EA027975B1 - Анти-псф-тау-антитела и их применение - Google Patents

Анти-псф-тау-антитела и их применение Download PDF

Info

Publication number
EA027975B1
EA027975B1 EA201491224A EA201491224A EA027975B1 EA 027975 B1 EA027975 B1 EA 027975B1 EA 201491224 A EA201491224 A EA 201491224A EA 201491224 A EA201491224 A EA 201491224A EA 027975 B1 EA027975 B1 EA 027975B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
rgo
zeg
tau
antibody
azr
Prior art date
Application number
EA201491224A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201491224A1 (ru
Inventor
Кристофер Олдерфер
Дариуш Жанекки
Сюэсун Лю
Мелисса Мрдок
Шэн-Дзюн Ву
Марк Меркен
Марк Вандермерен
Томас Малиа
Original Assignee
Янссен Байотек, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Янссен Байотек, Инк. filed Critical Янссен Байотек, Инк.
Publication of EA201491224A1 publication Critical patent/EA201491224A1/ru
Publication of EA027975B1 publication Critical patent/EA027975B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Management, Administration, Business Operations System, And Electronic Commerce (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

Раскрываются анти-ПСФ-тау-антитела и способы из изготовления и применения.

Description

Настоящее изобретение относится к анти-ПСФ-тау-антителам и способам их получения и применения.
Предпосылки создания изобретения
Болезнь Альцгеймера (БА) представляет собой дегенеративное нарушение мозговой деятельности, которое характеризуется в клиническом аспекте прогрессирующей потерей памяти, когнитивных функций, логического мышления, здравого смысла и эмоциональной устойчивости, что постепенно приводит к глубокому психическому распаду и, в конечном счете, к смерти. БА часто является причиной прогрессирующего слабоумия (деменции) у пожилых людей, это заболевание считается четвертой по распространенности причиной смерти от заболеваний в США. БА наблюдается в разных этнических группах по всему миру и представляет собой основную проблему общественного здоровья в настоящем и будущем.
Для головного мозга человека, страдающего БА, характерно поражение, именуемое сенильными (или амилоидными) бляшками, амилоидной ангиопатией (амилоидными отложениями в кровеносных сосудах) и нейрофибриллярными клубками. Большое количество таких очагов поражения, в частности амилоидных бляшек и нейрофибриллярных клубков парных спиральных филаментов, в целом обнаруживаются у пациентов с БА в нескольких областях головного мозга, отвечающих за память и когнитивную функцию.
Основным белковым компонентом нейрофибриллярной дегенерации при БА и некоторых других нейродегенеративных заболеваний является гиперфосфорилированная форма ассоциированного с микротрубочками тау-белка. Разработки лекарственных препаратов, предотвращающих или устраняющих агрегацию тау-белков вызывают большой интерес в течение многих лет, однако потенциальные препараты, включая противоагрегационные соединения и ингибиторы киназ, только допущены на стадию клинических исследований (Вгиийеи, е! а1., Ыа! Кеу Эгид Όίδεον 8:783-93, 2009).
Не так давно получены данные доклинических исследований на трансгенной мышиной модели таупатологии, свидетельствующие, что активная и пассивная иммунизация против тау может обладать терапевтическим действием (С’Ьак е! а1., 1. ΒίοΙ СЬет 286:34457-67, 2011, Вои1а)аидои1. е! а1., 1. ЫеигосЬет 118:658-67, 2011, ВоиЦцапдоШ е! а1., 1. №иго8С1 30:16559-66, 2010, Акит, е! а1., 1. №иго8С1 27:911529, 2007). Не так давно описана гипотеза о передаче и распространении таупатии, которая основана на стадиях прогрессирования таупатии по Вгаак в головном мозге человека и распространении таупатии на доклинических моделях таупатии после введения агрегатов тау-белка (Ргок!, е! а1., 1. ΒίοΙ СЬет 284:12845-52, 2009, С^адиега, е! а1., Ыа! Се11 Вю1 11:909-13, 2009). Таким образом, существует потребность в лекарственных препаратах для предотвращения агрегации тау-белков и прогрессирования таупатии для лечения БА и других нейродегенеративных заболеваний.
Краткое описание фигур
На фиг. 1 показана конкуренция меченого АТ8 различными анти-тау антителами.
На фиг. 2 показана конкуренция меченого РТ1 и различных анти-тау антител.
На фиг. 3 показана конкуренция меченого РТ3 и различных анти-тау антител.
На фиг. 4 показана конкуренция меченого АТ100 и различных анти-тау антител.
На фиг. 5 показана конкуренция меченого НТ7 и различных анти-тау антител.
Фиг. 6А. Анализ фосфорилированного тау в гомогенатах ствола головного мозга (фракция Р1), полученных от 5-месячных самок трансгенных животных с мутантным тау Р301Ь, которым вводили солевой раствор, мышей с 1дС1, РТ3 или АТ8, как указано на фигуре, или от интактных нетрансгенных животных (В6). Проводили ИФА с использованием АТ8 (левое поле) или АТ100 (правое поле) в качестве иммобилизирующих антител с последующим использованием биотинилированного-НТ7 и авидина, конъюгированного с пероксидазой хрена. Сигналы ИФА отражались на графике как относительное количество гомогената головного мозга животных с БА (нг/мл), обеспечивающего тот же сигнал ИФА, что и проб, полученных от нетрансгенных животных (В6). Данные представлены на графике индивидуально со средним ±С.О. Указаны значения р различий между животными, которым вводили РТ3 и 1дС1. Фиг. 6В. Вестерн-блоттинг фракции Р1 гомогенатов ствола головного мозга, полученных от животных, которым вводили 1дС1 или РТ3 с использованием АТ 100. Показаны сигналы от гомогенатов, полученных от 10 животных, которым вводили 1дС1 (от 1дС1-1 до 1дС1-10), и 7 животных, которым вводили РТ3 (РТ3-1, РТ3-2, от РТ3-7 до РТ3-10. В качестве контроля загрузки использовали актин.
Фиг. 7. Уровни общего тау в саркозил-растворимой (рТ4-растворимой) фракции, общего тау нерастворимой (рТ4-нерастворимой) фракции и фосфорилированного тау в нерастворимой (АТ8нерастворимой) фракции гомогенатов коры головного мозга, полученных от 5-месячных самок трансгенных мышей с мутантным тау Р301Ь, которым вводили РТ3 или изотип (1дС) в качестве контроля, как указано на фигуре. Уровни показаны как мера силы сигнала, полученного в ходе ИФА, изображенного графически индивидуально со средним ±СО. Проба 1т ίπ) представляет собой пробу положительного
- 1 027975 контроля, полученную из головного мозга мыши с мутантным тау Р301Ь, которой вводили агрегат тау. Изложение сущности изобретения
Один аспект изобретения представляет собой выделенное антитело, которое связывает ПСФ-тау, содержащее антигенсвязывающий участок вариабельного участка тяжелой цепи (Ун) БЕЦ ГО N0: 35 или 37, и антигенсвязывающий участок вариабельного участка легкой цепи (Уъ) 8Е0 ГО N0: 36 или 38.
Другой аспект изобретения представляет собой выделенное антитело, которое связывает ПСФ-тау, содержащее некоторые определяющие комплементарность участки тяжелой цепи и легкой цепи.
Еще один аспект изобретения представляет собой выделенное антитело, которое связывает ПСФтау, содержащее антигенсвязывающие участки вариабельного участка тяжелой цепи (Ун) 8Е0 ГО N0: 35 и антигенсвязывающие участки вариабельного участка легкой цепи (Уъ) 8Е0 ГО N0: 36.
Другой аспект изобретения представляет собой выделенное антитело, которое связывает ПСФ-тау, содержащее антигенсвязывающий участок вариабельного участка тяжелой цепи (Ун) 8Е0 ГО N0: 37 и антигенсвязывающий участок вариабельного участка легкой цепи (Уъ) 8Е0 ГО N0: 38.
Другой аспект изобретения представляет собой выделенное антитело или фрагмент, который конкурирует за связывание ПСФ-тау с моноклональным антителом, содержащим антигенсвязывающий участок вариабельного участка тяжелой цепи (Ун) 8Е0 ГО N0: 35 и антигенсвязывающий участок вариабельного участка легкой цепи (Уъ) 8Е0 ГО N0: 36, или антигенсвязывающий участок вариабельного участка тяжелой цепи (Ун) 8Е0 ГО N0: 37 и антигенсвязывающий участок вариабельного участка легкой цепи (Уъ) 8ЕО ГО N0: 38.
Другой аспект изобретения представляет собой полинуклеотиды, кодирующие антитела или фрагменты, раскрываемые в настоящем изобретении.
Другой аспект изобретения представляет собой вектор, содержащий полинуклеотид, раскрываемый в настоящем изобретении.
Другой аспект изобретения представляет собой клетку-хозяина, содержащую вектор, раскрываемый в настоящем изобретении.
Другой аспект изобретения представляет собой способ получения антитела, способного связывать ПСФ-тау, содержащее культивирование клеток-хозяев, раскрываемых в настоящем изобретении, и извлечении антител, продуцируемых клеткой-хозяином.
Подробное описание изобретения
Используемый в данном изобретении термин антитела имеет широкое значение и включает иммуноглобулины или молекулы антител, включая поликлональные антитела, моноклональные антитела (в том числе, мышиные, человеческие, адаптированные к человеку, гуманизированные и химерные моноклональные антитела и фрагменты антител.
В общем смысле антитела являются белками или пептидными цепочками, которые специфично связываются со специфическим антигеном. Структуры антител хорошо известны. Иммуноглобулины можно разделить на пять основных классов, а именно, 1дА, Ι§Ό, 1дЕ, 1§0 и 1дМ, в зависимости от аминокислотной последовательности константного домена тяжелой цепи. 1§А и Ι§0 далее подразделяются на изотипы 1дА1, 1дА2, Ι§01, 1дО2, Ι§03 и Ι§04. Исходя из аминокислотной последовательности константных доменов, легкая цепь антитела любого вида позвоночных может быть отнесена к одному из двух четко различающихся типов, а именно каппа (к) и лямбда (λ).
Термин фрагмент антитела означает часть интактного антитела. Примеры фрагментов антител включают в себя фрагменты РаЬ, РаЬ', Р(аЬ')2 и Εν, СЭР. антигенсвязывающий участок, вариабельный участок тяжелой или легкой цепи, диатела, молекулы одноцепочечных антител и полиспецифические антитела, образованные по меньшей мере из двух интактных антител или их фрагментов.
Вариабельные участки легкой или тяжелой цепи иммуноглобулинов состоят из каркасного участка, прерванного тремя антигенсвязывающими участками. Антигенсвязывающие участки могут описываться различными терминами, например, (ί) определяющие комплементарность участки (СИР) основываются на вариабельности последовательности (Аи апб КаЬа! 1. Ехр Меб 132:211-50, 1970). В целом, антигенсвязывающий участок имеет три СИР в каждом вариабельном участке (нСИР1, нСИР2 и нСИР3 в вариабельном участке тяжелой цепи (Ун) и БСГОРЕ ЬСИР2 и ЬСИР3 в вариабельном участке легкой цепи (Уъ)) (КаЬа! е1 а1., Зесщепеех οί РгсИепъ οί 1ттипо1ощса1 1п1еге81„ 51Ь Еб. РиЬЬс неаЬЬ 8егν^, №Ъопа1 1п81Ьи1е8 οί неаЬЬ, ВеШекба, Мб., 1991); (ίί) термин гипервариабельный участок, нУР или нУ относится в участкам вариабельного домена антитела, которые имеют гипервариабельную структуру, как определено СЬоЪЪа и Ьезк (СЬоЪЪа апб Ьезк ί. Мо1 ΒίοΙ 196:901-17, 1987). В целом, антигенсвязывающий участок имеет три гипервариабельных участка в каждой Ун (н1, н2, н3) и Уъ (Ъ1, Ь2, Ь3). СЬоЪЪа и Ьезк именуют структурно стабилизированные нУ каноническими структурами. Номенклатуры, а также аннотации СИР и нУ не так давно пересматривались АЬЫпапбап и МатЪп (АЬЫпапбап апб МатЪп Мо1 1ттипо1 45:3832-9, 2008); (ίίί) другое определение областей, которые образуют антигенсвязывающий участок, предложено ЬеГгапс (Ье£гапс, е1 а1., Ое\' Сотр 1ттипо1 27:55-77, 2003) на основании сравнения У-доменов из иммуноглобулинов и Т-клеточных рецепторов. В международной базе данных 1тМипоОепеТю8 (1МОТ; 1Шр://\у\у\\_Ьп81_ог8) приводится стандартизированные нумерация и дефиниция этих областей. Соответствие между СИР, нУ и 1МОТ подробно описано у ЬеГгапс е1 а1.,
- 2 027975 выше; (ίν) антигенсвязывающий участок также определяется на основании использования определяющих специфичность остатков (δΌΚυ) (А1тадго ί. Мо1 Кесодш! 17:132-43, 2004), где определяющие специфичность остатки (δΌΚ) обозначают остатки аминокислоты иммуноглобулина, которые непосредственно вовлечены в контакт с антигеном.
Каркас или каркасная последовательность представляют собой оставшиеся последовательности в вариабельной области антитела, кроме тех, которые определяются как последовательности антигенсвязывающего участка. В связи с тем, что точное определение антигенсвязывающего участка может быть обозначено различными дефинициями, как описано выше, точная каркасная последовательность зависит от определения антигенсвязывающего участка.
Используемый в данном документе термин моноклональное антитело (мкАТ) означает антитело (или фрагмент антитела), полученное из популяции, по существу, гомогенных антител. Моноклональные антитела высокоспецифичны и, как правило, направлены против единственной антигенной детерминанты.
Используемый в данном документе термин эпитоп означает часть антигена, с которой специфически связываются антитела. Эпитопы обычно состоят из химически активных (таких как полярных, неполярных или гидрофобных), поверхностно расположенных функциональных групп, таких как аминокислот или боковые цепи фосфорилированных аминокислот, и могут иметь специфическую трехмерную структуру, а также специфический заряд. Строение эпитопа может быть линейным или прерывистым, например, конформационный эпитоп, который формируется в результате пространственного взаимодействия между несмежными участками аминокислот антигена, в отличие от взаимодействия линейных последовательностей аминокислот. Конформационный эпитоп включает эпитопы, возникающие в результате пространственного свертывания белков антигенов, при котором аминокислоты из различных участков линейной последовательности антигена оказываются в тесной близости в трехмерном пространстве.
Тау представляет собой белок, широко распространенный в центральной и периферической нервной системе, имеющий множественные широко известные изоформы. В ЦНС человека существуют шесть основных изоформ тау, размер которых варьируется от 352 до 441, благодаря альтернативному сплайсингу (Напдег, е! а1., Тгеибк Мо1 Меб, 15:112-9, 2009). Эти изоформы отличаются друг от друга регулируемым включением 0-2 Ν-концевых вставок и 3 или 4 тандемных связывающих микротрубочки повторов, и обозначаются как 0Ν3Κ (8Еф ГО ΝΟ: 1), 1Ν3Κ (8Еф ГО ΝΟ: 2), 2Ν3Κ (8Еф ГО N0: 3), 0Ν4Κ (8Еф ГО ΝΟ: 4), 1Ν4Κ (8Еф ГО ΝΟ: 5) и 2Ν4Κ (8Еф ГО ΝΟ: 6). Термин контрольное тау при использовании в настоящем документе означает изоформу тау 8Еф ГО ΝΟ: 6, не подвергавшуюся фосфорилированию и другим посттрансляционным модификациям.
Тау-белок связывает микротрубочки и регулирует транспорт карго через клетки, процесс, который может быть модулирован фосфорилированием тау-белков. При БА и подобных ей расстройствах преобладает патологическое фосфорилирование тау-белков, которое, как считают, предшествует и/или запускает агрегацию тау-белков в фибриллы, называемые парными спиральными филаментами (ПСФ). Основным компонентом ПСФ является гиперфосфорилированное тау. Термин парный спиральный филамент-тау или ПСФ-тау при использовании в настоящем документе означает хорошо известные агрегаты тау в парных спиральных филаментах. При исследовании методом электронной микроскопии обнаруживаются два основных участка в структуре ПСФ, размытая оболочка и стержневой филамент; чувствительная к протеолизу размытая оболочка располагается снаружи филамента, а протеазоустойчивый стержень филамента образует остов ПСФ (А18сЫк, е! а1., Ргос №й1 Асаб δει υδΑ, 85:4884-8, 1988).
Антитела, связывающие ПСФ-тау при использовании в настоящем документе означают антитела, которые связывают ПСФ-тау при оценке в ходе вестерн-блоттинга. Обычно связывание антитела к ПСФтау может быть оценено по окрашиванию Кумасси примерно 500 нг ПСФ-тау после 1 ч блокирования в 5% (мас./об.) обезжиренном сухом молоке (ΝΡΌΜ) в ΤΒδ-Τ, 0,05% твин-20. Антитела, связывающие ПСФ-тау, факультативно не связывают контрольное тау (ГЕф ГО ΝΟ: 6) по результатам измерений с помощью вестерн-блоттинга при исследовании в условиях антигенной нагрузки, где оба контрольное тау и ПСФ-тау в равной степени обнаруживаются тау-антителами, которые не отдают предпочтение эпитопам ПСФ-тау (например, антитело НТ7, (ΤЬе^тоδс^еηΐ^ί^с, Рокфорд, Иллинойс) (Мегскеп, е! а1., 1. №игосйет 58:54 8-53, 1992). Такие примеры условий антигенной нагрузки представляют собой 500 нг ПСФтау и 200 нг контрольного тау.
В настоящем документе использованы общепринятые одно- и трехбуквенные коды обозначения аминокислот.
Композиции данного изобретения.
Настоящее изобретение относится к анти-ПСФ-тау антителам и применению этих антител. Такие анти-ПСФ-тау антитела могут иметь свойства связывания фосфорилированного эпитопа на ПСФ-таубелке или связывания нефосфорилированного эпитопа на ПСФ-тау-белке. Анти-ПСФ-тау-антитела могут использоваться в качестве лекарственных средств, как исследовательские или диагностические реагенты для обнаружения ПСФ-тау-белка в биологических пробах, например в тканях или клетках.
Один вариант осуществления изобретения представляет собой выделенное антитело, которое связывает ПСФ-тау, содержащее антигенсвязывающие участки вариабельного участка тяжелой цепи (УН)
- 3 027975 δΕρ ΙΌ N0: 35 или 37, и антигенсвязывающие участки вариабельного участка легкой цепи (УЕ) δΕρ ΙΌ N0: 36 или 38. В табл. 1 показаны остатки антигенсвязывающего участка примера антител, раскрываемых в настоящем изобретении, обозначенные согласно КаЬа! или СйоТЫа, а также примеры участков тяжелой и легкой цепи.
В другом варианте осуществления антигенсвязывающий участок Ун антител, раскрываемых в настоящем изобретении, содержит определяющие комплементарность участка тяжелой цепи (СОК) 1 (НСОК1), 2 (НСОК2) и 3 (НСОК3) δΕρ ΙΌ N0: 7, 8 и 9 или 13, 14 и 15, соответственно, или антигенсвязывающий участок УЕ антител, раскрываемых в настоящем изобретении, содержит СОК легкой цепи 1 (ЬСБК!), 2 (ЕСОК2) и 3 (БСПК3) δΕρ ΙΌ N0: 10, 11 и 12 или 16, 17 и 18 соответственно.
Другой вариант осуществления изобретения представляет собой выделенное антитело, которое связывает ПСФ-тау, содержащее антигенсвязывающий участок вариабельного участка тяжелой цепи (Ун) δΕρ ΙΌ N0: 35 или 37, и антигенсвязывающий участок вариабельного участка легкой цепи (УЕ) δΕρ ΙΌ N0: 36 или 38.
В другом варианте осуществления антигенсвязывающий участок Ун антител, раскрываемых в настоящем изобретении, содержит определяющие комплементарность участки тяжелой цепи (СОК) 1 (НСОК1), 2 (НСОК2) и 3 (нСоК3) δΕρ ΙΌ N0: 7, 8 и 9 или 13, 14 и 15 соответственно, или антигенсвязывающий участок УЕ антител, раскрываемых в настоящем изобретении, содержит СОК легкой цепи 1 (ЬСРК!), 2 (ЕСОК2) и 3 (БСПК3) δΕρ ΙΌ N0: 10, 11 и 12 или 16, 17 и 18 соответственно.
Таблица 1
Название последовательности ЗЕО Ю N0: Последовательность
РТ1 НС0К1, КаЬаЕ 7 5 5ИМС
РТ1 НСРН2, КаЬаР 8 ΡΗΡ6366ΤΝΥΝΕΗΕΚ6
РТ1 НСРНЗ, КаЬаР 9 3ΥΥΟΥϋΚΕΑΝ
РТ1 ЬСРН1, КаЬаР 10 Κ33Ε3ΗΕ.Η3Ν6ΝΤΥΗΥ
РТ1 ЬСРН2, КаЬаР 11 КМЗЫЬАЗ
РТ1 ЬСРНЗ, КаЬаР 12 МОУЬЕУРЬТ
РТЗ НСРН1, КаЬаР 13 3ΥΑΜ3
РТЗ НСРН2, КаЬаР 14 3IЗКССЫТΥΥΡΝ3νκσ
РТЗ НСРНЗ, КаЬаР 15 СИСОУСИЕАУ
РТЗ ЬСРН1, КаЬаР 16 ΚΑ3<2ϋΙΝΚΥΗΝ
РТЗ ЬСРН2, КаЬаР 17 ΚΑΝΚΙΑΌ
РТЗ ЬСРНЗ, КаЬаР 18 ЬОУОЕЕРЬТ
РТ1 НСРН1, СНоЕЫа 19 6ΥΤΕ333
РТ1 НСРН2, СНоЕЫа 20 ЬРСЗСС
РТ1 НСРНЗ, СНоЕЫа 21 3ΥΥϋΥϋΚΕΑ
РТ1 ЬСРН1, СНоЕЫа 22 3Ε3ΗΗΗ3Ν6ΝΤΥ
РТ1 ЬСРН2, СНоЕЫа 23 КМЗ
РТ1 ЬСРНЗ, СНоЕЫа 24 УЬЕУРЬ
РТЗ НСРН1, СНоЕЫа 25 6ΕΤΕ33Υ
РТЗ НСРН2, СНоЕЫа 26 ЗКССЫ
РТЗ НСРНЗ, СНоЕЫа 27 СИСОУСИЕА
РТЗ ЬСРН1, СНоЕЫа 28 3<2ϋΙΝΚΥ
РТЗ ЬСРН2, СНоЕЫа 29 ΚΑΝ
РТЗ ЬСРНЗ, СНоЕЫа 30 УОЕЕРЬ
РТ1 УН 35 0У0Ь003СТЕЬМКРСАЗУК13СКАТСУТЕ ЗЗЗИМСИУК0КРСНСЬЕИ1СО1ЬРСЗССТ ΝΥΝΕΚΕΚ6ΚΑ3ΕΤΑΕΤ33ΝΤΑΥΜ0Η33ΗΤ 3ΕΟ3ΑνΥΥ3νΚ3ΥΥΟΥΟΚΕΑΝΝ3<2(3ΤΗνΤ УЗА
РТ1 УЬ 36 О1УМТ<2ААРЗУРУТРСЕЗУЗ!ЗСКЗЗЕЗЬ
- 4 027975
ЬНЗИСИТ УЬ УИРЬОКРСОЗ Р<2ЬЬ IΥΚΜ5Ν ЬАЗСУРОНЕЗСЗСЗСТАЕТЬН13НУЕАЕР УСУУУСМОУЬЕУРЬТЕСАСТКЬЕЬК
РТЗ УН 37 ЕУКЬУЕ 3 ССЬЬУКРССЗ ЬКЬ3 СААЗ СЕТЕ 3 3 УАМЗИУК<2ИРЕККЬЕИУАЗ 13Κ66ΝΤ У УРИ5УКСРЕТ15РОИАРШЬУЬ0М55ЬР5 ЕРТАЬУУСАР.6И6РУ6ИЕАУИ60УТЬУТУ ЗА
РТЗ УЬ 38 Р1КМТ<23Р35МУАЗЬ6ЕВУТ1ТСКАЗ(2Р1 ИКУЬИИЕ<2<2КРСКЗРКТЬ1УКАИКЬЬРСУ РЗКЕЗСЗСЗС<2РУЗЬТ133ЬРУЕРМС1УУ СЬ<2УРЕЕРЬТЕ6Р6ТКЬЕЬК
Хотя варианты осуществления, проиллюстрированные в примерах, содержат вариабельные участки, один из тяжелой и один из легкой цепи, специалисты поймут, что альтернативные варианты осуществления могут содержать различные вариабельные участки тяжелой или легкой цепи. Одиночный вариабельный участок может использоваться для скрининга вариабельного домена, способного к формированию двухдоменного специфического антигенсвязывающего фрагмента, способного, например, связываться с ПСФ-тау. Такой скрининг может осуществляться с помощью методов фагового дисплея, например, с использованием иерархического двойного комбинаторного подхода, описанного в РСТ РиЫ. № А0 92/01047. Согласно этому подходу индивидуальная колония, содержащая клон Н или Б цепей, используется для инфицирования всей библиотеки клонов, кодирующих другую цепь (Б или Н), и получившийся двухцепочечный специфический антигенсвязывающий домен селективно отбирается в соответствии с методами фагового дисплея.
Другой вариант осуществления изобретения представляет собой выделенное антитело, которое связывает ПСФ-тау, содержащее антигенсвязывающий участок вариабельного участка тяжелой цепи (УН) δΕ^ ГО N0: 35 и антигенсвязывающий участок вариабельного участка легкой цепи (Уь) δΕΟ ГО N0: или 36.
Другой вариант осуществления изобретения представляет собой выделенное антитело, которое связывает ПСФ-тау, содержащее антигенсвязывающий участок вариабельного участка тяжелой цепи (УН) δΕ^ ГО N0: 37 и антигенсвязывающий участок вариабельного участка легкой цепи (Уь) δΕΟ ГО N0: или 38.
Другой вариант осуществления изобретения представляет собой выделенное антитело, которое связывает содержащие ПСФ-тау-белки определяющие комплементарность участки тяжелой цепи (СОИ) 1 (НСЭК1), 2 (НС0И2) и 3 (НСЭК3) δΕς ГО N0: 7, 8 и 9, соответственно, и СОИ легкой цепи 1 (БСЭК1), 2 (БСОК2) и 3 (БСЭК3) δΕΟ ГО N0: 10, 11 и 12 соответственно.
Другой вариант осуществления изобретения представляет собой выделенное антитело, которое связывает содержащие ПСФ-тау-белки определяющие комплементарность участки тяжелой цепи (СОИ) 1 (НСЭК1), 2 (11С0И2) и 3 (НСЭК3) δΕΠ ГО N0: 13, 14 и 15, соответственно, и СОИ легкой цепи 1 (ЬСЭК1), 2 (БСЭК2) и 3 (БСЭК3) δΕΠ ГО N0: 16, 17 и 18 соответственно.
В любом из приведенных выше вариантов осуществления выделенное антитело, связывающее ПСФ-тау-белок, может быть гуманизировано.
Антитела, раскрываемые в настоящем изобретении могут быть произведены с использованием различных методов, к примеру гибридомный метод (КоЫег и Μίίδΐοίπ №1иге 256:495-7, 1975). Химерные мкАТ, содержащие вариабельный участок легкой и тяжелой цепи, полученные из донорного антитела (обычно мышиного) в сочетании с постоянными участками легкой и тяжелой цепей, полученные из акцепторного антитела (обычно другого вида млекопитающих, например, человека), можно получить методом, раскрытым в патенте № 4816567. Можно приготовить мкАТ с привитыми на них СОИ, имеющие СЭК, полученные из иммуноглобулина донора нечеловеческого происхождения (обычно, мыши) и оставшиеся части молекулы иммуноглобулина, полученной из одного или более человеческих иммуноглобулинов, с помощью методов, известных в данной области, такими как раскрытые в патенте США № 5225539. Полностью человеческие мкАТ, не содержащие ни одной экзогенной последовательности, могут быть получены от мышей, имеющих человеческий трансген, с помощью описанных методов БопЬегд и соавт, №1иге 368:856-9, 1994, Εΐδ1ι\νι16 е! а1.,'№! Вю!есйпо1 14:845-51, 1996, Мепбе/ е! а1., Иа! Оепе! 15:146-56, 1997). Человеческие мкАТ могут быть также приготовлены и оптимизированы с использованием фаговых библиотек (Кпарр1к, е! а1., I. Мо1 ΒίοΙ 296:57-86, 2000, Кге^, е! а1., I. 1шшипо1 Μе!йοάδ 254:67-84, 2001, δΗΐ, е! а1., I. Мо1 Вю1 397:385-96, 2010).
Гуманизация антитела может быть выполнена с помощью хорошо известных методов, таких как ремоделирование поверхности определяющих специфичность остатков (δΏΡΗ) (и. δ. РиЬ1. № 2010/0261620), ремоделирование поверхности (РаШап е! а1., Мо1. 1ттипо1. 28:48 9-98, 1991), супергуманизация (1п!. Ра!. РиЬ1. № А004/006955) и супергуманизация на основе выявления и удаления из им- 5 027975 муноглобулина мыши потенциальных эпитопов для главного комплекса гистосовместимости и Т-клетки (патент США № 7657380). Человеческие каркасные последовательности, использующиеся для прививки/гуманизации могут выбираться специалистами в этой области из соответствующих баз данных. Выбранные каркасы могут быть далее модифицированы для сохранения или улучшения связывающей аффинности с использованием методов, изложенных Онееп с1 а1. (Оиссп. с1 а1., Ргос Νηΐΐ Асай δοί И8А 86:10029-33, 1989) или в И.8. РиЫ. № 2011/0092372.
Приготовление ПСФ-тау для использования в качестве антигена для иммунизации или выделения антител из фаговых библиотек может быть осуществлено с помощью любых подходящих методов. В примере способа ПСФ-тау-белок изолируют из головного мозга пациентов с БА с помощью хорошо известных протоколов, таких как описанные СгсспЬсгд и Όανίβδ (СгсспЬсгд апй Ωανίοδ Ргос Ναΐΐ Асай δα υδΑ 87:5827-31, 1990). ПСФ-тау-белок может быть выделен из коры головного мозга больного болезнью Альцгеймера после его смерти. Выделенный ПСФ-тау-белок характеризуется по чистоте и статусу гиперфосфорилирования с антителами, которые вступают в реакцию с ПСФ-тау. В типичном препарате ПСФ-тау-белка, гиперфосфорилированные полосы, перемещающиеся при примерно 60, 64, 68 и 72 кДа при проведении вестерн-блоттинга (δρίΙΕιπΟπί апй Соейей Ттепйк №игока 21:428-33, 1998), обнаруживаются антителом АТ8, которое специфично связывает гиперфосфорилированный ПСФ-тау, но не связывает дефосфорилированный ПСФ-тау-белок.
Антитела, раскрываемые в настоящем изобретении могут иметь характеристики несвязывания контрольного тау-белка δΕΟ ГО ΝΟ: 6. Такие антитела могут продуцироваться с использованием способов, описанных выше, и испытания антител на отсутствие связывания с контрольным тау может проводиться в ходе вестерн-блоттинга с последующим окрашиванием Кумасси в соответствии с описанным выше. Контрольное тау может рекомбинантно экспрессироваться и очищаться с использованием стандартных способов. Примерами антител, связывающих ПСФ-тау-белок, но не связывающих контрольное тау, являются антитела РТ1 и РТ3. Далее может оцениваться специфичность антител, раскрываемых в настоящем изобретении, например, с использованием иммуногистохимического исследования контрольных срезов головного мозга и срезов головного мозга, пораженного БА.
Антитела, раскрываемые в настоящем изобретении могут иметь аффинности к ПСФ-тау с константой диссоциации (Кс) ниже или равной примерно 10- , 10-, 10- , 10- , 10- или 10- М. Аффинность данной молекулы для ПСФ-тау-белка может быть определена экспериментально с использованием любого подходящего способа. Такие способы могут включать использование аппаратуры В1асоте, Рго1еОп или КшБхА, ИФА или конкурентно-связывающий анализ, хорошо известные специалистам.
Другой аспект изобретения представляет собой выделенное антитело или фрагмент, которые конкурируют за связывание ПСФ-тау с моноклональным антителом, содержащее антигенсвязывающий участок вариабельного участка тяжелой цепи (Ун) δΕΟ ГО ΝΟ: 35 и антигенсвязывающий участок вариабельного участка легкой цепи (Уъ) δΕΟ ГО ΝΟ: 36, или антигенсвязывающий участок вариабельного участка тяжелой цепи (Ун) δΕΟ ГО ΝΟ: 37 и антигенсвязывающий участок вариабельного участка легкой цепи (Уъ) δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 38.
Анализ конкуренции за связывание с ПСФ-тау может быть проведен ш уйго с помощью хорошо известных способов. Например, связывание антитела, меченого ΝΗδ-эфиром ΜδΌ δи1ίо-Тад™, с ПСФ-тау в присутствии немеченого антитела может быть оценено с помощью иммуноанализа с последующим электрохемолюминесцентным детектированием.
Для определения эпитопа антител, раскрываемых в настоящем изобретении, могут использоваться несколько хорошо известных методик в дополнение к конкурентно-связывающему анализу. Например, в случае, когда известна структура обоих из отдельных компонентов, может быть использован анализ ш кШсо прикрепления одного белка к другому с целью идентификации участков, совместимых для взаимодействия. Может быть проведено избирательное замещение водорода дейтерием в антигене и антителе с целью определения участков антигена, способных связываться с антителом. Сегментный и точечный мутагенез, модифицирующие антиген, могут быть использованы для локализации необходимых для связывания антитела аминокислот. Со-кристаллическая структура комплекса антиген-антитело используется для идентификации остатков, участвующих в образовании эпитопа и паратопа.
Антитела, раскрываемые в настоящем изобретении могут представлять собой моноклональные антитела изотопов 1§С, Ι§Ό, 1дА или 1дМ. Антитела, раскрываемые в настоящем изобретении, могут быть биспецифическими или полиспецифическими. Пример биспецифического антитела может связывать два отдельных эпитопа на ПСФ-тау или может связывать ПСФ-тау и бета-амилоид (АР). Другой пример биспецифического антитела может связывать ПСФ-тау-белок и рецептор эндогенного трансцитоза через гематоэнцефалический барьер, такой как инсулиновый рецептор, трансферриновый рецептор, рецептор инсулиноподобного фактора I и липопротеиновый рецептор. Примером антитела является 1дС 1 типа.
Иммунно-эффекторные свойства антител, раскрываемых в настоящем изобретении, также могут быть усилены или ослаблены за счет модификаций Рс-фрагмента с применением способов, хорошо известных специалистам. Например, эффекторные функции Рс-фрагмента, такие как связывание С1ц, комплементзависимая цитотоксичность (СЭС), антителозависимая клеточная цитотоксичность (АЭСС), фа- 6 027975 гоцитоз, понижающая регуляция рецепторов клеточной поверхности (например, рецептора В-клетки; ВСК) и т.п. может обеспечиваться и контролироваться модифицирующими остатками в Рс-фрагменте, ответственными за эти действия. Мутировавшие остатки в Рс-домене, увеличивающие полужизнь антител, могут также улучшить фармакокинетические свойства (δίτοίί Сигг Θρίη Вю1сс1то1 20:685-91, 2009).
Кроме того антитела, раскрываемые в настоящем изобретении, могут быть модифицированы посттрансляционно за счет таких процессов, как гликозилирование, изомеризация, дегликозилирование или ненатуральная ковалентная модификация, такая как присоединение нативной молекулы полиэтиленгликоля (пегилирование) или липидизация. Такие модификации могут происходить в условиях ίη νίνο или ίη νίίΓο. Например, антитела, раскрываемые в настоящем изобретении, могут быть конъюгированы с полиэтиленгликолем (ПЕГилированы) с целью улучшения их фармакокинетических профилей. Конъюгация может быть выполнена с помощью способов, известных специалистам в данной области. Отмечено, что конъюгация терапевтических антител с ПЭГ улучшает фармакодинамику, не оказывая влияния на функцию (Κηί§1ί, е1 а1., Ρΐαίβίβίδ 15:409-18, 2004, Ьеопд, е1 а1., СуЮкше 16:106-19, 2001, Уапд, е1 а1., Ρίοίβίη Εη§ 16:761-70, 2003).
Другой вариант осуществления изобретения представляет собой выделенный полинуклеотид, кодирующие антитела, раскрываемые в настоящем изобретении, или их комплемент, или их фрагменты. Примеры выделенных полинуклеотидов представляют собой полинуклеотиды, кодирующие полипептиды, содержащие СЭР тяжелой цепи иммуноглобулина НСЭК1, НСЭК2 и НСЭК3, показанные в δΕφ ΙΌ N0: 7, 8 и 9 или 13, 14 и 15, соответственно, или полипептиды, содержащие СЭР легкой цепи иммуноглобулина БСЭРк ЕСЭК2 и ЬСЭКЗ, показанные в δΕφ ΙΌ N0: 10, 11 и 12 или 16, 17 и 18, соответственно, и полинуклеотиды, имеющие последовательность, показанную в δΕφ ΙΌ N0: 31-34, кодирующие вариабельные участки, раскрываемые в настоящем изобретении. Другие полинуклеотиды, которые, принимая во внимание вырожденность генетического кода или предпочтительность использования кодонов в данной экспрессионной системе, кодируют предложенные антитела, раскрываемые в настоящем изобретении, также входят в объем настоящего изобретения. Выделенные нуклеиновые кислоты, раскрываемые в настоящем изобретении, могут быть изготовлены с использованием хорошо известных методов рекомбинации или синтеза. ДНК, кодирующие моноклональные антитела, легко изолируются и секвенируются с помощью методов, известных специалистам в данной области. При создании гибридом такие клетки могут служить источником такой ДНК. В альтернативном случае, при использовании метода дисплея со слиянием кодирующей последовательности и продукта трансляции (например, фаговых или рибосомальных библиотек), селекция связующего звена и нуклеиновой кислоты упрощена. После фаговой селекции участки фага, кодирующие антитело, можно выделять и использовать для синтеза целых антител, включая человеческие, или любых других желаемых антигенсвязывающих фрагментов, и экспрессировать в любом желаемом хозяине, включая клетки млекопитающих, клетки насекомых, клетки растений, дрожжи и бактерии.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой вектор, содержащий по меньшей мере один полинуклеотид, раскрываемый в настоящем изобретении. Такие векторы могут быть плазмидными, вирусными векторами, векторами на основе транспозонов или любыми другими векторами, пригодными для интродукции предложенных в настоящем изобретении полинуклеотидов в данный организм или в данное генетическое окружение любыми средствами.
Другой вариант осуществления изобретения представляет собой клетку-хозяин, содержащую любой из полинуклеотидов, раскрываемых в настоящем изобретении. Такими клетками-хозяевами могут быть эукариотические, бактериальные, растительные клетки или клетки архей. Примерами эукариотических клеток могут быть клетки млекопитающих, насекомых, птиц или другие клетки животного происхождения. Эукариотические клетки млекопитающих включают в себя бессмертные клеточные линии, такие как гибридомы или клеточные линии миеломы, например 8Ρ2/0 (Американская коллекция типовых культур (АТСС), Манассас, УА, СКЬ-1581), Νδ0 (Европейская коллекция клеточных культур (ЕСАСС), Солсбери, Уилтшир, Великобритания, ЕСАСС № 85110503), РО (АТСС СКЬ-1646) и Ад653 (АТСС СКЬ1580) мышиные клеточные линии. Обычно используется линия клеток миеломы человека И266 (АТТС СКЕ-Т1В-196). Другие используемые клеточные линии включают линии, полученные из яичников китайского хомячка (СНО), например, линии СНО-К18У (йон/а Βίοίοφβδ), СНО-К1 (АТСС СКЬ-61, ΙηνίίΓΟββη) или ΌΟ44.
Другой вариант осуществления изобретения представляет собой способ получения антитела, способного связывать ПСФ-тау-белки, содержащий культивирование клеток-хозяев, раскрываемых в настоящем изобретении, и извлечении антител, продуцируемых клетками-хозяевами. Способы создания и очистки антител хорошо известны специалистам в данной области.
Способы терапии.
Анти-ПСФ-тау-антитела, раскрываемые в настоящем изобретении, или их фрагменты, включая фрагменты РаЬ, (РаЬ')2, 5сРу. или антитела, содержащие антигенсвязывающий участок антител, раскрываемых в настоящем изобретении, также могут быть использованы для лечения, ослабления или профилактики симптомов у пациентов с нейродегенеративным заболеванием, для которого характерна патоло- 7 027975 гическая агрегация тау в головном мозге, таких как пациенты, страдающие БА или любой другой таупатией. Без намерения быть связанными рамками какой-либо конкретной теории, антитела, раскрываемые в настоящем изобретении, могут оказывать свое положительное действие посредством уменьшения патологической агрегации тау-белка и, соответственно, количества ПСФ-тау в головном мозге. Антитела, раскрываемые в настоящем изобретении, могут быть использованы для лечения любого больного животного. Примерами таких животных могут быть млекопитающие, такие как человек, грызуны, собаки, кошки и сельскохозяйственные животные. Например, антитела, раскрываемые в настоящем изобретении, также пригодны для приготовления лекарственных средств для терапии БА, при этом лекарственное средство приготовлено для введения в дозировках, определенных в настоящем документе.
Другой вариант осуществления изобретения представляет собой способ уменьшения агрегации тау у нуждающихся в этом пациентов, содержащий введение пациенту терапевтически эффективного количества выделенного антитела, раскрываемого в настоящем изобретении, в течение времени, необходимого для уменьшения агрегации тау.
Другой вариант осуществления, раскрываемый в настоящем изобретении, представляет собой способ лечения или ослабления симптомов нейродегенеративного заболевания, для которого характерна агрегация тау в организме пациента, содержащий введение пациенту терапевтически эффективного количества выделенного антитела, раскрываемого в настоящем изобретении, в течении времени, необходимого для лечения или ослабления симптомов нейродегенеративного заболевания.
В любом из вариантов осуществления, указанных выше, нейродегенеративное заболевание, включающее агрегацию тау, является таупатией.
В любом из вариантов осуществления, указанных выше, выделенное антитело содержит антитело, которое связывает ПСФ-тау, содержащее антигенсвязывающий участок вариабельного участка тяжелой цепи (Ун) δΕρ ГО N0: 35 и антигенсвязывающий участок вариабельного участка легкой цепи (Уь) δΕρ ГО N0: 36.
В любом из вариантов осуществления, указанных выше, выделенное антитело содержит антитело, которое связывает ПСФ-тау, содержащее антигенсвязывающий участок вариабельного участка тяжелой цепи (Ун) δΕρ ГО N0: 37 и антигенсвязывающий участок вариабельного участка легкой цепи (Уъ) δΕρ ГО N0: 38.
При использовании в настоящем документе таупатия охватывает любое нейродегенеративное заболевание, для которого характерна патологическая агрегация тау в головном мозге. В дополнение к наследственной и спорадической БА, другие примеры таупатий включают лобно-височную деменцию с паркинсонизмом, связанную с хромосомой 17 (ΡΤΏΡ-17), прогрессирующий надъядерный паралич, кортикобазальную дегенерацию, деменцию Пика, прогрессивный субкортикальный глиоз, деменцию с образованием только клубков, диффузные нейрофибриллярные клубки с кальцификацией, деменция с аргирофильными зернистыми шарами, комплекс боковой амитрофический склероз-деменция-паркинсонизм, синдром Дауна, синдром Герстманна-Штреусслера-Шейнкера, болезнь Галлервордена-Шпатца, миозит с включенными тельцами, болезнь Крейцфельда-Якоба, множественную системную атрофию, липоидный гистиоцитоз тип С, церебральную амилоидную ангиопатию с отложением прионного белка, подострый склерозирующий панэнцефалит, дистрофическую миотонию, боковой амиотрофический склероз с нейрофибриллярными клубками, постэнцефалитический паркинсонизм и хроническую травматическую энцефалопатию, такую как йетепйа ридШзйса (кулачная болезнь). (Мотз, с1 а1., №итоп 70:410-26, 2011).
Поведенческий фенотип, связанный с таупатией, включает в себя нарушение когнитивных функций, раннее изменение личности и расторможенность, апатию, абулию, мутацизм, апраксию, персерверацию, стереотипные движения/поведение, гипероральность, дезорганизацию, неспособность планирования или выполнения последовательных действий, эгоизм/грубость, антиобщественные личные черты, отсутствие сочувствия, спотыкающуюся неграмотную речь с частыми фразеологическими ошибками, но относительно сохранившееся понимание, нарушенное понимание и сложности с поиском слов, медленно прогрессирующую неустойчивость походки, ретропульсию, замирание, частые падения, ригидность второго шейного позвонка, не отвечающую на введение леводопы, надъядерный паралич взора, судорожные подергивания глазных яблок с характерным прямоугольным сигналом, медленные вертикальные саккады, псевдобульбарный синдром, апраксию конечностей, дистонию, потерю корковой чувствительности и тремор.
Пациенты, подлежащие лечению, включают бессимптомных лиц с риском развития БА или другой таупатии, а также пациентов, у которых симптомы проявляются в настоящее время. Пациенты, подлежащие лечению, включают лиц с известным генетическим риском развития БА, таким как семейный анамнез БА или наличие генетических факторов риска в геноме. Примеры факторов риска представляют собой мутации белка-предшественника амилоида (АРР), особенно в положении 717 и положениях 670 и 671 (мутация Харди и Шведская мутация, соответственно). Другие факторы риска представляют собой мутации генов пресенилина, Ρδ1 и Ρδ2, и АроЕ4, семейный анамнез гиперхолестеролемии или атеросклероза. Лиц, страдающих БА в настоящее время, можно отличить от старческой деменции по присутствию факторов риска, описанных выше. В дополнение, доступно несколько диагностических тестов для выявления лиц, страдающих БА. Эти тесты включают измерение содержания тау в спинномозговой жид- 8 027975 кости и уровни Αβ342. Повышенный уровень тау и сниженные уровни Αβ342 свидетельствуют о присутствии БА. Лица, страдающие БА, могут быть также диагностированы согласно критериям Ассоциации болезни Альцгеймера и относящихся к ней расстройств.
Введение/фармацевтические композиции.
Анти-ПСФ-тау-антитела, раскрываемые в настоящем изобретении, подходят как в качестве терапевтических, так и профилактических агентов для лечения или профилактики нейродегенеративных заболеваний, для которых характерна патологическая агрегация тау, таких как БА или другие таупатии. Лечение бессимптомных пациентов можно начинать в любом возрасте (например, примерно в 10, 15, 20, 25, 30 лет). Обычно, однако, нет необходимости начинать лечение, пока пациент не достигнет возраста примерно 40, 50, 60 или 70 лет. Лечение обычно включает в себя многократное введение препаратов в течение некоторого периода времени. Лечение можно мониторировать с помощью количественного определения антитела, или ответа активированных Т-клеток или В-клеток на терапевтический агент на протяжении определенного времени. При снижении ответа показано увеличение дозы введения.
При применении в профилактических целях фармацевтические композиции или лекарственные препараты вводятся пациенту, подверженному в той или иной форме риску развития БА, в дозе достаточной для устранения или снижения риска, ослабления степени тяжести или откладывание наступления заболевания на более поздний срок, включая биохимические, гистологические и/или поведенческие симптомы заболевания, его осложнения и промежуточные патологические фенотипы, наблюдающиеся в ходе развития заболевания. При применении в терапевтических целях композиции или препараты вводятся пациенту, у которого подозревают или уже диагностировали такое заболевание, в дозе, достаточной для снижения, прекращения или откладывания наступления любых симптомов заболевания (биохимических, гистологических и/или поведенческих). Введение лекарственного препарата может ослабить или устранить нарушение когнитивных функций легкой степени у пациентов, у которых еще не развилась патология, характерная для болезни Альцгеймера. Количество, необходимое для лечения или профилактики, обозначается как терапевтически- или профилактически-эффективная доза. В обоих профилактическом и терапевтическом режимах композиции или лекарственные препараты обычно вводятся в нескольких дозах, пока не будет достигнут достаточный иммунный ответ.
Анти-ПСФ-тау-антитела или их фрагменты, раскрываемые в настоящем изобретении, могут вводиться в сочетании с другими агентами, проявляющими эффективность при лечении родственных нейродегенеративных заболеваний. В случае БА антитела, раскрываемые в настоящем изобретении, могут вводиться в сочетании с агентами, снижающими или предотвращающим отложение бета-амилоида (Αβ3). Представляется возможным, что патологии, связанные с ПСФ-тау-белком и Αβ3, носят синергический характер. Поэтому комбинированная терапия, направленная на одновременное устранение как патологий, обусловленных ПСФ-тау-белком, так и патологий, обусловленных Αβ3, может быть более эффективной, чем терапия, направленная на каждое из этих состояний по отдельности.
В случае болезни Паркинсона и относящихся к ней нейродегенеративных заболеваний, иммунная модуляция с целью устранения агрегированных форм белка α-синуклеина также является перспективной терапией. Комбинированная терапия, направленная на одновременное устранение обоих из тау и белка α-синуклеина может быть более эффективной, чем терапия, направленная на каждый из этих белков по отдельности.
При применении способов, раскрываемых в настоящем изобретении, терапевтически эффективное количество антитела для лечения или ослабления симптомов таупатии может быть определено с помощью стандартных исследовательских методик. Например, доза антитела может быть определена с помощью введения агента животным в ходе исследований на подходящих животных моделях, хорошо известных специалистам в данной области.
В дополнение, для определения оптимального диапазона доз могут быть дополнительно использованы анализы количественного определения в условиях ίη νίΐτο. Выбор конкретной эффективной дозы (например, с помощью клинических испытаний) может быть осуществлено специалистами на основании нескольких факторов. Такими факторами являются: подлежащее лечению или профилактике заболевание, симптомы заболевания, масса тела пациента, иммунологический статус пациента и другие известные специалистам факторы. Точная доза, предназначенная для применения в составе композиции, зависит от способа введения препарата и тяжести болезни, и должна определяться на основании решения лечащего врача и состояния каждого пациента. Эффективная доза может быть экстраполирована исходя из кривой зависимости доза-эффект по данным, полученным в условиях ίη νίΐτο или на тест-системах в животных моделях.
Способ введения антител для терапевтического использования может представлять собой любой подходящий путь введения, который доставляет агент в организм пациента. Фармацевтические композиции этих антител пригодны для парентерального введения, например, внутрикожного, внутримышечного, внутрибрюшинного, внутривенного, подкожного, интраназального или интракраниального, или они могут быть введены в спинномозговую жидкость головного мозга или позвоночника.
Антитела, раскрываемые в настоящем изобретении, могут быть изготовлены в виде фармацевтиче- 9 027975 ской композиции, содержащей эффективное количество антитела в качестве активного ингредиента в фармацевтически приемлемом носителе. Термин носитель относится к разбавителям, адъювантам, вспомогательным веществам или несущей среде, с которыми вводится антитело. Фармацевтическая несущая среда может представлять собой жидкость, такую как вода или масла, включая масла, нефтяного, животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и подобные им масла. Например, могут быть использованы 0,4% солевой раствор и 0,3% раствор глицина. Указанные растворы стерильны и в целом не содержат механических включений. Стерилизация проводится с использованием общепринятых, хорошо известных способов стерилизации (например, фильтрацией). Композиции могут содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, необходимые для приближения к физиологическим условиям, такие как вещества корректировки рН, буферные вещества, стабилизаторы, сгущающие вещества, лубриканты и окрашивающие добавки и т.д. Концентрация антител, раскрываемых в настоящем изобретении, агента в таком фармацевтическом составе может варьироваться в широком диапазоне, т. е. от менее чем примерно 0,5%, обычно по меньшей мере примерно 1%, до 15 или 20% по массе, и выбирается, в первую очередь, с учетом требуемой дозы, объема жидкости, вязкости и т.д., в соответствии с конкретным выбранным способом введения.
Терапия может представлять режим однократного дозирования или режим многократного дозирования, при этом начальный курс лечения может состоять из 1-10 доз, с последующим введением других доз через определенные промежутки времени, необходимые для сохранения или усиления ответа, например, через 1-4 месяца введение второй дозы и, при необходимости, еще через несколько месяцев введение последующей дозы. Примеры подходящих схем лечения включают (ί) 0, 1 месяц и 6 месяцев; (ίί) 0, 7 дней и 1 месяц; (ίίί) 0 и 1 месяц; (ίν) 0 и 6 месяцев, или другие схемы, позволяющие получить желаемый ответ, при котором ожидается ослабление симптомов заболевания или степени тяжести заболевания.
Таким образом, раскрываемые в настоящем изобретении фармацевтические композиции для внутримышечного введения, могут содержать 1 мл стерильного забуференного водного раствора и от примерно 1 нг до примерно 100 мг, от примерно 50 нг до примерно 30 мг, или от примерно 5 мг до примерно 25 мг антитела, раскрываемого в настоящем изобретении. Аналогичным образом, раскрываемая в настоящем изобретении фармацевтическая композиция для внутривенного введения может содержать примерно 250 мл стерильного раствора Рингера и от примерно 1 мг до примерно 30 мг, или от примерно 5 мг до примерно 25 мг антитела, раскрываемого в настоящем изобретении. Способы изготовления композиций для парентерального введения хорошо известны и описаны более подробно, например, в Кеттдΐοη'δ РЬагтасеийса1 8с1еисе, 15-е изд., Маек РиЬйкШид Сотрапу, Истон, Пенсильвания.
Антитела, раскрываемые в настоящем изобретении, могут быть лиофилизированы для хранения и восстановлены в соответствующем носителе перед использованием. Этот способ зарекомендовал себя эффективным способом для антител и других белковых препаратов, и могут быть использованы известные специалистам методики лиофилизации и восстановления.
Диагностические методы и наборы.
Антитела, раскрываемые в настоящем изобретении, могут быть использованы в способах диагностирования БА или других таупатий у пациента. Этот способ включает обнаружение у пациента наличия ПСФ-тау с помощью диагностического реагента, такого как антитело или его фрагмент, раскрываемые в настоящем изобретении.
ПСФ-тау-белок может быть обнаружен в биологической пробе, забранной у пациента (например, крови, моче, спинномозговой жидкости), с помощью входа биологической пробы в контакт с диагностическим реагентом, содержащего антитело, и обнаружения связывания диагностического реагента, содержащего антитело с ПСФ-тау-белком в пробе, забранной у пациента. Анализы, проводимые для обнаружения, включают хорошо известные способы, такие как ИФА, иммуногистохимическое исследование, вестерн-блоттинг или ίη νίνο визуализация. Примеры диагностических антител представляют собой антитела РТ1 и РТ3, раскрываемые в настоящем изобретении, и относятся к 1дО1, к типа.
Диагностические антитела или аналогичные реагенты могут быть введены внутривенно в организм пациента или непосредственно в головной мозг любым подходящим путем, который доставляет агент в организм пациента в соответствии с примерами, приведенными выше. Доза антитела должна находиться в тех же пределах, что и доза для лечения. Обычно антитело метят, хотя при применении некоторых способов первичное антитело с аффинностью к ПСФ-тау-белку остается немеченым, и для связывания с первичным антителом используют вторичный агент для мечения. Выбор метки зависит от средства обнаружения. Например, флуоресцентная метка подходит для обнаружения оптическими методами. Использование парамагнитной метки подходит для обнаружения методом томографии без хирургического вмешательства. Радиоактивные метки могут быть также обнаружены с помощью ПЭТ или ОФЭКТ.
Диагноз выполнение с помощью сравнения количества, размера и/или интенсивности меченого ПСФ-тау, агрегатов тау и/или нейрофибриллярных клубков в пробе, забранной у пациента или в организме пациента, с соответствующими исходными значениями. Исходные значения могут представлять собой средние уровни у популяции здоровых людей. Исходные значения могут также представлять со- 10 027975 бой предшествующие уровни, определенные у того же пациента.
Диагностические способы, описанные выше, могут также использоваться для мониторирования ответа пациента на терапию посредством обнаружения наличия ПСФ-тау в организме пациента до, в течение или после лечения. Снижение значений относительно исходного уровня свидетельствует о положительном ответе на лечение. Величины могут также временно повышаться в биологических жидкостях по мере того, как патологические тау-белки выводятся из головного мозга.
Настоящее изобретение далее направлено на создание набора для выполнения исследований описанными выше диагностическими способами и способами мониторирования. Типично, такой набор содержит диагностический реагент, такой как антитела, раскрываемые в настоящем изобретении, и в качестве опции обнаруживаемую метку. Диагностическое антитело само по себе может содержать обнаруживаемую метку (например, флуоресцентную молекулу, биотин, и т.д.), которая обнаруживается непосредственно или обнаруживается через вторичную реакцию (например, реакция со стрептавидином). Альтернативным образом, может использоваться второй реагент, содержащий обнаруживаемую метку, при этом второй реагент имеет специфичность связывания с первичным антителом. В диагностическом наборе, подходящем для измерения ПСФ-тау в биологической пробе, антитела в наборе могут подставляться заранее связанными с твердой фазой, такой как лунки микротитрационного планшета.
Все цитируемые отсылки (включая книги, выданные патенты, опубликованные заявки на патент и одновременно находящаяся на рассмотрении заявки на патент того же заявителя), цитируемые в тексте данного изобретения, включены в содержание настоящего патента путем отсылки.
Пример 1.
Очищение парного спирального филамента-тау (ПСФ-тау).
ПСФ-тау-белок был частично очищен способом ОгеепЬегд и Эа\те5 с модификациями (ОгеепЬегд апб Эа\те5 Ргос ЫаН Асаб δει υδΑ 87:5827-31, 1990). Вкратце, ткань, полученная посмертно из коры головного мозга пациента с подтвержденной гистологически болезнью Альцгеймера, была частично очищена. Типично, 5 мг лобной доли гомогенизировали в 10 об. охлажденного буферного раствора Буфер Н (10 мМ Трис, 800 мМ ЫаС1, 1 мМ ЭГТК и 10% сахароза/рН 7,4) с использованием гомогенизатора ткани Поттера из стекла/тефлона (компания ΙΚΑ \Уог1<5. 1пс; Стауфен, Германия) на скорости 1000 об/мин. Гомогенизированный материал центрифугировали при 264,8 N (27000д) в течение 20 мин в роторе δοτуа11 δδ34. Отбрасывали осадок и супернатант доводили до конечной концентрации, составляющей 1% (мас./об.) Ν-лауроилсаркозина и 1% (по объему) 2-меркаптоэтанола, и инкубировали в течение 2 ч при температуре 37°С. Затем супернатант центрифугировали при 1059,1 N (108000д) в течение 35 мин при температуре 20°С в роторе Весктап 60Τί. Осадок осторожно вымывали в ЗФР и суспендировали в ЗФР. Супернатант центрифугировали повторно в соответствии с описанным и конечный осадок растворяли, брали аликвоты и замораживали при температуре -80°С. Качество препаратов ПСФ-тау оценивали на 12% ДСН-полиакриламидного геля и проводили вестерн-блоттинг с анти-тау-антителами АТ8 и НТ7 (компания ΤЬе^тοδс^еηΐ^ί^с, Рокфорд, Иллинойс). АТ8 обнаруживает ПСФ-тау-белок фосфорилированный по δ202/Τ205, но не связывается с нефосфорилированным ПСФ-тау-белком или с тау-белком дикого типа. НТ7 связывается с нефосфорилированным эпитопом на аминокислотах 159-163 тау (δΕΟ ГО ΝΟ: 6) и распознает как тау-белок, так и ПСФ-тау-белок. Препарат ПСФ-тау надлежащего качества состоит из 4 полос, имеющих молекулярную массу примерно 60, 64, 66 и 72 кДа при детектировании в ходе вестерн-блоттинга с помощью антитела, реагирующего с гипефосфорилированным ПСФ-тау-белком, такой как АТ8. Из одной и той же пробы головного мозга были приготовлены два отдельных препарата ПСФ-тау сравнимого качества и чистоты. Препарат 1 использовали для иммунизации.
Пример 2.
Генерация моноклональных антител против ПСФ-тау.
Анти-ПСФ-тау-антитела генерировали с использованием стандартного метода гибридомы на нормальных мышах линии Ва1Ь/с (КоЫег апб МПйет Ыа1иге 256:495-7, 1975). Полученные гибридомы засевали в 96-луночные планшеты и через 10 дней проводили прямой ТИФА ПСФ-тау в количестве 25 нг на лунку в соответствии с описанным ниже. Положительные клетки тестировали на перекрестную реактивность на контрольном тау-белке в количестве 10 нг на лунку (δΕΟ ГО ΝΟ: 6), экспрессированном в клетках Ε. Сой ВЬ21 и очищенном с помощью тепловой обработки и осаждение сульфатом аммония, и сразу же субклонировали, положительные клоны замораживали в жидком азоте. Все гибридомы выращивали в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла с прибавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (Нус1опе, Европа), добавки ΗΡСδ для слияния и клонирования гибридомы (2%) (Коске, Брюссель, Бельгия), 2% НТ С^фта, США), 1 мМ пирувата натрия, 2 мМ Ь-глутамина и пенициллина (100 ЕД/мл) и стрептомицина (50 мг/мл).
Вариабельные участки антител из селектированных клеток гибридомы клонировали в 1§О1/1дО2/ к окружении и экспрессировали и очищали, используя стандартные способы.
Прямой ИФА для селекции антитела.
ПСФ-тау-белок в количестве 25 нг/лунку выдерживали в течение ночи при температуре 4°С в 96луночных микротитрационных планшетах ЫиЫС Мах18огр (Ьг£е ТесЬпо1од1е8) с плоским дном и поверхностью, обеспечивающей высокую степень связывания, в буфере (10 мМ Трис, 10 мМ ЫаС1 и 10 мМ
- 11 027975 №ιΝ3. рН 8,5) в количестве 50 мкл на лунку. На следующий день планшеты блокировали 0,1% казеина в ЗФР в количестве 75 мкл на лунку в течение 60 мин при комнатной температуре. Затем прибавляли 50 мкл супернатанта гибридомы и инкубировали в течение 1 ч при температуре 37°С. После отмывки связанные моноклональные антитела детектировали с антимышиным овечьим 1§С, конъюгированным с пероксидазой хрена в количестве 50 мкл на лунку в течение 1 ч при температуре 37°С (АтегеЬатРЬагташа Вю1есЬ). Оба реагента разбавляли 0,1% казеин/ЗФР. Планшеты отмывали, и 50 мкл раствора 0,42 мМ 3,5,3',5'-тетраметилбензидина, 0,003% (по объему) Н2О2 в 100 мМ лимонной кислоты и 100 мМ фосфорнокислого натрия двузамещенного (рН 4,3) прибавляли в качестве субстрата. Оставляли на встряхивателе планшетов для проведения реакции максимум на 15 мин при комнатной температуре, после чего останавливали развитие окрашивания с помощью 2 N Н28О4 в количестве 50 мкл на лунку, и данные планшетов считывали на ридере микропланшетов при длине волны 450 нм (ТЬегтотах, компания Мо1еси1аг Иеуюе8).
Специфичность моноклональных антител.
Селектированные антитела, полученные в результате теста гибридом, тестировали на их перекрестную реактивность с рекомбинантно экспрессированным контрольным тау-белком (8ЕЦ ГО ΝΟ: 6). 500 нг ПСФ-тау и 200 нг контрольного тау загружали в 4-12% гель ΝιιΡΛΟΕ® Νο\όχ® В18-ТЙ8 и блоттировали на нитроцеллюлозной мембране с использованием системы ϊΒΙοΐ (компания 1пу|1годеп) в соответствии с инструкциями производителя. Мембраны блокировали в течение 1 ч с раствором трис-буфера с №С1 и с Твин 20 (ТВ8-Т; 1 М трис, 150 мМ №С1 и 0,05% Твин-20, рН 8,5), содержащий обезжиренное сухое молоко (ΝΕΌΜ) (5% мас./об.; Вютаб) и отмывали три раза в ТВ8-Т. Инкубировали с первичными контрольными антителами (1 мкг/мл) НТ7, АТ8, АТ100 (ТЬетто8с1епййс, Рокфорд, Иллинойс), и ВТ2 разводили в ТВ8-Т, содержащем ΝΕΌΜ (5% мас./об.), в течение ночи при температуре 4°С. Моноклональные антитела РТ1, РТ2, РТ3, РТ4 и РТ5, селектированные по результатам теста гибридом, прибавляли в супернатант культуры, содержащий 10% ФБС. Первичные антитела детектировали с использованием антимышиного овечьего 1д, конъюгированного с НРРО (1:20000 в ТВ8-Т, АтетвЬат Вю8шепсе8), методом усиленной хемилюминесценции с помощью система \Уе81 Иита® (Р1етсе, ТНегтовшепОПс). Сигналы регистрировали с помощью системы люминисцентной визуализации (РосНе И1адпо8Йс). РТ1 и РТ3 реагировали с ПСФ-тау-белком, но не реагировали с контрольным тау-белком по результатам вестерн-блоттинга. РТ2 реагировал с обоими белками. Профили связывания НТ7 и АТ8 описаны выше. АТ100 связывается с фосфорилированным 8ег212/ТЬг214 и связывается с ПСФ-тау-белком, но не с таубелком дикого типа. ВТ2 распознает нефосфорилированный эпитоп, содержащий 8199/8202 и, таким образом, распознает тау-белок дикого типа, но не ПСФ-тау-белок.
Конкурентное связывание с эпитопами.
Оценивали конкурентное связывание моноклональных антител РТ1, РТ2, РТ3, РТ4, РТ5, АТ8 (ТЬетто8с1епййс, Рокфорд, Иллинойс), АТ100 (ТЬегто8с1епййс, Рокфорд, Иллинойс) и НТ7 (ΜΝ1000) (ТЬегто 8аепййс, Рокфорд, Иллинойс) с ПСФ-тау-белком или фосфорилированными таупептидами. Антитела метили с помощью N48-эфира М8И® 8ийо-Тад (Ме8о 8са1е И18соуету) в соответствии с инструкциями производителя.
Для конкуренции с мечеными РТ1, РТ3, АТ100 и НТ7 обогащенные ПСФ-тау-белки в количестве 5 мкл (50 мкг/мл) на лунку (очищенные в соответствии с описанным выше) наносили на планшет М8И ШдНВшб (Ме8о 8са1е И18соуету, Гейтерсберг, Мэриленд) на 2 ч при комнатной температуре. Для конкуренции с АТ8, 25 мкл, 0,1 мг на лунку, синтетического биотинилированного и пегилированного пептида К8О¥88РО(р8)РО(рТ)РО8К8К-0Н (№№ ЕпДапб Рерйбе, БЬС, Гарднер, Массачусетс) (8ЕЦ ГО ΝΟ: 39), соответствующего остаткам 194-211 контрольного тау (8ЕО ГО ΝΟ: 6), фосфорилированного на остатках, соответствующих 8202/Т205 в контрольном тау-белке, наносили на планшеты, покрытые стрептавидином (Ме8о 8са1е И18соуету, Гейтерсберг, Мэриленд). После нанесения лунки блокировали с помощью 150 мкл 5% буфера М8И В1оскег А при комнатной температуре в течение 2 ч и отмывали три раза 0,1 М буфера на основе ГЭПЭС, рН 7,4. В каждую лунку прибавляли 25 мкл смеси меченых отдельных анти-тау-антител (10 нМ или 50 нМ) и последовательные разведения различных немеченых конкурентных антител (от 1 нМ до 2 мкМ). Планшеты инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре при острожном встряхивали и отмывали 3 раза, как описано выше. Прибавляли разведенный буфер для считывания М8И Реаб Вийет Т в количестве 150 мкл на лунку, и данные планшетов считывали с помощью 8ЕСТОР 1тадег 6000 (Ме8о 8са1е И18соуету, Гейтерсберг, Мэриленд).
Неперекрывающиеся эпитопы анти-тау-мкАТ НТ7, АТ100 и АТ8 описаны выше. Основываясь на опубликованных данных, не ожидали, что эти антитела будут конкурировать между собой за связывание с тау или пептидами.
Основываясь на проведенных анализах конкуренции, все без исключения антитела не конкурировали друг с другом за связывание, что указывает, что они связываются с разными эпитопами. Во всех без исключения экспериментах отмечено только самоингибирование. На фиг. 1-5 показаны результаты анализов конкуренции с мечеными АТ8, РТ1, РТ3, АТ100 и НТ7 соответственно.
- 12 027975
Пример 3.
Анти-ПСФ-тау-антитела снижают накопление ПСФ-тау в условиях ίη νίνο.
5-месячным самкам мышей линии Р301Ь (Тасошс, кат#002508) вводили один раз в неделю мышиный 1§01, физиологический раствор, РТ3 (500 мкг/мышь) или АТ8 (экспрессированный из гибридомы ЕСАСС, άβροδίΐ пишЬег 9110086) в течение 5 месяцев. Мышей анестезировали, перфузировали охлажденным ЗФР, головной мозг иссекали на льду. Одно полушарие головного мозга от каждой мыши гомогенизировали в 10 объемах буфера Н с последующим центрифугированием при 205,9 N (21000д) в течение 20 мин при температуре 4°С. Получившийся супернатант далее центрифугировали при 205,9 N (100000д) в течение 60 мин. После центрифугирования осадок (фракцию Р1) восстанавливали и ресуспендировали в лизисном буфере для проведения вестерн-блоттинга и ИФА, как описано СЬа1 е! а1., ί ΒίοΙ СЬет 286:34457-67, 2011. Для проб коры головного мозга фракцию Р1 далее обрабатывали 1% (мас./об.) Ν-лауроилсаркозина и ультрацентифугировали для дальнейшего обогащения ПСФ-тау в осадке. Обнаружено, что самцы мышей линии Р301Ь имели низкую экспрессию трансгенов, и их материал не использовали при проведении анализов.
Фосфорилированный тау-белок измеряли в гомогенатах ствола головного мозга (фракция Р1) в ходе ИФА сэндвич-типа с использованием антител АТ8 и АТ100 в качестве иммобилизованных антител с последующим детектированием биотинилированного НТ7 и авидина, конъюгированного с пероксидазой хрена (фиг. 6А и 6В), и с АТ100 в вестерн-блоттинге (фиг. 6С), как это описано в существенной степени в СЬа1 е! а1., ί ΒίοΙ СЬет 286:34457-67, 2011. Вкратце, осадок Р1 ресуспендировали лизисным буфером (Се11 ФдпаЬпд). Пробы остатка Р1 инкубировали в лунках, заранее покрытых АТ8 или АТ100 (Τίκπιιο Заепййс), с меченым биотином антителом НТ-7. Затем пробы промывали 5 раз буферным раствором с последующей инкубацией с авидином, конъюгированным пероксидазой хрена в течение 1 ч. Вслед за этим пробы инкубировали с однокомпонентным субстратом ТМБ (Τίκπιιο ЗОепЬйс) в течение 30 мин с последующей обработкой 2Ν Н2§04. Наконец, реакцию считывали при длине волны 450 нм и определяли содержание АТ8- или АТ100-реактивного тау-белка в головном мозге с помощью стандартной кривой, построенной по данным анализа гомогенатов головного мозга человека, пораженного БА, и представляли графически как относительное количество гомогената головного мозга, пораженного БА (нг/мл), обеспечивающего такой же сигнал ИФА, как и средние пробы материала нетрансгенного животного (Β6).
Статистически значимое снижение или тенденция к значимому снижению фосфорилированного тау отмечены у трансгенных животных с мутантным тау-белком Р301Ь, которым вводили РТ3, по сравнению с контрольными животными, которым вводили изотипический контроль, в ходе анализов ИФА с использованием АТ100 (ρ=0,057) или АТ8 (ρ=0,0475) для детектирования фосфорилирования (сигнал ИФА: группа с введением солевого раствора (1135±228,8); группа с введением 1§01(1344±245,6); группа с введением РТ3 (660,5±134,5); группа с введением АТ8(1271±274)).
Для подтверждения данных, полученных в ходе ИФА, гомогенаты ствола головного мозга (фракция Р1) животных, которым вводили 1§О1 или РТ3, анализировали в ходе вестерн-блоттинга посредством обнаружения ПСФ-тау с использованием антитела АТ100. Фильтры блоттировали с помощью антитела антиактин в качестве загрузочного контроля (фиг. 6В). Результаты вестерн-блоттинга показали снижение количества ПСФ-тау, обнаруживаемого антителом АТ100, по сравнению с животными, которыми вводили 1§О1.
При анализе коры головного мозга использовали как растворимые в саркозиле (представляющие растворимый тау-белок), так и нерастворимые (представляющие ПСФ-тау-белок) фракции коры головного мозга для проведения ИФА сэндвич-типа с использованием пан-тау-антитела (РТ4) или фосфо-тауантитела (АТ8) для захвата с последующим использованием биотин-пан-тау-антитела (ЬТаи10) и затем авидина, конъюгированного с пероксидазой хрена. Животные, которым вводили РТ3, имели одинаковый уровень общего содержания тау по сравнению с животными, которым вводили изотипический контроль 1дС1. Тенденция к понижению уровня ПСФ-тау была очевидной у животных, которым вводили РТ3, по сравнению с животными, которым вводили изотипический контроль при анализе нерастворимых в Νлауроилсаркозине фракций (ИФА захват с РТ4: группа с введением 1дС: 851026±261198 и группа с введением РТ3: 585639±120498; ИФА, захват с АТ8: группа с введением 1дС: 1125886±286240 (N=10) и группа с введением рТ3: 746582± 124970 (N=7)).
Пример 4.
Определение характеристик анти-ПСФ-тау-антител.
Определение аффинности.
Взаимодействие моноклональных антител РТ1 и РТ3 с рекомбинантным человеческим растворимым тау-белком или ПСФ-тау-белком изучали с помощью системы Рго1е0п. Все взаимодействия исследовали при температуре 25°С с использованием ЗФР, рН 7,4, с прибавлением 3 мМ ЭДТК, и 0,005% Твин-20 в качестве подвижного или системного буфера. Использовали два различных экспериментальных формата, один - для взаимодействия с рекомбинантно экспрессированным контрольным тау-белком, и другой - для взаимодействия с ПСФ-тау-белком. В этих экспериментах в качестве положительного
- 13 027975 контроля использовали НТ7 (Р1егсе, кат. № ΜΝ1000), мышиное анти-тау-антитело.
Для исследования взаимодействия с рекомбинантно экспрессированным контрольным тау-белком готовили поверхность биосенсора с помощью нанесения специфического антитела (ЛЬ) фрагмента БсХ античеловеческого или антимышиного 1дО на поверхность ИС датчика ОБС (Рго1еОп), следуя всем инструкциям производителя в отношении химии соединения аминов (~5000 единиц ответа (КИ)). Буфер соединения представлял собой 10 мМ ацетата натрия, рН 4,5. Анти-ПСФ-тау-антитела разводили в подвижном буфере и вводили для получения захвата, составляющего 60-130 Ки. За захватом анти-РБН-Тау мкАТ следовала инъекция рекомбинантно экспрессированного контрольного тау (Таи-441, каталог 51§ша# Т0576-50ид) в раствор (от 0,1 до 75 нМ в 5-кратных разведениях). Ассоциацию мониторировали в течение 2 мин (80 мкл инъектировали при скорости 40 мкл/мин). Диссоциацию мониторировали в течение 10 мин. Регенерацию поверхности сенсора проводили с помощью 0,85% Н3РО4 или 0,85% Н3РО4 с последующим 50 мМ ΝαΟΗ. Данные соразмерны в модели связывания 1:1. Данные соразмерны в модели связывания 1:1.
Таблица 2
мкАТ Антиген --1 -1- к (М с ) вкл. к (с ) выкл. *Ке (пМ)
РТ1 Контрольное тау А А
РТ1 ПСФ-тау 2,01Е+05 б,47Е-05 322
РТЗ Контрольное тау ААА
РТЗ ПСФ-тау (1,23±0,Об)Е+Об (2,18±0,28) Е-05 18±2
* Для ПСФ-тау это является кажущейся внутренней аффинностью, где ΚΏ получена как соотношении к££1/коп-1, как производное подгонки, выполненной с помощью бивалентной модели связывания.
** Значимое связывание отсутствует.
*** Связывание отсутствует в 4 из 5 экспериментов.
Для исследования взаимодействия с ПСФ-тау-белком готовили поверхность биосенсора с помощью захвата-соединения ПСФ-тау с использованием НТ7 в качестве реагента захвата. Требуется дополнительное приготовление ПСФ-тау, в соответствии с описанным выше, для системы Рго1еОп, чтобы ограничить количество нерастворимого материала, попадающего в струйные элементы. ПСФ-тау-белок, в соответствии с описанным выше, дополнительно готовили посредством 2-кратного центрифугирования при 49 N (5000д), при температуре 5°С в течение 10 мин, при этом супернатант из второго центрифугирования затем разводили в соотношении 1/20 или 1/40 в подвижном буфере. Для приготовления ИС, ковалентно иммобилизовывали НТ7 на поверхности ИС сенсора ОБС (Рго1еОп), следуя всем инструкциям производителя в отношении химии соединения аминов (~3000 единиц (КИ)). Буфер соединения представлял собой 10 мМ ацетата натрия, рН 4,5. После иммобилизации НТ7 ПСФ-тау-белок инъектировали и захватывали (~300 КИ) НТ7. После захвата ПСФ-тау-белок ковалентно иммобилизовывали на ИС сенсора посредством активации ИС, следуя всем инструкциям производителя в отношении химии соединения аминов. Оставшиеся реакционноспособные участки были окончательно блокированы с помощью инъекции этаноламина. После приготовления и стабилизации поверхности, модифицированной ПСФтау-белком, и поверхности сравнения (не содержащей антигена), анти-ПСФ-тау-антитела разводили в подвижном буфере и инъектировали в раствор (0,1-75 нМ в 5-кратных разведениях). Ассоциацию мониторировали в течение 3 мин (120 мкл инъектировали при скорости 40 мкл/мин). Диссоциацию мониторировали в течение 10 или 15 мин. Регенерацию поверхности сенсора проводили с помощью 10 мМ О1у, рН 2. Данные были соразмерны при использовании бивалентной модели связывания, в которой кажущуюся внутреннюю аффинность регистрировали как отношение ко££-1/коп-1.
Основываясь на экспериментах системы Рго!еОп, РТ1 связывал ПСФ-тау-белок с аффинностью 322 пМ и не связывался с контрольным тау-белком в условиях проведения испытаний (табл. 2). РТ3 связывал ПСФ-тау-белок с аффинностью 18±2 пМ и не связывался с контрольным тау-белком в 4 из 5 измерениях в условиях проведения испытаний. Одно из измерений на системе 5 Рго!еОп показало слабое связывание, которое может быть использовано для измерения аффинности > использовали 75 нМ, основываясь на максимальной концентрации контрольного тау.
Настоящее изобретение раскрыто в полном объеме, специалисту в данной области будет вполне понятно, что в него может быть внесено множество изменений и модификаций без отступления от сущности и объема прилагаемой формулы изобретения.
- 14 027975
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> Лапззеп БьоЕесИ, 1пс.
СИгьзЕорИег, А1Дег£ег БагДизх, Лапескь Хиезопд, Ь1и
Магс, Мегскеп МеИзза, МигДоск Магс, ЧапДегтеегеп Зат, Ии <120> Анти-ПСФ-тау-антитела и их применение <130> СЕЫ5316ИОРСТ <150> 61/577817 <151> 2011-12-20 <160> 39 <170> Патент в версии 3.5 <210> 1 <211> 352 <212> Белок <213> Ното зарьепз <400> 1
МеЕ 1 А1а О1и Рго Агд 5 О1п О1и РИе
ТИг Туг О1у Ьеи 20 О1у Азр Агд Ьуз
О1п Азр О1п 35 О1и О1у Азр ТИг Азр 40
О1у 11е 50 О1у Азр ТИг Рго Зег 55 Ьеи
ТИг 65 О1п А1а Агд МеЕ Уа1 70 Зег Ьуз
Азр Буз Ьуз А1а Ьуз 85 О1у А1а Азр
Агд О1у А1а А1а 100 Рго Рго О1у О1п
11е Рго А1а 115 Ьуз ТИг Рго Рго А1а 120
О1и Рго 130 Рго Ьуз Зег О1у Азр 135 Агд
О1и Уа1 10 МеЕ О1и Азр Н1з А1а 15 О1у
Азр 25 О1п О1у О1у Туг ТИг 30 МеЕ Н1з
А1а О1у Ьеи Ьуз А1а 45 О1и О1и А1а
О1и Азр О1и А1а 60 А1а О1у Н1з Уа1
Зег Ьуз Азр 75 О1у ТИг О1у Зег Азр 80
О1у Ьуз 90 ТИг Ьуз 11е А1а ТИг 95 Рго
Ьуз 105 О1у О1п А1а Азп А1а 110 ТИг Агд
Рго Ьуз ТИг Рго Рго 125 Зег Зег О1у
Зег О1у Туг Зег 140 Зег Рго О1у Зег
- 15 027975
Рго 145 О1у ТЬг Рго О1у Бег 150 Агд Бег Агд ТЬг Рго 155 Бег Ьеи Рго ТЬг Рго 160
Рго ТЬг Агд О1и Рго Ьуз Ьуз Уа1 А1а Уа1 Уа1 Агд ТЬг Рго Рго Ьуз
165 170 175
Бег Рго Бег Бег А1а Ьуз Бег Агд Ьеи О1п ТЬг А1а Рго Уа1 Рго МеЕ
180 185 190
Рго Азр Ьеи Ьуз Азп Уа1 Ьуз Бег Ьуз 11е О1у Бег ТЬг О1и Азп Ьеи
195 200 205
Ьуз Н1з О1п Рго О1у О1у О1у Ьуз Уа1 О1п 11е Уа1 Туг Ьуз Рго Уа1
210 215 220
Азр Ьеи Бег Ьуз Уа1 ТЬг Бег Ьуз Суз О1у Бег Ьеи О1у Азп 11е Н1з
225 230 235 240
Н1з Ьуз Рго О1у О1у О1у О1п Уа1 О1и Уа1 Ьуз Бег О1и Ьуз Ьеи Азр
245 250 255
РЬе Ьуз Азр Агд Уа1 О1п Бег Ьуз 11е О1у Бег Ьеи Азр Азп 11е ТЬг
260 265 270
Н1з Уа1 Рго О1у О1у О1у Азп Ьуз Ьуз 11е О1и ТЬг Н1з Ьуз Ьеи ТЬг
275 280 285
РЬе Агд О1и Азп А1а Ьуз А1а Ьуз ТЬг Азр Н1з О1у А1а О1и 11е Уа1
290 295 300
Туг Ьуз Бег Рго Уа1 Уа1 Бег О1у Азр ТЬг Бег Рго Агд Н1з Ьеи Бег
305 310 315 320
Азп Уа1 Бег Бег ТЬг О1у Бег 11е Азр МеЕ Уа1 Азр Бег Рго О1п Ьеи
325 330 335
А1а ТЬг Ьеи А1а Азр О1и Уа1 Бег А1а Бег Ьеи А1а Ьуз О1п О1у Ьеи
340 345 350
<210> 2 <211> 381 <212> Белок <213> Ното зар1епз <400> 2
МеЕ А1а О1и Рго Агд О1п О1и РЬе О1и Уа1 МеЕ О1и Азр Н1з А1а О1у 1 5 10 15
- 16 027975
ТЬг Туг О1у Ьеи О1у Азр Агд Ьуз Азр О1п О1у О1у Туг ТЬг МеЬ Н1з
20 25 30
О1п Азр О1п О1и О1у Азр ТЬг Азр А1а О1у Ьеи Ьуз О1и Зег Рго Ьеи
35 40 45
О1п ТЬг Рго ТЬг О1и Азр О1у Зег О1и О1и Рго О1у Зег О1и ТЬг Зег
50 55 60
Азр А1а Ьуз Зег ТЬг Рго ТЬг А1а О1и А1а О1и О1и А1а О1у 11е О1у
65 70 75 80
Азр ТЬг Рго Зег Ьеи О1и Азр О1и А1а А1а О1у Н1з Уа1 ТЬг О1п А1а
85 90 95
Агд МеЬ Уа1 Зег Ьуз Зег Ьуз Азр О1у ТЬг О1у Зег Азр Азр Ьуз Ьуз
100 105 110
А1а Ьуз О1у А1а Азр О1у Ьуз ТЬг Ьуз 11е А1а ТЬг Рго Агд О1у А1а
115 120 125
А1а Рго Рго О1у О1п Ьуз О1у О1п А1а Азп А1а ТЬг Агд 11е Рго А1а
130 135 140
Ьуз ТЬг Рго Рго А1а Рго Ьуз ТЬг Рго Рго Зег Зег О1у О1и Рго Рго
145 150 155 160
Ьуз Зег О1у Азр Агд Зег О1у Туг Зег Зег Рго О1у Зег Рго О1у ТЬг
165 170 175
Рго О1у Зег Агд Зег Агд ТЬг Рго Зег Ьеи Рго ТЬг Рго Рго ТЬг Агд
180 185 190
О1и Рго Ьуз Ьуз Уа1 А1а Уа1 Уа1 Агд ТЬг Рго Рго Ьуз Зег Рго Зег
195 200 205
Зег А1а Ьуз Зег Агд Ьеи О1п ТЬг А1а Рго Уа1 Рго МеЬ Рго Азр Ьеи
210 215 220
Ьуз Азп Уа1 Ьуз Зег Ьуз 11е О1у Зег ТЬг О1и Азп Ьеи Ьуз Н1з О1п
225 230 235 240
Рго О1у О1у О1у Ьуз Уа1 О1п 11е Уа1 Туг Ьуз Рго Уа1 Азр Ьеи Зег
245 250 255
Ьуз Уа1 ТЬг Зег Ьуз Суз О1у Зег Ьеи О1у Азп 11е Нтз Нтз Ьуз Рго
- 17 027975
260 265 270
О1у О1у О1у О1п Уа1 О1и Уа1 Ьуз Зег О1и Ьуз Ьеи Азр РЬе Ьуз Азр
275 280 285
Агд Уа1 О1п Зег Ьуз 11е О1у Зег Ьеи Азр Азп 11е ТЬг Н1з Уа1 Рго
290 295 300
О1у О1у О1у Азп Ьуз Ьуз 11е О1и ТЬг Н1з Ьуз Ьеи ТЬг РЬе Агд О1и
305 310 315 320
Азп А1а Ьуз А1а Ьуз ТЬг Азр Н1з О1у А1а О1и 11е Уа1 Туг Ьуз Зег
325 330 335
Рго Уа1 Уа1 Зег О1у Азр ТЬг Зег Рго Агд Н1з Ьеи Зег Азп Уа1 Зег
340 345 350
Зег ТЬг О1у Зег 11е Азр МеЬ Уа1 Азр Зег Рго О1п Ьеи А1а ТЬг Ьеи
355 360 365
А1а Азр О1и Уа1 Зег А1а Зег Ьеи А1а Ьуз О1п О1у Ьеи
370 375 380
<210> 3
<211> · 410
<212> Белок
<213> Ното заряепз
<400> 3
МеЬ А1а О1и Рго Агд О1п О1и РЬе О1и Уа1 МеЬ О1и Азр Н1з А1а О1у
1 5 10 15
ТЬг Туг О1у Ьеи О1у Азр Агд Ьуз Азр О1п О1у О1у Туг ТЬг МеЬ Н1з
20 25 30
О1п Азр О1п О1и О1у Азр ТЬг Азр А1а О1у Ьеи Ьуз О1и Зег Рго Ьеи
35 40 45
О1п ТЬг Рго ТЬг О1и Азр О1у Зег О1и О1и Рго О1у Зег О1и ТЬг Зег
50 55 60
Азр А1а Ьуз Зег ТЬг Рго ТЬг А1а О1и Азр Уа1 ТЬг А1а Рго Ьеи Уа1
65 70 75 80
Азр О1и О1у А1а Рго О1у Ьуз О1п А1а А1а А1а О1п Рго Н1з ТЬг О1и
85 90 95
Не Рго О1и О1у ТЬг ТЬг А1а О1и О1и А1а О1у 11е О1у Азр ТЬг Рго
- 18 027975
100 105 110
Зег Ьеи О1и Азр О1и А1а А1а О1у Н1з Уа1 ТЬг О1п А1а Агд МеЬ Уа1
115 120 125
Зег Ьуз Зег Ьуз Азр О1у ТЬг О1у Зег Азр Азр Ьуз Ьуз А1а Ьуз О1у
130 135 140
А1а Азр О1у Ьуз ТЬг Ьуз 11е А1а ТЬг Рго Агд О1у А1а А1а Рго Рго
145 150 155 160
О1у О1п Ьуз О1у О1п А1а Азп А1а ТЬг Агд 11е Рго А1а Ьуз ТЬг Рго
165 170 175
Рго А1а Рго Ьуз ТЬг Рго Рго Зег Зег О1у О1и Рго Рго Ьуз Зег О1у
180 185 190
Азр Агд Зег О1у Туг Зег Зег Рго О1у Зег Рго О1у ТЬг Рго О1у Зег
195 200 205
Агд Зег Агд ТЬг Рго Зег Ьеи Рго ТЬг Рго Рго ТЬг Агд О1и Рго Ьуз
210 215 220
Ьуз Уа1 А1а Уа1 Уа1 Агд ТЬг Рго Рго Ьуз Зег Рго Зег Зег А1а Ьуз
225 230 235 240
Зег Агд Ьеи О1п ТЬг А1а Рго Уа1 Рго МеЬ Рго Азр Ьеи Ьуз Азп Уа1
245 250 255
Ьуз Зег Ьуз 11е О1у Зег ТЬг О1и Азп Ьеи Ьуз Н1з О1п Рго О1у О1у
260 265 270
О1у Ьуз Уа1 О1п 11е Уа1 Туг Ьуз Рго Уа1 Азр Ьеи Зег Ьуз Уа1 ТЬг
275 280 285
Зег Ьуз Суз О1у Зег Ьеи О1у Азп 11е Н1з Н1з Ьуз Рго О1у О1у О1у
290 295 300
О1п Уа1 О1и Уа1 Ьуз Зег О1и Ьуз Ьеи Азр РЬе Ьуз Азр Агд Уа1 О1п
305 310 315 320
Зег Ьуз 11е О1у Зег Ьеи Азр Азп 11е ТЬг Н1з Уа1 Рго О1у О1у О1у
325 330 335
Азп Ьуз Ьуз 11е О1и ТЬг Нтз Ьуз Ьеи ТЬг РЬе Агд О1и Азп А1а Ьуз
340 345 350
- 19 027975
А1а Ьуз ТЬг 355 Азр Н1з О1у А1а О1и 360 11е Уа1 Туг Ьуз Зег 365 Рго Уа1 Уа1
Зег О1у Азр ТЬг Зег Рго Агд Н1з Ьеи Зег Азп Уа1 Зег Зег ТЬг О1у
370 375 380
Зег 11е Азр МеЬ Уа1 Азр Зег Рго О1п Ьеи А1а ТЬг Ьеи А1а Азр О1и
385 390 395 400
Уа1 Зег А1а Зег Ьеи А1а Ьуз О1п О1у Ьеи
405 410
<210> 4
<211> : 383
<212> Белок
<213> ] Ното зартепз
<400> 4
МеЬ А1а О1и Рго Агд О1п О1и РЬе О1и Уа1 МеЬ О1и Азр Н1з А1а О1у
1 5 10 15
ТЬг Туг О1у Ьеи О1у Азр Агд Ьуз Азр О1п О1у О1у Туг ТЬг МеЬ Н1з
20 25 30
О1п Азр О1п О1и О1у Азр ТЬг Азр А1а О1у Ьеи Ьуз А1а О1и О1и А1а
35 40 45
О1у 11е О1у Азр ТЬг Рго Зег Ьеи О1и Азр О1и А1а А1а О1у Н1з Уа1
50 55 60
ТЬг О1п А1а Агд МеЬ Уа1 Зег Ьуз Зег Ьуз Азр О1у ТЬг О1у Зег Азр
65 70 75 80
Азр Ьуз Ьуз А1а Ьуз О1у А1а Азр О1у Ьуз ТЬг Ьуз 11е А1а ТЬг Рго
85 90 95
Агд О1у А1а А1а Рго Рго О1у О1п Ьуз О1у О1п А1а Азп А1а ТЬг Агд
100 105 110
11е Рго А1а Ьуз ТЬг Рго Рго А1а Рго Ьуз ТЬг Рго Рго Зег Зег О1у
115 120 125
О1и Рго Рго Ьуз Зег О1у Азр Агд Зег О1у Туг Зег Зег Рго О1у Зег
130 135 140
Рго О1у ТЬг Рго О1у Зег Агд Зег Агд ТЬг Рго Зег Ьеи Рго ТЬг Рго
145 150 155 160
- 20 027975
Рго ТЬг Агд О1и Рго 165 Ьуз Ьуз Уа1 А1а Уа1 170 Уа1 Агд ТЬг Рго Рго 175 Ьуз
Зег Рго Зег Зег А1а Ьуз Зег Агд Ьеи О1п ТЬг А1а Рго Уа1 Рго МеЬ
180 185 190
Рго Азр Ьеи Ьуз Азп Уа1 Ьуз Зег Ьуз 11е О1у Зег ТЬг О1и Азп Ьеи
195 200 205
Ьуз Нйз О1п Рго О1у О1у О1у Ьуз Уа1 О1п 11е 11е Азп Ьуз Ьуз Ьеи
210 215 220
Азр Ьеи Зег Азп Уа1 О1п Зег Ьуз Суз О1у Зег Ьуз Азр Азп 11е Ьуз
225 230 235 240
Нйз Уа1 Рго О1у О1у О1у Зег Уа1 О1п 11е Уа1 Туг Ьуз Рго Уа1 Азр
245 250 255
Ьеи Зег Ьуз Уа1 ТЬг Зег Ьуз Суз О1у Зег Ьеи О1у Азп 11е Н1з Н1з
260 265 270
Ьуз Рго О1у О1у О1у О1п Уа1 О1и Уа1 Ьуз Зег О1и Ьуз Ьеи Азр РЬе
275 280 285
Ьуз Азр Агд Уа1 О1п Зег Ьуз 11е О1у Зег Ьеи Азр Азп 11е ТЬг Н1з
290 295 300
ναι Рго О1у О1у О1у Азп Ьуз Ьуз 11е О1и ТЬг Н1з Ьуз Ьеи ТЬг РЬе
305 310 315 320
Агд О1и Азп А1а Ьуз А1а Ьуз ТЬг Азр Н1з О1у А1а О1и 11е Уа1 Туг
325 330 335
Ьуз Зег Рго Уа1 Уа1 Зег О1у Азр ТЬг Зег Рго Агд Н1з Ьеи Зег Азп
340 345 350
ναι Зег Зег ТЬг О1у Зег 11е Азр МеЬ Уа1 Азр Зег Рго О1п Ьеи А1а
355 360 365
ТЬг Ьеи А1а Азр О1и Уа1 Зег А1а Зег Ьеи А1а Ьуз О1п О1у Ьеи
370 375 380
<210> 5
<211> 441
<212> Белок
<213> Ното зар1епз
<400> 5
- 21 027975
МеЕ 1 А1а О1и Рго Агд О1п 5 О1и РЬе О1и Уа1 10 МеЕ О1и Азр Н1з А1а 15 О1у
ТЬг Туг О1у Ьеи О1у Азр Агд Ьуз Азр О1п О1у О1у Туг ТЬг МеЕ Н1з
20 25 30
О1п Азр О1п О1и О1у Азр ТЬг Азр А1а О1у Ьеи Ьуз О1и Зег Рго Ьеи
35 40 45
О1п ТЬг Рго ТЬг О1и Азр О1у Зег О1и О1и Рго О1у Зег О1и ТЬг Зег
50 55 60
Азр А1а Ьуз Зег ТЬг Рго ТЬг А1а О1и Азр Уа1 ТЬг А1а Рго Ьеи Уа1
65 70 75 80
Азр О1и О1у А1а Рго О1у Ьуз О1п А1а А1а А1а О1п Рго Н1з ТЬг О1и
85 90 95
11е Рго О1и О1у ТЬг ТЬг А1а О1и О1и А1а О1у 11е О1у Азр ТЬг Рго
100 105 110
Зег Ьеи О1и Азр О1и А1а А1а О1у Н1з Уа1 ТЬг О1п А1а Агд МеЕ Уа1
115 120 125
Зег Ьуз Зег Ьуз Азр О1у ТЬг О1у Зег Азр Азр Ьуз Ьуз А1а Ьуз О1у
130 135 140
А1а Азр О1у Ьуз ТЬг Ьуз 11е А1а ТЬг Рго Агд О1у А1а А1а Рго Рго
145 150 155 160
О1у О1п Ьуз О1у О1п А1а Азп А1а ТЬг Агд 11е Рго А1а Ьуз ТЬг Рго
165 170 175
Рго А1а Рго Ьуз ТЬг Рго Рго Зег Зег О1у О1и Рго Рго Ьуз Зег О1у
180 185 190
Азр Агд Зег О1у Туг Зег Зег Рго О1у Зег Рго О1у ТЬг Рго О1у Зег
195 200 205
Агд Зег Агд ТЬг Рго Зег Ьеи Рго ТЬг Рго Рго ТЬг Агд О1и Рго Ьуз
210 215 220
Ьуз Уа1 А1а Уа1 Уа1 Агд ТЬг Рго Рго Ьуз Зег Рго Зег Зег А1а Ьуз
225 230 235 240
Зег Агд Ьеи О1п ТЬг А1а Рго Уа1 Рго МеЕ Рго Азр Ьеи Ьуз Азп Уа1
245 250 255
- 22 027975
Ьуз Зег Ьуз 11е О1у 260 Зег ТЬг О1и Азп Ьеи Ьуз 265 Н1з О1п Рго 270 О1у О1у
О1у Ьуз Уа1 О1п 11е 11е Азп Ьуз Ьуз Ьеи Азр Ьеи Зег Азп Уа1 О1п
275 280 285
Зег Ьуз Суз О1у Зег Ьуз Азр Азп 11е Ьуз Н1з Уа1 Рго О1у О1у О1у
290 295 300
Зег Уа1 О1п 11е Уа1 Туг Ьуз Рго Уа1 Азр Ьеи Зег Ьуз Уа1 ТЬг Зег
305 310 315 320
Ьуз Суз С1у Зег Ьеи О1у Азп 11е Н1з Н1з Ьуз Рго О1у О1у О1у О1п
325 330 335
Уа1 О1и Уа1 Ьуз Зег О1и Ьуз Ьеи Азр РЬе Ьуз Азр Агд Уа1 О1п Зег
340 345 350
Ьуз 11е О1у Зег Ьеи Азр Азп 11е ТЬг Н1з Уа1 Рго О1у О1у О1у Азп
355 360 365
Ьуз Ьуз 11е О1и ТЬг Н1з Ьуз Ьеи ТЬг РЬе Агд О1и Азп А1а Ьуз А1а
370 375 380
Ьуз ТЬг Азр Н1з О1у А1а О1и 11е Уа1 Туг Ьуз Зег Рго Уа1 Уа1 Зег
385 390 395 400
О1у Азр ТЬг Зег Рго Агд Н1з Ьеи Зег Азп Уа1 Зег Зег ТЬг О1у Зег
405 410 415
11е Азр МеЬ Уа1 Азр Зег Рго О1п Ьеи А1а ТЬг Ьеи А1а Азр О1и Уа1
420 425 430
Зег А1а Зег Ьеи А1а Ьуз О1п О1у Ьеи
435 440
<210> 6
<211> 441
<212> Белок
<213> Ното зартепз
<400> 6
МеЬ А1а О1и Рго Агд О1п О1и РЬе О1и Уа1 МеЬ О1и Азр Н1з А1а О1у
1 5 10 15
ТЬг Туг О1у Ьеи О1у Азр Агд Ьуз Азр О1п О1у О1у Туг ТЬг МеЬ Нтз
20 25 30
- 23 027975
О1п Азр О1п О1и 35 О1у Азр ТЬг Азр 40 А1а О1у Ьей Ьуз О1и 45 Зег Рго Ьей
Ο1π ТЬг Рго ТЬг О1и Азр О1у Зег О1и О1и Рго О1у Зег О1и ТЬг Зег
50 55 60
Азр А1а Ьуз Зег ТЬг Рго ТЬг А1а О1и Азр Уа1 ТЬг А1а Рго Ьей Уа1
65 70 75 80
Азр О1и О1у А1а Рго О1у Ьуз О1п А1а А1а А1а О1п Рго Н1з ТЬг О1и
85 90 95
11е Рго О1и О1у ТЬг ТЬг А1а О1и О1и А1а О1у 11е О1у Азр ТЬг Рго
100 105 110
Зег Ьей О1и Азр О1и А1а А1а О1у Н1з Уа1 ТЬг О1п А1а Агд МеЬ Уа1
115 120 125
Зег Ьуз Зег Ьуз Азр О1у ТЬг О1у Зег Азр Азр Ьуз Ьуз А1а Ьуз О1у
130 135 140
А1а Азр О1у Ьуз ТЬг Ьуз 11е А1а ТЬг Рго Агд О1у А1а А1а Рго Рго
145 150 155 160
О1у О1п Ьуз О1у О1п А1а Азп А1а ТЬг Агд 11е Рго А1а Ьуз ТЬг Рго
165 170 175
Рго А1а Рго Ьуз ТЬг Рго Рго Зег Зег О1у О1и Рго Рго Ьуз Зег О1у
180 185 190
Азр Агд Зег О1у Туг Зег Зег Рго О1у Зег Рго О1у ТЬг Рго О1у Зег
195 200 205
Агд Зег Агд ТЬг Рго Зег Ьей Рго ТЬг Рго Рго ТЬг Агд О1и Рго Ьуз
210 215 220
Ьуз Уа1 А1а Уа1 Уа1 Агд ТЬг Рго Рго Ьуз Зег Рго Зег Зег А1а Ьуз
225 230 235 240
Зег Агд Ьей О1п ТЬг А1а Рго Уа1 Рго МеЬ Рго Азр Ьей Ьуз Азп Уа1
245 250 255
Ьуз Зег Ьуз 11е О1у Зег ТЬг О1и Азп Ьей Ьуз Н1з О1п Рго О1у О1у
260 265 270
О1у Ьуз Уа1 О1п 11е 11е Азп Ьуз Ьуз Ьей Азр Ьей Зег Азп Уа1 О1п
275 280 285
- 24 027975
Зег Ьуз 290 Суз О1у Зег Ьуз Азр 295 Азп 11е Ьуз Н1з Уа1 300 Рго О1у О1у О1у
Зег Уа1 О1п 11е Уа1 Туг Ьуз Рго Уа1 Азр Ьеи Зег Ьуз Уа1 ТИг Зег
305 310 315 320
Ьуз Суз О1у Зег Ьеи О1у Азп 11е Н1з Н1з Ьуз Рго О1у О1у О1у О1п
325 330 335
Уа1 О1и Уа1 Ьуз Зег О1и Ьуз Ьеи Азр РИе Ьуз Азр Агд Уа1 О1п Зег
340 345 350
Ьуз 11е О1у Зег Ьеи Азр Азп 11е ТИг Н1з Уа1 Рго О1у О1у О1у Азп
355 360 365
Ьуз Ьуз 11е О1и ТИг Н1з Ьуз Ьеи ТИг РИе Агд О1и Азп А1а Ьуз А1а
370 375 380
Ьуз ТИг Азр Н1з О1у А1а О1и 11е Уа1 Туг Ьуз Зег Рго Уа1 Уа1 Зег
385 390 395 400
О1у Азр ТИг Зег Рго Агд Н1з Ьеи Зег Азп Уа1 Зег Зег ТИг О1у Зег
405 410 415
11е Азр МеЕ Уа1 Азр Зег Рго О1п Ьеи А1а ТИг Ьеи А1а Азр О1и Уа1
420 425 430
Зег А1а Зег Ьеи А1а Ьуз О1п О1у Ьеи
435 440
<210> 7 <211> 5 <212> Белок <213> Миз тизси1из <400> 7
Зег Зег Тгр МеЕ О1у
5 <210> 8 <211> 17 <212> Белок <213> Миз тизси1из <400> 8
Азр 11е Ьеи Рго О1у Зег О1у О1у ТИг Азп Туг Азп О1и Агд РИе Ьуз
5 10 15
- 25 027975
О1у
<210> <211> <212> <213> 9 10 Белок Миз тизси1из
<400> 9
Бег Туг Туг Азр Туг Азр Агд РЬе
1 5
А1а Азп 10
<210> <211> <212> <213> 10 16 Белок Миз тизси1из
<400> 10
Агд Бег Бег О1и Бег Ьеи Ьеи Нтз
1 5
Бег Азп О1у Азп ТЬг Туг Ьеи Туг 10 15
<210> 11
<211> 7
<212> Белок
<213> Миз тизси1из
<400> 11
Агд МеЕ . Бег Азп Ьеи А1а Бег
1 5
<210> 12
<211> 9
<212> Белок
<213> Миз тизси1из
<400> 12
МеЕ О1п Туг Ьеи О1и Туг Рго Ьеи
1 5
ТЬг
<210> <211> <212> <213> 13 5 Белок Миз тизси1из
<400> 13
Бег Туг А1а МеЕ Бег
1 5
<210> 14 <211> 16 <212> Белок
- 26 027975
<213> Миз тизси1из
<400> 14
Зег Не Зег Ьуз О1у О1у Азп ТЬг
1 5
<210> 15
<211> 10
<212> Белок
<213> Ното зар1епз
<400> 15
О1у Тгр > О1у Азр Туг О1у Тгр РЬе
1 5
<210> 16
<211> 11
<212> Белок
<213> Миз тизси1из
<400> 16
Ьуз А1а Зег О1п Азр 11е Азп Агд
1 5
<210> 17
<211> 7
<212> Белок
<213> Миз тизси1из
<400> 17
Агд А1а Азп Агд Ьеи Ьеи Азр
1 5
<210> 18
<211> 9
<212> Белок
<213> Миз тизси1из
<400> 18
Ьеи О1п Туг Азр О1и РЬе Рго Ьеи
1 5
<210> 19
<211> 7
<212> Белок
<213> Миз тизси1из
<400> 19
О1у Туг ТЬг РЬе Зег Зег Зег
1 5
А1а Туг 10
Туг Ьеи Азп 10
ТЬг
Туг Туг Рго Азп Зег Уа1 Ьуз О1у 10 15
- 27 027975 <210> 20 <211> 6 <212> Белок
<213> Миз тизси1из
<400> 20
Ьеи Рго > О1у Зег О1у О1у
1 5
<210> 21
<211> 9
<212> Белок
<213> Миз тизси1из
<400> 21
Зег Туг Туг Азр Туг Азр Агд РЬе А1а
1 5
<210> 22
<211> 12
<212> Белок
<213> Миз тизси1из
<400> 22
Зег О1и Зег Ьеи Ьеи Н1з Зег Азп О1у Азп ТЬг Туг
1 5 10
<210> 23
<211> 3
<212> Белок
<213> Миз тизси1из
<400> 23
Агд МеЬ : Зег
1
<210> 24
<211> 6
<212> Белок
<213> Миз тизси1из
<400> 24
Туг Ьеи О1и Туг Рго Ьеи
1 5
<210> 25
<211> 7
<212> Белок
<213> Миз тизси1из
<400> 25
О1у РЬе > ТЬг РЬе Зег Зег Туг
- 28 027975 <210> 26 <211> 5 <212> Белок <213> Миз тизси1из <400> 26
Бег Ьуз О1у О1у Азп 1 5 <210> 27 <211> 9 <212> Белок <213> Миз тизси1из <400> 27
О1у Тгр О1у Азр Туг О1у Тгр РЬе А1а 1 5 <210> 28 <211> 7 <212> Белок <213> Миз тизси1из <400> 28
Бег О1п Азр 11е Азп Агд Туг 1 5 <210> 29 <211> 3 <212> Белок <213> Миз тизси1из <400> 29
Агд А1а Азп 1 <210> 30 <211> 6 <212> Белок <213> Миз тизси1из <400> 30
Туг Азр О1и РЬе Рго Ьеи 1 5 <210> 31 <211> 357 <212> ДНК <213> Миз тизси1из
- 29 027975
<400> 31 саддЬЬсадс ЬдсадсадЬс ЬддаасЬдад сЬдаЬдаадс сЬддддссЬс адЬдаадаЬа 60
ЬссЬдсаадд сЬасЬддсЬа сасаЬЬсадЬ адсЬссЬдда ЬддддЬдддЬ Ьаадсададд 120
ссЬддасаЬд дссЬЬдадЬд даЬЬддадас аЬЬЬЬассЬд даадЬддЬдд ЬасЬаасЬас 180
ааЬдададдЬ Ьсаадддсаа ддссЬсаЬЬс асЬдсадааа саЬссЬссаа сасадссЬас 240
аЬдсаасЬса дсадссЬдас аЬсЬдаддас ЬсЬдссдЬсЬ аЬЬасЬдЬдЬ аадаадсЬас 300
ЬаЬдаЬЬасд ассдсЬЬЬдс ЬаасЬддддс саадддасЬс ЬддЬсасЬдЬ сЬсЬдса 357
<210> 32 <211> 336 <212> ДНК <213> Миз тизси1из
<400> 32 даЬаЬЬдЬда ЬдасЬсаддс ЬдсасссЬсЬ дЬассЬдЬса сЬссЬддада дЬсадЬЬЬсс 60
аЬсЬссЬдса ддЬсЬадЬда дадЬсЬссЬд саЬадЬааЬд дсаасасЬЬа сЬЬдЬаЬЬдд 120
ЬЬссЬдсада ддссаддсса дЬсЬссЬсад сЬссЬдаЬаЬ аЬсддаЬдЬс саассЬЬдсс 180
ЬсаддадЬсс садасаддЬЬ садЬддсадЬ дддЬсаддаа сЬдсЬЬЬсас асЬдадааЬс 240
адЬададЬдд аддсЬдадда ЬдЬдддЬдЬЬ ЬаЬЬасЬдЬа ЬдсааЬаЬсЬ адааЬаЬссд 300
сЬсасдЬЬсд дЬдсЬдддас саадсЬддад сЬдааа 336
<210> 33 <211> 354 <212> ДНК <213> Миз тизси1из
<400> 33 даадЬдаадс ЬддЬддадЬс Ьдддддадас ЬЬадЬдаадс сЬддадддЬс ссЬдааасЬс 60
ЬссЬдЬдсад ссЬсЬддаЬЬ сасЬЬЬсадЬ адсЬаЬдсса ЬдЬсЬЬдддЬ ЬсдссадааЬ 120
ссададаада ддсЬддадЬд ддЬсдсаЬсс аЬЬадЬаадд дЬддЬаасас сЬасЬаЬсса 180
аасадсдЬда адддссдаЬЬ сассаЬсЬсс ададаЬааЬд ссаддаасаЬ ссЬдЬассЬд 240
саааЬдадса дЬсЬдаддЬс Ьдаддасасд дсссЬЬЬаЬЬ асЬдЬдсаад аддсЬддддЬ 300
даЬЬасдддЬ ддЬЬЬдсЬЬа сЬддддссаа дЬдасЬсЬдд ЬсасЬдЬсЬс Ьдса 354
<210> 34 <211> 321 <212> ДНК <213> Миз тизси1из
<400> 34 дасаЬсаада ЬдасссадЬс ЬссаЬсЬЬсс аЬдЬаЬдсаЬ сЬсЬаддада дададЬсасЬ 60
аЬсасЬЬдса аддсдадЬса ддасаЬЬааЬ аддЬаЬЬЬаа асЬддЬЬсса дсадааасса 120
дддаааЬсЬс сЬаадасссЬ даЬсЬаЬсдЬ дсааасадаЬ ЬдсЬадаЬдд ддЬсссаЬса 180
- 30 027975
аддЕЕсадЕд дсадЕддаЕс ЕдддсаадаЕ ЕасЕсЕсЕса ссаЕсадсад ссЕддаЕЕаЕ 240
даадаЕаЕдд дааЕЕЕаЕЕа ЕЕдЕсЕасад ЕаЕдаЕдадЕ ЕЕссдсЕсас дЕЕсддЕдаЕ 300
дддассаадс ЕддадсЕдаа а 321
<210> 35 <211> 119 <212> Белок <213> Миз тизси1из <400> 35
О1п Уа1 1 О1п Ьеи О1п 5 О1п Бег О1у ТЬг О1и 10 Ьеи МеЕ Ьуз Рго О1у 15 А1а
Бег Уа1 Ьуз 11е Бег Суз Ьуз А1а ТЬг О1у Туг ТЬг РЬе Бег Бег Бег
20 25 30
Тгр МеЕ О1у Тгр Уа1 Ьуз О1п Агд Рго О1у Н1з О1у Ьеи О1и Тгр 11е
35 40 45
О1у Азр 11е Ьеи Рго О1у Бег О1у О1у ТЬг Азп Туг Азп О1и Агд РЬе
50 55 60
Ьуз О1у Ьуз А1а Бег РЬе ТЬг А1а О1и ТЬг Бег Бег Азп ТЬг А1а Туг
65 70 75 80
МеЕ О1п Ьеи Бег Бег Ьеи ТЬг Бег О1и Азр Бег А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
Уа1 Агд Бег Туг Туг Азр Туг Азр Агд РЬе А1а Азп Тгр О1у О1п О1у
100 105 110
ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Бег А1а
115
<210> 36
<211> 112
<212> Белок
<213> Миз тизси1из
<400> 36
Азр 11е Уа1 МеЕ ТЬг О1п А1а А1а Рго Бег Уа1 Рго Уа1 ТЬг Рго О1у
1 5 10 15
О1и Бег Уа1 Бег 11е Бег Суз Агд Бег Бег О1и Бег Ьеи Ьеи Нтз Бег
20 25 30
Азп О1у Азп ТЬг Туг Ьеи Туг Тгр РЬе Ьеи О1п Агд Рго О1у О1п Бег
- 31 027975
Рго О1п 50 Ьеи Ьеи 11е Туг Агд 55 МеЬ Бег Азп Ьеи А1а 60 Бег О1у Уа1 Рго
Азр 65 Агд РЬе Бег О1у Бег 70 О1у Бег О1у ТЬг А1а 75 РЬе ТЬг Ьеи Агд 11е 80
Бег Агд Уа1 О1и А1а 85 О1и Азр Уа1 О1у Уа1 90 Туг Туг Суз МеЬ О1п 95 Туг
Ьеи О1и Туг Рго Ьеи ТЬг РЬе О1у А1а О1у ТЬг Ьуз Ьеи О1и Ьеи Ьуз
100 105 110 <210> 37 <211> 118 <212> Белок <213> Миз тизси1из
<400> 37
О1и Уа1 Ьуз Ьеи Уа1 О1и Бег О1у О1у Азр Ьеи Уа1 Ьуз Рго О1у О1у
1 5 10 15
Бег Ьеи Ьуз Ьеи Бег Суз А1а А1а Бег О1у РЬе ТЬг РЬе Бег Бег Туг
20 25 30
А1а МеЬ Бег Тгр Уа1 Агд О1п Азп Рго О1и Ьуз Агд Ьеи О1и Тгр Уа1
35 40 45
А1а Бег 11е Бег Ьуз О1у О1у Азп ТЬг Туг Туг Рго Азп Бег Уа1 Ьуз
50 55 60
О1у Агд РЬе ТЬг 11е Бег Агд Азр Азп А1а Агд Азп 11е Ьеи Туг Ьеи
65 70 75 80
О1п МеЬ Бег Бег Ьеи Агд Бег О1и Азр ТЬг А1а Ьеи Туг Туг Суз А1а
85 90 95
Агд О1у Тгр О1у Азр Туг О1у Тгр РЬе А1а Туг Тгр О1у О1п Уа1 ТЬг
100 105 110
Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Бег А1а
<210> 38 <211> 107 <212> Белок <213> Миз тизси1из
115
- 32 027975 <400> 38
Азр 1 11е Ьуз МеЬ ТЬг 5 О1п Зег Рго Зег Зег 10 МеЬ Туг А1а Зег Ьеи 15 О1у
О1и Агд Уа1 ТЬг 11е ТЬг Суз Ьуз А1а Зег О1п Азр 11е Азп Агд Туг
20 25 30
Ьеи Азп Тгр РЬе О1п О1п Ьуз Рго О1у Ьуз Зег Рго Ьуз ТЬг Ьеи 11е
35 40 45
Туг Агд А1а Азп Агд Ьеи Ьеи Азр О1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег О1у
50 55 60
Зег О1у Зег О1у О1п Азр Туг Зег Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи Азр Туг
65 70 75 80
О1и Азр МеЬ О1у 11е Туг Туг Суз Ьеи О1п Туг Азр О1и РЬе Рго Ьеи
85 90 95
ТЬг РЬе О1у Азр О1у ТЬг Ьуз Ьеи О1и Ьеи Ьуз
100 105
<210> 39 <211> 18 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> фосфорилированного тау-пептида, соответствующая остаткам 194-211 контрольного тау-белка <220>
<221> Фосфорилирование <222> (9)..(9) <220>
<221> Фосфорилирование <222> (12)..(12) <400> 39
Агд Зег О1у Туг Зег Зег Рго О1у Зег Рго О1у ТЬг Рго О1у Зег Агд

Claims (16)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Выделенное антитело, которое связывает парный спиральный филамент-тау (ПСФ-тау), содержащее определяющий комплементарность участок тяжелой цепи ΗΟΌΚ1, определяющий комплементарность участок тяжелой цепи ΗΟΌΚ2 и определяющий комплементарность участок тяжелой цепи 11С1Ж3 вариабельного домена тяжелой цепи УН с δЕ^ ΙΌ ΝΟ: 37 и определяющий комплементарность участок легкой цепи ЕСОК1, определяющий комплементарность участок легкой цепи ΕΟΌΚ2 и определяющий комплементарность участок легкой цепи ΕΟΌΚ3 вариабельного домена легкой цепи Уь с δЕ^ ΙΌ ΝΟ: 38.
  2. 2. Выделенное антитело по п.1, в котором ΗΟΌΚ1, ΗΟΌΚ2 и 11С1Ж3 содержат аминокислотные последовательности δЕ^ ΙΌ ΝΟ: 13, 14 и 15, обозначенные согласно КаЪа1, соответственно, и ЕСОК1, ΕΟΌΚ2 и ΕΟΌΚ3 содержат аминокислотные последовательности δЕ^ ΙΌ ΝΟ: 16, 17 и 18, обозначенные согласно КаЪа!, соответственно.
  3. 3. Выделенное антитело по п.2, содержащее νΗ с δЕ^ ΙΌ ΝΟ: 37 и Уь с δЕ^ ΙΌ ΝΟ: 38.
  4. 4. Выделенное антитело по п.1, в котором ΗΟΌΚ1, ΗΟΌΚ2 и 11С1Ж3 содержат аминокислотные последовательности δЕ^ ΙΌ ΝΟ: 25, 26 и 27, обозначенные согласно СЕо1Ыа, соответственно, и ЕСОК1, ΕΟΌΚ2 и 1.С1Ж3 содержат аминокислотные последовательности δЕ^ ΙΌ ΝΟ: 28, 29 и 30, обозначенные согласно СЕо1Ыа, соответственно.
  5. 5. Выделенное антитело по п.4, содержащее νΗ с δЕ^ ΙΌ ΝΟ: 37 и с δЕ^ ΙΌ ΝΟ: 38.
  6. 6. Выделенное антитело по п.2 или 4, отличающееся тем, что антитело представляет собой антитело изотипа ^01.
  7. 7. Выделенное антитело по п.2 или 4, отличающееся тем, что антитело представляет собой антитело изотипа ^02.
  8. 8. Выделенное антитело по п.2 или 4, отличающееся тем, что антитело представляет собой антитело изотипа ^04.
  9. 9. Выделенное антитело по пп.1, 2 или 4, отличающееся тем, что антитело является гуманизированным.
  10. 10. Выделенный полинуклеотид, кодирующий νΗ антитела по пп.1, 2 или 4.
  11. 11. Выделенный полинуклеотид, кодирующий антитела по пп.1, 2 или 4.
  12. 12. Вектор, содержащий полинуклеотид по п.10.
  13. 13. Вектор, содержащий полинуклеотид по п.11.
  14. 14. Клетка-хозяин для экспрессии антитела по п.1, содержащая вектор по п.12 и вектор по п.13.
  15. 15. Способ получения антитела, которое связывает ПСФ-тау, включающий культивирование клетки-хозяина по п.14 и выделение антитела, продуцируемого клеткой-хозяином.
  16. 16. Фармацевтическая композиция для уменьшения агрегации тау в парных спиральных филаментах (ПСФ-тау), содержащая антитело по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель.
EA201491224A 2011-12-20 2012-12-19 Анти-псф-тау-антитела и их применение EA027975B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161577817P 2011-12-20 2011-12-20
PCT/US2012/070486 WO2013096380A2 (en) 2011-12-20 2012-12-19 Anti-phf-tau antibodies and their uses

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201491224A1 EA201491224A1 (ru) 2014-11-28
EA027975B1 true EA027975B1 (ru) 2017-09-29

Family

ID=48669693

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201491224A EA027975B1 (ru) 2011-12-20 2012-12-19 Анти-псф-тау-антитела и их применение

Country Status (34)

Country Link
US (4) US9371376B2 (ru)
EP (2) EP2794654B1 (ru)
JP (4) JP6306513B2 (ru)
KR (1) KR101991681B1 (ru)
CN (2) CN104024274B (ru)
AU (2) AU2012359039B2 (ru)
BR (1) BR112014015323B1 (ru)
CA (2) CA3234629A1 (ru)
CO (1) CO6980627A2 (ru)
CY (1) CY1121862T1 (ru)
DK (1) DK2794654T3 (ru)
EA (1) EA027975B1 (ru)
EC (1) ECSP14005975A (ru)
ES (1) ES2738007T3 (ru)
GT (1) GT201400127A (ru)
HK (2) HK1203520A1 (ru)
HR (1) HRP20191342T1 (ru)
HU (1) HUE045656T2 (ru)
IL (3) IL233051B (ru)
LT (1) LT2794654T (ru)
MX (1) MX350311B (ru)
MY (2) MY186066A (ru)
NI (1) NI201400061A (ru)
NZ (1) NZ626269A (ru)
PH (1) PH12014501427A1 (ru)
PL (1) PL2794654T3 (ru)
PT (1) PT2794654T (ru)
RS (1) RS59024B1 (ru)
SG (1) SG11201403106SA (ru)
SI (1) SI2794654T1 (ru)
TR (1) TR201910720T4 (ru)
UA (1) UA114902C2 (ru)
WO (1) WO2013096380A2 (ru)
ZA (1) ZA201405317B (ru)

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MY186066A (en) * 2011-12-20 2021-06-18 Janssen Biotech Inc Anti-phf-tau antibodies and their uses
RU2018132044A (ru) 2012-07-03 2018-10-19 Вашингтон Юниверсити Антитела против тау
BR112015003326A2 (pt) 2012-08-16 2017-07-04 Ipierian Inc métodos de tratamento de uma tauopatia
US8980270B2 (en) 2013-01-18 2015-03-17 Ipierian, Inc. Methods of treating a tauopathy
JP2017512751A (ja) 2014-02-14 2017-05-25 アイピエリアン，インコーポレイティド タウペプチド、抗タウ抗体、およびそれらの使用方法
EP3486256A3 (en) * 2014-06-26 2019-08-28 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Antibodies and antigen-binding fragments that specifically bind to microtubule-associated protein tau
ZA201608812B (en) * 2014-06-26 2019-08-28 Janssen Vaccines & Prevention Bv Antibodies and antigen-binding fragments that specifically bind to microtubule-associated protein tau
TWI734975B (zh) 2014-06-27 2021-08-01 美商Ｃ２Ｎ醫療診斷有限責任公司 人類化抗-tau抗體
WO2016112078A2 (en) * 2015-01-08 2016-07-14 Janssen Biotech, Inc. Anti-phf-tau antibodies and their uses
TWI669314B (zh) 2015-02-26 2019-08-21 美國禮來大藥廠 針對ｔａｕ之抗體及其用途
TWI790642B (zh) 2015-06-05 2023-01-21 美商建南德克公司 抗-tau抗體及使用方法
CN107849105B (zh) * 2015-07-06 2021-09-17 Ucb生物制药有限责任公司 Tau结合抗体
NZ738058A (en) * 2015-07-06 2021-07-30 UCB Biopharma SRL Tau-binding antibodies
US20190224339A1 (en) * 2016-04-29 2019-07-25 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
EP3496750A2 (en) 2016-08-09 2019-06-19 Eli Lilly and Company Combination therapy
CN110248959B (zh) 2016-12-07 2023-06-30 基因泰克公司 抗tau抗体和使用方法
KR20230146126A (ko) * 2016-12-07 2023-10-18 제넨테크, 인크. 항-타우 항체 및 이의 이용 방법
CN110520440A (zh) 2017-02-17 2019-11-29 戴纳立制药公司 抗τ抗体及其使用方法
JOP20180014A1 (ar) 2017-02-27 2019-01-30 Teijin Pharma Ltd جسم مضاد متوافق مع البشر لعلاج أو الوقاية من الاضطرابات الإدراكية، وعملية لإنتاجه، وعامل لعلاج أو الوقاية من الاضطرابات الإدراكية باستخدامه
JOP20180021A1 (ar) * 2017-03-16 2019-01-30 Janssen Biotech Inc الأجسام المضادة لتكتلات خيوط بروتين تاو (tau) الحلزونية المزدوجة واستخداماتها
TW202340244A (zh) 2017-10-16 2023-10-16 日商衛材R&D企管股份有限公司 抗tau抗體及其用途
WO2019171258A1 (en) * 2018-03-05 2019-09-12 Janssen Pharmaceutica Nv Assays to detect neurodegeneration
JOP20200215A1 (ar) * 2018-03-05 2020-09-03 Janssen Pharmaceutica Nv الأجسام المضادة لـ PHF-Tau المضاد واستخداماتها
KR20200144551A (ko) * 2018-03-28 2020-12-29 악손 뉴로사이언스 에스이 알츠하이머병을 검출하고 치료하는 항체-기반 방법
CA3107788A1 (en) 2018-07-31 2020-02-06 Eli Lilly And Company Combination of anti-tau antibody and oga inhibitor for treatment of diseases characterized by aberrant tau aggregation
BR112022020753A2 (pt) 2020-04-15 2022-12-20 Voyager Therapeutics Inc Compostos de ligação a tau
AU2021297873A1 (en) 2020-06-25 2023-02-09 Merck Sharp & Dohme Llc High affinity antibodies targeting tau phosphorylated at serine 413
WO2022132923A1 (en) 2020-12-16 2022-06-23 Voyager Therapeutics, Inc. Tau binding compounds
CA3214310A1 (en) * 2021-03-26 2022-09-29 Rupesh Nanjunda Anti-tau antibodies and uses thereof
BR112023019205A2 (pt) * 2021-03-26 2023-10-24 Janssen Biotech Inc Anticorpos humanizados contra tau de filamento helicoidal pareado e usos dos mesmos
WO2023250388A1 (en) 2022-06-22 2023-12-28 Voyager Therapeutics, Inc. Tau binding compounds
WO2024059739A1 (en) 2022-09-15 2024-03-21 Voyager Therapeutics, Inc. Tau binding compounds

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070048785A1 (en) * 2004-06-09 2007-03-01 Lin Laura L Anti-IL-13 antibodies and complexes
WO2009017161A1 (ja) * 2007-07-30 2009-02-05 Medical And Biological Laboratories Co., Ltd. 炎症性サイトカインの抑制剤
US20090142261A1 (en) * 2006-08-04 2009-06-04 Novartis Ag EPHB3-Specific Antibody and Uses Thereof
US20090169547A1 (en) * 2005-11-24 2009-07-02 Ugur Sahin Monoclonal antibodies against claudin-18 for treatment of cancer
US20110059093A1 (en) * 2009-06-10 2011-03-10 Bernd Bohrmann Use of an anti-tau ps422 antibody for the treatment of brain diseases
US20110077224A1 (en) * 2009-09-29 2011-03-31 Nihar Pandey Linoleic phospholipids and uses thereof for inhibiting inflammatory and neurodegenerative processes
US20110118299A1 (en) * 2009-05-15 2011-05-19 The University Of Kentucky Research Foundation Treatment of mci and alzheimer's disease
US20110143443A9 (en) * 1991-10-25 2011-06-16 N.V. Innogenetics S. A. Isolsted Monoclonal - Associated Protein Tau and Kit
US20120087861A1 (en) * 2010-10-11 2012-04-12 Roger Nitsch Human Anti-Tau Antibodies
US20120276009A1 (en) * 2010-10-07 2012-11-01 Katholieke Universiteit Leuven Pharmaceutical composition

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
EP0737208B1 (en) * 1993-12-21 2006-08-02 Innogenetics N.V. Monoclonal antibodies specific for phf-tau, hybridomas secreting them, antigen recognition by these antibodies and their applications
JPH10506381A (ja) * 1994-07-29 1998-06-23 イノジェネティックス・ナムローゼ・フェンノートシャップ 特定のサブクラスまたは形態のホスホリレーションされたｔａｕのエピトープに特異的なモノクローナル抗体、それらを分泌するハイブリドーマ、これらの抗体の抗原認識およびそれらの応用
WO2004006955A1 (en) 2001-07-12 2004-01-22 Jefferson Foote Super humanized antibodies
EP1697741A4 (en) 2003-12-04 2008-02-13 Xencor Inc PROCESS FOR PRODUCING PROTEIN VARIANTS WITH INCREASED HOST STRUCTURE CONTENT AND COMPOSITIONS THEREOF
US20070280935A1 (en) * 2006-04-07 2007-12-06 Bernd Bohrmann Antibody that recognizes phosphorylated peptides
US20100261620A1 (en) 2008-10-14 2010-10-14 Juan Carlos Almagro Methods of Humanizing and Affinity-Maturing Antibodies
CA2765099A1 (en) * 2009-06-10 2010-12-16 New York University Phosphorylated tau peptide for use in the treatment of tauopathy
WO2011047146A2 (en) 2009-10-14 2011-04-21 Centocor Ortho Biotech Inc. Methods of affinity maturing antibodies
MY186066A (en) * 2011-12-20 2021-06-18 Janssen Biotech Inc Anti-phf-tau antibodies and their uses

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110143443A9 (en) * 1991-10-25 2011-06-16 N.V. Innogenetics S. A. Isolsted Monoclonal - Associated Protein Tau and Kit
US20070048785A1 (en) * 2004-06-09 2007-03-01 Lin Laura L Anti-IL-13 antibodies and complexes
US20090169547A1 (en) * 2005-11-24 2009-07-02 Ugur Sahin Monoclonal antibodies against claudin-18 for treatment of cancer
US20090142261A1 (en) * 2006-08-04 2009-06-04 Novartis Ag EPHB3-Specific Antibody and Uses Thereof
WO2009017161A1 (ja) * 2007-07-30 2009-02-05 Medical And Biological Laboratories Co., Ltd. 炎症性サイトカインの抑制剤
US20110118299A1 (en) * 2009-05-15 2011-05-19 The University Of Kentucky Research Foundation Treatment of mci and alzheimer's disease
US20110059093A1 (en) * 2009-06-10 2011-03-10 Bernd Bohrmann Use of an anti-tau ps422 antibody for the treatment of brain diseases
US20110077224A1 (en) * 2009-09-29 2011-03-31 Nihar Pandey Linoleic phospholipids and uses thereof for inhibiting inflammatory and neurodegenerative processes
US20120276009A1 (en) * 2010-10-07 2012-11-01 Katholieke Universiteit Leuven Pharmaceutical composition
US20120087861A1 (en) * 2010-10-11 2012-04-12 Roger Nitsch Human Anti-Tau Antibodies

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Mercken, et al., Monoclonal antibodies with selective specificity for Alzheimer Tau are directed against phosphatase-sensitive epitopes. Acta Neuropathol. 1992, 84(3):265-272, entire document *

Also Published As

Publication number Publication date
CY1121862T1 (el) 2020-07-31
PL2794654T3 (pl) 2019-11-29
US20150307600A1 (en) 2015-10-29
CN107226863B (zh) 2021-06-01
CN104024274B (zh) 2017-07-18
IL233051A0 (en) 2014-07-31
US9745371B2 (en) 2017-08-29
AU2012359039A1 (en) 2014-07-03
GT201400127A (es) 2015-03-23
EA201491224A1 (ru) 2014-11-28
MY186066A (en) 2021-06-18
DK2794654T3 (da) 2019-08-05
JP6695317B2 (ja) 2020-05-20
CO6980627A2 (es) 2014-06-27
BR112014015323B1 (pt) 2022-09-27
MX2014007476A (es) 2014-07-28
WO2013096380A2 (en) 2013-06-27
IL233051B (en) 2019-02-28
EP2794654B1 (en) 2019-05-22
HUE045656T2 (hu) 2020-01-28
JP2019176866A (ja) 2019-10-17
CA3234629A1 (en) 2013-06-27
MX350311B (es) 2017-09-01
KR101991681B1 (ko) 2019-06-21
AU2017264975A1 (en) 2017-12-21
SI2794654T1 (sl) 2019-08-30
LT2794654T (lt) 2019-11-11
EP2794654A2 (en) 2014-10-29
NZ626269A (en) 2016-06-24
BR112014015323A2 (pt) 2020-10-27
PH12014501427B1 (en) 2014-09-22
ZA201405317B (en) 2016-05-25
SG11201403106SA (en) 2014-12-30
WO2013096380A3 (en) 2013-08-22
MY178142A (en) 2020-10-05
UA114902C2 (uk) 2017-08-28
JP6987809B2 (ja) 2022-01-05
US10196440B2 (en) 2019-02-05
US10000559B2 (en) 2018-06-19
AU2017264975B2 (en) 2019-09-12
AU2012359039B2 (en) 2017-08-24
KR20140107493A (ko) 2014-09-04
CN104024274A (zh) 2014-09-03
IL281250A (en) 2021-04-29
US20170355758A1 (en) 2017-12-14
EP2794654A4 (en) 2015-09-30
TR201910720T4 (tr) 2019-08-21
EP3578567A1 (en) 2019-12-11
CN107226863A (zh) 2017-10-03
RS59024B1 (sr) 2019-08-30
PH12014501427A1 (en) 2014-09-22
JP2018078897A (ja) 2018-05-24
CA2859665A1 (en) 2013-06-27
NZ720141A (en) 2017-09-29
US20160304593A1 (en) 2016-10-20
ES2738007T3 (es) 2020-01-17
IL263021A (en) 2018-12-31
HRP20191342T1 (hr) 2019-11-01
NI201400061A (es) 2016-12-02
US20180305445A1 (en) 2018-10-25
HK1203520A1 (en) 2015-10-30
US9371376B2 (en) 2016-06-21
JP2020105179A (ja) 2020-07-09
JP2015500879A (ja) 2015-01-08
HK1244490A1 (zh) 2018-08-10
IL263021B (en) 2021-03-25
PT2794654T (pt) 2019-09-10
JP6987904B2 (ja) 2022-01-05
JP6306513B2 (ja) 2018-04-04
ECSP14005975A (es) 2015-07-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA027975B1 (ru) Анти-псф-тау-антитела и их применение
JP6300842B2 (ja) ヒト抗タウ抗体
RU2555526C2 (ru) Антитела, связывающиеся с протофибриллами, и их применение в методах терапии и диагностики болезни паркинсона, деменции, ассоциированной с образованием диффузных телец леви, и других альфа-синуклеинопатий
JP6494565B2 (ja) オリゴマー特異アミロイドベータエピトープおよび抗体
TW201900682A (zh) 抗ｐｈｆ－ｔａｕ抗體及其用途
JP7017013B2 (ja) 抗トランスサイレチン抗体
CN110248959A (zh) 抗tau抗体和使用方法
EA017611B1 (ru) Способ получения связывающей молекулы, специфичной к белку, ассоциированному с расстройством, или антитела или его связывающего фрагмента или по меньшей мере одной цепи иммуноглобулина, связывающих вышеуказанный белок (варианты), связывающая молекула, антитело, цепь иммуноглобулина или их связывающий фрагмент (варианты), антиген, полинуклеотид, вектор и клетка-хозяин, их включающие композиция и набор и способ диагностики или лечения неврологических расстройств посредством
JP2018139530A (ja) 認知症治療又は予防のためのヒト化抗体及びその製造方法、並びにそれを用いた認知症治療剤又は予防剤
JP2024512589A (ja) 抗タウ抗体及びその使用
JP2018508193A (ja) メディンを認識する抗体
BR122021014868B1 (pt) Anticorpos anti-phf-tau, polinucleotídeo isolado que codifica uma vh ou vl de anticorpo, vetor e método de produção de um anticorpo
NZ720141B2 (en) Anti-phf-tau antibodies and their uses

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ KG TJ TM