ES2352697T3 - Anticuerpos de dominio único de camelidae vhh dirigidos contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico y usos de los mismos. - Google Patents

Abstract

Un polipéptido anti-EGFR que comprende al menos un anticuerpo de dominio único dirigido contra EGFR, en el que dicho anticuerpo de dominio único procede de un anticuerpo de cadena pesada naturalmente desprovisto de cadena ligera (VHH), y en el que dicho al menos un anticuerpo de dominio único es capaz de internalizar EGFR en células EGFR + .

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona anticuerpos de dominio único de acuerdo con la reivindicación 1. La presente invención se refiere además a su uso en el diagnóstico y la terapia. Dichos anticuerpos pueden tener una secuencia de 5 región flanqueante con una alta homología con las secuencias de regiones flanqueantes humanas. Se describe una composición que comprende anticuerpos contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico en solitario o en combinación con otros fármacos.

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ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El EGFR es parte de la familia de receptores ERBB, que tiene cuatro miembros estrechamente relacionados —EGFR 10 (ERBB1), HER2 (ERBB2), HER3 (ERBB3) y HER4 (ERBB4)—, que consisten en un dominio de unión a ligando extracelular, un dominio transmembrana y un dominio tirosina quinasa intracelular (Yarden y col. 2001, Nature Rev. Mol. Cell Biol. 2, 127-137). La primera etapa en la estimulación mitogénica de células epidérmicas es la unión específica de ligandos tales como el factor de crecimiento epidérmico (EGF) o el factor de crecimiento transformante alfa (TGF) a una glicoproteína de membrana conocida como el receptor del factor de crecimiento epidérmico (receptor de EGF). 15 (Carpenter y col. 1979, Epidermal Growth Factor, Annual Review Biochem., Vol. 48, 193-216). El receptor de EGF está compuesto por 1.186 aminoácidos que se dividen en una porción extracelular de 621 restos y una porción citoplasmática de 542 restos conectadas por un solo segmento transmembrana hidrófobo de 23 restos. (Ullrich, y col. 1986, Human Epidermal Growth Factor cDNA Sequence and Aberrant Expression of the Amplified Gene in A-431 Epidermoid Carcinoma Cells, Nature, Vol. 309, 418-425). La porción externa del receptor de EGF puede subdividirse en 20 cuatro dominios. Se ha demostrado que el dominio I y III, flanqueados por dos dominios ricos en cisteína, contienen probablemente el sitio de unión a EGF del receptor (Ogiso y col. 2002. Crystal structure of the complex of human epidermal growth factor and receptor extracellular domains. Cell 110, 775-787. Garrett y col. 2002. Crystal structure of a truncated epidermal growth factor receptor extracellular domain bound to transforming growth factor alpha. Cell 110. 763-773.). La unión del EGF monovalente al dominio I y III conduce al inicio de las respuestas pleiotrópicas que 25 conducen a la síntesis de ADN y a la proliferación y diferenciación celular.

La unión del ligando monovalente a EGFR causa un cambio conformacional del dominio II del ectodominio del receptor, conduciendo a la dimerización del receptor que activa la actividad tirosina quinasa en el dominio intracelular. Esto conduce a la transfosforilación del receptor y al inicio de una miríada de cascadas de transducción de señales. La activación de EGFR se ha implicado en procesos involucrados en el crecimiento y la progresión tumoral, incluyendo la 30 proliferación celular, angiogénesis, metástasis, inhibición de la apoptosis y resistencia a radio- o quimioterapia. El EGFR se expresa en una amplia diversidad de tumores de origen epitelial, incluyendo >40% de CPNM (cánceres pulmonares no microcíticos), >95% de cánceres de cabeza y cuello, >30% de cánceres pancreáticos, >90% de carcinomas renales, >35% de cánceres de ovario, >40% de glioma y >31% de cánceres de vejiga (Salomon y col. 1995. Crit. Review Oncol. Hematol, 19, 183-232). Parece que los altos niveles de expresión de EGFR están asociados con progresión de la 35 enfermedad, aumento de la metástasis y mal pronóstico, proporcionando un fundamento sólido para desarrollar anticuerpos que se dirijan a EGFR eficaces para el tratamiento de diversos tumores sólidos. Se ha descubierto en diversos tipos de células tumorales humanas que esas células están caracterizadas por una desregulación de la señalización del receptor de EGF debido a una sobreexpresión del receptor y a la presencia de heterodímeros de EGFR de señalización constitutiva o formas mutantes de EGFR. Las células de cáncer de mama presentan una correlación 40 positiva entre la densidad de receptores de EGF y el tamaño tumoral y una correlación negativa con el grado de diferenciación. (Sainsbury y col. 1985, Epidermal Growth Factor Receptors and Oestrogen Receptors in Human Breast Cancer, Lancet, Vol. 1, 364-366; Sainsbury y col. 1985, Presence of Epidermal Growth Factor Receptor as an Indicator of Poor Prognosis in Patients with Breast Cancer, J. Clin. Path., Vol. 38, 1225-1228; Sainsbury y col. 1987. Epidermal-Growth-Factor Receptor Status as Predictor of Early Recurrence and Death From Breast Cancer, Lancet, Vol. 1, 1398-45 1400). Como los fibroblastos sinoviales y los queratinocitos son tipos celulares que también expresan receptor de EGF, estas células son células diana candidatas para el tratamiento de la artritis inflamatoria y de la psoriasis, respectivamente.

El EGFR se ha implicado también en varias otras enfermedades, tales como artritis inflamatoria (documentos US 5906820, US 5614488) e hipersecreción de moco en los pulmones (documentos US 6566324, US 6551989). 50

Muchos de los anticuerpos que se dirigen a EGFR tales como IMC-C225 (Erbitux, Imclone), EMD72000 (Merck Darmstadt), ABX-EGF (Abgenix), h-R3 (theraCIM, YM Biosciences) y Humax-EGFR (Genmab) se aislaron como anticuerpos que impiden la unión del ligando al receptor. Todavía ninguno de estos anticuerpos ni los fármacos actualmente disponibles son completamente eficaces para el tratamiento del cáncer y la mayoría están limitados por una grave toxicidad. Además, es extremadamente difícil y un proceso prologando desarrollar una nueva entidad química 55 (NEQ) con una potencia y selectividad suficientes para dicha secuencia diana. El objetivo principal en el tratamiento de tumores es destruir todas las células del tumor. Un agente terapéutico que destruye la célula se define como citotóxico. Un agente terapéutico que simplemente impide que las células se repliquen en lugar de destruir las células se define como citostático. Los compuestos terapéuticos basados en anticuerpos conocidos que se unen al receptor de EGF

simplemente impiden que las células se repliquen y, por lo tanto, dichos anticuerpos convencionales actúan como agente citostático (documentos EP 667165, EP 359282, US 5844093).

Por otro lado, los anticuerpos ofrecen un potencial significativo como fármacos debido a que tienen una especificidad exquisita hacia su diana y una baja toxicidad intrínseca. Además, el tiempo de desarrollo puede reducirse considerablemente cuando se compara con el desarrollo de nuevas entidades químicas (NEQ). Sin embargo, los 5 anticuerpos convencionales son difíciles de generar contra proteínas multiméricas en las que el dominio de unión a receptor del ligando está embebido en una hendidura o en la interfase entre las dos subunidades, como es el caso del Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico. Se sabe que los anticuerpos de cadena pesada descritos en la invención que proceden de Camelidae tienen una tendencia a unirse en cavidades (documento WO97/49805; Lauwereys y col, EMBO J. 17, 5312, 1998)). Por lo tanto, dichos anticuerpos de cadena pesada están intrínsecamente 10 adaptados a unirse a los dominios de unión a receptor de ligandos tales como EGF y, por lo tanto, pueden funcionar por un mecanismo de acción diferente para proporcionar un efecto citotóxico sobre células tumorales. Además, se sabe que dichos anticuerpos son estables durante periodos de tiempo prolongados, aumentando de este modo su vida media (Pérez y col, Biochemistry, 40, 74, 2001). Además, dichos fragmentos de anticuerpo de cadena pesada pueden producirse “en masa” en fermentadores usando sistemas de expresión baratos en comparación con la fermentación de 15 cultivos de células de mamífero tales como levaduras u otros microorganismos (documento EP 0 698 097).

El uso de anticuerpos derivados de fuentes tales como ratón, oveja, cabra, conejo, etc., y derivados humanizados de los mismos, como tratamiento para afecciones que requieren un efecto citostático o citotóxico sobre células tumorales es problemático por varias razones. Los anticuerpos tradicionales no son estables a temperatura ambiente y tienen que refrigerarse para su preparación y almacenamiento, requiriendo un equipo de laboratorio, almacenamiento y transporte 20 refrigerado necesario que contribuye al consumo de tiempo y gastos. La refrigeración a veces no es factible en países en desarrollo. Además, la fabricación o producción a pequeña escala de dichos anticuerpos es cara debido a que los sistemas celulares de mamífero necesarios para la expresión de anticuerpos activos e intactos requieren altos niveles de apoyo en términos de tiempo y equipamiento, y los rendimientos son muy bajos. Además, el gran tamaño de los anticuerpos convencionales limitaría la penetración tisular, por ejemplo, en el lugar de un tumor sólido. Además, los 25 anticuerpos tradicionales tienen una actividad de unión que depende del pH y, por lo tanto, no son adecuados para su uso en entornos fuera del intervalo de pH fisiológico habitual tales como, por ejemplo, en el tratamiento del cáncer colorrectal. Además, los anticuerpos tradicionales son inestables a bajo o alto pH y, por lo tanto, no son adecuados para su administración oral. Sin embargo, se ha demostrado que los anticuerpos de Camelidae resisten a condiciones duras, tales como pH extremo, reactivos desnaturalizantes y altas temperaturas (Ewert S y col, Biochemistry 2002 Mar 19; 30 41(11): 3628-36), haciéndolos adecuados para su suministro por administración oral. Además, los anticuerpos tradicionales tienen una actividad de unión que depende de la temperatura y, por lo tanto, son inadecuados para su uso en ensayos o kits realizados a temperaturas fuera de los intervalos de temperatura biológicamente activos (por ejemplo, 37  20ºC).

Los compuestos terapéuticos polipeptídicos y, en particular, los compuestos terapéuticos basados en anticuerpos tienen 35 un potencial significativo como fármacos porque tienen una especificidad exquisita hacia su diana y una baja toxicidad intrínseca. Sin embargo, los destinatarios expertos saben que un anticuerpo que se ha obtenido para una diana terapéuticamente útil requiere una modificación adicional para prepararlo para terapia humana, para evitar una reacción inmunológica no deseada en un individuo humano tras su administración al mismo. El proceso de modificación se denomina comúnmente “humanización”. El experto en la materia sabe que los anticuerpos generados en especies 40 distintas de seres humanos requieren una humanización para hacer al anticuerpo terapéuticamente útil en seres humano ((1) injertado de CDR: Protein Design Labs: US 6180370, US 5693761; Genentech US 6054297; Celltech: 460167, EP 626390, US 5859205; (2) Revestimiento: Xoma: US 5869619, US 5766886, US 5821123). Existe la necesidad de un procedimiento para producir anticuerpos que evite la necesidad de una humanización sustancial o que obvie completamente la necesidad de humanización. Existe la necesidad de una nueva clase de anticuerpos que tengan 45 regiones flanqueantes o restos aminoacídicos definidos y que puedan administrarse a un sujeto humano sin la necesidad de una humanización sustancial o la necesidad de una humanización en absoluto.

Otro inconveniente importante de los anticuerpos convencionales es que son moléculas grandes complejas y, por lo tanto, relativamente inestables, y que son sensibles a la degradación por proteasas. Esto significa que los fármacos de anticuerpos convencionales no pueden administrarse por vía oral, sublingual, tópica, nasal, vaginal, rectal o por 50 inhalación debido a que no son resistentes al bajo pH en estos sitios, a la acción de proteasas en estos sitios y en la sangre y/o debido a su gran tamaño. Tienen que administrarse por inyección (por vía intravenosa, subcutánea, etc.) para superar algunos de estos problemas. La administración por inyección requiere el entrenamiento de especialistas para usar una jeringa o aguja hipodérmica correctamente y con seguridad. Requiere además un equipo estéril, una formulación líquida del polipéptido terapéutico, un envasado en viales de dicho polipéptido en una forma estéril y estable 55 y, del sujeto, un sitio adecuado para la entrada de la aguja. Además, los sujetos experimentan comúnmente estrés físico y psicológico antes de y tras recibir una inyección. Por lo tanto, existe la necesidad de un procedimiento para la administración de polipéptidos terapéuticos que evite la necesidad de inyección, que no sólo ahorre costes/tiempo, sino que también sería más conveniente y más cómoda para el sujeto.

LOS OBJETIVOS DE LA PRESENTE INVENCIÓN 60

Un objetivo de la presente invención es proporcionar polipéptidos que comprenden uno o más anticuerpos de dominio único que se unen a EGFR, homólogos de dichos polipéptidos, porciones funcionales de homólogos. Dichos polipéptidos pueden i) inhibir la unión del ligando natural al receptor y/o ii) evitar la homo- y heterodimerización del receptor y/o iii) inducir la apoptosis en células humanas, modificando de este modo la actividad biológica del Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico tras la unión. Dichos polipéptidos podrían unirse en la hendidura de unión a 5 ligando del Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico o podrían no unirse en la hendidura de unión a ligando. Dichos polipéptidos son anticuerpos de dominio único.

Un objetivo adicional de la presente invención es proporcionar anticuerpos de dominio único que pueden ser anticuerpos de cadena pesada, anticuerpos naturalmente desprovistos de cadenas ligeras, anticuerpos de dominio único derivados de anticuerpos de 4 cadenas convencionales, anticuerpos modificados por ingeniería genética y armazones de dominio 10 único distintos de los derivados de anticuerpos.

Un objetivo adicional de la invención es proporcionar un procedimiento de administración de polipéptidos anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico por vía intravenosa, oral, sublingual, tópica, nasal, vaginal, rectal o por inhalación.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

En una realización, la presente invención se refiere a un polipéptido anti-EGFR que comprende al menos un anticuerpo 15 de dominio único dirigido contra EGFR, en el que dicho anticuerpo de dominio único procede de un anticuerpo de cadena pesada naturalmente desprovisto de cadena ligera (VHH) y en el que dicho al menos un anticuerpo de dominio único es capaz de internalizarse en células EGFR+, en particular dicho polipéptido anti-EGFR que puede obtenerse por incubación de fagos recombinantes que expresen un repertorio de VHH clonados con células EGFR+ en condiciones para permitir la internalización de los fagos y la posterior liberación de los fagos internalizados. La célula EGFR+ puede 20 seleccionarse de células HER-14 y A413.

Más específicamente, la presente invención proporciona polipéptidos anti-EGFR como se ha analizado anteriormente, en los que al menos un anticuerpo de dominio único corresponde a una secuencia representada por cualquiera de las SEC ID Nº: 21, 22 o

a. una secuencia homóloga de cualquiera de las SEC ID Nº: 21, 22 con una identidad de secuencia de más del 70%, 25 más del 80% o más del 90% con la secuencia precursora;

b. una porción funcional de cualquiera de las SEC ID Nº: 21, 22 que mantiene la interacción con la diana con una afinidad de 1 x 10-6 M o mejor;

c. una porción funcional de cualquiera de las SEC ID Nº: 21, 22 que comprende una deleción parcial de la secuencia de aminoácidos completa y todavía mantiene el sitio o sitios de unión y el dominio o dominios proteicos necesarios para la 30 unión de y la interacción con EGFR.

La invención proporciona más particularmente polipéptidos anti-EGFR como se han descrito anteriormente, en los que el al menos un anticuerpo de dominio único compite por o inhibe la unión del ligando natural a EGFR. El ligando natural puede ser EGF.

En una realización, el polipéptido anti-EGFR, como se ha descrito anteriormente, comprende al menos un anticuerpo de 35 dominio único que es capaz de unirse a su diana con una afinidad de más de 10-6 M.

En una realización adicional, el polipéptido anti-EGFR, como se ha descrito anteriormente, puede comprender además al menos un anticuerpo de dominio único dirigido contra una o más proteínas séricas. Las proteínas séricas pueden ser cualquiera de albúmina sérica, inmunoglobulinas séricas, proteína de unión a tiroxina, transferrina o fibrinógeno o un fragmento de las mismas. 40

En una realización, el polipéptido anti-EGFR como se ha descrito anteriormente comprende al menos un anticuerpo de dominio único que es un dominio de VHH. Dicho dominio de VHH puede llevar un aminoácido del grupo que consiste en glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, tirosina, triptófano, metionina, serina, treonina, asparagina o glutamina en posición 45 de acuerdo con la numeración de Kabat; o puede llevar un resto de arginina en la posición 103 de acuerdo con la numeración de Kabat. 45

En una realización particular, el polipéptido anti-EGFR como se ha descrito anteriormente comprende un dominio de VHH, en el que dicho dominio de VHH se obtiene inmunizando a un camélido y obteniendo un hibridoma a partir del mismo, o clonando una biblioteca de anticuerpos de dominio único posteriormente a la selección usando presentación en fagos.

En una realización adicional, el al menos un anticuerpo de dominio único es un VHH humanizado. Puede humanizarse 50 por sustitución de uno o más de los aminoácidos de Camelidae por su homólogo humano, como se encuentran en la secuencia de consenso humana. Más específicamente, puede humanizarse sustituyendo cualquiera de los restos siguientes en solitario o en combinación: posiciones de la FR1 1, 5, 28 y 30, el aminoácido distintivo en la posición 44 y

45 en la FR2, restos de la FR3 74, 75, 76, 83, 84, 93 y 94 y posiciones 103, 104, 108 y 111 en la FR4; numeración de acuerdo con la numeración de Kabat.

En una realización adicional, el polipéptido anti-EGFR, como se ha descrito anteriormente, puede comprender además al menos un anticuerpo de dominio único seleccionado del grupo que consiste en anticuerpo de dominio único anti-IFN-gamma, anticuerpo de dominio único anti-TNF-alfa, anticuerpo de dominio único anti-receptor de TNF-alfa y anticuerpo 5 de dominio único anti-receptor de IFN-gamma.

La invención proporciona un polipéptido anti-EGFR como se ha descrito anteriormente, en el que el número de anticuerpos de dominio único dirigidos contra EGFR es de al menos dos. Los dos o más anticuerpos de dominio único pueden ser diferentes en secuencia o idénticos en secuencia. Los dos o más anticuerpos de dominio único pueden estar fusionados genéticamente a nivel de ADN. Los anticuerpos de dominio único pueden estar unidos entre sí directamente. 10 El polipéptido anti-EGFR puede ser una molécula bivalente, trivalente o tetravalente.

La invención proporciona además un polipéptido anti-EGFR como se ha descrito anteriormente, que comprende además un vehículo que mejora la transferencia a través de la pared intestinal hacia el torrente sanguíneo. El vehículo puede ser un VHH que se une específicamente a un receptor en la pared intestinal.

La invención también proporciona un polipéptido anti-EGFR como se ha descrito anteriormente, que comprende además 15 un vehículo que mejora el transporte del polipéptido desde la luz pulmonar a la sangre. El vehículo puede ser un VHH que se une específicamente a un receptor en la superficie de la mucosa. Dicho receptor puede ser el receptor N de Fc (FcRn).

La invención también proporciona un ácido nucleico que codifica un polipéptido como se ha descrito anteriormente, así como una célula huésped que comprende el ácido nucleico. 20

En un aspecto adicional, la invención proporciona una composición que comprende un polipéptido como se ha descrito anteriormente, o un ácido nucleico como se ha descrito anteriormente, y un vehículo farmacéutico adecuado. La composición puede adaptarse a la vía de administración seleccionada, es decir, la vía oral, vaginal, rectal, parenteral, intranasal, por inhalación, sublingual, intravenosa, intramuscular, tópica o subcutánea, específicamente, puede ser adecuada para inyección o infusión. 25

La invención también proporciona una composición terapéutica que comprende un polipéptido anti-EGFR en combinación con un agente antineoplásico o quimioterápico, que en una realización puede ser para la administración separada de los componentes.

La invención proporciona además el polipéptido, ácido nucleico o composición anti-EGFR como se ha descrito anteriormente para su uso en el tratamiento, prevención y/o alivio de los síntomas de trastornos relacionados con 30 procesos inflamatorios, o que tienen efectos citostáticos o citotóxicos sobre tumores;

o para su uso en el tratamiento, prevención y/o alivio de cánceres epiteliales, tales como de pulmón, hígado, sistema nervioso central, hueso, sangre y sistema linfático, colon, mama, próstata, recto, vejiga, cabeza y cuello, ovario, testículo, pancreático y carcinoma de células escamosas,

o para su uso en el tratamiento, prevención y/o alivio de enfermedades autoinmunes, tales como enfermedad de 35 Addison (glándula suprarrenal), enfermedades autoinmunes del oído (oído), enfermedades autoinmunes del ojo (ojo), hepatitis autoinmune (hígado), parotitis autoinmune (glándula parotidea), enfermedad de Crohn (intestino), diabetes Tipo I (páncreas), epididimitis (epidídimo), glomerulonefritis (riñones), enfermedad de Graves (tiroides), síndrome de Guillain-Barré (células nerviosas), enfermedad de Hashimoto (tiroides), anemia hemolítica (eritrocitos), lupus eritematoso sistémico (múltiples tejidos), infertilidad masculina (esperma), esclerosis múltiple (células nerviosas), miastenia grave 40 (unión neuromuscular), pénfigo (principalmente piel), psoriasis (piel), fiebre reumática (corazón y articulaciones), artritis reumatoide (revestimiento articular), sarcoidosis (múltiples tejidos y órganos), esclerodermia (piel y tejido conectivo), síndrome de Sjogren (glándulas exocrinas y otros tejidos), espondiloartropatías (esqueleto axial y otros tejidos), tiroiditis (tiroides), vasculitis (vasos sanguíneos).

Más específicamente, la invención proporciona el uso de un polipéptido o construcción polipeptídica o de un ácido 45 nucleico, como se ha definido anteriormente, para la preparación de un medicamento para tratar un trastorno relacionado con procesos inflamatorios y cáncer,

o para la preparación de un medicamento para el tratamiento de afecciones que requieren el bloqueo de la acción de EGFR, el bloqueo de la unión de ligando a EGFR, la prevención de la dimerización de EGFR y/o la inducción de apoptosis, 50

o para la preparación de un medicamento para el tratamiento, prevención y/o alivio de cánceres epiteliales, tales como de pulmón, hígado, sistema nervioso central, hueso, sangre y sistema linfático, colon, mama, próstata, recto, vejiga, cabeza y cuello, ovario, testículo, pancreático y carcinoma de células escamosas,

o para la preparación de un medicamento para el tratamiento, prevención y/o alivio de enfermedades autoinmunes, tales como enfermedad de Addison (glándula suprarrenal), enfermedades autoinmunes del oído (oído), enfermedades autoinmunes del ojo (ojo), hepatitis autoinmune (hígado), parotitis autoinmune (glándula parotidea), enfermedad de Crohn (intestino), diabetes Tipo I (páncreas), epididimitis (epidídimo), glomerulonefritis (riñones), enfermedad de Graves (tiroides), síndrome de Guillain-Barré (células nerviosas), enfermedad de Hashimoto (tiroides), anemia hemolítica 5 (eritrocitos), lupus eritematoso sistémico (múltiples tejidos), infertilidad masculina (esperma), esclerosis múltiple (células nerviosas), miastenia grave (unión neuromuscular), pénfigo (principalmente piel), psoriasis (piel), fiebre reumática (corazón y articulaciones), artritis reumatoide (revestimiento articular), sarcoidosis (múltiples tejidos y órganos), esclerodermia (piel y tejido conectivo), síndrome de Sjogren (glándulas exocrinas y otros tejidos), espondiloartropatías (esqueleto axial y otros tejidos), tiroiditis (tiroides), vasculitis (vasos sanguíneos). 10

La invención proporciona además un procedimiento de producción de un polipéptido como se ha descrito anteriormente que comprende: cultivar células huésped que comprenden un ácido nucleico capaz de codificar dicho polipéptido o construcción polipeptídica en condiciones que permitan la expresión del polipéptido y recuperar el polipéptido producido a partir del cultivo. El procedimiento puede implicar células huésped que son células bacterianas, células de levadura, células de mamífero o células de insecto, más específicamente células bacterianas o células de levadura, en particular 15 células de E. coli, células de S. cerevisiae o células de P. pastoris.

Además, la invención también proporciona un procedimiento de diagnóstico de un trastorno caracterizado por la disfunción de EGFR que comprende las etapas de: poner en contacto una muestra con un polipéptido como se ha descrito anteriormente, detectar la unión de dicho polipéptido a dicha muestra y comparar la unión detectada en la etapa (b) con un patrón, en el que una diferencia en la unión respecto a dicha muestra es diagnóstica de un trastorno 20 caracterizado por una disfunción de EGFR.

La invención también proporciona un kit para explorar un trastorno caracterizado por una disfunción de EGFR que comprende un polipéptido de acuerdo con la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Y TABLAS

Figura 1. ELISA para detectar títulos de anticuerpos específicos de A431 en suero de llama. 25

Figura 2. Detección de títulos de anticuerpos específicos de EGFR en suero de llama.

Figura 3. Detección de títulos de anticuerpos específicos de EGFR en suero de las llamas 024 y 025 (panel A) y de las llamas 026 y 027 (panel B).

Figura 4. Respuesta de fagos a EGFR.

Figura 5. Alineamiento de aminoácidos de 31 clones identificados por el procedimiento de selección por elución 30 específica de epítopo.

Figura 6. ELISA de fagos en células (panel A) o en EGFR inmovilizados en fase sólida (panel B) de los 20 clones específicos de EGFR únicos identificados por el procedimiento de selección por elución específica de epítopo.

Figura 7. Internalización de EGFR-IIIa42 con Her-14 (panel A) y 3T3 (panel B).

Tabla 1. Programa de inmunización y recogida de tejidos. 35

Tabla 2. Visión de conjunto de las bibliotecas construidas.

Tabla 3. Visión de conjunto del procedimiento de selección por elución específica de epítopo.

Tabla 4. Visión de conjunto de procedimiento de selección por “internalización”.

Tabla 5. Secuencias de aminoácidos de dominios variables de anticuerpos específicos de EGFR.

Tabla 6. Tabla de identificación de cebadores. 40

DESCRIPCIÓN DETALLADA

La presente invención se refiere a un polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico (EGFR) que comprende al menos un anticuerpo de dominio único de acuerdo con la reivindicación 1 que se dirige hacia el Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico. La invención también se refiere a ácidos nucleicos capaces de codificar dichos polipéptidos. 45

Otra realización de la presente invención es un polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico en el que al menos un anticuerpo de dominio único corresponde a una secuencia correspondiente a cualquiera de las SEC ID Nº: 21 ó 22 como se muestran en la Tabla 5. Dichas secuencias proceden de anticuerpos de cadena pesada de Camelidae (VHH) que se dirigen hacia el Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico.

Los anticuerpos de dominio único son anticuerpos cuyas regiones determinantes de complementariedad son parte de un polipéptido de dominio único. De acuerdo con la invención, un anticuerpo de dominio único, como se usa en el presente documento, es un anticuerpo de dominio único de origen natural conocido como un anticuerpo de cadena pesada desprovisto de cadenas ligeras. Dichos anticuerpos de dominio único se desvelan en el documento WO 94/04678, por ejemplo. Por razones de claridad, este dominio variable derivado de un anticuerpo de cadena pesada naturalmente 5 desprovisto de cadena ligera se conoce en el presente documento como un VHH o nanocuerpo, para diferenciarlo de la VH convencional de las inmunoglobulinas de cuatro cadenas. Dicha molécula de VHH puede proceder de anticuerpos generados en especies de Camelidae, por ejemplo, en camello, dromedario, llama, vicuña, alpaca y guanaco. Otras especies aparte de Camelidae pueden producir anticuerpos de cadena pesada naturalmente desprovistos de cadena ligera; dichos VHH se incluyen en el ámbito de la invención. 10

Los VHH, de acuerdo con la presente invención y como saben los destinatarios expertos, son dominios variables de cadena pesada derivados de inmunoglobulinas naturalmente desprovistas de cadenas ligeras, tales como los derivadas de Camelidae, como se describe en el documento WO 94/04678 (y denominados en lo sucesivo dominios VHH o nanocuerpos). Las moléculas de VHH son aproximadamente 10x más pequeñas que las moléculas de IgG. Son polipéptidos sencillos y muy estables que resisten condiciones de temperatura y pH extremas. Además, son resistentes 15 a la acción de proteasas, no siendo el caso de los anticuerpos convencionales. Además, la expresión in vitro de VHH produce VHH funcionales plegadas apropiadamente de alto rendimiento. Además, los anticuerpos generados en camélidos reconocerán epítopos distintos de los reconocidos por anticuerpos generados in vitro mediante el uso de bibliotecas de anticuerpos o por inmunización de mamíferos distintos de camélidos (documento WO 9749805). Como tales, los VHH anti-EGFR pueden interaccionar más eficazmente con EGFR que los anticuerpos convencionales, 20 bloqueando de este modo su interacción con el ligando o ligandos de EGFR más eficazmente. Puesto que se sabe que los VHH se unen en epítopos “poco habituales” tales como cavidades o hendiduras (documento WO 97/49805), la afinidad de dichos VHH puede ser más adecuada para el tratamiento terapéutico.

Otra realización de la presente invención es un polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico de acuerdo con la reivindicación 1, que consiste en una secuencia correspondiente a la de un VHH de Camelidae dirigido 25 hacia EGFR o un miembro de la familia estrechamente relacionado. La invención también se refiere a una secuencia homóloga, una porción con una función o una porción funcional de una secuencia homóloga de dicho polipéptido. La invención también se refiere a ácidos nucleicos capaces de codificar dichos polipéptidos.

Un anticuerpo de dominio único de acuerdo con la reivindicación 1 de la presente invención se dirige contra EGFR o un miembro de la familia estrechamente relacionado. 30

El EGFR es una diana principal de acuerdo con la invención. De acuerdo con la invención, como se analiza a continuación, una construcción polipeptídica puede comprender además anticuerpos de dominio único dirigidos contra otras dianas tales como, por ejemplo, albúmina sérica. Un anticuerpo de dominio único dirigido contra una diana se refiere a un anticuerpo de dominio único que es capaz de unirse a dicha diana con una afinidad mejor que 10-6 M.

Las dianas también pueden ser fragmentos de dichas dianas. Por lo tanto, una diana también es un fragmento de dicha 35 diana, capaz de generar una respuesta inmune. Una diana también es un fragmento de dicha diana, capaz de unirse a un anticuerpo de dominio único generado contra la diana de longitud completa.

Un fragmento, como se usa en el presente documento, se refiere a menos del 100% de la secuencia (por ejemplo, el 99%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% etc.), pero que comprende 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o más aminoácidos. Un fragmento es de una longitud suficiente tal que la interacción 40 de interés se mantiene con una afinidad de 1 x 10-6 M o mejor.

Un fragmento, como se usa en el presente documento, también se refiere a inserciones, deleciones y sustituciones opcionales de uno o más aminoácidos que no alteran sustancialmente la capacidad de la diana para unirse a un anticuerpo de dominio único generado contra la diana de tipo silvestre. El número de inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos es preferiblemente de hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 45 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 88, 69 ó 70 aminoácidos.

La presente invención se refiere además a un polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico de acuerdo con la reivindicación 1, en el que un anticuerpo de dominio único es un VHH que pertenece a una clase que tiene secuencias de tipo humano. 50

Una clase de este tipo está caracterizada porque los VHH llevan un aminoácido del grupo que consiste en glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, tirosina, triptófano, metionina, serina, treonina, asparagina o glutamina en la posición 45, tal como, por ejemplo, L45 y un triptófano en posición 103, de acuerdo con la numeración de Kabat. Dicha secuencia de tipo humano está representada por la SEC ID Nº: 13. Como tales, los polipéptidos que pertenecen a esta clase muestran una alta homología de secuencia de aminoácidos con regiones flanqueantes de VH 55 humanas y dichos polipéptidos podrían administrarse a un ser humano directamente sin expectativas de una respuesta inmune no deseada por el mismo, y sin la carga de una humanización adicional.

Otra clase de tipo humano de anticuerpos de dominio único de Camelidae se ha descrito en el documento WO 03/035694 y contiene los restos hidrófobos de la FR2 que se encuentran típicamente en anticuerpos convencionales de origen humano o de otras especies, pero compensando esta pérdida de hidrofilia por el resto de arginina cargado en la posición 103 que sustituye al resto de triptófano conservado presente en la VH de anticuerpos de doble cadena. Como tales, los péptidos que pertenecen a estas dos clases muestran una alta homología de secuencia de aminoácidos con 5 regiones flanqueantes de VH humanas, y dichos péptidos podrían administrarse a un humano directamente sin expectativas de una respuesta inmune no deseada por los mismos, y sin la carga de una humanización adicional. La invención también se refiere a ácidos nucleicos capaces de codificar dichos polipéptidos.

La SEC ID Nº: 13 presenta una homología de secuencia de aminoácidos superior al 90% con regiones flanqueantes de VH humanas y, por lo tanto, dicho VHH podría administrarse a pacientes directamente sin expectativas de una 10 respuesta inmune por los mismos, y sin la carga adicional de una humanización. Por lo tanto, un aspecto de la presente invención permite la administración directa del polipéptido que comprende la SEC ID Nº: 13.

Cualquiera de los VHH anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico desvelados en el presente documento puede ser de la clase tradicional o de una clase de anticuerpos de Camelidae de tipo humano. Dichos anticuerpos pueden dirigirse contra el Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico completo o un fragmento del mismo, o un 15 fragmento de una secuencia homóloga del mismo. Estos polipéptidos incluyen los anticuerpos de Camelidae de longitud completa, en concreto los dominios Fc y VHH.

Los VHH anti-albúmina pueden interaccionar de una forma más eficaz con la albúmina sérica, que se sabe que es una proteína transportadora. Como proteína transportadora, algunos de los epítopos de la albúmina sérica pueden estar inaccesibles por proteínas, péptidos y compuestos químicos pequeños unidos. Puesto que se sabe que los VHH se 20 unen a epítopos “poco habituales” o no convencionales tales como cavidades (documento WO 97/49805), la afinidad de dichos VHH con la albúmina circulante puede ser más adecuada para el tratamiento terapéutico.

La presente invención se refiere por lo tanto al descubrimiento de que un polipéptido anti-EGFR de la invención que comprende además uno o más anticuerpos de dominio único dirigidos contra una o más proteínas séricas de un sujeto, tiene sorprendentemente una semivida significativamente prolongada en la circulación de dicho sujeto en comparación 25 con la semivida del VHH anti-diana cuando no es parte de dicho polipéptido anti-EGFR.

Otra realización de la presente invención es un polipéptido anti-EGFR de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende además al menos un anticuerpo de dominio único dirigido contra una proteína sérica, comprendiendo dicho polipéptido anti-EGFR una secuencia correspondiente a cualquiera representada por las SEC ID Nº: 27 a 40 (Tabla 5).

Otra realización de la presente invención es un polipéptido anti-EGFR de acuerdo con la reivindicación 1, en el que al 30 menos un anticuerpo de dominio único anti-proteína sérica corresponde a una secuencia representada por cualquiera de las SEC ID Nº: 23 a 26 y 41 a 53, como se muestra en la Tabla 5.

La proteína sérica puede ser cualquier proteína adecuada que se encuentre en el suero del sujeto, o un fragmento de la misma. En un aspecto de la invención, la proteína sérica es albúmina sérica, inmunoglobulinas séricas, proteína de unión a tiroxina, transferrina o fibrinógeno. Dependiendo del uso deseado tal como la semivida necesaria para un 35 tratamiento y/o una compartimentalización eficaz del antígeno diana, el compañero de VHH puede dirigirse a una de las proteínas séricas anteriores.

Además, se descubrió que dichas construcciones presentaban las mismas propiedades favorables de VHH tales como una alta estabilidad permaneciendo intactas en ratones, resistencia a pH extremo, estabilidad a altas temperaturas y alta afinidad por la diana. 40

Otra realización de la presente invención es un polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico multivalente como se ha desvelado en el presente documento, que comprende al menos dos anticuerpos de dominio único de acuerdo con la reivindicación 1 dirigidos contra el Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico. Dichos polipéptidos anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico multivalentes tienen la ventaja de una afinidad funcional alta poco habitual por la diana, presentando propiedades inhibidoras muy superiores a las esperadas en 45 comparación con sus homólogos monovalentes.

Los polipéptidos anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico multivalentes tienen afinidades funcionales que son varios órdenes de magnitud superiores a las de los polipéptidos anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico precursores monovalentes. Los inventores han descubierto que las afinidades funcionales de estos polipéptidos multivalentes son muy superiores a las descritas en la técnica anterior para anticuerpos bivalentes y multivalentes. 50 Sorprendentemente, los polipéptidos anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico de la presente invención unidos entre sí directamente o por una secuencia de engarce corta muestran las altas afinidades funcionales esperadas teóricamente con anticuerpos de cuatro cadenas convencionales multivalentes.

Los inventores han descubierto que dichas actividades funcionales muy aumentadas pueden detectarse preferentemente con antígenos compuestos por proteínas multiméricas y multidominio, en ensayos de unión directa o 55 en ensayos funcionales, por ejemplo, ensayos de citotoxicidad.

Un polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico multivalente, como se usa en el presente documento, se refiere a un polipéptido que comprende dos o más polipéptidos anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico de acuerdo con la reivindicación 1 que se han unido covalentemente. Los polipéptidos anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico pueden ser idénticos en secuencia o pueden ser diferentes en secuencia, pero se dirigen contra la misma diana o antígeno. Dependiendo del número de polipéptidos anti-Receptor del Factor de 5 Crecimiento Epidérmico unidos, un polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico multivalente puede ser bivalente (2 polipéptidos anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico), trivalente (3 polipéptidos anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico), tetravalente (4 polipéptidos anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico) o tener moléculas de mayor valencia.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, los polipéptidos anti-Receptor del Factor de Crecimiento 10 Epidérmico están unidos entre sí directamente, sin el uso de un engarce. De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, los polipéptidos anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico están unidos entre sí por una secuencia de engarce peptídica. Dicha secuencia de engarce puede ser una secuencia de origen natural o una secuencia de origen no natural. Se espera que la secuencia de engarce no sea inmunogénica en el sujeto al que se administran los polipéptidos anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico. La secuencia de engarce puede proporcionar una 15 flexibilidad suficiente al polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico multivalente, siendo al mismo tiempo resistente a la degradación proteolítica. Un ejemplo no limitante de una secuencia de engarce es una que puede proceder de la región de bisagra de los VHH descrita en el documento WO 96/34103.

Un aspecto de la invención es que un polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico multivalente desvelado anteriormente puede usarse en lugar de o también como los polipéptidos anti-Receptor del Factor de 20 Crecimiento Epidérmico unitarios individuales en las terapias y procedimientos de administración que se mencionan en el presente documento.

Los anticuerpos de dominio único pueden unirse para formar cualquiera de los polipéptidos anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico desvelados en el presente documento, que comprenden más de un anticuerpo de dominio único usando procedimientos conocidos en la técnica o cualquier procedimiento futuro. Pueden unirse no 25 covalentemente (por ejemplo, usando una combinación de estreptavidina/biotina, una combinación de anticuerpo/marcador) o covalentemente. Pueden fusionarse por entrecruzamiento químico haciendo reaccionar restos de aminoácidos con un agente de derivatización orgánico tal como se describe por Blatter y col., Biochemistry 24, 1517-1524; documento EP 294703. Como alternativa, el anticuerpo de dominio único puede fusionarse genéticamente a nivel de ADN, es decir, polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico formado que codifica el polipéptido 30 completo que comprende uno o más anticuerpos de dominio único anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico. Un procedimiento para producir un polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico bivalente o multivalente se desvela en la Solicitud de Patente PCT WO 96/34103. Una forma de unir anticuerpos de VHH es por la vía genética uniendo las secuencias codificantes de un anticuerpo de VHH directamente o por medio de un engarce peptídico. Por ejemplo, el extremo C-terminal del anticuerpo de VHH puede unirse al extremo N-terminal del anticuerpo 35 de dominio único siguiente.

Este modo de unión puede extenderse para unir anticuerpos de dominio único adicionales para la construcción y producción de construcciones tri-, tetra-, etc. funcionales.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, los anticuerpos de dominio único se unen entre sí por medio de una secuencia de engarce peptídica. Dicha secuencia de engarce puede ser una secuencia de origen natural o una 40 secuencia de origen no natural. Se espera que la secuencia de engarce no sea inmunogénica en el sujeto al que se le administra el polipéptido anti-IFN-gamma. La secuencia de engarce puede proporcionar una flexibilidad suficiente al polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico, siendo al mismo tiempo resistente a la degradación proteolítica. Un ejemplo no limitante de secuencias de engarce es uno que puede proceder de la región de bisagra de VHH descrita en el documento WO 96/34103. 45

El polipéptido desvelado en el presente documento puede prepararse por el experto en la materia de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica o cualquier procedimiento futuro. Por ejemplo, pueden obtenerse VHH usando procedimientos conocidos en la técnica tales como por inmunización de un camélido y obtención de hibridomas a partir del mismo, o por clonación de una biblioteca de anticuerpos de dominio único usando procedimientos de biología molecular conocidos en la técnica y posteriormente selección por ELISA con clones individuales de las bibliotecas no 50 seleccionadas o usando presentación en fago.

De acuerdo con un aspecto de la invención, un polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico puede ser una secuencia homóloga de un polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico de longitud completa de acuerdo con la reivindicación 1. De acuerdo con otro aspecto de la invención, un polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico puede ser una porción funcional de un polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento 55 Epidérmico de longitud completa de acuerdo con la reivindicación 1. De acuerdo con otro aspecto de la invención, un polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico puede ser una porción funcional de una secuencia homóloga de un polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico de longitud completa de acuerdo con la reivindicación 1. De acuerdo con un aspecto de la invención, un polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento

Epidérmico puede comprender una secuencia de un polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico de acuerdo con la reivindicación 1.

De acuerdo con un aspecto de la invención, un anticuerpo de dominio único de acuerdo con la reivindicación 1 usado para formar un polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico puede ser un anticuerpo de dominio único completo (por ejemplo, un VHH) o una secuencia homóloga del mismo. De acuerdo con otro aspecto de la 5 invención, un anticuerpo de dominio único de acuerdo con la reivindicación 1 usado para formar un polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico puede ser una porción funcional de un anticuerpo de dominio único completo. De acuerdo con otro aspecto de la invención, un anticuerpo de dominio único de acuerdo con la reivindicación 1 usado para formar un polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico puede ser una secuencia homóloga de un anticuerpo de dominio único completo. De acuerdo con otro aspecto de la invención, un anticuerpo de 10 dominio único de acuerdo con la reivindicación 1 usado para formar un polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico puede ser una porción funcional de una secuencia homóloga de un anticuerpo de dominio único completo.

Como se usa en el presente documento, una secuencia homóloga de la presente invención puede comprender adiciones, deleciones o sustituciones de uno o más aminoácidos, que no alteran sustancialmente las características 15 funcionales de los polipéptidos de la invención. Para los polipéptidos anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico, el número deleciones o sustituciones de aminoácidos es preferentemente de hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 ó 70 aminoácidos. 20

Una secuencia homóloga de acuerdo con la presente invención puede ser una secuencia modificada por la adición, deleción o sustitución de aminoácidos, no alterando sustancialmente dicha modificación las características funcionales en comparación con el polipéptido no modificado.

Una secuencia homóloga de acuerdo con la presente invención puede ser una secuencia que exista en otras especies de Camelidae tales como, por ejemplo, camello, dromedario, llama, vicuña, alpaca y guanaco. 25

Cuando la secuencia homóloga indica identidad de secuencia, se refiere a una secuencia que presenta una alta identidad de secuencia (una identidad de secuencia superior al 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 98%) con la secuencia precursora y preferentemente está caracterizada por propiedades similares de la secuencia precursora, en concreto afinidad, calculándose dicha identidad usando procedimientos conocidos.

Como alternativa, una secuencia homóloga también puede ser cualquier secuencia de aminoácidos que se obtenga 30 como resultado de sustituciones permitidas en cualquier número de posiciones de la secuencia precursora de acuerdo con la fórmula a continuación:

Ser sustituido por Ser, Thr, Gly y Asn;

Arg sustituido por uno de Arg, His, Gln, Lys y Glu;

Leu sustituido por uno de Leu, Ile, Phe, Tyr, Met y Val; 35

Pro sustituido por uno de Pro, Gly, Ala y Thr;

Thr sustituido por uno de Thr, Pro, Ser, Ala, Gly, His y Gln;

Ala sustituido por uno de Ala, Gly, Thr y Pro;

Val sustituido por uno de Val, Met, Tyr, Phe, Ile y Leu;

Gly sustituido por uno de Gly, Ala, Thr, Pro y Ser; 40

Ile sustituido por uno de Ile, Met, Tyr, Phe, Val y Leu;

Phe sustituido por uno de Phe, Trp, Met, Tyr, Ile, Val y Leu;

Tyr sustituido por uno de Tyr, Trp, Met, Phe, Ile, Val y Leu;

His sustituido por uno de His, Glu, Lys, Gln, Thr y Arg;

Gln sustituido por uno de Gln, Glu, Lys, Asn, His, Thr y Arg; 45

Asn sustituido por uno de Asn, Glu, Asp, Gin y Ser;

Lys sustituido por uno de Lys, Glu, Gln, His y Arg;

Asp sustituido por uno de Asp, Glu y Asn;

Glu sustituido por uno de Glu, Asp, Lys, Asn, Gin, His y Arg;

Met sustituido por uno de Met, Phe, Ile, Val, Leu y Tyr.

Una secuencia de nucleótidos homóloga de acuerdo con la presente invención puede referirse a secuencias de nucleótidos de más de 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 800 ó 1000 nucleótidos capaces de hibridar con la 5 complementaria inversa de la secuencia de nucleótidos capaz de codificar la secuencia de la patente en condiciones de hibridación rigurosas (tales como las descritas por Sambrook y col., Molecular Cloning, Laboratory Manuel, Cold Spring, Harbor Laboratory press, Nueva York.).

Como se usa en el presente documento, una porción funcional se refiere a una secuencia de un anticuerpo de dominio único que es de un tamaño suficiente tal que la interacción de interés se mantiene con una afinidad de 1 x 10-6 o mejor. 10

Como alternativa, una porción funcional comprende una deleción parcial de la secuencia de aminoácidos completa y que todavía mantiene el sitio o sitios de unión y el dominio o dominios proteicos necesarios para la unión de y la interacción con el Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico.

Como se usa en el presente documento, una porción funcional en lo que se refiere a la secuencia polipeptídica de un polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico se refiere a menos del 100% de la secuencia (por 15 ejemplo, al 99%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, etc.), pero que comprende 5 o más aminoácidos o 15 o más nucleótidos.

Una porción en lo que se refiere al polipéptido de un polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico se refiere a menos del 100% de la secuencia (por ejemplo, al 99%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, etc.), pero que comprende 5 o más aminoácidos o 15 o más nucleótidos.

Una realización de la presente invención se refiere a un procedimiento para preparar polipéptidos modificados 20 basándose en anticuerpos de llama por determinación de los restos aminoacídicos del dominio variable de anticuerpo (VHH) que pueden modificarse sin disminuir la afinidad nativa del dominio por el antígeno y al tiempo que se reduce su inmunogenicidad con respecto a una especie heteróloga; al uso de VHH que tienen modificaciones en los restos identificados que son útiles para su administración a especies heterólogas; y a los VHH modificados de este modo. Más específicamente, la invención se refiere a la preparación de VHH modificados que están modificados para su 25 administración a seres humanos, a los propios VHH resultantes y al uso de dichos VHH “humanizados” en el tratamiento de enfermedades en seres humanos. Por humanizado se entiende mutado de modo que la inmunogenicidad tras su administración en pacientes humanos sea minoritaria o inexistente. La humanización de un polipéptido de acuerdo con la presente invención comprende una etapa de sustitución de uno o más de los aminoácidos de Camelidae por su homólogo humano como se encuentra en la secuencia de consenso humana, sin que el polipéptido pierda su carácter 30 típico, es decir, la humanización no afecta significativamente a la capacidad de unión a antígeno del polipéptido resultante. Dichos procedimientos son conocidos por los destinatarios expertos. La humanización de anticuerpos de dominio único de Camelidae requiere la introducción y mutagénesis de una cantidad limitada de aminoácidos en una cadena polipeptídica sencilla. Esto es, al contrario que la humanización de scFv, Fab’, (Fab’)2 e IgG, que requiere la introducción de cambios de aminoácidos en dos cadenas, la cadena ligera y la pesada, y la conservación del 35 ensamblaje de ambas cadenas.

Como ejemplo no limitante, se humanizó el polipéptido de la SEC ID Nº: 13, que contiene restos de tipo humano en la FR2. La humanización requirió la mutagénesis de los restos de la FR1 en posición 1 y 5, que se introdujeron mediante el cebador usado para la clonación del repertorio y que no aparecen de forma natural en la secuencia de llama. La mutagénesis de esos restos no dio como resultado una pérdida de unión y/o actividad de inhibición. La humanización 40 también requirió la mutagénesis de los restos de la FR3 en las posiciones 74, 76, 83, 84, 93. La mutagénesis de esos restos no dio como resultado una pérdida radical de la unión y/o actividad de inhibición (no se muestran los datos). La combinación de las mutaciones de la FR1 y la FR3, por lo tanto, no afectó a la unión y/o actividad de inhibición (no se muestran los datos).

La humanización también requirió la mutagénesis de los restos de la FR4 en posición 108. La mutagénesis de Q108L 45 dio como resultado un menor nivel de producción en Escherichia coli. La posición 108 está expuesta a disolvente en VHH de camélido, mientras que en anticuerpos humanos esta posición está enterrada en la superficie de contacto VH-VL (Spinelli, 1996; Nieba, 1997). En VHH aislados la posición 108 está expuesta a disolvente. La introducción de una Leu hidrófoba no polar en lugar de una Gln no cargada polar tiene un efecto radical sobre el plegamiento/estabilidad intrínsecos de la molécula. 50

Como ejemplo no limitante, se humanizó el polipéptido representado en la SEC ID 6 que contiene restos distintivos de camélido en las posiciones 37, 44, 45 y 47 con características hidrófilas. La sustitución de los restos hidrófilos por restos hidrófobos humanos en las posiciones 44 y 45 (E44G y R45L) no tenía un efecto sobre la unión y/o inhibición. Sin embargo, se observó una pérdida de unión y/o actividad de inhibición cuando se introdujeron F37V y F47W. Los datos de modelado confirmaron que el resto crítico 37 conserva la integridad de la conformación de bucle de la CDR3 y, por lo 55 tanto, la actividad (no se muestran los datos; toda la numeración de acuerdo con Kabat).

Una realización de la presente invención es un procedimiento para humanizar un VHH que comprende las etapas de sustituir cualquiera de los restos siguientes en solitario o en combinación:

posiciones 1, 5, 28 y 30 de la FR1,

el aminoácido distintivo en las posiciones 44 y 45 de la FR2,

los restos 74, 75, 76, 83, 84, 93 y 94 de la FR3, 5

y las posiciones 103, 104, 108 y 111 de la FR4;

(numeración de acuerdo con la numeración de Kabat).

Una realización de la presente invención es un polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico como se desvela en el presente documento, o un ácido nucleico capaz de codificar dicho polipéptido, para su uso en el tratamiento, prevención y/o alivio de los síntomas de trastornos relacionados con procesos inflamatorios, o que tienen 10 efectos citostáticos o citotóxicos sobre tumores.

Otra realización de la presente invención es un uso de un VHH anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico como se desvela en el presente documento, o un ácido nucleico capaz de codificar dicho polipéptido, para la preparación de un medicamento para tratar un trastorno relacionado con procesos inflamatorios y cáncer.

El Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico está implicado en procesos inflamatorios y el bloqueo de la acción del 15 Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico puede tener un efecto antiinflamatorio, que es altamente deseable en ciertas patologías tales como, por ejemplo, artritis inflamatoria o psoriasis. Además, el bloqueo del Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico puede inhibir el crecimiento de tumores humanos. Los ejemplos de los presentes inventores demuestran que los VHH de acuerdo con la invención que se unen al Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico, y además bloquean la unión de ligando al Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico, impiden la (hetero-) 20 dimerización del receptor y/o inducen apoptosis.

Los polipéptidos y procedimientos de la presente invención son aplicables a cánceres epiteliales, tales como de pulmón, hígado, sistema nervioso central, hueso, sangre y sistema linfático, colon, mama, próstata, recto, vejiga, cabeza y cuello, ovario, testículo, pancreático y carcinoma de células escamosas. Esta lista de cánceres humanos pretende ser ejemplar más que global. 25

El procedimiento de la presente invención es aplicable a enfermedades autoinmunes, tales como enfermedad de Addison (glándula suprarrenal), enfermedades autoinmunes del oído (oído), enfermedades autoinmunes del ojo (ojo), hepatitis autoinmune (hígado), parotitis autoinmune (glándula parotidea), enfermedad de Crohn (intestino), diabetes Tipo I (páncreas), epididimitis (epidídimo), glomerulonefritis (riñones), enfermedad de Graves (tiroides), síndrome de Guillain-Barré (células nerviosas), enfermedad de Hashimoto (tiroides), anemia hemolítica (eritrocitos), lupus eritematoso 30 sistémico (múltiples tejidos), infertilidad masculina (esperma), esclerosis múltiple (células nerviosas), miastenia grave (unión neuromuscular), pénfigo (principalmente piel), psoriasis (piel), fiebre reumática (corazón y articulaciones), artritis reumatoide (revestimiento articular), sarcoidosis (múltiples tejidos y órganos), esclerodermia (piel y tejido conectivo), síndrome de Sjogren (glándulas exocrinas y otros tejidos), espondiloartropatías (esqueleto axial y otros tejidos), tiroiditis (tiroides), vasculitis (vasos sanguíneos). Entre paréntesis está el tejido afectado por la enfermedad. Esta lista de 35 enfermedades autoinmunes pretende ser ejemplar más que global.

La presente invención proporciona una composición terapéutica que comprende un VHH anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico de acuerdo con la reivindicación 1, que inhibe o destruye células tumorales humanas mediante dicha unión de VHH al Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico humano de dichas células tumorales en solitario o en combinación con agentes antineoplásicos o quimioterápicos. Son bien conocidos en la técnica agentes 40 antineoplásicos o quimioterápicos tales como doxorubicina y cisplatino.

Los polipéptidos y ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención pueden administrarse a un sujeto por vías convencionales, tales como por vía intravenosa. Sin embargo, una propiedad especial de los polipéptidos anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico de la invención es que son suficientemente pequeños para penetrar en barreras tales como membranas tisulares y/o tumores y actuar localmente, y actuar localmente sobre los mismos, y son 45 suficientemente estables para resistir ambientes extremos tales como en el estómago. Por lo tanto, otro aspecto de la presente invención se refiere a la administración de polipéptidos anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico.

Un sujeto de acuerdo con la invención puede ser cualquier mamífero susceptible de tratamiento por polipéptidos terapéuticos.

La administración oral de polipéptidos anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico de la invención da como 50 resultado el suministro de dichas moléculas en forma activa en los sitios locales que están afectados por el trastorno. Los polipéptidos anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico de la invención que se unen al Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico pueden neutralizar el receptor localmente, evitando la distribución por todo el cuerpo en su totalidad y limitando por lo tanto los efectos secundarios negativos. Microorganismos modificados genéticamente tales

como Micrococcus lactis son capaces de secretar fragmentos de anticuerpos. Dichos microorganismos modificados pueden usarse como vehículos para la producción local y la administración de fragmentos de anticuerpo en el intestino. Usando una cepa que produce un fragmento de anticuerpo neutralizante del Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico, podría tratarse la inflamación y ciertos cánceres.

Otro aspecto de la invención implica administrar polipéptidos anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico 5 usando la expresión en superficie en o la secreción a partir de bacterias no invasivas, tales como organismos huésped Gram-positivos como Lactococcus sp. usando un vector como se describe en el documento WO00/23471.

Una realización de la presente invención es un polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico como se desvela en el presente documento para su uso en el tratamiento, prevención y/o alivio de los síntomas de trastornos susceptibles de modulación por un antagonista de EGFR que es capaz de atravesar el entorno gástrico sin que se 10 inactive el polipéptido.

Son ejemplos de trastornos cánceres y cualquiera que cause inflamación, incluyendo pero sin limitación, artritis reumatoide y psoriasis. Como saben los expertos en la materia, una vez en posesión de dicho anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico, puede aplicarse la tecnología de formulación para liberar una cantidad máxima de polipéptido en la localización correcta (en el estómago, en el colon, etc.). Este procedimiento de administración es 15 importante para tratar, prevenir y/o aliviar los síntomas de trastornos cuyas diana se localizan en el sistema intestinal.

Un aspecto de la invención es un procedimiento para tratar, prevenir y/o aliviar los síntomas de un trastorno susceptible a moduladores de EGFR que son capaces de atravesar el entorno gástrico sin inactivarse, administrando por vía oral a un sujeto un anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico como se desvela en el presente documento.

Otra realización de la presente invención es un uso de un polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento 20 Epidérmico como se desvela en el presente documento para la preparación de un medicamento para tratar, prevenir y/o aliviar los síntomas de trastornos susceptibles a moduladores de EGFR que sean capaces de atravesar el entorno gástrico sin inactivarse.

Un aspecto de la invención es un procedimiento para administrar un modulador de EGFR al sistema intestinal sin que dicho compuesto se inactive, por administración por vía oral a un sujeto de un polipéptido anti-Receptor del Factor de 25 Crecimiento Epidérmico como se desvela en el presente documento.

Un aspecto de la invención es un procedimiento para administrar un modulador de EGFR al torrente sanguíneo de un sujeto sin que el compuesto se inactive, por administración por vía oral a un sujeto de un polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico como se desvela en el presente documento.

Otra realización de la presente invención es un polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico como se 30 desvela en el presente documento, para su uso en el tratamiento, prevención y/o alivio de los síntomas o trastornos susceptibles a moduladores de EGFR administrados al tracto vaginal y/o rectal.

Son ejemplos de trastornos cánceres y cualquiera que cause inflamación, incluyendo, pero sin limitación, artritis reumatoide y psoriasis. En un ejemplo no limitante, una formulación de acuerdo con la invención comprende un polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico como se desvela en el presente documento, que 35 comprende uno o más anticuerpos de dominio único dirigidos contra EGFR, en forma de un gel, crema, supositorio, película, o en forma de una esponja o como un anillo vaginal que libera lentamente el principio activo con el tiempo (dichas formulaciones se describen en los documentos EP 707473, EP 684814, US 5629001).

Un aspecto de la invención es un procedimiento para tratar, prevenir y/o aliviar los síntomas de trastornos susceptibles a moduladores de EGFR administrados al tracto vaginal y/o rectal, por administración por vía vaginal y/o rectal a un sujeto 40 de un polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico como se desvela en el presente documento

Otra realización de la presente invención es un uso de un polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico como se desvela en el presente documento, para la preparación de un medicamento para tratar, prevenir y/o aliviar los síntomas de trastornos susceptibles de modulación por un fragmento de unión a EGFR administrado al tracto vaginal y/o rectal. 45

Un aspecto de la invención es un polipéptido como se define en el presente documento, para su uso en un procedimiento para administrar un modulador de EGFR al tracto vaginal y/o rectal sin que dicho modulador se inactive, por administración al tracto vaginal y/o rectal de un sujeto de un polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico como se desvela en el presente documento.

Un aspecto de la invención es un polipéptido como se define en el presente documento, para su uso en un 50 procedimiento para administrar un modulador de EGFR al torrente de un sujeto sin que dicho modulador se inactive, por administración al tracto vaginal y/o rectal de un sujeto de un polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico como se desvela en el presente documento.

Otra realización de la presente invención es un polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico como se desvela en el presente documento, para su uso en el tratamiento, prevención y/o alivio de los síntomas de trastornos susceptibles a moduladores de EGFR administrados en la nariz, tracto respiratorio superior y/o pulmón.

Son ejemplos de trastornos cánceres y cualquiera que cause inflamación, incluyendo, pero sin limitación, artritis inflamatoria y psoriasis. En un ejemplo no limitante, una formulación de acuerdo con la invención comprende un 5 polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico como se desvela en el presente documento dirigido contra EGFR en forma de una pulverización nasal (por ejemplo, un aerosol) o inhalador. Puesto que el polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico es pequeño, puede alcanzar su diana mucho más eficazmente que moléculas de IgG terapéuticas.

Un aspecto de la invención es un polipéptido como se define en el presente documento, para su uso en un 10 procedimiento para tratar, prevenir y/o aliviar los síntomas de trastornos susceptibles a moduladores de EGFR administrados al tracto respiratorio superior y pulmón por administración a un sujeto de un polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico como se desvela en el presente documento, por inhalación a través de la boca o la nariz.

Otra realización de la presente invención es un uso de un polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento 15 Epidérmico como se desvela en el presente documento, para la preparación de un medicamento para tratar, prevenir y/o aliviar los síntomas de trastornos susceptibles de modulación por un fragmento de unión a EGFR administrado en la nariz, el tracto respiratorio superior y/o pulmón, sin que dicho polipéptido se inactive.

Un aspecto de la invención es un polipéptido como se define en el presente documento para su uso en un procedimiento para administrar un modulador de EGFR en la nariz, tracto respiratorio superior y pulmón sin inactivación, 20 por administración en la nariz, tracto respiratorio superior y/o pulmón de un sujeto de un polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico como se desvela en el presente documento.

Un aspecto de la invención es un polipéptido como se define en el presente documento para su uso en un procedimiento para administrar un modulador de EGFR al torrente sanguíneo de un sujeto sin inactivación, por administración en la nariz, tracto respiratorio superior y/o pulmón de un sujeto de un polipéptido anti-Receptor del Factor 25 de Crecimiento Epidérmico como se desvela en el presente documento.

Una realización de la presente invención es un polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico como se desvela en el presente documento, para su uso en el tratamiento, prevención y/o alivio de los síntomas de trastornos susceptibles a moduladores de EGFR administrados en la mucosa intestinal, en el que dicho trastorno aumenta la permeabilidad de la mucosa intestinal. Debido a su pequeño tamaño, un polipéptido anti-Receptor del Factor de 30 Crecimiento Epidérmico como se desvela en el presente documento, puede atravesar la mucosa intestinal y alcanzar el torrente sanguíneo más eficazmente en sujetos que padecen trastornos que causan un aumento en la permeabilidad de la mucosa intestinal, por ejemplo enfermedad de Crohn.

Un aspecto de la invención es un polipéptido como se define en el presente documento, para su uso en un procedimiento para tratar, prevenir y/o aliviar los síntomas de trastornos susceptibles a moduladores de EGFR 35 administrados en la mucosa intestinal, en el que dicho trastorno aumenta la permeabilidad de la mucosa intestinal, por administración por vía oral a un sujeto de un polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico como se desvela en el presente documento.

Este procedimiento puede aumentarse aún más mediante un aspecto adicional de la presente invención —el uso de vehículos de transporte activo. En este aspecto de la invención, un VHH se fusiona a un vehículo que aumenta la 40 transferencia a través de la pared intestinal hacia el torrente sanguíneo. En un ejemplo no limitante, este “vehículo” es un segundo VHH que se fusiona con el VHH terapéutico. Dichas construcciones de fusión se generan usando procedimientos conocidos en la técnica. El VHH de “vehículo” se une específicamente a un receptor en la pared intestinal que induce una transferencia activa a través de la pared.

Otra realización de la presente invención es un uso de un polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento 45 Epidérmico como se desvela en el presente documento, para la preparación de un medicamento para tratar, prevenir y/o aliviar los síntomas de trastornos susceptibles a moduladores de EGFR administrados en la mucosa intestinal, en el que dicho trastorno aumenta la permeabilidad de la mucosa intestinal.

Un aspecto de la invención es un polipéptido como se define en el presente documento, para su uso en un procedimiento para administrar un modulador de EGFR en la mucosa intestinal sin que se inactive, por administración 50 por vía oral a un sujeto de un polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico que comprende uno o más anticuerpos de dominio único dirigidos contra EGFR.

Un aspecto de la invención es un polipéptido como se define en el presente documento, para su uso en un procedimiento para administrar un modulador de EGFR al torrente sanguíneo de un sujeto sin que se inactive, por administración por vía oral a un sujeto de un polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico que 55 comprende uno o más anticuerpos de dominio único dirigidos contra EGFR.

Este procedimiento puede aumentarse aún más mediante un aspecto adicional de la presente invención —el uso de vehículos de transporte activos. En este aspecto de la invención, un polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico como se describe en el presente documento se fusiona a un vehículo que aumenta la transferencia a través de la pared intestinal hacia el torrente sanguíneo. En un ejemplo no limitante, este “vehículo” es un VHH que se fusiona a dicho polipéptido. Dichas construcciones de fusión se generan usando procedimientos conocidos en la técnica. El 5 VHH de “vehículo” se une específicamente a un receptor en la pared intestinal que induce una transferencia activa a través de la pared.

Una realización de la presente invención es un polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico como se desvela en el presente documento, para su uso en el tratamiento, prevención y/o alivio de los síntomas de trastornos susceptibles a moduladores de EGFR, que es capaz de atravesar los tejidos bajo la lengua eficazmente. Una 10 formulación de dicho polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico como se desvela en el presente documento, por ejemplo, un comprimido, pulverización, gota, se pone bajo la lengua y se adsorbe a través de las membranas mucosas hacia la red capilar bajo la lengua.

Un aspecto de la invención es un polipéptido como se define en el presente documento, para su uso en un procedimiento para tratar, prevenir y/o aliviar los síntomas de trastornos susceptibles a la modulación por un compuesto 15 terapéutico que es capaz de atravesar los tejidos bajo la lengua eficazmente, administrando por vía sublingual a un sujeto un polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico como se desvela en el presente documento.

Otra realización de la presente invención es un uso de un polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico como se desvela en el presente documento, para la preparación de un medicamento para tratar, prevenir y/o aliviar los síntomas de trastornos susceptibles a un modulador de EGFR que sea capaz de atravesar los tejidos bajo la 20 lengua.

Un aspecto de la invención es un polipéptido como se define en el presente documento, para su uso en un procedimiento para administrar un modulador de EGFR a los tejidos bajo la lengua sin que se inactive, administrando por vía sublingual a un sujeto un polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico como se desvela en el presente documento. 25

Un aspecto de la invención es un polipéptido como se define en el presente documento, para su uso en un procedimiento para administrar un modulador de EGFR al torrente sanguíneo de un sujeto sin que se inactive, por administración por vía oral a un sujeto de un polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico como se desvela en el presente documento.

Una realización de la presente invención es un polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico como se 30 desvela en el presente documento, para su uso en el tratamiento, prevención y/o alivio de los síntomas de trastornos susceptibles a un modulador de EGFR que sea capaz de atravesar la piel eficazmente.

Son ejemplos de trastornos cánceres y cualquiera que cause inflamación, incluyendo, pero sin limitación, artritis reumatoide y psoriasis. Una formulación de dicho polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico, por ejemplo, una crema, película, pulverización, gota, parche se pone en la piel y atraviesa la misma. 35

Un aspecto de la invención es un polipéptido como se define en el presente documento, para su uso en un procedimiento para tratar, prevenir y/o aliviar los síntomas de trastornos susceptibles a un modulador de EGFR que es capaz de atravesar la piel eficazmente, administrando por vía tópica a un sujeto un polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico como se desvela en el presente documento.

Otra realización de la presente invención es un uso de polipéptidos anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico 40 como se desvelan en el presente documento, para la preparación de un medicamento para tratar, prevenir y/o aliviar los síntomas de trastornos susceptibles de modulación por un modulador de EGFR que sea capaz de atravesar la piel eficazmente.

Un aspecto de la invención es un polipéptido como se define en el presente documento, para su uso en un procedimiento para administrar un modulador de EGFR en la piel sin que se inactive, administrando por vía tópica a un 45 sujeto un polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico como se desvela en el presente documento.

Un aspecto de la invención es un polipéptido como se define en el presente documento, para su uso en un procedimiento para administrar un modulador de EGFR al torrente sanguíneo de un sujeto, administrando por vía tópica a un sujeto un polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico como se desvela en el presente documento. 50

En otra realización de la presente invención, un polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico de acuerdo con la reivindicación 1 comprende además un anticuerpo de dominio único de vehículo (por ejemplo, VHH) que actúa como vehículo de transporte activo para el transporte de dicho polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico de la luz pulmonar a la sangre.

Son ejemplos de trastornos cánceres y cualquiera que cause inflamación, incluyendo, pero si limitación, hipersecreción de moco en los pulmones, artritis reumatoide y psoriasis. El polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico que comprende además un vehículo se une específicamente a un receptor presente en la superficie de la mucosa (células epiteliales bronquiales) dando como resultado el transporte activo del polipéptido desde la luz pulmonar a la sangre. El anticuerpo de dominio único de vehículo puede fusionarse al polipéptido anti-Receptor del Factor de 5 Crecimiento Epidérmico. Dichas construcciones de fusión se generan usando procedimientos conocidos en la técnica y se describen en el presente documento. El anticuerpo de dominio único de “vehículo” se une específicamente a un receptor en la superficie de la mucosa que induce una transferencia activa a través de la superficie.

También se describe un procedimiento para determinar qué anticuerpos de dominio único (por ejemplo, VHH) se transportan de forma activa hacia el torrente sanguíneo tras su administración nasal. De forma similar, puede 10 administrarse una biblioteca de fagos de VHH inmunes o sin exposición previa por vía nasal, y después de diferentes puntos temporales tras la administración, puede aislarse sangre u órganos para rescatar los fagos que se hayan transportado activamente al torrente sanguíneo. Un ejemplo no limitante de un receptor para el transporte activo desde la luz pulmonar hasta el torrente sanguíneo es el receptor N de Fc (FcRn). Un aspecto de la invención incluye las moléculas de VHH identificadas por el procedimiento. Dicho VHH puede usarse después como VHH de vehículo para la 15 administración de un VHH terapéutico a la diana correspondiente en el torrente sanguíneo tras su administración nasal.

En un aspecto de la invención, se puede usar un polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico como se desvela en el presente documento, para explorar para agentes que modulen la unión de dicho polipéptido al Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico. Cuando se identifican en un ensayo que mide la unión o el desplazamiento de dicho polipéptido solamente, los agentes tendrán que someterse a un ensayo funcional para 20 determinar si modularían la acción del Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico in vivo. Se proporcionan a continuación ejemplos de ensayos de exploración principalmente con respecto a la SEC ID Nº: 3, aunque puede ser apropiado cualquier polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico como se desvela en el presente documento.

En un ejemplo de un experimento de desplazamiento, se incuban fagos o células que expresan Receptor del Factor de 25 Crecimiento Epidérmico en tampón de unión, por ejemplo, con un polipéptido representado por la SEC ID Nº: 3 que se ha marcado, en presencia o ausencia de concentraciones crecientes de un modulador candidato. Para validar y calibrar el ensayo, pueden realizarse reacciones de competición de control usando concentraciones crecientes de dicho polipéptido y que no está marcado. Después de la incubación, las células se lavan exhaustivamente y se mide el polipéptido marcado unido según sea apropiado para el marcador dado (por ejemplo, recuento de escintilación, 30 fluorescencia, etc.). Una disminución de al menos el 10% en la cantidad de polipéptido marcado unido en presencia de modulador candidato indica un desplazamiento de la unión por el modulador candidato. Se considera que los moduladores candidatos se unen específicamente en éste u otros ensayos descritos en el presente documento si desplazan el 50% del polipéptido marcado (dosis polipeptídica subsaturante) a una concentración de 1 M o menos.

Como alternativa, la unión o desplazamiento de la unión pueden controlarse por resonancia de plasmón superficial 35 (RPS). Los ensayos de resonancia de plasmón superficial pueden usarse como un procedimiento cuantitativo para medir la unión entre dos moléculas por el cambio en la masa próxima a un sensor inmovilizado causada por la unión o pérdida de unión de, por ejemplo, el polipéptido representado por la SEC ID Nº: 3 de la fase acuosa al Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico, o fragmento del mismo, inmovilizado en una membrana en el sensor. Este cambio en la masa se mide como unidades de resonancia frente al tiempo después de la inyección o eliminación de dicho 40 polipéptido o modulador candidato, y se mide usando un Biosensor Biacore (Biacore AB). El Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico o fragmento del mismo puede, por ejemplo, inmovilizarse sobre una microplaca sensora (por ejemplo, microplaca CM5 de calidad de investigación; Biacore AB) en una membrana lipídica de película fina de acuerdo con procedimientos descritos por Salamon y col. (Salamon y col., 1996, Biophys J. 71: 283-294; Salamon y col., 2001, Biophys. J. 80: 1557-1567; Salamon y col., 1999, Trends Biochem. Sci. 24: 213-219, incorporándose cada uno en el 45 presente documento por referencia). Sarrio y col. demostraron que puede usarse RPS para detectar la unión del ligando al receptor del adenosina GPCR A(1) inmovilizado en una capa lipídica sobre la microplaca (Sarrio y col., 2000, Mol. Cell. Biol. 20: 5164-5174, incorporado en el presente documento por referencia). Las condiciones para la unión de la SEC ID Nº: 3 al Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico, o fragmento del mismo, en un ensayo de RPS pueden ajustarse con precisión por un experto en la materia usando las condiciones descritas por Sarrio y col. Como punto de 50 partida.

La RPS puede ensayar para moduladores de la unión de al menos dos formas. En primer lugar, un polipéptido representado por la SEC ID Nº: 3, por ejemplo, puede preunirse al Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico inmovilizado, o un fragmento del mismo, seguido de la inyección del modulador candidato a una concentración que varía de 0,1 nM a 1 M. El desplazamiento del polipéptido unido puede cuantificarse, permitiendo la detección de la unión del 55 modulador. Como alternativa, el Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico unido a membrana, o fragmento del mismo, puede preincubarse con un modulador candidato y exponerse, por ejemplo, a un polipéptido representado por la SEC ID Nº: 3. Una diferencia en la afinidad de unión entre dicho polipéptido y Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico, o fragmento del mismo, preincubado con el modulador en comparación con la existente entre dicho polipéptido y Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico, o fragmento del mismo, en ausencia del modulador 60 demostrará la unión o desplazamiento de dicho polipéptido en presencia de modulador. En cualquier ensayo, una

disminución del 10% o más en la cantidad de dicho polipéptido unido en presencia de modulador candidato respecto a la cantidad de dicho polipéptido unido en ausencia de modulador candidato indica que el modulador candidato inhibe la interacción del Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico, o fragmento del mismo, y dicho polipéptido.

Otro procedimiento de detección de la inhibición de la unión de, por ejemplo, un polipéptido representado por la SEC ID Nº: 3 al Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico, o fragmento del mismo, usa la transferencia de energía por 5 resonancia de fluorescencia (FRET). La FRET es un fenómeno de mecánica cuántica que ocurre entre un donador de fluorescencia (D) y un aceptor de fluorescencia (A) en estrecha proximidad entre sí (habitualmente <100 Å de separación) si el espectro de emisión de D se solapa con el espectro de excitación de A. Las moléculas a ensayar, por ejemplo, un polipéptido representado por la SEC ID Nº: 3 y un Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico, o fragmento del mismo, se marcan con un par complementario de fluoróforos donador y aceptor. Mientras están 10 estrechamente unidos entre sí por la interacción de Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico:polipéptido, la fluorescencia emitida tras la excitación del fluoróforo donador tendrá una longitud de onda diferente de la emitida en respuesta a esa longitud de onda de excitación cuando dicho polipéptido y Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico, o fragmento del mismo, no están unidos, proporcionando la cuantificación de moléculas unidas frente a no unidas por medición de la intensidad de emisión a cada longitud de onda. Son bien conocidos en la técnica fluoróforos 15 donadores con los que marcar el Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico, o un fragmento del mismo. Son de interés particular variantes de la GFP de A. victoria conocidas como Cyan FP (CFP, Donador (D)) y Yellow FP (YFP, Aceptor (A)). Como ejemplo, la variante YFP puede prepararse como una proteína de fusión con Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico, o un fragmento del mismo. Se conocen en la técnica vectores para la expresión de variantes de GFP como fusiones (Clontech), así como reactivos marcados con fluoróforo (Molecular Probes). La adición de un 20 modulador candidato a la mezcla de polipéptido marcado fluorescentemente e YFP-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico dará como resultado la inhibición de la transferencia de energía demostrada, por ejemplo, mediante una disminución en la fluorescencia de YFP respecto a una muestra sin el modulador candidato. En un ensayo que usa FRET para la detección de la interacción de Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico:polipéptido, un 10% o más de disminución en la intensidad de la emisión fluorescente a la longitud de onda del aceptor en muestras que contienen 25 un modulador candidato, respecto a muestras sin el modulador candidato, indica que el modulador candidato inhibe la interacción de Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico:polipéptido.

Una muestra como se usa en el presente documento puede ser cualquier muestra biológica que contenga Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico, tal como muestras clínicas (por ejemplo, fracciones celulares, sangre completa, plasma, suero, tejido, células, etc.), obtenidas de muestras clínicas, agrícolas, forenses, de investigación u otras 30 muestras posibles. Las muestras clínicas pueden ser de origen humano o animal. La muestra analizada puede ser tanto sólida como líquida por naturaleza. Es evidente que cuando se usan materiales sólidos, éstos se disuelven primero en una solución adecuada.

Una variación sobre FRET usa la desactivación de la fluorescencia para controlar las interacciones moleculares. Una molécula en el par de interacción puede marcarse con un fluoróforo y la otra con una molécula que desactiva la 35 fluorescencia del fluoróforo cuando se pone en estrecha aposición con la misma. Un cambio en la fluorescencia tras la excitación es indicativo de un cambio en la asociación de las moléculas marcadas con la pareja de fluoróforo:desactivador. Generalmente, un aumento en la fluorescencia del Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico marcado o fragmento del mismo es indicativo de que el polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico que lleva el desactivador se ha desplazado. Para ensayos de desactivación, un aumento del 10% o superior 40 en la intensidad de emisión fluorescente en muestras que contienen un modulador candidato, respecto a muestras sin el modulador candidato, indica que el modulador candidato inhibe la interacción de Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico:polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico .

Además de los procedimientos de resonancia de plasmón superficial y FRET, la medición de la polarización de la fluorescencia es útil para cuantificar la unión. El valor de polarización de la fluorescencia para una molécula marcada 45 fluorescentemente depende del tiempo de correlación rotacional o velocidad de balanceo. Los complejos, tales como los formados por el Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico o fragmento del mismo, que se asocian con un polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico marcado fluorescentemente, tienen mayores valores de polarización que el polipéptido marcado que no está formando complejos. La inclusión de un inhibidor candidato de la interacción del Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico:polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento 50 Epidérmico da como resultado una disminución en la polarización de la fluorescencia respecto a una mezcla sin el inhibidor candidato, si el inhibidor candidato altera o inhibe la interacción de Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico, o un fragmento del mismo, con dicho polipéptido. La polarización de la fluorescencia está bien adaptada a la identificación de pequeñas moléculas que alteran la formación de complejos de Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico:polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico. Una disminución del 10% o más en la 55 polarización de la fluorescencia en muestras que contienen un modulador candidato, respecto a la polarización de fluorescencia en una muestra que carece del modulador candidato, indica que el modulador candidato inhibe la interacción de Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico:polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico.

Otra alternativa para controlar las interacciones de Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico:polipéptido anti-60 Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico usa un ensayo biosensor. Se han descrito en la técnica biosensores ICS

(Australian Membrane Biotechnology Research Institute; Cornell B, Braach-Maksvytis V, King L, Osman P, Raguse B, Wieczorek L y PaceR. “A biosensor that uses ion-channel switches” Nature 1997, 387, 580). En esta tecnología, la asociación de Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico, o fragmento del mismo, y un polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico se acopla al cierre de canales iónicos facilitados por gramicidina en bicapas de membrana suspendidas y, por lo tanto, a un cambio medible en la admitancia (similar a la impedancia) del biosensor. 5 Esta estrategia es lineal durante seis órdenes de magnitud de cambio de la admitancia y está idealmente adaptada a la exploración de alto rendimiento a gran escala de bibliotecas combinatorias de moléculas pequeñas. Un cambio del 10% o superior (aumento o disminución) en la admitancia en una muestra que contiene un modulador candidato respecto a la admitancia de una muestra que carece del modulador candidato, indica que el modulador candidato inhibe la interacción del Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico, o fragmento del mismo, y dicho polipéptido. Es importante señalar 10 que en ensayos que examinan la interacción de Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico, o fragmento del mismo, con un polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico, es posible que un modulador de la interacción no tenga que interaccionar necesariamente de forma directa con el dominio o dominios de las proteínas que interaccionan físicamente con dicho polipéptido. También es posible que un modulador interaccione en una localización eliminada del sitio de interacción y cause, por ejemplo, un cambio conformacional en el Receptor del Factor de 15 Crecimiento Epidérmico. No obstante, los moduladores (inhibidores o agonistas) que actúan de esta forma son de interés como agentes para modular la unión del Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico a su receptor.

Cualquiera de los ensayos de unión descritos puede usarse para determinar la presencia de un agente en una muestra, por ejemplo, una muestra tisular, que se une a Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico, o fragmento del mismo, o que afecta a la unión de, por ejemplo, un polipéptido representado por la SEC ID Nº: 3 al Receptor del Factor de 20 Crecimiento Epidérmico, o fragmento del mismo. Para hacerlo, un Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico o fragmento del mismo se hace reaccionar con dicho polipéptido en presencia o ausencia de la muestra, y la unión de polipéptido se mide según sea apropiado para el ensayo de unión que se esté usando. Una disminución del 10% o más en la unión de dicho polipéptido indica que la muestra contiene un agente que modula la unión de dicho polipéptido a Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico, o fragmento del mismo. 25

Por supuesto, los procedimientos generalizados anteriores podrían aplicarse fácilmente a la exploración para moduladores candidatos que alteren la unión entre cualquier polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico de la invención y Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico o un fragmento del mismo.

Una célula que es útil de acuerdo con la invención se selecciona preferentemente del grupo que consiste en células bacterianas tales, por ejemplo, E. coli, células de levadura tales como, por ejemplo, S. cerevisiae, P. pastoris, células de 30 insecto o células de mamífero.

Una célula que es útil de acuerdo con la invención puede ser cualquier célula en la que una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende un anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico de la invención, una secuencia homóloga del mismo, una porción funcional del mismo, una porción funcional de una secuencia homóloga del mismo o una variante mutante del mismo de acuerdo con la invención puede introducirse de modo que el polipéptido se 35 exprese a niveles naturales o por encima de los niveles naturales, como se define en el presente documento. Preferentemente, un polipéptido de la invención que se expresa en una célula presenta una farmacología normal o casi normal como se define en el presente documento. Más preferentemente, un polipéptido de la invención que se expresa en una célula comprende la secuencia de nucleótidos capaz de codificar una cualquiera de las secuencias de aminoácidos presentadas en la Tabla 5 o capaz de codificar una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de 40 al menos el 70% con la secuencia de aminoácidos presentada en la Tabla 5.

De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, una célula se selecciona del grupo que consiste en células COS7, una célula CHO, una célula LM (TK-), una célula NIH-3T3, célula HEK-293, célula K-562 o una célula de astrocitoma 1321 N1, pero también otras líneas celulares transfectables.

En general, una “cantidad terapéuticamente eficaz”, una “dosis terapéuticamente eficaz” y una “cantidad eficaz” se 45 refieren a la cantidad necesaria para conseguir el resultado o resultados deseados (modular la unión del Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico; tratar o prevenir el cáncer o la inflamación). Un experto en la materia reconocerá que la potencia y, por lo tanto, una “cantidad eficaz” puede variar para los diversos compuestos que modulan la unión del Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico usado en la invención. Un experto en la materia puede evaluar fácilmente la potencia del compuesto. 50

Como se usa en el presente documento, el término “compuesto” se refiere a un polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico de la presente invención, o un ácido nucleico capaz de codificar dicho polipéptido o un agente identificado de acuerdo con el procedimiento de exploración descrito en el presente documento, o dicho polipéptido que comprende uno o más aminoácidos derivatizados.

Por “farmacéuticamente aceptable” se entiende un material que no es biológicamente indeseable o indeseable de otro 55 modo, es decir, el material puede administrarse a un individuo junto con el compuesto sin causar ningún efecto biológico indeseable o interaccionar de una forma perjudicial con cualquiera de los otros componentes de la composición farmacéutica en la que está contenido.

Los polipéptidos de una clase de VHH de tipo humano, como se desvelan en el presente documento, son útiles para tratar o prevenir afecciones en un sujeto y comprenden administrar una cantidad farmacéuticamente eficaz de un compuesto o composición.

Los polipéptidos de la presente invención son útiles para tratar o prevenir afecciones relacionadas con cáncer, artritis reumatoide y psoriasis en un sujeto y comprende administrar una cantidad farmacéuticamente eficaz de un compuesto o 5 composición que se une al Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico .

Los polipéptidos anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico como se desvelan en el presente documento, son útiles para tratar o prevenir afecciones relacionadas con cáncer, artritis reumatoide y psoriasis en un sujeto, y comprenden administrar una cantidad farmacéuticamente eficaz de una combinación de compuesto con otro, tal como, por ejemplo, doxorubicina. 10

La presente invención no se limita a la administración de formulaciones que comprenden un solo compuesto de la invención. Dentro del ámbito de la invención se incluye proporcionar tratamientos de combinación en los que se administra una formulación a un paciente que lo necesite que comprende más de un compuesto de la invención.

Las afecciones mediadas por Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico incluyen, pero sin limitación, cáncer, artritis reumatoide y psoriasis. 15

Un compuesto útil en la presente invención puede formularse como composiciones farmacéuticas y administrarse a un huésped mamífero, tal como un paciente humano o un animal doméstico en una diversidad de formas adaptadas a la vía de administración seleccionada, es decir, por vía oral o parenteral, por vía intranasal por inhalación, por vía intravenosa, intramuscular, tópica o subcutánea.

Un compuesto de la presente invención también puede administrarse usando procedimientos de administración de 20 terapia génica. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 5.399.346 que se incorpora por referencia en su totalidad. Usando un procedimiento de administración de terapia génica, las células primarias transfectadas con el gen para el compuesto de la presente invención pueden transfectarse adicionalmente con promotores específicos de tejido a órganos, tejidos, injertos, tumores o células específicas diana y pueden transfectarse además con secuencias señal y de estabilización para una expresión localizada subcelularmente. 25

Por lo tanto, el presente compuesto puede administrarse por vía sistémica, por ejemplo, por vía oral en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable tal como un diluyente inerte o un vehículo comestible asimilable. Pueden incluirse en cápsulas de gelatina de carcasa blanda o dura, pueden comprimirse en comprimidos o pueden incorporarse directamente en los alimentos de la dieta del paciente. Para su administración terapéutica oral, el compuesto activo puede combinarse con uno o más excipientes y usarse en forma de comprimidos ingeribles, comprimidos bucales, 30 trociscos, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas y similares. Dichas composiciones y preparaciones deberían contener al menos el 0,1% del compuesto activo. El porcentaje de las composiciones y preparaciones puede, por supuesto, variarse y puede ser convenientemente de entre aproximadamente el 2 y aproximadamente el 60% del peso de una forma de dosificación unitaria dada. La cantidad de compuesto activo en dichas composiciones terapéuticamente útiles es tal que se obtendrá un nivel de dosificación eficaz. 35

Los comprimidos, trociscos, píldoras, cápsulas y similares también pueden contener lo siguiente: aglutinantes tales como goma tragacanto, goma arábiga, almidón de maíz o gelatina; excipientes tales como fosfato dicálcico; un agente disgregante tal como almidón de maíz, almidón de patata, ácido algínico y similares; un lubricante tal como estearato de magnesio; y puede añadirse un agente edulcorante tal como sacarosa, fructosa, lactosa o aspartamo o un agente saporífero tal como menta, aceite de gaulteria o aroma de cereza. Cuando la forma de dosificación unitaria es una 40 cápsula, puede contener además de materiales del tipo anterior, un vehículo líquido, tal como un aceite vegetal o un polietilenglicol. Pueden estar presentes diversos otros materiales como recubrimientos o para modificar de otro modo la forma física de la forma de dosificación unitaria sólida. Por ejemplo, los comprimidos, píldoras o cápsulas pueden revestirse con gelatina, cera, goma laca o azúcar y similares. Un jarabe o elixir puede contener el compuesto activo, sacarosa o fructosa como agente edulcorante, metil y propilparabenos como conservantes, un colorante y saporífero tal 45 como aroma de cereza o naranja. Por supuesto, cualquier material usado en la preparación de cualquier forma de dosificación unitaria debería ser farmacéuticamente aceptable y sustancialmente no tóxico en las cantidades empleadas. Además, el compuesto activo puede incorporarse en preparaciones y dispositivos de liberación sostenida.

El compuesto activo también puede administrarse por vía intravenosa o intraperitoneal por infusión o inyección. Las soluciones del compuesto activo o sus sales pueden prepararse en agua, opcionalmente mezclarse con un tensioactivo 50 no tóxico. Las dispersiones también pueden prepararse en glicerol, polietilenglicoles líquidos, triacetina y mezclas de los mismos, y en aceites. En condiciones normales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para evitar el crecimiento de microorganismos.

Las formas de dosificación farmacéuticas adecuadas para inyección o infusión pueden incluir soluciones o dispersiones acuosas estériles o polvos estériles que comprenden el principio activo que está adaptado para la preparación 55 extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables o infundibles estériles, opcionalmente encapsuladas en liposomas. En todos los casos, la forma de dosificación última debe ser estéril, fluida y estable en las condiciones de

fabricación y almacenamiento. El vehículo o excipiente líquido puede ser un disolvente o medio de dispersión líquido que comprenda, por ejemplo, agua, etanol, un poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicoles líquidos y similares), aceites vegetales, ésteres de glicerilo no tóxicos y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, por formación de liposomas, por mantenimiento del tamaño de partícula necesario en el caso de dispersiones o por uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede provocarse 5 por diversos agentes antifúngicos y antibacterianos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, tampones o cloruro sódico. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede provocarse mediante el uso en las composiciones de agentes que retrasen la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Se preparan soluciones inyectables estériles incorporando el compuesto activo en la cantidad necesaria en el disolvente 10 apropiado con diversos otros ingredientes de los enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de esterilización por filtración. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los procedimientos preferidos de preparación son las técnicas de secado al vacío y de secado por congelación, que producen un polvo del principio activo más cualquier ingrediente deseado adicional presente en las soluciones previamente esterilizadas por filtración. 15

Para la administración tópica, el presente compuesto puede aplicarse en forma pura, es decir, cuando son líquidos. Sin embargo, generalmente es deseable administrarlos en la piel como composiciones o formulaciones en combinación con un vehículo dermatológicamente aceptable, que puede ser un sólido o un líquido.

Los vehículos sólidos útiles incluyen sólidos finamente divididos tales como talco, arcilla, celulosa microcristalina, sílice, alúmina y similares. Los vehículos líquidos útiles incluyen agua, hidroxialquilos o glicoles o mezclas de agua-20 alcohol/glicol, en los que el presente compuesto puede disolverse o dispersarse a niveles eficaces, opcionalmente con ayuda de tensioactivos no tóxicos. Pueden añadirse adyuvantes tales como fragancias y agentes antimicrobianos adicionales para optimizar las propiedades para un uso dado. Las composiciones líquidas resultantes pueden aplicarse a partir de almohadillas absorbentes, usarse para impregnar vendas y otros vendajes, o pulverizarse sobre el área afectada usando pulverizadores de tipo bomba o aerosol. 25

También pueden emplearse espesantes tales como polímeros sintéticos, ácidos grasos, sales y ésteres de ácidos grados, alcoholes grasos, celulosas modificadas o materiales minerales modificados con vehículos líquidos para formar pastas untables, geles, pomadas, jarabes y similares por aplicación directamente en la piel del usuario.

Se conocen en la técnica ejemplos de composiciones dermatológicas útiles que pueden usarse para administrar el compuesto en la piel; por ejemplo, véase Jacquet y col. (Patente de Estados Unidos Nº: 4.608.392), Geria (Patente de 30 Estados Unidos Nº: 4.992.478), Smith y col. (Patente de Estados Unidos Nº: 4.559.157) y Wortzman (Patente de Estados Unidos Nº: 4.820.508).

Pueden determinarse dosificaciones útiles del compuesto comparando su actividad in vitro y su actividad in vivo en modelos animales. Se conocen en la técnica procedimientos para la extrapolación de las dosificaciones eficaces en ratones y otros animales a seres humanos; por ejemplo, véase la Patente de Estados Unidos Nº: 4.938.949. 35

Generalmente, la concentración del compuesto o compuestos en una composición líquida, tal como una loción, será de aproximadamente el 0,1-25% en peso, preferentemente de aproximadamente el 0,5-10% en peso. La concentración en una composición semisólida o sólida, tal como un gel o un polvo será de aproximadamente el 0,1-5% en peso, preferentemente de aproximadamente el 0,5-2,5% en peso.

La cantidad del compuesto, o una sal activa o derivado del mismo, necesaria para su uso en el tratamiento no sólo 40 variará con la sal particular seleccionada, sino también con la vía de administración, la naturaleza de la afección que se esté tratando y la edad y estado del paciente, y en última instancia será a discreción del médico o clínico que lo atienda. La dosificación del compuesto también varía dependiendo de la célula, tumor, tejido, injerto u órgano diana.

La dosis deseada puede presentarse convenientemente en una dosis individual o como dosis divididas administradas a intervalos apropiados, por ejemplo, dos, tres, cuatro o más subdosis al día. La propia subdosis puede dividirse 45 adicionalmente, por ejemplo, en varias administraciones discretas bastante separadas; tales como inhalaciones múltiples de un insuflador o por aplicación de una pluralidad de gotas en el ojo.

Un régimen de administración podría incluir un tratamiento diario a largo plazo. Por “a largo plazo” se entiende al menos dos semanas y, preferentemente, varias semanas, meses o años de duración. Pueden determinarse las modificaciones necesarias en este intervalo de dosificación por un experto en la materia usando sólo una experimentación de rutina 50 dados los contenidos del presente documento. Véase, Remington’s Pharmaceutical Sciences (Martin, E.W., ed. 4), Mack Publishing Co., Easton, PA. La dosificación también puede ajustarse por el médico individual en el caso de cualquier complicación.

Moduladores candidato

También se describe un agente que es un modulador de interacciones entre el Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico y su ligando.

El agente candidato puede ser un agente sintético, o una mezcla de agentes, o puede ser un producto natural (por ejemplo, un extracto vegetal o sobrenadante de cultivo). Un agente candidato incluye una molécula pequeña que puede sintetizarse, un extracto natural, péptidos, proteínas, carbohidratos, lípidos, etc. 5

Pueden explorarse agentes moduladores candidatos de grandes bibliotecas de agentes sintéticos o naturales. Actualmente se usan numerosos medios para la síntesis aleatoria y dirigida de sacáridos, péptidos y agentes basados en ácidos nucleicos. Están disponibles en el mercado bibliotecas de agentes sintéticos en varias compañías incluyendo Maybridge Chemical Co. (Trevillet, Cornwall, Reino Unido), Comgenex (Princeton, NJ), Brandon Associates (Merrimack, NH) y Microsource (New Milford, CT). Una biblioteca química poco frecuente está disponible en Aldrich (Milwaukee, WI). 10 Están disponibles y pueden prepararse bibliotecas combinatorias. Como alternativa, están disponibles bibliotecas de agentes naturales en forma de extractos bacterianos, fúngicos, vegetales y animales en, por ejemplo, Pan Laboratories (Bothell, WA) o MycoSearch (NC) o se pueden producir fácilmente por procedimientos bien conocidos en la técnica. Además, las bibliotecas y agentes producidos natural y sintéticamente se modifican fácilmente por medios químicos, físicos y bioquímicos convencionales. 15

Pueden encontrarse agentes útiles dentro de numerosas clases químicas. Los agentes útiles pueden ser agentes orgánicos o agentes orgánicos pequeños. Los agentes orgánicos pequeños tienen un peso molecular de más de 50 aunque menos de aproximadamente 2.500 daltons, preferentemente menos de aproximadamente 750, más preferentemente menos de aproximadamente 350 daltons. Las clases ejemplares incluyen heterociclos, péptidos, sacáridos, esteroides y similares. Los agentes pueden modificarse para aumentar su eficacia, estabilidad, compatibilidad 20 farmacéutica y similares. Puede usarse la identificación estructural de un agente para identificar, generar o explorar agentes adicionales. Por ejemplo, cuando se identifican agentes peptídicos pueden modificarse en una diversidad de formas para aumentar su estabilidad, tal como usando un aminoácido no natural, tal como un D-aminoácido, particularmente D-alanina, funcionalizando el extremo amino o carboxílico terminal, por ejemplo, para el grupo amino, acilación o alquilación, y para el grupo carboxilo, esterificación o amidificación o similares. 25

Para una exploración primaria, una concentración útil de un agente candidato de acuerdo con la invención es de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 100 M o más (es decir, 1 mM, 10 mM, 100 mM, 1 M, etc.). La concentración de exploración primaria se usará como un límite superior junto con nueve concentraciones adicionales, en las que las concentraciones adicionales se determinan por reducción de la concentración de exploración primaria a intervalos semilogarítmicos (por ejemplo, para 9 concentraciones más) para exploraciones secundarias o para generar 30 curvas de concentración.

Kit de exploración de alto rendimiento

Un kit de exploración de alto rendimiento, como se describe en el presente documento, comprende todos los medios y recursos necesarios para realizar la detección de un agente que modula las interacciones de Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico/ligando por interacción con Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico o un fragmento del 35 mismo en presencia de un polipéptido, preferentemente a una concentración en el intervalo de 1 M a 1 mM.

El kit comprende lo siguiente. Células recombinantes que comprenden y expresan la secuencia de nucleótidos que codifica el Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico, o fragmento del mismo, que se cultivan de acuerdo con el kit en un soporte sólido, tal como una placa de microtitulación, más preferentemente una placa de microtitulación de 96 pocillos, de acuerdo con procedimientos bien conocidos por el experto en la materia, especialmente como se describe 40 en el documento WO 00/00245. Como alternativa, el Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico, o fragmento del mismo, se suministra en una forma purificada que se inmovilizará sobre, por ejemplo, una placa de microtitulación de 96 pocillos por el experto en la materia. Como alternativa, el Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico, o fragmento del mismo, se suministra en el kit preinmovilizado sobre, por ejemplo, una placa de microtitulación de 96 pocillos. El Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico puede ser Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico completo o 45 un fragmento del mismo.

Se añaden agentes moduladores a concentraciones de aproximadamente 1 M a 1 mM o más a pocillos definidos en presencia de una concentración apropiada de un polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico de acuerdo con la reivindicación 1, una secuencia homóloga del mismo, una porción funcional del mismo o una porción funcional de una secuencia homóloga del mismo, estando dicha concentración de dicho polipéptido preferentemente en 50 el intervalo de 1 M a 1 mM. Los kits pueden contener uno o más polipéptidos anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico (por ejemplo, uno o más de un polipéptido representado por cualquiera de las SEC ID Nº: 1 a 15 u otros polipéptidos anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico, una secuencia homóloga del mismo, una porción funcional del mismo o una porción funcional de una secuencia homóloga del mismo).

Se realizan ensayos de unión de acuerdo con los procedimientos ya desvelados en el presente documento, y los 55 resultados se comparan con el nivel basal de, por ejemplo, Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico, o fragmento del mismo, que se une a un polipéptido anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico, una secuencia homóloga del mismo, una porción funcional del mismo o una porción funcional de una secuencia homóloga del mismo, pero en

ausencia de un agente modulador añadido. Los pocillos que muestran un aumento o disminución de al menos 2 veces, preferentemente 5 veces, más preferentemente 10 veces y, más preferentemente, 100 veces o más en la unión de Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico-polipéptido (por ejemplo) en comparación con el nivel de actividad en ausencia de modulador, se seleccionan para un análisis adicional.

Otros kits útiles 5

También se describen kits útiles para explorar para moduladores de la unión de Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico/ligando, así como kits útiles para el diagnóstico de trastornos caracterizados por una disfunción de la señalización del Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico. También se describen kits útiles para explorar para moduladores de trastornos, así como kits para su diagnóstico, caracterizándose dichos trastornos por uno o más procesos que implican al Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico. Los kits útiles pueden incluir un Receptor del 10 Factor de Crecimiento Epidérmico aislado o fragmento del mismo. Como alternativa, o además, un kit puede comprender células transformadas para expresar Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico o un fragmento del mismo. Un kit puede comprender un polinucleótido que codifica un Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico o fragmento del mismo. Un kit puede comprender los cebadores específicos útiles para la amplificación del Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico o un fragmento del mismo. Los kits útiles pueden comprender un polipéptido de 15 Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico aislado, un homólogo del mismo o una porción funcional del mismo. Un kit puede comprender células transformadas para expresar dicho polipéptido. Los kits pueden contener más de un polipéptido. Un kit puede comprender un polinucleótido que codifica un Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico o un fragmento del mismo. Un kit puede comprender los cebadores específicos útiles para la amplificación de una macromolécula tal como, por ejemplo, Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico o un fragmento del mismo. Todos 20 los kits comprenderán los artículos indicados o combinaciones de artículos y materiales de envasado por lo tanto. Los kits también incluirán instrucciones para su uso.

Ejemplos

La invención se ilustra mediante el siguiente ejemplo no limitante. 25

Ejemplo 1: Inmunización

Después de la autorización del Comité Ético de la Facultad de Medicina Veterinaria (Universidad de Gante, Bélgica) se inmunizó a 4 llamas (024, 025, 026 y 027) con el antígeno tumoral receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) de acuerdo con todas las normativas de bienestar animal actuales. Para generar una respuesta inmune dependiente de anticuerpos (tabla 1), a dos animales se les inyectaron células de carcinoma escamoso vulvar humano intactas (A431, 30 ATCC CRL 1555), que expresaban EGFR en su superficie celular, mientras que se administraron extractos de membrana derivados de A431 a las otras dos llamas (026 y 027). Cada animal recibió siete dosis de antígenos administrados por vía subcutánea a intervalos semanales (tabla 1). Cuando se inmunizaban con células intactas, cada dosis consistía en 108 células A431 recién recogidas. La dosis para la inmunización con extractos de membrana consistía en vesículas preparadas a partir de 108 células A431. Las vesículas se prepararon de acuerdo con Cohen y 35 colaboradores (Cohen S, Ushiro H, Stoscheck C, Chinkers M, 1982. A native 170,000 epidermal growth factor receptor kinase complex from shed plasma membrane vesicles. J. Biol. Chem. 257: 1523-31). Las vesículas se almacenaron a -80ºC antes de la administración. Se administraron dos inyecciones extra de ocho microgramos de EGFR purificado (Sigma) en una emulsión con el adyuvante Stimune (CEDI Diagnostics B.V., Lelystad, Países Bajos) por vía intramuscular a la llama 025 (tabla 1). 40

Ejemplo 2: Evaluación de la respuesta inmune

El día 0, 28 y 42, se recogieron 10 ml de sangre (pre-)inmune y el suero se usó para evaluar la inducción de las respuestas inmunes en los 4 animales. Se realizó un primer ELISA para verificar si los animales generaban anticuerpos que reconocieran epítopos de A431. Después de revestir una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos tratada con gelatina (0,5% en PBS durante 10 minutos), se retiró el exceso de gelatina y se cultivaron las células A431 durante una 45 noche en los micropocillos hasta su confluencia. Las células se fijaron con paraformaldehído al 4% en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, el fijador se bloqueó con glicina 100 mM en PBS durante 10 minutos, seguido de bloqueo de los pocillos con una solución de PBS-leche desnatada al 4%, de nuevo durante 10 minutos. Se aplicaron diluciones de suero de animales inmunizados y se detectaron los anticuerpos específicos de A431 con un antisuero policlonal anti-llama desarrollado en conejo, seguido de un conjugado secundario de cabra anti-conejo con 50 peroxidasa de rábano picante (HRP) (Dako, Dinamarca). Para los cuatro animales, la inmunización con células intactas o vesículas de membrana dio como resultado la inducción de un título significativo de anticuerpos específicos de A431 (figura 1). Para verificar si los anticuerpos de llama inducidos eran específicos de EGFR, se evaluaron los títulos de anticuerpos en suero sobre fibroblastos de ratón que expresaban EGFR humano (Her-14) y se compararon con la línea celular de fibroblastos de ratón parental NIH3T3 clon 2.2 (3T3), realizado de forma similar a como se ha descrito 55 anteriormente (figura 2). De nuevo, el título en suero de anticuerpos que se unen a Her-14 era superior en comparación con el título para las células 3T3 parentales, indicando que los anticuerpos en suero circulantes eran específicos de EGFR.

Por último, la respuesta en suero en animales inmunizados se verificó sobre EGFR purificado revestida en fase sólida. El EGFR purificado (Sigma) y el antígeno carcinoembrionario irrelevante (CEA, Scripps), ambos a 1 g/ml, se inmovilizaron durante una noche a 4ºC en una placa Maxisorp de 96 pocillos (Nunc). Los pocillos se bloquearon con una solución de caseína (1% en PBS). Después de la adición de diluciones de suero, se detectaron las inmunoglobulinas unidas específicamente usando un antisuero de conejo anti-llama seguido de un conjugado de cabra anti-conejo con 5 fosfatasa alcalina (Sigma), mostrando que para todos los animales se inducía una respuesta inmune dependiente de anticuerpos significativa contra EGFR (figura 3).

Ejemplo 3: Clonación del repertorio de fragmentos de anticuerpo de cadena pesada (VHH)

Puesto que se sabe poco sobre la ontogenia de la inmunoglobulina de camélidos, se recogieron tejidos que contenían células B de distinto origen y de diferentes puntos temporales para cada animal (tabla 1). Después de la recogida de 10 tejidos, se aisló el ARN total de acuerdo con el procedimiento descrito por (Chomczynski P y Sacchi N. 1987. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem 162: 156-159). El procedimiento para clonar el repertorio de VHH se basa en un procedimiento descrito en la Solicitud de Patente WO 03/054016. Se preparó el ADNc sobre el ARN total con Transcriptasa Inversa de MMLV (Invitrogen) usando oligonucleótidos oligo d(T) (de Haard HJ, van Neer N, Reurs A, Hufton SE, Roovers RC, Henderikx P, de Bruine AP, 15 Arends JW, Hoogenboom HR. 1999. A large non-immunized human Fab fragment phage library that permits rapid isolation and kinetic analysis of high affinity antibodies. J. Biol. Chem. 274: 18218-30). Las cantidades de ARN de los distintos tejidos usados para la síntesis de ADNc se enumeran en la tabla 2. El ADNc se purificó con una extracción con fenol/cloroformo, seguida de una precipitación con etanol, y posteriormente se usó como molde para amplificar el repertorio de VHH. En una primera PCR, el repertorio de segmentos génicos de anticuerpos tanto convencionales (1,6 20 kb) como de cadena pesada (1,3 kb) se amplificó usando un cebador específico líder (ABL002) y ALB010, un cebador oligo d(T) (para una lista de cebadores véase la tabla 6). Los fragmentos de ADN resultantes se separaron por electroforesis en gel de agarosa. El fragmento de 1,3 kb amplificado que codifica segmentos de anticuerpo de cadena pesada se purificó a partir de gel de agarosa y se usó como molde en una PCR anidada usando una mezcla de cebadores de la FR1 (ABL037-ABL043) y ABL010. Los productos de PCR se digirieron con Sfil (introducido en el 25 cebador de la FR1) y BstEII (de origen natural en la FR4). Después de la electroforesis en gel, el fragmento de ADN de aproximadamente 400 pares de bases se purificó a partir del gel y se ligaron 330 ng del repertorio de VHH amplificado en los sitios de restricción correspondientes de un microgramo de fagémido pAX004 para obtener una biblioteca después de la electroporación de Escherichia coli TG1. El pAX004 permite la producción de partículas de fago, que expresan las VHH individuales como una proteína de fusión con el producto geneIII. El tamaño de las bibliotecas 30 obtenidas a partir de los distintos tejidos recogidos de las llamas inmunizadas se describe en la tabla 2. Como control de calidad, se realizó una PCR de colonias usando el cebador inverso M13 y un cebador geneIII sobre 24 colonias escogidas aleatoriamente de cada biblioteca y se calculó el porcentaje de clones que contenían un inserto del tamaño correcto (tabla 2).

Ejemplo 4: Evaluación del repertorio clonado 35

En un ELISA de fago policlonal, se evaluó la especificidad del repertorio de fagos clonado sobre EGFR y sobre un antígeno irrelevante (TNF). Para generar viriones recombinantes que expresan el repertorio de VHH como proteínas de fusión con el producto geneIII, la biblioteca se cultivó a 37ºC en 10 ml de medio 2xTY que contenía glucosa al 2% y 100 g/ml de ampicilina, hasta que la DO600nm alcanzó 0,5. Se añadieron fagos M13KO7 (1012) y la mezcla se incubó a 37ºC durante 2 x 30 minutos, primero sin agitación, después con agitación a 100 rpm. Las células se centrifugaron 40 durante 5 minutos a 4.500 rpm a temperatura ambiente. El sedimento bacteriano se resuspendió en 50 ml de medio 2xTY que contenía 100 g/ml de ampicilina y 25 g/ml de kanamicina y se incubó durante una noche a 37ºC con agitación enérgica a 250 rpm. Los cultivos de una noche se centrifugaron durante 15 minutos a 4500 rpm a 4ºC y se usó sobrenadante para concentrar los fagos. Los fagos se precipitaron con PEG (polietilenglicol al 20% y NaCl 1,5 M) durante 30 minutos en hielo y se centrifugaron durante 20 minutos a 4.500 rpm. El sedimento se resuspendió en 1 ml de 45 PBS. Los fagos se precipitaron de nuevo con PEG durante 10 minutos en hielo y se centrifugaron durante 10 minutos a 14.000 rpm y 4ºC. El sedimento se disolvió en 1 ml de PBS. Se inmovilizó un g/ml de EGFR o TNF en una placa Maxisorp de 96 pocillos (Nunc) y se incubó durante una noche a 4ºC. Las placas se lavaron 5 veces con PBS/Tween-20 al 0,05% y los pocillos se bloquearon con una solución de caseína (1% en PBS) y se añadieron diluciones de fago durante 2 h a temperatura ambiente. Se detectaron los fagos unidos usando el anticuerpo monoclonal anti-M13 gpVIII 50 conjugado con HRP (Amersham Biosciences) y ABTS/H2O2 como sustrato. Las placas se leyeron a 405 nm después de 15 minutos de incubación a temperatura ambiente. Un ejemplo de una respuesta de fago de una combinación de fagos rescatados de bibliotecas de PBL1 de los animales 024 y 025 se representa en la figura 4.

Ejemplo 5: Estrategias de selección múltiples para identificar nanocuerpos específicos de EGFR

Se rescataron bibliotecas por cultivo de las bacterias hasta fase logarítmica (DO600 = 0,5), seguido de infección con fago 55 auxiliar para obtener fagos recombinantes que expresan el repertorio de VHH clonados en la punta del fago como proteína de fusión con gpIII (como se describe en el ejemplo 4). Cuando se seleccionaba para anticuerpos específicos de EGFR, se han seguido dos estrategias de selección diferentes.

Selección por elución específica de epítopo

Una primera estrategia de selección se basaba en el hecho de que el EGFR puede purificarse por cromatografía de afinidad través de la elución de ligando. Se llevaron a cabo cuatro condiciones de elución diferentes aplicando un exceso de moléculas que competían por el sitio de unión a ligando o epítopos solapantes (tabla 3). Cuando la selección se realizó sobre células A431 o Her-14, se mezclaron fagos recombinantes no seleccionados durante 20 minutos a 4ºC con 6 x 108 células sanguíneas (principalmente monocitos, células T y B) o 2 x 107 3T3, respectivamente, para reducir 5 los fagos recombinantes que reconocen epítopos comunes inespecíficos de EGFR. Los fagos no unidos se incubaron después con células de selección EGFR+ durante 2 horas, seguido de 6 lavados con PBS enfriado en hielo. Los fagos se eluyeron posteriormente con un exceso de ligando EGF, monoclonal de ratón 2e9 (Defize LH, Moolenaar WH, van der Saag PT, de Laat SW 1986. Dissociation of cellular responses to epidermal growth factor using anti-receptor monoclonal antibodies. EMBO J. 5: 1187-92) o anticuerpos antagonistas de EGFR 225 y 528 (Sato JD, Kawamoto T, Le 10 AD, Mendelsohn J, Polikoff J, Sato GH 1983. Biological effects in vitro of monoclonal antibodies to human epidermal growth factor receptors. Mol. Biol. Med. 1: 511-529). Todas las etapas de selección se realizaron a 4ºC para evitar la internalización de fagos mediada por receptor. Se infectaron E. coli TG1 cultivadas logarítmicamente con los fagos eluidos y se cultivaron durante una noche a 37ºC sobre medio selectivo 2xTY Ap100 y glucosa al 2%. Las células se rasparon y se usaron en una siguiente ronda de selección cuando fue necesario. Se realizaron dos o tres rondas de 15 selección para enriquecer para fagos recombinantes específicos de EGFR (tabla 3). Cuando se usó para la selección antígeno purificado (tabla 3), el EGFR se inmovilizó a 1 g/ml sobre placas de microtitulación Maxisorp.

Selección para internalización de fragmentos de VHH

Una segunda estrategia de selección se basaba en la observación de que después de la unión del ligando al receptor, la señalización celular mediada por EGFR puede regularse negativamente por el mecanismo de internalización de 20 receptores. Para identificar los fagos recombinantes que son capaces de internalizarse a través de moléculas de superficie celular, se siguió el protocolo descrito por Poul y colaboradores (Poul MA, Becerril B, Nielsen UB, Morisson P, Marks JD. 2000. Selection of tumor-specific internalizing human antibodies from phage libraries. J. Mol. Biol. 301: 1149-61). Se añadieron fagos recombinantes no seleccionados a aproximadamente 2 x 107 fibroblastos de ratón 3T3 durante 30 minutos a 4ºC en medio de unión enfriado en hielo (DMEM tamponado con bicarbonato; Suero Fetal de Ternera al 25 10%, Hepes 25 mM), complementado con leche desnatada al 2% para reducir los VHH inespecíficos. Los fagos no unidos se incubaron posteriormente con células de selección EGFR+ preenfriadas (Her-14 o A431) en medio de unión durante 1,5 horas a 4ºC, seguido de seis lavados con PBS enfriado en hielo para eliminar los fagos no unidos. Las células se cubrieron con medio de unión precalentado y se transfirieron inmediatamente a 37ºC durante 20 minutos para permitir la internalización. Posteriormente, las células se enfriaron a 4ºC y se separaron con incubaciones en ácido 30 suave (NaCl 500 mM; glicina 100 mM pH 2,5) durante 10 minutos para eliminar los fagos recombinantes unidos a superficie. Las células se liberaron de la matriz extracelular por tripsinización. Después, las células resuspendidas se lisaron durante 4 minutos con TEA 100 mM a 4ºC para liberar los fagos internalizados. Se infectaron E. coli TG1 cultivadas logarítmicamente con los fagos eluidos y se cultivaron durante una noche a 37ºC en medio selectivo (2xTY Ap100 con glucosa al 2%). Las bibliotecas usadas para una sola ronda de selección sobre A431 y en paralelo sobre 35 Her-14 se resumen en la tabla 4.

Ejemplo 6: Caracterización de nanocuerpos específicos de EGFR

Para verificar la especificidad de EGFR de clones individuales después del procedimiento de selección por elución específica de epítopo, se realizó una ELISA de fagos sobre clones individuales. 47 clones escogidos aleatoriamente para cada procedimiento de selección (1, 2, 3, 4, Ia y IIIa; tabla 3) se cultivaron hasta fase logarítmica (DO600 = 0,5), 40 seguido de infección con fago auxiliar para obtener fagos recombinantes como se describe en el ejemplo 4. Se realizó un ELISA de fagos tanto sobre EGFR revestido en fase sólida (en comparación con pocillo no revestido) como sobre células Her-14 revestidas con gelatina (en comparación con 3T3). La presencia de VHH específico de EGFR se verificó usando aproximadamente 109 partículas de fago recombinante de cada clon antes de la detección con un anticuerpo monoclonal anti-M13 gpVIII conjugado con HRP. Con los clones de puntuación positiva en el ELISA de fagos sobre 45 células y/o sobre EGFR inmovilizado en fase sólida (tabla 3) se realizó un análisis de huella genética de Hinfl (no se muestran los datos). La secuencia de nucleótidos se determinó para un clon representativo de cada huella genética distinta, dando como resultado 5, 8, 3, 4, 7 y 4 secuencias diferentes para las condiciones 1, Ia, 2, IIIa, 3 y 4, respectivamente. El alineamiento de las secuencias de aminoácidos de estos 31 agentes de unión (figura 5) indicó que 20 de ellos eran únicos (enumerados en la tabla 5). La especificidad de EGFR de los 20 clones únicos en ELISA de 50 fagos (tanto sobre células como sobre EGFR revestido en fase sólida) se muestra en la figura 6.

Para la selección de acuerdo con el protocolo de internalización, se realizó un ELISA de fagos sobre células con un total de 84 clones individuales de forma similar a la de los clones identificados por el procedimiento de selección de elución específica de epítopo. Después del análisis de huella genética de HinfI, de la determinación de la secuencia de nucleótidos y del alineamiento de la secuencia de aminoácidos con el panel de 20 agentes de unión únicos descrito 55 anteriormente (no se muestran los datos), se identificaron 2 nuevos clones anti-EGFR, EGFR-B11 y el con EGFR-F11 (tabla 5). La especificidad de EGFR de ambos clones en ELISA de fagos sobre células se muestra en la figura 6, panel A.

Ejemplo 7: Internalización de nanocuerpos mediada por receptor de EGF

Se cultivaron células Her-14 y 3T3 durante una noche sobre cubreobjetos de vidrio, se lavaron con medio de unión (véase el ejemplo 5) y se enfriaron a 4ºC durante 20 minutos. Se prepararon fagos de nanocuerpo EGFRIIIa42 como se describe en el ejemplo 4 y se añadieron aproximadamente 1012 viriones recombinantes, diluidos en medio de unión complementado con leche desnatada al 2%, a las células enfriadas en hielo durante 1 hora a 4ºC. Las células se lavaron una vez con PBS enfriado con hielo para eliminar los fagos no unidos. Posteriormente, las células se cambiaron 5 a 37ºC durante 20 minutos para permitir la internalización de fagos y se enfriaron de nuevo a 4ºC. Las células se lavaron dos veces con PBS. Después, los fagos unidos a superficie celular se eliminaron mediante dos lavados con ácido con tampón de separación (NaCl 150 mM, HAc 125 mM) durante siete minutos a temperatura ambiente. Después de dos lavados con PBS, las células se fijaron con paraformaldehído al 4% en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente y se lavaron de nuevo dos veces con PBS. Las células fijadas se permeabilizaron entonces en Triton X-100 al 0,2% en 10 PBS durante 5 minutos a temperatura ambiente, seguido de dos lavados con PBS y el fijador restante se bloqueó con glicina 100 mM en PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron con PBS-gelatina al 0,5% (p/v) y el fago internalizado se visualizó por tinción con anti-M13 gpVIII-FITC (Amersham Biosciences) seguido de un anticuerpo monoclonal anti-ratón marcado con FITC y posterior visualización por microscopía de fluorescencia. La figura 7 muestra que el EGFRIIIa42 es capaz de internalizarse en Her-14 (panel A) pero no células 3T3 (panel B). 15

Tabla 1

Día

Llama 024 Llama 025 Llama 026 Llama 027

0

células intactas células intactas vesículas vesículas

7

células intactas células intactas vesículas vesículas

14

células intactas células intactas vesículas vesículas

21

células intactas células intactas vesículas vesículas

28

células intactas células intactas vesículas vesículas

35

células intactas células intactas vesículas vesículas

(continuación)

Día

Llama 024 Llama 025 Llama 026 Llama 027

42

células intactas células intactas vesículas vesículas

46

Muestra de sangre de 150 ml (PBL1) Muestra de sangre de 150 ml (PBL1) Muestra de sangre de 150 ml (PBL1) ganglio linfático Muestra de sangre de 150 ml (PBL1) ganglio linfático

47

Ganglio linfático, bazo, médula ósea

49

EGFR purificado Muestra de sangre de 150 ml (PBL2) Muestra de sangre de 150 ml (PBL2)

55

EGFR purificado

59

Muestra de sangre de 150 ml (PBL2)

60

Ganglio linfático, bazo, médula ósea

Tabla 2

Animal

Tejido ARN (g) Tamaño (x 108) % Inserto

Llama 024

PBL1 200 0,25 83

Llama 024

Ganglio linfático de íleon 40 2,3 78

Animal

Tejido ARN (g) Tamaño (x 108) % Inserto

Llama 024

Ganglio linfático intestinal 150 0,17 100

Llama 024

Médula ósea 97 1,5 83

Llama 024

Bazo 160 0,16 95

Llama 025

PBL1 200 0,06 95

Llama 025

Ganglio linfático (íleon + colon) 200 0,8 96

Llama 025

Médula ósea 200 0,045 88

Llama 025

Bazo 200 2 86

Llama 025

PBL2 200 0,13 83

Llama 026

PBL1 + ganglio linfático 100 + 200 2,46 85

Llama 027

PBL1 + ganglio linfático 100 + 200 1,08 92

Tabla 3

Condición de elución

Molécula de elución Selección: formato de antígeno ELISA Her-14 ELISA EGER Familias de agente de unión

Ronda I Ronda II Ronda III

1

EGF A431 Her-14 - 1/47 24/47 6

Ia

EGFR 5/47 23/47 8

2

2e9 A431 Her-14 - 2/47 32/47 5

IIIa

EGFR 11/47 32/47 4

3

225 A431 A431 Her-14 8/47 28/47 5

EGFR 20/47 31/47

4

528 A431 A431 Her-14 16/47 10/47 5

EGFR 22/47 29/47

Tabla 4

Biblioteca

Células de Selección Fragmento de anticuerpo seleccionado

Combinación de ganglio linfático, médula ósea, bazo y PBL1 (024+025)

Her-14 A2

Combinación de médula ósea (024+025)

A431 A4, A9, B11

Combinación de PBL1 (024+025)

A431 F11

5

Claims (49)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un polipéptido anti-EGFR que comprende al menos un anticuerpo de dominio único dirigido contra EGFR, en el que dicho anticuerpo de dominio único procede de un anticuerpo de cadena pesada naturalmente desprovisto de cadena ligera (VHH), y en el que dicho al menos un anticuerpo de dominio único es capaz de internalizar EGFR en células 5 EGFR+.
2. 2. Un polipéptido anti-EGFR de acuerdo con la reivindicación 1, que puede obtenerse por incubación de fagos recombinantes que expresan un repertorio de VHH clonados con células EGFR+, en condiciones para permitir la internalización de los fagos y la posterior liberación de los fagos internalizados.
3. 3. Un polipéptido anti-EGFR de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que la célula EGFR+ se 10 selecciona de células HER-14 y A431.
4. 4. Un polipéptido anti-EGFR de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el al menos un anticuerpo de dominio único corresponde a una secuencia representada por cualquiera de las SEC ID Nº: 21, 22 o

   a) una secuencia homóloga de cualquiera de las SEC ID Nº: 21, 22 con una identidad de secuencia de más del 70% con la secuencia precursora; 15

   b) una porción funcional de cualquiera de las SEC ID Nº: 21, 22 que mantiene la interacción con la diana con una afinidad de 1 x 10-6 M o mejor,

   c) una porción funcional de cualquiera de las SEC ID Nº: 21, 22 que comprende una deleción parcial de la secuencia de aminoácidos completa y todavía mantiene el sitio o sitios de unión y el dominio o dominios proteicos necesarios para la unión de y la interacción con EGFR. 20
5. 5. Un polipéptido anti-EGFR de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el al menos un anticuerpo de dominio único corresponde a una secuencia representada por cualquiera de las SEC ID Nº: 21, 22, o a una secuencia homóloga de cualquiera de las SEC ID Nº: 21, 22 con una identidad de secuencia de más del 80% con la secuencia precursora.
6. 6. Un polipéptido anti-EGFR de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el al menos un 25 anticuerpo de dominio único corresponde a una secuencia representada por cualquiera de las SEC ID Nº: 21, 22, o a una secuencia homóloga de cualquiera de las SEC ID Nº: 21, 22 con una identidad de secuencia de más del 90% con la secuencia precursora.
7. 7. Un polipéptido anti-EGFR de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el al menos un anticuerpo de dominio único compite por o inhibe la unión del ligando natural a EGFR. 30
8. 8. Un polipéptido anti-EGFR de acuerdo con la reivindicación 7, en el que dicho ligando natural es EGF.
9. 9. Un polipéptido anti-EGFR de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el al menos un anticuerpo de dominio único es capaz de unirse a su diana con una afinidad superior a 10-6 M.
10. 10. Un polipéptido anti-EGFR de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende además al menos un anticuerpo de dominio único dirigido contra una o más proteínas séricas. 35
11. 11. Un polipéptido anti-EGFR de acuerdo con la reivindicación 10, en el que dicho al menos un anticuerpo de dominio único dirigido contra una o más proteínas séricas se dirige contra cualquiera de albúmina sérica, inmunoglobulinas séricas, proteína de unión a tiroxina, transferrina o fibrinógeno, o un fragmento de las mismas.
12. 12. Un polipéptido anti-EGFR de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el al menos un anticuerpo de dominio único es un dominio de VHH. 40
13. 13. Un polipéptido anti-EGFR de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el al menos un anticuerpo de dominio único es un dominio de VHH que lleva un aminoácido del grupo que consiste en glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, tirosina, triptófano, metionina, serina, treonina, asparagina o glutamina en la posición 45 de acuerdo con la numeración de Kabat.
14. 14.Un polipéptido anti-EGFR de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el al menos un anticuerpo de dominio único 45 es un dominio de VHH que lleva un resto de arginina en la posición 103 de acuerdo con la numeración de Kabat.
15. 15. Un polipéptido anti-EGFR de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en el que dicho dominio de VHH se obtiene por inmunización de un camélido y la obtención de un hibridoma a partir del mismo, o por clonación de una biblioteca de anticuerpos de dominio único y la posterior selección mediante el uso de presentación en fago.
16. 16. Un polipéptido anti-EGFR de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que el al menos un 50 anticuerpo de dominio único es un VHH humanizado.
17. 17. Un polipéptido anti-EGFR de acuerdo con la reivindicación 16, en el que el al menos un anticuerpo de dominio único es humanizado por sustitución de uno o más de los aminoácidos de Camelidae por su homólogo humano como se encuentra en la secuencia de consenso humana.
18. 18. Un polipéptido anti-EGFR de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 ó 17, en el que el al menos un anticuerpo de dominio único es humanizado por sustitución de cualquiera de los restos siguientes en solitario o en 5 combinación: posiciones de la FR1 1, 5, 28 y 30, el aminoácido distintivo en la posición 44 y 45 de la FR2, restos de la FR3 74, 75, 76, 83, 84, 93 y 94, y posiciones 103, 104, 108 y 111 en la FR4; numeración de acuerdo con la numeración de Kabat.
19. 19. Un polipéptido anti-EGFR de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, que comprende además un anticuerpo de dominio único seleccionado del grupo que consiste en anticuerpo de dominio único anti-IFN-gamma, 10 anticuerpo de dominio único anti-TNF-alfa, anticuerpo de dominio único anti-receptor de TNF-alfa y anticuerpo de dominio único anti-receptor de IFN-gamma.
20. 20. Un polipéptido anti-EGFR de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en el que el número de anticuerpos de dominio único dirigidos contra EGFR es de al menos dos.
21. 21. Un polipéptido anti-EGFR de acuerdo con la reivindicación 20, en el que los dos o más anticuerpos de dominio único 15 son diferentes en secuencia.
22. 22. Un polipéptido anti-EGFR de acuerdo con la reivindicación 20, en el que los dos o más anticuerpos de dominio único son idénticos en secuencia.
23. 23. Un polipéptido anti-EGFR de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22, en el que los dos o más anticuerpos de dominio único están fusionados genéticamente a nivel de ADN. 20
24. 24. Un polipéptido anti-EGFR de acuerdo con la reivindicación 23, en el que los anticuerpos de dominio único están unidos entre sí directamente.
25. 25. Un polipéptido anti-EGFR de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 24, que es una molécula bivalente, trivalente o tetravalente.
26. 26. Un polipéptido anti-EGFR de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, que comprende además un 25 vehículo que mejora la transferencia a través de la pared intestinal hacia el torrente sanguíneo.
27. 27. Un polipéptido anti-EGFR de acuerdo con la reivindicación 26, en el que dicho vehículo es un VHH que se une específicamente a un receptor en la pared intestinal.
28. 28. Un polipéptido anti-EGFR de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, que comprende además un vehículo que aumenta el transporte del polipéptido desde la luz pulmonar hasta la sangre. 30
29. 29. Un polipéptido anti-EGFR de acuerdo con la reivindicación 28, en el que dicho vehículo es un VHH que se une específicamente a un receptor sobre la superficie de la mucosa.
30. 30. Un polipéptido anti-EGFR de acuerdo con la reivindicación 29, en el que dicho receptor es el receptor N de Fc (FcRn).
31. 31. Un ácido nucleico que codifica un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30. 35
32. 32. Una célula huésped que comprende el ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 31.
33. 33. Una composición que comprende un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones hasta la 30, o un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 31, y un vehículo farmacéutico adecuado.
34. 34. Una composición de acuerdo con la reivindicación 33, adaptada a la vía de administración seleccionada, es decir, por vía oral, vaginal, rectal, parenteral, intranasal, por inhalación, por vía sublingual, intravenosa, intramuscular, tópica o 40 subcutánea.
35. 35. Una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 33 ó 34, adecuada para inyección o infusión.
36. 36. Una composición terapéutica que comprende un polipéptido anti-EGFR de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30 en combinación con un agente antineoplásico o quimioterápico.
37. 37. Una composición terapéutica de acuerdo con la reivindicación 36, para la administración separada de los 45 componentes.
38. 38. Un polipéptido anti-EAFR de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30, un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 31, o una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 33 a 37, para su uso en el tratamiento y/o prevención de trastornos relacionados con procesos inflamatorios.
39. 39. Un polipéptido anti-EGFR de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30, un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 31, o una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 33 a 37, para su uso en el 5 tratamiento y/o prevención de cánceres epiteliales, tales como de pulmón, hígado, sistema nervioso central, hueso, sangre y sistema linfático, colon, mama, próstata, recto, vejiga, cabeza y cuello, ovario, testículo, pancreático y carcinoma de células escamosas.
40. 40.Un polipéptido anti-EGFR de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30, un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 31, o una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 33 a 37, para su uso en el 10 tratamiento y/o la prevención de enfermedades autoinmunes, tales como enfermedad de Addison (glándula suprarrenal), enfermedades autoinmunes del oído (oído), enfermedades autoinmunes del ojo (ojo), hepatitis autoinmune (hígado), parotitis autoinmune (glándula parotidea), enfermedad de Crohn (intestino), diabetes Tipo I (páncreas), epididimitis (epidídimo), glomerulonefritis (riñones), enfermedad de Graves (tiroides), síndrome de Guillain-Barré (células nerviosas), enfermedad de Hashimoto (tiroides), anemia hemolítica (eritrocitos), lupus eritematoso sistémico (múltiples tejidos), 15 infertilidad masculina (esperma), esclerosis múltiple (células nerviosas), miastenia grave (unión neuromuscular), pénfigo (principalmente piel), psoriasis (piel), fiebre reumática (corazón y articulaciones), artritis reumatoide (revestimiento articular), sarcoidosis (múltiples tejidos y órganos), esclerodermia (piel y tejido conectivo), síndrome de Sjogren (glándulas exocrinas y otros tejidos), espondiloartropatías (esqueleto axial y otros tejidos), tiroiditis (tiroides), vasculitis (vasos sanguíneos). 20
41. 41.Uso de un polipéptido o construcción polipeptídica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30, o de un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 31, para la preparación de un medicamento para tratar un trastorno relacionado con procesos inflamatorios y cáncer.
42. 42.Uso de un polipéptido o construcción polipeptídica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30, o de un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 31, para la preparación de un medicamento para tratar, prevenir y/o 25 cánceres epiteliales tales como de pulmón, hígado, sistema nervioso central, hueso, sangre y sistema linfático, colon, mama, próstata, recto, vejiga, cabeza y cuello, ovario, testículo, pancreático y carcinoma de células escamosas.
43. 43.Uso de un polipéptido o construcción polipeptídica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30, o de un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 31, para la preparación de un medicamento para tratar y/o prevenir enfermedades autoinmunes, tales como enfermedad de Addison (glándula suprarrenal), enfermedades autoinmunes del 30 oído (oído), enfermedades autoinmunes del ojo (ojo), hepatitis autoinmune (hígado), parotitis autoinmune (glándula parotidea), enfermedad de Crohn (intestino), diabetes Tipo I (páncreas), epididimitis (epidídimo), glomerulonefritis (riñones), enfermedad de Graves (tiroides), síndrome de Guillain-Barré (células nerviosas), enfermedad de Hashimoto (tiroides), anemia hemolítica (eritrocitos), lupus eritematoso sistémico (múltiples tejidos), infertilidad masculina (esperma), esclerosis múltiple (células nerviosas), miastenia grave (unión neuromuscular), pénfigo (principalmente piel), 35 psoriasis (piel), fiebre reumática (corazón y articulaciones), artritis reumatoide (revestimiento articular), sarcoidosis (múltiples tejidos y órganos), esclerodermia (piel y tejido conectivo), síndrome de Sjogren (glándulas exocrinas y otros tejidos), espondiloartropatías (esqueleto axial y otros tejidos), tiroiditis (tiroides), vasculitis (vasos sanguíneos).
44. 44.Un procedimiento de producción de un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30, que comprende: 40

    (a) cultivar células huésped que comprenden un ácido nucleico capaz de codificar un polipéptido o construcción polipeptídica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30 en condiciones que permitan la expresión del polipéptido, y

    (b) recuperar el polipéptido producido a partir del cultivo.
45. 45. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 44, en el que dichas células huésped son células bacterianas, 45 células de levadura, células de mamífero o células de insecto.
46. 46. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 45, en el que dichas células huésped son células bacterianas o células de levadura.
47. 47. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 46, en el que dichas células huésped son células de E. coli, células de S. cerevisiae o células de P. pastori. 50
48. 48.Un procedimiento de diagnóstico de un trastorno caracterizado por la disfunción de EGFR, que comprende las etapas de:

    (a) poner en contacto una muestra con un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30,

    (b) detectar la unión de dicho polipéptido a dicha muestra, y

    (c) comparar la unión detectada en la etapa (b) con un patrón, en el que una diferencia en la unión respecto a dicha muestra es diagnóstica de un trastorno caracterizado por una disfunción de EGFR.
49. 49.Un kit para explorar un trastorno caracterizado por una disfunción de EGFR, que comprende un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30.

    5