 reconocen diferentes epítopos modificados en filamento ^t helicoidal emparejado en la enfermedad de Alzheimer. Hasegawa et al. (1993) Journal of Neurochemistry 60 (6): 2068-2077 describe la caracterización de dos anticuerpos monoclonales distintos para filamentos helicoidales emparejados. Goedert et al. (1994) Biochemical Journal 301 (3): 871-877 describe el mapeo de epítopos de anticuerpos monoclonales a los filamentos helicoidales pareados de la enfermedad de Alzheimer. Condamines et al. (1995) Neuroscience Letters 192 (2): 81-84 describe un nuevo inmunoensayo para el mapeo de la degeneración neurofibrilar en la enfermedad de Alzheimer. Hasegawa et al. (1996) FEB S Letters 384: 25-30 describe la caracterización de mAb AP422, un anticuerpo monoclonal dependiente de la fosforilación contra la proteína tau. Hoffmann et al. (1997) Biochemistry 36 (26): 8114­ 8124 informa que los epítopos específicos de filamentos helicoidales emparejados con enfermedad de Alzheimer única implican doble fosforilación en sitios específicos. Jicha et al. (1997) Journal of Neurochemistry 69 (5): 2087-2095 describe un anticuerpo dependiente de la conformación y la fosforilación que reconoce los filamentos helicoidales pareados de la enfermedad de Alzheimer. Singer et al. (2006) Biochemical and Biophysical Research Communications 346 (3): 819-828 describe los sitios de fosforilación vecinos como marcadores específicos de PHF-tau en la enfermedad de Alzheimer. Porzig et al. (2007) Biochemical and Biophysical Research Communications 358 (2): 644­ 649 describe el mapeo de mAbs AT8 y Tau5 dirigidos contra regiones hiperfosforiladas de la proteína tau humana. Mercken et al. (1992) Acta Neuropathol. 84 (3): 265-272 informa que los anticuerpos monoclonales con especificidad selectiva para el Alzheimer Tau se dirigen contra epítopes sensibles a la fosfatasa. El documento US 2011/143443 describe la proteína tau y el kit asociados monoclonales aislados. El documento US 2011/059093 describe el uso de un anticuerpo anti-tau ps422 para el tratamiento de enfermedades cerebrales.

[0006] Recientemente, la evidencia preclínica se ha producido en modelos transgénicos tau ratón que la inmunización activa y pasiva para tau puede tener un potencial terapéutico (Chai, et al J Biol Chem 286:. 34457-67, 2011, Boutajangout, et al J Neurochem 118: 658-67, 2011, Boutajangout, et al. J Neurosci 30: 16559-66, 2010, Asuni, et al. J Neurosci 27: 9115-29, 2007). Una transmisión de tauopatía y una hipótesis de propagación se han descrito recientemente y se basan en las etapas de Braak de la progresión de la tauopatía en el cerebro humano y la propagación de la tauopatía después de las inyecciones de agregados de tau en modelos de tau preclínicos (Frost, et al. J Biol Chem 284: 12845-52, 2009, Clavaguera, et al. Nat Cell Biol 11: 909-13, 2009). Por lo tanto, existe una necesidad de agentes terapéuticos para prevenir la agregación de tau y la progresión de la tauopatía para tratar la EA y otras enfermedades neurodegenerativas.

Breve descripción de las figuras

[0007]

La Figura 1 muestra la competencia de AT8 marcado por varios anticuerpos anti-tau.

La Figura 2 muestra la competencia del PT1 marcado por varios anticuerpos anti-tau.

La Figura 3 muestra la competencia del PT3 marcado por varios anticuerpos anti-tau.

La Figura 4 muestra la competencia de AT100 marcado por varios anticuerpos anti-tau.

La Figura 5 muestra la competencia de HT7 marcado por varios anticuerpos anti-tau.

La Figura 6 (A) Análisis de tau fosforilada en homogenados del tronco cerebral (fracción P1) de animales transgénicos P301L hembras de 5 meses tratados con solución salina, IgG1 de ratón, PT3 o AT8 como se indica en la figura, o de animales no transgénicos no tratados (B6). El ELISA se realizó utilizando AT8 (panel izquierdo) o AT100 (panel derecho) como anticuerpos de captura seguidos de HT7 biotinilado y avidina-HRP. Las señales de ELISA se representan como una cantidad relativa de homogeneizado de cerebro EA (ng/ml) que proporciona la misma señal de ELISA que las muestras promedio de un animal no transgénico (B6). Los datos se representan de forma individual junto con la media /- se indican los valores de p para las diferencias entre los animales tratados con PT3 e IgG1. (B) Transferencia Western de la fracción de homogenados del tronco cerebral PI de animales tratados con IgG1 o PT3 utilizando AT100. Se muestra la señal de los homogenados de 10 animales tratados con IgG1 (IgG1-1 a IgG1-10) y 7 animales tratados con PT3 (PT3-1, PT3-2, PT3-7 a PT3-10). Se utilizó actina como control de carga.

La Figura 7 Niveles de tau total en sarcosil soluble (pT4 soluble), tau total en tau insoluble (pT4 insoluble) y fosforilada en homogenados de corteza insolubles (AT8) derivados de ratones transgénicos P301L hembra de 5 meses de edad tratados con PT3 o control de isotipo (IgG) como se indica en la figura. Los niveles se muestran como una medida de una señal de ELISA graficada individualmente junto con la media /- DE. La muestra 1m inj es una muestra de control positivo derivada de un cerebro de ratón P301L inyectado con un agregado de tau.

Sumario de la invención

[0008] La invención proporciona un anticuerpo aislado que se une PHF-tau que comprende una VH de la SEQ ID NO: 37 y una VL de la SEQ ID NO: 38, o una versión humanizada de la misma, en donde dicha versión humanizada tiene afinidad hacia PHF-tau con una constante de disociación (K ^d) menor o igual a 10-10 M, según lo determinado por ProteOn.

[0009] Otro aspecto de la invención es polinucleótidos que codifican los anticuerpos de la invención o fragmentos de los mismos.

[0010] Otro aspecto de la invención es un vector que comprende los polinucleótidos de la invención.

[0011] Otro aspecto de la invención es una célula huésped que comprende el vector de la invención.

[0012] Otro aspecto de la invención es un método para producir un anticuerpo que se une a PHF-tau que comprende cultivar la célula huésped de la invención y recuperación del anticuerpo producido por la célula huésped.

[0013] La invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

[0014] La invención proporciona además el anticuerpo de la invención para uso en el tratamiento o la prevención de, o la reducción de los síntomas de, una enfermedad neurodegenerativa que implica la agregación patológica de tau en el cerebro.

Descripción detallada de la invención

[0015] El término "anticuerpos" tal como se utiliza aquí, se entiende en un sentido amplio e incluye inmunoglobulina o moléculas de anticuerpos que incluyen anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, incluyendo anticuerpos monoclonales murinos, humanos, adaptados a humanos, humanizados y quiméricos y fragmentos de anticuerpos.

[0016] En general, los anticuerpos son proteínas o cadenas peptídicas que presentan especificidad de unión a un antígeno específico. Las estructuras de anticuerpos son bien conocidas. Las inmunoglobulinas se pueden asignar a cinco clases principales, a saber, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de la cadena pesada. IgA e IgG se subclasifican además como los isotipos IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Las cadenas ligeras de anticuerpos de cualquier especie de vertebrado pueden asignarse a uno de dos tipos claramente distintos, a saber, kappa (^k ) y lambda (X), en función de las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.

[0017] El término "fragmentos de anticuerpo" significa una porción de un anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen Fab, Fab', F(ab ')2 y Fv, CDR, sitio de unión a antígeno, región variable de cadena pesada o ligera, diacuerpos, moléculas de anticuerpo de cadena simple y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de al menos dos anticuerpos intactos o fragmentos de los mismos.

[0018] Una región variable de cadena ligera o pesada de inmunoglobulina se compone de una región "marco" interrumpida por "sitios de unión a antígeno". Los sitios de unión a antígeno se definen utilizando varios términos como sigue: (i) Las regiones determinantes de complementariedad (CDR) se basan en la variabilidad de secuencia (Wu y Kabat J Exp Med 132: 211-50, 1970). En general, el sitio de unión a antígeno tiene tres CDR en cada región variable (HCDR1, HCDR2 y HCDR3 en la región variable de cadena pesada (VH) y LCDR1, LCDR2 y LCDR3 en la región variable de cadena ligera (VL)) (Kabat et al., Secuencias de proteínas de interés inmunológico, 5a edición, Servicio de Salud Pública, Institutos Nacionales de la Salud, Bethesda, Md., 1991). (ii) El término "región hipervariable", "HVR" o "HV" se refiere a las regiones de un dominio variable de anticuerpo que tienen una estructura hipervariable como la definen Chothia y Lesk (Chothia y Lesk J Mol Biol 196: 901-17, 1987). En general, el sitio de unión al antígeno tiene tres regiones hipervariables en cada VH (HI, H2, H3) y VL (L1, L2, L3). Chothia y Lesk se refieren a los HV conservados estructuralmente como "estructuras canónicas". Abhinandan y Martin (Abhinandan y Martin Mol Immunol 45: 3832-9, 2008) han revisado recientemente los sistemas de numeración, así como la anotación de CDR y HV. (iii) Otra definición de las regiones que forman el sitio de unión a antígeno ha sido propuesta por Lefranc (Lefranc, et al. Dev Comp Immunol 27: 55-77, 2003) en base a la comparación de los dominios V de las inmunoglobulinas y los receptores de células T. La base de datos de ImMunoGeneTics (IMGT) internacional (http:_//www_imgt_org) proporciona una numeración y definición estandarizadas de estas regiones. La correspondencia entre CDR, HV y delimitaciones de IMGT se describe en Lefranc et al., Supra, (iv) El sitio de unión a antígeno también se puede delinear en función de la especificidad que determina el uso de residuos (SDRU) (Almagro J Mol Recognit 17: 132-43, 2004), donde residuos determinantes de especificación de (SDR), se refiere a los residuos de aminoácidos de una inmunoglobulina que están directamente involucrados en el contacto con el antígeno.

[0019] "Marco" o "secuencia marco" son las secuencias restantes dentro de la región variable de un anticuerpo que no sean las definidas como secuencias de sitios de unión a antígeno. Debido a que la definición exacta de un sitio de unión a antígeno puede determinarse mediante varias delineaciones como se describió anteriormente, la secuencia marco exacta depende de la definición del sitio de unión a antígeno.

[0020] El término "anticuerpo monoclonal" (mAb) como se usa en la presente memoria significa un (fragmento o anticuerpo) anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, por lo general se dirigen contra un único determinante antigénico.

[0021] El término "epítopo", como se usa en este documento significa una porción de un antígeno al que un anticuerpo se une específicamente. Los epítopos generalmente consisten en agrupaciones superficiales químicamente activas (tales como polares, no polares o hidrófobas) de restos tales como aminoácidos, aminoácidos fosforilados o cadenas laterales de polisacáridos y pueden tener características estructurales tridimensionales específicas, así como características específicas de carga. Un epítopo puede ser de naturaleza lineal o puede ser un epítopo discontinuo, por ejemplo, un epítopo conformacional, que se forma por una relación espacial entre aminoácidos no contiguos de un antígeno en lugar de una serie lineal de aminoácidos. Un epítopo conformacional incluye epítopos resultantes del plegamiento de un antígeno, donde los aminoácidos de diferentes porciones de la secuencia lineal del antígeno se encuentran en proximidad cercana en el espacio tridimensional.

[0022] La Tau es una proteína abundante del sistema nervioso central y periférico que tiene múltiples isoformas bien conocidas. En el SNC humano, existen seis isoformas tau principales que varían en tamaño de 352 a 441 debido al empalme alternativo (Hanger, et al. Trends Mol Med 15: 112-9, 2009). Estas isoformas se diferencian entre sí por la inclusión regulada de 0-2 inserciones N-terminales y 3 o 4 repeticiones de unión a microtúbulos dispuestas en tándem, y se denominan 0N3R (SEQ ID NO: 1), 1N3R (SEQ ID NO: 2), 2N3R (SEQ ID NO: 3), 0N4R (SEQ ID NO: 4), 1N4R (SEQ ID NO: 5) y 2N4R (SEQ ID NO: 6). El término "control tau", como se usa en el presente documento, se refiere a la isoforma tau de la SEQ ID NO: 6 que está exenta de fosforilación y otras modificaciones postraduccionales.

[0023] Tau se une a los microtúbulos y regula el transporte de carga a través de las células, un proceso que se puede modular mediante la fosforilación de tau. En la enfermedad de Alzheimer y trastornos relacionados, prevalece la fosforilación anormal de tau y se cree que precede y/o desencadena la agregación de tau en fibrillas, denominadas filamentos helicoidales pareados (PHF). El principal constituyente de la PHF es la tau hiperfosforilada. El término "filamento helicoidal pareado tau" o "PHF-tau", como se usa en el presente documento, se refiere a agregados tau bien conocidos en filamentos helicoidales pareados. Dos regiones principales en la estructura de PHF son evidentes en la microscopía electrónica, la capa difusa y el filamento del núcleo; la capa peluda es sensible a la proteolisis y está ubicada fuera de los filamentos, y el núcleo de filamentos resistente a la proteasa que forma la columna vertebral de los PHF (Wischik, et al. Proc Natl Acad Sci EE.UU . 85: 4884-8, 1988).

[0024] "Anticuerpos que se unen a PHF-tau" como se usa en el presente documento se refiere a anticuerpos que se unen a PHF-tau según se evaluó en transferencia Western. Típicamente, la unión del anticuerpo a PHF-tau se puede evaluar después de la tinción de Coomassie de aproximadamente 500 ng de PHF-tau después de 1 hora de bloqueo en 5% (p/v) de leche en polvo sin grasa (NFDM) TBS-T, Tween-20 al 0,05%. Los anticuerpos que se unen a PHF-tau opcionalmente no se unen a tau de control (SEQ ID NO: 6) según lo medido por transferencia Western cuando se ensayan bajo una condición de carga de antígeno en la que tanto tau de control como PHF-tau se detectan por igual por anticuerpos de tau que no tienen preferencia por epítopos PHF-tau (por ejemplo, anticuerpo HT7, (ThermoScientific, Rockford, IL) (Mercken, et al. J Neurochem 58: 548-53, 1992). Tales condiciones de carga de antígeno ejemplares son 500 ng de PHF-tau y 200 ng de control tau.

[0025] En este documento se usan códigos de aminoácidos de una y tres letras bien conocidos convencionales.

Composiciones de la materia

[0026] La presente invención se refiere a anticuerpos anti-PHF-tau y usos de tales anticuerpos. Dichos anticuerpos anti-PHF-tau pueden tener las propiedades de unirse a un epítope fosforilado en PHF-tau o unirse a un epítope no fosforilado en PHF-tau. Los anticuerpos anti-PHF-tau pueden ser útiles como agentes terapéuticos y como reactivos de investigación o diagnóstico para detectar PHF-tau en muestras biológicas, por ejemplo en tejidos o células.

[0027] Una realización de la descripción es un anticuerpo aislado que se une PHF-tau que comprende un sitio de unión a antígeno de una región variable de cadena pesada (VH) de la SEQ ID NO: 35 o 37, o un sitio de unión a antígeno de una región variable de cadena ligera (VL) de la SEQ ID NO: 36 o 38. La Tabla 1 muestra los residuos del sitio de unión al antígeno de anticuerpos ejemplares definidos de acuerdo con Kabat o Chothia, así como regiones variables de cadena ligera y pesada ejemplares.

[0028] En otra realización de la descripción, el sitio de unión a antígeno de la VH de los anticuerpos comprende regiones determinantes de la complementariedad de la cadena pesada (CDR) 1 (HCDR1), 2 (HCDR2) y 3 (HCDR3) de SEQ ID NOs: 7, 8 y 9 o 13, 14 y 15, respectivamente, y el sitio de unión a antígeno de la VL de los anticuerpos comprende CDR de cadena ligera 1 (LCDR1), 2 (LCDR2) y 3 (LCDR3) de SEQ ID NOs: 10, 11 y 12 o 16, 17 y 18, respectivamente.

[0029] Otra realización de la descripción es un anticuerpo aislado que se une PHF-tau que comprende un sitio de unión a antígeno de una región variable de cadena pesada (VH) de la SEQ ID NO: 35 o 37, y un sitio de unión a antígeno de una región variable de la cadena ligera (VL) de SEQ ID NO: 36 o 38.

[0030] En otra realización de la descripción, el sitio de unión a antígeno de la VH de los anticuerpos comprende regiones determinantes de la complementariedad de la cadena pesada (CDR) 1 (HCDR1), 2 (HCDR2) y 3 (HCDR3) de SEQ ID NOs: 13, 14 y 15, respectivamente, y el sitio de unión al antígeno de la VL de los anticuerpos comprende las CDR de cadena ligera 1 (LCDR1), 2 (LCDR2) y 3 (LCDR3) de las SEQ ID NO: 16, 17 y 18, respectivamente.

Tabla 1.

[0031] Aunque las realizaciones ilustradas en los Ejemplos comprenden pares de regiones variables, uno de una cadena pesada y uno de una cadena ligera, un experto en la técnica reconocerá que las realizaciones alternativas pueden comprender regiones variables de cadena pesada o ligera individuales. La región variable única se puede usar para detectar dominios variables capaces de formar un fragmento de unión a antígeno específico de dos dominios capaces de, por ejemplo, unirse a PHF-tau. La selección puede llevarse a cabo mediante métodos de selección de visualización de fagos usando, por ejemplo, el enfoque combinatorio dual jerárquico descrito en la publicación PCT. No. WO92/01047. En este enfoque, se utiliza una colonia individual que contiene un clon de la cadena H o L para infectar una biblioteca completa de clones que codifican la otra cadena (L o H), y el dominio de unión al antígeno específico de dos cadenas resultante se selecciona de acuerdo con técnicas de visualización de fagos como se describe.

[0032] Otra realización de la descripción es un anticuerpo aislado que se une PHF-tau que comprende un sitio de unión a antígeno de una región variable de cadena pesada (VH) de la SEQ ID NO: 35 y un sitio de unión a antígeno de una región variable de cadena ligera (VL) de SEQ ID NO: 36.

[0033] Otra realización de la descripción es un anticuerpo aislado que se une PHF-tau que comprende un sitio de unión a antígeno de una región variable de cadena pesada (VH) de la SEQ ID NO: 37 y un sitio de unión a antígeno de una región variable de cadena ligera (VL) de SEQ ID NO: 38.

[0034] Otra realización de la descripción es un anticuerpo aislado que se une PHF-tau que comprende regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada (CDR) 1 (HCDR1), 2 (HCDR2) y 3 (Hc Dr 3) de SEQ ID NOs: 7, 8 y 9, respectivamente, y las CDR de cadena ligera 1 (Lc Dr 1), 2 (Lc Dr 2) y 3 (LCDR3) de SEQ ID NOs: 10, 11 y 12, respectivamente.

[0035] Otra realización de la descripción es un anticuerpo aislado que se une PHF-tau que comprende regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada (CDR) 1 (HCDR1), 2 (HCDR2) y 3 (Hc Dr 3) de SEQ ID NOs: 13, 14 y 15, respectivamente, y las CDR de cadena ligera 1 (Lc Dr 1), 2 (LCDR2) y 3 (Lc DR3) de SEQ ID NOs: 16, 17 y 18, respectivamente.

[0036] En cualquiera de las realizaciones anteriores, el anticuerpo aislado que se une a PHF-tau puede humanizarse.

[0037] Los anticuerpos de la presente invención se pueden producir mediante una variedad de técnicas, por ejemplo, por el método de hibridoma (Kohler y Milstein Nature 256: 495-7, 1975). Los mAbs quiméricos que contienen una región variable de cadena ligera y cadena derivada de un anticuerpo donante (típicamente murino) en asociación con regiones constantes de cadena ligera y pesada derivadas de un anticuerpo aceptor (típicamente otra especie de mamífero como el humano) pueden prepararse por el método descrito en la patente de EE.UU . N° 4.816.567. Los mAbs injertados con CDR que tienen CDRs derivados de una inmunoglobulina donante no humana (típicamente murina) y las partes restantes derivadas de inmunoglobulina de la molécula que se derivan de una o más inmunoglobulinas humanas pueden prepararse mediante técnicas conocidas por los expertos en la técnica, tales como las que se describen en la patente de EE.UU . N° 5.225.539. Se pueden preparar mAbs completamente humanos que carecen de secuencias no humanas a partir de ratones transgénicos con inmunoglobulina humana mediante técnicas a las que se hace referencia en (Lonberg, et al. Nature 368: 856-9, 1994, Fishwild y otros, Nat Biotechnol 14: 845-51, 1996, Mendez, et al., Nat Genet 15: 146-56, 1997). Los mAb humanos también pueden prepararse y optimizarse a partir de bibliotecas de presentación de fagos (Knappik, et al. J Mol Biol 296: 57-86, 2000, Krebs, et al. JImmunol Methods 254: 67-84, 2001, Shi, et al. J Mol Biol 397: 385-96, 2010).

[0038] La humanización de anticuerpos se puede lograr usando métodos bien conocidos, como la determinación de la especificidad de los recursos de repavimentación (SD RR) (Publicación de los Estados Unidos N° 2010/0261620), repavimentación (Padlan et al. Mol. Immunol. 28: 489-98, 1991), super humanización (Int. Pat. Publ. N°WO04/006955) y optimización del contenido de cuerdas humanas (US Pat. N° 7.657.380). Los expertos en la técnica pueden seleccionar secuencias marco humanas útiles para injertar/humanizar a partir de bases de datos relevantes. Los marcos seleccionados pueden modificarse adicionalmente para preservar o mejorar la afinidad de unión mediante técnicas tales como las descritas en Queen et al. (Queen, et al. Proc Natl Acad Sci EE.UU . 86: 10029-33, 1989) o en la Publicación de EE.UU . N° 2011/0092372.

[0039] La preparación de PHF-tau para ser usada como un antígeno para inmunización o aislamiento de anticuerpos de bibliotecas de presentación de fagos puede realizarse usando cualquier técnica adecuada. En un método ejemplar, la PHF-tau se aísla de cerebros de pacientes con EA que utilizan protocolos bien conocidos, como los descritos en Greenberg y Davies (Greenberg y Davies Proc Natl Acad Sci EE.UU . 87: 5827-31, 1990). La PHF-tau puede aislarse de la corteza postmortem de un paciente con Alzheimer. La PHF-tau aislada se caracteriza por su estado de pureza e hiperfosforilación con anticuerpos que se sabe que reaccionan con PHF-tau. En una preparación típica de PHF-tau, las bandas hiperfosforiladas que migran a aproximadamente 60, 64, 68 y 72 kDa en transferencia Western (Spillantini y Goedert Trends Neurosci 21: 428-33, 1998) se detectan por un anticuerpo AT8 que se une específicamente a PHF-tau hiperfosforilada pero no PHF-tau defosforilada.

[0040] Los anticuerpos de la presente invención puede tener las características de no unión de control tau de la SEQ ID NO: 6. Dichos anticuerpos pueden generarse usando los métodos descritos anteriormente y ensayando los anticuerpos por su falta de unión para controlar tau en transferencias Western seguido de tinción de Coomassie como se describe anteriormente. El control tau puede expresarse y purificarse de forma recombinante utilizando métodos estándar. Los anticuerpos ejemplares que se unen a PHF-tau pero no a control tau son los anticuerpos PT1 y PT3. Los anticuerpos de la invención pueden evaluarse adicionalmente por su especificidad, por ejemplo, usando inmunohistoquímica en rodajas de cerebro de control y EA.

[0041] Los anticuerpos pueden tener afinidades hacia PHF-tau con una constante (K ^d) de menos de o igual a aproximadamente 10-10 disociación, 10-11 o 10-12 M. La afinidad de una molécula dada para PHF-tau puede ser determinada experimentalmente utilizando cualquier método adecuado. Dichos métodos pueden utilizar instrumentos de Biacore, ProteOn o KinExA, ELISA o ensayos de unión competitiva conocidos por los expertos en la técnica.

[0042] Otro aspecto de la descripción es un anticuerpo aislado o fragmento que compite por la PHF-tau de unión con un anticuerpo monoclonal que comprende un sitio de unión a antígeno de una región variable de cadena pesada (VH) de la SEQ ID NO: 35 y un sitio de unión a antígenos de una región variable de cadena ligera (VL) de SEQ ID NO: 36, o un sitio de unión a antígeno de una región variable de cadena pesada (VH) de SEQ ID NO: 37 y un sitio de unión a antígenos de una variable de región de cadena ligera (VL) de SEQ ID NO: 38.

[0043] La competición entre la unión a PHF-tau se puede ensayar in vitro utilizando métodos bien conocidos. Por ejemplo, la unión del anticuerpo MSS sulfo-TagTM marcado con NHS-éster al PHF-tau en presencia de un anticuerpo no marcado se puede evaluar utilizando un inmunoensayo seguido de detección por electroquimioluminiscencia.

[0044] Varias metodologías bien conocidas, además de unión competitiva se pueden emplear para determinar el epítopo de unión de los anticuerpos de la invención. Por ejemplo, cuando se conocen las estructuras de ambos componentes individuales, se puede llevar a cabo un acoplamiento in silico proteína-proteína para identificar sitios compatibles de interacción. El intercambio de hidrógeno-deuterio (H/D) se puede llevar a cabo con el complejo de antígeno y anticuerpo para mapear regiones en el antígeno que puede estar unido por el anticuerpo. La mutagénesis segmentaria y puntual del antígeno se puede usar para localizar los aminoácidos importantes para la unión del anticuerpo. La estructura de co-cristal del complejo antígeno-anticuerpo se utiliza para identificar los residuos que contribuyen al epítope y al paratope.

[0045] Los anticuerpos de la invención pueden ser anticuerpos monoclonales de los isotipos IgG, IgD, IgA o IgM. Los anticuerpos de la invención pueden ser biespecíficos o multiespecíficos. Un anticuerpo biespecífico ejemplar puede unirse a dos epítopos distintos en PHF-tau o puede unirse a PHF-tau y beta amiloide (Ap). Otro ejemplo de anticuerpo biespecífico puede unirse a PHF-tau y un receptor endógeno de la transcitosis de la barrera hematoencefálica, como el receptor de insulina, el receptor de transferencia, el receptor del factor de crecimiento tipo insulina 1 y el receptor de lipoproteínas. Un anticuerpo ejemplar es del tipo IgG1.

[0046] Propiedades efectoras inmunes de los anticuerpos de la invención pueden ser mejoradas o silenciadas a través de modificaciones Fc por técnicas conocidas para los expertos en la técnica. Por ejemplo, las funciones efectoras de Fc, como la unión a C1q, la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), la fagocitosis, la regulación negativa de los receptores de la superficie celular (por ejemplo, el receptor de células B; BCR), etc. ser provisto y/o controlado modificando los residuos en el Fc responsable de estas actividades. Las propiedades farmacocinéticas también podrían mejorarse mediante la mutación de residuos en el dominio Fc que prolongan la vida media del anticuerpo (Strohl Curr Opin Biotechnol 20: 685-91, 2009).

[0047] Además, los anticuerpos de la invención pueden ser modificados después de la traducción por procesos tales como la glicosilación, isomerización, desglicosilación o modificación covalente de origen no natural, tales como la adición de restos de polietilenglicol (pegilación) y lipidación. Tales modificaciones pueden ocurrir in vivo o in vitro. Por ejemplo, los anticuerpos de la invención pueden conjugarse con polietilenglicol (PEGilado) para mejorar sus perfiles farmacocinéticos. La conservación puede llevarse a cabo mediante técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Se ha demostrado que la conjugación de anticuerpos terapéuticos con PEG mejora la farmacodinámica sin interferir con la función (Knight, et al., Platelets 15: 409-18, 2004, Leong, et al. Cytokine 16: 106-19, 2001, Yang, et al. Protein Eng 16: 761-70, 2003).

[0048] Otra realización de la invención es un polinucleótido aislado que codifica los anticuerpos de la invención o su complemento, o fragmentos de los mismos. Polinucleótidos aislados a modo de ejemplo de la divulgación son polinucleótidos que codifican polipéptidos que comprenden una CDR de cadena pesada de inmunoglobulina HCDR1, HCDR2 y HCDR3 mostradas en las SEQ ID nO: 7, 8 y 9 o 13, 14 y 15, respectivamente, o polipéptidos que comprenden una cadena inmunológica de inmunoglobulina. Las CDR LCDR1, LCDR2 y LCDR3 se muestran en las SEQ ID NO: 10, 11 y 12 o 16, 17 y 18, respectivamente, y los polinucleótidos que tienen una secuencia mostrada en las SEQ ID NO: 31-34, que codifican las regiones variables del anticuerpo. Otros polinucleótidos que, dada la degeneración del código genético o las preferencias de codones en un sistema de expresión dado, codifican los anticuerpos de la invención también están dentro del alcance de la invención. Los ácidos nucleicos aislados de la presente invención pueden prepararse usando técnicas recombinantes o sintéticas bien conocidas. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se aísla y secuencia fácilmente usando métodos conocidos en la técnica. Cuando se produce un hibridoma, tales células pueden servir como una fuente de dicho ADN. Alternativamente, utilizando técnicas de visualización en las que la secuencia de codificación y el producto de traducción están vinculados, como las bibliotecas de presentación de fagos o ribosomas, se simplifica la selección del aglutinante y el ácido nucleico. Después de la selección del fago, las regiones codificantes de anticuerpos del fago pueden aislarse y usarse para generar anticuerpos completos, incluidos los anticuerpos humanos, o cualquier otro fragmento de unión a antígeno deseado, y expresarse en cualquier huésped deseado, incluidas las células de mamíferos, células de insectos, células vegetales, levadura, y bacterias.

[0049] Otra realización de la invención es un vector que comprende al menos un polinucleótido de la invención. Dichos vectores pueden ser vectores de plásmidos, vectores virales, vectores basados en transposones o cualquier otro vector adecuado para la introducción de los polinucleótidos de la invención en un organismo o fondo genético dado por cualquier medio.

[0050] Otra realización de la invención es una célula huésped que comprende cualquiera de los polinucleótidos de la invención. Dichas células huésped pueden ser células eucariotas, células bacterianas, células vegetales o células archeales. Las células eucariotas ejemplares pueden ser de origen mamífero, insecto, aviar u otro animal. Las células eucariotas de mamíferos incluyen líneas celulares inmortalizadas, como hibridomas o líneas celulares de mieloma, como SP2/0 (American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, CRL-1581), NS0 (Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC), Salisbury, Wiltshire, RU, ECACC N° 85110503), líneas celulares murinas FO (ATCC CRL-1646) y Ag653 (ATCC CRL-1580). Una línea celular de mieloma humano ejemplar es U266 (ATTC CRL-TIB-196). Otras líneas celulares útiles incluyen las derivadas de células de ovario de hámster chino (CHO) como CHO-K1SV (Lonza Biologics), CHO-K1 (ATCC CRL-61, Invitrogen) o DG44.

[0051] Otra realización de la invención es un método de fabricación de un anticuerpo que se une tau PHF comprende cultivar una célula huésped de la invención y recuperar el anticuerpo producido por la célula huésped. Los métodos para producir anticuerpos y purificarlos son bien conocidos en la técnica.

Métodos de tratamiento

[0052] Los anticuerpos anti-PHF-tau de la invención o fragmentos de los mismos, incluyendo Fab, (Fab')2, fragmentos scFv o anticuerpos que comprenden sitios de unión a antígeno de los anticuerpos de la invención pueden usarse para tratar, reducir o prevenir síntomas en pacientes que tienen una enfermedad neurodegenerativa que implica la agregación patológica de tau dentre del cerebro, tales como pacientes que padecen EA y otra tauopatía. Aunque no deseen estar sujetos a ninguna teoría particular, los anticuerpos de la invención pueden ejercer su efecto beneficioso al reducir la agregación patológica de tau y, por lo tanto, la cantidad de PHF-tau en el cerebro. Los anticuerpos de la invención se pueden usar para tratar a un paciente animal que pertenece a cualquier clasificación. Ejemplos de tales animales incluyen mamíferos tales como seres humanos, roedores, perros, gatos y animales de granja. Por ejemplo, los anticuerpos de la invención son útiles en la preparación de un medicamento para el tratamiento de la EA en el que el medicamento se prepara para la administración en dosis definidas en el presente documento.

[0053] Otra realización de la invención es un anticuerpo de la invención para uso en un método para reducir la agregación de tau en pacientes en necesidad del mismo que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo aislado de la invención durante un tiempo suficiente para reducir la agregación de tau.

[0054] Otra realización de la invención es un anticuerpo de la invención para uso en un método para tratar o reducir los síntomas de una enfermedad neurodegenerativa que implica la agregación de tau en un paciente que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo aislado de la invención durante un tiempo suficiente para tratar o reducir los síntomas de la enfermedad neurodegenerativa.

[0055] En cualquiera de las realizaciones anteriores, la enfermedad neurodegenerativa que implica la agregación de tau es una tauopatía.

[0056] En cualquiera de las realizaciones de la descripción, el anticuerpo aislado comprende un anticuerpo que se une PHF-tau que comprende un sitio de unión a antígeno de un VH de SEQ ID NO: 35 y un sitio de unión a antígeno de un VL de SEQ ID NO: 36.

[0057] En cualquiera de las realizaciones anteriores, el anticuerpo aislado comprende un anticuerpo que se une PHF-tau que comprende un sitio de unión a antígeno de un VH de SEQ ID NO: 37 y un sitio de unión a antígeno de un VL de la SEQ ID NO: 38.

[0058] Como se usa en el presente documento una "tauopatía" abarca cualquier enfermedad neurodegenerativa que implica la agregación patológica de tau en el cerebro. Además de la EA familiar y esporádica, otras tauopatías ejemplares son la demencia frontotemporal con parkinsonismo vinculado al cromosoma 17 (FTDP-17), parálisis supranuclear progresiva, degeneración corticobasal, enfermedad de Pick, gliosis subcortical progresiva, demencia solo tangencial, bridas neurofibrilares difusas con calcificación, demencia de grano argirofílico, complejo de parkinsonismo-demencia de esclerosis lateral amiotrófica, síndrome de Down, enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheinker, enfermedad de Hallervorden-Spatz, inclusión de miositis en el cuerpo, enfermedad de Creutzfeld-Jakob, enfermedad de múltiples sistemas, enfermedad de Niemann-Pick tipo C, proteína priónica, angiopatía amiloide cerebral, panencefalitis subaguda con escamas, distrofia miotónica, enfermedad de la neurona motora no guanamiana con ovillos neurofibrilares, parkinsonismo post-cefalítico y encefalopatía traumática crónica, como demencia pugulística (enfermedad de boxeo). (Morris, et al. Neuron 70: 410-26, 2011).

[0059] Un fenotipo conductual relacionado con taupatía incluye deterioro cognitivo, cambios en la personalidad y desinhibición temprana, apatía, abulia, mutismo, apraxia, perseveración, movimientos/comportamientos estereotipados, hiperoralidad, desorganización, incapacidad para planificar u organizar las tareas secuenciales, egoísmo/insensibilidad, rasgos antisociales, falta de empatía, interrupción del habla, habla agramática con frecuentes errores parafásicos pero comprensión relativamente conservada, deficiencias en la comprensión y deficiencias en la búsqueda de palabras, inestabilidad de la marcha lentamente progresiva, retropulsiones, congelación, caídas frecuentes, rigidez axial responsiva sin levodopa, parálisis supranuclear de la mirada, sacudidas de onda cuadrada, movimientos sacádicos lentos verticales, parálisis pseudobulbar, apraxia de las extremidades, distonía, pérdida sensorial cortical y temblor.

[0060] Los pacientes susceptibles de tratamiento incluyen individuos asintomáticos con riesgo de EA u otra tauopatía, así como pacientes que presentan síntomas actualmente. Los pacientes susceptibles de tratamiento incluyen individuos que tienen un riesgo genético conocido de EA, como antecedentes familiares de EA o presencia de factores de riesgo genéticos en el genoma. Los factores de riesgo ejemplares son mutaciones en la proteína precursora de amiloide (APP), especialmente en la posición 717 y las posiciones 670 y 671 (mutaciones de Hardy y Swedish, respectivamente). Otros factores de riesgo son las mutaciones en los genes de presenilina, PS1 y PS2, y ApoE4, antecedentes familiares de hipercolesterolemia o aterosclerosis. Las personas que actualmente padecen e A pueden ser reconocidas de la demencia característica por la presencia de factores de riesgo descritos anteriormente. Además, hay una serie de pruebas de diagnóstico disponibles para identificar a las personas que tienen EA. Estas incluyen la medición de los niveles de tau y Ap42 del líquido cefalorraquídeo. Los niveles elevados de tau y disminuidos de Ap42 significan la presencia de EA. Las personas que sufren de EA también pueden ser diagnosticadas por E A y los criterios de la Asociación de Trastornos Relacionados.

Administración/Composiciones Farm acéuticas

[0061] Los anticuerpos anti-PHF-tau de la invención son adecuados tanto como agentes terapéuticos como profilácticos para tratar o prevenir enfermedades neurodegenerativas que implican la agregación patológica de tau, tal como EA u otras tauopatías. En pacientes asintomáticos, el tratamiento puede comenzar a cualquier edad (por ejemplo, a aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30 años). Por lo general, sin embargo, no es necesario comenzar el tratamiento hasta que el paciente alcance los 40, 50, 60 o 70 años. El tratamiento generalmente implica múltiples dosis durante un período de tiempo. El tratamiento puede controlarse analizando el anticuerpo o las respuestas de las células T o B activadas al agente terapéutico a lo largo del tiempo. Si la respuesta cae, se indica una dosis de refuerzo.

[0062] En las aplicaciones profilácticas, las composiciones farmacéuticas o medicamentos se administran a un paciente susceptible de, o de otra manera en riesgo de, EA en una cantidad suficiente para eliminar o reducir el riesgo, disminuir la gravedad, o retrasar el comienzo de la enfermedad, incluidos los síntomas bioquímicos, histológicos y/o de comportamiento de la enfermedad, sus complicaciones y los fenotipos patológicos intermedios presentados durante el desarrollo de la enfermedad. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones o los medicamentos se administran a un paciente sospechoso de o que ya padece dicha enfermedad en una cantidad suficiente para reducir, detener o retrasar cualquiera de los síntomas de la enfermedad (bioquímicos, histológicos y/o de comportamiento). La administración de un agente terapéutico puede reducir o eliminar el deterioro cognitivo leve en pacientes que aún no han desarrollado la patología característica del Alzheimer. Una cantidad adecuada para lograr un tratamiento terapéutico o profiláctico se define como una dosis terapéuticamente o profilácticamente eficaz. Tanto en los regímenes profilácticos como en los terapéuticos, las composiciones o medicamentos se administran usualmente en varias dosis hasta que se haya logrado una respuesta inmune suficiente.

[0063] Los anticuerpos anti-PHF-tau o fragmentos de los mismos de la invención se pueden administrar en combinación con otros agentes que son eficaces para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas relacionadas. En el caso de EA, los anticuerpos de la invención se pueden administrar en combinación con agentes que reducen o previenen la deposición de beta-amiloide (Ap). Es posible que las patologías PHF-tau y Ap sean sinérgicas. Por lo tanto, la terapia de combinación dirigida al aclaramiento de ambas patologías relacionadas con PHF-tau y Ap y Ap al mismo tiempo puede ser más efectiva que la orientación individual de cada una.

[0064] En el caso de la enfermedad de Parkinson y enfermedades neurodegenerativas relacionadas, la modulación inmune para borrar formas agregadas de la proteína de a-sinucleína es también una terapia emergente. Una terapia de combinación que apunte al aclaramiento de las proteínas tau y a-sinucleína simultáneamente puede ser más efectiva que apuntar a cada proteína individualmente.

[0065] Como se usa en el presente documento, la "cantidad terapéuticamente eficaz" del anticuerpo en el tratamiento o mejora de los síntomas de una tauopatía se puede determinar por técnicas de investigación estándar. Por ejemplo, la dosis del anticuerpo se puede determinar administrando el agente a modelos animales relevantes bien conocidos en la técnica.

[0066] Además, los ensayos in vitro pueden emplearse opcionalmente para ayudar a identificar intervalos de dosificación óptimos. Los expertos en la técnica pueden determinar la selección de una dosis efectiva particular (por ejemplo, mediante ensayos clínicos) basándose en la consideración de varios factores. Tales factores incluyen la enfermedad a tratar o prevenir, los síntomas involucrados, la masa corporal del paciente, el estado inmune del paciente y otros factores conocidos por los expertos en la técnica. La dosis precisa que se empleará en la formulación también dependerá de la vía de administración y la gravedad de la enfermedad, y debe decidirse según el criterio del médico y las circunstancias de cada paciente. Las dosis efectivas pueden extrapolarse a partir de curvas de dosis-respuesta derivadas de sistemas de prueba in vitro o de modelos animales.

[0067] El modo de administración para el uso terapéutico de los anticuerpos de la invención puede ser cualquier vía adecuada que suministre el agente al huésped. Las composiciones farmacéuticas de estos anticuerpos son útiles para la administración parenteral, por ejemplo, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal o intracraneal o pueden administrarse en el líquido cefalorraquídeo del cerebro o la columna vertebral.

[0068] Los anticuerpos de la invención se pueden preparar como composiciones farmacéuticas que contienen una cantidad eficaz del anticuerpo como un ingrediente activo en un vehículo farmacéuticamente aceptable. El término "portador" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra el anticuerpo. Dichos vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos, tales como agua y aceites, incluidos los de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. Por ejemplo, se puede usar un 0,4% de solución salina y un 0,3% de glicina. Estas soluciones son estériles y generalmente libres de partículas. Pueden esterilizarse mediante técnicas convencionales de esterilización bien conocidas (p. ej., filtración). Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximarse a condiciones fisiológicas tales como agentes de ajuste y tamponamiento del pH, agentes estabilizantes, espesantes, lubricantes y colorantes, etc. La concentración de los anticuerpos de la invención en dicha formulación farmacéutica puede variar ampliamente, es decir, desde menos de aproximadamente el 0,5%, generalmente en o al menos aproximadamente el 1% hasta tanto como el 15 o el 20% en peso y se seleccionará principalmente en base a la dosis requerida, volúmenes de fluidos, viscosidades, etc., de acuerdo con el modo particular de administración seleccionado.

[0069] El tratamiento se puede administrar en un solo programa de dosis, o como un programa de dosis múltiple en el que un curso primario de tratamiento puede ser con 1-10 dosis separadas, seguido de otras dosis administradas a intervalos de tiempo posteriores requeridos para mantener y/o reforzar la respuesta, por ejemplo, de 1 a 4 meses para una segunda dosis y, si es necesario, una dosis posterior después de varios meses. Los ejemplos de programas de tratamiento adecuados incluyen: (i) 0, 1 mes y 6 meses, (ii) 0, 7 días y 1 mes, (iii) 0 y 1 mes, (iv) 0 y 6 meses, u otros programas suficientes para obtener las respuestas deseadas que se espera que reduzcan los síntomas de la enfermedad o reduzcan la gravedad de la enfermedad.

[0070] Por lo tanto, una composición farmacéutica de la invención para inyección intramuscular podría prepararse para contener 1 ml de agua tamponada estéril, y entre aproximadamente 1 ng a aproximadamente 100 mg, aproximadamente 50 ng a aproximadamente 30 mg o aproximadamente 5 mg a aproximadamente 25 mg de un anticuerpo de la invención. De manera similar, una composición farmacéutica de la invención para infusión intravenosa se podría preparar para contener aproximadamente 250 ml de solución de Ringer estéril y aproximadamente 1 mg a aproximadamente 30 mg o aproximadamente 5 mg a aproximadamente 25 mg de un anticuerpo de la invención. Los métodos reales para preparar composiciones administrables por vía parenteral son bien conocidos y se describen con más detalle en, por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Science", 15a edición, Mack Publishing Company, Easton, PA.

[0071] Los anticuerpos de la invención pueden liofilizarse para almacenamiento y reconstituirse en un vehículo adecuado antes de su uso. Se ha demostrado que esta técnica es efectiva con los anticuerpos y otras preparaciones de proteínas y se pueden emplear técnicas de liofilización y reconstitución conocidas en la técnica.

Métodos de diagnóstico y kits.

[0072] Los anticuerpos de la invención se pueden usar en métodos de diagnóstico de EA o de otro tauopatía en un sujeto. Este método implica detectar, en el sujeto, la presencia de PHF-tau utilizando un reactivo de diagnóstico tal como un anticuerpo o un fragmento del mismo de la presente invención.

[0073] La PHF-tau puede detectarse en una muestra biológica de un sujeto (p. ej., sangre, orina, líquido cefalorraquídeo) poniendo en contacto la muestra biológica con el reactivo de anticuerpo de diagnóstico y detectando la unión del reactivo de anticuerpo de diagnóstico a PHF-tau en la muestra del sujeto. Los ensayos para llevar a cabo la detección incluyen métodos bien conocidos tales como ELISA, inmunohistoquímica, transferencia Western o formación de imágenes in vivo. Los anticuerpos de diagnóstico ejemplares son los anticuerpos PT1 y PT3, y son de tipo IgG1,K.

[0074] Los anticuerpos de diagnóstico o reactivos similares pueden administrarse por inyección intravenosa en el cuerpo del paciente, o directamente en el cerebro por cualquier vía adecuada que suministre el agente al huésped como se ejemplifica anteriormente. La dosis de anticuerpo debe estar dentro de los mismos rangos que para los métodos de tratamiento. Típicamente, el anticuerpo está marcado, aunque en algunos métodos, el anticuerpo primario con afinidad por PHF-tau no está marcado y se usa un agente de marcaje secundario para unirse al anticuerpo primario. La elección de la etiqueta depende de los medios de detección. Por ejemplo, una etiqueta fluorescente es adecuada para la detección óptica. El uso de etiquetas paramagnéticas es adecuado para la detección tomográfica sin intervención quirúrgica. Las etiquetas radiactivas también se pueden detectar utilizando PET o SP EC T .

[0075] El diagnóstico se realiza comparando el número, tamaño y/o intensidad de PHF-tau, agregados de tau y/o enredos neurofibrilares en una muestra del sujeto o en el sujeto, con los valores de referencia correspondientes. Los valores de referencia pueden representar los niveles medios en una población de individuos no enfermos. Los valores de línea de base también pueden representar niveles previos determinados en el mismo sujeto.

[0076] Los métodos de diagnóstico descritos anteriormente también se pueden usar para controlar la respuesta de un sujeto a la terapia mediante la detección de la presencia de PHF-tau en un sujeto antes, durante o después del tratamiento. Una disminución en los valores en relación con la línea de base indica una respuesta positiva al tratamiento. Los valores también pueden aumentar temporalmente en los fluidos biológicos a medida que la tau patológica se elimina del cerebro.

[0077] Se describe aquí un kit para realizar los métodos de diagnóstico y seguimiento anteriormente descritos. Normalmente, tales kits contienen un reactivo de diagnóstico como los anticuerpos de la divulgación y, opcionalmente, una etiqueta detectable. El propio anticuerpo de diagnóstico puede contener el marcador detectable (p. ej., molécula fluorescente, biotina, etc.) que es directamente detectable o detectable a través de una reacción secundaria (p. ej., reacción con estreptavidina). Alternativamente, se puede utilizar un segundo reactivo que contiene el marcador detectable, donde el segundo reactivo tiene especificidad de unión para el anticuerpo primario. En un kit de diagnóstico adecuado para medir PHF-tau en una muestra biológica, los anticuerpos del kit pueden suministrarse preconducidos a una fase sólida, como a los pocillos de una placa de microtitulación.

Ejemplo 1

Purificación de filamento tau helicoidal emparejado (PHF-tau)

[0078] La PHF-tau se purificó parcialmente mediante un método modificado de Greenberg y Davies (Greenberg y Davies Proc Natl Acad Sci EE.UU. 87: 5827-31, 1990). Brevemente, el tejido postmortem de la corteza obtenido de un paciente con Alzheimer histológicamente confirmado fue parcialmente purificado. Típicamente, se homogeneizaron 5 mg de corteza frontal en 10 vol de tampón frío H (Tris 10 mM, NaCI 800 mM, EG TA 1 mM y sacarosa al 10%/pH 7,4) utilizando un homogeneizador de tejidos de vidrio/Teflon Potter (IKA Works, Inc ; Staufen, Alemania) a 1000 rpm. El material homogeneizado se centrifugó a 27.000 g durante 20 min en un rotor Sorvall SS34. El sedimento se desechó y el sobrenadante se ajustó a una concentración final de 1% (p/v) de N-lauroilsarcosina y 1% (v/v) de 2-mercaptoetanol y se incubó durante 2 horas a 37°C. Posteriormente, el sobrenadante se centrifugó a 108.000 g durante 35 min a 20°C en un rotor Beckman 60Ti. El sedimento se lavó cuidadosamente en PBS y se suspendió en PBS. El sobrenadante se centrifugó por segunda vez como se describe y el sedimento final se disolvió, se dividió en partes alícuotas y se congeló a -80°C. La calidad de las preparaciones de PHF-tau se evaluó en una SDS-PAGE al 12% y transferencia de Western con anticuerpos anti-tau AT8 y HT7 (ThermoScientific, Rockford, IL). AT8 detecta PHF-tau fosforilada en S202/T205, pero no se une a PHF-tau no fosforilada ni a la tau de tipo salvaje. HT7 se une a un epítope no fosforilado en los aminoácidos 159-163 de Tau (de la SEQ ID NO: 6), y reconoce tanto tau como PHF-tau. Una preparación de PHF-tau de buena calidad se compone de 4 bandas que tienen pesos moleculares de aproximadamente 60, 64, 66 y 72 kDa en una transferencia de Western detectada con un anticuerpo reactivo con PHF-tau hiperfosforilado, como AT8. Se hicieron dos preparaciones de PHF-tau separadas con calidad y pureza comparables a partir de la misma muestra de cerebro. La preparación 1 se utilizó para la inmunización.

Ejemplo 2

Generación de anticuerpos monoclonales contra PHF-tau

[0079] Los anticuerpos Anti- PHF-tau se generaron utilizando la tecnología de hibridomas estándar en ratones Balb/c normales (Kohler y Milstein Nature 256: 495-7, 1975). Los hibridomas obtenidos se sembraron en placas de 96 pocillos y se seleccionaron después de 10 días en un ELISA directo en 25 ng/pocillo recubierto con PHF-tau como se describe a continuación. Las células positivas se analizaron para determinar la reactividad cruzada en 10 ng/pocillo recubierto con control tau (SEQ ID NO: 6) expresada en células E. Coli BL21 y se purificaron mediante tratamiento térmico y precipitación con sulfato de amonio, y se subclonaron inmediatamente y los clones positivos se congelaron. En nitrógeno líquido. Todos los hibridomas se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado con un 10% de suero de ternera fetal (Hyclone, Europa), suplemento de clonación por fusión de hibridomas (2%) (Roche, Bruselas, Bélgica) 2% de HT (Sigma, EE . UU.), Piruvato de sodio 1 mM, L-glutamina 2 mM y penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (50 mg/ml).

[0080] Las regiones variables de anticuerpo se clonaron a partir de células de hibridoma seleccionadas en un fondo IgG1/IgG2/ k de ratón y se expresaron y se purificaron usando métodos habituales.

ELISA directo para la selección de anticuerpos

[0081] PHF-tau de 25 ng/pocillo se recubrió durante la noche a 4°C en placas de microtitulación de fondo plano de alta unión de 96 pocillos de NUNC Maxisorp (Life Technologies) en tampón de recubrimiento de 50 pl/pocillo (Tris 10 mM, 10 NaCl mM y NaN3 10 mM, pH 8,5). Al día siguiente, las placas se bloquearon con 75 pl/pocillo de caseína al 0,1% en PBS durante 60 minutos a temperatura ambiente. A continuación, 50 pl de hybridoma sobrenadante se añadió y se incubó durante 1 h a 37°C. Después del lavado, los anticuerpos monoclonales unidos se detectaron con 50 pl/pocillo de IgG de oveja anti ratón conjugada con peroxidasa de rábano picante durante 1 hora a 37°C (Amersham-Pharmacia Biotech). Ambos reactivos se diluyeron en caseína al 0,1%/PBS. Las placas se lavaron y 50 pl de una solución de 3,5,3',5'-tetrametil-bencidina 0,42 mM, 0,003% (v/v) H²O² en 100 mM de ácido cítrico y 100 mM de fosfato de hidrógeno disódico (pH 4,3) se añadió como el sustrato. La reacción se dejó proceder durante un máximo de 15 minutos en un agitador de placas a temperatura ambiente, después de lo cual se detuvo el desarrollo de color con 2 N H²SO ⁴ , 50 pl/pocillo y las placas se leyeron en un lector de placas de microtitulación a 450 nm (Thermomax, Molecular Devices).

Especificidad de los anticuerpos monoclonales.

[0082] Los anticuerpos selectos obtenidos a partir del cribado de hibridoma se analizaron para determinar su reactividad cruzada con tau de control expresado de forma recombinante (SEQ ID NO: 6). Se cargaron 500 ng de PHF-tau y 200 ng de control tau en un gel NuPAGE® Novex® Bis-Tris 4-12% y se secaron en una membrana de nitrocelulosa mediante el uso de un sistema iBlot (Invitrogen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las membranas se bloquearon durante 1 hora con solución salina tamponada con Tween-20 (TBS-T; Tris 1M, NaCl 150 mM y Tween-20 al 0,05%, pH 8,5) que contenía leche sin grasa (NFDM) (5% p/v; Biorad) y se lavó tres veces en TBS-T. La incubación con los anticuerpos de control primario (1 pg/ml) HT7, AT8, AT100 (ThermoScientific, Rockford, IL) y BT2 diluidos en TBS-T que contenía NFDM (5% p/v) se realizó durante la noche a 4°C. Se añadieron anticuerpos monoclonales PT1, PT2, PT3, PT4 y PT5 seleccionados del cribado de hibridoma en un sobrenadante de cultivo que contenía FCS al 10%. Los anticuerpos primarios se detectaron utilizando Ig oveja anti ratón conjugado con HRPO (1:20.000 en TBS-T, Amersham Biosciences) a través de la quimioluminiscencia mejorada West Dura® (Pierce, Thermoscientific). Las señales fueron capturadas por el sistema de imágenes Lumi (Roche Diagnostic). PT1 y PT3 reaccionaron con PHF-tau y no reaccionaron con control tau en transferencias Western. PT2 fue reactivo con ambas proteínas. Los perfiles de unión de HT7 y AT8 se describen anteriormente. AT100 se une a Ser212/Thr214 fosforilado y se une a PHF-tau pero no a tau de tipo salvaje. BT2 reconoce un epítope no fosforilado que comprende S199/S202, y por lo tanto reconoce tau de tipo salvaje pero no PHF-tau.

Unión competitiva de epítopos

[0083] Se evaluaron los anticuerpos monoclonales PT1, PT2, PT3, PT4, PT5, AT8 (ThermoScientific, Rockford, IL), AT100 (ThermoScientific, Rockford, IL) y HT7 (MN1000) (Thermo Scientific, Rockford, IL) para unión competitiva a PHF-tau o péptidos tau fosforilados. Los anticuerpos se marcaron utilizando MSD® SULFO-TAG NHS Ester (Meso Scale Discovery) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

[0084] Para la competición con la etiqueta PT1, PT3, AT100 y HT7, 5 j l (50 |jg/ml)/pocillo de proteínas PHF-Tau enriquecidos (purificado como se describe anteriormente) se recubrió en la placa MSD HighBind (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD) durante 2 horas a temperatura ambiente (RT). Para la competencia con AT8, 25 j l de 0,1 mg/pocillo biotinilado y péptido pegilado R SG Y SSP G (pS) PG (pT) PGSRSR-OH (New England Peptide, L l C., Gardner, MA) (SEQ ID ID: 39) correspondiente a los residuos 194-211 del control tau (SEQ ID NO: 6) fosforilados en los residuos correspondientes a S202/T205 en el control tau se recubrieron en placas cargadas con estreptavidina (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD). Después del recubrimiento, los pocillos se bloquearon con 150 j l de tampón bloqueador A de MSD al 5% a temperatura ambiente durante 2 horas y se lavaron tres veces con tampón H EPES 0,1 M, pH 7,4. Se agregaron 25 j l de una mezcla de anticuerpo anti-tau individual marcado (10 nM o 50 nM) y diluciones en serie de varios anticuerpos competidores no marcados (1 nM a 2 jM ) en cada pocillo. Las placas se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación suave y se lavaron 3 veces como antes. Se agregaron 150 jl/pocillo de MSD Read Buffer T diluido y las placas se leyeron en un SEC TO R Imager 6000 (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD).

[0085] Epítopos no solapantes de anti-Tau mAbs HT7, AT100 y AT8 se describen anteriormente. Según los datos publicados, no se esperaba que estos anticuerpos compitieran entre sí en la unión a proteínas o péptidos Tau.

[0086] En base a los ensayos de competición realizados, ninguno de los anticuerpos compitió entre sí por la unión, lo que indica que todos se unen a diferentes epítopos. En cada experimento, solo se observó auto-inhibición. Las Figuras 1-5 muestran los resultados de los ensayos de competencia con AT8, PT1, PT3, AT100 y HT7 etiquetados, respectivamente.

Ejemplo 3

Los anticuerpos anti-PHF tau reducen la acumulación de PHF-tau in vivo

[0087] Se trataron ratones P301L hembra de 5 meses (Taconic, n° de gato 002508) una vez a la semana con IgG1 de ratón, solución salina, PT3 (500 jg/ratón) o AT8 (expresado a partir del hibridoma ECACC, número de depósito 9110086) durante 5 meses. Los ratones fueron anestesiados, perfundidos con PBS frío y los cerebros se diseccionaron en hielo. Para cada ratón, se homogeneizó un hemisferio cerebral en 10 volúmenes de tampón H, seguido de centrifugación a 21.000 g durante 20 min a 4°C. El sobrenadante resultante se centrifugó adicionalmente a 100.000 g durante 60 min. Después de la centrifugación, el sedimento (fracción PI) se recuperó y se volvió a suspender con tampón de lisis para los análisis de Western y ELISA, como lo describen Chai et al. J Biol Chem 286: 34457-67, 2011. Para muestras de córtex, la fracción PI se trató adicionalmente con N-lauroilsarcosina al 1% (p/v) y se ultracentrifugó para enriquecer aún más PHF-tau en el sedimento. Se encontró que los ratones P301L machos tenían una baja expresión de transgén y no se incluyeron en los análisis.

[0088] Tau fosforilado se midió en los homogenados del tronco cerebral (fracción PI) con ELISA sándwich utilizando anticuerpos AT8 y AT100 como anticuerpos de captura seguido por la detección por HT7 biotinilado y avidina-HRP (Figura 6a y 6B), y con AT100 en una transferencia Western (Figura 6C) esencialmente como se describe en Chai et al. J Biol Chem 286: 34457-67, 2011. En resumen, el sedimento de PI se resuspendió con tampón de lisis (señalización celular). Las muestras de gránulos de PI se incubaron en AT8 o AT100 (Thermo Scientific) pocillos pre-recubiertos y el anticuerpo HT-7 marcado con biotina. Las muestras se lavaron luego 5 veces con tampón, seguido de incubación con avidina-HRP durante una hora. Después de esto, las muestras se incubaron con un sustrato TMB de una etapa (Thermo Scientific) durante 30 minutos, seguido de 2N H²SO ⁴. Finalmente, se leyó la reacción a 450 nm y se determinó la cantidad de tau reactiva AT8 o AT100 en el cerebro utilizando una curva estándar derivada de homogenados de cerebro de EA humanos, y se representó como una cantidad relativa de homogeneizado de cerebro de EA (ng/ml) proporcionando la misma señal ELISA como un promedio de muestras de un animal no transgénico (B6).

[0089] Una disminución o tendencia estadísticamente significativa hacia la significación en tau fosforilada se observó en animales transgénicos P301L tratados con PT3, en comparación con los animales de control de isotipo administrados en ensayos ELISA utilizando AT100 (p = 0,057) o AT8 (p = 0,0475) a fosforilación detectada (señal ELISA : grupo salino (1135 ± 228.8); grupo IgG1 (1344 ± 245.6); grupo PT3 (660,5 ± 134.5); grupo AT8 (1271 ± 274)).

[0090] Para confirmar los datos obtenidos con ELISA , homogenados de tronco cerebral (fracción PI) de animales tratados con IgG1 o PT3 se analizaron en transferencia de Western mediante la detección de PHF-tau usando el anticuerpo AT100. Los filtros se secaron utilizando un anticuerpo anti-actina como control de carga (Figura 6B). Las transferencias de Western mostraron una cantidad atenuada de PHF-tau detectada con el anticuerpo AT100 cuando se compararon con los animales tratados con IgG1.

[0091] Para el análisis de la corteza, tanto sarcosil soluble (que representa tau soluble) e insoluble (que representa PHF-tau) fracciones de la corteza se analizaron por ELISA sándwich utilizando un anticuerpo pan-tau (PT4) o anticuerpo fosfo-tau (AT8) para captura seguida de un anticuerpo de biotina -pan-tau (hTau10) seguido de HRP-avidina. Los animales tratados con PT3 tenían niveles similares de tau total en comparación con los animales tratados con el isotipo de control IgG1. Una tendencia hacia niveles más bajos de PHF-tau fue evidente en animales tratados con PT3 cuando se comparó con el control de isotipo en las fracciones insolubles de N-lauroilsarcosina (captura ELISA con PT4: grupo IgG: 851026 ± 261198 y grupo PT3: 585639 ± 120498; ELISA, captura con AT8: grupo IgG: 1125886 ± 286240 (N = 10) y grupo pT3: 746582 ± 124970 (N = 7)).

Ejemplo 4

Caracterización de anticuerpos anti-PHF-tau

Determinación de afinidad

[0092] Las interacciones de anticuerpos monoclonales PT1 y PT3 con tau o PHF-tau soluble humana recombinante fueron estudiados por ProteOn. Todas las interacciones se estudiaron a 25°C utilizando PBS pH 7,4, complementado con EDTA 3 mM y Tween-20 al 0,005% como corrido o tampón del sistema. Se utilizaron dos formatos de experimentos diferentes, uno para la interacción con el control expresado de forma recubierta y otro para la interacción con el PHF-tau. En estos experimentos HT7 (Pierce, cat n° MN1000), se usó un anticuerpo anti-tau de ratón como control positivo.

[0093] Para estudiar la interacción con tau de control expresado de forma recombinante, una superficie de biosensor se preparó por acoplamiento de un fragmento IgG Fcy anti-humano o anti-ratón de anticuerpo específico (Ab) a la superficie de un sensor chip GLC (ProteOn) utilizando cada fabricante de Instrucciones para la química de acoplamiento de aminas (<5000 unidades de respuesta (RU)). El tampón de acoplamiento fue acetato de sodio 10 mM, pH 4,5. Los anticuerpos anti-PHF-tau se diluyeron en el tampón de ejecución y se inyectaron para obtener una captura de 60-130 RU. La captura de mAbs anti-PFH-Tau fue seguida de una inyección de control tau expresado de forma recombinante (Tau-441, catálogo Sigma n° T0576-50ug) en solución (0,1 a 75 nM en diluciones de 5 veces). La asociación se monitorizó durante 2 minutos (80 pl inyectados a 40 pl/min). La disociación se controló durante 10 minutos. Se obtuvo regeneración de la superficie del sensor con 0,85% H³PO⁴ , o 0,85% H³PO⁴ seguido de NaOH 50 mM. Los datos se ajustaron usando un modelo de unión 1:1. Los datos se ajustaron usando un modelo de unión 1:1.

Tabla 2.

[0094] Para estudiar la interacción con PHF-tau, una superficie de biosensor se preparó por captura de acoplamiento PHF-tau usando HT7 como reactivo de captura. Se requirió una preparación adicional de la PHF-tau como se describió anteriormente para que ProteOn limite la cantidad de material insoluble que ingresa a la fluídica. El PHF-tau como se describió anteriormente se preparó adicionalmente mediante centrifugación 2 veces a 5000 g, 5°C, 10 min, donde el sobrenadante de la segunda centrifugación se diluyó luego 1/20 o 1/40 en tampón de funcionamiento. Para preparar el chip, HT7 se inmovilizó covalentemente a la superficie de un chip sensor G LC (ProteOn) usando las instrucciones de cada fabricante para la química de acoplamiento de amina (<3000 unidades de respuesta (RU). El tampón de acoplamiento era acetato de sodio 10 mM, pH 4,5). Después de la inmovilización de HT7, se inyectó PHF-tau y se capturó (< 300 RU) mediante HT7. Después de la captura, se inmovilizó de forma covalente de PHF-tau en el sensor chip mediante la activación del chip utilizando las instrucciones de cada fabricante para la química de acoplamiento de aminas. Finalmente, los sitios reactivos restantes se bloquearon por inyección de etanolamina. Después de la preparación y estabilización de la superficie modificada con PHF-tau y la superficie de referencia (que no contiene antígeno), los anticuerpos anti-PHF-tau se diluyeron en el tampón de funcionamiento y se inyectaron en solución (0,1­ 75 nM en diluciones de 5 veces). La asociación se controló durante 3 minutos (120 pl inyectados a 40 pl/min). La disociación se controló durante 10 o 15 minutos. La regeneración de la superficie del sensor se obtuvo con 10 mM Gly pH 2. Los datos se ajustaron utilizando un modelo de unión bivalente en el que la afinidad intrínseca aparente se

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo aislado que se une a PHF-tau que comprende un VH de SEQ ID NO: 37 y un VL de SEQ ID NO: 38, o una versión humanizada del mismo,

en donde dicha versión humanizada tiene afinidad hacia PHF-tau con una constante de disociación (Kd) menor o igual que 10-10 M, según lo determinado por ProteOn.

2. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo es de isotipo IgG, opcionalmente en el que el anticuerpo es de:

(a) isotipo IgG1,

(b) isotipo IgG2,

(c) isotipo IgG3, o

(d) Isotipo IgG4.

3. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo, tal como un Fab, Fab', F(ab ')2 o fragmento Fv.

4. El anticuerpo aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el anticuerpo está humanizado.

5. Un polinucleótido aislado que codifica el anticuerpo aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

6. Un vector que comprende un polinucleótido de la reivindicación 5.

7. Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 6.

8. Un método para producir un anticuerpo que se une a PHF-tau que comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 7 y recuperar el anticuerpo producido por la célula huésped.

9. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y un portador farmacéuticamente aceptable.

10. El anticuerpo aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para uso en terapia.

11. El anticuerpo aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para uso en el tratamiento o prevención, o reducción de los síntomas de una enfermedad neurodegenerativa que involucra la agregación patológica de tau dentro del cerebro.

12. El anticuerpo aislado para el uso de la reivindicación 11, en el que la enfermedad neurodegenerativa es la enfermedad de Alzheimer.