CN101687032A - 抗ephb3的拮抗剂抗体 - Google Patents

Abstract

本发明提供EphB3特异性抗体，连同包含此种抗体的药物组合物、包含药物组合物的试剂盒、以及预防和治疗EphB3相关疾病或病症的方法。

Description

抗EPHB3的拮抗剂抗体

技术领域

本发明涉及通过施用EphB3拮抗剂抗体(EphB3-antagonist antibodies)用于预防和治疗EphB3相关疾病或病症的方法。

发明背景

EphB3是ephrin受体酪氨酸激酶家族中的受体。目前已知在人中存在14种Eph受体和9种ephrin配体。Ephrin受体(Ephs)及其配体ephrins介导众多发育过程，特别是在神经系统和血管系统中。Ephrins也已知在肿瘤发展、血管发生、转移生长和细胞存活中起作用。基于其结构和序列关系，ephrins分成通过糖基磷脂酰肌醇键锚定于膜上的ephrin-A(EFNA)类，和为跨膜蛋白质的ephrin-B(EFNB)类。基于其细胞外结构域序列的相似性及其结合ephrin-A和ephrin-B配体的亲和力，Eph受体家族分成2个组。Eph受体构成受体酪氨酸激酶(RTK)家族的最大亚组。

Ephs看起来通过在激活后发信号来起作用。Ephrin的结合诱导Eph受体寡聚化，引起Ephs的近膜残基的磷酸化。活化的Ephs具有多个磷酸化的酪氨酸，其充当信号蛋白质(例如RasGAP、Src、LMW-PTP、PLCg、PI3-激酶、Grb2和包含PDZ的蛋白质)的停泊位点。

Eph受体(EphA1、EphA2、EphB2)的超表达引起在不存在受体过磷酸化的情况下的转化。磷酸化的EphB受体负调节Ras-MAP-激酶途径和FAK信号，损害细胞生长。

已经提示EphB3在各种疾病状态中起作用。例如，EphB3表达与腹腔疾病(celiac disease)中特有的增生和绒毛萎缩相关(Diasdado等人，Gut，53(7)：944-951(2004))。也已提出EphB3在中风和神经变性疾病中具有神经保护性作用。在损伤后EphB3表达的上调也可能促成脊髓中抑制轴突再生的环境(Willson等人，Cell Transplant，12(3)：279-90(2003))。观察到EphB3配体，Ephrin B2，在眼血管生成性疾病中上调(Ozaki等人，Am.J.Opthalmol.，138(2)：270-9(2004))。

因此，需要鉴定可以调节EphB3及其在此种疾病中的作用的组合物和方法。本发明涉及这些以及其他重要需要。

发明概述

EphB3的核苷酸序列显示于SEQ ID NO：1中，并且氨基酸序列显示于SEQ ID NO：2中。细胞外结构域(ECD)由SEQ ID NO：2的氨基酸1-559组成。可替代地，ECD由SEQ ID NO：2的34-555组成(注意在NCBI Entrez蛋白质序列数据库中存在对应于人EphB3的2个地址编号(locus numbers)。在这2种情况下，提交序列的研究者均预测了：(a)由ATG起始密码子到终止密码子的编码区编码的氨基酸的数目；(b)在前体序列中哪个氨基酸区段代表分泌信号序列(这个序列将在成熟加工过程中被去除，以产生成熟的蛋白质)；和(c)哪个残基区段代表跨膜区。因为成熟蛋白质的“细胞外”结构域无论如何都位于信号序列和跨膜结构域之间，所以ECD的预测程度取决于信号和TM区域的放置位置。2个地址的提交者(NP_004434和P54753)都预测前体长度为998个氨基酸，并且分泌信号跨越残基1-33。因此，他们同意ECD起始于残基34。然而，他们在TM区域的起始上不一致：NP_004434预测于残基556起始(从而ECD终止于氨基酸555)，而P54753预测TM在残基560处起始(从而ECD终止于氨基酸559))。如本文实施例中描述的，由氨基酸37-558组成的ECD用于免疫接种以产生抗体。

本发明的材料和方法满足本领域的前述和其他相关需要。本发明一般地涉及减少EphB3受体活性的EphB3拮抗剂抗体，制备此种抗体的方法，和使用EphB3拮抗剂抗体治疗EphB3相关疾病或病症的方法。

在本发明的一个实施方案中，提供了拮抗剂抗体，其以10^-6M或小于10^-6M的亲和力(KD)结合EphB3的细胞外结构域，并且与抗体XPA.04.017、XHA.05.172、XHA.05.849、XPA.04.031或XPA.04.019中的任何一种竞争结合超过75％的EphB3。术语“10^-6M或小于10^-6M的亲和力(KD)”意指例如10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M、10^-10M、10^-11M或10^-12M(即，小于10^-6M的数)的亲和力。在另一个实施方案中，拮抗剂抗体与抗体XPA.04.017、XHA.05.172、XHA.05.849、XPA.04.031或XPA.04.019中的任何一种结合相同的EphB3表位。在另外一个实施方案中，提供了拮抗剂抗体，其包含抗体XPA.04.017、XHA.05.172、XHA.05.849、XPA.04.031或XPA.04.019中任何一种的1、2、3、4、5或6个CDRs。在另外一个实施方案中，前述抗体是嵌合抗体、人源化抗体、工程化人抗体(human engineered antibody)、人抗体、单链抗体或抗体片段。

在本发明的另一个实施方案中，提供了前述拮抗剂抗体，其中CDR内的至少一个氨基酸由另一种抗EphB3抗体的相应CDR的相应残基置换。在另一个实施方案中，提供了前述拮抗剂抗体，其中CDR内的1个或2个氨基酸已进行修饰。在另外一个实施方案中，拮抗剂抗体在可变轻链区或重链区上保留与抗体XPA.04.017、XHA.05.172、XHA.05.849、XPA.04.031或XPA.04.019至少60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％的同一性。在另外一个实施方案中，拮抗剂抗体包含人抗体序列的恒定区和人抗体序列的一个或多个重和轻链可变构架区。在另外一个实施方案中，提供了前述拮抗剂抗体，其中人抗体序列是人个体序列、人共有序列、人个体胚系序列或人共有胚系序列。

在另外一个实施方案中，本发明提供了前述拮抗剂抗体，其中重链恒定区是修饰或未修饰的IgG、IgM、IgA、IgD、IgE，其片段，或其组合。在另一个实施方案中，拮抗剂抗体与EphB3具有10^-7、10^-8、10^-9、10^-10或10^-11M或更低的结合亲和力。在另外一个实施方案中，提供了在CDRs中包含保守置换的前述拮抗剂抗体。在另外一个实施方案中，提供了在低和中等风险残基中包含保守或非保守改变的前述拮抗剂抗体。在另一个实施方案中，提供了前述拮抗剂抗体，其中轻链恒定区是修饰或未修饰的λ轻链恒定区、κ轻链恒定区、其片段、或其组合。

用于测量对EphB3活性的抑制的体外试验是本领域已知的。例如，可以考虑细胞迁移试验(例如针对血管发生的HUVEC迁移试验、针对腹腔疾病的肠细胞迁移、中风中的炎症细胞)和细胞基质粘附试验(例如层粘连蛋白、纤连蛋白)(Miao，H.等人，J.Biol.Chem.，280(2)：923-931(2005)；Wang，Y.等人，Angiogenesis，7：335-345(2004)；Nakada，M等人，Cancer Res.，66(17)：8492-8500(2006)；和Gupta，S.K.等人，J.Leuko.Biol.66(1)：135-143(1999))。

在再进一步的示例性实施方案中，提供了前述拮抗剂抗体，其增强细胞增殖，例如神经细胞增殖和/或再生。在其他示例性实施方案中，抑制细胞增殖(例如，与肠细胞相关的细胞增殖，例如在腹腔疾病中，或者与血管或内皮细胞相关的细胞增殖，例如在血管发生中)是有用的。

本发明考虑众多方法。在本发明的一个实施方案中，提供了筛选用于治疗EphB3相关疾病或病症的、针对EphB3蛋白质细胞外结构域的拮抗剂抗体的方法，其包括下述步骤：使包含EphB3的ECD的多肽与候选抗体接触，所述候选抗体包含抗体XPA.04.017、XHA.05.172、XHA.05.849、XPA.04.031或XPA.04.019的至少1、2、3、4、5或6个CDRs；检测候选抗体与多肽的结合亲和力，并且如果检测出至少10^-6M的结合亲和力，则将候选抗体鉴定为可以用于治疗EphB3相关疾病或病症的拮抗剂抗体。在另外一个实施方案中，提供了系统地改变抗体和筛选针对EphB3蛋白质细胞外结构域的拮抗剂抗体的方法，所述拮抗剂抗体可以用于治疗EphB3相关疾病或病症，所述方法包括下述步骤：制备在抗体XPA.04.017、XHA.05.172、XHA.05.849、XPA.04.031或XPA.04.019的CDRs内包含对于1个或2个氨基酸的修饰的候选抗体；使包含EphB3的ECD的多肽与候选抗体接触；检测候选抗体与多肽的结合亲和力，并且如果检测出至少10^-6M的结合亲和力，则将候选抗体鉴定为可以用于治疗EphB3相关疾病或病症的拮抗剂抗体。

在另外一个实施方案中，提供了筛选用于治疗EphB3相关疾病或病症的针对EphB3蛋白质细胞外结构域的拮抗剂抗体的方法，其包括下述步骤：使肠、内皮或神经细胞与候选抗体接触，所述候选抗体包含抗体XPA.04.017、XHA.05.172、XHA.05.849、XPA.04.031或XPA.04.019的至少1、2、3、4、5或6个CDRs或者在一个或多个CDRs内包含1个或2个氨基酸的修饰；检测细胞的增殖或存活；并且如果检测出细胞增殖或存活上的改变，那么鉴定候选抗体为可以用于治疗EphB3相关疾病或病症的拮抗剂抗体。

在另外一个实施方案中，提供了治疗患有与病理性肠细胞增殖相关的腹腔疾病或其他疾病的受试者的方法，其包括施用治疗有效量的前述一种抗体的步骤。在再进一步的实施方案中，提供了治疗神经变性疾病、或在神经或脊髓的局部缺血性或创伤性或其他损伤后用于刺激轴突或其他神经元再生的方法。示例性神经元疾病包括：由创伤性损伤、脑或局部血管缺血、毒素、或感染(包括病毒、细菌、真菌或寄生虫感染)造成的对神经元的损害、以及帕金森氏病、亨廷顿氏病、阿尔茨海默氏病、老年性痴呆、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、多发性硬化(MS)、周围神经病变、脊髓性肌萎缩、克-雅二氏病(Creutzfeldt-Jakob disease)或AIDS痴呆。在另一个实施方案中，提供了治疗与病理性血管细胞增殖相关的血管生成性疾病或其他疾病的方法，其包括施用治疗有效量的前述抗体之一的步骤。示例性血管生成性疾病包括：眼疾病例如糖尿病性视网膜病变或早产儿视网膜病变、或老年性黄斑变性、以及银屑病、类风湿性关节炎、粉瘤、动脉再狭窄、血管瘤、自身免疫疾病、与其他急性或慢性炎症、疤痕或粘连形成、或子宫内膜异位症相关的血管发生。在另外一个实施方案中，施用第二治疗剂。在另外一个实施方案中，受试者用其他治疗剂或手术进一步治疗。

在本发明的另外一个实施方案中，提供了靶向表达EphB3的细胞的方法，其包括施用与放射性核素或其他毒素缀合的前述拮抗剂抗体的步骤。在另外一个实施方案中，提供了前述方法，其中受试者是哺乳动物。在另外一个实施方案中，受试者是人。

在本发明的另一个实施方案中，提供了包含如下核苷酸序列的分离的核酸分子，所述核苷酸序列编码前述拮抗剂抗体的重链或轻链。在另外一个实施方案中，提供了包含与调节控制序列可操作地连接的前述核酸分子的表达载体。在另外一个实施方案中，提供了包含前述载体或前述核酸分子的宿主细胞。在另外一个实施方案中，提供了使用前述宿主细胞产生拮抗剂抗体的方法，包括在合适的条件下培养宿主细胞且回收抗体。在另一个实施方案中，提供了通过前述方法产生的拮抗剂抗体。

在本发明的另一个实施方案中，提供了纯化至至少95重量％同质性的前述拮抗剂抗体。在另外一个实施方案中，提供了包含前述拮抗剂抗体和药学上可接受的载体的药物组合物。在另外一个实施方案中，提供了包含前述拮抗剂抗体的试剂盒，其包含包装在容器中的治疗有效量的本发明的抗体，其中所述试剂盒任选包含第二治疗剂，且进一步包含附着于容器上或与容器包装在一起的标签，所述标签描述了容器的内容物，且提供关于如何使用容器的内容物治疗EphB3相关疾病或病症的适应症和/或说明书。在另一个实施方案中，提供了前述试剂盒，其中容器是小瓶或瓶或预装注射器。

附图简述

图1显示了XPA.04.017、XPA.04.031和XPA.04.019轻链和重链的风险线(H＝高风险，M＝中等风险，L＝低风险)，XPA.04.017、XPA.04.031和XPA.04.019轻链和重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NOs：3-8)，以及CDR H1、H2和H3在氨基酸序列内的定位。

发明详述

本发明提供了EphB3特异性拮抗剂抗体，包含此种拮抗剂抗体的药物制剂，制备该拮抗剂抗体和药物制剂的方法，以及用该药物制剂和化合物治疗患者的方法。此种拮抗剂抗体可以抑制配体(例如Ephrin B2、EphrinB1、Ephrin B3)与EphB3的结合、抑制EphB3二聚化、抑制EphB3磷酸化、抑制配体诱导的EphB3受体活化、和/或调节EphB3介导的细胞-细胞粘着。本文提供的一类拮抗剂抗体抑制Ephrin B2与EphB3受体的结合，并且可以充当竞争性抑制剂。本文提供的另一类拮抗剂抗体不抑制Ephrin B2与EphB3受体的结合，但仍减少EphB3磷酸化和/或二聚化(受体活化的量度)的水平。类似地，本文提供的另一类拮抗剂抗体抑制EphrinB1和/或Ephrin B3与EphB3受体的结合，并且可以充当竞争性抑制剂。本文提供的再一类拮抗剂抗体不抑制Ephrin B1和/或Ephrin B3与EphB3受体的结合，但仍减少EphB3磷酸化和/或二聚化的水平。

在某些实施方案中，本发明的拮抗剂抗体结合本文公开的表位或其部分。在某些实施方案中，拮抗剂抗体与受体的结合抑制受体磷酸化。在某些实施方案中，拮抗剂抗体与受体的结合抑制配体与EphB3的结合。在某些实施方案中，拮抗剂抗体与受体的结合抑制EphB3二聚化。在某些实施方案中，拮抗剂抗体与受体的结合抑制配体诱导的受体活化。受体活化(即，信号传递)可以通过本领域已知的技术来确定。例如，受体活化可以经由免疫沉淀随后为蛋白质印迹分析来检测受体或其底物(例如酪氨酸或丝氨酸/苏氨酸)的磷酸化进行确定。在某些实施方案中，提供了拮抗剂抗体，其使配体活性或受体活性受到抑制，达到在不存在抗体的情况下的活性的至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％或至少50％。

在某些实施方案中，EphB3抗体抑制EphB3与细胞内衔接蛋白质的结合。

如本文所使用的，术语“细胞内衔接蛋白质”指使信号复合物的不同部分连接的蛋白质。衔接子可以具有或不具有酶促活性。衔接蛋白质的例子是本领域技术人员已知的。例如，Grb2是不具有内在酶促活性的衔接蛋白质，而RasGAP是具有酶促活性的衔接蛋白质。

可以对如通过体外试验测量的具有高亲和力和效力的几种优选鼠类或嵌合抗体，基于Studnicka等人的Human Engineering^TM方法，进行修饰，以在人中具有更少免疫原性。简言之，将重链和轻链可变区的表面暴露氨基酸残基在测定为不可能不利地影响抗原结合或蛋白质折叠的位置中改变为人残基，由此减少其就人类环境而言的免疫原性。构建编码修饰的重和/或轻链可变区的合成基因，并且与人γ重链和/或κ轻链恒定区的编码序列连接。任何人重链和轻链恒定区都可以与Human Engineered^TM抗体可变区组合使用。将该人重和轻链基因引入哺乳动物细胞内，获得所产生的重组免疫球蛋白产物且进行表征。

根据本发明的示例性拮抗剂抗体包括XPA.04.017、XHA.05.172、XHA.05.849、XPA.04.031或XPA.04.019。依照布达佩斯条约的条款，于2006年11月17日将下述抗体分泌性杂交瘤保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801 University Blvd.，Manassas，VA 20110-2209(USA)：

杂交瘤名称	ATCC保藏号
		XHA.05.172
XHA.05.849

提供下述定义用于帮助更全面地了解本发明。

一般定义

如本文所使用的，靶抗原人“EphB3”指与SEQ ID NO：2具有基本上相同的氨基酸序列的人多肽，及其天然存在的等位基因变体。如本文所使用的，“EphB3的ECD”指由SEQ ID NO：2的氨基酸37-558表示的EphB3的细胞外部分。

如本文所使用的，“EphB3相关疾病或病症”指与病理性肠细胞增殖相关的腹腔疾病或其他疾病；与病理性血管细胞增殖相关的血管生成性疾病或其他疾病，例如眼血管生成性疾病，例如糖尿病性视网膜病变或早产儿视网膜病变、或老年性黄斑变性、以及银屑病、类风湿性关节炎、粉瘤、动脉再狭窄、血管瘤、自身免疫疾病、与其他急性或慢性炎症疤痕或粘连形成、或子宫内膜异位症相关的血管发生；神经元损伤，例如经由创伤性损伤、脑或局部血管缺血、毒素、或感染(包括病毒、细菌、真菌或寄生虫感染)造成的神经元损伤；神经变性疾病，例如帕金森氏病、亨廷顿氏病、阿尔茨海默氏病、老年性痴呆、淀粉样侧索硬化(Amyloid lateral schlerosis，ALS)、多发性硬化(MS)、周围神经病变、脊髓性肌萎缩、克-雅二氏病或AIDS痴呆；或癌症，例如肺、卵巢、食道、结肠或乳腺癌。

“治疗”是以阻止病症的病理状态发展或改变病症的病理状态为目的而进行的干预。因此，“治疗”指治疗性治疗和防止或预防措施。需要治疗的对象包括已患有病症的那些以及有待于其中预防病症的那些。对患有临床、生物化学、放射学或主观的疾病症状的患者的治疗，可以包括减轻某些或所有此种症状或减少对疾病的易感性。

对于治疗目的，“哺乳动物”指分类为哺乳动物的任何动物，包括人、家畜和农畜、和动物园动物、竞技动物或宠物动物，例如犬、马、猫、牛等。优选地，哺乳动物是人。

如本文所使用的，短语“治疗有效量”是指对于本发明的实施方案是合适的治疗或预防抗体量，当依照期望的治疗方案施用时，所述量将引起所期望的治疗或预防效应或应答，包括减轻某些或所有的此种疾病症状或减少对疾病的易感性。

抗体

术语“免疫特异性”或“特异性结合”意指抗体以大于或等于约10⁴M^-1、优选大于或等于约10⁵M^-1、更优选大于或等于约10⁶M^-1的K_a与EphB3或其ECD结合。与其他无关分子比较，抗体可以对靶抗原具有实质上更大的亲和力。与直向同源物或同源物比较，抗体也可以对靶抗原具有实质上更大的亲和力，例如对于靶抗原至少1.5-倍、2-倍、5-倍10-倍、100-倍、10³-倍、10⁴-倍、10⁵-倍、10⁶-倍或更大的相对亲和力。备选地，与已知同源物或直向同源物交叉反应的抗体可能是有用的。

本发明的抗体也可以通过至少10^-4M，优选至少约10^-4M至约10^-12M，更优选至少约10^-5M、10^-6M、10^-7M或10^-8M、10^-9M、10^-10M或10^-11M的亲和力(K_D)表征。对于抗体，合适的亲和力可以依治疗应用而变。此种亲和力可以使用常规技术容易地进行测定，例如通过平衡透析；通过使用BIAcore 2000仪器，使用由制造商给出的一般操作方案；通过放射性免疫测定试验使用放射性标记的靶抗原；或通过本领域技术人员已知的其他方法。亲和力数据可以例如通过Scatchard等人，Ann N.Y.Acad.Sci.，51：660(1949)的方法进行分析。

“拮抗剂抗体”意指能够抑制EphB3的活化的抗体分子。因此，“拮抗剂”抗EphB3抗体能够抑制配体与EphB3结合，减少磷酸化活性，减少EphB3寡聚化，减少EphB3内化，和/或减少EphB3下游信号传导。术语“抗体”按最广义使用，并且包括完全装配的抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、可以结合抗原的抗体片段(例如Fab’、F’(ab)2、Fv、单链抗体、双链抗体(diabodies))、和包含前述的重组肽，只要它们显示期望的生物活性即可。抗体片段可以通过使用重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学切割进行生产，并且在下文进一步描述。单克隆抗体的非限制性例子包括鼠类、嵌合、人源化、人和Human Engineered^TM免疫球蛋白、抗体、具有衍生自免疫球蛋白的序列的嵌合融合蛋白、或其突变蛋白或衍生物，各自在下文进一步描述。本发明考虑完整分子和/或片段的多聚体或聚集物，包括化学衍生的抗体。根据本发明考虑具有任何同种型类型或亚型的抗体。

如本文所使用的，术语“单克隆抗体”指该抗体得自基本上同质的一群抗体，即，除了可能以小量存在的可能天然突变或可变翻译后修饰外，群体中包含的每个单抗体都是相同的。单克隆抗体是高度特异性的；与一般包含针对不同决定簇(表位的)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制备物形成对比，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除了其特异性，单克隆抗体的有利之处还在于它们由同质培养物合成，不被具有不同特异性和特征的其他免疫球蛋白污染。

修饰词“单克隆”指抗体得自基本上同质的一群抗体的特征，而不应解释为需要通过任何特定方法生产该抗体。例如，待依照本发明使用的单克隆抗体可以通过首先由Kohler等人，1975Nature，256：495描述的杂交瘤方法进行制备，或可以通过重组DNA方法进行制备(参见，例如，美国专利号4,816,567)。“单克隆抗体”还可以例如是重组的、嵌合的、人源化的、人的、Human Engineered^TM的或抗体片段。

“分离的”抗体是已鉴定并且从其天然环境的组分中分离和回收的抗体。其天然环境的污染组分是将干扰抗体的诊断或治疗用途的物质，并且可以包括酶、激素和其他蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选实施方案中，抗体将纯化至(1)如通过Lowry方法测定的超过95重量％，并且最优选超过99重量％的抗体，(2)通过使用转杯序列分析仪足以获得N末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(3)使用考马斯蓝或优选地银染色在还原或非还原条件下通过SDS-PAGE为同质。分离的抗体包括在重组细胞内原位的抗体，因为抗体天然环境的至少一种组分将不存在。然而，一般地，分离的抗体将通过至少一个纯化步骤进行制备。

“免疫球蛋白”或“天然抗体”是四聚体糖蛋白。在天然存在的免疫球蛋白中，每个四聚体由2对相同的多肽链组成，每对具有1条“轻”链(约25kDa)和1条“重”链(约50-70kDa)。每条链的氨基末端部分包括主要负责抗原识别的约100-110个或更多氨基酸的“可变”(“V”)区。每条链的羧基末端部分定义主要负责效应子功能的恒定区。依赖其重链的恒定结构域的氨基酸序列，免疫球蛋白可以归于不同类。重链分类为mu(μ)、delta(A)、gamma(γ)、alpha(α)和epsilon(ε)，并且分别定义抗体的同种型IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。这些中的几种可以进一步分成亚类或同种型，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。不同同种型具有不同的效应子功能；例如IgG1和IgG3同种型具有抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性。人轻链分类为kappa(κ)和lambda(λ)轻链。在轻和重链内，可变区和恒定区通过约12个或更多氨基酸的“J”区连接，其中重链还包括约10个或更多氨基酸的“D”区。一般参见，FundamentalImmunology，Ch.7(Paul，W.，编辑，第2版Raven Press，N.Y.(1989))。

关于抗体的结构和产生的详细描述，参见Roth，D.B.和Craig，N.L.，Cell，94：411-414(1998)，其整体引入本文作为参考。简言之，产生编码重和轻链免疫球蛋白序列的DNA的过程主要在发育中的B细胞中发生。在各种免疫球蛋白基因区段发生重排和连接之前，V、D、J和恒定(C)基因区段一般以相对紧密地接近的方式位于单个染色体上。在B细胞分化过程中，V、D、J基因区段(或在轻链基因的情况下仅V和J)的各一个合适的家族成员发生重组以形成功能性重排的重和轻免疫球蛋白基因可变区。这种基因区段重排过程看起来是顺次的。首先，进行重链D至J连接，随后为重链V至DJ连接，和轻链V至J连接。除了V、D和J区段的重排外，通过在轻链的V和J区段连接处和在重链的D和J区段连接处的可变重组，进一步的多样性在免疫球蛋白重和轻链的初级库(primaryrepertoire)中产生。轻链中的此种变异一般在V基因区段的最后一个密码子和J区段的第一个密码子内发生。连接上的相似不精确性在重链染色体上D和J_H区段之间发生，并且可以延伸超过多达10个核苷酸。此外，D和J_H之间以及V_H和D基因区段之间可以插入几个核苷酸，所述核苷酸非由基因组DNA编码。这些核苷酸的添加称为N-区多样性。可变区基因区段中的此种重排和可以在此种连接过程中发生的可变重组的净效应是初级抗体库的产生。

“抗体片段”包含完整全长抗体的部分，优选地完整抗体的抗原结合或可变区，并且包括由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体片段的非限制性例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、结构域抗体(dAb)、互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、单链抗体片段、双链抗体、三链抗体、四链抗体、微型抗体(minibody)、线性抗体(Zapata等人，Protein Eng.，8(10)：1057-1062(1995))；螯合重组抗体、三体(tribody)或双体(bibody)、胞内抗体(intrabody)、纳米抗体、小分子免疫药物(small modularimmunopharmaceuticals，SMIPs)、抗原结合结构域免疫球蛋白融合蛋白、驼源化(camelized)抗体、包含VHH的抗体、或其突变蛋白质或衍生物、和包含免疫球蛋白的至少部分的多肽(所述部分足以赋予多肽特异性的抗原结合，例如CDR序列)，条件是抗体保留所需生物活性。

抗体的木瓜蛋白酶消化产生2个相同的抗原结合片段(称为“Fab”片段，各自具有单个抗原结合位点)，和残留的“Fc”片段(其名称反映了其容易结晶化的能力)。胃蛋白酶处理得到具有2个“Fv片段”的F(ab′)2片段。“Fv”片段是包含完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。这个区域由紧密、非共价结合的1个重链和1个轻链可变结构域的二聚体组成。其构型使得每个可变结构域的3个CDRs相互作用，以在VH VL二聚体的表面上界定出抗原结合位点。共同地，6个CDRs赋予抗体抗原结合特异性。然而，甚至单个可变结构域(或仅包含对于抗原特异的3个CDRs的Fv的一半)也具有识别且结合抗原的能力。

“单链Fv”或“sFv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单条多肽链中。优选地，Fv多肽进一步包含在VH和VL结构域之间的多肽接头，其使得Fv能够形成用于抗原结合的所需结构。关于scFv的综述，参见Pluckthun in The Pharmacology of MonoclonalAntibodies，第I13卷，Rosenburg和Moore编辑，Springer-Verlag，NewYork，第269-315页(1994)。

Fab片段还包含轻链的恒定结构域和重链的第一个恒定结构域(CH1)。Fab片段不同于Fab′片段之处在于重链CH1结构域的羧基末端处几个残基的添加，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab′-SH是本文中恒定结构域的一个或多个半胱氨酸残基具有游离巯基的Fab′的命名。F(ab′)2抗体片段最初Fab′片段对的形式产生，该对Fab′片段在其间具有铰链半胱氨酸。

术语“高变”区指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”或CDR的氨基酸残基[即轻链可变结构域中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)和重链可变结构域中的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)，如由Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版Public Health Service，National Institutesof Health，Bethesda，Md.(1991)描述的]和/或来自高变环的那些残基(即轻链可变结构域中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)和重链可变结构域中的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)，如由[Chothia等人，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)]描述的。

“构架”或FR残基是除高变区残基外的那些可变结构域残基。

短语“恒定区”指赋予效应子功能的抗体分子的部分。

如本文所使用的，短语“嵌合抗体”指包含衍生自2种不同抗体的序列的抗体(参见例如美国专利号4,816,567)，所述2种不同抗体一般源自不同物种。最一般地，嵌合抗体包含人和鼠类抗体片段，一般是人恒定区和小鼠可变区。

术语“突变蛋白质”指如下的抗体的多肽序列，其在可变区或等价于可变区的部分中包含至少一个氨基酸置换、缺失或插入，条件是突变蛋白质保留所需结合亲和力或生物活性。突变蛋白质可以与亲本抗体基本上同源或基本上等同。

术语“衍生物”当与本发明的抗体结合使用时，指通过如下技术进行共价修饰的抗体，所述技术如遍在蛋白化、与治疗或诊断剂缀合、标记(例如用放射性核素或各种酶)、共价聚合物附着例如聚乙二醇化(用聚乙二醇衍生)和通过非天然氨基酸的化学合成的插入或置换。本发明的衍生物将保留本发明的未衍生分子的结合性质。

当在本文中使用时，术语“抗体”尤其包括保留结合EphB3细胞外部分的能力的下述任何一种：

1)具有图1中所示氨基酸序列的亲本抗体的氨基酸突变蛋白质，包括包含如下可变重链氨基酸序列和/或包含如下可变轻链氨基酸序列的突变蛋白质，所述可变重链氨基酸序列与亲本氨基酸序列至少60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同源，所述可变轻链氨基酸序列与亲本氨基酸序列至少60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同源(对于此同源性的确定，考虑相似氨基酸)；

2)包含具有图1中所示氨基酸序列的亲本抗体的一个或多个互补决定区(CDRs)的EphB3结合多肽，优选地包含重链的至少CDR3，且优选包含2个或更多、或3个或更多、或4个或更多、或5个或更多、或所有6个CDRs；

3)根据在Studnicka等人，美国专利号5,766,886和本文实施例8中所示的方法，通过改变亲本序列产生的Human Engineered^TM抗体，其中使用Kabat编号以鉴定低、中等和高风险残基；此种抗体包含至少一条下述重链和至少一条下述轻链：(a)其中不同于人参考免疫球蛋白序列中的相应残基的所有低风险啮齿类动物残基已被修饰为与人参考免疫球蛋白序列中的人残基相同的残基的重链，或(b)其中所有低和中等风险的啮齿类动物残基已被修饰(必要时，与人参考免疫球蛋白序列中的残基相同)的重链，(c)其中所有低风险残基已被修饰(必要时，与人参考免疫球蛋白序列中的残基相同)的轻链，或(d)其中所有低和中等风险的残基已被修饰(必要时，与人参考免疫球蛋白序列中的残基相同)的轻链；

4)前述段落(3)中的所述抗体的突变蛋白质，其包含与原始啮齿类动物轻链具有至少60％氨基酸序列同一性的重或轻链，更优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、和最优选至少95％，包括例如65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和100％同一性；

5)EphB3结合多肽，其包含啮齿类动物抗体的一个或多个CDRs的高风险残基，且优选包含2个或更多、或3个或更多、或4个或更多、或5个或更多、或所有6个CDRs的高风险残基，并且任选包含在低或中等风险残基处的一个或多个改变；

例如，包含在低风险残基处的一个或多个改变和在中等风险残基处的保守置换，或

例如，保留中等和高风险氨基酸残基，且包含在低风险残基处的一个或多个改变，

其中所述改变包括插入、缺失或置换，并且可以是保守置换，或可以致使该工程化抗体在序列上更接近于人轻链或重链序列、人胚系轻链或重链序列、共有人轻链或重链序列、或共有人胚系轻链或重链序列。此种被考虑的改变也可以以如下序列形式显示。在AKKLVHTPYSFKEDF的假定序列中，其中根据Studnicka等人，美国专利号5,766,886分配至每个残基的相应风险，是HMLHMLHMLHMLHML(H＝高，M＝中，L＝低)，对于该假定序列的低风险残基的示例性改变可以显示为AKXLVXTPXSFXEDX，其中X是任何氨基酸，或可替代地其中X是在那个位置处的原始残基的保守置换，对于低和中等风险残基的示例性改变可以类似地显示为，例如AYXLYXTYXSYXEYX，其中X是任何氨基酸，Y是在那个位置处的原始残基的保守置换。

术语“竞争性抗体”包括

1)例如，如通过X射线晶体学测定的，与抗体XPA.04.017、XHA.05.172、XHA.05.849、XPA.04.031或XPA.04.019结合EphB3的相同表位的单克隆抗体；和

2)与抗体XPA.04.017、XHA.05.172、XHA.05.849、XPA.04.031或XPA.04.019竞争超过75％、超过80％、或超过81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％或95％的单克隆抗体。

本发明的抗体优选以至少10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10或10^-11M或更低值的亲和力K_D与EphB3的ECD结合，并且优选抑制受体磷酸化、信号传导、配体结合、EphB3二聚化、配体诱导的受体活化、和/或EphB3介导的细胞间粘着。

任选地，在本申请的申请日前公众公开的或在该日期前提交的申请中公开的任何嵌合、人或人源化抗体排除于本发明的范围之外。

“非啮齿类动物”单克隆抗体如本文广义定义为不是由啮齿类动物杂交瘤产生的完整全啮齿类动物单克隆抗体的任何抗体。因此，非啮齿类动物抗体具体地包括但不限于，啮齿类动物抗体的突变蛋白质、啮齿类动物抗体片段、线性抗体、嵌合抗体、人源化抗体、Human Engineered^TM抗体和人抗体，包括由转基因动物或经由噬菌体展示技术产生的人抗体。类似地，非鼠类抗体包括但不限于鼠类抗体的突变蛋白质、鼠类抗体片段、线性抗体、嵌合、人源化、Human Engineered^TM抗体和人抗体。

靶抗原

用于生产抗体的靶抗原可以是例如保留所需表位，任选与另一种多肽融合的EphB3的细胞外部分，或其片段，所述另一种多肽允许表位以其天然构象展示。可替代地，可以使用在细胞表面上表达的完整EphB3产生抗体。此种细胞可以是经转化以表达EphB3的细胞，或可以是表达EphB3的其他天然存在的细胞。可以用于产生抗体的EphB3多肽的其他形式对于本领域技术人员是显而易见的。

EphB3的各种结构域包括配体结合结构域(SEQ ID NO：2的氨基酸残基39-212)，TNFR结构域(SEQ ID NO：2的氨基酸残基256-331)，第一个纤连蛋白结构域(SEQ ID NO：2的氨基酸残基340-435)，和第二个纤连蛋白结构域(SEQ ID NO：2的氨基酸残基453-535)。EphB3的配体结合结构域的示例性表位选自SEQ ID NOS：9-143。EphB3的TNFR结构域的示例性表位选自SEQ ID NOS：159-257。EphB3的第一个纤连蛋白结构域的示例性表位选自SEQ ID NOS：257-299。EphB3的第二个纤连蛋白结构域的示例性表位选自SEQ ID NOS：378-419。

下表1提供了已鉴定为适于被抗EphB3抗体识别的线性表位的EphB3(SEQ ID NO：2)区域。

表1

作图区域(aa)	表体长度	表位	氨基酸序列位置	表位#	SEQ ID NO：
						98-115	8-聚体	WRRDVQRV	98-105	1	9
98-115	8-聚体	RRDVQRVY	99-106	2	10
						98-115	8-聚体	RDVQRVYV	100-107	3	11
98-115	8-聚体	DVQRVYVE	101-108	4	12
						98-115	8-聚体	VQRVYVEL	102-109	5	13
98-115	8-聚体	QRVYVELK	103-110	6	14
						98-115	8-聚体	RVYVELKF	104-111	7	15
98-115	8-聚体	VYVELKFT	105-112	8	16
						98-115	8-聚体	YVELKFTV	106-113	9	17

98-115	8-聚体	VELKFTVR	107-114	10	18
						98-115	8-聚体	ELKFTVRD	108-115	11	19
98-115	9-聚体	WRRDVQRVY	98-106	12	20
						98-115	9-聚体	RRDVQRVYV	99-107	13	21
98-115	9-聚体	RDVQRVYVE	100-108	14	22
						98-115	9-聚体	DVQRVYVEL	101-109	15	23
98-115	9-聚体	VQRVYVELK	102-110	16	24
						98-115	9-聚体	QRVYVELKF	103-111	17	25
98-115	9-聚体	RVYVELKFT	104-112	18	26
						98-115	9-聚体	VYVELKFTV	105-113	19	27
98-115	9-聚体	YVELKFTVR	106-114	20	28
						98-115	9-聚体	VELKFTVRD	107-115	21	29
98-115	10-聚体	WRRDVQRVYV	98-107	22	30
						98-115	10-聚体	RRDVQRVYVE	99-108	23	31
98-115	10-聚体	RDVQRVYVEL	100-109	24	32
						98-115	10-聚体	DVQRVYVELK	101-110	25	33
98-115	10-聚体	VQRVYVELKF	102-111	26	34
						98-115	10-聚体	QRVYVELKFT	103-112	27	35
98-115	10-聚体	RVYVELKFTV	104-113	28	36
						98-115	10-聚体	VYVELKFTVR	105-114	29	37
98-115	10-聚体	YVELKFTVRD	106-115	30	38
						152-194	8-聚体	NPYVKVDT	152-159	1	39
152-194	8-聚体	PYVKVDTI	153-160	2	40
						152-194	8-聚体	YVKVDTIA	154-161	3	41
152-194	8-聚体	VKVDTIAP	155-162	4	42
						152-194	8-聚体	KVDTIAPD	156-163	5	43
152-194	8-聚体	VDTIAPDE	157-164	6	44
						152-194	8-聚体	DTIAPDES	158-165	7	45
152-194	8-聚体	TIAPDESF	159-166	8	46
						152-194	8-聚体	IAPDESFS	160-167	9	47
152-194	8-聚体	APDESFSR	161-168	10	48
						152-194	8-聚体	PDESFSRL	162-169	11	49
152-194	8-聚体	DESFSRLD	163-170	12	50
						152-194	8-聚体	ESFSRLDA	164-171	13	51
152-194	8-聚体	SFSRLDAG	165-172	14	52
						152-194	8-聚体	FSRLDAGR	166-173	15	53
152-194	8-聚体	SRLDAGRV	167-174	16	54
						152-194	8-聚体	RLDAGRVN	168-175	17	55
152-194	8-聚体	LDAGRVNT	169-176	18	56
						152-194	8-聚体	DAGRVNTK	170-177	19	57
152-194	8-聚体	AGRVNTKV	171-178	20	58
						152-194	8-聚体	GRVNTKVR	172-179	21	59
152-194	8-聚体	RVNTKVRS	173-180	22	60
						152-194	8-聚体	VNTKVRSF	174-181	23	61
152-194	8-聚体	NTKVRSFG	175-182	24	62
						152-194	8-聚体	TKVRSFGP	176-183	25	63
152-194	8-聚体	KVRSFGPL	177-184	26	64
						152-194	8-聚体	VRSFGPLS	178-185	27	65
152-194	8-聚体	RSFGPLSK	179-186	28	66
						152-194	8-聚体	SFGPLSKA	180-187	29	67
152-194	8-聚体	FGPLSKAG	181-188	30	68
						152-194	8-聚体	GPLSKAGF	182-189	31	69

152-194	8-聚体	PLSKAGFY	183-190	32	70
						152-194	8-聚体	LSKAGFYL	184-191	33	71
152-194	8-聚体	SKAGFYLA	185-192	34	72
						152-194	8-聚体	KAGFYLAF	186-193	35	73
152-194	8-聚体	AGFYLAFQ	187-194	36	74
						152-194	9-聚体	NPYVKVDTI	152-160	37	75
152-194	9-聚体	PYVKVDTIA	153-161	38	76
						152-194	9-聚体	YVKVDTIAP	154-162	39	77
152-194	9-聚体	VKVDTIAPD	155-163	40	78
						152-194	9-聚体	KVDTIAPDE	156-164	41	79
152-194	9-聚体	VDTIAPDES	157-165	42	80
						152-194	9-聚体	DTIAPDESF	158-166	43	81
152-194	9-聚体	TIAPDESFS	159-167	44	82
						152-194	9-聚体	IAPDESFSR	160-168	45	83
152-194	9-聚体	APDESFSRL	161-169	46	84
						152-194	9-聚体	PDESFSRLD	162-170	47	85
152-194	9-聚体	DESFSRLDA	163-171	48	86
						152-194	9-聚体	ESFSRLDAG	164-172	49	87
152-194	9-聚体	SFSRLDAGR	165-173	50	88
						152-194	9-聚体	FSRLDAGRV	166-174	51	89
152-194	9-聚体	SRLDAGRVN	167-175	52	90
						152-194	9-聚体	RLDAGRVNT	168-176	53	91
152-194	9-聚体	LDAGRVNTK	169-177	54	92
						152-194	9-聚体	DAGRVNTKV	170-178	55	93
152-194	9-聚体	AGRVNTKVR	171-179	56	94
						152-194	9-聚体	GRVNTKVRS	172-180	57	95
152-194	9-聚体	RVNTKVRSF	173-181	58	96
						152-194	9-聚体	VNTKVRSFG	174-182	59	97
152-194	9-聚体	NTKVRSFGP	175-183	60	98
						152-194	9-聚体	TKVRSFGPL	176-184	61	99
152-194	9-聚体	KVRSFGPLS	177-185	62	100
						152-194	9-聚体	VRSFGPLSK	178-186	63	101
152-194	9-聚体	RSFGPLSKA	179-187	64	102
						152-194	9-聚体	SFGPLSKAG	180-188	65	103
152-194	9-聚体	FGPLSKAGF	181-189	66	104
						152-194	9-聚体	GPLSKAGFY	182-190	67	105
152-194	9-聚体	PLSKAGFYL	183-191	68	106
						152-194	9-聚体	LSKAGFYLA	184-192	69	107
152-194	9-聚体	SKAGFYLAF	185-193	70	108
						152-194	9-聚体	KAGFYLAFQ	186-194	71	109
152-194	10-聚体	NPYVKVDTIA	152-161	72	110
						152-194	10-聚体	PYVKVDTIAP	153-162	73	111
152-194	10-聚体	YVKVDTIAPD	154-163	74	112
						152-194	10-聚体	VKVDTIAPDE	155-164	75	113
152-194	10-聚体	KVDTIAPDES	156-165	76	114
						152-194	10-聚体	VDTIAPDESF	157-166	77	115
152-194	10-聚体	DTIAPDESFS	158-167	78	116
						152-194	10-聚体	TIAPDESFSR	159-168	79	117
152-194	10-聚体	IAPDESFSRL	160-169	80	118
						152-194	10-聚体	APDESFSRLD	161-170	81	119
152-194	10-聚体	PDESFSRLDA	162-171	82	120
						152-194	10-聚体	DESFSRLDAG	163-172	83	121

152-194	10-聚体	ESFSRLDAGR	164-173	84	122
						152-194	10-聚体	SFSRLDAGRV	165-174	85	123
152-194	10-聚体	FSRLDAGRVN	166-175	86	124
						152-194	10-聚体	SRLDAGRVNT	167-176	87	125
152-194	10-聚体	RLDAGRVNTK	168-177	88	126
						152-194	10-聚体	LDAGRVNTKV	169-178	89	127
152-194	10-聚体	DAGRVNTKVR	170-179	90	128
						152-194	10-聚体	AGRVNTKVRS	171-180	91	129
152-194	10-聚体	GRVNTKVRSF	172-181	92	130
						152-194	10-聚体	RVNTKVRSFG	173-182	93	131
152-194	10-聚体	VNTKVRSFGP	174-183	94	132
						152-194	10-聚体	NTKVRSFGPL	175-184	95	133
152-194	10-聚体	TKVRSFGPLS	176-185	96	134
						152-194	10-聚体	KVRSFGPLSK	177-186	97	135
152-194	10-聚体	VRSFGPLSKA	178-187	98	136
						152-194	10-聚体	RSFGPLSKAG	179-188	99	137
152-194	10-聚体	SFGPLSKAGF	180-189	100	138
						152-194	10-聚体	FGPLSKAGFY	181-190	101	139
152-194	10-聚体	GPLSKAGFYL	182-191	102	140
						152-194	10-聚体	PLSKAGFYLA	183-192	103	141
152-194	10-聚体	LSKAGFYLAF	184-193	104	142
						152-194	10-聚体	SKAGFYLAFQ	185-194	105	143
244-256	8-聚体	NAVEVSVP	244-251	1	144
						244-256	8-聚体	AVEVSVPL	245-252	2	145
244-256	8-聚体	VEVSVPLK	246-253	3	146
						244-256	8-聚体	EVSVPLKL	247-254	4	147
244-256	8-聚体	VSVPLKLY	248-255	5	148
						244-256	8-聚体	SVPLKLYC	249-256	6	149
244-256	9-聚体	NAVEVSVPL	244-252	7	150
						244-256	9-聚体	AVEVSVPLK	245-253	8	151
244-256	9-聚体	VEVSVPLKL	246-254	9	152
						244-256	9-聚体	EVSVPLKLY	247-255	10	153
244-256	9-聚体	VSVPLKLYC	248-256	11	154
						244-256	10-聚体	NAVEVSVPLK	244-253	12	155
244-256	10-聚体	AVEVSVPLKL	245-254	13	156
						244-256	10-聚体	VEVSVPLKLY	246-255	14	157
244-256	10-聚体	EVSVPLKLYC	247-256	15	158
						274-298	8-聚体	GHEPAAKE	274-281	1	159
274-298	8-聚体	HEPAAKES	275-282	2	160
						274-298	8-聚体	EPAAKESQ	276-283	3	161
274-298	8-聚体	PAAKESQC	277-284	4	162
						274-298	8-聚体	AAKESQCR	278-285	5	163
274-298	8-聚体	AKESQCRP	279-286	6	164
						274-298	8-聚体	KESQCRPC	280-287	7	165
274-298	8-聚体	ESQCRPCP	281-288	8	166
						274-298	8-聚体	SQCRPCPP	282-289	9	167
274-298	8-聚体	QCRPCPPG	283-290	10	168
						274-298	8-聚体	CRPCPPGS	284-291	11	169
274-298	8-聚体	RPCPPGSY	285-292	12	170
						274-298	8-聚体	PCPPGSYK	286-293	13	171
274-298	8-聚体	CPPGSYKA	287-294	14	172
						274-298	8-聚体	PPGSYKAK	288-295	15	173

274-298	8-聚体	PGSYKAKQ	289-296	16	174
						274-298	8-聚体	GSYKAKQG	290-297	17	175
274-298	8-聚体	SYKAKQGE	291-298	18	176
						274-298	9-聚体	GHEPAAKES	274-282	19	177
274-298	9-聚体	HEPAAKESQ	275-283	20	178
						274-298	9-聚体	EPAAKESQC	276-284	21	179
274-298	9-聚体	PAAKESQCR	277-285	22	180
						274-298	9-聚体	AAKESQCRP	278-286	23	181
274-298	9-聚体	AKESQCRPC	279-287	24	182
						274-298	9-聚体	KESQCRPCP	280-288	25	183
274-298	9-聚体	ESQCRPCPP	281-289	26	184
						274-298	9-聚体	SQCRPCPPG	282-290	27	185
274-298	9-聚体	QCRPCPPGS	283-291	28	186
						274-298	9-聚体	CRPCPPGSY	284-292	29	187
274-298	9-聚体	RPCPPGSYK	285-293	30	188
						274-298	9-聚体	PCPPGSYKA	286-294	31	189
274-298	9-聚体	CPPGSYKAK	287-295	32	190
						274-298	9-聚体	PPGSYKAKQ	288-296	33	191
274-298	9-聚体	PGSYKAKQG	289-297	34	192
						274-298	9-聚体	GSYKAKQGE	290-298	35	193
274-298	10-聚体	GHEPAAKESQ	274-283	36	194
						274-298	10-聚体	HEPAAKESQC	275-284	37	195
274-298	10-聚体	EPAAKESQCR	276-285	38	196
						274-298	10-聚体	PAAKESQCRP	277-286	39	197
274-298	10-聚体	AAKESQCRPC	278-287	40	198
						274-298	10-聚体	AKESQCRPCP	279-288	41	199
274-298	10-聚体	KESQCRPCPP	280-289	42	200
						274-298	10-聚体	ESQCRPCPPG	281-290	43	201
274-298	10-聚体	SQCRPCPPGS	282-291	44	202
						274-298	10-聚体	QCRPCPPGSY	283-292	45	203
274-298	10-聚体	CRPCPPGSYK	284-293	46	204
						274-298	10-聚体	RPCPPGSYKA	285-294	47	205
274-298	10-聚体	PCPPGSYKAK	286-295	48	206
						274-298	10-聚体	CPPGSYKAKQ	287-296	49	207
274-298	10-聚体	PPGSYKAKQG	288-297	50	208
						274-298	10-聚体	PGSYKAKQGE	289-298	51	209
313-336	8-聚体	PAASICTC	313-320	1	210
						313-336	8-聚体	AASICTCH	314-321	2	211
313-336	8-聚体	ASICTCHN	315-322	3	212
						313-336	8-聚体	SICTCHNN	316-323	4	213
313-336	8-聚体	ICTCHNNF	317-324	5	214
						313-336	8-聚体	CTCHNNFY	318-325	6	215
313-336	8-聚体	TCHNNFYR	319-326	7	216
						313-336	8-聚体	CHNNFYRA	320-327	8	217
313-336	8-聚体	HNNFYRAD	321-328	9	218
						313-336	8-聚体	NNFYRADS	322-329	10	219
313-336	8-聚体	NFYRADSD	323-330	11	220
						313-336	8-聚体	FYRADSDS	324-331	12	221
313-336	8-聚体	YRADSDSA	325-332	13	222
						313-336	8-聚体	RADSDSAD	326-333	14	223
313-336	8-聚体	ADSDSADS	327-334	15	224
						313-336	8-聚体	DSDSADSA	328-335	16	225

313-336	8-聚体	SDSADSAC	329-336	17	226
						313-336	9-聚体	PAASICTCH	313-321	18	227
313-336	9-聚体	AASICTCHN	314-322	19	228
						313-336	9-聚体	ASICTCHNN	315-323	20	229
313-336	9-聚体	SICTCHNNF	316-324	21	230
						313-336	9-聚体	ICTCHNNFY	317-325	22	231
313-336	9-聚体	CTCHNNFYR	318-326	23	232
						313-336	9-聚体	TCHNNFYRA	319-327	24	233
313-336	9-聚体	CHNNFYRAD	320-328	25	234
						313-336	9-聚体	HNNFYRADS	321-329	26	235
313-336	9-聚体	NNFYRADSD	322-330	27	236
						313-336	9-聚体	NFYRADSDS	323-331	28	237
313-336	9-聚体	FYRADSDSA	324-332	29	238
						313-336	9-聚体	YRADSDSAD	325-333	30	239
313-336	9-聚体	RADSDSADS	326-334	31	240
						313-336	9-聚体	ADSDSADSA	327-335	32	241
313-336	9-聚体	DSDSADSAC	328-336	33	242
						313-336	10-聚体	PAASICTCHN	313-322	34	243
313-336	10-聚体	AASICTCHNN	314-323	35	244
						313-336	10-聚体	ASICTCHNNF	315-324	36	245
313-336	10-聚体	SICTCHNNFY	316-325	37	246
						313-336	10-聚体	ICTCHNNFYR	317-326	38	247
313-336	10-聚体	CTCHNNFYRA	318-327	39	248
						313-336	10-聚体	TCHNNFYRAD	319-328	40	249
313-336	10-聚体	CHNNFYRADS	320-329	41	250
						313-336	10-聚体	HNNFYRADSD	321-330	42	251
313-336	10-聚体	NNFYRADSDS	322-331	43	252
						313-336	10-聚体	NFYRADSDSA	323-332	44	253
313-336	10-聚体	FYRADSDSAD	324-333	45	254
						313-336	10-聚体	YRADSDSADS	325-334	46	255
313-336	10-聚体	RADSDSADSA	326-335	47	256
						313-336	10-聚体	ADSDSADSAC	327-336	48	257
362-383	8-聚体	PRDLGGRD	362-369	1	258
						362-383	8-聚体	RDLGGRDD	363-370	2	259
362-383	8-聚体	DLGGRDDL	364-371	3	260
						362-383	8-聚体	LGGRDDLL	365-372	4	261
362-383	8-聚体	GGRDDLLY	366-373	5	262
						362-383	8-聚体	GRDDLLYN	367-374	6	263
362-383	8-聚体	RDDLLYNV	368-375	7	264
						362-383	8-聚体	DDLLYNVI	369-376	8	265
362-383	8-聚体	DLLYNVIC	370-377	9	266
						362-383	8-聚体	LLYNVICK	371-378	10	267
362-383	8-聚体	LYNVICKK	372-379	11	268
						362-383	8-聚体	YNVICKKC	373-380	12	269
362-383	8-聚体	NVICKKCH	374-381	13	270
						362-383	8-聚体	VICKKCHG	375-382	14	271
362-383	8-聚体	ICKKCHGA	376-383	15	272
						362-383	9-聚体	PRDLGGRDD	362-370	16	273
362-383	9-聚体	RDLGGRDDL	363-371	17	274
						362-383	9-聚体	DLGGRDDLL	364-372	18	275
362-383	9-聚体	LGGRDDLLY	365-373	19	276
						362-383	9-聚体	GGRDDLLYN	366-374	20	277

362-383	9-聚体	GRDDLLYNV	367-375	21	278
						362-383	9-聚体	RDDLLYNVI	368-376	22	279
362-383	9-聚体	DDLLYNVIC	369-377	23	280
						362-383	9-聚体	DLLYNVICK	370-378	24	281
362-383	9-聚体	LLYNVICKK	371-379	25	282
						362-383	9-聚体	LYNVICKKC	372-380	26	283
362-383	9-聚体	YNVICKKCH	373-381	27	284
						362-383	9-聚体	NVICKKCHG	374-382	28	285
362-383	9-聚体	VICKKCHGA	375-383	29	286
						362-383	10-聚体	PRDLGGRDDL	362-371	30	287
362-383	10-聚体	RDLGGRDDLL	363-372	31	288
						362-383	10-聚体	DLGGRDDLLY	364-373	32	289
362-383	10-聚体	LGGRDDLLYN	365-374	33	290
						362-383	10-聚体	GGRDDLLYNV	366-375	34	291
362-383	10-聚体	GRDDLLYNVI	367-376	35	292
						362-383	10-聚体	RDDLLYNVIC	368-377	36	293
362-383	10-聚体	DDLLYNVICK	369-378	37	294
						362-383	10-聚体	DLLYNVICKK	370-379	38	295
362-383	10-聚体	LLYNVICKKC	371-380	39	296
						362-383	10-聚体	LYNVICKKCH	372-381	40	297
362-383	10-聚体	YNVICKKCHG	373-382	41	298
						362-383	10-聚体	NVICKKCHGA	374-383	42	299
436-469	8-聚体	PLPPRYAA	436-443	1	300
						436-469	8-聚体	LPPRYAAV	437-444	2	301
436-469	8-聚体	PPRYAAVN	438-445	3	302
						436-469	8-聚体	PRYAAVNI	439-446	4	303
436-469	8-聚体	RYAAVNIT	440-447	5	304
						436-469	8-聚体	YAAVNITT	441-448	6	305
436-469	8-聚体	AAVNITTN	442-449	7	306
						436-469	8-聚体	AVNITTNQ	443-450	8	307
436-469	8-聚体	VNITTNQA	444-451	9	308
						436-469	8-聚体	NITTNQAA	445-452	10	309
436-469	8-聚体	ITTNQAAP	446-453	11	310
						436-469	8-聚体	TTNQAAPS	447-454	12	311
436-469	8-聚体	TNQAAPSE	448-455	13	312
						436-469	8-聚体	NQAAPSEV	449-456	14	313
436-469	8-聚体	QAAPSEVP	450-457	15	314
						436-469	8-聚体	AAPSEVPT	451-458	16	315
436-469	8-聚体	APSEVPTL	452-459	17	316
						436-469	8-聚体	PSEVPTLR	453-460	18	317
436-469	8-聚体	SEVPTLRL	454-461	19	318
						436-469	8-聚体	EVPTLRLH	455-462	20	319
436-469	8-聚体	VPTLRLHS	456-463	21	320
						436-469	8-聚体	PTLRLHSS	457-464	22	321
436-469	8-聚体	TLRLHSSS	458-465	23	322
						436-469	8-聚体	LRLHSSSG	459-466	24	323
436-469	8-聚体	RLHSSSGS	460-467	25	324
						436-469	8-聚体	LHSSSGSS	461-468	26	325
436-469	8-聚体	HSSSGSSL	462-469	27	326
						436-469	9-聚体	PLPPRYAAV	436-444	28	327
436-469	9-聚体	LPPRYAAVN	437-445	29	328
						436-469	9-聚体	PPRYAAVNI	438-446	30	329

436-469	9-聚体	PRYAAVNIT	439-447	31	330
						436-469	9-聚体	RYAAVNITT	440-448	32	331
436-469	9-聚体	YAAVNITTN	441-449	33	332
						436-469	9-聚体	AAVNITTNQ	442-450	34	333
436-469	9-聚体	AVNITTNQA	443-451	35	334
						436-469	9-聚体	VNITTNQAA	444-452	36	335
436-469	9-聚体	NITTNQAAP	445-453	37	336
						436-469	9-聚体	ITTNQAAPS	446-454	38	337
436-469	9-聚体	TTNQAAPSE	447-455	39	338
						436-469	9-聚体	TNQAAPSEV	448-456	40	339
436-469	9-聚体	NQAAPSEVP	449-457	41	340
						436-469	9-聚体	QAAPSEVPT	450-458	42	341
436-469	9-聚体	AAPSEVPTL	451-459	43	342
						436-469	9-聚体	APSEVPTLR	452-460	44	343
436-469	9-聚体	PSEVPTLRL	453-461	45	344
						436-469	9-聚体	SEVPTLRLH	454-462	46	345
436-469	9-聚体	EVPTLRLHS	455-463	47	346
						436-469	9-聚体	VPTLRLHSS	456-464	48	347
436-469	9-聚体	PTLRLHSSS	457-465	49	348
						436-469	9-聚体	TLRLHSSSG	458-466	50	349
436-469	9-聚体	LRLHSSSGS	459-467	51	350
						436-469	9-聚体	RLHSSSGSS	460-468	52	351
436-469	9-聚体	LHSSSGSSL	461-469	53	352
						436-469	10-聚体	PLPPRYAAVN	436-445	54	353
436-469	10-聚体	LPPRYAAVNI	437-446	55	354
						436-469	10-聚体	PPRYAAVNIT	438-447	56	355
436-469	10-聚体	PRYAAVNITT	439-448	57	356
						436-469	10-聚体	RYAAVNITTN	440-449	58	357
436-469	10-聚体	YAAVNITTNQ	441-450	59	358
						436-469	10-聚体	AAVNITTNQA	442-451	60	359
436-469	10-聚体	AVNITTNQAA	443-452	61	360
						436-469	10-聚体	VNITTNQAAP	444-453	62	361
436-469	10-聚体	NITTNQAAPS	445-454	63	362
						436-469	10-聚体	ITTNQAAPSE	446-455	64	363
436-469	10-聚体	TTNQAAPSEV	447-456	65	364
						436-469	10-聚体	TNQAAPSEVP	448-457	66	365
436-469	10-聚体	NQAAPSEVPT	449-458	67	366
						436-469	10-聚体	QAAPSEVPTL	450-459	68	367
436-469	10-聚体	AAPSEVPTLR	451-460	69	368
						436-469	10-聚体	APSEVPTLRL	452-461	70	369
436-469	10-聚体	PSEVPTLRLH	453-462	71	370
						436-469	10-聚体	SEVPTLRLHS	454-463	72	371
436-469	10-聚体	EVPTLRLHSS	455-464	73	372
						436-469	10-聚体	VPTLRLHSSS	456-465	74	373
436-469	10-聚体	PTLRLHSSSG	457-466	75	374
						436-469	10-聚体	TLRLHSSSGS	458-467	76	375
436-469	10-聚体	LRLHSSSGSS	459-468	77	376
						436-469	10-聚体	RLHSSSGSSL	460-469	78	377
509-530	8-聚体	QLDGLRPD	509-516	1	378
						509-530	8-聚体	LDGLRPDA	510-517	2	379
509-530	8-聚体	DGLRPDAR	511-518	3	380
						509-530	8-聚体	GLRPDARY	512-519	4	381

509-530	8-聚体	LRPDARYV	513-520	5	382
						509-530	8-聚体	RPDARYVV	514-521	6	383
509-530	8-聚体	PDARYVVQ	515-522	7	384
						509-530	8-聚体	DARYVVQV	516-523	8	385
509-530	8-聚体	ARYVVQVR	517-524	9	386
						509-530	8-聚体	RYVVQVRA	518-525	10	387
509-530	8-聚体	YVVQVRAR	519-526	11	388
						509-530	8-聚体	VVQVRART	520-527	12	389
509-530	8-聚体	VQVRARTV	521-528	13	390
						509-530	8-聚体	QVRARTVA	522-529	14	391
509-530	8-聚体	VRARTVAG	523-530	15	392
						509-530	9-聚体	QLDGLRPDA	509-517	16	393
509-530	9-聚体	LDGLRPDAR	510-518	17	394
						509-530	9-聚体	DGLRPDARY	511-519	18	395
509-530	9-聚体	GLRPDARYV	512-520	19	396
						509-530	9-聚体	LRPDARYVV	513-521	20	397
509-530	9-聚体	RPDARYVVQ	514-522	21	398
						509-530	9-聚体	PDARYVVQV	515-523	22	399
509-530	9-聚体	DARYVVQVR	516-524	23	400
						509-530	9-聚体	ARYVVQVRA	517-525	24	401
509-530	9-聚体	RYVVQVRAR	518-526	25	402
						509-530	9-聚体	YVVQVRART	519-527	26	403
509-530	9-聚体	VVQVRARTV	520-528	27	404
						509-530	9-聚体	VQVRARTVA	521-529	28	405
509-530	9-聚体	QVRARTVAG	522-530	29	406
						509-530	10-聚体	QLDGLRPDAR	509-518	30	407
509-530	10-聚体	LDGLRPDARY	510-519	31	408
						509-530	10-聚体	DGLRPDARYV	511-520	32	409
509-530	10-聚体	GLRPDARYVV	512-521	33	410
						509-530	10-聚体	LRPDARYVVQ	513-522	34	411
509-530	10-聚体	RPDARYVVQV	514-523	35	412
						509-530	10-聚体	PDARYVVQVR	515-524	36	413
509-530	10-聚体	DARYVVQVRA	516-525	37	414
						509-530	10-聚体	ARYVVQVRAR	517-526	38	415
509-530	10-聚体	RYVVQVRART	518-527	39	416
						509-530	10-聚体	YVVQVRARTV	519-528	40	417
509-530	10-聚体	VVQVRARTVA	520-529	41	418
						509-530	10-聚体	VQVRARTVAG	521-530	42	419

多克隆抗体

多克隆抗体优选通过相关抗原和佐剂的多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射在动物中产生。可以通过使相关抗原与如下蛋白质缀合来获得改善的抗体应答，所述蛋白质在待免疫接种的物种中是免疫原性的，例如钥孔血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白、或大豆胰蛋白酶抑制剂，其中所述缀合可以使用双官能剂或衍生剂实现，例如马来酰亚氨基苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐或本领域已知的其他试剂。

以抗原、免疫原性缀合物或衍生物免疫动物，所述免疫通过使例如100μg或5μg(分别用于兔或小鼠)该蛋白质或缀合物与3体积的弗氏完全佐剂混合，并且在多个位点处皮内注射该溶液实现。一个月后，动物用在弗氏完全佐剂中的1/5至{分数(1/10)}原始量的肽或缀合物通过在多个位点处皮下注射进行加强。在加强注射后7-14天时，动物进行放血，并且就抗体滴度测定血清，动物加强直至滴度达到平台。优选地，动物用相同抗原但与不同蛋白质和/或通过不同交联剂缀合的缀合物进行加强。缀合物也可以在重组细胞培养物中以蛋白质融合物形式制备。此外，聚集试剂例如明矾可以适当地用于增强免疫应答。

单克隆抗体

单克隆抗体可以使用首先由Kohler等人，Nature，256：495(1975)描述的杂交瘤方法进行制备，或可以通过重组DNA方法进行制备。

在杂交瘤方法中，小鼠或其他合适的宿主动物例如仓鼠或猕猴如本文所描述的进行免疫接种，以引发产生或能够产生将与用于免疫接种的蛋白质特异性结合的抗体的淋巴细胞。可替代地，淋巴细胞可以在体外进行免疫。随后使用合适的融合试剂例如聚乙二醇使淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles andPractice，第59-103页(Academic Press，1986))。

由此制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中进行接种和生长，所述培养基优选包含抑制未融合的、亲本骨髓瘤细胞的生长或存活的一种或多种物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，那么用于杂交瘤的培养基一般将包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，所述物质阻止HGPRT缺陷型细胞的生长。

优选的骨髓瘤细胞是可以有效融合、支持选定的抗体生成细胞稳定地高水平生产抗体、并且对培养基敏感的那些。人骨髓瘤和小鼠-人杂交骨髓瘤(heteromyeloma)细胞系也已描述用于生产人单克隆抗体(Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications，第51-63页(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987))。示例性鼠类骨髓瘤系包括衍生自可从美国SalkInstitute Cell Distribution Center，San Diego，Calif.获得的MOP-21和M.C.-11小鼠肿瘤的那些，和衍生自可从美国典型培养物保藏中心Rockville，Md.获得的SP-2或X63-Ag8-653细胞的那些。

对其中杂交瘤细胞正在生长的培养基就抗抗原的单克隆抗体的产生进行测定。优选地，杂交瘤细胞生产的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀或通过体外结合测定法，例如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)进行测定。单克隆抗体的结合亲和力可以例如通过Scatchard分析(Munson等人，Anal.Biochem.，107：220(1980))进行测定。

鉴定产生所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，这些克隆可以通过有限稀释法进行亚克隆，并且通过标准方法进行生长(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，第59-103页(Academic Press，1986))。用于这个用途的合适培养基包括例如DMEM或RPMI-1640培养基。此外，杂交瘤细胞可以作为腹水肿瘤在动物中进行体内生长。由亚克隆分泌的单克隆抗体可以合适地通过常规免疫球蛋白纯化操作，例如蛋白质A-琼脂糖、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析，与培养基、腹水液或血清分开。

编码单克隆抗体的DNA可以使用常规操作从杂交瘤细胞中分离和测序(例如通过使用能够与编码单克隆抗体的重和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。序列测定将一般需要分离至少部分目的基因或cDNA。通常这需要克隆编码单克隆抗体的DNA，或优选地，mRNA(即，cDNA)。克隆可以使用标准技术来进行(参见，例如，Sambrook等人(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Guide，第1-3卷，Cold Spring HarborPress，其引入本文作为参考)。例如，cDNA文库可以通过polyA+mRNA、优选膜结合mRNA的逆转录进行构建，并且使用对于人免疫球蛋白多肽基因序列特异的探针筛选该文库。然而，在一个优选实施方案中，聚合酶链反应(PCR)用于扩增编码目的免疫球蛋白基因区段(例如轻链可变区段)的cDNAs(或全长cDNAs的部分)。扩增序列可以容易地克隆到任何合适的载体内，例如表达载体、微基因(minigere)载体、或噬菌体展示载体。应当理解所使用的具体克隆方法不是关键的，只要可以测定目的免疫球蛋白多肽的一些部分序列即可。如本文所使用的，“分离的”核酸分子或“分离的”核酸序列是这样的核酸分子，其(1)得到鉴定且和在其天然来源中通常与之相关的至少一种污染核酸分子分开，或(2)被克隆、扩增、加标签(tag)或以其他方式与背景核酸区分开来，从而使得目的核酸的序列可以得到确定，即被视为分离的。分离的核酸分子与其在自然界中时相比可以具有不同的形式或环境。分离的核酸分子因此不同于存在于天然细胞中的该核酸分子。然而，分离的核酸分子可以包括包含在通常表达抗体的细胞中的核酸分子，在该细胞中该核酸分子例如位于与在天然细胞中时不同的染色体位置中。

用于克隆和测序的RNA的一个来源是杂交瘤，所述杂交瘤通过从转基因小鼠获得B细胞且使B细胞与永生细胞融合来产生。使用该杂交瘤的优点是它们可以容易地被筛选，并且可以容易地选出产生目的人单克隆抗体的杂交瘤。可替代地，RNA可以从免疫接种的动物的B细胞(或整个脾脏)中进行分离。当使用非杂交瘤的来源时，可能希望筛选编码具有特异性结合特征的免疫球蛋白或免疫球蛋白多肽的序列。用于此种筛选的一种方法是使用噬菌体展示技术。噬菌体展示在例如Dower等人，WO91/17271，McCafferty等人，WO 92/01047，以及Caton和Koprowski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：6450-6454(1990)中得到描述，所述参考文献各自引入本文作为参考。在使用噬菌体展示技术的一个实施方案中，自免疫接种的转基因小鼠分离cDNA(例如总脾脏cDNA)，使用聚合酶链反应扩增编码免疫球蛋白多肽的一部分例如CDR区的cDNA序列，并且将扩增序列插入噬菌体载体内。编码具有所需结合特征的目的肽(例如可变区肽)的cDNAs，通过标准技术例如淘选进行鉴定。

随后测定扩增的或克隆的核酸的序列。然而，一般地，测定编码免疫球蛋白多肽的整个可变区的序列，但有时仅测序可变区的部分(例如CDR编码部分)将足够。一般地，测序部分的长度为至少30个碱基，更通常将测序编码至少约三分之一或至少约二分之一可变区长度的碱基。

测序可以在从cDNA文库中分离的克隆上进行，或当使用PCR时，在亚克隆所扩增的序列后进行，或对扩增区段直接PCR测序。可以使用标准技术进行测序(参见，例如Sambrook等人(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Guide，Vols 1-3，Cold Spring Harbor Press，和Sanger，F.等人(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74：5463-5467，其引入本文作为参考)。通过比较克隆的核酸的序列与人免疫球蛋白基因和cDNAs的公开序列，取决于测序的区域，本领域技术人员将能够容易地确定，(i)杂交瘤免疫球蛋白多肽的胚系区段使用(包括重链的同种型)，和(ii)重和轻链可变区的序列，包括起因于N区添加和体细胞突变过程的序列。免疫球蛋白基因序列信息的一个来源是美国国立生物信息学中心(NationalCenter for Biotechnology Information)，国立医学图书馆(National Libraryof Medicine)，国立卫生研究所(National Institutes of Health)，Bethesda，Md。

抗体片段

如上所述，抗体片段包含完整全长抗体的部分，优选完整抗体的抗原结合区或可变区，并且包括由抗体片段形成的线性抗体和多特异性抗体。抗体片段的非限制性例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、Fd、结构域抗体(dAb)、互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、单链抗体片段、双链抗体、三链抗体、四链抗体、微型抗体、线性抗体、螯合重组抗体、三体或双体、胞内抗体、纳米抗体、小分子免疫药物(SMIPs)、抗原结合结构域免疫球蛋白融合蛋白、驼源化抗体、包含VHH的抗体、或其突变蛋白质或衍生物、和包含免疫球蛋白的至少部分的多肽(其中所述部分足以赋予多肽特异性抗原结合，例如CDR序列)，条件是抗体保留所需生物活性。此种抗原片段可以通过整个抗体的修饰来产生，或使用重组DNA技术或肽合成进行从头合成。

术语“双链抗体”指具有2个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段在同一多肽链(VH VL)中包含与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)。通过使用太短而不允许相同链上的2个结构域之间配对的接头，这些结构域被迫与另一条链的互补结构域配对，以产生2个抗原结合位点。双链抗体在例如EP 404,097；WO 93/11161；和30 Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993)中更充分地进行描述。

“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的V_H和V_L结构域，其中这些结构域存在于单条多肽链中，并且任选包含在V_H和V_L结构域之间的多肽接头，其使得Fv能够形成用于抗原结合的所需结构(Bird等人，Science 242：423-426，1988，和Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883，1988)。Fd片段由V_H和C_H1结构域组成。

另外的抗体片段包括由V_H结构域组成的结构域抗体(dAb)片段(Ward等人，Nature 341：544-546，1989)。

“线性抗体”包含一对串联Fd区段(V_H-C_H1-V_H-C_H1)，其形成一对抗原结合区域。线性抗体可以是双特异性或单特异性的(Zapata等人Protein Eng.8：1057-62(1995))。

由经由肽接头(无铰链)或经由IgG铰链与CH3融合的scFv组成的“微型抗体”已在Olafsen，等人，Protein Eng Des Sel.2004 Apr；17(4)：315-23中得到描述。

缺乏轻链的功能性重链抗体天然存在于护士鲨(Greenberg等人，Nature 374：168-73，1995)、毯状鲨(Nuttall等人，Mol Immunol.38：313-26，2001)和Camelidae(Hamers-Casterman等人，Nature 363：446-8，1993；Nguyen等人，J.Mol.Biol.275：413，1998)、例如骆驼、单峰骆驼、羊驼和美洲驼中。抗原结合位点在这些动物中减少为单个结构域——VH_H结构域。这些抗体仅使用重链可变区形成抗原结合区域，即这些功能抗体是仅具有结构H₂L₂的重链的同二聚体(称为“重链抗体”或“HCAbs”)。驼源化的V_HH据报告与包含铰链、CH2和CH3结构域且缺乏CH1结构域的IgG2和IgG3恒定区重组(Hamers-Casterman等人，同上)。例如，美洲驼IgG1是常规的(H₂L₂)抗体同种型，其中V_H与包含铰链、CH1、CH2和CH3结构域的恒定区重组，而美洲驼IgG2和IgG3是缺乏CH1结构域且不包含轻链的仅重链同种型。仅经典V_H片段是难以以可溶形式生产的，但当构架残基改变为更象VH_H样时，可以获得在溶解性和特异性结合方面的改善。(参见，例如Reichman，等人，J ImmunolMethods 1999，231：25-38.)已发现驼源化的V_HH结构域以高亲和力与抗原结合(Desmyter等人，J.Biol.Chem.276：26285-90，2001)，并且在溶液中具有高稳定性(Ewert等人，Biochemistry 41：3628-36，2002)。用于产生具有驼源化重链的抗体的方法在例如美国专利公开号20050136049和20050037421中得到描述。

因为重链抗体的可变结构域是具有仅15kDa分子量的最小全功能抗原结合片段，故将这个实体称为纳米抗体(Cortez-Retamozo等人，CancerResearch 64：2853-57，2004)。纳米抗体文库可以由免疫接种的单峰骆驼产生，如Conrath等人，(Antimicrob Agents Chemother 45：2807-12，2001)中所述或使用已描述的重组方法。

胞内抗体(intrabody)是显示细胞内表达且可以操作细胞内蛋白质功能的单链抗体(Biocca，等人，EMBO J.9：101-108，1990；Colby等人，Proc Natl Acad Sci USA.101：17616-21，2004)。包含使抗体构建体保留在细胞内区域中的细胞信号序列的胞内抗体可以如Mhashilkar等人(EMBO J 14：1542-51，1995)和Wheeler等人(FASEB J.17：1733-5.2003)中所述来产生。穿膜抗体(transbody)是可透过细胞的抗体，其中蛋白质转导结构域(PTD)与单链可变片段(scFv)抗体融合Heng等人，(MedHypotheses.64：1105-8，2005)。

进一步考虑的抗体是对于靶蛋白质特异的SMIPs或结合结构域免疫球蛋白融合蛋白。这些构建体是包含与免疫球蛋白结构域融合的抗原结合结构域的单链多肽，其中所述免疫球蛋白结构域是执行抗体效应子功能所需的。参见例如，WO03/041600、美国专利公开20030133939和美国专利公开20030118592。

多价抗体

在某些实施方案中，可能希望产生多价或甚至多特异性(例如双特异性、三特异性等)单克隆抗体。此种抗体可以具有对于靶抗原的至少2个不同表位的结合特异性，或可替代地它可以与2种不同分子例如靶抗原和细胞表面蛋白质或受体结合。例如，双特异性抗体可以包括与靶结合的臂和与白细胞上的触发分子，例如T细胞受体分子(例如CD2或CD3)、或IgG的Fc受体(FcγR)，例如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)结合的另一个臂，以便使细胞防御机制集中于靶表达细胞。作为另一个例子，双特异性抗体可以用于使细胞毒性剂定位于表达靶抗原的细胞。这些抗体具有靶结合臂和结合细胞毒性剂(例如皂草毒蛋白(saporin)、抗干扰素-60、长春花生物碱、蓖麻毒蛋白A链、氨甲蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。多特异性抗体可以作为全长抗体或抗体片段进行制备。

双特异性抗体包括交联的抗体或“异缀合物”抗体(heteroconjugate)。例如，异缀合物中的抗体之一可以与抗生物素蛋白偶联，另一与生物素偶联。异缀合物抗体可以使用任何常规交联方法进行制备。合适的交联剂是本领域众所周知的，并且连同许多交联技术在美国专利号4,676,980中公开。

根据用于制备双特异性抗体的另一种方法，可以就一对抗体分子之间的界面进行改造，以使从重组细胞培养物中回收的异二聚体百分比达到最大。优选的界面包含抗体恒定结构域的C_H3结构域的至少部分。在这种方法中，来自第一抗体分子的界面的一个或多个小氨基酸侧链用较大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)进行替换。在第二抗体分子的界面上通过用较小的侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换大氨基酸侧链以产生与第一抗体分子界面上的该大侧链具有相同或相似大小的补偿性“腔”。这提供了用于使异二聚体的得率增加超过其他不希望有的终产物例如同二聚体的机制。参见1996年9月6日公开的WO96/27011。

用于从抗体片段产生双特异性抗体的技术也已在文献中得到描述。例如，双特异性抗体可以使用化学连接进行制备。Brennan等人，Science 229：81(1985)描述了其中对完整抗体进行蛋白水解切割以产生F(ab′)₂片段的操作。这些片段在二硫醇络合剂亚砷酸钠的存在下进行还原，以稳定邻位的二硫醇且阻止分子间二硫化物形成。随后使所产生的Fab′片段转变成硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。随后通过用巯基乙胺还原使Fab′-TNB衍生物之一再转变成Fab′-硫醇，且与等摩尔量的另一Fab′-TNB衍生物混合，以形成双特异性抗体。所产生的双特异性抗体可以用作试剂用于选择性固定酶。Better等人，Science 240：1041-1043(1988)公开了自细菌分泌功能性抗体片段(参见，例如，Better等人，Skerra等人Science 240：1038-1041(1988))。例如，可以直接从大肠杆菌中直接回收Fab′-SH片段，并且进行化学偶联以形成双特异性抗体(Carter等人，Bio/Technology10：163-167(1992)；Shalaby等人，J.Exp.Med.175：217-225(1992))。

Shalaby等人，J.Exp.Med.175：217-225(1992)描述了全人源化的双特异性抗体F(ab′)₂分子的产生。每个Fab′片段分开由大肠杆菌进行分泌，并且在体外实施直接的化学偶联以形成双特异性抗体。由此形成的双特异性抗体能够与超表达HER2受体的细胞和正常的人T细胞结合，以及触发人细胞毒性淋巴细胞针对人乳腺肿瘤靶的裂解活性。

用于从重组细胞培养物中直接制备和分离双特异性抗体片段的各种技术也已得到描述。例如，双特异性抗体已使用亮氨酸拉链进行生产，例如GCN4。(一般参见Kostelny等人，J.Immunol.148(5)：1547-1553(1992)。)来自Fos和Jun蛋白质的亮氨酸拉链肽通过基因融合而与2种不同抗体的Fab′部分进行连接。抗体同二聚体在铰链区处进行还原以形成单体，然后再氧化以形成抗体异二聚体。这种方法也可以用于生产抗体同二聚体。

术语“双链抗体”指具有2个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段在同一多肽链(VH VL)中包含与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)。通过使用太短而不允许相同链上的2个结构域之间配对的接头，这些结构域被迫与另一条链的互补结构域配对，以产生2个抗原结合位点。参见，例如，Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993)。

通过使用单链Fv(sFv)二聚体以制备双特异性抗体片段的另一种策略也已得到报告。参见Gruber等人，J.Immunol.152：5368(1994)。

可替代地，双特异性抗体可以是如Zapata等人Protein Eng.8(10)：1057-1062(1995)中所述产生的“线性抗体”。简言之，这些抗体包含一对串联的Fd区段(V_H-C_H1-V_H-C_H1)，其形成一对抗原结合区域。线性抗体可以是双特异性或单特异性的。

还可以考虑具有超过2个效价的抗体。例如，可以制备三特异性抗体。(Tutt等人，J.Immunol.147：60(1991))。

“螯合重组抗体”是双特异性抗体，其识别靶抗原的邻近且非重叠的表位，并且其足够柔性以与2个表位同时结合(Neri等人，J Mol Biol.246：367-73，1995)。

双特异性Fab-scFv(“双体”)和三特异性Fab-(scFv)(2)(“三体”)的产生在Schoonjans等人(J Immunol.165：7050-57，2000)和Willems等人(J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci.786：161-76，2003)中得到描述。对于双体或三体，使scFv分子与VL-CL(L)和VH-CH₁(Fd)链中的一个或两个融合，例如为了产生三体，使2个scFv与Fab的C末端融合，而在双体中使1个scFv与Fab的C末端融合。

抗体的重组生产

抗体可以通过重组DNA方法，使用本领域众所周知的抗体表达系统之一进行生产(参见，例如，Harlow和Lane，Antibodies：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory(1988))。

编码本发明的抗体的DNA可以置入表达载体内，所述表达载体随后转染到原来不生产免疫球蛋白蛋白质的宿主细胞内，例如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、人胚肾293细胞(例如293E细胞)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、或骨髓瘤细胞，以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。抗体的重组生产是本领域众所周知的。抗体片段一直由完整抗体的蛋白水解消化而衍生(参见，例如，Morimoto等人，Journal of Biochemical andBiophysical Methods 24：107-117(1992)和Brennan等人，Science 229：81(1985))。然而，这些片段目前可以由重组宿主细胞直接生产。用于生产抗体片段的其他技术包括肽合成和共价连接，这对于技术人员将是显而易见的。

表达控制序列指在具体宿主生物中表达可操作地连接的编码序列所需的DNA序列。适合于原核生物的控制序列例如包括启动子、任选地操纵基因序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、多腺苷酸化信号和增强子。

当核酸置于与另一种核酸序列发生功能关系的位置时，它是可操作地连接的。例如，如果多肽作为参与多肽分泌的前蛋白质进行表达，则编码前序列或分泌前导序列的DNA与编码多肽的DNA为可操作地连接的；如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则启动子或增强子与编码序列是可操作地连接的；或如果核糖体结合位点被置于利于翻译的位置时，其与编码序列是可操作地连接的。一般地，可操作地连接意指被连接的DNA序列是邻接的，并且在分泌前导序列的情况下，邻接且在阅读框中。然而，增强子无需是邻接的。连接可以通过在方便的限制位点处连接来完成。如果此种位点不存在，那么可以依照常规实践使用合成寡核苷酸衔接子或接头。

细胞、细胞系和细胞培养物通常可互换使用，并且在本文中所有这些名称均包括后代。转化体和转化细胞包括原代受试细胞和由其衍生的培养物，与传代次数无关。还应当理解由于有意或非有意的突变，所有后代在DNA内容上可能不是精确相同的。包括与在最初转化细胞中所筛选的功能或生物活性具有相同功能或生物活性的突变体后代。当旨在为不同名称时，由上下文将是清楚的。

在一个可替代实施方案中，目的免疫球蛋白的氨基酸序列可以通过直接蛋白质测序进行测定。合适的编码核苷酸序列可以根据通用密码子表进行设计。

所需抗体的氨基酸序列突变蛋白质可以通过将合适的核苷酸改变引入编码DNA内或通过肽合成进行制备。此种突变蛋白质包括例如在抗体的氨基酸序列内的残基缺失和/或插入和/或置换。可以制备缺失、插入和置换的任何组合，以取得最终构建体，条件是最终构建体具有所需特征。氨基酸变化也可以改变单克隆、人、人源化、Human Engineered^TM或突变蛋白质抗体的翻译后加工，例如改变糖基化位点的数目或位置。

编码抗体的氨基酸序列突变蛋白质的核酸分子可以通过本领域已知的各种方法进行制备。这些方法包括但不限于，从天然来源中分离(对于天然存在的氨基酸序列突变蛋白质)，或通过对抗体的较早制备的突变蛋白质或非突变蛋白质形式进行寡核苷酸介导的(或定点)诱变、PCR诱变、或盒式诱变来制备。

本发明还提供编码本发明抗体的分离核酸(任选地与被宿主细胞识别的控制序列可操作地连接)、包含该核酸的载体和宿主细胞、以及用于生产抗体的重组技术(这可以包含培养宿主细胞从而使得核酸被表达，以及任选地从宿主细胞培养物或培养基中回收抗体)。

对于抗体的重组生产，分离编码其的核酸并且插入复制型载体内，用于进一步克隆(DNA的扩增)或用于表达。编码单克隆抗体的DNA可以使用常规操作(例如，通过使用能够与编码抗体的重和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)容易地进行分离且测序。许多载体是可用的。载体组分一般包括但不限于，下述中的一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种选择标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。

(1)信号序列组分

本发明的抗体可以不仅直接地还可以作为与异源多肽的融合多肽形式重组地生产，所述异源多肽优选是信号序列或在成熟蛋白质或多肽的N末端处具有特异性切割位点的其他多肽。优选选择的信号序列是由宿主细胞识别且加工(即通过信号肽酶切割)的那种。如果原核宿主细胞不识别且加工天然抗体信号序列，那么该信号序列可以由选自例如下述的信号序列替代：果胶酸裂解酶(例如pelB)、碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp或耐热肠毒素II前导序列。对于酵母分泌，天然信号序列可以由下述替代：例如酵母转化酶前导区、α因子前导区(包括酵母菌属(Saccharomyces)和克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)α因子前导区)、或酸性磷酸酶前导区、白色念珠菌(C.albicans)葡糖淀粉酶前导区、或WO90/13646中描述的信号。在哺乳动物细胞表达中，哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导区例如单纯疱疹gD信号是可用的。

编码此种前体区域的DNA在阅读框中与编码抗体的DNA进行连接。

(2)复制起点组分

表达和克隆载体包含使得载体能够在一种或多种所选择的宿主细胞中复制的核酸序列。一般地，在克隆载体中，这种序列是使得载体能够不依赖于宿主染色体DNA而复制的序列，包括复制起点或自主复制序列。此种序列对于各种细菌、酵母和病毒是众所周知的。来自质粒pBR322的复制起点适合于大多数革兰氏阴性菌，2μ质粒起点适合于酵母，并且各种病毒起点可以用于哺乳动物细胞中的克隆载体。一般地，复制起点组分不是哺乳动物表达载体所需的(一般可以使用SV40起点，这仅因为它包含早期启动子)。

(3)选择标记组分

表达和克隆载体可以包含选择基因，也称为可选择标记。一般的选择基因编码这样的蛋白质，其(a)赋予对于抗生素或其他毒素的抗性，例如氨苄青霉素、新霉素、氨甲蝶呤、四环素、G418、遗传霉素、组氨醇或霉酚酸，(b)补充营养缺陷型缺陷，或(c)提供无法从复杂培养基中获得的关键营养素，例如对于芽孢杆状菌属(Bacilli)，编码D-丙氨酸消旋酶的基因。

选择方案的一个例子利用使宿主细胞生长停滞的药物。用异源基因成功转化的那些细胞将产生赋予药物抗性的蛋白质，且因此经历该选择而存活。此种显性选择的例子使用药物氨甲蝶呤、新霉素、组氨醇、嘌呤霉素、霉酚酸和潮霉素。

用于哺乳动物细胞的合适选择标记的另一个例子是使得可以鉴定能摄取抗体编码核酸的细胞的那些，例如DHFR、胸苷激酶、金属硫蛋白-I和-II，优选灵长类金属硫蛋白基因、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。

例如，对于用DHFR选择基因转化的细胞首先通过在如下培养基中培养所有转化体进行鉴定，所述培养基包含氨甲蝶呤(Mtx)——DHFR的竞争性拮抗剂。当采用野生型DHFR时，合适的宿主细胞是缺乏DHFR活性的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。

可替代地，用编码本发明抗体、野生型DHFR蛋白质、和另一选择标记例如氨基糖苷3′-磷酸转移酶(APH)的DNA序列转化或共转化的宿主细胞(特别是包含内源性DHFR的野生型宿主)，可以通过在培养基中的细胞生长进行选择，所述培养基包含用于选择标记的选择试剂，例如氨基糖苷类抗生素，例如卡那霉素、新霉素或G418。参见美国专利号4,965,199。

用于在酵母中使用的合适选择基因是酵母质粒YRp7中存在的trp1基因(Stinchcomb等人，Nature，282：39(1979))。trp1基因提供了在缺乏于色氨酸中生长的能力的酵母突变株，例如ATCC编号44076或PEP4-1中使用的选择标记。Jones，Genetics，85：12(1977)。由此trp1损伤在酵母宿主细胞基因组中的存在提供了可以用于通过在不存在色氨酸的情况下的生长来检测转化的有效环境。类似地，Leu2缺陷型酵母菌株(ATCC 20,622或38,626)可以由具有Leu2基因的已知质粒补充。Ura3缺陷型酵母菌株可以由具有ura3基因的质粒补充。

此外，衍生自1.6μm环状质粒pKD1的载体可以用于转化克鲁维酵母菌属酵母。可替代地，对于乳酸克鲁维酵母(K.lactis)报告了用于大规模生产重组牛凝乳酶的表达系统。Van den Berg，Bio/Technology，8：135(1990)。用于通过克鲁维酵母菌属的工业菌株分泌成熟的重组人血清白蛋白的合适多拷贝表达载体也已得到公开。Fleer等人，Bio/Technology，9：968-975(1991)。

(4)启动子组分

表达和克隆载体通常包含启动子，所述启动子被宿主生物识别且与抗体编码核酸可操作地连接。适合于与原核宿主一起使用的启动子包括阿拉伯糖(例如，araB)启动子phoA启动子、β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统、和杂合启动子例如tac启动子。然而，其他已知细菌启动子也是合适的。用于在细菌系统中使用的启动子也可以包含与编码本发明抗体的DNA可操作地连接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。

关于真核生物的启动子序列是已知的。实质上所有真核基因都具有富含AT的区域，其距离转录起始位点上游约25-30个碱基。在许多基因的转录起始上游70-80碱基发现的另一种序列是CNCAAT区域，其中N可以是任何核苷酸。在大多数真核基因的3′末端处是AATAAA序列，其可以是用于给编码序列的3′末端添加聚腺苷酸尾的信号。所有这些序列都适宜地插入真核表达载体内。

用于与酵母宿主一起使用的合适启动序列的例子包括用于3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶的启动子，所述其他糖酵解酶例如烯醇酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、6-磷酸葡萄糖异构酶、3-磷酸甘油酸酯变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡糖异构酶和葡糖激酶。

其他酵母启动子，即，具有通过生长条件控制转录的额外优点的诱导型启动子，是醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢相关的降解酶、金属硫蛋白、3-磷酸甘油醛脱氢酶、和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区。用于在酵母表达中使用的合适载体和启动子在EP 73,657中进一步描述。酵母增强子也可以有利地与酵母启动子一起使用。

在哺乳动物宿主细胞中自载体的抗体转录可以通过例如得自病毒基因组、得自异源哺乳动物启动子(例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子)、得自热休克启动子的启动子来控制，其中所述病毒例如Abelson白血病病毒、多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳头状瘤病毒、禽肉瘤病毒、最优选巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒、猿猴病毒40(SV40)，条件是此种启动子与宿主细胞系统相容。

SV40病毒的早期和晚期启动子常规地作为SV40限制性片段获得，所述SV40限制性片段还包含SV40病毒复制起点。人巨细胞病毒的立即早期启动子常规地作为HindIII限制性片段获得。使用牛乳头状瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统公开于美国专利号4,419,446中。这个系统的修饰在美国专利号4,601,978中描述。还参见Reyes等人，Nature297：598-601(1982)，其公开了在来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子控制下在小鼠细胞中表达人β-干扰素cDNA。可替代地，劳斯肉瘤病毒长末端重复可以用作启动子。

(5)增强子元件组分

编码本发明抗体的DNA经由高等真核生物的转录可以通常通过将增强子序列插入载体内得到增加。来自哺乳动物基因(珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)的许多增强子序列目前是已知的。然而，一般地，将使用来自真核细胞病毒的增强子。例子包括在复制起点(bp100-270)的晚期侧上的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、在复制起点的晚期侧上的多瘤病毒增强子、和腺病毒增强子。关于用于激活真核启动子的增强子元件，还参见Yaniv，Nature 297：17-18(1982)。增强子可以在载体内拼接于抗体编码序列的5′或3′，但优选位于启动子的5′。

(6)转录终止组分

在真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其他多细胞生物的有核细胞)中使用的表达载体还将包含对于转录终止和对于稳定mAb所需的序列。此种序列通常从真核或病毒DNAs或cDNAs的5′及偶然地3′非翻译区中获得。这些区域包含在编码抗体的mRNA的非翻译部分中转录为多腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种有用的转录终止组分是牛生长激素多腺苷酸化区域。参见WO94/11026和其中公开的表达载体。另一种是小鼠免疫球蛋白轻链转录终止子。

(7)宿主细胞的选择和转化

在本文中用于在载体中克隆或表达DNA的合适宿主细胞是上文描述的原核生物、酵母或高等真核细胞。用于这个用途的合适原核生物包括真细菌，例如革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)例如埃希氏杆菌属(Escherichia)例如大肠杆菌、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、沙雷氏菌属(Serratia)例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)和志贺氏菌属(Shigella)、以及芽孢杆菌属(Bacilli)例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(例如1989年4月12日公布的DD 266,710中公开的地衣芽孢杆菌41P)、假单胞菌属(Pseudomonas)例如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)和链霉菌属(Streptomyces)。一种优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC 31,446)，但其他菌株例如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌W3110(ATCC 27,325)也是合适的。这些例子是举例说明性而不是限制性的。

除了原核生物外，真核微生物例如丝状真菌或酵母是抗体编码载体的合适克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或普通面包酵母在低等真核宿主微生物中最常用。然而，许多其他属、物种和菌株也是通常可得的，并且可以在本文中使用，例如栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属宿主例如乳酸克鲁维酵母、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC24,178)、K.waltii(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)；耶氏酵母属(Yarrowia)(EP 402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastors)(EP 183,070)；假丝酵母属(Candida)；里氏木霉(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗糙脉孢霉(Neurosporacrassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)例如Schwanniomyces occidentalis；和丝状真菌例如脉孢霉属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、(Tolypocladium)、和曲霉属(Aspergillus)宿主例如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。

用于表达糖基化抗体的合适宿主细胞衍生自多细胞生物。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。众多杆状病毒株和变体以及来自宿主例如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)(果蝇)、和家蚕(Bombyx mori)的相应许可性昆虫宿主细胞已得到鉴定。用于转染的各种病毒株是可公开获得的，例如苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)NPV的L-1变体和家蚕NPV的Bm-5株，并且此种病毒可以根据本发明在本文中用作病毒，特别是用于转染草地贪夜蛾细胞。

棉花、玉米、马铃薯、大豆、碧冬茄、番茄、烟草、浮萍属(lemna)和其他植物细胞的植物细胞培养物也可以用作宿主。

然而，在脊椎动物细胞中的兴趣是最大的，并且脊椎动物细胞在培养(组织培养)中的繁殖已变成常规操作。有用的哺乳动物宿主细胞系的例子是中国仓鼠卵巢细胞，包括CHOK1细胞(ATCC CCL61)、DXB-11、DG-44、和中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；通过SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾细胞系(293或悬浮培养中亚克隆生长的293细胞，[Graham等人，J.Gen Virol.36：59(1977)]；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；小鼠塞尔托利细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980))；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；Buffalo大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(HepG2，HB 8065)；小鼠乳房肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人，Annals N.Y Acad.Sci.383：44-68(1982))；MRC5细胞；FS4细胞；和人肝细胞瘤系(Hep G2)。

为抗体生产，宿主细胞用上述表达或克隆载体进行转化或转染，并且在改良的常规营养培养基中进行培养，所述改良针对诱导启动子、选择转化体、或扩增编码所需序列的基因是合适的。此外，具有由选择标记分开的多拷贝转录单位的新载体和转染细胞系对于抗体表达是特别有用的且是优选的。

(8)培养宿主细胞

用于生产本发明抗体的宿主细胞可以在各种培养基中进行培养。商购可得的培养基例如Ham′s F10(Sigma)、极限必需培养基((MEM)，(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、和Dulbecco改良Eagle培养基((DMEM)，Sigma)适合于培养宿主细胞。此外，Ham等人，Meth.Enz.58：44(1979)，Barnes等人，Anal.Biochem.102：255(1980)，美国专利号4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO90103430；WO87/00195；或U.S.Patent Re.No.30,985中描述的任何培养基也均可以用作培养基用于宿主细胞。必要时，这些培养基中的任何一种可以补充激素和/或其他生长因子(例如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(例如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(例如HEPES)、核苷酸(例如腺苷和胸苷)、抗生素(例如Gentamycin^TM药物)、微量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)、和葡萄糖或等价的能源。任何其他必需补充物也可以以合适的浓度包括在内，这将是本领域技术人员已知的。培养条件例如温度、pH等可以是选择用于表达的宿主细胞先前使用的那些，并且对于普通技术人员将是显而易见的。

(9)抗体的纯化

当使用重组技术时，抗体可以在胞内、周质间隙中产生，或直接分泌到培养基内，包括从微生物培养物分泌。如果抗体进行细胞内生产，那么第一个步骤，可以例如通过离心或超滤移出微粒碎片，宿主细胞或裂解的碎片。Better等人Science 240：1041-1043(1988)；ICSU Short Reports10：105(1990)；和Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：457-461(1993)描述了用于分离分泌至大肠杆菌的周质间隙的抗体的操作，。(还参见，[Carter等人，Bio/Technology 10：163-167(1992)]。

由微生物或哺乳动物细胞制备的抗体组合物可以使用例如羟基磷灰石层析、阳离子或阴离子交换层析和亲和层析进行纯化，其中亲和层析是优选的纯化技术。蛋白质A作为亲和配体的适宜性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白质A可以用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark等人，J.Immunol.Meth.62：1-13(1983))。蛋白质G推荐用于所有小鼠同种型和用于人γ3(Guss等人，EMBO J.5：15671575(1986))。亲和配体所附着的基质最常是琼脂糖，但其他基质也是可用的。与用琼脂糖可以达到的相比较，机械上稳定的基质例如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯允许更快速的流速和更短的加工时间。当抗体包含C_H 3结构域时，Bakerbond ABX^TM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，N.J.)可以用于纯化。用于蛋白质纯化的其他技术例如在离子交换柱上分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、在硅胶上层析、在肝素SEPHAROSE^TM上层析、在阴离子或阴离子交换树脂上层析(例如聚天冬氨酸柱)、层析聚焦、SDS-PAGE、和硫酸铵沉淀也是可用的，并取决于待回收的抗体。

嵌合抗体

在人中将啮齿类动物抗体单独地或作为缀合物重复体内施用会在接受者中造成针对该啮齿类动物抗体的免疫应答；即所谓的HAMA应答(人抗小鼠抗体)。如果需要重复给药，那么HAMA应答可能限制药物的有效性。通过用亲水聚合物例如聚乙二醇化学修饰抗体，或通过使用基因改造方法使得抗体结构更象人的(例如嵌合、人源化、人或HumanEngineered^TM抗体)，可以减少抗体的免疫原性。因为此种改造抗体在人中比亲本小鼠单克隆抗体具有较小免疫原性，所以它们可以用于治疗人而具有少得多的过敏性反应危险。因此，这些抗体在涉及给人体内施用的治疗应用中可能是优选的。

其中小鼠单克隆抗体的可变Ig结构域与人恒定Ig结构域融合的嵌合单克隆抗体，可以使用本领域已知的标准操作来产生(参见Morrison，S.L.，等人(1984)Chimeric Human Antibody Molecules；Mouse AntigenBinding Domains with Human Constant Region Domains，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81，6841-6855；and，Boulianne，G.L.，等人，Nature312，643-646.(1984))。例如，可以用结合CEA的啮齿类动物抗体的可变结构域的基因序列替代人骨髓瘤蛋白质的可变结构域，由此产生重组嵌合抗体。这些操作在EP 194276、EP 0120694、EP 0125023、EP 0171496、EP 0173494和WO 86/01533中详细描述。尽管某些嵌合单克隆抗体已证明在人中更少免疫原性，但小鼠可变Ig结构域仍可能导致显著的人抗小鼠应答。

人源化抗体

人源化抗体可以通过各种方法来获得，所述方法包括例如：(1)将非人互补决定区(CDRs)嫁接到人构架和恒定区上(在本领域中称为通过“CDR嫁接”人源化的工艺)，或可替代地，(2)移植整个非人可变结构域，但通过替换表面残基用人样表面“掩蔽”它们(在本领域中称为“镶嵌”的工艺)。在本发明中，人源化抗体将包括“人源化”和“镶嵌”抗体。这些方法公开于例如Jones等人，Nature 321：522525(1986)；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，81：6851 6855(1984)；Morrison和Oi，Adv.Immunol.，44：65 92(1988)；Verhoeyer等人，Science 239：1534 1536(1988)；Padlan，Molec.Immun.28：489 498(1991)；Padlan，Molec.Immunol.31(3)：169 217(1994)；和Kettleborough，C.A.等人，Protein Eng.4(7)：773 83(1991)中，所述参考文献各自引入本文作为参考。

例如，可以分离或合成啮齿类动物抗体的CDRs的基因序列，并且替代同源人抗体基因的相应序列区域，产生具有原始啮齿类动物抗体的特异性的人抗体。这些操作在EP 023940、WO 90/07861和WO91/09967中描述。

CDR移植涉及将来自小鼠重和轻链可变Ig结构域的6个CDRs中的一个或多个引入合适的人可变Ig结构域的4个构架区内，也称为CDR嫁接。这种技术(Riechmann，L.，等人，Nature 332，323(1988))利用保守的构架区(FR1-FR4)作为支架以支持主要与抗原接触的CDR环。然而，CDR嫁接的缺点在于：它可以导致比原始小鼠抗体具有实质上较低的结合亲和力的人源化抗体，因为构架区的氨基酸可能在抗原结合中起作用，并且因为CDR环的氨基酸可能影响2个可变Ig结构域的结合。为了保持人源化单克隆抗体的亲和力，CDR嫁接技术可以通过下述得到改善：选择最类似于原始小鼠抗体的构架区的人构架区，以及在抗原结合位点的计算机建模辅助下对构架或CDRs内的单氨基酸实施定点诱变(例如，Co，M.S.，等人(1994)，J.Immunol.152，2968-2976)。

人源化抗体的一种方法包括使非人重和轻链序列与人重和轻链序列比对，基于此种比对来选择人构架以替换非人构架，分子建模以预测人源化序列的构象，且与亲本抗体的构象比较。这个过程可以尾随对CDR区中扰乱CDRs结构的残基的反复回复突变，直至人源化序列模型的预测构象极其接近于亲本非人抗体的非人CDRs的构象。此种人源化抗体可以进一步衍生以促进摄取和清除(例如经由Ashwell受体)(参见，例如，美国专利号5,530,101和5,585,089，所述专利引入本文作为参考)。

许多通过理性设计实现的小鼠单克隆抗体的人源化已得到报告(参见，例如，2002年7月11日公开的20020091240和美国专利号5,693,762，美国专利号5,766,866。

Human Engineered ^TM 抗体

短语“Human Engineered^TM抗体”指衍生自非人抗体，一般是小鼠单克隆抗体的抗体。可替代地，Human Engineered^TM抗体可以衍生自嵌合抗体，该嵌合抗体保留或基本上保留亲本、非人抗体的抗原结合性质，但与亲本抗体比较，当施用于人时，显示减少的免疫原性。

抗体可变结构域的Human Engineering^TM已由Studnicka描述[参见，例如，Studnicka等人，美国专利号5,766,886；Studnicka等人ProteinEngineering 7：805-814(1994)]，作为用于减少免疫原性同时保留抗体分子的结合活性的方法。根据该方法，确定每个可变区氨基酸的置换风险。氨基酸置换区分为3个风险类别：(1)低风险改变是具有减少免疫原性的最大潜力且具有破坏抗原结合的最小机会的那些；(2)中等风险改变是可以进一步减少免疫原性，但有较大可能影响抗原结合或蛋白质折叠的那些；(3)高风险残基是对于结合或对于维持抗体结构是重要的、且有影响抗原结合或蛋白质折叠的最高风险的那些。由于脯氨酸的三维结构作用，在脯氨酸处的修饰一般被视为是至少中等风险改变，即使位置典型地是低风险位置。

啮齿类动物抗体的轻和重链的可变区可以如下进行HumanEngineered^TM，以在以下位置处置换为人氨基酸，所述位置被确定为不太可能不利地影响抗原结合或蛋白质折叠，但可能减少在人环境中的免疫原性。处于“低风险”位置处且根据该方法为修饰的候选物的氨基酸残基可以通过下述进行鉴定：将啮齿类动物可变区的氨基酸序列与人可变区序列比对。可以使用任何人可变区，包括个体的VH或VL序列、或人共有VH或VL序列、或个体的或共有的人胚系序列。可以改变在任何数目的低风险位置处或在所有低风险位置处的氨基酸残基。例如，在比对的鼠类和人氨基酸残基不同的每个低风险位置处，引入氨基酸修饰以用人残基替换啮齿类动物残基。可替代地，可以改变在所有低风险位置处和在任何数目的中等风险位置处的氨基酸残基。理想地，为了达到最小的免疫原性，所有低和中等风险位置都从啮齿类动物序列变成人序列。

构建包含修饰的重和/或轻链可变区的合成基因，并且与人γ重链和/或κ轻链恒定区连接。任何人重链和轻链恒定区都可以与HumanEngineered^TM抗体可变区组合使用，包括IgA(任何亚型，例如IgA1或IgA2)、IgD、IgE、IgG(任何亚型，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)或IgM。将该人重和轻链基因引入宿主细胞例如哺乳动物细胞内，并且获得所产生的重组免疫球蛋白产物且进行表征。

来自转基因动物的人抗体

针对靶抗原的人抗体也可以使用转基因动物来产生，所述转基因动物不具有内源性免疫球蛋白生产，并且经改造而包含人免疫球蛋白基因座。例如，WO 98/24893公开了具有人Ig基因座的转基因动物，其中由于内源性重和轻链基因座的失活，该动物不产生功能性内源免疫球蛋白。WO91/10741还公开了能够产生针对免疫原的免疫应答的转基因非灵长类动物哺乳动物宿主，其中抗体具有灵长类动物恒定和/或可变区，并且其中内源性免疫球蛋白编码基因座被置换或灭活。WO 96/30498公开了使用Cre/Lox系统以修饰哺乳动物中的免疫球蛋白基因座，以便替换所有或部分的恒定或可变区，从而形成修饰的抗体分子。WO 94/02602公开了具有灭活的内源性Ig基因座和功能性人Ig基因座的非人哺乳动物宿主。美国专利号5,939,598公开了制备转基因小鼠的方法，其中所述小鼠缺乏内源性重链，并且表达包含一个或多个异种恒定区的外源性免疫球蛋白基因座。

使用上文描述的转基因动物，可以产生针对所选择的抗原分子的免疫应答，并且可以从动物中取出抗体生成细胞，且用于生产分泌人单克隆抗体的杂交瘤。免疫接种方案、佐剂等是本领域已知的，并且可以在例如转基因小鼠的免疫接种中使用，如WO 96/33735中描述的。这个出版物公开了针对各种抗原分子的单克隆抗体，所述抗原分子包括IL 6、IL 8、TNFa、人CD4、L选择蛋白、gp39和破伤风毒素。单克隆抗体可以就抑制或中和相应蛋白质的生物活性或生理效应的能力进行测试。WO 96/33735公开了衍生自用IL-8免疫接种的转基因小鼠的免疫细胞的抗IL-8单克隆抗体，其阻断IL-8诱导的嗜中性粒细胞的功能。对用于免疫接种转基因动物的抗原具有特异性的人单克隆抗体也公开于WO 96/34096和美国专利申请号20030194404；和美国专利申请号20030031667)中。还参见Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2551(1993)；Jakobovits等人，Nature，362：255-258(1993)；Bruggermann等人，Year in Immuno.，7：33(1993)；和美国专利号5,591,669、美国专利号5,589,369、美国专利号5,545,807；以及美国专利申请号20020199213、WO 96/34096以及美国专利申请号20030194404；和美国专利申请号20030031667。

用于制备单克隆抗体的另外转基因动物包括在美国专利号5,770,429和Fishwild等人(Nat.Biotechnol.14：845-851，1996)中描述的Medarex其包含来自未重排的人抗体基因的基因序列，所述序列编码人抗体的重和轻链。的免疫接种使得能够生产针对靶蛋白质的单克隆抗体。

此外，Ishida等人(Cloning Stem Cells.4：91-102，2002)描述了TransChromo Mouse(TCMOUSE^TM)，其包含兆碱基大小的人DNA区段，并且掺入整个人免疫球蛋白(hIg)基因座。TCMOUSE具有完全的hIgs多样库，包括IgGs的所有亚型(IgG1-G4)。TC小鼠用各种人抗原免疫接种可以产生包含人抗体的抗体应答。

美国专利申请号20030092125描述了用于使动物的免疫应答偏向所需表位的方法。人抗体也可以通过体外活化的B细胞来产生(参见美国专利号5,567,610和5,229,275)。

来自噬菌体展示技术的抗体

用于制备重组人抗体基因库(repertoire)的技术和将所编码的抗体片段展示在丝状噬菌体表面上的技术的发展，已提供了用于直接制备和选择人抗体的重组方法，该方法也可以应用于人源化、嵌合、鼠类或突变蛋白质抗体。通过噬菌体技术产生的抗体作为抗原结合片段——通常为Fv或Fab片段——在细菌中产生，并且因此缺乏效应子功能。效应子功能可以通过2种策略之一引入：片段可以改造成完全抗体用于在哺乳动物细胞中表达，或改造成具有能够触发效应子功能的第二结合位点的双特异性抗体片段。

一般地，抗体的Fd片段(V_H-C_H1)和轻链(V_L-C_L)通过PCR分别进行克隆，并且在组合噬菌体展示文库中进行随机重组，随后可以就与特定抗原的结合进行选择。Fab片段表达在噬菌体表面上，即与编码其的基因物理上连接。因此，通过抗原结合选择Fab可以实现对Fab编码序列的共选择，随后可以扩增该序列。通过几轮抗原结合和再扩增——称为淘选的步骤，富集且最终分离对于抗原特异的Fab。

在1994年，描述了用于抗体的人源化的方法，称为“引导选择”。引导选择将噬菌体展示技术的力量用于小鼠单克隆抗体的人源化(参见Jespers，L.S.，等人，Bio/Technology 12，899-903(1994))。为此，小鼠单克隆抗体的Fd片段可以与人轻链文库组合进行展示，并且所产生的杂交Fab文库随后可以用抗原进行选择。小鼠Fd片段从而提供了引导选择的模板。随后，使所选择的人轻链与人Fd片段文库组合。对所得的文库的选择产生全人Fab。

用于从噬菌体展示文库获得人抗体的各种操作已得到描述(参见，例如，Hoogenboom等人，J.Mol.Biol.，227：381(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol，222：581-597(1991)；美国专利号5,565,332和5,573,905；Clackson，T.和Wells，J.A.，TIBTECH 12，173-184(1994))。特别地，衍生自噬菌体展示文库的抗体的体外选择和进化已成为有力工具(参见Burton，D.R.和Barbas III，C.F.，Adv.Immunol.57，191-280(1994)；和Winter，G.，等人，Annu.Rev.Immunol.12，433-455(1994)；美国专利申请号20020004215和WO92/01047；2003年10月9日公开的美国专利申请号20030190317和美国专利号6,054,287；美国专利号5,877,293。

Watkins，“Screening of Phage-Expressed Antibody Libraries byCapture Lift，”Methods in Molecular Biology，Antibody Phage Display：Methods and Protocols 178：187-193，和2003年3月6日公开的美国专利申请号200120030044772描述了通过“capturelife”——一种涉及将候选结合分子固定在固体载体上的方法，筛选噬菌体表达抗体文库或其他结合分子的方法。

抗体产物可以就活性及在本发明治疗方法中的适宜性进行筛选，其中筛选可以使用如本文中题为“筛选方法”部分中描述的试验，或使用本领域已知的任何合适试验进行。

氨基酸序列突变蛋白质

本发明的抗体包括亲本抗体的突变蛋白质，其中亲本抗体的多肽序列已通过在可变区或与可变区等价的部分中(包括在CDRs内)的至少一个氨基酸置换、缺失或插入而被改变，条件是突变蛋白质保留所需结合亲和力或生物活性。突变蛋白质可以与亲本抗体基本上同源或基本上相同，例如具有至少65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性或同源性。与序列相关的同一性或同源性在本文中定义为：在将候选序列与亲本序列比对和必要时引入缺口以达到最大百分比序列同一性后，在不考虑任何保守置换为序列同一性的部分的情况下，候选序列中与亲本序列相同的氨基酸残基的百分比。抗体序列的N末端、C末端或内部延伸、缺失或插入无一应解释为影响序列同一性或同源性。因此，序列同一性可以通过如下标准方法进行测定，所述标准方法通常用于比较2个多肽的氨基酸的位置相似性。使用计算机程序例如BLAST或FASTA，2个多肽就其相应氨基酸的最佳匹配进行比对(沿着一个或两个序列的全长，或沿着一个或两个序列的预定部分)。这些程序提供了缺省开放罚分和缺省缺口罚分，并且评分矩阵例如PAM 250[标准评分矩阵；参见Dayhoff等人，Atlas of Protein Sequence and Structure，第5卷，supp.3(1978)]可以与计算机程序结合使用。例如，同一性百分比随后可以计算为：相同匹配的总数目乘以100，然后除以匹配跨度内的较长序列的长度和引入该较长序列内以便比对2个序列的缺口数目的总和。

本发明的抗体还可以包括在恒定区的多肽序列中的改变，该改变不影响结合亲和力但可以改变效应子功能，例如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)或清除和摄取(和对于半衰期所产生的影响)。

插入

氨基酸序列插入包括长度为1个残基至包含100个或更多残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及单个或多个氨基酸残基例如2、3或更多残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N末端甲硫氨酰基残基的抗体，或与附加表位或救助受体表位(salvage receptor epitope)融合的抗体(包括抗体片段)。抗体分子的其他插入突变蛋白质包括糖基化位点的添加、用于分子内或分子间键合的半胱氨酸的添加，或与增加抗体的血清半衰期的多肽的融合，例如在N末端或C末端处。例如，半胱氨酸键可以加入抗体内，以改善其稳定性(特别是当抗体是抗体片段例如Fv片段时)。

抗体的糖基化一般是N联或O联的。N联指碳水化合物部分与天冬酰胺残基的侧链附着。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸是用于碳水化合物部分与天冬酰胺侧链的酶促附着的识别序列，其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸。这些三肽序列中任一在多肽中的存在可以产生潜在的糖基化位点。因此，N联糖基化位点可以这样加入抗体中，即，通过改变氨基酸序列，从而使得它包含这些三肽序列中的一个或多个。O联糖基化指糖N-乙酰半乳糖胺、葡萄糖或木糖与羟基氨基酸，最常见地丝氨酸或苏氨酸，的附着，尽管也可以使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。O联糖基化位点可以这样加入抗体中，即，将一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基插入或通过置换引入原始抗体的序列中。

术语“已附加表位的”指与附加表位融合的抗体。附加表位(epitope tag)多肽具有足够的残基以提供能针对其产生对抗其的抗体的表位，然而又足够短从而使得它不干扰抗体的活性。附加表位优选足够独特，从而使得针对其的抗体基本上不与其他表位交叉反应。合适的标签多肽一般具有至少6个氨基酸残基，并且通常为8-50个氨基酸残基(优选约9-30个残基)。例子包括flu HA标签多肽及其抗体12CA5[Field等人，Mol.Cell.Biol.8：2159-2165(1988)]；c-myc标签以及针对其的8F9、3C7、6E10、G4、B7和9E10抗体[Evan等人，Mol.Cell.Biol.5(12)：3610-3616(1985)]；和单纯疱疹病毒糖蛋白D(gD)标签及其抗体[Paborsky等人，ProteinEngineering 3(6)：547-553(1990)]。其他示例性标签是多组氨酸序列，一般约6个组氨酸残基，其允许使用镍螯合分离如此标记的化合物。本领域众所周知且常规使用的其他标记物和标签，例如

标签包括在本发明中。

如本文所使用的，术语“救助受体结合表位”指IgG分子(例如，IgG₁、IgG₂、IgG₃或IgG₄)的Fc区域的表位，其负责增加IgG分子的体内血清半衰期。

缺失

氨基酸序列缺失包括长度为1个残基至100个或更多残基的氨基和/或羧基末端缺失(导致保留对于靶抗原的结合亲和力的片段)，以及单个或多个氨基酸残基例如2、3或更多残基的序列内缺失。例如，糖基化位点可以通过缺失三肽的部分或全部或缺失糖基化的其他识别序列而失去或移至不同位置。

置换

另一种类型的突变蛋白质是氨基酸置换突变蛋白质。在这些突变蛋白质中抗体分子中的至少一个氨基酸残基被去除并在其位置上插入了不同残基。本发明考虑于高变区或CDR区或构架区的任何一个内的置换诱变。保守置换显示于表2中。大多数保守置换示于“优选置换”的标题下。如果此种置换未导致生物活性的改变，那么可以引入在表1中命名为“示例性置换”或在下文中就氨基酸分类进一步描述的更实质性改变，并且筛选产物。

表2

原始的    示例性的                      优选的残基置换

Ala(A)    val；leu；ile                 val

Arg(R)    lys；gln；asn                 lys

Asn(N)    gln；his；asp，lys；gln       arg

Asp(D)    glu；asn                      glu

Cys(C)    ser；ala                      ser

Gln(Q)    asn；glu                      asn

Glu(E)    asp；gln                      asp

Gly(G)    ala

His(H)    asn；gln；lys；arg

Ile(I)    leu；val；met；ala；leu

          phe；                         正亮氨酸

Leu(L)    正亮氨酸；ile；val；          ile

          met；ala；phe

Lys(K)    arg；gln；asn                 arg

Met(M)    leu；phe；ile                 leu

Phe(F)    leu；val；ile；ala；tyr

Pro(P)    ala

Ser(S)    thr

Thr(T)    ser                           ser

Trp(W)    tyr；phe                      tyr

Tyr(Y)    trp；phe；thr；ser            phe

Val(V)    ile；leu；met；phe；          leu

          ala；正亮氨酸

抗体的生物学性质的实质性变化可以通过选择如下置换来完成，所述置换在其维持以下方面的作用上明显不同：(a)置换区域中多肽主链的结构，例如片层或螺旋构象，(b)分子在靶位点处的电荷或疏水性，或(c)侧链体积。天然存在的残基基于常见的侧链性质分成下述组：

(1)疏水的：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；

(2)中性亲水的：cys、ser、thr；

(3)酸性：asp、glu；

(4)碱性：asn、gln、his、lys、arg；

(5)影响链取向的残基：gly、pro；和

(6)芳香族的：trp、tyr、phe。

保守置换涉及将氨基酸用其类别中的另一个成员替换。非保守置换涉及将这些类别之一的成员用另一个类别的成员替换。

不涉及维持抗体的正确构象的任何半胱氨酸残基也可以进行置换，一般用丝氨酸置换，以改善分子的氧化稳定性和阻止异常交联。

亲和力成熟一般涉及制备和筛选在亲本抗体的CDRs内具有置换的抗体突变蛋白质，并且选择相对于亲本抗体具有改善的生物性质例如结合亲和力的突变蛋白质。用于产生此种置换突变蛋白质的一个方便方法是使用噬菌体展示的亲和力成熟。简言之，对几个高变区位点(例如，6-7个位点)进行突变，以在每个位点处产生所有可能的氨基酸置换。由此产生的抗体突变蛋白质以单价形式，，作为包装在每个颗粒内的M13的基因III产物的融合物，由丝状噬菌体颗粒展示。噬菌体展示的突变蛋白质随后就其生物活性(例如，结合亲和力)进行筛选。参见例如，WO 92/01047、WO93/112366、WO 95/15388和WO 93/19172。

目前的抗体亲和力成熟方法属于2个诱变类别：随机的和非随机的。易错PCR、细菌增变株(Low等人，J.Mol.Biol.260，359-68，1996)和饱和诱变(Nishimiya等人，J.Biol.Chem.275：12813-20，2000；Chowdhury，P.S.Methods Mol.Biol.178，269-85，2002)是随机诱变方法的典型例子(Rajpal等人，Proc Natl Acad Sci USA.102：8466-71，2005)。非随机技术通常使用丙氨酸扫描或定点诱变，以产生特定突变蛋白质的有限集合。某些方法在下文中进一步详细描述。

经由淘选方法的亲和力成熟——重组抗体的亲和力成熟通常通过在递减量抗原的存在下对候选抗体的几轮淘选来完成。减少每轮的抗原量以选择对于抗原具有最高亲和力的抗体，从而从大型原料库中得到高亲和力的抗体。经由淘选的亲和力成熟是本领域众所周知的，并且例如在Huls等人(Cancer Immunol Immunother.50：163-71，2001)中描述。使用噬菌体展示技术的亲和力成熟方法在本文其他地方描述，并且是本领域已知的(参见例如，Daugherty等人，Proc Natl Acad Sci USA.97：2029-34，2000)。

浏览式诱变——浏览式诱变(Look through mutagenesis，LTM)(Rajpal等人，Proc Natl Acad Sci USA.102：8466-71，2005)提供了用于对抗原结合位点快速作图的方法。对于LTM，选择9个氨基酸代表由20种天然氨基酸提供的主要侧链化学，以剖析在抗体的所有6个CDRs中的每一个位置处功能性侧链对结合的贡献。LTM在CDR内产生一系列位置的单点突变，其中每个“野生型”残基由所选择的9个氨基酸之一系统置换。对突变的CDRs进行组合，以产生具有增加的复杂性和大小的组合单链可变片段(scFv)文库，同时不妨碍所有突变蛋白质的定量展示。在阳性选择后，测序具有改善的结合的克隆，并且对有利突变进行作图。

易错PCR——易错PCR涉及核酸在不同选择轮次之间的随机化。随机化通过所使用的聚合酶的固有错误率而以低比率发生，但可以通过易错PCR得到增强(Zaccolo等人，J.Mol.Biol.285：775-783，1999)，所述PCR使用在转录过程中具有高固有错误率的聚合酶(Hawkins等人，J MolBiol.226：889-96，1992)。在突变循环后，使用本领域的常规方法选择对于抗原具有改善的亲和力的克隆。

DNA改组——核酸改组是一种通过较短或较小多核苷酸的库的体外或体内同源重组以产生变体多核苷酸的方法。DNA改组已在美国专利号6,605,449、美国专利6,489,145、WO 02/092780和Stemmer，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91：10747-51(1994)中得到描述。一般地，DNA改组由3个步骤组成：用DNA酶I将待改组的基因片断化，使片段随机杂交和在DNA聚合酶的存在下经由PCR将该片断化的基因重新装配或补平(有性PCR，sexual PCR)，通过常规PCR扩增重新装配的产物。

DNA改组不同于易错PCR之处在于它是反转链反应。在易错PCR中，聚合酶起始位点的数目和分子的数目指数增长。相反地，在随机多核苷酸的核酸重新装配或改组中，起始位点的数目和随机多核苷酸的数目(并非大小)随着时间而减少。

在抗体的情况下，例如，DNA改组允许所有CDR1s与所有CDR2s与所有CDR3s自由组合结合。多个序列家族可以考虑在同一反应中进行改组。此外，改组一般保留相对顺序，从而使得例如CDR1将不会在CDR2的位置中发现。优秀的改组体(shufflants)将包含大量最佳(例如最高亲和力)CDRs，并且优秀的改组体可以基于其优良的亲和力而被选择。

可以在DNA改组中使用的模板多核苷酸可以是DNA或RNA。它可以具有各种长度，这取决于待重组或重新装配的较短或较小多核苷酸或基因的大小。优选地，模板多核苷酸为50bp-50kb。模板多核苷酸通常应是双链的。

可以考虑在基因选择的起始步骤过程中，将具有与模板多核苷酸相同的区域和与模板多核苷酸不同的区域的单链或双链核酸多核苷酸加入模板多核苷酸中。还可以考虑将2种不同但相关的多核苷酸模板在起始步骤过程中混合。

丙氨酸扫描——可以执行丙氨酸扫描诱变，以鉴定对抗原结合有显著贡献的高变区残基。Cunningham和Wells，(Science 244：1081-1085，1989)。鉴定残基或一组靶残基(例如带电荷的残基，例如arg、asp、his、lys和glu)，并且用中性或带负电荷的氨基酸(最优选丙氨酸或多丙氨酸)替换，以影响氨基酸与抗原的相互作用。被证实对于置换具有功能敏感性的那些氨基酸位置可以通过于置换位点或针对置换位点引入进一步的或其他的突变而精化。因此，在预定了用于引入氨基酸序列改变的位点时，突变本身的性质无需是预定的。例如，为了分析在给定位点处的突变的表现，可以在靶密码子或区域处进行ala扫描或随机诱变，并且就所需活性筛选所表达的抗体突变蛋白质。

计算机辅助设计——可替代地或另外地，分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体和抗原之间的接触点，或使用计算机软件模拟此接触点，可能是有利的。此种接触残基和邻近残基是根据本文阐述的技术进行置换的候选物。一旦此种突变蛋白质产生后，可以对该组突变蛋白质实施如本文所述的筛选，并且可以选择在一种或多种相关测定试验中具有优良性质的抗体作进一步开发。

亲和力成熟一般涉及制备和筛选在亲本抗体的CDRs内具有置换的抗体突变蛋白质，并且选择相对于亲本抗体具有改善的生物性质例如结合亲和力的突变蛋白质。用于产生此种置换突变蛋白质的一种方便方法是使用噬菌体展示的亲和力成熟。简言之，对几个高变区位点(例如，6-7个位点)进行突变，以在每个位点处产生所有可能的氨基酸置换。由此产生的抗体突变蛋白质以单价形式由丝状噬菌体颗粒展示，作为包装在每个颗粒内的M13的基因III产物的融合物。噬菌体展示的突变蛋白质随后就其生物活性(例如，结合亲和力)进行筛选。

可以执行丙氨酸扫描诱变，以鉴定对抗原结合具有显著贡献的高变区残基。可替代地或另外地，分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体和抗原之间的接触点，可能是有利的。此种接触残基和邻近残基是根据本文阐述的技术用于置换的候选物。一旦产生此种突变蛋白质，可以对该组突变蛋白质实施如本文所述的筛选，并且可以选出在一种或多种相关测定试验中具有优良性质的抗体用于进一步开发。

改变的效应子功能

本发明考虑抗体的其他修饰。例如，可能希望就效应子功能而修饰本发明的抗体，以便例如增强抗体在治疗EphB3相关疾病或病症中的有效性。例如，一个或多个半胱氨酸残基可以被引入Fc区中，从而允许这个区域中的链间二硫键形成。由此产生的同二聚体抗体可以具有改善的内在化能力和/或增加的补体介导的细胞杀死和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。参见Caron等人，J.Exp Med.176：1191-1195(1992)和Shopes，B.J.Immunol.148：2918-2922(1992)。具有增强活性的同二聚体抗体也可以使用异双官能交联剂进行制备，如Wolff等人，Cancer Research 53：2560-2565(1993)中描述的。可替代地，抗体可以进行改造，以具有双重Fc区并且因此可以具有增强的补体裂解和ADCC能力。参见Stevenson等人，Anti-Cancer Drug Design 3：219-230(1989)。此外，已证实CDR内的序列可能造成抗体与II类MHC结合并且触发不希望有的辅助T细胞应答。保守置换可以允许抗体保留结合活性，而丧失其触发不希望有的辅助T细胞应答的能力。还参见整体引入本文作为参考的Steplewski等人，Proc Natl Acad Sci USA.1988；85(13)：4852-6，其描述了其中鼠类可变区与人γ1、γ2、γ3和γ4恒定区连接的嵌合抗体。

在本发明的某些实施方案中，可能希望使用抗体片段而不是完整抗体。在这种情况下，可能希望修饰抗体片段，以便增加其血清半衰期，例如给抗体片段添加分子例如PEG或其他水溶性聚合物，包括多糖聚合物，以增加半衰期。这也可以例如通过将救助受体结合表位掺入抗体片段内(例如，通过抗体片段中的合适区域的突变或通过将表位掺入肽标签内并随后融合在抗体片段的任一末端或中间，例如通过DNA或肽合成)(参见，例如WO96/32478)来达到。

救助受体结合表位优选为这样的区域，其中来自Fc结构域的一个或两个环的任何一个或多个氨基酸残基被转移至抗体片段的类似位置上。更加优选地，转移来自Fc结构域的一个或两个环的3个或更多残基。再更优选地，表位取自Fc区(例如IgG的Fc区)的CH2结构域，且转移至抗体的CH1、CH3或VH区、或超过一个的此种区域。可替代地，表位取自Fc区的CH2结构域，且转移至抗体片段的C_L区或V_L区或两者。还参见国际申请WO 97/34631和WO 96/32478，其描述了Fc变体及其与救助受体的相互作用。

因此，本发明的抗体可以包含人Fc部分，人共有Fc部分，或其保留与Fc救助受体相互作用的能力的突变蛋白质，包括其中涉及二硫键的半胱氨酸被修饰或去除，和/或其中met在N末端处加入和/或N末端20个氨基酸中的一个或多个被去除，和/或与补体相互作用的区域例如C1q结合位点被去除，和/或ADCC位点被去除的突变蛋白质[参见，例如，Molec.Immunol.29(5)：633-9(1992)]。IgG类别的抗体也可以包括不同的恒定区，例如IgG2抗体可以进行修饰以显示IgG1或IgG4恒定区。

在IgG1的情况下，对于恒定区，尤其是铰链或CH2区，的修饰可以增强或降低效应子功能，包括ADCC和/或CDC活性。在其他实施方案中，对IgG2恒定区进行修饰以减少抗体-抗原聚集物形成。在IgG4的情况下，对于恒定区，特别是铰链区，的修饰可以减少半抗体的形成。在具体示例性实施方案中，提供了将IgG4铰链序列Cys-Pro-Ser-Cys突变成IgG1铰链序列Cys-Pro-Pro-Cys。

先前的研究将人和鼠IgG上的FcR结合位点主要作图定位于由IgG残基233-239组成的下部铰链区。其他研究提出其它的宽区段，例如Gly316-Lys338用于人Fc受体I，Lys274-Arg301和Tyr407-Arg416用于人Fc受体III，或发现位于下部铰链外的少数特定残基，例如Asn297和Glu318用于鼠IgG2b与鼠Fc受体II的相互作用。人IgG1 Fc片段与人Fc受体IIIA的3.2-

晶体结构的报告描绘了IgG1残基Leu234-Ser239、Asp265-Glu269、Asn297-Thr299和Ala327-Ile332参与和Fc受体IIIA的结合。基于晶体结构已提示，除下部铰链(Leu234-Gly237)外，IgG CH2结构域环FG(残基326-330)和BC(残基265-271)中的残基也可能在与Fc受体IIA的结合中发挥作用。参见整体引入本文作为参考的Shields等人，J.Biol.Chem.，276(9)：6591-6604(2001)。Fc受体结合位点内的残基的突变可以导致改变的效应子功能，例如改变的ADCC或CDC活性，或改变的半衰期。如上所述，潜在的突变包括一个或多个残基的插入、缺失或置换，包括用丙氨酸置换、保守置换、非保守置换、或用来自不同IgG亚类的相同位置处的相应氨基酸残基替换(例如，用IgG2残基替换在那个位置处的相应IgG1残基)。

Shields等人报告了涉及与所有人Fc受体的结合的IgG1残基位于接近铰链的CH2结构域中，并且分成如下2个类别：1)可以与所有FcR直接相互作用的位置包括Leu234-Pro238、Ala327和Pro329(和可能地Asp265)；2)影响碳水化合物性质或位置的位置包括Asp265和Asn297。影响与Fc受体II的结合的另外IgG1残基如下：(最大影响)Arg255、Thr256、Glu258、Ser267、Asp270、Glu272、Asp280、Arg292、Ser298，和(较小影响)His268、Asn276、His285、Asn286、Lys290、Gln295、Arg301、Thr307、Leu309、Asn315、Lys322、Lys326、Pro331、Ser337、Ala339、Ala378和Lys414。A327Q、A327S、P329A、D265A和D270A减少结合。除上文关于所有FcR鉴定的残基外，使与Fc受体IIIA的结合减少40％或更多的另外IgG1残基如下：Ser239、Ser267(仅Gly)、His268、Glu293、Gln295、Tyr296、Arg301、Val303、Lys338和Asp376。改善与FcRIIIA的结合的突变蛋白质包括T256A、K290A、S298A、E333A、K334A和A339T。Lys414显示在FcRIIA和FcRIIB的结合上的40％减少，Arg416显示FcRIIA和FcRIIIA结合的30％减少，Gln419显示FcRIIA结合的30％减少和FcRIIB结合的40％减少，Lys360显示FcRIIIA结合的23％提高。还参见Presta等人，Biochem.Soc.Trans.(2001)30，487-490。

例如，整体引入本文作为参考的美国专利号6,194,551，描述了具有改变的效应子功能的突变蛋白质，其包含在人IgG Fc区中在氨基酸位置329、331或322(使用Kabat编号)处的突变，其中某些显示减少的C1q结合或CDC活性。作为另一个例子，整体引入本文作为参考的美国专利号6,737,056，描述了具有改变的效应子功能或Fc-γ-受体结合的突变蛋白质，其包含在人IgG Fc区中在氨基酸位置238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439处(使用Kabat编号)的突变，其中某些显示与减少的ADCC或CDC活性相关的受体结合特征。在这些中，在氨基酸位置238、265、269、270、327或329处的突变被认为减少与FcRI的结合，在氨基酸位置238、265、269、270、292、294、295、298、303、324、327、329、333、335、338、373、376、414、416、419、435、438或439处的突变被认为减少与FcRII的结合，并且在氨基酸位置238、239、248、249、252、254、265、268、269、270、272、278、289、293、294、295、296、301、303、322、327、329、338、340、373、376、382、388、389、416、434、435或437处的突变被认为减少与FcRIII的结合。

整体引入本文作为参考的美国专利号5,624,821，报告了鼠抗体的Clq结合活性可以通过使重链的氨基酸残基318、320或322突变来改变，并报告了替换残基297(Asn)导致裂解活性的去除。

整体引入本文作为参考的美国申请公开号20040132101，描述了在氨基酸位置240、244、245、247、262、263、266、299、313、325、328或332处(使用Kabat编号)，或位置234、235、239、240、241、243、244、245、247、262、263、264、265、266、267、269、296、297、298、299、313、325、327、328、329、330或332处(使用Kabat编号)具有突变的突变蛋白质，其中在位置234、235、239、240、241、243、244、245、247、262、263、264、265、266、267、269、296、297、298、299、313、325、327、328、329、330或332处的突变可以减少ADCC活性或减少与Fcγ受体的结合。

整体引入本文作为参考的Chappel等人，Proc Natl Acad Sci USA.1991；88(20)：9036-40，报告IgG1的嗜细胞活性是其重链CH2结构域的固有性质。在IgG1的氨基酸残基234-237之任何一个处的单点突变显著降低或消除其活性。将IgG1残基234-237(LLGG)全部置换入IgG2和IgG4是恢复全部结合活性所需的。观察到包含整个ELLGGP序列(残基233-238)的IgG2抗体比野生型IgG1更有活性。

整体引入本文作为参考的Isaacs等人，J Immunol.1998；161(8)：3862-9，报告在对于FcγR结合关键的基序内的突变(谷氨酸233至脯氨酸、亮氨酸/苯丙氨酸234至缬氨酸、和亮氨酸235至丙氨酸)完全阻止对靶细胞的耗竭。突变谷氨酸318至丙氨酸消除小鼠IgG2b的效应子功能，并且还减少人IgG4的效力。

整体引入本文作为参考的Armour等人，Mol Immunol.2003；40(9)：585-93，鉴定了IgG1突变蛋白质，其与活化受体FcγRIIa反应的效力比野生型IgG1低至少10倍，但其与抑制性受体FcγRIIb的结合仅减少4倍。突变在氨基酸233-236的区域中和/或在氨基酸位置327、330和331处进行。还参见整体引入本文作为参考的WO 99/58572。

整体引入本文作为参考的Xu等人，J Biol Chem.1994；269(5)：3469-74，报告IgG1 Pro331突变成Ser显著减少C1q结合且基本上消除裂解活性。相反，在IgG4中Pro置换Ser331导致IgG4 Pro331突变蛋白质具有部分裂解活性(40％)。

整体引入本文作为参考的Schuurman等人，Mol Immunol.2001；38(1)：1-8，报告涉及重链间键形成的铰链半胱氨酸之一Cys226突变至丝氨酸导致更稳定的重链间连接。IgG4铰链序列Cys-Pro-Ser-Cys突变成IgG1铰链序列Cys-Pro-Pro-Cys也显著稳定重链之间的共价相互作用。

整体引入本文作为参考的Angal等人，Mol Immunol.1993；30(1)：105-8，报告在IgG4中氨基酸位置241处的丝氨酸突变成脯氨酸(在IgG1和IgG2中此位置处发现的氨基酸)导致同质抗体的生产，以及与原始嵌合IgG4比较，延长血清半衰期且改善组织分布。

本发明还考虑具有改变的碳水化合物结构的抗体分子的生产，所述改变的碳水化合物结构导致改变的效应子活性，所述抗体分子包括显示改善的ADCC活性的无岩藻基化或具有减少的岩藻糖基化的抗体分子。达到这点的各种方法是本领域已知的。例如，ADCC效应子活性通过抗体分子与FcγRIII受体的结合来介导，已证实这依赖于CH2结构域的Asn-297处的N联糖基化的碳水化合物结构。未岩藻糖基化的抗体以增加的亲和力结合该受体，并且比天然的、岩藻糖基化的抗体更有效地触发FcγRIII介导的效应子功能。例如，未岩藻糖基化的抗体在如下CHO细胞中的重组生产导致具有100倍增加的ADCC活性的抗体，在所述CHO细胞中α-1，6-岩藻糖基转移酶已被敲除[Yamane-Ohnuki等人，Biotechnol Bioeng.2004Sep 5；87(5)：614-22]。类似效应可以通过减少在岩藻糖基化途径中的这种或其他酶的活性(例如通过siRNA或反义RNA处理，改造细胞系以敲除该一种或多种酶，或用选择性糖基化抑制剂培养[Rothman等人，MolImmunol.1989 Dec；26(12)：1113-23])来达到。某些宿主细胞株例如Lec13或大鼠杂交瘤YB2/0细胞系，天然地生产具有较低的岩藻糖基化水平的抗体。Shields等人，J Biol Chem.2002 Jul 26；277(30)：26733-40；Shinkawa等人，J Biol Chem.2003 Jan 31；278(5)：3466-73。也已确定通过例如在超表达GnTIII酶的细胞中重组生产抗体来增加平分型(bisected)碳水化合物的水平，可以增加ADCC活性。Umana等人，NatBiotechnol.1999 Feb；17(2)：176-80。已预测2个岩藻糖残基中仅1个的不存在就可能足以增加ADCC活性。[Ferrara等人，J Biol Chem.2005年12月5日]

其他共价修饰

抗体的共价修饰也包括在本发明的范围内。酌情，它们可以通过化学合成或通过抗体的酶促或化学切割来进行。其他类型的抗体共价修饰可以通过使抗体的靶氨基酸残基与有机衍生剂反应而引入分子内，其中所述有机衍生剂能够与所选择的侧链或N或C末端残基反应。

半胱氨酰残基最通常与α-卤代乙酸(和相应的胺)，例如氯乙酸或氯乙酰胺反应，以产生羧甲基或羧基氨甲基衍生物。半胱氨酰残基也可以通过与下述物质反应进行衍生：溴三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸、氯乙酰基磷酸酯、N-烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、对氯汞苯甲酸、2-氯汞基-4-硝基酚、或氯-7-硝基苯并-2-噁-1，3-二唑。

组氨酰残基可以通过在pH 5.5-7.0下与焦碳酸二乙酯反应进行衍生，因为这种试剂对于组氨酰侧链相对特异。对溴苯甲酰甲基溴也是有用的；该反应优选在pH 6.0在0.1M二甲基胂酸钠中进行。

赖氨酰和氨基末端残基与琥珀酸酐或其他羧酸酐反应。用这些试剂的衍生化具有逆转赖氨酰残基的电荷的效应。用于衍生含α-氨基残基的其他合适试剂包括亚氨酸酯，例如吡啶甲亚氨酸甲基酯(methylpicolinimidate)、磷酸吡哆醛、吡哆醛、氯代硼氢化物(chloroborohydride)、三硝基苯磺酸、邻甲基异脲、2，4-戊二酮、和转氨酶催化的与乙醛酸的反应。

精氨酰残基通过与一种或多种常规试剂反应进行修饰，在所述常规试剂中有苯甲酰甲醛、2，3-丁二酮、1，2-环己二酮和茚三酮。由于胍官能团的高pK_a，精氨酸残基的衍生化要求反应在碱性条件下进行。此外，这些试剂可以与赖氨酸的基团以及精氨酸ε-氨基反应。

可以进行酪氨酰残基的特定修饰，通过与芳香族重氮化合物或四硝基甲烷反应来将光谱标记引入酪氨酰残基内是特别有意义的。最通常地，N-乙酰咪唑(acetylimidizole)和四硝基甲烷分别用于形成邻乙酰酪氨酰类和3-硝基衍生物。酪氨酰残基可以使用¹²⁵I或¹³¹I进行碘化，以制备标记的蛋白质用于在放射性免疫测定中使用。

羧基侧基(天冬氨酰或谷氨酰)通过与碳化二亚胺(R-N.dbd.C.dbd.N-R′)反应进行选择性修饰，其中R和R′是不同的烷基，例如1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳化二亚胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4，4-二甲基戊基)碳化二亚胺。此外，天冬氨酰和谷氨酰残基通过与铵离子反应转变成天冬酰胺酰和谷氨酰胺酰残基。

谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰残基常常脱去酰胺基，分别成为相应的谷氨酰和天冬氨酰残基。这些残基在中性或碱性条件下脱酰胺。这些残基的脱酰胺形式落入本发明的范围内。

其他修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰或苏氨酰残基的羟基的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化(T.E.Creighton，Proteins：Structure and Molecular Properties，W.H.Freeman & Co.，San Francisco，第79-86页(1983))，N末端胺的乙酰化，和任何C末端羧基的酰胺化。

另一种类型的共价修饰涉及糖苷与抗体的化学或酶促偶联。这些操作是有利的，因为它们不要求在如下宿主细胞中生产抗体，所述宿主细胞具有用于N或O联糖基化的糖基化能力。依赖所使用的偶联方式，一个或多个糖可以附着于：(a)精氨酸和组氨酸，(b)游离羧基，(c)游离巯基例如半胱氨酸的那些，(d)游离羟基例如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的那些，(e)芳香族残基例如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的那些，或(f)谷氨酰胺的酰胺基。这些方法在1987年9月11日公开的WO87/05330以及Aplin和Wriston，CRC Crit.Rev.Biochem.，第259-306页(1981)中描述。

抗体上存在的任何碳水化合物部分的去除都可以化学或酶促完成。化学去糖基化要求抗体暴露于化合物三氟甲磺酸或等价化合物。这种处理导致除了连接糖(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)外的大多数或所有糖的切割，同时使抗体保持完整。化学去糖基化由Hakimuddin，等人Arch.Biochem.Biophys.259：52(1987)和Edge等人Anal.Biochem.，118：131(1981)描述。抗体上的碳水化合物部分的酶促切割可以通过使用各种糖苷内切酶或外切酶来达到，如由Thotakura等人Meth.Enzymol.138：350(1987)描述的。

另一种类型的抗体共价修饰包含使抗体与各种非蛋白质性质的聚合物之一连接，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧乙基化多元醇、聚氧乙基化山梨糖醇、聚氧乙基化葡萄糖、聚氧乙基化甘油、聚氧化烯、或多糖聚合物例如葡聚糖。此种方法是本领域已知的，参见，例如美国专利号4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192，4,179,337，4,766,106，4,179,337，4,495,285，4,609,546或EP 315 456。

每个抗体分子可以被一个或多个(即1、2、3、4、5或更多)聚合物分子附着。聚合物分子优选通过接头分子与抗体附着。一般而言，聚合物可以是合成或天然存在的聚合物，例如任选取代的直链或支链聚烯烃、聚亚烯烃(polyalkenylene)或聚氧化烯聚合物，或分支或未分支的多糖，例如同多糖或杂多糖。优选的聚合物是聚氧乙烯多元醇和聚乙二醇(PEG)。PEG在室温下在水中是可溶的，并且具有通式：R(O--CH2--CH2)n O-R，其中R可以是氢，或保护基团例如烷基或烷醇基团。优选地，保护基团具有1-8个碳，更优选地它是甲基。符号n是正整数，优选1-1,000，更优选2-500。PEG具有1000-40,000的优选平均分子量，更优选2000-20,000，最优选3,000-12,000。优选地，PEG具有至少一个羟基，更优选地它是末端羟基。优选活化这个羟基以与本发明抑制剂上的游离氨基反应。然而，应当理解，反应基团的类型和数量可以改变，以便获得本发明的共价缀合的PEG/抗体。优选的聚合物和使其与肽附着的方法显示于美国专利号.4,766,106；4,179,337；4,495,285；和4,609,546中，所述专利全部在此整体引入作为参考。

基因治疗

治疗性抗体向合适细胞的递送可以经由离体、原位或体内基因疗法来完成，其中可以使用本领域已知的任何合适方式，包括使用物理DNA转移方法(例如，脂质体或化学处理)或使用病毒载体(例如，腺病毒、腺伴随病毒或逆转录病毒)。例如，对于体内治疗，单独地或与载体、脂质体或沉淀物结合的编码所需抗体的核酸可以直接注射到受试者体内，并且在某些实施方案中，可以在需要抗体化合物表达的位点处进行注射。对于离体治疗，取出受试者的细胞，将核酸引入这些细胞内，并且将修饰的细胞直接或例如包裹在多孔膜内送回受试者体内(所述多孔膜将植入患者体内)。参见，例如美国专利号4,892,538和5,283,187。存在可用于将核酸引入活细胞内的各种技术。可以依赖核酸在体外转移到培养细胞内还是在体内转移到预期宿主的细胞中而改变技术。适合于在体外将核酸转移到哺乳动物细胞内的技术包括脂质体、电穿孔、显微注射、细胞融合、DEAE-葡聚糖和磷酸钙沉淀的使用。用于离体递送核酸的常用载体是逆转录病毒。

其他体内核酸转移技术包括用病毒载体(例如腺病毒、单纯疱疹I病毒、或腺伴随病毒)和基于脂质的系统转染。核酸和转染试剂任选地与微粒结合。示例性转染试剂包括磷酸钙或氯化钙共沉淀，DEAE-葡聚糖介导的转染，季铵两亲性化合物DOTMA((二油酰基氧基丙基)三甲铵溴化物，由GIBCO-BRL作为Lipofectin商品化))(Felgner等人，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84，7413-7417；Malone等人(1989)Proc.NatlAcad.Sci.USA 86 6077-6081)；具有悬垂的(pendent)三甲铵头部的亲脂性谷氨酸二酯(Ito等人(1990)Biochem.Biophys.Acta 1023，124-132)；可代谢的母体脂质(parentlpids)例如阳离子脂质二(十八基)酰氨基甘氨酰精胺(DOGS，Transfectam，Promega)和二棕榈酰磷脂酰乙醇戊基精胺(DPPES)(J.P.Behr(1986)Tetrahedron Lett.27，5861-5864；J.P.Behr等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，6982-6986)；可代谢的季铵盐(DOTB，N-(1-[2，3-二油酰氧基]丙基)-N，N，N-三甲基铵甲基硫酸盐(DOTAP)(Boehringer Mannheim)，聚乙烯亚胺(PEI)，二油酰基酯，ChoTB，ChoSC，DOSC)(Leventis等人(1990)Biochim.Inter.22，235-241)；3β[N-(N′，N′-二甲基氨基乙烷)-氨甲酰基]胆固醇(DC-Chol)，二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)/3β[N-(N′，N′-二甲基氨基乙烷)-氨甲酰基]胆固醇(DC-Chol)的一比一混合物(Gao等人，(1991)Biochim.Biophys.Acta 1065，8-14)，精胺，亚精胺，脂多胺(lipopolyamine)(Behr等人，Bioconjugate Chem，1994，5：382-389)，亲脂性聚赖氨酸(LPLL)(Zhou等人，(1991)Biochim.Biophys.Acta939，8-18)，[[(1，1，3，3-四甲基丁基)甲苯氧基]乙氧基]乙基]二甲基苄铵氢氧化物(DEBDA氢氧化物)与过量磷脂酰胆碱/胆固醇(Ballas等人，(1988)Biochim.Biophys.Acta 939，8-18)，溴化十六烷基三甲铵(CTAB)/DOPE混合物(Pinnaduwage等人，(1989)Biochim.Biophys.Acta 985，33-37)，谷氨酸的亲脂性二酯(TMAG)与DOPE、CTAB、DEBDA、二月桂基溴化铵(DDAB)和硬脂胺与磷脂酰乙醇胺的混合(Rose等人，(1991)Biotechnique 10，520-525)，DDAB/DOPE(TransfectACE，GIBCO BRL)，和带有寡聚半乳糖的脂质。增加转移效率的示例性转染增强试剂包括例如DEAE-葡聚糖、polybrene、溶酶体破裂肽(Ohmori N I等人，Biochem Biophys Res Commun Jun.27，1997；235(3)：726-9)、基于软骨素的蛋白聚糖、硫酸化蛋白聚糖、聚乙烯亚胺、聚赖氨酸(PollardH等人J Biol Chem，1998 273(13)：7507-11)、整联蛋白结合肽CYGGRGDTP、线性葡聚糖nonasaccharide、甘油、在寡核苷酸的3′末端核苷间键处栓系的胆固醇基(Letsinger，R.L.1989 Proc Natl Acad Sci USA86：(17)：6553-6)、溶血磷脂、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇胺和1-油酰基溶血卵磷脂。

在某些情况下，可能希望用这样的试剂递送核酸，所述试剂使包含核酸的载体导向靶细胞。此种“靶向”分子包括对于靶细胞上的细胞表面膜蛋白质特异的抗体，或靶细胞上的受体的配体。当采用脂质体时，结合与胞吞作用相关的细胞表面膜蛋白质的蛋白质可以用于靶向和/或促进摄取。此种蛋白质的例子包括对于特定细胞类型具有向性的衣壳蛋白质及其片段，在循环中经历内在化的蛋白质的抗体，和靶向细胞内定位和增强细胞内半衰期的蛋白质。在其他实施方案中，可以使用受体介导的胞吞作用。此种方法例如在Wu等人，1987或Wagner等人，1990中描述。关于目前已知的基因标记和基因治疗方案的综述，参见Anderson 1992。还参见WO93/25673以及其中引用的参考文献。关于基因治疗技术的另外综述，参见Friedmann，Science，244：1275-1281(1989)；Anderson，Nature，第392增补，no 6679，第25-30页(1998)；Verma，Scientific American：68-84(1990)；和Miller，Nature，357：455460(1992)。

筛选方法

本发明的另一个方面涉及鉴定减少EphB3活性的抗体的方法，其包括使EphB3与抗体接触，并且测定抗体是否改变EphB3的活性。在受试抗体的存在下的活性与在不存在受试抗体的情况下的活性比较。当包含受试抗体的样品的活性低于在缺乏受试抗体的样品中的活性时，则抗体已灭活或减少该活性。有效治疗依赖鉴定缺乏显著毒性的有效活性剂。抗体可以通过本领域已知的方法就结合亲和力进行筛选。例如，可以使用凝胶迁移测定法、蛋白质印迹、放射性标记的竞争测定法、通过层析的共分级分离、共沉淀、交联、ELISA等，这些均在例如Current Protocols in MolecularBiology(1999)John Wiley & Sons，NY中描述，所述参考文献整体引入本文作为参考。

为了最初筛选与靶抗原上的期望表位结合的抗体，可以执行常规交叉阻断试验，例如Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，编辑Harlow和David Lane(1988)中描述的那种。也可以使用常规竞争结合测定法，其中未知抗体通过其抑制靶与本发明的靶特异性抗体的结合的能力进行表征。可以使用完整抗原、其片段例如细胞外结构域或线性表位。表位作图在Champe等人，J.Biol.Chem.270：1388-1394(1995)中描述。

在体外结合测定法的一个变体方案中，本发明提供了包括下述步骤的方法：(a)使固定的EphB3与候选抗体接触，和(b)检测候选抗体与EphB3的结合。在一个可替代实施方案中，固定候选抗体且检测EphB3的结合。固定可以使用本领域已知的任何方法来完成，包括与载体、珠或层析树脂共价键合，以及非共价、高亲和力相互作用，例如抗体结合，或使用链霉抗生物素蛋白/生物素结合(其中被固定的化合物可以包括生物素部分)。结合的检测可以使用下述来完成：(i)使用在未固定的化合物上的放射性标记，(ii)使用在未固定化合物上的荧光标记，(iii)使用对于未固定化合物具免疫特异性的抗体，(iv)使用在未固定化合物上能激发固定化合物所附着的荧光载体的标记物，以及本领域众所周知且常规实践的其他技术。

减少靶抗原的活性的抗体可以通过下述进行鉴定：使候选抗体与靶抗原(或表达靶抗原的细胞)一起温育，且测定候选抗体对靶抗原的活性或表达的影响。在受试抗体的存在下的活性与在不存在受试抗体的情况下的活性比较。当包含受试抗体的样品的活性低于在缺乏受试抗体的样品中的活性时，则抗体已减少该活性。调节靶抗原多肽或多核苷酸的活性的抗体的选择性可以通过将其对靶抗原的作用与其对其他相关化合物的作用相比较来评估。

在具体示例性实施方案中，可以考虑检测抗体在培养细胞系统中的效应，以测定其抑制受体磷酸化、信号传导、配体结合、EphB3二聚化、配体诱导的受体活化、和/或EphB3介导的细胞间粘着的能力。另外，细胞试验，包括如本文描述的增殖试验、软琼脂试验和/或细胞毒性试验，也可以用于评估特定EphB3抗体。

特定抗体或抗体组合的生物活性可以使用合适的动物模型在体内进行评估。例如，可以考虑转染成年大鼠脊髓并且监控EphB3和配体表达的上调。(Cell Transplant.2003；12(3)：279-90)。

本发明还涵盖高通量筛选(HTS)试验，以鉴定与靶抗原相互作用或抑制靶抗原的生物活性(即抑制磷酸化、二聚化、配体诱导的受体活化、或细胞内信号传导等)的抗体。HTS试验允许以有效方式筛选大量化合物。考虑基于细胞的HTS系统，以研究靶抗原及其结合配偶体之间的相互作用。可以设计HTS试验，以鉴定具有所需性质的“命中”或“先导化合物”，从该化合物出发可以设计修饰以改善该所需性质。

在本发明的另一个实施方案中，采用高通量筛选法筛选在CDR内具有1、2、3或更多氨基酸修饰的且对靶抗原多肽具有合适的结合亲和力的抗体片段或CDR。

联合治疗

在已鉴定到在动物模型中有效的超过一种抗体后，可能更有利的是，使2种或更多此种抗体(其与相同或不同靶抗原结合)混合在一起以提供更加改善的功效。包含一种或多种抗体的组合物可以施用于患有或易于患有EphB3相关疾病或病症的个人或哺乳动物。2种治疗剂的并用不要求这些治疗剂同一时间施用或通过相同途径进行施用，只要这些治疗剂发挥其疗效的时间段存在重叠即可。可以考虑同时或顺次施用，以及在不同日或周时施用。

本发明的方法考虑单种抗体以及不同抗体的组合或“鸡尾酒式混合物”的施用。此种抗体混合物可以具有某些优点，因为它们可以包含利用不同效应子机制的抗体，或可以使直接细胞毒性抗体与依赖免疫效应子功能的抗体组合。此种组合的抗体可以显示协同疗效。

本发明的方法进一步考虑组合施用单种抗体或抗体混合物以及对于待治疗的该具体疾病或病症而言医学上公认的标准护理。

细胞毒性剂指抑制或阻止细胞的功能和/或引起细胞损坏的物质。该术语意欲包括放射性同位素(例如I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰和Re¹⁸⁶)，化学治疗剂，和毒素例如细菌、真菌、植物或动物起源的酶促活性毒素或者合成毒素，或其片段。非细胞毒性剂指不抑制或阻止细胞功能和/或不引起细胞破坏的物质。非细胞毒性剂可以包括可以被活化成为细胞毒性的试剂。非细胞毒性剂可以包括珠、脂质体、基质或颗粒(参见，例如美国专利公开2003/0028071和2003/0032995，其引入本文作为参考)。此种试剂可以与根据本发明的抗体缀合、偶联、连接或结合。

施用和制剂

本发明的抗体可以配制成包含适合于所需递送方法的载体的药物组合物。合适的载体包括当与抗体组合时能保留抗体的所需活性并且与受试者的免疫系统不反应的任何材料。例子包括但不限于，许多标准药学载体中的任何一种，例如无菌磷酸盐缓冲盐水溶液、抑菌水等。各种水性载体，例如水、缓冲水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸等均可以使用，并且可以包括其他蛋白质用于增强稳定性(例如白蛋白、脂蛋白、球蛋白等)，承受轻微的化学改变等。

抗体的治疗性制剂可以以冻干制剂或水溶液的形式制备用于贮存，方式是使具有所需纯度的抗体与任选的生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合(Remington′s Pharmaceutical Sciences第16版，Osol，A.编辑(1980))。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度时对于接受者是无毒的，并且包括缓冲剂例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八基二甲基苄基氯化铵；氯己双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯例如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂例如EDTA；糖例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子例如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂例如TWEEN^TM、PLURONICS^TM或聚乙二醇(PEG)。

对于待治疗的具体适应症，本文的制剂也可以包含超过一种活性化合物，优选不会不利地相互影响的具有互补活性的那些。这些分子以对于预期目的有效的量适宜地组合存在。

活性成分也可以截留在通过例如团聚技术或通过界面聚合制备的微囊(例如，分别地，羟甲基纤维素或明胶-微囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊)中，胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳、纳米颗粒和纳米囊)中或粗乳状液中。此种技术公开于Remingtont′s PharmaceuticalSciences第16版，Osol，A.编辑(1980)中。

待用于体内施用的制剂必须是无菌的。这可以通过经由无菌滤膜过滤容易地实现。

抗体可以通过任何合适的方法进行施用，包括肠胃外、皮下、腹膜内、肺内和鼻内、以及如果期望局部处理时，伤口内施用。肠胃外输注包括静脉内、动脉内、腹膜内、肌内、真皮内或皮下施用。此外，抗体也可以适宜地通过脉冲输注来施用，特别是用递减剂量的抗体。优选地给药通过注射来给予，最优选地静脉内或皮下注射。可以考虑其他施用方法，包括局部(topical)、特别是经皮、经粘膜、直肠、口或局部(local)施用，例如通过接近于期望位点放置的导管。

对于鼻内施用，药物制剂和药物可以是包含合适的溶剂和任选地其他化合物的喷雾剂或气雾剂，所述其他化合物例如但不限于稳定剂、抗微生物剂、抗氧化剂、pH调节剂、表面活性剂、生物利用度调节剂和这些的组合。用于气雾剂制剂的推进剂可以包括压缩空气、氮气、二氧化碳、或基于烃的低沸点溶剂。

可注射剂型一般包括水悬浮液或油悬浮液，其可以使用合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂进行制备。可注射形式可以为溶液相或为悬浮液的形式，其用溶剂或稀释剂进行制备。可接受的溶剂或媒介物(vehicle)包括无菌水、林格氏溶液或等渗水性盐水溶液。

对于注射，药物制剂和/或药物可以是适合于用如上所述的合适溶液复原(reconstitution)的粉剂。这些的例子包括但不限于，冷冻干燥、旋转干燥或喷雾干燥的粉剂，无定形粉剂，粒剂，沉淀物或微粒。对于注射，制剂可以任选包含稳定剂、pH调节剂、表面活性剂、生物利用度调节剂和这些的组合。

可以制备缓释制剂。缓释制剂的合适例子包括包含抗体的固体疏水聚合物半透性基质，所述基质为成形物体的形式，例如膜或微囊。缓释基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)、或聚(乙烯醇))、聚乳酸(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸和乙基-L谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物例如Lupron Depot^TM(由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林组成的可注射微球体)、和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。尽管聚合物例如乙烯乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸使得分子能够持续释放超过100天，但某些水凝胶释放蛋白质的时间段较短。当包封的抗体在体内停留长时间时，由于在37℃暴露于湿气，它们可能变性或聚集，导致生物活性的丧失和免疫原性的可能改变。依赖所涉及的机制，可以设计理性策略用于稳定。例如，如果发现聚集机制是通过疏基-二硫化物交换的分子间S-S键形成，则稳定可以通过下述来达到：修饰巯基残基、由酸性溶液冻干、控制含湿量、使用合适的添加剂、及开发特定的聚合物基质组合物。可以使用本领域已知的其他策略。

如本文所描述的，本发明的制剂可以设计为短效的、快速释放的、长效的或持续释放的。因此，药物制剂也可以配制用于控制释放或用于缓慢释放。

本发明组合物也可以包含例如胶束或脂质体、或某些其他包囊化形式，或可以以延长释放的形式进行施用，以提供长期的贮存和/或递送效应。因此，药物制剂和药物可以压制成丸或圆柱，并且以储库型注射剂或植入剂例如支架(stent)的形式肌内或皮下植入。此种植入剂可以采用已知的惰性材料，例如聚硅氧烷和生物可降解聚合物。

除上文描述的那些代表性剂型外，药学上可接受的赋形剂和载体也是本领域技术人员一般已知的，并且因此包括在本发明中。此种赋形剂和载体例如在″Remingtons Pharmaceutical Sciences″Mack Pub.Co.，NewJersey(1991)中描述，所述参考文献引入本文作为参考。

依赖疾病的状况，受试者的年龄、体重、一般健康状况、基因型、性别和饮食，剂量间隔，施用途径，排泄率和药物的组合，可以调整具体剂量。包含有效量的上述任何剂型均在常规试验的范围内，并且因此完全在本发明的范围内。

本发明的抗体通常以基本上不含其他天然存在的免疫球蛋白或其他生物学分子的形式制备。当施用于患有或易于患有EphB3相关疾病或病症的哺乳动物时，优选的抗体还将显示最低限度的毒性。

本发明的组合物可以通过常规、众所周知的灭菌技术进行灭菌。所产生的溶液可以包装以备用，或在无菌条件下进行过滤且冻干，冻干制剂在施用前与无菌溶液混合。需要时组合物可以包含药学上可接受的辅助物质以接近生理条件，所述辅助物质例如pH调整和缓冲剂，张力调整剂等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙和稳定剂(例如，1-20％麦芽糖等)。

本发明的抗体还可以经由脂质体进行施用，所述脂质体是由各种类型的脂质和/或磷脂和/或表面活性剂组成的小囊泡，其对于递送药物(例如本文公开的抗体和任选地化学治疗剂)有用。脂质体包括乳状液、泡沫、胶束、不溶性单层、磷脂分散体、片层等，并且可以充当媒介物以使抗体靶向特定组织以及增加组合物的半衰期。各种方法可用于制备脂质体，如例如美国专利号4,837,028和5,019,369中描述的，所述专利引入本文作为参考。

包含抗体的脂质体通过本领域已知的方法进行制备，例如在Epstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：3688(1985)；Hwang等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA 77：4030(1980)；以及美国专利号4,485,045和4,544,545中描述的。具有增加的循环时间的脂质体公开于美国专利号5,013,556中。特别有用的脂质体可以通过反相蒸发法来产生，其中使用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物。脂质体可以通过规定孔径的滤器挤出以产生具有所需直径的脂质体。本发明的抗体的Fab′片段可以经由二硫化物交换反应与脂质体缀合，如Martin等人，J.Biol.Chem.257：286-288(1982)中描述的。化学治疗剂(例如多柔比星)任选包含在脂质体内[参见，例如Gabizon等人，J.National Cancer Inst.81(19)：1484(1989)]。

这些组合物中的抗体浓度可以有大的变化，即从小于约10重量％、通常至少约25重量％到多达75重量％或90重量％，并且将依照所选择的具体施用方式主要通过液体体积、粘度等进行选择。用于制备口部、局部和肠胃外施用组合物的实际方法对于本领域技术人员将是已知的或显而易见的，并且在例如Remington′s Pharmaceutical Science，第19版，MackPublishing Co.，Easton，PA(1995)中详细描述，所述参考文献引入本文作为参考。

用于治疗患者疾病的本发明组合物的有效量可以通过本领域众所周知的标准经验方法来确定。足以实现该目的的量定义为“治疗有效剂量”。抗体的有效量可以变化，且取决于疾病的严重度以及待治疗患者的重量和一般状态，但一般为约1.0μg/kg-约100mg/kg体重。示例性剂量可以为每次应用约10μg/kg-约30mg/kg，或约0.1mg/kg-约20mg/kg，或约1mg/kg-约10mg/kg。抗体也可以按体表面积进行给药(例如不超过4.5g/平方米)。其他示例性抗体剂量包括在单次施用中总共高达8g(假定80kg的体重或1.8平方米的体表面积)。

施用可以通过本领域已知的任何方式。例如，抗体可以通过一次或多次分开的推注(bolus)施用进行施用，或通过历经例如5、10、15、30、60、90、120分钟或更多时间的短期或长期输注进行施用。在最初治疗期后且依赖患者的应答和治疗的耐受性，可以根据需要施用维持剂量，例如每周、每2周、每3周、每4周、每月、每2个月、每3个月或每6个月，以维持患者应答。在发生对疾病症状的期望抑制前可能需要更频繁的剂量，并且剂量可以根据需要进行调整。这种治疗的进程可以通过常规技术和测定法容易地监控。治疗可以持续规定的时间段或可以是长期的，持续数年直至疾病进展或死亡。

可以进行组合物的单次或多次施用，其中由治疗医生选择剂量水平和模式。对于疾病的预防或治疗，抗体的合适剂量将依赖待治疗的疾病类型(如上文定义的)，疾病的严重度和病程，抗体施用用于预防还是治疗目的，先前治疗，患者的临床史和对抗体的应答，以及主治医生的判断。抗体可以适宜地一次或经过一系列治疗而施用于患者。

无论如何，制剂应随时间的过去提供经过足以发挥所需生物活性(例如预防或使EphB3相关疾病或病症的严重度降到最低)的治疗性抗体量。本发明的组合物可以单独或作为辅助治疗与本领域已知用于治疗此种疾病的其他治疗结合进行施用。

抗体组合物将以与良好的医疗实践一致的方式进行配制、给药和施用。在此方面考虑的因素包括待治疗的具体病症、待治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床状况、病症的起因、活性剂的递送位点、施用方法、施用时间安排、和医学从业者已知的其他因素。待施用的抗体的治疗有效量将受这些考虑因素的控制，并且是预防、改善或治疗该靶介导的疾病、病状或病症所需的最小量。此种量优选低于对于宿主有毒或使得宿主明显对感染更易感的量。

抗体无需但可以任选地与目前用于预防或治疗所述病症的一种或多种活性剂一起配制。此种其他活性剂的有效量依赖制剂中存在的抗体量、疾病的类型、病症或病症或治疗、和上文讨论的其他因素。这些活性剂一般以与上文所用相同的剂量和施用途径使用，或以迄今采用的剂量的约1-99％施用。

在本发明的另一个实施方案中，提供了包含用于治疗期望病状的材料的产品。产品可以包含容器和标签。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器和试管。容器可以由各种材料例如玻璃或塑料形成。容器容纳对于治疗病状有效的组合物，并且可以具有无菌入口(例如容器可以是具有可被皮下注射针穿透的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。组合物中的活性剂是本发明的抗体。在容器上的或伴随容器的标签指出组合物用于治疗所选择的病状。产品可以进一步包含第二个容器，其包含第二治疗剂(包括本文讨论的或本领域已知的用于疾病的任何第二治疗剂)。产品可以进一步包含另一个容器，其包含药学上可接受的缓冲液，例如磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液或葡萄糖溶液用于使冻干的抗体制剂复原。它还可以进一步包括从商业和用户观点来看需要的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、滤器、针头、注射器和具有使用说明书的包装插页。

免疫疗法

在治疗具有EphB3相关疾病或病症的患者中有用的抗体可以包括能够起始针对表达EphB3的细胞的有力免疫应答，或能够起始针对表达EphB3的细胞的细胞毒性的那些。与细胞毒性剂缀合的抗体可以用于使细胞毒性剂靶向表达EphB3的组织。可替代地，抗体可以通过补体介导的或抗体依赖性的细胞毒性(ADCC)机制引发细胞裂解，这2者都需要免疫球蛋白分子的完整Fc部分用于与效应细胞Fc受体位点或补体蛋白质相互作用。此外，对细胞生长发挥直接生物学效应的抗体在本发明的实践中也是有用的。

抗EphB3抗体可以以其“裸露”或未缀合形式施用，或可以与其他治疗或诊断剂直接缀合，或可以与包含此种其他治疗或诊断剂的载体聚合物间接缀合。

抗体可以通过使用下述物质可检测地进行标记：放射性同位素、亲和标记(例如生物素、抗生物素蛋白等)、酶标记(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)、发荧光或发光或生物发光标记(例如FITC或罗丹明等)、顺磁原子等。用于完成此种标记的操作是本领域众所周知的；例如，参见(Sternberger，L.A.等人，J.Histochem.Cytochem.18：315(1970)；Bayer，E.A.等人，Meth.Enzym.62：308(1979)；Engval，E.等人，Immunol.109：129(1972)；Goding，J.W.J.Immunol.Meth.13：215(1976))。

抗体部分的缀合在美国专利号6,306,393中描述。一般技术也在Shih等人，Int.J.Cancer 41：832-839(1988)；Shih等人，Int.J.Cancer 46：1101-1106(1990)；和Shih等人，美国专利号5,057,313中描述。这种一般方法涉及使具有氧化的碳水化合物部分的抗体组分与载体聚合物反应，所述载体聚合物具有至少一个游离胺官能团，且载有多个药物、毒素、螯合剂、硼附加物(addend)或其他治疗剂。这种反应导致最初的希夫碱(亚胺)连接，这可以通过还原成仲胺得到稳定以形成最终缀合物。

载体聚合物可以是例如氨基葡聚糖或至少50个氨基酸残基的多肽。用于使药物或其他试剂与载体聚合物缀合的各种技术是本领域已知的。可以使用多肽载体代替氨基葡聚糖，但多肽载体在链中应具有至少50个氨基酸残基，优选100-5000个氨基酸残基。至少某些氨基酸应是赖氨酸残基或谷氨酸或天冬氨酸残基。赖氨酸残基的悬垂胺以及谷氨酸和天冬氨酸的悬垂羧酸对于附着药物、毒素、免疫调节剂、螯合剂、硼附加物或其他治疗剂是方便的。合适的多肽载体的例子包括聚赖氨酸、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、其共聚物、以及这些氨基酸和其他例如丝氨酸的混合聚合物，以对所产生的装载载体和缀合物赋予所需溶解性质。

可替代地，抗体缀合物可以通过使抗体组分与治疗剂直接缀合进行制备。一般操作类似于间接缀合方法，除治疗剂与氧化的抗体组分直接附着外。例如，抗体的碳水化合物部分上可以附着聚乙二醇以延长半衰期。

可替代地，治疗剂可以经由二硫键形成或使用异双官能交联剂附着在还原的抗体组分的铰链区处，所述异双官能交联剂例如3-(2-吡啶联硫基)丙酸N-琥珀酰酯(SPDP)。Yu等人，Int.J.Cancer56：244(1994)。用于此种缀合的一般技术是本领域众所周知的。参见，例如，Wong，Chemistry Of Protein Conjugation and Cross-Linking(CRC Press 1991)；Upeslacis等人，″Modification of Antibodies by Chemical Methods，″inMonoclonal Antibodies：Principles and Applications，Birch等人(编辑)，第187-230页(Wiley-Liss，Inc.1995)；Price，″Production andCharacterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies，″in MonoclonalAntibodies：Production，Enineering and Clinical Application，Ritter等人(编辑)，第60-84页(Cambridge University Press 1995)。各种双官能蛋白质偶联剂是本领域已知的，例如3-(2-吡啶联硫基)丙酸N-琥珀酰亚氨基酯(SPDP)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚氨酸酯的双官能衍生物(例如已二酰亚氨二甲基酯HCL)、活性酯(例如二琥珀酰亚氨基辛二酸酯)、醛(例如戊二醛)、二-叠氮化合物(例如二(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、二重氮衍生物(例如二(对重氮基苯甲酰基)乙二胺)、二异氰酸酯(例如亚甲代苯基2，6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(例如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。

最后，可以构建包含一个或多个抗EphB3抗体部分和另一多肽的融合蛋白。制备抗体融合蛋白的方法是本领域众所周知的。参见，例如，美国专利号6,306,393。包含白介素-2部分的抗体融合蛋白由Boleti等人，Ann.Oncol.6：945(1995)，Nicolet等人，Cancer Gene Ther.2：161(1995)，Becker等人，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 93：7826(1996)，Hank等人，Clin.Cancer Res.2：1951(1996)，和Hu等人，Cancer Res.56：4998(1996)描述。

本发明的抗体可以以其“裸露”或未缀合形式施用，或可以缀合治疗剂。

本发明进一步提供了可检测标记形式的上述抗体。抗体可以通过使用下述进行可检测地标记：放射性同位素、亲和标记(例如生物素、抗生物素蛋白等)、酶标记(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)、荧光或发光或生物发光标记(例如FITC或罗丹明等)、顺磁原子等。用于完成此种标记的操作是本领域众所周知的；例如，参见(Sternberger，L.A.等人，J.Histochem.Cytochem.18：315(1970)；Bayer，E.A.等人，Meth.Enzym.62：308(1979)；Engval，E.等人，Immunol.109：129(1972)；Goding，J.W.J.Immunol.Meth.13：215(1976))。

“标记”指与抗体直接或间接缀合的可检测化合物或组合物。标记自身可以是通过其自身可检测的(例如，放射性同位素标记或荧光标记)，或在酶标记的情况下，可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。可替代地，标记自身可以是不可检测的，但其可以是能被可检测的另一种试剂结合的元件(例如附加表位或结合配偶体对例如生物素-抗生物素蛋白中的一个等)。因此，抗体可以包含有利于其分离的标签或标记，并且本发明的鉴定抗体的方法可以包括通过与标签或标记相互作用而分离抗体的步骤。

免疫缀合物的生产在美国专利号6,306,393中描述。免疫缀合物可以通过使治疗剂与抗体组分间接缀合进行制备。一般技术在Shih等人，Int.J.Cancer 41：832-839(1988)；Shih等人，Int.J.Cancer 46：1101-1106(1990)；和Shih等人，美国专利号5,057,313中描述。一般方法涉及使具有氧化的碳水化合物部分的抗体组分与载体聚合物反应，所述载体聚合物具有至少一个游离胺官能团，且装载有多个药物、毒素、螯合剂、硼附加物或其他治疗剂。这种反应导致最初的希夫碱(亚胺)连接，这可以通过还原成仲胺得到稳定以形成最终缀合物。

载体聚合物优选是氨基葡聚糖或至少50个氨基酸残基的多肽，尽管其他基本上等价的聚合物载体也可以使用。优选地，最终的免疫缀合物在水性溶液例如哺乳动物血清中是可溶的，并易于施用和可以有效地靶向治疗使用。因此，在载体聚合物上的增溶功能将增强最终免疫缀合物的血清溶解性。特别地，氨基葡聚糖将是优选的。

用氨基葡聚糖载体制备免疫缀合物的过程一般从葡聚糖聚合物开始，有利地约10,000-100,000平均分子量的葡聚糖。葡聚糖与氧化剂反应，以实现其碳水化合物环的部分的受控氧化从而产生醛基。可以根据常规程序，用糖解化学试剂例如NaIO₄方便地实现氧化。

氧化的葡聚糖随后与聚胺反应，优选地二胺，且更优选地单或多羟基二胺。合适的胺包括乙二胺、丙二胺、或其他象聚亚甲基二胺、二亚乙基三胺或象聚胺、1，3-二氨基-2-羟基丙烷、或其他象羟基化二胺或聚胺等。相对于葡聚糖的醛基过量的胺用于确保醛官能团基本上完全转变成希夫碱基团。

还原剂例如NaBH₄、NaBH₃CN等用于实现所产生的希夫碱中间产物的还原性稳定。所产生的加合物可以经由通过常规筛分柱进行纯化，以去除交联葡聚糖。

还可以使用使葡聚糖衍生以引入胺官能团的其他常规方法，例如与溴化氰反应，随后与二胺反应。

该氨基葡聚糖随后与通过常规方法制备的、处于活化形式的待装载的具体药物、毒素、螯合剂、免疫调节剂、硼附加物或其他治疗剂的衍生物，优选地，羧基活化的衍生物反应，其中可以例如使用二环己基碳二亚胺(DCC)或其水溶性变体，以形成中间体加合物。

可替代地，多肽可以通过戊二醛缩合或通过使蛋白质上的活化羧基与氨基葡聚糖上的胺反应从而与氨基葡聚糖偶联。

射电金属或磁共振增强剂的螯合剂是本领域众所周知的。一般是乙二胺四乙酸(EDTA)和二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)的衍生物。这些螯合剂一般在侧链上具有可用于使螯合剂与载体附着的基团。此种基团包括例如异硫氰酸苄酯，DTPA或EDTA可以通过其与载体的胺基偶联。可替代地，螯合剂上的羧基或胺基可以通过活化或通过先衍生然后偶联而与载体偶联，这些全都可以通过众所周知的方法实施。

硼附加物例如碳硼烷可以通过常规方法与抗体组分附着。例如，碳硼烷可以用悬垂侧链(pendant side chain)上的羧基官能团进行，如本领域众所周知的。此种碳硼烷与载体例如氨基葡聚糖的附着可以通过碳硼烷的羧基的活化以及与载体上的胺缩合而达成，以产生中间体缀合物。此种中间体缀合物随后与抗体组分附着，以产生治疗上有用的免疫缀合物，如下文描述的。

可以使用多肽载体代替氨基葡聚糖，但多肽载体在链中应具有至少50个氨基酸残基，优选100-5000个氨基酸残基。至少某些氨基酸应是赖氨酸残基或谷氨酸或天冬氨酸残基。赖氨酸残基的悬垂胺以及谷氨酸和天冬氨酸的悬垂羧酸对于附着药物、毒素、免疫调节剂、螯合剂、硼附加物或其他治疗剂是方便的。合适的多肽载体的例子包括聚赖氨酸、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、其共聚物、以及这些氨基酸和其他例如丝氨酸的混合聚合物，以对所产生的装载载体和缀合物赋予所需溶解性质。

中间体缀合物与抗体组分的缀合通过使抗体组分的碳水化合物部分氧化且使所得到的醛(和酮)羰基与载体上于装载上药物、毒素、螯合剂、免疫调节剂、硼附加物或其他治疗剂后剩余的胺基反应来实现。可替代地，中间体缀合物可以经由在装载治疗剂后引入中间体缀合物中的胺基与氧化的抗体组分附着。氧化用化学方法(例如NaIO₄或其他糖解试剂)或酶方法(例如用神经氨酸酶和半乳糖氧化酶)方便地实现。在氨基葡聚糖载体的情况下，一般氨基葡聚糖的并非所有胺都用于装载治疗剂。氨基葡聚糖的剩余胺与氧化的抗体组分缩合，以形成希夫碱加合物，其随后(通常用硼氢化物还原剂)还原稳定。

根据本发明，类似操作可以用于生产其他免疫缀合物。装载的多肽载体优选具有剩余的游离赖氨酸残基用于与抗体组分的氧化的碳水化合物部分缩合。需要时，多肽载体上的羧基可以通过例如用DCC活化且与过量二胺反应而转变成胺。

最终的免疫缀合物使用方便技术进行纯化，例如在Sephacryl S-300上的筛分层析或使用一个或多个CD84Hy表位的亲和层析。

可替代地，免疫缀合物可以通过使抗体组分与治疗剂直接缀合进行制备。一般操作类似于间接缀合方法，除治疗剂与氧化的抗体组分直接缀合外。

作为进一步的举例说明，治疗剂可以经由二硫键形成在还原的抗体组分的铰链区处附着。例如，可以构建具有单个半胱氨酸残基的破伤风类毒素肽，所述半胱氨酸残基用于使肽与抗体组分附着。作为可替代方案，此种肽可以使用异双官能交联剂与抗体组分附着，所述异双官能交联剂例如N-琥珀酰3-(2-吡啶联硫基)丙酸酯(SPDP)。Yu等人，Int.J.Cancer56：244(1994)。用于此种缀合的一般技术是本领域众所周知的。参见，例如，Wong，Chemistry Of Protein Conjugation and Cross-Linking(CRC Press1991)；Upeslacis等人，″Modification of Antibodies by Chemical Methods，″in Monoclonal Antibodies：Principles and Applications，Birch等人(编辑)，第187-230页(Wiley-Liss，Inc.1995)；Price，″Production andCharacterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies，″in MonoclonalAntibodies：Production，Enineering and Clinical Application，Ritter等人(编辑)，第60-84页(Cambridge University Press 1995)。

抗体和细胞毒性剂的缀合可以使用各种双官能蛋白质偶联剂进行制备，例如N-琥珀酰亚氨基3-(2-吡啶联硫基)丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫代环戊烷(IT)、亚氨酸酯的双官能衍生物(例如己二酰亚氨二甲基酯HCL)、活性酯(例如二琥珀酰亚氨基辛二酸酯)、醛(例如戊二醛)、二-叠氮基化合物(例如二(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、二重氮基衍生物(例如二(对重氮基苯甲酰基)乙二胺)、二异氰酸酯(例如亚甲代苯基2，6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(例如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，肽缀合物可以如Vitetta等人，Science 238：1098(1987)中所述进行制备。碳-14标记的1-异硫氰酸酯基苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是示例性螯合剂缀合物(参见，例如，WO94/11026)。

如上所述，抗体的Fc区中的碳水化合物部分可以用于缀合治疗剂。然而，如果抗体片段用作免疫缀合物的抗体组分，那么Fc区可能不存在。然而，可以将碳水化合物部分引入抗体或抗体片段的轻链可变区内。参见，例如，Leung等人，J.Immunol.154：5919(1995)；Hansen等人，美国专利号5,443,953。改造的碳水化合物部分随后可以用于附着治疗剂。

此外，本领域技术人员将知道缀合方法的众多可能的变化方案。例如，碳水化合物部分可以用于附着聚乙二醇，以便延长完整抗体或其抗原结合片段在血液、淋巴或其他细胞外液中的半衰期。此外，通过使治疗剂与碳水化合物部分及与游离巯基附着，可以构建“二价免疫缀合物”。此游离巯基可以位于抗体组分的铰链区中。

抗体融合蛋白

本发明考虑包含一个或多个抗体部分和另一多肽的融合蛋白的使用，所述另一多肽为例如免疫调节剂或其他治疗剂。制备抗体融合蛋白的方法是本领域众所周知的。参见，例如，美国专利号6,306,393。包含白介素-2部分的抗体融合蛋白由Boleti等人，Ann.Oncol.6：945(1995)，Nicolet等人，Cancer Gene Ther.2：161(1995)，Becker等人，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 93：7826(1996)，Hank等人，Clin.Cancer Res.2：1951(1996)，和Hu等人，Cancer Res.56：4998(1996)描述。此外，Yang等人，Hum.Antibodies Hybridomas 6：129(1995)，描述了包含F(ab′)₂片段和肿瘤坏死因子α部分的融合蛋白。

制备其中重组分子包含一个或多个抗体组分和另一治疗剂的融合蛋白的方法也是本领域技术人员已知的。例如，参见Chaudhary等人，Nature339：394(1989)，Brinkmann等人，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 88：8616(1991)，Batra等人，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 89：5867(1992)，Friedman等人，J.Immunol.150：3054(1993)，Wels等人，Int.J.Can.60：137(1995)，Fominaya等人，J.Biol.Chem.271：10560(1996)，Kuan等人，Biochemistry 35：2872(1996)，和Schmidt等人，Int.J.Can.65：538(1996)；Kreitman等人，Leukemia 7：553(1993)，Nicholls等人，J.Biol.Chem.268：5302(1993)，Thompson等人，J.Biol.Chem.270：28037(1995)，和Vallera等人，Blood 88：2342(1996)；Deonarain等人，Tumor Targeting 1：177(1995)，Linardou等人，CellBiophys.24-25：243(1994)，Wang等人，Abstracts of the 209th ACSNational Meeting，Anaheim，Calif.，Apr.2-6，1995，Part 1，BIOT005；Dohlsten等人，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 91：8945(1994)。

在本发明的方法中有用的酶包括但不限于，用于将含磷酸药物前体转变成自由药物的碱性磷酸酶；用于将含硫酸药物前体转变成自由药物的芳基硫酸酯酶；用于将含肽药物前体转变成自由药物的蛋白酶，例如沙雷氏菌属蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶和组织蛋白酶(例如组织蛋白酶B和L)；用于转变含D-氨基酸取代基的药物前体的D-丙氨酰羧肽酶；用于将糖基化的药物前体转变成自由药物的碳水化合物切割酶，例如β-半乳糖苷酶和神经氨酸酶；用于将由β-内酰胺衍生的药物转变成自由药物的β-内酰胺酶；和用于将在胺氮处分别由苯氧乙酰基或苯乙酰基衍生的药物转变成自由药物的青霉素酰胺酶，例如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶。可替代地，具有酶促活性的抗体(也称为抗体酶)可以用于将本发明的药物前体转变成自由活性药物(参见，例如，Massey，Nature328：457-458(1987))。抗体-抗体酶缀合物可以如本文所述进行制备，用于将抗体酶递送给所需细胞群体。

本发明的酶可以通过本领域众所周知的技术，例如使用上文讨论的异双官能交联剂，与抗体共价结合。可替代地，包含与本发明酶的至少功能活性部分连接的本发明抗体的至少抗原结合区域的融合蛋白可以使用本领域众所周知的重组DNA技术进行构建(参见，例如，Neuberger等人，Nature 312：604-608(1984))。

非治疗用途

本发明的抗体可以用作靶抗原的亲和纯化试剂，或在靶抗原的诊断测定法中使用，例如检测其在特定细胞、组织或血清中的表达。抗体也可以用于体内诊断测定法。一般地，对于这些目的，抗体用放射性核素(例如¹¹¹In、⁹⁹Tc、¹⁴C、¹³¹I、¹²⁵I、³H、³²P或³⁵S)进行标记，从而使得位点可以使用免疫闪烁成像术进行定位。

本发明的抗体可以在任何已知的测定方法中使用，例如竞争性结合测定法、直接和间接夹心测定法例如ELISAs、和免疫沉淀测定法。Zola，Monoclonal Antibodies：A Manual of Techniques，第147-158页(CRCPress，Inc.1987)。抗体也可以用于免疫组织化学，以使用本领域已知的方法标记细胞样品。

为了方便起见，本发明的抗体可以在试剂盒中提供，即，预定量的试剂与用于执行诊断测定的说明书的包装组合。当抗体用酶进行标记时，试剂盒将包括酶所需要的底物和辅因子(例如，提供可检测生色团或荧光团的底物前体)。此外，可以包括其他添加剂，例如稳定剂、缓冲剂(例如阻断缓冲液或裂解缓冲液)等。各种试剂的相对量可以进行大的变化，以提供在溶液中这样的试剂浓度，该浓度实质性地优化测定试验的灵敏度。特别地，试剂可以作为干燥粉剂提供，该粉剂通常是冻干的，包括赋形剂，在溶解后将提供具有合适浓度的试剂溶液。

实施例

本发明通过下述实施例进行举例说明，所述实施例并不旨在以任何方式限制本发明。

实施例1

EPHB3细胞外结构域(ECD)的制备

为了EphB3的ECD的重组表达，首先采取巢式PCR方法掺入标签且改造编码区的末端以预备用于掺入表达载体内。使用的引物如下(全部以5′至3′序列书写)：

正向#1：

TCGTATACATTTCTTACATCTATGCGCTGGAAGAGACCCTCATGGACACAAA

(SEQ ID NO：420)

正向#2：

GGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTACGAAGGAGATATACATATGAAATTCTT

AGTCAACGTTGCCCTTGTTTTTATGGTCGTATACATTTCTTACATCTATGCG

(SEQ ID NO：421)

反向#1：

CGGGTCGTCGAGGTCCTCGTCGAAGGGCCTCGTGTAGTGGTAGTGGTAGTGCCT

(SEQ ID NO：422)

反向#2：

CCTCGTGTAGTGGTAGTGGTAGTGCCTCGAATTTGGGTCGAAAGAACATGTTTCACC

AGGG

(SEQ ID NO：423)

PCR扩增使用PfuUltra^TM Hotstart PCR Master Mix(Stratagene)根据制造商的建议来进行。用于扩增的模板是在pDONOR201中克隆的EphB3 ECD片段。使用拓扑异构酶克隆策略将ECD PCR产物克隆到pBlueBac4.5GW内。最终选择的克隆通过双链测序加以证实。制备代表每个克隆的10-20μgDNA用于昆虫转染。

重组构建体按如下用于在昆虫细胞中表达EphB3 ECD。通过噬斑纯化分离共转染了编码EphB3细胞外结构域的质粒DNA与Sapphire^TM基因组苜蓿银纹夜蛾DNA的杆状病毒。重组病毒进行扩增，且以1-1.5x10⁶细胞/ml的密度，在10L(工作体积)摇袋式生物反应器中以2-10的感染复数(moi)用于感染Tn5昆虫细胞。感染48小时后，收集细胞和上清液且进行离心，并且制备上清液用于浓缩。在用切向流10kDa MW截断膜8x浓缩前，上清液在0.45μm空心纤维柱上进行澄清。在蛋白质纯化前，上清液用1L，0.2um孔真空烧瓶进行过滤灭菌。

EphB3 ECD如下进行纯化。使包含EphB3 ECD的昆虫细胞培养上清液以13ml/分钟的流速经过在缓冲液A(PBS/0.35M NaCl/5mM咪唑)中平衡的25mL Ni螯合柱(G.E.树脂目录号17-5318-03)。包含EphB3 ECD的结合蛋白质使用从缓冲液A到缓冲液B(PBS/0.35M NaCl/250mM咪唑)的30柱体积梯度进行洗脱。级分通过SDS-PAGE进行检查，并且合并含有所需纯度的EphB3 ECD的那些级分。该合并物对缓冲液A进行透析，并且经过2x5mL HisTrap(G.E.)柱。HisTrap柱以与第一个Ni螯合柱相同的方式进行洗脱。级分通过SDS-PAGE进行检查，并且合并包含所需纯度的EphB3 ECD蛋白质的那些级分。最终的合并物针对PBS/0.1M精氨酸进行透析。最终物质通过N末端测序以及还原性和非还原性SDS-PAGE(考马斯染色和蛋白质分析)就身份和纯度进行分析。

实施例2

由鼠杂交瘤分泌的靶特异性抗体的鉴定

用于杂交瘤产生的免疫原是重组形式的人EphB3的细胞外结构域(ECD)(对应于SEQ ID NO：2的氨基酸37-558)，其使用杆状病毒/昆虫细胞表达系统产生。对于免疫接种，使ECD与等体积的佐剂混合，并且将混合物皮下注射在后肢足垫的腹侧面上。根据各种免疫接种程序表每3-14天用免疫原注射小鼠，以产生强免疫应答。显示良好免疫应答的小鼠随后被处死，并且收获淋巴结，并且收集淋巴结中的B细胞。根据本领域众所周知的技术，随后使B细胞与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤，并且在ELISA和FACS测定中筛选生产识别EphB3蛋白质的抗体的杂交瘤。

实施例3

通过噬菌体展示鉴定靶特异性抗体

筛选抗体

为了分离一组抗EphB3抗体，筛选自EphB3细胞外结构域(ECD)超免疫的小鼠产生的Omniclonal噬菌体展示文库(Buechler等人PatentNumber 6057098)。

根据美国专利号6,057,098中的方案得自Omniclonal文库的单菌落在ELISA测定法中就结合活性进行筛选。简言之，微量培养物生长至OD₆₀₀＝0.6，在这个点时通过添加0.2％w/v阿拉伯糖诱导可溶抗体片段的表达，随后于30℃在振荡培养箱中过夜培养。离心细菌，并且制备周质提取物，且用于检测针对固定在Nunc MaxiSorp^TM微量平板上的EphB3-ECD的抗体结合活性，该检测根据微量平板制造商提供的标准ELISA方案进行。抗原结合也通过使用荧光活化细胞分选(FACS)分析法测量与CHO-K1-EphB3表达细胞的结合进行评估。

将通过噬菌体展示鉴定的抗体候选物转变成完整IgG

为了将来自最初筛选的先导候选物结合剂转变成包含抗体重和轻链恒定区的抗体，将该结合剂的重和轻链的可变区的编码序列克隆到有专利权的哺乳动物表达载体(WO 2004/033693)内，所述表达载体编码kappa(κ)和gamma-1(γ1)恒定区基因。

抗体如Handa等人(2004 American Society of Cancer Biology Poster#1937)中所述在293E细胞中瞬时表达。转染细胞的上清液在培养第6天时进行收获，并且使用蛋白质A琼脂糖(GE HEalthcare)根据制造商的方案纯化IgG。

实施例4

EphB3抗体表位箱(bin)

使用表面等离子共振(SPR)技术，抗EphB3抗体通过一系列竞争测定策略分配至表位箱(bin)。在这种方法中，使一种抗体直接或通过捕获试剂固定在传感器芯片上，且当配体注射至固定的抗体上时，允许该抗体结合配体(EphB3 ECD)。随后注射第二受试抗体，并且测定其结合被第一抗体捕获的配体的能力。如果抗体与配体上的空间上分开的表位结合，那么第二抗体应该也能结合配体/第一抗体复合物。2种不同抗体同时结合相同配体分子的能力被称为配对(pairing)。

1.第一个系列的实验利用在所有流动室(flong cell)上由高密度的兔抗小鼠Fc特异性抗体(RAM-Fc)包被的CM5传感器芯片。

a.运行缓冲液是HBS-EP(

Inc.)，温度设为25℃，并且流速是10μL/分钟。

b.通过注射1-10μg/mL稀释液1-3分钟在每个流动室上捕获不同的抗体，导致200-1000RU的捕获水平。

c.随后通过30分钟注射在HBS-EP中的100μg/mL小鼠IgG，封闭表面。

d.待就配对(paring)进行检测的抗体以1μg/mL进行注射，以验证芯片被有效封闭，且测定该抗体的本底结合水平。

e.配体以2-10μg/mL注射2-4分钟。

f.待配对的抗体再次如上文步骤1d进行注射。如果抗体在这个注射过程中结合，那么2种抗体形成配对，并且因此放入分开的表位箱中。如果第二种抗体不结合，它与第一种抗体竞争结合，则将它们置于相同或重叠的表位箱中。

g.作为自我配对的对照，每种捕获抗体就与其自身的配对进行检测。

2.一旦阐明了几个表位箱或独特的非配对抗体集后，这些抗体就用于进一步研究更多的抗体。一次使用4种抗体以顺次方式查询抗体。通过在4个流动室的每一个上捕获来自不同表位箱的杂交瘤抗体，随后一次跨所有4个小室执行上文描述的配对方案，查询了更大的样品集。

3.这个方法经修改也用于评价人抗体Fab片段，其中该修改是不使用采用100μg/mL小鼠IgG的封闭步骤，因为RAM-Fc表面不捕获人Fabs。

实施例5

使用基于流式细胞术的测定法选择拮抗剂EphB3抗体以及检测EphB3磷酸化和降解

为了鉴定靶向EphB3的拮抗剂抗体，开发了基于流式细胞术(FACS)的测定法以监控受体活化的下游效应(例如，总细胞磷酸酪氨酸(pY)测定试验，作为信号途径活化的量度)。

总细胞酪氨酸磷酸化

总细胞pY测定试验采用表达高水平的该受体的、悬浮适应的、稳定转染的CHO细胞系。此试验用于筛选杂交瘤上清液、纯化的杂交瘤衍生的抗体、和纯化的重新具有完整IgG格式的噬菌体展示衍生的抗体。

将超表达EphB3的悬浮适应的CHO-K1细胞以2x10⁵细胞/孔种植到圆底96孔板内。针对EphB3的抗体随后1∶10直接稀释到每个样品孔内。使样品37℃温育40-45分钟。温育后，细胞在室温下用2％甲醛固定20分钟。细胞随后用透化缓冲液洗涤2X，且重悬浮于包含PE缀合的小鼠抗磷酸酪氨酸抗体(PY20)的透化缓冲液中。细胞于4℃温育1小时，用透化缓冲液洗涤2X，且通过流式细胞术进行分析。

约24％的受试抗体在pY测定中显示出激动剂活性。3种抗体(XPA.04.017、XHA.05.172和XHA.05.849)引起FACS磷酸酪氨酸染色大约1.5倍的减少，并且这些抗体中的2种(XPA.04.017和XHA.05.172)被作图至相对于这些激动剂抗体不同的表位箱，说明这2种抗体识别与EphB3拮抗效应相关的独特表位。显示最小激动剂活性的2种抗体(XPA.04.019和XPA.04.031)阻止了EphrinB2的结合(下文进一步描述)。

实施例6

EPHRINB2结合竞争测定试验和表位竞争测定试验

A.Flexchip传感器芯片预备

Flexchip分析平台(Biacore，Uppsala Sweden)用于快速测试3种鉴定的抗EphB3拮抗剂抗体与来自另外7个鉴定的表位箱的代表抗体之间的结合竞争，并且也测定这些拮抗剂及来自此另外7个箱的激动剂抗体是否与EphrinB2配体竞争结合EphB3-ECD。

纯化的抗体使用25μL吸头未经稀释而一式两份地点样在裸露的金Flexchip载片上。重组EphB3-ECD和蛋白质A/G一式三份地进行点样。蛋白质浓度概括在表4中。点样后，将芯片置于85％湿度室内1.5小时，随后于4℃放置过夜。

表4.点样在Flexchip传感器芯片表面上的试剂。

样品	浓度(mg/mL)
		EphB3-ECD	1.8
重组小鼠Ephrin-B2/Fc嵌合体	0.5
		XHA.05.849	1.1
XHA.05.172	4.4
		XPA.04.017-IgG	0.5
XPA.04.031-IgG	1.4
		XPA.04.019-IgG蛋白质A/G	2.10.5

在芯片进行点样后，Flexchip用PBST(含0.05％Tween 20的磷酸盐缓冲盐水)运行缓冲液进行平衡。Dock芯片，且使用1X Flexchip封闭溶液(Biacore)进行封闭。

B.EphrinB2竞争测定试验

将在运行缓冲液中2μg/mL的EphrinB2以500uL/分钟注射5分钟，以验证不存在与固定抗体的非特异性结合，并且也验证它与点样的EphB3-ECD结合。随后为在运行缓冲液中2μg/mL的EphB3-ECD的5分钟注射，之后紧接EphrinB2的另一次5分钟注射。XHA.05.849不结合足以在这个试验中进行有效评估的ECD量。所有其他抗体结合显著水平的EphB3-ECD，并且除XPA.04.031和XPA.04.019外的全部抗体允许EphrinB2与抗体捕获的ECD结合(参见下表5)。未检测出EphrinB2与由XPA.04.031和XPA.04.019捕获的重组EphB3-ECD的结合。

表5.EphrinB2和EphB3-ECD与点样抗体的结合

C.表位竞争测定试验

除非另有说明，所有注射以500μL/分钟进行5分钟，并且所有样品用PBST运行缓冲液进行稀释。EphB3-ECD以1μg/mL进行注射，随后紧接为受试抗体以2μg/mL注射。在每次抗体竞争测试后，芯片通过下述进行再生：10mM甘氨酸，pH 2.5的30秒注射，随后为5分钟缓冲液流，然后为10分钟封闭缓冲液流步骤，随后为另一次5分钟缓冲液流。表位竞争数据通过使用Flexchip评估软件的“report point”项进行分析，其中选择命名为Begin、Mid和End的区域，并且将在所选择区域上的平均应答输入表内。

抗体XHA.05.172、XHA.05.849、XPA.04.017和激动剂抗体用作针对所有点样抗体的受试注射样品。来自每个表位竞争测定循环的数据显示于下表6-8中。

表6.在Flexchip试验中测试XHA.05.172与点样抗体对EphB3-ECD的结合竞争

表7.在Flexchip试验中测试XPA.04.017与点样抗体对EphB3-ECD的结合竞争

表8.在Flexchip试验中测试XHA.05.849与点样抗体对EphB3-ECD的结合竞争

D.结论

测试了拮抗剂抗体以及来自每个激动剂箱的代表，以确定它们与EphB3细胞外结构域(ECD)的结合是否阻止EphrinB2配体与该ECD结合。如上所示，EphB3拮抗剂抗体中的2种，XPA.04.017和XHA.05.172，构成与任何激动剂箱不同的独特箱。这个新箱通过2种抗体彼此竞争且不与来自其他7个箱的任何一种其他抗体竞争的能力进行定义。2种抗体XPA.04.017和XHA.05.172也不阻止捕获的ECD与EphrinB2配体结合。这个数据证实本文鉴定和描述的抗体具有拮抗活性，与激动剂抗体结合不同的表位，并且具有并非与EphrinB2配体直接竞争的作用机制。2种抗体XPA.04.019和XPA.04.031具有极小的激动剂活性，但阻止了EphrinB2与捕获的ECD的结合(即配体竞争剂)，且因此可以表征为拮抗剂。激动剂抗体无一表现出此种配体结合竞争。

实施例7

鼠抗体的人源化

这个实施例阐述了用于鼠抗EphB3抗体的人源化的方法。

设计编码人源化的XPA.04.017、XPA.04.031和XPA.04.019轻和重链 的基因

鼠抗体XPA.04.017、XPA.04.031和XPA.04.019的轻链和重链可变区氨基酸序列显示于图1中。使用National Biomedical Foundation ProteinIdentification Resource或相似数据库鉴定的人抗体序列用于提供人源化抗体的构架。为了选择人源化重链的序列，使鼠重链序列与人抗体重链的序列进行比对。在每个位置处选择人抗体氨基酸用于人源化的序列，除非该位置落入下文定义的4个类别中的任何一个中，在这种情况下选择鼠氨基酸：

(1)该位置落入如由Kabat，J.Immunol.，125，961-969(1980)定义的互补决定区(CDR)内；

(2)该人抗体氨基酸在该位置处对于人重链是罕见的，而该鼠氨基酸在该位置处对于人重链是常见的；

(3)该位置在鼠重链的氨基酸序列中紧邻CDR；或

(4)鼠抗体的三维建模暗示该氨基酸在物理上接近于抗原结合区域。

为了选择人源化轻链的序列，使鼠轻链序列与人抗体轻链的序列进行比对。在每个位置处选择人抗体氨基酸用于人源化的序列，除非该位置落入在上文描述和下文重复的类别之一中：

(1)CDR′s；

(2)比人抗体更典型的鼠氨基酸；

(3)与CDR′s邻近；或

(4)与结合区域可能的三维接近性。

重和轻链基因的实际核苷酸序列如下进行选择：

(1)核苷酸序列编码如上所述选择的氨基酸序列；

(2)位于这些编码序列5′的核苷酸序列编码前导(信号)序列。这些前导序列经选择为抗体典型的；

(3)位于编码序列的3′的核苷酸序列是跟随小鼠轻链J5区段和小鼠重链J2区段的序列，其是鼠序列的部分。包括这些序列是因为它们包含剪接供体信号；和

(4)在序列的每个末端处是Xba I位点，以允许在Xba I位点处切割且克隆到载体的Xba I位点内。

人源化的轻和重链基因的构建

为了合成重链，使用Applied Biosystems 380B DNA合成仪合成4种寡核苷酸。其中2种寡核苷酸是重链的每条链的部分，并且每种寡核苷酸与临近的下一种重叠约20个核苷酸，以允许退火。这些寡核苷酸一起覆盖了整个人源化的重链可变区，在每个末端处具有少数额外核苷酸以允许在Xba I位点处切割。寡核苷酸由聚丙烯酰胺凝胶进行纯化。

每种寡核苷酸使用ATP和T4多核苷酸激酶通过标准操作进行磷酸化(Maniatis等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989))。为了退火磷酸化的寡核苷酸，将它们以各约3.75μM的浓度一起悬浮于40ul TA(33mM Tris乙酸盐，pH 7.9、66mM乙酸钾、10mM乙酸镁)中，于95℃加热4分钟，且缓慢冷却至4℃。为了通过合成每种寡核苷酸的相反链由寡核苷酸合成全长基因，在100ul终体积中加入下述组分：

10ul        退火的寡核苷酸

0.16mM      每种脱氧核糖核苷酸

0.5mM       ATP

0.5mM       DTT

100ug/ml    BSA

3.5ug/ml    T4g43蛋白质(DNA聚合酶)

25ug/ml     T4g44/62蛋白质(聚合酶辅助蛋白质)

25ug/ml     45蛋白质(聚合酶辅助蛋白质)

使混合物于37℃温育30分钟。随后加入10u T4DNA连接酶，并且于37℃的温育继续30分钟。聚合酶和连接酶通过使反应于70℃温育15分钟进行灭活。为了用Xba I消化基因，向反应中加入包含200ug/ml的BSA和1mM的DTT的50ul 2X TA、43ul水和在5ul中的50u Xba I。反应于37℃温育3小时，然后在凝胶上进行纯化。从凝胶中纯化Xba I片段，并且通过标准方法克隆到质粒pUC19的Xba I位点内。质粒使用标准技术进行纯化，并且使用双脱氧法进行测序。

表达人源化轻和重链的质粒的构建通过下述来完成：从插入了该轻和重链Xba I片段的pUC19质粒中分离这些片段，然后将其插入合适的表达载体的Xba I位点内，当转染到合适的宿主细胞内时，所述表达载体将表达高水平的完整重链。

人源化抗体的合成和亲和力

将表达载体转染到小鼠Sp2/0细胞内，并且整合质粒的细胞通过标准方法基于由表达载体赋予的选择标记进行选择。为了验证这些细胞分泌与EphB3结合的抗体，使来自细胞的上清液与已知表达EphB3的细胞一起温育。洗涤后，使细胞与荧光素缀合的山羊抗人抗体一起温育，洗涤，且在FACSCAN细胞荧光测量仪上就荧光进行分析。

对于接下来的实验，将生产人源化抗体的细胞注射到小鼠内，并且收集所产生的腹水。人源化抗体经过山羊抗人免疫球蛋白抗体的亲和柱从腹水中纯化至基本同质，所述亲和柱根据标准技术在Affigel-10载体(Bio-RadLaboratories，Inc.，Richmond，Calif.)上制备。人源化抗体相对于原始鼠抗体的亲和力根据本领域已知的技术进行测定。

实施例8

鼠类抗体的人改造

这个实施例描述了Human Engineered^TM抗体的克隆和表达，以及此种抗体的纯化和就结合活性进行测试。

Human Engineered ^TM 序列的设计

抗体可变结构域的Human Engineering^TM已由Studnicka描述[参见，例如，Studnicka等人美国专利号5,766,886；Studnicka等人ProteinEngineering 7：805-814(1994)]，作为用于减少免疫原性同时保留抗体分子的结合活性的方法。根据该方法，确定每个可变区氨基酸的置换风险。氨基酸置换被分为3个风险类别之一：(1)低风险改变是具有减少免疫原性的最大潜力且具有破坏抗原结合的最小机会的那些；(2)中等风险改变是将进一步减少免疫原性，但具有影响抗原结合或蛋白质折叠的较大可能性的那些；(3)高风险残基是对于结合或对于维持抗体结构是重要的、且具有影响抗原结合或蛋白质折叠的最高风险的那些。由于脯氨酸的三维结构作用，在脯氨酸处的修饰一般被视为是至少中等风险改变，即使位置是典型的低风险位置。置换改变是优选的，但插入和缺失也是可以的。图7显示对XPA.04.017、XPA.04.031和XPA.04.019轻和重链的每个氨基酸残基的风险赋值，分类为高、中或低风险改变。

本发明鼠抗体的轻和重链的可变区可以使用这种方法进行HumanEngineered^TM。处于低风险位置的根据该方法为修饰候选物的氨基酸残基可以通过使鼠可变区的氨基酸序列与人可变区序列比对进行鉴定。可以使用任何人可变区，包括个体的VH或VL序列，或人共有VH或VL序列。可以改变在任何数目的低风险位置处或在所有低风险位置处的氨基酸残基。

类似地，所有低和中等风险位置上的根据该方法为修饰候选物的氨基酸残基可以通过使鼠可变区的氨基酸序列与人可变区序列比对进行鉴定。可以改变在任何数目的低或中等风险位置处或在所有低和中等风险位置处的氨基酸残基。

用于永久细胞系开发的表达载体的制备

编码每一个上文描述的重和轻链V区序列连同抗体衍生的信号序列的DNA片段使用合成的核苷酸合成进行构建。将编码每一个上文描述的轻链V区氨基酸序列的DNA插入包含人κ轻链恒定区的载体pMXP10内。将编码每一个上文描述的重链V区氨基酸序列的DNA插入包含人γ-1、2、3或4重链恒定区的载体pMXP6内。所有这些载体包含hCMV启动子和小鼠κ轻链3′非翻译区，以及选择标记基因例如neo或his用于分别选择G418或组氨醇抗性转染子。

用于瞬时表达的表达载体的制备

也构建包含上文描述的轻或重链基因的载体用于瞬时转染。这些载体类似于上文描述的用于永久转染的载体，除了代替neo或his基因，它们包含EB病毒oriP用于在表达EB病毒核抗原的HEK293细胞中复制。

工程化人抗EphB3抗体在HEK293E细胞中的瞬时表达

将各自包含来自EB病毒的oriP和上文描述的轻链或重链基因的分开载体瞬时转染到HEK293E细胞内。允许瞬时转染的细胞温育多达10天，这之后回收上清液并且使用蛋白质A层析纯化抗体。

永久转染的CHO-K1细胞的开发

将上文描述的包含轻和重基因各1个拷贝的载体一起转染到Ex-Cell302适应的CHO-K1细胞内。适应于在Ex-Cell 302培养基中悬浮生长的CHO-K1细胞一般用40ug线性化载体进行电穿孔。可替代地，线性化DNA可以与线性聚乙烯亚胺(PEI)复合且用于转染。将细胞接种在包含补充有1％FBS和G418的Ex-Cell 302培养基的96孔板中。克隆在96孔板中进行筛选，并且将来自每个转染的～10％的最好克隆转移至包含Ex-Cell302培养基的24孔板。

生产力试验在Ex-Cell 302培养基中在24孔板中针对生长7和14天的培养物进行，在这时培养上清液通过IgG的免疫球蛋白ELISA测定法就分泌抗体的水平进行测试。

将最好克隆转移至包含Ex-Cell 302培养基的摇瓶。一旦细胞适应悬浮生长后，就用在Ex-Cell 302培养基中的这些克隆进行摇瓶测试。细胞在包含25ml培养基的125ml锥形瓶中生长高达10天。摇瓶在温育期至少每隔一天打开以允许气体交换，并且在培养基中的免疫球蛋白多肽水平在温育期结束时通过IgG ELISA进行测定。用2个或3个多单位(multi-unit)转录载体顺次多重转染相同细胞系，导致显示免疫球蛋白生产水平进一步增加(优选至300μg/ml或更多)的克隆和细胞系。

纯化

可以设计自本发明的载体和所有细胞系纯化免疫球蛋白多肽的方法。例如，根据本领域众所周知的方法，在结束后通过过滤去除细胞。将滤液加载到蛋白质A柱上(需要时，多次经过)。柱进行洗涤，然后从柱中洗脱所表达且分泌的免疫球蛋白多肽。对于抗体产物的制备，将蛋白质A合并物保持在低pH下(pH 3最少30分钟和最多1个小时)作为病毒灭活步骤。吸附阳离子交换步骤接下来用于进一步纯化产物。使来自吸附分离柱的洗脱物经过病毒保留滤器，以进一步清除潜在病毒颗粒。滤液通过产物不结合的阴离子交换柱进行进一步纯化。最后，通过渗透过滤(diafiltration)将产物转移到制剂缓冲液内而结束该纯化过程。将保留物调整至至少1mg/mL的蛋白质浓度，且加入稳定剂。

结合活性

评估重组Human Engineered^TM抗体的EphB3结合活性。使蛋白质通过蛋白质A柱以从摇瓶培养上清液纯化，随后通过A₂₈₀进行浓度测定。如其他实施例中所述进行结合测定试验。

实施例9

序列

SEQ ID NO：1(EphB3的核苷酸序列)

cgtgagcggcgcagcaagatcccagctcggaccccggacggcgcgcgcccccgaagccccggatcccagtcgggcccgcagctgac

cgccagattactgtgcatcccgaatcacgaccacctgcaccctcctgccccggcccgccccccaagtcctcaggcacccagctccccgg

cgccccggatcctcctggaccggtccgtccagattcccgcgggaccgacctgtccgcatccccaggaccgccgggctcggtgcaccgc

ctcggtcccggagccgcccgcctggattgcattccctcctctcctggatctcctgggacccgacgcgagcctgccccggagcccgccga

gcgcaccctctctcgggtgcctgcagccccgccggcgcggcccggcccggcgcggcccggctcggctcctagagctgccacggccat

ggccagagcccgcccgccgccgccgccgtcgccgccgccggggcttctgccgctgctccctccgctgctgctgctgccgctgctgctgc

tgcccgccggctgccgggcgctggaagagaccctcatggacacaaaatgggtaacatctgagttggcgtggacatctcatccagaaagt

gggtgggaagaggtgagtggctacgatgaggccatgaatcccatccgcacataccaggtgtgtaatgtgcgcgagtcaagccagaacaa

ctggcttcgcacggggttcatctggcggcgggatgtgcagcgggtctacgtggagctcaagttcactgtgcgtgactgcaacagcatcccc

aacatccccggctcctgcaaggagaccttcaacctcttctactacgaggctgacagcgatgtggcctcagcctcctcccccttctggatgga

gaacccctacgtgaaagtggacaccattgcacccgatgagagcttctcgcggctggatgccggccgtgtcaacaccaaggtgcgcagctt

tgggccactttccaaggctggcttctacctggccttccaggaccagggcgcctgcatgtcgctcatctccgtgcgcgccttctacaagaagt

gtgcatccaccaccgcaggcttcgcactcttccccgagaccctcactggggcggagcccacctcgctggtcattgctcctggcacctgcat

ccctaacgccgtggaggtgtcggtgccactcaagctctactgcaacggcgatggggagtggatggtgcctgtgggtgcctgcacctgtgc

caccggccatgagccagctgccaaggagtcccagtgccgcccctgtccccctgggagctacaaggcgaagcagggagaggggccctg

cctcccatgtccccccaacagccgtaccacctccccagccgccagcatctgcacctgccacaataacttctaccgtgcagactcggactct

gcggacagtgcctgtaccaccgtgccatctccaccccgaggtgtgatctccaatgtgaatgaaacctcactgatcctcgagtggagtgagc

cccgggacctgggtggccgggatgacctcctgtacaatgtcatctgcaagaagtgccatggggctggaggggcctcagcctgctcacgc

tgtgatgacaacgtggagtttgtgcctcggcagctgggcctgacggagcgccgggtccacatcagccatctgctggcccacacgcgctac

acctttgaggtgcaggcggtcaacggtgtctcgggcaagagccctctgccgcctcgttatgcggccgtgaatatcaccacaaaccaggct

gccccgtctgaagtgcccacactacgcctgcacagcagctcaggcagcagcctcaccctatcctgggcacccccagagcggcccaacg

gagtcatcctggactacgagatgaagtactttgagaagagcgagggcatcgcctccacagtgaccagccagatgaactccgtgcagctgg

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agaccacaagtgagagaggctctggggcccagcagctccaggagcagcttcccctcatcgtgggctccgctacagctgggcttgtcttcg

tggtggctgtcgtggtcatcgctatcgtctgcctcaggaagcagcgacacggctctgattcggagtacacggagaagctgcagcagtacat

tgctcctggaatgaaggtttatattgacccttttacctacgaggaccctaatgaggctgttcgggagtttgccaaggagatcgacgtgtcctgc

gtcaagatcgaggaggtgatcggagctggggaatttggggaagtgtgccgtggtcgactgaaacagcctggccgccgagaggtgtttgt

ggccatcaagacgctgaaggtgggctacaccgagaggcagcggcgggacttcctaagcgaggcctccatcatgggtcagtttgatcacc

ccaatataatccggctcgagggcgtggtcaccaaaagtcggccagttatgatcctcactgagttcatggaaaactgcgccctggactccttc

ctccggctcaacgatgggcagttcacggtcatccagctggtgggcatgttgcggggcattgctgccggcatgaagtacctgtccgagatga

actatgtgcaccgcgacctggctgctcgcaacatccttgtcaacagcaacctggtctgcaaagtctcagactttggcctctcccgcttcctgg

aggatgacccctccgatcctacctacaccagttccctgggcgggaagatccccatccgctggactgccccagaggccatagcctatcgga

agttcacttctgctagtgatgtctggagctacggaattgtcatgtgggaggtcatgagctatggagagcgaccctactgggacatgagcaac

caggatgtcatcaatgccgtggagcaggattaccggctgccaccacccatggactgtcccacagcactgcaccagctcatgctggactgc

tgggtgcgggaccggaacctcaggcccaaattctcccagattgtcaataccctggacaagctcatccgcaatgctgccagcctcaaggtca

ttgccagcgctcagtctggcatgtcacagcccctcctggaccgcacggtcccagattacacaaccttcacgacagttggtgattggctggat

gccatcaagatggggcggtacaaggagagcttcgtcagtgcggggtttgcatcttttgacctggtggcccagatgacggcagaagacctg

ctccgtattggggtcaccctggccggccaccagaagaagatcctgagcagtatccaggacatgcggctgcagatgaaccagacgctgcc

tgtgcaggtctgacaccggctcccacggggaccctgaggaccgtgcagggatgccaagcagccggctggactttcggactcttggacttt

tggatgcctggccttaggctgtggcccagaagctggaagtttgggaaaggcccaagctgggacttctccaggcctgtgttccctccccagg

aagtgcgccccaaacctcttcatattgaagatggattaggagagggggtgatgacccctccccaagcccctcagggcccagaccttcctg

ctctccagcaggggatccccacaacctcacacttgtctgttcttcagtgctggaggtcctggcagggtcaggctggggtaagccggggttc

cacagggcccagccctggcaggggtctggccccccaggtaggcggagagcagtccctccctcaggaactggaggaggggactccag

gaatggggaaatgtgacaccaccatcctgaagccagcttgcacctccagtttgcacagggatttgttctgggggctgagggccctgtcccc

acccccgcccttggtgctgtcataaaagggcaggcaggggcaggctgaggagttgccctttgccccccagagactgactctcagagcca

gagatgggatgtgtgagtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgcgcgcgcgcgcgcgtgtgtgtgtgcacgcactggcctgcacagagagcat

gggtgagcgtgtaaaagcttggccctgtgccctacaatggggccagctgggccgacagcagaataaaggcaataagatgaaaaaaaaa

aaaaaa

SEQ ID NO：2(EphB3的蛋白质序列)

MARARPPPPPSPPPGLLPLLPPLLLLPLLLLPAGCRALEETLMDTKWVTSELAWTSHPES

GWEEVSGYDEAMNPIRTYQVCNVRESSQNNWLRTGFIWRRDVQRVYVELKFTVRDCN

SIPNIPGSCKETFNLFYYEADSDVASASSPFWMENPYVKVDTIAPDESFSRLDAGRVNTK

VRSFGPLSKAGFYLAFQDQGACMSLISVRAFYKKCASTTAGFALFPETLTGAEPTSLVIA

PGTCIPNAVEVSVPLKLYCNGDGEWMVPVGACTCATGHEPAAKESQCRPCPPGSYKAK

QGEGPCLPCPPNSRTTSPAASICTCHNNFYRADSDSADSACTTVPSPPRGVISNVNETSLI

LEWSEPRDLGGRDDLLYNVICKKCHGAGGASACSRCDDNVEFVPRQLGLTERRVHISH

LLAHTRYTFEVQAVNGVSGKSPLPPRYAAVNITTNQAAPSEVPTLRLHSSSGSSLTLSW

APPERPNGVILDYEMKYFEKSEGIASTVTSQMNSVQLDGLRPDARYVVQVRARTVAGY

GQYSRPAEFETTSERGSGAQQLQEQLPLIVGSATAGLVFVVAVVVIAIVCLRKQRHGSD

SEYTEKLQQYIAPGMKVYIDPFTYEDPNEAVREFAKEIDVSCVKIEEVIGAGEFGEVCRG

RLKQPGRREVFVAIKTLKVGYTERQRRDFLSEASIMGQFDHPNIIRLEGVVTKSRPVMII

TEFMENCALDSFLRLNDGQFTVIQLVGMLRGIAAGMKYLSEMNYVHRDLAARNILVNS

NLVCKVSDFGLSRFLEDDPSDPTYTSSLGGKIPIRWTAPEAIAYRKFTSASDVWSYGIVM

WEVMSYGERPYWDMSNQDVINAVEQDYRLPPPMDCPTALHQLMLDCWVRDRNLRPK

FSQIVNTLDKLIRNAASLKVIASAQSGMSQPLLDRTVPDYTTFTTVGDWLDAIKMGRYK

ESFVSAGFASFDLVAQMTAEDLLRIGVTLAGHQKKILSSIQDMRLQMNQTLPVQV

在本说明书中提及和/或在申请数据单中列出的所有上述美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物，均整体引入本文作为参考。

根据前述显而易见的是，尽管本发明的具体实施方案已在本文中进行描述用于举例说明的用途，但可以进行各种修饰而不背离本发明的精神和范围。

序列表

<110>诺瓦提斯公司和爱克索马技术有限公司(Novartis AG and Xoma Ltd.)

<120>抗EPHB3的拮抗剂抗体

<130>PP028395.0002(27527/42271A)

<150>US 60/873,386

<151>2006-12-07

<160>423

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>4096

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>1

cgtgagcggc gcagcaagat cccagctcgg accccggacg gcgcgcgccc ccgaagcccc    60

ggatcccagt cgggcccgca gctgaccgcc agattactgt gcatcccgaa tcacgaccac   120

ctgcaccctc ctgccccggc ccgcccccca agtcctcagg cacccagctc cccggcgccc   180

cggatcctcc tggaccggtc cgtccagatt cccgcgggac cgacctgtcc gcatccccag   240

gaccgccggg ctcggtgcac cgcctcggtc ccggagccgc ccgcctggat tgcattccct   300

cctctcctgg atctcctggg acccgacgcg agcctgcccc ggagcccgcc gagcgcaccc   360

tctctcgggt gcctgcagcc ccgccggcgc ggcccggccc ggcgcggccc ggctcggctc   420

ctagagctgc cacggccatg gccagagccc gcccgccgcc gccgccgtcg ccgccgccgg   480

ggcttctgcc gctgctccct ccgctgctgc tgctgccgct gctgctgctg cccgccggct   540

gccgggcgct ggaagagacc ctcatggaca caaaatgggt aacatctgag ttggcgtgga   600

catctcatcc agaaagtggg tgggaagagg tgagtggcta cgatgaggcc atgaatccca   660

tccgcacata ccaggtgtgt aatgtgcgcg agtcaagcca gaacaactgg cttcgcacgg   720

ggttcatctg gcggcgggat gtgcagcggg tctacgtgga gctcaagttc actgtgcgtg   780

actgcaacag catccccaac atccccggct cctgcaagga gaccttcaac ctcttctact   840

acgaggctga cagcgatgtg gcctcagcct cctccccctt ctggatggag aacccctacg   900

tgaaagtgga caccattgca cccgatgaga gcttctcgcg gctggatgcc ggccgtgtca   960

acaccaaggt gcgcagcttt gggccacttt ccaaggctgg cttctacctg gccttccagg  1020

accagggcgc ctgcatgtcg ctcatctccg tgcgcgcctt ctacaagaag tgtgcatcca  1080

ccaccgcagg cttcgcactc ttccccgaga ccctcactgg ggcggagccc acctcgctgg  1140

tcattgctcc tggcacctgc atccctaacg ccgtggaggt gtcggtgcca ctcaagctct  1200

actgcaacgg cgatggggag tggatggtgc ctgtgggtgc ctgcacctgt gccaccggcc  1260

atgagccagc tgccaaggag tcccagtgcc gcccctgtcc ccctgggagc tacaaggcga  1320

agcagggaga ggggccctgc ctcccatgtc cccccaacag ccgtaccacc tccccagccg  1380

ccagcatctg cacctgccac aataacttct accgtgcaga ctcggactct gcggacagtg  1440

cctgtaccac cgtgccatct ccaccccgag gtgtgatctc caatgtgaat gaaacctcac    1500

tgatcctcga gtggagtgag ccccgggacc tgggtggccg ggatgacctc ctgtacaatg    1560

tcatctgcaa gaagtgccat ggggctggag gggcctcagc ctgctcacgc tgtgatgaca    1620

acgtggagtt tgtgcctcgg cagctgggcc tgacggagcg ccgggtccac atcagccatc    1680

tgctggccca cacgcgctac acctttgagg tgcaggcggt caacggtgtc tcgggcaaga    1740

gccctctgcc gcctcgttat gcggccgtga atatcaccac aaaccaggct gccccgtctg    1800

aagtgcccac actacgcctg cacagcagct caggcagcag cctcacccta tcctgggcac    1860

ccccagagcg gcccaacgga gtcatcctgg actacgagat gaagtacttt gagaagagcg    1920

agggcatcgc ctccacagtg accagccaga tgaactccgt gcagctggac gggcttcggc    1980

ctgacgcccg ctatgtggtc caggtccgtg cccgcacagt agctggctat gggcagtaca    2040

gccgccctgc cgagtttgag accacaagtg agagaggctc tggggcccag cagctccagg    2100

agcagcttcc cctcatcgtg ggctccgcta cagctgggct tgtcttcgtg gtggctgtcg    2160

tggtcatcgc tatcgtctgc ctcaggaagc agcgacacgg ctctgattcg gagtacacgg    2220

agaagctgca gcagtacatt gctcctggaa tgaaggttta tattgaccct tttacctacg    2280

aggaccctaa tgaggctgtt cgggagtttg ccaaggagat cgacgtgtcc tgcgtcaaga    2340

tcgaggaggt gatcggagct ggggaatttg gggaagtgtg ccgtggtcga ctgaaacagc    2400

ctggccgccg agaggtgttt gtggccatca agacgctgaa ggtgggctac accgagaggc    2460

agcggcggga cttcctaagc gaggcctcca tcatgggtca gtttgatcac cccaatataa    2520

tccggctcga gggcgtggtc accaaaagtc ggccagttat gatcctcact gagttcatgg    2580

aaaactgcgc cctggactcc ttcctccggc tcaacgatgg gcagttcacg gtcatccagc    2640

tggtgggcat gttgcggggc attgctgccg gcatgaagta cctgtccgag atgaactatg    2700

tgcaccgcga cctggctgct cgcaacatcc ttgtcaacag caacctggtc tgcaaagtct    2760

cagactttgg cctctcccgc ttcctggagg atgacccctc cgatcctacc tacaccagtt    2820

ccctgggcgg gaagatcccc atccgctgga ctgccccaga ggccatagcc tatcggaagt    2880

tcacttctgc tagtgatgtc tggagctacg gaattgtcat gtgggaggtc atgagctatg    2940

gagagcgacc ctactgggac atgagcaacc aggatgtcat caatgccgtg gagcaggatt    3000

accggctgcc accacccatg gactgtccca cagcactgca ccagctcatg ctggactgct    3060

gggtgcggga ccggaacctc aggcccaaat tctcccagat tgtcaatacc ctggacaagc    3120

tcatccgcaa tgctgccagc ctcaaggtca ttgccagcgc tcagtctggc atgtcacagc    3180

ccctcctgga ccgcacggtc ccagattaca caaccttcac gacagttggt gattggctgg    3240

atgccatcaa gatggggcgg tacaaggaga gcttcgtcag tgcggggttt gcatcttttg    3300

acctggtggc ccagatgacg gcagaagacc tgctccgtat tggggtcacc ctggccggcc    3360

accagaagaa gatcctgagc agtatccagg acatgcggct gcagatgaac cagacgctgc    3420

ctgtgcaggt ctgacaccgg ctcccacggg gaccctgagg accgtgcagg gatgccaagc    3480

agccggctgg actttcggac tcttggactt ttggatgcct ggccttaggc tgtggcccag    3540

aagctggaag tttgggaaag gcccaagctg ggacttctcc aggcctgtgt tccctcccca    3600

ggaagtgcgc cccaaacctc ttcatattga agatggatta ggagaggggg tgatgacccc    3660

tccccaagcc cctcagggcc cagaccttcc tgctctccag caggggatcc ccacaacctc    3720

acacttgtct gttcttcagt gctggaggtc ctggcagggt caggctgggg taagccgggg    3780

ttccacaggg cccagccctg gcaggggtct ggccccccag gtaggcggag agcagtccct    3840

ccctcaggaa ctggaggagg ggactccagg aatggggaaa tgtgacacca ccatcctgaa    3900

gccagcttgc acctccagtt tgcacaggga tttgttctgg gggctgaggg ccctgtcccc    3960

acccccgccc ttggtgctgt cataaaaggg caggcagggg caggctgagg agttgccctt    4020

tgccccccag agactgactc tcagagccag agatgggatg tgtgagtgtg tgtgtgtgtg    4080

tgtgtgtgtg cgcgcg                                                    4096

<210>2

<211>998

<212>PRT

<213>人

<400>2

Met Ala Arg Ala Arg Pro Pro Pro Pro Pro Ser Pro Pro Pro Gly Leu

1               5                   10                  15

Leu Pro Leu Leu Pro Pro Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Leu Leu Pro

            20                  25                  30

Ala Gly Cys Arg Ala Leu Glu Glu Thr Leu Met Asp Thr Lys Trp Val

        35                  40                  45

Thr Ser Glu Leu Ala Trp Thr Ser His Pro Glu Ser Gly Trp Glu Glu

    50                  55                  60

Val Ser Gly Tyr Asp Glu Ala Met Asn Pro Ile Arg Thr Tyr Gln Val

65                  70                  75                  80

Cys Asn Val Arg Glu Ser Ser Gln Asn Asn Trp Leu Arg Thr Gly Phe

                85                  90                  95

Ile Trp Arg Arg Asp Val Gln Arg Val Tyr Val Glu Leu Lys Phe Thr

            100                 105                 110

Val Arg Asp Cys Asn Ser Ile Pro Asn Ile Pro Gly Ser Cys Lys Glu

        115                 120                 125

Thr Phe Asn Leu Phe Tyr Tyr Glu Ala Asp Ser Asp Val Ala Ser Ala

    130                 135                 140

Ser Ser Pro Phe Trp Met Glu Asn Pro Tyr Val Lys Val Asp Thr Ile

145                 150                 155                 160

Ala Pro Asp Glu Ser Phe Ser Arg Leu Asp Ala Gly Arg Val Asn Thr

                165                 170                 175

Lys Val Arg Ser Phe Gly Pro Leu Ser Lys Ala Gly Phe Tyr Leu Ala

            180                 185                 190

Phe Gln Asp Gln Gly Ala Cys Met Ser Leu Ile Ser Val Arg Ala Phe

        195                 200                 205

Tyr Lys Lys Cys Ala Ser Thr Thr Ala Gly Phe Ala Leu Phe Pro Glu

    210                 215                 220

Thr Leu Thr Gly Ala Glu Pro Thr Ser Leu Val Ile Ala Pro Gly Thr

225                 230                 235                 240

Cys Ile Pro Asn Ala Val Glu Val Ser Val Pro Leu Lys Leu Tyr Cys

                245                 250                 255

Asn Gly Asp Gly Glu Trp Met Val Pro Val Gly Ala Cys Thr Cys Ala

            260                 265                 270

Thr Gly His Glu Pro Ala Ala Lys Glu Ser Gln Cys Arg Pro Cys Pro

        275                 280                 285

Pro Gly Ser Tyr Lys Ala Lys Gln Gly Glu Gly Pro Cys Leu Pro Cys

    290                 295                 300

Pro Pro Asn Ser Arg Thr Thr Ser Pro Ala Ala Ser Ile Cys Thr Cys

305                 310                 315                 320

His Asn Asn Phe Tyr Arg Ala Asp Ser Asp Ser Ala Asp Ser Ala Cys

                325                 330                 335

Thr Thr Val Pro Ser Pro Pro Arg Gly Val Ile Ser Asn Val Asn Glu

            340                 345                 350

Thr Ser Leu Ile Leu Glu Trp Ser Glu Pro Arg Asp Leu Gly Gly Arg

        355                 360                 365

Asp Asp Leu Leu Tyr Asn Val Ile Cys Lys Lys Cys His Gly Ala Gly

    370                 375                 380

Gly Ala Ser Ala Cys Ser Arg Cys Asp Asp Asn Val Glu Phe Val Pro

385                 390                 395                 400

Arg Gln Leu Gly Leu Thr Glu Arg Arg Val His Ile Ser His Leu Leu

                405                 410                 415

Ala His Thr Arg Tyr Thr Phe Glu Val Gln Ala Val Asn Gly Val Ser

            420                 425                 430

Gly Lys Ser Pro Leu Pro Pro Arg Tyr Ala Ala Val Asn Ile Thr Thr

        435                 440                 445

Asn Gln Ala Ala Pro Ser Glu Val Pro Thr Leu Arg Leu His Ser Ser

    450                 455                 460

Ser Gly Ser Ser Leu Thr Leu Ser Trp Ala Pro Pro Glu Arg Pro Asn

465                 470                 475                 480

Gly Val Ile Leu Asp Tyr Glu Met Lys Tyr Phe Glu Lys Ser Glu Gly

                485                 490                 495

Ile Ala Ser Thr Val Thr Ser Gln Met Asn Ser Val Gln Leu Asp Gly

            500                 505                 510

Leu Arg Pro Asp Ala Arg Tyr Val Val Gln Val Arg Ala Arg Thr Val

        515                 520                 525

Ala Gly Tyr Gly Gln Tyr Ser Arg Pro Ala Glu Phe Glu Thr Thr Ser

    530                 535                 540

Glu Arg Gly Ser Gly Ala Gln Gln Leu Gln Glu Gln Leu Pro Leu Ile

545                 550                 555                 560

Val Gly Ser Ala Thr Ala Gly Leu Val Phe Val Val Ala Val Val Val

                565                 570                 575

Ile Ala Ile Val Cys Leu Arg Lys Gln Arg His Gly Ser Asp Ser Glu

            580                 585                 590

Tyr Thr Glu Lys Leu Gln Gln Tyr Ile Ala Pro Gly Met Lys Val Tyr

        595                 600                 605

Ile Asp Pro Phe Thr Tyr Glu Asp Pro Asn Glu Ala Val Arg Glu Phe

    610                 615                 620

Ala Lys Glu Ile Asp Val Ser Cys Val Lys Ile Glu Glu Val Ile Gly

625                 630                 635                 640

Ala Gly Glu Phe Gly Glu Val Cys Arg Gly Arg Leu Lys Gln Pro Gly

                645                 650                 655

Arg Arg Glu Val Phe Val Ala Ile Lys Thr Leu Lys Val Gly Tyr Thr

            660                 665                 670

Glu Arg Gln Arg Arg Asp Phe Leu Ser Glu Ala Ser Ile Met Gly Gln

        675                 680                 685

Phe Asp His Pro Asn Ile Ile Arg Leu Glu Gly Val Val Thr Lys Ser

    690                 695                 700

Arg Pro Val Met Ile Leu Thr Glu Phe Met Glu Asn Cys Ala Leu Asp

705                 710                 715                 720

Ser Phe Leu Arg Leu Asn Asp Gly Gln Phe Thr Val Ile Gln Leu Val

                725                 730                 735

Gly Met Leu Arg Gly Ile Ala Ala Gly Met Lys Tyr Leu Ser Glu Met

            740                 745                 750

Asn Tyr Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile Leu Val Asn Ser

        755                 760                 765

Asn Leu Val Cys Lys Val Ser Asp Phe Gly Leu Ser Arg Phe Leu Glu

    770                 775                 780

Asp Asp Pro Ser Asp Pro Thr Tyr Thr Ser Ser Leu Gly Gly Lys Ile

785                 790                 795                 800

Pro Ile Arg Trp Thr Ala Pro Glu Ala Ile Ala Tyr Arg Lys Phe Thr

                805                 810                 815

Ser Ala Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Ile Val Met Trp Glu Val Met

            820                 825                 830

Ser Tyr Gly Glu Arg Pro Tyr Trp Asp Met Ser Asn Gln Asp Val Ile

        835                 840                 845

Asn Ala Val Glu Gln Asp Tyr Arg Leu Pro Pro Pro Met Asp Cys Pro

    850                 855                 860

Thr Ala Leu His Gln Leu Met Leu Asp Cys Trp Val Arg Asp Arg Asn

865                 870                 875                 880

Leu Arg Pro Lys Phe Ser Gln Ile Val Asn Thr Leu Asp Lys Leu Ile

                885                 890                 895

Arg Asn Ala Ala Ser Leu Lys Val Ile Ala Ser Ala Gln Ser Gly Met

            900                 905                 910

Ser Gln Pro Leu Leu Asp Arg Thr Val Pro Asp Tyr Thr Thr Phe Thr

        915                 920                 925

Thr Val Gly Asp Trp Leu Asp Ala Ile Lys Met Gly Arg Tyr Lys Glu

    930                 935                 940

Ser Phe Val Ser Ala Gly Phe Ala Ser Phe Asp Leu Val Ala Gln Met

945                 950                 955                 960

Thr Ala Glu Asp Leu Leu Arg Ile Gly Val Thr Leu Ala Gly His Gln

                965                 970                 975

Lys Lys Ile Leu Ser Ser Ile Gln Asp Met Arg Leu Gln Met Asn Gln

            980                 985                 990

Thr Leu Pro Val Gln Val

        995

<210>3

<211>108

<212>PRT

<213>人

<400>3

Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly

1               5                   10                  15

Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Gly Thr Asn

            20                  25                  30

Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile

        35                  40                  45

Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser

65                  70                  75                  80

Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg

            100                 105

<210>4

<211>118

<212>PRT

<213>人

<400>4

Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1               5                   10                  15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Arg Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

            20                  25                  30

Trp Met His Trp Met Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

        35                  40                  45

Gly Met Ile His Pro Thr Ser His Thr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

    50                  55                  60

Lys Ser Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Gly Ser Ala Val Tyr Phe Cys

                85                  90                  95

Ala Arg Glu Gly Pro Gly Thr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

            100                 105                 110

Thr Leu Thr Val Ser Ser

        115

<210>5

<211>113

<212>PRT

<213>人

<400>5

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1               5                   10                  15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser

            20                  25                  30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

        35                  40                  45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

    50                  55                  60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65                  70                  75                  80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

                85                  90                  95

Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

            100                 105                 110

Arg

<210>6

<211>121

<212>PRT

<213>人

<400>6

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1               5                   10                  15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

            20                  25                  30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

        35                  40                  45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ala Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe

    505                  5                  60

Lys Asp Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Tyr Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Arg Glu Gly Lys Tyr Gly Ser Tyr Tyr Gly Leu Asp Tyr Trp Gly

            100                 105                 110

Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>7

<211>109

<212>PRT

<213>人

<400>7

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Thr Thr Met Ala Ala Ser Pro Gly

1               5                   10                  15

Glu Lys Ile Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Ser Asn

            20                  25                  30

Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Phe Ser Pro Lys Leu Leu

        35                  40                  45

Ile Tyr Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser

    50                  55                  60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Gly Thr Met Glu

657                  0                  75                  80

Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Ser Ile Pro

                85                  90                  95

Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg

            100                 105

<210>8

<211>113

<212>PRT

<213>人

<400>8

Gln Val Gln Val Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1               5                   10                  15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Arg Ala Ser Asp Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

            20                  25                  30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

        35                  40                  45

Gly Asn Val Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

    50                  55                  60

Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Ser Asn Pro Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser

            100                 105                 110

Ser

<210>9

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>9

Trp Arg Arg Asp Val Gln Arg Val

1               5

<210>10

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>10

Arg Arg Asp Val Gln Arg Val Tyr

1               5

<210>11

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>11

Arg Asp Val Gln Arg Val Tyr Val

1               5

<210>12

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>12

Asp Val Gln Arg Val Tyr Val Glu

1               5

<210>13

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>13

Val Gln Arg Val Tyr Val Glu Leu

1               5

<210>14

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>14

Gln Arg Val Tyr Val Glu Leu Lys

1               5

<210>15

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>15

Arg Val Tyr Val Glu Leu Lys Phe

1               5

<210>16

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>16

Val Tyr Val Glu Leu Lys Phe Thr

1               5

<210>17

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>17

Tyr Val Glu Leu Lys Phe Thr Val

1               5

<210>18

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>18

Val Glu Leu Lys Phe Thr Val Arg

1               5

<210>19

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>19

Glu Leu Lys Phe Thr Val Arg Asp

1               5

<210>20

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>20

Trp Arg Arg Asp Val Gln Arg Val Tyr

1               5

<210>21

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>21

Arg Arg Asp Val Gln Arg Val Tyr Val

1               5

<210>22

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>22

Arg Asp Val Gln Arg Val Tyr Val Glu

1               5

<210>23

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>23

Asp Val Gln Arg Val Tyr Val Glu Leu

1               5

<210>24

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>24

Val Gln Arg Val Tyr Val Glu Leu Lys

1               5

<210>25

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>25

Gln Arg Val Tyr Val Glu Leu Lys Phe

1               5

<210>26

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>26

Arg Val Tyr Val Glu Leu Lys Phe Thr

1               5

<210>27

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>27

Val Tyr Val Glu Leu Lys Phe Thr Val

1               5

<210>28

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>28

Tyr Val Glu Leu Lys Phe Thr Val Arg

1               5

<210>29

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>29

Val Glu Leu Lys Phe Thr Val Arg Asp

1               5

<210>30

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>30

Trp Arg Arg Asp Val Gln Arg Val Tyr Val

1               5                   10

<210>31

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>31

Arg Arg Asp Val Gln Arg Val Tyr Val Glu

1               5                   10

<210>32

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>32

Arg Asp Val Gln Arg Val Tyr Val Glu Leu

1               5                   10

<210>33

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>33

Asp Val Gln Arg Val Tyr Val Glu Leu Lys

1               5                   10

<210>34

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>34

Val Gln Arg Val Tyr Val Glu Leu Lys Phe

1510

<210>35

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>35

Gln Arg Val Tyr Val Glu Leu Lys Phe Thr

1510

<210>36

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>36

Arg Val Tyr Val Glu Leu Lys Phe Thr Val

1               5                   10

<210>37

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>37

Val Tyr Val Glu Leu Lys Phe Thr Val Arg

1               5                   10

<210>38

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>38

Tyr Val Glu Leu Lys Phe Thr Val Arg Asp

1               5                   10

<210>39

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>39

Asn Pro Tyr Val Lys Val Asp Thr

1               5

<210>40

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>40

Pro Tyr Val Lys Val Asp Thr Ile

1               5

<210>41

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>41

Tyr Val Lys Val Asp Thr Ile Ala

1               5

<210>42

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>42

Val Lys Val Asp Thr Ile Ala Pro

1               5

<210>43

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>43

Lys Val Asp Thr Ile Ala Pro Asp

1               5

<210>44

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>44

Val Asp Thr Ile Ala Pro Asp Glu

1               5

<210>45

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>45

Asp Thr Ile Ala Pro Asp Glu Ser

1               5

<210>46

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>46

Thr Ile Ala Pro Asp Glu Ser Phe

1               5

<210>47

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>47

Ile Ala Pro Asp Glu Ser Phe Ser

1               5

<210>48

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>48

Ala Pro Asp Glu Ser Phe Ser Arg

1               5

<210>49

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>49

Pro Asp Glu Ser Phe Ser Arg Leu

1               5

<210>50

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>50

Asp Glu Ser Phe Ser Arg Leu Asp

1               5

<210>51

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>51

Glu Ser Phe Ser Arg Leu Asp Ala

1               5

<210>52

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>52

Ser Phe Ser Arg Leu Asp Ala Gly

1               5

<210>53

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>53

Phe Ser Arg Leu Asp Ala Gly Arg

1               5

<210>54

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>54

Ser Arg Leu Asp Ala Gly Arg Val

1               5

<210>55

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>55

Arg Leu Asp Ala Gly Arg Val Asn

1               5

<210>56

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>56

Leu Asp Ala Gly Arg Val Asn Thr

1               5

<210>57

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>57

Asp Ala Gly Arg Val Asn Thr Lys

1               5

<210>58

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>58

Ala Gly Arg Val Asn Thr Lys Val

1               5

<210>59

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>59

Gly Arg Val Asn Thr Lys Val Arg

1               5

<210>60

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>60

Arg Val Asn Thr Lys Val Arg Ser

1               5

<210>61

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>61

Val Asn Thr Lys Val Arg Ser Phe

1               5

<210>62

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>62

Asn Thr Lys Val Arg Ser Phe Gly

1               5

<210>63

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>63

Thr Lys Val Arg Ser Phe Gly Pro

1               5

<210>64

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>64

Lys Val Arg Ser Phe Gly Pro Leu

1               5

<210>65

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>65

Val Arg Ser Phe Gly Pro Leu Ser

1               5

<210>66

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>66

Arg Ser Phe Gly Pro Leu Ser Lys

1               5

<210>67

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>67

Ser Phe Gly Pro Leu Ser Lys Ala

1               5

<210>68

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>68

Phe Gly Pro Leu Ser Lys Ala Gly

1               5

<210>69

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>69

Gly Pro Leu Ser Lys Ala Gly Phe

1               5

<210>70

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>70

Pro Leu Ser Lys Ala Gly Phe Tyr

1               5

<210>71

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>71

Leu Ser Lys Ala Gly Phe Tyr Leu

1               5

<210>72

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>72

Ser Lys Ala Gly Phe Tyr Leu Ala

1               5

<210>73

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>73

Lys Ala Gly Phe Tyr Leu Ala Phe

1               5

<210>74

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>74

Ala Gly Phe Tyr Leu Ala Phe Gln

1               5

<210>75

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>75

Asn Pro Tyr Val Lys Val Asp Thr Ile

1               5

<210>76

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>76

Pro Tyr Val Lys Val Asp Thr Ile Ala

1               5

<210>77

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>77

Tyr Val Lys Val Asp Thr Ile Ala Pro

1               5

<210>78

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>78

Val Lys Val Asp Thr Ile Ala Pro Asp

1               5

<210>79

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>79

Lys Val Asp Thr Ile Ala Pro Asp Glu

1               5

<210>80

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>80

Val Asp Thr Ile Ala Pro Asp Glu Ser

1               5

<210>81

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>81

Asp Thr Ile Ala Pro Asp Glu Ser Phe

1               5

<210>82

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>82

Thr Ile Ala Pro Asp Glu Ser Phe Ser

1               5

<210>83

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>83

Ile Ala Pro Asp Glu Ser Phe Ser Arg

1               5

<210>84

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>84

Ala Pro Asp Glu Ser Phe Ser Arg Leu

1               5

<210>85

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>85

Pro Asp Glu Ser Phe Ser Arg Leu Asp

1               5

<210>86

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>86

Asp Glu Ser Phe Ser Arg Leu Asp Ala

1               5

<210>87

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>87

Glu Ser Phe Ser Arg Leu Asp Ala Gly

1               5

<210>88

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>88

Ser Phe Ser Arg Leu Asp Ala Gly Arg

1               5

<210>89

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>89

Phe Ser Arg Leu Asp Ala Gly Arg Val

1               5

<210>90

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>90

Ser Arg Leu Asp Ala Gly Arg Val Asn

1               5

<210>91

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>91

Arg Leu Asp Ala Gly Arg Val Asn Thr

1               5

<210>92

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>92

Leu Asp Ala Gly Arg Val Asn Thr Lys

1               5

<210>93

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>93

Asp Ala Gly Arg Val Asn Thr Lys Val

1               5

<210>94

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>94

Ala Gly Arg Val Asn Thr Lys Val Arg

1               5

<210>95

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>95

Gly Arg Val Asn Thr Lys Val Arg Ser

1               5

<210>96

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>96

Arg Val Asn Thr Lys Val Arg Ser Phe

1               5

<210>97

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>97

Val Asn Thr Lys Val Arg Ser Phe Gly

1               5

<210>98

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>98

Asn Thr Lys Val Arg Ser Phe Gly Pro

1               5

<210>99

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>99

Thr Lys Val Arg Ser Phe Gly Pro Leu

1               5

<210>100

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>100

Lys Val Arg Ser Phe Gly Pro Leu Ser

1               5

<210>101

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>101

Val Arg Ser Phe Gly Pro Leu Ser Lys

1               5

<210>102

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>102

Arg Ser Phe Gly Pro Leu Ser Lys Ala

1               5

<210>103

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>103

Ser Phe Gly Pro Leu Ser Lys Ala Gly

1               5

<210>104

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>104

Phe Gly Pro Leu Ser Lys Ala Gly Phe

1               5

<210>105

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>105

Gly Pro Leu Ser Lys Ala Gly Phe Tyr

1               5

<210>106

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>106

Pro Leu Ser Lys Ala Gly Phe Tyr Leu

1               5

<210>107

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>107

Leu Ser Lys Ala Gly Phe Tyr Leu Ala

1               5

<210>108

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>108

Ser Lys Ala Gly Phe Tyr Leu Ala Phe

1               5

<210>109

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>109

Lys Ala Gly Phe Tyr Leu Ala Phe Gln

1               5

<210>110

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>110

Asn Pro Tyr Val Lys Val Asp Thr Ile Ala

1               5                   10

<210>111

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>111

Pro Tyr Val Lys Val Asp Thr Ile Ala Pro

1               5                   10

<210>112

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>112

Tyr Val Lys Val Asp Thr Ile Ala Pro Asp

1               5                   10

<210>113

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>113

Val Lys Val Asp Thr Ile Ala Pro Asp Glu

1               5                   10

<210>114

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>114

Lys Val Asp Thr Ile Ala Pro Asp Glu Ser

1               5                   10

<210>115

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>115

Val Asp Thr Ile Ala Pro Asp Glu Ser Phe

1               5                   10

<210>116

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>116

Asp Thr Ile Ala Pro Asp Glu Ser Phe Ser

1               5                   10

<210>117

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>117

Thr Ile Ala Pro Asp Glu Ser Phe Ser Arg

1               5                   10

<210>118

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>118

Ile Ala Pro Asp Glu Ser Phe Ser Arg Leu

1               5                   10

<210>119

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>119

Ala Pro Asp Glu Ser Phe Ser Arg Leu Asp

1               5                   10

<210>120

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>120

Pro Asp Glu Ser Phe Ser Arg Leu Asp Ala

1               5                   10

<210>121

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>121

Asp Glu Ser Phe Ser Arg Leu Asp Ala Gly

1               5                   10

<210>122

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>122

Glu Ser Phe Ser Arg Leu Asp Ala Gly Arg

1               5                   10

<210>123

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>123

Ser Phe Ser Arg Leu Asp Ala Gly Arg Val

1               5                   10

<210>124

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>124

Phe Ser Arg Leu Asp Ala Gly Arg Val Asn

1               5                   10

<210>125

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>125

Ser Arg Leu Asp Ala Gly Arg Val Asn Thr

1               5                   10

<210>126

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>126

Arg Leu Asp Ala Gly Arg Val Asn Thr Lys

1               5                   10

<210>127

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>127

Leu Asp Ala Gly Arg Val Asn Thr Lys Val

1               5                   10

<210>128

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>128

Asp Ala Gly Arg Val Asn Thr Lys Val Arg

1               5                   10

<210>129

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>129

Ala Gly Arg Val Asn Thr Lys Val Arg Ser

1               5                   10

<210>130

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>130

Gly Arg Val Asn Thr Lys Val Arg Ser Phe

1               5                   10

<210>131

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>131

Arg Val Asn Thr Lys Val Arg Ser Phe Gly

1               5                   10

<210>132

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>132

Val Asn Thr Lys Val Arg Ser Phe Gly Pro

1               5                   10

<210>133

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>133

Asn Thr Lys Val Arg Ser Phe Gly Pro Leu

1               5                   10

<210>134

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>134

Thr Lys Val Arg Ser Phe Gly Pro Leu Ser

1               5                   10

<210>135

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>135

Lys Val Arg Ser Phe Gly Pro Leu Ser Lys

1               5                   10

<210>136

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>136

Val Arg Ser Phe Gly Pro Leu Ser Lys Ala

1               5                   10

<210>137

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>137

Arg Ser Phe Gly Pro Leu Ser Lys Ala Gly

1               5                   10

<210>138

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>138

Ser Phe Gly Pro Leu Ser Lys Ala Gly Phe

1               5                   10

<210>139

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>139

Phe Gly Pro Leu Ser Lys Ala Gly Phe Tyr

1               5                   10

<210>140

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>140

Gly Pro Leu Ser Lys Ala Gly Phe Tyr Leu

1               5                   10

<210>141

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>141

Pro Leu Ser Lys Ala Gly Phe Tyr Leu Ala

1               5                   10

<210>142

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>142

Leu Ser Lys Ala Gly Phe Tyr Leu Ala Phe

1               5                   10

<210>143

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>143

Ser Lys Ala Gly Phe Tyr Leu Ala Phe Gln

1               5                   10

<210>144

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>144

Asn Ala Val Glu Val Ser Val Pro

1               5

<210>145

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>145

Ala Val Glu Val Ser Val Pro Leu

1               5

<210>146

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>146

Val Glu Val Ser Val Pro Leu Lys

1               5

<210>147

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>147

Glu Val Ser Val Pro Leu Lys Leu

1               5

<210>148

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>148

Val Ser Val Pro Leu Lys Leu Tyr

1               5

<210>149

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>149

Ser Val Pro Leu Lys Leu Tyr Cys

1               5

<210>150

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>150

Asn Ala Val Glu Val Ser Val Pro Leu

1               5

<210>151

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>151

Ala Val Glu Val Ser Val Pro Leu Lys

1               5

<210>152

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>152

Val Glu Val Ser Val Pro Leu Lys Leu

1               5

<210>153

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>153

Glu Val Ser Val Pro Leu Lys Leu Tyr

1               5

<210>154

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>154

Val Ser Val Pro Leu Lys Leu Tyr Cys

1               5

<210>155

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>155

Asn Ala Val Glu Val Ser Val Pro Leu Lys

1               5                   10

<210>156

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>156

Ala Val Glu Val Ser Val Pro Leu Lys Leu

1               5                   10

<210>157

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>157

Val Glu Val Ser Val Pro Leu Lys Leu Tyr

1               5                   10

<210>158

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>158

Glu Val Ser Val Pro Leu Lys Leu Tyr Cys

1               5                   10

<210>159

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>159

Gly His Glu Pro Ala Ala Lys Glu

1               5

<210>160

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>160

His Glu Pro Ala Ala Lys Glu Ser

1               5

<210>161

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>161

Glu Pro Ala Ala Lys Glu Ser Gln

1               5

<210>162

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>162

Pro Ala Ala Lys Glu Ser Gln Cys

1               5

<210>163

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>163

Ala Ala Lys Glu Ser Gln Cys Arg

1               5

<210>164

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>164

Ala Lys Glu Ser Gln Cys Arg Pro

1               5

<210>165

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>165

Lys Glu Ser Gln Cys Arg Pro Cys

1               5

<210>166

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>166

Glu Ser Gln Cys Arg Pro Cys Pro

1               5

<210>167

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>167

Ser Gln Cys Arg Pro Cys Pro Pro

1               5

<210>168

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>168

Gln Cys Arg Pro Cys Pro Pro Gly

1               5

<210>169

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>169

Cys Arg Pro Cys Pro Pro Gly Ser

1               5

<210>170

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>170

Arg Pro Cys Pro Pro Gly Ser Tyr

1               5

<210>171

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>171

Pro Cys Pro Pro Gly Ser Tyr Lys

1               5

<210>172

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>172

Cys Pro Pro Gly Ser Tyr Lys Ala

1               5

<210>173

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>173

Pro Pro Gly Ser Tyr Lys Ala Lys

1               5

<210>174

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>174

Pro Gly Ser Tyr Lys Ala Lys Gln

1               5

<210>175

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>175

Gly Ser Tyr Lys Ala Lys Gln Gly

1               5

<210>176

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>176

Ser Tyr Lys Ala Lys Gln Gly Glu

1               5

<210>177

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>177

Gly His Glu Pro Ala Ala Lys Glu Ser

1               5

<210>178

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>178

His Glu Pro Ala Ala Lys Glu Ser Gln

1               5

<210>179

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>179

Glu Pro Ala Ala Lys Glu Ser Gln Cys

1               5

<210>180

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>180

Pro Ala Ala Lys Glu Ser Gln Cys Arg

1               5

<210>181

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>181

Ala Ala Lys Glu Ser Gln Cys Arg Pro

1               5

<210>182

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>182

Ala Lys Glu Ser Gln Cys Arg Pro Cys

1               5

<210>183

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>183

Lys Glu Ser Gln Cys Arg Pro Cys Pro

1               5

<210>184

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>184

Glu Ser Gln Cys Arg Pro Cys Pro Pro

1               5

<210>185

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>185

Ser Gln Cys Arg Pro Cys Pro Pro Gly

1               5

<210>186

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>186

Gln Cys Arg Pro Cys Pro Pro Gly Ser

1               5

<210>187

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>187

Cys Arg Pro Cys Pro Pro Gly Ser Tyr

1               5

<210>188

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>188

Arg Pro Cys Pro Pro Gly Ser Tyr Lys

1               5

<210>189

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>189

Pro Cys Pro Pro Gly Ser Tyr Lys Ala

1               5

<210>190

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>190

Cys Pro Pro Gly Ser Tyr Lys Ala Lys

1               5

<210>191

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>191

Pro Pro Gly Ser Tyr Lys Ala Lys Gln

1               5

<210>192

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>192

Pro Gly Ser Tyr Lys Ala Lys Gln Gly

1               5

<210>193

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>193

Gly Ser Tyr Lys Ala Lys Gln Gly Glu

1               5

<210>194

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>194

Gly His Glu Pro Ala Ala Lys Glu Ser Gln

1               5                   10

<210>195

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>195

His Glu Pro Ala Ala Lys Glu Ser Gln Cys

1               5                   10

<210>196

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>196

Glu Pro Ala Ala Lys Glu Ser Gln Cys Arg

1               5                   10

<210>197

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>197

Pro Ala Ala Lys Glu Ser Gln Cys Arg Pro

1               5                   10

<210>198

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>198

Ala Ala Lys Glu Ser Gln Cys Arg Pro Cys

1               5                   10

<210>199

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>199

Ala Lys Glu Ser Gln Cys Arg Pro Cys Pro

1               5                   10

<210>200

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>200

Lys Glu Ser Gln Cys Arg Pro Cys Pro Pro

1               5                   10

<210>201

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>201

Glu Ser Gln Cys Arg Pro Cys Pro Pro Gly

1               5                   10

<210>202

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>202

Ser Gln Cys Arg Pro Cys Pro Pro Gly Ser

1               5                   10

<210>203

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>203

Gln Cys Arg Pro Cys Pro Pro Gly Ser Tyr

1               5                   10

<210>204

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>204

Cys Arg Pro Cys Pro Pro Gly Ser Tyr Lys

1               5                   10

<210>205

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>205

Arg Pro Cys Pro Pro Gly Ser Tyr Lys Ala

1               5                   10

<210>206

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>206

Pro Cys Pro Pro Gly Ser Tyr Lys Ala Lys

1               5                   10

<210>207

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>207

Cys Pro Pro Gly Ser Tyr Lys Ala Lys Gln

1               5                   10

<210>208

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>208

Pro Pro Gly Ser Tyr Lys Ala Lys Gln Gly

1               5                   10

<210>209

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>209

Pro Gly Ser Tyr Lys Ala Lys Gln Gly Glu

1               5                   10

<210>210

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>210

Pro Ala Ala Ser Ile Cys Thr Cys

1               5

<210>211

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>211

Ala Ala Ser I1e Cys Thr Cys His

1               5

<210>212

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>212

Ala Ser Ile Cys Thr Cys His Asn

1               5

<210>213

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>213

Ser Ile Cys Thr Cys His Asn Asn

1               5

<210>214

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>214

Ile Cys Thr Cys His Asn Asn Phe

1               5

<210>215

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>215

Cys Thr Cys His Asn Asn Phe Tyr

1               5

<210>216

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>216

Thr Cys His Asn Asn Phe Tyr Arg

1               5

<210>217

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>217

Cys His Asn Asn Phe Tyr Arg Ala

1               5

<210>218

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>218

His Asn Asn Phe Tyr Arg Ala Asp

1               5

<210>219

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>219

Asn Asn Phe Tyr Arg Ala Asp Ser

1               5

<210>220

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>220

Asn Phe Tyr Arg Ala Asp Ser Asp

1               5

<210>221

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>221

Phe Tyr Arg Ala Asp Ser Asp Ser

1               5

<210>222

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>222

Tyr Arg Ala Asp Ser Asp Ser Ala

1               5

<210>223

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>223

Arg Ala Asp Ser Asp Ser Ala Asp

1               5

<210>224

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>224

Ala Asp Ser Asp Ser Ala Asp Ser

1               5

<210>225

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>225

Asp Ser Asp Ser Ala Asp Ser Ala

1               5

<210>226

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>226

Ser Asp Ser Ala Asp Ser Ala Cys

1               5

<210>227

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>227

Pro Ala Ala Ser Ile Cys Thr Cys His

1               5

<210>228

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>228

Ala Ala Ser Ile Cys Thr Cys His Asn

1               5

<210>229

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>229

Ala Ser Ile Cys Thr Cys His Asn Asn

1               5

<210>230

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>230

Ser Ile Cys Thr Cys His Asn Asn Phe

1               5

<210>231

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>231

Ile Cys Thr Cys His Asn Asn Phe Tyr

1               5

<210>232

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>232

Cys Thr Cys His Asn Asn Phe Tyr Arg

1               5

<210>233

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>233

Thr Cys His Asn Asn Phe Tyr Arg Ala

1               5

<210>234

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>234

Cys His Asn Asn Phe Tyr Arg Ala Asp

1               5

<210>235

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>235

His Asn Asn Phe Tyr Arg Ala Asp Ser

1               5

<210>236

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>236

Asn Asn Phe Tyr Arg Ala Asp Ser Asp

1               5

<210>237

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>237

Asn Phe Tyr Arg Ala Asp Ser Asp Ser

1               5

<210>238

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>238

Phe Tyr Arg Ala Asp Ser Asp Ser Ala

1               5

<210>239

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>239

Tyr Arg Ala Asp Ser Asp Ser Ala Asp

1               5

<210>240

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>240

Arg Ala Asp Ser Asp Ser Ala Asp Ser

1               5

<210>241

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>241

Ala Asp Ser Asp Ser Ala Asp Ser Ala

1               5

<210>242

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>242

Asp Ser Asp Ser Ala Asp Ser Ala Cys

1               5

<210>243

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>243

Pro Ala Ala Ser Ile Cys Thr Cys His Asn

1               5                   10

<210>244

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>244

Ala Ala Ser Ile Cys Thr Cys His Asn Asn

1               5                   10

<210>245

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>245

Ala Ser Ile Cys Thr Cys His Asn Asn Phe

1               5                   10

<210>246

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>246

Ser Ile Cys Thr Cys His Asn Asn Phe Tyr

1               5                   10

<210>247

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>247

Ile Cys Thr Cys His Asn Asn Phe Tyr Arg

1               5                   10

<210>248

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>248

Cys Thr Cys His Asn Asn Phe Tyr Arg Ala

1               5                   10

<210>249

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>249

Thr Cys His Asn Asn Phe Tyr Arg Ala Asp

1               5                   10

<210>250

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>250

Cys His Asn Asn Phe Tyr Arg Ala Asp Ser

1               5                   10

<210>251

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>251

His Asn Asn Phe Tyr Arg Ala Asp Ser Asp

1               5                   10

<210>252

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>252

Asn Asn Phe Tyr Arg Ala Asp Ser Asp Ser

1               5                   10

<210>253

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>253

Asn Phe Tyr Arg Ala Asp Ser Asp Ser Ala

1               5                   10

<210>254

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>254

Phe Tyr Arg Ala Asp Ser Asp Ser Ala Asp

1               5                   10

<210>255

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>255

Tyr Arg Ala Asp Ser Asp Ser Ala Asp Ser

1               5                   10

<210>256

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>256

Arg Ala Asp Ser Asp Ser Ala Asp Ser Ala

1               5                   10

<210>257

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>257

Ala Asp Ser Asp Ser Ala Asp Ser Ala Cys

1               5                   10

<210>258

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>258

Pro Arg Asp Leu Gly Gly Arg Asp

1               5

<210>259

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>259

Arg Asp Leu Gly Gly Arg Asp Asp

1               5

<210>260

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>260

Asp Leu Gly Gly Arg Asp Asp Leu

1               5

<210>261

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>261

Leu Gly Gly Arg Asp Asp Leu Leu

1               5

<210>262

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>262

Gly Gly Arg Asp Asp Leu Leu Tyr

1               5

<210>263

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>263

Gly Arg Asp Asp Leu Leu Tyr Asn

1               5

<210>264

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>264

Arg Asp Asp Leu Leu Tyr Asn Val

1               5

<210>265

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>265

Asp Asp Leu Leu Tyr Asn Val Ile

1               5

<210>266

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>266

Asp Leu Leu Tyr Asn Val Ile Cys

1               5

<210>267

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>267

Leu Leu Tyr Asn Val Ile Cys Lys

1               5

<210>268

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>268

Leu Tyr Asn Val Ile Cys Lys Lys

1               5

<210>269

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>269

Tyr Asn Val Ile Cys Lys Lys Cys

1               5

<210>270

<21l>8

<212>PRT

<213>人

<400>270

Asn Val Ile Cys Lys Lys Cys His

1               5

<210>271

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>271

Val Ile Cys Lys Lys Cys His Gly

1               5

<210>272

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>272

Ile Cys Lys Lys Cys His Gly Ala

1               5

<210>273

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>273

Pro Arg Asp Leu Gly Gly Arg Asp Asp

1               5

<210>274

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>274

Arg Asp Leu Gly Gly Arg Asp Asp Leu

1               5

<210>275

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>275

Asp Leu Gly Gly Arg Asp Asp Leu Leu

1               5

<210>276

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>276

Leu Gly Gly Arg Asp Asp Leu Leu Tyr

1               5

<210>277

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>277

Gly Gly Arg Asp Asp Leu Leu Tyr Asn

1               5

<210>278

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>278

Gly Arg Asp Asp Leu Leu Tyr Asn Val

1               5

<210>279

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>279

Arg Asp Asp Leu Leu Tyr Asn Val Ile

1               5

<210>280

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>280

Asp Asp Leu Leu Tyr Asn Val Ile Cys

1               5

<210>281

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>281

Asp Leu Leu Tyr Asn Val Ile Cys Lys

1               5

<210>282

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>282

Leu Leu Tyr Asn Val Ile Cys Lys Lys

1               5

<210>283

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>283

Leu Tyr Asn Val Ile Cys Lys Lys Cys

1               5

<210>284

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>284

Tyr Asn Val Ile Cys Lys Lys Cys His

1               5

<210>285

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>285

Asn Val Ile Cys Lys Lys Cys His Gly

1               5

<210>286

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>286

Val Ile Cys Lys Lys Cys His Gly Ala

1               5

<210>287

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>287

Pro Arg Asp Leu Gly Gly Arg Asp Asp Leu

1               5                   10

<210>288

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>288

Arg Asp Leu Gly Gly Arg Asp Asp Leu Leu

1               5                   10

<210>289

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>289

Asp Leu Gly Gly Arg Asp Asp Leu Leu Tyr

1               5                   10

<210>290

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>290

Leu Gly Gly Arg Asp Asp Leu Leu Tyr Asn

1               5                   10

<210>291

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>291

Gly Gly Arg Asp Asp Leu Leu Tyr Asn Val

1               5                   10

<210>292

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>292

Gly Arg Asp Asp Leu Leu Tyr Asn Val Ile

1               5                   10

<210>293

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>293

Arg Asp Asp Leu Leu Tyr Asn Val Ile Cys

1               5                   10

<210>294

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>294

Asp Asp Leu Leu Tyr Asn Val Ile Cys Lys

1               5                   10

<210>295

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>295

Asp Leu Leu Tyr Asn Val Ile Cys Lys Lys

1               5                   10

<210>296

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>296

Leu Leu Tyr Asn Val Ile Cys Lys Lys Cys

1               5                   10

<210>297

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>297

Leu Tyr Asn Val Ile Cys Lys Lys Cys His

1               5                   10

<210>298

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>298

Tyr Asn Val Ile Cys Lys Lys Cys His Gly

1               5                   10

<210>299

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>299

Asn Val Ile Cys Lys Lys Cys His Gly Ala

1               5                   10

<210>300

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>300

Pro Leu Pro Pro Arg Tyr Ala Ala

1               5

<210>301

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>301

Leu Pro Pro Arg Tyr Ala Ala Val

1               5

<210>302

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>302

Pro Pro Arg Tyr Ala Ala Val Asn

1               5

<210>303

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>303

Pro Arg Tyr Ala Ala Val AsnIle

1               5

<210>304

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>304

Arg Tyr Ala Ala Val Asn Ile Thr

1               5

<210>305

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>305

Tyr Ala Ala Val Asn Ile Thr Thr

1               5

<210>306

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>306

Ala Ala Val Asn Ile Thr Thr Asn

1               5

<210>307

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>307

Ala Val Asn Ile Thr Thr Asn Gln

1               5

<210>308

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>308

Val Asn Ile Thr Thr Asn Gln Ala

1               5

<210>309

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>309

Asn Ile Thr Thr Asn Gln Ala Ala

1               5

<210>310

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>310

Ile Thr Thr Asn Gln Ala Ala Pro

1               5

<210>311

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>311

Thr Thr Asn Gln Ala Ala Pro Ser

1               5

<210>312

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>312

Thr Asn Gln Ala Ala Pro Ser Glu

1               5

<210>313

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>313

Asn Gln Ala Ala Pro Ser Glu Val

1               5

<210>314

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>314

Gln Ala Ala Pro Ser Glu Val Pro

1               5

<210>315

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>315

Ala Ala Pro Ser Glu Val Pro Thr

1               5

<210>316

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>316

Ala Pro Ser Glu Val Pro Thr Leu

1               5

<210>317

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>317

Pro Ser Glu Val Pro Thr Leu Arg

1               5

<210>318

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>318

Ser Glu Val Pro Thr Leu Arg Leu

1               5

<210>319

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>319

Glu Val Pro Thr Leu Arg Leu His

1               5

<210>320

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>320

Val Pro Thr Leu Arg Leu His Ser

1               5

<210>321

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>321

Pro Thr Leu Arg Leu His Ser Ser

1               5

<210>322

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>322

Thr Leu Arg Leu His Ser Ser Ser

1               5

<210>323

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>323

Leu Arg Leu His Ser Ser Ser Gly

1               5

<210>324

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>324

Arg Leu His Ser Ser Ser Gly Ser

1               5

<210>325

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>325

Leu His Ser Ser Ser Gly Ser Ser

1               5

<210>326

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>326

His Ser Ser Ser Gly Ser Ser Leu

1               5

<210>327

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>327

Pro Leu Pro Pro Arg Tyr Ala Ala Val

1               5

<210>328

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>328

Leu Pro Pro Arg Tyr Ala Ala Val Asn

1               5

<210>329

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>329

Pro Pro Arg Tyr Ala Ala Val Asn Ile

1               5

<210>330

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>330

Pro Arg Tyr Ala Ala Val Asn Ile Thr

1               5

<210>331

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>331

Arg Tyr Ala Ala Val Asn Ile Thr Thr

1               5

<210>332

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>332

Tyr Ala Ala Val Asn Ile Thr Thr Asn

1               5

<210>333

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>333

Ala Ala Val Asn Ile Thr Thr Asn Gln

1               5

<210>334

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>334

Ala Val Asn Ile Thr Thr Asn Gln Ala

1               5

<210>335

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>335

Val Asn Ile Thr Thr Asn Gln Ala Ala

1               5

<210>336

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>336

Asn Ile Thr Thr Asn Gln Ala Ala Pro

1               5

<210>337

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>337

Ile Thr Thr Asn Gln Ala Ala Pro Ser

1               5

<210>338

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>338

Thr Thr Asn Gln Ala Ala Pro Ser Glu

1               5

<210>339

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>339

Thr Asn Gln Ala Ala Pro Ser Glu Val

1               5

<210>340

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>340

Asn Gln Ala Ala Pro Ser Glu Val Pro

1               5

<210>341

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>341

Gln Ala Ala Pro Ser Glu Val Pro Thr

1               5

<210>342

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>342

Ala Ala Pro Ser Glu Val Pro Thr Leu

1               5

<210>343

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>343

Ala Pro Ser Glu Val Pro Thr Leu Arg

1               5

<210>344

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>344

Pro Ser Glu Val Pro Thr Leu Arg Leu

1               5

<210>345

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>345

Ser Glu Val Pro Thr Leu Arg Leu His

1               5

<210>346

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>346

Glu Val Pro Thr Leu Arg Leu His Ser

1               5

<210>347

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>347

Val Pro Thr Leu Arg Leu His Ser Ser

1               5

<210>348

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>348

Pro Thr Leu Arg Leu His Ser Ser Ser

1               5

<210>349

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>349

Thr Leu Arg Leu His Ser Ser Ser Gly

1               5

<210>350

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>350

Leu Arg Leu His Ser Ser Ser Gly Ser

1               5

<210>351

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>351

Arg Leu His Ser Ser Ser Gly Ser Ser

1               5

<210>352

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>352

Leu His Ser Ser Ser Gly Ser Ser Leu

1               5

<210>353

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>353

Pro Leu Pro Pro Arg Tyr Ala Ala Val Asn

1               5                   10

<210>354

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>354

Leu Pro Pro Arg Tyr Ala Ala Val Asn Ile

1               5                   10

<210>355

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>355

Pro Pro Arg Tyr Ala Ala Val Asn Ile Thr

1               5                   10

<210>356

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>356

Pro Arg Tyr Ala Ala Val Asn Ile Thr Thr

1               5                   10

<210>357

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>357

Arg Tyr Ala Ala Val Asn Ile Thr Thr Asn

1               5                   10

<210>358

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>358

Tyr Ala Ala Val Asn Ile Thr Thr Asn Gln

1               5                   10

<210>359

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>359

Ala Ala Val Asn Ile Thr Thr Asn Gln Ala

1               5                   10

<210>360

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>360

Ala Val Asn Ile Thr Thr Asn Gln Ala Ala

1               5                   10

<210>361

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>361

Val Asn Ile Thr Thr Asn Gln Ala Ala Pro

1               5                   10

<210>362

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>362

Asn Ile Thr Thr Asn Gln Ala Ala Pro Ser

1               5                   10

<210>363

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>363

Ile Thr Thr Asn Gln Ala Ala Pro Ser Glu

1               5                   10

<210>364

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>364

Thr Thr Asn Gln Ala Ala Pro Ser Glu Val

1               5                   10

<210>365

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>365

Thr Asn Gln Ala Ala Pro Ser Glu Val Pro

1               5                   10

<210>366

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>366

Asn Gln Ala Ala Pro Ser Glu Val Pro Thr

1               5                   10

<210>367

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>367

Gln Ala Ala Pro Ser Glu Val Pro Thr Leu

1               5                   10

<210>368

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>368

Ala Ala Pro Ser Glu Val Pro Thr Leu Arg

1               5                   10

<210>369

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>369

Ala Pro Ser Glu Val Pro Thr Leu Arg Leu

1               5                   10

<210>370

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>370

Pro Ser Glu Val Pro Thr Leu Arg Leu His

1               5                   10

<210>371

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>371

Ser Glu Val Pro Thr Leu Arg Leu His Ser

1               5                   10

<210>372

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>372

Glu Val Pro Thr Leu Arg Leu His Ser Ser

1               5                   10

<210>373

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>373

Val Pro Thr Leu Arg Leu His Ser Ser Ser

1               5                   10

<210>374

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>374

Pro Thr Leu Arg Leu His Ser Ser Ser Gly

1               5                   10

<210>375

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>375

Thr Leu Arg Leu His Ser Ser Ser Gly Ser

1               5                   10

<210>376

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>376

Leu Arg Leu His Ser Ser Ser Gly Ser Ser

1               5                   10

<210>377

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>377

Arg Leu His Ser Ser Ser Gly Ser Ser Leu

1               5                   10

<210>378

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>378

Gln Leu Asp Gly Leu Arg Pro Asp

1               5

<210>379

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>379

Leu Asp Gly Leu Arg Pro Asp Ala

1               5

<210>380

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>380

Asp Gly Leu Arg Pro Asp Ala Arg

1               5

<210>381

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>381

Gly Leu Arg Pro Asp Ala Arg Tyr

1               5

<210>382

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>382

Leu Arg Pro Asp Ala Arg Tyr Val

1               5

<210>383

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>383

Arg Pro Asp Ala Arg Tyr Val Val

1               5

<210>384

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>384

Pro Asp Ala Arg Tyr Val Val Gln

1               5

<210>385

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>385

Asp Ala Arg Tyr Val Val Gln Val

1               5

<210>386

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>386

Ala Arg Tyr Val Val Gln Val Arg

1               5

<210>387

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>387

Arg Tyr Val Val Gln Val Arg Ala

1               5

<210>388

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>388

Tyr Val Val Gln Val Arg Ala Arg

1               5

<210>389

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>389

Val Val Gln Val Arg A1a Arg Thr

1               5

<210>390

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>390

Val Gln Val Arg Ala Arg Thr Val

1               5

<210>391

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>391

Gln Val Arg Ala Arg Thr Val Ala

1               5

<210>392

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>392

Val Arg Ala Arg Thr Val Ala Gly

1               5

<210>393

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>393

Gln Leu Asp Gly Leu Arg Pro Asp Ala

1               5

<210>394

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>394

Leu Asp Gly Leu Arg Pro Asp Ala Arg

1               5

<210>395

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>395

Asp Gly Leu Arg Pro Asp Ala Arg Tyr

1               5

<210>396

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>396

Gly Leu Arg Pro Asp Ala Arg Tyr Val

1               5

<210>397

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>397

Leu Arg Pro Asp Ala Arg Tyr Val Val

1               5

<210>398

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>398

Arg Pro Asp Ala Arg Tyr Val Val Gln

1               5

<210>399

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>399

Pro Asp Ala Arg Tyr Val Val Gln Val

1               5

<210>400

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>400

Asp Ala Arg Tyr Val Val Gln Val Arg

1               5

<210>401

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>401

Ala Arg Tyr Val Val Gln Val Arg Ala

1               5

<210>402

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>402

Arg Tyr Val Val Gln Val Arg Ala Arg

1               5

<210>403

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>403

Tyr Val Val Gln Val Arg Ala Arg Thr

1               5

<210>404

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>404

Val Val Gln Val Arg Ala Arg Thr Val

1               5

<210>405

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>405

Val Gln Val Arg Ala Arg Thr Val Ala

1               5

<210>406

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>406

Gln Val Arg Ala Arg Thr Val Ala Gly

1               5

<210>407

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>407

Gln Leu Asp Gly Leu Arg Pro Asp Ala Arg

1               5                   10

<210>408

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>408

Leu Asp Gly Leu Arg Pro Asp Ala Arg Tyr

1               5                   10

<210>409

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>409

Asp Gly Leu Arg Pro Asp Ala Arg Tyr Val

1               5                   10

<210>410

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>410

Gly Leu Arg Pro Asp Ala Arg Tyr Val Val

1               5                   10

<210>411

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>411

Leu Arg Pro Asp Ala Arg Tyr Val Val Gln

1               5                   10

<210>412

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>412

Arg Pro Asp Ala Arg Tyr Val Val Gln Val

1               5                   10

<210>413

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>413

Pro Asp Ala Arg Tyr Val Val Gln Val Arg

1               5                   10

<210>414

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>414

Asp Ala Arg Tyr Val Val Gln Val Arg Ala

1               5                   10

<210>415

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>415

Ala Arg Tyr Val Val Gln Val Arg Ala Arg

1               5                   10

<210>416

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>416

Arg Tyr Val Val Gln Val Arg Ala Arg Thr

1               5                   10

<210>417

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>417

Tyr Val Val Gln Val Arg Ala Arg Thr Val

1               5                   10

<210>418

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>418

Val Val Gln Val Arg Ala Arg Thr Val Ala

1               5                   10

<210>419

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>419

Val Gln Val Arg Ala Arg Thr Val Ala Gly

1               5                   10

<210>420

<211>52

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的引物

<400>420

tcgtatacat ttcttacatc tatgcgctgg aagagaccct catggacaca aa    52

<210>421

<211>108

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的引物

<400>421

gggacaagtt tgtacaaaaa agcaggctac gaaggagata tacatatgaa attcttagtc  60

aacgttgccc ttgtttttat ggtcgtatac atttcttaca tctatgcg              108

<210>422

<211>54

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的引物

<400>422

cgggtcgtcg aggtcctcgt cgaagggcct cgtgtagtgg tagtggtagt gcct          54

<210>423

<211>61

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的引物

<400>423

cctcgtgtag tggtagtggt agtgcctcga atttgggtcg aaagaacatg tttcaccagg    60

g                                                                    61

Claims (44)

1.一种拮抗剂抗体，其以10^-6M或低于10^-6M的亲和力(K_D)结合EphB3的细胞外结构域，并且与抗体XPA.04.017、XHA.05.172、XHA.05.849、XPA.04.031或XPA.04.019中的任何一种竞争结合超过75％的EphB3。

2.权利要求1的抗体，其与抗体XPA.04.017、XHA.05.172、XHA.05.849、XPA.04.031或XPA.04.019中的任何一种结合相同的EphB3表位。

3.一种拮抗剂抗体，其包含抗体XPA.04.017、XHA.05.172、XHA.05.849、XPA.04.031或XPA.04.019中任何一种的1、2、3、4、5或6个CDRs。

4.权利要求1-3中任一项的抗体，其中所述抗体是嵌合抗体、人源化抗体、工程化人抗体、人抗体、单链抗体或抗体片段。

5.前述权利要求中任一项的抗体，其中CDR内的至少一个氨基酸由另一种抗EphB3抗体的相应CDR的相应残基置换。

6.前述权利要求中任一项的抗体，其中CDR内的1个或2个氨基酸已进行修饰。

7.前述权利要求中任一项的抗体，其在可变轻或重链区域上保留与抗体XPA.04.017、XHA.05.172、XHA.05.849、XPA.04.031或XPA.04.019至少60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％的同一性。

8.前述权利要求中任一项的抗体，其包含人抗体序列的恒定区及人抗体序列的一个或多个重和轻链可变构架区。

9.权利要求8的抗体，其中所述人抗体序列是个体人序列、人共有序列、个体人胚系序列或人共有胚系序列。

10.前述权利要求中任一项的抗体，其中所述重链恒定区是修饰或未修饰的IgG、IgM、IgA、IgD、IgE，其片段或其组合。

11.前述权利要求中任一项的抗体，其与EphB3具有10^-7、10^-8、10^-9M或更低的结合亲和力。

12.前述权利要求中任一项的抗体，其在CDRs中包含保守置换。

13.前述权利要求中任一项的抗体，其包含在低和中等风险残基中的保守或非保守改变。

14.前述权利要求中任一项的抗体，其中轻链恒定区是修饰或未修饰的λ轻链恒定区、κ轻链恒定区、其片段或其组合

15.前述权利要求中任一项的抗体，其抑制EphB3磷酸化。

16.前述权利要求中任一项的抗体，其抑制EphB3二聚化。

17.前述权利要求中任一项的抗体，其抑制EphB3配体诱导的受体活化。

18.前述权利要求中任一项的抗体，其抑制EphB3信号传导。

19.前述权利要求中任一项的抗体，其抑制ephrinB2与EphB3的结合。

20.前述权利要求中任一项的抗体，其抑制ephrinB1与EphB3的结合。

21.前述权利要求中任一项的抗体，其抑制ephrinB3与EphB3的结合。

22.权利要求1-21中任一项的抗体，其抑制肠细胞的增殖。

23.权利要求1-21中任一项的抗体，其抑制血管细胞的增殖。

24.权利要求1-21中任一项的抗体，其促进神经元细胞的增殖。

25.前述权利要求中任一项的抗体，其与另一诊断或治疗剂缀合。

26.一种筛选用于治疗EphB3相关疾病或病症的针对EphB3蛋白质细胞外结构域的拮抗剂抗体的方法，其包括下述步骤：

使包含EphB3的ECD的多肽与候选抗体接触，所述候选抗体包含抗体XPA.04.017、XPA.04.031或XPA.04.019的至少1、2、3、4、5或6个CDRs；

检测所述候选抗体与所述多肽的结合亲和力，和

如果检测出至少10^-6M的结合亲和力，那么鉴定所述候选抗体为在治疗EphB3相关疾病或病症中有用的抗体。

25.一种系统地改变拮抗剂抗体且筛选用于治疗EphB3相关疾病或病症的、针对EphB3蛋白质细胞外结构域的拮抗剂抗体的方法，所述方法包括下述步骤：

制备在抗体XPA.04.017、XHA.05.172、XHA.05.849、XPA.04.031或XPA.04.019的CDRs内包含1个或2个氨基酸的修饰的候选抗体，

使包含EphB3的ECD的多肽与所述候选抗体接触，

检测所述候选抗体与所述多肽的结合亲和力，和

如果检测出至少10^-6M的结合亲和力，那么鉴定所述候选抗体为在治疗EphB3相关疾病或病症中有用的抗体。

26.一种筛选用于治疗EphB3相关疾病或病症的针对EphB3蛋白质细胞外结构域的拮抗剂抗体的方法，其包括下述步骤：

使细胞与候选抗体接触，所述候选抗体包含抗体XPA.04.017、XHA.05.172、XHA.05.849、XPA.04.031或XPA.04.019的至少1、2、3、4、5或6个CDRs，或所述抗体在一个或多个CDRs内包含1个或2个氨基酸的修饰；

检测所述细胞的增殖或存活；

如果检测出细胞增殖或存活上的减少或增加，那么鉴定所述候选抗体为在治疗EphB3相关疾病或病症中有用的抗体。

27.一种治疗患有腹腔疾病的受试者的方法，其包括以治疗有效量施用权利要求1-25中任一项的抗体的步骤。

28.一种治疗患有血管生成性疾病的受试者的方法，其包括以治疗有效量施用权利要求1-25中任一项的抗体的步骤。

29.一种治疗患有神经元损伤的受试者的方法，其包括以治疗有效量施用权利要求1-25中任一项的抗体的步骤。

30.一种治疗患有神经变性疾病的受试者的方法，其包括以治疗有效量施用权利要求1-25中任一项的抗体的步骤。

31.一种靶向表达EphB3的细胞的方法，其包括施用与另一治疗剂缀合的前述权利要求中任一项的抗体的步骤。

32.权利要求27-31中任一项的方法，其中所述受试者是哺乳动物。

33.权利要求32的方法，其中所述受试者是人。

34.一种分离的核酸分子，其包含编码权利要求1-23中任一项的抗体重链或轻链的核苷酸序列。

35.一种表达载体，其包含与调节控制序列可操作地连接的权利要求34的核酸分子。

36.一种宿主细胞，其包含权利要求35的载体或权利要求48的核酸分子。

37.一种使用权利要求36的宿主细胞生产抗体的方法，其包括在合适的条件下培养权利要求36的宿主细胞，和回收所述抗体。

38.一种抗体，其通过权利要求37的方法生产。

39.权利要求1-23或38中任一项的抗体，其纯化至至少95重量％同质。

40.一种药物组合物，其包含权利要求39的抗体和药学上可接受的载体。

41.一种包含前述权利要求中任一项的抗体的试剂盒，该试剂盒包含包装在容器中的治疗有效量的本发明抗体，所述试剂盒任选包含第二治疗剂，且进一步包含与容器附着或与容器包装在一起的标签，所述标签描述所述容器的内容物和提供关于使用所述容器的内容物治疗EphB3相关疾病或病症的适应症和/或说明书。

42.权利要求41的试剂盒，其中所述容器是小瓶或瓶或预装注射器。

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