CN110114088A - 用于预防τ蛋白聚集的单克隆抗α-突触核蛋白抗体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及单克隆抗α‑突触核蛋白抗体的新颖用途。这些抗体可用于预防τ蛋白聚集，并从而治疗τ蛋白病变，例如阿尔茨海默氏病。

Description

用于预防τ蛋白聚集的单克隆抗α-突触核蛋白抗体

发明领域

本发明涉及免疫特异性结合α-突触核蛋白的单克隆抗体的新颖用途，还涉及将这些分子及其α-突触核蛋白结合片段用于治疗τ蛋白病变(例如阿尔茨海默病(AD))的方法。

对序列表的引用

本申请包括一个或多个序列表(依照37C.F.R.1.821等等)，其是以纸版和计算机可读介质两者披露的，并且将其纸版和计算机可读披露通过引用以其全文并入本文。

背景技术

年龄相关性神经退行性疾病，如阿尔茨海默氏病(AD)和痴呆，是现今的最大社会性挑战之一。世界卫生组织估计，护理老年人的成本将持续增加并且诊断为痴呆的病例的数目到2050年增至三倍(World Health Organization and Alzheimer's DiseaseInternational-Status Report(2012)DEMENTIA:A public health priority[世界卫生组织和阿尔茨海默氏病国际状态报告(2012)痴呆：公共卫生优先事项]，WHO)。对于AD的首要治疗是神经递质调节剂，例如乙酰胆碱酯酶抑制剂和NMDA调节剂。这些疗法在世纪之交变得可用，并且仍然形成用于与痴呆和AD相关的记忆缺陷的症状减轻的基础。然而，这些药物不靶向AD的潜在病因，即淀粉样蛋白β(Aβ)肽和τ蛋白聚集体的积累以及神经元突触和最终神经元的相关损失。

对老年人的纵向的社区范围的研究(Weiner,M.W.等人(2014)ADNI；Breteler,M.M.等人(1992)Neuroepidemiology[神经流行病学]11增刊1,23-28；Launer,L.J.(1992)Neuroepidemiology[神经流行病学]11增刊1,2-13)以及大基因组范围相关研究(Lambert,J.C.等人(2013)Nat.Genet.[自然基因组学]45,1452-1458)已经显示，AD是痴呆的多相混合物，其中高达10％的晚期AD患者缺乏淀粉样蛋白病变(Crary,J.F.等人(2014)ActaNeuropathol.[神经病理学学报]128,755-766)。此外，由Braak和Braak进行的开创性病理学研究(Braak,H.和Braak,E.(1996)Acta Neurol.Scand.[斯堪的纳维亚神经学学报]增刊165,3-12)证明神经原纤维缠结病变程度与尸体解剖前的认知状态之间的明显相关。这些观察已经通过一些研究者(Nelson,P.T.等人(2012)J.Neuropathol.Exp.Neurol.[神经病理学与实验神经学杂志]71,362-381)以及在最近的纵向生物标志物研究中得以验证，所述研究指示，贯穿该疾病的早期和后期，τ蛋白和磷酸化τ蛋白的脑脊液(CSF)水平增加(Jack,C.R.,Jr.等人(2013)Lancet Neurol.[柳叶刀神经学]12,207-216)。

如以上指出的，微管相关蛋白、τ蛋白、及其过度磷酸化形式形成作为AD的一类主要标志的细胞内神经原纤维缠结的主要成分。此外，τ蛋白的具体基因变体与额颞痴呆(FTD)的家族形式相关联。在AD中τ蛋白病变的表现以不同的空间模式出现，起始于内嗅皮质中，随后为海马区以及皮质区(Braak,H.和Braak,E.(1996)Acta Neurol.Scand.[斯堪的纳维亚神经学学报]增刊165,3-12)。τ蛋白病变的具体阶段还良好地与认知能力相关(Nelson,P.T.等人(2012)J.Neuropathol.Exp.Neurol.[神经病理学与实验神经学杂志]71,362-381；Braak,E.等人(1999)Eur.Arch.Psychiatry Clin.Neurosci.[欧洲精神病学与临床神经科学档案]249增刊3,14-22)。综上，此证据形成对于AD的基于τ蛋白的假设的基础。需要的是τ蛋白的细胞内积累导致微管变性和脊髓坍塌。结果是神经元之间的通信故障和细胞死亡随之发生。最近，还已经显示τ蛋白本身可以形成内-病原性种类，这些种类可以将神经变性从一个细胞传递到下一个细胞(Clavaguera,F.等人(2009)Nat.Cell Biol.[自然细胞生物学]11,909-913)。

作为内-病原体的τ蛋白

Clavaguera和同事们已经证明τ蛋白本身可以充当内-病原体(Clavaguera,F.等人(2009)Nat.Cell Biol.[自然细胞生物学]11,909-913)。将低自旋脑提取物分离自P301Sτ蛋白转基因小鼠(Allen,B.等人(2002)J.Neurosci.[神经科学杂志]22,9340-9351)，稀释并且注入幼小ALZ17小鼠的海马体和皮质区中。该ALZ17小鼠是τ蛋白转基因小鼠品系，该品系仅发展晚期病变(Probst,A.等人(2000)Acta Neuropathol.[神经病理学学报]99,469-481)。经注射的ALZ17小鼠快速发展实体丝状病变，并且给予来自P301S小鼠的经免疫耗减的脑提取物或来自野生型小鼠的提取物并不诱导τ蛋白病变。将脑提取物在可溶(S1)和十二烷基肌氨酸钠-不溶的τ蛋白(P3)(Sahara,N.等人,(2013)J.Alzheimer’s.Dis.[阿尔茨海默氏病杂志]33,249-263)方面分级并且将这些注入ALZ17小鼠证明了P3部分是诱导病变中最有力的。它包含多数的细胞内过度磷酸化丝状τ蛋白。大部分的病变还可以在将P301S提取物注入野生型小鼠的脑中时诱导，但无NFT形成。在后续的研究中，Clavaguera等人已表明，从其他τ蛋白病变(嗜银颗粒痴呆(AGD)、进行性核上性麻痹(PSP)、以及皮质基底节变性(CBD))的尸体解剖后的脑组织提取的人类τ蛋白也可以在ALZ17模型中诱导τ蛋白病变(Clavaguera,F.等人(2013)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊]110,9535-9540)。自从呈现了这些数据，若干其他τ蛋白接种和扩展模型已经被报道(Ahmed,Z.等人(2014)Acta Neuropathol.[神经病理学学报]127,667-683；Walker,L.C.等人(2013)JAMA Neurol.[美国医学会杂志：神经学分册]70,304-310)。从这些研究得出的主要结论指示一种机制，通过该机制在细胞内内含物中的病原性τ蛋白从该细胞分泌进入周质空间。然后病理τ蛋白材料沿着囊泡鞘以顺行方向和逆行方向被运输，并且随后通过批量内吞作用被邻近细胞吸收。这个机制解释了为什么在人类疾病中观察到的病变的扩展遵循不同的解剖学模式。有趣的是，病理性τ蛋白的外周给予可以加速ALZ17小鼠中τ蛋白病变的形成(Clavaguera,F.等人(2014)Acta Neuropathol.[神经病理学学报]127,299-301)。

α-突触核蛋白和τ蛋白病变之间的关系

α-突触核蛋白是蛋白家族的成员，包括β-和γ-突触核蛋白和突触素(synoretin)。α-突触核蛋白在与突触关联的正常状态下表达，并且被认为在调节突触泡释放中起作用，并且由此影响神经、可塑性、学习和记忆。

若干研究已经暗示，在帕金森氏病(PD)发病机理中，α-突触核蛋白具有中心作用。在病理条件下，该蛋白可以聚集以形成细胞内不溶性原纤维。例如，突触核蛋白在路易体(LB)中累积(Spillantini等人,Nature[自然](1997)388:839-40；Takeda等人,J.Pathol.[病理学杂志](1998)152:367-72；Wakabayashi等人,Neurosci.Lett.[神经科学快报](1997)239:45-8)。将α-突触核蛋白基因中的突变以及该基因的二倍和三倍重复与帕金森氏病罕见的家族形式共分离(Kruger等人,Nature Gen.[自然遗传学](1998)18:106-8；Polymeropoulos等人,Science[科学](1997)276:2045-7)。

一个重要的发现一直认为α-突触核蛋白可分泌到并且存在于血浆和脑脊液(CSF)中。若干研究，例如Pacheco等人(2015)和其他人的研究(Conway等人,(2000)Proc NatlAcad Sci USA[美国国家科学院院刊],97:571-576；Volles等人,J.Biochem.[生物化学杂志](2003)42:7871-7878)已经表明，细胞外突触核蛋白在大脑中起着致病作用。他们已证明α-突触核蛋白拥有对直接暴露于细胞外突触核蛋白低聚物的脑神经元质膜的神经毒性。基于突触核蛋白分泌数据的另一个有趣的假设是α-突触核蛋白的朊病毒样传播构成帕金森氏病和其他突触核蛋白病变进展的基础(Lee等人,Hansen等人(2011)J.Clin Invest[临床研究杂志]121:715-725)。这些发现产生了如下希望：细胞外突触核蛋白可以被免疫疗法靶向(Vekrellis等人(2011)Lancet Neurol[柳叶刀神经学]10:1015-1025)并且是治疗α-突触核蛋白病变的潜在治疗方法。除了突变，α-突触核蛋白基因的可变剪接和该蛋白质的翻译后修饰，例如磷酸化作用、泛素化、硝化、和截短可以产生α-突触核蛋白的蛋白形式，该蛋白形式具有形成α-突触核蛋白的聚集的和/或有毒的形式的增加的能力(Beyer和Ariza,Mol Neurobiol[分子神经生物学]2013年4月；47(2):509-24)。然而，α-突触核蛋白病变中的α-突触核蛋白的精确病理学种类仍然未知。已经将各种从低聚物至原纤维范围的错误折叠的/聚集的/分泌的种类和不同翻译后修饰与毒性关联，但哪一个最重要还没有达成一致(是否真的甚至只有单一的毒性种类)。

病理学的共同表现，例如，在患有PD的患者亚组中的路易体、Abeta斑块和神经原纤维缠结或在AD患者亚组中的路易体(Galpern和Lang,Ann.Neurol.[神经学年鉴](2008),59:449-458)导致了对聚集倾向蛋白可以彼此交叉接种到什么程度的研究。已经报道α-突触核蛋白和τ蛋白能够在体外共孵育时诱导各自的纤维化(Giasson等人,(2003)Science[科学]300:636-640)。在细胞系统中，有支持和不支持τ蛋白与α-突触核蛋白原纤维的交叉接种的证据。Holmes等人未能证明在基于FRET的τ蛋白报告子细胞系中τ蛋白与由全长α-突触核蛋白制成的原纤维的交叉接种(Holmes等人,(2014)PNAS doi/10.1073:E4376-E4385)。原纤化的全长α-突触核蛋白A53T或来自多系统萎缩症(MSA)患者的PTA-沉淀的(以富集原纤化的α-突触核蛋白)脑样品均不能诱导τ蛋白聚集(Woerman等人,(2015)PNASdoi/10.1073:E4949-E4958)。其他人报道，在一些条件下，α-突触核蛋白可诱导τ蛋白聚集，例如由N-末端截短(21-140)的α-突触核蛋白制成的α-突触核蛋白原纤维显示诱导QBI293细胞中的τ蛋白磷酸化(Waxman和Giasson(2011)J.Neurosci[神经科学杂志]31:7604-7618)。在神经元培养物中，全长原纤化的α-突触核蛋白使种子τ蛋白聚集。然而，由截短的α-突触核蛋白(1-120或32-140)制成的原纤化的α-突触核蛋白可以通过细胞内重复的自我接种(来自每次传代的5％或10％原纤化的α-突触核蛋白作为种子包含在随后传代的原纤维化中)(Guo等人,(2013)Cell[细胞]154:109-117)。

据我们所知，还没有研究假设α-突触核蛋白的分泌的低聚物形式或原纤化形式可能是AD或其他τ蛋白病变的早期发病机制中的促成因素，其通常独立于可见的α-突触核蛋白内含物。可以证明τ蛋白与α-突触核蛋白交叉接种的报道集中于解释为什么在一些PD患者中伴随着明显的α-突触核蛋白聚集(路易体)发现神经原纤维缠结。这些研究推测，交叉接种可以发生在与τ蛋白和α-突触核蛋白沉积有密切生理联系的区域(Giasson等人,(2003)Science[科学]300:636-640；Waxman和Giasson(2011)J.Neurosci[神经科学杂志]31:7604-7618；Guo等人,(2013)Cell[细胞]154:109-117)。这一观点是新的：可溶性细胞外低聚物形式/原纤化形式的α-突触核蛋白而不是路易体或路易神经突形式的细胞内聚集体是产生τ蛋白神经原纤维缠结的重要促成因素。

α-突触核蛋白免疫疗法

与α-突触核蛋白结合的抗体已被开发成为治疗突触核蛋白病变(也称为路易体病(LBD))的潜在治疗剂。突触核蛋白病变被表征为用显微镜可见为路易体(LB)和/或路易神经突的细胞内蛋白聚集体的沉积，其中蛋白α-突触核蛋白是主要组分(Jellinger,MovDisord.[运动障碍]2012年1月；27(1):8-30；McKeith等人,Neurology[神经病学](1996)47:1113-24)。突触核蛋白病变包括帕金森氏病(包括特发性帕金森氏病)和弥漫性路易体(DLB)病(也称为路易体痴呆(DLB)、阿尔茨海默氏病的路易体变体(LBV)、组合型阿尔茨海默氏和帕金森氏病(PD))、纯自主神经衰竭和多系统萎缩症(MSA；例如橄榄体脑桥小脑萎缩、纹状体黑质变性和夏伊-德尔格综合征(Shy-Drager Syndrome))。

已经显示若干不同的α-突触核蛋白抗体在临床前动物模型中具有治疗效果。靶向包含α-突触核蛋白残基91-99的表位的抗体和靶向包含α-突触核蛋白残基118-126的表位的抗体两者都显示对转基因小鼠的运动和认知缺陷有影响(Games等人2014)。这些抗体中最先进的是一种基于小鼠单克隆抗体9E4的人源化抗体，其靶向包含α-突触核蛋白残基118-126的表位，并且目前正处于I期的临床试验中。此外，靶向α-突触核蛋白的氨基末端表位的抗体已显示在小鼠朊病毒样转移模型中在预防病变的传播和毒性方法具有可能的治疗潜力(Tran等人2014)，并且靶向包含α-突触核蛋白残基120-140的表位的C-末端抗体274(Bae等人2012)也显示在临床前模型中对从细胞到细胞的病变传播具有影响。除了这些，靶向构象的种类(例如α-突触核蛋白的低聚物和原纤维)的抗体已经显示能够至少减少这些推测有毒的α-突触核蛋白种类的水平(等人2014和Spencer等人2014)。在体内降低α-突触核蛋白低聚物水平的这些构象抗体，例如mab47，也显示靶向α-突触核蛋白氨基酸121-125的C-末端表位(US20120308572)。其他构象的、原纤维和低聚物特异性抗体也靶向C-末端序列(Vaikath等人Neurobiol Dis[疾病神经生物学]2015年4月30；79:81-99)。重要的是，这些α-突触核蛋白抗体中没有一种声称能够预防τ蛋白聚集，且因此能够潜在地治疗τ蛋白病变。

在本发明中，我们惊奇地发现聚集的/原纤化的α-突触核蛋白能够诱导τ蛋白的聚集，而产生的与α-突触核蛋白结合的几种抗体能够预防这种聚集。我们示出，不同α-突触核蛋白抗体的组均能预防τ蛋白在细胞模型中的聚集：结合至推测有毒的α-突触核蛋白片段1-119/122(结合至α-突触核蛋白的氨基酸112-117)并中和α-突触核蛋白的该截短形式的抗体(GM37)、结合至α-突触核蛋白的氨基酸136-140的抗体(2E6)、结合至α-突触核蛋白的氨基酸126-138的抗体(GM63)以及结合至α-突触核蛋白的氨基酸118-126的抗体9E4。为了支持α-突触核蛋白的原纤维形式可能有助于早期AD病变，我们证明了来自AD患者的大脑中的原纤化α-突触核蛋白的存在独立于路易体病变的存在。这支持了可溶性细胞外形式的原纤化α-突触核蛋白可能潜在地在τ蛋白病变(例如所有AD)患者中的τ蛋白病变中起作用，并不仅在那些以可见α-突触核蛋白聚集体为特征(由脑成像或尸体解剖后染色确定)的τ蛋白病变患者中起作用。

发明内容

本发明涉及α-突触核蛋白结合单克隆抗体用于抑制τ蛋白聚集的用途。

如本文和权利要求书中披露的本发明的抗体可以用于治疗患有阿尔茨海默氏病的患者或患有τ蛋白病变的患者，所述τ蛋白病变例如：嗜银颗粒痴呆(AGD)；精神病，特别是因AD导致的精神病或患有AD的患者中的精神病；患有路易体痴呆症的患者的精神病症状；进行性核上性麻痹(PSP)；额颞痴呆(FTD或其变体)；TBI(急性或慢性创伤性脑损伤)；皮质基底节变性(CBD)；皮克病；原发性年龄相关性τ蛋白病变(PART)；神经原纤维缠结为主型老年性痴呆；拳击员痴呆；慢性创伤性脑病；中风；中风恢复；与帕金森氏病相关的神经变性；与染色体关联的帕金森综合征；利缇可-伯蒂格病(Lytico-Bodig disease)(关岛型帕金森氏病-痴呆复合征)；神经节胶质瘤和神经节细胞瘤；脑膜血管瘤病；脑炎后帕金森综合征；亚急性硬化性全脑炎；亨廷顿氏病；铅中毒脑病；结节性硬化症；哈勒沃登-施帕茨病(Hallervorden-Spatz disease)以及脂褐质沉积症。更典型地，该τ蛋白病变选自下组，该组由以下组成：阿尔茨海默氏病；嗜银颗粒痴呆(AGD)；精神病，特别是因AD导致的精神病或患有AD的患者中的精神病；患有路易体痴呆症的患者的精神病症状；进行性核上性麻痹(PSP)；额颞痴呆(FTD或其变体)；TBI(急性或慢性创伤性脑损伤)；皮质基底节变性(CBD)；以及皮克病。

附图说明

图1显示用于产生杂交瘤的免疫方案。下表列出了用于鉴定GM37和GM285的免疫原和小鼠品系的差异。独立地对不同HCo17-Balb/c和HCo12/Balb/c小鼠进行免疫(以下提供这些小鼠的描述)。从小鼠中鉴定了表达GM37的杂交瘤，这些小鼠使用包含氨基酸1-140原纤维的全长α-突触核蛋白进行免疫，并用全长(FL)α-突触核蛋白(SEQ ID NO 10)的截短的α-突触核蛋白片段1-60和1-119进行强化。表达抗体GM285的杂交瘤来自一个免疫方案，其中HCo12-Balb/c小鼠使用全长单体α-突触核蛋白(氨基酸1-140)进行免疫，接着用全长原纤维α-突触核蛋白进行强化(实例1)。

图2(小图A-C)显示针对结合α-突触核蛋白、α-突触核蛋白同系物和直向同源物的GM37的筛选。

A)使用基于无洗涤液的ELISA(FMAT)将抗体GM37结合至α-突触核蛋白。

B)使用SPR(Fortebio公司)结合抗体GM37对于α-突触核蛋白是特异性的(α图)，并且不结合其他相关突触核蛋白家族蛋白β-突触核蛋白(β小图)和γ-突触核蛋白(γ小图)。使用SPR(Fortebio Octetred)进行测量，GM37对来自食蟹猴(食蟹猴小图)和小鼠(小鼠小图)的α-突触核蛋白显示相似的结合。(实例1)。

C)使用SPR(Fortebio Octetred)结合抗体GM285对于α-突触核蛋白是特异性的，并且不结合其他相关突触核蛋白家族蛋白β-突触核蛋白和γ-突触核蛋白。使用SPR(Fortebio Octetred)进行测量，GM285对来自食蟹猴(食蟹猴小图)和小鼠(小鼠小图)的α-突触核蛋白显示相似的结合(实例1)。

图3(小图A-C)显示GM37的实时结合亲和力。

A)如通过SPR(3000)所确定的，以随时间(x轴)变化的RU(相对单位)(y轴)测定抗体GM37对α-突触核蛋白的结合。山羊抗人IgG被固定在CM5芯片上。GM37被捕获在山羊抗人IgG固定化的芯片上并且测试了人α-突触核蛋白的浓度系列(3.125、6.25、12.5、25、50、100nM)对表面的结合。每个循环之间重新产生传感器表面。

B)将来自在不同浓度结合的信号转换成结合曲线。

C)计算了抗体GM37的结合常数(表示为hlgG1-6004-037-C106S)(实例2)。

图4(小图A-C)显示GM285的实时结合亲和力。

A)如通过SPR(3000)所确定的，以随时间(x轴)变化的RU(y轴)测定抗体GM285对α-突触核蛋白的结合。山羊抗人IgG被固定在CM5芯片上。GM285被捕获在山羊抗人IgG固定化的芯片上并且测试了人α-突触核蛋白的浓度系列(3.125、6.25、12.5、25、50、100nM)对表面的结合。每个循环之间重新产生传感器表面。

B)将来自在不同浓度结合的信号转换成结合曲线。

C)计算了抗体GM285的结合常数(表示为hlgG1-6004-285)(实例2)。

图5(小图A-C)显示对比抗体9E4的实时结合亲和力。

A)如通过SPR(3000)所确定的，显示以随时间(x轴)变化的RU(y轴)测定的9E4对α-突触核蛋白的结合。山羊抗人IgG被固定在CM5芯片上。9E4通过结合至山羊抗人IgG被捕获在芯片上，该山羊抗人IgG被固定在芯片上。测试了人α-突触核蛋白的浓度系列(3.125、6.25、12.5、25、50、100nM)对表面的结合。每个循环之间重新产生传感器表面。

B)将来自在不同浓度结合的信号转换成结合曲线。

C)计算了抗体9E4的结合常数。(实例2)。

图6(小图A-B)显示抗体GM37和GM285的表位图。ELISA数据显示抗体结合至来自α-突触核蛋白氨基酸序列95-132的连续的多肽(20聚体)的相对水平(其他非结合多肽未示出)。

A)GM37表位需要多肽序列ILEDMP(SEQ ID NO:9)用于完全结合。

B)GM285需要多肽ILED(SEQ ID NO:19)用于完全结合。(实例3)。

图7显示了一个表，该表比较了GM37及其变体1-3与固定的重组人α-突触核蛋白的结合率动力学参数。使用SPR测量该结合，并使用1:1结合算法(T200)确定结合比率。

图8由α-突触核蛋白抗体预防的、由α-突触核蛋白种子诱导的τ蛋白聚集。图7上图显示，可以通过α-突触核蛋白种子(原纤化的重组α-突触核蛋白)在一种细胞模型中有效诱导τ蛋白聚集，这种细胞模型通常用于评估干扰τ蛋白聚集的药剂的效果。α-突触核蛋白种子诱导的τ蛋白聚集一般可以通过α-突触核蛋白抗体-例如9E4(Elan，Prothena)和灵北公司(Lundbeck)抗体HLD1、GM37(“37”)和GM63(“63”)来预防。针对在丝氨酸396上磷酸化的τ蛋白的抗体(D1.2、C10.2和人性化(h)c10.2和表示为Lu0041G的另一个τ蛋白抗体)和对于α-突触核蛋白没有亲和力的对照抗体不影响τ蛋白聚集，这支持治疗性抗体与接种种类而不是内源性蛋白质相互作用的重要性(实例12)。图8下图显示了HEK293细胞中聚集测定的概况。使用具有P301L突变的编码人全长τ蛋白的cDNA转染细胞。二十四小时后，用α-突触核蛋白种子与抗体组合处理细胞。48小时后，使用生物化学测定来测量细胞匀浆中τ蛋白的聚集水平(实例5)。

图9来自所有AD病例50例(分为中期(Braak III/IV)和晚期(Braak V/VI)AD)的额叶皮质中α-突触核蛋白聚集体的存在。包括2个DLB样品作为对照(A中上两行)。AD样品中未检测到α-突触核蛋白-丝氨酸129磷酸化。包括路易体痴呆(DLB)样品作为阳性对照。

A和B证明了通过生物化学方法测量的50例AD患者的额叶皮质中聚集的α-突触核蛋白的存在。临床诊断为患有AD的患者，且该诊断通过尸体解剖后τ蛋白和Abeta的组织学染色证实。所有患者均未出现路易体病变(聚集的丝氨酸129磷酸化的α-突触核蛋白)，图9C。所有患者中α-突触核蛋白聚集体的存在和丝氨酸129磷酸化的α-突触核蛋白(路易体的标志物)的缺失支持了这样的假设，即在α-突触核蛋白病变可能表现为路易体之前，所有AD患者中均存在聚集形式的α-突触核蛋白。我们认为这些聚集的前路易体形式的α-突触核蛋白可以作为诱导τ蛋白病变的一个促成因素(图8)。总之，我们假设任何能够中和α-突触核蛋白聚集体(种子)或通过其他方式预防α-突触核蛋白聚集体进入神经元或神经胶质细胞并促进τ蛋白聚集的α-突触核蛋白抗体，都将具有治疗τ蛋白病变的治疗潜力。

具体实施方式

定义

如在此使用的，术语“α-突触核蛋白”与“α-突触核蛋白蛋白质”同义，并且是指任何α-突触核蛋白蛋白质亚型(例如在UniProt中鉴定为P37840,1-3)。关于如下显示的SEQID NO:10，给予α-突触核蛋白的氨基酸编号，其中甲硫氨酸(M)是氨基酸残基1：

SEQ ID NO:10:

MDVFMKGLSK AKEGVVAAAE KTKQGVAEAA GKTKEGVLYV

GSKTKEGVVH GVATVAEKTK EQVTNVGGAV VTGVTAVAQK

TVEGAGSIAA ATGFVKKDQL GKNEEGAPQE GILEDMPVDP

DNEAYEMPSE EGYQDYEPEA

本发明涉及能够免疫特异性结合至α-突触核蛋白(特别是人α-突触核蛋白)的抗体和抗体的片段，并且在一个实施例中显示出免疫特异性结合至人α-突触核蛋白的氨基酸110-140内的表位的能力。根据一些实施例，这些抗体结合至人α-突触核蛋白的氨基酸112-117、112-115、118-126、126-138或136-140内的表位。

术语“τ蛋白病变”典型地是指与τ蛋白病理性聚集相关的神经退行性疾病。典型地，该τ蛋白病变选自下组，该组由以下组成：阿尔茨海默氏病；嗜银颗粒痴呆(AGD)；精神病，特别是因AD导致的精神病或患有AD的患者中的精神病；患有路易体痴呆症的患者的精神病症状；进行性核上性麻痹(PSP)；额颞痴呆(FTD或其变体)；TBI(急性或慢性创伤性脑损伤)；皮质基底节变性(CBD)；皮克病；原发性年龄相关性τ蛋白病变(PART)；神经原纤维缠结为主型老年性痴呆；拳击员痴呆；慢性创伤性脑病；中风；中风恢复；与帕金森氏病相关的神经变性；与染色体关联的帕金森综合征；利缇可-伯蒂格病(关岛型帕金森氏病-痴呆复合征)；神经节胶质瘤和神经节细胞瘤；脑膜血管瘤病；脑炎后帕金森综合征；亚急性硬化性全脑炎；亨廷顿氏病；铅中毒脑病；结节性硬化症；哈勒沃登-施帕茨病以及脂褐质沉积症。更典型地，该τ蛋白病变选自下组，该组由以下组成：阿尔茨海默氏病；嗜银颗粒痴呆(AGD)；精神病，特别是因AD导致的精神病或患有AD的患者中的精神病；患有路易体痴呆症的患者的精神病症状；进行性核上性麻痹(PSP)；额颞痴呆(FTD或其变体)；TBI(急性或慢性创伤性脑损伤)；皮质基底节变性(CBD)；以及皮克病。具体地，该τ蛋白病变可以选自阿尔茨海默氏病、嗜银颗粒痴呆(AGD)、因AD导致的精神病或患有AD的患者中的精神病、患有路易体痴呆症的患者的精神病症状。

本发明上下文中的术语“抗体(Ab)”是指免疫球蛋白分子，或根据本发明的一些实施例是指能够特异性地结合至分子(“抗原”)的表位的免疫球蛋白分子的片段。天然存在的抗体典型地包括四聚体，它通常由至少两个重(H)链和至少两个轻(L)链构成。每条重链由重链可变区(在此缩写为VH)和重链恒定区构成，重链恒定区通常由三个结构域(CH1、CH2和CH3)构成。重链可以具有任何同种型，包括IgG(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)。每条轻链由轻链可变区(在此缩写为VL)和轻链恒定区(CL)构成。轻链包括κ链和λ链。重链和轻链可变区典型地负责抗原识别，而重链和轻链恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq))的结合。VH和VL区可以进一步细分成称作“互补决定区”的超变区，它们中间穿插着称为“框架区”(FR)的更保守的区域。每个VH和VL由三个CDR结构域和四个FR结构域组成，从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。特别相关的是抗体及其表位结合片段，它们已经被“分离”以存在于一种物理环境中，该物理环境不同于它们在自然界中存在的环境，或者它们已经被修饰以在氨基酸序列方面不同于天然存在的抗体。

如在此使用的，术语“抗体的表位结合片段”意指能够免疫特异性地结合至表位的抗体的片段。表位结合片段可以包含这种抗体的1、2、3、4、5个或所有6个CDR结构域，并且虽然能够免疫特异性地结合至这种表位，但可以展现对这种表位的不同于这种抗体的免疫特异性、亲和力或选择性。然而，优选地，表位结合片段将包含这种抗体的所有6个CDR结构域。抗体的表位结合片段可以是单一多肽链(例如scFv)，或者可以包含各自具有氨基末端和羧基末端的两个或更多个多肽链(例如，抗体、Fab片段、Fab₂片段等)。可以获得展现表位结合活性的抗体的片段，例如通过完整抗体的蛋白酶切割。更优选地，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由单独基因编码，但是此类基因序列或其编码cDNA可以使用重组方法通过柔性接头连接，该柔性接头使得这两个结构域能够成为单条蛋白链，在该单条蛋白链中VL区和VH区缔合以形成单价表位结合分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如，Bird等人,(1988)Science[科学]242:423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)[美国国家科学院院刊]85:5879-5883)。可替代地，通过采用柔性接头(其太短(例如，小于约9个残基)而不能使单条多肽链的VL区和VH区缔合在一起)，可以形成双特异性抗体、双抗体或类似分子(其中两条这样的多肽链缔合在一起以形成二价表位结合分子)(关于双抗体的描述，参见例如PNAS USA 90(14),6444-8(1993))。包含在本发明中的表位结合片段的实例包括(i)Fab'或Fab片段，即一种由VL、VN、CL和CH1结构域组成的单价片段，或如描述于WO2007059782中的单价抗体；(ii)F(ab')2片段，即包含两个在铰链区由二硫键连接的Fab片段的二价片段；(iii)基本上由VH结构域和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)基本上由VL结构域和VH结构域组成的Fv片段；(v)dAb片段(Ward等人,Nature[自然]341，544-546(1989))，其基本上有VH结构域组成并且也称为结构域抗体(Holt等人；Trends Biotechnol.[生物技术趋势]2003年11月；2i(ll):484-90)；(vi)骆驼抗体或纳米抗体(Revets等人；ExpertOpin Biol Ther.[生物疗法的专家意见]2005年1月；5_(l):l ll-24)以及(vii)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由分离基因编码，但是可以使用重组方法通过合成接头将它们连接，该合成接头使得它们能够成为单条蛋白链，在该单条蛋白链中VL区和VH区配对以形成单价分子(称为单链抗体或单链Fv(scFv)；参见例如，Bird等人,Science[科学]242，423-426(1988)和Huston等人,PNAS USA 85,5879-5883(1988))。在此进一步讨论在本发明的背景下的这些和其他有用抗体片段。还应理解的是，除非另外指明，否则术语抗体还包括抗体样多肽，如通过任何已知技术(如酶促切割、肽合成和重组技术)提供的嵌合抗体和人源化抗体以及保留与抗原特异性结合能力的抗体片段(抗原结合片段)。这样产生的抗体可以具有任何同种型。如在此使用的，“同种型”是指由重链恒定区基因编码的免疫球蛋白类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)。使用本领域的普通技术人员已知的常规技术获得这类抗体片段；可以按与完整抗体相同的方式针对实用性容易地对能够与希望的表位结合的合适片段进行筛选。

抗体GM37、37或GM37wt(在本文中可互换使用)旨在意指抗体或其抗原结合片段，它们包含如在SEQ ID No 1-3中给出的重链CDR1-3和如在SEQ ID No 4-6中给出的轻链CDR1-3或由其组成。

GM37的变体1、2和3与GM37的不同之处在于如下给出的重链中的CDR 2序列：

GM37变体1重链CDR2 SEQ ID NO:33

GM37变体2重链CDR2 SEQ ID NO:34

GM37变体3重链CDR2 SEQ ID NO:35

抗体GM285或IgG-6004-285(在本文中可互换使用)旨在意指抗体或其抗原结合片段，它们包含如在SEQ ID No 20-22中给出的重链CDR1-3和如在SEQ ID No 23-25中给出的轻链CDR1-3或由其组成。

抗体GM63或63(在本文中可互换使用)旨在意指抗体或其抗原结合片段，它们包含如在SEQ ID No 51-53中给出的重链CDR1-3和如在SEQ ID No 54-56中给出的轻链CDR1-3或由其组成。

抗体9E4旨在意指抗体或其抗原结合片段，它们包含如在SEQ ID No 44-46中给出的重链CDR1-3和如在SEQ ID No 47-49中给出的轻链CDR1-3或由其组成。

抗体2E6或m2E6旨在意指抗体或其抗原结合片段，它们包含如在SEQ ID No 62-64中给出的重链CDR1-3和如在SEQ ID No 65-67中给出的轻链CDR1-3或由其组成。

2E6的变体，即ch2E6和2E6-HLD1、2或3与2E6相比，区别在于CDR区外的其重链和轻链。

ch2E6包含重链SEQ ID NO:70或由其组成，并且

包含轻链SEQ ID NO:71或由其组成。

2E6-HLD-1包含重链SEQ ID NO:72或由其组成，并且

包含轻链SEQ ID NO:73或由其组成。

2E6-HLD-2包含重链SEQ ID NO:74或由其组成，并且

包含轻链SEQ ID NO:75或由其组成。

2E6-HLD-2包含重链SEQ ID NO:76或由其组成，并且包含轻链SEQ ID NO:77或由其组成。

亲和力成熟形式的HLD1：7A10、5A1、9D7、9G11、7C4、L3、8D9、9C12或6B6与2E6相比，区别在于如在序列表和权利要求书中定义的其CDR区。

抗体“’6B6”旨在意指由轻链SEQ ID NO 120和重链SEQ ID NO 121组成的抗体。

抗体“5A1”旨在意指由轻链SEQ ID NO 104和重链SEQ ID NO 105组成的抗体。

抗体“9D7”旨在意指由轻链SEQ ID NO 106和重链SEQ ID NO 107组成的抗体。

抗体“9G11”旨在意指由轻链SEQ ID NO 108和重链SEQ ID NO 109组成的抗体。

抗体“L3”旨在意指由轻链SEQ ID NO 112和重链SEQ ID NO 113组成的抗体。

抗体“7A10”旨在意指由轻链SEQ ID NO 114和重链SEQ ID NO 115组成的抗体。

抗体“8D9”旨在意指由轻链SEQ ID NO 116和重链SEQ ID NO 117组成的抗体。

抗体“9C12”旨在意指由轻链SEQ ID NO 118和重链SEQ ID NO 119组成的抗体。

抗体“7C4”旨在意指由轻链SEQ ID NO 110和重链SEQ ID NO 111组成的抗体。

除非在此另外指明，否则该区中的氨基酸残基编号是根据IMGT进行的，参见Sequences of Proteins of Immunological Interest[免疫学关注的蛋白质序列],第5版,Public Health Service[公共卫生服务],National Institutes of Health[美国国立卫生研究院],贝塞斯达,马里兰州,(1991)。

上述抗体可以用于治疗患有阿尔茨海默氏病的患者或患有τ蛋白病变的患者，所述τ蛋白病变例如：嗜银颗粒痴呆(AGD)；精神病，特别是因AD导致的精神病或患有AD的患者中的精神病；患有路易体痴呆症的患者的精神病症状；进行性核上性麻痹(PSP)；额颞痴呆(FTD或其变体)；TBI(急性或慢性创伤性脑损伤)；皮质基底节变性(CBD)；皮克病；原发性年龄相关性τ蛋白病变(PART)；神经原纤维缠结为主型老年性痴呆；拳击员痴呆；慢性创伤性脑病；中风；中风恢复；与帕金森氏病相关的神经变性；与染色体关联的帕金森综合征；利缇可-伯蒂格病(关岛型帕金森氏病-痴呆复合征)；神经节胶质瘤和神经节细胞瘤；脑膜血管瘤病；脑炎后帕金森综合征；亚急性硬化性全脑炎；亨廷顿氏病；铅中毒脑病；结节性硬化症；哈勒沃登-施帕茨病以及脂褐质沉积症。更典型地，该τ蛋白病变选自下组，该组由以下组成：阿尔茨海默氏病；嗜银颗粒痴呆(AGD)；精神病，特别是因AD导致的精神病或患有AD的患者中的精神病；患有路易体痴呆症的患者的精神病症状；进行性核上性麻痹(PSP)；额颞痴呆(FTD或其变体)；TBI(急性或慢性创伤性脑损伤)；皮质基底节变性(CBD)；以及皮克病。

“抗α-突触核蛋白”抗体是特异性结合至α-突触核蛋白或α-突触核蛋白片段的抗体。

如在此使用的，术语“人抗体”旨在包括具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可以包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，在体外通过随机或位点特异性诱变或在基因重排期间或在体内通过体细胞突变引入的突变)。

如在此使用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指单分子组合物的抗体分子制剂。单克隆抗体组合物对特定表位显示单一的结合特异性和亲和力。

本发明的这些抗体及其α-突触核蛋白表位结合片段将优选是“人源化”的，特别是当被采用以用于治疗目的时。术语“人源化的”是指通常使用重组技术制备的具有衍生自来自非人物种的免疫球蛋白的抗原结合位点和基于人免疫球蛋白的结构和/或序列的剩余免疫球蛋白结构的嵌合分子。抗原结合位点可以包含融合至人恒定域的完全非人抗体可变域或仅包含接枝到人可变域的适当人框架区的此类可变域的互补决定区(CDR)。此类人源化分子的框架残基可以是野生型的(例如，全人的)或者它们可以被修饰成包含一种或多种未在其序列已经充当人源化的基础的人抗体中发现的氨基酸取代。人源化减小或消除该分子的恒定区充当人个体中的免疫原的可能性，但是仍存在对外源可变区做出免疫应答的可能性(LoBuglio,A.F.等人(1989)“Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man:Kinetics And Immune Response[人体内的小鼠/人嵌合单克隆抗体：动力学与免疫应答]”,Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)[美国国家科学院院刊]86:4220-4224)。另一种方法不仅集中于提供人衍生的恒定区，还集中于修饰可变区以便将它们改造成尽可能接近人形式。已知的是，重链和轻链两者的可变区都含有三个互补决定区(CDR)，它们响应于所讨论的抗原而改变并且决定结合能力，其侧翼为四个框架区(FR)，这些框架区在给定物种中是相对保守的并且推定为CDR提供支架。当相对于特定抗原制备非人抗体时，可以通过在有待修饰的人抗体中存在的FR上接枝衍生自非人抗体的CDR来“改造”或“人源化”可变区。已经由Sato,K.等人(1993)Cancer Res[癌症研究]53:851-856；Riechmann,L.等人(1988)“Reshaping Human Antibodies for Therapy[改造治疗用的人抗体]”,Nature[自然]332:323-327；Verhoeyen,M.等人(1988)“Reshaping Human Antibodies:Grafting AnAntilysozyme Activity[改造人抗体：接枝抗溶菌酶活性]”,Science[科学]239:1534-1536；Kettleborough,C.A.等人(1991)“Humanization Of A Mouse Monoclonal AntibodyBy CDR-Grafting:The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation[通过CDR-接枝人源化小鼠单克隆抗体：框架残基在环构象中的重要性]”,ProteinEngineering[蛋白质工程]4:773-3783；Maeda,H.等人(1991)“Construction Of ReshapedHuman Antibodies With HIV-Neutralizing Activity[具有HIV中和活性的经改造的人抗体的构建]”,Human Antibodies Hybridoma[人抗体杂交瘤]2:124-134；Gorman,S.D.等人(1991)“Reshaping A Therapeutic CD4Antibody[改造治疗性CD4抗体]”,Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)[美国国家科学院院刊]88:4181-4185；Tempest,P.R.等人(1991)“Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human RespiratorySyncytial Virus Infection in vivo[改造人单克隆抗体以抑制体内人呼吸道合胞病毒感染]”,Bio/Technology[生物/技术]9:266-271；Co,M.S.等人(1991)“HumanizedAntibodies For Antiviral Therapy[抗病毒治疗用的人源化抗体]”,Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)[美国国家科学院院刊]88:2869-2873；Carter,P.等人(1992)“Humanization Of An Anti-p185her2Antibody For Human Cancer Therapy[人癌症治疗用的抗p185her2抗体的人源化]”,Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)[美国国家科学院院刊]89:4285-4289；以及Co,M.S.等人(1992)“Chimeric And Humanized AntibodiesWith Specificity For The CD33Antigen[对CD33抗原具有特异性的嵌合和人源化抗体]”,J.Immunol.[免疫学杂志]148:1149-1154报道了这种方法在各种抗体中的应用。在一些实施例中，人源化抗体保留所有CDR序列(例如，含有来自小鼠抗体的所有六个CDR的人源化小鼠抗体)。在其他实施例中，人源化抗体具有一个或多个CDR(一个、两个、三个、四个、五个、六个)，它们相对于原始抗体是改变的，它们还被称为一个或多个“衍生自”来自原始抗体的一个或多个CDR的CDR。人源化抗原的能力是众所周知的(参见例如，美国专利号5,225,539；5,530,101；5,585,089；5,859,205；6,407,213；6,881,557)。

如在此使用的，抗体或其表位结合抗原结合片段被说成“免疫特异性地”结合另一分子的区域(即，表位)，如果它相对于替代表位与该表位更加频繁地、更加快速地、以更长的持续时间和/或以更大的亲和力或亲合力反应或缔合的话。通过阅读本定义还应理解，例如，特异性地结合至第一靶标的抗体或其表位结合抗原结合片段可以或可以不特异性地或优先地结合至第二靶标。如在此使用的，在抗体与预定抗原结合的背景下，术语“结合”典型地是指以对应于约10^-7M或更小(如约10^-8M或更小、如约10^-9M或更小)的KD的亲和力结合，当用抗原作为配体并且抗体作为分析物在BIAcore 3000仪器中通过例如表面等离子体共振(SPR)技术确定时，并且以对应于以下KD的亲和力结合到预定抗原，该KD比该抗体对与除预定抗原或紧密相关抗原之外的非特异性抗原(例如，BSA、酪蛋白)结合的亲和力低至少十倍，如低至少100倍、例如低至少1,000倍、如低至少10,000倍、例如低至少100,000倍。使亲和力更低的量依赖于抗体的KD，从而当抗体的KD非常低时(即抗体是高度特异性的)，则使针对抗原的亲和力低于针对非特异性抗原的亲和力的量可以是至少10,000倍。

如在此使用的，术语“kd”(秒-1或1/s)是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率常数。所述值又称为koff值。

如在此使用的，术语“ka”(M-1x秒-1或1/M)是指特定抗体-抗原相互作用的缔合速率常数。

如在此使用的，术语“KD”(M)是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。

如在此使用的，术语“KA”(M-1或1/M)是指特定抗体-抗原相互作用的缔合平衡常数并且通过ka除以kd获得。

在一些抗体中，仅需CDR的一部分(即结合所需的CDR残基亚群，称为SDR)在人源化抗体中保持结合。可以通过分子建模和/或凭经验或者如在Gonzales,N.R.等人,(2004)“SDR Grafting Of A Murine Antibody Using Multiple Human Germline Templates ToMinimize Its Immunogenicity[使用多个人种系模板对鼠类抗体进行SDR接枝以最小化其免疫原性]”,Mol.Immunol.[分子免疫学]41:863-872中所述的，基于先前研究(例如CDR H2中的残基H60-H65通常是不需要的)从位于Chothia超变环外的卡巴特CDR区域(参见，Kabat等人,(1992)Sequences of Proteins of Immunological Interest[免疫学关注的蛋白质序列],National Institutes of Health[美国国立卫生研究院],公开号91-3242；Chothia,C.等人,(1987)“Canonical Structures For The Hypervariable Regions OfImmunoglobulins[免疫球蛋白的超变区的典型结构]”,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]196:901-917)中鉴定不接触抗原并且不在SDR中的CDR残基。在此类人源化抗体中，在一个或多个供体CDR残基不存在或整个供体CR被省略的位置处，占据该位置的氨基酸可以是在受体抗体序列中占据相应位置(通过Kabat编号)的氨基酸。在所包含的CDR中受体对供体氨基酸的这样的取代的数目反映了竞争考虑的平衡。这样的取代在降低人源化抗体中的小鼠氨基酸的数目方面并且因此在降低潜在的免疫原性方面是潜在有利的。然而，取代还可以引起亲和力变化，并且优选避免亲和力的显著减少。还可以凭经验选择CDR内的取代位置和待取代的氨基酸。

CDR残基的单个氨基酸改变可以导致失去功能性结合的事实(Rudikoff,S.等(1982)“Single Amino Acid Substitution Altering Antigen-Binding Specificity[改变抗原结合特异性的单个氨基酸取代]”,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)[美国国家科学院院刊]79(6):1979-1983)提供了用于系统地鉴定可替代的功能性CDR序列的手段。在一种用于获得此类变体CDR的优选方法中，将编码CDR的多核苷酸诱变(例如经由随机诱变或通过位点定向方法(例如，用编码突变座位的引物进行聚合酶链式介导的扩增))以产生具有取代的氨基酸残基的CDR。通过比较原始(功能性)CDR序列中的相关残基的身份与取代的(非功能性)变体CDR序列的身份，可以鉴定出该取代的BLOSUM62.iij取代得分。BLOSUM系统提供了通过分析受信任的比对的序列的数据库而创建的氨基酸取代的矩阵(Eddy,S.R.(2004)“Where Did The BLOSUM62Alignment Score Matrix Come From？[BLOSUM62比对分数矩阵来自哪里？]”,Nature Biotech.[自然生物技术]22(8):1035-1036；Henikoff,J.G.(1992)“Amino acid substitution matrices from protein blocks[来自蛋白质块的氨基酸取代矩阵]”,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)[美国国家科学院院刊]89:10915-10919；Karlin,S.等人(1990)“Methods For Assessing The Statistical Significance Of MolecularSequence Features By Using General Scoring Schemes[用于通过使用一般评分方案评估分子序列特征的统计学显著性的方法]”),Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)[美国国家科学院院刊]87:2264-2268；Altschul,S.F.(1991)“Amino Acid Substitution Matrices FromAn Information Theoretic Perspective[从信息理论角度的氨基酸取代矩阵]”,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]219,555-565。目前，最先进的BLOSUM数据库是BLOSUM62数据库(BLOSUM62.iij)。表1呈现了BLOSUM62.iij取代得分(得分越高取代越保守，并且因此更加可能地，该取代将不会影响功能)。如果包含所得CDR的抗原结合片段不能结合到ROR1，例如，则BLOSUM62.iij取代得分被认为是不充分保守的，并且选择且产生新的具有更高取代得分的候选取代。因此，例如，如果原始残基是谷氨酸(E)并且非功能性取代残基是组氨酸(H)，则BLOSUM62.iij取代得分将为0，并且更保守的变化(如变为天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或赖氨酸)是优选的。

本发明因此考虑了随机诱变用于鉴定改进的CDR的用途。在本发明的背景下，保守取代可以由反映在以下三个表中的一个或多个中的氨基酸类别内的取代定义：

保守取代的氨基酸残基类别：

替代性保守氨基酸残基取代类别：

氨基酸残基的替代性物理和功能分类：

更保守的取代分组包括：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸以及天冬酰胺-谷氨酰胺。

另外组的氨基酸还可以使用描述于例如Creighton(1984)Proteins:Structureand Molecular Properties[蛋白质：结构和分子特性](第2版1993),W.H.弗里曼公司(W.H.Freeman and Company)中的原则来配制。

噬菌体展示技术可以可替代地用于增加(或降低)CDR亲和力。被称为亲和力成熟的这种技术采用诱变或“CDR步移”并且重选择使用靶抗原或其抗原性抗原结合片段来鉴定具有如下CDR的抗体，这些CDR当与初始抗体或亲本抗体相比时以更高(或更低)亲和力结合到抗原(参见例如，Glaser等人(1992)J.Immunology[免疫学杂志]149:3903)。诱变整个密码子而不是单个核苷酸产生氨基酸突变的半随机谱。可构建由一组变体克隆所组成的库，每一克隆都在单个CDR中相差单个氨基酸改变，并且这些克隆包含代表了每个CDR残基的每个可能氨基酸取代的变体。可通过使固定化突变体与标记的抗原相接触来筛选对抗原的结合亲和力增加(或减少)的突变体。本领域中已知的任何筛选方法(例如ELISA)可以用于鉴定对抗原具有增加或降低的亲和力的突变体抗体(参见Wu等人1998,Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)[美国国家科学院院刊]95:6037；Yelton等人,1995,J.Immunology[免疫学杂志]155:1994)。可以可能地使用使轻链随机化的CDR步移(参见例如Schier等人,1996,J.Mol.Bio.[分子生物学杂志]263:551)。

用于完成此类亲和力成熟的方法描述于以下中，例如：Krause,J.C.等人(2011)“An Insertion Mutation That Distorts Antibody Binding Site ArchitectureEnhances Function Of A Human Antibody[扭曲抗体结合位点构造的插入突变增强了人类抗体的功能]”,MBio.2(1)pii:e00345-10.doi:10.1128/mBio.00345-10；Kuan,C.T.等人(2010)“Affinity-Matured Anti-Glycoprotein NMB Recombinant ImmunotoxinsTargeting Malignant Gliomas And Melanomas[靶向恶性胶质瘤和黑色素瘤的亲和力成熟的抗糖蛋白NMB重组免疫毒素]”,Int.J.Cancer[国际癌症杂志]10.1002/ijc.25645；Hackel,B.J.等人(2010)“Stability And CDR Composition Biases Enrich BinderFunctionality Landscapes[稳定性和CDR组成偏移丰富了结合物功能景观]”,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]401(1):84-96；Montgomery,D.L.等人(2009)“AffinityMaturation And Characterization Of A Human Monoclonal Antibody Against HIV-1gp41[针对HIV-1gp41的人类单克隆抗体的亲和力成熟和表征]”,MAbs[单克隆抗体]1(5):462-474；Gustchina,E.等人(2009)“Affinity Maturation By TargetedDiversification Of The CDR-H2Loop Of A Monoclonal Fab Derived From ASyntheticHuman Antibody Library And Directed Against The InternalTrimeric Coiled-Coil Of Gp41Yields A Set Of Fabs With Improved HIV-1Neutralization Potency And Breadth[通过源自合成原初人类抗体文库并且针对Gp41的内部三聚卷曲螺旋的单克隆Fab的CDR-H2环的靶向多样化的亲和力成熟产生了一组具有改进的HIV-1中和效力和幅度的Fab]”,Virology[病毒学]393(1):112-119；Finlay,W.J.等人(2009)“Affinity Maturation Of A Humanized Rat Antibody For Anti-RAGETherapy:Comprehensive Mutagenesis Reveals A High Level Of MutationalPlasticity Both Inside And Outside The Complementarity-Determining Regions[用于抗RAGE疗法的人源化大鼠抗体的亲和力成熟：全面诱变揭示在互补决定区内外同时存在的高水平的突变可塑性]”,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]388(3):541-558；Bostrom,J.等人(2009)“Improving Antibody Binding Affinity And Specificity For TherapeuticDevelopment[改进抗体结合亲和力和特异性用于治疗开发]”,Methods Mol.Biol.[分子生物学方法],525:353-376；Steidl,S.等人(2008)“In Vitro Affinity Maturation OfHuman GM-CSF Antibodies By Targeted CDR-Diversification[通过靶向的CDR多样化的人类GM-CSF抗体的体外亲和力成熟]”,Mol.Immunol.[分子免疫学]46(1):135-144；和Barderas,R.等人(2008)“Affinity Maturation Of Antibodies Assisted By In SilicoModeling[通过计算机建模辅助的抗体的亲和力成熟]”,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)[美国国家科学院院刊]105(26):9029-9034。

因此，所包含的抗体或其表位结合片段的CDR变体的序列可以通过取代而不同于亲本抗体的CDR的序列；例如取代的4个氨基酸残基、3个氨基酸残基、2个氨基酸残基或氨基酸残基中的1个。此外，根据本发明的实施例，设想的是，CDR区中的氨基酸可以用保守取代进行取代，如在以下3个表中所定义的。例如，酸性残基Asp可以被Glu取代而不会实质性地影响该抗体的结合特征。

术语“表位”意指能够免疫特异性结合抗体的抗原决定簇。表位通常由如氨基酸或糖侧链分子的表面基团组成，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。构象表位和非构象表位的区别在于，在变性溶剂的存在下，对构象表位(而不是非构象表位)的结合丧失。表位可以包含直接涉及结合的氨基酸残基(也称为表位的免疫显性组分)以及其他没有直接涉及结合的氨基酸残基，如被特异性抗原结合肽有效阻断的氨基酸残基(换言之，该氨基酸残基在特异性抗原结合肽的足迹之内)。

术语“转基因非人动物”是指具有包含一个或多个人重链和/或轻链转基因或转染色体(整合或未整合进动物的天然基因组DNA)的基因组并且能够表达全人抗体的非人动物。例如，转基因小鼠可以具有人类轻链转基因和人类重链转基因或人类重链转染色体，这样使得当用α-突触核蛋白抗原和/或表达α-突触核蛋白的细胞免疫时，该小鼠产生人抗α-突触核蛋白抗体。人类重链转基因可以被整合进小鼠的染色体DNA中，转基因小鼠就是这样，例如HuMAb小鼠，如HCo7或HCol2小鼠，或者人类重链转基因可以被维持在染色体外，如描述于WO 02/43478中的转染色体KM小鼠就是这样。这样的转基因和转染色体小鼠(在此统称为“转基因小鼠”)通过经历V-D-J重组和同种型转换能够产生多种针对给定抗原的人单克隆抗体同种型(如IgG、IgA、IgM、IgD和/或IgE)。

转基因非人动物还可以通过引入编码这样的特异性抗体的基因(例如通过将这些基因可操作地连接至在该动物的乳中表达的基因)而用于产生针对特定抗原的抗体。

如在此使用的术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”意指改善、减缓或逆转疾病或障碍的进展或严重性，或者改善、减缓或逆转这种疾病或障碍的一种或多种症状或副作用。出于本发明的目的，“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”另外意指用于获得有益的或希望的临床结果的方法，其中“有益的或希望的临床结果”包括但不限于症状的缓解、障碍或疾病程度的减小、稳定化的(即没有恶化的)疾病或障碍状态、疾病或障碍状态进展的延缓或减缓、疾病或障碍状态的改善或减轻以及疾病或障碍的缓解，不论是部分地或全部地、可检出的或不可检出的。

当应用于本发明的抗体时，“有效量”是指以所需剂量并且持续所需时间段足以达到预期生物效应或希望的治疗结果(包括但不限于临床结果)的量。当应用于本发明的抗体时，短语“治疗有效量”旨在表示抗体足以改善、减轻、稳定、逆转、减慢或延缓障碍或疾病状态的进展、或者该障碍或疾病的症状的进展的量。在一个实施例中，本发明的方法提供了抗体与其他化合物组合的给予。在此类情况下，“有效量”是足以引起预期的生物效应的该组合的量。

抗α-突触核蛋白抗体的治疗有效量可以根据以下因素而变化，如个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及抗α-突触核蛋白抗体在个体中引起希望的应答的能力。治疗有效量还是抗体或抗体部分的有益治疗效果超过其任何毒性或有害效果的量。

如以上指出，本发明特别涉及单克隆抗体，该单克隆抗体能免疫特异性地结合到人α-突触核蛋白的氨基酸110-140内的表位。在一个实施例中，该抗体能与抗体GM37竞争结合α-突触核蛋白的112-117表位。在另一个实施例中，该抗体能与抗体GM285竞争结合α-突触核蛋白的112-115表位。在另一个实施例中，该抗体能与抗体GM63竞争结合α-突触核蛋白的126-138表位。在另一个实施例中，该抗体能与抗体2E6竞争结合α-突触核蛋白的126-140表位。在又另一个实施例中，该抗体能与抗体9E4竞争结合α-突触核蛋白的118-126表位。

该抗体优选是人或人源化抗体。

在权利要求中进一步定义本发明的抗体。

本发明还提供了一种降低患者中τ蛋白缠结形成的方法，该方法包括向需要这种治疗的患者给予治疗有效量的本发明的抗体。

此外，抗体可以与药学上可接受的载体、稀释剂和/或稳定剂一起处于组合物中。本发明的抗体可以在疗法中使用。特别地，本发明的抗体可以在治疗τ蛋白病变中使用。典型地，该τ蛋白病变选自下组，该组由以下组成：阿尔茨海默氏病；嗜银颗粒痴呆(AGD)；精神病，特别是因AD导致的精神病或患有AD的患者中的精神病；患有路易体痴呆症的患者的精神病症状；进行性核上性麻痹(PSP)；额颞痴呆(FTD或其变体)；TBI(急性或慢性创伤性脑损伤)；皮质基底节变性(CBD)；皮克病；原发性年龄相关性τ蛋白病变(PART)；神经原纤维缠结为主型老年性痴呆；拳击员痴呆；慢性创伤性脑病；中风；中风恢复；与帕金森氏病相关的神经变性；与染色体关联的帕金森综合征；利缇可-伯蒂格病(关岛型帕金森氏病-痴呆复合征)；神经节胶质瘤和神经节细胞瘤；脑膜血管瘤病；脑炎后帕金森综合征；亚急性硬化性全脑炎；亨廷顿氏病；铅中毒脑病；结节性硬化症；哈勒沃登-施帕茨病以及脂褐质沉积症。更典型地，该τ蛋白病变选自下组，该组由以下组成：阿尔茨海默氏病；嗜银颗粒痴呆(AGD)；精神病，特别是因AD导致的精神病或患有AD的患者中的精神病；患有路易体痴呆症的患者的精神病症状；进行性核上性麻痹(PSP)；额颞痴呆(FTD或其变体)；TBI(急性或慢性创伤性脑损伤)；皮质基底节变性(CBD)；以及皮克病。具体地，该τ蛋白病变可以选自阿尔茨海默氏病、嗜银颗粒痴呆(AGD)、因AD导致的精神病或患有AD的患者中的精神病、患有路易体痴呆症的患者的精神病症状。

该治疗可以是长期的并且患者可以接受至少2周(如至少持续1个月、6个月、1年或更久)治疗。

本发明的抗体可以例如是通过杂交瘤方法产生的单克隆抗体，该方法首次由Kohler等人,Nature[自然]256,495(1975)进行描述，或者可以是通过重组DNA方法产生的单克隆抗体。还可以使用例如在Clackson等人,Nature[自然]352,624-628(1991)和Marks等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]222,581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体展示文库中分离单克隆抗体。单克隆抗体可以从任何合适的来源获得。因此，例如，单克隆抗体可以从制备自鼠类脾脏B淋巴细胞的杂交瘤获得，这些淋巴细胞获得自用目的抗原或编码目的抗原的核酸免疫的小鼠，例如，这些淋巴细胞处于在表面表达该抗原的细胞的形式。单克隆抗体还可以从来源于免疫的人的或非人哺乳动物(如大鼠、兔、狗、绵羊、山羊、灵长类动物等)的表达抗体的细胞的杂交瘤获得。

在一个实施例中，本发明的抗体是人抗体。可以使用携带部分人免疫系统而非小鼠系统的转基因或转染色体小鼠产生针对α-突触核蛋白的人单克隆抗体。此类转基因和转染色体小鼠包括分别在本文中称为HuMAb小鼠和KM小鼠的小鼠，并且在本文中统称为“转基因小鼠”。

HuMAb小鼠含有人免疫球蛋白基因微基因座连同定向突变，该微座位编码非重排人重链可变和恒定(μ和Y)以及轻链可变和恒定(K)免疫球蛋白序列，这些定向突变使内源μ和K链基因座失活(Lonberg,N.等人,Nature[自然]368,856-859(1994))。因此，此类小鼠展示出小鼠IgM或IgK的表达减少，并且响应于免疫，所引入的人类重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变以产生高亲和力人类IgG、κ单克隆抗体(Lonberg,N.等人(1994)，同上；评论于Lonberg,N.,Handbook of Experimental Pharmacology[实验药物学手册]113,49-101(1994)中；Lonberg,N.和Huszar,D.,Intern.Rev.Immunol.[国际免疫学评论]第13卷65-93(1995)，以及Harding,F.和Lonberg,N.,Ann.N.Y.Acad.Sci.[纽约科学院年刊]764536-546(1995))。HuMAb小鼠的制备详细描述于Taylor,L.等人,Nucleic Acids Research[核酸研究]20,6287-6295(1992)；Chen,J.等人,International Immunology[国际免疫学]5,647-656(1993)；Tuaillon等人,J.Immunol.[免疫学杂志]152,2912-2920(1994)；Taylor,L.等人,International Immunology[国际免疫学]6,579-591(1994)；Fishwild,D.等人,Nature Biotechnology[自然生物技术]14,845-851(1996)。还参见US 5,545,806、US5,569,825、US 5,625,126、US 5,633,425、US 5,789,650、US 5,877,397、US 5,661,016、US5,814,318、US 5,874,299、US 5,770,429、US 5,545,807、WO 98/24884、WO 94/25585、WO93/1227、WO 92/22645、WO 92/03918以及WO 01/09187。

Hco7小鼠在其内源轻链(κ)基因中具有JKD破坏(如描述于Chen等人,EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]12,821-830(1993))，在其内源重链基因中具有CMD破坏(如描述于WO 01/14424的实例1)，具有KCo5人κ轻链转基因(如描述于Fishwild等人,NatureBiotechnology[自然生物技术]14,845-851(1996))和HCo7人重链转基因(如描述于US 5,770,429)。

HCol2小鼠在其内源轻链(κ)基因中具有JKD破坏(如描述于Chen等人,EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]12,821-830(1993))，在其内源重链基因中具有CMD破坏(如描述于WO 01/14424的实例1)，具有KCo5人κ轻链转基因(如描述于Fishwild等人,NatureBiotechnology[自然生物技术]14,845-851(1996))和HCol2人重链转基因(如描述于WO01/14424的实例2)。

在KM小鼠品系中，内源小鼠κ轻链基因已经被同型结合地破坏，如描述于Chen等人,EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]12，811-820(1993)，并且内源小鼠重链基因已经被同型结合地破坏，如描述于WO 01/09187的实例1。这个小鼠品系携带人κ轻链转基因KCo5，如描述于Fishwild等人,Nature Biotechnology[]14,845-851(1996)中。这个小鼠品系还携带由染色体14片段hCF(SC20)构成的人重链转染色体，如描述于WO 02/43478中。

来自这些转基因小鼠的脾细胞可以用于根据熟知的技术产生分泌人单克隆抗体的杂交瘤。本发明的人单克隆抗体或者源于其他物种的本发明的抗体还可以通过产生对于目的免疫球蛋白重链和轻链序列而言转基因的另一非人哺乳动物或植物并且从其中产生可回收形式的抗体而转基因地产生。与哺乳动物中的转基因生产相结合，抗体可以从山羊、奶牛或其他哺乳动物的乳中产生和回收。参见例如US 5,827,690、US 5,756,687、US 5,750,172和US 5,741,957。

本发明的抗体可以具有任何同种型。同种型的选择典型地将由希望的效应子功能(如ADCC诱导)来指导。示例性同种型是IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。可以使用人轻链恒定区κ或λ中任一者。如果希望的话，可以通过已知方法转换本发明的抗α-突触核蛋白抗体的类别。例如，最初是IgM的本发明抗体可以类别转换为本发明的IgG抗体。此外，类别转换技术可以用来将一个IgG亚类转化成另一亚类，例如从IgGl到IgG2。因此，本发明的抗体的效应子功能可以通过同种型切换变为例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM抗体，用于各种治疗用途。在一个实施例中，本发明的抗体是IgG1抗体，例如IgG1,κ。

在一个实施例中，本发明的抗体是全长抗体，优选IgG抗体，特别是IgG1,κ抗体。在另一个实施例中，本发明的抗体是抗体片段或单链抗体。

抗体片段可以例如使用常规技术通过片段化来获得，并且按与如在此针对完整抗体描述的相同方式针对实用性对片段进行筛选。例如，F(ab')2片段可以通过用胃蛋白酶处理抗体而产生。可以处理所得F(ab')2片段，以减少二硫键，从而产生Fab'片段。Fab片段可以通过用木瓜蛋白酶处理IgG抗体而获得；Fab'片段可以用胃蛋白酶消化IgG抗体而获得。F(ab')片段还可以经由硫醚键或二硫键通过结合以下描述的Fab’而产生。Fab'片段是通过切割F(ab')2的铰链区的二硫键获得的抗体片段。Fab'片段可以通过用还原剂(如二硫苏糖醇)处理F(ab')2片段而获得。抗体片段还可以通过在重组细胞中表达编码此类片段的核酸而产生(参见例如Evans等人,J.Immunol.Meth.[免疫学方法杂志]184,123-38(1995))。例如，编码F(ab')2片段的一部分的嵌合基因可以包括编码H链的CH1结构域和铰链区的DNA序列，随后是翻译终止密码子，以产生这样一种截短的抗体片段分子。

在一个实施例中，抗α-突触核蛋白抗体是单价抗体，优选是具有铰链区缺失的单价抗体，如在WO 2007059782(将其通过引用以其全文并入本文)中所述。因此，在一个实施例中，抗体是单价抗体，其中所述抗α-突触核蛋白抗体通过以下方法构建，该方法包括：i)提供编码所述单价抗体的轻链的核酸构建体，所述构建体包含编码所选抗原特异性抗α-突触核蛋白抗体的VL区的核苷酸序列和编码Ig的恒定CL区的核苷酸序列，其中编码所选抗原特异性抗体的VL区的所述核苷酸序列和编码Ig的CL区的所述核苷酸序列被可操作地连接在一起，并且其中，在IgG1亚型的情况下，编码CL区的核苷酸序列已经被修饰，这样使得在多克隆人IgG的存在下或当给予给动物或人时，该CL区不含有能够与包含该CL区的相同氨基酸序列的其他肽形成二硫键或共价键的任何氨基酸；ii)提供编码所述单价抗体的重链的核酸构建体，所述构建体包含编码所选抗原特异性抗体的VH区的核苷酸序列和编码人Ig的恒定CH区的核苷酸序列，其中编码CH区的核苷酸序列已经被修饰，这样使得在多克隆人IgG的存在下或当给予给动物、人时，对应于铰链区的区域和(如由Ig亚型所要求的)CH区的其他区域(如CH3区)不包含参与和包含人Ig的CH区的相同氨基酸序列的其他肽形成二硫键或共价或稳定的非共价重链间键的任何氨基酸残基，其中编码所选抗原特异性抗体的VH区的所述核苷酸序列和编码所述Ig的CH区的所述核苷酸序列被可操作地连接在一起；iii)提供用于产生所述单价抗体的细胞表达系统；iv)通过在(iii)的细胞表达系统的细胞中共表达(i)和(ii)的核酸构建体来产生所述单价抗体。

类似地，在一个实施例中，抗α-突触核蛋白抗体是单价抗体，其包含：

(i)如在此描述的本发明抗体的可变区或所述区的抗原结合部分，以及

(ii)免疫球蛋白的CH区或其包含CH2和CH3区的抗原结合片段，其中该CH区或其抗原结合片段已经被修饰，这样使得对应于铰链区的区域和(如果该免疫球蛋白不是IgG4亚型的话)CH区的其他区域(如CH3区)不包含能够与相同CH区形成二硫键或在多克隆人IgG的存在下与相同CH区形成其他共价或稳定的非共价重链间键的任何氨基酸残基。

在一个另外的实施例中，单价α-突触核蛋白抗体的重链已经被修饰，这样使得已经缺失整个铰链。

在另一个另外的实施例中，所述单价抗体的序列已经被修饰，这样使得它不包含用于N-连接的糖基化的任何受体位点。

本发明的抗α-突触核蛋白抗体还包括单链抗体。单链抗体是其中重链和轻链Fv区相连的肽。在一个实施例中，本发明提供了单链Fv(scFv)，其中本发明的抗α-突触核蛋白抗体的Fv中的重链和轻链由柔性肽接头(典型地为约10、12、15或更多个氨基酸残基)连接成单条肽链。产生此类抗体的方法描述于例如US 4,946,778；Pluckthun,在ThePharmacology of Monoclonal Antibodies[单克隆抗体药理学],第113卷,Rosenburg和Moore编辑,施普林格出版公司(Springer-Verlag),纽约,第269-315页(1994)；Bird等人,Science[科学]242,423-426(1988)；Huston等人,PNAS USA 85,5879-5883(1988)和McCafferty等人,Nature[自然]348,552-554(1990)。单链抗体可以是单价的，如果仅使用单个VH和VL的话；可以是二价的，如果使用两个VH和VL的话；或可以是多价的，如果使用两个以上VH和VL的话。

通常，可以通过包含任何合适数目的经修饰的氨基酸和/或与此类偶联取代基缔合来修饰在此描述的抗α-突触核蛋白抗体。在此背景下，适合性通常由至少基本上保留与非衍生化亲本抗α-突触核蛋白抗体相关的α-突触核蛋白选择性和/或α-突触核蛋白特异性的能力决定。一个或多个经修饰的氨基酸的包含在例如增加多肽血清半衰期、降低多肽抗原性或增加多肽储存稳定性中可以是有利的。对一种或多种氨基酸进行修饰，例如，在重组产生的过程中与翻译同时进行或在翻译之后进行(例如，在哺乳动物细胞中表达过程中在N-X-S/T基序上的N-连接的糖基化作用)，或通过合成手段进行修饰。经修饰的氨基酸的非限制性实例包括糖基化的氨基酸、硫酸化的氨基酸、异戊二烯化(例如，法尼基化、香叶基-香叶基化(geranylgeranylated))的氨基酸、乙酰化的氨基酸、酰化的氨基酸、聚乙二醇化的氨基酸、生物素酰化的氨基酸、羧基化的氨基酸、磷酸化的氨基酸等。足够指导技术人员进行氨基酸修饰的参考在整个文献中相当充分。实例方案可见于Walker(1998)ProteinProtocols on CD-Rom[关于CD-Rom的蛋白质方案]胡玛纳出版社(Humana Press),托瓦塔(Towata),新泽西州(NJ)。经修饰的氨基酸可以例如选自糖基化的氨基酸、聚乙二醇化的氨基酸、法尼基化的氨基酸、乙酰化的氨基酸、生物素酰化的氨基酸、偶联到脂质部分的氨基酸或偶联到有机衍化剂的氨基酸。

抗α-突触核蛋白抗体还可以通过共价偶联到聚合物而化学地修饰，以例如增加其循环半衰期。示例性聚合物以及将它们附接到肽的方法说明于例如US 4,766,106；US 4,179,337；US 4,495,285和US 4,609,546中。另外的说明性聚合物包括聚氧乙基化的多元醇和聚乙二醇(PEG)(例如，分子量在约1,000与约40,000之间，如在约2,000与约20,000之间，例如约3,000-12,000g/mol的PEG)。

在一个方面中，本发明涉及药物组合物，其包含：

-如本文定义的抗α-突触核蛋白抗体，以及

-药学上可接受的载体。

这些药物组合物可以用药学上可接受的载体或稀释剂以及任何其他已知的佐剂和赋形剂根据常规技术配制，这些常规技术是例如在以下中披露的那些：Remington:TheScience and Practice of Pharmacy[雷明顿：药学科学与实践],第21版,Gennaro编,马克出版公司(Mack Publishing Co.),伊斯顿(Easton),宾夕法尼亚州(PA),2005。

药学上可接受的载体或稀释剂连同任何其他已知的佐剂和赋形剂应该适合于本发明的所选化合物和所选给予方式。基于就抗原结合而言对本发明的所选化合物或药物组合物的所希望的生物特性的显著不利影响的缺少(例如，小于实质性影响(10％或更少相对抑制、5％或更少相对抑制等))来确定药物组合物的载体和其他组分的适合性。

本发明的药物组合物还可以包括稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、洗涤剂(例如，非离子型洗涤剂(如吐温-20或吐温-80)、稳定剂(例如，无糖或无蛋白氨基酸)、防腐剂、组织固定剂、增溶剂、和/或其他适合用于包含于药物组合物中的材料。以不影响组合物的生物活性为目的来选择稀释剂。此类稀释剂的实例为蒸馏水、生理磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液和汉克氏溶液。此外，药物组合物或配制品还可以包含其他载体，或无毒的、非治疗性的、非免疫原性的稳定剂等。组合物还可以包含大的、缓慢代谢的大分子，如蛋白质、多糖(像壳聚糖)、聚乳酸、聚乙醇酸和共聚物(例如，乳胶功能化的交联琼脂糖、琼脂糖、纤维素等)、聚合氨基酸、氨基酸共聚物以及脂质聚集体(例如，油滴或脂质体)。

本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以变化，以获得对于特定患者、组合物和给予方式而言有效实现所希望的治疗应答的活性成分量。所选的剂量水平将取决于多种药代动力学因素，包括所采用的本发明具体组合物或其酰胺的活性，给予途径，给予时间，所采用的具体化合物的排泄速率，治疗持续时间，与所采用的具体组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料，所治疗患者的年龄、性别、体重、病情、一般健康状况和既往病史以及医学领域熟知的类似因素。

药物组合物可以通过任何适合的途径和方式给予，包括：用于预防性和/或治疗性治疗的胃肠外、局部、口服或鼻内手段。在一个实施例中，胃肠外地给予本发明的药物组合物。如在此使用的短语“胃肠外给予(parenteral administration)”和“胃肠外地给予(administered parenterally)”意指除肠内和局部给予之外的给予方式，通常是通过注射，并且包括表皮、静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心内、真皮内、腹膜内、腱内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、椎管内、颅内、胸腔内、硬膜外以及胸骨内注射和输注。

在体内和体外给予本发明的化合物的另外的合适途径是本领域中熟知的，并且可以由本领域普通技术人员选择。

在一个实施例中，该药物组合物是通过静脉内或皮下注射或输注来给予。

药学上可接受的载体包括任何和所有合适的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂、抗氧化剂和吸收延迟剂以及可与本发明的化合物生理上兼容的类似物。

可以用于本发明的药物组合物中的合适的水性和非水性载体的实例包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、乙醇、右旋糖、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇、以及类似物)、以及其合适的混合物、植物油(如橄榄油、玉米油、花生油、棉籽油、以及芝麻油)、羧甲基纤维素胶体溶液、黄蓍胶以及可注射的有机酯(例如油酸乙酯)和/或各种缓冲剂。在药物领域中其他载体是熟知的。

药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散体和用于临时制备无菌注射液或分散体的无菌粉剂。使用此类介质和试剂用于药物活性物质在本领域是已知的。除了在任何常规介质或试剂与活性化合物不兼容的情况下，考虑了其在本发明药物组合物中的使用。

本发明的药物组合物还可以包含药学上可接受的抗氧化剂，例如(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；以及(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。

本发明的药物组合物还可以在组合物中包含等渗剂，如糖、多元醇(如甘露醇、山梨醇、甘油)或氯化钠。

本发明的药物组合物还可以含有一种或多种适用于所选给予途径的佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂、分散剂、防腐剂或缓冲剂，这些试剂可以增强药物组合物的保质期或有效性。本发明的化合物可以与载体一起制备，这些载体可以保护化合物免于被快速释放，如控释配制品，包括植入物、透皮贴剂和微囊化递送系统。此类载体可以包括明胶、单硬脂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯、可生物降解的生物兼容聚合物(如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸)(单独的或与蜡一起)或本领域熟知的其他材料。用于制备此类配制品的方法通常是本领域普通技术人员已知的。参见例如，Sustained andControlled Release Drug Delivery Systems[缓释和控释递药系统],J.R.Robinson编辑,马歇尔德克公司(Marcel Dekker,Inc.),纽约,1978。

在一个实施例中，可以将本发明的化合物配制成确保在体内恰当分布。用于胃肠外给予的药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散体和用于临时制备无菌注射液或分散体的无菌粉剂。使用此类介质和试剂用于药物活性物质在本领域是已知的。除了在任何常规介质或试剂与活性化合物不兼容的情况下，考虑了其在本发明药物组合物中的使用。还可以将补充性活性化合物掺入组合物中。

在生产和储存条件下，注射用药物组合物典型地必须是无菌且稳定的。可以将组合物配制为溶液、微乳液、脂质体或适于高药物浓度的其他有序结构。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油(如橄榄油)和可注射有机酯(如油酸乙酯)的水性或非水性溶剂或分散介质。可以例如通过使用包衣材料(如卵磷脂)，通过维持所需的粒度(在分散体的情况下)和通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。在许多情况下，优选的是在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇(如甘油、甘露醇、山梨醇)或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中包括延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸盐和明胶)来实现。无菌可注射溶液可通过按需要将处于适当溶剂中的所需量的活性化合物与例如如上文列举的成分中的一种或组合掺在一起、随后微滤除菌来制备。通常，通过将活性化合物掺入无菌运载体中来制备分散体，该无菌运载体包含基础分散介质以及例如来自以上列举的那些的所需的其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂的情况下，制备方法的实例是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，这从其之前的无菌过滤溶液得到活性成分和任何另外的所希望成分的粉剂。

无菌可注射溶液可以通过按需要将所需量的活性化合物与一种上文列举的成分或成分的组合掺在适当溶剂中，随后灭菌微孔过滤来制备。通常，通过将活性化合物掺入无菌载体中来制备分散体，该无菌载体含有基础分散介质和来自上文列举的那些的其他所需成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂的情况下，制备方法的实例是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，这从其之前的无菌过滤溶液得到活性成分和任何另外的所希望成分的粉剂。

调整在以上治疗方法和使用中的剂量方案，以提供最佳期望应答(例如，治疗应答)。例如，可以给予单一推注剂，可以随时间给予若干个分剂量或可以由治疗情况的紧迫性指示来按比例的减少或增加剂量。肠胃外组合物可以被配制成单位剂型，以易于给予和剂量的均一性。如在此使用的单位剂型是指适合作为针对待治疗受试者的单一剂量的物理上离散的单位；每个单位含有经计算产生与所需药用载体相关的所需治疗效应的活性化合物的预先确定的量。针对本发明的单位剂型的说明受指示于并直接依赖于：(a)活性化合物的独特特性和将要达到的特定疗效，和(b)在复合这样的活性化合物以在个体中获得灵敏治疗的领域中固有的限制。

抗α-突触核蛋白抗体的有效剂量和剂量方案取决于待治疗的疾病或病症并且可以由本领域的普通技术人员确定。在剂量给予的任何一天，剂量的范围可以从约0.0001至约100mg/kg宿主体重，并且更通常是从约0.01至约5mg/kg宿主体重。例如，剂量可以是1mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg体重的范围内。因而示例性剂量包括：从约0.1至约10mg/kg/体重，从约0.1至约5mg/kg/体重，从约0.1至约2mg/kg/体重，从约0.1至约1mg/kg/体重，例如约0.15mg/kg/体重，约0.2mg/kg/体重，约0.5mg/kg/体重，约1mg/kg/体重，约1.5mg/kg/体重，约2mg/kg/体重，约5mg/kg/体重，或约10mg/kg/体重。

具有本领域普通技术的医师或兽医可以容易地确定并且开出所需药物组合物的有效量。例如，医师或兽医可以按低于为了达到所希望的治疗效果所需的水平开始给予药物组合物中采用的抗α-突触核蛋白抗体，并且逐步增加剂量直至达到所希望的效果。通常，本发明组合物的合适日剂量将是有效产生治疗效果的最低剂量的化合物量。这样一个有效剂量通常将取决于上述因素。给予可以例如是静脉内的、肌内的、腹膜内的或皮下的，或者例如临近靶标位点给予。如果希望的话，药物组合物的有效日剂量可以在一整天以适当的时间间隔分开为两个、三个、四个、五个、六个或更多个子剂量来给予，任选地以单位剂型给予。虽然本发明的化合物可以单独给予，但是优选的是作为如上描述的药物组合物给予该化合物。

序列表

本发明的另外的实施例

1.一种α-突触核蛋白结合单克隆抗体或其抗原结合片段，用于抑制τ蛋白的聚集。

2.根据项1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中该抗体结合聚集的可溶形式的α-突触核蛋白。

3.根据项1或2所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中τ蛋白聚集的抑制在体内或体外。

4.根据前述项中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中将所述α-突触核蛋白抗体给予患有阿尔茨海默氏病的患者。

5.根据前述项中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中该患者不具有阿尔茨海默氏病的路易体变体或组合型帕金森氏和阿尔茨海默氏病。

6.根据项1-3所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中将所述α-突触核蛋白抗体给予患有选自下组的τ蛋白病变的患者，该组包括以下：嗜银颗粒痴呆(AGD)；精神病，特别是因AD导致的精神病或患有AD的患者中的精神病；患有路易体痴呆症的患者的精神病症状；进行性核上性麻痹(PSP)；额颞痴呆(FTD或其变体)；TBI(急性或慢性创伤性脑损伤)；皮质基底节变性(CBD)；皮克病；原发性年龄相关性τ蛋白病变(PART)；神经原纤维缠结为主型老年性痴呆；拳击员痴呆；慢性创伤性脑病；中风；中风恢复；与帕金森氏病相关的神经变性；与染色体关联的帕金森综合征；利缇可-伯蒂格病(关岛型帕金森氏病-痴呆复合征)；神经节胶质瘤和神经节细胞瘤；脑膜血管瘤病；脑炎后帕金森综合征；亚急性硬化性全脑炎；亨廷顿氏病；铅中毒脑病；结节性硬化症；哈勒沃登-施帕茨病以及脂褐质沉积症。更典型地，该τ蛋白病变选自下组，该组由以下组成：阿尔茨海默氏病；嗜银颗粒痴呆(AGD)；精神病，特别是因AD导致的精神病或患有AD的患者中的精神病；患有路易体痴呆症的患者的精神病症状；进行性核上性麻痹(PSP)；额颞痴呆(FTD或其变体)；TBI(急性或慢性创伤性脑损伤)；皮质基底节变性(CBD)；以及皮克病。

7.根据前述项中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述α-突触核蛋白抗体结合至α-突触核蛋白的C-末端部分。

8.根据项7所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中该抗体结合至人α-突触核蛋白的C-末端氨基酸110-140内的表位。

9.根据项7或8所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述表位是在人α-突触核蛋白(SEQ ID NO 10)的氨基酸112-117、112-115、118-126、126-138或136-140内。

10.根据前述项中任一项所述的单克隆抗体，其中所述抗体结合人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:10)的氨基酸112-117(SEQ ID NO:9(ILEDMP))内的表位，或其结合所述表位的抗原结合片段。

11.根据前述项中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体能与包含SEQ ID NO:8的轻链可变域和SEQ ID NO:7、30、31或32的重链可变域的抗体竞争结合所述表位。

12.根据前述项中任一项所述的单克隆抗体，其中所述抗体能特异性结合人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:10)的氨基酸112-115(SEQ ID NO:19(ILED))内的表位，或其结合所述表位的抗原结合片段。

13.根据前述项中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体能与包含SEQ ID NO:26的重链可变域和SEQ ID NO:27的轻链可变域的抗体竞争结合所述表位。

14.根据项9所述的单克隆抗体，其中所述抗体结合人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:10)的氨基酸118-126(例如SEQ ID NO:36(NEAYE))内的表位，或其结合所述表位的抗原结合片段。

15.根据项9所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体能与包含SEQ IDNO:42的重链可变域和SEQ ID NO:43的轻链可变域的抗体竞争结合所述表位。

16.根据项9所述的单克隆抗体，其中所述抗体结合人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:10)的氨基酸126-138(SEQ ID NO:50(EMPSEEGYQD YEP)内的表位，或其结合所述表位的抗原结合片段。

17.根据项9所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体能与包含SEQ IDNO:57的重链可变域和SEQ ID NO:58的轻链可变域的抗体竞争结合所述表位。

18.根据项9所述的单克隆抗体，其中所述抗体结合人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:10)的氨基酸126-140(SEQ ID NO:61(EMPSEEGYQD YEPEA)内的表位，或其结合所述表位的抗原结合片段。

19.根据项18所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体能与包含SEQID NO:68的重链可变域和SEQ ID NO:69的轻链可变域的抗体竞争结合所述表位。

20.根据前述项中任一项所述的单克隆抗体，该单克隆抗体包含完整的抗体或由其组成。

21.根据前述项中任一项所述的单克隆抗体，其中该单克隆抗体选自下组，该组由以下组成：亚型IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的抗体。

22.根据前述项中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，包含抗原结合片段或由其组成，该抗原结合片段选自下组，该组由以下组成：Fv片段(如单链Fv和二硫化物键合的Fv)、Fab样片段(如Fab片段、Fab’片段和F(ab)2片段)和结构域抗体(如单VH可变域或VL可变域)。

23.根据前述项中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段展现出以下特性中的一种或多种：

a)对于α-突触核蛋白的结合亲和力(KD)在0.5-10nM之间，例如1-5nM或1-2nM；

b)抑制α-突触核蛋白原纤维的蛋白酶截短的能力；

c)在F28-snca转基因小鼠中逆转基础突触传递的损伤的能力；

d)如通过体内微透析测量的，在小鼠海马体内降低α-突触核蛋白的水平的能力；

e)当长期给予时，在帕金森氏病的大鼠模型中恢复运动功能的能力；

f)预防α-突触核蛋白接种(例如在体外和/或在帕金森氏病小鼠模型中不可溶的磷酸化的α突触核蛋白的积累)的能力；和/或

g)在人脑中结合截短的α-突触核蛋白的能力。

24.根据以上项中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段是一种人的、人源化的、重组的或嵌合的抗体。

25.根据项1-11所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其片段包含：

(a)具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链CDR1；

(b)具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链CDR2；

(c)具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链CDR3；

(d)具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链CDR1；

(e)具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链CDR2；和

(f)具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链CDR3。

26.根据项25所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:7的重链可变域或SEQ ID NO:8的轻链可变域。

27.根据项25所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:7的可变域组成的重链和由SEQ ID NO:8的可变域组成的轻链。

28.根据项1-11所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其片段包含：

(a)具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链CDR1；

(b)具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的重链CDR2；

(c)具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链CDR3；

(d)具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链CDR1；

(e)具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链CDR2；和

(f)具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链CDR3。

29.根据项28所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:30的重链可变域或SEQ ID NO:8的轻链可变域。

30.根据项28所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:30的可变域组成的重链和由SEQ ID NO:8的可变域组成的轻链。

31.根据项1-11所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其片段包含：

(a)具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链CDR1；

(b)具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的重链CDR2；

(c)具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链CDR3；

(d)具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链CDR1；

(e)具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链CDR2；和

(f)具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链CDR3。

32.根据项31所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:31的重链可变域或SEQ ID NO:8的轻链可变域。

33.根据项31所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:31的可变域和SEQ ID NO:8的可变域组成的重链。

34.根据项1-11所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其片段包含：

(a)具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链CDR1；

(b)具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的重链CDR2；

(c)具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链CDR3；

(d)具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链CDR1；

(e)具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链CDR2；和

(f)具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链CDR3。

35.根据项34所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:32的重链可变域或SEQ ID NO:8的轻链可变域。

36.根据项34所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:32的可变域和SEQ ID NO:8的可变域组成的重链。

37.根据项1-13中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其片段包含：

(a)具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的重链CDR1；

(b)具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链CDR2；

(c)具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的重链CDR3；

(d)具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的轻链CDR1；

(e)具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的轻链CDR2；和

(f)具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的轻链CDR3。

38.根据项37所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:26的重链可变域或SEQ ID NO:27的轻链可变域。

39.根据项37所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:26的可变域和SEQ ID NO:27的可变域组成的重链。

40.根据项1-9和项16-17所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述α-突触核蛋白抗体包含：

(a)具有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的重链CDR1；

(b)具有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的重链CDR2；

(c)具有SEQ ID NO:53的氨基酸序列的重链CDR3；

(d)具有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的轻链CDR1；

(e)具有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的轻链CDR2；和

(f)具有SEQ ID NO:56的氨基酸序列的轻链CDR3。

41.根据项40所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:57的重链可变区或SEQ ID NO:58的轻链可变区。

42.根据项40所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:57的重链可变区和SEQ ID NO:58的轻链可变区。

43.根据项1-9和项14-15所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述α-突触核蛋白抗体包含：

(a)具有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的重链CDR1；

(b)具有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的重链CDR2；

(c)具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的重链CDR3；

(d)具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的轻链CDR1；

(e)具有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的轻链CDR2；和

(f)具有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的轻链CDR3。

44.根据项43所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:42的重链可变区或SEQ ID NO:43的轻链可变区。

45.根据项43所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:42的重链可变区和SEQ ID NO:43的轻链可变区。

46.根据项1-9和项18-19所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述α-突触核蛋白抗体包含：

οSEQ ID NO:94或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列；

οSEQ ID NO:66或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列；和

οSEQ ID NO:67或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列。

47.根据项46所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO 94、66和67的CDR。

48.根据项46或47所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述α-突触核蛋白抗体包含：

οSEQ ID NO:97或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列；

οSEQ ID NO:63或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列；和

οSEQ ID NO:64或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列。

49.根据项48所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO 97、63和64的CDR。

50.根据项46或47所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:110的氨基酸序列或由其组成。

51.根据项48或49所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:111的氨基酸序列或由其组成。

52.根据项50和51所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:110的氨基酸序列或由其组成，该重链可变区包含SEQ ID NO:111的氨基酸序列或由其组成。

53.根据项1-9和项18-19所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述α-突触核蛋白抗体包含：

οSEQ ID NO:95或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列；

οSEQ ID NO:66或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列；和

οSEQ ID NO:67或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列。

54.根据项53所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO 95、66和67的CDR。

55.根据前述项53或54所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含以下CDR：

οSEQ ID NO:62或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列；

οSEQ ID NO:63或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列；和

οSEQ ID NO:103或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列。

56.根据项55所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO 62、63和103的CDR。

57.根据项53或54所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列或由其组成。

58.根据项55或56所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列或由其组成。

59.根据项57和58所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列或由其组成，该重链可变区包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列或由其组成。

60.根据项53或54所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列或由其组成。

61.根据项55和56所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:117的氨基酸序列或由其组成。

62.根据项60和61所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列或由其组成，该重链可变区包含SEQ ID NO:117的氨基酸序列或由其组成。

63.根据项1-9和项18-19所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述α-突触核蛋白抗体包含：

οSEQ ID NO:65或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列；

οSEQ ID NO:66或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列；和

οSEQ ID NO:96或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列。

64.根据项63所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO 65、66和96的CDR。

65.根据前述项63或64所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含以下CDR：

οSEQ ID NO:62或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列；

οSEQ ID NO:63或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列；和

οSEQ ID NO:64或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列。

66.根据项65所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO 62、63和64的CDR。

67.根据项63或64所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列或由其组成。

68.根据项65或66所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:113的氨基酸序列或由其组成。

69.根据项67和68所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列或由其组成，该重链可变区包含SEQ ID NO:113的氨基酸序列或由其组成。

70.根据项1-9和项18-19所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述α-突触核蛋白抗体包含：

οSEQ ID NO:65或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列；

οSEQ ID NO:66或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列；和

οSEQ ID NO:67或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列。

71.根据项70所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO 65、66和67的CDR。

72.根据前述项70或71所述的用途，包含重链可变区，该重链可变区包含以下CDR：

οSEQ ID NO:62或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列；

οSEQ ID NO:98或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列；和οSEQ ID NO:101或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列。

73.根据项72所述的用途，包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO 62、98和101的CDR。

74.根据项70或71所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列或由其组成。

75.根据项72或73所述的用途，包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列或由其组成。

76.根据项74和75所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列或由其组成，该重链可变区包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列或由其组成。

77.根据项1-9和项18-19所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述α-突触核蛋白抗体包含：

οSEQ ID NO:65或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列；

οSEQ ID NO:66或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列；和

οSEQ ID NO:67或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列。

78.根据项77所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO 65、66和67的CDR。

79.根据前述项77或78所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含以下CDR：

οSEQ ID NO:62或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列；

οSEQ ID NO:99或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列；和

οSEQ ID NO:64或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列。

80.根据项79所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO 62、99和64的CDR。

81.根据项77或78所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列或由其组成。

82.根据项79或80所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:109的氨基酸序列或由其组成。

83.根据项81和82所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列或由其组成，该重链可变区包含SEQ ID NO:109的氨基酸序列或由其组成。

84.根据项1-9和项18-19所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述α-突触核蛋白抗体包含：

οSEQ ID NO:65或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列；

οSEQ ID NO:66或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列；和

οSEQ ID NO:67或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列。

85.根据项84所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO 65、66和67的CDR。

86.根据前述项84或85所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含以下CDR：

οSEQ ID NO:62或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列；

οSEQ ID NO:100或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列；和

οSEQ ID NO:64或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列。

87.根据项86所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO 62、100和64的CDR。

88.根据项84或85所述的用途，包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列或由其组成。

89.根据项86或87所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列或由其组成。

90.根据前述项88和89中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列或由其组成，该重链可变区包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列或由其组成。

91.根据项1-9和项18-19所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述α-突触核蛋白抗体包含：

οSEQ ID NO:65或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列；

οSEQ ID NO:66或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列；和

οSEQ ID NO:67或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列。

92.根据项91所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO 65、66和67的CDR。

93.根据前述项91或92所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含以下CDR：

οSEQ ID NO:62或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列；

οSEQ ID NO:63或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列；和

οSEQ ID NO:102或具有不超过4个氨基酸差异、或不超过3个氨基酸差异、或不超过2个氨基酸差异、或不超过1个氨基酸差异的氨基酸序列。

94.根据项93所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO 62、63和102的CDR。

95.根据项91或92所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列或由其组成。

96.根据项93或94所述的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:107的氨基酸序列或由其组成。

97.根据项95或96所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列或由其组成，该重链可变区包含SEQ ID NO:107的氨基酸序列或由其组成。

98.一种核酸，该核酸编码根据项25-97中任一项所述的抗体或片段。

99.一种药物组合物，该药物组合物包含根据以上项中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段或者根据项25-97中任一项所述的制剂，以及药学上可接受的载体。

100.一种治疗受试者中的根据项5或6所述的疾病的方法，所述方法包括将根据项1-97中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段以有效量给予所述受试者。

101.根据项100所述的方法，其中该治疗是长期的。

102.根据项101所述的方法，其中该长期治疗是持续至少2周。

103.根据项100所述的方法，其中该受试者是人。

104.一种试剂盒，该试剂盒包含根据项1-97所述的抗体或其抗原结合片段，用于根据项100所述的方法中。

105.根据项5或6所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中根据项1-97所述的单克隆抗体是可检测地标记的。

106.根据项105所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述可检测的标记是荧光标记、化学发光标记、顺磁性标记、放射性同位素标记或酶标记。

107.根据项105-106所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，用于检测或测量所述α-突触核蛋白在受试者的脑或任何其他器官或体液中的存在或量。

108.根据项105-107所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述检测或测量包括对结合所述α-突触核蛋白的所述抗突触核蛋白抗体进行体内成像。

109.根据项105-108所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述检测或测量包括对结合所述α-突触核蛋白的所述抗突触核蛋白抗体或其所述抗原结合片段进行体外成像。

110.根据项1-97中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段用于生产对根据项5或6所述的疾病进行治疗、诊断或成像的药物的用途。

111.一种延缓患者中的根据项5或6所述的疾病的进展的方法，所述方法包括通过给予如在项1-97中定义的抗体来降低或减弱所述患者中的病理τ蛋白的积累。

实例

实例1：抗体筛选

1.免疫原和配体生产

获得或生产以下蛋白质用作图1所示的免疫原。使用三种免疫原使小鼠免疫，这些免疫原包括：全长重组的人α-突触核蛋白原纤维；包含氨基酸1-60的人α-突触核蛋白重组蛋白质(Rpeptide公司，博加特(Bogart)，乔治亚州(Georgia))和包含氨基酸1-119的人α-突触核蛋白重组蛋白质。为了从全长α-突触核蛋白中制得原纤维，使用了来自Rpeptide公司(博加特，乔治亚州)的冻干产品(目录号S-1001-2)。此物以1mg/ml的蛋白质浓度溶解在20mM Tris和300mM NaCl缓冲液中。为了制得原纤维，将蛋白质溶液以170μl等份在每个孔具有直径为70μm的陶瓷珠的96孔板上以200rpm在Vortemp 56摇床培养箱(美国新泽西州爱迪生市Labnet国际公司(Labnet International,Edison,NJ,USA))中于37℃下孵育7天，并且添加硫磺素T后形成了原纤维，并且在这些孔的一个中测量荧光。含有氨基酸1-60的重组α-突触核蛋白溶解在水中以得到1mg/ml的浓度。

使用以下构建体制备包含氨基酸1-119的重组α-突触核蛋白：编码6个氨基酸的组氨酸标签的合成基因、接着是Xa因子切割位点，以及编码人α-突触核蛋白氨基酸1-119的序列：

MAHHHHHHIE GRMDVFMKGL SKAKEGVVAA AEKTKQGVAE AAGKTKEGVL

YVGSKTKEGV VHGVATVAEK TKEQVTNVGG AVVTGVTAVA QKTVEGAGSI

AAATGFVKKD QLGKNEEGAP QEGILEDMPV D(SEQ ID NO:16)

该序列通过金斯瑞公司(Genscript)合成并且被克隆到pET24a(+)表达载体(Novagen)的NdeI-XhoI位点。

该表达载体被转化到大肠杆菌BL21中并且挑选单个菌落用于表达，该表达使用来自Novagen公司(用户协议TB383rev.H1005)的隔夜表达自动诱导系统。规模为500ml的终培养体积。通过在6000g下离心10分钟来收获细胞并且随后将其使用BugBuster蛋白提取试剂(用户协议TB245Rev.0304)裂解。裂解后，将样品通过离心进行清除，并且将上清液用于进一步纯化。

将His标记的蛋白经5ml的HisTrap柱(GE医疗集团(GE healthcare))纯化，该柱在20mM磷酸钠(pH7.5)、1M NaCl(A缓冲液)中平衡。将样品上样并使用A缓冲液进行洗涤后，将蛋白质在大于20柱体积的A缓冲液中以0.25M咪唑的梯度进行洗脱。收集5ml的级分并通过SDS-PAGE进行分析。将具有目的蛋白的级分合并、浓缩，并应用到在10mM tris(pH 7.4)、300mM NaCl中的S200(26/60)尺寸排阻柱(GE医疗集团)。根据具有预期大小的条带在SDS-PAGE中的存在再次合并级分。

为了去除N-末端标签，使用Novagen试剂盒(69037-3FRX)，将纯化的his标记的α-突触核蛋白1-119与Xa因子以1:50的比例一起孵育。孵育过夜后，使用Xarrest琼脂糖分批地去除Xa因子。如以上所述，最终通过许可的HisTrap色谱纯化切割的α-突触核蛋白1-119。从流出的液体获得纯化的α-突触核蛋白1-119并使用centricon浓缩装置浓缩至约400μg/ml。

将α-突触核蛋白(Rpeptide公司)以2mg/ml在PBS中进行再水合并且在混合时逐滴地添加过氧亚硝酸盐(100μL/mg蛋白质)。然后将亚硝基化α-突触核蛋白在5L PBS中透析并储存于-20℃。

使用多巴胺来氧化α-突触核蛋白。合并相同体积的在10mM的PBS(pH7.4)中制备的200uM多巴胺-HCL(Sigma P5244)溶液和在10mM的PBS(pH7.4)中的28μMα-突触核蛋白(Rpeptide公司)溶液。将所得的14uMα-突触核蛋白/100uM多巴胺在37℃O/N下(过夜)孵育。然后，将氧化的α-突触核蛋白在PBS中透析并储存于-20℃。

产生突触核蛋白蛋白质的不同天然和嵌合形式以筛选抗α-突触核蛋白抗体的多样性文库。筛选的构建体包括以下：人、小鼠、大鼠和食蟹猴α-突触核蛋白，人β-突触核蛋白，人γ-突触核蛋白以及最后缺乏α-突触核蛋白残基120-140的α-突触核蛋白衍生物。此外，产生了一系列4个改组构建体：A-Syn-AAKK-BAP、A-Syn-BAAK-BAP、A-Syn-BBAA-BAP、A-Syn-BBKK-BAP(SEQ ID No:11-14)。这些构建体含有人α-突触核蛋白(A)、人β-突触核蛋白(B)和鸡α-突触核蛋白(K)的线性延伸物。对含有与配体的C-末端融合的生物素受体肽(BAP)标记的基因进行克隆，以便于促进这些配体的位点特异性生物素酰化。生物素酰化允许这些配体附着于以可溶性ELISA形式使用的珠粒。构建了哺乳动物表达载体，该载体携带不同的α-突触核蛋白BAP标签融合构建体(ASynBAP)。使用瞬时转染(Genmab A/S)使这些配体在HEK293细胞中表达。

2.免疫

抗体HuMab-突触核蛋白来源于HuMAb小鼠品系HCo17-BALB/c和HCo12-BALB/c小鼠的免疫、小鼠免疫球蛋白(Ig)重链和小鼠κ轻链的双敲除，其防止抗体的表达，这些抗体完全为鼠类的抗体(人单克隆抗体；梅达瑞克斯公司(Medarex Inc.)，圣何塞，加利福尼亚州，美国)。通过插入人Ig重链和人Igκ轻链基因座使得不同小鼠品系成为转基因的并且区别在于人VH(重链的可变域)和VL(轻链的可变域)基因的数目。

以14天的间隔交替使用20μg抗原经腹膜内(IP)和使用相同免疫原经皮下(SC，在尾根处)使48只小鼠免疫。进行最多八次免疫，4次IP和4次SC。

用完全弗氏佐剂(CFA；Difco实验室(Difco Laboratories)，底特律，密歇根州，美国)中的α-突触核蛋白免疫原进行第一次免疫，之后的免疫在不完全弗氏佐剂(IFA)中进行。当发现血清滴度足够(针对至少两个连续的、双周的、筛选事件，在如上文描述的抗原特异性筛选测定中，发现1/50或更低的血清稀释度呈阳性)时，在融合之前四天和三天，将小鼠另外用100μL PBS中的10μgα-突触核蛋白免疫原蛋白静脉内地(IV)强化两次。

免疫方案示于图1。

抗体GM37来自如下免疫方案，在该免疫方案中使用人全长α-突触核蛋白原纤维，交替使用具有氨基酸1-60和1-119的α-突触核蛋白C-末端截短形式。

抗体GM285来自如下免疫方案，在该免疫方案中人α-突触核蛋白单体1-140被用于前4次免疫。如果没有滴度，免疫使用原纤维(ip/sc)继续，否则使用单体继续。

3.HuMab杂交瘤产生

将具有如上定义的足够抗原特异性滴度发生的HuMAb小鼠处死并且收集腹主动脉与腔静脉两侧的脾脏和淋巴结。基本上根据制造商的说明书，使用CEEF 50电融合系统(细胞脉冲科学公司(Cyto Pulse Sciences)，格伦伯尼(Glen Burnie)，马里兰州，美国)通过电融合进行脾细胞和淋巴结细胞与小鼠骨髓瘤细胞系的融合。将融合的细胞接种在融合培养基中，该培养基含有10％Fetal Clone I牛血清(普达生物公司(Perbio))、1mM丙酮酸钠(康伯司公司(Cambrex))、0.5U/mL青霉素、0.5U/mL链霉素(康伯司公司)、50μM 2-巯基乙醇(英杰公司(Invitrogen))、600ng/mL白介素6(IL-6)(施特拉特曼公司(Strathmann))、1xHAT(西格玛公司(Sigma))和0.5mg/mL卡那霉素(英杰公司)，在HyQ mADCF-Mab(普达生物公司)中。十天之后，收获上清液并且将细胞培养基更换为收获培养基，该收获培养基含有10％Fetal Clone I牛血清、0.5U/mL青霉素、0.5U/mL链霉素、600ng/mL IL-6和1x proHT(康伯司公司)，在HyQ mADCF-Mab中。通过初级筛选测定来筛选杂交瘤培养物的上清液。上清液的特征在于结合到八种不同的配体。这些包括4种直向同源物：人、小鼠、大鼠和食蟹猴，人α-突触核蛋白β-突触核蛋白和人γ-突触核蛋白(SEQ ID NO 37-41)，并且最后测试它们结合至缺乏α-突触核蛋白残基120-140的人α-突触核蛋白衍生物的能力。

使用自动化液体处理系统(Genmab A/S)使用高通量悬浮ELISA形式进行抗α-突触核蛋白抗体的筛选。平板的读数是由两个系统进行的，使用来自应用生物系统公司(Applied Biosystems)的FMAT 8200来读取384孔板并且使用来自分子装置公司(Molecular Devices)的ImageXpress Velos细胞仪来读取1536孔板。

在初级筛选中，克隆被表征为结合8种不同配体的能力。这些包括一系列的4个改组构建体：A-Syn-AAKK-BAP、A-Syn-BAAK-BAP、A-Syn-BBAA-BAP、A-Syn-BBKK-BAP(SEQ IDNO:11-14)，α-突触核蛋白120-140缺失-BAP，硝化的人α-突触核蛋白-BAP和氧化的人α-突触核蛋白-BAP。

简言之，将潜在包含α-突触核蛋白特异性抗体的血清或上清液添加到珠粒中以允许结合α-突触核蛋白和/或α-突触核蛋白衍生的构建体。使用荧光共轭物(Fc特异性的山羊抗人IgG共轭的DyLight649)来检测抗α-突触核蛋白抗体的结合。两种已知的小鼠抗α-突触核蛋白抗体，LB509和Syn211，作为阳性对照被列入筛选。为了确保α-突触核蛋白抗体的特异性检测，在384孔格式滴度筛选中，使用抗α-突触核蛋白血清池作为阴性对照，而在基于1536孔格式8珠粒的实验中使用人ChromPure IgG。

将来自最佳初级孔的杂交瘤细胞接种于半固体培养基中，该培养基由40％克隆培养基(CloneMedia)(Genetix公司，汉普郡(Hampshire)，英国)和60％HyQ 2x完全培养基(Hyclone公司，沃尔瑟姆(Waltham)，美国)制成。对于每个初级孔，接种Genetix黑色6孔板的孔。使用ClonePix系统(Genetix公司)从每个孔中挑取25个亚克隆。将亚克隆挑取在收获培养基中。七天之后，针对突触核蛋白特异性人IgG结合再次对亚克隆上清液进行筛选并且使用Octet(Fortebio公司，门洛帕克(Menlo Park)，美国)测量人IgG浓度。从每个初级孔选择最佳亚克隆并且在仅含有600ng/mL IL-6、0.5U/mL青霉素、0.5U/mL链霉素和1x proHT的扩增培养基中进行扩增。将亚克隆从一个96孔板孔扩增到一个24孔板孔，到四个24孔板孔，到六个6孔板孔。通过这种方法得到的克隆被指定为初级克隆(PC)。

使用Octet 384RED(Fortebio公司，门洛帕克，美国))进行另外的抗体结合研究。通过稀释于样品稀释剂(Fortebio公司，品号18-5028)中制备2μg/ml的HuMab抗体溶液。将胺反应性传感蛋白(Fortebio公司，品号18-0008)用于HuMab的固定。在偶联至胺反应性传感蛋白之前，将HuMab稀释在MES pH 6.0缓冲液(18-5027)中。如下在30℃和1000rpm下进行偶联：将胺反应性传感蛋白在PBS中预湿并且随后用EDC/NHS(Fortebio公司，品号18-1033/18-1034)活化溶液(根据制造商的说明书)活化300秒。在600秒期间用HuMab固定活化的传感蛋白。

图2显示，在Octet中，GM37和GM285结合至重组的人、食蟹猴和小鼠α-突触核蛋白，并且不结合人β-或γ-突触核蛋白。

4.突触核蛋白特异性HuMab可变域的序列分析和在表达载体中的克隆

从0.2至5x106个杂交瘤细胞制备总RNA并且使用SMART RACE cDNA扩增试剂盒(克罗泰克公司(Clontech))从100ng总RNA制备5’-RACE-互补DNA(cDNA)。通过PCR扩增VH和VL编码区并且框内地直接在p33G1f和p33κ表达载体(含有人类IgG1./κ恒定域编码序列)中通过连接独立克隆进行克隆(Aslanidis,C.和P.J.de Jong,Nucleic Acids Res[核酸研究]1990；18(20):6069-74)。对于每个抗体，对16个VL克隆和16个VH克隆进行测序。选择具有正确可读框(ORF)的克隆进行进一步研究和表达。使用293fectin在FreestyleTM 293-F细胞中瞬时共表达重链和轻链的所有组合的载体。

在GM37的情况下，VH区的测序确定了在CDR3结构域位置106处的额外的半胱氨酸。为了消除由于二硫键形成导致的错误折叠的可能性和抗体活性的潜在损失，将在位置106处的半胱氨酸突变为丝氨酸。

基于来源于杂交瘤PTA-8221(美国专利20080175838)的VH和VL序列(SEQ ID NO42和43)产生对比抗体9E4。

5.抗体的表达/纯化

使用pTT5载体和PEIpro作为瞬时转染试剂(加拿大国家研究理事会(NationalResearch Council of Canada))，通过在HEK293 6E细胞中进行转染产生抗体。总之，使用PEIpro(VWR公司)将重链和轻链转染到HEK293细胞中，并且转染24小时后向细胞补充TN1(西格玛公司)。细胞生长直至生存力接近50％，并且抗体的产量通过简单的IgG滴度(赛默公司(Thermo))测量。将培养物上清液经0.2μm死端过滤器进行过滤，装载在5mL蛋白A柱(rProtein A FF，阿莫仙生物科学公司(Amersham Bioscience))上并且用0.1M柠檬酸-NaOH(pH 3)洗脱。将洗脱物立即用2M Tris-HCl(pH 9)中和，并且用12.6mM NaH₂PO₄、140mMNaCl(pH 7.4)(贝朗公司(B.Braun))，O/N透析。透析之后，将样品经0.2μm死端过滤器进行无菌过滤。通过SDS-PAGE确定纯度并且通过比浊法和280nm处的吸光度测量浓度。将纯化的抗体等分并且储存在-80℃下。

实例2：利用表面等离子体共振表征抗体

使用3000测定抗体与α-突触核蛋白的实时结合。在CM5芯片的第一流动细胞(Fc1)和第二流动细胞(Fc2)中通过对多克隆兔抗小鼠抗体(小鼠抗体捕获试剂盒的一部分，GE医疗集团，目录号：BR-1008-38)进行胺偶联来制备捕获表面。在Fc2中以达到约500RU的配体水平所需的浓度捕获小鼠抗体。在Fc1-2中以30μl/min注射分析物(ASynBAP)之前，使基线稳定10min。ASynBAP分别以100-3200nM和25-3200RU运行。每个滴定系列中的最高浓度以一式两份允许。每个周期结束时，用10mM甘氨酸-HCl(pH1.7)(30秒注射)再生表面以去除捕获的小鼠抗体和分析物。HBS-EP(GE医疗集团，目录号：BR-1001-88)被用作所有实验中的运行缓冲液和样品稀释液，并且在25℃运行该测定。在获得之前，将所有样品保持在4℃。

将记录在Fc1中的应答(其中捕获抗体已被固定化但没有α-突触核蛋白抗体被捕获)从在Fc2中的应答减去。使用BIA评估软件版本4.1.1，将1:1或2:1结合算法与数据集进行拟合。显示抗体GM37、GM285和9E4与人α-突触核蛋白结合的结果可以在图3、4和5中看到。

实例3：表位作图

使用在Pepscan(Pepscan Zuidersluisweg 2 8243RC，莱利斯塔德(Lelystad)，荷兰))上的重叠线性肽的阵列进行抗体对α-突触核蛋白的表位作图。在基于Pepscan的ELISA中测试抗体与每个合成的20聚体肽的结合。将覆盖α-突触核蛋白的整个编码序列的线性肽阵列，以及具有氧化的甲硫氨酸或亚硝基化的酪氨酸的所有肽，与初级抗体溶液一起孵育(在4℃下过夜)。洗涤后，将肽阵列与1/1000稀释的抗体过氧化物酶共轭物(SBA,cat.nr.2010-05)在25℃一起孵育一小时。洗涤后，添加过氧化物酶底物2,2'-连氮基-二-3-乙基苯噻唑啉磺酸盐(ABTS)和2μl/ml的3％H2O2。一小时后，测量显色。用电荷耦合装置(CCD)-摄像机和图像处理系统定量显色。对于数据处理，从CCD摄象机获得范围从0到3000mAU的值，类似于标准的96孔板ELISA阅读器。将结果进行量化，并存储到Peplab数据库。偶尔一个孔包含导致假阳性值的气泡，手动检查这些板并且将气泡造成的任何值都记录为0。抗体GM37和GM285分别与包含序列ILEDMP或ILED的肽的结合数据可在图6中看到。

实例4：GM37和GM37变体

在哺乳动物细胞培养物中，在模拟将用于生产在患者中使用的临床级材料的生产条件的条件下，生产抗α-突触核蛋白抗体。众所周知，以这种方式产生的蛋白质经受了可能影响抗体的治疗效力和生物物理属性(其影响抗体随时间的稳定性)的翻译后修饰。数十年的研究确定的经验知识鉴定了一组已知为特定分子的显影提供风险的翻译后修饰。这些翻译后修饰已显示与存在于重链和轻链蛋白的一级序列中的氨基酸串相关。已经产生算法，这些算法可以鉴别这些序列并确定它们对治疗性抗体的制造性和显影性的潜在风险。

抗体的一级序列的计算机模拟分析可以用于使有潜力被开发为治疗剂的分子脱风险。特别地，VH和VL区的详细分析可以鉴定被认为对分子活性重要的但也可以是其随时间的稳定性的潜在危险的独特的氨基酸。序列特异性脱酰胺已被鉴定为蛋白质结构的潜在危险。蛋白质脱酰胺可以发生在谷氨酰胺或天冬酰胺残基的酰胺侧链上并将这些酰胺侧链转化为羧酸酯基团(Lorenzo等人PLOSone[公共科学图书馆期刊],DOI:10.1371,2015年12月)。对于天冬酰胺，在中性pH下非酶脱酰胺发生更快，因此被认为比谷氨酰胺具有更高的风险。该活性进一步被序列中的随后的氨基酸影响，并且能以数天或数年的速率发生。经历脱酰胺的蛋白质的实际命运需要通过实验评估以确定这一改变对其稳定性和活性两者的影响。

我们鉴定了在GM37的VH结构域内脱酰胺的位点。氨基酸残基54是天冬酰胺(N)，接着是位置55处的甘氨酸(G)。N54有较高的自发脱酰胺的风险。为了减轻这种风险，我们产生一组3个变体，用丝氨酸(S)、谷氨酰胺(Q)或组氨酸(H)取代天冬酰胺(N)。所有3个变体在哺乳动物细胞培养物中使用瞬时转染方法生产。所有3个变体显示出与GM37wt类似的表达和纯化特性。

对于八种产物中的每一种，使用已经培养至少2周的CHOK1SV GS-KO细胞进行400ml瞬时转染。转染前24小时，进行细胞传代培养。所有转染使用基因脉冲Xcell(伯乐公司(Bio-Rad))通过电穿孔进行。对于每次转染，将活细胞重悬于补充有6mM的L-谷氨酰胺的预热的CD-CHO培养基中至2.86x10⁷个细胞/ml。将40μg包含适当的重链和轻链的各自建立的SGV DNA等分到每个反应杯(伯乐公司，GenePulser反应杯，0.4cm空隙，165-2088)中，并添加700μl细胞悬浮液。将细胞在300V、900μF下进行电穿孔。转染的细胞被转移到在Erlenmeyer烧瓶中的预热培养基中，并且还将用预热的培养基漂洗两次的反应杯的内容物转移到烧瓶中。将转染的培养物在振荡培养箱中于36.5℃、5％CO₂、85％湿度、140rpm下孵育6天。在收获时使用Cedex HiRes自动细胞计数器(罗氏公司(Rosche))测量细胞活力。

为了评价残基54在结合人α-突触核蛋白中的重要性，我们在两个不同的实验中分析了变体结合的能力。使用竞争ELISA形式，我们评估了在残基54上的变化将会对GM37结合溶液中的α-突触核蛋白的能力的影响。通过评估突触核蛋白(其能够抑制抗体与包被ELISA板的突触核蛋白的结合)的浓度，我们发现所有三种变体保持与GM37wt相同的结合并以产生1-2nM IC50的高亲和力结合α-突触核蛋白(图7)。在室温下，使用固定浓度(0.3μg/ml)的如下抗体中的每一种：GM37(即GM 37wt)、GM37变体1、GM37变体2和GM37变体3与0-1000nM范围内的人α-突触核蛋白预孵育60分钟来进行竞争测定。捕获剩余的未结合的抗体，并在涂有100ng/ml重组人α-突触核蛋白的ELISA平板上使用抗人检测抗体通过电化学发光(默沙东公司(MSD)，盖瑟斯堡(Gathersburg)，马里兰州)来测定。对于GM 37wt、GM37变体1、GM37变体2和GM37变体3，相互作用的IC50分别是1.9nM、1.6nM、2.1nM和1.4nM(如使用Prism确定的)。

使用表面等离子共振(SPR)，我们评估了GM37wt(2批)和这三种变体(实例2)的结合实时动力学。将人α-突触核蛋白捕获到载玻片(配体)上并且将抗体作为分析物在多个浓度下分别进行了测试。在多个浓度的抗体存在下的结合曲线的分析表明，所有四种抗体的结合速率(on rate)是相同的，类似地，当抗体从缓冲液去除时测得的解离速率(off-rate)显示抗体之间无统计学差异。使用1:1结合算法，关注效力损失，所有4种抗体具有几乎相同的结合常数(图7)。

实例5：可以通过针对α-突触核蛋白的抗体来预防由α-突触核蛋白种子诱导的τ蛋白聚集

α-突触核蛋白原纤维(种子)制剂的描述

α-突触核蛋白的原纤维化可以按照以下稍微不同的方案来完成。

根据制造商的建议，将购自rPeptide公司的重组的α-突触核蛋白(目录号S-1001-2)溶解于双蒸馏水中，得到1mg/ml于20mM Tris-HCL/100mM NaCl中的溶液，pH＝7.4。使用Virginia Lee/Kelvin Luk方案从单体α-突触核蛋白生成α-突触核蛋白成形的原纤维(PFF)(Luk等人,Science[科学],2012,16；338(6109):949-53)。将1mg/ml溶液在37℃下在搅拌(300rpm)下孵育2天，然后暂停3天，然后搅拌1天，然后暂停1天，然后搅拌4天。在此之后，收获原纤维并保存在-20℃下直到使用。当原纤维用于细胞测定时，通常在添加前立即用喇叭探头超声发生器对其进行超声处理5分钟，设置5.50％的周期。

可替代地，将1mg/ml溶液在37℃下持续振荡5-7天。终产品被称为“粗原纤维”。超声处理之后，它们被称为“粗种子”。可以将粗原纤维离心，并将含有聚集的α-突触核蛋白的沉淀悬浮于新鲜PBS中，并称为“纯原纤维”。“纯种子”是通过超声处理纯原纤维获得的。

α-突触核蛋白抗体介导的对τ蛋白接种的抑制

为了显示α-突触核蛋白抗体介导的抑制细胞内τ蛋白接种的作用，建立了一种基于HEK293细胞的接种测定(图8，下图展示了测定设置)。将HEK293细胞以100,000细胞/孔铺板在24孔板中，并在铺板后24小时内用编码人τ蛋白-P301L-FLAG的cDNA瞬时转染。转染后24小时，将细胞用聚集的原纤化的α-突触核蛋白(种子)(含有或不含有抗体)接种24小时(使用Lipofectamine2000转染)，随后分离并重铺板细胞，并且在另外24小时之后收获。在补充有1％triton X、phos-stop和完全的磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂(罗氏公司)缓冲液的PBS中，将细胞裂解并进行超声处理。使用来自Cisbio公司的τ蛋白聚集测定来分析总细胞裂解物。这种测定是基于在FRET中的时间分辨荧光，对于供体(Tb3+缀合的)和受体(d2缀合的)抗体而言使用的是相同抗体。将10μl样品与10μl抗体混合物混合，并且孵育20小时。在Pherastar酶标仪上读取板以评估时间分辨荧光(在切换激发光之后，测量的/整合的FRET信号)。该测定以高特异性和灵敏性测量在来自AD患者的人脑尸体解剖材料、来自τ蛋白转基因小鼠(rTg4510)的脑材料以及接种的HEK293细胞中聚集的τ蛋白。使用不同的原纤化τ蛋白制剂作为种子，有效地使用这种基于HEK293细胞的接种测定来选择τ蛋白抗体临床候选物。

结果如图8上图所示。仅转染α-突触核蛋白种子(300ng粗种子)导致相对τ蛋白聚集在100(α-突触核蛋白，第3条)左右，这表明α-突触核蛋白有效力地诱导内源性τ蛋白的交叉接种。接种效应不受B12(对照抗体)和以下τ蛋白抗体(mC10-2，mD1.2，名称为LU0041G的τ蛋白结合抗体，和人源化(h)C10-2)的共转染的影响。然而，通过将细胞与针对α-突触核蛋白的四种不同的抗体HLD1、GM37(37)、GM63(63)和9E4共孵育，τ蛋白聚集发生了部分逆转，例如，抗体9E4导致相对聚集增加到20(与未处理的对照中的100相比)。用粗种子共转染(2.4ug抗体和300ng种子，总体积400ul)所有抗体。

实例6：抗体发现2E6和2E6变体

A.免疫/杂交瘤筛选

通过用与例如反应性醛交联的不同突触核蛋白聚集体免疫小鼠来产生针对α-突触核蛋白的单克隆抗体。第一抗原是由来自Rpeptide公司(火星山路4241号(4241MarsHill Road)，Bogart，佐治亚州30622，美国)的重组冻干α-突触核蛋白制成的。其通过将该蛋白溶解于PBS中而制成，以给出70uM的α-突触核蛋白的溶液(1mg/ml)。将该溶液在37℃下孵育18小时，并在100ul等分试样中冷冻。第二抗原是由重组的α-突触核蛋白(Rpeptide公司)通过将其以70mM溶解于20mM Tris(pH＝7.4)、0.15M NaCl中类似地制成的。将反应性醛ONE(4-氧代-2-壬烯醛，目录号10185，来自开曼化学公司(Cayman Chemicals)，安阿伯市(Ann Arbor)，密歇根州)以20:1的摩尔比添加至α-突触核蛋白共价交联低聚物中。将溶液在37℃下孵育18小时(不振荡)。将未反应的ONE用Vivaspin500旋转柱(10kda MWCO)去除，并且用20mM Tris(pH 7.4)、0.15M NaCl对样品进行透析，并以等分试样冷冻。第三抗原是重组的α-突触核蛋白片段氨基酸1-60(Rpeptide公司)，其以冻干粉(来自Rpeptide公司的原始材料)的形式发送。简言之，对三只雌性小鼠(4-7周龄)进行免疫，并加强至三次。使尾部出血并通过针对抗原的酶联免疫吸附测定(ELISA)对抗突触核蛋白抗体进行筛选。通过血清稀释液定义滴度，以在ELISA中获得基线的3倍的OD读数。选择滴度高于对照组1:50,000的小鼠进行融合。将收获的脾细胞融合到SP2/0小鼠骨髓瘤细胞中，由单细胞融合物稀释并铺板。收集融合后14天的上清液，并筛选用于抗体生产。使用突触核蛋白ELISA，从约1000个孔中回收50个阳性克隆。使用克隆分型系统/AP试剂盒进行免疫球蛋白分型(南方生物技术公司(Southern Biotechnology)，伯明翰(Birmingham)，阿拉巴马州(AL))。在下面的SKMEL5细胞测定中，筛选了50种抗α-突触核蛋白上清液，以减少atto-标记的α-突触核蛋白聚集体的积累。包括市售抗体LB509作为阳性对照。发现在这50种抗血清中，只有4种抗血清使细胞内α-突触核蛋白的积累减少，并将这些抗体用于克隆。然后在测定中测试这四种抗体的剂量应答。选择具有最大作用的抗体2E6用于PD相关模型中的进一步表征。

原纤维制剂的描述

重组的α-突触核蛋白定购自rPeptide公司(目录号S-1001-2)，并根据制造商的建议溶解于双蒸馏水中，得到1mg/ml于20mM Tris-HCL/100mM NaCl中的溶液，pH＝7.4。通过使用来自西格玛公司(#38371)的Atto488蛋白标记试剂盒用Atto488来荧光标记α-突触核蛋白。制备30％Atto488-标记的和70％未标记的α-突触核蛋白的混合物，然后将该混合物在37℃下在搅拌(300rpm)下孵育2天，然后暂停3天，然后搅拌1天，然后暂停1天，然后搅拌4天。在此之后，收获原纤维并保存在-20℃下直到使用。当原纤维用于细胞测定时，通常在添加前立即用喇叭探头超声发生器对其进行超声处理5分钟，设置5.50％的周期。

抗体介导的对SK-mel5细胞积累的抑制

使人黑色素瘤细胞系SK-mel5(ATCC，HTB-70)按照ATCC-指南生长。将细胞以3000个细胞/孔的密度铺板于Falcon BD 96孔板中，并放置黏附过夜。向细胞(0.01mg/ml)中添加Atto488标记的α-突触核蛋白原纤维与m2E6抗体(0.01mg/ml)和α-突触核蛋白肽113-125或126-140(0.01mg/ml)。孵育24小时后，将细胞在PBS中洗涤两次并通过4％多聚甲醛固定。然后用Hoechst对细胞进行染色，并在Cellomics ArrayScan中读数。在一个通道中检测核，并确定有效目标的数量。在核周围预先定义的环形成区域中的另一通道中检测Atto488标记的原纤维，从而代表细胞的细胞质。定量含有α-突触核蛋白斑点的细胞的百分比。结果显示，在未给出原纤维的细胞中，含斑点的细胞的背景非常低(背景可能是自发荧光导致的)，图7C。在仅给出原纤维的细胞中，75％的细胞已累积细胞内斑点。在与原纤维和m2E6抗体共孵育的细胞中，仅存在约30％的斑点阳性细胞。当细胞与原纤维、m2E6和126-140肽共孵育时，存在约60％的阳性细胞，因此该肽显著抑制m2E6的作用。113-120肽与原纤维和2E6的共孵育不改变m2E6的作用。原纤维与肽113-120或126-140中的任一个一起孵育对细胞中原纤维的积累没有影响。因此，m2E6与溶液中的α-突触核蛋白原纤维结合，并抑制其在细胞中的积累。

使用增加剂量的2E6-HLD1进行处理显示有斑点的细胞百分比呈剂量依赖性下降。用不相关对照抗体(B12)处理的细胞显示无效果。

B.突触核蛋白ELISA

使用抗原特异性ELISA测定来分析抗体阳性融合物的结合。用100ng聚集的突触核蛋白包被Corning 96孔高结合板。在室温(RT)下使用PBS中的5％牛奶封闭孔1小时(hr)。使用PBS+1％吐温20洗涤板3次。每个孔均添加100微升杂交瘤上清液，并在室温下孵育板。随后，将HRP缀合的山羊抗小鼠二级IgG(H&L链特异的或γ-链特异的)添加到每个孔中以检测结合的抗突触核蛋白抗体的存在。对于定量底物，添加一种组分TMB，并在OD620处对板进行测量。

C.确定抗体HC和LC可变域的DNA序列

选择四种抗α突触核蛋白阳性杂交瘤，并从细胞沉淀中提取mRNA。使用寡聚(dT)引物通过逆转录酶从每种mRNA制备物产生cDNA。随后，使用可变域引物进行PCR反应，以扩增HC和LC基因的VH和VL区。将扩增的DNA在琼脂糖凝胶上分离，并分离VH和VL产物，从凝胶中纯化，克隆到pCR2.1(英杰公司)中，并转化到TOP10细胞中。选择最少6个阳性菌落并通过DNA测序进行分析，以确定VH和VL区的序列。

实例7：抗体工程化

单克隆抗体的表达

扩增杂交瘤克隆的培养物，并使用蛋白质G色谱法从培养的上清液中纯化小鼠单克隆抗体。使用以下步骤生产重组的小鼠抗体、人抗体及嵌合抗体：将重链和轻链基因瞬时共转染至HEK293细胞，扩增培养物，收获上清液，并通过蛋白色谱法纯化。在CHO细胞中产生了如下实例，在这些实例中重复需要克数量的抗体稳定细胞系。这些稳定的细胞系可以根据需要进行扩增，并如前所述进行抗体纯化。

重组抗体的克隆

通过重链和轻链基因(Geneart A/G公司)的基因合成来产生重组单克隆抗体。合成的基因随后被克隆到标准表达载体(例如pcDNA3.1)中，用于在哺乳动物细胞培养物中表达。

人源化

通过基于结构的CDR接枝实现了m2E6的人源化。针对PDB和IMGT数据库中发现的所有人抗体VL和VH框架氨基酸序列，对2E6VL和VH结构域的氨基酸序列进行同源性筛选。使用来自PDB数据库的20SL抗体对m2E6Fv区域进行结构建模。20SL氨基酸序列分别与2E6VH和VL结构域具有82.7％和83.2％的同源性。重要的是，在的分辨率下确定20SL的结构。2E6人源化框架与20SL的结构比对能够确定框架区中的重要残基，这些残基可能经由空间位阻或空间力影响折叠或局部结构。采用人源化抗体的理论抗体结构建模来指导在2E6的人源化版本中维持特定残基作为原始小鼠氨基酸的潜在重要性，从而维持结合特异性和亲和力。采用结构建模来优化人源化2E6的活性。

通过将VH CDR接枝到人种系基因IGHV1-46*01的框架(69％同源性)上来进行2E6VH区的人源化。小鼠2E6与所选择的人框架区之间存在23个氨基酸差异。结构建模确定了7个氨基酸位置，其中人类残基的变化可能负面影响2E6的活性。这些残基被反向突变为原始小鼠氨基酸。生产了三种不同版本的人源化重链。人源化HLD-1含有所有7个反向突变：M37V、I48M、A68V、L70M、V72R、K74T、A79V，HLD-2含有I48M、A68V、L70M、V72R、K74T、A79V，且HLD-3含有M37V、I48M、L70M、V72R、K74T、A79V。

通过将VL CDR接枝到人种系基因IGKV3-11*01的框架(64％同源性)上来进行2E6VL区的人源化。小鼠2E6与所选择的人框架区之间存在26个氨基酸差异。结构建模确定了R45L、W46L、V57I、Y70F这4个氨基酸位置，其中人残基的变化可能负面影响2E6的活性。对于HLD-1、HLD-2和HLD-3，所有这4个残基都被反向突变为原始小鼠氨基酸。

HLD-1、HLD-2、HLD-3在HEK 293细胞中瞬时表达。从培养的上清液中纯化抗体，随后使用突触核蛋白配体形式通过SPR(Biacore 3000)分析与突触核蛋白的结合(表5)。

表5：不同人源化2E6克隆与嵌合体2E6的动力学结合分析

HLD1的亲和力成熟是通过以下来完成的：通过基于密码子的退化PCR引物在轻链CDR3上随机突变，并且类似地，通过基于密码子的退化PCR引物在重链CDR3上随机突变，并使用易错PCR的体外进化。从培养的上清液中纯化抗体，随后使用CM5芯片上固定的抗人IgG抗体捕获的IgG，通过SPR(Biacore 3000)分析与突触核蛋白的结合(表6)。

表6：第一轮亲和力成熟后，人源化2E6克隆HLD1的不同亲和成熟版本的动力学结合分析

在第一轮亲和力成熟后，我们构建了4个突变(A、B、C、D)：A)组合重链CDR2(将KYNVNFKT突变为KYNVNIKT)和重链CDR3(将LGHYGNLYAMDY突变为LGHYGNLYAKDY)中的两个突变；B)将轻链CDR1突变(将SASSSVSYMH突变为SASSSVSYIH)掺入到L3-11轻链中；C)将轻链框架突变(将PRRWIY突变为PRRLIY，紧邻上游CDR2)掺入到L3-11轻链中；以及D)将轻链CDR1突变(将SASSSVSYMH突变为SASSSVSYIH)和轻链框架突变(将PRRWIY突变为PRRLIY)掺入到L3-11轻链中。基于Biacore数据和抗体序列，我们使用了以下不同组合测试了轻链和重链的共表达：

1.L3-11轻链+9C12重链

2.L3-11轻链+8D9重链

3.7A10轻链+9C12重链

4.L3-11轻链+A

5. 7A10轻链+A

9.B+9C12重链

10.C+9C12重链

11.D+9C12重链

12.B+8D9重链

13.C+8D9重链

14.D+8D9重链

15.B+重链

16.C+重链

17.D+重链

从培养的上清液中纯化抗体，随后使用CM5芯片上固定的抗人IgG抗体捕获的IgG，通过SPR(Biacore 3000)分析与突触核蛋白的结合(表7)。

表7：对突变进行组合后，人源化2E6克隆HLD1的不同亲和成熟版本的动力学结合分析

实例8

将来自AD患者的额叶皮质在冰冷的无菌PBS中进行均质化，并通过刀均质器进行均质化，使用Branson超声波仪(5次脉冲0,9秒，输出2)进行超声处理并在4℃下以3000g清除5分钟。收集上清液，并通过BCA确定蛋白浓度。用于确定α-突触核蛋白聚集体水平的样品包含2.1-4.8ug/μl蛋白质。使用可商购自Cisbio公司(目录号6FASYPEG)的α-突触核蛋白聚集测定来测量α-突触核蛋白聚集体。使用即将可商购自Cisbio公司的突触核蛋白-p129聚集测定来测量在丝氨酸129上磷酸化的α-突触核蛋白(突触核蛋白-p129，路易体的标志物)。根据制造商的方案，使用来自每个试剂盒的相应缓冲液进行这两种测定。简言之，将所有10％匀浆以1:12和1:72连续稀释于裂解缓冲液的任一者中，并且将10μl样品与10μl的相应抗体混合物(5μl Tb-穴状抗体和5μl d2缀合物)混合并孵育20小时。在Pherastar酶标仪上测量时间分辨FRET，并计算信噪比，并对每个样品进行蛋白质标准化。

来自AD患者的额叶皮质的50个新鲜冷冻组织样品获得自美国亚利桑那州太阳城的班纳太阳健康研究所的大脑和身体捐赠项目(Banner Sun Health Research InstituteBrain and Body Donation program(BBDP),Sun city,Arizona,US)。获得来自中期AD(Braak III/IV期)患者的25个样品和来自晚期AD(Braak V/VI期)患者的25个样品。据报道，没有一个样本含有α-突触核蛋白病变的免疫组织化学证据。

结果示于图9中。α-突触核蛋白聚集体可在所有50个AD病例中测量。在图9A中，来自10％脑匀浆(W/V)的12倍和72倍稀释液的原始数据显示浓度依赖性信号强度。包括来自患有路易体痴呆(DLB)的患者的两个样品作为阳性对照(图9A中的红线)。在图9B中，将来自1:12稀释液的数据标准化为样品中的总蛋白，显示在中期AD(Braak III/IV期)和晚期AD(Braak V/VI期)中存在相似水平的α-突触核蛋白聚集体。

在任何AD样品中均未检测到在丝氨酸129上磷酸化的α-突触核蛋白，而其明显存在于DLB样品中(图9C)。在丝氨酸129上磷酸化的α-突触核蛋白是明显的路易体病变的标志物，并且使用α-突触核蛋白-丝氨酸129-磷酸化抗体对尸体解剖后的脑的组织学染色通常用于确认像帕金森氏病和DLB等突触核蛋白病变的诊断。50个AD样本中不存在这种标志物可能表明α-突触核蛋白聚集体总是存在于AD脑中-并且可以存在突触核蛋白聚集体而不存在明显的路易体病变。

基于这些发现，结合图8中的发现，我们假设任何能够中和α-突触核蛋白聚集体(种子)或通过其他方式预防α-突触核蛋白聚集体进入神经元或神经胶质细胞并促进τ蛋白聚集的α-突触核蛋白抗体，都将具有治疗τ蛋白病变的治疗潜力。

序列表

<110> H.隆德贝克有限公司（H. Lundbeck A/S）

<120> 用于预防τ蛋白聚集的单克隆抗α-突触核蛋白抗体

<130> 1055

<160> 121

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> GM37 CDR 1重链

<400> 1

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Thr

1 5 10

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> GM37 CDR2重链

<400> 2

Ala Ile Arg Ser Asn Gly Asp Arg Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> GM37 CDR3重链

<400> 3

Ala Lys Asn Trp Ala Pro Phe Asp Ser

1 5

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> GM37 CDR1轻链

<400> 4

Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> GM37 CDR 2轻链

<400> 5

Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> GM37 CDR 3轻链

<400> 6

Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr

1 5

<210> 7

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> GM37 CDR重链

<400> 7

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Arg Ser Asn Gly Asp Arg Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asn Trp Ala Pro Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr

<210> 8

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> GM 37轻链

<400> 8

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro

85 90 95

Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 9

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 表位112-117

<400> 9

Ile Leu Glu Asp Met Pro

1 5

<210> 10

<211> 140

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> α-突触核蛋白

<400> 10

Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Lys Ala Lys Glu Gly Val Val

1 5 10 15

Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Ala Glu Ala Ala Gly Lys

20 25 30

Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys Glu Gly Val

35 40 45

Val His Gly Val Ala Thr Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Val Thr

50 55 60

Asn Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys

65 70 75 80

Thr Val Glu Gly Ala Gly Ser Ile Ala Ala Ala Thr Gly Phe Val Lys

85 90 95

Lys Asp Gln Leu Gly Lys Asn Glu Glu Gly Ala Pro Gln Glu Gly Ile

100 105 110

Leu Glu Asp Met Pro Val Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Met Pro

115 120 125

Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala

130 135 140

<210> 11

<211> 165

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> A-Syn-AAKK-BAP

<400> 11

Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Lys Ala Lys Glu Gly Val Val

1 5 10 15

Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Ala Glu Ala Ala Gly Lys

20 25 30

Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys Glu Gly Val

35 40 45

Val His Gly Val Ala Thr Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Val Thr

50 55 60

Asn Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys

65 70 75 80

Thr Val Glu Gly Ala Gly Asn Ile Ala Ala Ala Thr Gly Leu Val Lys

85 90 95

Lys Asp Gln Leu Ala Lys Gln Asn Glu Glu Gly Phe Leu Gln Glu Gly

100 105 110

Met Val Asn Asn Thr Asp Ile Pro Val Asp Pro Glu Asn Glu Ala Tyr

115 120 125

Glu Met Pro Pro Glu Glu Glu Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala Gly

130 135 140

Ser Ala Gly Gly Ser Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys

145 150 155 160

Ile Glu Trp His Glu

165

<210> 12

<211> 165

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> A-Syn-BAAK-BAP

<400> 12

Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Met Ala Lys Glu Gly Val Val

1 5 10 15

Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Thr Glu Ala Ala Glu Lys

20 25 30

Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys Glu Gly Val

35 40 45

Val His Gly Val Ala Thr Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Val Thr

50 55 60

Asn Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys

65 70 75 80

Thr Val Glu Gly Ala Gly Ser Ile Ala Ala Ala Thr Gly Phe Val Lys

85 90 95

Lys Asp Gln Leu Ala Lys Gln Asn Glu Glu Gly Phe Leu Gln Glu Gly

100 105 110

Met Val Asn Asn Thr Asp Ile Pro Val Asp Pro Glu Asn Glu Ala Tyr

115 120 125

Glu Met Pro Pro Glu Glu Glu Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala Gly

130 135 140

Ser Ala Gly Gly Ser Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys

145 150 155 160

Ile Glu Trp His Glu

165

<210> 13

<211> 162

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> A-Syn-BBAA-BAP

<400> 13

Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Met Ala Lys Glu Gly Val Val

1 5 10 15

Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Thr Glu Ala Ala Glu Lys

20 25 30

Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Arg Glu Gly Val

35 40 45

Val Gln Gly Val Ala Ser Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Ala Ser

50 55 60

His Leu Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys

65 70 75 80

Thr Val Glu Gly Ala Gly Ser Ile Ala Ala Ala Thr Gly Phe Val Lys

85 90 95

Lys Asp Gln Leu Gly Lys Asn Glu Glu Gly Ala Pro Gln Glu Gly Ile

100 105 110

Leu Glu Asp Met Pro Val Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Met Pro

115 120 125

Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala Gly Ser Ala Gly

130 135 140

Gly Ser Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp

145 150 155 160

His Glu

<210> 14

<211> 165

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> A-Syn-BBKK-BAP

<400> 14

Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Met Ala Lys Glu Gly Val Val

1 5 10 15

Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Thr Glu Ala Ala Glu Lys

20 25 30

Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Arg Glu Gly Val

35 40 45

Val Gln Gly Val Ala Ser Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Ala Ser

50 55 60

His Leu Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys

65 70 75 80

Thr Val Glu Gly Ala Gly Asn Ile Ala Ala Ala Thr Gly Leu Val Lys

85 90 95

Lys Asp Gln Leu Ala Lys Gln Asn Glu Glu Gly Phe Leu Gln Glu Gly

100 105 110

Met Val Asn Asn Thr Asp Ile Pro Val Asp Pro Glu Asn Glu Ala Tyr

115 120 125

Glu Met Pro Pro Glu Glu Glu Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala Gly

130 135 140

Ser Ala Gly Gly Ser Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys

145 150 155 160

Ile Glu Trp His Glu

165

<210> 15

<211> 141

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> A-Syn-120-140_Del-BAP

<400> 15

Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Lys Ala Lys Glu Gly Val Val

1 5 10 15

Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Ala Glu Ala Ala Gly Lys

20 25 30

Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys Glu Gly Val

35 40 45

Val His Gly Val Ala Thr Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Val Thr

50 55 60

Asn Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys

65 70 75 80

Thr Val Glu Gly Ala Gly Ser Ile Ala Ala Ala Thr Gly Phe Val Lys

85 90 95

Lys Asp Gln Leu Gly Lys Asn Glu Glu Gly Ala Pro Gln Glu Gly Ile

100 105 110

Leu Glu Asp Met Pro Val Asp Gly Ser Ala Gly Gly Ser Gly Gly Leu

115 120 125

Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu

130 135 140

<210> 16

<211> 131

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> α-突触核蛋白氨基酸1-119

<400> 16

Met Ala His His His His His His Ile Glu Gly Arg Met Asp Val Phe

1 5 10 15

Met Lys Gly Leu Ser Lys Ala Lys Glu Gly Val Val Ala Ala Ala Glu

20 25 30

Lys Thr Lys Gln Gly Val Ala Glu Ala Ala Gly Lys Thr Lys Glu Gly

35 40 45

Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys Glu Gly Val Val His Gly Val

50 55 60

Ala Thr Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Val Thr Asn Val Gly Gly

65 70 75 80

Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys Thr Val Glu Gly

85 90 95

Ala Gly Ser Ile Ala Ala Ala Thr Gly Phe Val Lys Lys Asp Gln Leu

100 105 110

Gly Lys Asn Glu Glu Gly Ala Pro Gln Glu Gly Ile Leu Glu Asp Met

115 120 125

Pro Val Asp

130

<210> 17

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> κ（LC恒定区）

<400> 17

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

1 5 10 15

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

20 25 30

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

35 40 45

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

50 55 60

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

65 70 75 80

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

85 90 95

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 18

<211> 329

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> IgG1（HC恒定区）

<400> 18

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

325

<210> 19

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> GM285表位112-115

<400> 19

Ile Leu Glu Asp

1

<210> 20

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> GM285 CDR1重链

<400> 20

Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Phe Thr Met Thr

1 5 10

<210> 21

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> GM285 CDR2重链

<400> 21

Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 22

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> GM285 CDR3重链

<400> 22

Ala Lys Asn Trp Ala Pro Phe Asp Tyr

1 5

<210> 23

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> GM285 CDR1轻链

<400> 23

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 24

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> GM285 CDR2轻链

<400> 24

Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr

1 5

<210> 25

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> GM285 CDR3轻链

<400> 25

Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr

1 5

<210> 26

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> GM285 VH

<400> 26

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Phe

20 25 30

Thr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Leu Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asn Trp Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr

<210> 27

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> GM285 VL

<400> 27

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Val Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro

85 90 95

Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 28

<211> 329

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> GM285 IgG1恒定区

<400> 28

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

325

<210> 29

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> GM285 κ链

<400> 29

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

1 5 10 15

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

20 25 30

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

35 40 45

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

50 55 60

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

65 70 75 80

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

85 90 95

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 30

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> GM37变体1重链

<400> 30

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Arg Ser Ser Gly Asp Arg Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asn Trp Ala Pro Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr

<210> 31

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> GM 37变体2重链

<400> 31

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Arg Ser Gln Gly Asp Arg Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asn Trp Ala Pro Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr

<210> 32

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> GM 37变体3重链

<400> 32

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Arg Ser His Gly Asp Arg Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asn Trp Ala Pro Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr

<210> 33

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> GM37变体1重链CDR 2

<400> 33

Ala Ile Arg Ser Ser Gly Asp Arg Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 34

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> GM37变体2 CDR 2重链

<400> 34

Ala Ile Arg Ser Gln Gly Asp Arg Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 35

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> GM37变体3 CDR 2重链

<400> 35

Ala Ile Arg Ser His Gly Asp Arg Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 36

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 9E4结合表位

<400> 36

Asn Glu Ala Tyr Glu

1 5

<210> 37

<211> 134

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 人β-突触核蛋白

<400> 37

Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Met Ala Lys Glu Gly Val Val

1 5 10 15

Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Thr Glu Ala Ala Glu Lys

20 25 30

Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Arg Glu Gly Val

35 40 45

Val Gln Gly Val Ala Ser Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Ala Ser

50 55 60

His Leu Gly Gly Ala Val Phe Ser Gly Ala Gly Asn Ile Ala Ala Ala

65 70 75 80

Thr Gly Leu Val Lys Arg Glu Glu Phe Pro Thr Asp Leu Lys Pro Glu

85 90 95

Glu Val Ala Gln Glu Ala Ala Glu Glu Pro Leu Ile Glu Pro Leu Met

100 105 110

Glu Pro Glu Gly Glu Ser Tyr Glu Asp Pro Pro Gln Glu Glu Tyr Gln

115 120 125

Glu Tyr Glu Pro Glu Ala

130

<210> 38

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 人γ-突触核蛋白

<400> 38

Met Asp Val Phe Lys Lys Gly Phe Ser Ile Ala Lys Glu Gly Val Val

1 5 10 15

Gly Ala Val Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Thr Glu Ala Ala Glu Lys

20 25 30

Thr Lys Glu Gly Val Met Tyr Val Gly Ala Lys Thr Lys Glu Asn Val

35 40 45

Val Gln Ser Val Thr Ser Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Ala Asn

50 55 60

Ala Val Ser Glu Ala Val Val Ser Ser Val Asn Thr Val Ala Thr Lys

65 70 75 80

Thr Val Glu Glu Ala Glu Asn Ile Ala Val Thr Ser Gly Val Val Arg

85 90 95

Lys Glu Asp Leu Arg Pro Ser Ala Pro Gln Gln Glu Gly Glu Ala Ser

100 105 110

Lys Glu Lys Glu Glu Val Ala Glu Glu Ala Gln Ser Gly Gly Asp

115 120 125

<210> 39

<211> 140

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 食蟹猴的α-突触核蛋白直向同源物

<400> 39

Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Lys Ala Lys Glu Gly Val Val

1 5 10 15

Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Ala Glu Ala Ala Gly Lys

20 25 30

Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys Glu Gly Val

35 40 45

Val His Gly Val Ala Thr Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Val Thr

50 55 60

Asn Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys

65 70 75 80

Thr Val Glu Gly Ala Gly Ser Ile Ala Ala Ala Thr Gly Phe Ile Lys

85 90 95

Lys Asp Gln Leu Gly Lys Asn Glu Glu Gly Ala Pro Gln Glu Gly Ile

100 105 110

Leu Gln Asp Met Pro Val Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Met Pro

115 120 125

Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala

130 135 140

<210> 40

<211> 140

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 大鼠的α-突触核蛋白直向同源物

<400> 40

Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Lys Ala Lys Glu Gly Val Val

1 5 10 15

Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Ala Glu Ala Ala Gly Lys

20 25 30

Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys Glu Gly Val

35 40 45

Val His Gly Val Thr Thr Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Val Thr

50 55 60

Asn Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys

65 70 75 80

Thr Val Glu Gly Ala Gly Asn Ile Ala Ala Ala Thr Gly Phe Val Lys

85 90 95

Lys Asp Gln Met Gly Lys Gly Glu Glu Gly Tyr Pro Gln Glu Gly Ile

100 105 110

Leu Glu Asp Met Pro Val Asp Pro Ser Ser Glu Ala Tyr Glu Met Pro

115 120 125

Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala

130 135 140

<210> 41

<211> 140

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 小鼠的α-突触核蛋白直向同源物

<400> 41

Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Lys Ala Lys Glu Gly Val Val

1 5 10 15

Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Ala Glu Ala Ala Gly Lys

20 25 30

Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys Glu Gly Val

35 40 45

Val His Gly Val Thr Thr Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Val Thr

50 55 60

Asn Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys

65 70 75 80

Thr Val Glu Gly Ala Gly Asn Ile Ala Ala Ala Thr Gly Phe Val Lys

85 90 95

Lys Asp Gln Met Gly Lys Gly Glu Glu Gly Tyr Pro Gln Glu Gly Ile

100 105 110

Leu Glu Asp Met Pro Val Asp Pro Gly Ser Glu Ala Tyr Glu Met Pro

115 120 125

Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala

130 135 140

<210> 42

<211> 446

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 9E4 HC

<400> 42

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Asn Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Ala Gly Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

420 425 430

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 43

<211> 220

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 9E4 LC

<400> 43

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ile Gln Thr Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys

35 40 45

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Ile Arg Lys Ser Gly Val

50 55 60

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp

115 120 125

Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn

130 135 140

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu

145 150 155 160

Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp

165 170 175

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

180 185 190

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser

195 200 205

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 220

<210> 44

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 9E4 CDR1重链

<400> 44

Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Gly Met Ser

1 5 10

<210> 45

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 9E4 CDR2重链

<400> 45

Ser Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Asn Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 46

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 9E4 CDR3重链

<400> 46

Gly Gly Ala Gly Ile Asp Tyr

1 5

<210> 47

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 9E4 CDR1轻链

<400> 47

Lys Ser Ile Gln Thr Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 48

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 9E4 CDR2轻链

<400> 48

Trp Ala Ser Ile Arg Lys Ser

1 5

<210> 49

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 9E4 CDR3轻链

<400> 49

Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr

1 5

<210> 50

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> GM63表位126-138

<400> 50

Glu Met Pro Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro

1 5 10

<210> 51

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> GM63 CDR1重链

<400> 51

Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Ile Ile

1 5 10

<210> 52

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> GM63 CDR2重链

<400> 52

Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Lys Thr Asn

1 5 10

<210> 53

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> GM63 CDR3重链

<400> 53

Thr Arg Ala His Trp Gly Arg Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 54

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> GM63 CDR1轻链

<400> 54

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 55

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> GM63 CDR2轻链

<400> 55

Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser

1 5

<210> 56

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> GM63 CDR3轻链

<400> 56

Gln Gln Phe Lys Ser Tyr Pro Arg Thr

1 5

<210> 57

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> GM63 VH

<400> 57

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Ile Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Ile Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Lys Thr Asn Tyr Ala Gln Asn Leu

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Ala His Trp Gly Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr

<210> 58

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> GM63 VL

<400> 58

Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Lys Ser Tyr Pro Arg

85 90 95

Thr Leu Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 59

<211> 701

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> GM63重链恒定域

<400> 59

Gly Cys Cys Thr Cys Cys Ala Cys Cys Ala Ala Gly Gly Gly Cys Cys

1 5 10 15

Cys Ala Thr Cys Gly Gly Thr Cys Thr Thr Cys Cys Cys Ala Cys Thr

20 25 30

Gly Gly Cys Gly Cys Cys Cys Thr Cys Cys Thr Cys Cys Ala Ala Gly

35 40 45

Ala Gly Cys Ala Cys Cys Ala Gly Cys Gly Gly Cys Gly Gly Cys Ala

50 55 60

Cys Ala Gly Cys Cys Gly Cys Cys Cys Thr Gly Gly Gly Cys Thr Gly

65 70 75 80

Cys Cys Thr Gly Gly Thr Gly Ala Ala Gly Gly Ala Cys Thr Ala Cys

85 90 95

Thr Thr Cys Cys Cys Cys Gly Ala Gly Cys Cys Ala Gly Thr Gly Ala

100 105 110

Cys Cys Gly Thr Gly Thr Cys Cys Thr Gly Gly Ala Ala Cys Thr Cys

115 120 125

Thr Gly Gly Cys Gly Cys Cys Cys Thr Gly Ala Cys Cys Thr Cys Cys

130 135 140

Gly Gly Cys Gly Thr Gly Cys Ala Cys Ala Cys Cys Thr Thr Cys Cys

145 150 155 160

Cys Cys Gly Cys Cys Gly Thr Gly Cys Thr Gly Cys Ala Gly Ala Gly

165 170 175

Cys Ala Gly Cys Gly Gly Cys Cys Thr Gly Thr Ala Cys Ala Gly Cys

180 185 190

Cys Thr Gly Ala Gly Cys Ala Gly Cys Gly Thr Gly Gly Thr Gly Ala

195 200 205

Cys Cys Gly Thr Gly Cys Cys Cys Ala Gly Cys Ala Gly Cys Ala Gly

210 215 220

Cys Cys Thr Gly Gly Gly Cys Ala Cys Cys Cys Ala Gly Ala Cys Cys

225 230 235 240

Thr Ala Cys Ala Thr Cys Thr Gly Cys Ala Ala Cys Gly Thr Gly Ala

245 250 255

Ala Cys Cys Ala Cys Ala Ala Gly Cys Cys Cys Ala Gly Cys Ala Ala

260 265 270

Cys Ala Cys Cys Ala Ala Gly Gly Thr Gly Gly Ala Cys Ala Ala Gly

275 280 285

Ala Gly Ala Gly Thr Gly Gly Ala Gly Cys Cys Cys Ala Ala Gly Ala

290 295 300

Gly Cys Thr Gly Cys Gly Ala Cys Ala Ala Gly Ala Cys Cys Cys Ala

305 310 315 320

Cys Ala Cys Cys Thr Gly Cys Cys Cys Cys Cys Cys Cys Thr Gly Cys

325 330 335

Cys Cys Ala Gly Cys Cys Cys Cys Ala Gly Ala Gly Cys Thr Gly Cys

340 345 350

Thr Gly Gly Gly Cys Gly Gly Ala Cys Cys Cys Ala Gly Cys Gly Thr

355 360 365

Gly Thr Thr Cys Cys Thr Gly Thr Thr Cys Cys Cys Cys Cys Cys Cys

370 375 380

Ala Ala Gly Cys Cys Cys Ala Ala Gly Gly Ala Cys Ala Cys Cys Cys

385 390 395 400

Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Cys Ala Gly Cys Ala Gly Gly Ala Cys

405 410 415

Cys Cys Cys Cys Gly Ala Gly Gly Thr Gly Ala Cys Cys Thr Gly Cys

420 425 430

Gly Thr Gly Gly Thr Gly Gly Thr Gly Gly Ala Cys Gly Thr Gly Ala

435 440 445

Gly Cys Cys Ala Cys Gly Ala Gly Gly Ala Cys Cys Cys Ala Gly Ala

450 455 460

Gly Gly Thr Gly Ala Ala Gly Thr Thr Cys Ala Ala Cys Thr Gly Gly

465 470 475 480

Thr Ala Cys Gly Thr Gly Gly Ala Cys Gly Gly Cys Gly Thr Gly Gly

485 490 495

Ala Gly Gly Thr Gly Cys Ala Cys Ala Ala Cys Gly Cys Cys Ala Ala

500 505 510

Gly Ala Cys Cys Ala Ala Gly Cys Cys Cys Ala Gly Ala Gly Ala Gly

515 520 525

Gly Ala Gly Cys Ala Gly Thr Ala Cys Ala Ala Cys Ala Gly Cys Ala

530 535 540

Cys Cys Thr Ala Cys Ala Gly Gly Gly Thr Gly Gly Thr Gly Thr Cys

545 550 555 560

Cys Gly Thr Gly Cys Thr Gly Ala Cys Cys Gly Thr Gly Cys Thr Gly

565 570 575

Cys Ala Cys Cys Ala Gly Gly Ala Cys Thr Gly Gly Cys Thr Gly Ala

580 585 590

Ala Cys Gly Gly Cys Ala Ala Gly Gly Ala Ala Thr Ala Cys Ala Ala

595 600 605

Gly Thr Gly Cys Ala Ala Gly Gly Thr Cys Thr Cys Cys Ala Ala Cys

610 615 620

Ala Ala Gly Gly Cys Cys Cys Thr Gly Cys Cys Ala Gly Cys Cys Cys

625 630 635 640

Cys Cys Ala Thr Cys Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Cys Cys Ala Thr

645 650 655

Cys Ala Gly Cys Ala Ala Gly Gly Cys Cys Ala Ala Gly Gly Gly Cys

660 665 670

Cys Ala Gly Cys Cys Ala Cys Gly Gly Gly Ala Gly Cys Cys Cys Cys

675 680 685

Ala Gly Gly Thr Gly Thr Ala Cys Ala Cys Cys Cys Thr

690 695 700

<210> 60

<211> 323

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> GM63 κ轻链恒定域

<400> 60

Gly Ala Ala Cys Thr Gly Thr Gly Gly Cys Thr Gly Cys Ala Cys Cys

1 5 10 15

Ala Thr Cys Thr Gly Thr Cys Thr Thr Cys Ala Thr Cys Thr Thr Cys

20 25 30

Cys Cys Gly Cys Cys Ala Thr Cys Thr Gly Ala Thr Gly Ala Gly Cys

35 40 45

Ala Gly Thr Thr Gly Ala Ala Ala Thr Cys Thr Gly Gly Ala Ala Cys

50 55 60

Thr Gly Cys Cys Thr Cys Ala Gly Thr Gly Gly Thr Gly Thr Gly Cys

65 70 75 80

Cys Thr Gly Cys Thr Gly Ala Ala Cys Ala Ala Cys Thr Thr Cys Thr

85 90 95

Ala Cys Cys Cys Cys Cys Gly Gly Gly Ala Gly Gly Cys Cys Ala Ala

100 105 110

Gly Gly Thr Gly Cys Ala Gly Thr Gly Gly Ala Ala Gly Gly Thr Gly

115 120 125

Gly Ala Cys Ala Ala Cys Gly Cys Cys Cys Thr Gly Cys Ala Gly Ala

130 135 140

Gly Cys Gly Gly Cys Ala Ala Cys Ala Gly Cys Cys Ala Gly Gly Ala

145 150 155 160

Gly Ala Gly Cys Gly Thr Cys Ala Cys Cys Gly Ala Gly Cys Ala Gly

165 170 175

Gly Ala Cys Ala Gly Cys Ala Ala Gly Gly Ala Cys Thr Cys Cys Ala

180 185 190

Cys Cys Thr Ala Cys Ala Gly Cys Cys Thr Gly Ala Gly Cys Ala Gly

195 200 205

Cys Ala Cys Cys Cys Thr Gly Ala Cys Cys Cys Thr Gly Thr Cys Cys

210 215 220

Ala Ala Gly Gly Cys Cys Gly Ala Cys Thr Ala Cys Gly Ala Gly Ala

225 230 235 240

Ala Gly Cys Ala Cys Ala Ala Gly Gly Thr Gly Thr Ala Cys Gly Cys

245 250 255

Cys Thr Gly Cys Gly Ala Gly Gly Thr Gly Ala Cys Cys Cys Ala Cys

260 265 270

Cys Ala Gly Gly Gly Cys Cys Thr Gly Thr Cys Cys Ala Gly Cys Cys

275 280 285

Cys Cys Gly Thr Gly Ala Cys Cys Ala Ala Gly Ala Gly Cys Thr Thr

290 295 300

Cys Ala Ala Cys Ala Gly Gly Gly Gly Cys Gly Ala Gly Thr Gly Cys

305 310 315 320

Thr Gly Ala

<210> 61

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 9E4表位126-140

<400> 61

Glu Met Pro Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala

1 5 10 15

<210> 62

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> CDR1 VH

<400> 62

Ser Tyr Trp Met His

1 5

<210> 63

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> CDR2 VH

<400> 63

Arg Ile Asp Pro Asn Ser Gly Thr Thr Lys Tyr Asn Val Asn Phe Lys

1 5 10 15

Thr

<210> 64

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> CDR3 VH

<400> 64

Leu Gly His Tyr Gly Asn Leu Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 65

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> CDR1 VL

<400> 65

Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His

1 5 10

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<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> CDR2 VL

<400> 66

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser

1 5

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<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> CDR3 VL

<400> 67

Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr

1 5

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<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

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Trp Met His Trp Met Lys Gln Arg Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile

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<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> m2E6 VL

<400> 69

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Thr Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Asp Thr Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 70

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> ch2E6 VH

<400> 70

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1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Met Lys Gln Arg Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Asn Ser Gly Thr Thr Lys Tyr Asn Val Asn Phe

50 55 60

Lys Thr Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Pro Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Gly His Tyr Gly Asn Leu Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Ser Val Thr

115

<210> 71

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

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<400> 71

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Thr Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Asp Thr Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 72

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 2E6-HLD1 VH

<400> 72

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Asn Ser Gly Thr Thr Lys Tyr Asn Val Asn Phe

50 55 60

Lys Thr Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Gly His Tyr Gly Asn Leu Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr

115

<210> 73

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 2E6-HLD1 VL

<400> 73

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Arg Trp Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

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65 70 75 80

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Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 74

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 2E6-HLD2 VH

<400> 74

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Asn Ser Gly Thr Thr Lys Tyr Asn Val Asn Phe

50 55 60

Lys Thr Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Gly His Tyr Gly Asn Leu Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr

115

<210> 75

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 2E6-HLD2 VL

<400> 75

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Arg Trp Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

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Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr

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Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 76

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 2E6-HLD 3 VH

<400> 76

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Asn Ser Gly Thr Thr Lys Tyr Asn Val Asn Phe

50 55 60

Lys Thr Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Gly His Tyr Gly Asn Leu Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr

115

<210> 77

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 2E6-HLD 3 VL

<400> 77

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Arg Trp Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu

65 70 75 80

Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Asn

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 78

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> D1.2 CDR 1轻链

<400> 78

Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His

1 5 10 15

<210> 79

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> D1.2 CDR 2轻链

<400> 79

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 80

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> D1.2 CDR 3轻链

<400> 80

Ser Gln Ser Thr His Val Pro

1 5

<210> 81

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> D1.2 CDR 1重链

<400> 81

Lys Ala Ser Gly Asn Thr Phe Thr Asp Tyr Glu Ile His

1 5 10

<210> 82

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> D1.2 CDR 2重链

<400> 82

Ala Ile Asp Pro Glu Thr Gly Asn Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 83

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> D1.2 CDR 3重链

<400> 83

Ser Arg Gly Phe Asp Tyr

1 5

<210> 84

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> D1.2轻链

<400> 84

Asp Val Met Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp His Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Phe Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser

85 90 95

Thr His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu

115 120 125

Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg

145 150 155 160

Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

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180 185 190

Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser

195 200 205

Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

210 215

<210> 85

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> D1.2重链

<400> 85

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Asn Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Glu Ile His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Asp Pro Glu Thr Gly Asn Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Arg Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Ser Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro

115 120 125

Gly Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val

130 135 140

Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Ser Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser

145 150 155 160

Leu Ser Ser Ser Val His Thr Phe Pro Ala Leu Leu Gln Ser Gly Leu

165 170 175

Tyr Thr Met Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser

180 185 190

Gln Thr Val Thr Cys Ser Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Thr Val

195 200 205

Asp Lys Lys Leu Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Pro Cys

210 215 220

Pro Pro Cys Lys Glu Cys His Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Glu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Asn Ile Lys Asp Val Leu Met

245 250 255

Ile Ser Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu

260 265 270

Asp Asp Pro Asp Val Arg Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val

275 280 285

His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Ile

290 295 300

Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly

305 310 315 320

Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ser Pro Ile

325 330 335

Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ile Lys Gly Leu Val Arg Ala Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Ile Leu Pro Pro Pro Ala Glu Gln Leu Ser Arg Lys Asp Val Ser

355 360 365

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370 375 380

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385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Ile Tyr Ser Lys Leu Asp Ile

405 410 415

Lys Thr Ser Lys Trp Glu Lys Thr Asp Ser Phe Ser Cys Asn Val Arg

420 425 430

His Glu Gly Leu Lys Asn Tyr Tyr Leu Lys Lys Thr Ile Ser Arg Ser

435 440 445

Pro Gly Lys

450

<210> 86

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> C10.2 CDR 1轻链

<400> 86

Gln Ala Ser Gln Gly Thr Ser Ile Asn Leu Asn

1 5 10

<210> 87

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> C10.2 CDR 2轻链

<400> 87

Gly Ala Ser Asn Leu Glu Asp

1 5

<210> 88

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> C10.2 CDR 3轻链

<400> 88

Leu Gln His Thr Tyr Leu Pro

1 5

<210> 89

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> C10.2 CDR 1重链

<400> 89

Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Arg Thr Ile His

1 5 10

<210> 90

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> C10.2 CDR 2重链

<400> 90

Tyr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Asn Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 91

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> C10.2 CDR 3 重链

<400> 91

Arg Gly Ala Met Asp Tyr

1 5

<210> 92

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> C10.2轻链

<400> 92

Asp Val Gln Met Ile Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Ile Val Thr Met Thr Cys Gln Ala Ser Gln Gly Thr Ser Ile Asn

20 25 30

Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Asp

65 70 75 80

Glu Asp Met Ala Thr Tyr Phe Cys Leu Gln His Thr Tyr Leu Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala

100 105 110

Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly

115 120 125

Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile

130 135 140

Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu

145 150 155 160

Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr

180 185 190

Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Asn Glu Cys

210

<210> 93

<211> 439

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> C10.2重链

<400> 93

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Asp Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Arg

20 25 30

Thr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Asn Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro

115 120 125

Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val

130 135 140

Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser

145 150 155 160

Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu

165 170 175

Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser

180 185 190

Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val

195 200 205

Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys

210 215 220

Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys

225 230 235 240

Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val

245 250 255

Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp

260 265 270

Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe

275 280 285

Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp

290 295 300

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe

305 310 315 320

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys

325 330 335

Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys

340 345 350

Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp

355 360 365

Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys

370 375 380

Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser

385 390 395 400

Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr

405 410 415

Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser

420 425 430

Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

435

<210> 94

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> CDR1 VL 7C4

<400> 94

Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Phe Met His

1 5 10

<210> 95

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> CDR1 VL 7A10/8D9

<400> 95

Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile His

1 5 10

<210> 96

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> CDR3 VL L3

<400> 96

Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Phe

1 5

<210> 97

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> CDR1 VH 7C4

<400> 97

Arg Tyr Trp Met His

1 5

<210> 98

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> CDR2 VH 5A1

<400> 98

Arg Val Asp Pro Asn Ser Gly Thr Thr Lys Tyr Asn Val Asn Phe Lys

1 5 10 15

Thr

<210> 99

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> CDR2 VH 9G11

<400> 99

Arg Ile Asp Pro Asn Ser Gly Thr Thr Lys Tyr Asn Val His Phe Lys

1 5 10 15

Thr

<210> 100

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> CDR2 VH 9C12

<400> 100

Arg Ile Asp Pro Asn Ser Gly Thr Thr Lys Tyr Asn Val Asn Ile Lys

1 5 10 15

Thr

<210> 101

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> CDR3 VH 5A1

<400> 101

Leu Gly His Tyr Gly Asn Leu Asn Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 102

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> CDR3 VH 9D7

<400> 102

Leu Gly His Tyr Ser Lys Val Leu Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 103

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> CDR3 VH 7A10/8D9

<400> 103

Leu Gly His Tyr Gly Asn Leu Tyr Ala Lys Asp Tyr

1 5 10

<210> 104

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 5A1 VL

<400> 104

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Arg Trp Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu

65 70 75 80

Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 105

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 5A1 VH

<400> 105

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Gln Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Tyr Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Val Asp Pro Asn Ser Gly Thr Thr Lys Tyr Asn Val Asn Phe

50 55 60

Lys Thr Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Thr Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Gly His Tyr Gly Asn Leu Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr

115

<210> 106

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 9D7 VL

<400> 106

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Arg Trp Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu

65 70 75 80

Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 107

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 9D7 VH

<400> 107

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Asn Ser Gly Thr Thr Lys Tyr Asn Val Asn Phe

50 55 60

Lys Thr Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Gly His Tyr Ser Lys Val Leu Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr

115

<210> 108

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 9G11 VL

<400> 108

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Gln Ala Pro Arg Arg Trp Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu

65 70 75 80

Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 109

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 9G11 VH

<400> 109

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Asn Ser Gly Thr Thr Lys Tyr Asn Val His Phe

50 55 60

Lys Thr Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Gly His Tyr Gly Asn Leu Tyr Ala Thr Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr

115

<210> 110

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 7C4 VL

<400> 110

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Phe Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Arg Trp Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu

65 70 75 80

Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 111

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 7C4 VH

<400> 111

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Pro Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Asn Ser Gly Thr Thr Lys Tyr Asn Val Asn Phe

50 55 60

Lys Thr Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Gly His Tyr Gly Asn Leu Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr

115

<210> 112

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> L3 VL

<400> 112

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Arg Trp Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu

65 70 75 80

Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 113

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> L3 VH

<400> 113

Gln Val Gln Leu Val Gln Gln Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Asn Ser Gly Thr Thr Lys Tyr Asn Val Asn Phe

50 55 60

Lys Thr Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Gly His Tyr Gly Asn Leu Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr

115

<210> 114

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 7A10 VL

<400> 114

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Arg Trp Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu

65 70 75 80

Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Asn

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 115

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 7A10 VH

<400> 115

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Asn Ser Gly Thr Thr Lys Tyr Asn Val Asn Phe

50 55 60

Lys Thr Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Gly His Tyr Gly Asn Leu Tyr Ala Lys Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr

115

<210> 116

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 8D9 VL

<400> 116

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Arg Trp Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu

65 70 75 80

Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 117

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 8D9 VH

<400> 117

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Asn Ser Gly Thr Thr Lys Tyr Asn Val Asn Phe

50 55 60

Lys Thr Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Gly His Tyr Gly Asn Leu Tyr Ala Lys Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr

115

<210> 118

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 9C12 VL

<400> 118

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Arg Leu Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu

65 70 75 80

Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 119

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 9C12 VH

<400> 119

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Asn Ser Gly Thr Thr Lys Tyr Asn Val Asn Ile

50 55 60

Lys Thr Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Gly His Tyr Gly Asn Leu Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr

115

<210> 120

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 6B6 VL

<400> 120

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Arg Leu Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu

65 70 75 80

Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 121

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工的（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 6B6 VH

<400> 121

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Asn Ser Gly Thr Thr Lys Tyr Asn Val Asn Phe

50 55 60

Lys Thr Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Gly His Tyr Gly Asn Leu Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr

115

Claims (15)

1.一种α-突触核蛋白结合单克隆抗体或其抗原结合片段，用于抑制τ蛋白的聚集。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中该抗体结合聚集的可溶形式的α-突触核蛋白。

3.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中τ蛋白聚集的抑制在体内或体外。

4.根据前述权利要求中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中将所述α-突触核蛋白抗体给予患有阿尔茨海默氏病的患者。

5.根据前述权利要求中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中该患者不具有阿尔茨海默氏病的路易体变体或组合型帕金森氏和阿尔茨海默氏病。

6.根据权利要求1-3所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中将所述α-突触核蛋白抗体给予患有选自下组的τ蛋白病变的患者，该组包括以下：嗜银颗粒痴呆(AGD)；精神病，特别是因AD导致的精神病或患有AD的患者中的精神病；患有路易体痴呆症的患者的精神病症状；进行性核上性麻痹(PSP)；额颞痴呆(FTD或其变体)；TBI(急性或慢性创伤性脑损伤)；皮质基底节变性(CBD)；皮克病；原发性年龄相关性τ蛋白病变(PART)；神经原纤维缠结为主型老年性痴呆；拳击员痴呆；慢性创伤性脑病；中风；中风恢复；与帕金森氏病相关的神经变性；与染色体关联的帕金森综合征；利缇可-伯蒂格病(关岛型帕金森氏病-痴呆复合征)；神经节胶质瘤和神经节细胞瘤；脑膜血管瘤病；脑炎后帕金森综合征；亚急性硬化性全脑炎；亨廷顿氏病；铅中毒脑病；结节性硬化症；哈勒沃登-施帕茨病以及脂褐质沉积症；更典型地，该τ蛋白病变选自下组，该组由以下组成：阿尔茨海默氏病；嗜银颗粒痴呆(AGD)；精神病，特别是因AD导致的精神病或患有AD的患者中的精神病；患有路易体痴呆症的患者的精神病症状；进行性核上性麻痹(PSP)；额颞痴呆(FTD或其变体)；TBI(急性或慢性创伤性脑损伤)；皮质基底节变性(CBD)；以及皮克病。

7.根据前述权利要求中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述α-突触核蛋白抗体结合至α-突触核蛋白的C-末端部分。

8.根据权利要求7所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中该抗体结合至人α-突触核蛋白的C-末端氨基酸110-140内的表位。

9.根据权利要求7或8所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述表位是在人α-突触核蛋白(SEQ ID NO10)的氨基酸112-117、112-115、118-126、126-138或136-140内。

10.根据权利要求1-9所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其片段包含：

(a)具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链CDR1；

(b)具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链CDR2；

(c)具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链CDR3；

(d)具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链CDR1；

(e)具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链CDR2；和

(f)具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链CDR3。

11.根据权利要求1-9所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其片段包含：

(a)具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链CDR1；

(b)具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的重链CDR2；

(c)具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链CDR3；

(d)具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链CDR1；

(e)具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链CDR2；和

(f)具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链CDR3。

12.根据权利要求1-9所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其片段包含：

(a)具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链CDR1；

(b)具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的重链CDR2；

(c)具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链CDR3；

(d)具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链CDR1；

(e)具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链CDR2；和

(f)具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链CDR3。

13.根据权利要求1-9所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其片段包含：

(a)具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链CDR1；

(b)具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的重链CDR2；

(c)具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链CDR3；

(d)具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链CDR1；

(e)具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链CDR2；和

(f)具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链CDR3。

14.根据权利要求1-9中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其片段包含：

(a)具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的重链CDR1；

(b)具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链CDR2；

(c)具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的重链CDR3；

(d)具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的轻链CDR1；

(e)具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的轻链CDR2；和

(f)具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的轻链CDR3。

15.一种药物组合物，该药物组合物包含根据以上权利要求中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体。