HU221001B1

HU221001B1 - Egyláncú anti-EGFR Fv-k és anti-EGFR ellenanyagok

Info

Publication number: HU221001B1
Application number: HU9503285A
Authority: HU
Inventors: Jaime Adan; Keith H. Ansell; Mary M. Bendig; Francesc Blasco; Detlef Güssow; A. Cathrine Kettleborough; Francesc Mitjans; Jaime Piulats; Elisabet Rosell
Original assignee: Merck Patent Gmbh.
Priority date: 1994-03-17
Filing date: 1995-03-16
Publication date: 2002-07-29
Also published as: PL181342B1; AU2071695A; DK0699237T3; JPH08510922A; JP2006025794A; EP0699237A1; ES2191702T3; US5844093A; EP0699237B1; DE69529649D1; DE69529649T2; CZ292061B6; HU9503285D0; CA2163012A1; NO954626L; CA2163012C; CZ301495A3; KR100376038B1; SK283889B6; HUT73461A

Description

A találmány tárgyát anti-EGFR ellenanyagok és ellenanyagfragmensek, előnyösen egyláncú „Fv”-k (scFv-k) képezik, melyek immunizált emlős, előnyösen egér sejtjeiből előállított fágalapú ellenanyag-génkönyvtárakból nyerhetők. A fágalapú ellenanyag-génkönyvtárakból izolált ellenanyagfragmenseket a találmány szerinti géntechnológiai eljárásokkal úgy módosíthatjuk, hogy részlegesen humanizált teljes ellenanyag-molekulákat kapjunk. A találmány szerinti a kiméra anti-EGFR ellenanyagok humánimmunglobulin konstans régiókat tartalmaznak, és - csakúgy mint találmány szerinti fragmenseik - alkalmasak humántumorok diagnosztizálására és kezelésére.

A találmány szerinti megoldás világossá teszi továbbá, hogy immunizált emlősökből ellenanyagok izolálására fág ellenanyag-génkönyvtárak alkalmazása a szokásos hibridómatechnológiához képest egy alternatív, sokoldalúbb eljárást képvisel.

A találmány tárgyát képezik továbbá, a fenti ellenanyagokat vagy fragmenseket tartalmazó, tumorok - például melanoma, glioma vagy karcinóma - kezelésére alkalmas gyógyászati készítmények. Az említett ellenanyagokat vagy fragmenseiket diagnosztikai célra is alkalmazhatjuk in vitro vagy in vivő az említett tumorok lokalizálására és azonosítására.

A leírásban előforduló szakkifejezések közül az alábbiakat a megadott definíciók értelmében használjuk:

„FR”-knek (keretrégióknak) nevezzük a könnyű- és nehézlánc variábilis régiójának négy alrégióját, melyek a három CDR-t közrefogják.

„CDR”-eknek (komplementeritást meghatározó régióknak) nevezzük a könnyű- és nehézlánc variábilis régiójának három alrégióját, melyek hipervariábilis szekvenciákkal rendelkeznek, és hurokszerkezetet vesznek fel, melyek elsősorban felelősek az antigénnel történő közvetlen kontaktus létrehozásáért.

„Kiméra ellenanyagok” vagy részlegesen humanizált ellenanyagok alatt olyan ellenanyagokat értünk, melyek humáneredetű konstans régókat és nemhumán eredetű, például egérből származó variábilis régiókat (ezen belül CDR-régiókat) tartalmaznak.

„Humanizált” vagy teljesen humanizált ellenanyagoknak olyan ellenanyagokat nevezünk, melyek humáneredetű konstans régiókat és FR-régiókat, valamint nemhumán eredetű CDR-régiókat tartalmaznak.

„EGF” valamint „EGFR” alatt az epidermális növekedési faktort, valamint annak receptorát értjük.

A „PCR” rövidítés polimeráz-láncreakciós eljárásra vonatkozik.

Az „scFv” rövidítés egyláncú Fv-re vonatkozik, amely egy ellenanyagfragmens.

„V_L”-nek a könnyűlánc variábilis régióját nevezzük.

„V_K”-nak a kappa-lánc variábilis régióját nevezzük.

„V_H”-nak a nehézlánc variábilis régióját nevezzük.

A „PBS” rövidítés foszfátpufferes fiziológiás sóoldatot jelent.

Az „FCS” fötális boíjúszérumot jelent.

A „HBSS”-nek Hanks-pufferolt sóoldatot nevezünk.

A „FITC” rövidítés fluoreszcein-izotiocianátra vonatkozik.

Az „MTC” rövidítés kevert timocita sejttenyészetet jelöl.

Az epidermális növekedési faktor (EGF) epidermális és epithetiális sejtekre nézve mitogén, polipeptidhormon. A fogékony sejtekkel történő kölcsönhatása során az EGF membránreceptorokhoz (EGFR-receptorokhoz) kötődik. Az EGFR körülbelül 170 kD molekulatömegű transzmembrán-glikoprotein, és a c-erb-B proto-onkogén génterméke.

A Mab-425 a jól ismert, humán A431 karcinómasejtvonallal szemben (ATCC CRL 1555) előállított egér monoklonális ellenanyag, amely a humán-EGFR külső doménján található polipeptidepitóphoz kötődik, és gátolja az EGF kötődését. A Mab-425 ellenanyagról (ATCC HB 9629) kimutatták, hogy képes in vitro tumorcitotoxicitás közvetítésére, valamint epidermoid vagy kolorektális (vastagbél és végbél) karcinómaeredetű sejtvonalakban in vitro gátolja a tumorsejtek szaporodását [Rodeck és munkatársai: Cancer Rés. 47, 3692 (1987)]. A Mab-425 ellenanyag humanizált, valamint kiméra változatával foglalkozik a WO 92/15683 nemzetközi közzétételi irat.

Az elmúlt néhány év során olyan eljárásokat írtak le, melyek alkalmazásával prokarióta gazdasejtekben, például E. co/z-sejtekben funkcionális ellenanyagfragmensek állíthatók elő. Ilyenek például az Fv-fragmens és az Fab-fragmens, melyek közül az Fv-fragmensnek van különös jelentősége. Leírtak egyláncú Fv-fragmenseket is, (melyekben a V_L- és V_H-lánc össze van kapcsolva) [Bírd és munkatársai: Science 242, 423 (1988); Huston és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879 (1988)].

A fág ellenanyag-génkönyvtárak ellenanyagoknak immunizált állatokból történő izolálása szempontjából alternatív technológiát képviselnek a hibridómatechnológiához képest. A hibridómatechnológia úgy működik, hogy az ellenanyag-termelő sejteket folyamatos szaporodásává („halhatatlanná”) tesszük. A fág ellenanyagtechnológia szerint, az ellenanyagot kódoló géneket tesszük „halhatatlanná” [Winter G. és Milstein C.: Natúré 349, 293 (1991)]. A fág ellenanyag-technológiában az ellenanyag nehézlánc variábilis régióját (V_H), valamint a könnyűlánc variábilis régióját (V_L) képező géneket PCR-eljárással amplifikáljuk, a variábilis régiókat véletlenszerű módon kombináljuk és fágrészecskék felszínén, ellenanyagfragmensekként expresszáljuk, majd a fág ellenanyag-génkönyvtárat a kérdéses antigénhez kötődő ellenanyagokra nézve átvizsgáljuk.

A hibridómatechnológiát, amennyiben az állatok lépében erős immunválaszt lehetett kiváltani, igen sikeresen alkalmazták egér monoklonális ellenanyagok izolálására. Például humán epidermális növekedésifaktorreceptorral szembeni egér monoklonális ellenanyagokat izoláltak intraperitoneálisan humán A431-tumorsejtekkel immunizált egerek lépéből [Murthy és munkatársai: Arch. Biochem. Biophys. 252, 549 (1987)]. A fág ellenanyag-technológia előnye a hibridómatechnológiával szemben az, hogy kiindulási anyagként gya2

HU 221 001 Bl korlatilag bármilyen forrásból származó, ellenanyagexpresszáló sejt alkalmazható, és rövid idő alatt nagyszámú különböző ellenanyag vizsgálható át. A fág ellenanyag-technológia további előnye, hogy azzal a kérdéses ellenanyagok variábilis régióját kódoló géneket már klónoztuk, és azonnal rendelkezésére állnak további géntechnológiai módosítás céljára.

Egy közlemény szerint, fág ellenanyag-génkönyvtárból izolált antitetanusz-toxoid Fab-fragmenst alakítottak teljes ellenanyag-molekulává [Bender és munkatársai : Hűm. Antibod. Hybridomas 4, 74 (1993)].

Az elmúlt tíz év folyamán, az aktív immunizációs technika alternatívájaként az in vitro immunizációt alkalmazták mind humán-, mind egérrendszerből származó antigének széles skálájával szembeni monoklonális ellenanyagok (,qnAb”-k) előállítására [például: Vaux D. J. T., Helenius A. és Mellman I.: Natúré 336, 36 (1988); Gathuru J. K. és munkatársai: J. Immunoi. Methods 137, 95 (1991); Borrebaeck C. A. K.: Immunoi. Today 9, 355 (1988)]. A fenti megközelítési mód előnye, hogy csak kis mennyiségű antigénre van szükség, és az eljárás alkalmazható humánhihridómák előállítására. De a gyenge affinitással rendelkező IgM-ellenanyagok előállítása, valamint azok a nehézségek, melyek az in vitro immunizációt követően a humánlimfociták folyamatos szaporodásúvá történő alakításával kapcsolatosan jelentkeztek, állandó problémát jelentettek a fenti technológia alkalmazásánál.

Az ellenanyagok előállításának új módját jelenti a nehézlánc (Vjj) és könnyűlánc (V_L) variábilis régiókat kódoló génekből álló készlet PCR-amplifikációja, melyeket ezután véletlenszerűen rekombinálunk és „ellenanyag-prezentáló” fág génkönyvtárakként expresszálunk (7-9). Ellenanyag variábilis régiókat kódoló géneket klónoztak és füzionáltak egyláncú Fvfragmensekként (scFv) a kisméretű burokproteinhez (a 3. génhez) (10). A fágrészecske felszínén bemutatja (prezentálja) az ellenanyagfragmenst, és az az ellenanyagok kötő tulajdonságait kihasználva, „panning”-eljárással (többszöri, egymást követő felviteli és mosási lépéseket tartalmazó eljárás) szelektálható. Az eljárás előnye, hogy a V-gének véletlenszerű rekombinációja olyan új specifitással és affinitással rendelkező új párosításokat eredményezhet, melyeket természetes úton nem szelektálhattunk volna. Az eljárás lehetővé teszi továbbá, egérből vagy emberből származó, antigénnel nem találkozott vagy in vitro immunizált limfociták alkalmazását.

A korábbi próbálkozások egér-B-sejtek in vitro immunizálásával EGFR-receptorral szembeni mAb-k előállítására alacsony affinitású, keresztreakciókat mutató ellenanyagokat eredményeztek. Abból a célból, hogy a fenti hátrányokat kiküszöböljük, in vitro immunizációt végeztünk, majd a PCR-klónozási technológiát követtük.

A találmány tárgyát képezi tehát az EGF-receptorhoz nagy affinitással kötődni képes ellenanyagok és ellenanyagfragmensek kifejlesztése, melyeket a fentiekben és az alábbiakban ismertetett előnyös eljárás szerint állítunk elő.

Az alábbiakban összefoglaljuk a találmány szerinti megoldást.

A találmányban három különböző fág ellenanyaggénkönyvtárból izolált, egér-anti-EGFR ellenanyagokat hasonlítunk össze szokásos hibridómatechnológiával nyert, egér-Mab(425) ellenanyaggal [Murthy és munkatársai: Arch. Biochem. Biophys. 252, 549 (1987); Kettlehorough és munkatársai: Protein Eng. 4, ΤΓ3 (1991)]. Nemcsak az immunizált egér lépéből készítettünk génkönyvtárat, hanem az immunizált egér elvezető nyirokcsomójából és in vitro immunizált egérsejtekből is. A génkönyvtárakból izolált két, egyláncú „Fv”-t (scFv-t) géntechnológiai úton úgy módosítottunk, hogy kiméra, teljes ellenanyag-molekulákat kapjunk, melyekben az egér variábilis régiók humán konstans régiókhoz kapcsolódnak.

Közelebbről, a találmány tárgyát immunizált emlős, előnyösen egér sejtjeiből, előnyösen lépéből vagy elvezető nyirokcsomójából származó sejtekből vagy in vitro immunizált sejtekből előállított fág ellenanyaggénkönyvtárból nyerhető anti-EGFR, egyláncú Fv képezi. Általánosságban, a találmány tárgya nem korlátozódik scFv-fragmensekre, hanem annak tárgyát képezik egyéb anti-EGFR ellenanyagfragmensek, mint például Fab-fragmensek vagy F(ab’)₂-fragmensek is.

Több, a találmány szerinti scFv jól definiált DNS- és aminosavszekvenciával rendelkezik. A találmány tárgyát képezik tehát olyan egyláncú Fv-ffagmensek, melyekben a nehézlánc és könnyűlánc variábilis régiók a felsorolt, 1-32. azonosító számú, előnyösen az 5-8. ábrán bemutatott nehézlánc- és könnyűlánc-szekvenciák közül valamelyik DNS-szekvenciával és/vagy aminosavszekvenciával rendelkeznek.

Mivel diagnosztikai vagy terápiás célra sok esetben csak teljesen működőképes, teljes ellenanyag alkalmazható, a találmány célja, hogy az egyláncú Fv-fragmensekből származó variábilis régiókat humánimmunglobulin konstans régiókkal kapcsoljuk össze, hogy teljes, részlegesen vagy teljesen humanizált anti-EGFR ellenanyagokat kapjunk.

A találmány célja tehát, hogy a fentiekben, az alábbiakban, valamint az igénypontokban definiált ellenanyagfragmensekből származó DNS-szekvenciákból, valamint humánimmunglobulin konstans régiókból teljes anti-EGFR ellenanyagot állítsunk elő, melyben, a találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a nehézlánc a gamma-l-lánc aminosavszekvenciájával, a könnyűlánc a kappa-lánc aminosavszekvenciájával rendelkezik.

A találmány szerint, az anti-EGFR scFv-ffagmenst fág ellenanyag-génkönyvtár technológiával izoláljuk. A találmány tárgyát képezi tehát anti-EGFR egyláncú Fv-fragmensek előállítására szolgáló eljárás, mely az alábbi lépéseket tartalmazza:

(i) immunizált emlőssejtekből, előnyösen egérsejtekből RNS-t izolálunk;

(ii) első cDNS-szálat szintetizáljuk;

(iii) az immunizált sejtekből származó cDNS-ben található V_H- és V_K-géneket amplifíkáljuk;

(iv) az említett géneket megfelelő restrikciós hasítási helyekkel fágmid-vektorba klónozzuk;

(v) a ligálási reakció termékével prokarióta sejteket transzformálunk;

HU 221 001 Bl (vi) a fág génkönyvtárakat tisztított EGFR alkalmazásával EGFR-receptorral szemben irányuló fág ellenanyagokra nézve átvizsgáljuk; és (vii) a kívánt egyláncú Fv-fragmenst prokarióta gazdasejtben, előnyösen E. coliban termeljük.

A találmány tárgyát képezi továbbá, teljes antiEGFR ellenanyagok előállítására szolgáló eljárás, melyben a fent ismertetettek szerint, vagy az igénypontokban definiáltak szerint előállított anti-EGFR ellenanyagfragmensek variábilis régióit kódoló DNS-t legalább egy, humánimmunglobulin konstans régiókat kódoló genomi DNS-t tartalmazó eukarióta expressziós vektorba klónozzuk, a fenti vektorral eukarióta sejteket transzformálunk, és az ellenanyagot expresszáljuk, majd izoláljuk.

Az anti-EGFR scFv-fragmensek, főképp a teljes anti-EGFR ellenanyagok humántumorok diagnózisára és terápiájára alkalmazhatók. A találmány tárgyát képezik tehát a fentiekben definiált vagy az igénypontokban definiált anti-EGFR egyláncú Fv-fragmenst vagy teljes anti-EGFR ellenanyagot tartalmazó gyógyászati készítmények.

A találmány eredményeit és előnyeit az alábbiakban foglalhatjuk össze.

Új, egér-anti-EGFR ellenanyagokat izoláltunk fág ellenanyag-génkönyvtárakból. Az új ellenanyagok legalább négy különböző V_H-alosztályt és négy különböző V_K-alosztályt képviselnek [Kábát és munkatársai: „Sequences of proteins of immunological interest” 5. kiadás, „U. S. Dept. of Health and Humán Services”, Bethesda (1991)]. Ezeket a hibridómatechnológiával izolált, egér-Mab-425 ellenanyagtól eltérő párosítások és szekvenciák jellemezték. Az egér-Mab-425 ellenanyag V_H2b és V_K4 párosítással rendelkezik, mely a fág ellenanyagokban nem volt megfigyelhető. A 425_VH-régióval az scFv-L3-llD mutatta a legnagyobb fokú azonosságot (84,9%). Az eltérések legnagyobb része a CDR-régiókban mutatkozott. A 425V_Krégióval az scFv-S4-2D mutatta a legnagyobb fokú azonosságot (83,2%). Az eltérések legnagyobb része itt is a CDR-régiókban, különösen a CDR3 régióban volt megfigyelhető. A találmány szerinti eljárás alkalmazásával fág ellenanyag-génkönyvtárakból számos különböző, új, anti-EGFR ellenanyagot izoláltunk, ezek az ellenanyagok mind különböznek a MAb-425 ellenanyagtól, amennyiben legalább két scFv az EGFRreceptoron a MAb-425 ellenanyagtól eltérő epitópot ismert fel. Ez ellentmond egy korábbi közleménynek, mely szerint kombinációs génkönyvtárakból izolált ellenanyagok nagymértékű hasonlóságot mutattak a hibridómatechnológiával izoláltakhoz [Caton és Koprowski: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6450 (1990)].

A három fág ellenanyag-génkönyvtár közül nagy affinitású ellenanyagok előállításához szükséges szelekciós lépések számát és a nagy affinitású ellenanyagok változatosságát tekintve a legjobb génkönyvtámak az elvezető nyirokcsomóból előállított génkönyvtár bizonyult. Két okból határoztunk úgy, hogy a fág ellenanyag-génkönyvtár előállításához nyirokcsomóból nyerünk RNS-t. Először, korábbi vizsgálatok azt mutatták, hogy a talpon keresztül történő immunizálást követően a térdhajlati nyirokcsomókból nagyobb arányban kaptunk nagy affinitású IgG-ellenanyagokat termelő Bsejteket, mint intraperitoneális (hasüregen át történő) immunizálást követően a lépből [Venn és Dresser: J. Immunoi. Methods 702, 95 (1987)]. Másodszor, az elvezető nyirokcsomókból közismerten könnyen lizálhatók humánantitumor ellenanyagok. Talpon át immunizált egér térdhajlati nyirokcsomójából izolált egér-anti-EGFR ellenanyagok előállítása szolgált modellként tehát humán-anti-EGFR ellenanyagok izolálásához egy emlőkarcinómában szenvedő beteg hónalji nyirokcsomóiból. Kimutattuk, hogy kis mennyiségű nyirokcsomómintából megfelelő méretű génkönyvtárak állíthatók elő, majd a génkönyvtárakból nagy affinitású ellenanyagok izolálhatok.

Bár mindhárom fág ellenanyag-génkönyvtárból sikerült egér-anti-EGFR ellenanyagokat izolálni, nem világos, hogy az újonnan izolált ellenanyagok bármelyike nagyobb affinitással rendelkezik-e, mint a hibridómatechnológiával izolált MAb-425 ellenanyag. Az első analízisek során, a fág ellenanyaggénkönyvtáreredetű scFv-fragmensek látszólag jobban kötődtek az EGFR-receptorhoz, mint a MAb-425 ellenanyagból származó scFv-fragmens (2. ábra). Kiméra, teljes ellenanyag-molekulákkal végzett további kísérletekben a kiméra ellenanyagok egyike (S4-2D) a kiméra-425 ellenanyaggal megegyező affinitást mutatott az EGFR-receptorhoz. A második kiméra ellenanyag (L3-11D) a kiméra-425 ellenanyaghoz képest négyszer alacsonyabb affinitással rendelkezett (4. ábra). Az scFv-fragmensek alkalmazásával kapott kötődési eredmények valószínűleg azért félrevezetőek, mivel az scFv-készítmények monomerek és dimerek elegyét tartalmazhatják [Griffiths és munkatársai: EMBO J. 72, 725 (1993)]. Ezzel szemben, a kiméra IgG-ellenanyagok várhatóan nem képeznek dimereket, és a kiméra L3-1 ID és S4-2D ellenanyagok mérete megfelelt a bivalens, monomer kiméra IgG-ellenanyagok méretének. A 425, L3-1 ID és S4-2D scFv-ffagmenseket tartalmazó, affinitásos eljárással tisztított készítmények analízise azonban azt mutatta, hogy a fenti scFvkészítmények monomer, dimer és más multimer formákat tartalmaztak. Ezenkívül, a monomer és multimer formák viszonylagos aránya az egyes scFv-k esetében más-más volt. A 425-scFv tartalmazott legkisebb arányban dimer formákat. Amint az megjósolható, a dimer, és különösen a nagyobb multimer formák erősebben kötődtek a tisztított EGFR-receptorhoz, mint a monomer forma. Úgy tűnik, a 425-scFv kevésbé hajlamos dimerképzésre, mint egyes újonnan izolált scFvfragmensek.

Bár az ellenanyagfragmensek expresszálása fágrészecskék felszínén a kívánt specifitással rendelkező ellenanyagok gyors szelektálására szolgáló hatékony eljárás alapját képezi, valószínűleg sem a fág ellenanyagok, sem maguk az ellenanyagfragmensek (scFv-fragmensek vagy Fab-fragmensek) nem képviselik a kívánt végterméket. Bemutatjuk továbbá, hogy a

HU 221 001 Bl fág ellenanyag-génkönyvtárakból izolált egér-scFvfragmensek hogy alakíthatók könnyen teljes ellenanyag-molekulákká. Ebben az esetben, az egér variábilis régiókat humán konstans régiókhoz kapcsoltuk, hogy részlegesen humanizált, kiméra ellenanyagokat kapjunk.

A fenti eredmények azt mutatják, hogy fág ellenanyag-technológia alkalmazásával, immunizált egerekből változatos anti-EGFR ellenanyagfragmensek izolálhatok. Az ellenanyagfragmensekből ezután a kívánt konstans régiókat tartalmazó, teljes ellenanyagmolekulák állíthatók elő. Monoklonális ellenanyagok izolálására egerekből, esetenként még a hibridómatechnológia lehet a választandó eljárás. Amennyiben nagy immunogenitású antigén áll rendelkezésre, és egy, vagy néhány különböző anti-antigén ellenanyagot termelő, kisszámú hibridóma-sejtvonalat kívánunk nyerni, valószínűleg kevés okunk van a fág ellenanyagtechnológia alkalmazásának mérlegelésére. Ha azonban nagy affinitású ellenanyagok előállítása céljából speciális immunizálási eljárás, mint például talpon át történő injektálás alkalmazása tűnik előnyösnek, vagy ha az antigénen található sok különböző epitóp ellen irányuló, nagyszámú ellenanyagot kívánunk előállítani, vagy nagyon kevéssé domináns, feltehetően kevésbé immunogén epitóp ellen irányuló ellenanyagot kívánunk előállítani, akkor a fág ellenanyag-technológia a választandó eljárás. Abban az esetben is, ha várhatóan az ellenanyagok további géntechnológiai módosítására van szükség, a fág ellenanyag-technológia alkalmazása előnyös, mivel ezáltal az ellenanyaggének már klónozva vannak.

A találmány szerinti megközelítési mód, melyben az adott antigénnel történő in vitro immunizálást PCRklónozási technológiával kombináltuk, olyan scFvfragmenseket eredményezett, melyek reagáltak az EGFR-receptorral, és más antigénekkel nem mutattak keresztreaktivitást. A találmány szerinti immunizálási eljárás alapját olyan antigénprezentálás képezi, mely nem oldható, hanem membránvezikulum-készítmény, valamint maga a tenyésztő tápfolyadék, amely FCSmentes. Mindkét eljárásról leírták, hogy alkalmazásukkal az in vitro immunizálás hatékonysága fokozható, mivel az antigéneket az antigénprezentáló sejtek számára hozzáférhetővé teszi [például: Brams P. és munkatársa: J. Immunoi. Methods 98, 11 (1987)].

Az MTC alkalmazásával kapott eredmények összhangban vannak korábbi közleményekkel [például, Borrebaeck C. A. K. és Möller S. A. : J. Immunoi. 136, 3710 (1986); Möller S. A. és Borrebaeck C. A. K.: „In Vitro Immunization in Hybridoma Technology”, „Elsevier Science Publishers Β. V.”, szerk.: Borrebaeck C. A. K., Amszterdam, 3. oldal, (1983)], melyekben limfokinforrásként MTC-felülúszó használatát javasolták az in vitro immunizációs eljárás hatékonyságának javítására. A membránvezikulumkészítmény poliantigénnek tekinthető, mivel az ilyen vezikulumban sok különböző antigéndetermináns van jelen. Ezért úgy tűnik, mintha bizonyos mértékű poliklonális aktivációt hoznának létre. Mi ezt a feltevést kizártuk, mivel az anti-EGFR-specifikus válasz nyilvánvalóan különbözött standard poliklonális aktivátorral kiváltott választól.

Ahelyett, hogy az in vitro immunizációt követően a B-sejteket tettük volna folyamatos szaporodásüvá („halhatatlanná”), a molekuláris stratégiát alkalmaztuk, melyben a V_H és V_L ellenanyaggéneket tettük „halhatatlanná”. Ezeket a monoklonális ellenanyagffagmenseket baktériumokban expresszáltuk és termeltük. A fágprezentációs rendszer hatékony módszer specifikus antigének ellen irányuló ellenanyagfragmensek izolálására. Az ellenanyagfragmens és a gp3-burokprotein közti stopkodon jelenléte, szupresszor és nem szupresszor törzsek alkalmazásán keresztül megteremti a lehetőségét annak, hogy váltsunk a felszínen történő prezentálás és oldható scFv-fragmens szekréciója között [Hoogenboom és munkatársai: Nucl. Acids Rés. 19, 4133 (1991)].

Az in vitro antigénstimulált B-sejtekben a specifikus válasz fokozódásának és az mRNS-szint növekedésének köszönhetően, az in vitro immunizálás az antigénnel szemben nagymértékű specifítást mutató ellenanyagfragmensek izolálásához vezet. Két szelekciós kört követően a kiónok 100%-a pozitívnak bizonyult EGFR-kötődésre nézve. Ezzel szemben, in vivő immunizációs eljárásokból származó kiónok csak négy szelekciós kört követően váltak 100%-ban pozitívakká [Kettleborough és munkatársai : EP 94 104 160 számú európai szabadalmi leírás; és Eur. J. Immunoi. 24, 952 (1994)].

„Naív” (ellenanyaggal nem stimulált) ellenanyaggénekből előállított, ellenanyagfragmens-prezentáló fág génkönyvtárak alkalmazása lehetővé teszi specifikus humán ellenanyagfragmensek előállítását immunizálás nélkül, vagy in vitro immunizációt követően. Az ellenanyagfragmensek egyszerű, gyors és gazdaságos módon, közvetlenül baktériumokban állíthatók elő.

A találmány szerinti eljárások során az alábbi biológiai eredetű anyagokat és általános módszereket alkalmaztuk.

A leírás vonatkozásában említett mikroorganizmusok, sejtvonalak, plazmidok, fágmidek, promoterek, rezisztenciamarkerek, replikációs origók vagy egyéb vektorfragmensek a kereskedelemben vagy másképp, általánosan hozzáférhetőek. Amennyiben azokra vonatkozólag a leírásban más információt nem adtunk meg, azok csak a példaként szolgálnak, nem esszenciálisak a találmány szempontjából, és egyéb megfelelő eszközökkel vagy biológiai anyagokkal helyettesíthetők.

Az scFv-fragmensek klónozására és az scFv-proteinek előállítására előnyösen baktérium-gazdasejteket alkalmazunk. Ilyen gazdasejtek például az E. coli vagy Bacillus.

A találmány szerinti teljes anti-EGFR ellenanyagok előállítására előnyösen eukarióta gazdasejteket, például COS-, CHO- vagy élesztősejteket alkalmazunk.

A találmány szempontjából esszenciális technikákat a leírásban részletesen ismertetjük. A leírásban részletesen nem ismertetett technikák szakember számára jól ismert standard eljárásoknak felelnek meg, vagy azo5

HU 221 001 BI kát az idézett szakirodalmi hivatkozásokban, szabadalmi bejelentésekben, valamint a szokásos szakirodalomban részletesen ismertetik.

Az alábbiakban röviden ismertetjük a leírásokhoz csatolt ábrákat.

Az 1. ábra a fág ellenanyag-génkönyvtárakból izolált scFv-fragmensek aminosavszekvenciáit mutatja. (A) a nyirokcsomó-génkönyvtárból származó scFvfragmenseket ismerteti. (B) a lépgénkönyvtárból származó scFv-fragmenseknek felel meg. Feltüntettük a komplementeritást meghatározó régiókat (CDR-régiókat) és a keretrégiókat (FR-régiókat).

A 2. ábra az scFv-fragmensek EGFR-receptorhoz történő kötődését szemlélteti. A bakteriális felülúszóban meghatároztuk az scFv-fragmensek koncentrációját, és az scFv-fragmenseket ELISA-eljárással tisztított EGFRreceptorhoz történő kötődésre nézve teszteltük. (A) a nyirokcsomó-génkönyvtárból származó scFvfragmensek kötődését mutatja. (B) a lépgénkönyvtárból származó scFv-fragmensek kötődését mutatja. Pl (pozitív kontroll) a MAb-425 ellenanyagból származó scFvfragmens. L1 és SÍ (negatív kontrollok) az előszelektált nyirokcsomó- és lépgénkönyvtárból származó, nem kötődő scFv-fragmensek.

A 3. ábra a variábilis régiók emlőssejtekben történő expresszálás céljából történő összeépítésénél alkalmazott köztivektorokat ábrázol. (A)V_H-vektor. (B)V_K-vektor.

A 4. ábra kiméra, teljes ellenanyagok EGFRreceptorhoz történő kötődését szemlélteti. A COSsejtek felülúszójában az ellenanyagok koncentrációját ELISA-eljárással határoztuk meg, és az ellenanyagokat ELISA-eljárással tisztított EGFR-receptorhoz történő kötődésre nézve teszteltük.

Az 5. ábra az L2-11C azonosító jelű scFv-fragmens DNS- és aminosavszekvenciáját mutatja. (A) könnyűlánc; (B) nehézlánc.

Aminosavpozíciók:

(A)FR-l	1-23,	CDR-1: 24-34,
FR-2	35-49,	CDR-2: 50-56,
FR-3	57-88,	CDR-3: 89-97,
FR-4	98-109.
(B)FR-l	1-30,	CDR-1: 31-35,
FR-2	36-49,	CDR-2: 50-66,
FR-3	67-98,	CDR-3: 99-108,
FR-4	109-119.

A 6. ábra az L2-12B azonosító jelű scFv-fragmens DNS- és aminosavszekvenciáját mutatja. (A) könnyűlánc; (B) nehézlánc.

Aminosavpozíciók:

(A)FR-l	1-23,	CDR-1: 24-38
FR-2	39-49,	CDR-2: 50-56,
FR-3	57-88,	CDR-3: 89-97,
FR-4	98-109.
(B)FR-l	1-30,	CDR-1: 31-35,
FR-2	36-49,	CDR-2: 50-66,
FR-3	67-98,	CDR-3: 99-108,
FR-4	109-119.

A 7. ábra az L3-11D azonosító jelű scFv-fragmens DNS- és aminosavszekvenciáját mutatja. (A) könnyűlánc; (B) nehézlánc.

Az FR-régiók és CDR-régiók aminosavpozíciói megfelelnek a 6. ábrán bemutatottaknak.

A 8. ábra az S4-2D azonosító jelű scFv-fragmens DNS- és aminosavszekvenciáját mutatja. (A) könnyűlánc; (B) nehézlánc.

Aminosavpozíciók:

(A)FR-l	1-23,	CDR-1: 24-35,
FR-2	36-50,	CDR-2: 51-57,
FR-3	58-89,	CDR-3: 90-98,
FR-4	99-110.
(B)FR-l	1-30,	CDR-1: 31-35,
FR-2	36-49,	CDR-2: 50-66,
FR-3	67-98,	CDR-3: 99-107,
FR-4	108-118.

Az 5-8. ábra szerinti szekvenciák ugyancsak megtalálhatók a leíráshoz csatolt szekvencialistában, amely a találmány szerinti kitanítás részét képezi.

Az alábbiakban részletesen ismertetjük a találmány szerinti megoldást.

(1) Fág ellenanyag-génkönyvtárak előállítása és átvizsgálása.

Három fág ellenanyag-génkönyvtárat állítottunk elő, egyet A431 jelzésű, humán karcinóma-sejtvonallal immunizált egér lépéből (8,8 χ 10⁵ kiónt tartalmazó génkönyvtár), egyet talpon keresztül, tisztított EGFR-receptorral immunizált egér térdhajlati nyirokcsomójából (6,5 x1ο⁶kiónt tartalmazó génkönyvtár), egyet pedig in vitro A431 vezikulumokkal immunizált egérlimfocitákból (1,1 χ 10⁵kiónt tartalmazó génkönyvtár), (az A431 vezikulumok előállítására és az in vitro immunizációra vonatkozó részleteket az 1. és 2. példákban ismertetjük).

A szelekciót megelőzően mindegyik génkönyvtárból származó legalább 46 klón esetében BstNI-emésztéssel analizáltuk a kiónokra jellemző emésztési mintát („ujjlenyomatot”) [Clackson és munkatársai: Natúré 352, 624 (1991)], hogy a klónkészlet változatosságának mértékét meghatározzuk. Az emésztéssel kapott minták sokfélesége volt megfigyelhető. Ugyancsak a szelekciót megelőzően valamennyi génkönyvtárból 96 kiónt ELISAeljárással EGFR-receptorhoz történő kötődésre teszteltünk. A lép- és a nyirokcsomó-eredetű génkönyvtárakból származó scFv-fragmensek egyike sem kötődött EGFRreceptorhoz. Az in vitro immunizációval előállított génkönyvtárból származó scFv-fragmensek egyike kötődött az EGFR-receptorhoz. EGFR-receptorral fedett immuncsövek alkalmazásával végzett egyetlen szelekciós kört követően a nyirokcsomó-eredetű génkönyvtár és az in vitro immunizációval előállított génkönyvtár esetében az EGFR-receptorhoz kötődő scFv-fragmensek nyilvánvaló feldúsulása volt megfigyelhető. A léperedetű génkönyvtár esetében egy második szelekciós körre volt szükség, mielőtt EGFR-receptorhoz kötődő scFvfragmenst tudtunk kimutatni. A harmadik szelekciós kört követően a nyirokcsomó-eredetű génkönyvtárból és az in vitro immunizációval előállított génkönyvtárból származó scFv-fragmensek többsége pozitívnak bizonyult EGFR-kötődésre nézve. A léperedetű génkönyvtár esetében végzett, egy negyedik szelekciós kört követően, az abból származó scFv-fragmensek többsége pozitívnak bizonyult EGFR-kötődésre nézve (1. táblázat).

HU 221 001 Bl

1. táblázat

Az EGFR-receptorhoz kötődő kiónok százalékos aránya az egyes szelekciós köröket követően

	Nyirokcsomó-eredetű génkönyvtár	Léperedetű génkönyvtár	In vitro immunizált sejtekből előállított génkönyvtár
Szelekciót megelőzően	0	0	1
Első szelekciós kör	77	0	84
Második szelekciós kör	86	26	100
Harmadik szelekciós kör	90	77	100
Negyedik szelekciós kör	nem teszteltük	97	nem teszteltük

(2) Az EGFR-receptorhoz kötődő klánok szekvenciaanalizise

Valamennyi szelekciós kört követően az EGFRreceptorhoz kötődő kiónokban található scFvfragmensek emésztési mintáját BstNI-emésztéssel analizáltuk [Clackson és munkatársai: Natúré 352, 624 (1991)]. Nyilvánvaló volt, hogy bizonyos emésztési minták feldúsultak. A nyirokcsomó-eredetű génkönyvtár esetében a második és harmadik szelekciós körből, a léperedetű génkönyvtár esetében a harmadik és negyedik szelekciós körből származó, eltérő BstNI-lenyomatokkal rendelkező kiónokat választottunk a V_H- és Vk-régiók DNS-szekvenciájának meghatározására. A későbbi szelekciós körökből származó kiónokat analizáltunk, mivel ezekben várhatóan nagyobb affinitású kiónok találhatók [Clackson és munkatársai: Natúré 352, 624 (1991)].

A nyirokcsomó-eredetű génkönyvtárból tizenhat kiónt szekvenáltunk és hat különböző scFv-fragmenst figyeltünk meg (1. ábra). Ezek közül öt, egyedi V_H- és Vk-régió párosításokat tartalmazott. A hatodik, egy előzőleg már előfordult V_H-régió-variánst tartalmazott, melyben hat aminosavváltozás volt megfigyelhető, ezek közül öt az 1. keretrégióban (1. FR-régióban). A fenti változások közül kettő a degenerált VH1BACKSFI láncindító oligonukleotid alkalmazásának lehet tulajdonítható [Hoogenboom és munkatársai: Nucl. Acids Rés. 19, 4133 (1991)]. A többi, a PCReljárás közben keletkezett hiba következménye lehet. A V_H-régiók két alosztályba voltak sorolhatók, a V_H2b és V_H3d alosztályokba, míg a Vk-régiók négy alcsoportba tartoztak, a Vk3, Vk4, Vk5 és Vk6 alcsoportokba [Kábát és munkatársai: „Sequences of proteins of immunological interest” 5. kiadás, „U. S. Dept. of Health and Humán Services”, Bethesda (1991)]. A léperedetű génkönyvtárból tíz független kiónt szekvenáltunk, és négy különböző scFv-fragmenst találtunk. Ezek közül három, egyedi V_H- és Vk-régiókból álló párosításokat tartalmazott, míg a negyedik, egy előzőleg már előfordult párosításhoz volt hasonló, ebben a V_H-régión belül csupán két aminosaveltérés volt kimutatható, ezek közül az egyik a 2. komplementeritást meghatározó régióban (2. CDR-régióban) jött létre, két aminosaveltérés pedig a Vk-régióban volt megfigyelhető. Az alcsoport-felosztás V_H2a, V_H2c és V_H3d V_H-alcsoportok, valamint Vk3, valamint Vk4 Vk-alcsoportok jelenlétére mutatott. A nyirokcsomó-eredetű génkönyvtárból és a léperedetű génkönyvtárból származó scFv-fragmensek összehasonlítása alkalmával csak egy olyan scFv-fragmenst találtunk, amely mindkét génkönyvtárban közös volt, ezek az L3-10A és az S4-10H scFv-fragmensek voltak (1. ábra). Erről a kiónról ELISA-eljárással kimutattuk, hogy erősen kötődik EGFR-receptorhoz. Nagy gondossággal jártunk el, hogy a génkönyvtárak közti kontamináció lehetőségét kizárjuk, mégis, egy erős EGFR-kötődést mutató kiónnal történő minimális kontamináció lehetőségét nehéz kizárni. Figyelembe véve azonban a Balb/c-egerek beltenyésztett természetét, lehetséges, hogy két különböző génkönyvtárban egymástól függetlenül ugyanazt az scFv-fragmenst mutatjuk ki.

(3) Az EGFR-receptorhoz történő kötődés affinitásának és specifitásának analízise.

Az antigénhez történő jó kötődési sajátság és a DNS-szekvenciában megfigyelhető változatosság alapján a nyirokcsomó-eredetű génkönyvtárból és a léperedetű génkönyvtárból néhány kiónt további analízis céljára kiválasztottunk. Ezeket az scFv-fragmenseket ELISA-eljárással analizáltuk tisztított EGFRreceptorhoz, irreleváns antigénekhez és EGFRreceptort expresszáló vagy nem expresszáló tumorsejtvonalakhoz történő kötődésre nézve. Pozitív kontrollként scFv-fragmenseket állítottunk elő egérMAb-425 ellenanyagból (Pl). Negatív kontrollokként a szelekciót megelőzően scFv-fragmenseket állítottunk elő (Ll és Sl) a nyirokcsomó-eredetű génkönyvtárból és a léperedetű génkönyvtárból. Az scFv-fragmensek koncentrációját a tesztelendő scFv-fragmensek hígításainak és ismert koncentrációjú, tisztított scFvfragmens hígításainak, Westem-blot alapján történő összehasonlításával határoztuk meg.

Az scFv-fragmenseket ELISA-eljárással tisztított EGFR-receptorhoz történő kötődésre nézve teszteltük, és az eredményeket grafikusan ábrázoltuk (2. ábra). Az így felállított rangsor az egyes kísérletek során reprodukálhatónak bizonyult. Az EGFR-receptorhoz legerősebben kötődő scFv-fragmensek a nyirokcsomó-eredetű génkönyvtárból származó L2-1C, és L3-10A fragmensek, valamint a léperedetű génkönyvtárból származó S4-10H-fragmensek voltak. Amint azt az előzőekben említettük, az L3-10A és S4-10H scFvfragmensek azonos DNS-szekvenciával rendelkeztek. Egy, az S4-10H scFv-fragmenshez igen hasonló scFv7

HU 221 001 Bl fragmens (S4-5A), amely két aminosaveltérést tartalmazott a V_H-régióban és kettőt a Vk-régióban, következetesen alacsonyabb kötődést mutatott, mint az S4-10H. Ezzel szemben, az L2-12B és L3-11D fragmensek között megfigyelhető eltéréseknek nem volt kifejezett hatásuk a kötődésre. Az izolált scFvfragmensek közül csupán kettő mutatott a 425 jelzésű scFv-fragmensnél kisebb mértékű kötődést.

Az scFv-fragmenseket ELISA-eljárással teszteltük műanyaghoz és egy sor semleges proteinhez (ovalbumin, tyúktojáslizozim, citokróm-C, glicerinaldehid-3foszfát-dehidrogenáz, CBA-albumin és BSA) történő kötődésre nézve. Egyik scFv-fragmens sem adott a háttérnél magasabb értéket.

Az scFv-fragmenseket ELISA-eljárással teszteltük három tumorsejt vonalhoz történő kötődésre. Az A431 és MDA-MB468 sejtvonalak vulvából, valamint emlőből izolált, EGFR-receptort hordozó tumorsejtek. Az SK-MEL-23 sejtvonal egy gangliozidot hordozó, melanóma-sejtvonal, melyet negatív kontrollként alkalmaztunk. A tíz tesztelt scFv-fragmens közül csak négy kötődött mind tisztított EGFR-receptorhoz, mind EGFR-receptort hordozó tumorsejtekhez (L2-12B, L3-11D, L2-11C és S4-2D; lásd, 5-8. ábrák). Az SK-MEL23 sejtekhez nem volt kötődés kimutatható. Ennek a meglepő eredménynek több magyarázata lehet. Az egyik szerint, az immunizáció, szelekció és az ELISA-eljárás során alkalmazott EGFR egy szekretált EGFR-proteinszármazék volt [Weber és munkatársai: Science 224,294 (1984)]. Ez a protein a C-terminális végen 17 további aminosavat tartalmaz [Günther és munkatársai: J. Bioi. Chem. 265, 22082 (1990)]. Az scFvfragmenseket ELISA-eljárással teszteltük arra nézve, hogy kötődnek-e ehhez a 17 aminosavból álló peptidhez, ennek során nem volt kötődés megfigyelhető. Lehetséges, hogy a szekretált EGFR-protein-származék és a tumorsejtek felszínén található EGFR konformáció vagy glikozilezés tekintetében tér el egymástól.

A tumorsejtekhez történő kötődés további vizsgálata céljából három scFv-fragmenst (L2-11A, L3-11D és S4-2D) tisztítottunk és „flow cytometriás” eljárással A431 tumorsejtekhez történő kötődésre nézve analizáltunk. A 425 jelzésű scFv-fragmenseket alkalmaztuk pozitív kontrollként. A három vizsgált scFv-fragmens közül csak az L3-11D és az S4-2D kötődött az A 431 sejtekhez. Ez a két scFv-fragmens hasonló kötődési jellemzőkkel rendelkezik, mint a 425 jelzésű scFv-fragmens.

Mind tisztított EGFR-receptorhoz, mind EGFRreceptort hordozó tumorsejtekhez kötődő izolátumokból előállított, tisztított scFv-fragmenseket kompetíciós kötődési vizsgálatban teszteltünk egér-Mab-425 ellenanyaggal szemben. Míg a tisztított 425-scFv-fragmens az adott koncentrációtartomány alkalmazása mellett képes volt az egér-MAb-425 ellenanyag EGFRreceptorhoz történő kötődését gátolni, az L3-11D és S4-2D ezen koncentrációk mellett nem gátolta az egérMAb-425 ellenanyag EGFR-receptorhoz történő kötődését. A fenti két scFv-fragmens úgy tűnik, az egérMAb-425 ellenanyagtól eltérő epitópokat ismer fel az EGFR-receptoron.

(4) scFv-fragmensekből előállított kiméra, teljes ellenanyagok.

Két scFv-fragmenst (L3-11D és S4-2D) választottunk ki, hogy azokból teljes ellenanyagmolekulákat állítsunk elő. Az egér-V_H- és -Vkfragmenseket immunoglobulin szignálszekvenciákat és összekapcsolási („splice”) donorszignálokat tartalmazó köztivektorokba klónoztuk (3. ábra). A V_H köztivektorban a klónozási helyek elhelyezkedése azzal a következménnyel járt, hogy a V_H-fragmensben az első aminosav aszparaginsavról glutaminsavra cserélődött. A köztivektorokból, a most már szignálszekvenciákkal és összekapcsolási („splice”) donorszekvenciákkal ellátott V_H- és Vk-régiókat tartalmazó DNSfragmenseket humán gamma-1 konstans régiót vagy humán kappa konstans régiót kódoló DNS-eket tartalmazó emlőssejt expressziós vektorokba klónoztuk [Maeda és munkatársai: Hűm. Antibod. Hybridomas 2, 124 (1991)]. Valamennyi kiméra ellenanyag esetében, a nehézlánc és könnyűlánc expressziós vektorokat együttesen COS-sejtekbe transzfektáltuk. Pozitív kontrollként a sejteket kiméra-425 ellenanyagot kódoló nehézlánc és könnyűlánc expressziós vektorokkal expresszáltuk együtt [Kettleborough és munkatársai: Protein Eng. 4, 773 (1991)]. A sejtekről tápfolyadékot gyűjtöttünk, és ELISA-eljárással meghatároztuk az abban található ellenanyagok koncentrációját, valamint az ellenanyagok kötődési képességét az EGFR-receptorhoz (4. ábra). Amikor az antigénhez történő maximális kötődés felének eléréséhez szükséges ellenanyag-koncentrációkat összehasonlítottuk, azt találtuk, hogy a kiméra S4-2D ellenanyag a kiméra-425 ellenanyaggal azonos mértékben kötődött az EGFR-receptorhoz. A kiméra L3-11D ellenanyag kötődésének mértéke az EGFR-receptorhoz azonban, körülbelül négyszer alacsonyabb volt, mint a kiméra-425 ellenanyagé. A kiméra-425 ellenanyag affinitása [Kettleborough és munkatársai: Protein Eng. 4, 773 (1991)] kompetíciós kötődési vizsgálattal történő meghatározás alapján 1,9 χ 10⁸ (mol/1)¹ volt. A fenti eredmények azért voltak meglepőek, mivel az scFvfragmensek analízisével kapott adatok arra utaltak, hogy mind az S4-2D, mind az L3-11D scFvfragmens jobban kötődik az EGFR-receptorhoz, mint a 425-scFv-fragmens (2. ábra). Protein-A alkalmazásával tisztított, kiméra L3-11D és S4-2D ellenanyagmintákat SDS-PAGE-eljárással analizáltunk redukáló és nem redukáló feltételek mellett „Flow-citometriás” eljárással teszteltük a kiméra L3-11D és S4-2D ellenanyagok kötődését A431 és SK-MEL-23 sejtekhez is. Mindkét kiméra ellenanyag jól kötődött az EGFR-expresszáló A431 sejtekhez és nem kötődött az EGFR-negatív SK-MEL-23 sejtekhez.

(5) Terápiás és diagnosztikai célú alkalmazás

A találmány szerinti ellenanyagfragmensek és teljes ellenanyagok terápiás célból beadhatók humán betegeknek. A találmány tárgyát képezi tehát aktív összetevőként a fentiekben és az igénypontokban definiált, legalább egy ellenanyagot vagy ellenanyagfragmenst, valamint egy vagy több gyógyászatilag elfogadható hordo8

HU 221 001 Bl zó segédanyagot, kötőanyagot vagy hígítóanyagot tartalmazó gyógyászati készítmény.

Tipikusan, a találmány szerinti ellenanyagot intravénásán vagy parenterálisan adjuk be. Általánosságban, az ellenanyagffagmensek beadható dózistartománya elég nagy a kívánt tumorszupresszáló vagy tumorizáló hatás kiváltásához. A dózis függ az életkortól, az általános állapottól, nemtől, a betegben a betegség előrehaladottságának fokától, és a dózis 0,1 mg/kg-200 mg/kg között, előnyösebben 0,1 mg/kg-100 mg/kg között változhat, naponta egy vagy több dózisban, egy vagy több napig adagolva.

Parenterális beadásra alkalmas készítmények steril vizes vagy nemvizes oldatok, szuszpenziók vagy emulziók lehetnek. Nemvizes oldószerek lehetnek például polipropilénglikol, növényi olajok, mint például olívaolaj, injektálható szerves észterek, mint például etiloleát, valamint egyéb, a célnak megfelelő, a technika állása szerint ismert oldószerek. A találmány szerinti ellenanyagok alkalmazhatók egy fiziológiásán elfogadható hordozó segédanyagot tartalmazó készítményben. Ilyen megfelelő hordozó segédanyagok például a fiziológiás sóoldat, PBS, Ringer-oldat vagy laktátos Ringer-oldat. A gyógyászati készítmény tartalmazhat ezenkívül tartósítószereket, vagy más adalékanyagokat, mint például antibiotikumokat, antioxidánsokat, és kelátorokat.

Az ellenanyagokat (fragmenseket) citotoxicitásuk fokozása céljából ismert eljárásokkal citokinekkel, például IL-2-vel konjugálhatjuk.

A találmány szerinti gyógyászati készítmények alkalmasak valamennyi típusú tumor, például melanomák, gliomák, és karcinómák, valamint keringésirendszereredetű tumorok és körülhatárolt tumorok kezelésére.

Diagnosztikai célokra az ellenanyagok konjugálhatók például röntgensugárzás számára átlátszatlan festékkel vagy radioaktívan jelölhetők. Előnyös jelölési eljárás a „Iodogen”-módszer. Diagnosztikus célra az ellenanyagot előnyösen F(ab’)2-fragmensekként vagy scFvfragmensekként adjuk be. Ez olyan kiváló eredményt ad, hogy nincs szükség a háttér kivonására.

A találmány szerinti megoldást a pontosabb értelmezhetőség céljából a továbbiakban konkrét megvalósítási példákon keresztül kívánjuk szemléltetni.

1. példa

A431 vezikulumok

Levált membránvezikulumokat a korábbiakban ismertetett, kismértékben módosított eljárás szerint állítottunk elő [Cohen és munkatársai: J. Bioi. Chem. 257, 1523 (1982); Yeaton és munkatársai: J. Bioi. Chem. 258, 9254 (1983)]. Összefüggő A431 sejttenyészetet tartalmazó palackokat kalciumot és magnéziumot tartalmazó PBS-sel mostunk. A palackokhoz hipotóniás PBS-t adtunk és 15 percig ráztuk. A sejteket ezután vezikulumképző pufferrel mostuk (100 mmol/1 NaCl, 50 mmol/1 Na₂HPO₄, 5 mmol/1 KC1, 0,5 mmol/1 MgSO₂, pH 8,5). A palackokhoz vezikulumképző puffért adtunk és a palackokat rázás mellett, szobahőmérsékleten és 37 °C-on tartottuk. Ezután a puffért fémszűrőn át, jégre állított 50 ml-es csövekbe beöntöttük, és 150 g mellett, 5 percig, 4 °C-on centrifugáltuk. Az üledéket kidobtuk és a felülúszót 39 000 rpm mellett, 90 percig ultracentrifúgáltuk. Az így kapott üledéket 10 mmol/1 Hepes-pufferben (pH 7,4) szuszpendáltuk. A vezikulumokból származó EGFR analízise céljából a mintákat 9 térfogat etanollal precipitáltuk, 0,08 mol/1 Tris-pufferben szuszpendáltuk (pH 6,8), és standardként MAb-425 ellenanyag alkalmazása mellett SDSPAGE-analízist végeztünk.

A készítmények proteintartalmát módosított „Coomassie Plus” eljárással határoztuk meg, standardként BSA-t alkalmaztunk, és a leolvasást 595 nm-en végeztük. A vezikulumokból származó EGFR analízise céljából a mintákat 9 térfogat etanollal (egy éjszakán át, 4 °C-on) precipitáltuk. Az üledéket Trispufferben szuszpendáltuk (0,08 mol/1, pH 6,8), majd SDS-PAGE-analízist végeztünk [5%-os felső gél („stacking” gél), 1 óra, 35 mA; 10%-os futtató (alsó) gél, 2,5 óra, 40 mA], A mintákat és standardokat duplikátumban alkalmaztuk. Az egyiket „Coomassie Blue” festékkel festettük, a másikat nitrocellulóz lapokra biotoltuk (12 V, 16 óra, 4 °C), és egér-MAb-425 ellenanyaggal (anti-EGFR ellenanyaggal), majd alkalikus foszfatázzal konjugált, anti-egér IgGellenanyaggal kezeltük.

Az in vitro immunizációk során három tápfolyadékot alkalmaztunk. Ezek az alábbiak voltak: 1. tápfolyadék (Ml), 2. tápfolyadék (M2) és kevert timocita tápfolyadék („Mixed Thymocyte Culture Médium”) (MTC). Az Ml 50 mmol/1 2-merkaptoetanollal és 2 mmol/1 L-Glutaminnal (Gibco) kiegészített HL1 tápfolyadék volt (Ventrex Laboratories, USA). Az M2 tápfolyadék 50 mmol/1 2-merkaptoetanollal, 40 egység/ml IL-2-vel (Genzyme), 20 mg/ml adjuváns peptiddel („Adjuvant Peptid”, Sigma), 2 mmol/1 L-glutaminnal, 100 egység/ml penicillinnel (Gibco) és 100 mg/ml streptomycinnel kiegészített HL1 tápfolyadék volt (Ventrex Laboratories, USA). Az M2 tápfolyadékhoz 4% vagy 20% FCS-t (Biological Industries) adtunk. Az MTC tápfolyadékot Vaux eljárása szerint állítottuk elő (1). Röviden, háromhetes korú Balb/c- és C57/BL-1 egerek timuszából különálló sejteket tartalmazó sejtszuszpenziót állítottunk elő oly módon, hogy a csecsemőmirigyet (timuszt) steril 50 „mesh” méretű szitán átnyomtuk. A sejtszuszpenziót összegyűjtöttük, HBSSpufferrel kétszer mostuk, és az élő sejtek számát tripánkék festékkizárásos módszerrel meghatároztuk. Ezt követően, a timocitákat 4% FCS-t, 2 mmol/1 Lglutamint, 100 egység/ml penicillint és 100 mg/ml streptomycint tartalmazó HL1 tápfolyadékban az egyes törzsekre vonatkoztatva, milliliterenként 2,5xlO⁶ sejtdenzitás eléréséig tenyésztettük. Negyvennyolc óra elteltével a felülúszókat eltávolítottuk, 0,22 mm-es szűrőn átszűrtük, és -70 °C-on tároltuk.

Nem immunizált, nyolchetes korú Balb/c-egerekból származó lépsejtszuszpenziót a timociták esetében leirt módszerrel állítottunk elő. Az élő sejtek számát tripánkék festékkizárásos módszerrel határoztuk meg.

HU 221 001 Bl

2. példa

In vitro immunizáció és szűrővizsgálat

Az in vitro immunizáció során három tápfolyadékot alkalmaztunk. Ezek az alábbiak voltak: 1. tápfolyadék (Ml), 2. tápfolyadék (M2) és kevert timocita tápfolyadék („Mixed Thymocyte Culture Médium”) (MTC). Az Ml 50 mmol/1 2-merkaptoetanollal és 2 mmol/1 LGlutaminnal (Gibco) kiegészített HL1 tápfolyadék volt (Ventrex Laboratories, USA). Az M2 tápfolyadék 50 mmol/12-merkaptoetanollal, 40 egység/ml IL-2-vel (Genzyme), 20 mg/ml adjuváns peptiddel („Adjuvant Peptid”, Sigma), 2 mmol/1 L-glutaminnal, 100 egység/ml penicillinnel (Gibco) és 100 mg/ml streptomycinnel kiegészített HL1 tápfolyadék volt (Ventrex Laboratories, USA). Az M2 tápfolyadékhoz 4% vagy 20% FCS-t (Biological Industries) adtunk. Az MTC tápfolyadékot Vaux eljárása szerint állítottuk elő (1). Röviden, háromhetes korú Balb/c- és C57/BL-1 egerek timuszából különálló sejteket tartalmazó sejtszuszpenziót állítottunk elő oly módon, hogy a csecsemőmirigyet (timuszt) steril 50 „mesh” méretű szitán átnyomtuk. A sejtszuszpenziót összegyűjtöttük, HBSS-pufferrel kétszer mostuk, és az élő sejtek számát tripánkék festékkizárásos módszerrel meghatároztuk. Ezt követően, a timocitákat 4% FCS-t, 2 mmol/1 Lglutamint, 100 egység/ml penicillint és 100 mg/ml streptomycint tartalmazó HL1 tápfolyadékban az egyes törzsekre vonatkoztatva, milliliterenként 2,5 xlO⁶sejtdenzitás eléréséig tenyésztettük. Negyvennyolc óra elteltével a felülúszókat eltávolítottuk, 0,22 mm-es szűrőn átszűrtük, és -70 °C-on tároltuk.

Nem immunizált, nyolchetes korú Balb/c-egerekból származó lépsejtszuszpenziót a timociták esetében leírt módszerrel állítottunk elő. Az élő sejtek számát tripánkék festékkizárásos módszerrel határoztuk meg.

Háromhetes korú Balb/c- és C57/BL-1 egerek timuszából különálló sejteket tartalmazó sejtszuszpenziót állítottunk elő oly módon, hogy a csecsemőmirigyet (timuszt) steril 50 „mesh” méretű szitán átnyomtuk. A sejtszuszpenziót összegyűjtöttük, HBSSpufferrel mostuk, és az élő sejtek számát tripánkék festékkizárásos módszerrel meghatároztuk. Ezt követően, a timocitákat 4% FCS-t, 2 mmol/1 L-glutamint, 100 egység/ml penicillint és 100 pg/ml streptomycint tartalmazó HL1 tápfolyadékban az egyes törzsekre vonatkoztatva, mililiterenként 2,5xlO⁶ sejtdenzitás eléréséig tenyésztettük. Negyvennyolc óra elteltével a felülúszókat eltávolítottuk, átszűrtük, és tároltuk. Nem immunizált, nyolchetes korú Balb/c-egerekből származó lépsejtszuszpenziót a timociták esetében leírt módszerrel állítottunk elő. Az élő sejtek számát tripánkék festékkizárásos módszerrel határoztuk meg.

Az in vitro immunizációt 6 mélyületű lemezeken (Costar) végeztük. A rekeszekben 3,5 ml térfogatú Ml tápfolyadékban [50 pmol/1 2-merkaptoetanollal és 2 mmol/1 L-Glutaminnal (Gibco) kiegészített HL1 tápfolyadékban (Ventrex Laboratories, USA)] 10⁷ lépsejtet inkubáltunk, a kívánt koncentrációban EGFR-t tartalmazó vezikulumok jelenlétében (37 °C-on, 5% CO₂mellett). A kontrollrekeszekhez EGFR-receptort nem expresszáló sejtekből származó vezikulumokat vagy PBS-t adtunk. Néhány óra múlva valamennyi mélyülethez 3,5 ml, 4% vagy 10% FCS-t (Biological Industries) tartalmazó M2 tápfolyadékot adtunk, [amely 50 pmol/1

2-merkaptoetanollal, 40 egység/ml IL-2-vel (Genzyme), 20 pg/ml adjuvánspeptiddel (,Adjuvant Peptid”, Sigma), 2 mmol/1 L-glutaminnal, 100 egység/ml penicillinnel (Gibco) és 100 pg/ml streptomycinnel kiegészített HL1 tápfolyadék volt (Ventrex Laboratories, USA)]. Egyes kísérletekben az M2 tápfolyadékot adjuváns peptiddel (20 pg/ml) és IL-2-vel (40 egység/ml) kiegészített MTC tápfolyadékkal (kevert timocita tápfolyadékkal) helyettesítettük [Vaux és munkatársai: Natúré. 336, 36 (1988).]. (Megjegyezzük, hogy az FCS, IL-2 és adjuváns peptid végkoncentrációja a tenyészetben ennél 50%-kal kisebb.) A sejteket 72, 96, 120 vagy 144 óráig a fentiekkel megegyező feltételek mellett inkubáltuk, végül, a sejteket specifikus immunglobulin jelenlétére teszteltük vagy azokból RNS-t izoláltunk.

A szűrővizsgálatot tisztított antigénekkel vagy fixált A431 sejtekkel végeztük. Az eljárás némi módosítással, lényegében megegyezett a korábban leírt eljárással [Caroll és munkatársai: Hybridoma 9, 81 (1990)]. Röviden, steril, 96 mélyületű lemezeket egy éjszakán át, PBS-ben oldott, tisztított EGFR-receptorral (2,5 pg/ml), GD3-ganglioziddal (2 pg/ml), vagy ribonukleázzal (10 pg/ml) fedtünk. Amennyiben antigénként A431 sejteket alkalmaztunk, a sejteket 96 mélyületű lemezeken egyrétegű tenyészet kialakulásáig tenyésztettük és 0,1%-os glutáraldehiddel fixáltuk. Az in vitro immunizált limfocitákat mostuk, 5xlO⁵sejt/ml sűrűség eléréséig 2% fotális boíjúszérummal és 2 mmol/1 L-glutaminnal kiegészített HL1 tápfolyadékban szuszpendáltuk, valamennyi mélyülethez lxlO⁵sejtet adtunk, és a sejteket 48 óráig (37 °C-on, 5% CO₂mellett) inkubáltuk. Valamennyi csoport esetében tizenhat duplikátumot készítettünk. Ezt követően, a limfocitákat 0,1% Tween-20-at tartalmazó PBS-sel történő ötszöri mosással eltávolítottuk. A specifikus immunglobulinokat peroxidázzal jelölt, nyálban termelt anti-egér-immunglobuliimal (Dako) mutattuk ki (1 óra, 37 °C). Szubsztrátként citrát-foszfát-pufferben (0,55 mg/ml) oldott 2,2’-azino-bisz(3-etilbenz-tiazolin6-szulfonsav)-diammóniumsót (ABTS) (Sigma) használtunk.

3. példa

A génkönyvtárak előállítása

Három fág ellenanyag-génkönyvtárat állítottunk elő, egyet intraperitoneálisan A431 sejtekkel immunizált egér lépéből [Murthy és munkatársai: Arch. Biochem. Biophys. 252, 549 (1987)], egyet talpon keresztül, tisztított EGFR-receptorral immunizált egér térdhajlati nyirokcsomójából, egyet pedig in vitro A431 vezikulumokkal immunizált egérsejtekből nyert RNS alapján. Első cDNS-szálat szintetizáltunk. A V_Hés Vk-géneket PCR-eljárással amplifikáltuk és összeállítottuk [Clackson és munkatársai: Natúré 352, 624 (1991)]. PCR-technikával a ffagmenseket NotI és

HU 221 001 Β1

Sfil restrikciós hasítási helyekkel toldottuk meg, és az scFv-ftagmenseket pHENl fágmid-vektorba klónoztuk [Hoogenboom és munkatársai: Nucl. Acids Rés. 19, 4133 (1991)]. A ligálási reakció termékét elektroporációval E. co/z'-sejtekbe juttattuk, a kapott telepeket lekapartuk és tápfolyadékba tettük, hogy génkönyvtártörzstenyészeteket kapjunk [Marks és munkatársai: J. Mól. Bioi. 222, 581 (1991)].

4. példa

A génkönyvtárak átvizsgálása A génkönyvtárakból M13K07 „helper-fág” alkalmazásával (Promega, Madison, WI) fág ellenanyagokat szabadítottunk fel [Marks és munkatársai: J. Mól. Bioi. 222, 581 (1991)]. Immunvizsgálat céljára készült csöveket („Immunotube”, Nunc, Life Sciences, Paisley, UK) egy éjszakán át, 4 ml, 2,5 pg/ml koncentrációjú, PBSben oldott EGFR-receptorral fedtünk. PBS-sel végzett három mosást követően a csöveket legalább egy óráig, 37 °C-on, 2% tejport tartalmazó PBS-pufferrel (PBSMpufferrel) inkubáltuk. A fágokat (10¹²—10¹³) 4 ml PBSM-pufferben szuszpendáltuk, és az EGFRreceptorral fedett csövekben 1 óráig, szobahőmérsékleten inkubáltuk. A csöveket hússzor 0,1% Tween-t tartalmazó PBS-sel, majd hússzor PBS-sel mostuk. A kötődött fágokat 10 percig, 1 ml térfogatú, 0,1 mol/1 trietilaminnal, rotációs keverővei végzett inkubálást követően eluáltuk. Az eluált fágokat 0,5 ml, 1 mol/1 TrisHCl (pH 7,5) hozzáadásával neutralizáltuk, majd azokkal log-fázisú, E. coli TG1 törzshöz tartozó sejteket fertőztünk. A fertőzött sejteket kioltottuk és különálló telepeket választottunk scFv-fragmensek kis mennyiségű indukciója céljára. A megmaradt telepeket tápfolyadékba kapartuk, és abból vettünk mintát, hogy a következő vizsgálati körhöz fágokat állítsunk elő.

5. példa scFv-fragmensek előállítása és analízise A korábbiakban leírtak szerint [Kettleborough és munkatársai: lásd fent] oldható scFv-ffagmenseket állítottunk elő E. coli HB2151 törzsben. A baktérium felülúszóban az scFv-fragmensek koncentrációját ismert koncentrációjú, tisztított scFv-fragmens készítmény standardként történő alkalmazásával határoztuk meg. A felülúszókat szűrtük, és 0,1% koncentráció eléréséig nátrium-azidot adtunk hozzájuk. A felülúszókból és a standardból készített sorozathígításokat 96 mérőhelyes „dot-blot”-készülékkel foltok formájában Immobilon-PVDF filterekre vittünk fel. A filtereket Westem-blot-analízisnél alkalmazott eljárás szerint kezeltük [Towbin és munkatársai: Proc. Nat. Acad. Sci. USA 76, 4350 (1979)]. Az scFv-ffagmenseket a C-terminális-toldalék ellen termelt ellenanyag [Munro és Pelham: Cell 46, 291 (1986)], majd peroxidázzal konjugált, kecskében termelt anti-egér IgG- és IgM-ellenanyagok (Jackson ImmunoResearch Láb Inc., West Grove, PA) alkalmazásával mutattuk ki. A reakciót az ECL-rendszer (Amersham, Aylesbury, UK) alkalmazásával hívtuk elő. Denzitométerrel, előzőleg villanásszerűen megvilágított („pre-flashed”) autoradiogramokat tapogattunk le.

Standard görbét készítettünk, és annak alapján a felülúszókban meghatároztuk az scFv-fragmensek koncentrációját.

Antigén-kötődési ELISA-vizsgálatokat EGFRreceptorral (2,5 pg/ml) lemezek alkalmazásával végeztünk. Az scFv-fragmenseket tartalmazó felülúszókat PBSM-pufferben hígítottuk és a lemezekhez adtuk. A kötődött scFv-ffagmenseket a fent leírtak szerint, 9E10-ellenanyagok alkalmazásával mutattuk ki. A felülúszókat egy sor semleges proteinhez és műanyaghoz történő kötődésre is teszteltük. ELISA-lemezeket egy éjszakán át, 100 pg/ml koncentráció mellett, ovalbuminnal, tyúktojás-lizozimmal, citokróm-c-vel, glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenázzal, egéralbuminnal (CBA-törzs), valamint BSA-val fedtünk. A fedett lemezekhez duplikátumokban, 2% tejport tartalmazó, hígítatlan felülúszót adtunk, és a kötődött scFv-fragmenseket a fent leírtak szerint kimutattuk.

A sejtkötődési ELISA-vizsgálatokat tumorsejtvonalak, nevezetesen A431 (ATCC CRL 1555), MDA-MB-468 (ATCC HTB 132) és SK-MEL-23 (negatív kontroll) sejtvonalak alkalmazásával végeztük. A sejteket poli-D-lizinnel kezelt, 96-mélyületű szövettenyésztő lemezeken (Nunc) összefüggő sejttenyészet kialakulásáig tenyésztettük. A sejteket DMEM-pufferrel mostuk, és 37 °C-on, 2 óráig, 2,5% BSA-t tartalmazó PBS-sel blokkoltuk. A leszívást követően valamennyi mélyülethez felülúszót, valamint azzal megegyező térfogatú, 4% tejport tartalmazó 2xYT-tápfolyadékot adtunk, és a sejteket 1 órán át, 4 °C-on inkubáltuk. A kötődött scFvfragmenseket a fent leírtak szerint mutattuk ki.

Kompetíción alapuló ELISA-vizsgálatot végeztünk oly módon, hogy EGFR-receptorral fedett lemezeket 50 pl tisztított scFv-fragmenssel (100 pg/ml) 10 percig előinkubáltunk. A lemezekhez MAb-425 ellenanyagot (50 pl) adtunk 3,13-200 ng/ml koncentrációkban. Az inkubációt és mosást követően a kötődött MAb-425 ellenanyagokat kecskében termelt, antiegér IgG- és IgM-ellenanyagok alkalmazásával mutattuk ki.

6. példa

DNS-analízis

A BstNI-ujjlenyomat készítéséhez az egyes kiónokból származó scFv-fragmens-inszerteket PCReljárással amplifikáltuk, és a terméket BstNI-enzimmel emésztettük [Clackson és munkatársai: Natúré 352, 624 (1991)]. A DNS-t Sequenase-reagenskészlet alkalmazásával szekvenáltuk (United States Biochemicals, Clevland, OH).

7. példa

Az scFv-fragmensek tisztítása

A bakteriális felülúszókat centrifügálással feltisztítottuk, 0,2 pm áteresztőképességű filtereken átszűrtük, majd 1 ml térfogatú, cianogén-bromiddal aktivált „Sepharose-4B”-hez (Pharmacia, Uppsala, Svédország) kötött, tisztított EGFR-receptort (5 mg) tartalma11

HU 221 001 Bl zó oszlopra vittük fel. Az oszlopot 30 ml PBS-sel, majd 5 ml 0,2 mol/1 glicinnel (pH 5,0) mostuk. Az scFvfragmenseket 0,2 mol/1 glicin/HCl oldattal (pH 2,8) eluáltuk. Az eluátumot 10 χ PBS-pufferrel neutralizáltuk. A proteintartalmú frakciókat összegyűjtöttük, és puffért ultrafiltrációval (Amicon, Stonehouse, UK) 1% BSA-t és 0,05% nátrium-azidot tartalmazó PBS-re cseréltük.

8. példa

A tisztított scFv-fragmensekFACS-analízise

A431 sejteket tripszinnel kezeltünk és 10% FCS-t tartalmazó DMEM-ben inkubáltunk. A sejteket hideg DMEM-pufferrel kétszer mostuk, és 45 pm áteresztőképességű filteren átszűrtük. A sejteket (10⁶) 30 percig, jégen, 50 μΐ térfogatú, 1% BSA-t tartalmazó PBSben oldott, tisztított scFv-fragmensekkel inkubáltuk. Hideg PBS-pufferrel végzett két mosást követően a kötődött scFv-fragmenseket 50 μΐ FITC-konjugált 9E10 ellenanyag (100 pg/ml) alkalmazásával mutattuk ki. Miután a sejteket 30 percig jégen tartottuk, azokat PBS-sel egyszer mostuk, 1% formaldehidet tartalmazó PBS-sel fixáltuk, és FACSCAN-készülékkel (Becton-Dickinson, Cowley, UK) analizáltuk.

9. példa

Teljes, kiméra-ellenanyagok előállítása, analízise és expresszálása

PstI és BstEII hasítási helyek felhasználásával a kiválasztott scFv-fragmensek V_H-régióit kódoló DNSeket humán-HG3-CL ellenanyagból [Rechavi és munkatársai: Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80, 855 (1983)] származó eukarióta szignálszekvenciát és összekapcsolási donorhelyet tartalmazó, V_H köztivektorba szubklónoztuk (3. ábra). A Vk-régiókat kódoló DNSeket Vk köztivektorba történő inszertálás céljából PCR láncinditó oligonukleotidok alkalmazásával úgy módosítottuk, hogy azok az 5’- és 3’-végeken Xhol és SstI hasítási helyeket tartalmazzanak:

[Vk „Fór” (előre irányuló):

5’-CCG TTT CAG CTC GAC CTT GGT CCC-3’, Vk Back” (visszafelé irányuló):

5’-GAC ATT GAG CTC ACC CAG TCT CCA3’]. Az Sstl-Xhol ffagmenseket átalakított humán CAMPATH-1 könnyűláncból származó eukarióta szignálszekvenciát [Riechmann és munkatársai: Natúré 332, 21 (1988)] és összekapcsolási donorhelyet tartalmazó Vk köztivektorba klónoztuk (3. ábra). A variábilis régiókat valamint eukariótahatároló („flanking”) régiókat kódoló DNS-eket HindlII-BamHIfragmensekként humán-gamma-1 konstans régiót vagy humán kappa konstans régiót kódoló genomi DNS-t tartalmazó emlőssejt expressziós vektorba klónoztuk [Maeda és munkatársai: Hűm. Antibod. Hybridomas 2, 124 (1991)]. A nehézlánc és könnyűlánc expressziós vektorokat elektroporációval COS-sejtekbe juttattuk. 72 óra elteltével a tápfolyadékot összegyűjtöttük, és a kiméra anti-EGFR ellenanyagokat ELISA-eljárással analizáltuk [Kettleborough és munkatársai: Protein Eng. 4, 773 (1991)].

10. példa

In vitro immunizált sejtekből származó scFvfragmensek előállítása

Az alábbiakban leírt eljárások a fent ismertetett eljárások kismértékben módosított változatai. Az immunizálást, a génkönyvtárak előállítását és átvizsgálását az 1-4. példákban leírtak szerint végeztük. Az azt követő lépéseket az alábbiakban részletesen ismertetjük.

Az elsődleges génkönyvtár, valamint a három lépésben végrehajtott „panning”-eljárás után nyert kiónok vizsgálatát követően néhány különálló, ampicillinrezisztens kolóniát választottunk ki. Alkalikus lizálással fágmid DNS-t állítottunk elő, és hő-sokk alkalmazásával egy nem szupresszor törzset, közelebbről, E. coli HB2151 törzset transzfektáltunk. Telepeket 2 xTY-Amp-Glu-tápfolyadékba oltottunk, és egy éjszakán át, 30 °C-on tenyésztettünk. Egy 5 ml térfogatú mintával 50 ml térfogatú, 100 mg/ml ampicillint és 0,1% glükózt tartalmazó 2xTY-tápfolyadékot oltottunk be, és 1 órán át (a „log”-fázis eléréséig), rázás mellett, 30 °C-on folytattuk a tenyésztést. A sejteket összegyűjtöttük, és az oldható scFv-fragmensek expresszálódását 1 mmol/1 végkoncentrációig izopropil-P-D-tiogalaktopiranozid (IPTG) hozzáadásával indukáltuk [De Bellis D. és Schwartz I.: Nucleic Acids Rés. 18, 1311 (1990)]. A tenyészeteket egy éjszakán át, 30 °C-on, rázás mellett tenyésztettük. Az scFvfragmenseket tartalmazó felülúszókat centrifugálással feltisztítottuk, és 0,22 mm-es szűrőn átszűrtük és teszteltük. A bakteriális felülúszókat a fent leírtak szerint, ELISA-eljárással EGFR-receptorhoz történő kötődésre teszteltük [Kettleborough és munkatársai: EP 94 104 160; és Eur. Immunoi. 24, 952 (1994)]. Kiválasztott scFv-fragmensek specifitását ELISA-eljárással vizsgáltuk különböző, EGFR-receptorral rokonságot mutató vagy EGFR-receptorral rokonságot nem mutató proteinekkel vagy egyéb antigénekkel fedett lemezek, valamint műanyagok alkalmazásával. Az alábbi antigéneket alkalmaztuk: RN-áz, BSA, ÓVA, GD₃gangliozid, vitronektin-receptor (VNR), IlblIIa vérlemezke-glikoprotein (GPIIblIIa), és diszialil-laktoN-tetraóz (DSLNT). A fedést egy éjszakán át, az egyes antigének esetében optimális koncentráció mellett végeztük. A fedett ELISA-lemezeket 1 órán át, 37 °C-on, PBS-ben (vegyes %) oldott 1,5% fölözött tejporral fedtük. Mosást követően a mikrotitráló lemezek mélyületeihez 100 μΐ scFv-ffagmenst tartalmazó felülúszót adtunk, és a lemezeket 2 órán át, 37 °C-on inkubáltuk. A kötődött scFv-fragmenseket a 9E10 antic-myc ellenanyag (Mycl-9E10,2 hibridoma kondicionált tápfolyadéka), valamint alkalikus foszfatázzal konjugált, nyúlban termelt anti-egér ellenanyag (Dako) alkalmazásával mutattuk ki.

Három EGFR-receptort hordozó tumorsejtvonalat, az A431, az MDA-MB-231 humánemlő-adenokarcinóma (ATCC, HTB 26) és a HT29 humánvastagbéladenokarcinóma (ATCC, HTB 38) sejtvonalakat, valamint egy EGFR-receptort nem expresszáló, WM-164 jelzésű sejtvonalat használtunk az scFvfragmensek sejteken található EGFR-receptorhoz való

HU 221 001 Bl kötődési képességének tesztelésére, FACS-analízis és immunfluoreszcencia alkalmazásával, fixálatlan sejteken. Az indirekt fluoreszcencia-analízishez a sejteket Terasaki-lemezekre oltottuk (2 x1ο⁴ sejt/mélyűlet) és 24 óráig tenyésztettük. Ezután a sejteket 90 percig, szobahőmérsékleten, 20 ml térfogatú, az scFvfragmenseket tartalmazó nyers, bakteriális felülúszóval inkubáltuk. Az első ellenanyaggal (anti-c-myc) és második ellenanyaggal történő inkubálást 60-60 percig, szobahőmérsékleten végeztük. A második ellenanyagot, amely FITC-konjugált, nyúlban termelt anti-egér ellenanyag volt (Dako) 1:20 arányban hígítottuk.

A FACS-analízishez 5 χ 10⁵ sejtet 1% BSA-t és 0,1% nátrium-azidot tartalmazó PBS-sel (PBS-BSA) mostunk, és 20 percig, 4 °C-on, 50 ml térfogatú, nyers bakteriális felülúszóval inkubáltunk. Hideg PBS-BSApufferrel végzett két mosást követően a kötődött scFvffagmenseket anti-c-myc ellenanyaggal és 1:25 arányban hígított, FITC-konjugált, kecskében termelt antiegér ellenanyaggal (Becton-Dickinson) mutattuk ki. A sejtekhez 5 mg/ml végkoncentrációban propidiumjodidot (Pl) adtunk. Egy léghűtéses argonlézerrel felszerelt „EPICS Profile Il”-készülékkel „flow-citometriás” analízist végeztünk. A 488 nm hullámhosszot (15 mV) alkalmaztuk gerjesztésre. A FITC-emissziót egy 530 nm-es sávszűrővel, a PI-emissziót egy 625 nm-es sávszűrővel gyűjtöttük. Élő sejteket szelektáltunk az előreeső fényszórás (a sejt granuláltságának a mértékére jellemző) és az oldalirányú szórás (a sejt méretére jellemző) adatainak pontdiagramon történő ábrázolása és a PI-festődött sejtek kizárása alapján.

Az elsődleges és a szelektált génkönyvtárak változatosságát klónozott fragmensek PCR-amplifikációjával [Güssow D. és Clackson T.: Nucleic Acids Rés. 17, 4000 (1989)] és a BstNI emésztéssel kapott minták analízisével (8) határoztuk meg. Néhány kiónt Sequenasereagenskészlet alkalmazásával (USB), didezoxiláncterminációs eljárással szekvenáltunk [Sanger F. és munkatársai: Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74, 5463 (1977)].

Nyers bakteriális felülúszókat (10 μΐ) SDS-PAGEeljárással, 12,5%-os gélen vizsgáltunk. Westem-blotanalízist végeztünk, lényegében Towbin leírása szerint [Towbin és munkatársai: J. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 76, 4350 (1979)]. A proteineket elektrobloteljárással Immobilon-P (Millipore) vagy nitrocellulóz (Bio-Rad) membránokra vittük át. A blotot 2% (vegyes %) fölözött tejet tartalmazó PBS-sel blokkoltuk. Az scFv-fragmenseket anti-wyc-ellenanyag (9E10 ellenanyag), peroxidázzal konjugált, anti-egér ellenanyag (Jackson) és erősített kemilumineszcens rendszer (ECL, Amersham) alkalmazásával mutattuk ki.

A levált membránvezikulumok kvantitatív analízise szerint az összproteinkoncentráció 2,5 mg/ml volt, melynek csak 10-14%-a, azaz 250-350 ng/ml képviselt EGFR-receptort [Sato és munkatársai: J. Natl. Cancer Inst. 21, 1601 (1989); Yeaton és munkatársai : J. Bioi. Chem. 258, 9254 (1983)]. SDS-PAGEeljárással végzett elektroforetikus analízis, majd „Coomassie-blue” festékkel történő festés azt mutatta, hogy a vezikulumok igen összetett proteinkeveréket tartalmaztak. ProteindegradáciÓTa utaló jelet nem láttunk. Westem-blot-analízis alapján megállapítottuk, hogy az általunk alkalmazott kísérleti feltételek mellett a membránvezikulum készítményben teljes EGFreceptor-molekulák voltak jelen.

Az FCS- és limfokinszükségletet meghatározása céljából 20% vagy 4% FCS-t tartalmazó MTC és M2 tápfolyadékokat hasonlítottunk össze. Antigénként és kontrollként EGFR-tartalmú vezikulumokat, valamint PBSt alkalmaztunk. A lépsejteket 3 órán át, hat mélyületű lemezeken Ml tápfolyadékban (szérummentes tápfolyadékban) inkubáltuk antigén jelenlétében vagy anélkül. Ezt követően a sejtekhez MTC vagy M2 tápfolyadékot adtunk, és 72, 96,120 vagy 144 óra elteltével vizsgálatot végeztünk fixált A431 sejtek alkalmazásával. A visszanyert élő sejtek száma valamennyi kísérletben 20-40% közé esett, ami megegyezik korábbi közleményekben leírt eredményekkel [Gavilondo-Cowley J. és munkatársai: „In vitro Immunization in Hybridoma Technology”, „Elsevier Science Publishers Β. V.” Amszterdam, 131. oldal (1988)]. A specifikus válasz maximumát MTC alkalmazása mellett, a negyedik napon mértük; míg a 4% vagy 20% FCS-t tartalmazó (2% vagy 10% FCS-végkoncentrációjú) M2 tápfolyadék a hatodik napig késleltette a maximális válasz kialakulását (2. táblázat). Az MTC azonban 10% FCS mellett, valószínűleg poliklonális aktiválás révén, nem specifikus választ váltott ki, amint azt láttuk akkor, amikor az eredményeket a specifikus és nem specifikus válasz hányadosaként fejeztük ki. A további kísérletekben 4% FCS-t tartalmazó M2 tápfolyadék alkalmazása és 6 napos tenyésztés mellett döntöttünk.

Az EGFR jelenléte a vezikulumok felszínén erősen megnövelte az antigénre adott válasz mértékét. A fent leírthoz hasonló eljárás szerint, EGFR-t expresszáló és nem expresszáló sejtvonalakból származó vezikulumokat hasonlítottunk össze. Limfocitákat 3 órán át, Ml tápfolyadékban, vezikulumok jelenlétében inkubáltunk. Ezt követően, a sejtekhez 4% FCS-t tartalmazó M2 tápfolyadékot adtunk. Hat nap elteltével, az egyes csoportokból származó limfocitákat 48 óráig, EGFR-receptorral, fixált A431 sejtekkel, RNáz-zal vagy GD3-mal fedett, 96 mélyületű lemezeken inkubáltuk. A vártnak megfelelően, ezeknek a vizsgálatoknak az eredményei multispecifikus válaszmintát mutattak (3. táblázat). Az optikai denzitás alapján az EGFR-receptorral szemben kimutatható reaktivitás nyilvánvalóan nagyobb volt, amennyiben antigénként EGFR-expresszáló vezikulumokat alkalmaztunk.

Összefoglalva, ezek az eredmények arra utalnak, hogy az in vitro immunizációt követően, habár éretlen, de kimutatható mértékű, antigéndependens válasz jött létre, mely révén több, EGFR-receptorral szemben irányuló, variábilis régiók PCR-klónozására alkalmas, immunizált limfocitacsoport keletkezett.

Az in vitro immunizációt követően kapott scFvfragmensek pHENl fágmidba történő klónozását követően 1,1 χ 10⁵ klónból álló génkönyvtárat nyertünk. Ezt a génkönyvtárat két másik, in vivő immunizációval ka13

HU 221 001 Bl pott génkönyvtárral párhuzamosan állítottuk elő. Ezeknek a fág génkönyvtáraknak az előállítását a korábbiakban leírták [Kettleborough és munkatársai: EP 94 104 160; és Eur. J. Immunoi. 24, 952 (1994)].

Az EGFR-receptorhoz kötődő scFv-fragmensek szelektálása céljából a fágokat EGFR-receptorral fedett immuncsövek felhasználásával „panning”eljárásnak vetettük alá. Az eluált fágokkal SupE E. coli-törzset fertőztünk, összesen három szelekciós kört végeztünk. Mindegyik körben, a háttér kiszámítása céljából egy antigénmentes csövet teszteltünk párhuzamosan. Az első mosás során az immuncsőbe

1,5 χ 10¹⁰ fágrészecskét mértünk, és a fedett immuncsőből 6,6xlO⁴ fágrészecskét eluáltunk; míg a háttérpopulációból csupán 200 kolóniát kaptunk. A harmadik mosás során a csőbe 1 χ 10¹¹ fágrészecskét mértünk, és 5,6 χ 10¹⁰ fágrészecskét eluáltunk.

Az scFv-fragmensek további jellemzése céljából, a fágpopulációkból a szelekciót megelőzően és az egyes szelekciós köröket követően 22-22 kiónt választottunk ki.

A génkönyvtár változatosságát a klónozott fragmensek BstNI-enzimmel kapott emésztési mintája alapján analizáltuk. A szelekciót megelőzően a génkönyvtár rendkívül változatosnak tűnt. Az első szelekciós kört követően a kötődött kiónok emésztési mintája több azonos restrikciós mintával rendelkező csoport jelenlétére utalt.

A különböző szelekciós körökből a kiónok kiválasztása az emésztési minták alapján történt. A DNSszekvenálás a legtöbb szelektált kiónban eltérő szekvenciák jelenlétét mutatta. A 10D2, 5D3, 10E2, 1B3, 4B3 és 5E2 kiónokban található komplementeritást meghatározó régiók (CDR-régiók) hosszúsága és összetétele eltérő volt. A legtöbb variáció a V_H- és V_L-szekvenciák CDR3 régiójában volt megfigyelhető. A 5D3 és 1E3 kiónok a harmadik szelekciós körből származtak. Ezek ELISA-analízis és „flow cytometriás” vizsgálat alapján erősen kötődtek EGFR-receptorhoz, és azonos szekvenciával rendelkeztek.

Oldható scFv-fragmenseket a HB-2151 jelzésű, nem szupresszor E. coli-törzs IPTG jelenlétében történő tenyésztésével nyertünk.

Az scFv-termelődés igazolására, az egyes kiónokból származó bakteriális tápfolyadékot gélelektroforézissel analizáltuk. Western-blotanalízissel, egy körülbelül 35 000 kD nagyságú, jól kivehető csíkot mutattunk ki.

Az EGFR-receptorral szemben kötődési aktivitást mutató kiónokat ELISA-eljárással azonosítottuk. A szelektált kiónok keresztreaktivitásának vizsgálatára különböző antigének alkalmazásával ELISA-vizsgálatokat végeztünk. Az antigénekkel (EGFR, RN-áz, BSA, KLH, ÓVA, GD₃-gangliozid, vitronektin-receptor, IlblIIa vérlemezke-glikoprotein és diszialil-lakto-N-tetraóz) az optimális koncentráció alkalmazása mellett ELISA-lemezeket fedtünk (4. táblázat). A nem EGFR-antigénekhez nem volt kötődés kimutatható. Az scFv-fragmensek három EGFR-receptort hordozó tumorsejtvonalhoz (A431 humán epidermoid karcinóma, MDA-MB-231 humánemlő-adenokarcinóma és HT-29 humánvastagbél-adenokarcinóma sejtvonalakhoz) történő kötődését is teszteltük. Negatív kontrollként egy EGFR-receptort nem expresszáló, WM-164 jelzésű, humánmelanomasejtvonalat alkalmaztunk. A tumorsejtvonalakhoz kötődő kiónokat fixálatlan sejtek alkalmazásával, indirekt immunfluoreszcenciás eljárással is teszteltük, az eredményeket FACS-analízissel mennyiségileg meghatároztuk. A fixálatlan sejtek alkalmazása biztosítja a membránreceptorok természetes konformációjának megtartását. A pozitív kiónok A431 sejtek felhasználása mellett jól kivehető fluoreszcenciát mutattak. A többi EGFR-receptort hordozó tumorsejtvonal alkalmazása esetén gyenge fluoreszcenciát figyeltünk meg. A negatív sejtvonalhoz nem volt kötődés kimutatható. Az eredményeket „flow cytometriás” eljárással megerősítettük. Tizenhét pozitív kiónt és három negatív kiónt vizsgáltunk „flow cytometriás” eljárással A431, MDA-MB-231 és HT-29 sejtvonalakhoz történő kötődésre nézve. Negatív sejtvonalként WM-164 sejtvonalat alkalmaztunk. Pozitív kontrollként a 425-scFv-fragmenst (Pl kiónt), negatív kontrollként a klónozóvektort (HEN) alkalmaztuk. Az eredményeket az 5. táblázatban összegeztük. Két klón, a 4B2 és 5E2 klón, ELISA-vizsgálat alapján az EGFRreceptorhoz történő kötődésre pozitívnak bizonyult, de az EGFR-receptort expresszáló tumorsejtvonalakhoz történő kötődésre nézve negatív volt.

2. táblázat

Különböző tápfolyadékok hatása az in vitro immunizációra²)

A431-sejtekkel szemben történő vizsgálat napja

3. nap 4. nap 5. nap 6. nap

Vizsgálat Antigén	O.D.^C)	arány⁴)	O.D.	arány	O.D.	arány	O.D.	arány
1. vezikulumok	0,39	2,11	0,80	3,76	0,78	3,90	0,95	10,3
PBS	3		1		4		1
	0,18		0,21		0,20		0,09
	6		3		1		2

HU 221 001 Bl

2. táblázat (folytatás)

A431-sejtekkel szemben történő vizsgálat napja

Vizsgálat	Antigén	3. nap	O.D.	4. nap arány	5. nap	6. nap
O.D.c)	arány⁴)	O.D.	arány	O.D.	arány
2.	vezikulumok	0,52	2,50	0,85	1,76	0,86	2,75	1,16	3,94
	PBS	7		2		3		8
		0,21		0,48		0,31		0,29
		0		2		3		6
3.	vezikulumok	0,76	1,48	1,16	2,01	1,08	2,07	LU	1,91
	PBS	3		9		9		5
		0,51		0,58		0,52		0,58
		3		1		5		1

1. vizsgálat: Ml, valamint 4% FCS-t tartalmazó M2 (FCS végkoncentráció: 2%);

2. vizsgálat: Ml, valamint 20% FCS-t tartalmazó M2 (FCS végkoncentráció: 10%);

3. vizsgálat: A tápfolyadék, valamint 4% FCS-t tar- gc talmazó MTC (FCS végkoncentráció: 2%);

a) BALB/c egerekből nyert lépsejteket (10⁷) hat mélyületű lemezeken, 3 órán át, 3,5 ml, A431 sejtekből származó vezikulumokat tartalmazó Ml tápfolyadékban vagy PBS-ben inkubáltunk. Ezt követően a sejtekhez 3,5 ml, θθ 4% vagy 20% FCS-t tartalmazó MTC tápfolyadékot vagy M2 tápfolyadékot adtunk, és a lemezeket inkubáltuk.

A 3., 4., 5. és 6. napokon in vitro immunizált limfocitákat a tápfolyadékból eltávolítottuk, a vezikulumok eltávolítása céljából HBSS-pufferrel mostuk, és fixált A431 sejtek- gg kel fedett, 96 mélyületű lemezekre oltottuk, majd 48 órán át inkubáltuk (lásd a módszerek leírását).

b) Az FCS végkoncentrációja a tápfolyadékban.

c) O.D.: a 405 nm-en mért optikai denzitást jelenti.

Az eredmények tizenhat rekesz átlagát képviselik.

d) A specifikus válasz (antigénként vezikulumok alkalmazása mellett) és a nem specifikus válasz (antigénként PBS alkalmazása mellett) aránya.

3. táblázat ^5

Az in vitro immunizációt követően létrejött válasz multispecifitása»)

A vizsgálatot az alábbi antigénekkel szemben végeza) Limfocitákat in vitro immunizáltunk EGFRreceptort expresszáló (EGFR+) vagy EGFR-receptort nem expresszáló (EGFR-) vezikulumokkal. Hat napig tartó inkubációt követően a sejteket eltávolítottuk a tenyészetből, és a fent felsorolt antigénekkel szemben vizsgáltuk.

b) A választ optikai denzitásban (405 nm) adtuk meg.

4. táblázat

Kiválasztott scFv-fragmensek keresztreaktivitása néhány antigénnel szemben»)

Antigén^b>	Fedés [mg/ml]	Eredmény
EGFR	2,5	+
RN-áz	10	-
BSA	10	-
KLH	10	-
ÓVA	10	-
GD₃-gangliozid	2	-
VNR	1	-
GPIIblIIa	1	-
DSLNT	5	-

	antigén A431- csoport sejtek	EGFR	GD3	RN-áz
1. vizs-	EGFR+ 0,5120»)	0,326	0,140	0,249
gálát	EGFR- 0,427	0,070	0,123	0, 304
2. vizs-	EGFR+ 1,430	0,730	0,233	0,670
gálát	EGFR- 0,789	0,195	0,118	0,561

a) Az ELISA-vizsgálatokat a leírtak szerint végeztük.

b) Vitronektin-receptor (VNR); IlblIIa vérlemezkeglikoprotein (GPIIblIIa); diszialil-lakto-N-tetraóz (DSLNT).

HU 221 001 Bl

5. táblázat scFv-klónok EGFR-receptorral szemben mért reaktivitása. Tisztított, oldható antigénnel végzett ELISA-eljárás és sejtvonalak alkalmazásával végzett citometriás analízis összehasonlító eredményei

Kiónok pozitív	Tumorsejtvonalak citometriás analízise³) (önkényes fluoreszcenciaegységek átlagértéke)⁴	ELISA (O.D.) EGFR
WM164	A431	MDAAMÖB231	HT29
7H1	1,5	112,9	16,4	2,6	1,2
4B2	1,2	5,3	4,2	0,6	2
10D2	1,5	145,3	36,3	4,8	2
12D2	1,8	129,5	29,3	5,7	2
5E2	1,4	2,5	7,1	0,5	1,8
8E2	1,5	134,5	47,7	5,1	1,9
5F2	1,3	146,3	40,6	5,7	1,9
11H2	1,9	152,2	25,3	2	1,9
1B3	0,6	105,1	36,4	5,2	>2
4B3	0,5	78	15,8	2,3	2
3D3	1,2	94,3	25,1	4,8	1,9
5D3	0,5	112	22,2	5,5	>2
4F3	0,4	110,3	32,3	6,2	>2
4G3	0,4	76,5	20,4	2	>2
1E3	0,4	118,3	33,8	5,1	2
3H3	0,6	76,5	33,7	4,2	>2
negatív
5F1	2,4	2,3	3,6	1,8	0,2
7G1	1,4	10,2	4	2,8	0,2
1H1	0,5	5	4	0,75	0,2
kontrollok
HEN	0,4	4,1	3,7	1	0,2
Pl	0,6	85,5	21,3	2,5	1,9

a) Három EGFR-receptort hordozó sejtvonalat b) Negatív és pozitív kontrolokként inszertált (A431, MDAAMB231 és HT29) és egy EGFR- 50 fragmenst nem tartalmazó vektort (HEN) és receptort nem expresszáló sejtvonalat (WM164) alkal- Mab-425 ellenanyagból származó scFv-fragmenst máztunk az scFv-fragmensek tumorsejtekhez történő (Pl) használtunk.

kötődésének fent ismertetettek szerint végzett citometriás analízisére.

HU 221 001 Bl

SZEKVENCIALISTA

AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 327 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ : egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: cDNS HIPOTETIKUS: nem ANTISZENSZ: nem FRAGMENSTÍPUS: N-terminális.

EREDETI FORRÁS:

ORGANIZMUS: egér

TÖRZS: Balb/c

EGYEDFEJLŐDÉSI FÁZIS: felnőtt

SZÖVETTÍPUS: nyirokcsomó KÖZVETLEN FORRÁS:

KLÓN: L2 1 IC (könnyűlánc)

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: CDS

ELHELYEZKEDÉS: 1-327

AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GAC Asp 1

ATT GAG

CTC Leu

ACC Thr 5

CAG Gin

TCT CCA GCC TCC

CTG GCT

GCA Al a

TCT Ser

GTG Val 15

GGA Gly

48

Ile

Glu

Ser

Pro

Al a

Ser 10

Leu

Al a

GAA

ACT

GTC

ACC

ATC

ACA

TGT

CGA

GCA

AGT

GAG

AAC

ATT

TAC

TAT

AGT

96

Glu

The

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Al a

Ser

Glu

Asn

Ile

Tyr

Ser

20

25

30

TTA

GCA

TGG

TAT

CAG

AAG

CAA

GGG

AAA

TCT

CCT

CAG

CTC

CTG

ATC

144

Leu

Al a

Trp

Tyr

Gin

Lys

Gin

Gly

Lys

Ser

Pro

Gin

Leu

I le

35

40

45

TAT

AGT

GCA

AGC

GCC

TTG

GAA

GAT

GGT

GTC

CCA

TCG

AGG

TTC

AGT

GGC

192

Tyr

Ser

Al a

Ser

Al a

Leu

Glu

Asp

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

AGT

GGA

TCT

GGG

ACA

CAG

TAT

TCT

TTA

AAG

ATC

AAC

ATG

CAG

CCT

240

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Gin

Tyr

Ser

Leu

Ly s

Ile

Asn

Me t

Gin

Pro

65

70

75

80

GAA

GAT

ACC

GCT

ACT

TAC

TTC

TGT

AAA

CAG

ACT

TAT

GAC

GTT

CCG

TGG

288

Glu

Asp

Thr

Al a

Thr

Tyr

Phe

Cy s

Lys

Gin

Thr

Tyr

Asp

Val

Pro

Trp

85

90

95

ACG

TTC

GGT

GGA

GGG

ACC

AAG

CTG

GAA

ATA

AAA

CGG

GCG

327

Thr

Phe

Gly

Thr

Ly s

Leu

Glu

Ile

Ly s

Arg

Al a

100 105

A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 109 aminosav

TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: fehérje

A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

HU 221 001 Bl

Asp 1

Ile

Glu

Leu

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Al a

Ser 10

Leu

Al a

Ser

Val 15

Gly

Glu

Thr

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Al a

Ser

Glu

Asn

Ile

Tyr

Ser

20

25

30

Leu

Al a

Trp

Tyr

Gin

Lys

Gin

Gly

Lys

Ser

Pro

Gin

Leu

Ile

35

40

45

Tyr

Se r

Al a

Ser

Al a

Leu

Glu

As p

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Gin

Tyr

Ser

Leu

Lys

Ile

Asn

Me t

Gin

Pro

65

70

75

80

Glu

As p

Thr

Al a

Thr

Tyr

Phe

Cys

Lys

Gin

Thr

Tyr

Asp

Val

Pro

Trp

85

90

95

Thr

Phe

Gly

Thr

Ly s

Leu

Glu

Ile

Lys

Arg

Al a

100

105

A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 357 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

EREDETI FORRÁS:

ORGANIZMUS: egér

TÖRZS: Balb/c

EGYEDFEJLŐDÉSI FÁZIS: felnőtt

SZÖVETTÍPUS: nyirokcsomó KÖZVETLEN FORRÁS:

KLÓN: L2 1 IC (nehézlánc)

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: CDS

ELHELYEZKEDÉS: 1-357

A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CAG GTG

CAA Gin

CTG CAG GAG

TCA GGG

CCT GAG

CTG GTG AGC CCT GGG GCT

Gin 110

Val

Leu

Gin

Glu 115

Ser

G1 y

Pro

Glu

Leu 120

Val

Arg

Pro

Gly

Al a 125

TCA

GTG

AAG

ATG

TCC

TGC

AAG

GCT

TCA

GGC

TAT

ACC

TTC

ACT

ACC

TAC

Ser

Val

Lys

Me t

Ser

Cys

Ly s

Al a

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Tyr

130

135

140

TGG

ATA

CAC

TGG

ATG

AAA

CAG

AGG

CCT

GGA

CAA

GGC

CTT

CAG

TGG

ATT

Trp

Ile

Hi s

Trp

Me t

Ly s

Gin

Arg

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu

Gin

Trp

Ile

145

150

155

GGC

ATG

ATT

GAT

CCT

TCC

AAT

AGT

GAA

ACT

AGG

TTA

AAT

CAG

AAT

TTC

Gly

Me t

Ile

Asp

Pro

Ser

Asn

Ser

Glu

Thr

Arg

Leu

Asn

Gin

Asn

Phe

160

165

170

144

192

HU 221 001 BI

AGG GAC Arg Asp 175

AAG Lys

GCC Al a

ACA Thr

TTG AGT GTA GAC AAA TCC TCC AAT AAA GCC TAC

240

Leu

Ser 180

Va 1

As p

Lys

Ser

Ser 185

Asn

Ly s

Al a

Tyr

ATG

CAG

CTC

AGC

CTG

ACA

TCT

GAG

GAC

TCT

GCA

ATC

TAT

TAC

TGT

288

Me t

Gin

Leu

Ser

Leu

Thr

Ser

Glu

Asp

Ser

Al a

Ile

Tyr

Cy s

190

195

200

205

GCA

AGA

TGG

GAC

TAC

GGT

AGT

GGC

CAC

TTT

GAC

TAC

TGG

GGC

CAA

GGG

336

Al a

Arg

Trp

Asp

Tyr

Gly

Ser

Gly

Hi s

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

210

215

220

ACC

ACG

GTC

ACC

GTC

TCC

TCA

357

Thr

Val

Thr

Val

Ser

225

A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 119 aminosav

TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: protein

A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Gin 1

Val

Gin

Leu

Gin 5

Glu

Ser

Gly

Pro

Glu 10

Leu

Val

Arg

Pr o

Gly 15

Al a

Ser

Val

Lys

Me t 20

Se r

Cys

Lys

Al a

Ser 25

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr 30

Thr

Tyr

Trp

Ile

Hi s 35

Trp

Me t

Lys

Gin

Arg 40

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu 45

Gin

Trp

Ile

Gly

Me t 50

Ile

Asp

Pro

Ser

Asn 55

Ser

Glu

Thr

Arg

Leu 60

Asn

Gin

Asn

Phe

Arg 65

Asp

Lys

Al a

Thr

Leu 70

Ser

Val

Asp

Lys

Ser 75

Ser

Asn

Ly s

Al a

Tyr 80

Me t

Gin

Leu

Ser

Ser 85

Leu

Thr

Ser

Glu

As p 90

Se r

Al a

Ile

Tyr

Tyr 95

Cys

Al a

Arg

Trp

Asp 100

Tyr

Gly

Ser

Gly

Hi s 105

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly 110

Gin

Gly

Thr

Val 115

Thr

Val

Ser

AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 339 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: cDNS HIPOTETIKUS: nem ANTISZENSZ : nem FRAGMENSTÍPUS: N-terminális.

EREDETI FORRÁS:

ORGANIZMUS: egér

HU 221 001 Bl

TÖRZS: Balb/c

EGYEDFEJLŐDÉSI FÁZIS: felnőtt

SZÖVETTÍPUS: nyirokcsomó KÖZVETLEN FORRÁS:

KLÓN: L2 12B (könnyűlánc)

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: CDS

ELHELYEZKEDÉS: 1-339

AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GAC ATT

GAG CTC

ACC Thr

CAG Gin 125

TCT CCA GCT TCT

TTG GCT Leu Alá 130

CTG Val

TCT Se r

CTA Leu

GGG Gly 135

Asp 120

Ile

Glu

Leu

Ser

Pro Alá

Ser

CAG

AGG

GCC

ACC

ATC

TCC

TGC

AGA

GCC

AGC

GAA

AGT

GTT

GAT

AAT

TTT

Gin

Arg

Al a

Thr

Ile

Ser

Cys

Arg

Al a

Ser

Glu

Ser

Va 1

Asp

Asn

Phe

140

145

150

GGC

ATT

AGT

TTT

ATG

AAC

TGG

TTC

CAA

CAG

AAA

CCA

GGA

CAG

CCA

CCC

Gly

Ile

Ser

Phe

Me t

Asn

Trp

Phe

Gin

Ly s

Pro

Gly

Gin

Pro

155

160

165

AAA

CTC

ATC

TAT

GGT

GCA

TCC

AAC

CAA

GGA

TCC

GGG

GTC

CCT

GCC

Lys

Leu

Ile

Tyr

Gly

Al a

Ser

Asn

Gin

Gl y

Ser

Gly

Val

Pro

Al a

170

175

180

AGG

TTT

AGT

GGC

AGT

GGG

TCT

GGG

ACA

GAC

TTC

AGC

CTC

AAC

ATC

CAT

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Ser

Leu

Asn

Ile

Hi s

185

190

195

CCT

CTG

GAG

GAT

ACT

GCA

ATG

TAT

TTC

TGT

CAG

CAA

AGT

AAG

Pro

Leu

Glu

Asp

Thr

Al a

Me t

Tyr

Phe

Cys

Gin

Ser

Ly s

200

205

210

215

GAG

GTT

CCG

CTC

ACG

TTC

GGT

GCT

GGG

ACC

AAG

CTG

GAA

ATA

AAA

CGG

Glu

Val

Pro

Leu

Thr

Phe

Gly

Alá

Gly

Thr

Ly s

Leu

Glu

Ile

Lys

Arg

220

225

230

144

192

240

288

336

GCG

Al a

A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 113 aminosav

TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: protein A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

339

Asp 1

Ile

Glu

Leu

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Al a

Ser 10

Leu

Al a

Val

Ser

Leu 15

Gly

Gin

Arg

Al a

Thr 20

Ile

Ser

Cys

Arg

Al a 25

Ser

Glu

Ser

Val

As p 30

Asn

Phe

Gly

Ile

Ser 35

Phe

Me t

Asn

Trp

Phe 40

Gin

Ly s

Pro

Gly 45

Gin

Pro

Lys

Leu 50

Leu

Ile

Tyr

Gly

Al a 55

Ser

Asn

Gin

Gly

Ser 60

Gly

Va 1

Pro

Al a

HU 221 001 Bl

Arg 65

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly 70

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe 75

Ser

Leu

As n

Ile

Hi s 80

Pro

Leu

Glu

As p

Thr

Al a

Me t

Tyr

Phe

Cys

Gin

Ser

Lys

85

90

95

Glu

Val

Pro

Leu

Thr

Phe

Gly

Al a

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Ly s

Arg

100

105

110

Al a

A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 357 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

EREDETI FORRÁS:

ORGANIZMUS: egér

TÖRZS: Balb/c

EGYEDFEJLŐDÉSI FÁZIS: felnőtt

SZÖVETTÍPUS: nyirokcsomó KÖZVETLEN FORRÁS:

KLÓN: L2 12B (nehézlánc)

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: CDS

ELHELYEZKEDÉS: 1-357

A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CAG GTG CAG CTG

CAG Gin

GAG Glu

TCT GGA CCT GAG CTG GTG AAG CCT GGG GCT

48

Gin Val 115

Gin

Leu

Ser 120

Gly

Pro Glu

Leu Val 125

Lys

Pro

Gly

Alá

TTA

GTG

AAG

ATA

TCC

TGC

AAG

GCT

TCT

GGT

TAC

ACC

TTC

ACC

AGC

TAC

96

Leu

Va 1

Ly s

Ile

Ser

Cy s

Lys

Al a

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Ser

Tyr

130

135

140

145

TGG

ATG

CAC

TGG

GTG

AAG

CAG

AGG

CCT

GGA

CAA

GGC

CTT

GAG

TGG

ATC

144

Trp

Me t

Hi s

Trp

Val

Lys

Gin

Arg

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu

Glu

Trp

Ile

150

155

160

GGA

GAG

ATT

GAT

CCT

TCT

GAT

AGT

TAT

ACT

AAC

TAC

AAT

CAA

AAG

TTC

192

Gly

Glu

Ile

Asp

Pro

Ser

Asp

Ser

Tyr

Thr

Asn

Tyr

Asn

Gin

Lys

Phe

165

170

175

AAG

GGC

AAG

GCC

ACA

TTG

ACT

GTA

GAC

AAA

TCC

AAC

ACA

GCC

TAC

240

Ly s

GI y

Lys

Al a

Thr

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Asn

Thr

Al a

Tyr

180

185

190

ATG

CAG

CTC

AGC

CTG

ACA

TCT

GAG

GAC

TCT

GCG

GTC

TAT

TAC

TGT

288

Me t

Gin

Leu

Ser

Leu

Thr

Ser

Glu

As p

Ser

Al a

Val

Tyr

Cys

195

200

205

GCA

AGA

TCG

GAC

TAC

GGT

AGT

AGC

CAC

TTT

GAC

TAC

TGG

GGC

CAA

GGG

336

Al a

Arg

Ser

Asp

Tyr

Gly

Ser

Hi s

Phe

As p

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

210

215

220

225

HU 221 001 Bl

ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 230

A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 119 bázispár

TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: fehérje A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

357

Gin 1

Val

Gin

Leu

Gin 5

Glu

Ser

Gly

Pro

Glu 10

Leu

Val

Lys

Pro

Gly 15

Al a

Leu

Val

Lys

lle 20

Ser

Cys

Lys

Al a

Ser 25

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr 30

Ser

Tyr

Trp

Me t

Hi s 35

Trp

Val

Lys

Gin

Arg 40

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu 45

Glu

Trp

lle

Gly

Glu 50

lle

Asp

Pro

Ser

Asp 55

Ser

Tyr

Thr

Asn

Tyr 60

Asn

Gin

Ly s

Phe

Lys 65

Gly

Lys

Al a

Thr

Leu 70

Thr

Va 1

Asp

Lys

Ser 75

Ser

Asn

Thr

Al a

Tyr 80

Me t

Gin

Leu

Ser

Ser 85

Leu

Thr

Ser

Glu

Asp 90

Ser

Al a

Val

Tyr

Tyr 95

Cy s

Al a

Arg

Ser

Asp 100

Tyr

Gly

Ser

Hi s 105

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gl y 110

Gin

Gly

Thr

Val

Thr

Val

Ser

115

A 9. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 339 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

EREDETI FORRÁS :

ORGANIZMUS: egér

TÖRZS: Balb/c

EGYEDFEJLŐDÉSI FÁZIS: felnőtt

SZÖVETTÍPUS: nyirokcsomó KÖZVETLEN FORRÁS:

KLÓN: L3 1 ID (könnyűlánc)

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: CDS

ELHELYEZKEDÉS: 1-339

A 9. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

HU 221 001 Bl

GAC ATT

GAG Glu

CTC ACC CAG

TCT Ser

CCA GCT

TCT TTG GCT GTG

TCT Ser

CTA Leu

GGG Gly 135

48

Asp 120

lle

Leu

Thr

Gin 125

Pro

Al a

Ser

Leu 130

Al a

Val

CAG

AGG

GCC

ACC

ATC

TCC

TGC

CGA

GCC

AGC

GAA

AGT

GTT

GAT

AAT

TTT

96

Gin

Arg

Al a

Thr

lle 140

Ser

Cys

Arg

Al a

Ser 145

Glu

Ser

Val

As p

Asn 150

Phe

GGC

ATT

AGT

TTT

ATG

AAC

TGG

TTC

CAA

CAG

AAA

CCA

GGA

CAG

CCA

CCC

144

Gly

lle

Ser

Phe 155

Me t

Asn

Trp

Phe

Gin 160

Gin

Ly s

Pro

Gly

Gin 165

Pro

AAA

CTC

ATC

TAT

GGT

GCA

TCC

AAC

CAA

GGA

TCC

GGG

GTC

CCT

GCC

192

Lys

Leu

Leu 170

lle

Tyr

Gly

Al a

Ser 175

Asn

Gin

G1 y

Ser

Gly 180

Val

Pro

Al a

AGG

TTT

AGT

GGC

AGT

GGG

TCT

GGG

ACA

GAC

TTC

AGC

CTC

AAC

ATC

CAT

240

Arg

Phe 185

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser 190

Gly

Thr

Asp

Phe

Ser 195

Leu

Asn

lle

Hi s

CCT

TTG

GAG

GAT

ACT

GCA

ATG

TAT

TTC

TGT

CAG

CAA

AGT

AAG

288

Pro 200

Leu

Glu

Asp

Asp 205

Thr

Al a

Me t

Tyr

Phe 210

Cys

Gin

Ser

Lys 215

GAG

GTT

CCG

CTC

ACG

TTC

GGT

GCT

GGG

ACC

AAG

CTG

GAG

CTG

AAA

CGG

336

Glu

Val

Pro

Leu

Thr 220

Phe

Gly

Al a

Gly

Thr 225

Ly s

Leu

Glu

Leu

Lys 230

Arg

GCG 339

Alá

A 10. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 113 aminosav

TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: fehérje

A 10. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Asp 1

lle

Glu

Leu

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Al a

Ser 10

Leu

Al a

Val

Ser

Leu 15

Gly

Gin

Arg

Al a

Thr 20

lle

Ser

Cys

Arg

Al a 25

Ser

Glu

Ser

Val

Asp 30

Asn

Phe

Gly

lle

Ser 35

Phe

Me t

Asn

Trp

Phe 40

Gin

Ly s

Pro

Gly 45

Gin

Pro

Lys

Leu 50

Leu

lle

Tyr

Gly

Al a 55

Ser

Asn

Gin

G1 y

Ser 60

Gly

Va 1

Pro

Al a

Arg 65

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly 70

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe 75

Ser

Leu

Asn

lle

Hi s 80

Pro

Leu

Glu

Asp 85

Asp

Thr

Al a

Me t

Tyr 90

Phe

Cys

Gin

Ser 95

Ly s

Glu Al a

Val

Pro

Leu 100

Thr

Phe

Gly

Al a

Gly 105

Thr

Ly s

Leu

Glu

Leu 110

Lys

Arg

HU 221 001 Bl

All. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 357bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

EREDETI FORRÁS:

ORGANIZMUS: egér

TÖRZS: Balb/c

EGYEDFEJLŐDÉSI FÁZIS: felnőtt

SZÖVETTÍPUS: nyirokcsomó KÖZVETLEN FORRÁS:

KLÓN: L3 11D (nehézlánc)

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: CDS

ELHELYEZKEDÉS: 1-357

All. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GAG GTG Glu Val 115

CAG Gin

CTG Leu

CAG CAG TCA

GGG Gly

GCT Al a

GAG Glu

CTT GTG AAG CCT

GGG Gly

GCT Al a

48

Gin Gin

Ser 120

Leu

Val 125

Lys

Pro

TCA

GTG

AAG

CTG

TCC

TGC

AAG

GCT

TCT

GGC

TAC

ACC

TTC

ACC

AGC

TAC

96

Ser

Val

Lys

Leu

Ser

Cys

Lys

Al a

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Ser

Tyr

130

135

140

145

TGG

ATG

CAC

TGG

GTG

AAG

CAG

AGG

CCT

GGA

CAA

GGC

CTT

GAG

TGG

ATC

144

Trp

Me t

Hi s

Trp

Val

Ly s

Gin

Arg

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu

Glu

Trp

Ile

150

155

160

GGA

GAG

ATT

GAT

CCT

TCT

GAT

AGT

TAT

ACT

AAC

TAC

AAT

CAA

AAG

TTC

192

Gly

Glu

Ile

As p

Pro

Ser

Asp

Ser

Tyr

Thr

Asn

Tyr

Asn

Gin

Lys

Phe

165

170

175

AAG

GGC

AAG

GCC

ACA

TTG

ACT

GTA

GAC

AAA

TCC

AGC

ACA

GCC

TAC

240

Lys

Gly

Ly s

Al a

Thr

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Thr

Al a

Tyr

180

185

190

ATG

CAG

CTC

AGC

CTG

ACA

TCT

GAG

GAC

TCT

GCG

GTC

TAT

TAC

TGT

188

Me t

Gin

Leu

Ser

Leu

Thr

Ser

Glu

As p

Ser

Al a

Val

Tyr

Cy s

195

200

205

GCA

AGA

TCG

GAC

TAC

GGT

AGT

AGC

CAC

TTT

GAC

TAC

TGG

GGC

CAA

GGG

336

Al a

Arg

Ser

As p

Tyr

Gly

Ser

Hi s

Phe

As p

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

210

215

220

225

ACC

ACG

GTC

ACC

GTC

TCC

TCA

357

Thr

Val

Thr

Val

Ser

230

A 12. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 119 aminosav

TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: fehérje

HU 221 001 Bl

A 12. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Glu

Val

Gin

Leu

Gin

Ser

Gly

Al a

Glu

Leu

Va 1

Lys

Pro

Gly

Al a

1

5

10

15

Ser

Val

Lys

Leu

Ser

Cys

Lys

Al a

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Ser

Tyr

20

25

30

Trp

Me t

Hi s

Trp

Val

Lys

Gin

Arg

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu

Glu

Trp

Ile

35

40

45

Gly

Glu

Ile

Asp

Pr o

Ser

Asp

Ser

Tyr

Thr

Asn

Tyr

Asn

Gin

Lys

Phe

50

55

60

Lys

Gly

Lys

Al a

Thr

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Thr

Al a

Tyr

65

70

75

80

Me t

Gin

Leu

Ser

Leu

Thr

Ser

Glu

Asp

Ser

Al a

Val

Tyr

Cys

85

90

95

Al a

Arg

Ser

Asp

Tyr

Gly

Ser

Se r

Hi s

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

100

105

110

Thr

Val

Thr

Val

Ser

115

A 13. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 327 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

EREDETI FORRÁS:

ORGANIZMUS: egér

TÖRZS: Balb/c

EGYEDFEJLŐDÉSI FÁZIS: felnőtt

SZÖVETTÍPUS: nyirokcsomó KÖZVETLEN FORRÁS:

KLÓN: S4 2D (könnyűlánc)

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: CDS

ELHELYEZKEDÉS: 1-327

A 13. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GAC

ATT

GAG

CTC

ACC

CAG

TCT

CCA

ACC

ATG

GCT

GCA

TCT

CCC

GGG

Asp 120

Ile

Glu

Leu

Thr

Gin 125

Se r

Pro

Thr

Me t 130

Al a

Ser

Pro

Gly 135

GAG

AAG

ATC

ACT

ATC

ACC

TGC

AGT

GCC

AGC

TCA

AGT

ATA

AGT

TCC

AAT

Glu

Lys

Ile

Thr

Ile 140

Thr

Cys

Ser

Al a

Ser 145

Ser

Ile

Ser

Ser 150

Asn

TAC

TTG

CAT

TGG

TAT

CAG

AAG

CCA

GGA

TTC

TCC

CCT

AAA

CTC

TTG

Tyr

Leu

Hi s

Trp 155

Tyr

Gin

Lys

Pro 160

Gly

Phe

Ser

Pro

Lys 165

Leu

144

HU 221 001 Bl

192

ATT TAT AGG

ACA Thr

TCC Ser

AAT Asn

CTG GCT TCT GGA

GTC CCA GCT CGC

TTC Phe

AGT Ser

Ile

Tyr

Arg 170

Leu

Ala 175

Ser

Gly

Va 1

Pro

Al a 1 80

Arg

GGC

AGT

GGG

TCT

GGG

ACC

TCT

TAC

TCT

CTC

ACA

ATT

GGC

ACC

ATG

GAG

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Ser

Tyr

Ser

Leu

Thr

Ile

Gly

Thr

Me t

Glu

185

190

195

GCT

GAA

GAT

GTT

GCC

ACT

TAC

TGC

CAG

GGT

AGT

ATA

CCA

Al a

Glu

Asp

Val

Al a

Thr

Tyr

Cys

Gin

G1 y

Ser

Ile

Pro

200

205

210

215

CGC

ACG

TTC

GGA

GGG

GGC

ACC

AAG

CTG

GAA

ATC

AAA

CGG

Arg

Thr

Phe

Gly

G1 y

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Ly s

Arg

220

225

A 14.

AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 109 aminosav

TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA:

lineáris

MOLEKULATÍPUS:

fehérje

A 14. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Asp

Ile

Glu

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Thr

Me t

Al a

Ser

Pro

Gly

1

5

10

15

Glu

Lys

Ile

Thr

Ile

Thr

Cys

Ser

Al a

Ser

Ile

Ser

Asn

20

25

30

Tyr

Leu

Hi s

Trp

Tyr

Gin

Ly s

Pro

Gly

Phe

Ser

Pro

Ly s

Leu

35

40

45

Ile

Tyr

Arg

Thr

Ser

Asn

Leu

Al a

Ser

Gly

Val

Pro

Al a

Arg

Phe

Ser

50

55

60

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Ser

Tyr

Ser

Leu

Thr

Ile

Gly

Thr

Me t

Glu

65

70

75

80

Al a

Glu

Asp

Val

Al a

Thr

Tyr

Cys

Gin

Gly

Ser

Se r

Ile

Pro

85

90

95

Arg

Thr

Phe

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

Arg

100

105

A 15.

AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

240

288

327

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI: HOSSZA: 354bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ : nem

FRAGMENSTÍPUS: N-terminális.

EREDETI FORRÁS: ORGANIZMUS: egér TÖRZS: Balb/c

EGYEDFEJLŐDÉSI FÁZIS: felnőtt SZÖVETTÍPUS: nyirokcsomó

HU 221 001 Bl

KÖZVETLEN FORRÁS:

KLÓN: S42D (nehézlánc)

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: CDS

ELHELYEZKEDÉS: 1-354

A 15. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GAG GTC AAG CTG

CAG CAG TCA GGA CCT GAG

CTG GTA AAG CCT GGG GCT

Glu Val 110

Lys

Leu

Gin

Gin 115

Ser

Gly

Pro

Glu

Leu 120

Val

Lys

Pro

Gly

Al a 125

TCA

GTG

AAG

ATG

TCC

TGC

AAG

GCT

TCT

GGA

TAC

GCA

TTC

ATA

AGT

TTT

Ser

Val

Lys

Me t

Ser

Cys

Ly s

Al a

Ser

Gly

Tyr

Al a

Phe

Ile

Ser

Phe

130

135

140

GTT

ATG

CAC

TGG

GTG

AAG

CAG

AAG

CCT

GGG

CAG

GGC

CTT

GAG

TGG

ATT

Val

Me t

Hi s

Trp

Val

Ly s

Gin

Ly s

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu

Glu

Trp

Ile

145

150

155

GGA

TTT

ATT

AAT

CCT

TAC

AAT

GAT

GGT

ACT

AAG

TAC

AAT

GAG

AAG

TTC

Gly

Phe

Ile

Asn

Pro

Tyr

Asn

As p

Gly

Thr

Ly s

Tyr

Asn

Glu

Ly s

Phe

160

165

170

AAA

GAC

AAG

GCC

ACA

CTG

ACT

TCA

GAC

AAA

TCC

AGC

ACA

GCC

TAC

Lys

As p

Ly s

Al a

Thr

Leu

Thr

Ser

Asp

Lys

Ser

Thr

Al a

Tyr

175

180

185

ATG

GAG

CTC

AGC

CTG

ACC

TCT

GAG

GAC

TCT

GCG

GTC

TAT

TAC

TGT

Me t

Glu

Leu

Ser

Leu

Thr

Ser

Glu

Asp

Ser

Al a

Val

Tyr

Cys

190

195

200

205

GCA

AGT

GGG

GAT

TAC

GAC

AGG

GCT

ATG

GAC

TAC

TGG

GGC

CAA

GGG

ACC

Al a

Ser

Gly

Asp

Tyr

Asp

Arg

Al a

Me t

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

210

215

220

ACG

GTC

ACC

GTC

TCC

TCA

Thr

Val

Thr

Val

Ser

225

144

192

240

288

336

354

A 16. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 118 aminosav

TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: fehérje

A 16. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Glu 1

Val

Lys

Leu

Gin 5

Gin

Ser

G1 y

Pro

Glu 10

Leu

Val

Ly s

Pro

Gly 15

Al a

Ser

Va 1

Lys

Me t 20

Ser

Cys

Ly s

Al a

Ser 25

G1 y

Tyr

Al a

Phe

Ile 30

Ser

Phe

Val

Me t

Hi s 35

Trp

Va 1

Ly s

Gin

Ly s 40

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu 45

Glu

Trp

Ile

Gly

Phe 50

Ile

Asn

Pro

Tyr

Asn 55

As p

Gly

Thr

Ly s

Tyr 60

Asn

G1 u

Lys

Phe

HU 221 001 Bl

Lys 65

As p

Ly s

Al a

Thr

Leu 70

Thr

Ser

Asp

Ly s

Ser 75

Ser

Thr

Al a

Tyr 80

Me t

Glu

Leu

Ser

Se r

Leu

Thr

Se r

Glu

Asp

Ser

Al a

Val

Tyr

Cys

85

90

95

Al a

Ser

Gly

Asp

Tyr

Asp

Arg

Al a

Me t

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

100

105

110

Thr Val Thr Val Ser Ser 115

A 17. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 717 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

EREDETI FORRÁS:

ORGANIZMUS: egér

TÖRZS: Balb/c

EGYEDFEJLŐDÉSI FÁZIS: felnőtt

SZÖVETTÍPUS: splenociták KÖZVETLEN FORRÁS:

KLÓN: 4B2 SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: CDS

ELHELYEZKEDÉS: 1-717

A 17. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GAG Glu

GTG Va 1 120

AAG Lys

CTG CAG GAG

TCT GGG GGA GAC

TTA GTG AAG CCT GGA GGG

48

Leu

Gin

Glu

Ser 125

Gly

Asp

Leu

Val 130

Lys

Pro

Gly

TCC

CTG

AAA

CTC

TCC

TGT

GCA

GCC

TCT

GGA

TTC

ACT

TTC

AGT

AGC

TAT

96

Ser 135

Leu

Ly s

Leu

Ser

Cys 140

Al a

Ser

Gly

Phe 145

Thr

Phe

Ser

Tyr 150

GGC

ATG

TCT

TGG

GTT

CGG

CAG

ACT

CCA

GAC

AAG

AGG

CTG

GAG

TCT

GTC

144

Gly

Me t

Ser

Trp

Val 155

Arg

Gin

Thr

Pro

Asp 160

Ly s

Arg

Leu

Glu

Ser 165

Val

GCA

ACC

ATT

AGT

GGT

GCT

TAC

ATC

TAC

TAT

CCA

GAC

AGT

GTG

192

Al a

Thr

Ile

Ser 170

Ser

Gly

Al a

Tyr 175

Ile

Tyr

Pro

As p 180

Ser

Val

AAG

GGG

CGA

TTC

ACC

ATC

TCC

AGA

GAC

AAT

GCC

AAG

AAC

ACC

CTG

TAC

240

Lys

Gly

Arg 185

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg 190

Asp

Asn

Al a

Lys

Asn 195

Thr

Leu

Tyr

CTG

CAA

ATG

AGC

AGT

CTG

AAG

TCT

GAG

GAC

ACA

GCC

ATG

TAT

TAC

TGT

288

Leu

Gin 200

Me t

Ser

Leu

Lys 205

Ser

Glu

Asp

Thr

Al a 210

Me t

Tyr

Cys

GCA

AGA

CTT

GAA

ACC

GGG

GAC

TAT

GCT

TTG

GAC

TAC

TGG

GGC

CAA

GGG

336

Al a 215

Arg

Leu

Glu

Thr

Gly 220

Asp

Tyr

Al a

Leu

As p 225

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly 230

HU 221 001 Bl

ACC ACG GTC ACC

GTC Va 1 235

TCC TCA GGT

GGC GGT GGC TCG GGC GGT

GGT Gly 245

GGG Gly

384

Thr

Val

Thr

Ser

Gly

Gly 240

Gly

Ser

Gly

TCG

GGT

GGC

GGA

TCT

GAC

ATT

GAG

CTC

ACC

CAG

TCT

CCA

GCT

TCT

432

Ser

Gly

Ser

Asp

Ile

Glu

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Al a

Ser

250

255

260

TTG

GCT

GTC

TCT

CTA

GGG

CAG

AGG

GCC

ACC

ATA

TTC

TGC

AAG

GAC

AGC

480

Leu

Al a

Val

Ser

Leu

Gly

Gin

Arg

Al a

Thr

Ile

Phe

Cy s

Ly s

Asp

Ser

265

270

275

CAA

AGT

GTT

GAT

TAT

GAT

GGT

GAT

AGT

TAT

ATG

AAC

TGG

TAC

CAA

CAG

528

Gin

Ser

Val

Asp

Tyr

Asp

Gly

As p

Ser

Tyr

Me t

Asn

Trp

Tyr

Gin

280

285

290

AAA

CCA

GGA

CAG

CCA

CCC

AAA

CTC

ATC

TAT

GCT

CGA

TCC

AAT

CTA

576

Lys

Pro

Gly

Gin

Pro

Lys

Leu

He

Tyr

Al a

Arg

Ser

Asn

Leu

295

300

305

310

GAA

TCT

GGG

GTC

CCT

GCC

AGG

TTT

AGT

GGC

AGT

GGG

TCT

GGG

ACA

GAC

624

Glu

Ser

Gly

Val

Pro

Al a

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

315

320

325

TTC

AGC

CTC

AAC

ATC

CAT

CCT

CTG

GAG

GAT

ATT

GCA

ATG

TAT

672

Phe

Ser

Leu

Asn

Ile

Hi s

Pro

Val

Glu

Asp

Ile

Al a

Me t

Tyr

330

335

340

TTC

TGT

CAG

CAA

AGT

AGG

AAG

GTT

CCG

TGG

TCG

TTC

GGT

GGA

GGG

717

Phe

Cys

Gin

Ser

Arg

Lys

Val

Pro

Trp

Ser

Phe

Gly

345

350

355

A 18. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 239 aminosav

TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: fehérje

A 18. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Glu Val 1

Lys

Leu

Gin Glu 5

Ser

Gly

Asp 10

Le u

Val

Lys

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Lys

Leu

Ser

Cy s

Al a

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Tyr

20

25

30

Gly

Me t

Ser

Trp

Val

Arg

Gin

Thr

Pro

Asp

Lys

Arg

Leu

Glu

Ser

Val

35

40

45

Al a

Thr

Ile

Ser

Gly

Al a

Tyr

Ile

Tyr

Pro

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Al a

Ly s

Asn

Thr

Leu

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gin

Me t

Ser

Leu

Ly s

Ser

Glu

Asp

Thr

Al a

Me t

Tyr

Cys

85

90

95

Al a

Arg

Leu

Glu

Thr

Gly

Asp

Tyr

Al a

Leu

As p

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

100

105

110

HU 221 001 BI

Thr

Val 115

Thr

Va 1

Ser

Gly 120

Gly

Ser

Gly 125

Gly

Ser

Gly 130

Gly

Ser

As p 135

Ile

Glu

Leu

Thr

Gin 140

Ser

Pro

Al a

Ser

Leu 145

Al a

Val

Ser

Leu

Gly 150

Gin

Arg

Al a

Thr

Ile 155

Phe

Cys

Lys

Asp

Ser 160

Gin

Ser

Val

As p

Tyr 165

Asp

Gly

As p

Ser

Tyr 170

Me t

Asn

Trp

Tyr

Gin 175

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin 180

Pro

Lys

Leu

Leu 185

Ile

Tyr

Al a

Arg

Se r 190

Asn

Leu

Glu

Ser

Gly 195

Val

Pro

Al a

Arg

Phe 200

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser 205

Gly

Thr

Asp

Phe

Ser 210

Leu

Asn

Ile

Hi s

Pro 215

Va 1

Glu

Asp

Asp 220

Ile

Al a

Me t

Tyr

Phe

Cys

Gin

Ser

Arg

Ly s

Val

Pro

Trp

Ser

Phe

Gly

225 230 235

A 19. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 732 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: cDNS HIPOTETIKUS: nem ANTISZENSZ: nem EREDETI FORRÁS:

ORGANIZMUS: egér

TÖRZS: Balb/c

SZÖVETTÍPUS: splenociták KÖZVETLEN FORRÁS:

KLÓN: 10 C 2 (egyláncú Fv, könnyű- és nehézlánc plusz kapcsoló oligonukleotid) SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: CDS

ELHELYEZKEDÉS: 1-732

A 19. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GAG GTG Glu Val 240

CAG CTG

CAG CAG TCT

GGG Gly

GCT GAA

CTG GTG AAG CCT GGG GCT

Gin

Leu

Gin Gin 245

Ser

Al a

Glu

Leu 250

Val

Lys

Pro

Gly

Al a 255

TCA

GTG

AAG

TTG

TCC

TGC

AAG

GCT

TCC

GGC

TAC

ACC

TTC

ACC

AGC

CAC

Ser

Va 1

Lys

Le u

Ser

Cys

Lys

Al a

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Ser

Hi s

260

265

270

TGG

ATG

CAC

TGG

GTG

AAG

CAG

AGG

GCT

GGA

CAA

GGC

CTT

GAG

TGG

ATC

Trp

Me t

Hi s

Trp

Va 1

Lys

Gin

Arg

Al a

Gly

Gin

Gly

Leu

Glu

Trp

Ile

275

280

285

GGA

GAG

TTT

AAT

CCC

AGC

AAC

GGC

CGT

ACT

AAC

TAC

AAT

GAG

AAA

TTC

Gly

Glu

Phe

Asn

Pro

Ser

Asn

Gly

Arg

Thr

Asn

Tyr

Asn

Glu

Ly s

Phe

290

295

300

144

192

HU 221 001 Bl

AAG Lys

AGC AAG

GCC Al a

ACA CTG ACT GTA GAC AAA TCC TCC AGC ACA GCC

TAC Tyr

240

Ser 305

Lys

Thr

Leu

Thr 310

Val

Asp

Ly s

Ser

Ser 315

Ser

Thr

Al a

ATG

CAA

CTC

AGC

CTG

ACA

TCT

GAG

GAC

TCT

GCG

GTC

TAT

TAC

TGT

288

Me t

Gin

Leu

Ser

Leu

Thr

Ser

Glu

Asp

Ser

Al a

Val

Tyr

Cys

320

325

330

335

GCC

AGT

CGG

GAC

TAT

GAT

TAC

GAC

GGA

CGG

TAC

TTT

GAC

TAC

TGG

GGC

336

Al a

Ser

Arg

Asp

Tyr

Asp

Tyr

As p

Gly

Arg

Tyr

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

340

345

350

CAA

GGG

ACC

ACG

GTC

ACC

GTC

TCC

TCA

GGT

GGC

GGT

GGC

TCG

GGC

GGT

384

Gin

Gly

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Gly

Ser

Gly

355

360

365

GGT

GGG

TCG

GGT

GGC

GGA

TCT

GAC

ATT

GAG

CTC

ACC

CAG

TCT

CCA

432

Gly

Ser

Gly

Ser

Asp

Ile

Glu

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

370

375

380

GCA

ATC

ATG

TCT

GCA

TCT

CCA

GGG

GAG

AAG

GTC

ACC

ATG

ACC

TGC

AGT

480

Alá

Ile

Me t

Ser

Al a

Ser

Pro

Gly

Glu

Ly s

Val

Thr

Me t

Thr

Cys

Ser

385

390

395

GCC

AGC

TCA

AGT

GTA

AGT

TAC

ATG

TAC

TGG

TAC

CAG

AAA

CCA

GGA

528

Al a

Ser

Val

Ser

Tyr

Me t

Tyr

Trp

Tyr

Gin

Ly s

Pro

Gly

400

405

410

415

TCC

CCC

AGA

CTC

CTG

ATT

TAT

GAC

ACA

TCC

AAC

CTG

GCT

TCT

GGA

576

Ser

Pro

Arg

Leu

Ile

Tyr

Asp

Thr

Ser

Asn

Leu

Al a

Ser

Gly

420

425

430

GTC

CCT

GTT

CGC

TTC

AGT

GGC

AGT

GGG

TCT

GGG

ACC

TCT

TAC

TCT

CTC

624

Val

Pr o

Val

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Ser

Tyr

Ser

Leu

435

440

445

ACA

ATC

AGC

CGA

ATG

GAG

GCT

GAA

GAT

GCT

GCC

ACT

TAT

TAC

TGC

CAG

672

Thr

Ile

Ser

Arg

Me t

Glu

Al a

Glu

Asp

Al a

Thr

Tyr

Cys

Gin

450

455

460

CAG

TGG

AGT

TAC

CCA

CCC

ATG

TAC

ACG

TTC

GGA

GGG

ACC

AAG

720

Gin

Trp

Ser

Tyr

Pro

Me t

Tyr

Thr

Phe

Gly

Thr

Lys

465 470 475

CTG GAA ATA AAA 732

Leu Glu Ile Lys

480

A 20. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 244 aminosav

TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: fehéije

A 20. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Alá Glu Leu Val Lys Pro Gly Alá 15 10 15

HU 221 001 BI

Ser

Val

Lys

Leu 20

Ser

Cy s

Lys

Al a

Ser 25

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr 30

Ser

Hi s

Trp

Me t

Hi s 35

Trp

Val

Lys

Gin

Arg 40

Al a

Gly

G1 n

Gly

Leu 45

Glu

Trp

Ile

Gly

Glu 50

Phe

Asn

Pro

Ser

Asn 55

Gly

Arg

Thr

Asn

Tyr 60

Asn

Glu

Lys

Phe

Lys 65

Ser

Lys

Al a

Thr

Leu 70

Thr

Val

Asp

Lys

Ser 75

Ser

Thr

Al a

Tyr 80

Me t

Gin

Leu

Ser

Ser 85

Leu

Thr

Ser

Glu

Asp 90

Ser

Al a

Val

Tyr

Tyr 95

Cys

Al a

Ser

Arg

Asp 100

Tyr

Asp

Tyr

Asp

Gly 105

Arg

Tyr

Phe

Asp

Tyr 110

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr 115

Thr

Va 1

Thr

Val

Ser 120

Ser

Gly

Gly 125

Ser

Gly

Gly 130

Ser

Gly

G1 y

Gly 135

Ser

Asp

Ile

Glu

Leu 140

Thr

Gin

Ser

Pro

Al a 145

Ile

Me t

Ser

Al a

Ser 150

Pro

Gly

Glu

Ly s

Va 1 155

Thr

Me t

Thr

Cys

Ser 160

Al a

Ser

Val 165

Ser

Tyr

Me t

Tyr

Trp 170

Tyr

Gin

Lys

Pro 175

Gly

Ser

Pro

Arg 180

Leu

Ile

Tyr

Asp 185

Thr

Ser

Asn

Leu

Al a 190

Ser

Gly

Val

Pro

Val 195

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser 200

Gly

Ser

Gly

Thr

Ser 205

Tyr

Ser

Leu

Thr

Ile 210

Ser

Arg

Me t

Glu

Al a 215

Glu

Asp

Al a

Thr 220

Tyr

Cy s

Gin

Gin 225

Trp

Ser

Tyr

Pro 230

Pro

Me t

Tyr

Thr

Phe 235

Gly

Thr

Lys 240

Leu Glu Ile Lys

A 21. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 732 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

EREDETI FORRÁS:

ORGANIZMUS: egér

TÖRZS: Balb/c

SZÖVETTÍPUS: splenociták KÖZVETLEN FORRÁS:

KLÓN: 3 D 3 (egyláncú Fv, könnyű- és nehézlánc plusz kapcsoló oligonukleotid)

HU 221 001 Bl

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: CDS

ELHELYEZKEDÉS: 1-732

A 21. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GAG GTC Glu Val 245

CAA Gin

CTG CAG

CAG TCA GGG GCT GAA CTG GTG AAG CCT GGG GCT

48

Leu

Gin

Gin 250

Ser

Gly

Ala

Glu

Leu 255

Val

Lys

Pro

Gly

Al a 260

TCA

GTG

AAG

TTG

TCC

TGC

AAG

GCT

TCC

GGC

TAC

ACC

TTC

ACC

AGC

CAC

96

Ser

Val

Lys

Leu

Ser

Cys

Lys

Al a

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Ser

Hi s

265

270

275

TGG

ATG

CAC

TGG

GTG

AAG

CAG

AGG

GCT

GGA

CAA

GGC

CTT

GAG

TGG

ATC

144

Trp

Me t

Hi s

Trp

Val

Lys

Gin

Arg

Al a

Gly

Gin

Gly

Leu

Glu

Trp

Ile

280

285

290

GGA

GAG

TTT

AAT

CCC

AGC

AAC

GGC

CGT

ACT

AAC

TAC

AAT

GAG

AAA

ATC

192

Gly

Glu

Phe

Asn

Pro

Ser

Asn

Gly

Arg

Thr

Asn

Tyr

Asn

Glu

Lys

Ile

295

300

305

AAG

AGC

AAG

GCC

ACA

CTG

ACT

GTA

GAC

AAA

TCC

AGC

ACA

GCC

TAC

240

Lys

Ser

Lys

Al a

Thr

Leu

Thr

Val

Asp

Ly s

Ser

Thr

Al a

Tyr

310

315

320

ATG

CAA

CTC

AGC

CTG

ACA

TCT

GAG

GAC

TCT

GCG

GTC

TAT

TAC

TGT

288

Me t

Gin

Leu

Ser

Leu

Thr

Ser

Glu

As p

Ser

Al a

Val

Tyr

Cys

325

330

335

340

GCC

AGT

CGG

GAC

TAT

GAT

TAC

GAC

GGA

CGG

TAC

TTT

GAC

TAC

TGG

GGC

336

Al a

Ser

Arg

Asp

Tyr

Asp

Tyr

As p

Gly

Arg

Tyr

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

345

350

355

CAA

GGG

ACC

ACG

GTC

ACC

GTC

TCC

TCA

GGT

GGC

GGT

GGC

TCG

GGC

GGT

384

Gin

Gly

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Gly

Se r

Gly

360

365

370

GGT

GGG

TCG

GGT

GGC

GGA

TCT

GAC

ATT

GAG

CTC

ACC

CAG

TCT

CCA

432

Gly

Ser

Gly

Ser

Asp

Ile

Glu

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

375

380

385

ACA

ATC

ATG

TCT

GCA

TCT

CCA

GGG

GAG

AAG

GTC

ACC

ATG

ACC

TGC

AGT

480

Thr

Ile

Me t

Ser

Al a

Ser

Pro

Gly

Glu

Lys

Val

Thr

Me t

Thr

Cys

Ser

390

395

400

GAC

AGC

TCA

AGT

GTA

AGT

TAC

ATG

TAC

TGG

TAC

CAG

AAG

ACA

GGA

528

Asp

Ser

Val

Ser

Tyr

Me t

Tyr

Trp

Tyr

Gin

Lys

Thr

Gly

405

410

415

420

TCC

CCC

AGA

CTC

CTG

ATT

TAT

GAC

ACA

TCC

AAC

CTG

GCT

TCT

GGA

576

Ser

Pro

Arg

Leu

Ile

Tyr

Asp

Thr

Ser

Asn

Leu

Ala

Ser

Gly

425

430

435

GTC

CCT

GTT

CGC

TTC

AGT

GGC

AGT

GGG

TCT

GGG

ACC

TCT

TAC

TCT

CTC

624

Val

Pro

Val

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Ser

Tyr

Ser

Leu

440

445

450

ACA

ATC

AGC

CGA

ATG

GAG

GCT

GAA

GAT

GCT

GCC

ACT

TAT

TAC

TGC

CAG

672

Thr

Ile

Ser

Arg

Me t

Glu

Al a

Glu

Asp

Al a

Thr

Tyr

Cy s

Gin

455

460

465

HU 221 001 Bl

720

CAG Gin

TGG AGT AGT

TAC CCA CCC ATG

TAC Tyr

ACG Thr

TTC Phe

GGA GGG

GGG Gly

ACC Thr

AAG Lys

Trp 470

Ser

Tyr

Pro

Pro 475

Me t

Gly 480

Gly

CTG

GAA

ATA

AAA

Leu

G1 u

Ile

Ly s

732

485

A 22. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 244 aminosav

TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: fehérje

A 22. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Glu 1

Val

Gin

Leu

Gin 5

Gin

Ser

Gly

Al a

Glu 10

Leu

Val

Lys

Pro

Gly 15

Al a

Ser

Val

Lys

Leu 20

Ser

Cys

Ly s

Al a

Ser 25

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr 30

Ser

Hi s

Trp

Me t

His 35

Trp

Val

Lys

Gin

Arg 40

Al a

Gly

Gin

Gly

Leu 45

Glu

Trp

Ile

Gly

Glu 50

Phe

Asn

Pro

Ser

Asn 55

Gly

Arg

Thr

Asn

Tyr 60

Asn

Glu

Lys

Ile

Lys 65

Ser

Lys

Al a

Thr

Leu 70

Thr

Va 1

Asp

Lys

Ser 75

Ser

Thr

Al a

Tyr 80

Me t

Gin

Leu

Ser

Ser 85

Leu

Thr

Ser

Glu

As p 90

Ser

Al a

Val

Tyr

Tyr 95

Cys

Al a

Ser

Arg

Asp 100

Tyr

As p

Tyr

Asp

Gly 105

Arg

Tyr

Phe

Asp

Tyr 110

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr 115

Thr

Val

Thr

Val

Ser 120

Ser

Gly

G1 y

Gly

Gly 125

Ser

Gly

Gly 130

Ser

Gly

Gly 135

Se r

Asp

Ile

Glu

Leu 140

Thr

Gin

Ser

Pro

Thr 145

Ile

Me t

Ser

Al a

Ser 150

Pro

Gly

Glu

Ly s

Val 155

Thr

Me t

Thr

Cys

Ser 160

Asp

Ser

Val 165

Ser

Tyr

Me t

Tyr

Trp 170

Tyr

Gin

Lys

Thr 175

Gly

Ser

Pro

Arg 180

Leu

Ile

Tyr

Asp 185

Thr

Ser

Asn

Leu

Al a 190

Ser

Gly

Val

Pro

Val 195

Arg

Phe

Ser

Gly

Se r 200

Gly

Ser

Gly

Thr

Ser 205

Tyr

Ser

Leu

Thr

Ile

Ser

Arg

Me t

Glu

Al a

Glu

Asp

Al a

Thr

Tyr

Cys

Gin

210 215 220

HU 221 001 Bl

Gin Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Met Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 225 230 235 240

Leu Glu Ile Lys

A 23. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 738 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

EREDETI FORRÁS:

ORGANIZMUS: egér

TÖRZS: Balb/c

SZÖVETTÍPUS: splenociták KÖZVETLEN FORRÁS:

KLÓN: 1 E 3 (egyláncú Fv, könnyű- és nehézlánc plusz kapcsoló oligonukleotid)

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: CDS

ELHELYEZKEDÉS: 1-738

A 23. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GAG GTG CAG CTG CAG CAG TCT GGG GCT GAA CTG GTG AAG CCT GGG GCT

48

Glu Val 245

Gin

Leu Gin

Gin 250

Ser

Gly

Al a

Glu

Leu 255

Val

Lys

Pro

Gly

Al a 260

TCA

GTG

AAG

TTG

TCC

TGC

AAG

GCT

TCC

GGC

TAC

ACC

TTC

ACC

AGC

CAC

96

Ser

Val

Lys

Leu

Ser

Cy s

Ly s

Al a

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Ser

Hi s

265

270

275

TGG

ATG

CAC

TGG

GTG

AAG

CAG

AGG

GCT

GGA

CAA

GGC

CTT

GAG

TGG

ATC

144

Trp

Me t

Hi s

Trp

Val

Ly s

Gin

Arg

Alá

Gly

Gin

Gly

Leu

Glu

Trp

Ile

280

285

290

GGA

GAG

TTT

AAT

CCC

AGC

AAC

GGC

CGT

ACT

AAC

TAC

AAT

GAG

AAA

TTC

192

Gly

Glu

Phe

Asn

Pro

Ser

Asn

Gly

Arg

Thr

Asn

Tyr

Asn

Glu

Lys

Phe

295

300

305

AAG

AGC

AAG

GCC

ACA

CTG

ACT

GTA

GAC

AAA

TCC

AGC

ACA

GCT

TAC

240

Lys

Ser

Lys

Al a

Thr

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Se r

Ser

Thr

Al a

Tyr

310

315

320

ATG

CAA

CTC

AGC

CTG

ACA

TCT

GAG

GAC

TCT

GCG

GTC

TAT

TAC

TGT

288

Me t

Gin

Leu

Ser

Leu

Thr

Ser

Glu

Asp

Ser

Al a

Val

Tyr

Cys

325

330

335

340

GCC

AGT

CGG

GAC

TAT

GAT

TAC

GAC

GGA

CGG

TAC

TTT

GAC

TAC

TGG

GGC

336

Al a

Ser

Arg

As p

Tyr

Asp

Tyr

Asp

Gly

Arg

Tyr

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

345

350

355

CAA

GGG

ACC

ACG

GTC

ACC

GTC

TCC

TCA

GGT

GGC

GGT

GGC

TCG

GGC

GGT

384

Gin

Gly

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Gly

Ser

Gly

360

365

370

HU 221 001 Bl

432

GGT GGG Gly Gly

TCG GGT GGC

GGC GGA TCT GGA

TCT Se r

GAC Asp

ATT GAG CTC ACC

CAG Gin

Ser 375

Gly

Gly Gly

Ser 380

Gly

lle

Glu 385

Leu

Thr

TCT CCA

ACA

ATC

ATG

TCT GCA

TCT

CCA

GGG

GAG

AAG

GTC

ACC

ATG

ACC

Ser Pro

Thr

lle

Me t

Ser Alá

Se r

Pro

Gly

Glu

Lys

Val

Thr

Me t

Thr

390

395

400

TGC AGT

GAC

AGC

TCA

AGT GTA

AGT

TAC

ATG

TAC

TGG

TAC

CAG

AAG

Cys Ser

Asp

Ser

Ser Val

Ser

Tyr

Me t

Tyr

Trp

Tyr

Gin

Lys

405

410

415

420

CCA GGA

TCC

CCC

AGA CTC

CTG

ATT

TAT

GAC

ACA

TCC

AAC

CTG

GCT

Pro Gly

Ser

Pro

Arg Leu

Leu

lle

Tyr

Asp

Thr

Ser

Asn

Leu

Al a

425

430

435

TCT GGA

GTC

CCT

GTT

CGC TTC

AGT

GGC

AGT

GGG

TCT

GGG

ACC

TCT

TAC

Ser Gly

Val

Pro

Val

Arg Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Ser

Tyr

440

445

450

TCT CTC

ACA

ATC

AGC

CGA ATG

GAG

GCT

GAA

GAT

GCT

GCC

ACT

TAT

TAC

Ser Leu

Thr

lle

Ser

Arg Met

Glu

Al a

Glu

As p

Al a

Thr

Tyr

455

460

465

TGC CAG

CAG

TGG

AGT

AGT TAC

CCA

CCC

ATG

TAC

ACG

TTC

GGA

GGG

Cys Gin

Gin

Trp

Ser

Ser Tyr

Pro

Me t

Tyr

Thr

Phe

Gly

470

475

480

ACC AAG

CTG

GAA

ATA

AAA

Thr Lys

Leu

Glu

lle

Lys

485

490

A 24. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 246 aminosav

TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA:

lineáris

MOLEKULATÍPUS:

fehérje

A 24. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEIRASA:

Glu Val

Gin

Leu

Gin

Gin Ser

Gly

Al a

Glu

Le u

Val

Lys

Pro

Gly

Al a

1

5

10

15

Ser Val

Lys

Leu

Ser

Cys Lys

Al a

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Ser

Hi s

20

25

30

Trp Met

Hi s

Trp

Val

Lys Gin

Arg

Al a

Gly

Gin

Gly

Leu

Glu

Trp

lle

35

40

45

Gly Glu

Phe

Asn

Pro

Ser Asn

Gly

Arg

Thr

Asn

Tyr

Asn

Glu

Ly s

Phe

50

55

60

Lys Ser

Lys

Al a

Thr

Leu Thr

Val

Asp

Ly s

Ser

Thr

Al a

Tyr

65

70

75

80

Me t Gin

Leu

Ser

Leu Thr

Ser

Glu

Asp

Ser

Al a

Val

Tyr

Cy s

85

90

95

Alá Ser

Arg

As p

Tyr

Asp Tyr

Asp

Gly

Arg

Tyr

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

100

105

110

480

528

576

672

720

738

624

HU 221 001 Β1

Gin

Gly

Thr 115

Thr

Val

Thr

Val

Ser 120

Ser

Gly

Gly 125

Ser

Gly

Gly 130

Ser

Gly

Gly 135

Ser

Gly

Ser

As p

Ile 140

Glu

Leu

Thr

Gin

Ser 145

Pr o

Thr

Ile

Me t

Ser 150

Al a

Ser

Pro

Gly

Glu 155

Lys

Val

Thr

Me t

Thr 160

Cys

Ser

Asp

Ser

Ser 165

Ser

Val

Ser

Tyr

Me t 170

Tyr

Trp

Tyr

Gin

Gin 175

Lys

Pro

Gly

Ser

Se r 180

Pro

Arg

Leu

Ile 185

Tyr

Asp

Thr

Ser

Asn 190

Leu

Al a

Ser

Gly

Val 195

Pro

Val

Arg

Phe

Ser 200

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly 205

Thr

Ser

Tyr

Ser

Leu 210

Thr

Ile

Ser

Arg

Me t 215

Glu

Al a

Glu

As p

Al a 220

Al a

Thr

Tyr

Cys 225

Gin

Trp

Ser

Ser 230

Tyr

Pro

Me t

Tyr 235

Thr

Phe

Gly

Gly 240

Thr Lys Leu Glu Ile Lys 245

A 25. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 726 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

EREDETI FORRÁS:

ORGANIZMUS: egér

TÖRZS: Balb/c

SZÖVETTÍPUS: splenociták KÖZVETLEN FORRÁS:

KLÓN: 5 F 1 (egyláncú Fv, könnyű- és nehézlánc plusz kapcsoló oligonukleotid) SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: CDS

ELHELYEZKEDÉS: 1-726

A 25. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CAG

GTG

AAA

CTG

CAG

GAG

TCT

GGG

GCT

GAA

CTG

GTG

AAG

CCT

GGG

GCT

Gin

Val

Lys

Leu 250

Gin

Glu

Ser

Gly

Al a 255

Glu

Leu

Val

Lys

Pro 260

Gly

Al a

TCA

GTG

AAG

TTG

TCC

TGC

AAG

GCT

TCC

GGC

TAC

ACC

TTC

ACC

AGC

CAC

Ser

Val

Lys 265

Leu

Se r

Cys

Lys

Al a 270

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe 275

Thr

Ser

Hi s

TGG

ATG

CAC

TGG

GTG

AAG

CAG

AGG

GCT

GGA

CAA

GGC

CTT

GAG

TGG

ATC

Trp

Me t 280

Hi s

Trp

Va 1

Lys

Gin 285

Arg

Al a

Gly

Gin

Gly 290

Leu

Glu

Trp

Ile

144

HU 221 001 Bl

192

GGA

GAG

ATT

AAT

CCC

AGA

ACG

GCG

CCT

ACT

AAC

TAC

AAT

GAG

AAA

TTC

Gly 295

GI u

Ile

Asn

Pro

Arg 300

Thr

Alá

Pro

Thr

Asn 305

Tyr

Asn

Glu

Lys

Phe 310

AAG

AGC

AAG

GCC

ACA

CTG

ACT

GTA

GAC

AAA

TCC

AGC

ACA

GCC

TAC

Lys

Ser

Lys

Al a

Thr 315

Leu

Thr

Val

Asp

Lys 320

Ser

Thr

Al a 325

Tyr

ATG

CAA

CTC

AGC

CTG

ACA

TCT

GAG

GAC

TCT

GCG

GTC

TAT

TAC

TGT

Me t

Gin

Leu

Se r 330

Ser

Leu

Thr

Ser

Glu 335

Asp

Ser

Al a

Val

Tyr 340

Tyr

Cys

GCC

AGT

CGG

GAC

TAT

GAT

TAC

GAC

GGA

CGG

TAC

TTT

GAC

TAC

TGG

GGC

Al a

Ser

Arg 345

As p

Tyr

Asp

Tyr

Asp 350

Gly

Arg

Tyr

Phe

As p 355

Tyr

Trp

Gly

CAA

GGG

ACA

ACG

GTC

ACC

GTC

TCC

TCA

GGT

GGC

GGT

GGC

TCG

GGC

GGT

Gin

Gly 360

Thr

Val

Thr

Val 365

Ser

Gly

Gly 370

Gly

Ser

Gly

GGT

GGG

TCG

GGT

GGC

GGA

TCT

GAC

ATT

GAG

CTC

ACC

CAG

TCT

CCA

Gly 375

GI y

Ser

Gly

Gly 380

Gly

Ser

Asp

Ile

Glu 385

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro 390

ACA

ATC

ATG

TCT

GCA

TCT

CCA

GGG

GAG

AAG

GTC

ACC

ATG

ACC

TGC

AGT

Thr

He

Me t

Se r

Al a 395

Ser

Pro

Gly

Glu

Lys 400

Val

Thr

Me t

Thr

Cys 405

Ser

GAC

AGC

TCA

AGT

GTA

AGT

TAC

ACG

TAC

TGG

TAC

CAG

AAG

ACA

GGA

Asp

Ser

Ser 410

Val

Ser

Tyr

Thr

Tyr 415

Trp

Tyr

Gin

Ly s 420

Thr

Gly

TCC

CCC

AGA

CTC

CTG

ATT

TAT

GAC

ACA

TCC

AAC

CTG

GCT

TCT

GGA

Ser

Pro 425

Arg

Leu

Ile

Tyr 430

As p

Thr

Ser

Asn

Leu 435

Al a

Ser

Gly

GTC

CCT

GTT

CGC

TTC

AGT

GGC

AGT

GGG

TCT

GGG

ACC

TCT

TAC

TCT

CTC

Val

Pro 440

Val

Arg

Phe

Ser

Gly 445

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr 450

Ser

Tyr

Ser

Leu

ACA

ATC

AGC

CGA

ATG

GAG

GCT

GAA

GAT

GCT

GCC

ACT

TAT

TAC

TGC

CAG

Thr 455

Ile

Ser

Arg

Me t

Glu 460

Al a

Glu

As p

Al a

Al a 465

Thr

Tyr

Cys

Gin 470

CAG

TGG

AGT

TAC

CCG

CTC

ACG

TTC

GGT

GCT

GGG

ACC

AAG

CTG

CAA

Gin

Trp

Ser

Tyr 475

Pro

Leu

Thr

Phe

Gly 480

Al a

Gly

Thr

Lys

Leu 485

Glu

240

288

336

384

432

480

528

576

624

672

720

ATA AAA

Ile Lys

A 26. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 242 bázispár

TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: fehérje

A 26. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

726

HU 221 001 Bl

Gin 1

Va 1

Lys

Leu

Gin Glu 5

Ser

Gly Alá

Glu 10

Leu

Val

Ly s

Pro

Gly 15

Alá

Ser

Va 1

Lys

Leu

Ser

Cys

Lys

Al a

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Ser

Hi s

20

25

30

Trp

Me t

Hi s

Trp

Val

Lys

Gin

Arg

Al a

Gly

Gin

Gly

Leu

G1 u

Trp

Ile

35

40

45

Gly

Glu

Ile

Asn

Pro

Arg

Thr

Al a

Pro

Thr

Asn

Tyr

Asn

Glu

Lys

Phe

50

55

60

Lys

Ser

Lys

Al a

Thr

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Thr

Alá

Tyr

65

70

75

80

Me t

Gin

Leu

Ser

Leu

Thr

Ser

Glu

As p

Ser

Al a

Val

Tyr

Cys

85

90

95

Al a

Ser

Arg

Asp

Tyr

Asp

Tyr

Asp

Gly

Arg

Tyr

Phe

Asp

Tyr

Trp

G1 y

100

105

110

Gin

Gly

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Gly

Ser

Gly

115

120

125

Gly

Ser

Gly

Ser

Asp

Ile

Glu

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

130

135

140

Thr

Ile

Me t

Ser

Alá

Ser

Pro

Gly

Glu

Ly s

Va 1

Thr

Me t

Thr

Cys

Ser

145

150

155

160

Asp

Ser

Val

Ser

Tyr

Thr

Tyr

Trp

Tyr

Gin

Lys

Thr

Gly

165

170

175

Ser

Pro

Arg

Leu

Ile

Tyr

Asp

Thr

Ser

Asn

Leu

Al a

Ser

Gly

180

185

190

Val

Pro

Val

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Ser

Tyr

Ser

Leu

195

200

205

Thr

Ile

Ser

Arg

Me t

Glu

Al a

Glu

Asp

Al a

Thr

Tyr

Cy s

Gin

210

215

220

Gin

Trp

Ser

Tyr

Pro

Leu

Thr

Phe

Gly

Alá

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

225

230

235

240

Ile

Lys

A 27.

AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI: HOSSZA: 726 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

FRAGMENSTÍPUS: N-terminális.

EREDETI FORRÁS: ORGANIZMUS: egér TÖRZS: Balb/c

HU 221 001 Bl

SZÖVETTÍPUS: splenociták KÖZVETLEN FORRÁS:

KÖNYVTÁR: 7 G 1 (egyláncú Fv, könnyű- és nehézlánc plusz kapcsoló oligonukleotid) SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: CDS

A 27. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GAG GTC Glu Val

AAG Lys 245

CTG Leu

CAG Gin

CAG TCA GGG

GCT GAA CTG GTG AAG CCT GGG GCT

48

Gin

Ser

Gly 250

Ala

Glu

Leu

Val

Lys 255

Pro

Gly

Al a

TCA

GTG

AAG

TTG

TCC

TGC

AAG

GCT

TCC

GGC

TAC

ACC

TTC

ACC

AGC

CAC

96

Ser

Val

Lys

Leu

Ser

Cys

Lys

Al a

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Ser

His

260

265

270

TTG

GAT

CAC

TGG

GTG

AAG

CAG

AGG

GGC

TGG

CAA

GGC

CTT

GAG

TGG

ATC

144

Leu

As p

Hi s

Trp

Val

Lys

Gin

Arg

Gly

Trp

Gin

Gly

Leu

Glu

Trp

Ile

275

280

285

290

GGA

CAG

TTT

AAT

CCC

AGC

AAC

GGC

CGT

ACT

AAC

TAC

AAT

GAG

AAA

TTC

192

Gly

Gin

Phe

Asn

Pro

Ser

Asn

Gly

Arg

Thr

Asn

Tyr

Asn

Glu

Lys

Phe

295

300

305

AAG

AGC

AAG

GCC

ACA

CTG

ACT

GTA

GAC

AAA

TCC

AGC

ACA

GCC

TAC

240

Ly s

Ser

Ly s

Al a

Thr

Leu

Thr

Va 1

As p

Lys

Ser

Thr

Al a

Tyr

310

315

320

ATC

GAA

CTC

AGC

CTG

ACA

TCT

GAG

GAC

TGC

TCG

GTC

TAT

TAC

TGT

288

Ile

Glu

Leu

Ser

Se r

Leu

Thr

Ser

Glu

Asp

Cy s

Ser

Val

Tyr

Cy s

325

330

335

GCC

AGT

CGG

GAC

TAT

GAT

TAC

GAC

GGA

CGG

TAC

TTT

GAC

TAC

TGG

GGC

336

Al a

Ser

Arg

Asp

Tyr

Asp

Tyr

As p

Gly

Arg

Tyr

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

340

345

350

CAA

GGG

ACC

ACG

GTC

ACC

GTC

TCC

TCA

GGT

GGC

GGT

GGC

TCG

GGC

GGT

384

Gin

Gly

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Gly

Ser

Gly

355

360

365

370

GGT

GGG

TCG

GGT

GGC

GGA

TCT

GAC

ATT

GAG

CTC

ACC

CAG

TCT

CCA

432

Gly

Ser

Gly

Ser

As p

Ile

Glu

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

375

380

385

ACA

ATC

ATG

TCT

GCA

TCT

CCA

GGG

GAG

AAG

GTC

ACC

ATG

ACC

TGC

AGT

480

Thr

Ile

Me t

Ser

Al a

Ser

Pro

G1 y

Glu

Lys

Val

Thr

Me t

Thr

Cy s

Ser

390

395

400

GAC

AGC

TCA

AGT

GTA

AGT

TAC

ATG

TAC

TGG

TAC

CAG

AAG

ACA

GGA

528

Asp

Ser

Val

Ser

Tyr

Me t

Tyr

Trp

Tyr

Gin

Lys

Thr

Gly

405

410

415

TCC

CCC

AGA

CTT

CTG

ATT

TAT

GAC

ACA

TCC

AAC

CTG

GCT

TCT

GGA

576

Ser

Pro

Arg

Leu

Ile

Tyr

As p

Thr

Ser

Asn

Leu

Al a

Ser

Gly

420

425

430

GTC

CCT

GTT

CGC

TTC

AGT

GGC

AGT

GGG

TCT

GGG

ACC

TCT

TAC

TCT

CTC

624

Val

Pro

Val

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

G1 y

Ser

Gly

Thr

Ser

Tyr

Ser

Leu

435

440

445

450

HU 221 001 Bl

672

ACA

ATC

AGC

CGA

ATG

GAG

GCT

GAA

GAT

GCT

GCC

ACT

TAT

TAC

TGC

CAG

Thr

Ile

Ser

Arg

Me t 455

Glu

Al a

Glu

As p

Al a 460

Al a

Thr

Tyr

Cy s 465

Gin

CAG

TGG

AGT

TAC

CCG

CTC

ACG

TTC

GGT

GCT

GGG

ACC

AAG

CTG

GAA

Gin

Trp

Ser

Tyr

Pro

Leu

Thr

Phe

Gly

Al a

Gly

Thr

Ly s

Leu

Glu

470 475 480

720

ATA AAA

Ile Lys

A 28. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 242 aminosav

TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: fehérje

A 28. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

726

Glu 1

Val

Lys

Leu

Gin 5

Gin

Ser

Gly

Al a

Glu 10

Leu

Val

Lys

Pro

Gly 15

Al a

Ser

Val

Lys

Leu 20

Ser

Cys

Ly s

Al a

Ser 25

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr 30

Ser

Hi s

Leu

Asp

Hi s 35

Trp

Val

Lys

Gin

Arg 40

Gly

Trp

Gin

Gly

Leu 45

Glu

Trp

Ile

Gly

Gin 50

Phe

Asn

Pro

Ser

Asn 55

Gly

Arg

Thr

Asn

Tyr 60

Asn

Glu

Lys

Phe

Lys 65

Ser

Lys

Al a

Thr

Leu 70

Thr

Val

Asp

Lys

Se r 75

Ser

Thr

Al a

Tyr 80

Ile

Glu

Leu

Ser

Se r 85

Leu

Thr

Ser

Glu

Asp 90

Cys

Ser

Val

Tyr

Tyr 95

Cys

Al a

Ser

Arg

Asp 100

Tyr

Asp

Tyr

Asp

Gly 105

Arg

Tyr

Phe

Asp

Tyr 110

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr 115

Thr

Val

Thr

Val

Ser 120

Ser

Gly

Gly 125

Ser

Gly

Gly 130

Ser

Gly

Gly 135

Ser

Asp

Ile

Glu

Leu 140

Thr

Gin

Ser

Pro

Thr 145

Ile

Me t

Se r

Al a

Ser 150

Pro

Gly

Glu

Lys

Val 155

Thr

Me t

Thr

Cy s

Ser 160

Asp

Ser

Va 1 165

Ser

Tyr

Me t

Tyr

Trp 170

Tyr

Gin

Ly s

Thr 175

Gly

Ser

Se r

Pro

Arg 180

Leu

Ile

Tyr

Asp 185

Thr

Se r

Asn

Leu

Al a 190

Ser

Gly

Val

Pro

Val 195

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser 200

Gly

Ser

Gly

Thr

Ser 205

Tyr

Ser

Leu

Thr

Ile 210

Ser

Arg

Me t

Glu

Al a 215

Glu

As p

Al a

Thr Tyr 220

Tyr

Cy s

Gin

HU 221 001 Bl

Gin Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Alá Gly Thr Lys Leu Glu 225 230 235 240

Ile Lys

A 29. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 726 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

EREDETI FORRÁS:

ORGANIZMUS: egér

TÖRZS: Balb/c

SZÖVETTÍPUS: splenociták KÖZVETLEN FORRÁS:

KLÓN: 11 Η 1 (egyláncú Fv, könnyű- és nehézlánc plusz kapcsoló oligonukleotid)

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: CDS

ELHELYEZKEDÉS: 1-726

A 29. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GAG GTC AAG

CTG Leu

CAG CAG TCA GGG GCT GAA CTG GTG

AAG CCT GGG GCT

48

Glu Val

Lys 245

Gin

Ser

Gly 250

Al a

Glu

Leu

Val

Lys 255

Pro

Gly

Al a

TCA

GTG

AAG

TTG

TCC

TGC

AAG

GCT

TCC

GGC

TAC

ACC

TTC

ACC

AGC

CAC

96

Ser

Val

Lys

Leu

Ser

Cys

Lys

Al a

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Ser

Hi s

260

265

270

TGG

ATG

CAC

TGG

GTG

AAG

CAG

AGG

GCT

GGA

CAA

GGC

TTG

GAG

TGG

ATC

144

Trp

Me t

Hi s

Trp

Val

Lys

Gin

Arg

Al a

Gly

Gin

Gly

Leu

Gl u

Trp

Ile

275

280

285

290

GGA

GAG

TTT

AAT

CCC

AGC

AAC

GGC

CGT

ACT

AAC

TAC

AAT

GAG

AAA

TTC

192

Gly

Glu

Phe

Asn

Pro

Ser

Asn

Gly

Arg

Thr

Asn

Tyr

Asn

Glu

Lys

Phe

295

300

305

AAG

AGC

AAG

GCC

ACA

CTG

ACT

GTA

GAC

AAA

TCC

AGC

ACA

GCC

TAC

240

Lys

Ser

Ly s

Al a

Thr

Leu

Thr

Val

Asp

Ly s

Se r

Ser

Thr

Al a

Tyr

310

315

320

ATG

CAA

CTC

AGC

CTG

ACA

TCT

GAG

GAC

TCT

GCG

GTC

TAT

TAC

TGT

288

Me t

Gin

Leu

Ser

Leu

Thr

Ser

Glu

Asp

Se r

Al a

Val

Tyr

Cys

325

330

335

GCC

AGT

CGG

GAC

TAT

GAT

TAC

GAC

GGA

CGG

TAC

TTT

GAC

TAC

TGG

GGC

336

Al a

Ser

Arg

Asp

Tyr

Asp

Tyr

As p

Gly

Arg

Tyr

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

340

345

350

CAA

GGG

ACC

ACG

GTC

ACC

GTC

TCC

TCA

GGT

GGC

GGT

GGC

TCG

GGC

GGT

384

Gin

Gly

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Gly

Gl y

Ser

Gly

355

360

365

370

HU 221 001 Bl

GGT Gly

GGG Gly

TCG GGT GGC

GGC Gly

GGA Gly

TCT GAC

ATT GAG CTC ACC CAG TCT CCA

432

Ser

Gly Gly 375

Ser

Asp

lle 380

Glu

Leu

Thr

Gin

Ser 385

Pro

TCA

ATC

ATG

TCT

GCA

TCT

CCA

GGG

GAG

AAG

GTC

ACC

ATG

ACC

TGC

AGT

480

Ser

lle

Me t

Ser

Al a

Ser

Pro

Gly

Glu

Lys

Val

Thr

Me t

Thr

Cys

Ser

390

395

400

GAC

AGC

TCA

AGT

GTA

AGT

TAC

ATG

TAC

TGG

TAC

CAG

AAG

ACA

GGA

528

Asp

Ser

Va 1

Ser

Tyr

Me t

Tyr

Trp

Tyr

Gin

Lys

Thr

Gly

405

410

415

TCC

CCC

AGA

CTC

CTG

ATT

TAT

GAC

ACA

TCC

AAC

CTG

GCT

TCT

GGA

576

Ser

Pro

Arg

Leu

lle

Tyr

Asp

Thr

Ser

Asn

Leu

Al a

Ser

Gly

420

425

430

GTC

CCT

GTT

CGC

TTC

AGT

GGC

AGT

GGG

TCT

GGG

ACC

TCT

TAC

TCT

CTC

624

Val

Pro

Val

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Ser

Tyr

Ser

Leu

435

440

445

450

ACA

ATC

AGC

CGA

ATG

GAG

GCT

GAA

GAT

GCT

GCC

ACT

TAT

TAC

TGC

CAG

672

Thr

lle

Ser

Arg

Me t

Glu

Al a

Glu

Asp

Al a

Thr

Tyr

Cys

Gin

455 460 465

CAG TGG AGT AGT TAC CCA CAC ACG TTC GGT GCT GGG ACC AAG CTG GAA 720

Gin	Trp Ser	Ser Tyr Pro His Thr Phe Gly Alá Gly Thr 470 475	Lys Leu Glu 480
ATA	AAA
lle	Lys

A 30. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 242 aminosav

TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: fehérje

A 30. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Glu Val 1

Lys

Leu

Gin Gin 5

Ser

Gly

Al a

Glu 10

Leu

Val

Lys

Pro

Gly 15

Al a

Ser

Val

Lys

Leu

Ser

Cys

Ly s

Al a

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Ser

Hi s

20

25

30

Trp

Me t

Hi s

Trp

Val

Lys

Gin

Arg

Al a

Gly

Gin

Gly

Leu

Glu

Trp

lle

35

40

45

Gly

Glu

Phe

Asn

Pro

Ser

Asn

Gly

Arg

Thr

Asn

Tyr

Asn

Glu

Lys

Phe

50

55

60

Lys

Ser

Lys

Al a

Thr

Leu

Thr

Va 1

Asp

Lys

Se r

Ser

Thr

Al a

Tyr

65

70

75

80

Me t

Gin

Leu

Ser

Leu

Thr

Ser

Glu

Asp

Ser

Al a

Val

Tyr

Cys

85

90

95

Al a

Ser

Arg

Asp

Tyr

As p

Tyr

As p

Gly

Arg

Tyr

Phe

As p

Tyr

Trp

Gly

100

105

110

HU 221 001 Bl

Gin

G1 y

Thr 115

Thr

Va 1

Thr

Val

Ser 120

Ser

Gly

Gly 125

Ser

Gly

Gly 130

Ser

Gly

Gly 135

Ser

Asp

Ile

G1 u

Leu 140

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser 145

Ile

Me t

Ser

Al a

Ser 150

Pro

Gly

Glu

Lys

Val 155

Thr

Me t

Thr

Cys

Ser 160

As p

Ser

Val 165

Ser

Tyr

Me t

Tyr

Trp 170

Tyr

Gin

Ly s

Thr 175

G1 y

Ser

Pro

Arg 180

Leu

Ile

Tyr

Asp 185

Thr

Ser

Asn

Leu

Al a 190

Ser

Gly

Val

Pro

Val 195

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser 200

Gly

Ser

Gly

Thr

Ser 205

Tyr

Ser

Leu

Thr

Ile 210

Ser

Arg

Me t

Glu

Al a 215

Glu

Asp

Al a

Thr 220

Tyr

Cy s

Gin

Gin 225

Trp

Ser

Tyr

Pro 230

Hi s

Thr

Phe

Gly

Al a 235

Gly

Thr

Ly s

Leu

Glu 240

Ile Lys

A 31. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 732 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

EREDETI FORRÁS:

ORGANIZMUS: egér

TÖRZS: Balb/c

SZÖVETTÍPUS: splenociták KÖZVETLEN FORRÁS:

KLÓN: 1 A 1 (egyláncú Fv, könnyű- és nehézlánc plusz kapcsoló oligonukleotid) SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: CDS

ELHELYEZKEDÉS: 1-732

A 31. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GAG GTG CAG CTG CAG CAG TCT

GGG GCT

GAA CTG GTG AAG

CCT Pro

GGG Gly

GCT Al a

Glu

Val

Gin 245

Leu

Gin

Ser

Gly 250

Al a

Glu

Leu

Val

Lys 255

TCA

GTG

AAG

TTG

TCC

TGC

AAG

GCT

TCC

GGC

TAC

ACC

TTC

ACC

AGC

CAC

Ser

Va 1

Lys

Leu

Ser

Cys

Lys

Al a

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Ser

Hi s

260

265

270

TGG

ATG

CAC

TGG

GTG

AAG

CAG

AGG

GCT

GGA

CAA

GGC

CTT

GAG

TGG

ATC

Trp

Me t

Hi s

Trp

Val

Lys

Gin

Arg

Al a

Gly

Gin

Gly

Leu

Glu

Trp

Ile

275

280

285

290

144

HU 221 001 Bl

192

GGA GAG TTT

AAT CCC AGC AAC GGC

CGT Arg

ACT Thr 300

AAC Asn

TAC Tyr

AAT Asn

GAG Glu

AAA Lys 305

TTC Phe

Gly

Glu

Phe

Asn

Pro 295

Ser

Asn Gly

AAG

AGC

AAG

GCC

ACA

CTG

ACT

GTA

GAC

AAA

TCC

AGC

ACA

GCT

TAC

Lys

Ser

Lys

Al a

Thr

Leu

Thr

Va 1

Asp

Ly s

Ser

Thr

Al a

Tyr

310

315

320

ATG

CAA

CTC

AGC

CTG

ACA

TCT

GAG

GAC

TCT

GCG

GTC

TAT

TAC

TGT

Me t

Gin

Leu

Ser

Leu

Thr

Ser

Glu

Asp

Se r

Al a

Val

Tyr

Cys

325

330

335

GCC

AGT

CGG

GAC

TAT

GAT

TAC

GAC

GGA

CGG

TAC

TTT

GAC

TAC

TGG

GGC

Al a

Ser

Arg

Asp

Tyr

Asp

Tyr

Asp

Gly

Arg

Tyr

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

340

345

350

CAA

GGG

ACC

ACG

GTC

ACC

GTC

TCC

TCA

GGT

GGC

GGT

GGC

TCG

GGC

GGT

Gin

Gly

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Gly

Ser

Gly

355

360

365

370

GGT

GGG

TCG

GGT

GGC

GGA

TCT

GAC

ATT

GAG

CTC

ACC

CAG

TCT

CCA

Gly

Ser

Gly

Ser

Asp

Ile

Glu

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

375

380

385

ACA

ATC

ATG

TCT

GCA

TCT

CCA

GGG

GAG

AAG

GTC

ACC

ATG

ACC

TGC

AGT

Thr

Ile

Me t

Ser

Al a

Ser

Pr o

Gly

Glu

Ly s

Val

Thr

Me t

Thr

Cys

Ser

390

395

400

GAC

AGC

TCA

AGT

GTA

AGT

TAC

ATG

TAC

TGG

TAC

CAG

AAG

ACA

GGA

Asp

Ser

Val

Ser

Tyr

Me t

Tyr

Trp

Tyr

Gin

Lys

Thr

Gly

405

410

415

TCC

CCC

AGA

CTC

CTG

ATT

TAT

GAC

ACA

TCC

AAC

CTG

GCT

TCT

GGA

Ser

Se r

Pro

Arg

Leu

Ile

Tyr

As p

Thr

Ser

Asn

Leu

Al a

Ser

Gly

420

425

430

GTC

CCT

GTT

CGC

TTC

AGT

GGC

AGT

GGG

TCT

GGG

ACC

TCT

TAC

TCT

CTC

Val

Pro

Val

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Ser

Tyr

Ser

Leu

435

440

445

450

ACA

ATC

AGC

CGA

ATG

GAG

GCT

GAA

GAT

GCT

GCC

ACT

TAT

TAC

TGC

CAG

Thr

Ile

Ser

Arg

Me t

Glu

Al a

Glu

As p

Al a

Thr

Tyr

Cys

Gin

455

460

465

CAG

TGG

AGT

TAC

CCA

CCC

ATG

TAC

ACG

TTC

GGA

GGG

ACA

AAG

Gin

Trp

Ser

Tyr

Pro

Me t

Tyr

Thr

Phe

Gly

Thr

Ly s

470

475

480

TTG

GAA

ATA

AAA

Leu

Glu

Ile

Lys

485

240

288

336

384

432

480

528

576

624

672

720

732

A 32. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 244 aminosav

TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: fehérje

A 32. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

HU 221 001 Bl

Glu Val 1

Ser Val

Trp Met

Gly Glu 50

Lys Ser 65

Met Gin

Alá Ser

Gin Gly

Gly Gly 130

Thr Ile 145

Asp Ser

Ser Ser

Val Pro

Thr Ile 210

Gin Trp 225

Leu Glu

Gin Leu

Lys Leu 20

His Trp 35

Phe Asn

Lys Alá

Leu Ser

Arg Asp 100

Thr Thr 115

Ser Gly

Met Ser

Ser Ser

Pro Arg 180

Val Arg 195

Ser Arg

Ser Ser

Ile Lys

Gin Gin 5

Ser Cys

Val Lys

Pro Ser

Thr Leu 70

Ser Leu 85

Tyr Asp

Val Thr

Gly Gly

Alá Ser 150

Val Ser 165

Leu Leu

Phe Ser

Me t Glu

Tyr Pro 230

Ser Gly

Lys Alá

Gin Arg 40

Asn Gly 55

Thr Val

Thr Ser

Tyr Asp

Val Ser 120

Gly Ser 135

Pro Gly

Tyr Me t

Ile Tyr

Gly Ser 200

Alá Glu 215

Pro Me t

Al a	Glu 10
Ser 25	Gly
Alá	Gly
Arg	Thr
Asp	Lys
Glu	Asp 90
Gly 105	Arg
Ser	Gly
Asp	Ile
Glu	Lys
Tyr	Trp 170
Asp 185	Thr
Gly	Ser
As p	Alá
Tyr	Thr

Leu Val

Tyr Thr

Gin Gly

Asn Tyr 60

Ser Ser 75

Ser Alá

Tyr Phe

Gly Gly

Glu Leu 140

Val Thr 155

Tyr Gin

Gly Thr

Alá Thr 220

Phe Gly 235

Ser Asn

Lys Pro

Phe Thr 30

Leu Glu 45

Asn Glu

Ser Thr

Val Tyr

Asp Tyr 110

Gly Ser 125

Thr Gin

Me t Thr

Gin Lys

Gly Alá 15

Ser His

Trp Ile

Lys Phe

Alá Tyr 80

Tyr Cys 95

Trp Gly

Gly Gly

Ser Pro

Cys Ser 160

Thr Gly 175

Leu Alá 190

Ser Gly

Ser Tyr 205

Tyr Tyr

Gly Gly

Ser Leu

Cys Gin

Thr Lys

Claims

1. Immunizált emlős sejtjeiből előállított fágalapú ellenanyag-génkönyvtárból előállítható egyláncú antiEGFR Fv-fragmens, melynek variábilis régiója a következők bármelyike szerinti nehézlánc aminosavszekvenciát: 4., 8., 12., 16., 18., 20., 22., 24., 26. vagy 28. azonosító számú szekvencia; és a következők bármelyike szerinti könnyűlánc aminosavszekvenciát tartalmaz: 2., 6., 10., 14., 18., 20., 22., 24., 26. vagy 28. azonosító számú szekvencia.

2. Az 1. igénypont szerinti ellenanyagfragmens, amely immunizált egér sejtjeiből előállított ellenanyaggénkönyvtárból állítható elő.

3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti ellenanyagfragmens, amely az alábbi eredetű sejtekből előállított ellenanyag-génkönyvtárból állítható elő:

(i) nyirokcsomó, (ii) lép, vagy (iii) in vitro immunizált sejtek.

4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti ellenanyagfragmens nehéz- vagy könnyűláncának

HU 221 001 Bl aminosavszekvenciáját kódoló DNS-molekula, melynek szekvenciája a következő DNS-szekvenciák bármelyike szerinti: 1., 3., 5., 7., 9., 11., 13. vagy 15. azonosító számú szekvencia; vagy az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti ellenanyagfragmens nehézláncának vagy könnyűláncának aminosavszekvenciáját kódoló DNSmolekula, melynek szekvenciája a következő DNS-szekvenciák bármelyike szerinti: 17., 19., 21., 23., 25., 27., 29. vagy 31. azonosító számú szekvencia.

5. Ellenanyag, amelyet 4. igénypont szerinti DNSszekvenciát és humánimmunglobulinok konstans régióiból származtatott DNS-szekvenciát tartalmazó DNSmolekula kódol.

6. Az 5. igénypont szerinti ellenanyag, amelyben a nehéz konstanslánc-régió a humán gamma-l-lánc aminosavszekvenciáját, a könnyű konstanslánc-régió pedig egy humán kappa-lánc aminosavszekvenciáját tartalmazza.

7. Eljárás az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti egyláncú anti-EGFR Fv-fragmens előállítására, azzal jellemezve, hogy:

(i) immunizált emlőssejtekből, előnyösen egérsejtekből RNS-t izolálunk, (ii) első cDNS-szálat szintetizáljuk, (iii) az immunizált sejtekből származó cDNS-ben található V_H- és V_k-géneket amplifikáljuk, (iv) a fenti géneket megfelelő restrikciós helyekkel fágmid-vektorba klónozzuk, (v) a ligálási reakció termékével prokarióta sejteket transzformálunk, (vi) a fág ellenanyag-génkönyvtárakat tisztított EGFR alkalmazásával EGFR-receptorhoz kötődő fág ellenanyagokra átvizsgáljuk, és (vii) a kívánt egyláncú scFv-fragmenst prokarióta gazdasejtben, előnyösen E. coliban termeltetjük.

8. Eljárás teljes anti-EGFR ellenanyag előállítására, azzal jellemezve, hogy a 7. igénypont szerint előállítható anti-EGFR ellenanyagfragmensek variábilis régióit kódoló 4. igénypont szerinti DNS-t legalább egy, humánimmunglobulinok konstans régióit kódoló genomi DNS-t tartalmazó eukarióta expressziós vektorba klónozzuk, a vektorral (vektorokkal) eukarióta sejteket transzformálunk, majd az ellenanyagot expresszáltatjuk, és izoláljuk.

9. Gyógyászati készítmény, amely 1-3. igénypontok bármelyike szerinti anti-EGFR ellenanyagfragmenst vagy 5. vagy 6. igénypont szerinti, teljes anti-EGFR ellenanyagot tartalmaz.

10. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti antiEGFR ellenanyagfragmens vagy az 5. vagy 6. igénypontok szerinti, teljes anti-EGFR ellenanyag alkalmazása tumorellenes hatóanyag előállítására, vagy tumomövekedés diagnosztikus lokalizálására és nyomon követésére alkalmas készítmény előállítására.