CN103189073A - 抗表皮生长因子受体(egfr)的抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

公开了抗EGFR抗体、包含抗EGFR抗体组合的治疗组合物以及使用此类抗体和组合物治疗EGFR相关病症(例如，癌症)的方法。

Description

抗表皮生长因子受体(EGFR)的抗体及其用途
背景
天然免疫系统已进化到使得抗体能用于病原体的有效中和。从免疫的动物中分离出来的天然抗体制剂是多克隆起源的，并且与单独的抗体相比表现出免疫显性，所述单独抗体受限于特定抗原的一个或多个表位。中和抗体能够阻断与其结合的抗原的生物功能。中和抗体的混合物可比混合物中的任何单独抗体发挥更大的中和作用。
此结果已经通过组合抗表皮生长因子受体EGFR(ErbB1)的两种或更多种中和抗体而获得。结合至并抑制EGFR的抗体已被证明能提供有用的抗癌益处，并且具有很大的医疗和商业价值。两种对抗性但非竞争性的抗EGFR抗体的特定组合与任一种单独抗体的应用相比导致更快和更有效的EGFR下调(Friedman等(2005)PNAS 102：1915-1920)。两种交叉竞争性(即，互相竞争结合至抗原)抗EGFR抗体的组合已被证明是非协同的。多种抗体与EGFR的不同表位的结合可能在细胞表面上形成复合受体晶格，产生比用靶向单个表位的抗体所获得的内化和降解更有效的内化和降解。抗EGFR受体抗体的特定二元组合也被报道产生相加的和在一些情况下协同的体内抗肿瘤活性(Perera等(2005)Clin CancerRes 11：6390-6399)。针对突变体de2-7EGFR产生的单克隆抗体806与拮抗性抗体528的组合在胶质瘤异种移植模型中显现出比用任一种单独抗体治疗更显著的抗肿瘤活性。协同抗肿瘤活性的机制被证明与EGFR的迅速下调相关联，用所述单种抗体治疗不能诱导所述EGFR的迅速下调。同样地，EGFR磷酸化在另一二元组的抗EGFR抗体，西妥昔单抗和EMD55900的存在下大大降低(Kamat等(2008)Cancer Biol Ther7：726-33)。
靶向相关受体ErbB2的抗体的某些组合也已经被证明以协同的方式起作用(Friedman等(2005))。与帕妥珠单抗组合的曲妥单抗以对于单独抗体无效的剂量抑制BT474乳腺癌细胞的生存(Nahta等(2004)CancerRes 64：2343-2346)。在另一研究中，三种非竞争性抗ErbB2抗体在组合时表现出的在体外杀死BT474细胞的有效性远远高于它们在单独使用时的有效性，并且类似的结果在BT474体内异种移植模型(Spiridon等(2002)Clin Cancer Res 8：1699-701)中获得。
已经报道组合不止一种抗体可以增强抗体对肿瘤细胞的生长抑制(例如，细胞毒性)作用的其它证据。举例来说，组合了针对肿瘤抗原17-1A的单克隆抗体，研究了肿瘤细胞裂解，并且发现单克隆抗体及竞争抗体的组合是无效的，然而两种或多种非竞争抗体的组合导致完全的肿瘤细胞裂解。
因此，仍然需要用于产生组合作用以便增强肿瘤对抗EGFR抗体组合的反应性的另外途径和方法，所述组合包括增强信号转导抑制的组合和提供更有效的抑制细胞生长的或细胞毒性的结果的组合。
概述
本文提供了结合至EGFR且抑制各种EGFR功能的新型单克隆抗体。这些抗体当互相组合或与其它抗ErbB受体抗体(例如，其它抗EGFR抗体)组合时，与单独每种抗体的施用相比能够表现出协同或相加的治疗效果。这些抗体尤其当以本文提供的组合形式施用时，对治疗与EGFR介导的细胞信号转导相关的多种病症(例如，癌症)有用。因此，本文还提供分离的结合至EGFR并抑制各种EGFR功能的新型单克隆抗体的组合。还提供了这些抗体用于诊断和治疗目的的用途，也提供了如本文所公开的所述抗体组合的用途。
在一个实施方案中，提供了结合EGFR的单克隆抗体和此类抗体的组合。这些抗体和组合均表现出以下性质中的一种或多种：
(a)抑制AKT磷酸化或ERK磷酸化，例如，EGFR依赖性AKT磷酸化或EGFR依赖性ERK磷酸化，如基于细胞的测定所测量的；
(b)抑制表达EGFR的细胞的生长；
(c)抑制EGF配体结合至EGFR(例如，抑制结合EGFR的一种或多种配体的结合，所述配体包括EGF、转化生长因子(TGF)或双调蛋白)；
(d)抑制EGFR二聚化；或
(e)下调细胞表面上的EGFR(例如，通过受体的内化和再循环，和/或受体的内化和降解)。
在具体的实施方案中，所述抗体(即，当组合时)结合非重叠表位，如使用表面等离子体共振测定(例如，BIACORE)或FACS、或其它此类测定所确定的。在另一个具体的实施方案中，所述抗体相加地或协同地提供如上所述的功能性质的至少一种，即，
(a)抑制AKT磷酸化或ERK磷酸化，例如，EGFR依赖性AKT磷酸化或EGFR依赖性ERK磷酸化，如基于细胞的测定所测量的；
(b)抑制表达EGFR的细胞的生长；
(c)抑制配体结合至EGFR(例如，抑制结合EGFR的一种或多种配体的结合，所述配体包括EGF、转化生长因子(TGF)或双调蛋白)；
(d)抑制EGFR二聚化；或
(e)下调细胞表面上的EGFR(例如，通过受体的内化和再循环，和/或受体的内化和降解)。
在另一个实施方案中，所述单独单克隆抗体抑制EGFR配体的作用，却并不交叉竞争(即，所述抗体结合至不同的表位)。
本文提供的特定抗EGFR单克隆抗体包括那些包含含有选自由SEQ ID NO：1-11组成的组的氨基酸序列的重链可变区或含有选自由SEQ ID NO：12-17和19-22组成的组的氨基酸序列的轻链可变区的抗EGFR单克隆抗体。本文提供的抗体还包括那些包含含有以下氨基酸序列的重链和轻链可变区的抗体：
Figure BPA00001657524300041
*抗体名称，即va、vb、vc等。
还考虑在本文公开的抗体组合中使用与表I中列出的任何抗体结合至EGFR上相同表位的抗体。
本文其它特定抗体包括那些包含以下重链及轻链CDR3、CDR2和CDR1序列(该表II中的每个两位数均代表如以下表VI和VII中列出的SEQ ID NO：)的抗体。
Figure BPA00001657524300042
**抗体名称即ca、cb、cc等。
还考虑在本文公开的抗体组合中使用与表2中列出的任何抗体结合至EGFR上相同表位的抗体。
本发明还包括结合至由本文以下所述的任何特定抗体结合的相同或重叠表位的单克隆抗体。
本文公开的抗体包括所有已知形式的抗体和其它具有抗体样性质的蛋白质支架。举例来说，所述抗体可以是人抗体、人源化抗体、双特异性抗体、免疫缀合物、嵌合抗体或具有抗体样性质的蛋白质支架，如纤连蛋白或锚蛋白重复序列。所述抗体还可以是Fab、Fab’2、ScFv、AFFIBODY、纳米抗体或结构域抗体。所述抗体还可以具有任何同种型，包括以下任何同种型：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD和IgE。优选IgG抗体。
本文提供的两种抗体的示例性组合(以下称为“二元组(pair或pairs)”)包括：
Figure BPA00001657524300051
Figure BPA00001657524300061
***抗体二元组的名称
如上表中所列出的，命名的抗体被认为是将与其本身竞争的抗体。还考虑了与表III中列出的抗体二元组竞争结合至EGFR，或与表III中列出的抗体二元组结合至EGFR上相同表位的抗体二元组。
较多抗体中的三种的示例性组合包括上文直接定名为a-x的每个二元组与第三抗体的组合，所述第三抗体不存在于所述特定二元组中并且选自cd、ce、cf、cg、ch、ci、cj和ck，并且所述示例性组合进一步包括上文定名为y、z、aa、ab、ac、ad、ae、ag、ah、ai、aj、ak、al、am、ao、ap、aq、ar、as、at、au或av的每个二元组合与第三抗体的组合，所述第三抗体不存在于所述特定二元组中并且选自vd、ve、vf、vg、vh、vi和vj。
本文提供的三种抗体的示例性组合(下文称为“三元组(trio或trios)”)还包括在下表IV和表V中命名的那些，以及对于在下表IV和V中命名的每个三元组，包含与命名的三元组的每种抗体竞争结合至EGFR的每种抗体的三元组。本文公开的抗体基于竞争结合实验分类为组或“仓(bin)”，并且相应地描述在实施例和附图中。Bin1抗体全部互相竞争结合至EGFR的细胞外结构域，Bin2抗体全部互相竞争结合至EGFR的细胞外结构域，以及Bin3抗体全部互相竞争结合至EGFR的细胞外结构域。然而，Bin1抗体不与Bin2抗体或Bin3抗体竞争结合至EGFR的细胞外结构域，Bin2抗体不与Bin1抗体或Bin3抗体竞争结合至EGFR的细胞外结构域，以及Bin3抗体不与Bin1抗体或Bin2抗体竞争结合至EGFR的细胞外结构域。因此，每个Bin对应于那个Bin中的抗体将结合至其上的不同表位。Bin1、Bin2和Bin3在下表IV和V中分别称为第一抗体、第三抗体和第二抗体。
Figure BPA00001657524300071
Figure BPA00001657524300081
Figure BPA00001657524300091
Figure BPA00001657524300101
如上表I至V中所列出的，命名的抗体被认为是将与其本身竞争结合至EGFR的抗体。
本发明还包括与上表IV中列出的抗体的三元组中的任一种竞争结合至EGFR，或与上表IV中列出的抗体的三元组中的任一种结合至EGFR上的相同表位的抗体的三元组。
如表IV中所列出的，Bin1抗体包括抗体va、vb和vc(如表I中定义的)和抗体ca、cb和cc(如表II中定义的)。Bin2抗体包括抗体vd、ve、vf、vg和vh(如表I中定义的)和抗体cd、ce和cf(如表II中定义的)。Bin3抗体包括抗体vi和vj(如表I中定义的)和抗体cg、ch、ci、cj和ck(如表II中定义的)。
还提供抗EGFR抗体二元组(两种抗体，或二重抗体)的组合物，其中所述二元组中的一种抗体与本文定义的Bin1抗体竞争结合，或与本文定义的Bin1抗体结合至相同的表位，并且所述二元组中的第二抗体与本文定义的Bin2抗体竞争结合，或与本文定义的Bin2抗体结合至相同的表位。因此，在一实施方案中，提供抗EGFR抗体二元组的组合物，其包含第一抗体和第二抗体，其中(i)所述第一抗体与选自由va、vb和vc组成的组的抗体或选自由ca、cb和cc组成的组的抗体竞争结合，或与所述抗体结合至相同表位，以及(ii)所述第二抗体与选自由vd、ve、vf、vg和vh组成的组的抗体或选自由cd、ce和cf组成的组的抗体竞争结合，或与所述抗体结合至相同表位。
还提供了抗EGFR抗体二元组(两种抗体，或二重抗体)的组合物，其中所述二元组中的一种抗体与本文定义的Bin1抗体竞争结合，或与本文定义的Bin1抗体结合至相同的表位，并且所述二元组中的第二抗体与本文定义的Bin3抗体竞争结合，或与本文定义的Bin3抗体结合至相同的表位。因此，在一实施方案中，提供抗EGFR抗体二元组的组合物，其包含第一抗体和第二抗体，其中(i)所述第一抗体与选自由va、vb和vc组成的组的抗体或选自由ca、cb和cc组成的组的抗体竞争结合，或与所述抗体结合至相同表位，以及(ii)所述第二抗体与选自由vi和vj组成的组的抗体或选自由cg、ch、ci、cj和ck组成的组的抗体竞争结合，或与所述抗体结合至相同表位。
还提供了抗EGFR抗体二元组(两种抗体，或二重抗体)的组合物，其中所述二元组中的一种抗体与本文定义的Bin2抗体竞争结合，或与本文定义的Bin2抗体结合至相同的表位，并且所述二元组中的第二抗体与本文定义的Bin3抗体竞争结合，或与本文定义的Bin3抗体结合至相同的表位。因此，在一实施方案中，提供抗EGFR抗体二元组的组合物，其包含第一抗体和第二抗体，其中(i)所述第一抗体与选自由vd、ve、vf、vg和vh组成的组的抗体或选自由cd、ce和cf组成的组的抗体竞争结合，或与所述抗体结合至相同表位，以及(ii)所述第二抗体与选自由vi和vj组成的组的抗体或选自由cg、ch、ci、cj和ck组成的组的抗体竞争结合，或与所述抗体结合至相同表位。
还提供了抗EGFR抗体三元组(三种抗体，或三元抗体)的组合物，其中三元组中的一种抗体与本文定义的Bin1抗体竞争结合，或与本文定义的Bin1抗体结合至相同的表位，三元组中的第二抗体与本文定义的Bin2抗体竞争结合，或与本文定义的Bin2抗体结合至相同的表位，以及所述三元组中的第三抗体与本文定义的Bin3抗体竞争结合，或与本文定义的Bin3抗体结合至相同的表位。因此，在一个实施方案中，提供抗EGFR抗体三元组的组合物，其包含第一抗体、第二抗体和第三抗体，其中(i)所述第一抗体与选自由va、vb和vc组成的组的抗体或选自由ca、cb和cc组成的组的抗体竞争结合或与所述抗体结合至相同表位；(ii)所述第二抗体与选自由vd、ve、vf、vg和vh组成的组的抗体或选自由cd、ce和cf组成的组的抗体竞争结合或与所述抗体结合至相同的表位；以及(iii)所述第三抗体与选自由vi和yj组成的组的抗体或选自由cg、ch、ci、cj和ck组成的组的抗体竞争结合或与所述抗体结合至相同的表位。
举例来说，提供组合物，其包含包括第一抗体、第二抗体和第三抗体的抗EGFR抗体的三元组，其中(i)第一抗体与抗体ca(包含分别在SEQID NO：29、30和34中列出的重链CDR1、2和3，以及分别在SEQ IDNO：48、45和49中列出的轻链CDR1、2和3)竞争结合或与所述抗体ca结合至相同的表位；(ii)所述第二抗体与抗体cd(包含分别在SEQ IDNO：29、30和31中列出的重链CDR1、2和3，以及分别在SEQ ID NO：53、54和55中列出的轻链CDR1、2和3)竞争结合，或与所述抗体cd结合至相同的表位；以及(iii)所述第三抗体与抗体ch(包含分别在SEQ IDNO：23、24和26中列出的重链CDR1、2和3，以及分别在SEQ ID NO：39、40和42中列出的轻链CDR1、2和3)竞争结合，或与所述抗体ch结合至相同的表位。抗体ca、cd和ch的三元组合在本文中还被描述为表IV中列出的抗体三元组4c。
在下表VI和VII中，CDR氨基酸序列在每列中的相应SEQ ID NO的正上方列出，而相应的全重链或轻链可变序列由在左列中的前一行中的SEQ ID NO表示。
Figure BPA00001657524300131
Figure BPA00001657524300141
所考虑的组合物可进一步包括，或被制备成用作与另外的治疗剂，如另外的抗癌剂联合治疗的药剂。“抗癌剂”是用于治疗肿瘤、癌症、恶性肿瘤等的药物。药物疗法(例如，使用本文公开的抗体组合物)可在没有其它治疗存在的情况下施用，或与其它治疗如手术疗法、热疗法或辐射疗法(例如，使用电离辐射)联合。根据所涉及的器官或组织的性质，癌症治疗中可使用若干种类的抗癌剂。例如，乳腺癌通常受到雌激素的刺激，并且可使用使性激素失活的药物来治疗。同样地，前列腺癌可使用使雄激素失活的药物来治疗。用于与本文公开的抗体组合物组合的抗癌剂尤其包括在附表A中列出的那些抗癌剂，所述抗癌剂不应被理解为限制。一种或多种抗癌剂可与本文公开的抗体组合物同时施用，或在本文公开的抗体组合物施用之前或之后施用。本文公开的抗体组合物可与另外的抗癌剂，例如，以下附表A中公开的抗癌剂按顺序施用或一起施用。
还提供了用于选择特定抗体组合的方法。在一个实施方案中，此类方法包括选择具有关于EGFR活性或功能的特定IC50和/或IC90(例如，优于80nM的IC90-例如70nM或更低的IC90-用于抑制EGFR介导的信号转导)的抗EGFR抗体。此类抗体然后可以组合(例如，一起)的方式施用或按顺序施用。在另一个实施方案中，所述方法包括进一步选择互相之间不竞争结合至EGFR的抗体组合的步骤。另外的选择标准包括以下性质的至少一种：
(i)体内抑制异种移植模型中表达EGFR的细胞的生长；
(ii)体外抑制EGFR配体结合至EGFR；
(iii)体外抑制EGFR二聚化；或
(iv)体外下调细胞表面上的EGFR。
还考虑了试剂盒，其包含任选地包含在单个小瓶中的本文公开的一种或多种抗体或组合物，和/或用于治疗或诊断与EGFR相关的疾病(例如癌症)的使用说明书。此试剂盒可包含例如在单剂量小瓶或单剂量预装注射器中的单位剂量形式的抗体组合物。
本文公开的抗体和组合物可用于广泛的治疗和诊断应用，尤其是用于肿瘤学应用。因此，在另一方面，本文提供了通过施用足以抑制EGFR介导的活性的量的本文所述的一种或多种抗体或组合物来抑制受试者的EGFR活性的方法。可被治疗的具体治疗适应症包括，例如，器官或组织(如皮肤、大脑和中枢神经系统，头和颈部、食道、胃、结肠、直肠、肛门、肝脏、胰腺、胆管、胆囊、肺或支气管、乳房、卵巢、子宫、子宫颈、阴道、睾丸、生殖细胞、前列腺、肾脏、尿管、膀胱、肾上腺、脑垂体、甲状腺、骨骼、肌肉或其它结缔组织)的癌症、白血病、多发性骨癌瘤、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。
本文公开的抗体还可用于诊断或预后与EGFR相关的疾病(例如，癌症)，方式例如是使本文公开的一种或多种抗体、抗体二元组或抗体三元组(例如，离体或在体内)与受试者的细胞接触，并测量与所述细胞上的EGFR的结合水平，其中与EGFR的异常高水平的结合指示所述受试者患有与EGFR相关的癌症。
本发明的其它特征和优势将从以下详细描述以及权利要求书中显而易见。
附图简述
图1：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4以及SEQ ID NO：5包含的可变重链区的氨基酸序列。按照Vbase数据库划分序列以显示CDR位置。从FR3的终点跨越至JH区的起点的序列包含CDR3。也列出恒定重链区的氨基酸序列。
图2：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4以及SEQ ID NO：5包含的可变重链区的氨基酸序列。如按IMGT数据库划分序列以显示CDR位置。从FR3的终点跨越至JH区的起点的序列包含CDR3。也列出恒定重链区的氨基酸序列。
图3：SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8以及SEQ ID NO：9包含的可变重链区的氨基酸序列。如按Vbase数据库划分序列以显示CDR位置。从FR3的终点跨越至JH区的起点的序列包含CDR3。也列出恒定重链区的氨基酸序列。
图4：SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8以及SEQ ID NO：9包含的可变重链区的氨基酸序列。如按IMGT数据库划分序列以显示CDR位置。(从FR3的终点跨越至JH区的起点的序列包含CDR3。也列出恒定重链区的氨基酸序列。
图5：SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11包含的可变重链区的氨基酸序列。如按Vbase数据库划分序列以显示CDR位置。从FR3的终点跨越至JH区的起点的序列包含CDR3。也列出恒定重链区的氨基酸序列。
图6：SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11包含的可变重链区的氨基酸序列。如按IMGT数据库划分序列以显示CDR位置。从FR3的终点跨越至JH区的起点的序列包含CDR3。也列出恒定重链区的氨基酸序列。
图7：SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13以及SEQ ID NO：14包含的可变轻链区(Vκ)的氨基酸序列。如按IMGT数据库划分序列以显示CDR位置。也列出恒定轻链区的氨基酸序列。
图8：SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13以及SEQ ID NO：14包含的可变轻链区的氨基酸序列。如按Vbase数据库划分序列以显示CDR位置。也列出恒定轻链区的氨基酸序列。
图9：SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：22包含的可变轻链区的氨基酸序列。如按IMGT数据库划分序列以显示CDR位置。也列出恒定轻链区的氨基酸序列。
图10：SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：22包含的可变轻链区的氨基酸序列。如按Vbase数据库划分序列以显示CDR位置。也列出恒定轻链区的氨基酸序列。
图11：SEQ ID NO：21包含的可变轻链区的氨基酸序列。如按IMGT数据库划分序列以显示CDR位置。也列出恒定轻链区的氨基酸序列。
图12：SEQ ID NO：21包含的可变轻链区的氨基酸序列。如按Vbase数据库划分序列以显示CDR位置。也列出恒定轻链区的氨基酸序列。
图13：SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16包含的可变轻链区的氨基酸序列。如按IMGT数据库划分序列以显示CDR位置。也列出恒定轻链区的氨基酸序列。
图14：SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16包含的可变轻链区的氨基酸序列。如按Vbase数据库划分序列以显示CDR位置。也列出恒定轻链区的氨基酸序列。
图15：SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：19包含的可变轻链区的氨基酸序列。如按IMGT数据库划分序列以显示CDR位置。也列出恒定轻链区的氨基酸序列。
图16：SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：19包含的可变轻链区的氨基酸序列。如按Vbase数据库划分序列以显示CDR位置。也列出恒定轻链区的氨基酸序列。
图17A至图17D：通过直接的ELISA和表面等离子体共振对抗EGFR抗体进行表位作图。图17A至图17C是示出用野生型(图17A)、Bin1表位突变体(图17B)或Bin3表位突变体(图17C)EGFR的细胞外结构域(EGFR-ECD)作为捕获试剂的ELISA测定结果的图。x轴表示抗体的浓度，并且y轴表示相关的发光单位(RLU)。图17D是表面等离子体共振测定的结果，该结果证明来自Bin 1、2以及3的抗体结合至具有不同、非重叠表位的EGFR的细胞胞外结构域。使抗体ch(Bin3)缀合至BIACORE芯片的表面。注射野生型EGFR-ECD(0.5μM)，接着按顺序注射抗体cd(Bin2)、cb(Bin1)以及ch(Bin3)，缀合在芯片上的相同的抗体作为对照。结果被描绘为传感图，其中x轴表示时间(秒)，并且y轴表示BIACORE响应单位(RU)。
图18A至图18C：具有非重叠表位的两种抗EGFR抗体的组合对磷酸-ERK信号转导的抑制。将A431细胞与Bin 1+Bin 3(图18A和图18B)或Bin 1+Bin 2抗体(图18C)的指出的等摩尔组合一起孵育2小时，并且通过磷酸-ERK ELISA来分析细胞裂解产物。x轴表示抗体的浓度，并且y轴表示磷酸-ERK活性的强度，将该强度根据在+EGF配体对照中观察到的强度进行归一化。实线描绘了对来自每种组合的数据的五个参数逻辑拟合。每幅图下面的表包含每种组合的效价(在抗体饱和浓度下，部分磷酸-ERK活性)、IC50值以及IC90值，这些值如从用来拟合数据的逻辑函数中计算出。
图19A至图19B：具有非重叠表位的两种或三种抗EGFR抗体的组合对磷酸-ERK信号转导的抑制。A431细胞用等摩尔Bin1、Bin 2以及Bin 3抗体的三元组合进行处理(图19A)。然后将抗体(Bin 1)和cd(Bin 2)的二重组合与已知的抗EGFR抗体西妥昔单抗(图19B)进行比较，并且所述二元组合在降低磷酸-ERK方面比本领域已知的这种抗体更有效。如在图18中所示进行实验和图示数据。
图20A至图20D：通过具有非重叠表位的两种抗EGFR抗体的等摩尔和非等摩尔组合对磷酸-ERK信号转导的抑制。A431细胞用不同比率(以μg/ml计)的抗体二元组cb和cd(图20A)、cb和ch(图20B)、cb和ci(图20C)以及ca和cd(图20D)进行处理。如在图18中所示进行实验和图示数据。
图21：来自图20A至图20D中的磷酸-ERK信号转导抑制数据表示在热图中，其中x轴(列)表示抗体的浓度，y轴(行)表示以指出的比率组合的抗体二元组，并且z轴(朝向平面内)以灰度表示部分磷酸-ERK活性。z轴颜色图将高的磷酸-ERK活性表示为白色，低的活性表示为黑色，并且用灰色阴影表示中间的活性。将样本值根据分析样本的ELISA板上的+EGF配体对照的平均值进行单独地归一化，并且将整个板上的EGF配体对照(+/-)的平均值在左上角指出。
图22A至图22C：Bin 1+Bin 2或Bin 1+Bin 3抗体的单一抗体和二元组合对磷酸-EGF受体和磷酸-ERK信号转导的抑制，以及与其它已知的抗EGFR抗体如西妥昔单抗、尼妥珠单抗(nimotuzumab)以及扎鲁目单抗(zalutumumab)的比较。图22A示出Bin1/2抗体cb和cd对ERK活性的抑制。图22B示出Bin1/2抗体和cd对EGFR活性的抑制。图22C示出Bin1/3抗体cb和ch对ERK活性的抑制。如在图18中所示进行实验和图示数据。
图23A至图23D是示出细胞的CTG发光细胞活力测定结果的四幅图，这些细胞在有和没有EGF存在的情况下用Bin1/Bin2/Bin3mAb二元组或三元组进行处理。图23A示出用Bin1/3抗体ca和ch处理的H1975细胞的CTG测定结果。图23B示出用Bin1/2抗体ca和cd处理的H1975细胞的CTG测定结果。图23C(H1975细胞)和图23D(A431细胞)示出用抗体ca+cd+ch的Bin1/2/3三元组处理的细胞的CTG测定结果。对照包括用含有1％胎牛血清(1％FCS)的培养基处理的细胞和用无血清的培养基(SFM)处理的细胞。
图24A至图24B是示出在使用表皮样肿瘤细胞系A431(图24A)和NSCLC(非小细胞肺癌)肿瘤细胞系H1975(图24B)的小鼠异种移植肿瘤模型中，抗体cb与抗体ca+cd或cb+ch或ca+ch的二元组对肿瘤生长的抑制的两幅图。x轴表示移植后的天数，并且y轴表示以mm3计的肿瘤大小。
图25是流式细胞仪(FACS)分析结果的图，该图示出与西妥昔单抗或单独的EGF配体比较时，单独抗体ca、cf、ch或cb(在2μM浓度下)对生物素化EGF配体与A431细胞的结合的抑制。Y轴表示平均荧光指数(MFI)，并且x轴表示生物素化的人EGF配体的变化浓度(以nM计)。抗体ch显示出对EGF结合的一定程度的抑制，抗体cf显示出对高达20nM EGF浓度的EGF结合的实质上完全的抑制，并且抗体ca和抗体cb显示出对高达200nM EGF浓度的EGF结合的实质上完全的抑制。
详细描述
I.定义
术语“EGFR”、“ErbB1”以及“EGF受体”在本文互换使用以指人EGFR蛋白；参见UniProtKB/Swiss-Prot条目P00533(SEQ ID NO：58)。
如本文所使用的术语“抑制”指生物活性的任何统计学显著的降低，包括活性的完全阻断。举例来说，“抑制”可以指生物活性统计学显著地降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或约100％。
如本文所使用的磷酸化的抑制，是指相对于不存在抗体的情况下(对照)的信号转导而言，抗体可统计学显著地降低底物蛋白质的磷酸化的能力。如本领域中已知的，细胞内信号转导途径包括，例如磷酸肌醇磷脂3′-激酶/Akt(PI3K/Akt/PTEN或“AKT”)和/或有丝分裂原活化的蛋白激酶(MAPK/ERK或“ERK”)途径。如本领域中还已知，EGFR介导的信号转导可以通过测定底物的磷酸化水平(例如，AKT和/或ERK的磷酸化或无磷酸化)来测量。因此，在一个实施方案中，相对于没有这种抗EGFR抗体存在的情况下(对照)的AKT和/或ERK磷酸化水平而言，抗EGFR抗体组合和组合物统计学上显著地抑制AKT和ERK中的任一者或者该二者的磷酸化水平达至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或约100％。此类EGFR介导的信号转导可以使用本领域公认的技术来测量，所述计算测量涉及EGFR的细胞级联中的蛋白质，例如ELISA、Western或多重方法，如Luminex
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如本文所使用的短语“表达EGFR的细胞生长的抑制”，是指相对于不存在抗体的情况下(对照)的细胞生长，抗体在体内或体外统计学显著地降低表达EGFR的细胞的生长的能力。在一个实施方案中，当细胞与本文公开组合的抗体组合物接触时，相对于没有组合的抗体组合物存在的情况下(对照)测量的生长而言，表达EGFR的细胞(例如，癌细胞)生长可降低至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或约100％。细胞生长可以使用本领域公认的测量以下的技术来测定：细胞分裂速率、细胞群内经历细胞分裂的细胞的比例、和/或在细胞群中由于终末分化或细胞死亡而造成的细胞损失率(例如，使用细胞滴度发光测定或胸苷掺入法)。
如本文所使用的短语“EGFR配体结合至EGFR的抑制”，是指相对于不存在抗体的情况下(对照)的EGFR配体结合而言，抗体统计学上显著地降低EGFR配体结合至其受体EGFR的能力。这意指在抗体存在下，相对于对照(无抗体)而言，结合至EGFR的EGFR配体的量统计学显著地降低。相对于在不存在抗体的情况下(对照)的量而言，结合EGFR的EGFR配体的量在存在本文公开的抗体组合物或组合时可降低至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或约100％。EGFR配体结合的降低可以使用本领域公认的技术来测量，所述技术测量存在或不存在(对照)抗体的情况下，标记的EGFR配体(例如，放射性同位素标记的EGF或放射性同位素标记的β动物纤维素)与表达EGFR的细胞的结合水平。
如本文所使用的短语“EGFR二聚化的抑制”，是指相对于不存在抗体的情况下(对照)的EGFR二聚化而言，抗体统计学显著地降低EGFR二聚化(与另一种ErbB受体配对以形成同源二聚体，例如ErbB1/ErbB1配对，或异二聚体，例如ErbB1/ErbB3配对)的能力。在一个实施方案中，当表达EGFR的细胞与本文公开的抗体组合物或组合接触时，相对于不存在抗体的情况下(对照)测量的EGFR的二聚化而言，EGFR的二聚化可降低至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或约100％。EGFR二聚化的降低可以通过本领域公认的技术来测量，所述技术测量存在或不存在(对照)抗体的情况下的EGFR二聚水平。
如本文所使用的短语“EGFR表达的下调”，是指相对于不存在抗体的情况下(对照)的EGFR表达而言，抗体例如通过增加EGFR的内化而统计学显著地降低细胞表面上EGFR的表达的能力。在一个实施方案中，当表达EGFR的细胞与本文提供的组合的抗体组合物接触时，相对于不存在抗体的情况下(对照)测量的细胞表面上EGFR的表达而言，EGFR的表达可降低至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或约100％。细胞表面上的EGFR表达的下调包括，例如增加受体的内化/再循环，和/或增加受体的内化/降解受体。EGFR内化的增加可以使用本领域公认的技术来测量，所述计算测量存在或不存在(对照)抗体的情况下的EGFR内化水平。
关于EGFR抗体的组合(本文描述的)，如本文所使用的词语“相加的”或“相加性”是指两种或更多种抗体的活性，其中它们的组合活性(相对于特定功能，例如，抑制细胞生长)等于它们单独活性的总和。也就是说，当单独作用在表达EGFR的细胞上时，本文提供的两种或更多种抗体的活性总和约等于一起作用在相同细胞上的相同抗体的组合作用。在一个实施方案中，针对以上所讨论的任何性质(例如，AKT或ERK磷酸化的抑制，表达EGFR的细胞生长的抑制等)来测量相加的作用。
如本文所使用的词语“协同作用”或“协同的”是指两种或更多种抗体的活性，其中它们的组合活性(相对于特定功能，例如，细胞生长的抑制)大于它们单独的活性的预期相加作用。举例来说，预期的相加作用可以根据Bliss独立性标准来定义。根据Bliss标准，两种或更多种药物(例如，抗体)的作用等于单独药物的作用总和减去单独药物作用的乘积：
E12＝E1+E2-E1*E2
其中，E1是药物1引起的％抑制，E2是药物2引起的％抑制，以及E12是组合引起的预期％抑制。
协同作用可以适用于本文讨论的任何性质(例如，EGFR依赖性AKT或ERK磷酸化的抑制，表达EGFR的细胞生长的抑制等)。在具体的实施方案中，组合的抗体的活性相对于它们的单独活性的相加作用而言增加至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％或更高。
如在本文可互换使用的术语“抗体”或“免疫球蛋白”，包括完整抗体及其任何抗原结合片段(抗原结合部分)或其单链同源物。“抗体”包含至少一条重(H)链和一条轻(L)链。在天然存在的IgG中，例如，这些重链和轻链通过二硫键相互连接，并且存在两条成对的重链和轻链，这两对重链和轻链也通过二硫键相互连接。每条重链均由重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域，CH1、CH2以及CH3组成。每条轻链均由轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可以进一步再分成称为互补决定区(CDR)的高变区、其中夹杂着称为框架区(FR)或连接(J)区(分别在重链和轻链中的JH或JL)的更加保守的区域。每个VH和VL均由三个CDR、三个FR以及J结构域组成，其按以下顺序从氨基末端至羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、J。重链和轻链的可变区与抗原结合。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，该宿主组织或因子包括各种免疫系统的细胞(例如，效应细胞)或体液因子如经典补体系统的第一组分(Clq)。因此在本文公开的组合中，可以使用保留着特异性地结合至抗原(例如，EGFR)的能力的抗体的一个或多个片段。已经证明全长抗体的片段可以执行抗体的抗原结合功能。表示为抗原结合部分的结合片段或抗体片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL以及CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，在铰链区中包含两个通过二硫桥连接的Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)包括VH和VL结构域的dAb；(vi)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等(1989)Nature 341，544-546)；(vii)由VH或VL结构域组成的dAb；以及(viii)分离的互补决定区(CDR)或(ix)两种或更多种可任选地通过合成连接体(linker)连接的分离的CDR的组合。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但是它们可以使用重组方法通过能够使它们成为单蛋白质链的合成连接体连接，在该蛋白质链中VL和VH区配对以形成单价的分子(如免疫球蛋白片段的单链同源物被认为是单链Fv(scFv))。此类单链抗体也意图涵盖在术语“抗体”内。使用本领域技术人员已知的常规技术获得抗体片段，并且以与完整抗体相同的一般方法来对片段的效用进行筛选。抗原结合部分可以通过重组DNA技术或通过完整免疫球蛋白的酶或化学裂解来产生。
如本文所使用的术语“单克隆抗体”指从许多基本上同源的抗体群中获得的抗体，即，除了可能以少量存在的自然产生的突变外，包含该抗体群的单独抗体是相同的。此类免疫球蛋白的抗原结合片段(包括scFv)也涵盖在如本文所使用的术语“单克隆抗体”中。单克隆抗体是高度特异性的，并针对单个抗原位点。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂相比，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。单克隆抗体可以使用任何本领域公认的技术和本文描述的那些技术如，例如杂交瘤方法、转基因动物、重组DNA方法(参见，例如美国专利第4,816,567号)，或使用噬菌体抗体文库使用描述于例如美国专利第7,388,088号和美国专利申请第09/856,907号(PCT国际公布第WO 00/31246号)的技术来制备。单克隆抗体包括嵌合抗体、人抗体以及人源化抗体，并且可天然存在或重组产生。
术语“重组抗体”指通过重组的方式来制备、表达、产生或分离的抗体，如(a)从免疫球蛋白基因(例如，人免疫球蛋白基因)的转基因或转染色体动物(例如，小鼠)或由该动物制备的杂交瘤中分离的抗体，(b)从进行转化以表达抗体的宿主细胞中，例如从转染瘤中分离的抗体，(c)使用噬菌体展示从重组、组合的抗体文库(例如，包含人抗体序列)中分离的抗体，以及(d)通过任何其它涉及将免疫球蛋白基因序列(例如，人免疫球蛋白基因)拼接至其它DNA序列的方式来制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组抗体可具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在某些实施方案中，此类重组人抗体可以经受体外诱变，并且因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是可能并非天然地存在于体内的人抗体种系集合内的序列，尽管它们源自人种系VH和VL序列并且与人种系VH和VL序列相关。
术语“嵌合免疫球蛋白”或抗体是指其可变区源自第一物种，而其恒定区源自第二物种的免疫球蛋白或抗体。嵌合免疫球蛋白或抗体可以例如通过基因工程，由属于不同物种的免疫球蛋白基因片段构建。
如本文所使用的术语“人抗体”意图包括具有可变区的抗体，在该可变区中框架与CDR区均源自如例如如Kabat等所描述的人种系免疫球蛋白序列(参见Kabat等(1991)Sequences of proteins of ImmunologicalInterest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH公布号91-3242)。此外，如果抗体包含恒定区，那么恒定区也源自人种系免疫球蛋白序列。人抗体可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异的诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所使用的术语“人抗体”并不意图包括其中源自另一种哺乳动物物种(如小鼠)的种系的CDR序列已经被移植到人框架序列上的抗体。
人抗体可以具有至少一种或多种被氨基酸残基，例如不由人种系免疫球蛋白序列编码的活性增强氨基酸残基置换的氨基酸。通常，人抗体可以具有高达20个由氨基酸残基置换的位置，所述氨基酸残基不是人种系免疫球蛋白序列的部分。在具体的实施方案中，这些置换在如下所详细描述的CDR区内。
术语“人源化的抗体”是指包括至少一条人源化的抗体链(即，至少一条人源化的轻链或重链)的抗体。术语“人源化的抗体链”(即，“人源化的免疫球蛋白轻链”)指具有可变区的抗体链(即，分别是轻链或重链)，该可变区包括基本上来自人抗体的可变框架区和基本上来自非人抗体的互补决定区(CDR)(例如，至少一个CDR、两个CDR或三个CDR)，并且进一步包括恒定区(例如，在轻链情况下包含一个恒定区或其部分，并且在重链情况下优选包含三个恒定区)。
如本文所使用的“分离的”意图指基本上不含具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体或两种、三种或四种抗体的组合(例如，特异性地结合至EGFR的抗体ca、cf和ch的分离组合物基本上不含特异结合除EGFR以外的抗原的抗体)。另外，分离的抗体通常基本上不含其它细胞物质和/或化学物质。在本发明的一个实施方案中，将具有不同EGFR结合特异性的“分离的”单克隆抗体的组合在明确定义的组合物中进行组合。
如本文所使用的“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如，IgM或IgG1)。在一些实施方案中，本文提供的单克隆抗体组合物只包含IgG1同种型的抗体。在其它实施方案中，本文提供的单克隆抗体组合物只包含IgG2同种型的抗体。在其它实施方案中，本文提供的单克隆抗体组合物包含两种或三种不同同种型的抗体。
“抗原”是抗体可结合至其上的实体(例如，蛋白质实体或肽)。在本发明的各个实施方案中，抗原是EGF。在根据本发明的具体实施方案中，抗原是人EGFR。
相对应地，本发明公开内容也涵盖了结合至EGFR上的表位的抗体的组合，所述组合包含被本文描述的组合的特定抗体识别的所有或部分表位。在另一个实施方案中，提供了与本文描述的抗体竞争结合至EGFR的抗体。竞争抗体和识别相同或重叠表位的抗体可以使用常规技术如免疫测定，例如通过展示一种抗体阻碍另一抗体结合至靶抗原的能力，即，竞争结合测定来鉴定。竞争性结合可使用如下实施例中描述的测定来确定。
术语“特异性的结合”、“特异性地结合”、“选择性的结合”以及“选择性地结合”意指抗体对于特定的抗原或表位表现出明显的亲和力，并且通常不表现出与其它抗原和表位的显著交叉反应性。“明显的”或优选的结合包括KD为106、107、108、109或1010M-1或更优(better)的结合。抗体抗原相互作用的KD(亲和常数)指示50％的抗体和抗原分子结合在一起时的抗体浓度。因此，在适合的固定抗原浓度下，50％的较高(即，较强)亲和力抗体将在比用较低亲和力抗体来达到相同结合百分比所需要的抗体浓度低的抗体浓度下结合抗原分子。因此较低的KD值指示较高的(较强的)亲和力。如本文所使用的“更优的”亲和力是较强的亲和力，并且具有比它们的比较物低的数值，其中107M-1的KD为较低的数值，并因此代表比106M-1的KD更优的亲和力。比107M-1更优的亲和力(即，具有低于107M-1的KD值并且因此具有强于107M-1的亲和力)，优选比108M-1更优的亲和力通常是优选的。也考虑本文列出的那些值的中间值，并且优选的结合亲和力可以表示为亲和力的范围，例如对于本文公开的抗EGFR抗体的优选结合亲和力是106至1012M-1，优选地107至1012M-1，更优选地108至1012M-1。“不表现出显著交叉反应性”的抗体是不明显地结合至脱靶抗原(例如，非EGFR蛋白)的抗体。举例来说，在一个实施方案中，特异性地结合至EGFR的抗体相对于除ErbB1(EGFR)以外的ErbB分子或非ErbB蛋白或肽而言将对EGFR表现出至少两个，并且优选三个或四个或更多个数量级的结合亲和力(即，结合表现出两个、三个或四个或更多个数量级的较低KD值)。特异性的或选择性的结合可以根据用于确定此类结合的任何本领域公认的方式来确定，所述方式包括例如，根据如本文所描述的Scatchard测定和/或竞争(竞争性)结合测定。
如本文所使用的术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数或抗体对抗原的亲和力。在一个实施方案中，根据本发明的抗体以100nM或更优(即，或更小)(例如，90nM、80nM、70nM、60nM、50nM、40nM、30nM、20nM或10nM或更小)亲和力(KD)结合抗原(例如，EGFR)，如使用表面等离子体共振测定、细胞结合测定或平衡透析测定测量的。在具体的实施方案中，抗体以8nM或更优(例如，7nM、6nM、5nM、4nM、2nM、1.5nM、1.4nM、1.3nM、1.2nM、1.1nM、1nM或更低)亲和力(如用解离常数KD表示)结合EGFR，如通过表面等离子体共振测定或细胞细胞结合测定测量的。在其它实施方案中，当使用重组EGFR作为分析物以及使用抗体作为配体，在BIACORE 3000仪器中通过表面等离子体共振(SPR)技术进行测定时，抗体以约小于10-7M，如约小于10-8M、10-9M或10-10M或甚至更低的亲和力(KD)结合抗原(例如，EGFR)，并且以是它与除预先确定的抗原或密切相关的抗原以外的非特异性抗原(例如，BSA、酪蛋白)结合的亲和力至少2倍的亲和力结合至预先确定的抗原。其它用于测定KD的方法包括经由流式细胞术(FACS)或在溶液中使用KinExA
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技术来平衡结合至表达EGFR的活细胞。
如本文所使用的术语“Koff”是指抗体从抗体/抗原复合物中解离的离去速率常数。
如本文所使用的术语“IC50”和“IC90”，是指化合物(例如，抗EGFR抗体)分别抑制生物或生物化学功能(例如，EGFR的功能或活性)达50％和90％的效力的量度。举例来说，IC50指示需要多少的抗EGFR抗体来抑制EGFR的活性(例如，表达EGFR的细胞的生长)达一半。即，它是抗EGFR抗体的半数最大(50％)抑制浓度(IC)(50％IC或IC50)。根据FDA，IC50表示体外50％抑制所需要的药物的浓度。IC50和IC90可以通过本领域已知的技术来确定，例如通过构建剂量反应曲线，并且检查拮抗剂(即，抗EGFR抗体)的不同浓度对反转EGFR活性的影响来确定。
如本文所使用的“糖基化型式”，定义为共价连接至蛋白质，更具体地是连接至免疫球蛋白蛋白质的碳水化合物单元的型式。
如本文所使用的术语“核酸分子”意图包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链的或双链的，但优选地是双链的DNA。
如本文所使用的关于编码抗体或抗体片段(例如，VH、VL、CDR3)的核酸的术语“分离的核酸分子”，是指其中核苷酸序列实质上不含其它基因组核苷酸序列，例如编码结合除EGFR以外的抗原的抗体的核苷酸序列的核酸分子，所述其它序列可能天然地位于人基因组DNA中的核苷酸侧面。
如本文所使用的术语“修饰(modifying)”或“修饰(modification)”意图是指改变抗体或其抗原结合部分中的一个或多个氨基酸。改变可以通过在一个或多个位置上添加、取代或缺失氨基酸来实现。可以使用已知的技术来实现改变，如PCR诱变。举例来说，在一些实施方案中，可以修饰使用本发明的方法鉴定的抗体或其抗原结合部分，从而因此修饰抗体或其抗原结合部分对EGFR的结合亲和力。提供了抗体序列中的“保守氨基酸取代”，即，不会损害由核苷酸序列编码或含有氨基酸序列的抗体与抗原(即EGFR)的结合的核苷酸和氨基酸序列修饰。保守氨基酸取代包括一种类别中的氨基酸被相同类别的氨基酸取代，其中所述类别由共同的氨基酸侧链物理化学性质和自然中发现的同源蛋白质中的高取代频率来定义，如例如通过标准Dayhoff频率交换基质或BLOSUM基质确定的。已经将氨基酸侧链分类为六个大类，并且包括：I类(Cys)；II类(Ser、Thr、Pro、Ala、Gly)；III类(Asn、Asp、Gln、Glu)；IV类(His、Arg、Lys)；V类(Ile、Leu、Val、Met)以及VI类(Phe、Tyr、Trp)。举例来说，用另一III类残基如Asn、Gln或Glu取代Asp是保守取代。因此，抗EGFR抗体中预计的非必需氨基酸残基优选地用来自同一类别的另一种氨基酸残基置换。鉴定不消除抗原结合的核苷酸和氨基酸保守取代的方法是本领域中熟知的。
术语“非保守氨基酸取代”是指用另一种类别中的氨基酸取代一种类别的氨基酸；例如，用III类残基，如Asp、Asn、Glu或Gln取代Ala，II类残基。
或者，在另一个实施方案中，可以如通过饱和诱变沿着整个或部分抗EGFR抗体编码序列随机引入突变(保守或非保守)，并且可以筛选所得的修饰抗EGFR抗体的结合活性。
“共有序列”是由相关序列的家族中最频繁出现的氨基酸(或核苷酸)形成的序列。在蛋白质家族中，共有序列中的每个位置均由在该家族中的这个位置上最频繁出现的氨基酸占据。如果两种氨基酸同等频率地出现，那么两者中的任一者可以包括在共有序列中。免疫球蛋白的“共有框架”是指共有免疫球蛋白序列中的框架区。类似地，CDR的共有序列可以通过本发明EGFR抗体的CDR氨基酸序列的最佳比对得到。
对于核酸，术语“基本同源性”表明当最佳地比对和比较时，具有适当的核苷酸插入或缺失的两种核酸或其指定序列有至少约80％的核苷酸，通常至少约90％至95％，并且更优选地至少约98％至99.5％的核苷酸是相同的。或者，基本同源性当片段在选择性的杂交条件下将与链的补体杂交时存在。
核酸可存在于完整细胞中、细胞裂解产物中，或以部分纯化的或基本上纯的形式存在。当通过包括碱性/SDS处理、CsCl显带、柱层析、琼脂糖凝胶电泳以及其它本领域中熟知的技术在内的标准技术来从其它细胞组分或其它杂质，例如其它细胞核酸或蛋白质中纯化出来时，核酸是“分离的”或“基本上纯的”。
虽然该核酸组合物通常包含天然序列(除了修饰的限制位点等)，但是来自cDNA、基因组或其混合物的核酸组合物可替代地根据标准技术进行突变以提供改变的基因序列。对于编码序列，这些突变可根据需要修饰编码的氨基酸序列。具体地说，考虑了与本文描述的天然V、D、J序列、恒定序列、切换序列以及其它此类序列基本上同源的DNA序列。
术语“可操作地连接”是指使核苷酸序列与另一个核苷酸序列具有功能关系。举例来说，如果前序列或分泌性前导序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，那么该前序列或分泌性前导序列的DNA可操作地连接至多肽的DNA；如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么该启动子或增强子可操作地连接至该编码序列；或如果核糖体结合位点被放置成促进翻译，那么该核糖体结合位点可操作地连接至编码序列。通常，“可操作地连接”意指连接的DNA序列是邻接的，并且在分泌性前导序列的情况下连接的DNA序列是邻接的并且处于阅读相(reading phase)中。然而，增强子不是必须邻接的。通过在方便的限制性位点处的接合反应来实现连接。如果不存在此类位点，那么根据常规实践使用合成的寡核苷酸接头或连接体。当核酸与另一个核酸序列具有功能关系时，该核酸是“可操作地连接的”。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么该启动子或增强子是可操作地连接至该编码序列。关于转录调控序列，可操作地连接意指被连接的DNA序列是邻接的，并且在需要联接两个蛋白质编码区时，被连接的DNA序列是邻接的并且处于阅读框架中。对于切换序列，可操作地连接指示序列能够实现切换重组。
如本文所使用的术语“载体”，是指能够转运与其连接的另一个核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，该质粒是指另外的DNA片段可接合到其中的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中另外的DNA片段可以接合到病毒基因组中。某些载体能够在其被引入到其中的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其它载体(例如，非附加型哺乳动物载体)可以在被引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，并因此与宿主基因组一同进行复制。此外，某些载体能够指导与它们可操作地连接的基因的表达。这类载体在本文称为“重组表达载体”(或简称为，“表达载体”)。通常，在重组DNA技术中应用的表达载体经常以质粒的形式存在。术语“质粒”和“载体”可互换地使用。然而，也考虑了其它形式的表达载体，如病毒载体(例如，复制缺陷反转录病毒、腺病毒以及腺相关病毒)，其具有同等的功能。
如本文所使用的术语“重组宿主细胞”(或简称“宿主细胞”)，意图是指已经引入重组表达载体的细胞。应当理解的是，此类术语不仅指特定的对象细胞，而且指此类细胞的后代。因为由于突变或环境影响导致在后代中可能会出现某些改变，因而事实上，此类后代可能与母细胞不相同，但是它们仍然包括在如文所使用的术语“宿主细胞”的范围内。
如本文所使用的术语“治疗(treat、treating和treatment)”是指本文描述的治疗或预防措施。“治疗”的方法采用给受试者，例如，患有与EGFR依赖性信号转导相关的疾病或病症，或易患有此类疾病或病症的受试者施用本文公开的抗体或抗体二元组或三元组，以便预防、治愈、延迟该疾病或病症或者复发性疾病或病症、减轻其严重性，或改善该疾病或病症或复发性疾病或病症的一种或多种症状，或以便延长受试者的存活时间超过不存在此类治疗时预期的时间。
如本文所使用的术语“与EGFR依赖性信号转导相关的疾病”或“与EGFR依赖性信号转导相关的病症”包括其中发现EGFR的水平增加和/或涉及EGER的细胞级联的激活的疾病状态和/或与疾病状态相关的症状。术语“与EGFR依赖性信号转导相关的疾病”还包括与替代的EGFR信号转导途径的激活相关的疾病状态和/或症状。通常，术语“与EGFR依赖性信号转导相关的疾病”是指其发病、进展或症状的持续需要EGFR参与的任何病症。示例性的EGFR介导的病症包括，但不限于例如癌症。
术语“癌症”和“癌性”指的是或描述的是通常以不受调节的细胞生长为特征的哺乳动物的生理状况。癌症的实例包括，但不限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤以及白血病。此类癌症的更具体的实例包括：鳞状上皮细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃癌、胰腺癌、胶质细胞肿瘤如成胶质细胞瘤和神经纤维瘤病、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳癌、结肠癌、黑色素瘤、结肠直肠癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肾脏癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌以及各种类型的头颈癌。在具体的实施方案中，使用本文公开的方法治疗或诊断的癌症选自黑色素瘤、乳癌、卵巢癌、肾癌、肠胃/结肠癌、肺癌以及前列腺癌。
如本文所使用的术语“有效量”是指结合EGFR的抗体或其抗原结合部分的量，如本文所描述，当施用给受试者时，这个量足以影响与EGFR依赖性信号转导相关的疾病的治疗、预后或诊断。当单独使用或组合使用时，本文提供的抗体的治疗有效量将取决于抗体和组合的相对活性(例如，抑制细胞生长的活性)，并且取决于接受治疗的受试者和疾病状况、受试者的体重和年龄、疾病状况的严重性、施用方式等而变化，本领域普通技术人员可以很容易地确定治疗有效量。用于施用的剂量可以在以下范围内：例如，约1ng至约10,000mg、约5ng至约9,500mg、约10ng至约9,000mg、约20ng至约8,500mg、约30ng至约7,500mg、约40ng至约7,000mg、约50ng至约6,500mg、约100ng至约6,000mg、约200ng至约5,500mg、约300ng至约5,000mg、约400ng至约4,500mg、约500ng至约4,000mg、约1μg至约3,500mg、约5μg至约3,000mg、约10μg至约2,600mg、约20μg至约2,575mg、约30μg至约2,550mg、约40μg至约2,500mg、约50μg至约2,475mg、约100μg至约2,450mg、约200μg至约2,425mg、约300μg至约2,000、约400μg至约1,175mg、约500μg至约1,150mg、约0.5mg至约1,125mg、约1mg至约1,100mg、约1.25mg至约1,075mg、约1.5mg至约1,050mg、约2.0mg至约1,025mg、约2.5mg至约1,000mg、约3.0mg至约975mg、约3.5mg至约950mg、约4.0mg至约925mg、约4.5mg至约900mg、约5mg至约875mg、约10mg至约850mg、约20mg至约825mg、约30mg至约800mg、约40mg至约775mg、约50mg至约750mg、约100mg至约725mg、约200mg至约700mg、约300mg至约675mg、约400mg至约650mg、约500mg或约525mg至约625mg的抗体。可调整给药方案以提供最佳的治疗反应。有效量也是抗体的任何有毒或有害作用(即，副作用)被减至最低和/或被有益效果超过的有效量。
术语“治疗剂”意图涵盖任何和所有具有以下功能的化合物：降低或抑制疾病或病症的症状的严重性，或增加疾病或病症的无症状或症状减轻周期的频率和/或持续时间，或抑制或预防由于疾病或病症痛苦而引起的损伤或无力，或抑制或延缓疾病或病症的进展，或抑制或延缓疾病或病症的发病，或抑制或预防感染疾病或病症中的感染。治疗剂的非限制性实例包括小有机分子、单克隆抗体、双特异抗体、重组工程化生物制剂、RNAi化合物、酪氨酸激酶抑制剂以及商业化抗体。在某些实施方案中，酪氨酸激酶抑制剂包括，例如目前市售的药品尼洛替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)以及拉帕替尼(lapatinib)的一种或多种。市售药物抗EGFR抗体包括西妥昔单抗和帕尼单抗。其它药物抗EGFR抗体包括开发中的扎鲁目单抗(zalutumumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)以及马妥珠单抗(matuzumab)。
术语“患者”包括接受预防性或治疗性治疗的人和其它哺乳动物受试者。
术语“受试者”包括任何哺乳动物，例如，灵长类动物。举例来说，本文公开的方法和组合物可以用来治疗患有癌症的受试者。在具体的实施方案中，受试者是人。
术语“样本”是指从患者或受试者中取出的组织、体液或细胞(或任何前述的部分)。通常，将从患者中取出组织或细胞，但是也考虑了体内诊断。在实体肿瘤的情况下，组织样本可以从外科手术取出的肿瘤中取得，并且通过常规技术制备用于测试。在淋巴瘤和白血病的情况下，可以获得淋巴细胞、白血病细胞或淋巴组织(例如，从血液中获得白血病细胞)，并且适当地制备。包括尿、眼泪、血清、血浆、脑脊髓液、粪便、痰、细胞提取物等在内的其它样本也可以用于特定癌症。
本公开内容的各种方面进一步详细地描述在以下小节中。
II.用于生产抗体的方法
(i)单克隆抗体
单克隆抗体可以使用多种已知技术生产，如标准体细胞杂交技术、B淋巴细胞的病毒或致癌性转化，或者使用人抗体基因文库的酵母或噬菌体展示技术。在特定的实施方案中，该抗体是全人单克隆抗体。
因此，在一个实施方案中，使用杂交瘤方法产生结合EGFR的抗体。在这种方法中，可以用适宜的抗原免疫小鼠或其它合适的宿主动物，以便诱导出产生或能够产生将特异性结合至用于免疫的抗原的抗体的淋巴细胞。或者，可以在体外免疫淋巴细胞。然后可以使用适宜的融合剂如聚乙二醇使淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合从而形成杂交瘤细胞。测定其中正生长杂交瘤细胞的培养基生产针对该抗原的单克隆抗体的能力。在鉴定出产生具有期望特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，可以通过有限稀释程序对克隆进行亚克隆并且通过标准方法使克隆生长。用于这个目的的适宜培养基包括，例如，D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可以在体内生长，如在动物中的腹水瘤。可以通过诸如琼脂糖蛋白A、羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析或亲和层析的常规免疫球蛋白纯化程序，将该亚克隆分泌的单克隆抗体从培养基、腹水液或血清中分离出来。
在另一个实施方案中，可以从使用熟知技术如描述于例如以下专利中的那些技术产生的抗体文库中分离出结合EGFR的抗体：Ladner等的美国专利第5,223,409号、第5,403,484号和第5,571,698号；Dower等的美国专利第5,427,908号和第5,580,717号；McCafferty等的美国专利第5,969,108号和第6,172,197号；以及Griffiths等的美国专利第5,885,793号、第6,521,404号、第6,544,731号、第6,555,313号、第6,582,915号和第6,593,081号。另外，还可以使用通过链改组产生高亲和力(nM范围)人抗体的方法，以及组合感染(combinatorial infection)和体内重组作为用于构建非常大的噬菌体文库的策略。参见，例如美国专利申请第09/856,907号(PCT国际公布第WO 00/31246号)
在特定的实施方案中，使用噬菌体展示产生结合EGFR的单克隆抗体。这种技术涉及产生具有从人供体分离的免疫球蛋白序列的独特组合并且具有重链CDR的合成多样性的人Fab文库。然后筛选文库的结合至EGFR的Fab。
在又一个实施方案中，可以使用携带人免疫系统而不是小鼠系统的一部分的转基因或转染色体小鼠产生针对EGFR的人单克隆抗体(参见，例如，Lonberg和Kay的美国专利第5,545,806号，第5,569,825号，第5,625,126号，第5,633,425号，第5,789,650号，第5,877,397号，第5,661,016号，第5,814,318号，第5,874,299号和第5,770,429号；Surani等的美国专利第5,545,807号；Lonberg和Kay的PCT公布第WO92/03918号、第WO 93/12227号、第WO 94/25585号、第WO 97/13852号、第WO 98/24884号和第WO 99/45962号；以及Korman等的PCT公布第WO 01/14424号)。
在另一个实施方案中，可以使用在转基因和转染色体上携带人免疫球蛋白序列的小鼠，如携带人重链转基因和人轻链转染色体的小鼠产生人抗体(参见，例如，Ishida等的PCT公布WO 02/43478)。
更进一步地，表达人免疫球蛋白基因的替代转基因动物系统可在本领域中获得并且可以用来产生抗-EGFR抗体。例如，可以使用称作Xenomouse(Abgenix，Inc.)的替代转基因系统；此类小鼠描述在例如Kucherlapati等的美国专利第5,939,598号、第6,075,181号、第6,114,598号、第6,150,584号和第6,162,963号中。
而且，表达人免疫球蛋白基因的替代转染色体动物系统可在本领域中获得并且可以用来产生抗-EGFR抗体。例如，可以使用携带人重链转染色体和人轻链转染色体的小鼠。此外，携带人重和轻链转染色体的牛在本领域中已有描述并且可用来产生抗-EGFR抗体。
在又一个实施方案中，可以使用产生此类抗体的转基因植物和/或培养的植物细胞(如，烟草、玉米和浮萍)制备抗体。例如，通过例如使用诱导型启动子，可以使用表达抗体的转基因烟草叶产生此类抗体。转基因玉米也可以用来表达此类抗体及其抗原结合部分。也可以从包括抗体部分如单链抗体(scFv′s)的转基因植物种子，例如使用烟草种子和马铃薯块茎来大量地产生抗体。
结合使用包括本文公开的技术在内的任何技术制备的EGFR的单克隆抗体(或其部分)的结合特异性可以通过免疫沉淀法或通过体外结合测定，如放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)来测定。单克隆抗体或其部分的结合亲和力也可以通过Scatchard分析来测定。
在某些实施方案中，可以使用本领域公认的技术如本文描述的技术来进一步改变或优化使用上面讨论的任何方法产生的EGFR抗体，以获得期望的结合特异性和/或亲和力。
在一个实施方案中，源自EGFR抗体的部分抗体序列可以用来产生结构和功能上相关的抗体。例如，抗体主要通过位于六个重和轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基与靶抗原相互作用。因为这个原因，在单个抗体之间，CDR内的氨基酸序列比CDR外的序列更为多样化。因为CDR序列负责大部分抗体-抗原相互作用，因此可能通过构建表达载体来表达模拟特定天然存在的抗体的性质的重组抗体，所述表达载体包括来自特定天然存在的抗体的CDR序列，其被移植到来自具有不同性质的不同抗体的框架序列上。此类框架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库获得。
因而，抗-EGFR抗体的一个或多个结构特征，如CDR，可以用来创建保留了至少一种期望功能性质，例如，抑制表达EGFR的细胞生长的结构上相关的抗-EGFR抗体。
在特定的实施方案中，可通过重组方式将一个或多个选自SEQ IDNO：23-56的CDR区与已知的人框架区和CDR组合，从而创建另外的经重组工程化的抗-EGFR抗体。重和轻链可变框架区可以源自相同或不同的抗体序列。
本领域熟知，抗体重和轻链CDR3结构域在抗体对抗原的结合特异性/亲和力中起着特别重要的作用。因此，在某些实施方案中，产生包括本文描述的特定抗体的重和/或轻链CDR3的抗体。该抗体可以进一步包括本文公开的抗体的重和/或轻链CDR1和/或CDR2。
以上描述的工程化抗体的CDR 1、2和/或3区可以包含一个(多个)确切的氨基酸序列，如本文描述的那些。然而，普通技术人员将会意识到，与确切CDR序列有一些偏差是可能的，特别是对于CDR1和CDR2序列而言更是如此，CDR1和CDR2序列与CDR3序列相比可以容忍更多的变化，而不改变表位特异性(此类偏差是例如保守性氨基酸取代)。因此，在另一个实施方案中，工程化抗体可以由一个或多个CDR1和CDR2构成，所述CDR与本文命名的抗体的相应CDR具有例如90％、95％、98％、99％或99.5％的同一性。
在另一个实施方案中，可以改变CDR的一个或多个残基以改变结合从而获得更有利的结合速率。使用这种策略，可以获得具有例如1010M-1或更高的超高结合亲和力的抗体。可以使用本领域熟知以及本文描述的亲和力成熟技术来改变一个(多个)CDR区，接着筛选产生的结合分子的期望的结合变化。因此，当改变一个(多个)CDR时，可以监测结合亲和力及免疫原性的变化并且加以评分，以便获得针对最佳的结合和低免疫原性组合优化的抗体。
可以在抗体的重和/或轻链可变区的框架区或连接区的一个或多个中进行修饰，只要在这些修饰之后的抗原结合亲和力优于106M-1即可。
在另一个实施方案中，针对效应子功能进一步修饰抗体，以便增强抗体治疗例如癌症的有效性。例如，可以在Fc区中引入一个(多个)半胱氨酸残基，由此允许在这个区中形成链间二硫键。由此产生的同型二聚体抗体可能具有提高的内化能力和/或增强的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)。也可以使用异双功能交联剂制备具有增强的抗肿瘤活性的同型二聚体抗体。或者，具有双Fc区的抗体可被工程化改造并且可能因此具有增强的补体溶解和ADCC能力。
还提供了双特异性抗体和免疫缀合物，如下所讨论。
(ii)双特异性抗体
本文的双特异性抗体包括优选结合非重叠或非竞争表位的至少两种针对EGFR的结合特异性。此类双特异性抗体可以包括另外的结合特异性，例如，第三EGFR结合特异性和/或针对另一种ErbB受体(例如，ErbB3)或另一种抗原如癌基因产物的结合特异性。双特异性抗体可以被制备成全长抗体或抗体片段(例如，F(ab′)2双特异性抗体)。
用于制备双特异性抗体的方法是本领域熟知的(参见例如，WO05117973和WO 06091209)。例如，全长双特异性抗体的产生可以基于两个配对的免疫球蛋白重链-轻链的共表达，其中该两条链具有不同的特异性。用于制备和直接从重组细胞培养物中分离双特异性抗体片段的各种技术也已经有所描述。例如，已使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体。还报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体制备双特异性抗体片段的另一种策略。
在特定的实施方案中，双特异性抗体包含结合至EGFR的第一抗体(或其结合部分)，所述第一抗体(或其结合部分)用另一种功能性分子衍生化或连接至另一种功能性分子，例如另一种肽或蛋白质(例如，受体的另一种抗体或配体)从而产生结合至至少两个不同结合位点或靶分子的双特异性分子。抗体可以用一种以上的其它功能性分子衍生化或连接至一种以上的其它功能性分子，从而产生结合至两个以上的不同结合位点和/或靶分子的多特异性分子；此类多特异性分子也意图包括在如本文使用的术语“双特异性分子”中。为了创建双特异性分子，本文公开的抗体可以功能性连接(例如，通过化学偶联、基因融合、非共价缔合或其它方式连接)至一种或多种其它结合分子，如另一种抗体、抗体片段、肽或结合模拟物，使得产生双特异性分子。
因此，考虑了包含至少一种对EGFR的第一结合特异性和对第二靶表位的第二结合特异性的双特异性分子。在特定的实施方案中，第二靶表位是Fc受体，例如，人FcγRI(CD64)或人Fcα受体(CD89)。因此，还提供了既能够结合至表达FcγR、FcαR或FcεR的效应细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞或多形核细胞(PMN))，又能够结合至表达EGFR的靶细胞的双特异性分子。这些双特异性分子可使表达EGFR的细胞靶向效应细胞，并且可触发Fc受体介导的效应细胞活性，如表达EGFR的细胞的吞噬作用、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、细胞因子释放或过氧化物阴离子的产生。
在一个实施方案中，双特异性分子包含作为结合特异性的至少一种抗体，或其抗体片段，包括例如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv或单链Fv。所述抗体也可以是轻链或重链二聚体，或其任何最小片段如Fv或如在Ladner等的美国专利第4,946,778中描述的单链构建体。
可以使用本领域已知的方法，通过缀合成分结合特异性，例如抗FcR和抗EGFR结合特异性来制备双特异性分子。例如，可以分别产生双特异性分子的每种结合特异性，然后使它们彼此缀合。当结合特异性为蛋白质或肽时，可将多种偶联或交联剂用于共价缀合。交联剂的实例包括蛋白质A、碳化二亚胺、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)、5，5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻苯二马来酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)和磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)。优选的缀合剂为SATA和磺基-SMCC，均可得自Pierce Chemical Co.(Rockford，IL)。
当结合特异性为抗体时，它们可经由两个重链的C端铰链区的巯基键合而发生缀合。在特别优选的实施方案中，在缀合前修饰铰链区以包含奇数个巯基残基，优选1个。
或者，两种结合特异性可以在同一载体中编码，并且在同一宿主细胞中表达并装配。这种方法在双特异性分子为mAb x mAb、mAb x Fab、Fab x F(ab′)2或配体x Fab融合蛋白时特别有用。双特异性分子可以是包含一个单链抗体和结合决定蔟的单链分子，或者包含两个结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性分子可以包含至少两种单链分子。用于制备双特异性分子的方法描述于例如美国专利第5,260,203号、美国专利第5,455,030号、美国专利第4,881,175号、美国专利第5,132,405号、美国专利第5,091,513号、美国专利第5,476,786号、美国专利第5,013,653号、美国专利第5,258,498号和美国专利第5,482,858号。
双特异性分子与其特异性靶标的结合可通过例如酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射性免疫测定法(RIA)、FACS分析、生物测定(例如，生长抑制)，或Western印迹测定来证实。这些测定中的每一种一般都通过采用对感兴趣复合物具有特异性的标记的试剂(例如，抗体)来检测特别感兴趣的蛋白质-抗体复合物的存在。例如，FcR-抗体复合物可使用例如识别并特异性结合至抗体-FcR复合物的酶联抗体或抗体片段来检测。或者，该复合物可使用多种其它免疫测定中的任一种来检测。例如，抗体可被放射性标记并用于放射性免疫测定(RIA)。放射性同位素可通过诸如使用γ.-计数器或闪烁计数器的方法来检测，或者通过放射性自显影来检测。
(iii)免疫缀合物
本文提供的免疫缀合物可以通过使本文描述的抗体与另一种治疗剂缀合来形成。合适的试剂包括，例如，细胞毒性剂(例如，化疗剂)、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的有酶活性的毒素，或其片段)和/或放射性同位素(即，放射性缀合物)。
以上已描述了可用于制取此类免疫缀合物的化疗剂。可使用的有酶活性的毒素及其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自绿脓假单胞菌)、篦麻毒素A链、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-八叠球菌毒素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、泻果素、巴豆毒素、石碱草(sapaonariaofficinalis)抑制剂、白树毒素、丝林霉素、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素和单端孢霉烯类(tricothecene)。有多种可用于制备放射性缀合的抗EGFR抗体的放射性核素。实例包括212Bi、131I、131In、90Y和186Re。
免疫缀合物可使用诸如以下的多种双功能蛋白偶联剂制备：N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基双硫醇)丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫杂环戊烷(iminothiolane)(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(如二亚胺代己二酸二甲酯HCL)、活性酯类(如双琥珀酰亚胺基辛二酸酯)、醛(如戊二醛(glutareldehyde))、二叠氮基化合物(如二-(p-叠氮基苯甲酰基)己烷二胺)、二-重氮鎓衍生物(如二-(p-重氮鎓苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如甲代亚苯基2，6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。碳-14-标记的1-异硫氰基苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是将放射性核苷酸缀合至抗体的示例性螯合剂(参见，例如WO94/11026)。
III.筛选抗体的方法
在生产抗体之后，可以使用本领域熟知的多种测定法筛选所述抗体的各种性质，如本文描述的那些。
在一个实施方案中，使用例如纯化的EGFR和/或EGFR-表达细胞如A431细胞，筛选所述抗体的对EGFR的结合(例如，通过流式细胞术或ELISA)。可以进一步鉴定和比较由抗EGFR抗体结合的表位，例如，以鉴定非竞争性抗体(例如，结合不同表位的抗体)，以及竞争结合和/或结合相同或重叠表位的抗体。
竞争性抗体(如与在上表I和II中列出的任何抗体竞争结合至EGFR的抗体)和非竞争性抗体可使用常规技术鉴定。此类技术包括例如，显示出一种抗体阻断(或不阻断)另一种抗体与靶抗原结合的能力的免疫测定，即竞争结合测定。在测试下的免疫球蛋白抑制参考抗体与共同抗原如EGFR特异性结合的测定中确定竞争性结合。已知许多类型的竞争结合测定，例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定、固相直接生物素-亲和素EIA、固相直接标记测定、固相直接标记的夹心测定、固相直接125I标记的RIA、固相直接生物素-亲和素EIA以及直接标记的RIA。下面实施例的材料和方法以及实施例2中陈述的表面等离子体共振技术也可以有利地用于此目的。通常，此种测定涉及使用结合至固体表面的纯化抗原，或携带这些中的任一种的细胞、未标记的测试免疫球蛋白和标记的参考免疫球蛋白。竞争性抑制通过在测试免疫球蛋白存在下测定结合至固体表面或细胞的标记的量来测量。通常测试免疫球蛋白过量存在。通常，当竞争抗体过量存在时，它将抑制参考抗体与共同抗原的特异性结合至少达50-55％、55-60％、60-65％、65-70％、70-75％或更高。
用于确定由本文公开的抗体结合的表位的其它筛选技术包括，例如，抗原：抗体复合物晶体的x射线分析，该分析提供了表位的原子解析率(atomic resolution)。其它方法监测抗体与抗原片段或抗原的突变变异的结合，其中由抗原序列内的氨基酸残基的修饰造成的结合的丧失通常被认为是表位组分的指示。另外，还可以使用用于表位作图的计算组合方法。这些方法依赖于感兴趣抗体从组合噬菌体展示肽文库中亲和力分离特异性短肽的能力。然后这些肽被视为用于定义对应于用来筛选肽文库的抗体的表位的线索(lead)。对于表位作图，还已经开发了被证明可对构象不连续表位进行作图的计算算法。
在另一个实施方案中，筛选抗体(例如，非竞争性抗体抗EGFR抗体)的在结合至配体例如EGF后结合至暴露表位(即，不抑制EGFR-结合配体与EGFR结合)的能力。此类抗体可以通过例如，在不存在抗EGFR抗体(对照)或存在抗EGFR抗体的情况下使表达EGFR的细胞(例如，A431细胞)与标记的EGFR配体(例如，放射性标记或生物素化的EGF)接触来鉴定。如果所述抗体不抑制EGF结合至EGFR，那么相对于在不存在抗体时的量，将会观察到回收的标记的量没有发生统计学显著性降低。或者，如果所述抗体抑制EGF结合至EGFR，那么相对于在不存在抗体时的量，将会观察到回收的标记的量统计学显著性降低。
还可以筛选(测试)抗体的结合亲和力。这可以例如使用例如如下面描述的等离子体共振测定完成。
还可以使用信号转导测定如本文描述的那些，筛选抗体抑制经由EGFR的信号转导的能力。例如，抗体抑制EGFR配体介导的EGFR磷酸化的能力可通过在存在或不存在抗体的情况下用EGFR配体(例如，EGF)处理表达EGFR的细胞来评估。然后可以裂解细胞，离心粗裂解产物从而除去不溶性物质，并例如通过Western印迹以及随后用抗磷酸酪氨酸抗体探测来测量EGFR磷酸化。
或者，抗体抑制经由EGFR的下游信号转导的能力可以在用EGF配体进行EGFR刺激后，通过EGFR的已知底物如AKT和/或ERK的激酶测定来测量。例如，可以用EGF配体刺激表达EGFR的细胞，并且使该细胞与候选抗体一起孵育。随后由此类细胞制备的细胞裂解产物可与EGFR底物(或涉及EGFR的细胞途径中的蛋白质)的抗体如抗AKT抗体一起免疫沉淀，并且使用本领域公认的技术测定激酶活性(例如，AKT激酶活性)。相对于在不存在抗体时的水平或活性，存在抗体时EGFR底物或涉及EGFR的途径中的蛋白质的水平或活性(例如，激酶活性)的降低或完全消失指示抑制EGFR信号转导的抗体。
降低细胞表面上EGFR的水平的抗体可以通过其下调或抑制肿瘤细胞上EGFR的表达的能力来鉴定。在某些实施方案中，抗体通过诱导EGFR的内化(或增加EGFR的胞吞作用)(例如通过受体的内化和再循环和/或受体的内化和降解)来降低细胞表面上的EGFR。为了测试这一点，EGFR可以被生物素化，并且细胞表面上的EGFR分子数量可以很容易地例如通过在存在或不存在抗体情况下测量培养物中细胞单层上的生物素量，接着使EGFR免疫沉淀并用链霉亲和素探测来进行测量。在存在抗体情况下检测到生物素化EGFR随着时间的推移降低，指示抗体降低了细胞表面上的EGFR水平。
还可以使用本领域公认的技术，包括在下面实施例中描述的CellTiter Glow测定和氚标记的胸苷掺入测定，测试抗体和抗体组合的抑制(体内或体外抑制)表达EGFR的细胞，如肿瘤细胞的生长的能力。还可以筛选抗体的抑制表达EGFR的细胞的球状体生长的能力。这可以通过使用如本文所描述的接近发育中的肿瘤生长的条件的测定来完成。
在另一个实施方案中，筛选抗EGFR抗体的组合的有关抑制特定EGFR活性或功能，如EGFR-介导的信号转导的IC50和/或IC90值(例如，如通过ELISA、Western或多重(multiplex)方法，如Luminex
Figure BPA00001657524300431
测量的)。然后可以选择抗体的组合，该组合中的每一种抗体均具有特别期望的IC50和/或IC90值(例如，用于抑制EGFR信号转导的约80nM的IC90)。在一个实施方案中，该组合具有比已知参考抗体(例如，西妥昔单抗(cetuximab))高的IC50或IC90值。在另一个实施方案中，该组合具有相加的IC50或IC90(即，抗体在单独作用于表达EGFR的细胞时的活性总和约等于相同抗体一起作用于相同细胞时的联合效果)。在另一个实施方案中，该组合具有协同的IC50或IC90(即，抗体在单独作用于表达EGFR的细胞时的效果总和小于相同抗体一起作用于相同细胞时的联合效果)。
IV.药物组合物
在另一方面，本文提供了组合物，例如，药物组合物，其含有与药学上可接受的载体一起配制的单克隆抗体的一种或组合。在一个实施方案中，该组合物包括结合EGFR上的不同表位的多种(例如，两种或更多种)分离的抗体的组合。此类抗体优选具有有关抑制特定EGFR活性或功能如EGFR介导的信号转导的相加或协同效应。
如本文使用的“药学上可接受的载体”包括任何和所有生理相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。优选地，该载体适于静脉内、肌肉内、皮下、肠胃外、脊髓或表皮施用(例如，通过注射或输注施用)。根据不同的施用途径，可以将活性化合物，即抗体、双特异性和多特异性分子，包裹在某种材料中，以保护该化合物免受酸作用和其它可能使该化合物失活的自然条件的影响。
组合物可以单独施用或以联合治疗施用，即，与其它药剂联合施用。例如，联合治疗可以包括本文提供的组合物以及至少一种或多种另外的治疗剂如本文描述的抗癌剂。该组合物还可以与放射治疗和/或手术联合施用。抗EGFR抗体的特定组合也可以与或不与另外的治疗剂分开施用或顺序施用。
组合物可以通过本领域已知的多种方法施用。如本领域技术人员将会意识到的，施用途径和/或模式将根据期望的结果而改变。抗体可与将保护该抗体以防止其快速释放的载体一起制备，例如控释制剂，包括植入物、透皮贴片和微囊化递送系统。可以使用可生物降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。许多用于制备此类制剂的方法已经获得专利或是本领域技术人员普遍已知的。
为通过一定施用途径施用组合物，该成分(例如，抗体)可能需要用某种材料包裹或与某种材料共同施用该组合物以防止其失活。例如，可以将组合物在适当的载体，例如脂质体或稀释剂中施用给受试者。可接受的稀释剂包括盐水和水性缓冲液。脂质体包括水包油包水CGF乳液以及常规脂质体。
可接受的载体包括无菌水溶液或分散体以及用于即时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。此类介质和试剂在药物活性物质中的应用是本领域已知的。除了任何与抗体不相容的常规介质或试剂外，其它常规介质或试剂在本文提供的组合物中的应用都在考虑之中。补充活性成分也可以掺入到组合物中。
治疗组合物通常必须是无菌的并且在制造和储存条件下必须是稳定的。该组合物可被配制成为溶液、微乳液、脂质体或适用于高药物浓度的其它有序的结构。该载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)的溶剂或分散介质及其合适的混合物。可以例如通过使用涂层如卵磷脂、在分散体的情况中通过维持需要的颗粒大小和通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。在许多情况下，组合物中优选包含等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇或氯化钠。可以通过向组合物中引入延缓吸收的试剂，例如单硬脂酸盐和明胶来延长可注射组合物的吸收。
可无菌注射溶液，方式是将所需量的单克隆抗体和根据需要的上述所列成分的一种或组合掺入到适当的溶剂中，然后再进行无菌微过滤。一般而言，分散体是通过将抗体掺入到含有基本分散介质和来自上述列举的成分的所需其它成分的无菌媒介物中制备的。对于用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况，优选的制备方法为真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其产生活性成分加上来自其此前无菌过滤的溶液的任何需要的附加成分的粉末。
调节给药方案以提供期望的最佳反应(例如，治疗反应)。例如，可以单次施用大丸剂，可以随着时间的推移分几次剂量施用，或者剂量可以根据治疗状况的紧急程度成比例地降低或增加。例如，人抗体可以经皮下注射每周施用一次或两次，或者经皮下注射每月施用一次或两次。
将肠胃外施用组合物配制成剂量单位形式以便于施用和剂量均匀是尤其有利的。如本文使用的单位剂量形式是指适于作为单一剂量给予待治疗受试者的物理上分散的单元；每个单元均含有经计算与所需药物载体结合能够产生期望的治疗效果的预定量的抗体。本文提供的剂量单位形式的规格由(a)抗体的独特性质和需要达到的特定治疗效果，和(b)配制此类活性化合物用于个体中的灵敏治疗的领域中固有的局限规定，或直接取决于这些因素。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、偏亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基茴香醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
对于治疗组合物而言，制剂包括适于经口、经鼻、局部(包括口腔和舌下)、直肠和肠胃外施用的制剂。肠胃外施用是包含抗体的治疗组合物的最常见施用途径。该制剂可以方便地以单位剂量形式存在，并且可以通过药学领域已知的任何方法进行制备。可以与载体材料组合以制成单一剂量形式的抗体的量将会根据接受治疗的受试者和特定的施用模式而变化。这种抗体的量一般为足以产生治疗效果的量。一般而言，在一百的百分比中，这种量以质量计为约0.001百分比至约90百分比的抗体，优选为约0.005百分比至约70百分比，最优选为约0.01百分比至约30百分比。
如本文使用的短语“肠胃外施用”和“经肠胃外施用”是指除肠内和局部施用方式之外的施用方式，通常是经注射施用，并且包括但不局限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、心室内(intraventricular)、囊内、眼眶内、心脏内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。本文提供的药物组合物中可以使用的合适的水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油如橄榄油和可注射有机酯如油酸乙酯。可以例如通过使用包衣材料如卵磷脂、在分散剂的情况中通过维持所需的颗粒大小以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。
这些组合物还可以含有佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。本领域熟知的佐剂的特定实例包括例如无机佐剂(如铝盐，例如磷酸铝和氢氧化铝)、有机佐剂(例如，角鲨烯)、油基佐剂、病毒颗粒(例如，含有源自流感病毒的膜结合性血凝素(heagglutinin)和神经氨酸酶的病毒颗粒)。
既可以通过灭菌程序，也可以通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等来防止微生物的出现。还可能希望在组合物中包含等渗剂，例如糖、氯化钠等。另外，可以通过包含一种或多种延缓吸收的试剂如单硬脂酸铝或明胶来延长可注射的药物形式的吸收。
当组合物作为药物施用给人和动物时，它们可以单独给予，或者作为含有例如与药学上可接受载体结合的0.001％至90％(更优选0.005％至70％，例如0.01％至30％)的活性成分的药物组合物给予。
不管所选择的施用途径如何，本文提供的组合物可以合适的水合形式使用，并且它们可以通过本领域技术人员已知的常规方法配制成为药学上可接受的剂型。
本文提供的药物组合物中抗体的实际剂量水平可以改变以便获得对于特定患者、组合物和施用模式有效地实现期望的治疗反应而不会对患者产生毒性效应的活性成分的量。所选的剂量水平将取决于多种药代动力学因素，包括所采用的特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性；施用途径；施用时间；所使用的特定化合物的排泄率；治疗持续时间；与所使用的特定组合物联合使用的其它药物、化合物和/或材料；接受治疗的患者的年龄、性别、体重、状态、总体健康水平和之前的病史；以及医学领域熟知的类似因素。具有本领域普通技能的医生或兽医可以容易地确定和指定所需的组合物的有效量。例如，医生或兽医可以以低于达到期望治疗效果所需的水平的抗体的剂量开始，并逐渐增加剂量直到达到期望的效果为止。一般而言，本文提供的组合物的合适日剂量将为作为对产生治疗效果有效的最低剂量的抗体的量。此种有效剂量一般取决于上述因素。优选的是，施用方式为静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下施用，优选接近靶标位点施用。如果需要的话，治疗组合物的有效日剂量可以在整日时间内以适当的间隔以两个、三个、四个、五个、六个或更多个亚剂量独立地施用，任选地以单位剂量形式施用。尽管抗体单独施用是可能的，但是优选将抗体作为制剂(组合物)来施用。
可以使用本领域已知的医疗装置来施用治疗组合物，例如，美国专利第5,399,163号、第5,383,851号、第5,312,335号、第5,064,413号、第4,941,880号、第4,790,824号、第4,596,556号、第4,487,603号、第4.,486,194号、第4,447,233号、第4,447,224号、第4,439,196号和第4,475,196号中公开的医疗装置。
在某些实施方案中，该单克隆抗体可被配制以确保适当的体内分布。例如，血脑屏障(BBB)排除了许多高亲水性化合物。为了确保治疗抗体能够通过BBB(如果需要的话)，它们可被配制例如在脂质体中。对于制造脂质体的方法，参见，例如美国专利第4,522,811号、第5,374,548号、第5,399,331号、第5,891,468号、第6,056,973号、第6,210,707号、第6,224,903号、第6,316,024号、第7,122,202号、第7,135,177号和第7,507,407号以及美国专利公布20070116753。该脂质体可以包含一个或多个连接至和/或被选择性地转运至特定细胞或器官中的部分，因此能够提高靶向的药物递送。
本发明提供了包含抗EGFR抗体的三元组的药物组合物，即，该组合物包含三种不同的抗EGFR抗体，优选彼此之间不交叉竞争结合至EGFR和/或彼此之间结合至EGFR上不同表位的三种不同抗体。除了三种抗体之外，这些药物组合物可以包含药学上可接受的载体和/或一种(多种)其它赋形剂如上面详细描述的那些。该药物组合物可以在含有所有三种抗体的单个容器中提供，或者替代地，该药物组合物可以包含含有三个不同容器的包装，每个容器均含有三种不同的抗EGFR抗体中的一种(以及药学上可接受的载体和/或一种(多种)如上所述的其它赋形剂)。
例如，本发明提供了抗EGFR抗体的三元组(三种抗体，或三元抗体)的药物组合物，其中三元组的一种抗体与如本文定义的Bin1抗体竞争结合，或与所述Bin1抗体结合至相同表位，三元组的第二抗体与如本文定义的Bin2抗体竞争结合，或与所述Bin2抗体结合至相同表位，并且三元组的第三抗体与如本文定义的Bin3抗体竞争结合，或与所述Bin3抗体结合至相同表位。因而，在一个实施方案中，本发明提供了包含第一抗体、第二抗体和第三抗体的抗EGFR抗体三元组的药物组合物，其中(i)第一抗体与选自由va、vb和vc组成的组的抗体或选自由ca、cb和cc组成的组的抗体竞争结合，或者与所述抗体结合至相同表位；(ii)第二抗体与选自由vd、ve、vf、vg和vh组成的组的抗体或选自由cd、ce和cf组成的组的抗体竞争结合，或者与所述抗体结合至相同表位；(iii)第三抗体与选自由vi和vj组成的组的抗体或选自由cg、ch、ci、cj和ck组成的组的抗体竞争结合，或者与所述抗体结合至相同表位。
例如，本发明提供了包含含有第一抗体、第二抗体和第三抗体的抗EGFR抗体的三元组的药物组合物，其中(i)第一抗体与抗体ca(包含分别在SEQ ID NO：29、30和34中列出的重链CDR 1、2和3，以及分别在SEQ ID NO：48、45和49中列出的轻链CDR 1、2和3)竞争结合，或者与所述抗体ca结合至相同表位；(ii)第二抗体与抗体cd(包含分别在SEQID NO：29、30和31中列出的重链CDR 1、2和3，以及分别在SEQ IDNO：53、54和55中列出的轻链CDR 1、2和3)竞争结合，或者与所述抗体cd结合至相同表位；以及(iii)第三抗体与抗体ch(包含分别在SEQID NO：23、24和26中列出的重链CDR 1、2和3，以及分别在SEQ IDNO：39、40和42中列出的轻链CDR 1、2和3)竞争结合，或者与所述抗体ch结合至相同表位。抗体ca、cf和ch的三元组合在本文还被描述为表IV中列出的抗体三元组4c。
本发明还提供了上述的抗EGFR抗体的三元组在制造用于治疗与EGFR依赖性信号转导相关的疾病的药剂中的用途。本发明还提供了上述的抗EGFR抗体的三元组在制造用于治疗癌症的药剂中的用途，所述癌症为，例如表达EGFR的癌症，如包括但不限于以下的癌症：黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、肾癌、胃肠道癌、结肠癌、肺癌、胰腺癌、皮肤癌、头和颈部癌、胶质母细胞瘤、前列腺癌和其它实体和/或转移性肿瘤。
V.使用抗体的方法
还提供了在包括多种癌症在内的涉及EGFR依赖性信号转导的多种离体和体内诊断和治疗应用中使用结合EGFR的抗体的方法。
因此，在一个实施方案中，提供了用于治疗与EGFR依赖性信号转导相关的疾病的方法，方式是向受试者施用对于治疗该疾病有效的量的抗体或优选本文提供的抗体的组合。合适的疾病包括，例如，多种癌症，包括但不限于，黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、肾癌、胃肠道癌、结肠癌、肺癌、胰腺癌、皮肤癌、头和颈部癌、胶质母细胞瘤、前列腺癌和其它实体和/或转移性肿瘤。
抗体可以单独施用或者与另一种与该抗体结合或协同发挥作用的治疗剂一起治疗与EGFR介导的信号转导相关的疾病。此类治疗剂包括本文描述的治疗剂，例如，小有机分子、单克隆抗体、双特异性抗体、重组工程化生物制剂、RNAi化合物、酪氨酸激酶抑制剂和商业化抗体以及抗癌剂(例如，细胞毒素、化疗剂、小分子和放射治疗)。
还提供了包含任选地包含在单个小瓶中的一种或多种抗EGFR抗体的试剂盒，并且包括例如治疗或诊断与EGFR上调和/或EGFR依赖性信号转导相关的疾病的使用说明书。该试剂盒可以包括指示试剂盒内容物的预期用途的标签。术语标签包括提供在试剂盒上或与试剂盒在一起提供的，或以其它方式随试剂盒提供的任何文字、销售材料或记录材料。
其它实施方案描述在下列非限制性实施例中。
实施例
实施例1-5的材料和方法
在整个实施例1-5中，除非另外说明，否则使用下列材料和方法。
一般而言，除非另外指出，否则使用化学、分子生物学、重组DNA技术、免疫学(尤其例如，抗体技术)的常规技术和多肽制备的标准技术。
细胞系
在下述实验中使用的所有细胞系都获自National Cancer Institute或ATCC。
细胞系：
A431-表皮样癌
OVCAR-3-卵巢癌
Du 145-前列腺癌
ADRr-乳腺癌
肿瘤细胞的粉碎
使用深冷粉碎机(COVARIS Inc.)粉碎肿瘤。将肿瘤储存在特殊的袋子中(在添加肿瘤之前预先称重)，并在对肿瘤进行操作时将肿瘤置于液氮中。对于小肿瘤，首先向容纳肿瘤的袋子中加入200μL裂解缓冲液，在液氮中冷冻，并且然后再粉碎以提高袋子中肿瘤的回收率。将粉碎的肿瘤转移至2mL EPPENDORF管中，并置于液氮中直至准备进行进一步的加工。
肿瘤细胞裂解
在补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液中裂解肿瘤。将裂解缓冲液加入到肿瘤等分试样中，最终浓度为约62.5mg/mL。将肿瘤样本通过涡旋匀化30秒，并在冰上孵育大约30min。将裂解产物在QiagenQIASHREDDER柱上旋转约10min，以进一步匀化样本。将澄清的裂解产物在等分到新管中以用于进一步处理。
BCA测定
按照厂商的方案对所有肿瘤样本进行BCA测定(Pierce)。每个肿瘤样本的总蛋白浓度(以mg/mL计)随后用于ELISA结果的归一化。
ELISA测定
用于总的和磷酸-EGFR ELISA的所有ELISA试剂均作为Duoset试剂盒购自于R&D Systems。使用50μL抗体包被96半孔GREINER高结合板(Cat.#675077；GREINER BIO-ONE，Monroe，NC)，并在室温下孵育过夜。第二日早上，在BIOTEK板洗涤器中使用PBST(0.05％Tween-20)以1000μl/孔洗涤板三次。然后在室温下使用含2％BSA的PBS封闭板约一个小时。在BIOTEK板洗涤器中使用PBST(0.05％Tween-20)以1000μl/孔洗涤板三次。然后将50μL细胞裂解产物和稀释于50％裂解缓冲液和1％BSA中的标准品一式两份用于进一步处理。将样本在振荡下在4℃孵育2hr并在BIOTEK板洗涤器中用PBST(含有0.05％Tween-20的PBS)以1000μl/孔洗涤三次。将约50μl的检测抗体稀释在2％BSA中，加入PBST并在室温下孵育约1小时。对于磷酸-EGFR，使检测抗体与辣根过氧化物酶(HRP)直接缀合并在室温下孵育2hr。在BIOTEK板洗涤器中使用PBST(0.05％Tween-20)以1000μl/孔洗涤板3次。加入约50μl链霉亲和素-HRP并在室温下孵育30min(除pErbB3以外)。在BIOTEK板洗涤器中使用PBST(0.05％Tween-20)以1000μl/孔洗涤板3次。加入约50μL SUPERSIGNAL PICO ELISA底物并使用Fusion板阅读器读板。使用EXCEL分析数据。取重复样本的平均值并且使用误差条来代表两次重复试验之间的标准偏差。
AKT和/或ERK信号转导的抑制
EGFR介导的经由AKT或ERK的信号转导使用本领域公认的技术使用用于此类蛋白质的激酶测定来测量。参见，例如，美国专利公布第2010-0056761号。
EGFR二聚化测定
为了测量细胞中EGFR的均二聚程度，利用使用两类表位标记的EGFR构建体的共沉淀测定，例如，分别在EGFR的C端区域中含有Flag和Myc标签的EGFR-flag和EGFR-myc。将EGFR-flag和EGFR-myc共转染到细胞中，例如COS-7细胞中并在无血清培养基中孵育。使细胞裂解产物与抗Flag抗体沉淀并通过Western印记使用抗Myc抗体分析沉淀的材料，反之亦然。在存在抗体和不存在抗体(对照)的情况下测量并比较EGFR-myc与抗Flag抗体的共沉淀量，以及EGFR-flag与抗Myc抗体的共沉淀量。
EGFR内化测定
为了测量EGFR内化程度(即，EGFR表达的降低)，在存在和不存在(对照)抗体的情况下孵育表达放射性标记的EGFR(例如，125I)的细胞。测定并比较内化和表面放射性的比率。
结合亲和力
可采用两种独立的技术，例如表面等离子体共振测定和细胞结合测定使用A431细胞测量抗EGFR抗体的解离常数。还使用KinExA仪器(SAPIDYNE Instruments，Boise，ID)在含有重组EGF受体的溶液中测量抗体的亲和力和交叉反应性。该程序使用12种在5mL管中制备的ErbB1.6his的三倍滴定稀释液(1000nM、333nM、111nM、37nM、12.3nM、4.1nM、1.37nM、450pM、150pM、50pM、17pM)，保持每根管中的抗体浓度恒定在250pM。通过1∶1000稀释储备溶液(2mg/mL)来制备15mL 2ug/mL Cy5标记的Gα人IgG二抗。根据SAPIDYNE’sKinExA方案使ErbB1.6HIS缀合的PMMA珠粒偶联。将100ugErbB1-6his加入到预先测量的200mg PMMA珠粒的等分试样中。然后向该溶液中加入1X PBS从而使最终体积为1ml。然后将这种溶液在室温下孵育1hr。然后将珠粒转移到含有27ml 1X PBS的珠粒小瓶中。然后通过在KinExA Pro软件中输入参数来设置实验。
表面等离子体共振测定
表面等离子体共振测定如下进行。
利用胺偶联使抗体或抗原(300RU)固定在CM5芯片上。然后注射不同浓度的抗体或抗原以研究它们与固定蛋白质的缔合和解离。在不同的注射之间，使用合适的再生缓冲液(如甘氨酸，pH 2.5)使该芯片再生。使用方程1拟合解离阶段以确定Koff(解离速率)；
R＝Ro*exp(-Koff*t)    (1)
使用这个Koff值和方程2拟合缔合阶段以确定Kon(缔合速率)和KD(平衡常数)。
R = R max * C K a + C ( 1 - exp ( - ( K on * C + K off ) t ) - - - ( 2 )
其中C代表溶液中的抗原或抗体浓度，Rmax代表饱和信号并且t代表时间。
细胞结合测定
用于确定KD值的细胞结合测定如下进行：使用3mL胰蛋白酶-EDTA在37℃下使A431细胞脱壁5分钟。立即向胰蛋白酶化细胞中加入完全DMEM(10mL)，温和地重悬，并使用Beckman台式离心机在1100rpm下旋转5分钟。将细胞以2×106个细胞/毫升的浓度重悬在染色缓冲液(PBS+0.2％BSA+0.1％叠氮化钠)中，并将50μl(1×105个细胞)等分试样接种到96孔滴定板中。
在染色缓冲液中制备300μl 2000nM抗-EGFR抗体的储备溶液，并将其中的100μl连续稀释为200μl染色缓冲液。稀释的抗体的浓度在2000nM至0.1nM的范围内。然后向50μl细胞悬浮液中直接加入150μl不同蛋白质稀释液等分试样，使抗体的最终浓度为1500nM、500nM、166.7nM、55.6nM、18.5nM、6.17nM、2.05nM、0.68nM、0.23nM和0.076nM。
将在96孔板中的等分细胞与蛋白质稀释液一起在室温下在振荡下孵育2hr，并使用300μl染色缓冲液洗涤3次。然后将细胞与100μl在BD染色缓冲液中的Alexa 647-标记的山羊抗人IgG的1∶750稀释液一起在4℃下在振荡下孵育45分钟。最后，洗涤细胞两次，沉淀并重悬于250μl染色缓冲液+0.5μg/ml碘化丙啶中。在FACSCALIBUR流式细胞仪中使用FL4通道完成10,000个细胞的分析。分别将MFI值和抗EGFR抗体的相应浓度绘在y轴和x轴上。使用GRAPHPAD PRISM软件利用非线性回归曲线的单点结合模型确定分子的KD。
基于公式Y＝Bmax*X/KD+X(Bmax＝饱和时的荧光值。X＝抗体浓度。Y＝结合度)计算KD值。
肿瘤细胞增殖的抑制
如下检查对表达EGFR的细胞(例如，癌细胞)的细胞增殖的抑制：将Du145、A431或OVCAR-3细胞以20,000个细胞/孔接种在96孔组织培养板中，并让该细胞在补充有抗生素、2mM L-谷氨酰胺和10％胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养基中在37摄氏度和5％二氧化碳下生长24小时。然后将培养基更换为RPMI-1640(含有抗生素、2mM L-谷氨酰胺、0.5％FBS)，所述RPMI-1640不含或含有200nM、20nM、2nM、0.2nM、0.02nM和0nM浓度的抗体(对照IgG用作同种型对照)。使细胞在37℃和5％二氧化碳下生长36个小时。然后使用25μl3H-胸苷的1∶40稀释液(20Ci/mmol，1mCi/ml)对细胞进行脉冲，孵育过夜(18hr)，收获到FILTERMATS中并在β计数器上读数。
肿瘤细胞中的EGFR磷酸化的抑制
为了评估对EGFR磷酸化的体内抑制，裂解样本并如上所述的那样进行BCA和ELISA测定。
对EGF诱导的EGFR磷酸化的抑制
如下检查对EGF诱导的EGFR磷酸化的抑制：将OVCAR-3和ADRr细胞以35,000个细胞/孔的密度接种在96孔板中。将细胞在10％血清中孵育24hr，并且然后血清饥饿14hr。然后将细胞与不同浓度的抗-EGFR抗体预孵育40分钟。在预孵育后，除去培养基并使用50nM人EGF在37℃，5％CO2下刺激细胞5分钟。也使用EGF对照(5分钟，5nM)、10％血清和0％血清对照。使用1X冷PBS洗涤细胞，并通过在冰上孵育30分钟来使该细胞在50μl冰冷裂解缓冲液(R&D SYSTEMS ELISA KitBuffer 12，含有新加入的蛋白酶抑制剂)中裂解。裂解产物要么立即加以分析，要么冷冻在-80℃下直至使用。
对肿瘤细胞中的EGF-介导的信号转导的抑制
如下调查对配体介导的肿瘤细胞信号转导的抑制：将OVCAR-3或Du145细胞接种在96孔组织培养板中，并让该细胞在补充有抗生素、2mM L-谷氨酰胺和10％胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养基中在37℃和5％二氧化碳下生长24小时。将细胞在含有抗生素和2mM L-谷氨酰胺的RPMI-1640培养基中在37℃和5％二氧化碳下血清饥饿24小时。细胞用和不用1μM、250nM、63nM、16nM、4.0nM、1.0nM、240pM和61pM浓度的抗-EGFR抗体预处理30分钟，然后用EGF配体在37℃和5％二氧化碳下刺激10分钟。用冷PBS洗涤细胞，然后使用含有150mMNaCl、5mM焦磷酸钠、10mM bpV(phen)、50mM苯胂(phenalarsine)、1mM原钒酸钠和蛋白酶抑制剂混合物(Sigma，P714)的哺乳动物蛋白质提取物(MPER)裂解缓冲液(Pierce，78505)收获细胞。使用含有0.1％Tween-20的磷酸盐缓冲盐水中的4％牛血清白蛋白将细胞裂解产物稀释两倍，然后使通过ELISA针对AKT(EGFR的下游效应子)和EGFR磷酸化进行分析。
为了针对AKT磷酸化测试，使用对AKT有特异性的捕获抗体和对AKT的丝氨酸473上的磷酸化位点有特异性的生物素化检测抗体在ELISA板上对裂解产物进行测试。使用与和生物发光底物(Pierce，37070)反应的辣根过氧化物酶缀合的链霉亲和素产生信号。
实施例1：抗体的产生
为了获得人抗EGFR抗体，根据美国专利公布20100056386和20090181855中公开的方法筛选表达文库。
实施例2：结合亲和力/表位建仓
使用表面等离子体共振(SPR)分析结合亲和力。具体地，使其中一种蛋白质(抗体或靶标)固定在芯片(如本文描述的)的表面上并加入另一种蛋白质。测量这两种蛋白质的缔合/解离相互作用。随着溶液中的蛋白质与固定化蛋白质缔合，折射指数增大，其被共振信号捕获。随着蛋白质解离，信号减弱。
使用如上所述的BIACORE分析来分析表位建仓(EGF阻断)。使其中一种抗体固定在芯片的表面上。随着EGFR与抗体缔合，共振信号增强。然后使该芯片再生并注射EGFR和另一种抗体(例如，此前确定的与EGFR结合的抗体)的混合物。如果该抗体与所注射的抗体结合重叠的表位，那么该信号与单独注射的EGFR相比将会较弱。然后再次使该芯片再生并注射EGF配体和EGFR的混合物。测量共振信号。信号的减弱指示与EGF配体具有重叠的表位。最后一次使该芯片再生并注射EGFR以证实该抗体的活性。
实施例3：对肿瘤细胞中的EGFR磷酸化的抑制
如上所述的那样分析特定抗EGFR抗体对ADRr、Ovcar3，和A431细胞中的EGFR磷酸化的抑制。
实施例4：对肿瘤细胞中的AKT磷酸化的抑制
如上所述的那样分析抗体组合对Du145和Ovcar3细胞中的AKT磷酸化的抑制。基于两种参数测试两种细胞系：(1)ErbB1的高表达(＞105个受体/细胞)和(2)pAKT的诱导的动态范围≥5倍。
不考虑表位作图，将所有抗EGFR抗体与另一种抗EGFR抗体组合在一起。创建六点抑制曲线(许多二元组和三元组的系列10X稀释液的峰浓度为2μM)，而一些利用4点稀释曲线筛选。
将相加或协同抑制pAKT的所有抗体对不同表位作图。一些二元组是比西妥昔单抗更有效的抑制剂。两种细胞系的结果彼此相似，揭示在不存在突变受体或信号转导途径(例如，kRAS)的情况下，ErbB1的高表达(并且可能ErbB1＞ErbB2/3)是协同作用的起始标准。
使用抗EGFR抗体组合通过预孵育抗体40分钟来进行短期和长期抑制研究。重复进行预孵育抗体40分钟的测定，将其与预孵育抗体24小时的情况进行比较。数据显示EGFR的内化和降解的影响改变读数。
实施例5：对肿瘤细胞增殖的抑制
如上所述的那样分析对肿瘤细胞增殖的抑制。本文提供的二元组和三元组对DU145细胞的抑制作用优选为稳定的。此外，优选的抗体二元组和三元组比等摩尔浓度的西妥昔单抗具有更强的Du145细胞增殖抑制作用。还在pERK测定中评价了二元组和三元组。优选的二元组和三元组是pERK信号转导的有效拮抗剂。
实施例6-12的材料和方法
在整个实施例6-13中，除非另外说明，否则使用下列材料和方法。
一般而言，除非另外指出，否则本发明的实践采用化学、分子生物学、重组DNA技术、免疫学(尤其例如，抗体技术)的常规技术和多肽制备的标准技术。参见，例如，Sambrook，Fritsch和Maniatis，MolecularCloning Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)；Antibody EngineeringProtocols(Methods in Molecular Biology)，510，Paul，S.，Humana Pr(1996)；Antibody Engineering：A Practical Approach(Practical Approach Series，169)，McCafferty，编著，Irl Pr(1996)；Antibodies：A Laboratory Manual，Harlow等，C.S.H.L.Press，Pub.(1999)；及Current Protocols in MolecularBiology，Ausubel等，John Wiley&Sons编著(1992)。用于测定HCV生物学特征的体外和体内模型系统描述于例如Cell culture models and animalmodels of viral hepatitis.Part II：hepatitis C，Lab.Anim.(NY).；34(2)：39-47(2005)，及The chimpanzee model of hepatitis C virus infections，ILAR J.；42(2)：117-26(2001)中。
细胞系
下述实验中使用的所有细胞系都获自National Cancer Institute或ATCC。
细胞系：
A431-表皮样癌
Du 145-前列腺癌
H1975-非小细胞肺癌
EGFR细胞外结构域(EGFR-ECD)突变体的蛋白质纯化
针对mAb表位建仓产生EGFR细胞外结构域(EGFR-ECD)的突变体。基于西妥昔单抗(Li S.等，Cancer Cell.7：301-311，2005)和H11(Spangler J.等，PNAS.107：13252-13257，2010)表位并基于EGFR-ECD结构的结构分析(Protein Data Bank ID：1NQL；Ferguson K.M.等，Mol Cell.11：507-517，2003)设计突变。如包括在本申请中的蛋白质序列中所指出的，残基突变为丙氨酸。表达构建体的DNA合成通过DNA2.0(www.dna20.com)完成。随后的DNA亚克隆、在293F细胞中的蛋白质表达及蛋白质纯化如先前所述的那样完成。
对EGFR或ERK在肿瘤细胞中EGF介导的信号转导的抑制
如下调查对配体介导的肿瘤细胞信号转导的抑制：将A431或Du145细胞以35,000个细胞/孔或17,500个细胞/半孔的密度接种在96孔组织培养板中，并让该细胞在补充有抗生素、2mM L-谷氨酰胺和10％胎牛血清(FBS)的DMEM或RPMI-1640培养基中在37℃和5％二氧化碳下生长24个小时。将细胞在含有抗生素和2mM L-谷氨酰胺的1％FBS培养基中在37℃和5％二氧化碳下血清饥饿约20个小时。然后将细胞与不同浓度的抗EGFR抗体预孵育2hr，并且然后用人EGF配体(50ng/ml)(Preprotech，cat#AF-100-15)在37℃和5％二氧化碳下刺激10分钟。用冰冷的PBS洗涤细胞，并通过在冰上孵育30分钟来在50μl冰冷的裂解缓冲液(附加150mM NaCl和蛋白酶抑制剂混合物(Sigma，P714)的Mammalian Protein Extract Lysis缓冲液(MPER-Pierce，78505))中裂解。裂解产物要么立即通过针对ERK(EGFR下游效应子)的ELISA及EGFR磷酸化进行分析，要么在-80℃下冷冻直至使用。
ELISA测定
对于磷酸-EGFR夹心ELISA，用50μL EGFR抗体(EGFR Ab-11，Clone：199.12，不含BSA和叠氮化物，Fisher Scientific，cat#MS396P1ABX)包被96半孔GREINER高亲和力板(Cat.#675077；GREINER BIO-ONE，Monroe，NC)，并在室温下孵育过夜。第二日早上，在BIOTEK板洗涤器上使用100μl/孔的PBST(0.05％Tween-20)洗涤板3次。随后在室温下使用含2％BSA的PBS封闭板约1小时。在BIOTEK板洗涤器上使用100μl/孔的PBST(0.05％Tween-20)洗涤板3次。然后将细胞裂解产物(50μL)或稀释于50％裂解缓冲液和1％BSA-PBS(根据制造商的建议)中的标准品(pEGFR pY1068ELISA试剂盒，R&D Systems，cat#DYC3570)一式两份地加入该板中，并在振荡条件下在室温下孵育2hr或在4℃下孵育过夜。然后在BIOTEK板洗涤器中使用PBST(含有0.05％Tween-20的PBS)以100μl/孔洗涤板3次。将大约50μl缀合至辣根过氧化物酶(HRP)(pEGFR pY1068ELISA试剂盒，R&D Systems，cat#DYC3570)的检测抗体稀释在2％BSA中，加入PBS并在室温下孵育约2小时。在BIOTEK板洗涤器中使用PBST(0.05％Tween-20)以100μl/孔洗涤板3次。加入约50μL SUPERSIGNAL PICO ELISA底物并使用Envision(Perkin Elmer)板阅读器读板。分析数据，并且取重复样本的平均值并且使用误差条来代表两次重复试验之间的标准偏差。
磷酸-ERK ELISA以类似于磷酸-EGFR ELISA的方式进行，但有以下不同：人pERK ELISA Duoset试剂盒购自R&D Systems(cat#DYC1018-5)并按照制造商的建议使用。
使用EGFR-ECD野生型(WT)、Bin1表位突变体或Bin3表位突变体作为捕获试剂(4μg/ml)来进行直接ELISA。使用50μL捕获试剂包被96半孔GREINER高结合板(Cat.#675077；GREINER BIO-ONE，Monroe，NC)，并在室温下孵育过夜。第二日早上，在BIOTEK板洗涤器中使用PBST(0.05％Tween-20)以100μl/孔洗涤板3次，并在室温下使用pH为7.2的含1％BSA的PBS封闭约1小时。将稀释在pH为7.2的含1％BSA的PBS中的不同浓度(1μg/ml、0.25μg/ml、0.06μg/ml和0.02μg/ml)的单克隆抗体(mAb)与捕获试剂一起在室温下孵育2个小时，接着利用过氧化物酶缀合的AffiniPure Goat Anti-Human IgG Fc Fragment(JacksonImmunoresearch Catalog#109-035-008)在pH为7.2的含1％BSA的PBS中的1∶50,000稀释液检测2小时。加入约50μL Supersignal PICO ELISA底物并使用Envision(Perkin Elmer)板阅读器读板。分析数据，取重复样本的平均值并且使用误差条来代表两次重复试验之间的标准偏差。细胞用和不用2μM、666.6nM、222.2nM、74nM、24.7nM、8.2nM、2.7nM、914pM和304pM浓度的抗EGFR抗体处理2小时。
结合亲和力：动力学排斥测定(Kinetic Exclusion Assay)(KinExA)
还使用KinExA仪器(SAPIDYNE Instruments，Boise，ID)在含有重组EGF受体的溶液中测量抗体的亲和力和交叉反应性。用于这个测定的材料是KinExA 3000仪器和软件(Sapidyne Instruments，Boise，ID)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)珠粒(Sapidyne Instruments)、人抗EGFR IgG、重组人EGFR、Cy5-缀合的山羊抗人IgG(Jackson ImmunoResearch，WestGrove，PA)、磷酸盐缓冲盐水(PBS)以及在PBS中的牛血清白蛋白(100mg/ml)。
为了使重组EGF受体与PMMA珠粒偶联，将100μg重组EGFR加入到预测量的200mg PMMA珠粒等分试样中，并加入PBS以使总体积为1ml。将该珠粒在旋转轮上在室温下孵育1hr。然后简短地离心该珠粒并除去上清液。向该珠粒中加入100μl 100mg/ml在PBS中的BSA，并进一步加入PBS以使总体积为1ml。再次将该珠粒在旋转轮上在室温下孵育1hr。然后将该珠粒转移至含有27mL PBS的玻璃瓶。
为了确定单价抗体结合亲和力，在5ml具有恒定抗EGFR抗体浓度的PBS中制备重组EGFR的12步稀释系列(75nM、25nM、8.3nM、2.8nM、0.9nM、0.3nM、100pM、33pM、11pM、4pM、1.3pM、0pM)。对于准确的亲和力测量，总抗体结合位点浓度(“ABC”；由于化合价而为抗体摩尔浓度的两倍)应当小于EGFR的抗体的单价亲和力。将抗体-受体混合物在室温下孵育2hr以便达到平衡。根据期望的抗体-受体复合物的亲和力，可以相应地调整这个平衡时间。在单独的管中，使用储备抗体(2mg/mL)在PBS中的1∶1000稀释液制备15mL 2μg/mL Cy5-缀合的抗人IgG二抗。然后，将KinExA仪器管路附连至12根抗体-受体溶液管的每根中。通过装填的EGFR-珠粒柱注射每种溶液。(KinExA仪器自动地为每次注射装填新珠粒柱。)在洗涤步骤之后，使标记的二抗通过该柱。最后，使用测得的在不同受体浓度条件下的未复合受体的量，在KinExA软件中使用1∶1结合模型对平衡滴定数据进行拟合以产生亲和力值Kd。
为了采用KinExA“直接方法”确定结合速率，使用上述途径和总抗体结合位点浓度(ABC)来确定平衡单价结合亲和力(KD)。然后，使用“Theoretical Binding Curve Demonstration”软件(Sapidyne Instruments)，为动力学实验确定起始抗原浓度(L0)。为此，输入在单价结合亲和力实验中确定的亲和力和ABC值，并选择起始抗原浓度为大约20％的抗体将在平衡时不结合抗原的浓度。这在该实验中确保了良好的信噪比。使用在PBS中的储备抗体(2mg/mL)的1∶1000稀释液制备15mL 2μg/mLCy5-缀合的抗人IgG二次抗体。在单独的管中，制备8mL 2x ABC浓度的抗EGFR抗体溶液。这种浓度是运行浓度的两倍，因为它在实验之前与8mL抗原溶液混合在一起。在单独的管中，制备8mL 2xL0浓度的重组EGFR溶液。这种浓度也是运行浓度的两倍，因为它在实验之前与8mL抗体溶液混合在一起。然后，将EGFR包被的珠粒和二抗溶液分别放置在合适的容器和管路中。将该抗体和抗原溶液充分混合，并立即连接至合适的管路，并使用KinExA软件在所得溶液中测量游离抗体的量作为时间的函数。为了确定缔合常数kon(Kon)，使用KinExA软件根据可逆生物分子速率方程拟合作为时间的函数的游离抗体量的耗竭。解离常数Koff(Koff)等于Kon*KD(Kd)。
结合亲和力：表面等离子体共振测定
表面等离子体共振测定如下进行。
利用胺偶联使抗体或抗原(300RU)固定在CM5芯片上。然后注射不同浓度的抗体或抗原以研究它们与固定化蛋白质的缔合和解离。在不同的注射之间，使用合适的再生缓冲液(如甘氨酸，pH 2.5)使该芯片再生。使用方程1拟合解离阶段以确定Koff(解离速率)；
R＝Ro*exp(-Koff*t)(1)
使用这个Koff值和方程2拟合缔合阶段以确定Kon(缔合速率)和KD(平衡常数)。
R = R max * C K D + C ( 1 - exp ( - ( K on * C + K off ) t ) - - - ( 2 )
其中C代表溶液中的抗原或抗体浓度，Rmax代表饱和信号并且t代表时间。
细胞结合测定
用于确定KD值的细胞结合测定如下进行：使用3mL胰蛋白酶-EDTA在37℃下使A431细胞脱壁5分钟。立即向胰蛋白酶化细胞中加入完全DMEM(10mL)，温和地重悬，并使用Beckman台式离心机在1100rpm下旋转5分钟。将细胞以2×106个细胞/毫升的浓度重悬在染色缓冲液(PBS+0.2％BSA+0.1％叠氮化钠)中，并将50μl(1×105个细胞)等分试样接种到96孔滴定板中。
在染色缓冲液中制备300μl 2000nM抗EGFR抗体储备溶液，并将其中的100μl连续稀释到200μl染色缓冲液中。稀释的抗体浓度在2000nM至0.1nM的范围内。然后向50μl细胞悬浮液中直接加入150μl不同蛋白质稀释液等分试样，使抗体的最终浓度为1500nM、500nM、166.7nM、55.6nM、18.5nM、6.17nM、2.05nM、0.68nM、0.23nM和0.076nM。
将在96孔板中的等分细胞与蛋白质稀释液一起在室温下在振荡下孵育2hr，并使用300μl染色缓冲液洗涤3次。然后将细胞与100μl在BD染色缓冲液中的Alexa 647-标记的山羊抗人IgG的1∶750稀释液一起在4℃下在振荡下孵育45分钟。最后，洗涤细胞两次，沉淀并重悬于250μl染色缓冲液+0.5μg/ml碘化丙啶中。在FACSCALIBUR流式细胞仪中使用FL4通道完成10,000个细胞的分析。分别将MFI值和抗EGFR抗体的相应浓度绘在y轴和x轴上。使用GRAPHPAD PRISM软件利用非线性回归曲线的单点结合模型确定分子的KD。
基于公式Y＝Bmax*X/KD+X(Bmax＝饱和时的荧光值。X＝抗体浓度。Y＝结合度)计算KD值。
对肿瘤细胞增殖的体外抑制
如下在体外检查对表达EGFR的细胞(例如，癌细胞)的细胞增殖的抑制：将H1975或A431细胞以250、500、1000或2,000个细胞/孔接种在96孔组织培养板中，并使该细胞在补充有抗生素、2mM L-谷氨酰胺和10％胎牛血清(FCS)的RPMI-1640培养基中在37摄氏度和5％二氧化碳下生长24个小时。然后将培养基更换为补充有50ng/mL EGF的RPMI-1640(含有抗生素、2mM L-谷氨酰胺、1％FBS)，所述RPMI-1640中存在或不存在1μM抗体(最终浓度)。使该细胞在37℃和5％二氧化碳下生长6天。使用CellTiter-Glo
Figure BPA00001657524300631
(CTG)Luminescent Cell Viability Assay(Promega Corporation)根据制造商说明测量细胞活力。根据对作为代谢活细胞指示剂的ATP存在的定量，该CTG测定测得培养物中的活细胞数量。对照处理包括用含有抗生素、2mM L-谷氨酰胺、1％FCS但是没有补充50ng/mL EGF的RPMI-1640处理的细胞(称为1％FCS处理)以及用含有抗生素、2mM L-谷氨酰胺但是没有补充FCS或EGF的RPMI-1640处理的细胞(称为无血清培养基或SFM处理)。
小鼠异种移植体内研究
给Nu/nu小鼠(Charles River Labs)皮下注射3.5×106个A431细胞或2.0×106个H1975细胞，并使所得的肿瘤生长直至它们达到200mm的平均尺寸。然后如下开始给药。与小鼠EGFR交叉反应的抗体每2天给予一次(q2d)，而非交叉反应的抗体每4天给予一次(q4d)。以3天的时间间隔进行测量。A431和H1975的给药分别在5剂和7剂后停止。为这两项研究维持恢复期。抗体剂量被归一化以代表统一的血清半衰期。
实施例6：结合亲和力/表位建仓
使用如上所述的BIACORE分析来分析表位建仓。使其中一种抗体固定在芯片的表面上。随着EGFR与该抗体缔合，共振信号增强。按顺序注射属于1、2、3三个仓的抗体。如果所述抗体与所注射的抗体结合重叠的表位，那么该信号与此前的注射情况相比将无变化。如果所述抗体结合至非重叠表位，那么在芯片上的信号将高于先前的注射情况。最后将缀合至芯片的抗体作为游离配体注射以证实不存在与重叠表位的结合(图17D)。
对仓进行设计，以便所选的抗体可跨越EGFR细胞外结构域(ECD)上的三个不同的非重叠表位。这些仓分组为三个仓：Bin1与EGFR的结构域III作图并且代表c225表位(西妥昔单抗结合的位点)；Bin2与结构域I作图并且代表ICR10表位(Abcam Ab231)(Cochran等(2004)Journal ofImmunological Methods，287：147-158)；以及Bin3与结构域III作图并且代表克隆H11表位(Spangler J.等，PNAS.107：13252-13257，2010)。在下面的EGFR细胞外结构域中以粗体显示的氨基酸位置处，根据表位作图产生Bin1(B1-7MT-Ala)和Bin3(B3-4MT)突变体。
EGFR ECD(SEQ ID NO：59)
Figure BPA00001657524300641
使用标准重组DNA技术在指出的氨基酸位置处制备下列取代突变体，以产生具有下列突变体残基的Bin1(B1)和Bin3(B3)表位突变体：
突变体
Bin1(B1)突变体残基
B1-7MT-Ala：Q408A，Q432M，H433E，K467A，K489A，I491A，N497A
Bin3(B3)突变体残基
B3-4MT：S380A，F381G，T382A，H383G
使用EGFR-ECD野生型(WT)、Bin1表位突变体(c225表位)或Bin3表位突变体(H11表位)作为捕获试剂，进行直接ELISA。将不同浓度(1μg/ml、0.25μg/ml、0.06μg/ml和0.02μg/ml)的单克隆抗体(mAb)ca(Bin1)、cd(Bin2)和ch(Bin3)与该捕获试剂一起在室温下孵育2小时，接着利用HRP-缀合的抗人Fc多克隆抗体检测1个小时。如图17A中所示，所有三种抗体都结合至EGFR的WT细胞外结构域，而Bin1抗体ca没有结合至Bin1突变体表位(图17B)，并且ch抗体没有结合至Bin3突变体表位(图17C)。
为了进一步表征抗EGFR抗体，使mAb ch(Bin3)缀合至BIACORE芯片的表面。注射0.5μM EGFR细胞外结构域(EGFR-ECD)，接着按顺序注射mAb cd(Bin2)、mAb cb(Bin1)，并且最后注射mAb ch(Bin3)作为被EGFR ECD与缀合至芯片表面的Bin3抗体的结合阻断的表位的阴性对照。如图17D所示，来自这三个仓的抗体按顺序结合EGFR细胞外结构域，证明属于Bin 1、2，和3的mAb具有非重叠的不同表位。
通过ELISA和BIACORE进行的表位作图的概述见下表VIII，而如通过KinExA
Figure BPA00001657524300651
确定的结合亲和力的概述见下表IX。所有亲和力都优于0.8nM。
表VIII：
Figure BPA00001657524300661
n.d.-未确定(没有进行实验)
是，表示对应于非重叠表位的结合事件
否，表示不存在对应于重叠表位的结合事件
表IX
Figure BPA00001657524300662
实施例7：具有非重叠表位的两种抗EGFR抗体的组合对磷酸 -ERK信号转导的抑制
通过从两个或三个仓(上述Bin1、Bin2和Bin3)中的每个仓中选择出一种抗体，如通过pERK抑制测量，测试非重叠抗EGFR抗体组合在A431肿瘤细胞中抑制EGFR介导的信号转导的能力。将A431细胞与指出的Bin 1+Bin 3抗体等摩尔组合(图18A和图18B)或Bin 1+Bin 2抗体等摩尔组合(图18C)一起孵育2hr，并通过磷酸-ERK ELISA分析细胞裂解产物。结果证明所有二元组合都导致pERK信号转导被完全抑制，但是在抑制曲线的IC90处表现出不同的效力。
实施例8：具有非重叠表位的两种或三种抗EGFR抗体的组合对 ERK磷酸化的抑制
如在实施例7以及在上面方法部分中描述的那样如通过pERK抑制测量，进行有关抗体组合抑制EGFR信号转导的能力的另外的实验，用等摩尔量的指出的Bin1/Bin2抗体的双重(二元)组合(图19A)、Bin1/Bin2或Bin1/Bin3抗体的双重(二元)组合(图19B)，或Bin1、Bin 2和Bin 3抗体的三元组合(图19A)处理A431细胞。用Bin1+Bin2抗体、Bin1+Bin3抗体或Bin1+Bin2+Bin3抗体的组合的处理都表现出pERK产量的剂量依赖性减少。如图19A所示，具有非重叠表位的三种抗体的等摩尔组合完全抑制ERK激活。当与抗EGFR抗体西妥昔单抗相比时，抗体cb(Bin1)和cd(Bin 2)的二重组合在抑制曲线的IC50和IC90处表现出高出100和1000倍的降低pERK信号转导的效力(图19B)。而且，该二重混合物完全抑制pERK信号转导，而西妥昔单抗在最高剂量下没有达到最大抑制(仅50％)。
实施例9：具有非重叠表位的两种抗EGFR抗体的等摩尔和非等摩 尔组合对磷酸-ERK信号转导的抑制
用不同比率(以μg/ml表示)的抗体二元组cb和cd(图20A)、cb和ch(图20B)、cb和ci(图20C)以及ca和cd(图20D)处理A431细胞，并且如通过pERK抑制测量，确定该抗体二元组合抑制EGFR信号转导的能力。当单独使用(单独的300g/ml，不含第二抗体)时，来自Bin2(cd)及Bin3(ch和ci)的抗EGFR抗体对于降低pERK信号转导无效力(图20A、20B和20C)，而来自Bin1(cb和ca)的抗体表现出增强的效力。在所有情况下，该二重组合都导致pERK信号转导被完全抑制。改变比率以使其偏离等摩尔浓度，这并没有导致混合物的效价发生等效的改变，除了ca和cd二重组之外(图20D)。这些结果证明该混合物具有与单一抗体组分相比增高的效价，以及每种组分的至少10％的耐受性有助于对体外信号转导完全抑制(即，270+30μg/ml的cb+ch的比率在效价上和150+150μg/ml组合相等)。这些数据的概括由热图(图21)表示，其中x轴(列)表示抗体浓度，y轴(行)表示以指出的比率组合的抗体二元组，并且z轴(朝向平面内)以灰度表示磷酸-ERK活性分数。z轴颜色图将高磷酸-ERK活性表示为白色，低活性表示为黑色，并且用灰色阴影表示中间的活性。将样本值根据分析样本的ELISA板上的+EGF配体对照的平均值进行独立地归一化，并将整个板上的EGF配体对照(+/-)的平均值在左上角指出。
实施例10：Bin 1+Bin 2或Bin 1+Bin 3抗体的单一抗体和二元组合 对磷酸-EGF受体和磷酸-ERK信号转导的抑制以及与其它已知抗 EGFR抗体如西妥昔单抗、尼妥珠单抗和扎鲁目单抗的比较
用单一抗体或抗体二元组处理A431细胞，并将它们抑制EGFR依赖性信号转导的能力与已知抗EGFR抗体西妥昔单抗、尼妥珠单抗或扎鲁目单抗抑制EGFR依赖性信号转导的能力进行比较。如上面针对pERK和pEGFR信号转导所述的那样进行实验，并且结果在图22A-C中示出。与本领域已知的抗体以及混合物中的单独组分cb、cd和ch相比较，仅Bin1/Bin2抗体cb和cd的混合物(图22A)及Bin1/Bin3抗体cb和ch的混合物(图22C)有效地完全抑制磷酸-ERK信号转导。除了尼妥珠单抗之外，包括混合物在内的所有抗体都有效地完全抑制磷酸-EGF受体信号转导(图22B)。
实施例11：肿瘤细胞增殖的体外抑制
通过上述方法或对上述方法作少许修改来分析肿瘤细胞增殖的体外抑制。以250、500、1000或200个细胞/孔接种A431细胞(表皮样)或H1975细胞(NSCLC)，并用1μM的抗体组合进行处理。图23A-D示出使用CellTiter-Glo
Figure BPA00001657524300681
(CTG)Luminescent Cell Viability Assay(PromegaCorporation)的细胞增殖的抑制，所述CellTiter-Glo
Figure BPA00001657524300682
(CTG)LuminescentCell Viability Assay根据对作为代谢活细胞指示剂的ATP存在的定量测量培养物中活细胞的数量。图23A示出在存在或不存在EGF配体的情况下，用Bin1和3抗体ca抗体ca或与抗体ca和ch竞争结合至EGFR细胞外结构域的抗体的组合处理，但是未用无血清培养基(SFM)或单独的测定培养基(1％FCS)处理的H1975细胞的生长抑制。图23B示出与图23A相似的结果，但使用的是Bin1和2抗体ca和cd的组合。图23C(H1975细胞)和图23D(A431细胞)示出用抗体ca+cd+ch的Bin1/2/3三元组处理的细胞的细胞增殖的抑制。在这个实施例中使用的所有组合都明确地证明了抗体混合物在体外抑制细胞增殖的能力。
实施例12：异种移植模型中的肿瘤生长的体内抑制
为了评价肿瘤生长的体内抑制，在使用表皮样瘤细胞系A431(图24A)和NSCLC肿瘤细胞系H1975(图24B)的小鼠异种移植肿瘤模型中使用抗体二元组。给75只4-5周龄nu/nu小鼠皮下注射(植入)3.5×106个细胞/只小鼠的A431细胞或2.0×106个细胞/只小鼠的H1975细胞。在植入后的第8天(A431细胞)或第4天(H1975细胞)开始给予小鼠抗体二元组。使用前述方法或对前述方法作少许修改，Bin1/2(cb+cd)和Bin 1/3(cb+ch；ca+ch)抗体二元组在抑制A431肿瘤的肿瘤生长方面至少与西妥昔单抗一样有效。所有处理都导致肿瘤停滞，该肿瘤停滞在中止给药方案之后的整个恢复期内得到维持。然而，在H1975细胞中，所有处理都导致肿瘤停滞，但是在给药后迅速消退的肿瘤在除用ca+ch二元组处理的小鼠之外的所有小鼠中停止。
实施例13：抗EGFR抗体对EGF与细胞的结合的抑制
使A431细胞在T-150cm2组织培养瓶中的DMEM完全培养基(如上所述)中生长至汇合，使用10mL冰冷的PBS洗涤该细胞并使用5mL0.25％胰蛋白酶使该细胞脱壁，同时仔细监测脱壁以便将细胞表面蛋白质的胰蛋白酶化减至最低(～5-7min)。细胞一开始升起，就立即加入15mL完全培养基以稀释胰蛋白酶，并将悬浮液中的细胞转移至50mL锥形离心管中并在1200rpm下离心7min。弃去上清液并将细胞沉淀重悬在流式细胞仪缓冲液(在pH 7.2的1XPBS缓冲液中的2％胎牛血清、0.1％叠氮化钠)中。将细胞以100μl体积的30,000个细胞/孔的密度转移至V形底96孔板中。为每个技术重复接种总共12个孔(11个用于配体稀释曲线，1个用于单独配体的对照)，向每个孔中加入100μL浓度为4uM的抗体反应混合物(孔中的最终浓度为2μM)，除单独配体的对照孔之外，仅向单独配体的对照孔中加入流式细胞仪缓冲液。将细胞与抗体在室温下孵育1hr，接着加入100μL起始浓度为600nM(在孔中的最终浓度范围为200nM-0.003nM)的生物素-XX-EGF配体(Invitrogen cat#E3477)在流式细胞仪缓冲液中的3倍稀释液，并在室温下孵育10min。然后用100μL冰冷的流式细胞仪缓冲液洗涤细胞，在1800rpm下离心2min并弃去上清液。然后将细胞在100μL的在流式细胞仪缓冲液中的链霉亲和素-Alexa Fluor 647缀合物(Invitrogen cat#S21374)的1∶500稀释液中于室温下孵育30min。继这个步骤之后，在100μL冰冷的流式细胞仪缓冲液中洗涤细胞，在1800rpm下离心2min，然后弃去上清液。重复洗涤步骤，并将细胞重悬在80μL固定缓冲液(在pH7.2的1XPBS中的2％胎牛血清、2％多聚甲醛)中，并转移至U形底96孔板中。通过流式细胞术检测具有结合的配体的细胞，针对活细胞(FSC/SSC)和针对FL4-通道(测量Alexa-Fluor 647信号)阳性细胞进行选通(gating)。使用本文公开的方法或对其作少许修改获得的结果如图25中所示，并将结果描述在其说明中。
等同实施方案
本领域技术人员将认识到或仅使用常规实验就能够确定本文所描述的特定实施方案的许多等同实施方案。此类等同实施方案也意图包括在所附权利要求书中。在多条所附权利要求中的任一项中公开的实施方案的任何组合都被考虑在本公开的范围之内。
通过引用并入
上文提及的所有专利、待决的专利申请和专利公布都以引用的方式完整地并入本文。
附录A
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Figure BPA00001657524300711
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Figure BPA00001657524300791
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Figure BPA00001657524300821

Claims (26)

1.一种包含抗EGFR抗体三元组的组合物，所述抗EGFR抗体三元组包括第一抗体、第二抗体和第三抗体，其中(i)所述第一抗体是选自由ca、cb和cc组成的组的抗体，或与选自由ca、cb和cc组成的组的抗体竞争结合至EGFR，或与选自由ca、cb和cc组成的组的抗体结合至相同的表位；(ii)所述第二抗体是选自由cd、ce和cf组成的组的抗体，或与选自由cd、ce和cf组成的组的抗体竞争结合至EGFR，或与选自由cd、ce和cf组成的组的抗体结合至相同的表位；以及(iii)所述第三抗体是选自由cg、ch、ci、cj和ck组成的组的抗体，或与选自由cg、ch、ci、cj和ck组成的组的抗体竞争结合至EGFR，或与选自由cg、ch、ci、cj和ck组成的组的抗体结合至相同的表位。
2.如权利要求1所述的组合物，其中(i)所述第一抗体是抗体ca(包含分别在SEQ ID NO：29、30和34中示出的重链CDR1、2和3，以及分别在SEQ ID NO：48、45和49中示出的轻链CDR1、2和3)，或与所述抗体ca竞争结合至EGFR，或与所述抗体ca结合至相同的表位；(ii)所述第二抗体是抗体cd(包含分别在SEQ ID NO：29、30和31中示出的重链CDR1、2和3，以及分别在SEQ ID NO：53、54和55中示出的轻链CDR1、2和3)，或与所述抗体cd竞争结合至EGFR，或与所述抗体cd结合至相同的表位；以及(iii)所述第三抗体是抗体ch(包含分别在SEQ ID NO：23、24和26中示出的重链CDR1、2和3，以及分别在SEQ ID NO：39、40和42中示出的轻链CDR1、2和3)，或与所述抗体ch竞争结合至EGFR，或与所述抗体ch结合至相同的表位。
3.如权利要求1或2所述的组合物在制造用于癌症的治疗的药剂中的用途。
4.如权利要求3所述的用途，其中所述癌症的治疗是通过与作为抗癌剂的另外的药剂的联合治疗来进行的治疗。
5.如权利要求4所述的用途，其中所述抗癌剂包含拓扑异构酶抑制剂。
6.一种分离的单克隆抗体，所述抗体结合至EGFR细胞外结构域并且包含含有选自由SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11组成的组的氨基酸序列的重链可变区，并且进一步包含含有选自由SEQ ID NO：12、13、14、15、16、17、19、20、21和22组成的组的氨基酸序列的轻链可变区。
7.一种分离的单克隆抗体，所述抗体结合至EGFR细胞外结构域并且包含含有选自分别由以下组成的组的氨基酸序列的重链可变区和轻链可变区：
(a)SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：20；
(b)SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：21；
(c)SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：22；
(d)SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：12；
(e)SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：13；
(f)SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：14；
(g)SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：15；
(h)SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：16；
(i)SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：17；以及
(j)SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：19。
8.一种分离的单克隆抗体，所述抗体结合EGFR细胞外结构域并且包含重链和轻链CDR3、CDR2及CDR1序列，其中所述重链和轻链CDR3、CDR2及CDR1序列分别选自：
(a)SEQ ID NO：34、20和29的重链CDR3、CDR2及CDR1序列，以及SEQ ID NO：49、45和48的轻链CDR3、CDR2及CDR1序列；
(b)SEQ ID NO：37、36和35的重链CDR3、CDR2及CDR1序列，以及SEQ ID NO：51、45和50的轻链CDR3、CDR2及CDR1序列；
(c)SEQ ID NO：38、36和35的重链CDR3、CDR2及CDR1序列，以及SEQ ID NO：52、45和48的轻链CDR3、CDR2及CDR1序列；
(d)SEQ ID NO：31、30和29的重链CDR3、CDR2及CDR1序列，以及SEQ ID NO：55、54和53的轻链CDR3、CDR2及CDR1序列；
(e)SEQ ID NO：32、30和29的重链CDR3、CDR2及CDR1序列，以及SEQ ID NO：56、54和53的轻链CDR3、CDR2及CDR1序列；
(f)SEQ ID NO：33、30和29的重链CDR3、CDR2及CDR1序列，以及SEQ ID NO：56、54和53的轻链CDR3、CDR2及CDR1序列；
(g)SEQ ID NO：25、24和23的重链CDR3、CDR2及CDR1序列，以及SEQ ID NO：41、40和39的轻链CDR3、CDR2及CDR1序列；
(h)SEQ ID NO：26、24和23的重链CDR3、CDR2及CDR1序列，以及SEQ ID NO：42、40和39的轻链CDR3、CDR2及CDR1序列；
(i)SEQ ID NO：27、24和23的重链CDR3、CDR2及CDR1序列，以及SEQ ID NO：43、40和39的轻链CDR3、CDR2及CDR1序列；
(j)SEQ ID NO：28、24和23的重链CDR3、CDR2及CDR1序列，以及SEQ ID NO：46、45和44的轻链CDR3、CDR2及CDR1序列；以及
(k)SEQ ID NO：28、24和23的重链CDR3、CDR2及CDR1序列，以及SEQ ID NO：47、45和44的轻链CDR3、CDR2及CDR1序列。
9.一种分离的单克隆抗体，所述抗体与如权利要求7所述的抗体的任一种竞争结合至EGFR细胞外结构域，或与如权利要求7所述的抗体的任一种结合至相同的表位。
10.如权利要求5至9中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体是人抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
11.如权利要求5至9或5至10中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体选自由以下组成的组：双特异性抗体、免疫缀合物、Fab、Fab’2、ScFv、affibody、avimer、纳米抗体以及结构域抗体。
12.一种包含选自表II或表III中示出的二元组的抗体二元组的组合物，其中每种抗体是如权利要求5至9或5至11中任一项所述的抗体。
13.一种包含选自表IV或表V中列出的三元组的抗体三元组的组合物，其中每种抗体是如权利要求5至9或5至11中任一项所述的抗体。
14.如权利要求5至9或12或13中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含的抗体中的每种抗体均以优于100nm的KD结合至EGFR。
15.如权利要求5至9、或12、或13、或14中任一项所述的组合物，其中所述组合物表现出以下性质的至少一种：
(a)抑制AKT磷酸化或ERK磷酸化，如基于细胞的体外测定所测量的；
(b)体外抑制表达EGFR的肿瘤细胞的生长；
(c)体内抑制异种移植模型中表达EGFR的肿瘤细胞的生长；
(d)体外抑制配体结合至EGFR细胞外结构域；
(e)体外抑制EGFR二聚化；或
(f)体外下调细胞表面上的EGFR。
16.如权利要求15所述的组合物，其中与包含以与所述组合物中的组合抗体的总量(以摩尔表示)相等的量(以摩尔表示)包含在所述组合物中的单独抗体的制剂相比，所述抑制是相加或协同抑制。
17.一种包含两种或更多种抗体的组合物，其中所述两种或更多种抗体中的两种选自由以下组成的组：
(a)抗体ca，或与抗体ca竞争结合至EGFR或与抗体ca结合至相同表位的抗体，以及抗体cd，或与抗体cd竞争结合至EGFR或与抗体cd结合至相同表位的抗体；
(b)抗体ca，或与抗体ca竞争结合至EGFR或与抗体ca结合至相同表位的抗体，以及抗体ce，或与抗体ce竞争结合至EGFR或与抗体ce结合至相同表位的抗体；
(c)抗体ca，或与抗体ca竞争结合至EGFR或与抗体ca结合至相同表位的抗体，以及抗体cf，或与抗体cf竞争结合至EGFR或与抗体cf结合至相同表位的抗体；
(d)抗体ca，或与抗体ca竞争结合至EGFR或与抗体ca结合至相同表位的抗体，以及抗体cg，或与抗体cg竞争结合至EGFR或与抗体cg结合至相同表位的抗体；
(e)抗体ca，或与抗体ca竞争结合至EGFR或与抗体ca结合至相同表位的抗体，以及抗体ch，或与抗体ch竞争结合至EGFR或与抗体ch结合至相同表位的抗体；
(f)抗体ca，或与抗体ca竞争结合至EGFR或与抗体ca结合至相同表位的抗体，以及抗体ci，或与抗体ci竞争结合至EGFR或与抗体ci结合至相同表位的抗体；
(g)抗体ca，或与抗体ca竞争结合至EGFR或与抗体ca结合至相同表位的抗体，以及抗体cj，或与抗体cj竞争结合至EGFR或与抗体cj结合至相同表位的抗体；
(h)抗体ca，或与抗体ca竞争结合至EGFR或与抗体ca结合至相同表位的抗体，以及抗体ck，或与抗体ck竞争结合至EGFR或与抗体ck结合至相同表位的抗体；
(i)抗体cb，或与抗体cb竞争结合至EGFR或与抗体cb结合至相同表位的抗体，以及抗体cd，或与抗体cd竞争结合至EGFR或与抗体cd结合至相同表位的抗体；
(j)抗体cb，或与抗体ca竞争结合至EGFR或与抗体ca结合至相同表位的抗体，以及抗体ce，或与抗体ce竞争结合至EGFR或与抗体ce结合至相同表位的抗体；
(k)抗体cb，或与抗体cb竞争结合至EGFR或与抗体cb结合至相同表位的抗体，以及抗体cf，或与抗体cf竞争结合EGFR或与抗体cf结合至相同表位的抗体；
(l)抗体cb，或与抗体cb竞争结合至EGFR的抗体，以及抗体cg，或与抗体cg竞争结合至EGFR或与抗体cg结合至相同表位的抗体；
(m)抗体cb，或与抗体cb竞争结合至EGFR的抗体，以及抗体ch，或与抗体ch竞争结合至EGFR或与抗体ch结合至相同表位的抗体；
(n)抗体cb，或与抗体cb竞争结合至EGFR的抗体，以及抗体ci，或与抗体ci竞争结合至EGFR或与抗体ci结合至相同表位的抗体；
(o)抗体cb，或与抗体cb竞争结合至EGFR的抗体，以及抗体cj，或与抗体cj竞争结合至EGFR或与抗体cj结合至相同表位的抗体；
(p)抗体cb，或与抗体cb竞争结合至EGFR的抗体，以及抗体ck，或与抗体ck竞争结合至EGFR或与抗体ck结合至相同表位的抗体；
(q)抗体cc，或与抗体cc竞争结合至EGFR的抗体，以及抗体cd，或与抗体cd竞争结合至EGFR或与抗体cd结合至相同表位的抗体；
(r)抗体cc，或与抗体cc竞争结合至EGFR的抗体，以及抗体ce，或与抗体ce竞争结合至EGFR或与抗体ce结合至相同表位的抗体；
(s)抗体cc，或与抗体cc竞争结合至EGFR的抗体，以及抗体cf，或与抗体cf竞争结合至EGFR或与抗体cf结合至相同表位的抗体；
(t)抗体cc，或与抗体cc竞争结合至EGFR的抗体，以及抗体cg，或与抗体cg竞争结合至EGFR或与抗体cg结合至相同表位的抗体；
(u)抗体cc，或与抗体cc竞争结合至EGFR的抗体，以及抗体ch，或与抗体ch竞争结合至EGFR或与抗体ch结合至相同表位的抗体。
(v)抗体cc，或与抗体cc竞争结合至EGFR的抗体，以及抗体ci，或与抗体ci竞争结合至EGFR或与抗体ci结合至相同表位的抗体；
(w)抗体cc，或与抗体cc竞争结合至EGFR的抗体，以及抗体cj，或与抗体cj竞争结合至EGFR或与抗体cj结合至相同表位的抗体；
(x)抗体cc，或与抗体cc竞争结合至EGFR的抗体，以及抗体ck，或与抗体ck竞争结合至EGFR或与抗体ck结合至相同表位的抗体。
18.如权利要求12至16中任一项所述的组合物，其中所述抗体是：
(a)选自由抗体va和vd组成的组，以及与抗体va和vd竞争结合至EGFR，或与抗体va和vd结合至相同表位的抗体；或
(b)由抗体va和ve组成的组，或与抗体va和ve竞争结合至EGFR，或与抗体va和ve结合至相同表位的抗体；或
(c)由抗体va和vf组成的组，或与抗体va和vf竞争结合至EGFR，或与抗体va和vf结合至相同表位的抗体；
(d)由抗体va和vg组成的组，或与抗体va和vg竞争结合至EGFR，或与抗体va和vg结合至相同表位的抗体；
(e)由抗体va和vh组成的组，或与抗体va和vh竞争结合至EGFR，或与抗体va和vh结合至相同表位的抗体；
(f)由抗体va和vi组成的组，或与抗体va和vi竞争结合至EGFR，或与抗体va和vi结合至相同表位的抗体；
(h)由抗体va和vj组成的组，或与抗体va和vj竞争结合至EGFR，或与抗体va和vj结合至相同表位的抗体；
(i)由抗体vb和vd组成的组，或与抗体va和vi竞争结合至EGFR，或与抗体va和vi结合至相同表位的抗体；
(j)由抗体vb和ve组成的组，或与抗体vb和ve竞争结合至EGFR，或与抗体vb和ve结合至相同表位的抗体；
(k)由抗体vb和vf组成的组，或与抗体vb和vf竞争结合至EGFR，或与抗体vb和vf结合至相同表位的抗体；
(l)由抗体vb和vg组成的组，或与抗体vb和vg竞争结合至EGFR，或与抗体vb和vg结合至相同表位的抗体；
(m)由抗体vb和vh组成的组，或与抗体vb和vh竞争结合至EGFR，或与抗体vb和vh结合至相同表位的抗体；
(n)由抗体vb和vi组成的组，或与抗体vb和vi竞争结合至EGFR，或与抗体vb和vi结合至相同表位的抗体；
(o)由抗体vb和vj组成的组，或与抗体vb和vj竞争结合至EGFR，或与抗体vb和vj结合至相同表位的抗体；
(p)由抗体vc和vd组成的组，或与抗体vc和vd竞争结合至EGFR，或与抗体vc和vd结合至相同表位的抗体；
(q)由抗体vc和ve组成的组，或与抗体vc和ve竞争结合至EGFR，或与抗体vc和ve结合至相同表位的抗体；
(r)由抗体vc和vf组成的组，或与抗体vc和vf竞争结合至EGFR，或与抗体vc和vf结合至相同表位的抗体；
(s)由抗体vc和vg组成的组，或与抗体vc和vg竞争结合至EGFR，或与抗体vc和vg结合至相同表位的抗体；
(t)由抗体vc和vh组成的组，或与抗体vc和vh竞争结合至EGFR，或与抗体vc和vh结合至相同表位的抗体；
(u)由抗体vc和vi组成的组，或与抗体vc和vi竞争结合至EGFR，或与抗体vc和vi结合至相同表位的抗体；以及
(v)由抗体vc和vj组成的组，或与抗体vc和vj竞争结合至EGFR，或与抗体vc和vj结合至相同表位的抗体。
19.如权利要求12至18中任一项所述的组合物，进一步包含第三抗体。
20.如权利要求19所述的组合物，其中所述抗体是：
(a)由抗体ca、cg、cd组成的组，以及与抗体ca、cg和cd竞争结合至EGFR，或与抗体ca、cg和cd结合至相同表位的抗体；
(b)由抗体ca、cg、ce组成的组，以及与抗体ca、cg和ce竞争结合至EGFR，或与抗体ca、cg和ce结合至相同表位的抗体；
(c)由抗体ca、cg、cf组成的组，以及与抗体ca、cg和cf竞争结合至EGFR，或与抗体ca、cg和cf结合至相同表位的抗体；
(d)由抗体ca、ch、cd组成的组，以及与抗体ca、ch和cd竞争结合至EGFR，或与抗体ca、ch和cd结合至相同表位的抗体；
(e)由抗体ca、ch、ce组成的组，以及与抗体ca、ch和ce竞争结合至EGFR，或与抗体ca、ch和ce结合至相同表位的抗体；
(f)抗体ca、ch、cf，以及与抗体ca、ch和cf竞争结合至EGFR，或与抗体ca、ch和cf结合至相同表位的抗体；
(g)由抗体ca、ci、cd组成的组，以及与抗体ca、ci和cd竞争结合至EGFR，或与抗体ca、ci和cd结合至相同表位的抗体；
(h)由抗体ca、ci、ce组成的组，以及与抗体ca、ci和ce竞争结合至EGFR，或与抗体ca、ci和ce结合至相同表位的抗体；
(i)由抗体ca、ci、cf组成的组，以及与抗体ca、ci和cf竞争结合至EGFR，或与抗体ca、ci和cf结合至相同表位的抗体；
(j)由抗体ca、cj、cd组成的组，以及与抗体ca、cj和cd竞争结合至EGFR，或与抗体ca、cj和cd结合至相同表位的抗体；
(k)由抗体ca、cj、ce组成的组，以及与抗体ca、cj和ce竞争结合至EGFR，或与抗体ca、cj和ce结合至相同表位的抗体；
(l)由抗体ca、cj、cf组成的组，以及与抗体ca、cj和cf竞争结合至EGFR，或与抗体ca、cj和cf结合至相同表位的抗体；
(m)由抗体ca、ck、cd组成的组，以及与抗体ca、ck和cd竞争结合至EGFR，或与抗体ca、ck和cd结合至相同表位的抗体；
(n)由抗体ca、ck、ce组成的组，以及与抗体ca、ck和ce竞争结合至EGFR，或与抗体ca、ck和ce结合至相同表位的抗体；
(o)由抗体ca、ck、cf组成的组，以及与抗体ca、ck和cf竞争结合至EGFR，或与抗体ca、ck和cf结合至相同表位的抗体；
(p)由抗体cb、cg、cd组成的组，以及与抗体cb、cg和cd竞争结合至EGFR，或与抗体cb、cg和cd结合至相同表位的抗体；
(q)由抗体cb、cg、ce组成的组，以及与抗体cb、cg和ce竞争结合至EGFR，或与抗体cb、cg和ce结合至相同表位的抗体；
(r)由抗体cb、cg、cf组成的组，以及与抗体cb、cg和cf竞争结合至EGFR，或与抗体cb、cg和cf结合至相同表位的抗体；
(s)由抗体cb、ch、cd组成的组，以及与抗体cb、ch和cd竞争结合至EGFR，或与抗体cb、ch和cd结合至相同表位的抗体；
(t)由抗体cb、ch、ce组成的组，以及与抗体cb、ch和ce竞争结合至EGFR，或与抗体cb、ch和ce结合至相同表位的抗体；
(u)由抗体cb、ch、cf组成的组，以及与抗体cb、ch和cf竞争结合至EGFR，或与抗体cb、ch和cf结合至相同表位的抗体；
(v)由抗体cb、ci、cd组成的组，以及与抗体cb、ci和cd竞争结合至EGFR，或与抗体cb、ci和cd结合至相同表位的抗体；
(w)由抗体cb、ci、ce组成的组，以及与抗体cb、ci和ce竞争结合至EGFR，或与抗体cb、ci和ce结合至相同表位的抗体；
(x)由抗体cb、ci、cf组成的组，以及与抗体cb、ci和cf竞争结合至EGFR，或与抗体cb、ci和cf结合至相同表位的抗体；
(y)由抗体cb、cj、cd组成的组，以及与抗体cb、cj和cd竞争结合至EGFR，或与抗体cb、cj和cd结合至相同表位的抗体；
(z)由抗体cb、cj、ce组成的组，以及与抗体cb、cj和ce竞争结合至EGFR，或与抗体cb、cj和ce结合至相同表位的抗体；
(aa)由抗体cb、cj、cf组成的组，以及与抗体cb、cj和cf竞争结合至EGFR，或与抗体cb、cj和cf结合至相同表位的抗体；
(bb)由抗体cb、ck、cd组成的组，以及与抗体cb、ck和cd竞争结合至EGFR，或与抗体cb、ck和cd结合至相同表位的抗体；
(cc)由抗体cb、ck、ce组成的组，以及与抗体cb、ck和ce竞争结合至EGFR，或与抗体cb、ck和ce结合至相同表位的抗体；
(cc)由抗体cb、ck、cf组成的组，以及与抗体cb、ck和cf竞争结合至EGFR，或与抗体cb、ck和cf结合至相同表位的抗体；
(dd)由抗体cc、cg、cd组成的组，以及与抗体cc、cg和cd竞争结合至EGFR，或与抗体cc、cg和cd结合至相同表位的抗体；
(ee)由抗体cc、cg、ce组成的组，以及与抗体cc、cg和ce竞争结合至EGFR，或与抗体cc、cg和ce结合至相同表位的抗体；
(ff)由抗体cc、cg、cf组成的组，以及与抗体cc、cg和cf竞争结合至EGFR，或与抗体cc、cg和cf结合至相同表位的抗体；
(gg)由抗体cc、ch、cd组成的组，以及与抗体cc、ch和cd竞争结合至EGFR，或与抗体cc、ch和cd结合至相同表位的抗体；
(hh)由抗体cc、ch、ce组成的组，以及与抗体cc、ch和ce竞争结合至EGFR，或与抗体cc、ch和ce结合至相同表位的抗体；
(ii)由抗体cc、ch、cf组成的组，以及与抗体cc、ch和cf竞争结合至EGFR，或与抗体cc、ch和cf结合至相同表位的抗体；
(jj)由抗体cc、ci、cd组成的组，以及与抗体cc、ci和cd竞争结合至EGFR，或与抗体cc、ci和cd结合至相同表位的抗体；
(kk)由抗体cc、ci、ce组成的组，以及与抗体cc、ci和ce竞争结合至EGFR，或与抗体cc、ci和ce结合至相同表位的抗体；
(ll)由抗体cc、ci、cf组成的组，以及与抗体cc、ci和cf竞争结合至EGFR，或与抗体cc、ci和cf结合至相同表位的抗体；
(mm)由抗体cc、cj、cd组成的组，以及与抗体cc、cj和cd竞争结合至EGFR，或与抗体cc、cj和cd结合至相同表位的抗体；
(nn)由抗体cc、cj、ce组成的组，以及与抗体cc、cj和ce竞争结合至EGFR，或与抗体cc、cj和ce结合至相同表位的抗体；
(oo)由抗体cc、cj、cf组成的组，以及与抗体cc、cj和cf竞争结合至EGFR，或与抗体cc、cj和cf结合至相同表位的抗体；
(pp)由抗体cc、ck、cd组成的组，以及与抗体cc、ck和cd竞争结合至EGFR，或与抗体cc、ck和cd结合至相同表位的抗体；
(qq)由抗体cc、ck、ce组成的组，以及与抗体cc、ck和ce竞争结合至EGFR，或与抗体cc、ck和ce结合至相同表位的抗体；以及
(rr)由抗体cc、ck、cf组成的组，以及与抗体cc、ck和cf竞争结合至EGFR，或与抗体cc、ck和cf结合至相同表位的抗体。
21.如权利要求15所述的组合物，其中所述抗体是：
(a)抗体va、vi、vd，或与抗体va、vi和vd竞争结合至EGFR，或与抗体va、vi和vd结合至相同表位的抗体；
(b)抗体va、vi、ve，或与抗体va、vi和ve竞争结合至EGFR，或与抗体va、vi和ve结合至相同表位的抗体；
(c)抗体va、vi、vf，或与抗体va、vi和vf竞争结合至EGFR，或与抗体va、vi和vf结合至相同表位的抗体；
(d)抗体va、vj、vg，或与抗体va、vi和vg竞争结合至EGFR，或与抗体va、vi和vg结合至相同表位的抗体；
(e)抗体va、vj、vh，或与抗体va、vi和vh竞争结合至EGFR，或与抗体va、vi和vh结合至相同表位的抗体；
(f)抗体va、vj、vd，或与抗体va、vj和vd竞争结合至EGFR，或与抗体va、vj和vd结合至相同表位的抗体；
(g)抗体va、vj、ve，或与抗体va、vi和ve竞争结合至EGFR，或与抗体va、vi和ve结合至相同表位的抗体；
(h)抗体va、vj、vf，或与抗体va、vi和vf竞争结合至EGFR，或与抗体va、vi和vf结合至相同表位的抗体；
(i)抗体va、vj、vg，或与抗体va、vj和vg竞争结合至EGFR，或与抗体va、vj和vg结合至相同表位的抗体；
(j)抗体va、vj、vh，或与抗体va、vj和vh竞争结合至EGFR，或与抗体va、vj和vh结合至相同表位的抗体；
(k)抗体vb、vi、vd，或与抗体vb、vi和vd竞争结合至EGFR，或与抗体vb、vi和vd结合至相同表位的抗体；
(l)抗体vb、vi、ve，或与抗体vb、vi和ve竞争结合至EGFR，或与抗体vb、vi和ve结合至相同表位的抗体；
(m)抗体vb、vi、vf，或与抗体vb、vi和vf竞争结合至EGFR，或与抗体vb、vi和vf结合至相同表位的抗体；
(n)抗体vb、vi、vg，或与抗体vb、vi和vg竞争结合至EGFR，或与抗体vb、vi和vg结合至相同表位的抗体；
(o)抗体vb、vi、vh，或与抗体vb、vi和vh竞争结合至EGFR，或与抗体vb、vi和vh结合至相同表位的抗体；
(p)抗体vb、vj、vd，或与抗体vb、vj和vd竞争结合至EGFR，或与抗体vb、vj和vd结合至相同表位的抗体；
(q)抗体vb、vj、ve，或与抗体vb、vj和ve竞争结合至EGFR，或与抗体vb、vj和ve结合至相同表位的抗体；
(r)抗体vb、vj、vf，或与抗体vb、vj和vf竞争结合至EGFR，或与抗体vb、vj和vf结合至相同表位的抗体；
(s)抗体vb、vj、vg，或与抗体vb、vj和vg竞争结合至EGFR，或与抗体vb、vj和vg结合至相同表位的抗体；
(t)抗体vb、vj、vh，或与抗体vb、vj和vh竞争结合至EGFR，或与抗体vb、vj和vh结合至相同表位的抗体；
(u)抗体vc、vi、vd，或与抗体vc、vi和vd竞争结合至EGFR，或与抗体vc、vi和vd结合至相同表位的抗体；
(v)抗体vc、vi、ve，或与抗体vc、vi和ve竞争结合至EGFR，或与抗体vc、vi和ve结合至相同表位的抗体；
(w)抗体vc、vi、vf，或与抗体vc、vi和vf竞争结合至EGFR，或与抗体vc、vi和vf结合至相同表位的抗体；
(x)抗体vc、vi、vg，或与抗体vc、vi和vg竞争结合至EGFR，或与抗体vc、vi和vg结合至相同表位的抗体；
(y)抗体vc、vi、vh，或与抗体vc、vi和vh竞争结合至EGFR，或与抗体vc、vi和vh结合至相同表位的抗体；
(z)抗体vc、vj、vd，或与抗体vc、vj和vd竞争结合至EGFR，或与抗体vc、vj和vd结合至相同表位的抗体；
(aa)抗体vc、vj、ve，或与抗体vc、vj和ve竞争结合至EGFR，或与抗体vc、vj和ve结合至相同表位的抗体；
(bb)抗体vc、vj、vf，或与抗体vc、vj和vf竞争结合至EGFR，或与抗体vc、vj和vf结合至相同表位的抗体；
(cc)抗体vc、vj、vg，或与抗体vc、vj和vg竞争结合至EGFR，或与抗体vc、vj和vg结合至相同表位的抗体；或
(dd)抗体vc、vj、vh，或与抗体vc、vj和vh竞争结合至EGFR，或与抗体vc、vj和vh结合至相同表位的抗体。
22.如权利要求8至21中任一项所述的组合物在制造用于通过与另外的抗癌剂联合治疗而治疗癌症的药剂中的用途。
23.如权利要求22所述的组合物，其中所述另外的抗癌剂包含拓扑异构酶抑制剂。
24.一种试剂盒，所述试剂盒包含处于容器中的如权利要求8至23中任一项所述的组合物。
25.如权利要求24所述的试剂盒，其中所述容器包含处于单个小瓶中的所述组合物。
26.一种用于选择单克隆抗体的组合的方法，所述组合中的每种单克隆抗体均结合至EGFR细胞外结构域，所述方法包括选择至少两种抗体，每种抗体均具有优于80nM的、用于抑制EGFR介导的信号转导的IC90，并且每种抗体不互相竞争结合至EGFR细胞外结构域并且每种抗体均表现出以下性质的至少一种：
(i)体内抑制异种移植模型中表达EGFR的细胞的生长；
(ii)体外抑制配体结合至EGFR细胞外结构域；
(iii)体外抑制EGFR二聚化；或
(iv)体外下调细胞表面上的EGFR。
(v)抑制AKT磷酸化或ERK磷酸化，如基于细胞的体外测定所测量的。
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