CN111171151B - 抗egfr纳米抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药生物学和生物制药技术领域，具体涉及一种抗EGFR纳米抗体及其应用。所提供的抗EGFR纳米抗体选自下列至少之一：(1)具有GYTGCKNGMS所示的CDR1、IDRDGSP所示的CDR2、ATNPQRNIYGGSWCNY所示的CDR3；(2)与(1)相比，具有至少一个保守氨基酸取代。所提供的抗EGFR的纳米抗体，其分子量小，特异性强，而且与EGFR的活性区域CD3的结合能力强，可以用于EGFR高表达的肿瘤的诊断和治疗。

Description

抗EGFR纳米抗体及其应用

技术领域

本发明涉及医药生物学和生物制药技术领域，具体涉及一种抗EGFR纳米抗体及其应用。

背景技术

表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR，HER1)属于跨膜糖蛋白，在细胞的生长、增殖和分化等生理过程发挥重要的作用。EGFR是个良好前景的肿瘤诊断和治疗的靶点。研究表明生长因子受体在多种实体瘤细胞中过表达，并且在癌症的发生、发展过程中发挥重要的作用。能够靶向EGFR的抗体在癌症的治疗过程中发挥着重要的作用。

然而针对EGFR的单克隆抗体通常具有分子量大，生产纯化工艺难，免疫原性高等缺点。从纳米抗体文库中筛选纳米抗体能够短时间的获得高亲和力纳米抗体。小分子纳米抗体由于具有分子质量小，体积小，无Fc段等性质，使它们在很多方面的表现优于单克隆抗体，其免疫原性低，它们不易产生自身免疫反应；有很强的组织渗透性；易于结合隐蔽的抗原表位；可用微生物进行生产，且生产成本低等优势。目前纳米抗体可以被应用于治疗性抗体，诊断试剂，以及作为CAR-T细胞的靶头。

抗EGFR的纳米抗体还需要进一步改进。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种抗EGFR纳米抗体及其应用。

正常人体中，EGFR与其配体结合后会导致二聚化，激活了胞内酪氨酸蛋白激酶的活性，使C末端特异的酪氨酸残基磷酸化，启动下游一系列复杂交叉的信号转导途径。而EFGR胞外段结构域3(EGFR-ECD₃)作为EGFR活化位点之一，同样参与正常细胞的生长、分化及凋亡。在部分肿瘤组织中，EGFR位点发生突变或者过表达，导致信号转导通路的调节失控，从而使细胞生长失控和恶化，抑制细胞的凋亡而转变成肿瘤细胞。同时，EGFR表达的高低与肿瘤细胞的分化、恶性和浸润程度密切相关。为了获得抗EGFR的纳米抗体，发明人通过动物细胞瞬时转染的方法，在HEK293细胞中重组表达了EGFR胞外段的CD3区域片段，因为EGFR全长蛋白很大，而EGFR胞外段的CD3区域是其与配体EGF结合的区域。再以此重组蛋白为抗原免疫骆驼，抽取骆驼外周血构建噬菌体文库，从中筛选获得抗EGFR的纳米抗体，并经过验证可以在大肠杆菌和酵母中进行表达。所获得的纳米抗体分子量小，特异性强，与EGFR的活性区域CD3的结合能力强，因而可以用于EGFR高表达的肿瘤的诊断和治疗，同时可以作为针对EGFR实体瘤治疗的CAR-T细胞靶头的构建。

具体而言，本发明提供了如下技术方案：

在本发明的第一方面，本发明提供了一种抗EGFR纳米抗体，所述纳米抗体选自下列至少之一：(1)具有GYTGCKNGMS所示的CDR1、IDRDGSP所示的CDR2、ATNPQRNIYGGSWCNY所示的CDR3；(2)与(1)相比，具有至少一个保守氨基酸取代。本发明所提供的抗EGFR的纳米抗体，其分子量小，特异性强，而且与EGFR的活性区域CD3的结合能力强，可以用于EGFR高表达的肿瘤的诊断和治疗。

根据本发明的实施例，以上所述的纳米抗体可以进一步包括如下技术特征：

根据本发明的实施例，所述纳米抗体具有如下所示的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；(b)与(a)相比，具有至少一个保守氨基酸取代。

在本发明的第二方面，本发明提供了一种核酸，所述核酸包含编码本发明第一方面任一实施例所述的纳米抗体的核酸序列。所提供的核酸可以是DNA分子，也可以是RNA，所提供的核酸可以包合在载体中，用作抗EGFR纳米抗体的表达。

在本发明的第三方面，本发明提供了一种载体，所述载体包含本发明第二方面所述的核酸。

根据本发明的实施例，以上所述的表达载体可以进一步包括如下技术特征：

根据本发明的实施例，以上所述的表达载体进一步包括调节元件，所述调节元件与所述核酸可操作地连接，用于控制所述核酸在细胞中的表达，获得抗EGFR纳米抗体。

根据本发明的实施例，所述调节元件包括选自启动子、增强子、终止子中的至少一种。

在本发明的第四方面，本发明提供了一种重组细胞，所述重组细胞含有本发明第三方面所述的载体。所提供的重组细胞可以通过将载体转化到宿主细胞中获得。例如可以将外源基因或者DNA序列或者RNA序列引入到宿主细胞中，以便使得宿主细胞表达所引入的基因或者序列，来获得想要的物质，例如通常是由基因或者引入序列所编码的蛋白质。

在本发明的第五方面，本发明提供了一种生产抗EGFR纳米抗体的方法，包括培养本发明第四方面所述的重组细胞，以便获得所述抗EGFR纳米抗体。通过培养所提供的重组细胞，可以获得抗EGFR纳米抗体。

在本发明的第六方面，本发明提供了纳米抗体在制备治疗EGFR过表达为特征疾病的药物中的用途，所述纳米抗体为本发明第一方面所述的纳米抗体。

在本发明的第七方面，本发明提供了一种纳米抗体在制备治疗自身免疫疾病或者癌症的药物中的用途，所述纳米抗体为本发明第一方面所述的纳米抗体。

根据本发明的实施例，所述癌症包括但不限于头颈部鳞癌，鼻咽癌，乳腺癌，结直肠癌，肺癌，卵巢癌，膀胱癌等各种癌症。所提供的纳米抗体对于EGFR过表达为特征的癌症具有治疗效果，可以用来治疗EGFR过表达直接导致或者间接导致的疾病。

在本发明的第八方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括本发明第一方面所述的纳米抗体和药学上可接受的载体。所提供的纳米抗体可以和药学上可接受的载体复配，制备成药物组合物，用于治疗以EGFR高表达为特征的肿瘤或者一些自身免疫性疾病。

在本发明的第九方面，本发明提供了一种检测EGFR的试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的纳米抗体。所提供的试剂盒含有本发明第一方面所提供的纳米抗体，该纳米抗体能够与EGFR的活性区域CD3进行特异性结合，而且结合力强，可以用于检测EGFR的浓度或者含量。

在本发明的第十方面，本发明提供了一种Car-T细胞，所述Car-T细胞包括本发明第一方面所述的纳米抗体。应用Car-T细胞对病人进行细胞回输，可以治疗癌症或者其他EGFR过表达为特征的疾病。

附图说明

图1是根据本发明的实施例提供的抗EGFR纳米抗体的各部分区域的示意图。

图2是根据本发明的实施例提供的电泳和western blot检测验证重组表达的EGFR-ECD₃蛋白图。

图3是根据本发明的实施例提供的纯化后的重组EGFR-ECD₃蛋白图。

图4是根据本发明的实施例提供的三轮淘洗的菌落图。

图5是根据本发明的实施例提供的筛选获得的纳米抗体。

图6是根据本发明的实施例提供的大肠杆菌表达纯化NbH3结果。

图7是根据本发明的实施例提供的纳米抗体特异性检测结果。

图8是根据本发明的实施例提供的纳米抗体亲和力检测结果。

图9是根据本发明的实施例提供的CCK8实验检测纳米抗体生物学功能结果。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，需要说明的是，所描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

为了方便本领域技术人员的理解，对于本文中的一些术语进行了解释和说明。这些解释和说明仅用于方便理解，而不应看做是对本发明保护范围的限制。

在本文中，术语“抗体”是指能够与特异性抗原结合的免疫球蛋白分子。通常抗体结构包括两条分子量较轻的轻链和两条分子量较重的重链，重链(H链)和轻链(L链)由二硫键连接形成一个四肽链分子。其中，肽链的氨基端(N端)氨基酸序列变化很大，称为可变区(V区)，可变区决定抗体的识别以及与抗原的特异性结合；羧基端(C端)相对稳定，变化很小，称为恒定区(C区)，恒定区通常赋予重要的生物学特性，例如抗体链结合、分泌、经胎盘移动性、补体结合和Fc受体结合。重链和轻链的可变区通常称为VH和VL。

在可变区中某些区域氨基酸组成和排列顺序具有更高的变化程度，称为高变区(Hypervariable region，HVR)，高变区为抗原和抗体结合的位置，因此也称为决定簇互补区(complementarity-determining region，CDR)。重链可变区和轻链可变区上均有三个CDR区。为了表述上的方便，位于重链上的CDR区也称为重链高变区，位于轻链上的CDR区也称为轻链高变区。

肽链可变区内除了高变区之外的氨基酸组成和排列顺序变化相对较小，称为骨架区(FR)。VH和VL内各有4个骨架区，分别以FR1、FR2、FR3和FR4表示。

纳米抗体(nanobody，a single domain antibody)，也称VHH(Variable domainof heavy chain of heavy chain antibody)，较早是在骆驼体内存在的天然的缺失轻链的重链抗体，克隆其可变区可以得到只有重链可变区组成的单域抗体，称为VHH。纳米抗体是最小的功能性抗原结合片段，和普通抗体相比，纳米抗体分子量小，结构简单，易于进行基因改造，体积小，抗原特异性好，组织穿透力强，稳定性高，在疾病的诊断及治疗方面有广阔的应用前景。

在没有轻链的情况下，纳米抗体各自具有三个CDR，分别表示为CDR1、CDR2和CDR3，用来表征纳米抗体的抗原识别和结合的特异性。为此，在本发明的一个方面，本发明提供了一种抗EGFR纳米抗体，所述纳米抗体包括选自下列至少之一：(1)具有GYTGCKNGMS所示的CDR1、IDRDGSP所示的CDR2、ATNPQRNIYGGSWCNY所示的CDR3；(2)与(1)相比，具有至少一个保守氨基酸取代。这些保守氨基酸取代可以发生在CDR1上，也可以发生在CDR2上，或者发生在CDR3上，或者同时发生在CDR1、CDR2或者CDR3上。当然，这些保守氨基酸取代可以是一个氨基酸取代，两个氨基酸取代或者三个氨基酸取代。

本文中，所述“保守氨基酸取代”是指纳米抗体中的某些氨基酸或者某几个氨基酸发生改变，而不会损害纳米抗体的整体构象和功能。这些保守氨基酸取代包括使用具有相似的性质(例如，极性、氢键电位、酸度、碱度、疏水性、芳族基团的存在等)的另一种氨基酸替换一种氨基酸。具有相似性质的氨基酸是本领域技术人员熟知的。例如，精氨酸、组氨酸和赖氨酸是亲水-碱性氨基酸并且可以互换。类似地，异亮氨酸(疏水性氨基酸)可以被亮氨酸、蛋氨酸或缬氨酸替换。这种变化对纳米抗体的表观分子量或等电点几乎没有影响或没有影响。再例如一些天然氨基酸可被非天然氨基酸替换，例如D构型的氨基酸、或β或γ氨基酸。

根据本发明的实施例，所提供的纳米抗体具有如下所示的氨基酸序列：(a)SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列；(b)与(a)相比，具有至少一个保守氨基酸取代。与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比的保守氨基酸取代可以是一个氨基酸取代，两个氨基酸取代或者三个氨基酸取代。所发生的保守氨基酸取代优选发生在SEQ ID NO:1所示序列中除CDR1、CDR2和CDR3之外的区域。由此所提供的纳米抗体与EGFR的活性区域CD3的结合能力强，特异性高。

其中SEQ:ID NO:1所示氨基酸序列如下：

QVQLQESGGGSVQAGGSLNLSCAVSGYTGCKNGMSWYRQAPGKEREFVSGIDRDGSPSYADSVKGRFTISQDNAKNIVFLQMNSLRPEDTAMYYCATNPQRNIYGGSWCNYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1)。

其中SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中各部分区域的示意图如图1所示。图1中CDR1、CDR2和CDR3分别代表纳米抗体的高变区，FR1、FR2、FR3和FR4分别代表骨架区。

在本发明的另一方面，本发明提供了一种核酸，所述核酸包含编码上述所述抗EGFR纳米抗体的核酸序列。通常所称的核酸可以是DNA分子，也可以是RNA分子，其可以包含在任何合适的载体中，例如质粒、人工染色体、噬菌体或者病毒载体等。

在本发明的又一方面，本发明提供了一种表达载体，所述载体包含上述核酸。本文中所称的表达载体，在本领域也通常被称为克隆载体或者载体，指可以将DNA序列或者RNA序列引入到宿主细胞的载体，其可以用于转化到宿主细胞中，并促进核酸序列的表达，例如促进转录和翻译。这种表达载体可以包含调节元件，例如启动子、增强子、终止子等，用于引起或指导多肽的表达。用于动物细胞的表达载体的启动子和激活子的实施例包括SV40早期启动子和激活子等。合适的载体可以是质粒，例如一些包含复制起点的质粒或者整合质粒，例如pUC、pcDNA、pBR等。可用的病毒载体包括但不限于腺病毒、逆转录病毒、疱疹病毒和AAV载体。此类病毒载体可通过本领域技术人员熟知的技术生产，例如通过病毒的瞬时转染或者稳定转染获得。在进行病毒转染时，可用到的转染细胞可以是PA317细胞、PsiCRIP细胞、GPenv+细胞、293细胞等。

在本发明的另一方面，本发明提供了一种重组细胞，所述重组细胞含有上述所述的表达载体。所提供的重组细胞可以通过将表达载体转化到宿主细胞中获得。例如可以通过表达载体将外源基因或者DNA序列或者RNA序列引入到宿主细胞中，以便使得宿主细胞表达所引入的基因或者序列，来产生想要的物质，这些想要的物质通常是由基因或者引入序列所编码的蛋白质。常用的宿主细胞包括但不限于大肠杆菌宿主细胞(在导入时常用质粒载体)、昆虫宿主细胞(在导入时常用杆状病毒载体)，以及哺乳动物宿主细胞。例如，还可以包括原核细胞(例如细菌)和真核细胞(例如酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等)。具体的哺乳动物宿主细胞可以为Vero细胞、CHO细胞、3T3细胞、COS细胞等。

通过在合适的条件下培养上述提供的重组细胞，可以获得所述抗EGFR纳米抗体。在培养所述重组细胞时，可以采用本领域技术人员已知的任何生产技术，例如任何化学上、生物学上、遗传学上或者酶学技术，这些技术可以单独或者组合应用。所获得的抗EGFR纳米抗体可以通过常规的蛋白纯化方法进行分离和纯化，例如可以通过羟基磷灰石层析、凝胶电泳、亲和透析或色谱法等常规的蛋白纯化方法进行分离和纯化。

本发明所提供的抗EGFR纳米抗体可以用来治疗EGFR过表达为特征疾病，例如癌症。这些癌症包括但不限于头颈部鳞癌，鼻咽癌，乳腺癌，结直肠癌，肺癌，卵巢癌，膀胱癌等。

在本发明的又一方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括上述抗EGFR纳米抗体和药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”是指药学上可用的辅助成药的成分，例如可以包括任何溶剂、分散介质、包衣、抗细菌或抗真菌剂、等渗剂或吸收延迟剂等等。这些药学上可接受的载体的功能和用途是本领域技术人员公知的。本领域技术人员可以根据这些药学上可接受的载体的功能和用途，与抗EGFR纳米抗体复配，获得相应的药物组合物，用作制药或者疾病的治疗领域。所提供的药物组合物可以是不同的剂型，例如可以通过口服，通过吸入，肠胃外(特别是通过静脉内注射)等合适的形式施用。当肠胃外途径时，所提供的抗EGFR纳米抗体可以是以包装在小瓶中以可注射溶质和悬浮液的形式提供。通常可以将抗EGFR纳米抗体与缓冲剂、稳定剂、防腐剂、增溶剂、等渗剂和悬浮剂等混合来获得肠胃外施用的形式。混合后的各物质进行灭菌，然后以静脉内注射剂的形式包装。可用的缓冲剂可以是有机磷酸盐。可用的悬浮剂可以是甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、阿拉伯树胶和/或羧甲基纤维素钠。此外，可用的稳定剂可以是亚硫酸钠和偏亚硫酸氢钠，可用的防腐剂可以是对羟基苯甲酸钠、山梨酸、甲酚和氯甲酚等。

当然所提供的抗EGFR纳米抗体还可以作为试剂盒的一部分，用于检测EGFR。所提供的试剂盒除了含有抗EGFR纳米抗体之外，还可以含有本领域常用的用作抗原检测的常规试剂。

在本发明的另一方面，本发明还提供了一种治疗癌症患者的方法，所述方法包括给予所述患者有效量的药物组合物或者有效量的纳米抗体，所述药物组合物为上述提供的药物组合物，所述纳米抗体为上述提供的纳米抗体。

需要说明的是，根据上述所提供的抗EGFR纳米抗体可以应用于生物医药的研发，用作临床诊断，用作肿瘤的研究、治疗以及用作免疫学的研究和治疗上。例如，不仅仅可以应用到上述提到的各个产品，例如药物组合物，试剂盒等等，还可以结合本领域常用的技术，改造成多价抗体或者多特异性纳米抗体的形式。也可以应用于制备Car-T细胞。这些Car-T细胞可以通过基因工程的常用手段获得，从而可以应用该Car-T细胞回输到病人体内，治疗肿瘤。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1通过哺乳动物表达系统制备EGFR-ECD₃重组蛋白

(1)pCMV-EGFR-ECD₃重组质粒的构建

从NCBI上查得EGFR-ECD₃的序列：5′-ATGCGACCCTCCGGGACGGCCGGGGCAGCGCTCCTGGCGCTGCTGGCTGCGCTCTGCCCGGCGAGTCGGGCTCGCAAAGTGTGTAACGGAATAGGTATTGGTGAATTTAAAGACTCACTCTCCATAAATGCTACGAATATTAAACACTTCAAAAACTGCACCTCCATCAGTGGCGATCTCCACATCCTGCCGGTGGCATTTAGGGGTGACTCCTTCACACATACTCCTCCTCTGGATCCACAGGAACTGGATATTCTGAAAACCGTAAAGGAAATCACAGGGTTTTTGCTGATTCAGGCTTGGCCTGAAAACAGGACGGACCTCCATGCCTTTGAGAACCTAGAAATCATACGCGGCAGGACCAAGCAACATGGTCAGTTTTCTCTTGCAGTCGTCAGCCTGAACATAACATCCTTGGGATTACGCTCCCTCAAGGAGATAAGTGATGGAGATGTGATAATTTCAGGAAACAAAAATTTGTGCTATGCAAATACAATAAACTGGAAAAAACTGTTTGGGACCTCCGGTCAGAAAACCAAAATTATAAGCAACAGAGGTGAAAACAGCTGCAAGGCCACAGGCCAGCACCACCACCACCACCACTGA-3′(SEQ ID NO:2)，并送去合成pCMV-EGFR-ECD₃重组质粒(Sangon Biotech合成)。

(2)293F细胞瞬时转染表达EGFR-ECD₃

分别取200μg pCMV-EGFR-ECD₃重组质粒和1000μg聚乙烯亚胺(PEI，购于polysciences，64738)用5mL无血清RPMI1640培养基(购于Gibco，货号为2053126)稀释，轻轻吹打，然后将稀释的重组质粒和PEI混合均匀，获得含有重组质粒和PEI的混合物。

取4×10⁸个293F细胞(购于北京北纳创联生物技术研究院)到50mL tubespin管(购于SIGMA，货号为Z761036-26EA)中，800rpm离心5min，去上清再用25mL无血清RPMI1640培养基重悬细胞并转移到125mL三角摇瓶中，将上述混合物缓慢的滴加到293F细胞中，在37℃、5％CO₂、150rpm环境下培养，4小时后，补加293F无血清培养基(购于Sigma，货号为14571C)到200mL，继续培养到细胞存活率降到70％，800rpm离心收集细胞上清，再用0.45μm滤膜过滤，收集上清。

(3)EGFR-ECD₃的纯化

使用AKTA纯化仪(购于GE)对步骤(2)所获得的上清进行镍柱亲和层析。

首先，用流速为1mL/min的PBS溶液对镍柱(购于GE，货号为10230759)进行平衡，直到UV280值保持不变，再以1mL/min的流速上样，再用流速为1mL/min的PBS溶液对镍柱进行平衡，直到UV280值保持不变，分别用50mM的咪唑和150mM的咪唑以1mL/min的流速洗去杂蛋白，最后用250mM咪唑以1mL/min的流速的对目的蛋白进行洗脱，获得纯化蛋白。

(4)EGFR-ECD₃的鉴定

使用预制胶(购于invitrogen，货号EC6025BOX)进行电泳。

取上述获得的纯化蛋白样品20μL加入到预制胶中，80V电压30min使样品电泳至分离胶，然后120V电压电泳直到指示剂到底部，停止电泳。将胶浸泡在考马斯亮兰溶液(购于Solarbio，货号为P1305)中1h，再用脱色液脱色直到可以看到清晰的蛋白条带(购于Solarbio，货号为：P1305)。

同时，将胶与大小适当的NC膜(购于Millipore，货号为HATF00010)贴合在一块，采用三明治结构，加入转膜液，300mA恒流，进行转膜90min。之后，加入5％脱脂奶粉(购于BD，货号为232100)进行封闭，室温1h。用0.1％PBST洗膜，40rpm、5min。之后以1：5000的比例稀释Mouse anti-His mAb-HRP(购于Abmart，货号为M20020)加入到NC膜中。4℃、孵育过夜。第二天，用0.1％PBST洗膜，40rpm、5min，重复三次，洗去多余的抗体。将ECL化学发光液加入到NC膜表面，用凝胶成像仪(Bio-Rad)进行拍摄曝光。

图2为EGFR-ECD₃重组蛋白的表达检测结果。SDS-PAGE电泳和Western blot检测证明，分泌表达到培养上清中的蛋白为EGFR-ECD₃。图3为纯化后的EGFR-ECD₃的电泳结果，结果表明经过纯化的蛋白的纯度可以达到90％以上。

实施例2噬菌体纳米抗体文库的制备

利用上述获得的纯化蛋白制备噬菌体纳米抗体文库，包括如下步骤：

(1)利用上述EGFR-ECD₃纯化蛋白免疫双峰驼，采集免疫EGFR-ECD₃的双峰驼的血液，每只取100mL，将收集的血液与等体积的生理盐水混匀，将稀释后的血液缓慢加入到淋巴细胞分离液的表面，室温2000rpm离心20min。吸取第二层的淋巴细胞，加入五倍体积的PBS，室温2000rpm离心20min，重复三次。将收集下来的淋巴细胞加入1mL的Trizol(购于Invitrogen，货号为：15596026)试剂，重复混匀，于12000rpm、4℃离心15min。再向离心后上清中加入0.2mL的氯仿，充分混匀后静置3min，于12000rpm、4℃离心15min。吸取最上层水相与等体积的异丙醇混匀，静置10min，于12000rpm、4℃离心10min。去上清，再加入1mL预冷的75％乙醇，洗涤沉淀，于12000rpm、4℃离心10min。再加入100μL的DEPC水溶解，获得RNA。

(2)采用AMV First Strand cDNA Synthesis Kit(购于NEB，货号为：E6550S)将上述RNA逆转录为DNA。

第一步体系条件如下：

第二步体系条件如下：

(3)利用KAPA HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit(购于KAPA，购自于KK2611)通过PCR的方法扩增VHH基因。而且由于骆驼抗体有两种模板，C端略有不同，所以使用两个R-primer，来获得更多更全面的抗体。

反应条件：

F-primer:5′-GAGGAGGAGGAGGAGGTGGCCCAGGCGGCCCAGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG-3′(SEQ ID NO:3)。

R-primer1:5′-GAGGAGGAGGAGGAGGTGGCCCAGGCGGCCGGAGCTGGGGTCTTCGCTGTGGTGCG-3′(SEQ ID NO:4)。

R-primer2:5′-GAGGAGGAGGAGGAGGTGGCCCAGGCGGCCTGGTTGTGGTTTTGGTGTCTTGGGTT-3′(SEQ ID NO:5)。

(4)使用SfiⅠ(购于Takara，货号1244A)内切酶对pComb-3X载体(购于AlleleBiotechnology and Pharmaceuticals)和所扩增的VHH基因酶切，反应体系和条件如下：

(5)用T4 DNA Ligase对pComb-3X载体和VHH基因进行连接。反应体系条件如下：

(6)将0.2μL的上述连接产物与90μL TG1感受态菌液中，混匀加入电转杯，1900V电转5ms后，加入1mL SOC培养基(购于Sangon Biotech，货号为A507009)，37℃摇床中，250rpm培养1h。再加入10mL SOC培养基，继续培养1h。向其中加入2mL VCSM13辅助噬菌体(购于Biovector)的同时，加入含终浓度为10μg/mL氨苄青霉素(Amp，购于Sangon Biotech，货号为A610028)抗性的200mL SOC培养基，继续培养2h。之后加入终浓度为10μg/mL卡那霉素(Kana，购于Sangon Biotech，货号为A600286)培养过夜。

(7)将上述培养过夜的TG1菌液于4℃，3000g离心15min。将离心后的上清和PEG6000(购于Biosharp，货号为BY0027)/NaCl(购于Macklin，货号为S805275)溶液以6：1的比例混匀，冰上静置30min。2200×g离心30min，沉淀再用2mL PBS溶液重悬。再4℃，13200rpm离心5min。再用0.22μm滤膜(购于Merck Millipore，货号为SLGP033RB)过滤上清以用于淘洗实验。

实施例3噬菌体纳米抗体文库淘洗

对实施例2所获得的噬菌体纳米抗体文库进行淘洗，包括如下步骤：

(1)用NaHCO₃包被液(购于Sigma，货号为s6297)稀释EGFR-ECD₃蛋白，以每孔20μgEGFR-ECD₃蛋白偶联在酶标板中，4℃过夜，并设置阴性对照。

(2)次日，吸取酶标板中未偶联的目的蛋白，再加入300μL 0.1％PBST，静置3min(洗板一次)，再向酶标板中加入含2％脱脂奶粉，37℃封闭2h，再用300μL 0.1％PBST溶液洗板一次，静置3min。

(3)取300μL制备的噬菌体纳米抗体文库与等体积的2％脱脂奶粉混匀，每孔加入100μL的上述混合液，37℃孵育1h。

(8)每孔加入300μL 0.1％PBST溶液洗板5至15次，每次静置3min(根据淘洗轮数的递增，洗板次数也相应递增，最后一次淘洗，偶联抗原的浓度减半)，进行三轮淘洗实验。

(4)每孔加入100μL 100mM三乙胺(TES，购于aladdin)溶液，放置于室温孵育10min。将上清中解离的噬菌体继续感染TG1菌株，在多轮淘洗的过程中不断富集，以便筛选出特异性好、亲和力高的纳米抗体序列。

图4显示了经过三轮淘洗的菌落图。其中图4中3*10⁷CFU代表经过第一轮淘洗所获得的菌落数，8*10⁷CFU代表经过第二轮淘洗所获得的菌落数，8*10⁷CFU代表经过第三轮淘洗所获得的菌落数。

实施例4噬菌体纳米抗体文库筛选EGFR-ECD₃纳米抗体

利用经过淘洗的噬菌体纳米抗体文库筛选纳米抗体，包括如下步骤：

(1)随机挑选淘洗的最后一轮平板上的不同单菌落接种含1mL/孔2×YT培养基(购于Sangon Biotech，货号为A507016)的96孔深孔板(购于NUNC，货号为95040452)中，并在平板上做好标记。37℃，150rpm培养3h，之后加入1mM IPTG(购于Solarbio，货号为I8070)，28℃、150rpm过夜诱导。

(2)用NaHCO₃包被液稀释EGFR-ECD₃蛋白，以100ng EGFR-ECD₃纯化蛋白偶联在酶标板中，4℃过夜，并设置相应的阴性对照。

(3)次日，用0.1％PBST洗板，静置3min，再向酶标板中加入2％脱脂奶粉，37℃封闭2h，用0.1％PBST溶液洗板一次，同时将过夜诱导的深孔板于4℃，4000rpm，离心30min。吸去上清，每孔的沉淀各用200μL TES溶液重悬，4℃，150rpm，孵育2h。

(4)继续向每孔加入300μL TES/4溶液，放置于4℃，150rpm孵育2h。再将深孔板放置于4℃，4000rpm，离心30min。将上述上清以100μL分别加入到相应的含有目的蛋白的孔中以及阴性对照孔中，37℃孵育1h。

(5)每孔加入300μL 0.1％PBST溶液洗板，洗板三次，每次静置3min，去掉未结合的抗体，每孔加入100μL 1：5000稀释的anti-HA-HRP(购于GNI，货号为GNI4310-HA-S)，37℃孵育1h。

(6)每孔加入300μL 0.1％PBST溶液洗板，洗板三次，每次静置3min，以去掉未结合的抗体，每孔再加入100μL TMB(购于湖州英创，货号为TMB-S-004)显色剂，37℃避光孵育10min，每孔再加入100μL 2.29％硫酸(购于广州化学试剂厂)终止反应。

(7)用酶标仪测OD450nm波长处的值，抗原孔是空白孔吸光值的两倍，则视为阳性.

图5为筛选到的特异性EGFR-ECD₃纳米抗体的吸光度比值，其中图5中横线代表空白孔吸光值的两倍所对应的吸光值，横坐标对应不同的克隆编号。

(8)阳性转化子接种到10mL LB培养基(购于Sangon Biotech，货号为A507002)中，37℃，150rpm培养8h，收集菌液并送测序(Sangon Biotech)。

根据测序结果，用BLAST进行序列比对，将互补决定区序列高度相近的序列视为一株，最终筛选得到一株特异性抗EGFR纳米抗体，其氨基酸序列如：SEQ ID NO:1所示，该纳米抗体命名为Nb_H3。

实施例5抗EGFR纳米抗体的表达纯化

(1)将含有上述筛选获得的Nb_H3阳性转化子的质粒以1800V的电压电转至WK6(购于BioVector NTCC质粒载体菌种细胞基因保藏中心)菌株中，涂布在Amp抗性的LB平板上，过夜培养，第二天，挑取平板上的单菌落接种到10mL含有Amp抗性的LB培养基中，37℃、220rpm培养8h。

(2)将上述菌液接种到330mL含有Amp抗性的TB培养基(购于ELITE-MEDIA，M201-02)中，37℃，220rpm培养至OD＝0.7-0.8。再加入终浓度为1mM IPTG，28℃、220rpm诱导过夜。

(3)第二天，收集菌体，PBS重悬再离心。最后用菌体质量比TES溶液体积比1：10的比列重悬菌体，利用渗透压法破碎菌体。10000rpm离心30min，收集上清提取物。再用0.45μm滤膜进行过滤除菌体碎片。

(4)步骤参照实施例1(3)。

(5)步骤参照实施例1(4)，最终获得纯化后的纳米抗体Nb_H3，经Image J软件分析，其纯度为95％。

图6为特异性抗EGFR纳米抗体的表达纯化结果。其中图6中，标志物(marker)用来指示蛋白的大小；粗提液即代表步骤(3)中获得的菌体破碎上清；穿透液为步骤(4)获得的上柱后的穿透峰，Nb_H3代表经过表达纯化的特异性抗EGFR纳米抗体。

实施例6抗EGFR纳米抗体特异性检测

通过下面的步骤对实施例5获得的抗EGFR纳米抗体Nb_H3进行特异性检测：

(1)将EGFR-ECD₃、EGF(购于义翘神州，货号为GMP-10605-HNAE)、bFGF(购于义翘神州，货号为10014-HNAE)、Her2(购于义翘神州，货号为10004-HCCH)稀释为1μg/mL溶液，加入酶标板中，100ng/孔，4℃孵育过夜。同时设置对照。

(2)用300μL 0.1％PBST洗板，洗板一次，静置3min，每孔再加入300μL 5％脱脂奶粉，37℃封闭1h。

(3)用300μL 0.1％PBST洗板，洗板一次，静置3min，空白对照PBS以及实验组纳米抗体NbH₃加入到酶标板，每孔100μL，100ng/孔，37℃孵育1h。

(4)每孔加入300μL 0.1％PBST溶液洗板，洗板三次，每次静置3min，去掉未结合的抗体，再向每孔加入100μL 1：5000稀释的Mouse anti-HA mAb，37℃孵育1h。

(5)每孔加入300μL 0.1％PBST溶液洗板，洗板三次，每次静置3min，去掉未结合的抗体，再向每孔加入100μL 1：5000稀释的HRP-Goat Anti-Mouse IgG(H+L)(购于proteintech，货号为SA00001-1)，37℃孵育1h。

(6)每孔加入300μL 0.1％PBST溶液洗板，洗板五次，每次静置3min，每孔100μL的TMB溶液加入到酶标板中，37℃避光孵育10min。

(7)再向酶标板中每孔加入100μL 2.29％硫酸终止反应，用酶标仪在450nm和630nm处测量OD值，计算OD450-OD630的差值即为所得的OD值。

图7为抗EGFR纳米抗体特异性分析结果，结果表明此纳米抗体可特异性的结合EGFR-ECD3，与其它对照蛋白结合的比值大于2。

实施例7抗EGFR纳米抗体亲和力检测

应用下述方法对所获得的抗EGFR纳米抗体的亲和力进行检测：

(1)用NaHCO₃包被液稀释EGFR-ECD₃蛋白，以100ng EGFR-ECD₃蛋白偶联在酶标板中，4℃过夜，并设置相应的阴性对照。

(2)用300μL 0.1％PBST洗板，洗板一次，静置3min，每孔再加入300μL 5％脱脂奶粉，37℃封闭2h。

(3)用300μL 0.1％PBST洗板，洗板一次，静置3min，将纯化的纳米抗体NbH3以起始浓度40μg/mL，以1:2的比例倍比稀释8个浓度梯度，以100μL/孔加入到酶标板中，37℃孵育1h。

(4)后续步骤与参照实施例5。

图8为抗EGFR纳米抗体亲和力的检测结果，其EC50值为8.7619μg/mL。

实施例8

对于所提供的抗EGFR纳米抗体的抑癌效果进行如下验证：

取对数生长期A549细胞(购于北京北纳创联生物技术研究院)，以每孔5.0*10³个细胞接种于96孔细胞培养板中，设空白组(即含有细胞以及0.4％FBS的DMEM培养基)、对照组(饥饿后仅加最佳作用浓度的EGF(0.0625μmol/L))和实验组(饥饿后加最佳作用浓度的EGF与Nb_H3不同浓度梯度(以1μmol/L为起始浓度，1:4的比例倍比稀释，共9个梯度)的混合体系)，将96孔细胞培养板在培养箱(37℃，5％CO₂)预培养24h，弃去培养基，并用1×PBS小心清洗两遍，每孔加入100μL无血清的培养基，饥饿2h后弃去板内液体，配制最佳作用浓度的EGF以及不同浓度梯度的Nb_H3，加入至96孔细胞培养板中，将培养板在培养箱孵育48h，向每孔各加入10μL CCK8溶液(购于南京旋光科技有限公司)。将培养板置于培养箱内孵育1小时。用酶标仪测定在450nm-630nm处的吸光度值，取5孔平均值，以空白孔调零，绘制增殖抑制曲线。

图9为采用CCK8实验检测纳米抗体可抑制由EGF引起的A549细胞增殖，其最佳抑制浓度为0.015625μmol/L。由此表明所提供的纳米抗体在极低浓度下就可以抑制癌症细胞的增殖，从而应用于癌症治疗中或者用于制备抗癌药物。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 佛山汉腾生物科技有限公司,暨南大学

<120> 抗EGFR纳米抗体及其应用

<130> PIDC3196214

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 122

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 抗EGFR纳米抗体

<400> 1

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Asn Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Thr Gly Cys Lys Asn

20 25 30

Gly Met Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ser Gly Ile Asp Arg Asp Gly Ser Pro Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Ile Val Phe Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Thr Asn Pro Gln Arg Asn Ile Tyr Gly Gly Ser Trp Cys Asn Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 2

<211> 606

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> EGFR-ECD3

<400> 2

atgcgaccct ccgggacggc cggggcagcg ctcctggcgc tgctggctgc gctctgcccg 60

gcgagtcggg ctcgcaaagt gtgtaacgga ataggtattg gtgaatttaa agactcactc 120

tccataaatg ctacgaatat taaacacttc aaaaactgca cctccatcag tggcgatctc 180

cacatcctgc cggtggcatt taggggtgac tccttcacac atactcctcc tctggatcca 240

caggaactgg atattctgaa aaccgtaaag gaaatcacag ggtttttgct gattcaggct 300

tggcctgaaa acaggacgga cctccatgcc tttgagaacc tagaaatcat acgcggcagg 360

accaagcaac atggtcagtt ttctcttgca gtcgtcagcc tgaacataac atccttggga 420

ttacgctccc tcaaggagat aagtgatgga gatgtgataa tttcaggaaa caaaaatttg 480

tgctatgcaa atacaataaa ctggaaaaaa ctgtttggga cctccggtca gaaaaccaaa 540

attataagca acagaggtga aaacagctgc aaggccacag gccagcacca ccaccaccac 600

cactga 606

<210> 3

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F-primer

<400> 3

gaggaggagg aggaggtggc ccaggcggcc caggtsmarc tgcagsagtc wgg 53

<210> 4

<211> 56

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R-primer 1

<400> 4

gaggaggagg aggaggtggc ccaggcggcc ggagctgggg tcttcgctgt ggtgcg 56

<210> 5

<211> 56

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R-primer 2

<400> 5

gaggaggagg aggaggtggc ccaggcggcc tggttgtggt tttggtgtct tgggtt 56

Claims (11)

1.一种抗EGFR纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述纳米抗体的CDR1氨基酸序列为GYTGCKNGMS，所述纳米抗体的CDR2氨基酸序列为IDRDGSP，所述纳米抗体的CDR3氨基酸序列为ATNPQRNIYGGSWCNY。

2.一种核酸，其特征在于，所述核酸包含编码权利要求1所述的纳米抗体的核酸序列。

3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求2所述的核酸。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，进一步包括调节元件，所述调节元件与所述核酸可操作地连接。

5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述调节元件包括选自启动子、增强子、终止子中的至少一种。

6.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞含有权利要求3～5任一项所述的表达载体。

7.一种生产抗EGFR纳米抗体的方法，其特征在于，包括培养权利要求6所述的重组细胞，以便获得所述抗EGFR纳米抗体。

8.权利要求1所述的纳米抗体在制备治疗EGFR过表达为特征疾病的药物中的用途。

9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1所述的纳米抗体和药学上可接受的载体。

10.一种检测EGFR的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的纳米抗体。

11.一种Car-T细胞，其特征在于，所述Car-T细胞包括权利要求1所述的纳米抗体。

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