UA124733C2 - Антитіло до альфа-синуклеїну - Google Patents

Антитіло до альфа-синуклеїну Download PDF

Info

Publication number
UA124733C2
UA124733C2 UAA201811679A UAA201811679A UA124733C2 UA 124733 C2 UA124733 C2 UA 124733C2 UA A201811679 A UAA201811679 A UA A201811679A UA A201811679 A UAA201811679 A UA A201811679A UA 124733 C2 UA124733 C2 UA 124733C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
antibody
antigen
synuclein
binding fragment
amino acid
Prior art date
Application number
UAA201811679A
Other languages
English (en)
Inventor
Майкл Перкінтон
Майкл Перкинтон
Даррен Скоуфілд
Даррен Скоуфилд
Лоррейн Ірвінґ
Лоррейн Ирвинг
Джордж Том
Original Assignee
Медімм'Юн Лімітед
Медимм'Юн Лимитед
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Медімм'Юн Лімітед, Медимм'Юн Лимитед filed Critical Медімм'Юн Лімітед
Publication of UA124733C2 publication Critical patent/UA124733C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • G01N33/537—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with separation of immune complex from unbound antigen or antibody
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Abstract

Винахід стосується антитіла, що зв'язується з людським α-синуклеїном.

Description

ПЕРЕХРЕСНЕ ПОСИЛАННЯ НА СПОРІДНЕНУ ЗАЯВКУ
Дана заявка претендує на пріоритет за попередньою заявкою США Мо 62/344,746, поданої 2 червня 2016 року. Зазначена вище заявка є включеною в даний документ у вигляді посилання у всій своїй повноті.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
Представлена заявка містить перелік послідовностей, який є поданим в електронному вигляді в форматі АЗСІЇ та включеним в даний документ у вигляді посилання у всій своїй повноті. Зазначена копія АЗСІЇ, створена 30 травня 2017 року, називається 1848081-0002-091-
УММО1 5І хі та має розмір 48 099 байт.
ПЕРЕДУМОВИ СТВОРЕННЯ ВИНАХОДУ
Представлений винахід стосується а-синуклеїнових антитіл та їх застосування в попередженні або лікуванні захворювань, зокрема, альфа-синуклеїнопатій, та більш конкретно хвороби Паркінсона (РО).
Альфа-синуклеїнопатії, також відомі як захворювання тілець Леві (180), є родиною нейродегенеративних захворювань, які всі мають у своєму ядрі альфа-синуклеїн як ключову патологічну ознаку Оеїйпдег, Мом Оізога (2003), 18 Биррі 6: 52-12; та 5рійПапійпі та соеєдегі, Апп М
У Асай Зсі (2000), 920: 16-27; обидві з яких є включеними в даний документ у вигляді посилання). Альфа-синуклеїнопатії включають хворобу Паркінсона (РО), деменцію з тільцями
Леві (ОІВ) та множинну системну атрофію (М5А).
РО представляє собою повільно прогресуюче вікове порушення руху, яке вражає більше, ніж 195 людей старше 65 років. РО є другим найбільш поширеним нейродегенеративним станом після хвороби Альцгеймера.
Визначальною ознакою патології альфа-синуклеїнопатії є тільця Леві та нейрити Леві, які є нерозчинними включеннями агрегованих протеїнів, виявлених всередині нейронів головного мозку, виявлених після патологоанатомічного дослідження.
Присутність патології Леві та втрати нейронів у немоторних ділянках мозку, таких як базальний відділ переднього мозку, мезопонтинна система, мигдалина, неокортекс, дорзальне моторне ядро блукаючого нерва, нюхові цибулини, блакитна пляма, та стовбур мозку, можуть викликати когнітивний дефіцит та деменцію, гіпосмію, порушення сну, включаючи розлад
Зо поведінки сну зі швидким рухом очей (КВО), розлади настрою, включаючи депресію та тривогу, вегетативну дисфункцію, включаючи серцево-судинні та шлунково-кишкові проблеми, такі як запори, втому та сонливість. Деякі з цих немоторних симптомів виникають, щоб характеризувати премоторну або продромальну фазу захворювання (Каїйа еї аї. І апсеї (2015), 386(9996): 896-912; включений в даний документ у вигляді посилання).
Присутність патології Леві та втрати нейронів в моторних ділянках мозку, включаючи, зокрема, загибель дофамінергічних нейронів в чорній субстанції, може викликати тремтіння, ригідність, брадикінезію та постуральну нестабільність (ЗріПапіїпі та соєаегі, Апп М МУ Асай 5сі (2000), 920: 16-27; включений в даний документ у вигляді посилання).
Альфа-синуклеїновий (також називається "а-синуклеїн" або "а-5уп") протеїн є головним структурним компонентом тілець Леві та нейритів Леві. Альфа-синуклеїн представляє собою невеликий кислотний протеїн, який складається з 140 амінокислот (14 Кора). Людський природний немутантного типа альфа-синуклеїн має амінокислотну послідовність ХЕО ІЮО МО: 1 як описано в ОпіРгоїКкВ з номером доступу РЗ37840. Якщо інше не є очевидним з контексту, посилання на альфа-синуклеїн або його фрагменти включає природну людську немутантного типа амінокислотну послідовність, зазначену вище, та її людські аллельні варіанти, зокрема, ті, які пов'язані із захворюванням тілець Леві (наприклад, Е46К, АЗОР, Н5ОС, 5510 та А5БЗТ, де перша літера позначає амінокислоту в 5БЕО ІЮО МО: 1, число представляє собою положення кодона в ЗЕО ІЮ МО: 1, та друга літера представляє собою амінокислоту в аллельному варіанті). Такі варіанти можуть необов'язково бути присутніми окремо або в будь-якій комбінації.
Індуковані мутації ЕВЗО, А9ОМ, А76Т, які посилюють агрегацію альфа-синуклеїну, також можуть бути присутніми окремо або в комбінації один з одним та/або з людськими аллельними варіантами Е46К, АЗОР, Н5ЬОО, 5510 та А5ЗТ. На структурному рівні, альфа-синуклеїн містить три окремі ділянки: амфіпатичний М-термінальний альфа-спіральний домен, який має ліпідні та мембранні зв'язуючі властивості (залишки 1-60), центральний гідрофобний амілоїд-зв'язуючий домен, який кодує не-амілоїдний бета компонент (МАС) бляшок (залишки 61-95), та кислотний збагачений проліном С-термінальний хвіст (залишки 96-140). Залишки 71-82 МАС домен, як вважається, є ключовими для агрегаційних/фібриляційних властивостей альфа-синуклеїна, дозволяючи протеїну 0 переходити від структури випадкової спіралі до структури бета-листа (Візадіїа еї аі. РАБЕВ .) (2009), 23(2): 329-40; включений в даний документ у вигляді посилання). бо Хоча С-термінальний домен є вільним значної вторинної структури, він містить сайт ключового фосфорилювання на залишку 5ег129 та низку тирозинових залишків, які нітруються в цитозольних альфа-синуклеїнових включеннях. М-термінальні та С-термінальні усічені форми альфа-синуклеїни також існують. Посттрансляційні модифікації протеїна можуть впливати на агрегацію та токсичність альфа-синуклеїну (Опцезіаїі єї аІ. Ргод Вгаїп Нез (2010), 183: 115-45; включений в даний документ у вигляді посилання).
Альфа-синуклеїн є рясним в центральній нервовій системі (ЦНСО)/мозку, де він є знайденим як внутрішньоклітинно в нейронах та гліях, так також і позаклітинно в спинномозковій рідині (СЕ) (Моїепнацег єї аї. У Мешга! Тгтапот (2012), 119(7): 739-46; включений в даний документ у вигляді посилання), так і інтерстиціальній рідині (ЗЕ), яка омиває та оточує клітини мозку (Еттапоціїйдои еї аї. РГо5 Опе (2011), 6(7): е22225; включений в даний документ у вигляді посилання). Альфа-синуклеїн представляє собою синаптичний протеїн, який переважно експрсується в нейронах неокортексу, гіпокампу, чорній субстанції, таламусі, та мозочку (Імаї еї а». Нейрон (1995), 14: 467-475; включений в даний документ у вигляді посилання).
В фізіологічних умовах він є розташованим в нейрональних синаптичних закінченнях та є специфічно підвищено регульованими в пресинаптичних закінченнях під час синаптичного перегрупування, пов'язаного з набуттям (БРогіїй єї ам. У Мецтовзсі (2005), 25: 10913-10921; включений в даний документ у вигляді посилання).
Іп-мйко дослідження показали, що альфа-синуклеїнові мономери можуть утворювати відправну точку для процесу агрегації. Мономер може агрегуватися в безліч дрібних олігомерних видів, які потім стабілізуються взаємодіями бета-листа, перетворюючись на протофібрили, які можуть полімеризуватися в нерозчинні фібрилярні структури, що нагадують ті, які були виявлені в тільцях Леві (Стетадез еї аї. Сеї! (2012), 149(5): 1048-59; включений в даний документ у вигляді посилання).
При патологічних станах аберантна агрегація альфа-синуклеїну може бути ключем до патологічних змін, які спостерігаються при альфа-синуклеїнопатіях (І азпиеї! еї аї. Маїиге (2002), 418: 291; та Т5ідеІпу еї аІ. РЕЕВ5 доштаї (2007), 274: 1862-1877; обидві з яких є включеними в даний документ у вигляді посилання). Іп міїто та іп мімо дослідження показали, що нейротоксичні ефекти альфа-синуклеїну, як видається, викликаються малими розчинними олігомерними конформерами або протофібрилами (У/ппег еї аї. Ргос Маї! Асай 5сі 0 5 А (2011), 108(10): 4194- 9; та ОЮаплег єї а). У Мешгозсі (2007), 27(34): 9220-32; обидві з яких є включеними в даний документ у вигляді посилання). Хоча фібрилярні агрегати альфа-синуклеїну є характерними для
РО, олігомерні форми альфа-синуклеїну є токсичними видами (Оап?ег єї аї. ) Мешговзсі (2007), 27(34): 9220-32; І азп!еї! еї а. Маїиге (2002), 418: 291; та УМіппег єї а). Ргос Маї! Асад сі ОБА (2011), 108: 4194-4199; кожна з яких є включеною в даний документ у вигляді посилання).
Альфа-синуклеїнові олігомери може вивільнятися в позаклітинне середовище та займатися сусідніми клітинами в механізмі "розповсюдження" (Апдої та Вгипаїйп, Рагкіпхопізт Кеїаї Оізхога (2009), 15 Биррі 3: 5143-147; ЮОезріаїв єї а). Ргос Маї! Асай 5сі ОБА (2009), 106: 13010-13015; та
Ї се єї аї. У Віої Снет (2010), 285: 9262-9272; кожна з яких є включеною в даний документ у вигляді посилання). Агрегати альфа-синуклеїну можуть поширюватися неправильним скручуванням через пріон-подібний механізм розповсюдження (і ее єї а)Ї. Маї Нем Мешгої (2010), 6: 702-706; Г ик еї аІ. У Ехр Меа (2012), 209(5): 975-86; та І ик єї а). 5сівєпсе (2012), 338(6109): 949-53; кожна з яких є включеною в даний документ у вигляді посилання). Альфа-синуклеїн може, таким чином, індукувати нейродегенерацию шляхом або олігомерної токсичності, або розмноженням, та пріон-подібним поширенням.
В даний час є добре відомим та прийнятним, що клітини, включаючи нейрони, можуть секретувати різні форми альфа-синуклеїну (мономерів, олігомерів, агрегатів) в нормальних умовах, та також в умовах клітинного стресу, підвищеною є секреція мономерних та агрегованих форм альфа-синуклеїну в умовах клітинного стресу та через дане вивільнення альфа-синуклеїну в позаклітинне середовище, патологічні трансмісивні форми альфа- синуклеїну можуть поширюватися між нейронами (Кесазепз та Оепау, Егопі Мешигоапаї (2014), 8: 159; включений вданий документу вигляді посилання).
Ефекти альфа-синуклеїну при РО можуть виходити за межі негайного пошкодження вразливих нейрональних клітин. Як і при більшості нейродегенеративних захворювань, спостерігається також прозапальна клітинна відповідь (І ее еї аї. 9 Віої Спет (2010), 285: 9262- 9272; включений в даний документ у вигляді посилання). Циркулюючі альфа-синуклеїн та/або активовані астроцити можуть активувати мікроглії, що призводить до збільшення генерації реакційноздатних форм кисню, оксиду нітрогену та цитокіну, та подальшого посилення нейродегенерації (І ее еї аї. ) Віої Снет (2010), 285: 9262-9272; включений в даний документ у вигляді посилання).
Різноманітність різних експериментальних моделей продемонстрували передачу від клітини до клітини альфа-синуклеїну в культуральних клітинах або розповсюдження та поширення іп мімо альфа-синуклеїнових патологій. Патологія тілець Леві спостерігалася в ембріональних мезенцефальних нейрональних трансплантатах через більше, ніж 10 років після того, як трансплантати були терапевтично трансплантовані в смугасте тіло пацієнтів з РО. Зокрема, прищеплені нейрони містили низку включень, подібних до тілець Леві, які позитивно пофарбовані для альфа-синуклеїну, що вказує на те, що відбувається передача від господаря до трансплантата альфа-синуклеїнової патології (Гі еї аі. Маї Мей (2008), 14(5): 501-3; та
Когдомег єї аїЇ. Маї Меа (2008), 14(5): 504-6; обидві з яких є включеними в даний документ у вигляді посилання).
Крім того, попередньо сформовані рекомбінантні альфа-синуклеїнові фібрили та альфа- синуклеїнові олігомери можуть бути інтерналізовані культивованими клітинами та нейронами, та було продемонстровано пряме перенесення альфа-синуклеїну від донора до клітин- реципієнтів з утворенням альфа-синуклеїнових включень, аналогічних до патології Леві (бапгег еї а. У Мешговсі (2007), 27(34): 9220-32; МоіІрісеїП-Оаїєу єї аІ. Нейрон (2011), 72(1): 57-71; та ик еї а. Ргос Майї! Асай сі ОО 5 А (2009), 106(47): 20051-6; кожна з яких є включеною в даний документ у вигляді посилання). Ін'єкція попередньо сформованих синтетичних альфа- синуклеїнових фібрил або подібного до тілець Леві альфа-синуклеїну, який міститься в матеріалі, екстрагованому з мозку старих альфа-синуклеїнових трансгенних мишей, в мозок безсимптомної миші-реципієнта сприяє утворенню патології, подібної до тілець Леві в нейронах господаря тварин-реципієнтів разом з нейродегенерацією та неврологічним дефіцитом (ик еї а. У Ехр Меа (2012), 209(5): 975-86; та І ШИК еї аі. бсієпсе (2012), 338(6109): 949-53; обидві з яких є включеними в даний документ у вигляді посилання). Екстракти тілець Леві, які містять альфа- синуклеїн, виділені з мозку РО, інокульовані в чорну субстанцію або смугасте тіло мавп-макак та мишей швидко забираються клітинами-господарями (в межах 24 годин) з наступною більш повільною втратою стриарних дофамінергічних кінців, з очевидною втратою клітин після більше, ніж року (Кесазепз еї а. Апп Мештгої! (2014), 75(3): 351-62; включений в даний документ у вигляді посилання). Аналогічно, інокуляція мишей гомогенатами мозку, отриманими від пацієнтів з синуклеїнопатіями СІВ або М5А, викликає альфа-синуклеїнову подібну до Леві патологію у
Зо мишей-господарів (Умайз:х еї а). Ргос Маї! Асад Зсі ОО 5 А (2013), 110(48): 19555-60; та Мазида- зЗи7иКаке еї аї. Вгаіп (2013), 1З36(РІ 4)3: 1128-38; обидві з яких є включеними в даний документ у вигляді посилання). Нарешті, трансфер та передача як мономерного, так і олігомерного альфа- синуклеїну з нюхової цибулини до взаємопов'язаних мозкових структур була продемонстрована на мишах (Кеу еї аї. Асіа Мегораїної (2013), 126(4): 555-73; включений в даний документ у вигляді посилання).
Пасивні імунотерапевтичні підходи з антитілами, націленими на альфа-синуклеїн, були протестовані в численних доклінічних мишачих моделях альфа-синуклеїнопатії (І ажмапа еї а).
Ехрепй Оріп Тег Тагоєїв (2015): 1-40; включений в даний документ у вигляді посилання).
Зокрема, дослідження з використанням моноклонального антитіла, спрямованого проти альфа- синуклеїну (9Е4), показало іп мімо кліренс альфа-синуклеїнових агрегатів та патології, поведінкові моторні покращення та нейропротекторні ефекти (УМО 2014/058924; що є включеною в даний документ у вигляді посилання).
Подальші дослідження з використанням пасивної імунізації альфа-синуклеїнових трансгенних мишей, розроблених як експериментальні моделі РО/ОЇВ, з моноклональним антитілом 9Е4 показали антитіло до чистої альфа-синуклеїнової патології, яке знижує синаптичні та аксональні дефіцити, анулює втрати стриральних тирозингідроксилазних волокон, та значно зменшує дефіцити пам'яті та порушення рухової функції (Сатев єї аЇ. ) Мешцгозсі (2014), 34(28): 9441-54; Ває вї а!. ) Мешговзсі (2012), 32(39): 13454-69; та Мазіїан еї а!. Рі о5 Опе (2011), 6(4): е19338; кожна з яких є включеними в даний документ у вигляді посилання). Крім того, було продемонстровано, що пасивне введення анти-альфа-синуклеїнових моноклональних антитіл немутантного типа мишам, які були ін'єкційно введеними інтрастриарно з синтетичними альфа-синуклеїновими попередньо утвореними фібрилами (рії), призводило до сильного зниження патології Леві, запобігання втрати допамінового нейрона в чорній субстанції, та значного покращення рухових порушень, які проявляються в моделі на мишах після обробки рії: (Тгап еї а!. Сеї! Вер (2014), 7(6): 2054-65; включений в даний документ у вигляді посилання).
Крім того, однією з основних проблем, пов'язаних з лікуванням порушень ЦНС терапевтичними засобами з великими молекулами, такими як антитіла, є доставка даних лікарських засобів в уражені тканини. Прохід великих молекул в головний мозок та спинний бо мозок є значною мірою обмеженим гематоенцефалічним бар'єром (ВВВ). ВВВ захищає та регулює гомеостаз головного мозку та запобігає вільному проходженню молекул у більшість частин мозку, обмежуючи тим самим лікування багатьох захворювань головного мозку.
Транспортування важливих молекул, таких як поживні речовини, фактори росту та гормони, досягається за допомогою низки специфічних транспортерів та рецепторів, які регулюють проходження через ендотеліальні клітини мозку. Таким чином, доставка біологічних препаратів та інших лікарських засобів до головного мозку є серйозною проблемою. Додатково, мабуть, існують механізми транспортування, які швидко видаляють антитіла з головного мозку, імовірно, для запобігання запальних відповідей через залучення Ес з ефекторними лігандами, які сприяють прозапальній відповіді.
Протягом останнього десятиліття з'явилися повідомлення про перенесення антитіл через
ВВВ, коли зв'язування з позаклітинним доменом молекул-транспортерів полегшує трансцитоз комплексу рецепторного антитіла через шар ендотеліальних клітин.
ВВВ в основному складається з ендотеліальних клітин капілярів головного мозку, які мають спеціалізовані характеристики, такі як щільні з'єднання, для обмеження транспорту молекул в мозок (Кеезе еї аї. 1967, 9. Сеї! Віої. 34: 207-217; Вгіднпітап еї а!. 1969, У). СеїІ Віо!. 40: 648-677;
Вибіп еї аІ. 1999, Апп. Нем. Меицговсі. 22: 11-28), хоча інші типи клітин, такі як перицити, астроцити, та нейрональні клітини, також відіграють важливу роль у функції ВВВ. Як правило, менше ніж 0,1 96 периферично дозованого антитіла досягає головного мозку (Воадо еї аї. 2010,
Мої. РІпагт. 7: 237-244; Реріп5Ку еї аї. 2011, Маї. Мешйговсі. 8: 745-751). ВВВ функціонує як фізичний, метаболічний та імунологічний бар'єр (Саїйага еї а. 2003, Місгомазс. Ке5. 65:24-31).
Транспортування антитіл через ВВВ може бути посилено шляхом ініціювання трансцитозу, опосередкованого рецептором, на ендотеліальні клітини мозку. За допомогою даного процесу залучення антигенів на люминальний бік ендотеліальної клітини може індукувати інтерналізацію та перенесення антитіла через клітку, та потім його подальше вивільнення в тканину.
Сучасні способи лікування РО лікарськими засобами в основному є сфокусованими на лікування моторно-пов'язаних симптомів захворювання. В даний час немає маркетингової або доступної терапії, яка може лікувати або запобігати альфа-синуклеїнопатії.
Відповідно, в даній галузі техніки існує потреба в терапії для лікування альфа- синуклеїнопатій, особливо у людей.
Коо) СУТЬ ВИНАХОДУ
Представлений винахід стосується виділених антитіл до альфа-синуклеїну людини. Винахід передбачає антитіла або їх антиген-зв'язуючі фрагменти, які мають одну або декілька функціональних властивостей антитіла азіо0452 пдІ-3. Наприклад:
Винахід передбачає антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент, який специфічно зв'язує С-термінальну ділянку людського а-синуклеїну. Винахід передбачає антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент, який специфічно зв'язує ділянку, яка містить від приблизно амінокислоти 102 до приблизно амінокислоти 130 людського а-синуклеїну (наприклад, 5ЕО ІЮ
МО: 1). В деяких варіантах здійснення, антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент специфічно зв'язується з ділянкою, яка містить від приблизно амінокислоти 120 до приблизно амінокислоти 130 людського а-синуклетну (ЗЕОІЮ МО: 1). В деяких варіантах здійснення, антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент зв'язується з епітопом, який не є таким самим як антитіло, зв'язане антитілом 9Е4.
Винахід передбачає антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент, що зв'язує людський а-синуклеїн, але не людський В-синуклеїн або людський у-синуклеїн.
Винахід передбачає антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент, що зв'язується з а-синуклеїном людини, щура та яванського макаки.
Винахід передбачає антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент, який зв'язується з людським а-синуклеїном з високою афінністю. В одному варіанті здійснення, антитіло, або його антиген-зв'язуючий фрагмент, за винаходом зв'язується з альфа-синуклеїномом з Ко менше, ніж 500 пікомоль (пМ), менше, ніж 400 пМ, менше, ніж 300 пМ, менше, ніж 200 пМ, менше, ніж 150
ПМ, менше, ніж 120 пМ, менше, ніж 110 пМ або 106 пМ або менше, як виміряно, наприклад, з використанням аналізу Осієї В одному варіанті здійснення, антитіло, або його антиген- зв'язуючий фрагмент, за винаходом зв'язується з альфа-синуклеїном з Ко менше, ніж 400 пікомоль (ПМ), менше, ніж 300 пМ, менше, ніж 250 пМ, менше, ніж 200 пМ, менше, ніж 150 пМ, менше, ніж 120 пМ, менше, ніж 110 пМ, менше, ніж 100 пМ, менше, ніж 80 пМ або 74 пМ або менше як виміряно, наприклад, з використанням аналізу КіпЕХА.
Винахід передбачає антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент, який зв'язується з нативним ендогенним людським а-синуклеїном.
Винахід передбачає антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент, який зв'язується з бо мономерними формами людського а-синуклеїну.
Винахід передбачає антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент, який зв'язується з агрегатами людського а-синуклеїну.
Винахід передбачає антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент, який пов'язаний з захворюванням, що відповідає патологічним формам а-синуклеїну.
Винахід передбачає антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент за винаходом, який знижує рівні а-синуклеїн в інтерстиціальній рідині головного мозку. Зокрема, антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент відповідно до винаходу знижує рівні вільного незв'язаного а- синуклеїну в інтерстиціальній рідині головного мозку.
Винахід передбачає антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент за винаходом, який знижує рівні са-синуклеїну в спинномозковій рідині. Зокрема, антитіло або його антиген- зв'язуючий фрагмент відповідно до винаходу знижує рівні вільного незв'язаного а-синуклеїну в спинномозковій рідині.
Як використовується в даному документі, терміни "вільний незв'язаний а-синуклеїн" стосуються а-синуклеїну, який не є зв'язаним з антитілом або його антиген-зв'язуючим фрагментом відповідно до винаходу. Зазначений вільний незв'язаний а-синуклеїн може застосовуватися до а-синуклеїну в його мономерній або олігомерній формі, або в агрегованій формі. Дані терміни в цілому застосовуються до будь-якої патологічної форми а-синуклеїна.
Винахід передбачає антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент, який знижує поширення са-синуклеїну іп мімо.
В одному варіанті здійснення, антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент за представленим винаходом конкурує з антитілом а5іо0452 пді-3 за зв'язування з людським а- синуклеїном.
В одному варіанті здійснення, антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент за представленим винаходом зв'язується з таким самим епітоп на людському а-синуклеїні, як антитіло азіо0452 па1-3.
В одному варіанті здійснення, антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент за представленим винаходом походить з антитіла азуп0087, яке містить варіабельну ділянку важкого ланцюга (МН) амінокислотної послідовності з 5ЕО ІО МО: 2 та варіабельну ділянку легкого ланцюга (МІ) амінокислотних послідовностей з 5ЕО ІЮ МО: 3, як розкрито в даному документі.
В конкретному варіанті здійснення, антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент за представленим винаходом походить з антитіла ахупО087, причому зазначене антитіло або антиген-зв'язуючий фрагмент має Ко менше, ніж 500 мМ та зв'язується з таким самим епітопом, як будь-який з антитіл азуп0087, азІо0452 пдІ-3 та а5І00543, описаних в даному документі.
Як використовується в даному документі, "Н--СОК" означає комплементарну визначаючу ділянку (СОК) на ділянці важкої ланцюга, та "/-СОК" означає комплементарну визначаючу ділянку (СОК) на ділянці легкої ланцюга антитіла або його антиген-зв'язуючого фрагмента.
В одному варіанті здійснення, антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент відповідно до винаходу містить щонайменше один СОК, вибраний з: (і) Н-СОК'І з БЕО ІЮО МО: 5, (ії) Н-СОКЗ2 з БЕО ІЮ МО: 6, (іїї) Н-СОКЗ з БЕО ІЮ МО: 7, (м) ІЇ-СОК!І1 з БЕО ІО МО: 9, (хм) І-СОК2 з БЕО І МО: 10, (мі) ІГ-СОВАЗ з ЗЕО ІО МО: 11.
В наступному варіанті здійснення, СОКЗ важкого ланцюга антитіла або його антиген- зв'язуючого фрагмента відповідно до винаходу представляє собою СОМКЗ з 5ЕБЕО ІЮ МО: 16 важкого ланцюга антитіла азіо0452 подІ-3; талабо СОКЗ легкого ланцюга антитіла або його антиген-зв'язуючого фрагмента відповідно до винаходу представляє собою СОКЗ з 5БЕО ІЮ МО: 21 легкого ланцюга антитіла аз5Іо0452 па1-3.
В одному варіанті здійснення, антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент за представленим винаходом має щонайменше одну, щонайменше дві, щонайменше три, щонайменше чотири, щонайменше п'ять або всі СОК, вибрані з СОК антитіла а5Іо0452 паді1-3, тобто щонайменше одну СОК, вибрану з будь-якої однієї з зЗЕО ІЮ МО: 5, 5ЕО ІЮО МО: 15, 5ЕО
ІО МО: 16, БЕО І МО: 20, БЕО ІО МО: 10, 5БЕО ІО МО: 21.
В одному варіанті здійснення, СОКЗ важкого ланцюга антитіла або його антиген-зв'язуючого фрагмента за представленим винаходом представляє собою СОКЗ важкого ланцюга антитіла азіоб0452 пді-3; талабо СОКЗ легкого ланцюга антитіла або його антиген-зв'язуючого фрагмента за представленим винаходом представляє собою СОМЗ легкого ланцюга антитіла а5іо0452 па1І-3.
В одному варіанті здійснення, СОКЗ важкого ланцюга антитіла або його антиген-зв'язуючого фрагмента за представленим винаходом представляє собою СОКЗ важкого ланцюга антитіла азіоб0452 паді-3.
В одному варіанті здійснення, СОКЗ легкого ланцюга антитіла або його антиген-зв'язуючого фрагмента за представленим винаходом представляє собою СОКЗ легкого ланцюга антитіла азіоб0452 паді-3.
В одному варіанті здійснення, СОКЗ важкого ланцюга антитіла або його антиген-зв'язуючого фрагмента за представленим винаходом представляє собою СОКЗ важкого ланцюга антитіла азіо0452 пді-3, та СОКЗ легкого ланцюга антитіла або його антиген-зв'язуючого фрагмента за представленим винаходом представляє собою СОКЗ легкого ланцюга антитіла азІо0452 па1-3.
Представлений винахід передбачає антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент, який має шість СОК антитіла азіо0452 паі-3.
Таким чином, в одному варіанті здійснення, антитіло, або його антиген-зв'язуючий фрагмент відповідно до винаходу включає: а) три СОК важкого ланцюга, які мають послідовності: (ї) Н-СОК'І з БЕО ІЮО МО: 5, (ії) Н-СОК2 з БЕО ІО МО: 15; та (ій) нН-СОКЗ з БЕО ІЮ МО: 16, та р) три СОК легкого ланцюга, які мають послідовності: (ї) І-СОК! з БЕО ІЮО МО: 20, (ії) ІЇ-СОК2 з БЕО ІЮО МО: 10, та (іїї) ІЇ-СОКЗ з БЕО ІО МО: 21.
Представлений винахід передбачає антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент за представленим винаходом, який містить варіабельний важкий ланцюг, який має щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595, 9695, 97 90, 98 95, 9995, або 100 95 ідентичність до нуклеотидної послідовності, визначеної 5ЕО ІЮ МО: 13, та варіабельний легкий ланцюг, який має щонайменше 80 95, 85 95, 90 95, 9595, 96 95, 97 95, 98 95, 99 95, або 100 95 ідентичність до нуклеотидної послідовності, визначеної ЗЕО ІЮ МО: 18.
Представлений винахід передбачає антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент за представленим винаходом, який містить варіабельний важкий ланцюг, який має щонайменше 80 96, 85 95, 90 96, 95 96, 96 95, 97 96, 98 95, 99 95, або 100 95 ідентичність до амінокислотної послідовності, визначеної 5ЕО 10 МО: 14, та варіабельний легкий ланцюг, який має щонайменше 80 95, 85 95, 90 95, 9595, 96 95, 97 95, 98 95, 99 95, або 100 95 ідентичність до амінокислотної послідовності, визначеної ЗЕО ІЮО МО: 19.
Представлений винахід передбачає антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент за представленим винаходом, який містить варіабельний важкий ланцюг, який має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 14, та варіабельний легкий ланцюг, який має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 19.
В конкретному варіанті здійснення, антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент відповідно до винаходу включає варіабельний важкий ланцюг, який має послідовність, визначену ЗЕО ІО МО: 4, та варіабельний легкий ланцюг, який має послідовність, визначену
ЗЕОО МО: 8.
В наступному конкретному варіанті здійснення, антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент відповідно до винаходу включає варіабельний важкий ланцюг, який має послідовність, визначену ЗЕО ІЮ МО: 4, та варіабельний легкий ланцюг, який має послідовність, визначену ЗЕО ІЮ МО: 8, та зв'язується з людським а-синуклеїном з Ко менше, ніж 500 пМ, та зв'язує такий самий епітоп, як азуп0087, а5Іо0452 пдіІ-3 або азІо0543.
В іншому варіанті здійснення, антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент відповідно до винаходу включає варіабельний важкий ланцюг, який має щонайменше 80 95, 85 9», 90 95, 95 Об, 96 95, 97 90, 98 95, 99 95, або 100 95 ідентичність до послідовності, визначеної ЗЕО ІЮ МО: 14, та варіабельний легкий ланцюг, який має щонайменше 80 95, 85 95, 90 95, 95 У, 96 95, 97 Фо, 98 9, 99 95, або 100 95 ідентичність до послідовності, визначеної ЗЕО ІЮ МО: 19.
В конкретному варіанті здійснення, антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент відповідно до винаходу включає варіабельний важкий ланцюг, який має послідовність, визначену 5ЕО ІЮ МО: 14, та варіабельний легкий ланцюг, який має послідовність, визначену
ЗЕО ІО МО: 19.
В наступному варіанті здійснення, антитіло, або його антиген-зв'язуючий фрагмент відповідно до винаходу включає варіабельний важкий ланцюг, який має щонайменше 80 95, 85 У, 90 ов, 95 95, 96 9», 97 90, 98 90, 99 95, або 100 95 ідентичність до послідовності, визначеної
ЗЕО ІЮ МО: 14, та варіабельний легкий ланцюг, який має щонайменше 80 95, 85 9», 90 9, 95 95, б
96 95, 97 90, 98 95, 99 95, або 100 95 ідентичність до послідовності, визначеної ЗЕО ІЮ МО: 19, та додатково включає: а) три СОК важкого ланцюга, які мають послідовності: (ї) Н-СОКІ1 з БЕО ІЮ МО: 5, (ії) Н-СОК2 з БЕО ІЮ МО: 15; та (іїї) Н-СОКЗ з БЕО ІЮ МО: 16, та р) три СОК легкого ланцюга, які мають послідовності: (ї) І-СОК! з БЕО ІЮО МО: 20, (ії) ІЇ-СОК2 з БЕО ІЮО МО: 10; та (іїї) І-СОКЗ з БЕО ІЮО МО:21.
Представлений винахід також передбачає антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент, який містить варіабельний важкий ланцюг, який має нуклеотидну послідовність, визначену
ЗЕО ІЮ МО: 13, та варіабельний легкий ланцюг, який має нуклеотидну послідовність, визначену
ЗЕО ІО МО: 18.
Представлений винахід передбачає антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент, який містить варіабельний важкий ланцюг, який має амінокислотну послідовність, визначену
ЗЕОІО МО: 14, та варіабельний легкий ланцюг, який має амінокислотну послідовність, визначену ЗЕО ІО МО: 19.
Крім того, передбаченим є антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент за представленим винаходом, який містить важкий ланцюг, який має амінокислотну послідовність, визначену ЗЕО ІО МО: 12, та легкий ланцюг, який має амінокислотну послідовність, визначену
ЗЕО ІО МО: 17.
В іншому варіанті здійснення, антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент відповідно до винаходу включає варіабельний важкий ланцюг, який має щонайменше 80 95, 85 9», 90 95, 95 Об, 96 95, 97 90, 98 95, 99 95, або 100 95 ідентичність до послідовності, визначеної ЗЕО ІЮ МО: 24, та варіабельний легкий ланцюг, який має щонайменше 80 95, 85 95, 90 95, 95 У, 96 95, 97 Фо, 98 9, 99 95, або 100 95 ідентичність до послідовності, визначеної ЗЕО ІЮ МО: 30.
В конкретному варіанті здійснення, антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент відповідно до винаходу включає варіабельний важкий ланцюг, який має послідовність, визначену 5ЕО ІЮ МО: 24, та варіабельний легкий ланцюг, який має послідовність, визначену
ЗЕО ІО МО: 30.
В наступному варіанті здійснення, антитіло, або його антиген-зв'язуючий фрагмент відповідно до винаходу включає варіабельний важкий ланцюг, який має щонайменше 80 95, 85 У, 90 ов, 95 95, 96 9», 97 90, 98 90, 99 95, або 100 95 ідентичність до послідовності, визначеної
ЗЕО ІЮ МО: 24, та варіабельний легкий ланцюг, який має щонайменше 80 95, 85 9», 90 9, 95 95,
Зо 96 95, 97 Фо, 98 оо, 99 95, або 100 95 ідентичність до послідовності, визначеної ЗЕО ІЮ МО: 30 та додатково включає: с) три СОК важкого ланцюга, які мають послідовності: (м) Н-СОКІ з БЕО ІЮ МО: 25, (хм) Н-СОКІ2 з БЕО ІО МО: 26; та (мі) Н-СОМКЗ з БЕО ІО МО: 27, та а) три СОК легкого ланцюга які мають послідовності: (м) ІГ-СОК'!1 з БЕО ІЮО МО: 31, (У І-СОК2 з БЕО ІЮО МО: 32; та (мі) ІЇ-СОКЗ з БЕО ІЮО МО: 33.
Представлений винахід також передбачає антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент, який містить варіабельний важкий ланцюг, який має нуклеотидну послідовність, визначену
ЗЕО ІЮО МО: 24, та варіабельний легкий ланцюг, який має нуклеотидну послідовність, визначену
ЗЕО ІО МО: 30.
Представлений винахід передбачає антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент, який містить варіабельний важкий ланцюг, який має амінокислотну послідовність, визначену
ЗЕОІО МО: 24, та варіабельний легкий ланцюг, який має амінокислотну послідовність, визначену ЗЕО ІО МО: 30.
Крім того, передбаченим є антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент за представленим винаходом, який містить важкий ланцюг, який має амінокислотну послідовність, визначену ЗЕО ІО МО: 22, та легкий ланцюг, який має амінокислотну послідовність, визначену
ЗЕО ІО МО: 28.
В одному варіанті здійснення, антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент за представленим винаходом як визначено будь-де вище представляє собою ІдА, дО, ІДЕ, ІМ,
ІС, таке як ІДС1, Ідса2, доз, або Ідс4 антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент.
В іншому варіанті здійснення, антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент за представленим винаходом має модифіковану Ес ділянку. Прийнятні модифікації є добре відомими кваліфікованом фахівцю в даній галузі, та можуть включати серед іншого модифікації для збільшення або зменшення періоду напіввиведення, абляції, зменшення або посилення ефекторної функції, забезпечення заміщеними цистеїнами з вільними тіолами для кон'югації.
Приклади таких модифікацій вклячають УТЕ для збільшення періоду напіввиведення та/або ТМ для зниження ефекторної функції. В деяких варіантах здійснення, будь-яке з антитіл або антиген-зв'язуючих фрагментів, розкритих в даному документі, містить мутації
М252Уу/52541/1256Е (УТЕ) в Ес ділянці антитіла (баІГгАсдпа еї аї!., 2006, 9. Віо!. Спет, 281:23514- 23524). В деяких варіантах здійснення, будь-яке з антитіл або антиген-зв'язуючих фрагментів, розкритих в даному документі, містить потрійну мутацію (скорочено в даному документі як "ТМ") в Ес ділянці що відповідає мутації І 234Р/ 235Е/Р3315 мутації, розкритій в Одапезуап еї а!. Асіа
СтузіаїІодг О Віо! СтузіаїІодг, (2008) 64: 700-704. У варіанті здійснення антитіло або його антиген- зв'язуючий фрагмент за представленим винаходом може представляти собою антитіло (91 ТМ або його антиген-зв'язуючий фрагмент. В іншому варіанті здійснення антитіло або його антиген- зв'язуючий фрагмент за представленим винаходом може містити Ес ділянку, яка має МТЕ мутації.
В іншому варіанті здійснення антитіло, або його антиген-зв'язуючий фрагмент, за представленим винаходом може бути сполученим із залишком-транспортером крізь гематоенцефалічний бар'єр (ВВВ) причому ВВВ залишок-транспортер є здатним транспортувати антитіло, або його антиген-зв'язуючий фрагмент, крізь ВВВ.
У варіанті здійснення ВВВ залишок-транспортер може представляти собою антитіло.
У варіанті здійснення ВВВ антитіло може утворювати мультиспецифічний конструкт з анти-а- синцуклеїновим антитілом або його антиген-зв'язуючим фрагментом. ВВВ залишок-транспортер може містити визначаючу комплементарність ділянку-1ї імуноглобуліновового варіабельного важкого ланцюга (МН-СОМКІ1), визначаючу комплементарність ділянку-2 імуноглобуліновового варіабельного важкого ланцюга (МН-СОК2), визначаючу комплементарність ділянку-З3 імуноглобуліновового варіабельного важкого ланцюга (МН-СОКЗ), визначаючу комплементарність ділянку-1 імуноглобуліновового варіабельного легкого ланцюга (МІ -СОРАТ1),
Зо визначаючу комплементарність ділянку-2 імуноглобуліновового варіабельного легкого ланцюга (МІ-СОК2), та визначаючу комплементарність ділянку-3 імуноглобуліновового варіабельного легкого ланцюга (МІ-СОКЗ); де МН-СОКІ включає 5ЕО ІЮ МО. 40 або 49, МН-СОК2 включає
ЗЕО ІО МО. 41 або 50, МН-СОКЗ включає ЗЕО ІО МО. 42 або 51, М-СОКІ1 включає 5ЕО ІЮ МО. 36, 44 або 53, М -СОРК2 включає 5ЕО ІЮ МО. 37, 45 або 54 та МІ-СОКЗ включає ЗЕО І МО. 38, 46 або 55.
В деяких варіантах здійснення, залишок-транспортер включає ділянку імуноглобулінового варіабельного важкого ланцюга (УН), яка містить БЕО ІЮО МО: 47 або 5ЕО ІЮО МО: 39. В деяких варіантах здійснення, залишок-транспортер включає ділянку імуноглобулінового варіабельного легкого ланцюга (МІ), яка містить 5ЕО ІЮ МО: 43.
Крім того, залишок-транспортер може бути вибраним з повного антитіла, Ем фрагмента, бар фрагмента, Рар' фрагмента, Е(абБ)2 фрагмента, дисульфід-зв'язаного (а5Ем) фрагмента, одноланцюгового Ем (5СЕМ) фрагмента, 5с(Ем)2 фрагмента, діатіло, триатіло, тетратіло, тетратіло, та одноланцюгового антитіла. В конкретному варіанті здійснення, залишок- транспортер включає з5сЕМ фрагмент, який містить МН домен та Мі. домен, злитий разом через лінкер. В деяких випадках лінкер може представляти собою (Сіу45ег)" (5ЕО ІО МО: 56), де п представляє собою позитивне ціле число, вибране з групи, яке складається з 1, 2, 3, 4,5,6,7,8, 9 та 10.
В деяких варіантах здійснення, будь-яка молекула-транспортер за винаходом може бути поєднана, як описано в даному документі з будь-якою молекулою, яка зв'язує альфа-синуклеїн, за винаходом для забезпечення мультиспецифічної молекули зв'язування за винаходом.
Винахід передбачає антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент за представленим винаходом як визначено будь-де вище, для застосування як лікарського засобу.
Винахід також передбачає антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент за представленим винаходом як визначено будь-де вище для застосування в попередженні або лікуванні а-синуклеїнопатії.
В одному варіанті здійснення, а-синуклеїнопатія є вибраною з хвороби Паркінсона (РО), деменції з тільцями Леві (01 В), та множинної системної атрофії (МА).
В одному варіанті здійснення, а-синуклеїнопатія представляє собою хворобу Паркінсона (РО).
Винахід передбачає спосіб лікування або попередження захворювання, зокрема, захворювання, пов'язаного з центральною нервовою системою, у пацієнта, де спосіб включає введення пацієнту антитіла або його антиген-зв'язуючого фрагмента за представленим винаходом, як визначено будь-де вище.
В одному варіанті здійснення, захворювання представляє собою а-синуклеїнопатію.
В одному варіанті здійснення, а-синуклеїнопатія є вибраною з хвороби Паркінсона (РО), деменції з тільцями Леві (0 В), та множинної системної атрофії (МА).
В одному варіанті здійснення, а-синуклеїнопатія представляє собою хворобу Паркінсона (РО).
Винахід передбачає фармацевтичну композицію, яка містить антитіло або його антиген- зв'язуючий фрагмент за представленим винаходом, як визначено будь-де вище, та фармацевтично прийнятний ексципієнт.
Фраза "фармацевтично прийнятний ексципієнт" включає будь-які та всі розчинники, дисперсійні середовища, покриття, антибактеріальні агенти та протигрибкові агенти, ізотонічні агенти, та агенти, які затримують абсорбцію, та подібні, які є сумісними з фармацевтичним введенням. Застосування таких середовищ та агентів для фармацевтично активних речовин є добре відомим в даній галузі. Композиції можуть також містити інші активні сполуки, які забезпечують допоміжні, додаткові або посилюючі терапевтичні функції. Фармацевтичні композиції також можуть бути включеними в контейнер, упаковку або дозатор разом з інструкціями для введення.
Фармацевтичну композицію винаходу формулюють так, щоб вона була сумісною з передбачуваним способом введення. Способи для здійснення введення є відомими фахівцям в даній галузі Введення може, наприклад, бути внутрішньовенним, внутрішньочеревним, внутрішньом'язовим, внутрішньопорожнинним, підшкірним або трансдермальним.
Винахід передбачає виділену молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент за представленим винаходом, як визначено будь-де вище.
В конкретному варіанті здійснення, представлений винахід передбачає виділену молекулу нуклеїнової кислоти, яка містить ЗЕО ІЮО МО: 13 та/"або 5ЕО ІЮ МО: 18.
В іншому конкретному варіанті здійснення, представлений винахід передбачає виділену
Зо молекулу нуклеїнової кислоти, яка містить зЗЕО ІЮ МО: 23 та/або ЗЕО ІЮ МО: 29.
Після отримання цієї інформації фахівець в даній галузі може легко отримати молекули нуклеїнових кислот, що кодують розкриті антитіла або їх їх антиген-зв'язуючі фрагменти.
Нуклеїнові кислоти можуть містити ДНК або РНК та можуть бути повністю або частково синтетичними або рекомбінантними. Посилання на нуклеотидну послідовність охоплює молекулу ДНК із зазначеною послідовністю, та охоплює молекулу РНК із зазначеною послідовністю, в якій ) є заміщеним на Т, якщо контекст не вимагає іншого.
Молекули нуклеїнових кислот за винаходом включають кодуючу послідовність для СОК, МН домена, та/або МІ. домена, розкритих в даному документі.
Представлений винахід також передбачає конструкти у формі плазмід, векторів, фагемід, транскрипційних або експресійних касети, які містять щонайменше одну молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент за представленим винаходом, як визначено будь-де вище, зокрема що кодує СОР, амнН домен, та/або МІ. домен, розкриті в даному документі.
Даний винахід, крім того, передбачає клітину-господар, яка включає одну або декілька конструктів, як описано вище.
Крім того, передбаченими є нуклеїнові кислоти, що кодують будь-який один або декілька з
Сов (Н-СОВІ, Н-СОВ2, Н-СОВЗ, І-СОВІ1, І-СО2, або І-СОКЗ), МН або Мі. доменів, розкритих в даному документі, а також способи отримання кодованих продуктів. Спосіб включає експрсування кодованого продукта з кодуючої нуклеїнової кислоти. Експресія може бути досягнута шляхом культивування в відповідних умовах рекомбінантних клітин-господарів, що містять нуклеїнову кислоту. Після отримання експресією МН або Мі. домен, або специфічний зв'язуючий член може бути виділеним та/або очищеним, використовуючи будь-яку прийнятну методику, потім застосованим відповідним чином.
Антиген-зв'язуючий фрагменти, МН та/або Мі домени та кодуючі молекули нуклеїнової кислоти та вектори можуть бути виділеними та/або очищеними з їхнього природного середовища, в практично чистій або гомогенній формі, або, у випадку нуклеїнової кислоти, вільної або практично вільної від нуклеїнової кислоти або генів походження інших, ніж послідовність, що кодує поліпептид з необхідною функцією.
Системи для клонування та експресії поліпептида в різних клітинах-господарях є добре 60 відомими в даній галузі. Для клітин, прийнятих для продукування антитіл, дивіться бепе
Ехргеззіоп Зузіет5, Асадетіс Ргез55, ей5. Регпападе еї аї., 1999. Коротко, прийнятні клітини- господарі включають бактерії, рослинні клітини, клітини ссавців, та дріжджі та бакуловірусні системи. Лінії клітин ссавців, доступні в даній галузі для експресії гетерологічного поліпептиду включають клітини яєчників китайського хом'яка, Неї! а клітини, ниркові клітини дитячого хом'яка,
М5О мишачі мієломні клітини, та багато інших. Загальним бактеріальним господарем є Е. соїї.
Будь-яка система експресії протеїна, сумісна з винаходом, може бути використана для отримання розкритих антитіл. Прийнятні експресійні системи включають трансгенних тварин, описаних в Сепе Ехргезвзіоп Зузіет5, Асадетіс Ргез5, ед5. Регпапае? еї аї., 1999.
Відповідні вектори можуть бути вибрані або сконструйовані, так що вони містять відповідні регуляторні послідовності, включаючи промоторні послідовності, термінаторні послідовності, послідовності поліаденілювання, енхансерні послідовності, маркерні гени та інші послідовності у відповідних випадках. Вектори можуть бути плазмідами або вірусами, наприклад, фагом або фагемідою, у відповідних випадках. Для більш докладної інформації дивіться, наприклад, затргоок еї аї., МоІесшаг Сіопіпд: А Гарогаюгу Мапиаї, 2па єйд., Соїд брііпд Нагбог І арогаюгу
Ргез5, 1989. Багато відомих методик та протоколів для маніпулювання нуклеїнової кислоти, наприклад, в отриманні конструктів нуклеїнової кислоти, мутагенезі, секвенуванні, введенні ДНК в клітини та експресії генів, та аналізі протеїнів, є детально описаними в Сигепі Ргоїосої!в іп
Моїесшіаг Віоіоду, 2па Еайіоп, едв. А!Мзибеї єї аї., дхопп Уміїеу б 5опв, 1992.
Наступний аспект розкриття передбачає клітину-господар, яка містить нуклеїнову кислоту, як розкрито в даному документі, зокрема, вектор, який містить молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент за представленим винаходом, як визначено будь-де вище.
Ще один аспект передбачає спосіб, який включає введення такої нуклеїнової кислоти в клітину-господар. Введення може використовувати будь-яку доступну методику. Для еукаріотичних клітин, прийнятні методики можуть включати трансфекцію фосфатом кальцію,
РЕАЕ-декстран, електропорацію, опосередковану ліпосомою трансфекцію та трансдукцію з використанням ретровірусу або іншого вірусу, наприклад, вірусу коров'ячої віспи, або для клітин комах бакуловируса. Для бактеріальних клітин прийнятні методики можуть включати трансформацію хлоридом кальцію, електропорацію та трансфекцію з використанням
Зо бактеріофага. Введення нуклеїнової кислоти в клітини може супроводжуватися викликанням або дозволом експресії з нуклеїнової кислоти, наприклад, шляхом культивування клітин- господарів в умовах експресії гена.
КОРОТКИЙ ОПИС ФІГУР ТА ПЕРЕЛІКУ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
Представлений винахід зараз буде описаним більш докладно з посиланням на фігури, які додаються та перелік послідовностей, в яких показано:
Ключ до 5ЕО ІЮ МО: звуюовт 00000 у амокислот на ОСЛО НТ 202 Р 5 азупО087 - я я
Н-СОВоамінокислотнапослідовність./-/-/:/ | 6 г //
Загальна послідовність Н-СОМКЗамінокислотнапослідовність.:/-:/ 7 антитіла, отриманого зазупО087| МІ. амінокислотнапослідовність.:-:/ 7778
І-СОВ1амінокислотнапослідовність./-/-:/ / / 9 а5і00452 поі-З звіо0БАЗ
Загальна ВВВ ігапзрогіег
ВввОб2ді вввіоєг
00000000 руду амноююлн лослдовнтЬ 01010028
ВввОбЗді
Підписи до фігур
Таблиця 1: Визначення афінності ключових анти-й-синуклеїнових антитіл для людського а-5уп, виконаних на двох платформах вимірювання афінності.
Фігура 1: Схема аналізу НТЕЕ-.
Фігура 2: Порівняння амінокислотних послідовностей азуп0087, азіо0452п9І-3 та азіо0543 варіабельної ділянки важкого ланцюга (УН) (ЗЕО ІЮ МО: 2, 14 та 24, відповідно) та варіабельної ділянки легкого ланцюга (МІ) (ЗЕО ІЮО МО: 3, 19, та 30, відповідно). Підкреслені амінокислоти відповідають СОК.
Фігури ЗА-30: Нуклеотидна та амінокислотна послідовність аз5іо0452 падіІ-3. Фігури ЗА та ЗВ показують нуклеотидні та амінокислотні послідовності варіабельного важкого ланцюга та варіабельного легкого ланцюга, відповідно, а5і00452 падІ-3. Фігура ЗА розкриває 5ЕО ІО Мо: 13 та 14, відповідно, в порядку виникнення. Фігура ЗВ розкриває 5ЕО ІО Мо: 18 та 19, відповідно, в порядку появи. Фігури ЗС та 30 показують вирівнювання даних послідовностей з найближчими послідовностями людської зародкової лінії. Фігура ЗС показує вирівнювання амінокислотної послідовності домена варіабельного важкого ланцюга азіо0452 пді-3 (5ЕО1ЮО МО: 14) зародкової лінії (ЗНМЗ3-23 (5ЕО ІЮ МО: 58) та УНб послідовностей (5ЕО ІЮ МО: 59). Фігура 30 показує вирівнювання амінокислотної послідовності домена варіабельного легкого ланцюга азіоб0452 па!І-3 (ЗЕО ІЮО МО: 19) до зародкової лінії ІІ 5-45 (ЗЕО ІО МО: 60) та 712 (5ЕО ІЮ МО: 61), З послідовності. Підкресленими та позначеними є визначаючі комплементарність ділянки (СОК). Відмінності від зародкової лінії є виділеними жирним шрифтом та позначеними. Всі неверн'єрні залишки в каркасних ділянках легкого ланцюга є амінокислотами людської зародкової лінії. Верн'єрні залишки (не були змінені відповідно до амінокислот зародкової лінії.
Фігури 4А та 4В: Зв'язування епітопу завантажуючих ізолятних клонів, використовуючи панель а-зуп усічень. ЕГПІЗА-лунки покриті низкою комерційно доступних усічень а-5уп, що представляють різні визначені ділянки протеїна: 1-140: повної довжини а-5уп, 1-60: М- термінальна ділянка тільки, 61-140: неамілоїдний компонент бляшок (МАС) плюс С-термінальна ділянка, 1-95: М-термінальні та МАС ділянки, 96-140: С-термінальна ділянка тільки, АМАС:
Зо видалена МАС ділянка, МСАР: являє собою альтернативно сплайсовану форму а-5уп, де не достає амінокислот 103-129 (гПептид). Первинними антитілами, використовуваними для виявлення, були (Фігура 4А) АзупОо87; та (Фігура 4В) А5Іо0452 падіІ-3 (чорні стовпчики), азіо0543 (світло-сірі стовпчики) та МіІР228 ізотипний відповідний контроль (темно-сірі стовпчики).
Зв'язування виявляється або з анти-людським дс ЕциЗ- вторинним антитілом (Фігура 4А) або анти-людським ІДО-НЕР вторинним антитілом (Фігура 48).
Фігура 5: Специфічність азіо0452 пдІ-3 та абІо0543 щодо а-зуп по відношенню до членів синуклеїнової родини, використовуючи епітопний конкурентний аналіз ОБЕЇ РІА.
Використовуючи епітопний конкурентний аналіз НТЕЕ, визначали специфічність афінності оптимізованих азіо0452 пді-3 та азІо0543 клонів для а-зуп титруванням неміченого а-зуп, ВД-5уп та у-зуп. З цього визначали значення ІСво.
Фігура 6: Специфічність азі00452 пді-3 та азіо0543 щодо а-зуп людини, мавпи -яванського макаки та щура, використовуючи епітопний конкурентний аналіз НТЕЕ.
Використовуючи епітопний конкурентний аналіз НТКЕ, визначали профіль перехресної реактивності видових клонів, оптимізованих за афінностями в аналогічному аналізі шляхом титрування неміченого а-5уп та отримання значень ІСво для кожного виду а-5уп.
Фігури 7А та 7В: Репрезентативні результати проточної цитометрії, які демонструють, що клони, оптимізовані за афінністю, зв'язуються з нативним людський (а-5уп в людській нейробластомній клітинній лінії.
Панелі А, С, Е та о фігур 7А та 7В показують зв'язування з а-5уп негативною клітинною лінією раку молочної залози людини, ВТ20. Панелі В, 0, Е та Н фігур 7А та 7В показують зв'язування з а-хзуп позитивною людською нейробластомною клітинною лінією, ЗНЗУ5У. Фігура 7А: Первинні людські антитіла, що використовувалися в даному дослідженні, представляли собою азупО087 та Ни Ідс контроль. Зв'язування людського антитіла детектували, використовуючи вторинне анти-людське ІдС-БІТС (дасКк5оп). Фігура 7В: Первинні людський антитіла, які використовують в даному дослідженні, представляли собою а5і00452 па|1-3, азіо0543, та МІР228 ізотипний відповідний ІД1 ТМ контроль. Зв'язування людського антитіла детектували використовуючи вторинний анти-людський ІдДС-РІТС (Часкзоп). Первинні мишачі антитіла, які використовували, представляли собою 406 (Сомапсе), та ізотипний відповідний негативний контроль (К8УО Зузіет5). Зв'язування мишачого антитіла детектували, використовуючи вторинне анти-мишаче ІдО-РІТС (бідта).
Фігура 8: Специфічність оптимізованих анти-а-5уп дос для агрегованого людського а-зуп за
ОЕГРІА ЕГІБА. Графік показує, що азіо0452 пді-3 та а5іо0543, два високоафінних а-5уп специфічних клона, та навантажене антитіло азуп0087 детектували захоплені агреговані форми а-5уп (чорні стовпчики), але не виявили захоплений мономерний а-5уп.
Фігури 9А-9С: Специфічність клонів, оптимізованих за афінністю, в відповідних тканинах захворювання шляхом імуногістохімії. Фігури 9А, 9В та 9С показують фарбування з а5і00452 падІ-3, азуп0087 та а5іо0543, відповідно. Панелі А, В та С показують азіо0452 пді-3 фарбування як тілець Леві (Панелі А та В), так і нейритів Леві (Панель С) чорної субстанції в тканині головного мозку при РО. Панель О показує азіо0452 пді-3 низький рівень фарбування а-5уп в клітинах з височної кори в нормальній ділянці мозку. Панелі Е, Е, та б показують азіоб0452 паІ-3 фарбування тілець Леві, нейритів Леві та точок Леві мигдалини в тканині головного мозку при
РО. Панель Н показує ізотипний відповідний контроль антитіла, що демонструють відсутність фарбування в мигдалині в тканині головного мозку при РО. Панелі І - М показують фарбування азупО087 блакитної плями в тканині головного мозку при РО; виявлені патологічні ознаки представляють собою тільця Леві (Панель І та І), нейрональні агрегати (Панель .)), нейрити
Леві (Панель К), та бліді тіла (Панель М). Панелі М та О показують азіо0543 фарбування тілець
Леві та нейритів Леві в чорній субстанції в тканині головного мозку при РО. Панель Р показує
Зо а5іо0543 низький рівень фарбування а-зуп в клітинах з височної кори в нормальній ділянці головного мозку.
Фігури 10А та 108: Системне введення а5іо0452 подІ-3 швидко знижує рівні вільного асину в префронтальній корі щурів. Середнє значення 5 5ЕМ абсолютна (Фігура 10А) або відносна (Фігура 108) концентрація вільного а-синуклеїна в ІЗЕ азіо0452 подіІ-3 (30 мг/кг внутрішньовенно; заштриховані позначення) або носій (незаштриховані позначення) оброблених щурів.
Фігури 11А та 118: Доза аз5Іо0452 пді-3 та залежні від часу знижені рівні вільного асину у
С5Е щурів при системному введенні. Середнє значення х 5ЕМ абсолютна (Фігура 11А) або відносна (Фігура 118) концентрація вільного а«-синуклеїну в С5Е азіо0452 подіІ-з (3, 10, З0, 100 мг/кг внутрішньовенно; заштриховані позначення) або носія (незаштриховані позначення) оброблених щурів.
Фігури 12А-12С: Анти-альфа-синуклеїнові антитіла азіо0452 пді-3 та азіо0452 падІ-3-0265А блокують іпслатеральне-до-контрлатерального поширення альфа-синуклеїну. (Фігура 12А): миші, що не належать до ід, яким ін'єкційно вводили І М-а-5зуп в правий гіпокамп (чорні стрілки), були пасивно імунізовані щотижневими дозами анти-альфа- синуклеїнових мишачих ІдС1 антитіл: азІо0452 пдІ-3, абіо0452 паІ-3 0265А, 9Е4, або МІР228 ізотипного контрольного антитіла, протягом 13 тижнів, з подальшим визначенням поширення альфа-синуклеїну за допомогою імуноцитохімії з 5ЗУМ-1 та автоматизованим аналізом зображень. (Фігура 128): Кількісне визначення даних імунореактивності альфа-синуклеїну, отриманих з імуноцитохімічного аналізу іпслатеральних гіпокампальних коронарних зрізів, представлене в А. Кожна колонка являє собою середнє значення ї 5ЕМ з 10 незалежних обробок антитілом (п-10 мишей на групу обробки антитілом). "Р«е0,05 проти МІР228; 1- факторний АМОМА з пост-тестом Даннета. (Фігура 120): Кількісне визначення даних імунореактивності альфа-синуклеїну, отриманих з імуноцитохімічного аналізу контрлатеральних гіпокампальних коронарних зрізів, представлене в панелі А. Кожна колонка являє собою середнє значення ї ЗЕМ з 10 незалежних обробок антитілом (п-10 мишей на групу обробки антитілом). "Р«0,05 проти МІР228; 1-факторний АМОМА з пост-тестом Даннета.
Фігури 13А-13С: Анти-альфа-синуклеїнові антитіла азіо0452 пді-3 та азіо0452 паІ-3-0265А знижують депонування та розповсюдження лентивірусно-експресованого альфа-синуклеїну вздовж аксонів. (Фігура 13А): миші, що не належать до 19, яким ін'єкційно вводили І М-а-5уп в бо правий гіпокамп, були пасивно імунізовані щотижневими дозами анти-альфа-синуклеїнових мишачих ді антитіл: азіо0452 пді-3, азіо0452 паІ-3 0265А, 9Е4, або МІР228 ізотипним контрольним антитілом, протягом 13 тижнів, з подальшим імуноцитохімічним аналізом альфа- синуклеїнових депонувань вздовж іпслатеральний та контрлатеральний транс-гіпокампальних аксонів (чорні стрілки). (Фігура 13В): Кількісне визначення іпслатеральних аксональних альфа- синуклеїнових депонувань визначали з використанням імуноцитохімії з 5УМ-1 та автоматизованим аналізом зображень. Кожна колонка являє собою середнє значення ж 5ЕМ з незалежних обробок антитілом (п-10 мишей на групу обробки антитілом). "Р«0,05 проти
МІР228; 1-факторний АМОМА з пост-тестом Даннета. (Фігура 13С): Кількісне визначення контрлатеральних аксональних альфа-синуклеїнових депонувань визначали з використанням 10 імуноцитохімії з 5УМ-1 та автоматизованим аналізом зображень. Кожна колонка являє собою середнє значення ж ЗЕМ з 10 незалежних обробок антитілом (п-10 мишей на групу обробки антитілом). "Р«0,05 проти МІР228; 1-факторний АМОМА з пост-тестом Даннета.
Фігури 14А-14С: Анти-альфа-синуклеїнові антитіла азіо0452 пді-3 та азіо0452 паІ-3-0265А знижують альфа-синуклевнове депонування в САї гіпокампальних нейронах та неокортикальних нейронах шару 5. (Фігура 14А): Миші, що не належать до 9, яким ін'єкційно вводили І М-а-5уп в правий гіпокамп, були пасивно імунізовані щотижневими дозами анти- альфа-синуклеїнових мишачих Ідс1 антитіл: а5іо0452 пдіІ-3, азіо0б452 пдІ-3 0265А, 9Е4, або
МІР228 ізотипним контрольним антитілом, протягом 13 тижнів, з подальшим імуноцитохімічним аналізом альфа-синуклеїнових депонувань в іпслатеральних СА1 гіпокампальних нейронах та іпслатеральних неокортикальних нейронах шару 5 (чорні стрілки). (Фігура 14В): Кількісне визначення альфа-синуклетнових депонувань в іпслатеральних неокортикальних нейронах шару 5 проводили з використанням імуноцитохімії з 5УМ-1 та автоматизованим аналізом зображень. Показані дані представляють кількість альфа-синуклеїнових позитивних клітин (нейронів) на 0,1 кв. мм. Кожна колонка являє собою середнє значення х ЗЕМ з 10 незалежних обробок антитілом (п-10 мишей на групу обробки антитілом). "Р«е0,05 проти МІР228; 1- факторний АМОМА з пост-т-естом Даннета. (Фігура 14С): Кількісне визначення альфа- синуклеїнових депонувань в іпслатеральних САї гіпокампальних нейронах проводили з використанням імуноцитохімії з ЗУМ-1 та автоматизованим аналізом зображень. Показані дані представляють кількість альфа-синуклеїнових позитивних клітин (нейронів) на 0,1 кв. мм. Кожна
Зо колонка являє собою середнє значення х 5ЕМ з 10 незалежних обробок антитілом (п-10 мишей на групу обробки антитілом). "Р«е0,05 проти МІР228; 1-факторний АМОМА з пост-тестом
Даннета.
Фігури 15А-15С: авзіо0452 пді-3 та авзіо0452 паІ-3-0265А антитіла блокують альфа-си нуклеїнове поширення в альфа-синуклеїнових трансгенних мишах. (Фігура 15А): а-5уп 19 міші, яким ін'єкційно вводили І М-а-5уп в правий гіпокамп (чорні стрілки), були пасивно імунізовані щотижневими дозами анти-альфа-синуклеїнових мишачих Ідс1 антитіл: азІо0452 па1І-3, азіо0452 паІ-3 0265А, 9Е4, або МІР228 ізотипним контрольним антитілом, протягом 13 тижнів, з подальшим визначенням альфа-синуклеїнового поширення з використанням імуноцитохімії з
ЗУМ-1 та автоматизованим аналізом зображень. (Фігура 158): Кількісне визначення даних імунореактивності альфа-синуклеїну, отриманих з імуноцитохімічного аналізу іпслатеральних гіпокампальних коронарних зрізів, представлене в панелі А. Кожна колонка являє собою середнє значення ж ЗЕМ з 10 незалежних обробок антитілом (п-10 мишей на групу обробки антитілом). "Р«0,05 проти МІР228; 1-факторний АМОМА з пост-тестом Даннета. (Фігура 15С):
Кількісне визначення даних імунореактивності альфа-синуклеїну, отриманих з імуноцитохімічного аналізу контрлатеральних гіпокампальних коронарних зрізів, представлені в панелі А. Кожна колонка являє собою середнє значення х 5ЕМ з 10 незалежних обробок антитілом (п-10 мишей на групу обробки антитілом). "Р«0,05 проти МІР228; 1-факторний
АМОМА з пост-тестом Даннета.
Фігури 16А-16С: а5іо0452 пді-3 та азіо0452 пд9І-3-0265А антитіла знижують депонування та розповсюдження лентивірусно-експресованого альфа-синуклеїн вздовж аксонів в трансгенних мишах. (Фігура 16А): а-5зуп 4 миші, яким ін'єкційно вводили ІМ-а-з5уп в правий гіпокамп, були пасивно імунізовані щотижневими дозами анти-альфа-синуклеїнових мишачих Ідс1 антитіл: азіо0452 пді-3, азіо0452 пді-3 0265А, 9Е4, або МІР228 ізотипним контрольним антитілом, протягом 13 тижнів, з подальшим імуноцитохімічним аналізом альфа-синуклеїнових депонувань вздовж іпслатеральних та контрлатеральних транс-гіпокампальних аксонів (чорні стрілки). (Фігура 168): Кількісне визначення іпслатеральних аксональних альфа-синуклеїнових депонувань проводили з використанням імуноцитохімії з 5УМ-1 та автоматизованим аналізом зображень. Кожна колонка являє собою середнє значення їх 5ЕМ з 10 незалежних обробок антитілом (п-10 мишей на групу обробки антитілом). "Р«0,05 проти МІР228; 1-факторний бо АМОМА з пост--естом Даннета. (Фігура 16С): Кількісне визначення контрлатеральних аксональних альфа-синуклеїнових депонувань визначали з використанням імуноцитохімії з
ЗУМ-1 та автоматизованим аналізом зображень. Кожна колонка являє собою середнє значення ї ЗЕМ з 10 незалежних обробок антитілом (п-10 мишей на групу обробки антитілом). "Р«0,05 проти МІР228; 1-факторний АМОМА з пост-тестом Даннета.
Фігури 17А-170: авзіо0452 паІ-3 та авзіо0452 па4І-3-0265А антитіла знижують альфа- синуклеїнове депонування в СА! гіпокампальних нейронах та неокортикальних нейронах шару 5 у альфа-синуклеїнових трансгенних мишей. (Фігура 17А): а-5уп 9 миші, яким ін'єкційно вводили І М-а-зуп в правий гіпокамп, були пасивно імунізовані щотижневими дозами анти- альфа-синуклеїнових мишачих Ідс1 антитіл: а5іо0452 пдіІ-3, азіо0б452 пдІ-3 0265А, 9Е4, або
МІР228 ізотипним контрольним антитілом, протягом 13 тижнів, з подальшим імуноцитохімічним аналізом альфа-синуклеїнових депонувань в іпслатеральних СА1 гіпокампальних нейронах та іпслатеральних неокортикальних нейронах шару 5 (чорні стрілки). (Фігура 178): Кількісне визначення альфа-синуклеїнових депонувань в іпслатеральних неокортикальних нейронах шару 5 проводили з використанням імуноцитохімії 3 5УМ-1 та автоматизованим аналізом зображень. Показані дані представляють кількість альфа-синуклеїнових позитивних клітин (нейронах) на 0,1 кв. мм. Кожна колонка являє собою середнє значення хх ЗЕМ з 10 незалежних обробок антитілом (п-10 мишей на групу обробки антитілом). "Р«е0,05 проти МІР228; 1- факторний АМОМА з пост-т-естом Даннета. (Фігура 17С): Кількісне визначення альфа- синуклеїнових депонувань в іпслатеральних САї гіпокампальних нейронах проводили з використанням імуноцитохімії з 5УМ-1 та автоматизованим аналізом зображень. Показані дані представляють кількість альфа-синуклеїнових позитивних клітин (нейронах) на 0,1 кв. мм.
Кожна колонка являє собою середнє значення хх ЗЕМ з 10 незалежних обробок антитілом (п-10 мишей на групу обробки антитілом). "Р«0,05 проти МІР228; 1-факторний АМОМА з пост-тестом
Даннета. (Фігура 170): Кількісне визначення альфа-синуклеїнових депонувань в контрлатеральних САТ гіпокампальних нейронах проводили з використанням імуноцитохімії з
ЗУМ-1 та автоматизованим аналізом зображень. Показані дані представляють кількість альфа- синуклеїнових позитивних клітин (нейронах) на 0,1 кв. мм. Кожна колонка являє собою середнє значення хх 5ЕМ з 10 незалежних обробок антитілом (п-10 мишей на групу обробки антитілом). хр«0,05 проти МІР228; 1-факторний АМОМА з пост-тестом Даннета.
Зо Фігура 18 Конкуренція епітопів аз5Іо452-пдІЗ-підат ТМ з ВВВІОб26ба91І-5сЕк-В52-аі500452-пд1-3-
ПІДСТ ТМ демонструє в аналізі НТКЕ, що включення фрагмента ВВВ не змінює специфічність зв'язування азіо452-пдіЗ-піде1ТМмМ. руїйюпббО, мічене анти-альфа-синуклеїнове антитіло, авзіо0452НаІЗ3-пІДСІТТМ зв'язується з біотинільованим альфа синуклеїном, який, у свою чергу, є зв'язаним з міченим цирптатом стрептавідином. Після збудження цирптату відбувається перенесення енергії (ЕКЕТ) та коли в присутності ауїїдніЄбо міченого азіо0452падІЗ3-нІДСІТ ТМ, ауїїднівБо збуджується та в результаті призводить до флуоресценції. Якщо конкурентний Ід є присутнім, то зв'язування ауїїдніЄБо, міченого а5І00452, блокується, та запобігається збудження ауюне5боО, міченого а5іо0452, що в результаті призводить до зменшення флуоресцентного сигналу. Немічене а5і00452 та ВріО626-В52-аі500452 пПІДСТТМ обидва є здатними аналогічно конкурувати з ауійдніЄ5о, міченим азіо0452-паі3-нІЧДСТ ТМ.
Фігура 19 Зв'язування мишачих ендотеліальних клітин головного мозку ВВВІО626б91-852- авіо452-пді-3-піІдДСІ ТМ демонструє ефективне зв'язування з мішенню фрагмента ВВВ при сполученні з азіо452-пдІЗ-підДС1ТМ. Технології МАТ (Технологія флуоресцентного мікрооб'ємного аналізу) або аналіза Мігтог-раїЇ використовували для визначення специфічного зв'язування антитіл з ендотеліальними клітинами головного мозку. Даний аналіз вимірює зв'язування людських |ЇД0 з мишачими ендотеліальними клітинами головного мозку (Ь.ЕпсіЗ3).
В.Епаз клітини аналогічним чином зв'язуються з ВррІОб26 пІ9С1ТМ, ВЬБІОб62бдібзсЕм-В52- азіо0452-пПІДС1ТМ та ВЬБОб2гбдібсЕм-В52-МІР228 пПІДО1ТМ, але не з контрольним антитілом
МІР228 пІдС1ТМ. Дане зв'язування детектується мишачим анти-Ес тАб (людським специфічним) який, у свою чергу, детектується АІехайсног647 міченим козиним анти-мишачим Ес.
ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ
Представлений винахід грунтується на дивовижному та несподіваному відкритті антитіл авзіо0452 пді-3 та азіо0543. Дане відкриття призвело до появи нової групи антитіл, які мають характеристики, розділені антитілами азіо0452 поІ-3 та аз5Іо0543, а також підгруп антитіл, які мають характеристики а5100452 паіІ-3 та а5Іо0543, відповідно.
В одному варіанті здійснення, антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент за представленим винаходом походить з антитіла азуп0087, яке містить варіабельну ділянку важкого ланцюга (МН) амінокислотної послідовності 5ЕО ІЮ МО: 2 та варіабельну ділянку легкого ланцюга (МІ) амінокислотних послідовностей 5ЕО ІЮ МО: 3, як розкрито в даному 60 документі.
В конкретному варіанті здійснення, антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент за представленим винаходом походить з антитіла ахуп0087, причому зазначене антитіло або антиген-зв'язуючий фрагмент має Ко менше, ніж 500 нМ та зв'язує такий самий епітоп як і будь- яке з антитіл азуп0087, азІо0452п91-3 та азіо0543, описаних в даному документі.
Подібно до азуп0087, антитіла а5іо0452 пді-3 та азІо0543 зв'язують С-термінальну ділянку (залишки 96-140) людського а-синуклеїну. Більш конкретно, антитіла а5Іо0452 пдІ-3 та азІо0543 або їх антиген-зв'язуючий фрагмент зв'язує ділянку, що знаходиться між приблизно амінокислотою 102 та приблизно амінокислотою 130 людського а-синуклеїну (наприклад,
ЗЕОІЮ МО: 1). В деяких варіантах здійснення, будь-яке з антитіл або антиген-зв'язуючих фрагментів, розкритих в даному документі, зв'язують ділянку, що знаходиться між приблизно амінокислотою 120 та приблизно 130 людського а-синуклеїну (наприклад, 5ЕО ІЮО МО: 1).
В деяких варіантах здійснення, будь-яке з антитіл або антиген-зв'язуючих фрагментів, розкритих в даному документі, зв'язують епітоп, який не є таким самим епітоп, як епітоп, зв'язаний 9Е4 антитілом.
Антитіла аз5іо0452 поді-3 та а5іо00543 є селективними до а-синуклеїну. Антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент не зв'язується з іншими членами синуклеїнової родини, такими як рВ-синуклеїн або у-синуклеїн. Більш конкретно, антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент є специфічним для людського а-синуклеїна.
Антитіла азіо0452 поді-3 та а5іо0543 зв'язуються з людським, щурячим або мавп'ячим - яванського макаки альфа-синуклеїном. Здатність азіо0452 пді-3 та азіо0543 зв'язуватися з людським, мавп'ячим - яванського макаки та щурячим альфа-синуклеїном свідчить про зв'язування з іншим епітопом на людському альфа-синуклеїні в порівнянні з антитілами, які не зв'язуються з людським, мавп'ячим - яванського макаки та щурячим альфа-синуклеїном.
Антитіла азіо0452 пді-3 та азіо0543 є, таким чином, можуть використовуватися для оцінки іп мімо безпеки та дослідження в моделях захворювань на мавпах - яванського макаки та щурах.
Антитіла а5Іо0452 пді-3 та азіо0543 зв'язуються з людським а-синуклеїном з високою афінністю. Антитіла азІо0452 пді-3 та азІо0543 зв'язуються з альфа-синуклеїном з Ко менше, ніж 500 пікомоль (ПМ), менше, ніж 400 пМ, менше, ніж 300 пМ, менше, ніж 150 пМ, менше, ніж 120 пМ, менше, ніж 115 пМ, менше, ніж110 пМ або 106 пМ або менше як виміряно, наприклад, з
Зо використанням аналізу Осієї (дивіться, наприклад, Приклад 9). Антитіла аз5іо0452 пдІ-3 та абзіо0543 зв'язуються з альфа-синуклеїном з Ко менше, ніж 300 пікомоль (пМ), менше, ніж 250 ПМ, менше, ніж 200 пМ, менше, ніж 150 пМ, менше, ніж 120 пМ, менше, ніж 110 пМ або 108 пМ, менше, ніж 100 пМ, менше, ніж 80 пМ або 74 пМ або менше, як виміряно, наприклад, з використанням аналізу КіпЕХА (за посиланням на протокол аналізу КіпЕХА, дивіться, наприклад,
Приклад 9).
Фрагмент азіо0452 поді-3 Бар зв'язується з людським а-синуклеїном з високою афінністю.
Фрагмент аз5іо0452 пдІ-3 Раб зв'язується з альфа-синуклеїном з Ко менше, ніж 300 пікомМоль (ПМ), менше, ніж 200 пМ, менше, ніж 180 пМ, 174 пМ або менше як виміряно, наприклад, з використанням аналізу КіпЕХА (дивіться, наприклад, Приклад 9,3).
Антитіла азіо0452 пді-3 та ав5зі00543 зв'язуються з нативним ендогенним людським а-синуклеїном. Антитіла а5і00452 поІ-3 та азіо0543 зв'язуються з агрегатами людського а-синуклеїну. Зокрема, антитіла, таким чином, зв'язуються з епітопом, який не є необхідним для агрегації. Антитіла а5Іо0452 паІ-3 та азІ00543 є здатними до секвенування як на мономерні, так і агреговані форми альфа-синуклеїну. Антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент за винаходом є здатними зв'язувати мономерні та агреговані форми альфа-синуклеїна.
Антитіла а5іо0452 подіІ-3 та азіо0543 зв'язують патологічні форми а-синуклеїна, пов'язані із захворюванням, наприклад, тільця Леві, нейрити Леві, точки Леві в тканинах головного мозку при хворобі Паркінсона. Мінімальне фарбування спостерігається в нормальному (не хворому) головного мозку.
Антитіло азіо0452 пді-3 знижує рівні а-синуклеїну в інтерстиціальній рідині головного мозку.
Зокрема, антитіло авзіо0452 подІ-3 знижує рівні вільного незв'язаного а-синуклеїну в інтерстиціальній рідині головного мозку.
Антитіло азіо0452 пдіІ-3 знижує рівні с-синуклеїну в спинномозковій рідині. Зокрема, антитіло азіо0452 падіІ-3 знижує рівні вільного незв'язаного а-синуклеїну в спинномозковій рідині. Антитіло азіо0452 паІ-3 знижує поширення а-синуклеїну іп мімо. Ця нова функція інгібування поширення альфа-синуклеїна свідчить про зв'язування з іншим епітопом на людському альфа-синуклеїну в порівнянні з антитілами, які не інгібують поширення.
В деяких варіантах здійснення, будь-яке з антитіл або їх антиген-зв'язуючих фрагментів, розкритих в даному документі, мають будь-яку одну або декілька функціональних властивостей бо азіо0452 пді-3, наприклад, будь-яку з функціональних властивостей азіо0452 пдіІ-3, зазначених в даному документі. В деяких варіантах здійснення, будь-яке з антитіл або їх антиген-зв'язуючих фрагментів, розкритих в даному документі, мають будь-яку одну або декілька функціональних властивостей а5іо0543, наприклад, будь-яку з функціональних властивостей аз5іІ0о0543, зазначених в даному документі.
В одному варіанті здійснення, антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент за представленим винаходом конкурує з антитілом аз5і00452 подіІ-3 та/або а5І00543 за зв'язування з людським а-синуклеїном. В іншому варіанті здійснення, антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент за представленим винаходом зв'язується з таким самим епітопом на людському а- синуклеїні, як і антитіло а5І00452 пдіІ-3 та/або азІо0543.
Можна легко визначити, чи зв'язується антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент з епітопом еталонного антитіла або антиген-зв'язуючого фрагменті, як визначено вище. Такі способи є звичайною справою в даній галузі. Наприклад, антитіло може порівнюватись з іншим з використанням біохімічного конкурентного аналізу, за допомогою якого два антитіла (дин мічений з метою детектування та один ні) інкубують одночасно з даним антигеном. Якщо сигналу зв'язування досягається для міченого антитіла, то два антитіла, як зазначається, розпізнають різні, епітопи, які не перекриваються, на протеїні, що викликають зацікавленість.
Якщо не отримують ніякого сигнала зв'язування, то, навпаки, вони будуть охарактеризовані як такі, що мають епітопи, які перекриваються, на протеїновій послідовності, оскільки зв'язування одного антитіла стерично перешкоджає зв'язуванню другого антитіла. Крім того, амінокислотне розташування даного епітопу також може бути ідентифіковано з використанням модифікованих протеїнів, таких як усічені, лінійні пептидні послідовності, отримані з первинної амінокислотної послідовності антигену, види ортологів, та з використанням протеолітичного дайджеста та мас- спектрального аналізу антитіла, зв'язаного з даним протеїном. Дані методології служать для генерування ділянки взаємодії між антитілом та антигеном.
Додаткові рутинні експерименти (такі як пептидні мутації та аналізи зв'язування) можуть бути проведені для підтвердження того, чи спостерігається будь-яка недостатність зв'язування насправді внаслідок зв'язування епітопу за винаходом, або якщо деяке інше явище (таке як стеричне утруднення) несе відповідальність. Такі експерименти можуть проводитись з використанням ЕГІЗА, КІА, Віасоге, проточної цитометрії або інших відомих аналізів зв'язування
Зо антитіл.
Наприклад, для тонкого картування специфічного епітопу можуть бути отримані математичні моделі інтерфейсу епітоп:паратоп з даних, отриманих шляхом розв'язання структури комплексу антиген:антитіло з використанням методу візуалізації з високою роздільною здатністю, такого як співкристалізація з дифракцією рентгенівських променів, дифракція. Для підтвердження релевантності отриманої математичної моделі, з точки зору виявлення ключових контактних залишків, що визначають епітоп, точковий мутагенез антигену повинен бути виконаний згодом та аналіз впливу на міцність зв'язування між антигеном та антитілом, викликаним такими встановленими мутаціями. Використовуючи дану комбінацію способів, може бути встановлена точна карта ключових контактних залишків, які містять епітоп.
Антитіла або їх антиген-зв'язуючі фрагменти, які зв'язуються з епітопом антитіла або його антиген-зв'язуючим фрагментом за винаходом, можуть бути отримані шляхом продукування варіантів антитіла або його антиген-зв'язуючого фрагмента за винаходом. Такі варіанти антитіла або їх антиген-зв'язуючих фрагментів можуть мати СОК, які мають високий рівень ідентичності з СОК антитіла або його антиген-зв'язуючого фрагмента за винаходом. Наприклад, в деяких варіантах здійснення, будь-який з СОК, розкритих в даному документі будь-якого з антитіл або антиген-зв'язуючих фрагментів, розкритих в даному документі, може відрізнятися на 1 або 2 амінокислотних залишків в порівнянні з будь-якою однією або декількома з специфічних
СОК послідовностей, зазначених в даному документі (наприклад, будь-яка одна або декілька з
СОК, що має 5ЕО ІО МО: 5, 15, 16, 20, 10 та 21). Крім того, такі антитіла можуть мати одну або декілька варіацій (наприклад, консервативне амінокислотне заміщення) в каркасних ділянках.
В одному варіанті здійснення, антитіла або їх антиген-зв'язуючі фрагменти за винаходом мають варіації в СОМ амінокислотних послідовностях, які зберігають щонайменше 80 95, щонайменше 85 95, щонайменше 90 95, щонайменше 92 95, щонайменше 93 9565, щонайменше 94 96, щонайменше 95 95, щонайменше 96 95, щонайменше 97 95, щонайменше 98 95 та аж до 99 95 ідентичність послідовності до СОК антитіла азІо0452 па1І-3.
Зокрема, розглядаються консервативні амінокислотні заміщення. Консервативні заміщення є такими, що відбуваються в межах родини амінокислот, які мають споріднені бічні ланцюги.
Генетично кодовані амінокислоти зазвичай поділяються на родини: (1) кислотна: аспартат, глутамат; (2) основна: лізин, аргінін, гістидин; (3) неполярна: аланін, валін, лейцин, ізолейцин, бо пролін, фенілаланін, метіонін, триптофан; та (4) незаряджена полярна: гліцин, аспарагін,
глутамін, цистеїн, серин, треонін, тирозин. Дані родини можуть бути додатково віднесені до категорії: серин та треонін є аліфатично-гідрокси родиною; аспарагін та глутамін є амід-вмісною родиною; аланін, валін, лейцин та ізолейцин є аліфатичною родиною; та фенілаланін, триптофан та тирозин є ароматичною родиною. Таким чином, загалом можна очікувати, що ізольоване заміщення лейцина на ізолейцин або валін, аспартата на глутамат, треоніна на серин, або аналогічне заміщення амінокислоти на структурно споріднену амінокислоту, не буде мати сильного впливу на функцію зв'язування або властивості отриманого в результаті антитіла, особливо, якщо заміщення не включає амінокислоту в межі СОК сайта.
В одному варіанті здійснення, антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент відповідно до винаходу включає щонайменше одну СОК, вибрані з: (і) Н-СОКТІ з БЕО ІЮ МО:5, (ії) Н-СОКЗ2 з БЕО ІЮ МО:6, (іїї) Н-СОКЗ з БЕО І МО. 7, (м) ІГ-СОК1 з БЕО ІО МО: 9, (хм) І-СОК2 з БЕО І МО: 10, (м) ІГ-СОКЗ з БЕО І МО: 11.
В одному варіанті здійснення, антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент за представленим винаходом має щонайменше одну СОЕ, вибрану з СОК антитіла азіо0452 па1/-3, тобто щонайменше одну СОК, вибрану з будь-якої однієї з зЗЕО ІЮ МО: 5, 5ЕО ІЮО МО: 15, 5ЕО
ІО МО: 16, БЕО ІЮ МО: 20, 5ЕО І МО: 10, 5ЕО ІЮ МО: 21.
В іншому варіанті здійснення, СОКЗ важкого ланцюга антитіла або його антиген-зв'язуючого фрагмента за представленим винаходом представляє собою СОКЗ важкого ланцюга антитіла азіоб0452 пді-3; талабо СОКЗ легкого ланцюга антитіла або його антиген-зв'язуючого фрагмента за представленим винаходом представляє собою СОМЗ легкого ланцюга антитіла а5іо0452 пдіІ-3. Таким чином, в одному варіанті здійснення, СОКЗ важкого ланцюга антитіла або його антиген-зв'язуючого фрагмента відповідно до винаходу представляє собою СОКЗ з 5БЕО ІЮ МО: 16 важкого ланцюга антитіла азіо0452 пдІ-3; тал'або СОКЗ легкого ланцюга антитіла або його антиген-зв'язуючого фрагмента відповідно до винаходу представляє собою СОКЗ з 5БЕО ІЮ МО: 21 легкого ланцюга антитіла аз5Іо0452 па1-3.
В наступному варіанті здійснення, СОКЗ важкого ланцюга антитіла або його антиген- зв'язуючого фрагмента за представленим винаходом представляє собою СОМКЗ важкого ланцюга антитіла азІо0452 па|1-3.
В одному варіанті здійснення, СОКЗ легкого ланцюга антитіла або його антиген-зв'язуючого фрагмента за представленим винаходом представляє собою СОКЗ легкого ланцюга антитіла азіоб0452 паді-3.
Зо В одному варіанті здійснення, антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент за винаходом має шість СОК антитіла азіо0452 пдіІ-3, тобто три СОЕК важкого ланцюга, який має амінокислотні послідовності 5ЕО ІЮ МО: 5, 5ЕО ІЮ МО: 15 та 5ЕО ІЮ МО: 16; та три СОК легкого ланцюга, який має амінокислотні послідовності ЗЕО ІЮ МО: 20, 5ЕО І МО: 10 та 5ЕО ІЮ МО: 21.
Представлений винахід передбачає антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент за представленим винаходом, що містить варіабельний важкий ланцюг, який має щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595, 9695, 97 90, 98 95, 9995, або 100 95 ідентичність до нуклеотидної послідовності, визначеної 5ЕО ІЮ МО: 13, та варіабельний легкий ланцюг, який має щонайменше 80 95, 85 95, 90 95, 9595, 96 95, 97 95, 98 95, 99 95, або 100 95 ідентичність до нуклеотидної послідовності, визначеної ЗЕО ІЮ МО: 18.
Представлений винахід також передбачає антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент, який містить варіабельний важкий ланцюг, який має нуклеотидну послідовність, визначену
ЗЕО ІЮ МО: 13 та варіабельний легкий ланцюг, який має нуклеотидну послідовність, визначену
ЗЕО ІЮО МО: 18.
Представлений винахід передбачає антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент за представленим винаходом, що містить варіабельний важкий ланцюг, який має щонайменше 80 95, 8595, 9095, 9595, 96 90, 97 Уо, 98 95, 99 95, або 100 95 ідентичність до амінокислотної послідовності, визначеної 5ЕО 10 МО: 14, та варіабельний легкий ланцюг, який має щонайменше 80 95, 85 95, 90 95, 9595, 96 95, 97 95, 98 95, 99 95, або 100 95 ідентичність до амінокислотної послідовності, визначеної ЗЕО ІЮ МО: 19.
В одному варіанті здійснення, антитіло, або його антиген-зв'язуючий фрагмент, включає (Її) варіабельний важкий ланцюг, який має щонайменше 80 95, 85 95, 90 95, 95 Фо, 96 Фо, 97 Ус, 98 9, 99 95, або 100 95 ідентичність до амінокислотної послідовності, визначеної 5ЕО ІЮ МО: 14, та варіабельний легкий ланцюг, який має щонайменше 80 95, 85 95, 90 95, 95 У, 96 95, 97 Фо, 98 9,
99 95, або 100 95 ідентичність до амінокислотної послідовності, визначеної ЗЕО ІЮ МО: 19, та (ії) шість СОК антитіла азіо0452 паді-3.
Представлений винахід передбачає антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент відповідно до винаходу, що містить варіабельний важкий ланцюг, який має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 14, та варіабельний легкий ланцюг, який має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 19.
В одному варіанті здійснення, антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент відповідно до винаходу має шість СОК антитіла азіо0543.
Таким чином, в одному варіанті здійснення, антитіло, або його антиген-зв'язуючий фрагмент відповідно до винаходу включає: а) три СОК важкого ланцюга, які мають послідовності: (і) Н-СОК'І з БЕО ІЮ МО: 25, (її) Н-СОК2 з 5ЕО ІЮ МО: 26; та (ії) нН-СОКЗ з 5БЕО ІО МО: 27, та р) три СОК легкого ланцюга, які мають послідовності: (І) Г-СОК1 з БЕО І МО: 31, (ії) І-СОК2 з БЕО ІО МО: 32; та (іїї) І-СОКЗ з БЕО ІО МО: 33.
В наступному варіанті здійснення, антитіло, або його антиген-зв'язуючий фрагмент відповідно до винаходу включає варіабельний важкий ланцюг, який має щонайменше 80 95, 85 оо, 90 У, 95 95, 96 Фо, 97 95, 98 Фо, 99 95, або 100 95 ідентичність до послідовності, визначеної
ЗЕО ІЮ МО: 14, та варіабельний легкий ланцюг, який має щонайменше 80 95, 85 9», 90 9, 95 95, 96 95, 97 9, 98 95, 99 95, або 100 95 ідентичність до послідовності, визначеної 5ЕО ІЮ МО: 19,та додатково включає: а) три СОК важкого ланцюга, які мають послідовності: (мії) Н-СОК'І з БЕО ІЮ МО: 25, (мії) Н-СОК2 з 5ЕО ІЮ МО: 26; та (їх) Н-СОКЗ з 5ЕО ІО МО: 27, та р) три СОК легкого ланцюга які мають послідовності: (мії) ІГ-СОКІ з БЕО ІЮО МО: 31, (мії) І-СОК2 з БЕО ІО МО: 32; та (їх) І-СОКЗ з БЕО ІО МО: 33.
Представлений винахід також передбачає антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент, який містить варіабельний важкий ланцюг, який має нуклеотидну послідовність, визначену
ЗЕО ІЮ МО: 23 та варіабельний легкий ланцюг, який має нуклеотидну послідовність, визначену
ЗЕО І МО: 29.
Представлений винахід також передбачає антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент за представленим винаходом, що містить варіабельний важкий ланцюг, який має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 24, та варіабельний легкий ланцюг, який має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 30.
В наступному варіанті здійснення, антитіло, або його антиген-зв'язуючий фрагмент, включає важкий ланцюг, який має амінокислотну послідовність, визначену ЗЕО ІЮО МО: 22, та легкий ланцюг, який має амінокислотну послідовність, визначену ЗЕО ІЮ МО: 28.
Каркасна ділянка та СОК або антитіло можуть бути точно визначені (дивіться, Кабваї еї а/.
Зедиеєпсез ої Ргоївїпв5 ої Іттипоіоадісаї Іпіегеві, ГА Едйіоп, 0.5. Оєераптенпі ої Неайй апа Нитап
Зегмісез (1991), 91-3242, 1991; апа Споїніа вї а/. 9. Мої. Віо!. (1987), 196:901-917, обидві з яких є включеними в даний документ у вигляді посилання).
Незначні варіації в амінокислотних послідовностях антитіла або його антиген-зв'язуючого фрагмента за винаходом розглядаються як такі, що охоплюються представленим винаходом, за умови, що варіації в амінокислотній(их) послідовності(ях) зберігають щонайменше 75 95, більш переважно щонайменше 80 95, щонайменше 90 95, щонайменше 95 95, та найбільш переважно щонайменше 9995 ідентичності послідовності до антитіла або його антиген-зв'язуючого фрагмента за винаходом як визначеніо будь-де в даному документі. Зокрема, розглядаються консервативні амінокислотні заміщення.
Винахід також передбачає одноланцюгову амінокислотну послідовність, яка містить легкий ланцюг антитіла або його антиген-зв'язуючого фрагмента за представленим винаходом як визначені будь-де в даний документ. Винахід також передбачає одноланцюгову амінокислотну послідовність, яка містить важкий ланцюг антитіла або його антиген-зв'язуючого фрагмента за представленим винаходом, як визначені будь-де в даний документ.
Оптимальне вирівнювання послідовностей для порівняння може бути проведено, наприклад, використовуючи алгоритм вирівнювання локальних гомологій Зтій та У/аїегтап (Зтйй та Умаїегтап, Адму. Аррі. Май. 2 (1981), 484; включений в даний документ у вигляді посилання), використовуючи алгоритм Нідлмана-Вунша (Мееаіетап 5 Умуип5сй, У. Мої. Віої. (1970), 48: 443; включений в даний документ у вигляді посилання) способом пошуку схожості за
Пірсоном-Ліпманом (Реагзоп 5 Гіртап, Ргос Маї! Асад Зсі О 5 А (1988), 85: 2444; включений в даний документ у вигляді посилання), за допомогою комп'ютерних реалізацій даних алгоритмів (САР, ВЕЗТРЇІТ, РАБТА, та ТЕРАБ5ТА-бедиєпсе Апаїузізє боїймагє РасКаде ої Ше СепеїЇс5
Сотршиїег Стоир, Опімегейу ої М/івсопвзіп ВіотесппоЇоду Сепіег, 1710 Опімегейу Амепиє, Мадізоп, умі5. 53705), або шляхом візуального огляду (дивіться Сигтепі Ргоїосої5 іп МоїІесшиїаг Віоіоду, Е.М.
Аи!йзрбеї еї аїЇ, еа5, Сигтепі Ргоїосої5, спільне підприємство Сгеепе Рибіїзпіпуд Авзосіайев, Іп. апа
Уопп УмМіеу 5 Боп5, Іпс. (1995 Зирріетепі) Аєйизриреї; включений в даний документ у вигляді посилання).
Приклади алгоритмів прийнятних для визначення відсоткової подібності або ідентичності послідовності включають алгоритми ВІГАЗТ та ВІ АБТ 2,0 (дивіться Айб5сПпиї! єї аї. У. Мої. Віо1. (1990), 215(3): 403-410; та "пЕр:/Лмли.порі.піт.пійодом/" Майопа! Сепієег їог Віоїесппоїоду
Іпформатіоп; обидві з яких є включеними в даний документ у вигляді посилання).
В одному варіанті здійснення, антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент за винаходом є виділеним. В іншому варіанті здійснення, антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент за винаходом є очищеним.
В одному варіанті здійснення, антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент за винаходом є моноклональним антитілом. В іншому варіанті здійснення, антитіло або його антиген- зв'язуючий фрагмент за винаходом є гуманізованим антитілом. В ще іншому варіанті здійснення, антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент за винаходом є людським антитілом.
В одному варіанті здійснення, антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент за представленим винаходом представляє собою ІдА, дО, ІДЕ, ДМ або Ідс, такі як ІДС1, ІС,
ІЗ, та І(д4, антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент.
В іншому варіанті здійснення, антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент за винаходом
Зо має знижену афінність зв'язування з (ДО Ес рецепторами. Таким чином, антитіло або антиген- зв'язуючий фрагмент за винаходом має низький імуногенний ефект. В одному варіанті здійснення, антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент представляє собою Ідсї!1ї ТМ антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент. Д1 ТМ представляє собою Ідс1 потрійний мутант, який містить З точкових мутації (І 234Е/ 235Е/РЗ3315) в Ес домені, що знижує афінність зв'язування антитіла або його антиген-зв'язуючого фрагмента з Ес-гама рецепторами (Есукз) (Одапезуап єї аї. Асіа Сгувіайоаг О Віо! СтувіаМодг, (2008) 64: 700-704; включений в даний документ у вигляді посилання). В деяких варіантах здійснення, антитіло-опосередкована профілактика альфа-синуклеїнового поширення з використанням антитіл за винаходом таким, чином, не вимагає Ес-пов'язаних ефекторних функцій, як ключового механізму дії.
Антиген-зв'язуючі фрагменти включають Раб, Ем, 5сЕм, аАБ, Ра, Раб", (аб): або виділену ділянку визначення комплементарності (СОК), що має достатній каркас для зв'язування. Бар фрагмент може представляти собою моновалентний фрагмент, який складається з МІ, МН, СІ. та СНІ доменів. Е(аб)2 фрагмент може представляти собою бівалентний фрагмент, який містить два Бар фрагменти, з'єднані дисульфідним містком в шарнірній ділянці. Ес фрагмент може складатися з доменів СН2 та СНЗ. Ем фрагмент може складатися з доменів Мі та МН одноплечового антитіла. ЧАБ фрагмент (Умага еї аї. Маїште (1989), 341: 544-546; включений в даний документ у вигляді посилання) може складатися з домена МН. Виділена ділянка визначення комплементарності (СОК), яка має достатній каркас для зв'язування, може представляти собою антиген-зв'язуючу частину варіабельної ділянки.
Антиген-зв'язуюча частина варіабельної ділянки легкого ланцюга та антиген-зв'язуючу частину варіабельної ділянки важкого ланцюга, наприклад, два домена Ем фрагмента, Мі. та МН, можуть бути з'єднані, використовуючи рекомбінантні способи, за допомогою синтетичного лінкера, що дає можливість скласти як єдиний протеїновий ланцюг, в якому МІ. та МН ділянки паруються, щоб утворити моновалентні молекули (відомі як одноланцюговий Ем (всем); дивіться, наприклад, Віга еї аі. 5сіеєпсе (1988), 242(4877): 423-426; та Нивіюоп евї а!. Ргос Маї! Асай
Зсі 0 5 А (1988), 85: 5879-5883; обидві з яких є включеними в даний документ у вигляді посилання). їх отримують, використовуючи звичайні методики, відомі фахівцям в даній галузі, та частини піддають скринінгу для застосування таким самим чином, як і інтактні антитіла.
Антитіла або їх антиген-зв'язуючі фрагменти за винаходом можуть мати будь-які або всі бо переважні властивості, як визначено вище, або їх комбінації. Зокрема, антитіла або їх антиген-
зв'язуючі фрагменти за винаходом можуть бути селективними до альфа-синуклеїну та бути здатними сповільнювати або запобігати передачу від клітини до клітини та поширення альфа- синуклеїна іп мімо.
Функціональність отриманого в результаті антитіло або його антиген-зв'язуючого фрагмента за винаходом, та зокрема (і) його здатність зв'язувати епітоп альфа-синуклеїну; та (ії) його здатність уповільнювати або запобігати передачі від клітини до клітини та поширення альфа- синуклеїну іп мімо, може бути легко визначена шляхом аналізу його специфічної активності, використовуючи методики, описані в даному документі в Прикладах.
Дане розкриття передбачає композиції для доставки антитіла або його антиген-зв'язуючого фрагмента відповідно до винаходу через гематоенцефалічний бар'єр (ВВВ), використовуючи транспортерну молекулу, яка може перетинати ендотеліальні клітини головного мозку, тоді як асоційовані із зазначеним антитілом або фрагментом, наприклад, тоді як злитий або кон'югований із зазначеним антитілом або фрагментом. ВВВ послідовності є передбаченими в даному документі.
Як використовується в даному документі, термін "корисне навантаження" використовують як скорочення для антитіла або його антиген-зв'язуючого фрагмента, як описано в даному документі, чий перенос крізь ВВВ може бути полегшений транспортерною молекулою, як представлено в даному документі. Зокрема варіанти здійснення, "корисне навантаження" охоплює варіабельний ділянку важкого ланцюга антитіл за винаходом, більш конкретно варіабельну ділянку важкого ланцюга аі500452 пді-3 або азіо0543.
Корисне навантаження може бути частиною транспортерної молекули, наприклад, як злитий поліпептид, або приєднаний до поліпептида через дисульфідні зв'язки або інші ковалентні зв'язки. Альтернативно, корисне навантаження може бути асоційованим з транспортерною молекулою будь-яким способом, який дозволить транспортерній молекулаі полегшити його перенесення крізь ВВВ, як далі описано нижче. В певних аспектах корисне навантаження залишається частиною транспортерної молекули після проходження ВВВ, та зберігає активність в центральній нервовій системі (ЦНС) в такій формі. Альтернативно корисне навантаження може бути асоційованим з транспортерною молекулою під час проходження ВВВ, але таким чином, що дозволяє йому дисоціювати з транспортерною молекулою після проходження ВВВ.
Зо Розкриття, крім того, передбачає способи лікування або діагностики захворювання або розладу ЦНС, зокрема, са-синуклеїнопатії, що включають застосування таких транспортерних молекул, асоційованих з антитілом або його антиген-зв'язуючим фрагментом відповідно до винаходу.
В певних аспектах, дане розкриття передбачає виділену транспортерну молекулу, яка містить отриманий з імуноглобуліну поліпептид. В певних аспектах поліпептид є миметиком або немиметиком верблюжого антитіла ЕС5, ідентифікованого та виділеного, використовуючи технологію флуоресцентного мікрооб'ємного аналізу (ЕМАТ) для виявлення зв'язування з мікросудинними ендотеліальними клітинами головного мозку (ВММЕС), наприклад, мишачими
В.Епаз клітинами. В певних аспектах, отриманий з імуноглобуліну поліпептид представляє собою антитіло або його активний фрагмент, де "активний" означає, що транспортерна молекула може, наприклад, зв'язуватися з ВММЕС в одному або декількох видах, наприклад, мишачого ВМУМЕС, щурячого ВММЕС, мавп'ячого - яванського макаки ВМУЕС, або людського
ВММЕС, інтерналізують в ВММЕС одного або декількох видів, та/або перетинають гематоенцефалічний бар'єр або самостійно, або асоційовані з корисним навантаженням.
В деяких варіантах здійснення, ВВВ транспортерна молекула представляє собою ВВВ транспортерна молекула, описану в Попередній заявці на патент США Мо. 62/094,503, яка є включеною в даний документ у вигляді посилання у всій своїй повноті. В певних аспектах, транспортерна молекула включає одне або декілька з ВББІО241, ВЬБОб626, ВЬБОб26даЇ, вриюб6з32, вввіобзго! ВррІо654, ВррюЮ726, ВрОО727, ВріО732, ВЬрІ0754, ВрОЮб74, ВрОІО0755, вЬрі643, ВЬБО579 або ВЬБІО671, як описано в Попередній заявці на патент США Мо. 62/094,503, яка є включеною в даний документ у вигляді посилання у всій своїй повноті.
В конкретному варіанті здійснення, ВВВ транспортерна молекула представляє собою врО626 або ВВВІЮО632.
В певних варіантах здійснення, ВВВ транспортерна молекула є модифікованою на рівні генів зародкової лінії, наприклад, ВОБІОб2бод! є модифікованою на рівні генів зародкової лінії версії ВрРІщО626, названої "ВЬББЮб626а1".
В наступному конкретному варіанті здійснення, ВВВ транспортерна молекула представляє собою ВВВІО6329І або ВЬБрРЮб2ба)1.
В певних аспектах, транспортерна молекула не зв'язуються з ВМУЕС, але все ще є здатною бо транспортувати крізь ВВВ як показано в трансцитозному аналізі іп міїго.
Стосовно ВВВ транспортерних молекул, описані послідовності МН СОК відповідають класичним місцям нумерації Кабаї, а саме Караї Н-СОКІ1 знаходиться в положеннях 31-35, Н-
СОВ2 знаходиться в положеннях 50-65, та Н-СОРЗ знаходиться в положеннях 95-102. І-СОВ82 та Ї-СОКЗ також відповідають класичним місцям нумерації Кабаї, а саме положенням 50-56 та 89-97, відповідно. Як використовується в даному документі, терміни "/-СОКІ1" або "легкий ланцюг СОКТ" відповідають послідовностям розташованим в Кабвраї положеннях 23-34 в МІ. (на відміну від класичного розташування ІЇ-СОКІ1 відповідно до схеми нумерації Кабаї відповідає положенням 24-34).
В певних аспектах, отриманий з імуноглобуліну поліпептид включає визначаючі комплементарність ділянки (СОК) важкого ланцюга імуноглобуліна. Наприклад, отриманий з імуноглобуліну поліпептид може включати визначаючу комплементарність ділянку-ї важкого ланцюга імуноглобуліна (Н-СОКІ), визначаючу комплементарність ділянку-2 важкого ланцюга імуноглобуліна (Н-СОК2), ланцюг визначаючу комплементарність ділянку-3 важкого ланцюга імуноглобуліна (Н-СОКЗ3). В певних аспектах, отриманий з імуноглобуліну поліпептид може додатково містити, або альтернативно містити, СОМ легкого ланцюга імуноглобуліна.
Наприклад, отриманий з імуноглобуліну поліпептид може включати визначаючу комплементарність ділянку-ї легкого ланцюга імуноглобуліна (1-СОКІ), визначаючу комплементарність ділянку-2 легкого ланцюга імуноглобуліна (І-СОК2), та визначаючу комплементарність ділянку-3 легкого ланцюга імуноглобуліна (І-СОВ3).
В певних аспектах, отриманий з імуноглобуліну поліпептид містить Н-СОВІ, Н-СОМ2, Н-
СОВЗ, І-СОВІ, І-СОК2О, та І-СОКЗ 3 наступними амінокислотними послідовностями, відповідно: (а) БЕО ІЮ МО: 40 як Н-СОКІ1, 5ЕО ІО МО: 41 як Н-СОК2, 5ЕО ІЮО МО: 42 як Н-СОВЗ, 5ЕО І
МО: 36 як І-СОР1, ЗЕО ІЮО МО: 37 як І-СОК2, та 5ЕО ІЮ МО: 38 як І-СОКЗ, де СОЕ є подібними до тих, які ВББІО626 та ВЬБІОб626оаЇ; (Б) 5ЕО ІЮ МО: 40 як Н-СОКІ1, 5ЕО ІО МО: 41 як Н-СОК2, 5ЕО ІЮО МО: 42 як Н-СОВЗ, 5ЕО І
МО: 44 як І-СОК1, 5ЕО І МО: 45 як І-СОК2, та 5ЕО ІО МО: 46 як І-СОБ3З, де СОВ. є ідентичними до тих, які ВББЮОб626 та ВЬБІОб2ОЇ.
В певних аспектах, отриманий з імуноглобуліну поліпептид містить Н-СОВІ, Н-СОМ2, Н-
СОВЗ, І1-СОНІ, І-СОК2О, та І-СОКЗ 3 наступними амінокислотними послідовностями, відповідно: (а) БЕО ІЮО МО: 49 як Н-СОКІ1, 5ЕО ІЮО МО: 50 як Н-СОК2, 5ЕО ІЮО МО: 51 як Н-СОВЗ, 5ЕО І
МО: 53 як І-СОР1, ЗЕО ІЮО МО: 54 як І-СОК2, та 5ЕО ІЮ МО: 55 як І-СОКЗ, де СОЕ є подібними до тих, які ВЬББЮОб632а1; (Б) 5ЕО ІЮ МО: 49 як Н-СОК1, 5ЕО ІЮО МО: 50 як Н-СОК2, 5ЕО ІЮО МО: 51 як Н-СОВЗ, 5ЕО І
МО: 53 як І-СОК1І, 5ЕБЕО І МО: 54 як І-СОК2, та 5ЕО ІО МО: 55 як І-СОБ3З, де СОВ. є ідентичними до тих, які ВББІОбЗ21;
В певних альтернативних варіантах здійснення, одна або декілька СОК, як описано вище, є ідентичними до описаних СО, за винятком, наприклад, 1, 2, 3, 4, або 5 одиничних амінокислотних делецій, заміщень, або вставок.
В певних варіантах здійснення, транспортерна молекула, як представлено вище, може перетинати гематоенцефалічний бар'єр.
В певних аспектах, Н-СОВІ, Н-СОВ2, Н-СОВЗ, І-СОНІ1, І-СОК2, та І-СОКЗ можуть бути розташовані в каркасних ділянках імуноглобулінів для отримання антитіла УН та антитіла МІ.
В певних аспектах каркасні ділянки можуть представляти собою каркасні ділянки людського походження. В певних аспектах антитіло МН та антитіло МІ. є злитими разом, наприклад, через гнучкий пептид лінкер, з утворенням молекули 5сЕм. В певних аспектах МН та МІ додатково містять одну або декілька константних доменів імуноглобуліна, наприклад, СНІ домен, шарнірну ділянку, СНЗ домен, СНЗ домен, Сі -каппа домен, та/або СІ лямбда домен. В певних аспектах один або декілька константних доменів імуноглобуліна є отриманими з людського імуноглобуліна, наприклад, людського ІДС1 імуноглобуліна. В певних аспектах МН, Мі, та/або константні домени можуть містити мутації для полегшення, наприклад, більш тривалого або більш короткого періоду напіввиведення, підвищеної або зниженої ефекторної функції, або здатності приєднувати молекулу корисного навантаження або через пептидне злиття, дисульфідний зв'язок або хімічної кон'югації.
В певних аспектах за винаходом передбаченими є антитіла або їх антиген-зв'язуючі фрагменти відповідно до винаходу, асоційовані з транспортерною молекулою, яка може перетинати ендотеліальні клітини головного мозку, як описано в даному документі.
В конкретних аспектах, дане розкриття передбачає антитіло або його антиген-зв'язуючий бо фрагмент відповідно до винаходу, асоційоване з транспортерною молекулою, яка містить отриманий з імуноглобуліну поліпептид, де поліпептид включає варіабельну ділянку важкого ланцюга (МН) імуноглобуліну та варіабельну ділянку легкого ланцюга (МІ) імуноглобуліну.
В певних аспектах отриманий з імуноглобуліну поліпептид включає послідовності, представлені в даному документі, включаючи: (а) МН амінокислотну послідовність щонайменше на 80 95, 84 95, 85 95, 90 95, 95 о, 96 Ор, 97 95, 9895, або 9995 ідентичну до 5ЕО ІЮ МО: 39 та Мі амінокислотну послідовність щонайменше на 80 95, 84 9», 85 о, 90 Фо, 95 90, 96 95, 97 Фо, 98 95, або 99 95 ідентичну до 5ЕО ІЮ
МО: 43, де БЕО ІЮ МО: 39 та БЕО ІЮ МО: 43 кодують МН та Мі. ділянки з ВЬБІОб62б6оа), (Б) МН амінокислотну послідовність щонайменше на 80 Фо, 84 95, 85 о, 90 Уо, 95 бо, 96 Фо, 97 95, 9895, або 9995 ідентичну до 5ЕО ІЮ МО: 47 та Мі амінокислотну послідовність щонайменше на 80 95, 84 9», 85 о, 90 Фо, 95 90, 96 95, 97 Фо, 98 95, або 99 95 ідентичну до 5ЕО ІЮ
МО: 43, де БЕЕО ІЮО МО: 47 та БЕО ІЮО МО: 43 кодують МН та Мі. ділянки з ВББЮб26, (с) МН амінокислотну послідовність щонайменше на 80 95, 84 бо, 85 95, 90 о, 95 Фо, 96 о, 97 95, 9895, або 9995 ідентичну до 5ЕО ІЮ МО: 48 та Мі амінокислотну послідовність щонайменше на 80 95, 84 9», 85 о, 90 Фо, 95 90, 96 95, 97 Фо, 98 95, або 99 95 ідентичну до 5ЕО ІЮ
МО: 43, де БЕО ІЮ МО: 48 та БЕО ІЮО МО: 43 кодують МН та Мі. ділянки з ВЬБІО632.
В певних аспектах, дане розкриття передбачає антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент відповідно до винаходу, асоційовані з транспортерною молекулою, яка містить отриманий з імуноглобуліну поліпептид, де отриманий з імуноглобуліну поліпептид включає МН ділянку та Мі. ділянку, де: (а) МН ділянка включає 5ЕО ІЮ МО: 34, та Мі ділянка включає ЗЕО ІО МО: 35; або (Б) МН ділянка включає 5ЕО ІЮ МО: 39, та Мі ділянка включає ЗЕО ІО МО: 43; або (с) МН ділянка включає 5ЕО ІО МО: 39, та Мі. ділянка включає ЗЕО ІЮО МО: 35; або (4) МН ділянка включає 5ЕО ІЮ МО: 47, та Мі ділянка включає ЗЕО ІО МО: 43; або (є) МН ділянка включає 5ЕО ІЮ МО: 47, та МІ. ділянка включає ЗЕО ІЮО МО: 35; або (І) МН ділянка включає 5ЕО ІО МО: 48, та Мі ділянка включає 5ЕО ІЮО МО: 52.
В наступному варіанті здійснення, МН та Мі ділянки транспортерної молекули, як описано вище, є ковалентно зв'язаними з утворенням одноланцюгового фрагмента (СЕМ).
В певних аспектах, транспортерна молекула, представлена в даному документі, має транспортну активність, наприклад, вона може зв'язуватися з ВММЕС з одного або декількох видів, наприклад, мишачого, щурячого, мавп'ячого - яванського макаки, або людського ВМУЕС, вона може інтерналізуватися в ВММУЕС з одного або декількох видів, або вона може перетинати гематоенцефалічний бар'єр.
В певних аспектах, транспортерна молекула, як представлено в даному документі, включає отриманий з імуноглобуліну поліпептид, де отриманий з імуноглобуліну поліпептид включає антитіло або його здатний до проникнення через ВВВ фрагмент. "Здатний до проникнення через ВВВ фрагмент", як описується в даному документі, представляє собою фрагмент транспортерної молекули, який може специфічно зв'язуватися з
ВММЕС з одного або декількох видів та проходити через ВММЕС іп мійго або іп мімо з периферичної судинної системи в судинну систему ЦНС. Чи є даний фрагмент здатним до проникнення через ВВВ фрагментом може бути дослідженим різними іп мйго або іп мімо аналізами, відомими фахівцям в даній галузі. Наприклад, транспортерна молекула може бути досліджена в трансцитозному аналізі іп мії, в аналізі іп мімо, такому як діурезний аналіз, як описується в 5 62/094,503. Інші аналізи, які можуть використовуватися для вимірювання іп мімо доставки корисних навантажень крізь ВВВ включають, без обмеження, хронічну компресію (ССІ); модель збереженого пошкодження нерва (5МІ) або лігатуру спінального нерва (ЗМІ), всі з яких можуть вимірюватися через притупування лапками, або за моделлю Харгрейвса (Нагогеамез К, еї аї., Раіп; 1988; 32; 77-88). в певних аспектах, транспортерна молекула, як представлено в даному документі, може зв'язуватися з ВММЕС з одного або декількох видів, наприклад, людського, мавп'ячого - яванського макаки, мишачого, щурячого, або бичачого
ВММУЕС. Зв'язування може бути продемонстровано різними способами, відомими звичайним фахівцям в даній галузі, наприклад, в ЕМАТ аналізі, як описується в 05 62/094,503. В певних аспектах ВММУЕС представляють собою капілярні ендотеліальні клітини головного мозку (ВСЕС). В певних аспектах, транспортерна молекула, як представлено в даному документі, може проходити через шар ВСЕС в трансцитозному аналізі іп мій. В певних аспектах, активність транспортерної молекули може бути продемонстрована візуалізацією за рахунок транспортерної молекули в ЦНС. Наприклад, мічена тритієм транспортерна молекула може бути доставлена суб'єкту, наприклад, миші периферично, наприклад, внутрішньовенно, та потім візуалізованою в ЦНС за допомогою кількісної рентгенографії всього тіла. В певних аспектах,
транспортерна молекула локалізується в специфічних ділянках ЦНС, наприклад, корі мозочку, сірій речовині головного мозку, сірій речовині спинного мозку, мості, або їх комбінації.
В певних аспектах, транспортерна молекула, як описується в даному документі, включає антитіло або його здатний до проникнення через ВВВ фрагмент, що включає або складається з двох або більше субодиниць, наприклад, важкого ланцюга або його фрагмента та легкого ланцюга або його фрагмента, де важкий ланцюг та легкий ланцюг є поєднаними, наприклад, як одиничний злитий протеїн (наприклад, 5сЕм), або як дві субодиниці, утримувані разом одним або декількома дисульфідними зв'язками. В певних аспектах важкий ланцюг включає МН домен або ділянку, та легкий ланцюг включає Мі. домен або ділянку.
В одному варіанті здійснення, винахід передбачає антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент відповідно до винаходу, асоційований з транспортерна молекулою через гематоенцефалічний бар'єр, як описано в даному документі.
В конкретному варіанті здійснення, антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент відповідно до винаходу є асоційованим з транспортерною молекулою чрез гематоенцефалічний бар'єр, де транспортерна молекула представляє собою одноланцюговий фрагмент (5сЕм), який містить: і. варіабельну ділянку важкого ланцюга (МН) ВВВІОб2бді 5ЕО ІЮ МО: 39 та варіабельну ділянку легкого ланцюга (МІ) ВВВІО626ба! ЗЕО ІО МО: 43, або і. варіабельну ділянку важкого ланцюга (МН) ВВВІО626 5ЕО ІО МО: 47 та варіабельний ділянку легкого ланцюга (М) ВВВІО626 5ЕО ІЮ МО: 43, іі. варіабельну ділянку важкого ланцюга (МН) ВВВІО6329І 5ЕО ІЮ МО: 48 та варіабельний ділянку легкого ланцюга (МІ) ВВВІО63З2а9і з БЕО ІЮ МО: 52.
В певних аспектах важкий ланцюг додатково включає константний домен важкого ланцюга, наприклад, СНІ домен, шарнір, СН2 домен, та/або СНЗ домен, або його фрагмент. В певних аспектах константний домен важкого ланцюга представляє собою константний домен дО або його фрагмент, наприклад, людський константний домен до, наприклад, людський константний домен Ідс1, Ідс2, дез або Ідс4. В певних аспектах, константний домен Ідс або його фрагмент включає змінене глікозилювання та/або одне або декілька амінокислотних заміщень по відношенню до немутантного типа константного домена Ід, де модифікований до має певну властивість, наприклад, збільшений або зменшений період напіввиведення в порівнянні з періодом напіввиведення ІдС, який має немутантного типа константний домен Ідс, або збільшені або зменшені ефекторні функції по відношенню до немутантного типа константного домена Ідс, або здатність до приєднання гетерологічних фрагментів через, наприклад, пептидний зв'язок, дисульфідний зв'язок, або хімічна кон'югація. В певних аспектах, константний домен до або його фрагмент має змінене глікозилювання по відношенню до немутантного типа константного домена Ідс, де модифікований до має певну властивість, наприклад, збільшений або зменшений період напіввиведення в порівнянні з періодом напіввиведення Ідс, який має немутантного типа константний домен Ідс, або збільшені або зменшені ефекторні функції по відношенню до немутантного типа константного домена Ід.
В деяких варіантах здійснення, антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент відповідно до винаходу є асоційованим з ВВВІО62б6 або ВВВІОб62боді, як визначено в даному документі, утворюючи молекули біспецифічних антитіл.
В інших варіантах здійснення, зазначені біспецифічні антитіла відповідно до винаходу включають людський Ідс1 ТМ скелет (тобто ділянки СНІ, СН2, СНЗ важкого ланцюга Ідс1 ТМ), асоційований з одноланцюговим фрагментом (5сЕм), який містить МН та МІ. ділянки ВВВІО626б або ВВВІО62ба!, прищеплені до М-кінця ("Віз2 формат") або С-кінця ("ВізЗ3 формат") важкого ланцюга або М-кінця ("Вії формат") МІ, анти-а-синуклеїнового антитіла відповідно до винаходу. Посилання на Ві5 формат є таким, як розкрито в ОіМаві еї аІ. У Мої Віо!І. 2009 Осі 30;393(3):672-92.
В деяких варіантах здійснення, зазначені біспецифічні антитіла відповідно до винаходу додатково містять легкий ланцюг, який містить каппа або лямбда Сі. ділянку, асоційовану з М. анти-а-синуклеїновим антитілом відповідно до винаходу.
В конкретних варіантах здійснення, біспецифічні антитіла відповідно до винаходу включають людський ІдС1 ТМ скелет, асоційований з: () одноланцюговим фрагментом (5сЕм) ВВВІО626боді, який містить варіабельну ділянку важкого ланцюга (МН) з 5ЕО ІО МО: 39 та варіабельний ділянку легкого ланцюга (М) з ЗЕО ІЮ
МО: 43; або (ї) одноланцюговим фрагментом (5сЕм) ВЬБІО626, який містить варіабельну ділянку важкого ланцюга (МН) з ЗЕО ІО МО: 47 та варіабельний ділянку легкого ланцюга (МІ) з БЕО ІО МО: 43,
де зазначений 5сЕм є прищепленим до М-кінця (Віз2 формат) або С-кінця (ВіЗЗ3 формат) важкого ланцюга а5іо0452 пді-3 з ЗЕО ІО МО: 12 або М-кінця ("Вії формат") легкого ланцюга з
ЗЕО ІО МО. 17.
В ще наступних конкретних варіантах здійснення, біспецифічні антитіла відповідно до винаходу включають людський ДС1 ТМ скелет, асоційований з одноланцюговим фрагментом (зсЕм) ВВВІО62б6а)|, який містить (ії) варіабельний ділянку важкого ланцюга (УН) з ЗЕО ІЮ МО: 39 та (і) варіабельний ділянку легкого ланцюга (МІ) з ЗЕО ІЮ МО: 43; де зазначений ЗсЕмМ є прищепленим до М-кінця (Віз2 формат) або С-кінця (ВІЗЗ3 формат) важкого ланцюга азіо0452 паІ-3 з ЗЕО ІЮ МО: 12 або М-кінця ("ВіЗ1 формат") легкого ланцюга з 5ЕО ІЮ МО. 17.
В інших конкретних варіантах здійснення, біспецифічні антитіла відповідно до винаходу включають людський ІдДОС1 ТМ скелет, асоційований з: () одноланцюговим фрагментом (5сЕм) ВВВІО626боіІ, який містить варіабельну ділянку важкого ланцюга (МН) з 5ЕО ІО МО: 39 та варіабельний ділянку легкого ланцюга (М) з ЗЕО ІЮ
МО: 43; або (ї) одноланцюговим фрагментом (5сЕм) ВЬБІО626, який містить варіабельну ділянку важкого ланцюга (МН) з ЗЕО ІО МО: 47 та варіабельний ділянку легкого ланцюга (МІ) з БЕО ІО МО: 43, де зазначений 5сЕм є прищепленим до М-кінця (Віз2 формат) або С-кінця (ВіЗЗ3 формат) важкого ланцюга аз5іо0543 з БЕО ІЮ МО: 22 або М-кінця ("Віз1 формат") легкого ланцюга з ЗЕО
ІО МО. 28.
Представлений винахід також передбачає антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент за винаходом для застосування як лікарського засобу.
Представлений винахід також передбачає антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент за винаходом для застосування в попередженні або лікуванні захворювання центральної нервової системи, зокрема, а-синуклеїнопатії. В одному варіанті здійснення, а-синуклеїнопатія є вибраною з хвороби Паркінсона (РО), деменції з тільцями Леві (ОІВ), та множинної системної атрофії (М5А). В переважному варіанті здійснення, а-синуклеїнопатія є хворобою Паркінсона (РО).
Представлений винахід також передбачає застосування антитіла або його антиген- зв'язуючого фрагмента за винаходом для виробництва лікарського засобу для попередження
Зо або лікування захворювання центральної нервової системи, зокрема а-синуклеїнопатії. В одному варіанті здійснення, а-синуклеїнопатія є вибраною з хвороби Паркінсона (РО), деменції з тільцями Леві (ОЇ В), та множинної системної атрофії (М5А). В переважному варіанті здійснення, а-синуклеїнопатія є хворобою Паркінсона (РО).
Винахід також передбачає спосіб лікування або попередження захворювання у пацієнта, де спосіб включає введення пацієнту антитіла, або його антиген-зв'язуючого фрагмента за винаходом. В одному варіанті здійснення, а-синуклеїнопатія є вибраною з хвороби Паркінсона (РО), деменції з тільцями Леві (ОІВ), та множинної системної атрофії (М5А). В переважному варіанті здійснення, а-синуклеїнопатія є хворобою Паркінсона (РО).
При застосуванні, антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент за винаходом є здатним лікувати або попереджати прогресування захворювання шляхом інгібування розповсюдження та поширення альфа-синуклеїну іп мімо. Антитілу або його антиген-зв'язуючому фрагменту за винаходом, таким чином, надається чітка перевага над іншими терапевтичними засобами.
Винахід також передбачає спосіб уповільнення або попередження прогресування захворювання у суб'єкта, який цього потребує, який включає введення антитіла або його антиген-зв'язуючого фрагмент за винаходом пацієнту.
В одному варіанті здійснення, зазначений спосіб лікування захворювання включає введення терапевтично ефективної кількості антитіла або його антиген-зв'язуючого фрагмента за винаходом. В іншому варіанті здійснення, зазначений спосіб попередження захворювання або уповільнення або попередження прогресування захворювання включає введення профілактично ефективної кількості антитіла або його антиген-зв'язуючого фрагмента за винаходом.
Діапазони дозування для введення антитіла або його антиген-зв'язуючого фрагмента за представленим винаходом є такими, щоб отримати бажаний терапевтичний ефект. Слід розуміти, що необхідний діапазон дозування залежить від точної природи антитіла або його антиген-зв'язуючого фрагмента або композиції, способу введення, природи препарату, віку пацієнта, природи, ступеня або тяжкості стану пацієнта, протипоказання, якщо такі є, та судження лікаря. Варіації в цих рівнях дозування можуть регулюватися, використовуючи стандартні емпіричні процедури для оптимізації.
Прийнятні дозування знаходяться в діапазоні від 1 до 50 мг на кг маси тіла. Вони можуть знаходитися в діапазоні від 5 до 30 мг/кг, від 10 до 25 мг/кг, або від 15 до 20 мг/кг. Одиничну дозування може вводитись щодня або менш часто, наприклад, щотижня або щомісяця.
Введення може здійснюватися шляхом повторних введень антитіла або його антиген- зв'язуючого фрагмента за винаходом, протягом тривалого періоду часу. Введення може бути одночасним або послідовним, та може здійснюватися в будь-якому порядку.
Попередження або лікування, визначені в даному документі, може застосовуватися як єдина терапія або може включати, на додаток до антитіла або антиген-зв'язуючого фрагмента за винаходом, введення інших агентів або встановлених терапій, які зазвичай використовують в лікуванні а-синуклеїнопатій (такі як 1І-3,4-дигідроксифенілаланін (І-ВОРА), агоністи допаміна (рецептор), інгібітори катехол -О- метилтрансферази (СОМТ), та/або інгібітори моноаміноксидази типу В (МАО-В)). Введення інших агентів або встановлених терапій може здійснюватися в комбінації з, або як доповнення до, або в кон'югації з, антитілом або антиген- зв'язуючим фрагментом за винаходом та може бути шляхом одночасного, послідовного або роздільного дозування індивідуальних компонентів лікування.
Комбіноване лікування може бути здійснено будь-яким способом, який вважається необхідним або зручним для кваліфікованого фахівця в даній галузі та для цілей даного опису, не розглядається ніяких обмежень щодо порядку, кількості, повторення або відносної кількості сполук, які будуть використовуватися в комбінації.
Терапевтично ефективна кількість стосується кількості або антитіла або його антиген- зв'язуючого фрагмента, який при введенні окремо або в комбінації пацієнту для лікування захворювання, або щонайменше одного з клінічних симптомів захворювань, яка є достатньою для впливу на таке лікування захворювання, або симптом. Терапевтично ефективна кількість може варіювати в залежності, наприклад, від антитіла та/або симптомів захворювання, віку, ваги та/або стану здоров'я пацієнта, що підлягає лікуванню, та судження лікаря, що призначає.
Відповідна терапевтично ефективна кількість в будь-якому конкретному випадку можуть бути встановлені кваліфікованими фахівцями в даній галузі або можуть бути визначені за допомогою рутинних експериментів. Терапевтично ефективна кількість також являє собою таку, при якій будь-які токсичні або шкідливі ефекти антитіл, або антитіла, або його антиген-зв'язуючого
Зо фрагмента перевершуються сприятливими ефектами. "Профілактично ефективна кількість" означає будь-яку кількість антитіл, або антитіла, або його антиген-зв'язуючого фрагмента, яка при введенні окремо або в комбінації пацієнту, інгібує або затримує початок або повторне виникнення захворювань, або щонайменше одного з клінічних симптомів захворювань. В деяких варіантах здійснення, профілактично ефективна кількість попереджає виникнення або повторне виникнення захворювання в цілому. "Інгібування" виникнення означає або зменшення ймовірності виникнення захворювання, або попередження виникнення захворювання в цілому.
Представлений винахід також передбачає фармацевтичні композиції, які містять антитіло, або його антиген-зв'язуючий фрагмент за винаходом. Відповідно, представлений винахід передбачає фармацевтичну композицію, яка містить антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент за винаходом, разом з фармацевтично прийнятним ексципієнтом. Відповідні фармацевтично прийнятні ексципієнти можуть полегшувати переробку активних сполук у препарати, прийнятні для фармацевтичного введення.
Фармацевтичні композиціїза винаходом можуть бути сформульовані для, але не обмеженні цим, парентеральної доставки, наприклад, внутрішньом'язової, підшкірної або внутрішньовенної. Композиції, прийнятні для внутрішньом'язової, підшкірної або внутрішньовенної ін'єкції включають стерильні водні розчини.
Фармацевтична композиція може мати форму водного розчину та може включати фізіологічно сумісні буфери, такі як розчин Хенка, розчин Рінгера, або фізіологічний буферний сольовий розчин. Фармацевтична композиція може додатково або альтернативно містити речовини, які підвищують в'язкість суспензії, такі як натрію карбоксиметилцелюлоза, сорбіт, або декстран. Фармацевтична композиція може бути отримана у вигляді олійних ін'єкційних суспензій. Прийнятні ліпофільні розчинники або носії включають жирні олії, такі як кунжутна олія, або синтетичні естери жирних кислот, такі як етилолеат, або тригліцериди, або ліпосоми.
Необов'язково, фармацевтична композиція може містити прийнятні стабілізатори або агенти, які підвищують розчинність сполук для забезпечення приготування висококонцентрованих розчинів.
Представлений винахід передбачає виділену молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує антитіло, або його антиген-зв'язуючий фрагмент за винаходом. Представлений винахід також бо передбачає вектор, який містить виділену молекулу нуклеїнової кислоти за винаходом.
Представлений винахід, крім того, передбачає клітину-господар, яка містить вектор за винаходом.
Антитіла або антиген-зв'язуючі фрагменти за винаходом не обмежуються конкретним способом отримання або виробництва. Таким чином, винахід передбачає антитіла, які були виготовлені з гібридоми, яка секретує антитіло, а також антитіла, отримані з рекомбінантно продукованої клітини, яка була трансформованою або трансфікованою нуклеїновою кислотою або нуклеїновими кислотами, що кодують антитіло. Такі гібридоми, рекомбінантно продуковані клітини та нуклеїнові кислоти є частиною винаходу.
ПРИКЛАДИ
Приклад 1: Отримання антитіл
Анти-а-зуп специфічний антитіла виділяли з бібліотек фагового дисплею, використовуючи серії циклів відбору на рекомбінантному людському са-зуп ("Пи а-5уп"), як пасивно іммобілізованих в лунки мікротитрування та вільних в розчині. Наївні людські одноланцюгові Ем (5СЕм) бібліотеки фагового дисплею, клоновані в фагемидний вектор на основі ниткоподібного фага М13 використовували для відбору (Поуа еї аї., Ргоївіп Епа Оез 5еї. (2009), 22(3):159-68; та
Мацднап еї аї., Маї ВіоїесНпої. (1996), 14(3); 309-114; обидві з яких є включеними в даний документ у вигляді посилання).
Репрезентативне число індивідуальних клонів з виходів селекції після двох або трьох раундів відбору, описаних вище, спочатку скриніровали у вигляді розчинних 5сЕм фрагментів в периплазматичних екстрактах Е.соїї (Кіргіуапом еї аї, У Іттипо!ї Меїпоа5 (1997) 200: 69-77; включений в даний документ у вигляді посилання) в гомогенному ЕКЕТ (флуоресцентному резонансному перенесенні енергії) НТКЕФ (Нотодепеоих5 Тіте-Незоїмед Ріпогезсепсе, Сівбріо
Іптепаййопаї) аналізі щодо зв'язування з розчинним людським а-синуклеїном.
Ап НТРЕЕФ аналіз (Фігура 1) являє собою гомогенну технологію аналізу, яка використовує флуоресцентний резонансний перенос енергії між донорним та акцептгорним флуорофором, які знаходяться в безпосередній близькості (Маїпі5 С Сіїп Спет (1995) 41: 1391-1397.; включений в даний документ у вигляді посилання). Даний аналіз використовували для вимірювання макромолекулярних взаємодій шляхом безпосереднього або опосередкованого приєднання однієї з молекул, що викликають зацікавленість, до донорного флуорофору, наприклад, європію
Зо (ЕйиЗж-) криптату, та сполучення з іншою молекулою, що викликають зацікавленість, з акцепторним флуорофором ХІІ 665, (стабільний перехресно сшитий аллофікоціанін). Збудження молекули криптату (на 337 нм) в результаті призводило до флуоресцентного випромінювання при 620 нм. Енергія від цього випромінювання передавалась Хі 665 в безпосередній близькості криптату, що результаті призводило до випромінювання специфічної довгоживучої флуоресценції (при 665 нм) від ХІ 665. Вимірювалися специфічні сигнали як донора (при 620 нм), так і акцептора (при 665 нм), що дозволяло розрахувати співвідношення 665/620 нм, що компенсує присутність кольорових сполук в аналізі.
Неочищені зразки анти-а-5уп 5сЕм досліджували щодо зв'язування з біотинільованим а-5уп. 5 мікролітрів розчину, що містять 40 нМ біотинільованого людського а-5уп, поєднаного з 0,8 нм стрептавідину тербію (Сіб5ріо Іпіегпайопа!, 61О05АТІВ) додавали в 384 лунковий планшет з низьким об'ємом для аналізу (Совіаг, 3676). Далі, 10 мікролітрів кожного розведення досліджуваного зразка антитіл додавали в планшет. Нарешті в планшет для аналізу додавали 5 мікролітрів розчина, що містять ОС анти-тус (Сіббріо Іпіегпайопа!ї, 661МУСбАВ). Всі розведення проводили в аналітичному буфері, що містить 0,8 М калію флуориду (ВОН 103444Т) та 0,1 95 бичачого сироваткового альбуміну (ВЗА, Зідта АУ576) в Оцрессо5 РВ5 (Іпийгодеп, 14190185).
Аналітичні планшети інкубували протягом З годин при кімнатній температурі потім 16 годин при 4 "С до часу зчитування флуоресценції при довжинах хвиль випромінювання 620 нм та 665 нм, використовуючи планшетний рідер Епмізіоп (Регкіп ЕІтег).
Дані аналізували, обчислюючи співвідношення 665/620 нм, з наступним значенням Оейа Е для кожного зразка. Співвідношення 665/620 нм використовували для корегування інтерференції зразків за допомогою рівняння, наведеного нижче: нм опіввідномннявеві 620 - | завнмежнал) 10000 б2гОнмсигнал до ОекКа Е для кожного зразка потім обчислювали, використовуючи нижченаведене рівняння:
Орепак(о) - | -піввідноюнняра а ва втни оліввіднетвнияня зпиволиантрол ВВ Вазнм, 10000 співвіднопшеннянегативнижонтрольбб5/ б2ОнмМ
Негативний контроль (неспецифічне зв'язування) визначали шляхом заміни досліджуваного зразка на немічений людський або щурячий а-5уп.
Значення 95 Юепка РЕ були використані для обчислення 95 специфічного зв'язування, як описано нижче:
Уоспецифічневязування - балаль я енясяннь МеВОатю со (Загальнезвязування ОеНаго» - М5ВОенанов)
Значення ІСзо визначали, використовуючи програмне забезпечення сСгарпРай Ргізт шляхом підгонки кривої за допомогою чотирипараметричного логістичного рівняння:
У Нижній «з (верхній-нижній)/1-4-107((І сдЕС50-ХУУНІП5Іоре))
Х представляє собою логарифм концентрації.
У представляє собою специфічне зв'язування
У починається внизу і йде до вершини з сигмоподібною формою.
Клони одноланцюгових Гм, які зв'язуються з людським а-зуп як неочищені периплазматичні екстракти, піддавали ДНК секвенування (О5броит еї аї!, ІттипоїесппоІоду (1996), 2: 181-196; та
Мацднап еї аї., Маї Віоїесппої. (1996), 14(3); 309-14; обидві з яких є включеними в даний документ у вигляді посилання). Унікальні 5єсЕм знову експресували в бактеріях та очищали використовуючи афінну хроматографію (як описується в УМО 01/66754; включений у вигляді посилання). Ефективності цих зразків визначали титруванням очищеного препарату щодо зв'язування з біотинільованим людський а-5уп в НТЕЕ аналізі, як описано вище. Очищені 5сСЕм препарати, які демонстрували найсильніші 4-5уп взаємодію вибирали для перетворення у формат Ідо.
За допомогою титрування антитіла в аналізі НТКЕ клони ранжувалися щодо міцності зв'язування з а-5уп. Найкращі о-зуп зв'язуючі речовини аналізувалися далі щодо кінетики зв'язування з а-5уп (Конк) як ЇдО5 на біосенсорі Осієї Кей (дивіться спосіб як описується в
Прикладі 9), а також щодо селективності членів синуклеїнової родини (людський а-5уп, В-5уп, у- зуп) (дивіться спосіб, як описується в Прикладі 4) та щодо перехресної реактивності з мишачим а-5уп (дивіться спосіб, як описується в Прикладі 5).
Приклад 2: Отримання азіо0452 паіІ-3
С-термінально реактивний а-зуп специфічний клон, азуп0087, був ідентифікований шляхом скринінгу щодо зв'язування з людським а-5уп в ОЕЇ РІА аналізі (дивіться спосіб, як описується в
Прикладі 4). Азуп0087 зв'язується специфічно з а-5уп людини, мавпи - яванського макаки та гризуна (дивіться спосіб, як описується в Прикладі 5). Азуп0О087 повертали до найближчої можливої людської послідовності зародкової лінії (Тотіпзоп МВАБЕ. МКС Сепіге ої Ргоїевїп
Епдіпеегіпду, Сатбгідде, ОК. 1997; включений в даний документ у вигляді посилання) який не впливав на ефективність стандартними методами мутагенезу до оптимізації. Після гуманізування клон повторно оцінювали на зв'язування з а-5уп. Ніяких негативних ефектів не спостерігалося.
Великі бібліотеки 5сЕм-фагів, отримані з лідуючого клону були створені шляхом олігонуклеотид-спрямованого мутагенезу ділянки визначення комплементарності (СОК) 2 та З варіабельної важкого ланцюга (МН) та СОМ 1 та З легкого ланцюга (М), з використанням стандартних методів молекулярної біології, як описується в Сіагкзоп та І оулпап (2004)) (Рпаде аі5ріау: А ргасіїса! арргоасп. Охіога: Охіога Опімегейу Рге55; включений в даний документ у вигляді посилання). Бібліотеки піддавали селекції фагового дисплею на основі афінності, виконаної на розчинному біотинільованим людським са-5уп для вибору варіантів з більш високою афінністю щодо людського а-зуп. Селекції виконували, по суті, як описано раніше вище, за винятком зниження концентрації розчинного біотинільованого людського а-5уп для кожного циклу відбору.
Репрезентативні клони з кожного вибору селекції спочатку скринінгували як розчинні 5сЕм- фрагменти в периплазматичних екстрактах Е.соїї в НТКЕ-аналізі щодо їх здатності конкурувати за зв'язування з розчинним а-5уп проти батьківського а-5уп зв'язуючого клону азупоО087.
Продуктивність кожної бібліотеки в даних популяційних скринінгах використовували для інформування, які бібліотеки мутагенезу СОК додавали разом генетично, або "рекомбіновані"
БО для створення нових бібліотек, та дані рекомбіновані бібліотеки піддавалися подальшим раундам афінно-зв'язаних селекцій, виконаних на розчинному біотинільованому людському а- зуп.
Для як індивідуальної, так і рекомбінантної мутагенезної бібліотеки отриманих клонів, після аналізу послідовності позитивних зв'язуючих речовин, клони експресували та очищали як фрагменти 5сгм, так і до та зв'язування з розчинним а-зуп, знову підтверджували епітопними конкурентними аналізами НТКЕ. За допомогою титрування антитіла в НТКЕ епітопному конкурентному аналізі клони ранжували за їх значеннями ІСсзо для відносного покращення зв'язування з а-5уп в порівнянні з батьківським до азуп0087. Найкращі а-5уп зв'язуючі речовини аналізували далі щодо селективності члена синуклеїнової родини (людський а-5уп, В-зуп, у-5уп)
та щодо перехресної реактивності з а-5уп яванського макаки та щура за допомогою як аналіза прямого зв'язування НТЕЕ або аналіза конкуренції епітопів НТЕРЕ.
З цих ітераційних раундів рекомбінації бібліотеки та скринінгу виявили два потужні а-5уп специфічні, перехресно реактивні клони яванського макаки та щура, а5І00452 паІ-1 та а5Іо0467.
Одноточковий мутагенез виконували на аб5іо0452 пді-ї для кожного з СОК, де спостерігалося позитивне покращення в ІСво ефективності. Кожне положення у вибраному СОК мутували індивідуально через всі 20 можливих амінокислотних залишків, та знову скринінгували за допомогою епітопного конкурентного НТКЕ-аналізу для покращення ІСв5о в порівнянні з азіоб0452 пді-1 Ід. Множинні залишки через чотири СОК (Н2, НЗ, 11 та І 3) були ідентифіковані та об'єднані як на а5іо0452 пді-ї, так ії а5іо0467, та знову оцінені, використовуючи аналіз конкуренції епітопів НТКЕ для покращеного ІСво в порівнянні з азіо0452 пді-ї. З цих експериментів дві найбільш покращені зв'язуючі речовини були ідентифіковані як азІо0452 па1І-3 та азіо0543.
Фігура 2 порівнює амінокислотні послідовності ділянок МН та МІ. азуп0О087, азіо0452 падІ-3 та азіо0543.
Приклад 2,1: Переформатування 5сЕм в (ДС! ТМ
Одноланцюгові Ем клони з бажаними а-з5уп зв'язуючими властивостями були перетворені в ефекторну функцію нульового цільного імуноглобуліну 51 ТМ (9451 ТМ) (Одапезуап еї аї. Асіа
Стувзіайодг О Віо! СтузіаПоаг. (2008), б4(РІ 6):700-4; включений в даний документ у вигляді посилання) формат антитіла по суті, як описано Регзвіс евї аї. (Регзіс єї аі, Сепе (1997) 187: 9-18; включений в даний документ у вигляді посилання) з наступними модифікаціями. Фрагмент ОгігР був включений в вектори експресії для полегшення використання з СНО-транзиторними клітинами та для забезпечення епісомальної реплікації. Варіабельний важкий (УН) домен клонували в вектор (рРЕО1.4), що містить людські константні домени важкого ланцюга та регуляторні елементи, щоб експресувати весь важкий ланцюг ІдсСі ТМ в клітинах ссавців.
Аналогічним чином, варіабельний легкий (МІ) домен клонували в вектор (рЕШ4.4) для експресії людських константних доменів легкого ланцюга (лямбда) та регуляторні елементи, щоб експресувати весь легкий ланцюг Ідс в клітинах ссавців. Для того, щоб отримати Ідс5, важкий та легкий ланцюги їдС для експрсії векторів були трансфіковані в СНО-транзиторні клітини ссавців (ЮОагатоїа єї аїЇ, Віоїесппо! Ргод (2014) 30: 132-141; включений в даний документ у вигляді посилання). (дО були експресовані та секретовані в середовище. Урожаї фільтрували перед очищенням, потім дос чистили, використовуючи Протеїнову хроматографію.
Супернатанти культури завантажували в колонку відповідного розміру керамічного протеїну А (Віозерга) та промивали 50 мМ Ттгі5-НСІ рн 8,0, 250 мМ Масі. Зв'язаний (Дб елюювали з колонки, використовуючи 0,1 М натрію цитрат (рН 3,0) та нейтралізували додаванням Ттгі5-НОЇ (рН 9,0). Елюйований матеріал був заміненим буфером на РВ5, використовуючи Мар10 колонки (АтегзПпат, 517-0854-02), та концентрацію дб визначали спектрофотометрично, використовуючи коефіцієнт екстинкції на основі амінокислотної послідовності ІДС (Маси еї аї,
Апаї! Віоспет (1992) 200: 74-80; включений в даний документ у вигляді посилання). Очищений дО аналізували щодо чистоти агрегації та деградації, використовуючи 5ЕС-НРІС та 505-
РАСЕ.
Обгрунтуванням використання Ідс1 ТМ як кандидатного лікарського формату є мінімізувати нестандартне знищення за рахунок активації імунних клітин та комплементу (тобто, надмірного продукування СЗа, який може викликати запалення). Нестандартне знищення клітин може бути викликане потенційним накопиченням імунних комплексів, утворених кандидатним лікарським засобом та позаклітинним а-синуклетом, який продемонстрував взаємодію з ліпідними мембранами (Вагеї5 еї а!., Віорпуз. 9. (2010), 99: 2116-2124; включений в даний документ у вигляді посилання). (31 ТМ формат був вибраний так, як було продемонстровано, що він має незначне зв'язування з Реу рецепторами (ЕсукК) та зниженою С1д-опосередкованою активацією
БО комплементу імунними комплексами (Одапезуап еї аї!. Асіа СтузіаПодг О Віо! СтузіаїІоаг. (2008), ба(РІ 6):700-4; включений в даний документ у вигляді посилання).
Для того, щоб мінімізувати будь-який потенційний ризик імуногенності, структури аз5Іо0452 пді-3 є настільки близькими до амінокислотної послідовності людської зародкової лінії, як є можливим без впливу на ефективність. Це означає, що деякі амінокислоти в азіо0452 па|1-3, включаючи Верн'єрні залишки (Рооїе та Уміпіег, У Мої Віої. (1992), 224(2): 4687-99; включений в даний документ у вигляді посилання), не є мутованими до найближчої послідовності людської зародкової лінії. Для Мн домену азіо0452 пді-3 існує один Верн'єрний залишок в М ділянці, який не є мутованим до послідовності людської зародкової лінії ІЕЄМНЗ-23 та ІБУНб (Фігура 3С). Для
Мі домену азіо0452 падІ-3 всі каркасні залишки відповідають послідовності людської зародкової 60 лінії ІІ М5-45 та ІБ) 2 або ІСІ З (Фігура 30).
Приклад 3: Підтвердження афінності оптимізованого анти-о-5уп до епітопа
Рекомбінантні людські альфа-, бета- та гамма-синуклеїни, рекомбінантні усічені версії людського альфа-синуклеїну (аа1-60, аа1-95, ааб1-140, 96-140, АМАС і МСАР) та мишачий альфа-синуклеїн отримували від з гРеріде ГГ С. Картування сирого епітопу проводили, використовуючи комерційно доступні усічуння а-5уп.
Коротко, один мікрограм на мілілітр кожного усічення наносили на мікротитраційну лунку протягом ночі при 4 "С. Після промивання лунок в РВ5 додавали розведення 1 мкг/мл кожного анти-а-зуп антитіла. Після 1 год. інкубування та промивання зв'язане антитіло детектували шляхом додавання анти-людського Ідс, кон'югованого з або НЕР, або Еиз:. Після інкубування та промивання додавали відповідний субстрат детектування (розчин ТМВ або ОЕЇ РІА Еппапсег, відповідно), та планшет зчитували на пристрої для зчитування планшетів мікротитрування.
Дані дослідження зв'язування епітопу виявили, що основний ізолят, азуп0О087, розпізнає епітоп, розташований в С-термінальній ділянці с-5уп протеїна між амінокислотами 102 та 130 (Фігура 4А). Як аз5іо0452 падіІ-3, так ії азІо0543 зберігають своє розпізнавання одного і того ж епітопу, розташованого в С-термінальній ділянці с-5уп протеїна між амінокислотами 102 та 130, як і їх батьківський основний ізолят азуп0087 (Фігура 48В).
Приклад 4: Специфічність азіо0452 пдІ-3 та азіо0543 їТог а-зуп по відношенню до членів синуклеїнової родинм. використовуючи епітопний конкурентний аналіз НТКЕ
Важливо, щоб антитіло, призначене для використання в терапевтичних застосуваннях, було специфічним для людського а-зуп, щоб звести до мінімуму будь-які потенційні ризики безпеки, пов'язані з неналежною взаємодією з іншими синуклеїнами (В-синуклеїном та у-синуклеїном).
Специфічність а5іо0452 пдІ-3 та азІо00543 щодо а-5уп над іншими членами сінуклеїнової родини, В-зуп та у-зуп, визначали, використовуючи аналіз конкуренції епітопів НТКЕ, який вимірював зв'язування біотинільованого людського а-5уп з антитілом в розчині. а-зуп, ВД-зуп та у-зуп титрувалися в аналізі, та селективність азіо0452 падІ-3 до та азіо0543
ІДС оцінювали шляхом вимірювання ступеня інгібування зв'язування біотинільованого людського а-зуп з азіо0452 пдІ-3/а5І00543. Значення ІСво визначали за допомогою кривої, що відповідає даним чотирьох-параметричного логістичного рівнянню з використанням програмного забезпечення РКІЗМ 6 (Сгарпрад). Більш чутливі аналізи НТР, які вимірюють
Зо пряме зв'язування дос з людськими са-5уп, ДВ-зуп та у-зуп, також використовували для підтвердження специфічності са-5уп (дані не показані) Для негативного контролю зразок досліджуваного антитіла замінювали ізотипним контрольним антитілом або буфером тільки.
Репрезентативні значення ІСво, отримані з о-5уп, В-5уп та у-зуп протеїнів в епітопних конкурентних аналізах НТЕЕ азІ0о0452 пді-3 та азІо0543 показані на Фігурі 5. Ніякого зв'язування з В-5уп та у-зуп не спостерігалось при досліджуваних концентраціях (аж до 5 мкМ), демонструючи, що азіо0452 пді-3 та азіо0543 є селективними до а-5уп.
Приклад 5: Специфічність азіо0452 пдІ-3 до людського, мавп'ячого - яванського макаки та щурячого а-зуп використовуючи епітопний конкурентний аналіз НТКЕ
Враховуючи терапевтичне застосування, важливим є те, що антитіло є перехресно реактивним з са-синуклеїном яванського макаки та бажаним є те, що він є перехресно реактивним до а-синуклеїну щура, в межах 10-кратного від того, що спостерігається проти людського а-5уп. Це дає можливість проводити дослідження безпеки як у видах мавп - яванського макаки, так і у видів щура.
Специфічність а5Іо0452 пді-3 та атІо0543 для людського, мавп'ячого - яванського макаки та щурячого а-зуп визначали, використовуючи епітопний конкурентний аналіз НТКЕ, в якому вимірювали зв'язування біотинільованого людського а-5уп з а5Іо0452 паІ-3 в розчині.
Людський, мавп'ячим - яванського макаки та щурячий со-5уп титрували в аналізі, та селективність антитіла оцінювали шляхом вимірювання ступеня інгібування зв'язування біотинільованого людського а-5уп з антитілом. Значення ІСхо визначали за допомогою кривої, що відповідає даним чотирьох-параметричного логістичного рівнянню з використанням програмного забезпечення РКІЗМ 69 (Сгарпрад). Види перехресної реактивності азіо0452 паі-3 та а5тіо0543 також підтверджували, використовуючи формат аналізу прямого зв'язування НТКЕ (не показано). АвІо0452 пдІ-3 (ог азІо0543) титрували в аналізі, щоб конкурувати за зв'язування людського або мавп'ячого - яванського макаки або щурячого а-зуп з авзіо0452 подіІ-3 (або азіо0543) за аналізом НТКЕ. Для негативних контролів, зразок досліджуваного антитіла замінювали ізотипним контрольним антитілом або тільки буфером.
Репрезентативні значення ІСво, отримані з людськими, мавп'ячими - яванського макаки та щурячими а-зуп протеїнами в епітопному конкурентному аналізі НТЕЕ, показані на Фігурі 6.
Авіо0452 пді-3 зв'язується з людський та яванського макаки а-5уп зі значенням ІСво 5,7 нМ та 60 6,8 НМ відповідно, та зв'язується зі щурячим са-5уп зі значенням ІСзо 19, НМ, в межах
Зо
4-кратного. А5Іо00543 зв'язується з людським та яванського макаки со-5уп зі значенням
ІСво 2,0 нМ та 2,1 нМ відповідно, та зв'язується зі щурячим а-зуп зі значенням ІСв5о 3,8 НМ, в межах 2-кратного.
Здатність азіо0452 пді-3 зв'язуватися з людським, мавп'ячим - яванського макаки та щурячим а-зуп свідчить про зв'язування з іншим епітопом на людському альфа-синуклеїні в порівнянні з антитілами, які не зв'язуються з людським, та мавп'ячим - яванського макаки та щурячим а-зуп.
Приклад 6: Специфічність клонів, оптимізованих за афінністю щодо нативного а-5уп, виміряна методом проточної цитометрії
Специфічність афінності оптимізованих анти-а-зуп ІдСс5, азіо0452 пді-3 та азіо0543, щодо зв'язування з нативним, ендогенним людським (а-5уп визначали за методом проточної цитометрії, використовуючи а-5уп позитивних та негативних клітинних ліній.
Коротко, нейробластомні клітини ЗНЗУ5У (ай-зуп позитивний) та клітини раку молочної залози ВТ-20 (а-зуп негативний) фіксували в 0,01 96 формальдегіду та Шеп перемеабілізували з 0,5 95 (об./06.) Тжееп 20 перед інкубуванням з анти-с-5уп антитілом, позитивним контролем або ізотипним контролем антитіла. Після обширного промивання, зв'язане антитіло детектували шляхом інкубування з анти-людським або анти-мишачим ІдС-РІТС вторинним антитілом. Після подальших промивань клітини аналізували за допомогою апарату ГАС5 Сапіо ІІ (Весіюп
ОісКіпбзоп, ЕгапКіпт Їаке5, Му) та аналіз даних проводили, використовуючи програмне забезпечення Ріомлуо (Тгее аг, АзпПІапа, ОК).
Дані наносять на графік у вигляді гістограм, що показують різницю між клітинами, пофарбованими окремо, проти первинних забарвлених клітин антитіла. Результати на Фігурі 7А показують зсув флуоресцентного сигналу в присутності азуп0087 (панель 0) в а-5уп позитивних
ЗН-ЗУ5У клітинах, в порівнянні з ізотипним контролем та вторинним антитілом самостійно (панель В), що вказує на розпізнавання ендогенно експресованого а-5зуп. Азуп0О087 не зв'язується з а-5уп негативною людською клітинною лінією раку молочної залози, ВТ-20 (панель С). Результати на Фігурі 7В показують сильний зсув флуоресцентного сигналу в присутності або азіо0452 пдіІ-3, або ахіо0543 (панель Н) в порівнянні з позитивним контрольним антитілом, 406 на а-зуп позитивних 5Н-5У5У клітин (панель РЕ) та відсутністю зсув на а-5уп
Зо негативних ВТ-20 клітинах (панель б). Це демонструє, що як азіо0452 па/І-3, так і азіо0543 зв'язуються з нативним, ендогенно зкспрессированним внутрішньоклітинним людським а-5уп.
Приклад 7: Специфічність оптимізованих анти-а-зуп ІЇДо щодо агрегованого людського а-5уп за методом ОЕЇ-РІА ЕСГІЗА
Препарати або агрегати фібрилярних людських а-5уп генерували, як описано Етаді еї аї. (Етайі еї аї, Віоспетівігу (2004), 43: 2871-2878; включений в даний документ у вигляді посилання). Коротко, 200 мкл 50 мкМ рекомбінантного а-5уп аліквотували в 1,8 мл пробірки
Загеїейї та поміщали в інкубатор зі струшуванням при 37 "С протягом З днів при 280 об./хв.
Присутність агрегованого с-5уп визначали включенням тіофлавіну Т, який додавали до кінцевої концентрації 10 мкМ, інкубували в темряві протягом 1 год. при кімнатній температурі та флуоресценцію зчитували при довжині хвилі збудження 450 нм та довжині хвилі випромінювання 485 нм на мікропланшетному рідері Епмівіоп.
Специфічність афінності оптимізованих анти-а-зуп ІдС5, азіо0452 пді-3 та азіо0543, та основного антитіла азупО087, щодо агрегованого людського а-зуп визначали, використовуючи аналіз захоплення антитіла ОЕБЕЇ БІАФ. Даний аналіз вимірював захоплення агрегованого людського а-5уп азіо0452 пдіІ-3, абіо0543 або азхупО087 в попарному ЕГІЗА. Коротко, мишачу
Ід91 версію анти-а-зуп антитіла іммобілізували на лунці 9б-лункового планшета для мікротитрування (Мипс). Після блокування, агрегований або мономерний людський а-5уп інкубували в лунках. Після промивання, захоплений людський а-5уп детектували шляхом додавання людського Ідс1 ТМ версії такого самого анти-а-зуп антитіла та потім кон'югата анти- людський Ідо-Європій (РегКіп ЕІтег) або кон'югата анти-людський ІДО-НЕР. Після інкубування та промивання, додавали відповідний субстрат детектування (ТМВ або ОЕЇ РІА Еппапсег розчин відповідно), та планшет зчитували на рідері планшетів мікротитрування.
В даному аналізі тільки агрегований людський а-5уп буде захоплений та детектований, оскільки він представляє декілька копій одного й того самого епітопа на одиничному агрегаті.
Для мономерного а-зуп тільки одна копія епітопу є присутньою, таким чином, детектоване друге антитіло не може зв'язуватися в присутності захопленого антитіла. Дані підсумовані на Фігурі 8.
Основний ізолят, азхуп0087, є здатним зв'язуватися з агрегованим рекомбінантними людським а- зуп. Таким чином, епітоп, з яким зв'язується азуп0087, сам не бере участь в агрегації а-5уп. Як авзіо0452 пді-3, так і абіо0543 зберігали свою здатність зв'язуватися з агрегованим 60 рекомбінантними людським а-5уп.
Приклад 8: Специфічність оптимізованих анти-а-зуп дб у відповідних тканинах захворювання шляхом імуногістохімії
Специфічність афінності оптимізованих анти-а-зуп Ідсв, абзіо0452 паІ-3 та азіо0543, та основного антитіла азуп0087, щодо відповідних форм захворювання людського а-5уп визначали шляхом імуногістохімічного фарбування тканин головного мозку при хворобі Паркінсона.
Результати показані на Фігурі 9 та демонструють, що, подібно азуп0087, як азІо0452 па|1-3, так і азіо0543 можуть розпізнавати відповідні патологічні форми захворювання людського а-5уп в зрізах тканин головного мозку при хворобі Паркінсона, включаючи тільця Леві, нейрити Леві, нейрональні агрегати, точки Леві та фонові тканини головного мозку. Ніякого неспецифічного фарбування не спостерігалось в нормальній або здоровій тканині головного мозку.
Приклад 9: Визначення афінності анти-а-5уп антитіла
Константи рівноважної дисоціації (Ко) для анти-й-зуп (ДО для людського а-5уп визначали, використовуючи дві платформні технології: Осіе( Кей (Бопе Віо) та КіпЕХхХА (Заріаупе
Іпвігитепів).
Обидві системи аналізу показали гарну узгодженість, що вказує на те, що афінність азІо0452 пді-3 знаходилась в суб-наномолярному діапазоні. Таблиця 1 показує вимірювання афінності, отримані для ключових клонів анти-й-5уп, які генеруються протягом процесу основного виділення та основної оптимізації.
Приклад 9.1: Афінність азіо0452 па1І-3 за Осіевї
Афінність а5іо0452 п9І-3 ІдсС для рекомбінантного бактериально експресованого мономерного людського амі-ї-д49 а-5уп-Ніад-Ні5 оцінювали, використовуючи інструмент Осієї Кеа.
Авіо0452 паІ-3 попередньо змішували з різними концентраціями кожного ліганду до досягнення рівноваги... Кількість вільного антитіла потім вимірювали за допомогою Осіеї шляхом захоплення вільного азіо0452 падІ-3, використовуючи біотинільованим а-5уп, іммобілізований на покриті стрептавідином сенсори. Кількість вільного антитіла, детектованого при кожній концентрації а-5уп, наносили на графік по відношенню до концентрації ліганда, та програмне забезпечення КіпЕХА використовували для розрахунку рівноважної константи дисоціації (Кб).
Результати, наведені в Таблиці 1, демонструють, що авзтіо0452 пдІ-3 дО зв'язується з людським а-5уп з афінністю 106 пМ.
Зо Приклад 9.2: Афінність азіо0452 пді-3 за КіпЕХА
Крім того, афінність фази розчину (Ко) азіо0452 пдІ-3 (ЧО для рекомбінантного бактериально експресованого мономерного людського біотинільованого а-5зуп визначали, використовуючи інструмент КіпЕХхХА (Зарідупе Іпзігитепів). А5іо0452 пдіІ-3 попередньо змішували з різними концентраціями кожного ліганду до досягнення рівноваги. Кількість вільного антитіла потім вимірювали, використовуючи КіпЕХА шляхом захоплення вільного азіо0452 па|і-3, використовуючи са-5уп покриті кульки, змивання незв'язаного матеріалу та детектування зв'язаного антитіла, використовуючи флуоресцентно мічені види специфічного антитіла.
Кількість вільного антитіла, детектованого при кожній концентрації «-5уп наносили на графік по відношенню до концентрації ліганда та програмне забезпечення КіпЕХхХА використовували для розрахунку рівноважної константи дисоціації (Ко). Результати, наведені в Таблиці 1, демонструють, що аз5іо0452 паІ-3 ІдО зв'язується з а-5уп з афінністю 74 ПМ, демонструючи гарну узгодженість з вищенаведеним аналізом афінності фази розчину Осіеї.
Приклад 9.3: Афінність фрагмента ЕРар азІо0452 пді-3 за КіпЕХА
Фрагмент Бар азіо0452 п9ді-3 зв'язує а-синуклеїн з високою афінністю. Значення Ко фрагмента Раб аз5іо0452 пді-3 для а-синуклеїну, як виміряно в аналізі КіпЕХА (як описується в наведеному вище прикладі для повного антитіла), становить 174 пМ (95 95 СІ: 15-177 пМ).
Приклад 10: Вплив азіо0452 пдіІ-3 на рівні вільного незв'язаного а-синуклеїну в інтерстиціальній рідині префронтальної кори (ІЗЕ) самців щурів Спрег-Доулі
Дорослих самців щурів Спрег-Доулі (293-417 г; Напап, (Ше МеїШПегіапа5) анестизували та імплантували зонди в префронтальну кору.
За день до експерименту в префронтальну кору імплантували просунуті зонди (1-3 МДа поліетиленові мембрани 4 мм) з використанням стереотаксичної рамки (координати для зондів:
АР - -3,4 мм (до брегми), бічні ї- 0,8 мм (до серединної лінії), вентральна -5,0 мм (до твердої мозкової оболонки), брусок різця встановлювався на рівні -3,3 мм (всі координати відповідно до
Рахіпо5 та УМаїзоп, Те гаї Бгаїп іп 5іегеоїахіс соогаіпаге5, Асадетіс Рге55, Мем/ ХогКк, бІп еййіоп 2008). Зонди були прикріплені до черепа гвинтом з нержавіючої сталі та зубним цементом.
В день експерименту зонди мікродіаліза з подвійним розтяганням були з'єднані з гнучкою трубкою РЕЕК (У/езіегп Апаїуїса! Ргодисів Іпс. ОЮОБА; РКО0О5-020) до мікроперфузійного насосу (Нагуага) та перфузували штучним СЕ (перфузатом), що містить 147 мМ Масі, 3,0 мМ КСІ, 60 1,2 ММ Сасіг2, та 1,2 мМ Мо9сСІ2-0,2 95 ВЗА при швидкості потоку 0,5 мкл / хв. Виходи зондів були з'єднані гнучкою трубкою ЕГЕР. Через мінімум дві години попередньої стабілізації а5І00452 паІ-3 сформульованої в РВ5 або тільки РВЗ (носій) дозували відповідно 30 або 0 мг/кг. Сполуку вводили при внутрішньовенно 2 мл/кг. Зразки мікродіалізу збирали з інтервалом 120 хвилин.
Зразки збирали в міні-флакони (Місгоріоїесп/з5е АВ, Зу'едеп; 4001029). Всі зразки зберігали при - 80 с.
Для визначення концентрації вільного «-синуклеїну у щурячих ІЗЕ зразки мікродіалізу спочатку піддавали імунопреципітації для видалення азіо0452 падІ-3. Імунопреципітація спільно осаджує а-синуклеїн, зв'язаний з терапевтичними антитілами, тоді як незв'язаний "вільний" а- синуклеїн залишається в супернатанті. Розчин кульок протеїну А (ОупабеайбзФ Протеїн А) додавали до 96-лункового не вздовж планшета (поліпропілен 0,2 мл) та промивали двічі ТВ5Т (50 мМ ТВ5 плюс 0,1 95 Тмееп 20), використовуючи магніт (ЮЮупаМмад'""м 96 бік) для відділення кульок від розчину. В кожну лунку додавали розморожені зразки мікродіалізу щурів ІЗЕ (10 або 20 мкл), перемішували з кульками піпеткою вгору - вниз та інкубували при 4 "С з обертанням нахилу протягом 10 хвилин. Потім кульки двічі пелетували використовуючи магніт, щоб забезпечити повне видалення кульок. Зразки імунопреципітованих ІЗЕ були перенесені в 96- лунковий планшет з набору анти-й -синуклеїн ЕГІБА (Зепзоїуїетм Оцапійайме ЕГІЗА набір, людський/мишачий/щурячий, Апабрес.О5, А5Б-55550) з вже доданим буфером розбавлення зразка до загального об'єма 100 мкл. Калібрувальні зразки, по 100 мкл на лунку, додавали в планшет у двох повторах та 50 мкл робочого розчину детектування антитіл додавали в кожну лунку. Планшет інкубували при 4-8 "С протягом ночі при струшуванні та захищали від світла, та потім промивали шість разів 350 мкл промивного буфера. Нарешті, 100 мкл ТМВ забарвлюючого субстрату додавали до кожної лунки та планшет інкубували протягом 10-15 хвилин при кімнатній температурі в темряві. Для припинення реакції в кожну лунку додавали 50 мкл стоп-розчину, та планшет планшет зчитували протягом 2 годин при поглинанні 450 нм.
Кількісне визначення проводили шляхом побудови графіка відповіді стандартної кривої як одиниць поглинання в лінійній шкалі по відношенню до концентрації в логарифмічній шкалі. Для підгонки кривої була використана функція з чотирма параметрами.
Залежне від часу зменшення кількості вільного а-синуклеїну було продемонстровано в І5Е (Фігура 10) після одноразового внутрішньовенного введення 30 мг/кг азіо0452 падІ1-3.
Зо Приклад 11: Вплив азіо0452 па/І-3 на рівні вільного незв'язаного а-синуклеїну в С5Е самців щурів Спрег-Доулі
Дорослих самців щурів Спрег-Доулі анестизували, та катетери поміщали в цистернную мату, щоб пристосувати до відбору зразка С5Е. Внутрішню канюлю довжиною 0,8 см вставляли в цистернну магну, та виводили через розріз на верхній частині черепа. Кінець катетера С5Е фіксували в положенні зубним акриловим цементом та прикріплювали до черепа за допомогою трьох гвинтів з нержавіючої сталі. Тваринам давали мінімум 2 дні відновлення до введення сполуки.
А5іо0452 пді-3 формулювали в буфері для дозування по 3, 10, 30 або 100 мг/кг. Сполуку або носій тільки вводили внутрішньовенно у кількості 2 мл/кг.
Після збору щонайменше чотирьох чистих проб С5Е, взятих протягом мінімум двох днів, вводили сполуку. Всім тваринам дозували або а5іІ0о0452 поді-3 або носій на день "0". Зразки С5Е збирали в кожному зазначеному часовому інтервалі. Всі зразки зберігали при -807 С до відвантаження.
Для визначення вільного а-синуклеїну в С5Е, а-синуклеїн зв'язаний з азіо0452 па|І-3, видаляють шляхом імунопреципітації (ІР) перед аналізом. ІР буде спільно осаджувати а- синуклеїн зв'язаний з терапевтичними антитілами, тоді як незв'язаний "вільний" а-синуклеїн залишається в супернатанті. Визначення вільних рівнів с-синуклеїн в супернатанті здійснюють з використанням комерційного набору ЕГІЗА, отриманого від Апазрес. Аналіз проводили, як описано для ІЗЕ-результатів (як описується в Прикладі 10).
Дозу та залежне від часу зменшення вільного а-синуклеїну було продемонстровано в СЗЕ (Фігура 11) після одноразового внутрішньовенного введення азіо0452 подіІ-3 в діапазоні доз 3- 100 мг/кг.
Приклад 12: Функціональна характеристика азіо0452 падаІ-3 за рахунок зменшення поширення альфа-синуклеїну в лентивірусній моделі іп мімо альсра-синуклеїнопатії
Здатність високоафінного анти-альфа-синуклеїнового антитіла, а5іо0452 пді-3, блокувати поширення альфа-синуклеїну досліджували, використовуючи лентивірусну іп мімо мишачу модель альфа-синуклеїнопатії. Для цієї мети як нетрансгенним немутантного типа мишам (не- 19), так ії альфа-синуклеїновим надекспрсуючим трансгенним мишам (а-5уп 19) ін'єкційно вводили лентивірусний вектор, який експресує альфа-синуклеїн (І М-а-5уп) в правий гіпокамп, та бо потім пасивно імунізували щотижня протягом 13 тижнів анти-альфа синуклеїновими мишачими
(9091 антитілами, включаючи азіо0452 пдІ-3, та ізотипний контрольний мишачий дс1 МІР228
Наприкінці періоду імунізації мишей піддавали евтаназії, та їх мозок фіксували в 4 95 РЕА, потім коронарно розрізали та аналізували з використанням імуноцитохімії з автоматизованим аналізом зображень щодо рівнів альфа-синуклеїнової імунореактивності іпслатеральної та контрлатеральної до місця І М-а-5уп ін'єкції.
Хірургія та пасивна імунізація
Три-чотиримісячного віку нетрансгенні немутантного типу миші (не--49; п-40) та альфа- синуклеїнові трансгенні миші (са-5уп 9; п-40) отримували одну односторонню ін'єкцію в правий гіпокамп (-2,0, 1,5, -1,3 від Вгедта) лентивірусного вектора експрсування альфа-синуклеїну (І М- а-5уп). Через два тижні після операції ін'єкції ГМ-а-зуп, миші отримували щотижневі дози анти- альфа-синуклеїнових мишачих Ідс1 антитіл: а5іо0452 подіІ-3 (не-9у п-10; а-вуп 14 п-10), азіо0452 паІ-3 0265А (не-їд п-10; о-зуп їд п-10), 9Е4 (не-іду п-10; о-5уп 1д п-10), або їм дозували МІР228 ізотипний контрольний мишачий Ідс1 (не-рч п-10; а-5уп 4 п-10).
Всі мишачі ідо дозували по 20 мг/кг внутрішньочеревним (ІР) способом протягом 13 тижнів.
Тварини були розміщені в групах з максимумом або 4 на клітку. Тварин утримували на 12/12 циклі світло/тгемрява з доступом до їжі і води без обмеження. Клітки змінювалися один раз на тиждень та контролювалися щодня. Повідомлялося про будь-які несприятливі події. Всі тварини переносили хірургічні процедури, а також імунізації. Наприкінці періоду лікування антитіл мишей піддавали евтаназії згідно з керівництвом для гуманного лікування тварин, та їх мозок серійно секціонували по коронарних осях та оцінювали для нейропатологічного аналізу альфа- синуклеїнового поширення за допомогою імуноцитохімічних методів.
Альфа-синуклеїнова імуноцитохімія
Мізки видаляли, фіксували в 4 95 параформальдегіді, та зрізи розрізали в інтервалах 40 мкм в коронарних осях з використанням вибратоми та зберігали при -30 "С в кріопротекторному середовищі (30 95 гліцерин, 30 9о етиленгліколь, 40 о РВ5). Після промивання РВ5 та стадій блокування буфера зрізи інкубували протягом ночі при 4 "С з первинним антитілом (анти- альфа-синуклеїн тАр 5МУМ-1 від ВО при розведенні 1: 500), промивали РВЗ5 та інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі з вторинним антитілом (біотинільованим анти- мишачим /ідсСс від Месіог ІГарогайогіез при розведенні 1:100). Після завершення стадій
Зо промивання РВ5, альфа-синуклеїнове фарбування локалізувалося з використанням системи детектування комплексу авідін / біотин-пероксидаза (Еїйе АВС, Месіог І арогайогіє5). Потім зрізи аналізували за допомогою автоматизованого аналізу зображень щодо рівнів альфа-синуклеїну іпслатерального та контрлатерального в місці ін'єкції лентивірусного вектора (І М-а-5уп).
Статистика
Дані, отримані в результаті автоматичного отримання зображень рівнів альфа-синуклеїну в групах обробки не-і9д та а-5уп (9, аналізували за допомогою програми СгтарпРаай Ргізт Зоймаге,
Зап Оіведо Саїйотіа, ОБА. Один спосіб АМОМА був виконаний з апостеріорним критерієм
Даннетта. Дані, показані на фігурах, представлені як середнє значення ж стандартна похибка середнього (5ЕМ). Відмінності між групами вважалися статистично значущими при р «0,05. Всі аналізи були виконані сліпими для експерта. Групи обробки антитіл також були сліпими для експерта.
Результати
В обох мишей, що не належать до ід, та а-5уп 9 тісе, альфа-си нуклеїн імунореактивності на І М-а-вуп-ін'єкційному іпслатеральному боці була інтенсивною в нейропілі і охоплювала більшу частину поверхні гіпокампу (Фігура 12 А, Фігура 15 А; МІР228 - Іпслатеральний).
Контрлатеральний не-ін'єкційній гіпокамп мишей, що не належать до їд, та о-5уп 9 мишей, також показав високий рівень імунореактивності альфа-синуклеїну, що вказувало на те, що лентивірусно-експресований альти-синуклеїн поширився від введеного правого гіпокампу до лівого гіпокампу (Фігура 12 А, Фігура 15 А; МІР228 - Контрлатеральний). В даній лентивірусній альфа-синуклеїновій ін'єкційній мишачій моделі, попередні експерименти показали, що тільки експресований альфа-синуклеїновий протеїн поширюється до контрлатерального боку без доказів перенесення самого лентивіруса, як визначали за ПЛР-аналізом (дані не показані).
Іпслатеральні та контрлатеральні гіпокампальні рівні лентивірусно-експресованого альфа- синуклеїну у мишей, що не належать до ід, які були пасивно імунізовані 9Е4 антитілом (9Е4 - мишача версія РЕХО02 (РгошШепа)) були майже ідентичними до іпслатеральних та контрлатеральних гіпокампальних рівнів лентивірусно-експресованого альфа-синуклеїну у мишей, що не належать до ід, які були пасивно імунізовані МІР228 ізотипним контрольним мишачим Ідс1 (Фігура 12 А, В, С; 9Е4 в порівнянні з МІР228), вказуючи, що 9Е4 при дозі 20 мг/кг щотижня протягом 13 тижнів за ІР шляхом не блокує розповсюдження альфа-синуклеїну в даній бо альфа-синуклеїновій моделі поширення.
На противагу цьому, як іпслатеральні, так і контрлатеральні гіпокампальні рівні лентивірусно-експресованого альфа-синуклеїну у мишей, що не належать до ід, які були пасивно імунізовані або антитілом а5і00452 поді-3, або ефекторною нуль-мутантною версією азіо0452 паІ-3 (азіоб452-паІ-3-0265А), де заміщення аспарагінової кислоти на аланін в положенні 265 (0265А) в мишачому Ідс1 в результаті призвело до втрати взаємодії між цим ізотипом та низькоаффинними Ідс Ес рецепторами (ЕсукКіІВ та ЕсУуКІІї), виявленими на мікроглії, були набагато значно меншими, ніж іпслатеральні та контрлатеральні гіпокампальні рівні лентивірусно-експресованого альфа-синуклеїну у мишей, що не належать до 19, які були пасивно імунізовані МІР228 ізотипним контрольним мишачим Ідс1 (Фігура 12 А, В, С; а5Іо0452- паІ-3 б авіо0452-паІ-3-0265А в порівнянні з МІР228). Це вказує на те, що пасивна імунізація мишей або азіо0452-п3щдІі-3 або ефекторною нуль-мутантною версією 0265А авзіо0452-пдІ-3 надійно блокує поширення альфа-синуклеїну в даній мишачій моделі альфа-синуклеїнопатії.
Аналогічні результати були отримані, коли вектор І М-а-5уп був ін'єкційно введений в правий гіпокамп а-5уп 4 мишей; пасивна імунізація азІо0452-пдІ-3 або азіо0452-п39І-3-0265А, але не 9Е4, призводила до надійного та статистично значущого зниження як іпслатеральних, так і контрлатеральних рівнів альфа-синуклеїнової імунореактивності в гіпокампі при порівнянні з
ІМІР228-обробленими а-5уп 1д мишами (Фігура 15 А, В, С).
При більш високому збільшенні лентивірусно-експресовані альфа-синуклеїнові імунореактивні відкладення можуть спостерігатися вздовж обох іпслатеральних аксонів ін'єкційного боку та контрлатеральних аксонів неін'єкційній боку мишей, що не належать до (д, (Фігура 13 А; чорні стрілки, що показують транс-гіпокампальні аксони), пропонуючи, що альфа- синуклеїнове поширення до контрлатерального гіпокампу може головним чином відбуватися вздовж аксонів (транс-аксональне поширення). Іпслатеральні та контрлатеральні рівні аксональних альфа-синуклеїнових депонувань у мишей, що не належать до ЩД, пасивно імунізованих або 9Е4 антитілом, або МІР228 ізотипним контрольним мишачим Ідс1, не були суттєво різними (Фігура 13 А, В, С; 9Е4 в порівнянні з МІР228), вказуючи на те, що в наших експериментальних умовах, 9Е4 не впливає на рівні аксональних альфа-синуклеїнових депонувань, а також не зменшує розповсюдження альфа-синуклеїну вздовж аксонів в даній моделі поширення лентивірусної-альфа-синуклеїнопатії.
Зо На противагу цьому, як іпслатеральні, так і контрлатеральні рівні аксональних альфа- синуклеїнових депонувань у мишей, що не належать до щд, пасивно імунізованих або антитілом азіо0452 пді-3 або ефекторною нуль-мутантною версією азіо0452-пдІ-3 (азІо0452-пдІ-3-0265А), були значно нижчими, ніж рівні аксональних альфа-синуклеїнових депонувань у мишей, що не належать до ід, оброблених МІР228 ізотипним контрольним мишачим Ідс1 (Фігура 13 А, В, с; авзіо0452-п39І-3 4 авзіо0452-пд9І-3-0265А в порівнянні з МІР228), вказуючи на те, що пасивна імунізація мишей або а5іо0452-паІ-3 або ефекторною нуль-мутантною версією 0265А азіІо0452- пді-3 очищає аксональні альфа-синуклеїнові депонування та надійно блокує іпслатеральний-до- контрлатеральний перенос альфа-синуклеїну вздовж аксонів в даній мишачій моделі лентивірусної-альфа-синуклеїнопатії.
Дуже схожі результати були отримані, коли вектор І М-а-5уп вектор ін'єкційно вводили в правий гіпокамп а-5уп їд мишей; пасивна імунізація а5іо0452-пді-3 або азіо0452-пдІ-3-0265А, але не 9Е4, призвела до стійкого та статистично значущого зниження як іпслатеральнийх, так і контрлатеральних рівнів альфа-синуклеїнової імунореактивності вздовж аксонів при порівнянні з МІР228-обробленими а-5уп 94 мишами (Фігура 16 А, В, С).
У І М-а-зуп-мишей яким ін'єкційно вводили, що не належать до щД, при більш високому збільшенні інтенсивна альфа-синуклеїнова імунореактивність детектувалася в нейропілі іпслатерального гіпокампу та в меншій мірі в нейропілі іпслатерального неокортексу (Фігура 14А). Крім того, інтенсивні відкладення альфа-синуклеїну були виявлені в низьці ідентифікованих нейрональних клітинних тіл (сома) в САТ ділянці іпслатерального гіпокампу та більш слабка імунореактивність була виявлена в нейронах шару 5 іпслатерального неокортексу (Фігура 14; чорні стрілки). В той час як лікування антитілом 9Е4 не змінювало істотно кількість іпслатеральних САТ гіпокампальних нейронів або іпслатеральний неокортикальних нейронів шару 5, що містять альфа-синуклеїнові депонування при порівнянні з мишами, що не належать до 9, імунізовані МІР228 ізотипним контрольним мишачим дос (Фігура 14 А, В, С; 9Е4 в порівнянні з МІР228), миші, що не належать до З, оброблені або антитілом а5іо0452 пдІ-3 або ефекторною нуль-мутантною версію азіо0452-па1І-3 (азІо0452-пдІ-3-0265А) значно знижували кількість іпслатеральних САТ нейронів та іпслатеральний нейронів шару 5, що містять альфа- синуклеїнові депонування в порівнянні з мишами, обробленими МІР228 ізотипним контрольним мишачим Ідс, що не належать до 19, (Фігура 14 А, В, С; а5Іо0452-паІ-3 б. абіо0452-п9І-3-0265А в бо порівнянні з МІР228).
Крім того, інтенсивність альфа-синуклеїнової імунореактивності в нейропілі та нейронах іпслатеральної САТ ділянки гіпокампу та іпслатеральної ділянки шару 5 неокортексу була помітно нижчою у азіо0452-пдІ-3-оброблених та азіо0452-п39І-3-0265А-оброблених мишей, що не належать до 4, в порівнянні з мишами, обробленими МІР228 ізотипним контрольним мишачим ІдС, що не належать до 9, (Фігура 14 А; азіо0452-пді-3 б азіоб452-п39І-3-0265А в порівнянні з МІР228).
Аналогічні результати були отримані, коли вектор І М-а-5уп ін'єкційно вводили в правий гіпокамп а-5уп Щ мишей; лікування азіо0452-п3дІ-3 або азіо0452-паІ-3-0265А, але не 9Е4, призвела до статистично значущого зменшення кількості нейронів, що містять сильну альфа- синуклеїнову імунореактивність в іпслатеральних СА! гіпокампальних та шарових 5 неокортикальних ділянках, а також в контрлатеральній САТ гіпокампальній ділянці, при порівнянні з МІР228-обробленими а-5уп д мишами (Фігура 17 А, В, С, 0).
Було продемонстровано, що пасивна імунізація або немутантного типу мишей, що не належать до їд, або мишей а-з5уп їд4, причому обом стереотактикально ін'єкційно вводили лентивірусний вектор, який несе експресію людського альфа-синуклеїнового на одному боці гіпокампу, з високоафінним анти-альфа-синуклеїновим мишачим Ідс1 антитілом азіо0452-п341І-3 надійно знижує іпслатеральний-до-контрлатерального транс-аксональне поширення лентивірусно експресованого альфа-синуклеїну, що спостерігається в даній мишачій модель розповсюдження альфа-синуклеїну. Дане нова розкрита анти-альфа-синуклеїнова антитільна властивість інгібування поширення альфа-синуклеїну іп мімо свідчить про зв'язування з іншим епітопом людського альфа-синуклеїна в порівнянні з антитілами, які не інгібують поширення в досліджуваній моделі, наприклад, 9Е4 антитіла.
Крім того, дані, які показують, що ефекторна нуль-мутантна версія 0265А азіо0452-п91І-3 є однаково ефективною, як азіо0452-пдІ-3, при зниженні поширення альфа-синуклеїну в моделі, вказує, що опосередкована антитілом профілактика поширення альфа-синуклеїну не вимагає
Ес-асоційованих ефекторноих функцій, як ключового механізма дії, та зокрема це вказує на те, що, як видається, не існує вимоги або ролі для Ес рецепторів (ЕсуКІІВ та ЕсУуКІ!І), присутніх на мікроглії в антитіло-опосередкованій блокаді поширення альфа-синуклеїну.
Таким чином, антитіла за винаходом, які націлені на альфа-синуклеїн, а також на його
Зо антиген-зв'язуючий фрагмент, мають потенціал модифікувати захворювання при РО або 0І В або М5А шляхом блокування або уповільнення патологічного захоплення альфа-синуклеїну в клітинах реципієнта та запобігання дисеменуванню та передачі альфа-синуклеїнової патології між анатомічно зв'язаними ділянками мозку. Таким чином, антитіла, націлені на альфа- синуклеїн, можуть лікувати або попереджувати прогресування захворювання та мати терапевтичну користь для пацієнтів з синуклеїнопатіями, такими як РО, 0 В або М5А.
Приклад 13: Генерація біспецифічних антитіл 0452 пдІ-3-ВВВІОб2баї
Ілюстративні біспецифічні антитіла відповідно до винаходу, що включають людський Ідс1
ТМ скелет, асоційований з одноланцюговим фрагмент (5зсЕм) ВВВІО62бодіІ, прищепленим до М- кінця (Віє2 формат) або С-кінця (Візє3 формат) важкого ланцюга а5і00452 пдіІ-3 генерували, як описано нижче.
Біспецифічне антитіло відповідно до винаходу, в Ві52 форматі, генерували шляхом синтетичного продукування фрагмента ДНК, що кодує ВЬрІОб2бдізсЕм-(с45)х2-а5іо0452. пді-3
МН або вЬрюб2бул-(с45)х2-авіо452 падІ-3 МН, що містив В55НІЇ та В5СЕЇЇ фланкуючі сайти рестрикції ендонуклеаз, в зворотному напрямку ВЬБІОб2бдізсЕм або ВрБО62бул та прямому напрямку азіо0452 пдіІ-3 МН, відповідно. Потім розщеплені фрагменти ДНК безпосередньо клонували в векторний скелет пІДС1 ТМ.
Біспецифічне антитіло відповідно до винаходу, в Візє3 форматі генерували за допомогою
ПЛР ампліфікації з подальшим спрямованим клонуванням з використанням сайтів рестрикційної ендонуклеази (51їЇ та Хбаї). Були сформовані два фрагменти ПЛР: (1) ампліфікація пІдДС1ТМ --
СНЗ домену від сайту рестрикції 5ІЇ до С-термінального кінця СНЗ домена та (2) перекривання
ПЛР фрагмента з прямим ПЛР оліго, що включає С-термінальний кінець СНЗ-(545)х3 лінкера (ЗЕО ІЮ МО: 57) та М-термінальний кінець ВЬБІОб2баді зсЕм вздовж з оліго ампліфікуванням С- термінального кінця ВрБОб2бді 5сЕм та безпосередньої в прямому напрямку векторної послідовності після Хбраї сайта рестрикції. Обидва фрагменти ПЛР були зшиті разом в реакції
ПЛР протягування та потім безпосередньо клонували в РЕШТ 4 (людський (ДС1ТМ вектор) через сайти рестрикції ендонуклеази 51 та хХбраї.
Дані біспецифічні антитіла експресувалися в системі експресії на основі СНО, та отримані в результаті антитіла очищали, використовуючи колонку для очищення протеїну А. Всі біспецифічні антитіла, отримані з ВрБІО626, досліджували щодо зв'язування іп мйго з бо ендотеліальною клітинною лінією мозку миші (р.епаз) для підтвердження зв'язуючої активності залишка-транспортер ВВВ та також досліджували щодо конкурування зв'язування аіІ500452 паі-
З в основному епітопному конкурентному аналізі НТКЕ для підтвердження зв'язування з епітопом азіо0452 па1-3.
Таблиця 1 95 95 СІ азупО087 авіоб452 пді-1 0,3-2,3 НМ авіоб452 пді-3 15-177 ПМ авіоб0452. пдІ-3 106 пмМ 10-292 ПМ авіо0543 108 ПМ 34-223 ПМ авіо0543 113 ПМ 5-333 ПМ
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«14102 МЕДІММЮН ЛІМІТЕД «1205 АНТИТІЛА ДО АЛЬФА-СИНУКЛЕЇНУ ТА ЇХ ЗАСТОСУВАННЯ «1305 1845081-0002-0914АМО «1405 «їх «іо» 2344746 «Т512 2018-08509 «1605 81 «1702 Рагетій чегзіоп 3.5 «101 «011» 140 «2125 РКТ «2135 Ното зарепа «ап
МегАвр Уві Ре Мей ув ЗУ бец Бек ув Ав Був У ма! Ма ' 5 10 15
Аів Ага Ага сш ув Тег був ій Ох Маї Ав Со Ага Аа У ув 975 Зо
Твг ув Ов у Ма еш Руг уві Су Бегі уз Тігі ув ів ЗУ Ма! 40 45 маг Ні Су Уа! Аа Тг Ма! Аа со Був Ти ув ід іа Ма) Тег о
Авп уві СІХ Су Аа аг Уа ТНг Оу Уа) Тиг Ага Уа Аа іп ув 55 70 75 во
Тег Маг сш У Ага Су Бег Пе Аза Аз Аа Тг с1у Рле Ма був 88 во 95 ув Авр Сп ен ЗУ Гуз Ави сти у СУ Авіа Рго ій З Су Це 150 105 мо
Гей Сі Авр Мег Рго Уві Авзр Рго Авр. Авп ЗШ Аа Туг ОЇ МесРго не 120 125
Бек Об (У Гуг сп Авр Тук Сім Рго ОЇ Ава
130 135 145 «в «211122 «2122. РЕТ «13» Ното зарієпе «00» 2 бій ма! Спец бе бів Зек С8іу СУ СІМ Сей Ма! ій Рго ЗУ СІу 1 5 10 15
Бег Ген Ага ГешизегсСув Аа Аз Зег Біу Ре Твг еНе баг Зет Туг 95 Зо
Ага Ммеї Зег Тр Ма Ага Сій АМа Рго у Сув Су еп іш Тгр Уаї ай 45
Бег. Ага Не Бег Оу Бег Сіу Лу Зег ТА Туг Туг. Аз Авр Зег Уа
Ба во
Гу Іу Ага Ре Тиг Не бег Ага Авр Авпобег Сув Авп ТАгГеи Туг 85 та ТБ 8о
Гец'єїй Меї Ап Зег ен Аг Аа іш Ар ТАг Ага Ма! Туг Туг Сув 85 90 98
Аа 'ЄЇу Сіу Ага Ма Аа Ма Туг Туг Тук Гук сну Меї Авр Ма! Тр то 5 о ім біп біу ТАг Меї Уві Тнг Уві Зек Зег 115 120 «10» З кот 115 «2125 РАТ «13» Ното заріепе «400»
Зіп Айва Маг Гео Того іп Ро ЗегбЗегі ви Бег Аа бЗег Рго Су Ав 1 5 то 15
Бег Аа Зегіец ТО Сув ТВг Гец Аг Бег 3іу Авп Ави Ма! Спу Аби 29 95 30 туг Ага Не Тут тез Гук (зі (ій ув Заг Му беє Ріо Рго Сп ТУг 35 40 45 еп те Аг тугі уз Зег Авр Ада Авр | ув Нів іп слу бег Су Уа! 5О 55 Бо
Рго Баг Аг Рпе Бех Зіу Заг у5 Авр Ага Баг Авіа Авлп Аа Оу Це 85 то 75 во
Гей Рпеце Бег Сіу бви біп Зег С Авр ОО Аа Азр ТУ ТугСув вВ5 50 95
Ме Уа! Тер Ніз Бег Су Ма Ттр Уа! Рне Сіу Су Чу ТНг ув бе о 105 мо
Тіп Уві рей 115 «10254 «В112 122 «12 РАТ «13» пото варіенвь «220х ке215 ВАРІАНТ «Рог» (БО) (БО). «23» /замімат"АЇа" «20» «221» ВАРІАНТ «В2о (53,53 кегЗ3» заміна су" «220» «221» ВАРІАНТ «222» (54), (54) «ВЗ» /замінаю бе" «20» «вл» ВАРІАНТ «оре» ПОДИХ «аа» /замінак"Ад" «220» «221» ВАРІАНТ «ви» (102). 002) «га» ізамінак"Аго" коро» «2212 ВАРІАНТ «ва (1031103) х223х замінак"(оіу"
«ВО» кові» ВАРІАНТ «дао» 0 ТОЯ «га» /замінак"Кту" «ва» «раї» ВАРІАНТ «ваг» (108). (305) ква» ізамінає Це" «ред» «ав» ІНША, ОЗНАКА «фев (1.4122) «823» ізвмітках" БВаріантні залишки, надані в поспідовності, не мають перевагу по відношенню до тих, які в коментарях для варіантних положень" «роз 4
З Ма! Сів сви ви «3 бег у Су Су Гео маг оз Рто Су Су ! 5 10 15
БЗегіешлго ви бег Су Аа Аа Бег Су РНе ТІ Рне Зег Зег Туг 20 25 З
Аіз Меї беї Тер Уві Аго іп Аа Рго СПУ Гу У Бенц ЗІ Тр ма
З 40 45
Бег беге бе Ніз Ге Зіу Су Бег пк Туг Туг Ав Авр. Зет Уаї 50 55 що
Гув біу Ага Ре Трг Пе бег Аг Авр Ав Зег Гуз Ада Ті Ме Тує
Б 70 75 во і ви ІП Меє Азп Зегіви Аг Ав СЮ Авр Тіт. Ава Ма! Туг ТугСує 85 0 95
Ав су У Аа Авп Нів Уві ув Ту Ту Ту Оу Мег Авр ма! То 105 о
Су біп Сіу Ти Ме уаі Те ма! Бег Заг 115 т2о «Ло» 5 кр 5 «Ро» РАТ кіз» Ното заріепа «400» 5
БегтТугАза Меї баг 1 5 «СО» в «2115 17 «212» РТ «рі3» Ното заріепа «220» «21» ВАРІАНТ «22ах У) «рез» /замінає" Аа" край» креїх ВАРІАНТ кан (4р Я) «23» заміна" Су" «йо крої» ВАРІАНТ «ах 15). (85 «ваз» /замінаєве" «2905 «2212 ІНША, ОЗНАКА «ра» (1). 17) «23» заміткат Варіантні залишки, надані в' послідовності, не мають перезагу по відношенню до тих, які в коментарях для варіантних положень" «4005 5
Бегіе бек Нів Ге су Сау Зег Таг Туг Туг Аа Аврозег Уві Гу 1 в то 15 су «21057 «112 13 «2122 РЕТ «913» Ното варіанта «20» «Д212 ВАРІАНТ «ра (3.3) «23» заміна Ага" «280х «21» ВАВІАНТ «ов» (44) «да» Ізамінає Аку"
«Ох «дії» ВАРІАНТ «рей» (85 «г» /замінах Су" «ох «2212 ВАРІАНТ «22» 640 «2232 ізамінах"Ага" их «221» ВАРІАНТ «рве» 7). «без» /замінат Не" «220» «215 ІНША, ОЗНАКА кора» (т. (18) «йеЗ» заміткає" Варіантні залишки, надані в послідовності, не мають перевагу по відношенню до тих, які в коментарях для варіантних положень" «40027
СУ Аа дви Нів Уві Гуз Туг Туг Тут СУ Ме Авр Ма! 1 2 16 «2028 «9112114 ках РЕТ «2132. Ното заріелье «рах «фо 12-ВАРІАНТ «ав «?Зе/замінав сег «ЙО «2212 ВАРІАНТ каво» (28): 28) «иа» ізамінат су" рад» «221 ВАРІАНТ «222» (281429) «ред» /замінах Авр" «20» «2212 ВАРІАНТ «ага (303 (30) «З» заміна пе" «дО» «212 ВАРІАНТ «ва» (31). 31) «ри» Замах аг"
«аз агї» ВАРІАНТ чав (32). (32 «фа» ізамінах"Ата" «рей «в2г1» ВАРІАНТ «2925 (42) (42) «аа» Ізамінах Рто" «дао к21» ВАРІДНТ «дай» 82). (82) «ве» заміна бе «20» «215 ВАРІАНТ «2922» (98). (99) «2232 /замінах" ве" «вад «ои12 ВАРІАНТ «2225(100).4100) «аа» Ізамінає"Бе!" «рах «рої» ВАРІАНТ «2522 102).1102) «23» /Замінат Аа" «в20» «ве ВАРІАНТ «ов 104) (105) «ваз» ізамінат" Тут" кавоз «ей» ІНША ОЗНАКА кава Я) ! «283» замикає" Вавіантні звлишки, надані в послідовності, не мають перевагу по відношенню до тих, які в'юдментарях для варантних положень" «АВ сп Аа ма! ге Тег ів го бег Ваг іец Баг Ліва Бек Рго ВІу Ав 1 5 10 5
Оег Аа Зегіємц Тег був Тл Ген Аг бег Оу Ма Ргої ви. Ріо ув 29 25 ЗО
Тут. Аку Пе Тут ТгрТуг ів Спа ув Бегоу Бег Ро Ро Зі Туг
ЗЕ 40 48
І во ви Агу Туєс Су бег Авр Ав Авр уз Нів Сі Су Зег Зіу Уа
50 55 бо
Рго Бег Ага Рпе БегзІу Зегіув Авр Аа Заг Аз Авп Ада су Не. 65 70 75 80 меи Ре Зегоїу Бец бій Зег С Або СО Ав Авр Туї ТугСув Ме! 85 90 95
Ма! Тр Азр Нів слу Ма! Тгр Ма! Рпе у су Су ТНг був Сем Тог 60 105 о ча Гей «1029 «11514 «а РТ «213» Ното зарівпа «0 «22125 ВАРІАНТ «222 5). (5) «823» /замінак"Зеї" «рай» «21» ВАРІАНТ «222» (8). (6) кед» ізамінатну «ой «212: ВАРІАНТ «222» (7)-(7) «2» /замінах Авр" «2205 «2215 ВАРІАНТ «дай (8), 8) «ве» заміна Рне" «20» «21» ВАРІАНТ «рда (948) «йо» Заміна Заг" «2» «21» ВАРІАНТ. «вза (10310 «223» ізамінак"Агу" «20» «22121НША ОЗНАКА кора» (13414) «223» /заміткає" Варіантні залишки, надані в послідовності, яе мають перевагу по відношенню до тих, які в коментарях для варіантних попожень" «Ода
Тит сец Агу Бег Лу Аа Ріо Сеци Ріо Гуг Туг Ага Пе Туг 1 5 т ка» 10 «и» 1 «2152 РЕТ «13» Нопо варіепе «4005 10
Туг був зегАдар Аа Авр цу Нів іп Оу Баг . 1 5 то «в» 1 «ті «2122 РТ «2135 Ното варепае кад ка212 ВАРІДНТ «ов (4) (А) «Ра» /замінах" Вес" «ваз «2212 ВАРІДНТ «ра (5МВ «орі /замінах бе ак «2212 ВАРІАНТ «вза» (ТУ «Ра» заміна" Ага" «дз «221» ВАРІАНТ «282» 49). (9) «рез» ізамінає"тТує «220 кра» ІНША ОЗНАКА «вад» 1) (8) «аа /заміткає" Варіантні залишки, надані в.ласлідовнмості, не мають перевагу ло відношенню до тих, які в коментарях для варіантних положень" «АйО» 11
Ме Уа! Ттр.-Аво Ніз У Ма! Тер Ма! 1 5
«оті аБ2 «2125 ЕТ 13» Нато варівть їз Ма! сій бе Сец Су Зег іу іЖ Зі Сей Мві Со Рго Су Спу ї 5 ю 15
Вегізу Аг еу Зег Суз Аа Аа Зег Сіу ле Тит Ре Зеу бег Туг о 25 ЗО
Ага Меї Заг Ттр Уа Агу сіл Аа Рго у Сув Су се Ів тр Ма!
ЗБ 40 45 бБег Зег Пе бег Ніз'їен сту СІу Зег ТНг Туг Тут Лів Авр Бег Ма що
Гу ФУ Ага Рне Те Пе Зег Агу Авр Авт Зегі ув Ав Тег Бей Туг бо 70 75 80 ем Сіл Ме Авп бегі гу Ага Аа бій Авр.ТАг Ав уві Туг Тут був 85 во 95
Аіа Зх СИу Ав Авп Нів Су 15 Туг Тує Туг СУ Ме Авр ув Тер 100 195 о сіу Сів у Тв Те Ма! Тв Уа! Зег бег Аа бат ТС ув Сіу Ріо 115 120 125
Бег Узі Ре Рго ву Ав Рго Зег бе Був Зег Тиг Заг Су СМ ТНг 36 135 40
Аа Аве у Сує Гео ма! ув Авр Ту Рне Рго Зі ето ма тиг 145 150 155 160
Ма! Зег Ткр.Ава Бег СУ Ав ви ТАг Заг СІМ Маг нів тні РНе Рго 155 170 175 діа Уві бе іп Зег Бегіу Ме. Гук Зегі се Зег Заг Ма! ма! Риг 180 185 190
Уа! Рго Бег Зег Бе І виш Спу тн Сіп Тег Туг Ле Суб Авп ма! Авп 195 200 2а5
Не ув Рго Бег Ап Тегі ув ві Ав Гуз Аг Ма! Сій Рео у Бе 210 215 220
Сув'Авр Був ТНг Нів Те Сув Рго Рго Сув Рго Аа Рго Сі Ре ій 225 239 З 240 су Су Рго Зех Уа! Ре їви Рне Рго Рго ух Рго Куб Авр. Тигіец 245 250 255
Ме Пе бег Аа Тбг Ро бій Маг ТагСув Мага маг Авр уві Бег 280 або 270
Нів Сів Авр Рто Си Маг ув Ре Авп Тез Туг Ма Авр су Мамо 280 285
УагНів Авп Аа ув ТНг був Рго Агу Зв Сів Зіл ТубАвп Бех Твг 2950 295 об
Туг Ага уві Ма Вега ре Тв ма! Сец Нів Са АвроТріви Авп
ЗО5 Зо 315 320 сім був Сід Туг був Сув їуг Ма! Заг Ав був Аів Геи Рго Аа Заг 325 З30 335 пе і ув ТІ Це бег ув Аа ус сну Св Рго Ага Он Рго си зо ЗА З50
Уа Туг Те увуи РгоРго Зег Аг ОМ ОМ Меї ТНг Гуз Авп іп. Уві 355 З50 365
Зегіец ТпеСув беи Уві був Су Ре Туг Рго-зег Авр Пе Айва Ма 370 375 зво іц Ттрю ЗегАвип іу сна Ето Сі Ав Аво Ту був ТР ти Ра 385 Зо 395 400
Рго Ма сви дер Бег Аар Оу бег Ре Ре Сей Туг бег ув бе ТАг 405 а 415 ма Авр був Бет Асо Ттр сію біп су Яви Ма! Ре Зеї Сув. Зег Маї 420 425 4з0
Ме Нів Сім Аа Сец Нів Аз НівоТуг ТА Гуз Зегїеи Зегі ви 438 440 445
БегРгОо су ув 450 «210513 «211: 366 «122 ДНК «135 Ноато зарівав «20» «21» СО кгай (1). (366) «а00» 13 дво дію сад сід Ка дао (с до дда дос бо діа сво осі 999 999 48
Сів Маг бій рей Сви о Зегсіу М спу Гец Уа сна Рус у су 1 5 10 15 їсссі ада сіб їсстувоса усс ода чо асс й адс азс а! 96
Зег ем Ага Бей Бег Сув Ав Аза бБег Су Ре Тог рве бек зе Туг
Зо цес від ус ідо діс соус сао досі сов 959 зад д9о сів сао ща іо ї-4
АЗа-Меї Зег Тр ВЕ Аг (іл Аа Рго Су ув Су Се о Ттромаї їсаїссайсссас стаді оп ав аса їас ас оса дасіос дід 192
Бег Баг Це баг Нів Бей Су Су БЗег Тиг Туг Туг А Авр Зег уві
БО 55 І5.8) зад'ядсоцо нс асс аісіссазца часані їсс зад зас асо сід їй 2740 ув Су Аг Ре Тнг ее Зег Аго Авр Авт Зег був Азлотпг Бе Туг в5 79 78 во сіб сва від аас адс- сід ада ос даз дас асо дсе сі їв тас дії 288
Гец біп Меї Авп Зег Гео Агу Ага Сі Авр ТА Ада Маї Туг Туг був 85 Зо 95 су дда 999 са вас Сас 99 аву асіасіас Яда го дас ава да 336
Мазі сну Аа Ави Нів'ЄТуУ Був Тує Тут Тут СУ Меї Азр. ув Тр 100 105 1ю дос саз од асс асо діє асо іс іссіса Зб
Сіж са су Тк Твг Уві Тит Уа! Бег заг 115 120 «д1о5 14 «211129 «2122 РВТ «213» Ното зарівепа
«а00» 14
Маг сіпі ен ей и его су Сіу сви ві СТ Ро у Су 1 З 10 15 зегіви Ага Ге ех Суз Аіа Аів Бек оіу ре Ти Рне бег оег Тук
Зо
Ав Меї Бег Тр Маї Агу ій Аа Рго сіу Гув Оу Ген бін тр Уа
За ча 45
Ваг Заг Пе бек Нів мец слу слу Бет ТАг Тут Туг Лів Авр Бег Ма!
БО 5 во
Був СУ Аг РНне Тиг Пе Зег Аго Аво Аби Бег був Аби ТигЕеий Туг 65 73 75 Зо ії ви біп Меє Аби Бегі ги Ага Аа ЗМ Авр ті Ав Уа! Туг Туг Сув 85 о 95
Ага Сіу ЄЇУ Аа Ап Нів Спу був Туг Тут Тугоїу Меї Авр був Тр 190 т05 0
СУ Сі ЗІУ Тиг Те ма! Ти Ма! Зегбег 5 120 105 5 «1117 хро» РАТ «13» Ното зарівне «Од» 15
Бег Не бЗег Ні Ге (у біу бег ТА ТГуг Тут Аа Ар Зеє Уві бух 1 5 іо) 15 су «Ох 16 «11» З «12» РТ «13» Ното замепз «4002 В
Сх Ага Авп Ні у Сув Тує Туг Туг ау МегАвр уз
З В т
«102 17 «212» РАТ «213» Нота варівпв хайО» 17 сій Аа Маг бец Тег Сп Рго Ага Зег Геи Бег Аа Бег Рго Су Ав 1 5 3) 15 зег Аа зегіем Тит Сув ТНг ен Аго бег Сіу Ав Рго ем Рго Гуз 20 25 Зо
ТубАго Це Туг Тер Тує Сіл Сп був Рго Спу Зег Рго Рго Сів. Туг 35 Ай 45 іец ей Ага Туг ук Бег Авр Аа Арі ув Ні сб Оу Баг оу Ма що 55 50 го Зег Ага Ре Зег Оу бе! | ув.Авр Аз Баг Аа Ап Аа Су Це 55 79 75 80 і ей ей Пе бег Сіу г еи іп его Авр ОВ Аа Аво Тут Тут Сув 95
Меї ма Ттр Авр Ніз Лу ма Тр Тут Ре Оу у Су Тк ув Гей ню 305 о
ТТ уві бец у іп Рго ув Аа Аа бго Бег Маї Ти Сец Ре Ро
Б 120 125
Рг Зег бегони в Гей от Аа Ави був Аа тяг ей маг був їеи тзо 135 140
Ве Зег Ав Ре Туг Рго іх Да ма Тлг ма! Аза Тер Гув Ага Ар 145 150 155 160
Зег бе Рго Ма! | ув Аа су Ма о Тек тн Те Рго Бег ув іл 85 170 175
БегАвп Ав ув Тус Ав. Аа бег Зег Туг бе бегі ви Тіг Рто ой тво ї85 150 (іп тТго І ув Бег Нів.- Ага Зег Туг Зег Сув біп Уаг пт Нів іш біу 195 200 205
Ваг Ти Уа іш уз ТАг Уа! Аа Ро Тигою Сув Зег 210 215 220 «2105 18 коеіїі» 35 «212» ДНК. «та» Ното варіть «ад» ТВ: савасіносібасісавоасо даспсссіс ісасоісіє сіддаусвісадссацієс 80 ассідсассі дсосвоща часассссід ссовацав дозанею діаісвосва т20 авоссаддав діссісссса сігісіссо апдіасвазі сарасосасаааасассво 180
Чесісшщово їссссадссо сісідаа (ссааада сбсодссаа дсавооай 250
Насісвісї діддосіоса сісідводаї дадосічас ацацоні сон оуас 300 сасудсоісї загайсоо содвдарасе задсідассо іссів 846 «2105-19 «1115 «12» РЕТ «213» Ногто заріепе «Або» 18
СМа Аа Май ей Тег ой бго Аа бегі у Бег Ага зас Рго Су Аа
З 5 то 15
Зег Аа бегіец ТП Су ТО Бен Аго Зег слу Аа го Бей Рго ув
ТугАга Пе Туг Тер Ту Іл іт ув Бгто Су Бех Рго Рго іл Туг меч ей Ага Туг ув Зег.Авр Аа Авр ув Ні Сіп у Зег Су Ма! 5а 55 50
Рго Бег Агу Ре бе Су Бег ув Ар Аа Зет ід Ава Ді сту в 65 70 75 во
Гей сен Це бегбіу се сп Зег БІ Ар Аа Авр. Туг Тук Сув 85 що 5
Мега! То Авр.ів СОІУ Уа Тер Туг РНе Слу Слу Су Тр Гу Бе о 195 130
Тик Ма! ец 118 «210» 20 «1114 «р12» РЕЖ «213» Ногао заріепе «00» 20
Тег рей Агу Вег Су Ада Ргої ви Рго Гуз Тут Аго Це Туг 1 5 15 «210» 21 «1129 «2125 РКТ «213» Ното варі «4002 21
Меї ма! То Ар Нів Сіу Уаї Тиз тує
Я в «219» 22 «1» ав «рМахРЕТ «213»-Ното варівпе «А0О» 22
Сію Май сій Гец ви сін бБеє Сіу Су бу Сву Ма! Сп Рго5іу су 1 5 ло 76 бег ер Агд ен ет Сув Аа Аа Бек Су Ре Тег Ре бБег Зег Туг 20 28 30
Ага Меї Бек Ттр ві Ага спо Аа Рго у Був Му Гец ів Тер Ма; до 45
Баг Аа Песвег у Заг'су сіу Бег Тпг Туг Тут Ав Авр Зег Уві 80 хв Іу Агу Рве Твг НесбЗег Аго Авр Ап Бег був Ази ТР Сец Туг 65 70 75 80 мем сій Ме! Авп Баг Гео Агу Аа ій Авр ТНг Аа Ма Туг тут Сув 85 чо 95
Ав Су СУ Ав Аг Агу ЗУ Аг Ме Туг Тут Су Меї Авр Су Ти
100 5 тю
Сіх біп Сіу тиг Ти Уа! тн Ма Вег бег Аа бе ТІ ув СУ Ріо в 120 125
Зег Ма! РАе Рго Гви Ада Ро Бег Бе був Зег ТисЗегоу су ТИ 130 135 140
Аа Авівц Оу Суві ви Ма і ув Авр Ту Ре Его Сід Ро ма Тв 145 150 155 180
Уаї Зег тр Авп Бек Су Аа їео ТигБег і Уві Нів Тік РНе Рго 155 170 175
Аа Уа! і еш Зій ет БегЗіу ев Тугбегієо Зеє Баг Ма Ма! ТНе 180 185 180
Уа Рго Зег Земоег бе Су Тегі тТвг Ту Ле Су Авп Маг Ави 95 2 208
Ніз ув Реве? Ази Тік уз Маі Аврі ув Аг Ма! Сі Рго був 5ег 210 215 220
Сук Або ув ТАК ів Тк Су Ро го був Сто Аа Рго ів РКе ій 225 230 235 240 су су Рго Бег ма! Ре во еле Рус то був Рто ув Дер ТНКі во 245 250 255
Мене Бег-Дхо Тпг Рго Сію Уві Тиг Суб Уві Уа! Уа Ар Уві бог 260 265 27а
Нів Со Авр Рго СЮ Маг уз Ре Авп То. Тук Уа) Авро ну Ма! СЮ 275 280 285
Уа! Ні Авп Аа См ТАг Був Рго Ага Сі оц іп Туг Ав Зектн 299 235 зо
Тук Аа ма! Ма бе Ма! без ТА Уа: Сем Ніз Сніп Ар Тр ев Ав 305 Зо З15 320 су ув бін Туг був Сув був Ма! Зв Ал ув Аа Тец Рго Ага Зег
Зо зза 335
Не Сув ТЕГ Пе Зег бує Аа Су ЗУ сій Ро Ага СН Ріо бій 340 за5 350 ма! Туг Те цеи Рів Рго Бег Ар сім а Ме тт Гу Ав (ІЙ а
За5 за0 З65
Бег бви Гог Сув' ву Маг і-ув су Рле Туг Рго Зег Авр Пе Аа маї 370 375 ЗВО с Ттр іо Заг Аа Оу Сп Рго М Авп Ав Туг ув ТВ ТК РО зЗ85 395 95 4
Рго Уа! Гей Авр Зег Аєр Сіу бег Рів Рпе ви Тут бегі ув ви ТИ 305 410 45 маг Авр | уз Зег Аг Тер Сіп біл Су Авп-ма! Рне Бег Сув Бег Уа 420 425 430
Меч Нів іс дів ви Ні Авп Ніз Ту Тв біл ув бегіГеи бегі ев 435 440 445 зЗег Рго-Спу був 450 «2109523 «11» 306 «12 ДНК «2135 Ното варіви «400223 аадосаче визаазіє овадозоде Носіасаде сюачадоєє седацдасіє БО їссідсао ссісіздай сасоціваоє адсіаідсса двосіодці ссоссводої 0720 ссадаодаача зосіюдація заісісауеї анадіуаів цізсіюсас сасвіасає 180 зсадасісся ювавадссо знсассвісюсазадаса аносавова свсосіціеі 240 сідсазаюа асвасощавд адссозодає зсодсесог айасідіюсоодзадодаса 300 содеосуває удсаєтасів содааюувас авадочоссведодасаасооісасовіс ЗО іссіса 386 «рі» 24 «11» 122
«212» РТ «23» Ното зарієпа «АЮ» 24 сію Магбіп бев бви Сіш Зеї біх Сіу Сту Геи Ма! бій Рго сіу су 1 5 10 15
Бегі ви Агу Гео Зег Сує Ага Ліза Заг (Зіу Ріє Тиг Ре бег Бек Туг зо
Аза Ме зЗег Тр Уві Ага іп Ав Рго су був СПУ ме НІ ТТр. М ві
КЕ 4 45
Вег Ага Пе бег СУ Бе оу Сну Зеїг ТНг Тут Тут Аа Авр бег ма
Ба 55 Бо ув Сіу Ага Ре ТНг Не Заг Аг Авр Авп Зегі ув Авп Тв Сеи Туг 85 70 75 80
Їви Сіп Меї Авп Бег ви Аго Ага Зін Авр. ТНг Аа Ма! Туг Туг Су 85 що 95
Аа ЗІ СІХ Ага Агу Ага Оу Аг Не Туг Тук пу Мег Або Гуз Тр 190 105 10 су бів Су тег Тв ма! Тит Уа бе вБег 115 120 «2105 75 ке 5 ха122 РАТ «2132 Ното варіепе кАПО»ея
Бех Туг А Месбег 1 5 «10» ей «р115 17 «ро «2132 Но зарієпь «400» 25
Діа Не Зег Сіу Зег Су ЗУ Бег Тіт Туг Туг Аа Авр Зег Уа Гуз 1 Б 10 15 су
«9105 97 -2115 13 «122 РТ «2135 Ноїто зарівив «юю» 27
Су Ав Ато Ага У Ага Це Тут Тут Сіу Мег Авр був 1 Б КВ «2102-28 «211291 «132 КТ «та» Ното заріепе «300528 іп Аа Уві Єви Тег іп Ро Ав Зег Се) бег Аа Баг Ро СПУ Ав 7 5 19 15
Зехг Ага Зегіео ТгСув ТигЕ ей Агу ет бек су Авр Ре Бег Ага за
Туг Аг Пе Туг Тто Туг бій ів Дув Рто Сіу Бех Рг Ро ів Туг
Мей. цен Агу Туг ув бег Ар Аа Авр Гуз Нів Зіп Су бБег Оу Уа
БЕ 60
Рго Зег Ага Рле Заг Оу Зег Був Авр. Ага Зег Аа Авпо Ада бу Не 70 т5 Во
Гей Геи Ше Бег Су бе ій ех Си Авр Сі Ав Або Тут тус Суз 85 50 95
Меї Уа! ТрЗекзег су Аа То ТугРпе су СУ СІМ Ти Сув бек 100 105 130
Тиг Уа ен (іх біп Ро ув Аза Аа: Ро Баг Ма! Тит ви рве Рго
НИ 126 125
Рго баг Бек біц Сію Гец Сіл Ага Авп Гуз Аа Те Гео Ма! Сув Це 130 135 40
Це Зег-Авр Ре Туг Рго Сім Ліва Уві ТА Уві Аа Ттр їв Аза Ар 145 75 155 160 зегзегРго Ма! Сув Аза Зіу Магоютнг ти Тр Рге Зег був іп 185 1 175
ЗегАвпоАвп ув Тут Аа Аа Заг Заг Тугі ву Бегіео Тг Ро З ї8о0 185 150
Сів Тр Гуз Бех Нів Ага Зег Туг Зег був СіІп Уа! Таг Ні СІ Су 195 200 205
Ваг Ти Уа! і) ув Тнг Уві Аа Ро ТТ о Суз бег 2 215 220 «10» 29 «11 за «12» ДН «213» Нато зарівпе «4002 29 савасіюще Щщасісадес часної ісідецієїс сіддадсає адссацієіс во ассідсаєсі осасазіїс сддооасис Ісссодіаіа здагатасію дівісадсад 125 аадссзрода діссіюссса сіаісбюсі вадіасваві сасасосада ааасассяд 180 часісюдар'ососазося спнсюва іссазаца спсроссва дсводоай 240
Часісаїсі сідадсіоса цістазодає даросюасі зйанозвіозщовсс 300 адсуососі догаснсоа содазвдасс взадсювссо осів зЗ45 «210530 «115115 «12 РТ «182: Ното заріепе - «4005 30 бів Аа ма! Сем Тк Рго Аа Бег Бер зе Ав ет Рго Су Дів 1 5 10 15
Бех Аа бегібецз Тлг був ТВгГЕеу Аго Бег бег З)уУ Авр Ре Бег Ага з0
Тук Ага Пе Гук Тур Тут Сіл ій дує Ро іу Заг Рта Ро іп: Туг
Гец бе Аг Туг і уз Бег Авр Аа Авр ув Нів іп у Бег сну Уа! во
Рго зег Агу Рне Бег Спу Бег І уз. Авр. Аїд Бег Ага Ази Ага су Це 55 70 75 ЕТ)
Гей лем Пе бег ЗМ Гец Он Зехє С Авр ін Ага Авр Тут Тут Сув 90 55 мес ма! Тер. бБег Зег у Аа Тр Туг Ре Оу Сх Су Ті ув ей 190 705 10
Тік Ма Ге 115 кВ» «11 а «122 АТ «215» Ното варієпа «або
Тег Ге Аг Зак бег оіу Авр Рпе Бег Аку тує Ако Пе Туг 1 В 10 «810532 «аз «2125 ВАТ «2132 Ното заріепе «400238
Тук ув ЗегАвр Ав Авр Суб Нівчт Спу Бег 1 5 10 «210: 33 «11» 9 «125 КТ «185 Ното зарівпа. «4005 33
Меї Уа! Тгр бБег Зег ЗУ Аа Тур Туг
Н 5 «210» 34 «2112123 «2195 РТ «213» Ното варівпа «20» «раї» ВАРІАНТ «вро» (1)
«2932» /замінах'уві" «2212. ВАРІАНТ «ва ГК) «223» Ізамінає"ец" «220» «2215 ВАРІАНТ «2875 (75) «га» заміна Ага" «до «д21 ІНША ОЗНАКА «пай (3(123) «ро» /заміткахт" Варіантні запишки, надані в поспідовності; не мають перевагу по відношенню до тих, які в коментарях: для варіантних положень" «Ох ЗК
ЗІп Уа! си З ез маг (ЗІп аг Сіу Ага ЗИ Маг уз ув Рго Су Зег 1 5 10 15
Баг Уві Гуз Ма! Бек Сув Му Да Зег у Сіу Трг Рпе Зег Зег Туг о 25 30
Ав Не бБег Тгр Уві Ага Зіп Аа Рео Су Сів ОБ во іо Тер Ме!
СОІУ Аг пе ів го пе Беш іу ТВг Зег Аєп Тут Аа ів бу 'єйа во
Сіп БУ Ага Ма) Те Пе ТВ Аа Авр сі Зег Тиг Зег Гаг Аа Ту 65 70 75 Г518)
Ме: Сід Гед Зег Бек еи Аку Бег ію Авр ТВг Аа Ма! Туг Туг був 85 90 95
Аа Аго Ага бег ЗегІ.еи Аа Аа Аа Авр Аго СУ Ав Ре Авр Пе
Не 105 ла
Тер-еіу Сіп СУ Трг Ме Маг Ти Магзег Бег 115 120 «810» 35 «Ф112108 колах РТ ко18» Ното зарівнь бо крої» ВАРІАНТ «ра» (15).15) «реа» Ізамінах"Сіу" або "Ага" «20 «221» ВАРІАНТ «фраз» (28). (28) ке» заміна Ага" «да: «гаї» ВАРІАНТ «2222 129).429) «о» ізамінат Аго" або "ТР" «фей «21» ВАРІДНТ «во» (32).35) «ОЗ заміна тн" «Ох «2232» ВАРІДАТ «2222 (33). (33) «розг /замінат зе" «ВО «2212 ВАРІАНТ «гра 37).437) «Дега» ізамінах"сів" «Дей гаї» ВАРІАНТ край» (45). (44) «ге» ізамінах"Це" «Род «221» ВАРІАНТ «Рад (47).(47) «Кр» заміна че" «ОО «яд ВАРІДНТ «да 50). (50) «раз /замінаж"сіц" «до ра12 ВАРІАНТ «дозі (81) «23» ІЗамінах"дари" «гОх «21 ВАРІАНТ «222 (57 (Б «З» /замінах"Це" «000
«ові» ВАРІАНТ «фо» (88). (05 «ва» /замінах"А" «рад» і «раї» ВАРІАНТ край» (683 (88) «веЗ» ізамінає"тии «го» краї» ВАРІАНТ кг» (92).(92) «рез» заміна Ав" «ЙО» «б21х ВАРІАНТ «рда (83). (98) «2232 іЗамінає"Тун" «220х «0212 ВАРІАНТ «Зра(85). (95) «реЗізамінає Гув" або нів" «вад «221» ВАРІДНТ «ра» (95. (96) «23» ізамінат РІ" чо «221» ВАРІАНТ «да 97 «фрез» заміна" Тр" «20 «212 ІНША ОЗНАКА «ваш» (3. АЛО8) «223» ізамітках" Варіантні залишки, надані в паслідовності, не мають перевагу по-відношенню до тих, які в коментарях для варіантних положень" «АООз 35
Бег Бек сів ец Тпг сп. Авр Бгто ліва Уа ек Маг Ага Сец Аг бій: 1 5 о 15
Ти Уві Аг Пе Те Сув СЗіп Су Ар Бег Гео Тег Баг Гуг Туг Ага -
Зо
Авп Тер Туг бій Нів Гув Рго Зіу Сіп Аів Рго Уаі йеч Ма! Меї Тут
Су був Авп Авпо Аг то Беном Ма! Рго Аво Аг Ре бЗегону 5ег 5О 55 во
ЗегБегОїіу Ази ТНг Аа Вег Гец ТВг Не Те іу Аа (іп Айва Сі 70 75 но
Авр Сів Аа Авр Тут Тут буз Аєп бЗег.Аго Авр Заг Бег Зіу Ав Нів 85 90 95
Уа! чаї Ре Зіу Сіу Сіу Твгіув бец Тв? ма рев 100 105 «рій З «1121 «192 РЕТ ко13» Ното зарієпе «йо «2212 ВАРІАНТ «ай (8) кгеЗ» ізамінак"Ага" «0» «221» ВАРІАНТ кора»). (7) «Фа» заміна Аг" або ТА «вах кр212 ВАРІАНТ «208» (103-510) «2232 /замінах"Тні" «во «212 ВАРІАНТ «вра (1) «гг» ізамінах бе «рий» «2215 ІНША ОЗНАКА «дао «беЗ» /заміткак" Варіантні залишки, надані в послідовності, не мають перевагу по відношенню до тих, які в. коментарях для варіантних положень" «400236
Оп СУ Авр Зегі ву Тпг Бег Гуг Туг Ага Аби і 5 1а «103 «1 «212» РНТ «213» Ното варівель
«ех «9212 ВАРІАНТ «дет «9232 Ізамінах су" «2202 «2215 ВАРІАНТ «222 (3). «2235 ізамінаж'Авр" «80х краї» ІНША СЗНАКА «ад «г2З ізаміткає" Варіантні залишки, вадані в послідовності, не мають перевагу по відношенню до тих, ях) в коментарях для варівнтних попожень" «003
СУ Гуз АвпоАви Ага Ріо Бег 1 5 «2102-38 «ейії12 1 «ато РАТ «ф132 Ногао зарівпа «ДВО «б215 ВАРІАНТ «гар» (в) (5) «РОЗ» ізамінах "дви" кре «ве12 ВАРІАНТ «22248 (8) «23» /замінає"тТвг" «00» «2912 ВАРІАНТ «ей» (83.8) «ти32 Ізамінах ув або "Нів" ко «221» ВАРІАНТ «ТОВ (838) «З» замінактро" «реОх «рр» ВАРІАНТ «02» (10)::(10) «оиЗізамінае тр" хво . «ве 12 ІНІВА, ОЗНАКА «ай 1) «года» замітка "Варіавтні залишки, надані в послідовкості, не мають перевагу по відношенню до-тях, які в коментарях дпя варіантних положень" «400» 38
Авп о Бег Ага АвроЗег Зеє Спу Авп Нів Уа! Уві 1 в 10 «10559 «211 123 «12» РЕТ «3» Ното варіепе «а0о» 39 сів ма! Сіпіеи ма Сі Зекоїу Аа юю Ма узі ув Рго Сбу баг 1 5 10 15 зЗегУві Був Ма! бек Суб ув Аа Бег Су Сі ТНгРпе Зег бе Туг
Зо
Аа Ме Зег Тр Уа Аго бій Ага Рто Сіу Зілеіу бе Си Тр Ме!
СУ Агу Пе Ме Рго Не ем су Ти Бе АвпоРуг Аза Сіл ув Ре що 58 во сіл Су Агу Ма! ТВ Пе не Аа Ар и Бег ТНг бег ТАг Авіа Туг 65 70 75 во
Меї бініев Заг Зегієи Аг баг Си Авр Тиг Ага Уві Туг Тут Сув 85 0 95
А Аго Ага Зег вт Бец Ав Ав Аа Азр Ага у Аза Рне Авр Пе 100 105 т
Тів Сх Сік Су Тог Мега! Тиг Ма! Бе бет 115 120 «51040 «21125 «2125 РК кв135 ото варієпь «дО» 40
Зег Тут Ада Не Бег 1 5 «1» а
«1 15 «ета» РАТ «13» Ното зарівла «4005 41
Аго Пе Пе Рго Це бен слу Те Зег Ав Туг Ада сніп був Ре (іп 1 5 40 15 у «2102 42 «11514 ке102 ВТ «га» Ното заріепу «АПО» 42;
Агу Заг 5ег ви Ав Ада Ав Авр:Атго Су Аа Рпе Аєр Це 7 5 10 «210283. «ші11и7108 «212» РАТ «13» Ното зарівпе «Ой» 43
Бех Заг іш і еи Ти сп Авр Рго Ага Ма! Бег Маг Аза Ге у сів 1 а то 15
Тег ма! Ага Не Твг Сувій іу Авро Бек ви Ага Бе Туг Туг Аа 275 Зо
Зег Тер тугою Сів Гуз Рго БІ Сп Ав Ріо Марлен ма! Пе Тут су ув Азп Ап Аг Рго Вег'сіу Пе Рго Авр Аг Рне Заг су Заег
БО БЕ во
БегБег Бім Азп ТНг Аз Зег Бец Тпг Не Тік Су Аа іо Аза Су 70 7 во
Авр и Аа Аво Туг Тут Суз Авп.Зег Аго Авзр бег Зег Зіу Аеп НІВ 55 за 95 ма! Уа еле сіу ЗУ Сіу Тнг ув беч ТА Уві бе ен 105
«2» 44 «122 РВТ «2132 Ното варієпв каро» 44 бів Зіу Авр бег ей Аго бет Туї Туг Аа Зег ї 5 ій «ФО 45 «її ке122 РКТ : ке1 3» Ното заріептв «4005 45 су був Авп Авп. Ага Ро Зег 1 а «210» 48 «2112711 «182 РВТ «2132 Мого варівпе «400» 46 лап Баг Агу Авр.Бег Заг у Ав Ні Уві ма! 1 5 ю «1047 «112123 «2122 РЕТ «2132 Ното заріень «20 «ре1» джерело «о» /замітках ВБОЮВІВ М «400547
Сіу Ма! Сіл Ген Уві іп беєсіуУ Аа Сію Бей суз Су Рто чу веї 1 5 то 15
Зег а! був Ма бегСуві уз Аа Зег У Сіу Ті Рпе бЗеє зег Тут 0
Ага Ме Бег Тгр Уа) Аг «3іп Ага Рго Сіу Сля Сіу Гви СІЮ Тгр Ме!
АБ су Аго Це Ме Ро Че ем Сі Таг бек Ап Буг Айва Сіп ув Рне: 5О 56 во
Сів Су Аг Уаг ти Не ТБ Аз Авр.Сю Ага Тв Бе Те Аа Туг
65 70 75 80
Мессі еш бег Заг Гей Агу Бек Азр ТА Ага Май Тут Туг Сув 85 зо 95
Аа Ага Ага его гео Аа Ма ма Авр Аг ЗУ Аа Рре Ав Не
ТО 105 ча
Тв Су іп су. Тв? Мег маІ Тиг Уві Бег бег 115 120 «210248 «2112192 «та РиТ «213» Ното заріюпе. кАпОо» 48 сп мае без ма сі Бех су Аа В ма ув | ув Ро Су бЗег 1 5 10 15
Бег Уа ув Уві Зег Сув І ув Ав Заг.О1у Сіу Так Рне. Су Рг Туг 20 95 Зо
Ваг Пе тиг Тер Уві Аг біт Аа Ртго-Зіу (Зіп Су Кеш ім Ттр Меї 35 40 45 су Авре уві его Це епе бу ТНт Рго Ави Тут Ав ой Аво Ре 50 55 ГІ) сп у Ага ма! ти не сек Аа Авр Уві Баг Тл Ззег Те Ма) Туг 85 70 75 во
Меї Сі їеу бег бебі ви Аго бЗеє ін Авр ТАг Аа ма! Тук Туг Су 85 90 95
Аа ув Ага Су Бег Туг Туг СЛУ Агу С5у Су Ттр Ре Авр Ро Тр 190 105 110
Сіу Ага су ТнбСец Маг тік Уві! Зег зег 120 «210549 «115 «ва вт «2132 Ното варіень
«00» 49
Тег Туг Вег Пе ТНг
Ц 5 «102 50 чИ11 1 «12 РТ «213» Ното зарівн: «00 БО .
Азр Пе Маї Рго Пе Ре Сіу Тиг Рто Ава Тус Аа іп Авп Рей 1 5 10 15 су «РіО В «В115 15 «во» РАК «213» Ното зарівие «400» 51
Ат сіу Бег Тут Туг Сіу Ага Су сну Тгр не Ар Ро 1 5) 10 «210252 «11 і22 «12» РЕТ «різ» ото варінйа «400» 52.
Сп Ма! біо бен Уа! Сі Зег сну. Аа Сн Уа! уз був Ро Оу бег і 5 тю їв
Зег Уві ув Маі Баг Сув ув Ав Бег ЗІу Бу Тег Рне Су Тпетуг
Бег Пе Тл Тер Маї ка іп Ав Рго Су Зі СУ ец З Тгр Мей
За 40 45
ФУ Авр Пе Уві Рго Ле Ре Су ТНК Ро Ав Туг Аа бій Ав РНе
БО 58 во сій у Аг уаї Тіт Пе бе Аа Авр Ма! Беє Тит бег ТА Ма! Туг 85 70 75 80
Мессі єи Зегзегсіє) Ага зег ов Аве пт Аза Уві Тує Туг був
85 90 95
Аа був Аго (зу Зег Туг Буг іу Ага Сну сту Тгр Ре Авр Рго Тер 100 105 то іх Аг ЗУ Твгі ву Уві ТАг Ма бег Бех 135 120 «212 83 «й» В «1223 ВТ кола» Ното заріога «4005 53
Тег ту Зег Це Тег 1 В «210254 кої «1» РТ «й13» Ното заріете «400» 54
Авр Пе Уві Рго Це Ре. Су ТАг Рг Авт Туг Ла бій Авп РвВе ів 1 5 10 15 оіу «210» 55 «11213 «ох Вт «13» Ното варіепа «Ох 55
Ага У Зег Туг Тут СУ Аго Сіу Су То Єре Авр Ро 1 З 10 «10» 56 «112 50) кв12» РЕТ хе13» Штучна послідовність «ва? «212 джерело «2232 замітка пис штучних послідовностей: Синтетичний поліпептид" дО»
«Рі» ІНША ОЗНАКА кад» (1). (50) «виз» ізаміткат Дана послідовність може охоплювати 1-10 3 У Су Су Бег повторювальні бриниці" «00» «21» джерело хг» /замітках Дивіться опис як подана для детального опису заміщень та переважних варіантів здійснення" «ад» 58 сі у у Оу Баг Зіу Лу сту Су Берг зу сіу Су сну Бег (у 1 5 10 15 "Зіу біу Сіу Бег біу Спу Су Су бег Су СУ С1у Су бег біу ЗУ 290 25 Зо
Оу су Зег Сіу Сіу Сх ім Бек Зіу сСіу Сіу Су ЗегсМу ЗУ су 35 «0 аб
Оу бег 5а «вій»? «Ві» 15 2 РТ ке1Т3» Штучна послідовність «20» «Рі» джерело «ра» ізаміткат "Опис штучних послідовностей: бинтетичний пептид" «4005 57 шо
Сіу біу біу біу Бек су Сіу Су Су Зег у (ЗУ СУ сту Баг 1 5 Іо; 15 «210» 58 «Ті» 98 «122 РТ «132 ото зарівйе «ад» БВ
Сію ма сій Сені є ім Зег Сіу пу Су Се маг ой Рго Сіу сну і 5 10 15
БегІГеи Аг Гей бег Суз Аа Ав Заг су пе Тиг РНе Зег Зег Тує
КІВ)
Аа МесЗег Ттр Маї Ага Сп Аа Рго Су ув Сиу її ва бін Ттр Уаї
За 40 45
Заг Аа (є Заг Сіу Бег ЗУ Су Зег ТА Тук Туг Аза Авр Зег Уві 50 55 50
Гу СІУ Аго РНе- ТнНе Пе Зег Ага Ар Ав Зег був Аби Тиг ей Тут 685 то 75 во
Її ву бів Ме Аеп Бег Гец Ага Аа Су Дер Тім Ага ма! Туг Туссбув 90 95
Аа кув «10259 «112 1 «122 РТ «віз Ното заріеп: «Ада» 59
Тго у Сів Оу Те Твг Ма! Тег Магбег Бег ї 5 то «2105 80 «118 02 «12» НТ «2132: Ното варієпв «АдО» во сп Ага Уа ен Тег сі Рто Аа Зегі ви зе Аа Зег Рго чу Аа 1 5 нів; 18
Бег Аа Зегі ей ТигОув Тпгі є Аго Заг у Пе Авлома! Оу ТА 75 30
ТуУгАто це Тук Тр тує Зіпй сп був Рго Су заг то Рго Зп Туг 38 40 45
І еи ви Агу Туг Гуз: бег Авр Зег Авр і ув біп Сіп Оу Бег пу Ма!
БО 55 во
Ето бег Ага Ре Бег Оу Бег і ув Авр Аа Зег Аа Ав Ага сту Пе 58 70 75 І5-в)
Геміви пе Бегсіу є іп ех си Авр МО Аа Авро тує Туг Сув 85 90 95
Ме Пе Ттр Нів Тгр Уа!
«рові «11 «2122 РЕТ «213» Ното зарієпе «дО» ві пе су у Су Твгі уз во тик маг бей

Claims (20)

1 5 10 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, що зв'язується з людським а-синуклеїном, де антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент включає: а) три СОК важкого ланцюга, які мають послідовності: () Н-СОКІ з 5БЕО ІО МО: 5, (і) Н-СОКЗ2 з ЗЕО ІЮ МО: 15 та (ії) Н-СОКЗ з ЗЕО ІЮ МО: 16, та р) три СОК легкого ланцюга, які мають послідовності: () Ї-СОКІ1 з 5ЕО ІО МО: 20, (її) І-СОК2 з ЗЕО ІЮ МО: 10 та (ії) І-СОКЗ з ЗЕО ІО МО: 21.
2. Антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент за п. 1, що зв'язується з людським а- синуклеїном з Ко менше ніж 500 пМ.
3. Антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент за п. 1, що знижує перенесення а-синуклеїну від клітини до клітини іп мімо.
4. Антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент за п. 1, що зв'язує людський а-синуклеїн, але не людський р-синуклеїн або людський у-синуклеїн.
5. Антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент за п. 1, що зв'язується з людським, щурячим та яванського макаки а-синуклеїном.
6. Антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент за п. 1, що включає варіабельний важкий ланцюг, який містить амінокислотну послідовність, яка є щонайменше на 90 95 ідентичною до амінокислотної послідовності 5ЕО ІЮО МО: 14.
7. Антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент за п. 1, що включає варіабельний важкий ланцюг, який містить амінокислотну послідовність, яка є щонайменше на 95 95 ідентичною до амінокислотної послідовності зЗЕО ІЮО МО: 14.
8. Антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент за п. 1, що включає варіабельний важкий ланцюг, який містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 14.
9. Антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент за п. 1, що включає варіабельний легкий ланцюг, який містить амінокислотну послідовність, яка є щонайменше на 90 95 ідентичною до амінокислотної послідовності 5ЕО ІЮО МО: 19. Зо
10. Антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент за п. 1, що включає варіабельний легкий ланцюг, який містить амінокислотну послідовність, яка є щонайменше на 95 95 ідентичною до амінокислотної послідовності 5ЕО ІЮО МО: 19.
11. Антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент за п. 1, що включає варіабельний легкий ланцюг, який містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 19.
12. Антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент за п. 1, що включає важкий ланцюг, який містить амінокислотну послідовність, яка є щонайменше на 90 95 ідентичною до амінокислотної послідовності зЕО ІЮ МО: 12.
13. Антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент за п. 1, де антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент включає важкий ланцюг, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО І МО: 12.
14. Антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент за п. 1, що включає легкий ланцюг, який містить амінокислотну послідовність, яка є щонайменше на 90 95 ідентичною до амінокислотної послідовності зЕО ІЮ МО: 17.
15. Антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент за п. 1, що включає легкий ланцюг, який містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 17.
16. Антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент за п. 1, що включає варіабельний важкий ланцюг, який містить амінокислотну послідовність, яка є щонайменше на 95 95 ідентичною до амінокислотної послідовності 56 ІЮ МО: 14, та що додатково включає варіабельний легкий ланцюг, який містить амінокислотну послідовність, яка є щонайменше на 95 95 ідентичною до амінокислотної послідовності 5ЕО ІЮО МО: 19.
17. Антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент за п. 1, що включає варіабельний важкий ланцюг, який містить амінокислотну послідовність 5600 ІЮО МО: 14, та що додатково включає варіабельний легкий ланцюг, який містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 19.
18. Антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент за п. 1, що включає важкий ланцюг, який містить амінокислотну послідовність 562 ІЮ МО: 12, та що додатково включає легкий ланцюг, який містить амінокислотну послідовність ЖЕО ІЮ МО: 17.
19. Антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент за п. 1, що є антитілом.
20. Антитіло за п. 1, яке включає І 234Е/ 235Е/Р3315 потрійну мутацію в Ес-ділянці. 2 її я М ж що о х 5. с я г ЩЕ ю юю й Б А й М ДЕК пива ЕМ 5, Кк вом |В / ЕЕ А ж ШЕ 5 ЕЕ 8 і З Е і й ц ня ОК Ди х 4 ї- о М я 5 й й - їх Б що я є ! Є бак
Фіг. 1
81: в. ЕІ: ЖЕ ЗИ м КІ: ЩЕ 5: г: шо: ЩЕ ВІ: ГЕ ВІ: й: ВІ: і 8: т: В: х: ще п: І: ВІЇ НЕ БІ: 1: :: ВІ: В: Це: І: Ше: КІ: Б 5; :: ЖІ: «з 85 ех зок ГА Не в 1: НЕ «є БІ: м р: х: ме І КЕ ЩІ: 8 І В і ж Гл: РРО ЩІЇ ВІ: і; 1: І; г: АВ І: І: НЕ 1: :: «НИ І: ек І: "ШЕ а "й і, Кк ЩЕ І: ни у, в ІОВ» І НИ КЕ І й І і: ЕЕ чик ці НЕ Зк о «ож жк хі ШИЯ та те с Ї54 й д в г КЯ 1-8 я 5 8 8 іа І їх ка с се ее ЕЕ КЕНЕ БИКА ей ЯВНІ див
Фіг. 2 ве Ве Бя 8е Я» Ча їе й Че Ям й Ян 8я Вей Я. Де Я бе Вей Ще Ви оби 0 В» бе ні Ва Де Ва с б с» бе Ще би Ве бе Фердо Де В» ба бе бер о Ян Як Ше йе ЕЕ Ве Вк Юм Як Он Всі Че Я м бе йо бе де бе ве Ве Ка фе де бе до й й» Й з Зе би ба Зк ба йа бе бе Д»" Ме Ве й 8 Бо йо дя де бе Ян Як дно» Й Бо бе Я й м Я ж Че Ва бе Че Ве» бе м бе ве є В Як Де Я Ди Я К» Бо Да В в й
Фіг. ЗА
З« Ям б» Як Де бе І ба б й ба Ям Ве бе Що х бе дя Я Я» Б» Я хі В не Ка Я ре ВЕ Ве Ве В ВІ Ка Вк В я» в» Ко Яа Ве Ве бо бо бо Шж Ва бе В в В м Я Я Я» Ве Бе Вк Де ба бе ба Як Ме бе Шк бо ба бе Во
Фіг. ЗВ рій Саме ж «ки ТИ Во МУ Ах ши ЕЕ я Ж ВЛ й й ШЕ г З А мім МЕ зе з ва М а» ше і АШЕ ЗІ а КЕ: Же й чи че ва мя ще що 9 ГІ з їх еще кі вх їм іх ж Б ве ні кі що ми в в ве ше міш в вк р» М їв я А ще те: ще ГЯ п Б ТК, й ка мін в Ж Фі (8 зі їв (а ня ге я ББ Ес ск їх в Кк т ше ка Я Щі ч В с Шкеня ре А; шт ТОЮ яю ах ах гу ве - ЯМ и Я в 3 і в м ш те 4 тей І зр 301 5 Би м ще о ци ан дн» в їх Го а і Ех Го Бі
Фіг. 3С мів ж! що Фе я ме ЗУ! мклщ 3 ; міх ЩІ в І: : їв бе Е м їх ЕЕ жк ве гу В дм» ві й За щі ше вве ФО з чЩИЩ Кійе : не ще що ї5- ні і І ке ге) ща КЕ ОБ щі )
5. еВ ух й їх - що ож кій й я Ме що Са 5 5 ЕН ев Я ва ШЕ шИще в ше У й 2 з міш! бо ям в. ЩЕ ЕЕ й між дек в з 5 МІК Ве оф ок ЗА ШЕ Фон ож З Ж ле хо Кох их ти т ши й» Як нку « "р трон ее моїх ш в - ве Ку - Фе г. а « ія
Фіг. 30
НЕ. З ШИК заУпОщІ в шщ. Бе щЩ У ППИТИИШИ З ПИЛИ а І ВЕ БЕ ЗБ
В .. щ КЕ й шк с ре ши -. не ; Ф за х ЕЗ ей я евузіипсще КІ в ,. ШО зом поні Я її ш в чи уч - нич є. Е о, І М а Є м М « Ма ї с в я осевув і чпсяе
Фіг. 4 Ахів452 ппі-3 Азіо 543 зв З з ї») вобдодаове тя. дефіначна-яу в до ж ші з. з Ж за ту, я 5 Є е вва Я ет ха -, ( і «84 Я Ве Бу» х 5 рого Завнва Зуг зе ХЕ і йе сзащае ув ОЗ аа арка вує че ОК вм дова хук х. - 284 й з жвя я Ж | М. ж Д з - -В "ня в -Ж -В -К -В В -В -ї «ж 8 бор був МІ Бо уві ІС5О (пМІ) Абіо452 прі-3 Агіо5аЗ «ве Веїа-5уп Мі МІ ев Запта-5уз М МІ «ве Аірпа-5уп 5.7 2.0
Фіг. 5
Авіо452 паьі АвіоваЗ 225 1328 Б ні Жх Б ш- ча З ва ех є. а Б ре Суволюваєу ДУ я ! шх - 49 в Ва АЮЬя бу» | че НЯ жа: в стев'Аювьз бум УФ 9 а м нетаваюах дує я ге Калювазує У, Ж ЯК ометав Афве Був Ж. г ЧК Ноюза Араж бух а. «І «й «а «в «х - - - 48 -2 «й у -й «В Ка зЗув (8 са бЗуя ЦЕХ ІС50 (ПМ! деіо452 прі-3 Агіо543 -же Супо суп 58 2.1 -ек МЕ еезуВ 15.6 3.8 «вк Нитав а уп 5,7 2.0
Фіг. 6 вто БНВУЗУ І ! Е /; | нива ой еко Наказом Ронкопнвних с р ! А ! а І нини чи І у 1 у звупОдв8т й да Й я їч ! 1 і і Ме ж и ми зи Зал пив зах. вІмаьнюрх ре ях нні
Фіг. 7А
Вт-2о вВнА.вБуВу хо Я ЗУ СК щ ех опитикове нео сб ДТ нн | ЧАВВ; вобантник Медре з КО СО ооо М УТ нта кл днк СК ХК чл... Я яфре вової ай с М и Фа МИ ! їн : с се котки - чі заюб543 - Б ! Кк І ше роодохюсонкюк - м о Сев5 зізле
Фіг. 78 ваовоб ! Шк дода восової ок ЩІ Мопотег й я в м Вівик 5 о в В зооюю3 0 г з і с ЕЕ: ш г с ім... С НЕ ні : Я ки ни фе т Кі й Сіюпею
Фіг. 8
ОХ хх х і ОК :
и . КУМОКК ОК В ОО М о. Ох М п с с с її. с с її. г . . . КО У Ко ВОВКНКХ Око
К. с с 0 ОО Б о. о.
- Б. о УК а МО А ОО о ОО М ОЗ 5 шо. і шо в о. ни о п. с Зо в іч . с п. КО сс ху нен дКХ ЗК ОО МОХ М .
о. -- оо ще пи»
її. ня ПЕВ МКК 5 ОКО з ОЗ Бе пли М Ки КОКО З Є Бе й о ПАК и ще о. и о М що й 5 5 ЗК 5 Ох ГЕО 0 - п. Я. сш о. о: он я п х ЩО чн о . - о.
Ше. п. с . ос ши п В, ОХ о. 5 Бе: ЗИ а й. М . о.
Фіг. ЗА
ОО 3 х ХХ . п с ОК . у о. о. о . . . ще З о М Б ХХ о ее «В о. НН о о . є о. нс І х ОКУ ОКО ОХ КУ ж КОХ БО о
Фіг. ЗВ Фіг. 90 00025003 / авіодя52 прі-3 шк ; | т Зб дО - -о- ВШ Є і кре: ШЕ ЧЕ Е- чо09 - їй я во -- й - й (ПО - 5 рео 12 34 856 7 8 9 Впоиге айег йобе
Фіг. 10А ш 829 а 500452 ПЗ Е534 Ї - І еВ щі ї зотвв ЕВ (- м "їх : пиКфтенетя Я - Ї т врии ри ва М Кі т вх БЕН 6 дв рей 1 2 3 4 85 б 7а о ВПоцєз айег Яове
Фіг. 1085 д рова Ки)
п. ЖК є й -- чжаке ср Тк ще І з Зник ЕГО тя золюжу З КО. 8 --- ЗО яру - ор) -е Те о пн вв -- 100 толо на» ау ау? «аву Пперони бихизіаує айег оз) Єбозе 0) "ШИ й. яв | -- чейісів
5. : ; ЕВ ню «з Зедю с НО Г сення " пиши - ток й от Кк пе сон мин нин З -- З така ЩІ Су нн -- 100 пхука БЕ ох І Ше сне ВОВНИ с 208 дауї бву? дау4 ііперони (пошті іаує айег йове)
Фіг. 11 д Моп-напзцпепіс ЄСопітавтекаї ірейзієга! ес Ох Б. її ОХ . в Я паро с . 5. . Ног-в Нівросвнорх Пра) ї НТ понев т І ши ще . Щ ше с го щу р ерекот) і 5 . с пе ВД ші 5 і. у. і» ще БО ФА дп
Еш. с! п. же
Фіг. 12 д Моп-тапзаепіс Сопнаавга! Ірейатога! ЕН о Г і і Ос п пф НЕ і м г в, і І с с ЧИ ш 5-3, о. Бані КЗ Е ПОКЕеКК МУ МУК ов ши й. й щ . ) леж ї ОЗ ЗУ Я ОХ М ЖЕ МКК і у МК ПЕ ПІШЛИ Н
0. с ! і |і в ВН ТК, п ох ї . і і гг» и ! й ово о В ! ж с о Ко ха ж ОВК СЕ КО КУ і 0, о я | ші 'бт т ти Вот зн мм - Щі х - й с | х Б. Я Я ше спіанттця х преси ХК ОВ ово овкоссовосе ЩІ. й ОК БОБ ПЕ і МИ МК ММ хі мех М КМ НК: я С ване іі й и. і ай о. т Чай І дя ВІН КИ КИ с Еко | вві і мм я я а | ! 8 опе З п І
Фіг. 13
А М - оп-ігапздепіс сосопех Нірроса І Нрросатрих с ОК я ВК Б в о До шк Ж с ос Е те ші КО пк. 5 с тв щ п полонин шннннниння Е НН сн вскив он века і т. ші сх с ще у . с 5 й З ОО ще с вс ві фони . с я тт - сон нон і. т с ії посттеентет ско с МУ о. по КОХ Я с ПУ неповне хе МОХ АВК ЗУ УКХ х о х х с г » етос сте ЗКУ Х МУК Я Ж : їх т п ЗК ЗОВ зе с Її | як :
з. о . с Я | з5се ВН 25 о. З о. і І ВО а ! У а с о г. в с с "з Я с с м с шшнНн я ж й Фіг 14.
зуп : до исівїп сш опрНасга! Р 5 баже ШИ СОУ ще / і ж г пон он І в МОЖЕ о. я се " о В ши се КО ОО: х КК КОСУ ЗО Ди іш с-г г ї їж с ОО ОО т: Н с Бе 00: і с ХХ С хх Ох г КЗ с «о Нррозмириє рі (- с і а в і | г с М | 7 Ше: пн с І . ' ХК їх ОК - с с: | ні Ї ож с я -щ в . ; с п : | І. в с о: я | . си їй о. с ШЕ: і І я і г с вн І. о і її. ще с ш і КУ о: с о і. с : ЕК о. с З й м що с о с ; с ще КК МО Я пекнняни Їй с тя й і ТИ й де; о. їй я і и С ; В ще і о . о 5. щИ Й В що. с: І ; Ві о. . с но Н « це ОВ С З с М КОС о. У ОХ о п же І -- | ве і за ; с ШО я ХХ ВИ В ОК Ос са є ї і тет не З з ї с г шій ГГ : он МО ЗХ о хх Ї зав : я- . и; ЗА Б. МОЯ ХХ ХХ сх 19 ! і ща Б ! ї с . . о . у шо Бо що Х Б ОК ОКХ ; і КЕ ЕЕ . 1 о о. с Б -БЯ У в с о . ; з с З І : о. о. . й | 7 о г м я о ОКУ ї я СЯ я Кз
Фіг. 15 д ос-вуписівів пт РОТОР ИЙ ітд сюічююрйжки Сопітаатега! ірзйагегаї
ГГ. вгвув р ахопе Вей - п її. Кк : ї- КО ОБО ЗБЕ о ан КВ ЖЕ: З Ко: о. З о. ЗХ зОре З . з г її ! і . са нейе о. її. МЕ о. те щі ОО БО В З ОМ ІМ ь: Мн ВИШ чинни чини г о. . ой" З Ка ХХ ЗУ НН ох З . ОН С ооо ню КК ОКХ АК ЕД С її севуп ід ахопе (сопіга) вищ о. З в воно |і шк ге о ОО. В Ку, Ей оно сх и. і 5 ще . КЕ Но в МЕНШИЙ Е. ОБО Ех 5 ше же ше о 0: я еВ ПЕ ОКО і Шов КБ А 5 ши Ї НН у Кя Я яння я се ШЕ
Фіг. 16
Дросезун у пеогова (Меосопівх, рей) А а-вуписівіп 19 не) ск, КК "Трнеосопах Нірросанроє 5 з 00 00 Ше с ай Пеге те опи тет ооо тет овув пр аннконе Діірро, ІБ; п 0000 ще е с . с ЕД щу о. о ОО ш. с є СЯ з, 0000 000000 Шфадіннівнн ще о . . ТЗ . с
0... ССС | А ЕК 5 ХХ З я ся Ки й К я ве СЯ Я
Фіг. 17 ши Вин ни Шин, в ЕВЕТ зи Сеуріав ЖЕ «вм МЕС с Б Вуйднсе Вюф 5 Сотревбіюг Аірбазуласів 99 дл 294 е до | С ж Се в» ВорМОВІОці нег-авюйі52 поїз-півдсіТМ в во. «й АЗЮОЯЮ? пд МаЗі ТМ що 0 Ь В є Х тен МІРЗоВ пдДСТТМ в кх с. і ; а п а . - - "те 3 «В 25 г: ІЕС «В «Її -в ат Годо)
Фіг. 18
ААУ» дез ЛВ я екв т впоойейа 50 що у -ьо| 1 ю Ї ВЕС Біла Алінбетав Бе Атщітенва пав тав Діехатішеніо4ї? звоБаве»- ; ководе Ку С й т зо. я Ко де к- «вовав- Зх З г її ВОЮ й ше не яз ше ви ве Аніочу Сеопселітано й: «ке ВрВОВоЯ по ТМ те ОВЕН ОВЦ Ва аа паю ТМ таке МІрРОВО В ЕМ че ОВО о Ваз его п ТТ
Фіг. 19
UAA201811679A 2016-06-02 2017-06-01 Антитіло до альфа-синуклеїну UA124733C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662344746P 2016-06-02 2016-06-02
PCT/EP2017/063406 WO2017207739A1 (en) 2016-06-02 2017-06-01 Antibodies to alpha-synuclein and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA124733C2 true UA124733C2 (uk) 2021-11-10

Family

ID=59021492

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201811679A UA124733C2 (uk) 2016-06-02 2017-06-01 Антитіло до альфа-синуклеїну

Country Status (36)

Country Link
US (4) US10160800B2 (uk)
EP (2) EP3463435B1 (uk)
JP (2) JP7078552B2 (uk)
KR (1) KR102499438B1 (uk)
CN (2) CN109475616B (uk)
AR (1) AR108663A1 (uk)
AU (2) AU2017272804B2 (uk)
BR (1) BR112018074978A2 (uk)
CA (1) CA3025987A1 (uk)
CL (1) CL2018003438A1 (uk)
CO (1) CO2018014010A2 (uk)
CY (1) CY1124896T1 (uk)
DK (1) DK3463435T3 (uk)
EA (2) EA038358B1 (uk)
EC (1) ECSP18096095A (uk)
ES (1) ES2903402T3 (uk)
GE (1) GEP20217253B (uk)
HR (1) HRP20211935T1 (uk)
HU (1) HUE057214T2 (uk)
IL (1) IL263243A (uk)
LT (1) LT3463435T (uk)
MA (1) MA45125B1 (uk)
MD (1) MD3463435T2 (uk)
MX (1) MX2018014456A (uk)
MY (1) MY188183A (uk)
PE (1) PE20190440A1 (uk)
PH (1) PH12018502538A1 (uk)
PL (1) PL3463435T3 (uk)
PT (1) PT3463435T (uk)
RS (1) RS62682B1 (uk)
SG (1) SG11201810420YA (uk)
SI (1) SI3463435T1 (uk)
TW (2) TW202309093A (uk)
UA (1) UA124733C2 (uk)
WO (1) WO2017207739A1 (uk)
ZA (1) ZA201808582B (uk)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201512203D0 (en) 2015-07-13 2015-08-19 Lundbeck & Co As H Agents,uses and methods
MA46836A (fr) 2016-11-15 2019-09-25 H Lundbeck As Agents, utilisations et procédés pour le traitement d'une synucléinopathie
WO2018109058A1 (en) 2016-12-16 2018-06-21 H. Lundbeck A/S Agents, uses and methods
US10364286B2 (en) 2016-12-22 2019-07-30 H. Lundbeck A/S Monoclonal anti-alpha-synuclein antibodies for preventing tau aggregation
CA3051839A1 (en) 2017-02-17 2018-08-23 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies to alpha-synuclein and uses thereof
GB201720970D0 (en) 2017-12-15 2018-01-31 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
GB201720975D0 (en) 2017-12-15 2018-01-31 Ucb Biopharma Sprl Anti-alpha synuclein antibodies
US20210347868A1 (en) * 2018-10-19 2021-11-11 Gabriel Pascual Anti-synuclein antibodies
TWI734279B (zh) * 2018-12-14 2021-07-21 美商美國禮來大藥廠 抗α-突觸核蛋白抗體及其用途
EP3956027A1 (en) 2019-04-18 2022-02-23 AC Immune SA Novel molecules for therapy and diagnosis
CN110172098B (zh) * 2019-05-27 2023-03-10 长春工业大学 抗α-突触核蛋白的单克隆抗体及其应用
WO2021055881A1 (en) 2019-09-20 2021-03-25 Denali Therapeutics Inc. Anti-alpha-synuclein antibodies and methods of use thereof
KR102239512B1 (ko) * 2020-09-10 2021-04-12 서울대학교산학협력단 다중기능성 마이크로캡슐 조성물 및 그 제조방법
EP4229082A1 (en) 2020-10-16 2023-08-23 AC Immune SA Antibodies binding to alpha-synuclein for therapy and diagnosis
CN112920274A (zh) * 2021-03-17 2021-06-08 江苏贝格尔生物医药有限公司 一种检测alpha-synuclein蛋白的鼠单克隆抗体及其应用
CN113912716B (zh) * 2021-12-15 2022-03-01 北京凯祥弘康生物科技有限公司 针对α-突触核蛋白抗原的抗体及其应用

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001066754A1 (en) 2000-03-03 2001-09-13 Cambridge Antibody Technology Limited Human antibodies against eotaxin and their use
CA2441903C (en) 2000-05-26 2012-07-31 National Research Council Of Canada Single-domain brain-targeting antibody fragments derived from llama antibodies
EP1309341A2 (en) 2000-07-07 2003-05-14 Lars Lannfelt Prevention and treatment of alzheimer's disease
US20080014194A1 (en) 2003-10-31 2008-01-17 Elan Pharmaceuticals, Inc. Prevention and Treatment of Synucleinopathic and Amyloidogenic Disease
WO2008103472A2 (en) 2007-02-23 2008-08-28 Elan Pharmaceuticals, Inc. Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
US9034337B2 (en) 2003-10-31 2015-05-19 Prothena Biosciences Limited Treatment and delay of outset of synucleinopathic and amyloidogenic disease
TW200509968A (en) 2002-11-01 2005-03-16 Elan Pharm Inc Prevention and treatment of synucleinopathic disease
US8506959B2 (en) 2002-11-01 2013-08-13 Neotope Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
US7358331B2 (en) 2003-05-19 2008-04-15 Elan Pharmaceuticals, Inc. Truncated fragments of alpha-synuclein in Lewy body disease
ES2640669T3 (es) 2003-05-19 2017-11-03 Prothena Biosciences Limited Fragmentos truncados de alfa-sinucleína en enfermedad con cuerpos de lewy
WO2005047860A2 (en) 2003-11-08 2005-05-26 Elan Pharmaceuticals, Inc. Antibodies to alpha-synuclein
MX2007001679A (es) 2004-08-09 2007-05-23 Elan Pharm Inc Prevencion y tratamiento de la enfermedad sinucleinopatica y amiloidogenica.
EP1943341A4 (en) 2005-09-27 2010-07-07 Ca Nat Research Council HEMATOENCEPHALIC BARRIER EPITOPES AND USES THEREOF
US8147833B2 (en) 2007-02-23 2012-04-03 Neotope Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
JP4934074B2 (ja) 2007-03-07 2012-05-16 株式会社アルファ スイッチ固定構造
JP5747414B2 (ja) 2008-04-29 2015-07-15 バイオアークティック ニューロサイエンス アーベー α−シヌクレイン関連疾患についての治療および診断方法における使用のための抗体およびワクチン
PL2949666T3 (pl) 2008-12-19 2019-07-31 Biogen International Neuroscience Gmbh Ludzkie przeciwciała przeciwko alfa-synukleinie
JP4654348B1 (ja) 2010-02-23 2011-03-16 多摩川精機株式会社 検出装置用巻線の正弦波巻線方法
CN106397588B (zh) 2010-02-26 2020-09-08 生命北极神经科学公司 原细纤维结合抗体及其治疗和诊断帕金森氏症、路易体痴呆和其他α-共核蛋白病的应用
SI2723379T1 (sl) 2011-06-23 2019-03-29 Biogen International Neuroscience Gmbh Molekule, ki se vežejo ma anti alfa-sinuklein
JP5775974B2 (ja) 2011-10-28 2015-09-09 プロセナ バイオサイエンシーズ リミテッド アルファシヌクレインを認識するヒト化抗体
UA118441C2 (uk) 2012-10-08 2019-01-25 Протена Біосаєнсиз Лімітед Антитіло, що розпізнає альфа-синуклеїн
US9534044B2 (en) * 2013-02-28 2017-01-03 United Arab Emirates University Alpha-synuclein antibodies and uses thereof
CN111499743B (zh) * 2013-11-21 2024-01-12 豪夫迈·罗氏有限公司 抗-α-突触核蛋白抗体及使用方法
US9938356B2 (en) 2014-11-10 2018-04-10 Medimmune Limited Binding molecules specific for CD73 and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
MA45125A (fr) 2021-06-02
SI3463435T1 (sl) 2022-02-28
TWI765890B (zh) 2022-06-01
CN116120445A (zh) 2023-05-16
HRP20211935T1 (hr) 2022-03-18
US10160800B2 (en) 2018-12-25
CN109475616B (zh) 2022-10-18
JP2019527194A (ja) 2019-09-26
US20190276522A1 (en) 2019-09-12
GEP20217253B (en) 2021-05-13
AU2017272804A1 (en) 2018-12-13
CO2018014010A2 (es) 2019-01-18
EP4000632A1 (en) 2022-05-25
MA45125B1 (fr) 2021-11-30
AU2017272804B2 (en) 2023-11-23
US20210179698A1 (en) 2021-06-17
CN109475616A (zh) 2019-03-15
SG11201810420YA (en) 2018-12-28
EP3463435A1 (en) 2019-04-10
JP2022110117A (ja) 2022-07-28
ES2903402T3 (es) 2022-04-01
TW202309093A (zh) 2023-03-01
MD3463435T2 (ro) 2022-03-31
CL2018003438A1 (es) 2019-03-22
MX2018014456A (es) 2019-08-12
BR112018074978A2 (pt) 2019-03-12
LT3463435T (lt) 2021-12-27
KR102499438B1 (ko) 2023-02-14
DK3463435T3 (da) 2021-11-22
WO2017207739A1 (en) 2017-12-07
EA038358B1 (ru) 2021-08-13
EP3463435B1 (en) 2021-10-13
US10889639B2 (en) 2021-01-12
EA202191380A1 (ru) 2021-08-26
CA3025987A1 (en) 2017-12-07
ZA201808582B (en) 2021-08-25
IL263243A (en) 2018-12-31
MY188183A (en) 2021-11-24
AU2024200601A1 (en) 2024-04-18
PE20190440A1 (es) 2019-03-27
TW201802119A (zh) 2018-01-16
PT3463435T (pt) 2021-11-22
RS62682B1 (sr) 2021-12-31
US20230331830A1 (en) 2023-10-19
US11560424B2 (en) 2023-01-24
EA201892548A1 (ru) 2019-06-28
PH12018502538A1 (en) 2019-04-08
HUE057214T2 (hu) 2022-04-28
AR108663A1 (es) 2018-09-12
JP7078552B2 (ja) 2022-05-31
ECSP18096095A (es) 2019-01-31
US20180002411A1 (en) 2018-01-04
CY1124896T1 (el) 2023-01-05
PL3463435T3 (pl) 2022-02-14
KR20190013923A (ko) 2019-02-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA124733C2 (uk) Антитіло до альфа-синуклеїну
US11180545B2 (en) Antibody-based therapy of transthyretin (TTR) amyloidosis and human-derived antibodies therefor
US20230295297A1 (en) Anti-trem2 antibodies and methods of use thereof
US20200299397A1 (en) Blood-Brain Barrier Shuttles Containing Antibodies Recognizing Alpha-Synuclein
US20170210799A1 (en) Anti-ror1, antibodies, ror1 x cd3 bispecific antibodies, and methods of using the same
CN107074956A (zh) Cd123结合剂及其用途
CN109071648A (zh) 抗il-2抗体及其组合物和用途
US20230183345A1 (en) Anti-tigit antibody and preparation method and application thereof
CN103189073A (zh) 抗表皮生长因子受体(egfr)的抗体及其用途
KR20210090184A (ko) 타우 인식 항체
CN109475625A (zh) 用于治疗脊髓性肌肉萎缩症的组合物和方法
RU2723940C2 (ru) Биспецифические антигенсвязывающие полипептиды
US20220340657A1 (en) Antibody and bispecific antibody targeting lag-3 and use thereof