CN104024274B - 抗PHF‑tau抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抗PHF‑tau抗体及其制备和使用方法。

Description

抗PHF-tau抗体及其用途
本专利申请要求于2011年12月20日提交的美国临时申请号61/577,817的权益，所述美国临时申请的全部内容以引用方式并入本文。
技术领域
本发明涉及抗PHF-tau抗体及其制备和使用方法。
背景技术
阿尔茨海默氏病(AD)是退行性脑病症，其特征在于渐进性的记忆、认知、推理、判断和情感稳定性的丧失，所述丧失逐渐导致极度精神衰退和最终的死亡。AD是老年人中进行性精神障碍(痴呆)的非常常见的病因，并且被认为是美国第四大最常见的医学死因。AD已在全世界的种族群体中观察到，并且代表目前和未来的主要公共健康问题。
患有AD的个体的脑显示出称作老年(或淀粉样蛋白)斑、淀粉样蛋白血管病(淀粉样蛋白在血管中沉积)和神经原纤维缠结的特征性病变。一般在具有AD的患者中对于记忆和认知功能重要的人脑几个区域中发现大量这些病变，特别是淀粉样斑块和成对螺旋细丝的神经原纤维缠结。
AD及其他几种神经退化性疾病中的神经原纤维变性的主要蛋白质组分是高度磷酸化形式的微管相关蛋白tau。开发预防或清除tau聚集的治疗剂一直关注多年，但候选药物包括抗聚集化合物和激酶抑制剂只是刚刚进入临床测试(Brunden等人Nat Rev DrugDiscov8：783-93，2009)。
近来，在转基因tau小鼠模型中已产生tau的主动和被动免疫接种可具有治疗潜力的临床前证据(Chai等人J Biol Chem 286：34457-67，2011，Boutajangout等人JNeurochem 118：658-67，2011，Boutajangout等人J Neurosci 30：16559-66，2010，Asuni等人J Neurosci 27：9115-29，2007)。tau蛋白病变(tauopathy)传播和蔓延假设近来已得到描述，并且基于人脑中的tau蛋白病变进展的Braak阶段和在临床前tau模型中的tau聚集体注射 后的tau蛋白病变蔓延(Frost等人J Biol Chem 284：12845-52，2009，Clavaguera等人Nat Cell Biol 11：909-13，2009)。因此，存在预防tau聚集和tau蛋白病变进展以治疗AD及其他神经退化性疾病的治疗剂的需要。
附图说明
图1显示了多种抗tau抗体对标记AT8的竞争。
图2显示了多种抗tau抗体对标记PT1的竞争。
图3显示了多种抗tau抗体对标记PT3的竞争。
图4显示了多种抗tau抗体对标记AT100的竞争。
图5显示了多种抗tau抗体对标记HT7的竞争。
图6(A)如该图中所示，用盐水、小鼠IgG1、PT3或AT8处理的5月龄雌性P301L转基因动物，或来自未经处理的非转基因动物(B6)的脑干匀浆物(级分P1)中的磷酸化tau的分析。使用AT8(左图)或AT100(右图)作为捕获抗体，随后为生物素化的HT7和抗生物素蛋白-HRP来完成ELISA。ELISA信号标绘为AD脑匀浆物的相对量(ng/ml)，所述AD脑匀浆物提供与来自非转基因动物(B6)的平均样品相同的ELISA信号。数据连同平均值+/-S.D一起个别进行标绘。指示了PT3和IgG1处理的动物之间的差异的p值。(B)使用AT100来自IgG1或PT3处理的动物的脑干匀浆物级分P1的蛋白质印迹。显示了来自用IgG1(IgG1-1至IgG1-10)处理的10只动物和用PT3(PT3-1、PT3-2、PT3-7至PT3-10)处理的7只动物的匀浆物的信号。肌动蛋白用作装载对照。
图7如该图中所示，源自用PT3或同种型对照(IgG)处理的5月龄雌性P301L转基因动物的十二烷基肌氨酸钠可溶性(pT4可溶性)皮质匀浆物中的总tau水平，十二烷基肌氨酸钠不溶性(pT4不溶性)皮质匀浆物中的总tau水平，和十二烷基肌氨酸钠不溶性(AT8不溶性)皮质匀浆物中的磷酸化tau水平。水平显示为连同平均值+/-SD一起个别标绘的来自ELISA的信号测量。样品1m inj是源自用tau聚集体注射的P301L小鼠脑的阳性对照样品。
发明内容
本发明的一个方面是结合PHF-tau的分离的抗体，所述分离的抗体包含SEQ IDNO：35或37的重链可变区(VH)的抗原结合位点和SEQ ID NO：36或38的轻链可变区(VL)的抗原结合位点。
本发明的另一个方面是结合PHF-tau的分离的抗体，所述分离的抗体包含某些重链和轻链互补决定区。
本发明的另一个方面是结合PHF-tau的分离的抗体，所述分离的抗体包含SEQ IDNO：35的VH的抗原结合位点和SEQ ID NO：36的VL的抗原结合位点。
本发明的另一个方面是结合PHF-tau的分离的抗体，所述分离的抗体包含SEQ IDNO：37的VH的抗原结合位点和SEQ ID NO：38的VL的抗原结合位点。
本发明的另一个方面是和单克隆抗体竞争与PHF-tau进行结合的分离的抗体或片段，所述单克隆抗体包含SEQ ID NO：35的VH的抗原结合位点和SEQ ID NO：36的VL的抗原结合位点，或SEQ ID NO：37的VH的抗原结合位点和SEQ ID NO：38的VL的抗原结合位点。
本发明的另一个方面是编码本发明的抗体或其片段的多核苷酸。
本发明的另一个方面是包含本发明的多核苷酸的载体。
本发明的另一个方面是包含本发明的载体的宿主细胞。
本发明的另一个方面是制备结合PHF-tau的抗体的方法，所述方法包括培养本发明的宿主细胞，以及回收由所述宿主细胞产生的抗体。
具体实施方式
如本文所用，术语“抗体”广义地意指并且包括免疫球蛋白或抗体分子(包括多克隆抗体)、单克隆抗体(包括小鼠、人、人适应的(human-adapted)、人源化和嵌合单克隆抗体和抗体片段)。
一般来讲，抗体是蛋白质或肽链，其对于特定抗原表现出结合特异性。抗体结构是众所周知的。免疫球蛋白可根据重链恒定域氨基酸序列被指定为五种主要种类，即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。IgA和IgG还再分类为同种型IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。任何脊椎动物物种 的抗体轻链可基于其恒定结构域的氨基酸序列被指定至两种明显不同类型之一，即κ(κ)和λ(λ)。
术语“抗体片段”意指完整抗体的一部分。抗体片段的例子包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段、CDR、抗原结合位点、重或轻链可变区、双抗体、单链抗体分子和由至少两种完整抗体或其片段形成的多特异性抗体。
免疫球蛋白轻或重链可变区由被“抗原结合位点”间断的“构架”区组成。抗原结合位点使用如下的多种术语进行限定：(i)互补决定区(CDR)基于序列可变性(Wu和Kabat JExp Med 132：211-50，1970)。一般地，抗原结合位点具有在每个可变区中的三个CDR(重链可变区(VH)中的HCDR1、HCDR2和HCDR3以及轻链可变区(VL)中的LCDR1、LCDR2和LCDR3)(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，PublicHealth Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.，1991)。(ii)术语“高变区”、“HVR”或“HV”指如Chothia和Lesk限定的(Chothia和Lesk J Mol Biol 196：901-17，1987)，在结构中高变的抗体可变结构域的区域。一般地，抗原结合位点具有在每个VH(H1、H2、H3)和VL(L1、L2、L3)中的三个高变区。Chothia和Lesk将结构上保守的HV称为“规范结构”。CDR和HV的编号系统以及注释近来已由Abhinandan和Martin(Abhinandan和MartinMol Immunol 45：3832-9，2008)修订。(iii)形成抗原结合位点的区域的另一个定义已基于来自免疫球蛋白和T细胞受体的V结构域的比较，由Lefranc(Lefranc等人Dev CompImmunol 27：55-77，2003)提出。International ImMunoGeneTics(IMGT)数据库(http:_//www_imgt_org)提供了这些区域的标准化编号和定义。CDR、HV和IMGT划分(delineation)之间的对应性在Lefranc等人，出处同上中描述。(iv)抗原结合位点还可基于特异性决定残基使用(Specificity Determining Residue Usage)(SDRU)(Almagro J Mol Recognit 17：132-43，2004)进行划分，其中特异性决定残基(SDR)指直接涉及抗原接触的免疫球蛋白的氨基酸残基。
“构架”或“构架序列”是在抗体的可变区内除限定为抗原结合位点序列的那些外的剩余序列。因为抗原结合位点的确切定义可通过如上所述的多种划分来决定，所以确切的构架序列取决于抗原结合位点的定义。
如本文所用，术语“单克隆抗体”(mAb)是指获自基本上均质抗体的群体的抗体(或抗体片段)。单克隆抗体是高度特异性的，通常针对单一抗原决定簇。
如本文所用，术语“表位”是指抗体特异性结合的抗原部分。表位通常由部分(例如氨基酸、磷酸化氨基酸或多糖侧链)的化学活性(例如极性、非极性或疏水性)表面分组组成，并且可具有特定三维结构特征以及比电荷特征。表位在性质中可以是线性的或可以是不连续表位，例如构象表位，其通过抗原的非邻接氨基酸之间的空间关系而不是氨基酸的线性系列形成。构象表型包括通过抗原折叠而得的表位，其中来自所述抗原的线型序列的不同部分的氨基酸在3-维空间中靠近。
Tau是具有多重众所周知的同种型的丰富的中枢神经系统和外周神经系统蛋白质。在人CNS中，由于可变剪接，存在大小范围为352至441的六种主要tau同种型(Hanger等人Trends Mol Med 15：112-9，2009)。这些同种型通过0-2个N末端插入片段的调节包括和3或4个串联排列的微管结合重复序列而彼此不同，并且被称为0N3R(SEQ ID NO：1)、1N3R(SEQ ID NO：2)、2N3R(SEQ ID NO：3)、0N4R(SEQ ID NO：4)、1N4R(SEQ ID NO：5)和2N4R(SEQID NO：6)。如本文使用的术语“对照tau”指SEQ ID NO：6的tau同种型，其缺乏磷酸化及其他翻译后修饰。
Tau结合微管且调节货物(cargo)通过细胞的转运，所述转运是可通过tau磷酸化调节的过程。在AD和相关病症中，tau的异常磷酸化是普遍的，并且被认为领先于和/或触发tau聚集成称为成对螺旋细丝(PHF)的原纤维。PHF的主要组成成分是高度磷酸化的tau。如本文使用的术语“成对螺旋细丝-tau”或“PHF-tau”指众所周知的成对螺旋细丝中的tau聚集体。PHF结构中的两个主要区域在电子显微镜检查中是显而易见的：绒毛状外壳和核心细丝；绒毛状外壳对蛋白酶解是敏感的并位于细丝外部，而蛋白酶抗性的细丝核心构成PHF的主链(Wischik等人Proc Natl Acad Sci U S A85：4884-8，1988)。
如本文使用的“结合PHF-tau的抗体”指如在蛋白质印迹上评价的，结合PHF-tau的抗体。通常，抗体与PHF-tau的结合可在5％(w/v)脱脂奶粉(NFDM)TBS-T，0.05％Tween-20中的1小时封闭后，在约500ng PHF-tau的考马斯染色后进行评价。当在其中对照tau和PHF-tau两者均通 过tau抗体相等检测的抗原装载条件下进行测试时，如通过蛋白质印迹测量的，结合PHF-tau的抗体任选不结合对照tau(SEQ ID NO：6)，所述tau抗体对PHF-tau表位无优先(例如抗体HT7(ThermoScientific，Rockford，IL)(Mercken等人J Neurochem58：548-53，1992)。此类示例性抗原装载条件是500ng PHF-tau和200ng对照tau。
本文使用常规的众所周知的单字母和三字母氨基酸代码。
物质的组成
本发明涉及抗PHF-tau抗体和此类抗体的用途。此类PHF-tau抗体可具有结合PHF-tau上的磷酸化表位或结合PHF-tau上的非磷酸化表位的特性。抗PHF-tau抗体可用作治疗剂，以及用作研究或诊断试剂，以检测生物样品例如组织或细胞中的PHF-tau。
本发明的一个实施例是结合PHF-tau的分离的抗体，所述分离的抗体包含SEQ IDNO：35或37的重链可变区(VH)的抗原结合位点，或SEQ ID NO：36或38的轻链可变区(VL)的抗原结合位点。表1显示了根据Kabat或Chothia限定的本发明的示例性抗体以及示例性重和轻链可变区的抗原结合位点残基。
在另一个实施例中，本发明抗体的VH的抗原结合位点包含分别为SEQ ID NO：7、8和9或13、14和15的重链互补决定区(CDR)1(HCDR1)、2(HCDR2)和3(HCDR3)，或本发明抗体的VL的抗原结合位点包含分别为SEQ ID NO：10、11和12或16、17和18的轻链CDR1(LCDR1)、2(LCDR2)和3(LCDR3)。
本发明的另一个实施例是结合PHF-tau的分离的抗体，所述分离的抗体包含SEQID NO：35或37的重链可变区(VH)的抗原结合位点和SEQ ID NO：36或38的轻链可变区(VL)的抗原结合位点。
在另一个实施例中，本发明抗体的VH的抗原结合位点包含分别为SEQ ID NO：7、8和9或13、14和15的重链互补决定区(CDR)1(HCDR1)、2(HCDR2)和3(HCDR3)，并且本发明抗体的VL的抗原结合位点包含分别为SEQ ID NO：10、11和12或16、17和18的轻链CDR1(ICDR1)、2(ICDR2)和3(ICDR3)。
表1.
尽管“实例”中所示的实施例包括成对的可变区，一个来自重链并且一个来自轻链，但本领域技术人员将认识到其它实施例可包括单一重链可变区或单一轻链可变区。单一可变区可用于筛选能够形成能够例如结合PHF-tau的二结构域特异性抗原结合片段的可变结构域。所述筛选可通过噬菌体展示筛选方法来完成，其中使用例如在PCT公布WO92/01047中公开的分级双重组合方法。在此方法中，包含H或L链克隆的各个菌落用于感染编码另一条链(L或H)的克隆的完全文库，并且所得的双链特异性抗原结合结构域如所述的根据噬菌体展示技术加以选择。
本发明的另一个实施例是结合PHF-tau的分离的抗体，所述分离的抗体包含SEQID NO：35的重链可变区(VH)的抗原结合位点和SEQ ID NO：36的轻链可变区(VL)的抗原结合位点。
本发明的另一个实施例是结合PHF-tau的分离的抗体，所述分离的抗体包含SEQID NO：37的重链可变区(VH)的抗原结合位点和SEQ ID NO：38的轻链可变区(VL)的抗原结合位点。
本发明的另一个实施例是结合PHF-tau的分离的抗体，所述分离的抗体包含分别为SEQ ID NO：7、8和9的重链互补决定区(CDR)1(HCDR1)、2(HCDR2)和3(HCDR3)，并且包含分别为SEQ ID NO：10、11和12的轻链CDR1(LCDR1)、2(LCDR2)和3(LCDR3)。
本发明的另一个实施例是结合PHF-tau的分离的抗体，所述分离的抗体包含分别为SEQ ID NO：13、14和15的重链互补决定区(CDR)1(HCDR1)、2(HCDR2)和3(HCDR3)，并且包含分别为SEQ ID NO：16、17和18的轻链CDR1(LCDR1)、2(LCDR2)和3(ICDR3)。
在前述实施例的任一个中，结合PHF-tau的分离的抗体可以是人源化的。
本发明的抗体可通过多种技术进行生产，所述技术例如杂交瘤法(Kohler和Milstein Nature 256：495-7，1975)。可通过在美国专利4,816,567中公开的方法来制备嵌合mAb，所述嵌合mAb含有与源自受体抗体(通常为另一哺乳动物物种，例如人)的轻和重链恒定区结合的，源自供体抗体(通常为鼠)的轻链和重链可变区。。可通过本领域技术人员已知的技术例如美国专利5,225,539中公开的技术制备CDR移植的mAb，所述CDR移植的mAb具有源自非人供体免疫球蛋白(通常为鼠)的CDR，并且剩余的免疫球蛋白衍生的分子部分源自一种或多种人免疫球蛋白。可通过(Lonberg等人Nature 368：856-9，1994，Fishwild等人Nat Biotechnol14：845-51，1996，Mendez等人Nat Genet 15：146-56，1997)中提及的技术，由人免疫球蛋白转基因小鼠制备缺乏任何非人序列的mAb。人mAb还可由噬菌体展示文库进行制备且优化(Knappik等人J Mol Biol 296：57-86，2000，Krebs等人J Immunol Methods254：67-84，2001，Shi等人J Mol Biol 397：385-96，2010)。
抗体人源化可使用众所周知的方法来完成，所述方法例如特异性决定残基表面重建(SDRR)(美国公开2010/0261620)、表面重建(Padlan等人Mol.Immunol.28：489-98，1991)、超人源化(国际专利公开WO04/006955)和人串内容物优化(human string contentoptimization)(美国专利7,657,380)。可用于人移植/人源化的人构架序列可由本领域技术人员从有关数据库中选择。还可通过例如Queen等人(Queen等人Proc Natl Acad Sci US A 86：10029-33，1989)或美国公开2011/0092372中公开的技术修饰所选构架，以保存或增强结合亲合力。
用作免疫接种的抗原或从噬菌体展示文库中分离的抗体的PHF-tau的制备可使用任何合适技术来完成。在示例性方法中，使用众所周知的方案，例如Greenberg和Davies(Greenberg和Davies Proc Natl Acad Sci U S A87：5827-31，1990)中所述的方案，从患者脑中分离PHF-tau。PHF-tau可从阿尔茨海默氏病患者的死后皮质中分离。使用已知与PHF-tau反应的抗体，分离的PHF-tau就其纯度和高度磷酸化状态进行表征。在典型PHF-tau制备中，通过AT8抗体检测在蛋白质印迹中在约60、64、68和72kDa处 迁移的高度磷酸化条带(Spillantini和Goedert Trends Neurosci 21：428-33，1998)，所述AT8抗体特异性结合高度磷酸化的PHF-tau，但不结合去磷酸化的PHF-tau。
本发明的抗体可具有不结合SEQ ID NO：6的对照tau的特征。此类抗体可使用上文描述的方法生成，并且如上所述在蛋白质印迹中随后为考马斯染色，就其与对照tau结合的缺乏测试抗体。对照tau可使用标准方法重组表达且纯化。结合PHF-tau但不结合对照tau的示例性抗体是抗体PT1和PT3。本发明的抗体还可例如使用在对照和AD脑切片上的免疫组织化学就其特异性进行评估。
本发明的抗体可具有针对PHF-tau的亲和力，其结合常数(KD)小于或等于约10-7、10-8、10-9、10-10、10-11或10-12M。给定分子对于PHF-tau的亲和力可使用任何合适方法在实验上进行测定。此类方法可利用本领域技术人员已知的Biacore、ProteOn或KinExA仪器、ELISA或竞争结合测定。
本发明的另一个方面是和单克隆抗体竞争与PHF-tau进行结合的分离的抗体或片段，所述单克隆抗体包含SEQ ID NO：35的重链可变区(VH)的抗原结合位点和SEQ ID NO：36的轻链可变区(VL)的抗原结合位点，或SEQ ID NO：37的重链可变区(VH)的抗原结合位点和SEQ ID NO：38的轻链可变区(VL)的抗原结合位点。
可使用众所周知的方法在体外测定与PHF-tau结合之间的竞争。例如，在未标记抗体的存在下，MSD Sulfo-TagTM NHS酯标记的抗体与PHF-tau的结合可使用免疫测定随后为电化学发光检测进行评价。
除了竞争结合外的几种众所周知的方法可用于测定本发明的抗体的结合表位。例如，当两种各个组分的结构均已知时，可进行计算机芯片上的(in silico)蛋白质-蛋白质对接，以鉴定相互作用的相容位点。可使用所述抗原和抗体复合物进行氢-氘(H/D)交换以标测所述抗原上可能受到该抗体结合的区域。可使用所述抗原的片段和点诱变来定位对于抗体结合而言重要的氨基酸。使用抗体-抗原复合物的共晶体结构来鉴定对表位和互补位有贡献的残基。
本发明的抗体可以是IgG、IgD、IgA或IgM同种型的单克隆抗体。本发明的抗体可以是双特异性或多特异性的。示例性双特异性抗体可结合在PHF-tau上的两个不同表位，或可结合PHF-tau和β淀粉样蛋白(Aβ)。另 一种示例性双特异性抗体可结合PHF-tau和内源血脑屏障胞转作用受体，例如胰岛素受体、转移受体、胰岛素样生长因子-1受体和脂蛋白受体。示例性抗体具有IgG1类型。
本发明的抗体的免疫效应子特性可通过本领域技术人员已知的技术经由Fc修饰得到增强或沉默。例如，Fc效应子功能例如Clq结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、吞噬作用、细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)的下调等，可通过修饰Fc中负责这些活性的残基进行提供和/或得到控制。药代动力学特性还可通过使Fc结构域中的残基突变得到增强，所述突变延长抗体半衰期(Strohl Curr OpinBiotechnol 20：685-91，2009)。
另外，本发明的抗体可通过诸如糖基化、异构化、去糖基化或非天然存在的共价修饰(例如添加聚乙二醇部分(聚乙二醇化)和脂质化)等过程进行翻译后修饰。这种修饰可在体内或体外进行。例如，本发明的抗体可与聚乙二醇缀合(聚乙二醇化)以改善其药代动力学类型。缀合可通过本领域技术人员已知的技术来执行。治疗抗体与PEG的缀合已显示增强药效学，同时不干扰功能(Knight等人Platelets 15：409-18，2004，Leong等人Cytokine16：106-19，2001，Yang等人Protein Eng 16：761-70，2003)。
本发明的另一个实施例是编码本发明的抗体或其互补体、或其片段的分离的多核苷酸。示例性分离的多核苷酸是编码多肽的多核苷酸、和编码本发明的抗体可变区、具有SEQ ID NO：31-34中所示的序列的多核苷酸，所述多肽包含分别在SEQ ID NO：7、8和9或13、14和15中所示的免疫球蛋白重链CDR HCDR1、HCDR2和HCDR3，或包含分别在SEQ ID NO：10、11和12或16、17和18中所示的免疫球蛋白轻链CDR LCDR1、LCDR2和LCDR3。鉴于在给定表达系统中的遗传密码简并性或密码子优先性而编码本发明抗体的其他多核苷酸也在本发明的范围内。本发明的分离核酸可使用众所周知的重组技术或合成技术进行制备。使用本领域已知的方法，容易分离且测序编码单克隆抗体的DNA。在杂交瘤生成的情况下，此类细胞可用作此类DNA的来源。作为另外一种选择，使用其中编码序列和翻译产物相关联的展示技术，例如噬菌体或核糖体展示文库，简化了连接子和核酸的选择。噬菌体选择后，可分离来自噬菌体的抗体编码区，并用来产生完整抗体，包括人抗体或任何其他所需的抗原结合片段，并且表 达在任何所需的宿主内，所述宿主包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌。
本发明的另一个实施例是包含本发明的至少一种多核苷酸的载体。此类载体可以是质粒载体、病毒载体、基于转座子的载体或适合于通过任何方式将本发明的多核苷酸引入给定生物体或遗传背景的任何其他载体。
本发明的另一个实施例是包含本发明的多核苷酸中的任一种的宿主细胞。此类宿主细胞可以是真核细胞、细菌细胞、植物细胞或古菌细胞。示例性的真核细胞可以是哺乳动物、昆虫、禽类或其他动物来源。哺乳动物真核细胞包括无限增殖化细胞系，例如杂交瘤或骨髓瘤细胞系，例如SP2/0(美国典型培养物保藏中心(ATCC)，Manassas，VA，CRL-1581)、NS0(欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)，Salisbury，Wiltshire，UK，ECACC编号85110503)、FO(ATCC CRL-1646)和Ag653(ATCC CRL-1580)鼠细胞系。示例性人骨髓瘤细胞系是U266(ATTCCRL-TIB-196)。其他可用的细胞系包括源自中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的细胞系，例如CHO-K1SV(Lonza Biologics)、CHO-K1(ATCC CRL-61，Invitrogen)或DG44。
本发明的另一个实施例是制备结合PHF-tau的抗体的方法，所述方法包括培养本发明的宿主细胞，以及回收由所述宿主细胞产生的抗体。制造抗体并将其纯化的方法是本领域所熟知的。
治疗方法
本发明的抗PHF-tau抗体或其片段包括Fab、(Fab’)2、scFv片段，或包含本发明抗体的抗原结合位点的抗体，可用于治疗、减少或预防具有神经退化性疾病的患者中的症状，所述神经退化性疾病涉及脑内tau的病理性聚集，所述患者例如患有AD或任何其他tau蛋白病变的患者。尽管不希望受任何具体理论束缚，但本发明的抗体可通过减少脑中的病理性tau聚集且因此减少PHF-tau量而发挥其有利效应。本发明的方法可用于治疗属于任何类别的动物患者。此类动物的例子包括哺乳动物，诸如人、啮齿动物、犬类、猫类和农畜。例如，本发明的抗体可用于制备用于治疗AD的药剂，其中所述药剂制备用于以本文限定的剂量施用。
本发明的另一个实施例是减少有此需要的患者中的tau聚集的方法，所述方法包括给患者施用治疗有效量的本发明的分离的抗体，其时间足以减少tau聚集。
本发明的另一个实施例是治疗或减少患者中涉及tau聚集的神经退化性疾病的症状的方法，所述方法包括给患者施用治疗有效量的本发明的分离的抗体，其时间足以治疗或减少神经退化性疾病的症状。
在上述实施例的任一个中，涉及tau聚集的神经退化性疾病是tau蛋白病变。
在上述实施例的任一个中，分离的抗体包含结合PHF-tau的抗体，所述抗体包含SEQ ID NO：35的VH的抗原结合位点和SEQ ID NO：36的VL的抗原结合位点。
在上述实施例的任一个中，分离的抗体包含结合PHF-tau的抗体，所述抗体包含SEQ ID NO：37的VH的抗原结合位点和SEQ ID NO：38的VL的抗原结合位点。
如本文使用的“tau蛋白病变”包含涉及脑内的tau病理性聚集的任何神经退化性疾病。除了家族性和散发性AD外，其他示例性tau蛋白病变是与染色体17相关的额颞性痴呆及帕金森综合征(FTDP-17)、进行性核上性麻痹、皮质基底节变性、皮克氏(Pick′s)病、进行性皮质下胶质增生、仅缠结痴呆(tangle only dementia)、弥漫性神经原纤维缠结伴钙化、嗜银颗粒性痴呆、肌萎缩侧索硬化帕金森-痴呆综合征、唐氏综合症、格-施-沙氏(Gerstmann--Scheinker)病、哈-斯二氏(Hallervorden-Spatz)病、包涵体肌炎、克-雅二氏病、多系统萎缩、尼曼-皮克病C型、朊病毒蛋白脑淀粉样血管病、亚急性硬化性全脑炎、强直性肌营养不良、非guanamian伴神经原纤维缠结的运动神经元疾病、脑炎后帕金森综合征和慢性创伤性脑病例如拳击员痴呆症(拳击疾病)。(Morris等人Neuron70：410-26，2011)。
tau蛋白病变相关的行为表型包括认知损害、早期人格改变和失控、冷漠、意志缺乏、缄默症、失用症、持续言语、刻板的动作/行为、性欲亢进、混乱、无法计划或组织顺序任务、自私/无情、反社会特性、缺乏换位思考、踌躇、无语法的讲话伴频繁语义错误但相对保存完好的理解、受损的理解和选词障碍、缓慢渐进的步态不稳、反步症、不动、经常跌倒、非左旋多巴响应的轴向僵化、核上性凝视麻痹、方波抽搐、缓慢垂直扫视、假性延髓麻痹、肢体失用症、肌张力障碍、皮质感觉丧失和震颤。
顺应治疗的患者包括处于AD或其他tau蛋白病变危险中的无症状个体，以及目前显示症状的患者。顺应治疗的患者包括具有已知AD遗传危险例如AD家族史或基因组中存在遗传危险因素的个体。示例性危险因素是淀粉样蛋白前体蛋白(APP)中的突变，尤其是在第717位以及第670和671位处的突变(分别为哈迪(Hardy)和瑞典型突变)。其他危险因素是在早老蛋白基因、PS1和PS2以及ApoE4中的突变、高胆固醇血症或动脉粥样硬化的家族史。目前患有AD的个体可通过上述危险因素的存在的特征性痴呆进行识别。此外，许多诊断测试可用于鉴定具有AD的个体。这些包括脑脊髓液tau和Aβ42水平的测量。升高的tau和降低的Aβ42水平表明AD的存在。患有AD的个体还可通过AD及相关病症协会标准进行诊断。
施用/药物组合物
本发明的抗PHF-tau抗体适合作为用于治疗或预防神经退化性疾病的治疗试剂和预防试剂两者，所述神经退化性疾病涉及tau的病理性聚集，例如AD或其他tau蛋白病变。在无症状患者中，治疗可在任何年龄(例如在约10、15、20、25、30岁)时开始。然而，通常，直到患者达到约40、50、60或70岁时才需要开始治疗。治疗通常需要经过一段时间的多个剂量。治疗可通过随着时间过去测定针对治疗试剂的抗体、或活化T细胞或B细胞应答进行监控。如果应答下降，则指示加强剂量。
在预防应用中，将药物组合物或药剂施用于对AD敏感或另外处于AD危险中的患者，其量足以消除或减少危险，减轻严重性，或延迟疾病的发作，包括疾病的生物化学、组织学和/或行为症状，其并发症和在疾病发展过程中存在的中间病理学表型。在治疗应用中，将组合物或药剂施用于怀疑患有或已患有此类疾病的患者，其量足以减少、阻止或延迟疾病的任何症状(生物化学、组织学和/或行为)。治疗剂的施用可减少或消除患者中的轻度认知损害，所述患者仍未发展特征性阿尔茨海默氏病的病理学。足以实现治疗或预防处理的量定义为治疗或预防有效剂量。在预防和治疗方案两者中，组合物或药剂通常在几个剂量中施用，直至已实现足够的免疫应答。
本发明的抗PHF-tau抗体或其片段可与其他试剂组合施用，所述其他试剂对于治疗有关神经退化性疾病是有效的。在AD的情况下，本发明的抗体可与减少或预防β淀粉样蛋白(Aβ)沉积的试剂组合施用。PHF-tau和Aβ病理学协同作用是可能的。因此，同时靶向PHF-tau和Aβ以及Aβ相关病理学的组合治疗可能比个别靶向各自更有效。
在帕金森氏病和有关神经退化性疾病的情况下，清除聚集形式的α-突触核蛋白的免疫调节也是新出现的治疗。同时靶向tau和α-突触核蛋白两者的清除的组合治疗可能比个别靶向任一蛋白质更有效。
在本发明的方法中，在治疗或改善tau蛋白病变的症状中的抗体“治疗有效量”可通过标准研究技术进行测定。例如，抗体的剂量可通过将该试剂施用于本领域众所周知的有关动物模型进行测定。
此外，体外测定法可任选地用于辅助鉴定最佳的剂量范围。对具体有效量的选择可由本领域的技术人员根据对多种因素的考量(例如，经由临床试验)来测定。这类因素包括待治疗或预防的疾病、所涉及的症状、患者体重、患者免疫状态以及技术人员所知的其它因素。计划用于制剂中的精确剂量也将取决于给药途径以及疾病严重性，并且应根据执业者的判断以及各个患者的状况来决定。有效剂量可通过来自体外或动物模型测试体系的剂量响应曲线来推导。
本发明的抗体的治疗用途的施用模式可以是将该试剂递送至宿主的任何合适途径。这些抗体的药物组合物可用于肠胃外施用，例如真皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内或颅内，或它们可施用到脑或脊柱的脑脊髓液内。
本发明的抗体可制备为药物组合物，其含有有效量的抗体作为药学可接受的载体中的活性成分。术语“载体”指抗体与之一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。此类药学媒介物可以是液体，例如水和油，包括那些来源于石油、动物、植物的油或合成的油，诸如，花生油、大豆油、矿物油和芝麻油等等。例如，可使用0.4％盐水溶液和0.3％甘氨酸。这些溶液是无菌的，通常不含颗粒物。它们可通过常规的已知的灭菌技术(例如过滤)进行灭菌。组合物可根据需要含有药学可接受的辅助物质，以接近生理条件，例如pH调节剂和缓冲剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂等。在此类药物制剂中本发明的抗体的浓度可广泛改变，即从按重量计小 于约0.5％，通常为或至少约1％到多达15或20％，且将根据所选择的具体施用方式，主要基于所需剂量、流体体积、粘度等进行选择。
治疗可在单剂量时间表或作为多剂量时间表给予，在所述多剂量时间表中，初步治疗过程可使用1-10个分离的剂量，随后为维持和或增强应答所需的在后续时间间隔给予的其他剂量，例如对于第二剂量在1-4个月时，并且如果需要，在几个月后的一个或多个后续剂量。合适的治疗疗程的例子包括：(i)0、1个月和6个月，(ii)0、7天和1个月，(iii)0和1个月，(iv)0和6个月，或其他足以引起预期会减轻疾病症状或减轻疾病严重程度的所需反应的疗程。
因此，用于肌内注射的本发明的药物组合物可制备为含有1ml无菌缓冲水，以及约1ng至约100mg、约50ng至约30mg、或约5mg至约25mg本发明的抗体。类似地，用于静脉内输注的本发明的药物组合物可制成为含有约250ml无菌林格氏溶液，以及约1mg至约30mg、或约5mg至约25mg本发明的抗体。用于制备非肠道施用的组合物的实际方法是众所周知的，且更详细地描述在，例如，“Remington′s Pharmaceutical Science”，第15版，Mack PublishingCompany，Easton，PA中。
可将本发明的抗体低压冻干用于贮存，并在使用前在合适的载体中重构。该技术已显示对抗体及其他蛋白质制剂有效，并且可采用本领域已知的冻干和重构技术。
诊断方法和试剂盒
本发明的抗体可用于诊断受试者中的AD或其他tau蛋白病变的方法中。该方法涉及使用诊断试剂例如本发明的抗体或其片段，检测受试者中PHF-tau的存在。
通过使生物样品与诊断抗体试剂接触，并且检测诊断抗体试剂与来自受试者的样品中的PHF-tau的结合，可在来自受试者的生物样品(例如血液、尿、脑脊髓液)中检测PHF-tau。用于执行检测的测定包括众所周知的方法，例如ELISA、免疫组织化学、蛋白质印迹或体内成像。示例性诊断抗体是本发明的抗体PT1和PT3，并且具有IgG1，κ类型。
诊断抗体或类似试剂可通过静脉内注射到患者体内，或通过任何合适途径直接注射到脑内进行施用，所述任何合适途径如上文例示的将该试剂递送至宿主。抗体的剂量应在与治疗方法相同的范围内。通常，将抗体标 记，尽管在一些方法中，对PHF-tau具有亲和力的一抗是未标记的，并且第二标记抗体用于结合一抗。标记的选择取决于检测方法。例如，荧光标记适合于光学检测。顺磁性标记的使用适合于无需手术干预的断层摄影检测。放射性标记也可使用PET或SPECT进行检测。
诊断通过比较来自受试者的样品或受试者中的标记PHF-tau、tau聚集体和/或神经原纤维缠结的数目、大小和/或强度与相应基线值来进行。基线值可代表未患病个体群体中的平均水平。基线值还可代表在相同受试者中测定的先前水平。
通过在治疗前、在治疗过程中或在治疗后检测受试者中PHF-tau的存在，上文描述的诊断方法也可用于监控受试者对治疗的应答。相对于基线在值中的降低发出针对治疗的阳性应答的信号。随着病理性tau从脑中清除，值还可在生物学流体中瞬时增加。
本发明还涉及用于执行上述诊断和监控方法的试剂盒。通常，此类试剂盒含有诊断试剂例如本发明的抗体和任选的可检测标记。诊断抗体自身可含有可检测标记(例如荧光分子、生物素等)，其可直接检测或可经由次级反应(例如与链霉抗生物素蛋白反应)检测。作为另外一种选择，可利用含有可检测标记的第二试剂，其中该第二试剂对一抗具有结合特异性。在适合于测量生物样品中的PHF-tau的诊断试剂盒中，该试剂盒的抗体可与固相例如与微量滴定皿的壁预结合提供。
本专利申请中所有引用的参考文献的内容(包括参考文献、公布的专利、公布的专利申请以及共同未决的专利申请)在此明确地以引用方式并入。
实例1
成对螺旋细丝-tau(PHF-tau)的纯化
PHF-tau部分通过Greenberg和Davies的修改方法(Greenberg和Davies ProcNatl Acad Sci U S A 87：5827-31，1990)进行纯化。简言之，部分纯化得自组织学证实阿尔茨海默氏病的患者的死后皮质组织。通常，使用玻璃/特氟隆Potter组织匀浆器(IKAWorks，Inc；Staufen，Germany)，以1000rpm将5mg额皮质在10体积的冷缓冲液BufferH(10mMTris、800mM NaCl、1mM EGTA和10％蔗糖/pH7.4)中匀浆化。匀浆化的材料在Sorvall转子SS34中以27000g离心20分钟。弃去团块，并将上清液调整至1％ (w/v)N-月桂酰肌氨酸和1％(v/v)2-巯基乙醇的最终浓度，并且在37℃下温育2小时。随后，将上清液以108000g在20℃下在Beckman 60Ti转子中离心35分钟。将团块在PBS中小心洗涤并悬浮于PBS中。上清液如所述的离心第二次，并且将最终团块溶解，等分且在-80℃下冷冻。使用抗tau抗体AT8和HT7(ThermoScientific，Rockford，IL)，在12％SDS-PAGE和蛋白质印迹上评估PHF-tau制剂的质量。AT8检测在S202/T205处磷酸化的PHF-tau，但不结合非磷酸化的PHF-tau，也不结合野生型tau。HT7结合在Tau氨基酸159-163(SEQ ID NO：6的)处的非磷酸化表位，并且识别tau和PHF-tau两者。良好质量的PHF-tau制剂由在蛋白质印迹上具有约60、64、66和72kDa分子量的4个条带组成，所述蛋白质印迹使用与高度磷酸化的PHF-tau反应的抗体例如AT8进行检测。由相同脑样品制备具有可比较的质量和纯度的两种分开的PHF-tau制剂。制剂1用于免疫接种。
实例2
针对PHF-tau的单克隆抗体的生成
使用标准杂交瘤技术，在正常Balb/c小鼠中生成抗PHF-tau抗体(Kohler和Milstein Nature 256：495-7，1975)。将获得的杂交瘤种植到96孔板中，并且在10天后如下所述在直接ELISA中在25ng/孔包被的PHF-tau上进行筛选。在由对照tau(SEQ ID NO：6)包被的10ng/孔上就交叉反应性测试阳性细胞，所述对照tau在大肠杆菌(E.Coli)BL21细胞中表达，并且通过热处理和硫酸铵沉淀进行纯化，并且立即亚克隆所述阳性细胞并且将阳性克隆冷冻在液氮中。所有杂交瘤均在达尔贝科改良伊格尔培养基中生长，所述培养基补充有10％胎牛血清(Hyclone，Europe)、杂交瘤融合克隆补充物(2％)(Roche，Brussels，Belgium)、2％HT(Sigma，USA)、1mM丙酮酸钠、2mM L-谷氨酰胺以及青霉素(100U/ml)和链霉素(50mg/ml)。
由在小鼠IgG1/IgG2/κ背景上选择的杂交瘤细胞克隆抗体可变区，并且使用常规方法进行表达且纯化。
用于抗体选择的直接ELISA
将25ng/孔PHF-tau在4℃下在NUNC Maxisorp(Life Technologies)平底高结合96孔微量滴定板中的50μl/孔包被缓冲液(10mM Tris、10mM NaCl和10mM NaN3，pH8.5)中包被过夜。第二天，在室温下用75μl/孔 的在PBS中的0.1％酪蛋白封闭平板60分钟。接下来，加入50μl杂交瘤上清液，并且在37℃下温育1小时。在洗涤后，用50μl/孔的与辣根过氧化物酶缀合的绵羊抗小鼠IgG(Amersham-Pharmacia Biotech)在37℃下检测结合的单克隆抗体1小时。两种试剂均在0.1％酪蛋白/PBS中稀释。将平板洗涤，并且加入50μl0.42mM3，5，3’，5’-四甲基联苯胺、在100mM柠檬酸中的0.003％(v/v)H2O2和100mM磷酸氢二钠(pH4.3)溶液作为底物。允许反应在室温下在平板振荡器上进行最多15分钟，这之后用50μl/孔的2NH2SO4停止颜色发展，并且在微量滴定板阅读器(Thermomax，Molecular Devices)上在450nm处阅读平板。
单克隆抗体的特异性
得自杂交瘤筛选的选择抗体就其与重组表达的对照tau(SEQ ID NO：6)的交叉反应性进行测试。将500ng PHF-tau和200ng对照tau装载到 Bis-Tris4-12％凝胶上，并且根据制造商的说明书，通过使用iBlot系统(Invitrogen)印迹到硝酸纤维素膜上。将膜用含有脱脂奶粉(NFDM)(5％w/v；Biorad)的Tris缓冲盐水Tween-20(TBS-T；1M Tris、150mM NaCl和0.05％Tween-20，pH8.5)封闭1小时，并且在TBS-T中洗涤三次，与在含有NFDM(5％w/v)的TBS-T中稀释的对照一抗(1μg/ml)HT7、AT8、AT100(ThermoScientific，Rockford，IL)和BT2一起在4℃下温育过夜。将选自杂交瘤筛选的PT1、PT2、PT3、PT4和PT5单克隆抗体加入含有10％FCS的细胞上清液中。经由West增强化学发光(Pierce，Thermoscientific)，使用与HRPO缀合的绵羊抗小鼠Ig(在TBS-T中的1∶20000，Amersham Biosciences)检测一抗。信号由Lumi成像系统(Roche Diagnostic)捕获。PT1和PT3在蛋白质印迹中与PHF-tau反应，而不与对照tau反应。PT2与两种蛋白质反应。HT7和AT8的结合概况在上文描述。AT100与磷酸化的Ser212/Thr214结合，并与PHF-tau结合，但不与野生型tau结合。BT2识别包含S199/S202的非磷酸化表位，并且因此识别野生型tau而不是PHF-tau。
竞争性表位结合
单克隆抗体PT1、PT2、PT3、PT4、PT5、AT8(ThermoScientific，Rockford，IL)、AT100(ThermoScientific，Rockford，IL)和HT7(MN1000)(Thermo Scientific，Rockford，IL)就与PHF-tau或磷酸化的 tau肽的竞争结合进行评估。根据制造商的说明书，使用SULF0-TAG NHS酯(Meso Scale Discovery)标记抗体。
对于与标记PT1、PT3、AT100和HT7的竞争，将5μL(50μg/mL)/孔的富集PHF-Tau蛋白质(如上所述纯化的)包被在MSD HighBind平板(Meso Scale Discovery，Gaithersburg，MD)上在室温下(RT)2小时。对于与AT8的竞争，将25μL 0.1mg/孔的合成生物素化且聚乙二醇化的肽RSGYSSPG(pS)PG(pT)PGSRSR-OH(New England Peptide，LLC.，Gardner，MA)(SEQID NO：39)包被在荷有链霉抗生物素蛋白的平板(Meso Scale Discovery，Gaithersburg，MD)上，所述肽对应于在对应于对照tau中的S202/T205的残基处磷酸化的对照tau(SEQ IDNO：6)的残基194-211。在包被后，孔用150μL5％MSD封闭剂A缓冲液在RT下封闭2小时，并且用0.1M HEPES缓冲液，pH7.4洗涤三次。将25μL标记的各个抗tau抗体(10nM或50nM)和系列稀释的多种未标记的竞争抗体(1nM至2μM)的混合物加到每个孔上。使平板在RT下伴随轻轻振荡温育2小时，并且如上洗涤3次。加入150μL/孔的稀释的MSD阅读缓冲液T，并且在SECTOR成像仪6000(Meso Scale Discovery，Gaithersburg，MD)上阅读平板。
抗Tau mAb HT7、AT100和AT8的非重叠表位在上文描述。基于公开的数据，这些抗体未预期彼此竞争结合Tau蛋白质或肽。
基于执行的竞争测定，抗体无一彼此竞争结合，指示它们均与不同表位结合。在每个实验中，仅观察到自抑制。图1-5分别显示了使用标记AT8、PT1、PT3、AT100和HT7的竞争测定的结果。
实例3
抗PHF tau抗体在体内减少PHF-tau积聚
5-月龄的雌性P301L小鼠(Taconic，目录#002508)用小鼠IgG1、盐水、PT3(500μg/小鼠)或AT8(由杂交瘤ECACC，保藏号9110086表达)每周处理一次，共5个月。将小鼠麻醉，用冷PBS灌注，并且在冰上解剖脑。对于每只小鼠，一个脑半球在10体积的H缓冲液中匀浆化，随后在4℃下以21,000g离心20分钟。所得的上清液还以100,000g离心60分钟。在离心后，回收团块(级分P1)，并且用裂解缓冲液重悬浮用于蛋白质和ELISA分析，如由Chai等人J BiolChem 286：34457-67，2011描述的。 对于皮质样品，级分P1还用1％(w/v)N-月桂酰肌氨酸处理，并且超速离心以进一步富集团块中的PHF-tau。发现雄性P301L小鼠具有低转基因表达，并且不包括在分析中。
磷酸化的tau在脑干匀浆物(级分P1)中用夹心ELISA以及在蛋白质印迹中使用AT100(图6C)进行测量，所述夹心ELISA使用抗体AT8和AT100作为捕获抗体，随后通过生物素化的HT7和抗生物素蛋白-HRP检测(图6A和6B)，基本上如Chai等人J Biol Chem286：34457-67，2011中所述。简言之，用裂解缓冲液(Cell Signaling)重悬浮P1团块。P1团块样品在AT8或AT100(Thermo Scientific)预包被的孔中与生物素标记的HT-7抗体温育。样品随后用缓冲液洗涤5次，随后与抗生物素蛋白-HRP一起温育一小时。在这之后，使样品与单步TMB底物(Thermo Scientific)一起温育30分钟，随后为2N H2SO4。最后，在450nm处阅读反应，并且使用源自人AD脑匀浆物的标准曲线测定脑中的AT8-或AT100-反应性tau的数量，并且标绘为AD脑匀浆物的相对量(ng/ml)，所述AD脑匀浆物提供与来自非转基因动物(B6)的平均样品相同的ELISA信号。
当在使用AT100(p＝0.057)或AT8(p＝0.0475)以检测磷酸化的ELISA测定中，与施用同种型对照的动物相比较时，在用PT3处理的P301L转基因动物中可见磷酸化tau的统计上显著的降低或朝向显著性的趋势(ELISA信号：盐水组(1135±228.8)；IgG1组(1344±245.6)；PT3组(660.5±134.5)；AT8组(1271±274))。
为了证实用ELISA获得的数据，通过使用AT100抗体检测PHF-tau，在蛋白质印迹上分析来自IgG1-或PT3-处理的动物的脑干匀浆物(级分P1)。使用抗肌动蛋白抗体作为装载对照印迹滤器(图6B)。蛋白质印迹显示当与用IgG1处理的动物相比较时，用AT100抗体检测到的减弱的PHF-tau量。
对于皮质分析，通过夹心ELISA分析十二烷基肌氨酸钠可溶性(代表可溶性tau)和不溶性(代表PHF-tau)皮质级分两者，所述夹心ELISA使用泛tau抗体(PT4)或磷酸-tau抗体(AT8)用于捕获，随后为生物素-泛tau抗体(hTau10)，随后为HRP-抗生物素蛋白。与用同种型对照IgG1处理的动物相比较，用PT3处理的动物具有相似水平的总tau。当与N-月桂酰肌氨酸不溶性级分中的同种型对照相比较时，朝向更低PHF-tau水平的 趋势在用PT3处理的动物中是显而易见的(用PT4捕获的ELISA：IgG组：851026±261198和PT3组：585639±120498；用AT8捕获的ELISA：IgG组：1125886±286240(N＝10)和pT3组：746582±124970(N＝7))。
实例4
抗PHF-tau抗体的表征
亲和力测定
通过ProteOn研究单克隆抗体PT1和PT3与重组人可溶性tau或PHF-tau的相互作用。所有相互作用均在25℃下进行研究，使用补充有3mM EDTA和0.005％Tween-20的PBSpH7.4作为运行或系统缓冲液。使用两种不同的实验形式，一种用于与重组表达的对照tau的相互作用，而另一种用于与PHF-tau的相互作用。在这些实验中，HT7(Pierce，目录#MN1000)，小鼠抗tau抗体用作阳性对照。
为了研究与重组表达的对照tau的相互作用，使用每个制造商的胺偶联化学说明书，通过使抗人或抗小鼠IgG Fcγ片段特异性抗体(Ab)与GLC(ProteOn)传感器芯片的表面偶联，制备生物传感器表面(～5000应答单位(RU))。偶联缓冲液是10mM乙酸钠，pH4.5。将抗PHF-tau抗体在运行缓冲液中稀释并注射，以获得60-130RU的捕获。抗PFH-Tau mAb的捕获随后为在溶液中(在5倍稀释中的0.1至75nM)的重组表达的对照tau(Tau-441，Sigma目录#T0576-50ug)的注射。监控结合共2分钟(以40μL/分钟注射的80μL)。监控解离共10分钟。用0.85％H3PO4或0.85％H3PO4，随后为50mM NaOH获得传感器表面的再生。数据使用1∶1结合模型进行拟合。数据使用1∶1结合模型进行拟合。
表2.
mAb 抗原 kon(M-1s-1) koff(s-1) *KD(pM)
PT1 对照Tau **
PT1 PHF-Tau 2.01E+05 6.47E-05 322
PT3 对照Tau ***
PT3 PHF-Tau (1.23±0.06)E+06 (2.18±0.28)E-05 18±2
*对于PHF-tau，这是表观固有亲和力，其中KD作为源自使用二价结合模型执行的拟合的kff1/kon-1比获得。
**无显著结合
*** 在5次实验的4次中无结合
为了研究与PHF-tau的相互作用，使用HT7作为捕获试剂通过捕获偶联PHF-tau制备生物传感器表面。如较早描述的另外PHF-tau制剂是ProteOn所需的，以限制进入射流的不溶性材料的量。通过在5000g、5℃下10分钟的2次离心另外制备如上所述的PHF-tau，其中来自第二离心的上清液随后在运行缓冲液中1/20或1/40稀释。为了制备芯片，使用每个制造商的胺偶联化学说明书，使HT7共价固定至GLC(ProteOn)传感器芯片的表面(～3000应答单位(RU))。偶联缓冲液是10mM乙酸钠，pH4.5。在HT7固定后，注射PHF-tau并由HT7捕获(～300RU)。在捕获后，使用每个制造商的胺偶联化学说明书，通过活化芯片使PHF-tau共价固定至传感器芯片。最后通过注射乙醇胺封闭剩余的反应位点。在PHF-tau修饰的表面和参考表面(不含抗原)的制备和稳定后，将抗PHF-tau抗体在运行缓冲液中稀释，并且在溶液中(在5倍稀释中的0.1-75nM)注射。监控结合共3分钟(以40μL/分钟注射的120μL)。监控解离共10或15分钟。用10mM Gly pH2获得传感器表面的再生。数据使用二价结合模型进行拟合，其中表观固有亲和力报告为koff-1/kon-1的比。
基于ProteOn实验，PT1以322pM的亲和力结合PHF-tau，并且在测试的条件下显示不结合对照tau(表2)。PT3以18±2pM的亲和力结合PHF-tau，并且在测试的条件下，在5次测量的4次中显示不结合对照tau。5次ProteOn测量中的一次显示弱结合，其可在使用的最高浓度的对照tau的基础上用于评估亲和力＞75nM。
现已完整描述本发明，对于本领域的普通技术人员而言将显而易见的是，在不脱离所附权利要求的实质或范围的前提下，可对本发明做出多种修改和变型。

Claims (14)

1.一种结合PHF-tau的分离的抗体，包含
SEQ ID NO:35的重链可变区（VH）的抗原结合位点和SEQ ID NO:36的轻链可变区（VL）的抗原结合位点；或者
SEQ ID NO:37的重链可变区（VH）的抗原结合位点和SEQ ID NO:38的轻链可变区（VL）的抗原结合位点。
2.根据权利要求1所述的分离的抗体，其中
所述VH的抗原结合位点包含分别为SEQ ID NO:7、8和9的重链互补决定区（CDR）1（HCDR1）、2（HCDR2）和3（HCDR3），并且所述VL的抗原结合位点包含分别为SEQ ID NO:10、11和12的轻链CDR1（LCDR1）、2（LCDR2）和3（LCDR3）；或者
所述VH的抗原结合位点包含分别为SEQ ID NO:13、14和15的重链互补决定区（CDR）1（HCDR1）、2（HCDR2）和3（HCDR3），并且所述VL的抗原结合位点包含分别为SEQ ID NO:16、17和18的轻链CDR1（LCDR1）、2（LCDR2）和3（LCDR3）。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的结合PHF-tau的分离的抗体，所述分离的抗体包含SEQ ID NO:35的VH的抗原结合位点和SEQ ID NO:36的VL的抗原结合位点。
4.根据权利要求3所述的分离的抗体，其中所述VH的抗原结合位点包含分别为SEQ IDNO:7、8和9的HCDR1、HCDR2和HCDR3，并且所述VL的抗原结合位点包含分别为SEQ ID NO:10、11和12的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
5.根据权利要求1或2中任一项所述的结合PHF-tau的分离的抗体，所述分离的抗体包含SEQ ID NO:37的VH的抗原结合位点和SEQ ID NO:38的VL的抗原结合位点。
6.根据权利要求5所述的分离的抗体，其中所述VH的抗原结合位点包含分别为SEQ IDNO:13、14和15的HCDR1、HCDR2和HCDR3，并且所述VL的抗原结合位点包含分别为SEQ ID NO:16、17和18的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
7.一种结合PHF-tau的分离的抗体或其抗原结合片段，包含
包含分别为SEQ ID NO:7、8和9的HCDR1、HCDR2和HCDR3的VH的抗原结合位点，和包含分别为SEQ ID NO:10、11和12的LCDR1、LCDR2和LCDR3的VL的抗原结合位点。
8.一种结合PHF-tau的分离的抗体或其抗原结合片段，包含
包含分别为SEQ ID NO:13、14和15的HCDR1、HCDR2和HCDR3的VH的抗原结合位点，和包含分别为SEQ ID NO:16、17和18的LCDR1、LCDR2和LCDR3的VL的抗原结合位点。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体是人源化的。
10.一种分离的多核苷酸，其包含
编码包含分别为SEQ ID NO:7、8和9的HCDR1、HCDR2和HCDR3的抗体VH的多核苷酸，和
编码包含分别为SEQ ID NO:10、11和12的LCDR1、LCDR2和LCDR3的抗体VL的多核苷酸。
11.一种分离的多核苷酸，其包含
编码包含分别为SEQ ID NO:13、14和15的HCDR1、HCDR2和HCDR3的抗体VH的多核苷酸，和
编码包含分别为SEQ ID NO:16、17和18的LCDR1、LCDR2和LCDR3的抗体VL的多核苷酸。
12.一种载体，包含权利要求10或11所述的多核苷酸。
13.一种宿主细胞，包含权利要求12所述的载体。
14.一种制备结合PHF-tau的抗体的方法，所述方法包括培养权利要求13所述的宿主细胞，以及回收由所述宿主细胞产生的抗体。
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