CN101611058B - Prlr特异性抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了PRLR特异性抗体和包含这种抗体的药物组合物、包含药物组合物的试剂盒以及预防和治疗癌症的方法。

Description

PRLR特异性抗体及其用途
相关申请的交叉参考
本申请要求2007年6月26日提交的美国临时专利申请号60/946,360和2006年8月18日提交的美国临时专利申请号60/838,648的优先权。
技术领域
本发明涉及通过给予PRLR特异性抗体来预防和治疗癌症的方法。
发明背景
在美国，癌症是第二大致死原因。虽然“癌症”用于描述多种不同类型的癌症，例如，乳腺癌、前列腺癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌，但是在表型水平和基因水平上每一种类型的癌症都是不同的。当由于突变而使一个或多个基因的表达变得无法调控时癌症的生长就无法被调节，细胞的生长就会失控。
基因通常分为两类，癌基因和肿瘤抑制基因。癌基因的正常功能是促进细胞生长，但是只是在特殊条件下。当癌基因发生突变而无法被调控时，它在各种条件下都能促进细胞生长。但是，研究发现，对于癌症来说，必需使肿瘤抑制基因发生突变才能真正成功地治疗癌症。肿瘤抑制基因的正常功能是抑制细胞生长。肿瘤抑制基因的例子包括p53、p16、p21和APC，所有这些基因在正常发挥作用时都可抑制细胞发生分裂和不可控的生长。当肿瘤抑制基因发生突变或丢失时，其抑制细胞生长的功能也丢失，使细胞发生不可控的生长。
促乳素受体(PRLR)是一种单链跨膜1类细胞因子受体，与细胞因子超家族成员的受体同源，如IL2、IL3、IL4、IL6、IL7、促红素和GM-CSF的受体。PRLR具有多种生物学功能，其中包括细胞生长、分化、发育、泌乳和生殖。它没有内源性的酪氨酸激酶活性；配基结合可导致受体二聚化、Jak2的交叉磷酸化和下游信号产生。人促乳素受体cDNA最初是从肝癌和乳腺癌文库中分离出来的(Boutin，J.-M.等，Molec.Endocr.3：1455-1461，1989)。根据核苷酸序列预测，其成熟蛋白包含598个氨基酸，其胞浆区比大鼠肝PRL受体长很多。促乳素受体基因与生长激素受体基因位于同一染色体区，即5；13-p12(Arden，K.C.等，Cytogenet.Cell Gene 53：161-165，1990；Arden，K.C.等，(摘要)AM.J.Hum.Genet.45(增刊)：仅A129，1989)。生长激素也可以结合并活化促乳素受体。
人PRLR基因的基因组结构已经清楚(Hu，Z.-Z.等，J.Clin.Endocr.Metab.84：1153-1156，1999)。PRLR基因的5-引导-非翻译区包含两种第一外显子：E13，大鼠和小鼠E13的人对应物，和一种新的人型第一外显子，被称为E1N。5-引导-非翻译区还包含一个通用的非编码外显子2和外显子3的一部分，后者包含翻译起始密码子。E13和E1N外显子在800个碱基对以内。这两个外显子在人乳腺组织、乳腺癌细胞、生殖腺和肝脏中有表达。总之，包含E13的转录子表达于大多数组织中。PRLR基因产物由外显子3-10编码，其中外显子10编码胞内区的大部分。E13和E1N外显子分别从启动子PIII和PN二者之一开始转录。PIII启动子包含Sp1和C/EBP元件，这些元件与啮齿类动物启动子中的元件一致，与大鼠和小鼠的该基因的-480/-106区有81％的同源性。PN启动子包含推测的ETS家族蛋白的结合位点和核受体的半位点。
PRLR有多种不同的亚型，这些亚型的胞浆区长度不同。试验证明，人腹部皮下脂肪组织和乳腺脂肪组织表达4种PRLR mRNA亚型(L、I、S1a和S1b)(Ling，C.等，J.Clin.Endocr.Metab.88：1804-1808，2003)。另外，他们利用免疫印迹技术在人腹部皮下脂肪组织和乳腺脂肪组织中检测到了L-PRLR和I-PRLR蛋白的表达。与对照相比，PRL可降低人脂肪组织中脂蛋白脂肪酶的活性。Ling等人认为这些结果证明PRL通过功能性的PRLR可直接降低人脂肪组织内LPL的活性，这些结果说明在泌乳期间LPL可通过这种方式调节。这些PRLR亚型在大鼠体内的功能已被阐释清楚(Perrot-Applanat，M.等，Molec.Endocr.11：1020-1032，1997)。就像已知的长型受体(591个氨基酸)一样，缺少胞浆区198个氨基酸的Nb2型也能传递泌乳信号。但是缺少胞浆区291个氨基酸的短型受体是无活性的。将长型和短型共转染后检测短型的功能，结果表明短型受体可通过形成无活性异源二聚体的形式发挥显性负调节抑制剂的作用，导致Janus激酶2的活化被抑制。Perrot-Applanat等人认为，PRLR的异源二聚体可正性或负性活化PRL的转录。
最近的文献认为，PRLR在人乳腺癌和前列腺癌组织中是过量表达的(Li等，Cancer Res.，64：4774-4782，2004；Gill等，J Clin Pathol.，54：956-960，2001；Touraine等，J Clin Endocrinol Metab.，83：667-674，1998)。Li等人报道，在54％的前列腺癌标本中Stat5的活化和PRLR的表达具有高组织学级别的相关性(Li等，同上)。其他文献报道显示，在克隆形成分析中原发乳腺癌标本可对PRL产生反应，胞浆PRL浓度与乳腺癌风险相关(Tworoger等，CancerRes.，64：6814-6819，2004；Tworoger等，Cancer Res.，66：2476-2482，2006)。另一个文献报道显示PRL转基因小鼠会患恶性乳腺癌或前列腺异常增生(Wennbo等，J Clin Invest.，100：2744-2751，1997；Wennbo等，Endocrinology，138：4410-4415，1997)。
PRLR单克隆抗体可降低小鼠的乳腺癌发病率(Sissom等，Am.J.Pathol.133：589-595，1988)。另外，PRL拮抗剂(S179D突变体PRL)可抑制人前列腺癌细胞系DU-145在体外的增殖以及DU-145诱导肿瘤在体内的生长(Xu等，Cancer Res.，61：6098-6104，2001)。
因此，我们需要研究能在这些癌症中调节PRLR及其功能的组合物和方法。本发明涉及这些需求以及其他重要的需求。
发明概述
PRLR的核苷酸序列展示在SEQ ID NO：1中，氨基酸序列展示在SEQ IDNO：2中。胞外域(ECD)包含SEQ ID NO：2的25到234位氨基酸，其中包含两个主要的区，S1(25-122位氨基酸)和S2(123-234位氨基酸)。已经鉴定出了PRLR的许多不同亚型：长型(L)、中型(I)、无活性的可溶性亚型(PRLBP)ΔS1和无活性的短型S1a和S1b。每个亚型所包含的外显子和核苷酸区显示在图1中。在典型的实施方式中，本发明提供了能结合S1区和/或S2区的抗体。这种能结合S2区的抗体可以靶向到所有的活性亚型。本发明还提供了能特异性结合一个亚型而不能结合另一个亚型(例如，能结合中型而不能结合S1a或S1b)的抗体，或者能特异性结合活性亚型(长型、中型和ΔS1)而不能结合无活性亚型(S1a和S1b)的抗体。
本发明的材料和方法能满足上述需求及本领域的其他需求。
在一个实施方式中，本发明提供了能以10-6M或更低的平衡解离常数(KD)与PRLR胞外域结合并与下列任一抗体竞争结合75％以上PRLR的抗体：chXHA.06.642、chXHA.06.275、he.06.642-1、he.06.642-2、he.06.275-1、he.06.275-2、he.06.275-3、he.06.275-4、XPA.06.128、XPA.06.129、XPA.06.130、XPA.06.131、XPA.06.141、XPA.06.147、XPA.06.148、XPA.06.158、XPA.06.159、XPA.06.163、XPA.06.167、XPA.06.171、XPA.06.178、XPA.06.181、XPA.06.192、XPA.06.202、XPA.06.203、XPA.06.206、XPA.06.207、XPA.06.210、XPA.06.212、XPA.06.217、XPA.06.219、XPA.06.229、XPA.06.233、XPA.06.235、XPA.06.239、XPA.06.145、XHA.06.567、XHA.06.642、XHA.06.983、XHA.06.275、XHA.06.189或XHA.06.907。术语“10-6M或更低的平衡解离常数(KD)”是指平衡解离常数为，例如，10-6、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或10-12M(低于10-6M的数值)。在另一实施方式中，抗体与下列任一抗体所结合的PRLR的表位一样：chXHA.06.642、chXHA.06.275、he.06.642-1、he.06.642-2、he.06.275-1、he.06.275-2、he.06.275-3、he.06.275-4、XPA.06.128、XPA.06.129、XPA.06.130、XPA.06.131、XPA.06.141、XPA.06.147、XPA.06.148、XPA.06.158、XPA.06.159、XPA.06.163、XPA.06.167、XPA.06.171、XPA.06.178、XPA.06.181、XPA.06.192、XPA.06.202、XPA.06.203、XPA.06.206、XPA.06.207、XPA.06.210、XPA.06.212、XPA.06.217、XPA.06.219、XPA.06.229、XPA.06.233、XPA.06.235、XPA.06.239、XPA.06.145、XHA.06.567、XHA.06.642、XHA.06.983、XHA.06.275、XHA.06.189或XHA.06.907。
在另一个实施方式中，上述抗体包含下列任一抗体的1、2、3、4、5或6个CDR：chXHA.06.642、chXHA.06.275、he.06.642-1、he.06.642-2、he.06.275-1、he.06.275-2、he.06.275-3、he.06.275-4、XPA.06.128、XPA.06.129、XPA.06.130、XPA.06.131、XPA.06.141、XPA.06.147、XPA.06.148、XPA.06.158、XPA.06.159、XPA.06.163、XPA.06.167、XPA.06.171、XPA.06.178、XPA.06.181、XPA.06.192、XPA.06.202、XPA.06.203、XPA.06.206、XPA.06.207、XPA.06.210、XPA.06.212、XPA.06.217、XPA.06.219、XPA.06.229、XPA.06.233、XPA.06.235、XPA.06.239、XPA.06.145、XHA.06.567、XHA.06.642、XHA.06.983、XHA.06.275、XHA.06.189或XHA.06.907。在另一个实施方式中，上述抗体是嵌合抗体、人源化抗体、人基因工程抗体、人抗体、单链抗体或抗体片段。在另一实施方式中，本发明所提供的上述抗体的CDR内至少有一个氨基酸被另一抗PRLR抗体的相应CDR的相应残基取代。在一个典型实施方式中，本发明提供的上述抗体中选自如下一组的抗体的CDR内至少有一个氨基酸被另一抗PRLR抗体的相应CDR的相应残基取代：chXHA.06.642、chXHA.06.275、he.06.642-1、he.06.642-2、he.06.275-1、he.06.275-2、he.06.275-3、he.06.275-4、XPA.06.128、XPA.06.129、XPA.06.130、XPA.06.131、XPA.06.141、XPA.06.147、XPA.06.148、XPA.06.158、XPA.06.159、XPA.06.163、XPA.06.167、XPA.06.171、XPA.06.178、XPA.06.181、XPA.06.192、XPA.06.202、XPA.06.203、XPA.06.206、XPA.06.207、XPA.06.210、XPA.06.212、XPA.06.217、XPA.06.219、XPA.06.229、XPA.06.233、XPA.06.235、XPA.06.239、XPA.06.145、XHA.06.567、XHA.06.642、XHA.06.983、XHA.06.275、XHA.06.189或XHA.06.907。在另一个典型实施方式中，本发明提供的上述抗体中选自如下一组的抗体：chXHA.06.642、chXHA.06.275、he.06.642-1、he.06.642-2、he.06.275-1、he.06.275-2、he.06.275-3、he.06.275-4、XPA.06.128、XPA.06.129、XPA.06.130、XPA.06.131、XPA.06.141、XPA.06.147、XPA.06.148、XPA.06.158、XPA.06.159、XPA.06.163、XPA.06.167、XPA.06.171、XPA.06.178、XPA.06.181、XPA.06.192、XPA.06.202、XPA.06.203、XPA.06.206、XPA.06.207、XPA.06.210、XPA.06.212、XPA.06.217、XPA.06.219、XPA.06.229、XPA.06.233、XPA.06.235、XPA.06.239、XPA.06.145、XHA.06.567、XHA.06.642、XHA.06.983、XHA.06.275、XHA.06.189或XHA.06.907的CDR内至少有一个氨基酸被选自如下一组的另一抗体的相应CDR的相应残基取代：chXHA.06.642、chXHA.06.275、he.06.642-1、he.06.642-2、he.06.275-1、he.06.275-2、he.06.275-3、he.06.275-4、XPA.06.128、XPA.06.129、XPA.06.130、XPA.06.131、XPA.06.141、XPA.06.147、XPA.06.148、XPA.06.158、XPA.06.159、XPA.06.163、XPA.06.167、XPA.06.171、XPA.06.178、XPA.06.181、XPA.06.192、XPA.06.202、XPA.06.203、XPA.06.206、XPA.06.207、XPA.06.210、XPA.06.212、XPA.06.217、XPA.06.219、XPA.06.229、XPA.06.233、XPA.06.235、XPA.06.239、XPA.06.145、XHA.06.567、XHA.06.642、XHA.06.983、XHA.06.275、XHA.06.189或XHA.06.907。在另一实施方式中，本发明所提供的上述抗体的CDR内有一个或两个氨基酸被修饰。
在本发明的另一个实施方式中，本发明所提供的上述抗体在轻链或重链可变区上与抗体chXHA.06.642、chXHA.06.275、he.06.642-1、he.06.642-2、he.06.275-1、he.06.275-2、he.06.275-3、he.06.275-4、XPA.06.128、XPA.06.129、XPA.06.130、XPA.06.131、XPA.06.141、XPA.06.147、XPA.06.148、XPA.06.158、XPA.06.159、XPA.06.163、XPA.06.167、XPA.06.171、XPA.06.178、XPA.06.181、XPA.06.192、XPA.06.202、XPA.06.203、XPA.06.206、XPA.06.207、XPA.06.210、XPA.06.212、XPA.06.217、XPA.06.219、XPA.06.229、XPA.06.233、XPA.06.235、XPA.06.239、XPA.06.145、XHA.06.567、XHA.06.642、XHA.06.983、XHA.06.275、XHA.06.189或XHA.06.907有至少60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％的一致性。
在另一实施方式中，上述抗体包含人抗体序列的恒定区和人抗体序列的一个或多个重链和轻链可变框架区。在本发明另一个实施方式中，本发明提供的上述抗体中人抗体序列是个体人序列、人共有序列、个体人种系序列或人共有种系序列。
在另一实施方式中，本发明提供的上述抗体中重链恒定区是修饰的或未修饰的IgG、IgM、IgA、IgD、IgE、其片段或其组合。在另一实施方式中，本发明提供的上述抗体中重链恒定区是修饰的或未修饰的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在另一实施方式中，本发明提供的上述抗体与PRLR的平衡解离常数为10-6、10-7、10-8或10-9M或更低。在另一实施方式中，本发明所提供的上述抗体在CDR内有保守取代。在另一实施方式中，本发明所提供的上述抗体包含低和中度风险残基上的保守或非保守改变。在另一实施方式中，本发明所提供的上述抗体中轻链恒定区是修饰的或未修饰的λ轻链恒定区、κ轻链恒定区、其片段或其组合。
在另一实施方式中，本发明所提供的上述抗体能够抑制PRLR的二聚化、抑制PRLR的胞内磷酸化、抑制MAPK磷酸化的诱导、抑制AKT磷酸化的诱导和/或抑制PRL与PRLR的结合。
在其他实施方式中，上述抗体还能抑制VEGF的产生和/或血管发生。
在另一实施方式中，本发明所提供的上述抗体能抑制癌细胞的增殖。在另一实施方式中，抗体能抑制乳腺癌、前列腺癌或肺癌细胞的增殖。
除了癌症之外，本发明的另一实施方式提供了用于预防和/或治疗自身免疫疾病和炎性疾病或失调的上述抗体。抗体特别适用于预防、缓解或治疗包含自身免疫性和/或炎性组分的疾病。这些疾病包括而不限于自身免疫性疾病和炎性疾病，如系统性红斑狼疮(SLE)、盘状狼疮、狼疮性肾炎、肉状瘤病、炎性关节炎，其中包括而不限于幼年性关节炎、类风湿性关节炎、牛皮癣关节炎、莱特尔综合征、强直性脊柱炎和痛风性关节炎，器官或组织移植排斥、超急性、急性或慢性排斥和/或移植物抗宿主病、多发性硬化症、高IgE综合征、结节性多发性动脉炎、原发性胆汁性肝硬化、肠炎、克罗恩病、乳糜泻(谷蛋白敏感性肠病)、自身免疫性肝炎、恶性贫血、自身免疫性溶血性贫血、牛皮癣、硬皮病、重症肌无力、自身免疫性血小板减少性紫癜、自身免疫性甲状腺炎、格雷夫斯病、桥本甲状腺炎、免疫复合物病、慢性疲劳免疫异常综合征(CFIDS)、多肌炎和皮肌炎、冷球蛋白血症、血栓溶解、心肌病、寻常天庖疮、肺间质纤维化、I型和II型糖尿病、1、2、3和4型迟发型超敏反应、变态反应或变态反应性紊乱、对治疗蛋白的不需要的/意外的免疫反应、哮喘、丘-施二氏综合征(变应性肉芽肿)、特应性皮炎、变应性和刺激性接触性皮炎、风疹、IgE-介导的变态反应、动脉粥样硬化、血管炎、原发性炎性肌病、溶血性肌病、阿尔茨海默病、慢性炎性脱髓鞘性多神经病等。
在另一实施方式中，本发明提供的上述抗体与另一诊断或治疗剂连接。
在另一个实施方式中，本发明提供了筛选抗PRLR蛋白胞外域的抗体的方法，其中的抗体可用于治疗癌症，该方法包括步骤：使包含PRLR的ECD的多肽与包含下列抗体的至少1、2、3、4、5或6个CDR的候选抗体接触：chXHA.06.642、chXHA.06.275、he.06.642-1、he.06.642-2、he.06.275-1、he.06.275-2、he.06.275-3、he.06.275-4、XPA.06.128、XPA.06.129、XPA.06.130、XPA.06.131、XPA.06.141、XPA.06.147、XPA.06.148、XPA.06.158、XPA.06.159、XPA.06.163、XPA.06.167、XPA.06.171、XPA.06.178、XPA.06.181、XPA.06.192、XPA.06.202、XPA.06.203、XPA.06.206、XPA.06.207、XPA.06.210、XPA.06.212、XPA.06.217、XPA.06.219、XPA.06.229、XPA.06.233、XPA.06.235、XPA.06.239、XPA.06.145、XHA.06.567、XHA.06.642、XHA.06.983、XHA.06.275、XHA.06.189和XHA.06.907；检测候选抗体与多肽的结合亲和力，如果测得平衡解离常数为10-6M或更低则所述的候选抗体可被鉴定为可用于治疗癌症的抗体。
在另一实施方式中，本发明提供了系统改变抗体和筛选抗PRLR蛋白胞外域的抗体的方法，其中的抗体可用于治疗癌症，该方法包括制备候选抗体的步骤，其中的候选抗体在如下抗体的CDR内的一个或两个氨基酸上包含修饰：chXHA.06.642、chXHA.06.275、he.06.642-1、he.06.642-2、he.06.275-1、he.06.275-2、he.06.275-3、he.06.275-4、XPA.06.128、XPA.06.129、XPA.06.130、XPA.06.131、XPA.06.141、XPA.06.147、XPA.06.148、XPA.06.158、XPA.06.159、XPA.06.163、XPA.06.167、XPA.06.171、XPA.06.178、XPA.06.181、XPA.06.192、XPA.06.202、XPA.06.203、XPA.06.206、XPA.06.207、XPA.06.210、XPA.06.212、XPA.06.217、XPA.06.219、XPA.06.229、XPA.06.233、XPA.06.235、XPA.06.239、XPA.06.145、XHA.06.567、XHA.06.642、XHA.06.983、XHA.06.275、XHA.06.189和XHA.06.907；使包含PRLR的ECD的多肽与所述的候选抗体接触；检测候选抗体与多肽的结合亲和力；如果测得平衡解离常数为10-6M或更低则所述的候选抗体可被鉴定为可用于治疗癌症的抗体。
在另一个实施方式中，本发明提供了筛选抗PRLR蛋白胞外域的抗体的方法，其中的抗体可用于治疗癌症，该方法包括使乳腺、肺或前列腺细胞与候选抗体接触的步骤，其中的候选抗体包含如下抗体的至少1、2、3、4、5或6个CDR：chXHA.06.642、chXHA.06.275、he.06.642-1、he.06.642-2、he.06.275-1、he.06.275-2、he.06.275-3、he.06.275-4、XPA.06.128、XPA.06.129、XPA.06.130、XPA.06.131、XPA.06.141、XPA.06.147、XPA.06.148、XPA.06.158、XPA.06.159、XPA.06.163、XPA.06.167、XPA.06.171、XPA.06.178、XPA.06.181、XPA.06.192、XPA.06.202、XPA.06.203、XPA.06.206、XPA.06.207、XPA.06.210、XPA.06.212、XPA.06.217、XPA.06.219、XPA.06.229、XPA.06.233、XPA.06.235、XPA.06.239、XPA.06.145、XHA.06.567、XHA.06.642、XHA.06.983、XHA.06.275、XHA.06.189和XHA.06.907，或在一个或多个CDR内有一个或两个氨基酸修饰的抗体；检测所述细胞的增殖或存活能力；如果检测到细胞增殖和存活能力下降则所述的候选抗体可被鉴定为可用于治疗癌症的抗体。
在另一个实施方式中，本发明提供了治疗癌症患者的方法，其中包括0、I、II、III、IV或V期癌症患者，该方法包括给予治疗有效量的上述抗体的步骤。在一个相关的实施方式中，所述癌症是乳腺癌、肺癌或前列腺癌。在另一实施方式中，需要给予第二治疗剂。在一个典型实施方式中，第二治疗剂是阿霉素、柔红霉素或其他蒽环类抗生素或拓扑异构酶抑制剂。在其他实施方式中，上述任一拓扑异构酶抑制剂与chXHA.06.642、chXHA.06.275、he.06.642-1、he.06.642-2、he.06.275-1、he.06.275-2、he.06.275-3、he.06.275-4一起给予。在另一实施方式中，还对对象进行放疗或手术治疗。在本发明的另一实施方式中，所述对象是PRLR和HER2-neu表达阳性的，以及其中所述的第二治疗剂是抗Her2-neu抗体。在一个相关实施方式中，所述对象是PRLR和ER表达阳性的，以及其中所述的第二治疗剂是抗ER抗体。在另一实施方式中，本发明提供了可用作药物的本发明的抗体，其中包括用于治疗癌症的药物。在其他实施方式中，本发明提供了本发明的抗体在制备癌症治疗药物中的用途。药物可与第二治疗剂和/或放疗一起施与对象。
在本发明的另一实施方式中，本发明提供了靶向表达PRLR的肿瘤细胞的方法，该方法包括给予连接到放射性核素或其他毒素上的上述抗体的步骤。在另一实施方式中，所述对象是哺乳动物。在另一个实施方式中，所述对象是人。
在另一实施方式中，本发明提供了包含编码上述抗体的重链或轻链的核苷酸序列的游离核酸分子。在另一实施方式中，本发明提供了包含与调节控制序列可操控连接的上述核酸分子的表达载体。在另一个实施方式中，本发明提供了包含上述载体或上述核酸分子的宿主细胞。
在另一实施方式中，本发明提供了利用上述宿主细胞制备抗体的方法，该方法包括在合适的条件下培养宿主细胞并回收所述的抗体。在另一实施方式中，本发明提供了通过上述方法制备的抗体。
在另一个实施方式中，本发明提供了纯化至按重量计至少达到95％同质性的上述抗体。在另一实施方式中，本发明提供了包含上述抗体和药学上可接受的载体的药物组合物。
在另一实施方式中，本发明提供了包含包装在容器内的上述抗体的试剂盒，其中的上述抗体包含治疗有效量的本发明的抗体，试剂盒任选可包含第二治疗剂，还可以包含粘帖在容器上或者包装在容器内的标签，标签上注明容器的内含物并指导和/或说明如何使用容器的内容物来治疗癌症。在另一实施方式中，本发明提供了试剂盒，其中容器是药瓶或小瓶或预装注射器。
在本发明的另一实施方式中，本发明提供了能结合PRLR胞外域的抗体，其中抗体包含选自如下一组的轻链可变区氨基酸序列：SEQ ID NO：21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、82、84、86、88、91、95和96。在另一实施方式中，本发明提供了能结合PRLR胞外域的抗体，其中抗体包含选自如下一组的重链可变区氨基酸序列：SEQ ID NO：20、2、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、83、85、87、89、90、93、94、97和98。在另一实施方式中，本发明提供了能结合PRLR胞外域的抗体，其中抗体包含轻链可变区氨基酸序列SEQ ID NO：88和重链可变区序列SEQ ID NO：89。在另一实施方式中，本发明提供了能结合PRLR胞外域的抗体，其中抗体包含轻链可变区氨基酸序列SEQ ID NO：88和重链可变区序列SEQ ID NO：90。
在本发明的另一实施方式中，本发明提供了能结合PRLR胞外域的抗体，其中抗体包含轻链可变区氨基酸序列SEQ ID NO：91和重链可变区序列SEQ IDNO：93。在另一实施方式中，本发明提供了能结合PRLR胞外域的抗体，其中抗体包含轻链可变区氨基酸序列SEQ ID NO：91和重链可变区序列SEQ IDNO：94。在另一实施方式中，本发明提供了能结合PRLR胞外域的抗体，其中抗体包含轻链可变区氨基酸序列SEQ ID NO：92和重链可变区序列SEQ IDNO：93。在另一实施方式中，本发明提供了能结合PRLR胞外域的抗体，其中抗体包含轻链可变区氨基酸序列SEQ ID NO：92和重链可变区序列SEQ IDNO：94。
在本发明的另一实施方式中，本发明提供了能结合PRLR胞外域的抗体，其中抗体包含轻链可变区氨基酸序列SEQ ID NO：95和重链可变区序列SEQ IDNO：97。在另一实施方式中，本发明提供了能结合PRLR胞外域的抗体，其中抗体包含轻链可变区氨基酸序列SEQ ID NO：95和重链可变区序列SEQ IDNO：98。在另一实施方式中，本发明提供了能结合PRLR胞外域的抗体，其中抗体包含轻链可变区氨基酸序列SEQ ID NO：96和重链可变区序列SEQ IDNO：97。在另一实施方式中，本发明提供了能结合PRLR胞外域的抗体，其中抗体包含轻链可变区氨基酸序列SEQ ID NO：96和重链可变区序列SEQ IDNO：98。
在本发明的另一实施方式中，本发明提供了能结合人PRLR胞外域的抗体，其中抗体与胞外域结合的KD比与小鼠PRLR胞外域结合的KD低至少10到25,000倍、100到20,000倍、1,000到18,000倍、5,000到17,000倍、8,000到16,000倍、10,000到15,000倍、12,000到15,000倍、或13,000到14,000倍。在一个相关实施方式中，上述抗体与he.06.275-4结合的表位相同。在另一实施方式中，本发明提供了与人PRLR胞外域、小鼠PRLR胞外域和大鼠PRLR胞外域结合的抗体。在另一个实施方式中，本发明提供了以10-6M或更低的平衡解离常数(KD)与人、小鼠和大鼠PRLR胞外域结合的抗体。在一个相关实施方式中，上述抗体与he.06.642-2结合的表位相同。
在另一实施方式中，上述方法可用于鉴定需要用抗PRLR抗体治疗的对象，例如，通过(a)从对象获得样品；以及(b)分析样品的PRLR、Jak2、Mapk、Stat5、Erk1/2和/或Akt的磷酸化水平；其中PRLR、Jak2、Mapk、Stat5、Erk1/2和/或Akt的磷酸化水平是需要用抗PRLR抗体治疗的指示剂。在另一实施方式中，本发明提供了监测癌症对象的癌症疗法的方法，该方法包括步骤：(a)在开始癌症疗法前分析对象的第一样品的PRLR磷酸化水平；以及(b)在开始癌症疗法后分析第二样品，其中在开始癌症疗法后磷酸化PRLR的水平降低说明患者接受了治疗有效量的癌症疗法。在一个相关实施方式中，所述癌症疗法是上述任一实施方式所述的抗体。
附图简述
图1显示的是各种PRLR亚型的基因排列和外显子。
图2、3和4显示的是选择出的PRLR特异性抗体对pERK1/2磷酸化的效应。[mAb 1167是对照鼠抗PRLR单克隆抗体；R&D系统(R&D Systems)，货号MAB1167]
图5显示的是PRLR特异性抗体对PRL反应性肿瘤细胞系增殖的效应。
图6显示的是PRLR特异性抗体对PRLR胞内磷酸化的效应。
图7A-7C显示的是抗体XPA.06.128、XPA.06.129、XPA.06.130、XPA.06.131、XPA.06.141、XPA.06.147、XPA.06.148、XPA.06.158、XPA.06.159、XPA.06.163、XPA.06.167、XPA.06.171、XPA.06.178、XPA.06.181、XPA.06.192、XPA.06.202、XPA.06.203、XPA.06.206、XPA.06.207、XPA.06.210、XPA.06.212、XPA.06.217、XPA.06.219、XPA.06.229、XPA.06.233、XPA.06.235、XPA.06.239的VH和VL氨基酸序列以及CDR(下划线)的位置，在pERK试验中该抗体有80％以上的抑制活性。
图8显示的是抗体XPA.06.145的VH和VL氨基酸序列。
图9显示的是抗体XHA.06.983、XHA.06.275和XHA.06.642的前导序列以及VH和VL核苷酸序列。
图10显示的是抗体XHA.06.983、XHA.06.275和XHA.06.642的VH和VL氨基酸序列(下划线部分为CDR)。
图11显示的是能高效抑制BaF/prlr细胞增殖和存活的嵌合的抗PRLR单克隆抗体chXHA.06.642、chXHA.06.275和chXHA.06.983。KLH-G1是与对照抗体匹配的非特异性同种型抗体。右侧显示的是相应的小鼠单克隆抗体的IC50值。
图12显示的是嵌合的抗PRLR mAb可抑制T47D细胞内的STAT5信号。在用50ng/ml PRL刺激前30min用1ug/ml mAb预处理细胞。利用PRLR的磷酸酪氨酸残基546和611特异性抗体分析细胞裂解物内是否存在磷酸-PRLR。
图13显示了人基因工程抗体(Human EngineeredTM antibody)对pERK1/2磷酸化的效应。
图14显示的是抗PRLR mAb介导的ADCC。在使用mAb(1ug/ml)前用钙黄绿素-AM标记T47D-T2细胞，纯化的人NK细胞与细胞以10∶1的效靶比混合。孵育4小时后，测定释放到上清内的钙黄绿素-AM。抗KLH抗体和赫赛汀(Herceptin)分别作为阴性和阳性对照。％特异性计算为(实验组释放-自发释放)/(最大释放-自发释放)×100。
图15显示的是组合试验中抗PRLR mAb与细胞毒药物的协同效应。阿霉素(上图)和顺铂(下图)与抗KLH对照抗体、抗PRLR mAb chXHA.06.642或抗PRLR mAb chXHA.06.275(浓度均为1ug/ml)共同给药。通过CellTiter Glo分析测定细胞的存活率，报告为RLU(y-轴)。
图16显示的是STAT5磷酸化试验证明人基因工程单克隆抗体(HumanEngineeredTM mAb)保留有抗PRLR功能性特征。T47D细胞与1或10ug/ml mAb共孵育，然后再用或不用PRL(50ng/ml)处理30分钟。
图17A和B显示的是人源化的抗PRLR候选抗体可高效地抑制PRL依赖性的BaF3/PRLR细胞的生长。BaF3/PRLR细胞在PRL(50ng/ml)存在的条件下培养48小时，分别添加抗KLH对照抗体(上图)、嵌合抗体或HumanEngineeredTM抗体(人基因工程抗体)。利用曲线拟合的非线性回归分析计算EC50值。
图18A和B显示的是p-STAT5对chXHA.06.642处理动物内Nb2-C11肿瘤的抑制作用。带有Nb2-c11皮下肿瘤的无胸腺小鼠腹膜内注射chXHA.06.642或KLH对照IgG1 mAb。两天后腹膜内注射20ug oPRL。对照动物注射盐水。两天后腹膜内注射20ug oPRL，40分钟后收获肿瘤，利用免疫印迹或IHC分析p-STAT5。图18A，80ug Tyr694 p-STAT5的蛋白质印迹结果；图18B，Tyr694p-STAT5的IHC结果。
图19A和B显示的是两个不同的试验都证明chXHA.06.642对SCID小鼠的Nb2-c11大鼠淋巴瘤模型是有效的。
图20A和B显示的是chXHA.06.642可抑制SCID小鼠体内种植的Nb2-c11大鼠淋巴瘤。图20A显示了肿瘤体积；图20B显示了条件存活率。
图21A和B显示的是腹膜内单次注射oPRL诱导p-STAT5，用chA64.1处理可抑制T47D人乳腺异种移植物内的p-STAT5的诱导。chXHA.06.642或KLH对照IgG1腹膜内注射荷T47D肿瘤的免疫妥协小鼠，小鼠已被植入0.18mg/天雌二醇(E2)丸以支持肿瘤生长。两天后腹膜内注射20ug oPRL，40分钟后收获T47D肿瘤，利用免疫印迹或IHC分析p-STAT5。图21A，80ug Tyr694p-STAT5的蛋白质印迹结果；图21B，Tyr694 p-STAT5的IHC结果。
详细描述
本发明提供了PRLR特异性抗体、包含这种抗体的药学上可接受的制剂、制备抗体和药学上可接受的制剂的方法以及利用药学上可接受的制剂和化合物治疗患者的方法。本发明的抗体具有结合PRLR和/或抑制PRLR二聚化和/或抑制PRLR胞内磷酸化、和/或抑制PRLR下游信号转导，例如，通过Jak2、Mapk、Stat5、Erk1/2和/或Akt的磷酸化、以及抑制癌症或肿瘤相关的细胞增殖的理想生物学活性。本发明以这种方式提供了通过检测PRLR的磷酸化或通过分析其他下游信号伙伴如Jak2、Stat5、Erk1/2和/或Akt的磷酸化状态来直接分析PRLR活化的方法。因此，分析下游信号通路可用于确定哪些患者需要使用抗体PRLR抗体，或者用于监测用抗PRLR抗体治疗的患者。
本发明的抗体还可具有结合癌细胞表达的PRLR的理想生物学活性，因此可用于癌细胞的靶向性细胞毒治疗。
本发明还涉及鉴定PRLR基因或基因产物及其突变体的拮抗剂或激动剂的筛选试验。因此，本发明涉及鉴定PRLR基因或基因产物及其突变体的拮抗剂或激动剂的方法以及所述的激动剂或拮抗剂在治疗或预防本文所述的癌症中的用途。另外，本发明涉及核酸分子、多肽和/或PRLR基因编码产物在筛选、诊断、预防和/或治疗以PRLR异常表达或异常活性为特征的疾病中的用途，其中包括癌症，例如而不限于肺癌、乳腺癌和前列腺癌。
根据体外试验分析发现，几种优选的小鼠抗体或嵌合抗体具有较高的亲和力和效应，这些抗体通过Studnicka等的Human EngineeringTM方法改造后其免疫原性降低。简言之，将重链和轻链可变区的表面暴露氨基酸残基修饰成人源残基，这些位置的氨基酸被确定不可能对抗原结合或蛋白折叠产生不良影响，同时可以降低其在人体环境内的免疫原性。构建包含修饰重链和/或轻链可变区的合成基因并且连接到人γ重链和/或κ轻链恒定区上。所有的人重链和轻链恒定区都可用于连接Human EngineeredTM抗体(人基因工程抗体)可变区。人重链和轻链基因导入到哺乳动物细胞内，收获产生的重组免疫球蛋白产物并分析其特征。
本发明的典型抗体包括chXHA.06.642、chXHA.06.275、he.06.642-1、he.06.642-2、he.06.275-1、he.06.275-2、he.06.275-3、he.06.275-4、XPA.06.128、XPA.06.129、XPA.06.130、XPA.06.131、XPA.06.141、XPA.06.147、XPA.06.148、XPA.06.158、XPA.06.159、XPA.06.163、XPA.06.167、XPA.06.171、XPA.06.178、XPA.06.181、XPA.06.192、XPA.06.202、XPA.06.203、XPA.06.206、XPA.06.207、XPA.06.210、XPA.06.212、XPA.06.217、XPA.06.219、XPA.06.229、XPA.06.233、XPA.06.235、XPA.06.239、XPA.06.145、XHA.06.567、XHA.06.642、XHA.06.983、XHA.06.275、XHA.06.189和XHA.06.907。根据《布达佩斯条约》的规定，于2006年8月17日将下列分泌抗体的杂交瘤保存到位于美国弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏所(ATCC，10801 University Blvd.，Manassas，VA 20110-2209(USA))：
  杂交瘤名称   ATCC保藏号
  XHA.06.567   PTA-7794
  XHA.06.642   PTA-7795
  XHA.06.983   PTA-7796
  XHA.06.275   PTA-7797
  XHA.06.189   PTA-7798
  XHA.06.907   PTA-7799
下面所提供的定义用于帮助更完整地理解本发明。
一般定义
本文所用的靶抗原人“PRLR”是指与SEQ ID NO：2具有基本相同的氨基酸序列的人多肽及其天然的等位基因和/或剪接突变体。“PRLR的ECD”用于本文中是指SEQ ID NO：2的25到234位氨基酸所代表的PRLR的胞外部分。
在本文中。“肿瘤”是指所有的瘤性细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，以及所有的癌前和癌细胞和组织。
术语“癌”和“癌的”是用于描述哺乳动物的生理状态，其典型特征是细胞生长失控。癌症的例子包括而不限于乳腺癌、结肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、淋巴结癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、子宫癌、宫颈癌或皮肤癌。
“处理”是指为了阻止疾病发生或改变疾病病理学而进行的干扰措施。相应的，“治疗”即指治疗性措施又指预防性方法。需要治疗的那些患者包括已经患病的人以及那些需要预防疾病发生的人。对于肿瘤(例如，癌)治疗来说，治疗性药物可直接减轻肿瘤细胞的病理学活性，或者使肿瘤细胞对其他治疗措施如放疗和/或化疗变得更敏感。对产生临床、生化、放射学或主观症状的患者的治疗包括减轻某些或全部这类症状，或者减少疾病的诱因。癌的“病理学”包括危害患者健康的所有现象。这包括而不限于异常的或失控的细胞增生、转移、对临近细胞正常功能的干扰、细胞因子或其他分泌产物异常水平的释放、炎症或免疫反应的抑制或恶化等。因此，通过治疗后病情改善可表现为肿瘤缩小、肿瘤生长速度下降、已有肿瘤细胞或转移瘤细胞的破坏、和/或转移瘤缩小或数目减少。
可被治疗的“哺乳动物”是指可被分类为哺乳动物的任何动物，其中包括人、家畜、以及动物园动物、体育动物或宠物，如狗、马、猫、牛等。优选的哺乳动物是人。
本文所用的术语“治疗有效量”是指对于本发明的实施方式来说是合适的，当按照理想的治疗方案给药时能够激发理想的治疗性或预防性效应或反应的治疗性或预防性抗体的量，其中包括某些或所有疾病症状的减轻，或者疾病诱因的降低。
抗体
“亲和力”或“结合亲和力”通常用平衡缔合常数(KA)或平衡解离常数(KD)表示。术语“免疫特异性的”或“特异性结合”是指抗体与PRLR或其ECD的平衡缔合常熟(KA)大于或等于约106M-1、大于或等于约107M-1、大于或等于约108M-1或者大于或等于约109M-1、1010M-1、1011M-1或1012M-1。与其他不相关的分子相比，抗体与靶抗原的亲和力有实质提高。与直向同源物或同源物相比，抗体与靶抗原的亲和力还可以实质高出，例如，至少1.5倍、2倍、5倍、10倍、100倍、103倍、104倍、105倍、106倍或更高。另外，抗体与已知的同源物或直向同源物的交叉反应也可能是有用的。
本发明的抗体的特征还可以是平衡解离常数(KD)为10-4M、10-6M到10-7M或10-8M、10-10M、10-11M或10-12M或更低。利用常规技术可以很容易确定这种亲和力，例如通过平衡透析；按照厂家提供的通用方法通过使用BIAcore2000设备；利用放射性标记的靶抗原进行放免分析，或者本领域技术人员熟知的其他方法。亲和力数据可利用，例如，Scatchard等，Ann N.Y.Acad.Sci.，51：660(1949)的方法分析。
“中和抗体”是指能够消除或明显降低与其结合的靶抗原的效应功能的抗体分子。相应的，“中和”抗靶抗体能够消除或明显降低效应功能，如酶活性、配基结合或胞内信号转导。
术语“抗体”的含义很广，其中包括完整抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(如，双特异性抗体)、能结合抗原的抗体片段(例如，Fab’、F’(ab)2、Fv、单链抗体、双体)、骆驼体(camel body)以及包含上述抗体的重组肽，只要它们具有理想的生物学活性就可以。抗体片段可通过重组DNA技术或完整抗体的酶催化或化学裂解来制备，这些将在下文作进一步描述。单克隆抗体的非限定性例子包括鼠的、嵌合的、人源化的、人的和Human EngineeredTM免疫球蛋白、抗体、具有免疫球蛋白序列的嵌合融合蛋白、或其突变蛋白或衍生物，这些在下文都有进一步描述。本发明还提供了完整分子和/或片段，其中包括化学衍生抗体的多聚物或凝集物。任何同种型或亚型的抗体也包括在本发明的范围之内。
本文所用的术语“单克隆抗体”是指从一群基本同源的抗体中获得的抗体，即，这个群所包含的各个抗体除了可能天然发生的数量很少的突变以外都是一致的。单克隆抗体是有高度特异性的，直接抗单个抗原位点。另外，与通常包含抗不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体不同，每一个单克隆抗体都只抗抗原上的一个决定簇。除了其特异性之外，单克隆抗体的优点还在于它是由均一的培养物产生的，不会被具有不同特异性和特征的其他免疫球蛋白污染。
修饰语“单克隆”是指抗体来自于一群基本同源的抗体的特征，不应该被解释为需要通过任何特定的方法制备抗体。例如，本发明所用的单克隆抗体可通过Kohler等，Nature，256：495[1975]首先描述的杂交瘤方法制备，或者通过重组DNA方法制备(参见，例如，美国专利号4,816,567)。例如，“单克隆抗体”还可以是重组抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、Human EngineeredTM抗体或抗体片段。
“游离的”抗体是已被鉴定并且从其天然环境的组分中分离和回收出来的抗体。其天然环境的污染组分是指能干扰抗体的诊断或治疗用途的材料，其中包括酶、激素以及其他蛋白或非蛋白溶解物。在优选实施方式中，抗体被纯化成(1)根据Lowry方法测定重量百分比超过95％，最优选的超过99％，(2)纯度足以满足用旋压杯氏测序仪可获得至少15个N端残基或内部氨基酸序列，或者(3)在还原或非还原条件下进行SDS-PAGE并通过考马斯亮蓝或优选的银染染色，结果显示是均质性的。游离抗体包括重组细胞内的原位抗体，其中抗体天然环境的至少一个组分已不存在。但是，一般而言，游离抗体要至少通过一个纯化步骤制备。
“免疫球蛋白”或“天然抗体”是四聚体糖蛋白。在天然免疫球蛋白中，每一个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对多肽链包含一个“轻链”(约25kDa)和一个“重链”(约50-70kDa)。每条链的氨基端部分包含约100到110或更多氨基酸组成的“可变区”，主要负责抗原识别。每条链的羧基端定义恒定区，主要负责效应功能。根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可被分成不同的类。重链可被分成μ、Δ、γ、α和ε，分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。这些类中的几个类又可进一步分成亚类或同种型，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。不同的同种型有不同的效应功能；例如，IgG1和IgG3同种型有ADCC活性。人轻链可分为κ和λ轻链。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包括约10多个氨基酸的“D”区。参见，《基础免疫学》(Fundamental Immunology)第七章(Paul，W.编辑，第2版，纽约莱文出版社(Raven Press，N.Y.)(1989))。
有关抗体的结构和制备方法的详细描述参见Roth，D.B.和Craig，N.L.，Cell，94：411-414(1998)，本文已完整纳入作为参考。简言之，制备编码重链和轻链免疫球蛋白基因的过程主要发生在发育的B细胞内。在重排和连接各种免疫球蛋白基因片段之前，V、D、J和恒定区(C)基因片段通常出现在单个染色体的相对近端。在B细胞分化过程中，V、D、J(或者，轻链基因只有V和J)基因片段的合适家族成员的每一成员重组形成功能重排的重链和轻链免疫球蛋白基因。这个基因片段重排过程是顺序出现的。首先，重链D-J连接发生，然后是重链V-DJ连接和轻链V-J连接。除了V、D和J片段重排以外，免疫球蛋白重链和轻链的基本组成成分还会产生其他多样性，这种多样性的发生是通过轻链V和J片段连接处以及重链D和J连接处的可变重组。轻链的这种突变通常发生在V基因片段的最后一个密码子和J片段的第一密码子之内。连接处相似的不精确性也发生在D和JH片段之间的重链染色体上，其范围可达10个核苷酸之多。另外，D和JH以及VH和D基因片段之间还可能插入几个核苷酸，这些核苷酸不是由基因组DNA编码的。这些核苷酸的添加已知被称为N区多样性。可变区基因片段内的这种重排以及这种连接期间发生的可变重组的净效应就是主要抗体谱的产生。
“抗体片段”包含完整全长抗体(其中包括，例如，人抗体)的一部分，优选包含完整抗体的抗原结合区或可变区，抗体片段包括抗体片段所形成的多特异性抗体。抗体片段的非限制性例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、Fd、区抗体(dAb)、补体决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、单链抗体片段、双体、三体、四体、小体、线性抗体、螯合的重组抗体、三体或双体、胞内抗体、纳米抗体、小模块免疫药物(SMIPs)、抗原结合区免疫球蛋白融合蛋白、骆驼化抗体(camelizedantibody)、含VHH的抗体或其突变体或衍生物，以及包含免疫球蛋白的至少一部分从而足以赋予多肽抗原结合特异性的多肽，如CDR序列，只要抗体保留所需的生物学活性就可以。
木瓜蛋白酶消化抗体可产生两个相同的被称为“Fab”片段的抗原结合片段和一个残留的“Fc”片段，每个Fab片段包含一个抗原结合位点，Fc片段的名称反应了它很容易结晶化35的能力。胃蛋白酶处理可产生包含两个“Fv”片段的F(ab′)2片段。“Fv”片段是包含完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。这个区包含由一个重链可变区和一个轻链可变区紧密非共价相连组成的二聚体。在这种构型中，每一个可变区的三个CDR相互作用定义VH VL二聚体表面的抗原结合位点。6个CDR共同赋予抗体以抗原结合特异性。但是，即使一个可变区(或者只包含三个抗原特异性CDR的Fv的一半)也能够识别和结合抗原。
“单链Fv”或“sFv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL区，其中这些区存在于一条多肽链上。优选的是，Fv多肽还包含位于VH和VL区之间的多肽连接子，这种连接子可使Fv形成抗原结合所需的理想结构。有关sFv的综述参见Pluckthun的《单克隆抗体药理学》(The Pharmacology of MonoclonalAntibodies)113卷，Rosenburg和Moore编辑，纽约SV出版社(Springer-Verlag，New York)，269-315页(1994)。
Fab片段还包含轻链的恒定区和重链的第一恒定区(CH1)。Fab片段与Fab’片段的区别在于后者的重链CH1区羧基端包含几个残基，其中包含一个或多个来源于抗体铰链区的半胱氨酸。Fab′-SH在本文中被定义为恒定区的半胱氨酸残基包含三个巯基的Fab’。F(ab′)2抗体片段最初是作为Fab’片段对制备的，两个Fab’片段之间有铰链区半胱氨酸。
术语“超级可变区”是指抗体上的负责抗原结合的氨基酸残基。超级可变区包含“补体决定区”或CDR来源的氨基酸残基[即，轻链可变区的24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)位氨基酸，重链可变区的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)位氨基酸，如Kabat等，《免疫学的目标蛋白的序列》(Sequences of Proteinsof Immunological Interest)，第5版，位于马里兰州贝沙达的国立健康研究所的公众健康服务部(Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.)(1991)所述]和/或来自于超级可变环的那些残基(即，轻链可变区的26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)位氨基酸，重链可变区的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)位氨基酸，如Chothia等，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)所述]。
“框架”或FR残基是指那些超级可变区残基之外的可变区残基。
术语“恒定区”是指赋予抗体效应功能的抗体分子部分。
术语“嵌合抗体”用于本文中是指包含起源于两种不同抗体的序列的抗体(参见，例如，美国专利号4,816,567)，这两种抗体通常起源于不同物种。最常见的是，嵌合抗体包含人和小鼠的抗体片段，通常是人的恒定区和小鼠的可变区。
术语“突变型蛋白”或“突变体”可交互使用，是指在可变区或与可变区等价的区域包含至少一个氨基酸取代、缺失或插入的抗体多肽序列，但是突变型蛋白或突变体还保留了理想的结合亲和力或生物学活性。突变型蛋白与亲本抗体基本同源或基本一致。
术语“衍生物”与本发明的抗体联用时是指通过这类技术如泛素化、连接治疗性或诊断性试剂、标记(例如，用放射性核素或各种酶标记)、共价聚合物粘附如聚乙二醇化(衍生自聚乙二醇)以及通过化学合成非天然氨基酸进行插入或取代来共价修饰的抗体。本发明的衍生物保留了本发明的非衍生分子的结合特性。
本文所用的术语“抗体”尤其包括下列保留了与PRLR胞外域的结合能力的任一分子：
1)具有图7A-7C或图8所示的氨基酸序列的亲本抗体的氨基酸突变体，其中包括所包含的重链可变区氨基酸序列与亲本氨基酸序列至少有60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同源性的突变体，和/或所包含的轻链可变区氨基酸序列与亲本氨基酸序列至少有60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同源性的氨基酸序列，同源性是通过计算相似氨基酸确定的；
2)包含亲本抗体的一个或多个不同决定区(CDR)的PRLR结合多肽，其中的亲本抗体包含图7A-7C或图8所示的氨基酸序列，优选的是至少包含重链的CDR3，以及优选包含两个或两个以上、或者3个或3个以上、或者4个或4个以上、或者5个或5个以上、或者所有6个CDR；
3)根据Studnicka等，美国专利号5,766,886和本文实施例5所述的方法，利用Kabat编号鉴定低、中和高风险残基，通过改变亲本序列制备的HumanEngineeredTM抗体(人基因工程抗体)；这种抗体包含下列重链的至少一个和下列轻链的至少一个：(a)与人参考免疫球蛋白序列相应的残基不同的所有低风险啮齿类残基已被修饰成与人参考免疫球蛋白序列的人残基相同的残基的重链，或(b)如果需要，所有低和中风险啮齿类残基已被修饰成与人参考免疫球蛋白序列相同的残基的重链，(c)如果需要，所有低风险残基已被修饰成与人参考免疫球蛋白序列相同的残基的轻链，或(b)如果需要，所有低和中风险残基已被修饰成与人参考免疫球蛋白序列相同的残基的轻链。
4)上述段落(3)中上述抗体的突变体，该突变体所包含的重链或轻链、或者重链可变区或轻链可变区与原始的啮齿类轻链至少有60％的氨基酸一致性，更优选的是至少有80％、更优选的是至少有85％、更优选的是至少有90％、最更优选的是至少有95％的一致性，其中包括，例如，65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和100％的一致性；
5)包含啮齿类抗体的一个或多个CDR的高风险残基的PRLR结合多肽，以及优选包含两个或两个以上、或者3个或3个以上、或者4个或4个以上、或者5个或5个以上、或者所有6个CDR的高风险残基，以及任选包含低或中风险残基的一个或多个改变；
例如，包含低风险残基的一个或多个改变以及中风险残基的保守取代，或
例如，保留中风险和高风险氨基酸残基以及包含低风险残基的一个或多个改变，
其中改变包括插入、缺失或取代，可以是保守取代，或者改变可导致基因工程抗体在序列上更接近人轻链或重链序列、人种系轻链或重链序列、共有的人轻链或重链序列、或共有的人种系轻链或重链序列。本发明所包含的这种改变可以下面的序列格式展示。在一个假设的序列AKKLVHTPYSFKEDF中，根据Studnicka等，美国专利号5,766,886所描述的方法确定每一个残基的各自风险，那么序列可表示为HMLHMLHMLHMLHML(H＝高风险，M＝中风险，L＝低风险)，假设序列中低风险残基的典型改变可展示为：AKXLVXTPXSFXEDX，其中X可以是任何氨基酸，或者X是该位置原始残基的保守取代，低风险和中风险残基的典型改变也可以同样展示，例如AYXLYXTYXSYXEYX，其中X是任何氨基酸，Y是该位置原始残基的保守取代。
术语“竞争抗体”包括
1)与抗体chXHA.06.642、chXHA.06.275、he.06.642-1、he.06.642-2、he.06.275-1、he.06.275-2、he.06.275-3、he.06.275-4、XPA.06.128、XPA.06.129、XPA.06.130、XPA.06.131、XPA.06.141、XPA.06.147、XPA.06.148、XPA.06.158、XPA.06.159、XPA.06.163、XPA.06.167、XPA.06.171、XPA.06.178、XPA.06.181、XPA.06.192、XPA.06.202、XPA.06.203、XPA.06.206、XPA.06.207、XPA.06.210、XPA.06.212、XPA.06.217、XPA.06.219、XPA.06.229、XPA.06.233、XPA.06.235、XPA.06.239、XPA.06.145、XHA.06.567、XHA.06.642、XHA.06.983、XHA.06.275、XHA.06.189或XHA.06.907所结合的PRLR表位相同的非小鼠或非啮齿类抗体，例如，通过X射线衍射晶体分析法所确定的；以及
2)与小鼠抗体chXHA.06.642、chXHA.06.275、he.06.642-1、he.06.642-2、he.06.275-1、he.06.275-2、he.06.275-3、he.06.275-4、XPA.06.128、XPA.06.129、XPA.06.130、XPA.06.131、XPA.06.141、XPA.06.147、XPA.06.148、XPA.06.158、XPA.06.159、XPA.06.163、XPA.06.167、XPA.06.171、XPA.06.178、XPA.06.181、XPA.06.192、XPA.06.202、XPA.06.203、XPA.06.206、XPA.06.207、XPA.06.210、XPA.06.212、XPA.06.217、XPA.06.219、XPA.06.229、XPA.06.233、XPA.06.235、XPA.06.239、XPA.06.145、XHA.06.567、XHA.06.642、XHA.06.983、XHA.06.275、XHA.06.189或XHA.06.907竞争性超过75％、超过80％、或超过81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％或95％的非小鼠或非啮齿类抗体；另一种是将chXHA.06.642、chXHA.06.275、he.06.642-1、he.06.642-2、he.06.275-1、he.06.275-2、he.06.275-3、he.06.275-4、XPA.06.128、XPA.06.129、XPA.06.130、XPA.06.131、XPA.06.141、XPA.06.147、XPA.06.148、XPA.06.158、XPA.06.159、XPA.06.163、XPA.06.167、XPA.06.171、XPA.06.178、XPA.06.181、XPA.06.192、XPA.06.202、XPA.06.203、XPA.06.206、XPA.06.207、XPA.06.210、XPA.06.212、XPA.06.217、XPA.06.219、XPA.06.229、XPA.06.233、XPA.06.235、XPA.06.239、XPA.06.145、XHA.06.567、XHA.06.642、XHA.06.983、XHA.06.275、XHA.06.189或XHA.06.907的结合亲和力降低至少2、3、4、5、6、10、20、50、100倍或更高的第一非小鼠或非啮齿类单克隆抗体。
本发明的抗体优选以10-6、10-7、10-8、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M或更低的平衡解离常数与PRLR的ECD结合，以及优选抑制PRLR的胞内磷酸化和下游PRLR信号转导的活化，例如，通过STAT5、MAPK或AKT的活化。
任选是，在本申请的申请日之前公开的或在本申请的申请日之前递交的申请中所公开的任何嵌合、人或人源化抗体被排除在本发明的范围之外。
如本文所广泛定义的，“非啮齿类”单克隆抗体是指由啮齿类杂交瘤所产生的完整啮齿类单克隆抗体之外的任何抗体。因此，非啮齿类抗体特别包括而不限于啮齿类抗体的突变体、啮齿类抗体片段、线性抗体、嵌合抗体、人源化抗体、Human EngineeredTM抗体(人基因工程抗体)和人抗体，其中包括利用转基因动物或通过噬菌体展示技术制备的人抗体。同样，非小鼠抗体包括而不限于小鼠抗体的突变体、小鼠抗体片段、线性抗体、嵌合的、人源化的、HumanEngineeredTM和人的抗体。
靶抗原
可用于制备抗体的靶抗原可以是，例如，PRLR的胞外域或保留所需表位的PRLR片段，任选是与另一多肽融合在一起，这种多肽可使表位以其天然构型展示。另外，细胞表面表达的完整PRLR可用于制备抗体。这种细胞可被转化以表达PRLR或者可以是另一种表达PRLR的天然细胞。本领域的技术人员了解可用于制备抗体的其他形式的PRLR多肽。.
多克隆抗体
多克隆抗体优选通过多点皮下注射(sc)或腹膜内注射(ip)相关抗原和佐剂在动物内制备。通过将相关抗原连接到在被免疫的物种内具有免疫原性的蛋白质上可以提高抗体反应，这种蛋白质的例子有钥孔虫戚血蓝素、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或利用双功能或衍生试剂的大豆胰蛋白酶抑制剂，例如马来酰亚氨基苯甲酰磺基琥珀酰亚胺酯(maleimidobenzoyl sulfosuccinimide ester)(通过半胱氨酸残基连接)、N羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐或本领域已知的其他试剂。
动物用抗原、免疫原性偶联物或衍生物免疫，例如，100μg或5μg蛋白或偶联物(分别用于兔或小鼠)和3倍体积的完全福氏佐剂混合，然后将溶液皮内注射到多个位点。一个月后通过多个位点皮下注射初始量1/5到1/10的完全福式佐剂溶解的肽或偶联物对动物进行加强免疫。加强免疫后7-14天动物放血，分析血清中抗体的滴度。动物再次加强免疫直到滴度达到平台期。优选的，动物用相同抗原的偶联物加强免疫，但是也可以用连接到不同蛋白和/或通过不同交联剂连接的偶联物进行加强免疫。偶联物还可以融合蛋白的形式在重组细胞培养物中制备。另外，凝集试剂如明矾也适合用于增强免疫反应。
单克隆抗体
单克隆抗体可利用Kohler等，Nature，256：495(1975)所描述的杂交瘤方法或重组DNA方法制备。
在杂交瘤方法中，按照本文所述的免疫小鼠或其他合适的宿主动物如仓鼠或猕猴以刺激能够产生抗体的淋巴细胞，其中的抗体可与用于免疫的蛋白特异性结合。另外，也可在体外免疫淋巴细胞。然后利用合适的融合试剂如聚乙二醇使淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞(Goding，《单克隆抗体：原理与实践》(Monoclonal Antibodies：Principles and Practice)，59-103页学术出版社(Academic Press)，1986)，或者通过电促细胞融合技术进行融合。
因此，杂交瘤细胞可接种到合适的培养基中并在其中生长，培养基内优选含有一种或多种能抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，则杂交瘤的培养基内通常包含次黄嘌呤、氨喋呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质可阻止HPGRT缺失细胞的生长。
优选的骨髓瘤细胞是那些可有效融合并支持所筛选出的抗体产生细胞稳定高水平生产抗体的细胞，并且对培养基敏感。有报道证实人骨髓瘤和小鼠-人杂合骨髓瘤细胞系也可用于制备人单克隆抗体(Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)，Brodeur等，《单克隆抗体制备技术和应用》(MonoclonalAntibody Production Techniques and Applications)，51-63页(纽约MD公司(Marcel Dekker，Inc.，New York)，1987))。典型的小鼠骨髓瘤细胞系包括来源于Salk Institute Cell Distribution Center，San Diego，Calif.USA保存的MOP-21和M.C.-11小鼠肿瘤的那些细胞系以及来源于美国马里兰州洛可维尔的美国典型培养物保藏所(Rockville，Md.USA)保存的SP-2或X63-Ag8-653细胞的那些细胞系。
分析培养杂交瘤细胞的培养基以检测直接抗抗原的单克隆抗体的产生情况。优选的是，杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀或通过体外结合分析如放免分析(RIA)或酶联免疫吸附分析(ELISA)来确定。单克隆抗体的结合亲和力可以通过，例如，Scatchard分析(Munson等，Anal.Biochem.，107：220(1980))来确定。
当确定杂交瘤细胞可以产生具有理想特异性、亲和力和/或活性的抗体以后，杂交瘤细胞克隆可通过有限稀释方法进行亚克隆并通过标准方法培养(Goding，《单克隆抗体：原理与实践》(Monoclonal Antibodies：Principles andPractice)，59-103页(学术出版社，1986))。适用于此目的的培养基包括，例如，DMEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可作为动物体内的腹水肿瘤在体内培养。亚克隆分泌的单克隆抗体适于通过常规的免疫球蛋白纯化方法如蛋白A-琼脂糖、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析方法从培养基、腹水或血清中分离。
利用常规方法(例如，利用能够特异性结合编码单克隆抗体的重链和轻链基因的寡核苷酸探针)可以从杂交瘤细胞中分离编码单克隆抗体的DNA并测序。确定序列通常需要分离目的基因或cDNA的至少一部分。这通常需要克隆编码单克隆抗体的DNA或优选的mRNA(即，cDNA)。克隆可利用标准技术(参见，例如，Sambrook等，(1989)，《分子克隆：实验室指导》(Molecular Cloning：ALaboratory Guide)，1-3卷，冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press)，本文已纳入作为参考)完成。例如，通过反转录polyA+mRNA构建cDNA文库，优选膜相关的mRNA，利用人免疫球蛋白多肽基因序列特异性的探针筛选文库。但是，在一个优选实施方式中，聚合酶链式反应(PCR)用于扩增编码目的免疫球蛋白基因片段(例如，轻链可变区片段)的cDNA(或全长cDNA的一部分)。扩增出的序列可以很容易地克隆到任何合适的载体如表达载体、微基因载体或噬菌体展示载体内。应当理解的是，所使用的特定方法不是关键的因素，只要有可能确定目的免疫球蛋白多肽的某些部分的序列就可以。在本文中，“游离”核酸分子或“游离”核酸序列是指(1)从至少一种污染核酸分子中鉴定和分离出来的核酸分子，在核酸的天然资源中核酸分子通常与污染的核酸分子相关，或者(2)从背景核酸中克隆、扩增、标记或区分出来的核酸分子，这样目的核酸序列可以被确定，这些核酸分子被认为是游离的。游离核酸分子所具有的形式或所处的组在自然条件下是不存在的。因此，游离核酸分子与天然细胞中存在的核酸分子是有区别的。但是，游离核酸分子也包括通常表达抗体的细胞中所包含的核酸分子，例如，其中核酸分子在染色体上的位置与其在天然细胞中所处的位置不同。
用于克隆和测序的RNA的一个来源是通过获取转基因小鼠的B细胞并使其与永生细胞融合而制备的杂交瘤。使用杂交瘤的一个优点在于它们易于筛选，可以筛选出能产生人目的单克隆抗体的杂交瘤。另外，RNA可从免疫动物的B细胞(或全脾)中分离。如果使用杂交瘤之外的资源，比较理想的是筛选具有特异性结合特征的免疫球蛋白或免疫球蛋白多肽编码序列。完成这种筛选的一种方法是利用噬菌体展示技术。噬菌体展示技术见于，例如，Dower等，WO 91/17271，McCafferty等，WO 92/01047以及Caton和Koprowski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：6450-6454(1990)的描述，本文都已纳入作为参考。在使用噬菌体展示技术的一个实施方式中，从免疫的转基因小鼠中分离cDNA(例如，脾总cDNA)，利用聚合酶链式反应扩增编码部分免疫球蛋白多肽如CDR的cDNA序列，然后将扩增出的序列插入到噬菌体载体内。利用标准技术如淘洗技术鉴定编码目的肽如具有理想结合特征的可变区肽的cDNA。
然后测定扩增的或克隆的核酸的序列。一般情况下要测定编码免疫球蛋白多肽的完整可变区的序列，但是有时只测定一部分可变区如CDR编码区就足够了。通常测序的部分至少有30个碱基长，更常见的是要测定编码可变区的至少约1/3或至少约一半的序列。
测序可在分离自cDNA文库的克隆上进行，或者，当使用PCR时，可在将扩增的序列亚克隆后进行测序，或者直接通过PCR测定扩增片段的序列。测序可用标准技术完成(参见，例如，Sambrook等，(1989)，《分子克隆：实验室指导》(Molecular Cloning：A Laboratory Guide)，1-3卷，冷泉港出版社，以及Sanger，F.等，(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74：5463-5467，本文已纳入作为参考)。通过比较克隆的核酸序列与已公开的人免疫球蛋白基因和cDNA序列，本领域的技术人员根据测序的区域可以很容易地确定(i)杂交瘤免疫球蛋白多肽的种系片段用途(其中包括重链的同种型)和(ii)重链和轻链可变区序列，其中包括N区添加和体细胞突变而产生的序列。免疫球蛋白基因序列信息的一个来源是位于马里兰州贝沙达的国立健康研究所的国家医学图书馆的国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，National Libraryof Medicine，National Institutes of Health，Bethesda，Md)。
抗体片段
如上所述，抗体片段包括完整全长抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合区或可变区，以及包括抗体片段形成的线性抗体和多特异性抗体。抗体片段的非限定性例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、Fd、区抗体(dAb)、补体决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、单链抗体片段、双体、三体、四体、小体、线性抗体、螯合的重组抗体、三体或双体、胞内抗体、纳米抗体、小模块免疫药物(SMIPs)、抗原结合区免疫球蛋白融合蛋白、骆驼化抗体、含VHH的抗体或其突变体或衍生物，以及包含免疫球蛋白的至少一部分从而足以赋予多肽抗原结合特异性的多肽，如CDR序列，只要抗体保留所需的生物学活性就可以。这种抗原片段可通过利用重组DNA技术或肽合成技术修饰全长抗体或从新合成来制备。
术语“双体”是指含有两个抗原结合位点的小抗体片段，该片段包含一条与同一多肽链(VH VL)上的轻链可变区(VL)相连的重链可变区(VH)。由于所使用的连接子太短使同一条链上的两个区之间无法配对，因此这两个区被迫与另一条链上的互补区配对，形成两个抗原结合位点。有关双体更全面的描述参见，例如，EP 404,097；WO 93/11161；以及30 Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993)。
“单链Fv”或“sFv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL区，其中这些区存在于一条多肽链上，任选是，Fv多肽还包含位于VH和VL区之间的多肽连接子，这种连接子可使Fv形成抗原结合所需的理想结构(Bird等，Science242：423-426，1988，以及Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883，1988)。Fd片段由VH和CH1区组成。
其他抗体片段包括由VH组成的区抗体(dAb)片段(Ward等，Nature341：544-546，1989)。
“线性抗体”包含一对串联的Fd片段(VH-CH1-VH-CH1)，这些片段形成一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性的，也可以是单特异性的(Zapata等，Protein Eng.8：1057-62(1995))。
“微小抗体”包含scFv和CH3，二者由肽连接子(无铰链)或IgG铰链连接在一起，参见Olafsen，等，Protein Eng Des Sel.2004 Apr；17(4)：315-23的描述。
缺少轻链的功能性重链抗体是由铰口鲨(Greenberg等，Nature 374：168-73，1995)、斑纹须鲨(Nuttall等，Mol Immunol.38：313-26，2001)和骆驼科动物(Hamers-Casterman等，Nature 363：446-8，1993；Nguyen等，J.Mol.Biol.275：413，1998)如骆驼、单峰骆驼、羊驼和美洲驼自然产生的。在这些动物中，抗原结合位点缩减到单个区--VHH区。这些抗体只利用重链可变区就可以形成抗原结合区，即，这些功能性抗体是只具有H2L2结构的重链形成的同源二聚体(被称为“重链抗体”或“HCAb”)。据报道，骆驼化(Camelized)VHH可与包含铰链区、CH2和CH3区但缺少CH1区的IgG2和IgG3恒定区重组(Hamers-Casterman等，同上)。例如，美洲驼IgG1是常规(H2L2)抗体的同种型，其中VH与包含铰链区、CH1、CH2和CH3区的恒定区重组，而美洲驼IgG2和IgG3是只含重链的同种型，不含CH1区，也没有轻链。典型的只含VH的片段难以产生可溶性的形式，但是将框架区的残基改变成更类似VHH的残基可以提高其溶解度和特异性结合活性(参见，例如，Reichman等，J ImmunolMethods 1999，231：25-38)。研究发现，骆驼化VHH区可以很高的亲和力结合抗原(Desmyter等，J.Biol.Chem.276：26285-90，2001)，并且在溶液中非常稳定(Ewert等，Biochemistry 41：3628-36，2002)。制备具有骆驼化重链的抗体的方法参见，例如，美国专利出版号20050136049和20050037421的描述。
由于重链抗体的可变区是最小的全功能抗原结合片段，分子量只有15kDa，因此这个分子被称为纳米抗体(Cortez-Retamozo等，Cancer Research64：2853-57，2004)。纳米抗体库是从免疫的单峰骆驼中制备的，如Conrath等，(Antimicrob Agents Chemother 45：2807-12，2001)所述，或者是利用重组方法制备的，如所述。
胞内抗体是被证明在细胞内表达并且能调控细胞内蛋白功能的单链抗体(Biocca，等，EMBO J.9：101-108，1990；Colby等，Proc Natl Acad Sci USA.101：17616-21，2004)。胞内抗体包含细胞信号序列，这个序列的功能在于维持抗体在胞内区的结构，其制备方法可参见Mhashilkar等(EMBO J 14：1542-51，1995)和Wheeler等(FASEB J.17：1733-5.2003)。转运体(Transbody)是可透过细胞的抗体，其中蛋白转导区(PTD)与单链可变区片段(scFv)抗体融合在一起，Heng等，(Med Hypotheses.64：1105-8，2005)。
本发明还涉及的抗体包括SMIP或靶蛋白特异性的结合区免疫球蛋白融合蛋白。这些构建体是包含抗原结合区的单链多肽，其中抗原结合区融合到执行抗体效应功能所必须的免疫球蛋白区上。参见，例如，WO03/041600，美国专利出版号20030133939和美国专利出版号20030118592。
多价抗体
在某些实施方式中，比较理想的是制备多价单克隆抗体，甚至多特异性(例如，双特异性、三重特异性等)单克隆抗体。这种抗体对靶抗原的至少两个不同表位具有结合特异性，或者可以结合两个不同的分子，例如，靶抗原和细胞表面蛋白或受体。例如，双特异性抗体可包含一个结合靶抗原的臂和另一个结合白细胞上的激发分子如T细胞受体分子(例如，CD2或CD3)或IgG的Fc受体(FcγR)如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)从而将细胞防御机制集中到表达靶抗原的细胞上的臂。作为另一个例子，双特异性抗体可用于将细胞毒药物定位到表达靶抗原的细胞上。这些抗体包含靶抗原结合臂和结合细胞毒药物(例如，皂草素、抗干扰素-60、长春花碱、蓖麻毒蛋白A链、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。多特异性抗体可制备成全长抗体或抗体片段。
双特异性抗体包括交联的或“异源聚合的”的抗体。例如，异源聚合物中的一个抗体可与链亲和素偶联，另一个与生物素结合。异源聚合物抗体可用任何方便的交联方法制备。合适的交联剂是本领域熟知的，在美国专利号4,676,980中有描述，其中还包括多种交联技术。
根据制备双特异性抗体的另一种方法，一对抗体分子之间的界面可以被改造以使从重组细胞培养物中回收的异源二聚体所占百分率达到最高。优选的界面包含抗体恒定区CH3区的至少一部分。在这种方法中，来自于第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链被较大的侧链取代(如，酪氨酸或色氨酸)。用较小的氨基酸侧链(如丙氨酸或苏氨酸)取代大的氨基酸侧链会在第二抗体分子的界面上产生相同或相似尺寸侧链对大侧链的补偿“空洞”。这为提高杂合二聚体的产率使其超过其他不需要的终产物如同源二聚体提供了一个机制。参见1996年9月6日出版的WO96/27011。
利用抗体片段制备双特异性抗体的技术也可见于文献的描述。例如，可以利用化学连接的方法制备双特异性抗体。Brennan等，Science，229：81(1985)描述了一种方法，其中完整抗体通过蛋白酶裂解制备出F(ab′)2片段。这些片段在二巯基复合试剂亚砷酸钠存在的条件下被还原以稳定连位二巯基化合物，防止分子间二硫键形成。产生出的Fab′片段再被转化成硫代硝基苯甲酸(thionitrobenzoate)(TNB)衍生物。一个Fab′-TNB衍生物通过与巯基乙胺的还原反应再转化成Fab′-巯基，与等摩尔的其他Fab′-TNB衍生物混合形成双特异性抗体。所制备出的双特异性抗体可作为试剂用于特异性地固化酶。Better等，Science 240：1041-1043(1988)描述了功能性抗体片段从细菌中的分泌(参见，例如Better等，Skerra等，Science 240：1038-1041(1988))。例如，Fab′-SH片段可直接从大肠杆菌回收，该片段通过化学方法偶联可形成双特异性抗体。(Carter等，Bio/Technology 10：163-167(1992)；Shalaby等，J.Exp.Med.175：217-225(1992))。
Shalaby等，J.Exp.Med.，175：217-225(1992)描述了完全人源化的双特异性抗体F(ab′)2分子的制备方法。每一种Fab′片段都独自从大肠杆菌中分泌，在体外经过直接化学偶联后形成双特异性抗体。因此所形成的双特异性抗体能够结合过量表达HER2受体的细胞和正常的人T细胞，并且能够激发人细胞毒淋巴细胞抗人乳腺肿瘤靶位的溶解活性。
直接从重组细胞培养物中制备和分离双特异性抗体片段的各种技术也已有报道。例如，利用亮氨酸拉链如GCN4可制备出双特异性抗体。(参见，Kostelny等，J.Immunol.，148(5)：1547-1553(1992)。来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合的方式连接到两个不同抗体的Fab′部分。抗体同源二聚体在铰链区被还原形成单体，然后再氧化形成抗体异源二聚体。这种方法还被用于制备抗体同源二聚体。
术语“双体”是指含有两个抗原结合位点的小抗体片段，该片段包含一条与同一多肽链(VH VL)上的轻链可变区(VL)相连的重链可变区(VH)。由于所使用的连接子太短使同一条链上的两个区之间无法配对，因此这两个区被迫与另一条链上的互补区配对，形成两个抗原结合位点。参见，例如，Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993)。
制备双特异性抗体片段的另一种策略是利用单链Fv(sFv)二聚体，参见Gruber等，J.Immunol.152：5368(1994)。
另外，双特异性抗体可以是“线性抗体”，如Zapata等，Protein Eng.8(10)：1057-1062(1995)所述的方法制备的线性抗体。简言之，这些抗体包含一对串联的Fd片段(VH-CH1-VH-CH1)，这些片段形成一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性的，也可以是单特异性的。
本发明涉及二价以上的抗体。例如，可以制备三重特异性抗体。Tutt等，J.Immunol.147：60(1991)。
“螯合重组抗体”是可识别靶抗原上相邻而非重叠表位的双特异性抗体，这种抗体的柔软程度足以使其同时结合两个表位(Neri等，J Mol Biol.246：367-73，1995)。
双特异性Fab-scFv(“双体”)和三重特异性Fab-(scFv)(2)(“三体”)的制备方法见于Schoonjans等，(J Immunol.165：7050-57，2000)和Willems等，(JChromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci.786：161-76，2003)的描述。在双体或三体中，scFv分子融合到VL-CL(L)和VH-CH1(Fd)链中的一个或两个上，例如，在三体中，两个scFv融合到Fab的C区，而在双体中，一个scFv融合到Fab的C区。
抗体的重组制备方法
抗体可利用本领域熟知的一种抗体表达系统通过重组DNA方法制备(参见，例如，Harlow和Lane《抗体：实验室操作手册》(Antibodies：A LaboratoryManual)，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory)(1988))。
编码本发明抗体的DNA可被放置到表达载体内，然后将表达载体转染到宿主细胞如大肠杆菌细胞、猴COS细胞、人胚胎肾293细胞(例如，293E细胞)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不产生其他免疫球蛋白的骨髓瘤细胞内，从而在重组的宿主细胞内合成单克隆抗体。抗体的重组制备方法是本领域所熟知的。通过蛋白水解消化完整抗体可得到抗体片段(参见，例如，Morimoto等，Journal ofBiochemical and Biophysical Methods 24：107-117(1992)和Brennan等，Science229：81(1985))。但是，现在这些片段可以由重组宿主细胞直接产生。制备抗体片段的其他技术，其中包括肽合成技术和共价连接技术，是技术人员所熟知的。
表达控制序列是指可操控连接的编码序列在特定宿主有机体内表达所必须的DNA序列。适用于原核细胞的控制序列，例如，包括启动子、任选操纵子序列以及核糖体结合位点。真核细胞已知利用启动子、多聚腺苷酸信号和增强子。
当核酸与另一种核酸序列处于功能性相互关系中时则核酸是可操控连接的。例如，当原序列或分泌前导子的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白时，则该DNA与多肽的DNA可操控地连接；当启动子或增强子可影响序列的转录时，则该启动子或增强子与编码序列可操控地连接；或者当核糖体结合位点所处的位置能促进翻译时则该核糖体结合位点与编码序列可操控地连接。一般而言，可操控连接意味着被连接的DNA序列是连续的，以及在分泌前导序列中是连续的，并且处于阅读框架中。然而，增强子不一定是连续的。在方便的限制性酶切位点上通过连接反应可完成连接。如果这样的位点不存在，那么可按照常规实验合成寡核苷酸接头或连接子。
在本文中，细胞、细胞系和细胞培养物可交互使用，所有这些定义都包括子代细胞。转化子和转化细胞包括对象的原代细胞及其衍生的培养物，不论传代次数。还应当理解，子代细胞在DNA含量上不一定完全一致，因为存在有意或无意突变。在筛选原始转化细胞的过程中具有相同功能或生物活性的突变子代细胞也包括在该定义之内。如果意味着不同的含义，那么可以从上下文中看出来。
在另一个实施方式中，目的免疫球蛋白的氨基酸序列可通过蛋白直接测序来确定。可以根据通用密码表设计合适的编码核苷酸序列。
通过将合适的核苷酸改变引入到编码DNA内或者通过肽合成可以制备出理想抗体的氨基酸序列突变体。这种突变包括，例如，抗体的氨基酸序列内残基的缺失和/或插入和/或取代。缺失、插入和取代的任意组合都可使用以获得最后的构建体，只要最后的构建体具有理想的特征。氨基酸改变还可以改变单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、Human EngineeredTM抗体(人基因工程抗体)或突变抗体的翻译后处理过程，例如改变糖基化位点的数目和位置。
编码抗体的氨基酸序列突变体的核酸分子可用本领域已知的各种方法制备。这些方法包括而不限于从天然资源中分离(在出现天然氨基酸序列突变的情况下)或者通过寡核苷酸介导的(位点特异性的)突变、PCR突变制备，以及盒式突变先前制备的突变体或抗体的非突变版本。
本发明还提供了编码本发明抗体的游离核酸，任选是核酸与控制序列可操控地连接，这些控制序列可被宿主细胞、载体和包含核酸的宿主细胞识别，以及制备抗体的重组技术，该技术包括培养宿主细胞以表达核酸，以及任选从宿主细胞培养物或培养基中回收抗体。
为了通过重组方法制备抗体，将编码抗体的核酸分离出来并插入到可复制载体内以便于进一步克隆(扩增DNA)或表达。利用常规方法(例如，通过利用能够特异性结合编码抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)很容易分离和测序编码单克隆抗体的DNA。许多载体都是可用的。载体一般包括而不限于下列元件中的一个或多个：信号序列、复制起始位点、一个或多个筛选标志基因、增强子元件、启动子以及转录终止序列。
(1)信号序列组件
本发明的抗体不仅可以通过重组方法直接制备，而且还可以通过与异源多肽形成融合多肽来制备，优选的是，位于成熟蛋白或多肽N末端的信号序列或其他多肽包含特异性裂解位点。所选择的异源信号序列优选能够被宿主细胞识别和处理(即，被信号肽酶裂解)的信号序列。对于不能识别和处理天然抗体信号序列的原核宿主细胞来说，信号序列可用所选择的信号序列取代，例如，来源于果胶酶(例如，pelB)、碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp或热稳定内毒素II前导子的信号序列。对于酵母分泌来说，天然信号序列可以被，例如，酵母转化酶前导子、α因子前导子(包括酵母属和克鲁维酵母属α因子前导子)或酸性磷酸酶前导子、白色念珠菌葡萄糖淀粉酶前导子或WO 90/13646所描述的信号所取代。在哺乳动物细胞表达中，可以使用哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导子，如单纯疱疹gD信号。
编码这种前体区的DNA被连接到编码抗体的DNA的阅读框架内。
(2)复制起始位点组件
表达载体和克隆载体都包含能使载体在一种或多种特殊宿主细胞内复制的核酸序列。一般而言，在克隆载体内这个序列是能够使载体独立于宿主染色体DNA而复制的序列，其中包含复制起始位点或自主复制序列。许多细菌、酵母和病毒的这种序列都是已知的。质粒pBR322的复制起始位点适于大多数革兰氏阴性细菌，2μ质粒起始位点适于酵母，各种病毒的起始位点适于哺乳动物细胞的克隆载体。通常来说，哺乳动物表达载体不需要复制起始位点元件(一般只使用SV40起始位点，因为它包含早期启动子)。
(3)筛选标记组件
表达载体和克隆载体可包含筛选基因，也被称为筛选标志。典型的筛选基因编码的蛋白质能够(a)赋予对抗生素或其他毒素如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤、四环素、G418、遗传霉素、组胺醇或霉酚酸的耐药性，(b)弥补营养缺陷，或者(c)提供复合培养基中缺少的关键营养素，例如，编码Bacilli D丙氨酸消旋酶的基因。
筛选方法的一个例子是利用可以使宿主细胞生长停止的药物。成功转化外源基因的那些细胞可产生耐药性蛋白，因而可在选择培养基中存活下来。这种优势筛选的例子使用药物甲氨蝶呤、新霉素、组胺醇、嘌呤霉素、霉酚酸和潮霉素。
对于哺乳动物细胞来说，合适筛选标志物的另一个例子是那些能够用于鉴定细胞是否能够摄取抗体编码核酸的标志物，如DHFR、胸苷激酶、金属硫蛋白-I和-II，优选灵长类金属硫蛋白基因、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。
例如，转化DHFR筛选基因的细胞首先通过在包含甲氨蝶呤(Mtx)的培养基内培养所有转化子来鉴定，其中甲氨蝶呤是DHFR的竞争性拮抗剂。如果使用野生型DHFR，那么合适的宿主细胞是DHFR活性缺失的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。
另外，转化或共转化编码本发明抗体、野生型DHFR蛋白以及其他筛选标志物如氨基糖甙3′-磷酸转移酶(APH)的DNA序列的宿主细胞(特别是包含内源性DHFR的野生型宿主细胞)也可以通过在含筛选标志物的筛选药物如氨基糖甙类抗生素如卡那霉素、新霉素或G418的培养基内培养来进行筛选。参见美国专利号4,965,199。
适用于酵母的筛选基因是酵母质粒YRp7上存在的trp1基因(Stinchcomb等，Nature，282：39(1979))。trp1基因可为不能在色氨酸中生长的酵母的突变株提供筛选标志物，例如，ATCC No.44076或PEP4-1。Jones，Genetics，85：12(1977)。因此，酵母宿主细胞基因组内存在的trp1损伤为检测转化提供了一个有效环境，其中酵母可在缺乏色氨酸的条件下生长。同样，缺乏Leu2的酵母细胞系(ATCC 20,622或38,626)可被已知的携带Leu2基因的质粒弥补。缺乏Ura3的酵母细胞系可被携带ura3基因的质粒弥补。
另外，1.6.mu.m环状质粒pKD1来源的载体可用于转化克鲁维酵母。另外，利用乳酸克鲁维酵母表达系统大规模制备重组牛凝乳酶也已有报道。Van denBerg，Bio/Technology，8：135(1990)。文献还公开过利用稳定的多拷贝表达载体和克鲁维酵母的工业化细胞系分泌成熟的重组人血清白蛋白。Fleer等，Bio/Technology，9：968-975(1991)。
(4)启动子组件
表达和克隆载体一般都包含能被宿主有机体识别并与抗体编码核酸可操控连接的启动子。适用于原核宿主的启动子包括阿拉伯糖启动子(例如，araB)、phoA启动子、β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统以及杂合启动子如tac启动子。但是其他已知的细菌启动子也可以使用。适用于细菌系统的启动子还包含与编码本发明抗体的DNA可操控连接的夏因-达尔加诺(S.D.)序列。
真核细胞的启动子序列是已知的。几乎所有的真核细胞基因都有AT富含区，该区位于转录起始位点上游约25到30个碱基处。位于许多基因的转录起始位点上游70到80个碱基处的另一种序列是CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。在大多数真核基因的3’末端是AATAAA序列，这一序列可能是在编码序列3’末端添加多聚腺苷酸尾巴的信号。所有这些序列都适于插入到真核表达载体内。
可用于酵母宿主的合适启动序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶或其他酵解酶如烯醇化酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、三磷酸异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡萄糖激酶的启动子。
其他酵母启动子包括乙醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢相关的降解酶、金属硫蛋白、3-磷酸甘油醛脱氢酶以及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区，这些启动子是可诱导启动子，具有可通过培养条件控制转录的额外优势。适用于酵母表达的载体和启动子在EP 73,657中有进一步描述。酵母启动子优选与酵母增强子联合使用。
在哺乳动物宿主细胞内，抗体从载体的转录是可控的，例如，通过病毒基因组来源的启动子以及哺乳动物异源启动子如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子、热休克蛋白启动子，只要这种启动子与宿主细胞系统相容，其中病毒的例子有艾贝尔逊(氏)白血病病毒、多瘤病毒、鸡痘病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳头状瘤病毒、鸟类肉瘤病毒，最优选的是巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒、猿猴病毒40(SV40)。
SV40病毒的早期和晚期启动子作为SV40的限制性酶切片段可以很方便的获得，其中还包含SV40的复制起始位点。人巨细胞病毒的立即早期启动子作为Hind III E限制性酶切片段可以很方便地获得。美国专利号4,419,446公开了利用牛乳头状瘤病毒为载体的在哺乳动物宿主内表达DNA的系统。美国专利号4,601,978描述了对该系统的修饰。也可参见Reyes等，Nature297：598-601(1982)所描述的在单纯疱疹胸苷激酶启动子的控制之下人β干扰素cDNA在小鼠细胞内的表达。另外，鲁斯氏肉瘤病毒长末端重复序列也可用作启动子。
(5)增强子组件
通过在载体内插入增强子序列通常会增强编码本发明抗体的DNA在较高级的真核细胞内的转录。现在已知有许多哺乳动物基因(珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)来源的增强子序列。但是，人们通常使用真核细胞病毒来源的增强子。其中的例子包括位于复制起始位点后侧(100-270bp)的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、位于复制起始位点后侧的多瘤病毒增强子以及腺病毒增强子。也可参见Yaniv，Nature 297：17-18(1982)所描述的用于活化真核启动子的增强子元件。增强子可被插入到载体内抗体编码序列的3’或5’位置，但是优选位于启动子的5’位置。
(6)转录终止组件
真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或其他多细胞有机体来源的有核细胞)所使用的表达载体还包含终止转录以及稳定mRNA所必需的序列。这种序列通常位于真核或病毒DNA或cDNA的5’非翻译区，偶尔也会位于3’非翻译区。这些区包含转录成多聚腺苷酸片段的核苷酸片段，位于编码抗体的mRNA的非翻译部分内。一个有用的转录终止元件是牛生长激素多聚腺苷酸区。参见WO94/11026及其公开的表达载体。另一种是小鼠免疫球蛋白轻链转录终止子。
(7)宿主细胞的筛选和转化
可用于克隆或表达本文所述的载体内的DNA的合适宿主细胞包括上述原核细胞、酵母或较高级的真核细胞。用于此目的的合适原核细胞包括真细菌，如革兰氏阴性或革兰氏阳性有机体，例如，肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的细菌，如埃希氏杆菌属(Escherichia)的细菌如大肠杆菌(E.coli)，肠道细菌属(Enterobacter)的细菌、欧文氏菌属(Erwinia)的细菌、克雷白氏杆菌属(Klebsiella)的细菌、变形杆菌属(Proteus)的细菌、沙门氏菌属(Salmonella)的细菌如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、沙雷氏菌属(Serratia)的细菌如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)和志贺氏菌属(Shigella)的细菌，以及杆菌(Bacilli)如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(例如，1989年4月12日公开的DD 266,710所述的地衣芽孢杆菌)，假单胞菌属(Pseudomonas)的细菌如绿脓杆菌(P.aeruginosa)，和链霉菌属(Streptomyces)的细菌。一个优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC 31,446)，尽管其他株如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌W3110(ATCC 27,325)也适用。这些实施例是说明性的，而不是限制性的。除了原核细胞以外，真核微生物如丝状真菌或酵母也是抗体编码载体的合适克隆或表达宿主。酿酒酵母或常见的发面酵母是最常用的低级真核宿主微生物。但是，其他属、种和株也是常用的，也可用于本发明，如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母(Kluyveromyce)宿主如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)，脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)，保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)，K.wickeramii(ATCC 24,178)，K.waltii(ATCC 56,500)，K.drosophilarum(ATCC36,906)，耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)以及马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)；耶氏酵母(yarrowia)(EP 402,226)；毕赤酵母(Pichia pastors)(EP183,070)；念珠菌属(Candida)；木霉(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗糙链孢霉(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)如西方许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)；以及丝状真菌如链孢霉属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉(Tolypocladium)；以及曲霉属(Aspergillus)宿主如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。
适用于表达糖基化抗体的宿主细胞来源于多细胞生物。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。许多杆状病毒株及其突变株和来源于宿主如草地贪夜蛾(毛虫)、埃及伊蚊(蚊子)、白纹伊蚊(蚊子)、黑腹果蝇(果蝇)和家蚕的相应昆虫允许宿主细胞都已被鉴定。用于转染的许多病毒株都是公开的，例如苜蓿银纹夜蛾NPV的L-1突变株和家蚕NPV的Bm-5株，这种病毒可用作本发发明的病毒，特别是用于转染草地贪夜蛾细胞。
棉花、玉米、土豆、大豆、牵牛花、西红柿、烟草、浮萍和其他植物细胞的培养物也可用作宿主。
但是，最感兴趣的是脊椎动物细胞，在培养物(组织培养物)中繁殖脊椎动物细胞已经成为常规方法。可使用的哺乳动物细胞的例子有中国仓鼠卵巢细胞，其中包括CHOK1细胞(ATCC CCL61)、DXB-11、DG-44和中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：4216(1980))；转化SV40的猴肾CV1细胞系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚胎肾细胞系(可在悬浮培养物中生长的293或293亚克隆细胞[Graham等，J.Gen Virol.，36：59(1977)])；幼儿仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；小鼠塞尔托利氏细胞(IM4，Mather，Biol.Reprod.，23：243-251(1980))；猴肾细胞(CV1，ATCC CCL70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB8065)；小鼠乳房肿瘤细胞系(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982))；MRC5细胞；FS4细胞；以及人肝细胞瘤细胞系(Hep G2)。
宿主细胞可用上述表达或克隆载体转化用于制备抗体，并在常规的营养培养基中培养，培养基可加以调整以便于诱导启动子、筛选转化子或扩增编码目的序列的基因。另外，可通过筛选标志分离的新载体和用多个拷贝的转录单位转染的细胞系是特别有用的，优选用于表达抗体。
(8)培养宿主细胞
用于制备本发明抗体的宿主细胞可在各种培养基内培养。商品化的培养基如Ham′s F10(Sigma)、基本必需培养基(MEM)(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)以及达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(DMEM，Sigma)适用于培养宿主细胞。另外，Ham等，Meth.Enz.58：44(1979)；Barnes等，Anal.Biochem.102：255(1980)；美国申请号4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655或5,122,469；WO90/03430；WO 87/00195；或者美国专利登记号30,985所描述的培养基也可用于培养宿主细胞。所有这些培养基都必需添加激素和/或其他生长因子(例如，胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(例如，氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(例如，HEPES)、核苷酸(例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶)、抗生素(例如，庆大霉素药物)、微量元素(通常定义为最终浓度以微摩尔计的无机化合物)以及葡萄糖或等价的能量源。其他必需的添加物也可以适当的浓度添加，这是本领域技术人员所熟知的。培养条件如温度、pH等为上面筛选宿主细胞表达时所用的那些条件，也是本领域技术人员所熟知的。
(9)抗体的纯化
如果使用重组技术，抗体可在细胞内产生，如胞质周围空间，或直接分泌到培养基内，其中包括从微生物培养物中分泌。如果抗体在细胞内合成，那么作为第一步，要去除宿主细胞的特定碎片或裂解片段，例如，通过离心或超滤。Better等，Science 240：1041-1043(1988)；ICSU Short Reports(ICSU短报道)10：105(1990)；以及Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：457-461(1993)描述了一种分离分泌到大肠杆菌胞质周围空间的抗体的方法。(也可参见，[Carter等，Bio/Technology 10：163-167(1992)]。
从微生物或哺乳动物细胞制备的抗体组合物可通过，例如，羟磷灰石色谱、阳离子或阴离子交换层析和亲和层析纯化，其中亲和层析是优选的纯化技术。蛋白A是否合适作为亲和配基依赖于抗体的免疫球蛋白Fc区的种和同种型。基于人γ1、γ2或γ4重链，可用蛋白A纯化抗体(Lindmark等，J.Immunol.Meth.62：1-13(1983))。推荐使用蛋白G纯化所有小鼠同种型抗体和人γ3(Guss等，EMBO J.5：15671575(1986))。连接亲和性配基最常用的基质是琼脂糖，但是其他基质也可以使用。机械稳定性的基质如定孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯比琼脂糖更易达到较快的流速和较短的处理时间。如果抗体包含CH3区，那么可以利用Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，N.J.)进行纯化。根据所回收的抗体，用于蛋白纯化的其他技术如利用离子交换柱进行分级、乙醇沉淀、反相HPLC、硅层析、利用阳离子或阴离子交换树脂进行肝素SEPHAROSETM层析(例如聚天冬氨酸柱)、色谱聚焦、SDS-PAGE以及硫酸铵沉淀也可以使用。
嵌合抗体
啮齿类抗体单独或以偶联物的形式重复给予人体内可在受者体内产生抗啮齿类抗体的免疫反应；就是所谓的HAMA反应(人抗小鼠抗体)。如果需要重复给药，HAMA反应会限制药理效应。通过用亲水聚合物如聚乙二醇化学修饰抗体或者通过利用基因工程方法制备结构更类似人抗体的抗体如嵌合抗体、人源化抗体、人抗体或Human EngineeredTM抗体(人基因工程抗体)可降低抗体的免疫原性。由于这种基因工程抗体在人体内的免疫原性比亲本小鼠单克隆抗体低，因此它们用于治疗人时产生过敏反应的风险会大大降低。因此，这些抗体在用于治疗时是优选的，其中包括用于人体内。
嵌合单克隆抗体中小鼠单克隆抗体的可变Ig区被融合到人恒定Ig区上，利用本领域已知的方法可制备嵌合抗体(参见，Morrison，S.L.，等，(1984)“嵌合人抗体分子；小鼠抗原结合区与人恒定区”(Chimeric Human AntibodyMolecules；Mouse Antigen Binding Domains with Human Constant RegionDomains)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81，6841-6855；以及Boulianne，G.L.等，Nature 312，643-646.(1984))。例如，可结合CEA的啮齿类抗体的可变区基因序列可用人骨髓瘤蛋白的可变区取代，从而生成重组嵌合抗体。这些方法的细节参见EP 194276、EP 0120694、EP 0125023、EP 0171496、EP 0173494和WO86/01533。虽然某些嵌合的单克隆抗体已被证明在人体内具有较低的免疫原性，但是小鼠可变Ig区依然能导致明显的人抗鼠反应。
人源化抗体
人源化抗体可通过各种方法制备，其中包括，例如：(1)将非人补体决定区(CDR)嫁接到人框架区和恒定区上(这个过程在本领域中被称为通过“CDR嫁接”人源化)，或者(2)移植完整的非人可变区，但是通过替换表面残基从而用人样表面“遮蔽”非人可变区(这个过程在本领域中被称为“覆盖”)。在本发明中，人源化抗体包括“人源化的”抗体和“覆盖的”抗体。这些方法见于，例如Jones等，Nature 321：522 525(1986)；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，81：68516855(1984)；Morrison和Oi，Adv.Immunol.，44：65 92(1988)；Verhoeyer等，Science 239：1534 1536(1988)；Padlan，Molec.Immun.28：489 498(1991)；Padlan，Molec.Immunol.31(3)：169 217(1994)和Kettleborough，C.A.等，Protein Eng.4(7)：773 83(1991)的描述，本文已完整纳入参考。
例如，啮齿类抗体CDR的基因序列可以被分离出来，或者合成出来，并用同源人抗体基因的相应序列区取代，形成具有原始啮齿类抗体特异性的人抗体。这些方法见于EP 023940、WO 90/07861和WO91/09967的描述。
CDR嫁接包括将小鼠重链和轻链可变Ig区6个CDR中的一个或多个导入到人可变Ig区的四个合适框架区内，这也被称为CDR嫁接。这种技术(Riechmann，L.，等，Nature 332，323(1988))利用保守的框架区(FR1-FR4)作为支架支持主要与抗原接触的CDR环。但是，CDR嫁接的缺点在于产生的人源化抗体的结合亲和力明显低于原来的小鼠抗体，因为框架区氨基酸的主要功能在于抗原结合，以及因为CDR环的氨基酸会影响两个可变Ig区的联系。为了保持人源化单克隆抗体的亲和力，可以通过选择与原来小鼠抗体的框架区最相似的人框架区，或者根据抗原结合位点的计算机模型的帮助通过位点特异性突变框架区或CDR内的单个氨基酸来改善CDR嫁接技术(例如Co，M.S.，等，(1994)，J.Immunol.152，2968-2976)。
人源化抗体的一种方法包括将非人重链和轻链序列与人重链和轻链序列一起排列，根据排列的结果选择并用人框架区替换非人框架区，制作分子模型预测人源化抗体的构型并与亲本抗体的构型进行比较。然后重复回复突变CDR区内的残基以打破CDR的结构，直到人源化序列模型的预测构型非常接近亲本非人抗体的非人CDR的构型为止。这种人源化抗体还可以进一步衍化以促进摄取和清除，例如，通过Ashwell受体(参见，例如，美国申请号5,530,101和5,585,089，本文已纳入作为参考)。
通过合理设计已经完成了多种小鼠单克隆抗体的人源化(参见，例如，2002年7月11日公开的20020091240、WO 92/11018和美国专利No.，5,693,762、No.5,766,866)。
Human Engineered TM 抗体(人基因工程抗体)
术语“Human EngineeredTM抗体(人基因工程抗体)”是指来源于非人抗体，一般是小鼠单克隆抗体，的抗体。另外，Human EngineeredTM抗体(人基因工程抗体)可以来源于嵌合抗体，这种嵌合抗体保留或基本保留了亲本非人抗体的抗原结合特性，但是与亲本抗体相比在用于人体内时无免疫原性。
Studnicka已描述过抗体可变区的Human EngineeringTM(人基因工程化)[参见，例如，Studnicka等，美国专利号5,766,886；Studnicka等，Protein Engineering7：805-814(1994)]，这种方法可用于降低免疫原性，同时又能保持抗体分子的结合活性。根据该方法，每一个可变区氨基酸都被设定了取代的风险。根据风险不同氨基酸取代可分为三组：(1)低风险改变是破坏抗原结合活性的可能最小，并且最适合用于降低免疫原性的那些氨基酸；(2)中风险改变是虽然可被用于进一步降低免疫原性，但是有较大可能影响抗原结合或蛋白折叠的那些氨基酸；(3)高风险残基是对于结合或维持抗体结构具有重要作用并且最可能影响抗原结合或蛋白折叠的那些残基。由于脯氨酸在维持三维结构中的作用，通常认为在脯氨酸上进行修饰至少是中风险改变，即使该位置一般是低风险位置。
在预先确定不可能对抗原结合或蛋白折叠产生不良影响但是可能会降低抗体在人体环境中的免疫原性的位置上替换人氨基酸，这样啮齿类抗体的轻链和重链可变区就是人基因工程化的(Human EngineeredTM)。通过使啮齿类可变区的氨基酸序列与人可变区序列一起排列可以鉴定出处于“低风险”位置并且能够用本发明的方法进行修饰的氨基酸残基。所有人可变区都可以应用，其中包括独特的VH或VL序列、或者人共有VH或VL序列、或者独特的或共有的人种系序列。低风险位置上任意数目的氨基酸，或者全部氨基酸残基都可以被改变。例如，在每一个低风险位置上如果排列在一起的小鼠氨基酸残基和人氨基酸残基是不同的，那么就可以用人的残基取代啮齿类的残基。另外，所有低风险位置上的氨基酸残基以及任意数目的中风险位置上的氨基酸残基都可以被改变。理想的状况是，所有低风险和中风险位置都从啮齿类序列改变为人序列以达到最低程度的免疫原性。
构建包含修饰重链和/或轻链可变区的合成基因并连接到人γ重链和/或κ轻链恒定区。所有人重链和轻链恒定区都可用于连接Human EngineeredTM抗体(人基因工程抗体)可变区，其中包括IgA(所有亚类的IgA，如gA1或IgA2)、IgD、IgE、IgG(所有亚类的IgG，如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)或IgM。人重链和轻链可变区基因导入到宿主细胞如哺乳动物细胞内，收获产生出的重组免疫球蛋白产物并鉴定其特征。
来自于转基因动物的人抗体
利用转基因动物可以生产抗靶抗原的人抗体，其中转基因动物无内源性免疫球蛋白产生，并且经过基因工程改造包含人免疫球蛋白基因座。例如，WO98/24893公开了包含人Ig基因座的转基因动物，其中动物因为其内源性的重链和轻链基因座被灭活因而不产生功能性的内源性免疫球蛋白。WO 91/10741也公开了能够产生抗免疫原的免疫反应的非灵长类转基因哺乳动物宿主，其中抗体包含灵长类的恒定区和/或可变区，编码内源性免疫球蛋白的基因座被替换或被灭活。WO 96/30498公开了Cre/Lox系统在修饰哺乳动物免疫球蛋白基因座中的用途，例如替换全部或部分恒定区或可变区从而形成经修饰的抗体分子。WO 94/02602公开了包含灭活的内源性Ig基因座和功能性人Ig基因座的非人哺乳动物宿主。美国专利号5,939,598公开了制备转基因小鼠的方法，其中小鼠缺乏内源性重链，表达包含一个或多个异种恒定区的外源性免疫球蛋白基因座。
利用上述转基因动物可以诱导免疫反应以筛选抗原性分子，从动物体内收获抗体产生细胞，用于制备分泌人单克隆抗体的杂交瘤。免疫方法、佐剂等是本领域熟知的，可用于，例如，转基因小鼠的免疫，如WO 96/33735所述。这篇文献公开了抗各种抗原性分子如IL 6、IL 8、TNFa、人CD4、L选择素、gp39和破伤风毒素的单克隆抗体。检测单克隆抗体抑制或中和相应蛋白的生物学活性或生理效应的能力。WO 96/33735报道，来源于IL-8免疫转基因小鼠免疫细胞的抗IL-8单克隆抗体可阻断IL-8诱导的中性粒细胞的功能。用于免疫转基因动物的具有抗原特异性的人单克隆抗体还可见于WO 96/34096和美国专利申请号20030194404；以及美国专利申请号20030031667的描述。还可参见Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2551(1993)；Jakobovits等，Nature，362：255-258(1993)；Bruggermann等，Year in Immuno.，7：33(1993)；以及美国专利号5,591,669、美国专利号5,589,369、美国专利号5,545,807；和美国专利申请号20020199213、WO 96/34096以及美国专利申请号20030194404；和美国专利申请号20030031667。
可用于制备单克隆抗体的其他转基因动物包括美国专利号5,770,429和Fishwild，等，(Nat.Biotechnol.14：845-851，1996)所描述的MedarexHuMAb-MOUSE，该动物包含来源于未重排人抗体基因的基因序列，其中的人抗体基因编码人抗体的重链和轻链。免疫HuMAb-MOUSE
Figure G2007800302847D00452
可产生抗靶蛋白的单克隆抗体。
另外，Ishida等(Cloning Stem Cells.4：91-102，2002)描述了TransChromoMouse(转染色体小鼠)(TCMOUSETM)，这种动物包含人DNA的Mb大小的片段，插入了完整的人免疫球蛋白(hIg)基因座。TCMOUSE包含hIg的全部多样性谱，其中包括IgG的亚类(IgG1-G4)。用各种人抗体免疫TC Mouse可产生包含人抗体的抗体反应。
美国专利申请号20030092125描述了使动物的免疫反应偏向于目的表位的方法。人抗体也可以通过在体外活化B细胞来制备(参见美国申请号5,567,610和5,229,275)。
来自于噬菌体展示技术的抗体
制备重组人抗体基因谱技术以及在丝状噬菌体表面展示编码抗体片段的技术的发展为我们提供了一种直接制备和筛选人抗体的重组方式，这种技术还可用于人源化的、嵌合的、小鼠的或突变的抗体。通过噬菌体技术制备的抗体是作为细菌内的抗原结合片段，通常是Fv或Fab片段而产生的，因此缺少效应功能。效应功能可通过两种策略之一引入：片段被改造成可在哺乳动物细胞内表达的完整抗体，或者被改造成包含能激发效应功能的第二结合位点的双特异性抗体片段。
一般而言，抗体的Fd片段(VH-CH1)和轻链(VL-CL)分别通过PCR克隆，然后随机重组到组合噬菌体展示文库中，然后根据与特定抗原的结合来筛选文库。Fab片段表达在噬菌体表面，即，与编码它们的基因物理相连。因此，通过抗原结合来筛选Fab的同时也筛选了编码Fab的序列，后者可随后进行扩增。经过几轮的抗原结合和重复扩增就可以富集并最终分离出抗原特异性的Fab，这一过程被称为淘洗。
在1994年，报道了一种被称为“引导筛选”的抗体人源化方法。引导筛选利用噬菌体展示技术人源化小鼠单克隆抗体(参见Jespers，L.S.，等，Bio/Technology 12，899-903(1994))。为了达到此目的，小鼠单克隆抗体的Fd片段与人轻链文库一起展示，得到的杂合Fab文库用抗原进行筛选。因而小鼠的Fab片段为引导筛选提供了一个模板。随后，筛选出的人轻链与人Fd片段文库结合。筛选所得到的文库就可以获得完整的人Fab。
从噬菌体文库制备人抗体的各种方法都有报道(参见，例如，Hoogenboom等，J.Mol.Biol.，227：381(1991)；Marks等，J.Mol.Biol，222：581-597(1991)；美国申请号5,565,332和5,573,905；Clackson，T.和Wells，J.A.，TIBTECH 12，173-184(1994))。更具体地说，利用噬菌体文库体外筛选和基因工程抗体已经成为一种有效的工具(参见Burton，D.R.和Barbas III，C.F.，Adv.Immunol.57，191-280(1994)以及Winter，G.，等，Annu.Rev.Immunol.12，433-455(1994)；美国专利申请号20020004215和WO92/01047；2003年10月9日公开的美国专利申请号20030190317以及美国专利号6,054,287；美国专利号5,877,293)。
Watkins，“通过捕获提升筛选噬菌体表达的抗体文库”(“Screening ofPhage-Expressed Antibody Libraries by Capture Lift)，《分子生物学方法，抗体噬菌体展示：方法和操作手册》(Methods in Molecular Biology，Antibody PhageDisplay：Methods and Protocols)178：187-193以及2003年3月6日公开的美国专利申请号200120030044772描述了通过捕获提升(capture lift)筛选噬菌体表达抗体文库或其他结合分子的方法，该方法包括将候选结合分子固定在固相支持物上。
也可以利用本发明的治疗方法来筛选抗体产物的活性和适用性，如本文“筛选方法”部分所描述的方法以及本领域熟知的任何合适方法。
氨基酸序列突变体
本发明的抗体包括亲本抗体的突变型蛋白或突变体，其中亲本抗体的多肽序列被改变，可变区或与可变区等价的区域其中包括CDR内至少有一个氨基酸取代、缺失或插入，但是突变型蛋白或突变体依然保留了理想的结合亲和力或生物学活性。突变体可以与亲本抗体基本同源或基本一致，例如，至少65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸是一致的或同源的。有关这个序列的一致性或同源性在本文中被定义为，当序列排列在一起，如果需要可引入间隙，达到最大序列百分一致性后，保守取代不被当作是序列一致性的一部分，候选序列上与亲本序列一致的氨基酸参见所占的百分率。抗体序列的N端、C端或内部延伸、内部缺失或插入都被认为不会影响序列的一致性或同源性。因此，序列一致性可通过比较两个多肽的氨基酸位置的相似性常用的标准方法确定。利用计算机程序如BLAST或FASTA，将两个多肽排列在一起使其各自的氨基酸达到最佳匹配(在一个或两个序列的全长上，或者在一个或两个序列的预先确定区域)。这种程序提供了默认的缺口补偿和默认的间隙补偿，评分矩阵如PAM250[标准评分矩阵；Dayhoff等，《蛋白序列和结构图集》(Atlas of Protein Sequence and Structure)，第5卷，增刊3(1978)]可配合计算机程序一起使用。例如，百分一致性可按如下公式计算：匹配一致的总数/(匹配区间内较长序列的长度+为了排列两个序列而在较长序列内引入的间隙数)×100。
本发明的抗体还包括恒定区多肽序列的改变，这种改变不会影响结合亲和力但是会改变效应功能，如抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)、补体依赖的细胞毒作用(CDC)或清除和摄取(以及对半衰期的影响)。
插入
氨基酸序列插入包括氨基端和/或羧基端融合，长度范围从一个残基到包含100或100以上残基的多肽，以及单个或多个氨基酸残基如2、3或更多氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括带N端蛋氨酰残基的抗体，或与表位标签或补救受体表位融合的抗体。抗体分子的另一类插入突变体包括添加糖基化位点、添加形成分子内或分子间键的半胱氨酸、或与提高抗体血清半衰期的多肽融合，如融合到N端或C端。例如，半胱氨酸键可添加到抗体上以提高其稳定性(特别是当抗体是抗体片段如Fv片段时)。
抗体的糖基化通常是N-连接的或O-连接的。N-连接是指糖基基序连接到天冬酰胺残基的侧链上。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸是糖基基序经酶催化连接到天冬酰胺侧链上的识别序列，其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸。多肽上的这些三肽序列只要有一个存在就可以成为潜在的糖基化位点。因此，N-连接糖基化位点可以通过改变氨基酸序列使其包含一个或多个这种三肽序列添加到抗体上。O-连接糖基化是指一个糖基N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖连接到羟氨基酸上，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，尽管5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸也可以使用。O-连接糖基化位点可通过将一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基插入到原始抗体的序列上或者用一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基取代原始抗体的序列来添加到抗体上。
术语“附加的表位”是指融合到表位标签上的抗体。表位标签多肽有足够多的残基以提供表位从而可制造针对该表位的抗体，但是表位标签又很短，因此不会影响抗体的活性。优选的表位标签是十分独特的，这样抗该表位的抗体基本不与其他表位有交叉反应。适宜的表位标签多肽一般包含至少6个氨基酸残基，通常在约8-50个氨基酸残基之间(优选约9-30个残基)。表位标签的例子包括流感病毒血凝素标签多肽及其抗体12CA5[Field等，Mol.Cell.Biol.8：2159-2165(1988)]；c-myc标签及其8F9、3C7、6E10、G4、B7和9E10抗体[Evan等，Mol.Cell.Biol.5(12)：3610-3616(1985)]；以及单纯疱疹病毒糖蛋白D(gD)标签及其抗体[Paborsky等，Protein Engineering 3(6)：547-553(1990)]。其他典型的标签是多聚组氨酸序列，一般约6个组氨酸残基，利用镍螯合技术可以分离标记有这种标签的化合物。其他标记和标签如FLAG
Figure G2007800302847D00481
标签(纽约罗彻斯特柯达公司(Eastman Kodak，Rochester，NY))是本领域熟知和常用的，也包括在本发明的范围内。
在本文中，术语“补救受体结合表位”是指IgG分子(如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc区上的表位，负责提高IgG分子在体内的血清半衰期。
缺失
氨基酸序列缺失包括长度从1个到100或100个以上残基的氨基端和/或羧基端缺失，但是得到的片段还保留对靶抗原的结合亲和力，以及单个或多个氨基酸残基如2、3或更多氨基酸残基的序列内缺失。例如，通过缺失糖基化的部分或全部三肽序列或其他识别序列来删除糖基化位点或者将糖基化位点转移到其他位置。
取代
另一类突变体是氨基酸取代突变。在这些突变体中，抗体分子的至少一个氨基酸残基被去除，同时在其位置上插入了另一个不同的残基。本发明包括超级可变区或CDR区或框架区内的取代突变。保守取代列于下面的表1中。如果这种取代不会导致生物活性的改变，则可以引入表1中被称为“典型取代”的更多实质改变或者在下文氨基酸分类部分所进一步描述的更多实质改变，并且用于产物筛选。
表1
起始残基    典型取代                   优选取代
Ala(A)      val；leu；ile              val
Arg(R)      lys；gln；asn              lys
Asn(N)      gln；his；asp，lys；gln    arg
Asp(D)      glu；asn                   glu
Cys(C)      ser；ala                   ser
Gln(Q)      asn；glu                   asn
Glu(E)      asp；gln                   asp
Gly(G)      ala
His(H)      asn；gln；lys；arg
Ile(I)      leu；val；met；ala；       leu
            phe；                      正亮氨酸
Leu(L)      norleucine；ile；val；     ile
            met；ala；phe
Lys(K)      arg；gln；asn              arg
Met(M)      leu；phe；ile              leu
Phe(F)      leu；val；ile；ala；tyr
Pro(P)      ala
Ser(S)      thr
Thr(T)      ser                        ser
Trp(W)      tyr；phe                   tyr
Tyr(Y)      trp；phe；thr；ser         phe
Val(V)      ile；leu；met；phe；       leu
            ala；正亮氨酸
抗体生物学特性的实质改变可通过筛选取代来完成，其中的取代在以下方面具有明显不同的效应：(a)维持取代区多肽骨架的结构，例如，形成折叠或螺旋构型，(b)维持分子在靶位上的电荷或疏水性，或(c)维持侧链的松散性(bulk)。天然残基根据常见的侧链特性可分成以下几组：
(1)疏水性的：正亮氨酸，met，ala，val，leu，ile；
(2)中性亲水性的：cys，ser，thr；
(3)酸性的：asp，glu；
(4)碱性的：asn，gln，his，lys，arg；
(5)影响侧链方向的残基：gly，pro；以及
(6)芳香族残基：trp，tyr，phe。
保守取代包括用同一类氨基酸中的其他成员取代该氨基酸。非保守取代包括用另一类氨基酸的成员取代这些类中一类的成员。
不参与维持抗体正确构型的所有半胱氨酸残基都可以被取代，一般是用丝氨酸取代，以改善分子的氧化稳定性，阻止异常交联发生。
亲和力成熟通常包括制备和筛选亲本抗体CDR内有取代的抗体突变体以及筛选生物学特性如结合亲和力比亲本抗体高的突变体。制备这种取代突变体的一种简便方法是利用噬菌体展示技术进行亲和力成熟。简言之，突变几个超级可变区位点(例如，6-7个位点)以使每个位点上都包含所有可能的氨基酸取代。然后将制备出的抗体突变体与包裹在每个丝状噬菌体颗粒内的M13的基因III产物融合并以单价方式展示在噬菌体颗粒上。然后再根据生物学活性(例如，结合亲和力)筛选噬菌体展示的突变体。参见，例如，WO 92/01047、WO93/112366、WO 95/15388和WO 93/19172。
目前所用的抗体亲和力成熟方法属于两类突变技术：随机的和非随机的。易错PCR、诱变菌株(Low等，J.Mol.Biol.260，359-68，1996)和饱和突变(Nishimiya等，J.Biol.Chem.275：12813-20，2000；Chowdhury，P.S.，MethodsMol.Biol.178，269-85，2002)属于典型的随机突变方法(Rajpal等，Proc NatlAcad Sci USA.102：8466-71，2005)。非随机突变技术通常利用丙氨酸扫描或位点特异性突变制备有限的特异性突变体群。某些方法将在下文作进一步描述。
通过淘洗方法进行亲和力成熟-重组抗体的亲和力成熟通常通过几轮淘洗候选抗体来完成，随着淘洗轮次的增加抗原数量逐渐减少。每一轮抗原数量的减少都会筛选出具有最高抗原亲和力的抗体，从而可以从一大群起始材料中得到具有高亲和力的抗体。通过淘洗进行亲和力成熟是本领域所述的，可见于，例如，Huls等，(Cancer Immunol Immunother.50：163-71，2001)的描述。利用噬菌体展示技术进行亲和力成熟的方法在本文的其他地方也有描述，也是本领域所熟知的(参见，例如，Daugherty等，Proc Natl Acad Sci USA.97：2029-34，2000)。
精确突变(Look-through mutagenesis)-精确突变(LTM)(Rajpal等，ProcNatl Acad Sci USA.102：8466-71，2005)提供了一种快速绘制抗体结合位点地图的方法。在LTM中，代表20种天然氨基酸所提供的主要侧链化学的9种氨基酸被用于分析在抗体所有6个CDR的每一个位置上功能侧链对结合的贡献大小。LTM可在CDR内产生一系列单突变，其中每一个“野生型”残基都被所选出的9个氨基酸中的一个有组织的取代。突变的CDR组合在一起就形成了复杂性和容量不断增加但不会妨碍所用突变体定量展示的组合单链可变区片段(scFv)文库。经过正筛选以后，结合活性升高的克隆测序，绘制出有益的突变。
易错PCR-易错PCR包括不同筛选轮次之间的核酸的随机化。由聚合酶内源性出错频率导致的随机化发生率很低，但是在转录期间使用具有高内源性出错率的聚合物(Hawkins等，J Mol Biol.226：889-96，1992)进行易错PCR可提高随机化发生率(Zaccolo等，J.Mol.Biol.285：775-783，1999)。经过多个突变循环以后，利用本领域的常规方法可以筛选出抗原亲和力升高的克隆。
DNA改组-核酸改组是一种在体内或体外同源重组一群较短的或较小的多聚核苷酸以制备突变多聚核苷酸的方法。DNA改组可见于美国专利号6,605,449、美国专利6,489,145、WO 02/092780和Stemmer，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91：10747-51(1994)的描述。一般而言，DNA改组包括三步：用DNA酶I将需要改组的基因片段化，片段随机杂交并在DNA聚合酶存在的条件下通过PCR(有性PCR)装配或填充片段化的基因，以及通过常规PCR扩增重新装配的产物。
DNA改组与易错PCR不同，后者是反向链式反应。在易错PCR中，聚合酶起始位点数目和分子数量呈指数升高。与之相反，在核酸重装配或随机多聚核苷酸改组中，起始位点的数目和随机多聚核苷酸的数目(而不是大小)随时间延长而减少。
对于抗体来说，DNA改组可以使所有的CDR1、所有的CDR2和所有的CDR3自由组合连接。值得注意的是，在同一个反应中，多个家族的序列可以同时被改组。另外，改组通常具有相当次序，因此，例如，CDR1一般不会出现在CDR2的位置。稀有的改组子包含大量的上佳(例如，最高亲和力的)CDR，这些稀有改组子可根据其超级亲和力进行筛选。
可用于DNA改组的多聚核苷酸模板可以是DNA或RNA。根据被重组或重装配的基因或者较短或较小多聚核苷酸的大小，模板可以是各种长度的。优选的是，多聚核苷酸的长度为50bp到50kb。多聚核苷酸模板一般是双链。
值得注意的是，在基因筛选的起始步骤，包含与多聚核苷酸模板具有一致性的区以及与多聚核苷酸模板具有异质性的区的单链或双链核酸可被添加到多聚核苷酸模板上。还应当注意的是，在起始步骤中，两个不同但相关的多聚核苷酸模板可以混合在一起。
丙氨酸扫描突变-丙氨酸扫描突变可用于鉴定对抗原结合有明显影响的超级可变区残基。Cunningham和Wells(Science，244：1081-1085(1989))。残基或靶残基的基团被鉴定(例如，带电荷的残基如精氨酸、天冬氨酸、组氨酸、赖氨酸和谷氨酸)并被中性的或带负电荷的氨基酸(最优选丙氨酸或多聚丙氨酸)取代以影响氨基酸与抗原的相互作用。那些被证明对取代具有功能敏感性的氨基酸位置再通过在取代位点上进一步引入突变或引入其他突变来确认。因此，虽然引入氨基酸序列改变的位点要被预先确定，但是突变的本质性质无须预先确定。例如，为了分析给定位点上突变的表现，要在靶编码子或编码区上进行丙氨酸扫描或随机突变，然后筛选表达的具有理想活性的抗体突变体。
计算机辅助设计-另外，分析抗原-抗体复合物的晶体结构是有用的，晶体结构可用于鉴定抗体和抗原之间的接触点，或者用于通过计算机软件制作这种接触点的模型。这种接触残基及其邻近残基是利用本文所述的技术进行取代的候选残基。一旦制备出这样的突变体，就可以按照本文所述的方法筛选这一组突变体，筛选出在一个和多个相关分析中具有优越特性的抗体用于进一步的开发。
亲和力成熟通常包括制备和筛选亲本抗体CDR内有取代的抗体突变体以及筛选生物学特性如结合亲和力比亲本抗体高的突变体。制备这种取代突变体的一种简便方法是利用噬菌体展示技术进行亲和力成熟。简言之，突变几个超级可变区位点(例如，6-7个位点)以使每个位点上都包含所有可能的氨基酸取代。然后将制备出的抗体突变体与包裹在每个丝状噬菌体颗粒内的M13的基因III产物融合并以单价方式展示在噬菌体颗粒上。然后再根据生物学活性(例如，结合亲和力)筛选噬菌体展示的突变体。
丙氨酸扫描突变可用于鉴定对抗原结合有明显影响的超级可变区残基。另外，分析抗原-抗体复合物的晶体结构是有用的，晶体结构可用于鉴定抗体和抗原之间的接触点。这种接触残基及其邻近残基是利用本文所述的技术进行取代的候选残基。一旦制备出这样的突变体，就可以按照本文所述的方法筛选这一组突变体，筛选出在一个和多个相关分析中具有优越特性的抗体用于进一步的开发。
改变的效应功能
本发明还涉及抗体的其他修饰。修饰与效应功能有关的本发明的抗体是我们所期望的，例如，以此来增强抗体的癌症治疗效应。例如，半胱氨酸残基可以被引入到Fc区，从而允许在该区形成链间二硫键。因此，由此制备出的同源二聚体抗体的内化能力得以提高，和/或补体介导的细胞杀伤和抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)得以增强。参见Caron等，J.Exp Med.176：1191-1195(1992)和Shopes，B.J.Immunol.148：2918-2922(1992)。活性增强的同源二聚体抗体还可以用异源双功能交联子来制备，如Wolff等，Cancer Research 53：2560-2565(1993)的描述。另外，抗体可以经过改造使其包含两个Fc区，从而增强其补体裂解和ADCC能力。参见Stevenson等，Anti-Cancer Drug Design 3：219-230(1989)。另外，试验证明CDR内的序列可使抗体与MHC II类分子结合，激发不必要的辅助T细胞反应。保守取代可使抗体保留其结合活性，但是却丧失了激发不必要T细胞反应的能力。也可参见Steplewski等，Proc Natl Acad Sci USA.1988；85(13)：4852-6，本文已完整纳入作为参考，在该文献所描述的嵌合抗体中，小鼠的可变区与人的γ1、γ2、γ3和γ4恒定区相连。
在本发明的某些实施方式中，比较理想的是用抗体片段而不是完整抗体来增加肿瘤渗透性。在这种情况下，最好修饰抗体片段以提高其血清半衰期，例如，在抗体片段上添加分子如PEG或其他水溶性聚合物，其中包括多糖聚合物，以提高半衰期。也可以通过，例如，在抗体片段上插入补救受体结合表位来达到此目的(例如，通过突变抗体片段上的合适区域或者将表位插入到肽标签内然后融合到抗体片段的一端或者插入到抗体片段中间，例如，通过DNA或肽合成)(参见，例如，WO96/32478)。
补救受体结合表位优选组成一个区，在该区内来自于Fc区的一个或两个环的一个或多个氨基酸残基被转移到抗体片段的相似位置。更优选的是，转移Fc区的一个或两个环的3个或3个以上残基。更优选的是，表位来自于Fc区(如IgG的Fc区)的CH2区并被转移到CH1、CH3或VH区或者抗体的多个这样的区内。另外，表位来自于Fc区的CH2区并被转移到抗体片段的CL区或VL区，或者这两个区内。也可参见国际申请WO 97/34631和WO 96/32478，其中描述了Fc突变体及其与补救受体的相互作用。
因此，本发明的抗体可包含人Fc部分、人共有Fc部分或其突变体，其中突变体保留了与Fc补救受体相互作用的能力，这些突变体中参与形成二硫键的半胱氨酸被修饰或被去除，和/或蛋氨酸被添加在N端，和/或N端20个氨基酸中的一个或多个被删除，和/或与补体结合的区域如C1q结合位点被删除，和/或ADCC位点被删除[参见，例如，Molec.Immunol.29(5)：633-9(1992)]。IgG类的抗体也可以包含不同的恒定区，例如，IgG2抗体经修饰后具有了IgG1或IgG4的恒定区。
对于IgG1来说，对恒定区特别是铰链区或CH2区的修饰可增强或降低效应功能，其中包括ADCC和/或CDC活性。在其他实施方式中，IgG2恒定区经修饰后可降低抗体-抗原凝集物的形成。对于IgG4来说，对恒定区特别是铰链区的修饰可减少半抗体的形成。在特别典型的实施方式中，本发明涉及将IgG4铰链区序列Cys-Pro-Ser-Cys突变成IgG1铰链区序列Cys-Pro-Pro-Cys。
以前的研究已经绘制出了人和小鼠IgG上的FcR结合位点的地图，这些位点主要位于低铰链区，由IgG残基233-239组成。其他研究结果表明，另外一些片段，例如，Gly316-Lys338用于结合人Fc受体I，Lys274-Arg301和Tyr407-Arg416用于结合人Fc受体III，或者在低铰链区之外有几个特殊的残基，例如小鼠IgG2b的Asn297和Glu318与小鼠Fc受体II相互作用。文献报道的人IgG1 Fc片段与人Fc受体IIIA结合的3.2-
Figure G2007800302847D00541
晶体结构说明IgG1残基Leu234-Ser239、Asp265-Glu269、Asn297-Thr299和Ala327-Ile332参与和Fc受体IIIA的结合。该研究根据晶体结构证明，除了低铰链区(Leu234-Gly237)，IgGCH2区环FG(残基326-330)和BC(残基265-271)可能在与Fc受体IIA结合时发挥关键作用。参见Shields等，J.Biol.Chem.，276(9)：6591-6604(2001)，本文已完整纳入作为参考。Fc受体结合位点内的残基突变可导致效应功能的改变，例如ADCC或CDC活性的改变，或者半衰期的改变。如上所述，有效突变包括一个和多个残基的插入、缺失或取代，其中包括丙氨酸的取代、保守取代、非保守取代或用不同IgG亚类同一位置上的相应氨基酸残基的取代(例如，用IgG2该位置的相应残基取代IgG1的残基)。
Shields等报道，参与结合所有人Fc受体的IgG1残基定位于靠近铰链区的CH2区，可分为如下两类：1)与所有FcR直接相互作用的位置，其中包括Leu234-Pro238、Ala327和Pro329(可能还有Asp265；2)影响糖链性质的位置或者包含Asp265和Asn297的位置。影响与Fc受体II结合的其他IgG1残基还有(影响最大的)Arg255、Thr256、Glu258、Ser267、Asp270、Glu272、Asp280、Arg292、Ser298，以及(影响较小的)His268、Asn276、His285、Asn286、Lys290、Gln295、Arg301、Thr307、Leu309、Asn315、Lys322、Lys326、Pro331、Ser337、Ala339、Ala378和Lys414。A327Q、A327S、P329A、D265A和D270A抑制结合。除了已鉴定出的影响结合所有FcR的上述结合以外，可使Fc受体IIIA结合下降40％或更多的其他IgG1残基有：Ser239、Ser267(只有Gly)、His268、Glu293、Gln295、Tyr296、Arg301、Val303、Lys338和Asp376。与FcRIIIA的结合活性提高的突变包括T256A、K290A、S298A、E333A、K334A和A339T。试验证明，Lys414突变可使与FcRIIA和FcRIIB的结合活性下降40％，Arg416突变可使与FcRIIA和FcRIIIA的结合活性下降30％，Gln419突变可使与FcRIIA的结合活性下降30％，与FcRIIB的结合活性下降40％，以及Lys360突变可使与FcRIIIA的结合活性升高23％。也可参见Presta等，Biochem.Soc.Trans.(2001)30，487-490。
例如，美国专利号6,194,551，本文已完整纳入作为参考，描述了效应功能发生改变的突变体，该突变体的人IgG Fc区的329、331或322位(根据Kabat编号)氨基酸发生了突变，其中某些突变显示可降低C1q结合活性或CDC活性。作为另一个例子，美国专利号6,737,056，本文已完整纳入作为参考，描述了效应功能或Fcγ受体结合活性发生改变的突变体，其中的突变发生在人IgG Fc区的238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439位氨基酸(根据Kabat编号)，某些突变体显示出了与ADCC或CDC活性下降相关的受体结合特征。在这些突变中，238、265、269、270、327或329位氨基酸的突变可降低突变体与FCRI的结合活性，238、265、269、270、292、294、295、298、303、324、327、329、333、335、338、373、376、414、416、419、435、438或439位氨基酸的突变可降低突变体与FCRII的结合活性，以及238、239、248、249、252、254、265、268、269、270、272、278、289、293、294、295、296、301、303、322、327、329、338、340、373、376、382、388、389、416、434、435或437位氨基酸的突变可降低突变体与FCRIII的结合活性。
美国专利号5,624,821报道，本文已完整纳入作为参考，小鼠抗体的CIq结合活性可通过突变重链的氨基酸残基318、320或322来改变，取代残基297(Asn)可导致溶解活性消失。
美国专利申请出版号20040132101，本文已纳入作为参考，描述了在240、244、245、247、262、263、266、299、313、325、328或332位(根据Kabat编号)，或者234、235、239、240、241、243、244、245、247、262、263、264、265、266、267、269、296、297、298、299、313、325、327、328、329、330或332位(根据Kabat编号)包含突变的突变体，234、235、239、240、241、243、244、245、247、262、263、264、265、266、267、269、296、297、298、299、313、325、327、328、329、330或332位的突变可降低抗体的ADCC活性或降低抗体与Fcγ受体结合的能力。
Chappel等，Proc Natl Acad Sci USA.1991；88(20)：9036-40报道，本文已完整纳入作为参考，IgG1的嗜细胞活性是其重链CH2区的内在特性。IgG1的234-237位氨基酸中任一氨基酸的单点突变都可以明显降低甚至消除其活性。将IgG1残基234-237(LLGG)都取代成IgG2和IgG4是恢复完整结合活性所必须的。实验证明包含完整ELLGGP序列(残基233-238)的IgG2抗体比野生型IgG1的活性更高。
Isaacs等，J Immunol.1998；161(8)：3862-9报道，FcγR结合关键基序内的突变(谷氨酰胺233突变成脯氨酸，亮氨酸/苯丙氨酸234突变成缬氨酸，亮氨酸235突变成丙氨酸)可完全阻断靶细胞的杀伤。谷氨酰胺318突变成丙氨酸可消除小鼠IgG2b的效应功能，也能降低人IgG4的活性。
Armour等，Mol Immunol.2003；40(9)：585-93，本文已完整纳入作为参考，鉴定了IgG1突变体，该突变体与活化受体FcγRIIa反应的活性比野生型IgG1至少低10倍，但是与抑制性受体FcγRIIb结合的能力只下降4倍。突变还发生在氨基酸233-236区和/或327、330和331位氨基酸上。也可参见WO 99/58572，本文已完整纳入作为参考。
Xu等，J Biol Chem.1994；269(5)：3469-74报道，本文已完整纳入作为参考，将IgG1 Pro331突变成丝氨酸可显著降低C1q结合活性，并且能基本消除抗体的溶解活性。相反，用Pro取代IgG4的Ser331只能将部分溶解活性(40％)赋予IgG4 Pro331突变体。
Schuurman等，Mol Immunol.2001；38(1)：1-8报道，本文已完整纳入作为参考，将参与重链内键形成的一个铰链区半胱氨酸Cys226突变成丝氨酸可使重链内的连接更稳定。将IgG4铰链区序列Cys-Pro-Ser-Cys突变成IgG1铰链区序列Cys-Pro-Pro-Cys也能够明显稳定重链之间的共价连接。
Angal等，Mol Immunol.1993；30(1)：105-8报道，本文已完整纳入作为参考，与原始的嵌合IgG4相比，将IgG4内241位的丝氨酸突变成脯氨酸(在IgG1和IgG2的相应位置上是脯氨酸)可导致匀质抗体产生、血清半衰期延长以及组织分布得以改善。
本发明还涉及因糖链结构改变而导致效应活性发生改变的抗体分子的制备，其中包括缺少岩藻糖基化或岩藻糖基化程度降低的抗体分子，这种抗体分子的ADCC活性升高。本领域的多种方法都可以实现这一目的。例如，ADCC效应活性是由抗体分子与FcγRIII受体的结合介导的，研究发现其结合依赖于CH2区Asn-297位置上N连接糖基化的糖链结构。非岩藻糖基化的抗体与这个受体的结合亲和力提高，比天然的岩藻糖基化抗体相比能更有效地激发FcγRIII-介导的效应功能。例如，利用重组方法在α-1，6-岩藻糖基转移酶被敲除的CHO细胞内制备非岩藻糖基化的抗体可得到ADCC活性升高100倍的抗体[Yamane-Ohnuki等，Biotechnol Bioeng.2004 Sep 5；87(5)：614-22]。通过降低岩藻糖基化通路的这个酶或其他酶的活性也可以达到同样的效应，例如，通过siRNA或反义RNA处理、改造细胞系以敲除酶、或者用特异性糖基化抑制性培养[Rothman等，Mol Immunol.1989 Dec；26(12)：1113-23]。某些宿主细胞系如Lec13或大鼠杂交瘤细胞系YB2/0可天然地产生低岩藻糖基化水平的抗体。Shields等，J Biol Chem.2002 Jul 26；277(30)：26733-40；Shinkawa等，J Biol Chem.2003 Jan 31；278(5)：3466-73。试验证明，提高双叉糖链的水平，例如，通过在过量表达GnTIII酶的细胞内重组制备抗体，也能够提高抗体的ADCC活性。Umana等，Nat Biotechnol.1999 Feb；17(2)：176-80。据预测，两个岩藻糖残基中仅仅缺少一个就足以提高抗体的ADCC活性。Ferrara等，J Biol Chem.2005-12-5；[印刷前的电子出版物]
其他共价修饰
抗体的共价修饰也包括在本发明的范围之内。如果适用的话，共价修饰可通过化学合成或通过抗体的酶催化或化学裂解实现。抗体其他类型的共价修饰可通过抗体的靶氨基酸残基与能和特定侧链或N端或C端残基发生反应的有机衍生试剂发生反应而导入到分子内。
最常见的是半胱氨酸残基与α-卤素乙酸盐(及相应的胺)如氯乙酸或氯乙酰胺反应形成羧甲基或羧胺甲基衍生物。半胱氨酸残基也可以通过与溴代三氟乙酸、α-溴-β-(5-咪唑)丙酸、磷酸氯乙酰、3-氮-2-吡啶二硫化物、甲基-2-吡啶二硫化物、p-氯汞苯甲酸、2-氯汞基-4-硝基酚或氯-7-硝基苯-2-氧杂-1，3-二唑反应来生成。
组氨酰残基可通过与焦碳酸二乙酯在pH5.5-7.0的条件下反应来衍生，因为这个试剂对组氨酰侧链有相对的特异性。对溴苯酰甲基溴也可以适用；反应优选在pH6.0的0.1M二甲胂酸钠中进行。
赖氨酰残基和氨基端残基可与琥珀酸酐或其他羧酸酸酐反应。利用这些试剂进行衍生可对赖氨酰残基的电荷产生反向效应。适于衍生含α氨基残基的试剂包括亚氨酸酯类如吡啶甲酸亚胺甲酯(methyl picolinimidate)、磷酸吡哆醛、氢硼化氯(chloroborohydride)、三硝基苯磺酸、O-甲基异脲、2，4-戊二酮和转氨酶催化的与乙醛酸的反应。
精氨酰残基可通过与一种或几种常规试剂反应来修饰，其中包括苯甲酰甲醛、2，3-丁二酮、1，2-环己二酮和茚三酮。精氨酸残基的衍生需要在碱性条件下进行反应，因为胍功能基团具有较高的pKa。另外，这些试剂可与赖氨酸的基团以及精氨酸ε-氨基反应。
为了特定的目的可以对酪氨酰残基进行特殊修饰，例如，为了将光谱标签导入到酪氨酰残基内，可以和芳香族重氮化合物或四硝基甲烷反应。最常见的是N-乙酰咪唑(N-acetylimidizole)和四硝基甲烷用于分别形成O-乙酰酪氨酰残基和3-硝基衍生物。酪氨酰残基用125I或131I碘化后形成标记蛋白，可用于放免分析。
羧基侧链基团(天冬氨酰或谷氨酰基)可通过与碳二亚胺类(R-N＝C＝N-R′)反应进行特异性的修饰，其中R和R’是不同的烷基，如1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳二亚胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4，4-二甲基苯基)碳二亚胺。另外，天冬氨酰和谷氨酰残基可通过与铵离子反应而转化成天冬酰胺和谷氨酰胺残基。
谷氨酰胺和天冬酰胺残基常常会脱去酰胺基分别形成相应的谷氨酰和天冬氨酰残基。这些残基在中性或碱性条件下脱去酰胺基。这些残基的脱酰胺基形式也包括在本发明的范围之内。
其他修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟化、丝氨酰和苏氨酰残基羟基的磷酸化、赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α氨基的甲基化(T.E.Creighton，《蛋白质：结构和分子特性》(Proteins：Structure and Molecular Properties)，洛杉矶WHF公司(W.H.Freeman & Co.，San Francisco)，79-86页(1983))、N端氨基的乙酰化以及任一C端羧基的酰胺化。
另一类共价修饰包括在抗体上化学或酶催化偶联糖苷。这些方法的优点在于不需要在具有N-或O-糖基化能力的宿主细胞内制备抗体。根据所使用的偶联模式，糖可被连接到(a)精氨酸和组氨酸，(b)游离羧基，(c)游离巯基如半胱氨酸的那些巯基，(d)游离羟基如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的那些游离羟基，或者(f)谷氨酰胺的氨基上。这些方法可见于1987年11月11日公开的WO87/05330以及Aplin和Wriston，CRC Crit.Rev.Biochem.，59-306页(1981)的描述。
利用化学方法或酶催化方法可以去除抗体上所有的糖链基序。化学去糖基化需要将抗体暴露于三氟甲烷磺酸或其等价化合物中。这种处理可将除连接糖基(N-乙酰葡萄糖胺或N-乙酰半乳糖胺)之外的大部分或所有糖基裂解，但是依然能保持抗体的完整性。化学去糖基化的方法可见于Hakimuddin，等，Arch.Biochem.Biophys.259：52(1987)和Edge等，Anal.Biochem.，118：131(1981)的描述。酶催化裂解抗体上的糖链基序可通过使用各种内源性和外源性糖苷酶来实现，如Thotakura等，Meth.Enzymol.138：350(1987)所述。
抗体的另一类共价修饰包括将抗体连接到各种非蛋白聚合物上，例如，聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧乙基多元醇、聚氧乙基山梨醇、聚氧乙基葡萄糖、聚氧乙基甘油、聚氧乙烯或多糖聚合物如葡聚糖。这种方法是本领域熟知的，参见，例如，美国申请号4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192；4,179,337；4,766,106；4,179,337；4,495,285；4,609,546或EP 315 456。
每一个抗体分子可以连接一个或多个(即，1、2、3、4、5或更多)聚合物分子。聚合物分子优选通过连接子连接到抗体上。一般而言，聚合物可以是合成的或天然的聚合物，例如，任选取代直链或支链聚烯烃、聚氧烷烯聚合物、支链或非支链多糖，如同多糖和杂多糖。优选的聚合物是聚氧乙基多元醇和聚乙二醇(PEG)。PEG在室温下是水溶性的，通用化学式为R(O-CH2-CH2)nO-R，其中R是氢或保护性基团，如烷基或链烯醇基。优选的是，保护性基团含有1到8个碳原子，更优选的是甲基。符号n是正整数，优选1到1000，更优选2到500。优选的PEG是平均分子量为1000到40000的PEG，更优选的是2000到20000，最优选的是3000到12000。优选的是，PEG至少包含一个羟基，更优选的是包含末端羟基。这个羟基优选通过与抑制剂上的游离氨基反应而活化。但是，应当理解的是，活泼基团的类型和数量是可以变化的，只要能使PEG和本发明的抗体共价连接就可以。优选的聚合物以及将其连接到肽上的方法可见于美国申请号4,766,106；4,179,337；4,495,285和4,609,546，本文都已完整纳入作为参考。
基因治疗
治疗性抗体向合适细胞的转移可以通过使用本领域熟知的任何合适方法进行体外、原位或体内基因治疗来加以改变，其中包括通过使用DNA物理转移方法(例如，脂质体或化学处理)、或者通过使用病毒载体(例如，腺病毒、腺相关病毒或逆转录病毒)。例如，当进行体内治疗时，可将编码目的抗体的核酸单独或者与载体、脂质体或沉淀物一起注射到患者体内，在某些实施方式中，可以注射到需要抗体化合物在其中表达的部位。对于体外处理来说，取出患者的细胞，将核酸导入到这些细胞内，然后将修饰过的细胞直接或者用多孔膜包裹后回输到患者体内，其中包裹细胞的多孔膜可植入到患者体内。参见，例如，美国申请号4,892,538和5,283,187。目前有许多技术可用于将核酸导入到活细胞内。选择何种方法要根据核酸是转移到体外培养的细胞内还是转移到目的宿主体内的细胞内而定。适于将核酸转移到体外的哺乳动物细胞内的技术包括使用脂质体、电穿孔、微注射、细胞融合、DEAE-葡聚糖和钙磷酸盐沉淀。体外转移核酸的常用载体是逆转录病毒。
其他体内核酸转移技术包括用病毒载体(如腺病毒、单纯疱疹I病毒或腺相关病毒)和脂质系统转染。任选是，核酸和转染试剂与微粒相连。典型的转染试剂包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、季铵双亲性DOTMA((二油酰氧基丙基)三甲基溴化铵(商品名为Lipofectin，GIBCO-BRL)(Felgner等，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84，7413-7417；Malone等，(1989)Proc.Natl Acad.Sci.USA 86 6077-6081)；含下垂三甲铵头的亲脂性谷氨酸二酯(Ito等，(1990)Biochem.Biophys.Acta 1023，124-132)；可代谢的亲本脂质如阳离子脂质二-十八烷基酰氨基甘氨酰精胺(dioctadecylamidoglycylspermine)(DOGS，Transfectam，Promega)和二-棕榈酰磷脂酰乙醇胺基精胺(dipalmitoylphosphatidyl ethanolamylspermine)(DPPES)(J.P.Behr(1986)Tetrahedron Lett.27，5861-5864；J.P.Behr等，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，6982-6986)；可代谢的季铵盐(DOTB，N-[1-(2，3-二油酰基氧)丙基]-N，N，N-三甲氨甲基硫酸(DOTAP)(Boehringer Mannheim)、聚乙烯亚胺(PEI)、二油酰酯类、ChoTB、ChoSC、DOSC)(Leventis等，(1990)Biochim.Inter.22，235-241)；3β[N-(N′，N′-二甲基氨基乙烷)-氨甲酰]胆固醇(DC-Chol)，二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)/3β[N-(N′，N′-二甲基氨基乙烷)-氨甲酰]胆固醇1∶1的混合物(Gao等，(1991)Biochim.Biophys.Acta 1065，8-14)，精胺、精脒、脂多胺(Behr等，Bioconjugate Chem，1994，5：382-389)，亲脂性的聚赖氨酸(LPLL)(Zhou等，(1991)Biochim.Biophys.Acta 939，8-18)，带额外磷脂酰胆碱/胆固醇的[[(1，1，3，3-四甲基丁基)甲苯氧基]乙氧基]乙基]二甲基苄基铵氢氧化物([[(1，1，3，3-tetramethylbutyl)cre-soxy]ethoxy]ethyl]dimethylbenzylammoniumhydroxide(DEBDA氢氧化物)(Ballas等，(1988)Biochim.Biophys.Acta 939，8-18)，溴化十六烷基三甲铵(CTAB)/DOPE混合物(Pinnaduwage等，(1989)Biochim.Biophys.Acta 985，33-37)，谷氨酸(TMAG)与DOPE、CTAB、DEBDA、二-十二烷基溴化铵(DDAB)形成的亲脂性二酯，乙基硬脂胺与磷脂酰乙醇胺形成的混合物(Rose等，(1991)Biotechnique 10，520-525)，DDAB/DOPE(TransfectACE，BRL)，以及带寡半乳糖的脂质。可提高转染效率的典型转染增强试剂包括，例如，DEAE-葡聚糖、聚凝胺、溶酶体破裂肽(OhmoriNI等，Biochem Biophys Res Commun 1997/6/27；235(3)：726-9)、软骨素(chondroitan)基蛋白聚糖、硫酸化的蛋白聚糖、聚乙烯亚胺、多聚赖氨酸(PollardH等，J Biol Chem，1998 273(13)：7507-11)、整合素结合肽CYGGRGDTP、线性葡聚糖九糖、甘油、系于寡核苷酸3’端内部核苷连接上的胆固醇基(Letsinger，R.L.1989 Proc Natl Acad Sci USA 86：(17)：6553-6)、溶血磷脂、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇胺和1-油酰基溶血磷脂酰胆碱。
在某些情况下，比较理想的是用直接将含核酸载体转移给靶细胞的试剂转移核酸。这种“靶向”分子包括靶细胞表面膜蛋白特异性抗体或靶细胞受体的配基。如果使用脂质体，可与胞吞作用相关的细胞表面膜蛋白结合的蛋白可用于靶向到细胞和/或促进摄取。这种蛋白的例子包括特定细胞类型向性的壳蛋白及其片段、在循环中经历内化的蛋白的抗体、以及用于胞内定位和提高胞内半衰期的蛋白。在其他实施方式中，可以利用受体介导的胞吞作用。这种方法可见于，例如，Wu等，1987或Wagner等，1990的描述。有关目前已知的基因标记和基因治疗方法的综述可参见Anderson 1992。也可参见WO 93/25673及其引用的参考文献。有关基因治疗技术的其他综述可参见Friedmann，Science，244：1275-1281(1989)；Anderson，Nature，392卷的增刊，6679，25-30页(1998)；Verma，Scientific American：68-84(1990)；以及Miller，Nature，357：455-460(1992)。
筛选方法
本发明的另一方面涉及鉴定能够调节(即，降低)PRLR活性的抗体的方法，该方法包括使PRLR与抗体接触，确定抗体是否能够调节PRLR的活性。比较存在被测抗体时的活性与不存在被测抗体时的活性。如果包含被测抗体的样品的活性比不含被测抗体的样品的活性低则说明抗体具有抑制活性。有效治疗药物依赖于鉴定出缺乏明显毒性的有效治疗剂。可利用本领域熟知的方法根据结合活性来筛选抗体。例如，凝胶移动分析、蛋白质印迹、放射性标记的竞争分析、利用色谱共分馏、共沉淀、交联、ELISA、表面等离振子共振(例如，Biacore
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)、时间分辨荧光术(例如，DELFIA)等都可以使用，这些方法见于，例如，《当代分子生物学手册》(Current Protocols in Molecular Biology)(1999)、《当代免疫学手册》(Current Protocols in Immunology)(2007)，纽约约翰威利父子公司(John Wiley & Sons，NY)，本文都已完整纳入作为参考。另外，表面等离振子共振(例如，Biacore
Figure G2007800302847D00632
)可用于评价两个抗体之间的竞争(参见，例如，下面的实施例7)。时间分辨荧光术(例如，DELFIA)也可用于评价两个抗体之间的竞争水平。例如，根据厂家提供的方法可进行以微孔板为基础的竞争筛选DELFIA
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分析(PE公司(Perkin Elmer))。
为了初步筛选能与靶抗原上目的表位结合的抗体，可进行常规的交叉封闭试验，如《抗体，实验室手册》(Antibodies，A Laboratory Manual)，冷泉港实验室出版社，Harlow和David Lane编辑(1988)所描述的。也可以采用常规的竞争结合试验，其中根据未知抗体抑制靶抗原与本发明的靶抗原特异性抗体结合的能力来确定未知抗体的特征。完整抗体、其片段如胞外域或者线性表位也可以使用。表位绘图方法可参见Champe等，J.Biol.Chem.270：1388-1394(1995)的描述。
在体外结合试验的一个变体中，本发明提供了一种方法，该方法包括步骤(a)使固定的PRLR与候选抗体接触以及(b)检测候选抗体与PRLR的结合。在另一个实施方式中，候选抗体被固定，并检测PRLR的结合。固定可利用本领域熟知的方法完成，其中包括共价结合到支持物、小珠或色谱树脂上，以及非共价高亲和力的相互作用如抗体结合，或者使用链亲和素/生物素结合，其中被固定的化合物包含生物素基序。结合的检测可通过如下方法完成(i)利用未固定的化合物上的放射性标记物，(ii)利用非固定化合物上的荧光标记物，(iii)利用非固定化合物免疫特异性抗体，(iv)利用未固定的能激发荧光素支持物的化合物上的标记物，其中固定的化合物被连接在荧光素支持物上，以及本领域熟知的和常规使用的其他技术。
能调节(即增强、降低或阻断)靶抗原活性的抗体可通过如下方法鉴定：使候选抗体与靶抗原(或表达靶抗原的细胞)共孵育，确定候选抗体对靶抗原的活性或表达水平的影响。比较存在被测抗体时的活性与不存在被测抗体时的活性。如果包含被测抗体的样品的活性比不含被测抗体的样品的活性低则说明抗体具有抑制活性。调节靶抗原多肽或多聚核苷酸活性的抗体的特异性可通过比较其对靶抗原的效应与对其他相关化合物的效应来评价。
在特殊的典型实施方式中，本发明涉及通过测定抗体在培养的细胞系统中的效应来确定其抑制PRLR二聚化和/或中和PRLR的能力，其中PRLR的二聚化和/或中和PRLR可诱导STAT5和/或MAPK和/或AKT磷酸化或PRLR信号转导的其他指示分子。另外，细胞试验包括本文所述的增殖试验、软琼脂试验和/或细胞毒试验可用于评价特定的PRLR抗体。
特定抗体或抗体组合的生物学活性可利用合适的动物模型通过体内试验来评价。例如，可以利用异种移植癌症模型，其中人癌细胞被输入到免疫妥协动物如裸鼠或SCID小鼠体内。通过测定肿瘤形成、肿瘤消褪或转移等被抑制的水平来预测疗效。
本发明还涉及高通量筛选(HTS)试验，用于鉴定能与靶抗原相互作用的抗体或者能抑制靶抗原生物学活性(即，抑制酶催化活性、结合活性、胞内信号转导等)的抗体。HTS试验能以一种高效的方式筛选大量化合物。本发明包括利用以细胞为基础的HTS系统研究靶抗原与其结合伙伴之间的相互作用。设计出的HTS试验可用于鉴定具有理想特性的“采样化合物”或“先导化合物”，可以对这些化合物进行修饰以改善其理想特性。
在本发明的另一实施方式中，利用了高通量的筛选方法来筛选与靶抗原多肽具有合适结合亲和力的抗体片段或CDR内有1、2、3或更多氨基酸修饰的CDR。
组合治疗
目前已经鉴定出了多个在动物模型中有效的抗体，但是如果将两种或多种这类抗体混合在一起(结合相同的或不同的靶抗原)就可能提供更好的疗效。可以将包含一种或多种抗体的组合物给予患有癌症或者易患癌症的人或哺乳动物。同时给予两种治疗剂并不是说要在一个时间点同时给药，只要两种药物发挥其疗效的时间段有重合就可以。也可以同时或先后给药，例如隔不同的天数或不同的周数给药。
虽然抗体治疗适用于所有阶段的癌症，但是抗体治疗特别适于晚期癌症或转移癌。还未进行过化疗的患者优选采用抗体疗法和化疗或放疗的组合疗法，那些接受过一次或多次化疗的患者也适于抗体治疗。另外，抗体治疗也能减少同时使用的化疗的给药剂量，特别是对于那些无法良好耐受化疗药物的毒性的患者来说。
本发明的方法包括给予单一抗体以及给予不同抗体的组合或“鸡尾酒”。这种抗体混合物具有某些优势，因为抗体混合物包含能发挥不同效应机制的抗体，或者是细胞毒抗体与依赖免疫效应功能的抗体的直接组合。组合物中的这种抗体具有协同疗效。例如，本发明的方法包括给予M-CSF、RANKL、TaxotereTM、HerceptinTM、AvastinTM、ErbituxTM或抗-EGFR抗体以及他莫昔芬的抗体。
细胞毒药物是指能抑制或阻断细胞功能和/或导致细胞破坏的物质。该术语包括放射性同位素(例如，I131、I125、y90和Re186)、化疗药物和毒素如细菌、真菌、植物和动物来源的酶催化活化毒素或者合成毒素或其片段。非细胞毒剂是指不会抑制或阻断细胞功能和/或导致细胞破坏的物质。非细胞毒剂包括经过活化后变成细胞毒性的试剂。非细胞毒剂包括小珠、脂质体、基质或颗粒(参见，例如，美国专利出版号2003/0028071和2003/0032995，本文已纳入作为参考)。这种试剂可与本发明的抗体缀合、偶联、结合或相连。
癌症化疗药物包括而不限于烷化剂如卡铂和顺铂；氮芥类烷化剂；亚硝脲类烷化剂如卡莫司汀(BCNU)；抗代谢药如甲氨蝶呤；亚叶酸；嘌呤类似物抗代谢药如氟尿嘧啶(5-FU)和吉西他滨(Gemzar
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)；激素类抗肿瘤药如戈舍瑞林、亮丙瑞林和他莫昔芬；天然抗肿瘤药如阿地白介素、IL-2、多西紫杉醇、依托泊甙(VP-16)、干扰素α、紫杉醇(Taxol
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)和维甲酸(ATRA)；抗生素天然抗肿瘤药如博来霉素、更生霉素、柔红霉素、多柔比星、道诺霉素和丝裂霉素包括丝裂霉素C；以及长春花碱天然抗肿瘤药如长春碱、长春新碱、长春地辛；羟基脲；醋葡醛内酯、阿霉素、异环磷酰胺、依诺他滨、环硫雄醇、阿柔比星、安西他滨、尼莫司汀、盐酸丙卡巴肼、卡巴醌、卡铂、卡莫氟、色霉素A3、抗肿瘤多糖、抗肿瘤血小板因子、环磷酰胺(Cytoxin
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)、施佐菲兰、阿糖胞苷(胞嘧啶阿糖胞苷)、达卡巴嗪、硫代肌苷、塞替派、喃氟啶、多拉司他汀、多拉司他汀类似物如奥瑞斯他汀、CPT-11(伊立替康)、米托蒽醌、长春瑞滨、替尼泊苷、氨基蝶呤、洋红霉素、埃斯波霉素(参见，例如，美国专利号4,675,187)、新制癌菌素、OK-432、博来霉素、氟铁龙、溴甙、白消安、二磷酸己烯雌酚四钠、培洛霉素、苯丁抑制素(Ubenimex
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(乌苯美司))、干扰素β、美雄烷、二溴甘露醇、美法仑、层粘连蛋白肽、香菇多糖、采绒革盖菌提取物、喃氟啶/尿嘧啶、雌氮芥(雌激素/氮芥)。
另外，可用于治疗肿瘤患者的其他药物包括EPO、G-CSF、更昔洛韦；抗生素、亮丙瑞林；哌替啶；齐多夫定(AZT)；白细胞介素1到18，其中包括突变体和类似物；干扰素或细胞因子，如干扰素α、β和γ；激素如促黄体激素释放激素(LHRH)及其类似物和促性腺激素释放激素(GnRH)；生长激素如转化生长因子β(TGF-β)、成纤维细胞生长因子(FGF)、神经生长因子(NGF)、生长激素释放因子(GHRF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子同源因子(FGFHF)、肝细胞生长因子(HGF)和胰岛素生长因子(IGF)；肿瘤坏死因子α和β(TNF-α和β)；侵入抑制因子-2(IIF-2)；骨形态发生蛋白1-7(BMP1-7)；生长抑素；胸腺素-α-1；γ-球蛋白；超氧化物歧化酶(SOD)；EGFR(表皮生长因子受体)拮抗剂如西妥昔单抗和吉非替尼；PR(孕激素受体)拮抗剂和调节剂如米非司酮和OnapristoneTM；芳香酶(aromatoase)抑制剂如阿那曲唑、依西美坦和来曲唑；抗雌激素药物、雌激素受体拮抗剂和调节剂如他莫昔芬、托瑞米芬和氟维司群；补体因子；抗血管生成因子；抗原性物质；以及前药。
前药是指具有药理活性的物质的前体或衍生物，与亲本药物相比前药对肿瘤细胞的毒性较低或者无毒性，但是能够被催化活化或者转化成有活性的或者比亲本药物活性更高的形式。参见，例如，Wilman，“癌症化疗的前药”(″Prodrugsin Cancer Chemotherapy″)Biochemical Society Transactions，14，375-382页，615届贝尔法斯特会议(1986)和Stella等，“前药：靶向性药物转移的化学方法”(″Prodrugs：A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery，″)，《定向药物转移》(Directed Drug Delivery)，Borchardt等，(编辑)，247-267页，HumanaPress(1985)。前药包括而不限于包含磷酸盐的前药、包含硫代硫酸盐的前药、包含硫酸盐的前药、包含肽的前药、D氨基酸修饰的前药、糖基化的前药、包含β-内酰胺的前药、包含任选取代苯氧乙酰胺的前药或包含任选取代苯乙酰胺的前药、可转化为细胞毒活性更高的游离药物的5-氟胞嘧啶和其他5-尿嘧啶前药。可用于本发明的可转化成前药形式的细胞毒药物的例子包括而不限于上述化疗药物。
给药及制备
本发明的抗体可制成包含适用于理想给药方法的载体的药物组合物。合适的载体包括与抗体组合时能保持抗体的理想活性并且不与患者免疫系统发生反应的任何材料。载体的例子包括而不限于标准药学上可接受的载体中的任何一种，如无菌磷酸缓冲盐溶液、抑菌水等。各种水性载体也可以使用，例如，水、缓冲水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸等，还包括可增强稳定性的其他蛋白，如白蛋白、脂蛋白、球蛋白等，这些物质可对制剂产生温和的化学修饰效应等。
抗体的治疗性制剂可通过使具有理想纯度的抗体与任选生理性载体、赋形剂或稳定剂混合而制备以便于储存(《雷明顿药学》(Remington′s PharmaceuticalSciences)第16版，Osol，A.编辑，(1980))，制剂可以是冻干制剂或水溶液。合适的载体、赋形剂或稳定剂在应用剂量和浓度下对受者是无毒的，其中包括缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；包含维生素C和甲硫氨酸的抗氧化剂；防腐剂(如十八烷基二甲基苯甲基氯化铵；氯己双铵；苯扎氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；烷基对羟苯甲酸如甲基或丙基对羟苯甲酸；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；以及m-甲酚)；低分子量(少于约10个残基)的多糖；蛋白质如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖和其他糖类如葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗平衡离子如钠；金属复合物(例如，Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
本文的制剂还包含特定治疗用途所必须的多个活性化合物，尤其是具有补充活性并且互相之间没有反作用的那些化合物。这些分子适于以能达到预定目的的有效量组合存在。
活性组分还可以包裹在微囊中，例如，通过凝聚技术或界面聚合制备的微囊，如胶体药物转运系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米微囊)或粗滴乳状液中分别存在的羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚甲基甲酰胺微囊。这种技术在《雷明顿药学》第16版，Osol，A.编辑，(1980)中有描述。
可用于体内给药的制剂必须是无菌的。通过无菌滤膜过滤可以很容易实现这一点。
抗体可以合适的方式给药，其中包括胃肠外途径、皮下注射、腹膜内注射、肺内给药和鼻内给药，如果需要局部治疗也可以采用损伤部位内给药。胃肠外输注包括静脉注射、动脉内注射、腹膜内注射、肌肉注射、真皮内注射或皮下注射。另外，抗体也适于通过脉冲输注方式给药，尤其是抗体给药剂量不断下降时。优选通过注射给药，最优选的是通过静脉或皮下注射给药。本发明也包括其他给药方法，如局部给药，特别是透皮给药、透粘膜给药、直肠给药、口服或局部给药，例如，通过靠近目的部位的导管。
对于鼻腔粘膜给药来说，药学上可接受的制剂和药物可以是喷雾剂或气溶胶，其中包含合适的溶剂和任选其他化合物，例如但不限于稳定剂、抗菌剂、抗氧化剂、pH调节剂、表面活性剂、生物利用度调节剂以及上述物质的组合。气溶胶制剂推进剂包括压缩空气、氮气、二氧化碳或以烃类物质为基础的低沸点溶剂。
可注射的制剂一般包括水性悬液或油性悬液，这些溶液可利用合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂制备。可注射的制剂可位于溶液相中，或者以悬液的形式，用溶剂或稀释剂制备。药学上可接受的溶剂或载体包括无菌水、林格液或等渗的盐水溶液。
如果用于注射，药学上可接受的制剂和/或药物可以是适于用上述合适的溶液重组成的粉末。其中包括而不限于冷冻干燥的、旋转干燥的或喷雾干燥的粉末、无定形粉末、颗粒、沉淀物或微粒。用于注射时制剂任选可包含稳定剂、pH调节剂、表面活性剂、生物利用度调剂剂以及上述物质的混合。
也可以制备缓释制剂。合适的缓释制剂的例子包括包含抗体的固相疏水聚合物的半透性基质，这种基质可以具有固定的形状，例如，膜或微囊。缓释基质的例子包括聚酯类、水凝胶类(例如，聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)或聚乙烯醇)、聚乳酸(美国专利号3,773,919)、L谷氨酸和y乙基-L-谷氨酸的共聚物、不能降解的乙烯醋酸乙烯酯、可降解的乳酸-羟乙酸共聚物如Lupron DepotTM(由乳酸-羟乙酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球)，以及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然聚合物如乙烯醋酸乙烯酯和乳酸-羟乙酸可以使分子的释放时间达到100天以上，但是某些水凝胶维持蛋白释放的时间却较短。当包裹的抗体在体内存在较长时间时，抗体会因长期暴露于37℃湿润环境中而变性或凝集，结果导致生物学活性丧失，免疫原性可能会改变。可以根据参与的机制来设计合理的策略以使抗体稳定。例如，如果发现凝集是由硫-二硫化物交换而形成的分子间二硫键导致的，那么就可以通过修饰巯基残基、在酸溶液中冷冻干燥、控制含湿量、使用合适的添加物以及开发特异性的聚合物基质组合物来达到稳定的目的。本领域熟知的其他策略也可以使用。
本发明的制剂可以是短效的、速释的、长效的或缓释的，如本文所述。药学上可接受的制剂也可以制备成控释或缓释的形式。
即释组合物还可包含，例如，微粒或脂质体或某些其他包裹形式，或者以缓释形式给药以延长保存时间和/或转移效应。因此，药学上可接受的制剂和药物可压缩成片剂或圆柱形，作为仓储式注射剂或植入物如支架植入肌肉内或皮下。这种植入物可利用已知的惰性材料如聚硅酮和生物可降解聚合物。
除了上述那些典型制剂形式以外，药学上可接受的赋形剂和载体也是本领域技术人员熟知的，也可以包含在本发明中。这种赋形剂和载体描述于，例如，《雷明顿药学》第16版，Osol，A.编辑，(1980)中，本文已纳入作为参考。
根据患者的疾病状况、年龄、体重、一般健康状况、基因型、性别和饮食、给药间隔时间、给药途径、排泄率以及合并用药来调节特殊剂量。上述包含有效量的所有剂型都在常规试验的范围内，因此也包括在本发明的范围之内。
本发明的抗体制剂可基本不含其他天然免疫球蛋白或其他生物分子。优选的抗体在给予肿瘤患者或者易患肿瘤的患者时毒性很小。
本发明的组合物可通过常规的已知灭菌技术除菌。得到的溶液包装起来直接使用，或者在无菌状态下过滤并冻干，在给药前用无菌溶液溶解冻干制剂。组合物可包含接近生理调节所必须的药学上可接受的辅助物质，如pH调节和缓冲剂、张力调节剂等，例如，乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙和稳定剂(例如120％麦芽糖等)。
本发明的抗体可通过脂质体给药，脂质体是由各种脂质和/或磷脂和/或表面活性剂组成的小载体，可用于转移药物(例如，本文所述的抗体，和任选化疗药物)。脂质体包括乳化剂、泡沫、微粒、不溶性的单层、磷脂分散液、板状层等，可以作为载体将抗体靶向到特定组织以及提高组合物的半衰期。许多方法都可用于制备脂质体，如美国申请号4,837,028和5,019,369所述，本文已纳入作为参考。
包含抗体的脂质体可用本领域已知的方法制备，如Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：3688(1985)；Hwang等，Proc.Natl Acad.Sci.USA 77：4030(1980)以及美国申请号4,485,045和4,544,545所描述的。循环时间延长的脂质体在美国专利号5,013,556中有描述。特别适用的脂质体可利用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物通过反相蒸发法制备。通过确定孔径的滤膜挤出可得到具有理想直径的脂质体。本发明抗体的Fab’片段可通过二硫交换反应连接到脂质体上，如Martin等，J.Biol.Chem.257：286-288(1982)所述。任选是，化疗药物(如多柔比星)也可以包裹到脂质体内[参见，例如，Gabizon等，J.National Cancer Inst.81(19)：1484(1989)]。
这些组合物中的抗体浓度范围可以很宽，即，重量百分比从低于约10％，通常是至少约25％，到高达75％或90％，使用何种浓度主要根据液体体积、粘度等以及所选择的特定给药模式来确定。制备可通过口服、局部给药和胃肠外途径给药的组合物的实际制备方法是本领域技术人员所熟知的，详细描述参见《雷明顿药学》第19版，Mack Publishing Co.，Easton，PA(1995)，本文已纳入作为参考。
通过本领域熟知的标准经验方法可以确定治疗患者疾病所需的本发明组合物的有效量。
本发明的组合物可以足以阻止或至少部分抑制疾病进展的剂量给予已患或易患或有可能患，例如，乳腺癌、前列腺癌或肺癌的哺乳动物。足以达到此目的的剂量被定义为“治疗有效量”。抗体的有效量可根据疾病的严重程度以及被治疗患者的体重和一般状况而作出调整，但是一般在每公斤体重约1.0μg到100mg之间。典型的剂量范围为每次给予约10μg/kg到约30mg/kg、或约0.1mg/kg到约20mg/kg或约1mg/kg到约10mg/kg。还可以根据体表面积计算抗体的给药剂量(例如，最高可达4.5g/m2)。抗体的其他典型剂量包括单次给药总剂量高达8g(假设体重为80kg或体表面积为1.8m2)。
可以通过本领域熟知的任何方式给药。例如，抗体可以一个或多个分次给药的方式给药，或者通过在一段时间内，例如，5、10、15、30、60、90、120分钟或更长时间内，短期或长期输注给药。经过初始治疗期后，根据患者的反应及对治疗的耐受情况，如果需要维持患者的反应，可以给予维持剂量，例如，每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每两月一次、每三月一次或每六月一次。最常用的治疗方案是根据需要随时调整给药剂量，直到疾病症状的改善达到理想的效果。通过常规技术和试验可以很容易地监测治疗的进程。治疗可进行一个确定的时段，或者长期和持续进行数年，直到疾病恶化或者患者死亡。
可根据主治医师所选择的给药剂量和给药模式单次或多次给予组合物。当用于预防或治疗疾病时，抗体的合适给药剂量要根据如下因素确定：如上所述的被治疗的疾病类型、疾病的严重程度和进程、抗体给药的目的是为了预防或治疗、用药史、患者的病史和对抗体的反应以及主治医师的判断。抗体适于在一个时间点或者通过一系列治疗来给予患者。
在任何情况下，一段时间内制剂所提供的治疗性抗体的量都应该足以产生理想的生物学活性，例如，抑制癌症或使癌症的严重程度降到最低。本发明的组合物可单独给药，也可以作为辅助治疗方法与本领域已知的用于治疗这种疾病的其他治疗方法一起使用。
抗体组合物应按照GMP的标准制剂、给药和管理。因此需要考虑的因素包括特定适应症、特定适用哺乳动物、各个患者的临床状况、病因、给药部位、给药方法、给药方案、以及主治医师所熟知的其他因素。要根据这些因素来确定抗体的治疗有效量，并且应该是预防、抑制或治疗靶位介导的疾病所必须的最小剂量。这种剂量优选低于会对宿主造成毒性或者使宿主对感染更敏感的剂量。
虽然不是必须的，但是抗体也可以和目前所用的预防或治疗疾病的一种或多种药物一起制成制剂。这种其他药物的有效量要根据制剂中存在的抗体量、疾病或治疗的类型、以及上面所讨论的其他因素而定。这些药物通常用于同一给药剂量中，并通过上文所述的给药途径给药，或者约占迄今为止所用剂量的1到99％。
在本发明的另一实施方式中，提供了制品，其中包括用于治疗适应症的材料。制品包含容器和标签。合适的容器包括，例如，瓶子、小瓶、注射器和试管。容器可用各种材料制造，如玻璃或塑料。容器内包含的组合物可有效治疗疾病，容器有一个无菌接口(例如，容器可以是静脉注射袋或能被皮下注射针头刺穿的塞子)。组合物中的活性成分是本发明的抗体。容器上或与容器相连的标签说明了组合物可用于治疗所选择的疾病。制品还包含第二容器，其中含有第二治疗性药物(包括用于治疗本文所讨论的或本领域已知的疾病的任何第二治疗性药物)。制品还可以包含其他容器，其中含有药学上可接受的缓冲液，如磷酸盐缓冲液、林格式液或葡萄糖溶液，用于重组成冻干的抗体制剂。制品还可以包含其他材料，这些材料从生产商和用户的观点来看是必须的，其中包括其他缓冲液、稀释剂、滤膜、针头、注射器和包装说明书。
免疫治疗
可用于治疗癌症患者的抗体包括能起始有效抗肿瘤免疫反应的那些抗体以及能直接产生细胞毒作用的那些抗体。与细胞毒药物连接的抗体可用于将细胞毒药物靶向到表达PRLR的肿瘤组织内。另外，抗体可通过补体介导的或抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)机制诱导肿瘤细胞的溶解，两种机制都需要与效应细胞Fc受体位点或补体蛋白产生相互作用的免疫球蛋白分子完整的Fc部分。另外，对肿瘤生长有直接生物效应的抗体也可用于实现分发明。这种细胞毒抗体发挥作用的潜在机制包括抑制细胞的生长、调控细胞的分化、调控肿瘤血管生成因子的表达模式、以及诱导凋亡。特定抗体产生抗肿瘤效应的机制可通过确定ADCC、ADMMC、补体介导的细胞溶解等的体外试验来分析，这是本领域所熟知的。
在一个实施方式中，免疫治疗用结合PRLR并抑制LRLR活化的抗体进行。
抗PRLR抗体可以其“裸”抗体或未连接形式给药，也可以直接连接到其他治疗或诊断剂上，或者间接连接到包含这种其他治疗或诊断剂的载体聚合物上。
抗体可用放射性同位素、亲和力标记物(如生物素、链亲和素等)、酶催化标记物(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)、荧光素或化学发光或生物发光标记物(如FITC或罗丹明等)、顺磁性原子等进行可检测标记。完成这种标记的方法是本领域熟知的；例如，参见(Sternberger，L.A.等，J.Histochem.Cytochem.18：315(1970)；Bayer，E.A.等，Meth.Enzym.62：308(1979)；Engval，E.等，Immunol.109：129(1972)；Goding，J.W.J.Immunol. Meth.13：215(1976))。
抗体基序的连接可见于美国专利号6,306,393的描述。通用技术也可见于Shih等，Int.J.Cancer 41：832-839(1988)；Shih等，Int.J.Cancer 46：1101-1106(1990)和Shih等，美国专利号5,057,313的描述。这种通用方法包括使包含氧化糖链部分的抗体组分与包含至少一个游离氨基并且携带有一群药物、毒素、螯合剂、硼附加物或其他治疗剂的载体聚合物反应。这个反应可产生初始希夫碱(亚胺)连接，通过还原成仲胺后得以稳定并形成最后的偶联物。
载体聚合物可以是，例如，氨基葡聚糖(aminodextran)或至少包含50个氨基酸残基的多肽。用于将药物或其他试剂连接到载体聚合物上的各种方法都是本领域所熟知的。多肽载体可用于取代氨基葡聚糖，但是多肽载体的多肽链应该包含至少50个氨基酸残基，优选100-5000个氨基酸残基。其中至少有一些氨基酸应该是赖氨酸残基或谷氨酰胺或天冬氨酸残基。赖氨酸的下垂氨基以及谷氨酰胺和天冬氨酸的下垂羧基适于连接药物、毒素、免疫调节剂、螯合剂、硼附加物或其他治疗剂。合适多肽载体的例子包括多聚赖氨酸、多聚谷氨酸、多聚天冬氨酸、上述氨基酸的共聚物以及这些氨基酸和能赋予加载载体和偶联物理想溶解特性的其他氨基酸如丝氨酸的混合聚合物。
另外，结合抗体可通过将抗体组分与治疗剂直接连接来制备。通用方法与间接连接方法相似，只是治疗剂是直接连接到氧化抗体组分上。例如，抗体的糖链基序连接到聚乙二醇上以延长半衰期。
另外，治疗剂可通过二硫键的形成或通过使用异源双功能交联子如N-琥珀酰-3(2-联硫基吡啶)-丙酸盐(SPDP)连接到还原抗体的铰链区。Yu等，Int.J.Cancer56：244(1994)。用于这种连接的通用技术是本领域熟知的。参见，例如，Wong，《蛋白质结合和交联化学》(Chemistry Of Protein Conjugation andCross-Linking)(CRC出版社(CRC Press)1991)；Upeslacis等，“化学方法修饰抗体”(″Modification of Antibodies by Chemical Methods，″)，《单克隆抗体：原理及应用》(Monoclonal Antibodies：Principles and Applications)，Birch等，(编辑)，187-230页(Wiley-Liss，Inc.1995)；Price，“合成肽来源的抗体的制备和特征”(″Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies，″)，《单克隆抗体：制备、改造及临床应用》(Monoclonal Antibodies：Production，Enineering and Clinical Application)，Ritter等，(编辑)，60-84页(剑桥大学出版社(Cambridge University Press)1995)。各种双功能蛋白偶联剂都是本领域熟知的，如N-琥珀酰-3(2-联硫基吡啶)-丙酸盐(SPDP)、亚氨基硫烷(iminothiolane)(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(如盐酸脂肪酸二甲酯(dimethyl adipimidateHCL))、活性酯类(如辛二酸二琥珀酸亚胺)、醛类(如戊醛(glutareldehyde))、叠氮化合物(如双(p-叠氮苯甲酰)己二胺)、二叠氮衍生物(如双-(p-重氮基苯甲酰)-乙二胺)、二异氰酸盐(如甲苯2，6-二异氰酸酯)以及双活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。
最后，可以构建包含一种或多种抗PRLR抗体基序和另一多肽的融合蛋白。制备抗体融合蛋白的方法是本领域熟知的。参见，例如，美国专利号6,306,393。包含IL-2基序的抗体融合蛋白在Boleti等，Ann.Oncol.6：945(1995)，Nicolet等，Cancer Gene Ther.2：161(1995)，Becker等，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA93：7826(1996)，Hank等，Clin.Cancer Res.2：1951(1996)和Hu等，Cancer Res.56：4998(1996)中有描述。
在一个实施方式中，本发明的抗体可用作放射增敏剂。在这种实施方式中，抗体与放射增敏剂相连。术语“放射增敏剂”在本文中是指一种分子，优选低分子量的分子，当以治疗有效量的剂量给予动物时可提高被放射增敏细胞对电磁辐射的敏感性和/或提高可用电磁辐射治疗的疾病的疗效。可用电磁辐射治疗的疾病包括肿瘤性疾病、良性和恶性肿瘤以及癌细胞。
本文所用的术语“电磁辐射”和“辐射”包括而不限于波长为10-20到100米的射线。本发明的优选实施方式利用电磁辐射γ辐射(10-20到10-13m)、X射线辐射(10-12到10-9m)、紫外光(10nm到400nm)、可见光(400nm到700nm)、红外线辐射(700nm到1.0mm)以及微波辐射(1mm到30cm)。
已知放射增敏剂可提高癌细胞对电磁辐射毒性效应的敏感性。目前许多癌症治疗方案都利用可被X射线电磁辐射活化的放射增敏剂。X射线活化的放射增敏剂的例子包括而不限于：甲硝唑、醚醇硝唑、去甲基醚醇硝唑、哌莫硝唑、依他硝唑、硝唑吗啉、丝裂霉素C、RSU1069、SR423、EO9、RB6145、尼克酰胺、5-溴脱氧尿苷(BUdR)、5-碘脱氧尿苷(IUdR)、溴脱氧胞苷、氟脱氧尿苷(FUdR)、羟基脲、顺铂以及上述物质治疗有效性的类似物及衍生物。
癌症的光敏疗法(PDT)利用可见光作为致敏剂的辐射活化剂。光促辐射增敏剂的例子包括而不限于血卟啉衍生物、光卟啉(r)、苯-卟啉衍生物、NPe6、锡本卟啉(SnET2)、脱镁叶绿甲酯酸-a(pheoborbide-a)、细菌叶绿素-a、萘花青(naphthalocyanine)、酞菁、锌酞菁以及上述物质治疗有效性的类似物和衍生物。
在另一实施方式中，抗体可与肿瘤预靶向治疗所用的受体(如抗生物素蛋白链菌素)连接，其中抗体-受体偶联物被给予患者，然后利用清除药物从循环中清除未结合的偶联物，再给予连接有细胞毒药物(如放射性核素)的配基(如，卵蛋白)。
“标记物”是指与抗体直接或间接连接的可检测化合物或组合物。标记物可以是本身就是可以被检测的标记物(如，放射性同位素标记物或荧光素标记物)，或者酶催化标记物，可催化可检测底物化合物或组合物发生化学改变。另外，标记物本身可能是不能被检测的，但却是被可检测的另一种试剂结合的元素(例如，表位标签或结合伙伴对中的一个，如生物素-卵白素等)。因此，抗体可包含有利于其分离的标记物或标签，本发明的鉴定抗体的方法包括通过与标记物或标签的相互作用分离抗体的方法。
典型的治疗性免疫偶联物包含连接有细胞毒剂如化疗药物、毒素(例如，细菌、真菌、植物或动物来源的酶催化活化毒素或其片段)或放射性同位素(即，放射性偶联物)的本文所述的抗体。融合蛋白将在下文作进一步描述。
放射性金属或磁共振增强剂的螯合剂是本领域熟知的。比较典型的有乙二胺四乙酸(EDTA)和二乙烯三胺五乙酸(DTPA)的衍生物。这些螯合剂一般在侧链上都含有基团，螯合剂通过这些基团连接到载体上。这些基团包括，例如，异硫氰酸苄酯，DTPA或EDTA通过该基团偶联到载体的氨基上。另外，螯合剂上的羧基或氨基可通过活化或先衍生化然后偶联而连接到载体上，所有这些都是通过已知的方式完成的。
硼附加物如碳硼可通过常规方法连接到抗体上。例如，用下垂侧链上的羧基制备碳硼，这也是本领域所熟知的。这种碳硼与载体如氨基葡聚糖的连接可通过碳硼的羧基活化并与载体上的胺凝缩来完成，形成有治疗作用的免疫偶联物，如下文所述。
多肽载体可用于取代氨基葡聚糖，但是多肽载体的多肽链应该包含至少50个氨基酸残基，优选100-5000个氨基酸残基。其中至少有一些氨基酸应该是赖氨酸残基或谷氨酰胺或天冬氨酸残基。赖氨酸的下垂氨基以及谷氨酰胺和天冬氨酸的下垂羧基适于连接药物、毒素、免疫调节剂、螯合剂、硼附加物或其他治疗剂。合适多肽载体的例子包括多聚赖氨酸、多聚谷氨酸、多聚天冬氨酸、上述氨基酸的共聚物以及这些氨基酸和能赋予加载载体和偶联物理想溶解特性的其他氨基酸如丝氨酸的混合聚合物。
通过氧化抗体的糖链部分、所得的醛(和酮)羰基与加载药物、毒素、螯合剂、免疫调节剂、硼附加物或其他治疗性药物的载体上的氨基反应可以影响中间偶联物与抗体组分的结合。另外，中间偶联物可通过加载治疗性药物的中间偶联物上引入的氨基连接到氧化抗体组分上。例如，与NaIO4或其他糖酵解试剂进行化学反应，或者，例如，与神经氨酸苷酶和半乳糖氧化酶进行酶催化反应可以很方便地影响氧化作用。对于氨基葡聚糖载体来说，并不是氨基葡聚糖的所有氨基都用于加载治疗性药物。氨基葡聚糖的剩余氨基与氧化的抗体组分凝缩形成希夫碱加成物，然后通过还原而稳定，一般是用硼氢化物还原剂进行还原。
类似的方法可用于制备本发明的其他免疫偶联物。加载有多肽的载体优选包含富裕的游离残基用于和抗体组分的氧化糖链部分凝缩。如果需要，多肽载体上的羧基可转化成胺，例如，通过用DCC活化或者与过量的二胺(diamme)反应。
最终得到的免疫偶联物利用常规技术纯化，例如，在Sephacryl S-300上进行分子筛层析，或者用一个或多个CD84Hy表位进行亲和层析。
另外，免疫偶联物可通过将抗体组分与治疗剂直接连接来制备。通用方法与间接连接方法相似，只是治疗剂是直接连接到氧化的抗体组分上。
应当理解的是，其他治疗剂也可用螯合剂取代。本领域的技术人员无需特别的试验就可以制定出结合方案。
作为进一步的阐述，治疗剂可通过二硫键的形成连接到还原抗体组分的铰链区。例如，破伤风毒素肽可通过用于将肽连接到抗体组分上的单个半胱氨酸残基构建。另外，这种肽可用异源双功能交联子如N-琥珀酰-3(2-联硫基吡啶)-丙酸盐(SPDP)连接到抗体组分上。Yu等，Int.J.Cancer 56：244(1994)。用于这种连接的通用技术是本领域熟知的。参见，例如，Wong，《蛋白质结合和交联化学》(Chemistry Of Protein Conjugation and Cross-Linking)(CRC出版社1991)；Upeslacis等，“化学方法修饰抗体”(″Modification of Antibodies byChemical Methods，″)，《单克隆抗体：原理及应用》(MonoclonalAntibodies：Principles and Applications)，Birch等，(编辑)，187-230页(WL公司(Wiley-Liss，Inc.)1995)；Price，“合成肽来源的抗体的制备和特征”(″Productionand Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies，″)，《单克隆抗体：制备、改造及临床应用》(Monoclonal Antibodies：Production，Enineering andClinical Application)，Ritter等，(编辑)，60-84页(剑桥大学出版社1995)。
抗体与细胞毒剂的偶联物可通过各种双功能蛋白偶联剂如N-琥珀酰-3(2-联硫基吡啶)-丙酸盐(SPDP)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(如盐酸脂肪酸二甲酯)、活性酯类(如辛二酸二琥珀酸亚胺)、醛类(如戊醛)、叠氮化合物(如双(p-叠氮苯甲酰)己二胺)、二叠氮衍生物(如双-(p-重氮基苯甲酰)-乙二胺)、二异氰酸盐(如甲苯2，6-二异氰酸酯)以及双活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)制备。例如，蓖麻蛋白免疫毒素可按照Vitetta等，Science238：1098(1987)描述的方法制备。碳-14-标记的1-异硫氰基苯基-3-甲基二乙烯三胺五乙酸(MX-DTPA)是一种典型的用于将放射性核素连接到抗体上螯合剂(参见，例如，WO94/11026)。
如上所述，抗体Fc区的糖链基序可用于连接治疗剂。但是如果免疫偶联物的抗体组分用抗体片段，那么抗体片段可不包含Fc区。然而，在抗体或抗体片段的轻链可变区内引入糖链基序也是可能的。参见，例如，Leung等，J.Immunol.154：5919(1995)；Hansen等，美国专利号5,443,953。人基因工程糖链基序再用于连接治疗剂。
另外，本领域的技术人员将会了解结合方法无数可能的变体。例如，糖链基序可用于连接聚乙二醇以延长完整抗体或抗原结合片段在血液、淋巴或其他细胞外液体内的半衰期。另外，通过将治疗剂连接到糖链基序和游离巯基上来构建“二价免疫偶联物”也是有可能的。这种游离巯基可位于抗体组分的铰链区。
抗体融合蛋白
本发明涉及包含一种或多种抗体基序和另一种多肽如免疫调节剂或毒素基序的融合蛋白的用途。制备抗体融合蛋白的方法是本领域所熟知的。参见，例如，美国专利号6,306,393。包含IL-2基序的抗体融合蛋白可见于Boleti等，Ann.Oncol.6：945(1995)，Nicolet等，Cancer Gene Ther.2：161(1995)，Becker等，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 93：7826(1996)，Hank等，Clin.Cancer Res.2：1951(1996)以及Hu等，Cancer Res.56：4998(1996)的描述。另外，Yang等，Hum.Antibodies Hybridomas 6：129(1995)描述了一种包含F(ab′)2片段和肿瘤坏死因子α基序的融合蛋白。
抗体-毒素融合蛋白的制备方法也是本领域技术人员所熟知的，其中的重组分子包含一种或多种抗体组分和毒素或化疗药物。Chaudhary等，Nature 339：394(1989)，Brinkmann等，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 88：8616(1991)，Batra等，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 89：5867(1992)，Friedman等，J.Immunol.150：3054(1993)，Wels等，Int.J.Can.60：137(1995)，Fominaya等，J.Biol.Chem.271：10560(1996)，Kuan等，Biochemistry 35：2872(1996)和Schmidt等，Int.J.Can.65：538(1996)所描述的抗体-假单胞菌外毒素A融合蛋白。Kreitman等，Leukemia 7：553(1993)，Nicholls等，J.Biol.Chem.268：5302(1993)，Thompson等，J.Biol.Chem.270：28037(1995)和Vallera等，Blood 88：2342(1996)所描述的包含白喉毒素基序的抗体-毒素融合蛋白。Deonarain等，Tumor Targeting 1：177(1995)描述了一种包含RNA酶基序的抗体-毒素统合蛋白，而Linardou等，Cell Biophys.24-25：243(1994)制备了一种包含DNA酶I组分的抗体-毒素融合蛋白。白树毒素被用于Wang等，《第209界ACS全国会议摘要》(Abstracts of the 209th ACS NationalMeeting)，Anaheim，Calif.，8月2-6日，1995，第1部分，BIOT005所描述的抗体-毒素融合蛋白中的毒素基序。作为另一个例子，Dohlsten等，Proc.Nat′lAcad.Sci.USA 91：8945(1994)报道了一种包含葡萄球菌内毒素A的抗体-毒素融合蛋白。
适用于制备这种偶联物的毒素的例子有蓖麻毒素、相思豆毒素、核糖核酸酶、DNA酶I、葡萄球菌内毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、白树毒素、白喉毒素、假单胞菌外毒素和假单胞菌内毒素。参见，例如，Pastan等，Cell 47：641(1986)和Goldenberg，CA-A Cancer Journal for Clinicians 44：43(1994)。其他合适的毒素是本领域技术人员所熟知的。
通过将抗体连接到可将前药(例如，肽基化疗药物，参见WO81/01145)转化成活化的抗癌药物的前药转化酶上，本发明的抗体还可用于ADEPT中。参见，例如，WO88/07378和美国专利号4,975,278。
可用于ADEPT的免疫偶联物的酶组分包括能以这种方式作用于前药以将其转化为其活性更高的细胞毒形式的酶。
可用于本发明方法中的酶包括而不限于用于将含磷酸盐的前药转化成游离药物的碱性磷酸酶；用于将含硫酸盐的前药转化成游离药物的芳香基硫酸酯酶；用于将非毒性的5-氟胞嘧啶转化成抗癌药物5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脱氨酶；用于将含肽前药转化为游离药物的蛋白酶如粘质沙雷氏菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶和组织蛋白酶(如组织蛋白酶B和L)；用于转化含D氨基酸取代的前药的D-丙氨酰基羧肽酶；用于将羰基化前药转化成游离药物的糖链裂解酶如β-半乳糖苷酶和神经氨酸苷酶；用于将β-内酰胺衍生的药物转化成游离药物的β-内酰胺酶；以及用于将药物转化成游离药物的青霉素酰胺酶如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶，其中的药物是在其胺氮上分别用苯氧乙酰基或苯乙酰基衍生的。另外，具有酶活性的抗体，在本领域中也被称为抗体酶，可用于将本发明的前药转化成游离的活性药物(参见，例如，Massey，Nature 328：457-458(1987))。抗体-抗体酶偶联物可按照本文所述的方法制备，用于将抗体酶转运到肿瘤细胞群中。
本发明的酶可通过本领域熟知的技术共价结合到抗体上，例如使用上述异源双功能交联剂。利用本领域熟知的重组DNA技术可以构建包含本发明抗体的至少一个抗原结合区的融合蛋白，其中抗原结合区被连接到本发明的酶的至少一个功能活性部分上。(参见，例如，Neuberger等，Nature 312：604-608(1984))。
非治疗性用途
本发明的抗体可用作靶抗原的亲和纯化试剂，或者用于靶抗原的诊断试验，例如，检测特殊细胞、组织或血清中抗原的表达水平。抗体还可用于体内诊断试验。一般而言，用于此目的的抗体用放射性核素(如111In、99Tc、14C、131I、125I、3H、32P或35S)标记，这样可通过免疫液闪成像术来定位肿瘤。
本发明的抗体可用于任何已知的分析方法中，如竞争结合分析、直接和间接夹心分析如ELISA以及免疫沉淀分析。Zola，《单克隆抗体：技术操作手册》(Monoclonal Antibodies：A Manual of Techniques)，147-158页(CRC出版社1987)。抗体还可用于免疫组化分析，用本领域熟知的方法标记肿瘤样品。
为了便于操作，本发明的抗体可以试剂盒的方式提供，即，预定量的试剂和诊断分析操作说明书的包装组合。如果抗体用酶标记，那么试剂盒将包含酶所需要的底物和辅因子(例如，可提供可检测发色基团或荧光基团的底物前体)。另外，其他附加物也可以包括在内，例如，稳定剂、缓冲液(例如，封闭缓冲液或裂解缓冲液)等。各种试剂的相对量可以变化很大，只要试剂溶液的浓度可以使分析的敏感性达到最佳就可以。优选的是试剂以干粉的形式提供，通常的冷冻干燥的，其中包括溶解时能提供具有合适浓度的试剂溶液的赋形剂。
本发明通过下面的实施例来说明，这些实施例并不意味着以任何方式限定本发明。
实施例
实施例1
制备PRLR的ECD、S1和S2区片段
PRLR胞外域(ECD，SEQ ID NO：2的25-234位氨基酸)、S1区(SEQ ID NO：2的25-125位氨基酸)和S2区(SEQ ID NO：2的126-234位氨基酸)相应的PRLR片段的表达和纯化按如下方法进行。如表2所示，设计出ECD、S1和S2的昆虫表达构建体，引物是根据其各自的氨基酸序列设计的，可用于克隆片段(如表3所述)。
表2
Figure G2007800302847D00811
表3
Figure G2007800302847D00812
为了克隆S1和S2区，利用巢式PCR方法插入标签并改造3’/5’区。克隆S1用6个正向巢式引物和1个反向引物。克隆S2用5个正向巢式引物和3个反向引物。
PCR扩增用PfuUltraTM Hotstart PCR Master Mix(PfuUltraTM热启动PCR主混合物)(斯图特基因公司(Stratagene))按照厂家推荐的方法进行。用于扩增的模板是克隆到pDEST3218内的PRLR的ECD片段(数据未显示)。利用拓扑异构酶克隆策略将ECD PCR产物克隆到BlueBac4.5/V5-His TOPO-TA(因维曲根公司(Invitrogen))内。利用门控技术(Gateway Technology)(因维曲根公司)将S1和S2 PCR产物克隆到内部适用pAcMP3中。最后筛选出的克隆通过双链测序来确认。制备10-20ug DNA用于昆虫转染。
按照如下方法在昆虫细胞内利用重组构建体表达各个PRLR片段。通过编码PRLR胞外域的质粒DNA和SapphireTM基因组苜蓿银纹夜蛾(Autographacalifornica)DNA共转染的噬斑纯化分离杆状病毒。扩增重组病毒并用于感染Tn5昆虫细胞，密度为1×106-1.5×106细胞/ml，10L(工作体积)波浪式生物反应器内的moi为2-10。感染48小时后，收获细胞和上清，离心，得到的上清用于浓缩。上清在0.45um中空纤维柱上澄清，然后用正切流动过滤截止膜进行5倍浓缩。在进行蛋白纯化前上清用1L、0.2um孔径的真空瓶过滤除菌。
可用相似的方法在昆虫细胞内表达S1和S2区，只是在纯化前不用浓缩S1片段，S2片段在5kDa MW柱上浓缩。
PRLR片段纯化方法如下。从净表达组(expression group neat)中收获包含表达的PRLR的ECD或亚区的昆虫细胞培养物上清，或者利用标称截止分子量为1或5kD的叠加膜盒式装置(PF公司(Pall Filtron))浓缩，最高可浓缩10倍。在实际应用时，上清通过0.2微米的滤膜过滤。上清直接加载到PBS平衡柱上。
按照厂家推荐的流速在1或5mL HisTrap柱(GE健康护理公司(GEHealthcare))纯化His标签蛋白。在固定抗glu单克隆抗体的柱子上纯化Glu标签蛋白，纯化柱的制备方法如下：纯化的抗glu单克隆抗体溶于PBS中，浓度为3-10mg/mL，按照厂家的说明书将其连接到Affi-gel 10(伯乐公司(Bio-Rad))上，这是一种正-羟基琥珀酰亚胺活化的琼脂糖凝胶。抗glu琼脂糖包裹进XK16柱(GE健康护理公司)，以15-30cm/小时的线性流速运行。
通过用20倍柱体积的缓冲液A(PBS)到缓冲液B(PBS+0.25M咪唑(IX-0005，EMM公司(EM Merck))pH 7.4)的梯度洗脱将蛋白从HisTrap柱上洗脱下来。用含0.1mg/mL肽EYMPTD的PBS从抗glu柱上将蛋白洗脱下来。通过SDS-PAGE和蛋白质印迹或质谱鉴定各组分并适当混合。
混合的PRLR的ECD或亚区通过分子排阻层析进一步纯化，柱子为用PBS平衡的Superdex 75 26/60柱(GE健康护理公司)，流速为2.5mL/分。这些柱子的加载体积不超过10mL。通过SDS-PAGE鉴定各组分并适当混合。
实施例2
从人抗体噬菌体展示文库中分离靶特异性抗体
为了分离一组能中和人PRLR活性的抗体，平行筛选表达scFv片段的三个人抗体噬菌体展示文库。用于文库淘洗的靶位是促乳素受体的可溶性胞外域(ECD)(人促乳素受体氨基酸25-234)，其制备方法见上述实施例1。受体被生物素化(NHS-LC生物素，皮尔斯公司(Pierce))，可溶性淘洗在生物素化的ECD上进行。
从噬菌体展示文库中筛选靶抗原特异性抗体可按照Marks等，(MethodsMol Biol.248：161-76，2004)描述的方法进行。简言之，噬菌体展示文库与50pmol生物素化的ECD在室温下共孵育1小时，然后用100μl抗生物素蛋白链菌素小珠悬液(Dynabeads
Figure G2007800302847D00831
M-280链霉抗生物素蛋白，因维曲根公司)捕获形成的复合物。通过用洗涤缓冲液(PBS+5％牛奶)洗涤小珠来去除非特异性的噬菌体。结合的噬菌体用0.5ml 100nM三乙胺(TEA)洗脱，然后立即加入等体积的1M TRIS-Cl pH 7.4进行中和。洗脱下来的噬菌体群用于感染处于指数生长期的TG1大肠杆菌细胞，按照描述的方法(Methods Mol Biol.248：161-76，2004)恢复噬菌粒。筛选共重复三轮。从第三轮淘洗得到的噬菌体感染的TG1细胞中获得的单个克隆通过ELISA分析测定其结合活性进行筛选。简言之，从感染洗脱的噬菌体感染的TG1细胞中获得的单个克隆用于接种96孔板内的培养基。培养微孔板内的培养物使其OD500达到0.6，此时在微孔板内添加1mMIPTG然后在30℃的振荡孵育器中过夜培养以诱导可溶性抗体的表达。旋转沉降细菌，制备胞质提取物用于检测与96孔微孔板(96孔平底免疫吸附板，Nunc)上固定的ECD的抗体结合活性，所用方法为微孔板制造商提供的标准ELISA方法。
抗促乳素受体(PRLR)抗体与重组胞外域(ECD)的亲和力利用Biacore
Figure G2007800302847D00841
2000测定，用于评价抗体的亲和力等级。蛋白A/G捕获表面用于人scFv-Fc融合蛋白，兔抗小鼠IgG-Fc(RAM-Fc)抗体捕获表面用于杂交瘤产生的抗体。蛋白A/G和RAM-Fc双捕获芯片是CM5传感器芯片，按照Biacore
Figure G2007800302847D00842
公司推荐的方法通过标准的EDC-NHS胺偶联化学反应可以使固定在所有4个流动池上的捕获分子(蛋白A/G或RAM-Fc)达到最大捕获水平。流动缓冲液是HBS-EP(Biacore
Figure G2007800302847D00843
公司)，温度设定在25℃，流速最初设定在10μL/分。纯化出的抗体稀释到HBS-EP中，浓度约为1-3μg/mL，并在1到2分钟内注射到捕获芯片上。流速增加到25到30μL/分。PRLR的重组ECD稀释到1μg/mL，在5到6分钟内注射，解离10分钟。
曲线拟合采用BIAEvaluaion软件，用于计算动力结合速率常数和解离速率常数(分别为kon和koff)。1∶1朗缪尔相互作用模型和质量输运校正(masstransport correction)用于完成每一样品的同时ka/kd拟合。一些样品同时采用设置成适合当地的Rmax、kon和koff参数进行拟合。当发生基线漂移时，使用漂移值设定为常数并手工输入的漂移基线模型。漂移值的变化范围为-0.03到+0.05RU/秒。
也可以利用荧光活化细胞分选(FACS)分析和荧光微容量试验技术(FMAT，Fluorometric Microvolume Assay Technology)通过测定与表达促乳素受体的细胞的结合来评价抗体结合活性(Swartzman等，Anal Biochem.271：143-51，1999)。通过FACS或FMAT分析显示有结合活性的克隆进行测序，编码独特重链CDR3和轻链CDR3蛋白序列的克隆重新格式化成scFv-Fc，如下面的实施例3所描述的。按照下面实施例5和6描述的方法分析这些scFv-Fc抑制PRLR诱导的ERK1/2磷酸化的能力以及抑制PRLR诱导的BaF3/PRLR细胞系增殖的能力。如实施例7所述，进一步鉴定筛选出的抗体结合ECD、S1和S2的特征以及抗体对之间结合PRLR的ECD的相对竞争力。筛选出的抗体的数据显示在下面的表4中。
表4
  抗体   pERK1/2抑制IC50   BaF3/PRLR的增殖抑制IC50   亲和力或平衡解离常数KD(nM)   结构域特异性  表位盒(同一个盒内竞争结合PRLR的抗体)
  XPA.06.158   0.01   0.06   0.7   S1   4.5
  XPA.06.167   0.04   0.14   4   S1   3.8
  XPA.06.178   0.09   0.23   20   S1   3.8
  XPA.06.145   0.30   0.77   10   S1   4
  XPA.06.217   0.35   1.18   7   S1   7
  XHA.06.983   0.11   0.1   0.1   S？   6
  XHA.06.189   0.2   0.15   ＜0.1   S1   3.8
  XHA.06.275   0.5   1.31   0.4   S2   5
  XHA.06.567   0.65   7.06   0.8   S2   6.5
实施例3
克隆重新格式化成scFv-Fc格式
对于实施例2所鉴定出的每一个独特scFv克隆来说，通过PCR从噬菌体展示载体中扩增出编码scFv片段的cDNA，然后连接到哺乳动物表达载体内，该载体是XOMA的专利表达载体经修饰而成的(描述于WO 2004/033693，编码κ、λ或γ2恒定区基因)，可表达scFv-Fc蛋白的每一个抗体，其中蛋白的Fc区代表IgG1分子的CH2和CH3区。scFv-Fc融合蛋白的构建方法是本领域熟知的，例如，参见Fredericks等，Protein Eng Des Sel.2004 Jan；17(1)：95-106，Powers等，J Immunol Methods.2001 May 1；251(1-2)：123-35或Shu等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 1993，90，7995-7998。美国专利5,892,019也公开了Fc融合蛋白载体的构建方法及scFv-Fc融合蛋白的表达方法。
利用脂转染胺2000(Lipofectamine 2000)(因维曲根公司)按照厂家的说明书通过转染293E细胞可实现融合蛋白的表达。5天以后，通过离心去除细胞，按照厂家推荐的方法利用蛋白A琼脂糖(GE健康护理公司)从上清中纯化scFv-Fc融合蛋白。
实施例4
小鼠杂交瘤分泌的靶特异性抗体的鉴定
抗人促乳素受体(PRLR)胞外域的小鼠抗体按如下方法制备。通过皮下注射重组的PRLR胞外域(如上所述)免疫6只Balb/C小鼠。在28天内小鼠共接受10次注射。最后一次注射后4天处死小鼠，取出引流淋巴结。将淋巴结细胞悬浮后采用BTX ECM2001电-细胞操纵器(BTX ECM2001 Electro-CellManipulator)(哈佛仪器公司(Harvard Apparatus))通过电促细胞融合与小鼠骨髓瘤细胞系P3xAg8.653融合。
融合以后，细胞接种到大约40个96孔板内。12天后通过抗重组ECD的ELISA和FMAT筛选微孔板。FMAT试验使用CHO细胞系，该细胞被稳定转染，能表达高水平的PRLR受体。
按照下面实施例5和6描述的方法分析筛选出的杂交瘤抑制PRLR诱导的ERK1/2磷酸化的能力以及抑制PRLR诱导的BaF3/PRLR细胞系增殖的能力。如实施例7所述，进一步鉴定筛选出的抗体结合重组ECD、S1和S2的特征以及抗体对之间结合PRLR的ECD的相对竞争力。筛选出的抗体的数据显示在上面的表4中。
实施例5
确定抗体对ERK1/2磷酸化的影响
经过5个小时的血清饥饿以后，T47D细胞接种到包含完全生长培养基的微孔滴定板中，37℃孵育24小时。细胞用于磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤两次，与抗体在37℃共孵育30分钟，其中抗体用包含0.1％BSA的无血清培养基稀释。抗体的终浓度为30ng/ml。细胞与促乳素在37℃共孵育30分钟，然后用冰预冷的PBS洗涤两次。加入包含去污剂、螯合剂和各种蛋白酶以及磷酸酶抑制剂的标准裂解缓冲液以制备细胞裂解物。按照R&D系统公司(R&D Systems，Inc.)的DUOSET
Figure G2007800302847D00861
IC磷酸-ERK1/ERK2的说明书利用标准ELISA测定磷酸化的ERK1/2(pERK1/2)的水平。典型试验的结果显示在图2、3和4中，筛选出的抗体的试验结果显示在上面的表4中。
图7A-7C显示的是抗体的VH和VL氨基酸序列在pERK试验中可产生80％以上的抑制作用。
实施例6
确定抗体对PRL反应性细胞系增殖的影响
通过电穿孔方法将包含全长人PRLR和新霉素耐药盒的表达载体导入到小鼠前B细胞系BaF3中以制备BaF3/PRLR细胞。细胞在添加G418(1mg/ml)和rmIL-3(10ng/ml)的培养基中筛选7天，然后在不含G418或IL-3的rhPRL(1ug/ml)中再筛选7天。在14天的时间内，培养基中的PRL浓度逐步降低直到达到50ng/ml的维持水平。在试验的第一天，平底96孔板的每一孔中接种1×104细胞。孔中加入10ug/ml的抗体(scFv-Fc融合蛋白的形式)，添加和不加50ng/mlrhPRL。培养板孵育48小时，然后用CellTiter Glo试剂分析。样品设三复孔，激动作用定义为在不含PRL的情况下抗体所诱导的细胞增殖，而拮抗作用定义为在存在PRL的情况下的细胞增殖。筛选出的抗体的这种增殖试验结果显示在上面的表4中。
为了分析PRL诱导的增殖作用以及抗PRLR抗体对增殖的抑制作用，T47D或MCF7-NCI细胞以1×106细胞/ml调节生长培养基(无酚红的RPMI/10％FCS)的密度在T75培养瓶(总体积12ml)中分裂。分裂72小时后细胞用胰酶消化，计数，然后以每孔5000个细胞(T47D)或每孔20000个细胞(MCF7)的密度接种到平底96孔板中(100ul/孔)。MCF7细胞接种到无血清和无酚红RPMI培养基中，T47D细胞接种到无血清RPMI培养基或含10％碳条过滤血清的RPMI培养基中。接种24小时后在各孔中加入PRL和抗-PRLR抗体(50ul，浓缩3倍)。孵育72小时后，3[H]胸苷(1μci/孔)加到微孔板内，在37°孵育器中至少孵育6小时。利用胰酶和Tomtec 96孔微孔板细胞收获仪收获细胞。然后将滤膜转移到Trilux光度计中进行分析(1分钟计数)。图5中的增殖试验结果说明scFv可抑制促乳素介导的对增殖的促进作用。
实施例7
通过BIACORE测定结合亲和力和竞争作用
重复进行上述实施例2所述的BIACORE分析以确定筛选出的抗体与上述PRLR的ECD、S1和S2区的相对结合水平，只是S1、S2或ECD蛋白以10μg/mL的浓度、15μL/分钟的速率在2分钟内注射。利用Biacore
Figure G2007800302847D00871
控制软件采集这个分析的数据，表示为报告点(共振单元(RU))，结合抗原的量除以捕获抗体的量使数据标准化。数据显示在下面的表5中。
表5.标准化后的抗PRLR抗体结合的S1、S2和ECD。
Figure G2007800302847D00881
通过在Biacore2000上进行一系列注射来确定纯化的抗体的亲和力。所得到的亲和力和速率常数与这些抗体在HBS-EP缓冲系统中、25℃下与促乳素受体(PRLR)的重组胞外域(ECD)的结合有关。按照Biacore
Figure G2007800302847D00883
公司推荐的方法通过标准的EDC-NHS胺偶联化学反应制备带有约5000-1000RU蛋白A/G的CM5传感器芯片，用于捕获抗体。用HBS-EP捕获缓冲液将纯化的抗体稀释到约1ug/mL。确定达到250-400RU抗体捕获所需的注射时间。用于动力学分析的抗体的捕获通过以10uL/分的速率在1.5到3分钟内注射抗体来完成，注射时间根据最佳捕获水平的结果而定。
动力学分析时流速设定为40uL/分。从148nM(4ug/mL)或37nM(1ug/mL)开始以1∶3连续稀释制备5种浓度的PRLR ECD。每个浓度+缓冲液对照(浓度为0)都设双份。数据组是双参照的，用1∶1朗缪尔结合相互作用模型进行拟合。还对用IgG1和IgG2构建体重格式化得到的XPA.06.167的IgG重格式化(reformatted)构建体进行相同的分析。
动力学常数和筛选出的抗体与PRLR的ECD的结合亲和力显示在下面的表6中。
表6.亲和力分析结果
  抗体   kon(1/Ms)   koff(1/s)   KD(M)
  XPA.06.131   3.4E+04   7.3E-05   2.1E-09
  XPA.06.158   1.1E+05   7.3E-05   7.0E-10
  XPA.06.141   6.3E+04   5.3E-04   8.4E-09
  XPA.06.147   5.5E+05   5.3E-03   9.8E-09
  XPA.06.167IgG1   2.3E+05   6.0E-04   2.6E-09
  XPA.06.167IgG2   2.1+05   5.72E-04   2.7E-09
用相同方法确定其他抗体的动力学常数和亲和力(总结在下面的表7中)。
表7
  kon   koff   KD
  XHA.06.642   9.2E+05   8.6E-04   934pM
  XHA.06.275   1.0E+06   3.4E-04   337pM
  XHA.06.983   7.3E+05   3.2E-04   43pM
  kon   koff   KD
  chXHA.06.642   6.5E+04   5.2E-04   801pM
  chXHA.06.275   1.1E+06   2.2E-04   196pM
  chXHA.06.983   2.4E+05   1.0E-05   42pM
抗体对之间与PRLR结合的相对竞争或干扰(例如，配对分析)按照如下方法利用系列竞争分析策略确定。在这种方法中，一种抗体被直接或者通过捕获剂固定在传感器芯片上，通过将ECD注射到固定的抗体上使其与ECD结合。如果需要，通过注射高浓度的不相关IgG封闭过量的捕获剂(例如，当利用兔抗鼠IgG捕获表面检测两种小鼠抗体时)。随后注射用于测定竞争力的抗体，确定抗体与第一抗体捕获的ECD结合的能力。如果两种抗体分别结合ECD上的不同表位，那么第二抗体应该也能够结合ECD/第一抗体复合物。如果两种抗体互相干扰或竞争，那么第二抗体同样不能或根本不能结合ECD/第一抗体复合物。这种竞争分析的结果显示在上面的表4中(如果两种抗体具有相同的表位盒(bin)数，那么它们会彼此竞争结合ECD，以相同的模式与其他盒内的抗体竞争)。本发明特别涉及鉴定能与本文所述的盒中任何抗体结合相同表位的其他抗体，或者与这种抗体竞争结合PRLR的ECD的其他抗体。
实施例8
蛋白质印迹分析对PRL诱导的PRLR、STAT5和AKT磷酸化的影响
筛选出的抗体抑制PRL诱导的STAT5和AKT磷酸化的能力通过如下方法确定。细胞以3×105/ml的密度接种到添加无酚红RPMI/10％FCS的6孔板中培养过夜。24小时后用无血清RPMI更换培养基继续孵育30分钟。在某些试验中，在这个血清饥饿期间细胞与抗PRLR抗体或非特异性的对照抗体共孵育。然后在孔中加入50ng/ml PRL继续孵育30分钟，细胞用PBS漂洗一次，用含50mM Tris-HCl，pH7.5，150mM NaCl，1mM EDTA，1％NP-40，1mM Na3OV4，50mM NaF，0.25％脱氧胆酸盐和蛋白酶抑制剂的缓冲液裂解。试管在冷冻微量离心机中以14,000rpm离心，利用BCA试剂定量测定裂解物。用10％SDS-PAGE分离30μg全细胞裂解物，利用STAT5A/B(Y694/Y699，Upstate)或PRLR(Y546/Y611，自制的)的磷酸特异性抗体和ECL检测蛋白。通过用总STAT5(BD公司)或PRLR(酶化公司(Zymed))或AKT(细胞信号传导公司(CellSignalling))特异性抗体染色来确定等量的蛋白上样量。图6显示的是PRLR特异性抗体对PRLR胞内磷酸化的效应的典型分析结果。
实施例9
小鼠抗体的人源化
本实施例展示了一种人源化小鼠抗PRLR抗体的方法。
人源化PRLR抗体轻链和重链基因的设计
小鼠抗体XHA.06.983、XHA.06.275和XHA.06.642的VL和VH氨基酸序列显示在图10中。利用国家生物医药基础蛋白序列鉴定数据库或相似数据库鉴定的人抗体序列用于提供人源化抗体的框架。为了筛选人源化重链的序列，小鼠重链序列与人抗体重链的序列一起排列。在每一个点上，人抗体的氨基酸都被选择为人源化序列所用的氨基酸，除非该位置属于以下四种情形之一，在这四种情况下选择小鼠的氨基酸：
(1)该位置位于补体决定区(CDR)，如Kabat，J.Immunol.，125，961-969(1980)所定义的；
(2)人抗体氨基酸在人重链的这个位置上是稀有的，而小鼠氨基酸在人重链的这个位置上是常见的；
(3)该位置与小鼠重链氨基酸序列上的CDR非常接近；或者
(4)小鼠抗体的三维模型显示该氨基酸在物理空间位置上靠近抗原结合区。
为了筛选人源化轻链的序列，小鼠轻链序列与人抗体轻链的序列一起排列。在每一个点上，人抗体的氨基酸都被选择为人源化序列所用的氨基酸，除非该位置属于上述情形之一，这些情形重复如下：
(1)CDR；
(2)小鼠氨基酸比人抗体更常见；
(3)靠近CDR；或
(4)在三维结构上可能靠近结合区。
实际使用的重链和轻链基因的核苷酸序列按如下步骤选择：
(1)编码按照上述情形选择出的氨基酸序列的核苷酸序列；
(2)这些编码序列的5′端为编码前导(信号)序列的核苷酸序列。选择这些前导序列作为典型抗体；
(3)编码序列的3’端为小鼠轻链J5片段和小鼠重链J2片段之后的核苷酸序列，这些都是小鼠序列的一部分。这些序列包含其中是因为它们包含剪接供者信号；以及
(4)在序列的两端是Xba I位点，以便于在Xba I位点上剪切并克隆到载体的Xba I位点内。
人源化轻链和重链基因的构建
为了合成重链，利用应用生物系统公司(Applied Biosystems)的380B DNA合成仪合成4种寡核苷酸。两种寡核苷酸分别是一条重链的一部分，每条寡核苷酸都与下一条寡核苷酸重叠约20个核苷酸以便于复性。总之，寡核苷酸可覆盖整个人源化重链可变区，但是几个位于末端的核苷酸除外，这样便于在Xba I位点剪切。寡核苷酸用聚丙烯酰胺凝胶纯化。
按照标准方法利用ATP和T4多聚核苷酸激酶磷酸化每一条寡核苷酸(Maniatis等，《分子克隆：实验室操作手册》，第2版，冷泉港实验室出版社，纽约冷泉港，(1989))。为了使磷酸化的寡核苷酸复性，将寡核苷酸悬浮在40ulTA(33mM Tris乙酸盐，pH 7.9，66mM乙酸钾，10mM乙酸镁)中，每种寡核苷酸的浓度约为3.75μM，95℃变性4分钟，然后缓慢冷却到4℃。为了通过合成每一条寡核苷酸的相对链而从寡核苷酸合成完整基因，加入下列组分，总体积为100ul：
10ul       退火的寡核苷酸
0.16mM     每种脱氧核糖核苷酸
0.5mM      ATP
0.5mM      DTT
100ug/ml   BSA
3.5ug/ml   T4 g43蛋白(DNA聚合酶)
25ug/ml    T4 g44/62蛋白(聚合酶辅助蛋白)
25ug/ml    45蛋白(聚合酶辅助蛋白)
混合物在37℃孵育30分钟，然后加入10u的T4 DNA连接酶，在37℃再孵育30分钟。通过在70℃孵育15分钟灭活聚合酶和连接酶。基因用Xba I消化，在反应中加入50ul含200ug/ml BSA、1mM DTT、43ul水和5ul Xba I的2×TA。反应在37℃孵育3小时，然后在凝胶上纯化。从凝胶上纯化Xba I片段，然后利用标准方法克隆到质粒pUC19的Xba I位点。利用标准技术纯化质粒，通过双脱氧法测序。
表达人源化轻链和重链的质粒通过如下过程构建：从已插入重链和轻链Xba I片段的pUC19质粒中分离轻链和重链Xba I片段，然后将其插入到合适表达载体的Xba I位点，这种载体被转染到合适的宿主细胞内时可表达高水平的完整重链。
人源化抗体的合成和亲和力
表达载体转染到小鼠Sp2/0细胞内，根据表达载体赋予的可筛选标记物按照标准方法筛选整合了质粒的细胞。为了证明这些细胞能够分泌结合PRLR的抗体，细胞的上清与已知表达PRLR的细胞共孵育。洗涤以后，细胞用荧光素标记的羊抗人抗体标记，洗涤，并在FACSCAN细胞荧光测定仪上测定荧光强度。
体外培养可产生人源化抗体的细胞。按照标准方法，通过蛋白A的亲和层析柱(马萨诸塞州利特尔顿的PC公司(Pro-Chem Inc.，Littleton，MA)或类似装置)从细胞上清液中纯化人源化抗体，使其达到基本匀质化。根据本领域熟知的技术确定人源化抗体相对于起始小鼠抗体的亲和力。
实施例10
小鼠抗体的Human EngineeringTM(人基因工程化)
本实施例描述了Human EngineeredTM抗体(人基因工程抗体)的克隆和表达以及这种抗体的纯化和结合亲和力测定
Human Engineered TM (人基因工程化)序列的设计
抗体可变区的Human EngineeringTM(人基因工程化)已由Studnicka描述[参见，例如，Studnicka等，美国专利号5,766,886；Studnicka等，ProteinEngineering 7：805-814(1994)]，这是一种用于降低抗体分子的免疫原性同时又能保持其结合活性的方法。根据该方法，氨基酸取代可分为风险不同的三组：(1)低风险改变是降低免疫原性的潜能最大而破坏抗原结合活性的可能最小的那些改变；(2)中风险改变是虽然可被用于进一步降低免疫原性，但是有较大可能影响抗原结合或蛋白折叠的那些氨基酸；(3)高风险残基是对于结合或维持抗体结构具有重要作用并且最可能影响抗原结合或蛋白折叠的那些残基。由于脯氨酸在维持三维结构中的作用，通常认为在脯氨酸上进行修饰至少是中风险改变，即使该位置一般是低风险位置。图10显示的是小鼠抗体XHA.06.983、XHA.06.275和XHA.06.642的轻链和重链可变区氨基酸序列。
采用这种方法将小鼠抗体的轻链和重链可变区Human EngineeredTM(人基因工程化)。通过使小鼠可变区的氨基酸序列与人可变区序列一起排列可以鉴定出处于低风险位置并且能够用该方法进行修饰的候选氨基酸残基。所有人可变区都可以应用，其中包括独特的VH或VL序列、或者人共有VH或VL序列。低风险位置上任意数目的氨基酸，或者全部氨基酸残基都可以被改变。
同样，通过使小鼠可变区的氨基酸序列与人可变区序列一起排列可以鉴定出处于低风险和中风险所有位置并且能够用该方法进行修饰的候选氨基酸残基。低风险或中风险位置上任意数目的氨基酸，或者低风险和中风险位置上的全部氨基酸残基都可以被改变。
Human Engineered TM 抗体(人基因工程抗体)序列的制备
编码Human EngineeredTM(人基因工程化)重链和轻链V区序列和信号序列(例如，抗体来源的信号序列)的DNA序列通过合成核苷酸合成技术构建。将编码本文所述的每一种轻链可变区氨基酸序列的DNA插入到包含κ或λ轻链恒定区的载体内。将编码本文所述的每一种重链可变区氨基酸序列的DNA插入到包含γ1、2、3或4重链恒定区的载体内。所有这些载体都包含启动子(例如，hCMV启动子)和3’非翻译区(例如，小鼠κ轻链3’非翻译区)以及其他调节序列，选择何种其他调节序列要根据其用于瞬时表达还是用于稳定细胞系培养而定(美国2006/0121604)。
为了使用上述包含可变区序列的载体表达Human EngineeredTM抗体(人基因工程抗体)，从低风险轻链、低风险+中风险轻链、低风险重链和低风险+中风险重链的不同组合中制备至少四种突变体。在轻链或重链或者二者都不包含中风险改变的那些例子中，可以相应地少制备几个突变体。
瞬时表达载体的制备
构建包含上述轻链或重链基因的载体用于瞬时转染。除了上述HumanEngineeredTM抗体(人基因工程抗体)序列、启动子和轻链3’非翻译区以外，这些载体优选包含EB病毒oriP以便于在表达EB病毒核抗原的HEK293细胞中复制。
Human-Engineered TM PRLR抗体(人基因工程化PRLR抗体)在HEK293细胞 中的瞬时表达
将包含上述EB病毒oriP和重链或轻链基因的各种载体瞬时转染到HEK293细胞内，如美国2006/0121604所述。瞬时转染的细胞培养最多可达10天，然后收集上清，利用蛋白A层析纯化抗体。
用于永生细胞系生长的表达载体的制备
除了上述Human EngineeredTM抗体(人基因工程抗体)序列、启动子和轻链3’非翻译区以外，用于永生细胞系生长的载体还包含可筛选标记基因，如用于分别筛选G418耐药转染子或组氨醇耐药转染子的neo或his。最终构建出的载体包含一个拷贝的重链和一个拷贝的轻链编码区。
永久转染的CHO-K1细胞的培养
上述包含一个拷贝的轻链或重链基因的载体转染到Ex-Cell 302适应的CHO-K1细胞内。适应在Ex-Cell 302培养基内悬浮生长的CHO-K1细胞通常用线性载体转染，线性化的载体是用线性聚乙烯亚胺(PEI)制备的。细胞接种到包含Ex-Cell 302培养基的96孔板中，其中添加了1％FBS和G418。筛选96孔板内的克隆，每个转染最多约有10％的克隆被转移到深孔96孔板中，培养基为添加G418的Ex-Cell 302培养基。
繁殖力试验在深孔96孔板内进行，用Ex-Cell 302培养基培养14天，取此时的上清通过IgG的免疫球蛋白ELISA试验测定分泌的抗体水平。
将顶部克隆转移到含Ex-Cell 302培养基的摇瓶内。用Ex-Cell 302培养基内的这些克隆进行摇瓶试验。细胞在含25ml培养基的125ml锥形瓶中培养14天。在孵育结束时通过IgG ELISA或HPLC测定培养基内的免疫球蛋白多肽的水平。用两种或三种多单位转录载体顺序转染同一细胞系可得到免疫球蛋白表达水平进一步升高的克隆和细胞系，优选表达水平升高到300μg/ml或更高。
纯化
从本发明的载体和所有细胞系来纯化免疫球蛋白多肽的方法已有报道(参见，例如，US 2006/0121604)。例如，根据本领域熟知的方法，培养终止后通过过滤去除细胞。滤液上载到蛋白A色谱柱上(如果需要，可以反复过柱)。洗涤色谱柱，然后从色谱柱洗脱下来分泌的免疫球蛋白多肽。为了制备抗体产物，将蛋白A群置于低pH(在pH3环境中处理30分钟到1小时)环境中作为病毒灭活步骤。然后通过吸附性阳离子交换步骤进一步纯化产物。从吸附性分离柱上洗脱下来的产物通过病毒阻留滤膜以进一步清除可能存在的病毒颗粒。过滤物通过阴离子交换柱进一步纯化，产物不与阴离子交换柱结合。最后，将产物转移到制剂缓冲液中进行透析过滤结束纯化过程。将蛋白浓度调整到至少1mg/mL并添加稳定剂。
结合活性
评价重组Human EngineeredTM抗体(人基因工程抗体)的PRLR结合活性。摇瓶培养物上清通过蛋白A色谱柱以纯化蛋白，然后在A280确定蛋白浓度。结合活性试验按照其他实施例描述的方法进行。
实施例11
人基因工程抗体
上述小鼠抗体中的三种抗体是Human EngineeredTM(人基因工程抗体)，如实施例10所述。
促乳素受体抗体XHA.06.642和XHA.06.275的Human Engineering TM (人基 因工程化)
XHA.06.642的重链在11个低风险位置或13个低+中风险位置上被HumanEngineeredTM(人基因工程化)；轻链只在低风险位置(14个改变)上被HumanEngineeredTM(人基因工程化)，因为所有的中风险位置都已经是人氨基酸。XHA.06.275的重链在7个低风险位置或11个低+中风险位置上被HumanEngineeredTM(人基因工程化)；轻链在8个低风险位置或10个低+中风险位置上被Human EngineeredTM((人基因工程化))。
XHA.06.642、XHA.06.275和XHA.06.983来源的Human-EngineeredTM(人基因工程化)可变区的氨基酸序列显示在下面(下划线部分是CDR)。这些可变区可以各种组合装配(例如SEQ ID NO：88和SEQ ID NO：89；SEQ ID NO：88和SEQ ID NO：90；SEQ ID NO：91和SEQ ID NO：93；SEQ ID NO：91and SEQ IDNO：94；SEQ ID NO：92和SEQ ID NO：93；或SEQ ID NO：92和SEQ ID NO：94)以形成Human-EngineeredTM抗体(人基因工程抗体)he.06.642-1、he.06.642-2、he.06.275-1、he.06.275-2、he.06.275-3、he.06.275-4。
he.06.642  LC可变区低风险(SEQ ID NO：88)：
DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASKSVSTSGYTYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISPVQAEDVATYYCQHSGELPPSFGQGTKLEIK
he.06.642  HC可变区低风险(SEQ ID NO：89)：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTFSSYGMSWVRQAPGKRLEWVATVSSGGTYTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAMYYCARHRGNYYATYYYAMDYWGQGTLVTVSS
he.06.642  HC可变区低风险+中风险(SEQ ID NO：90)：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTFSSYGMSWVRQAPGKGLEWVATVSSGGTYTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHRGNYYATYYYAMDYWGQGTLVTVSS
he.06.275  LC可变区低风险(SEQ ID NO：91)：
DVQITQSPSSLSASPGDRITLTCRASKNIYKYLAWYQEKPGKTNNLLIYS GSTLHSGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAMYYCQQHNDYPYTFGQGTKLEIK
he.06.275  LC可变区低风险+中风险(SEQ ID NO：92)：
DVQITQSPSSLSASPGDRITLTCRASKNIYKYLAWYQEKPGKANKLLIYS GSTLHSGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAMYYCQQHNDYPYTFGQGTKLEIK
he.06.275  HC可变区低风险(SEQ ID NO：93)：
DVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQFPGKKLEWMGYISYSGSTSYNPSLKSRITISRDTSKNQFSLQLNSVTAADTATYFCARDY GYVFDYWGQGTTLTVSS
he.06.275  HC可变区低风险+中风险(SEQ ID NO：94)：
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGYSITSDYAWNWIRQFPGKGLEWMGYISYSGSTSYNPSLKSRITISRDTSKNQFSLQLNSVTAADTAVYFCARDY GYVFDYWGQGTTLTVSS
he.06.983  LC可变区低风险(SEQ ID NO：95)：
DIVMTQSPDSLAVSAGERVTINCKASQGVSNDVAWFQQKPGQSPKLLIYSASTRYTGVPDRLSGSGSGTDFTFTISSVQAEDVAVYFCQQDYTSPTFGQGTKLEIK
he.06.983  LC可变区低风险+中风险(SEQ ID NO：96)：
DIVMTQSPDSLAVSLGERVTINCKASQGVSNDVAWFQQKPGQSPKLLIYSASTRESGVPDRLSGSGSGTDFTFTISSVQAEDVAVYFCQQDYTSPTFGQGTKLEIK
he.06.983  HC可变区低风险(SEQ ID NO：97)：
DVQLVESGGGLVQPGGSRRLSCAASGFAFSSFGMQWVRQAPGKGLEWVAYISSGSSTIYYADTVKGRFTISRDNPKNTLYLQMNSLRAEDTAMYYCVRSGRDYWGQGTLVTVSS
he.06.983  HC可变区低风险+中风险(SEQ ID NO：98)：
EVQLVESGGGLVQPGGSRRLSCAASGFAFSSFGMQWVRQAPGKGLEWVAYISSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNPKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRS GRDYWGQGTLVTVSS
实施例12
he.06.642和he.06.275抗体的表达及纯化
Human EngineeredTM(人基因工程化)he.06.642和he.06.275轻链和重链可变区与人κ和γ-1或γ-2恒定区分别连接。然后将重链和轻链基因连接到强启动子和有效的3’非翻译区上并克隆到包含EB病毒复制起点的瞬时表达载体内。
抗体在HEK293细胞内瞬时表达，使用的质粒分别编码抗体重链和轻链序列，其中重链和轻链序列是各种低风险或低风险+中风险的组合，如实施例10所述。重链∶轻链DNA的比例等于1∶2。利用PEI转染细胞，DNA∶PEI等于1∶2，DNA的浓度为1ug/mL。细胞密度为8e5细胞/mL。DNA利用标准恰根(Qiagen)试剂盒制备。表达培养物在包含IS293培养基(伊耳文科技公司(IrvineScientific))+1％低Ig FBS(海克隆公司(Hyclone))的2L培养瓶内培养，每瓶含400mL培养基。培养条件为37℃、5％CO2、90-95RPM摇动。培养5-7天后，收获培养基，澄清后用于纯化上样。
上述抗体的嵌合形式和Human EngineeredTM形式(人基因工程化形式)的纯化通过一步就可以完成，只需使瞬时表达培养物上清直接通过重组蛋白A快速流动色谱柱(GE健康护理公司)就可以。用pH3.5的0.1mM甘氨酸洗脱主要的峰。混合收集的峰在PBS中透析，利用标称截止分子量为30kD的离心浓缩机浓缩蛋白。最终的纯度可达95％以上，总收率约为60％。利用Endosafe PTS LAL单元(查尔斯河公司(Charles River))或QCL-1000显色LAL终点试验(QCL-1000Chromogenic LAL Endpoint Assay)(隆萨公司(Lonza))分析最终混合物中的内毒素，结果显示所有抗体的内毒素含量都小于0.05EU/mg(在检测限以下)。通过在Superdex 200 10/300GL色谱柱(GE健康护理公司)上进行SEC来确定嵌合抗体he.06.642-2的凝集状态，结果显示这个抗体是单体。
通过一个层析步骤和透析进行缓冲交换可以使chXHA.06.642的纯度达到95％以上。chXHA.06.642在PBS中是可溶性的，浓度为3mg/mL，通过分子排阻层析检测发现其中基本不含杂质或凝集物。
通过流式细胞术检测人基因工程抗人PRLR抗体
收获CHO-K1亲本细胞和表达人促乳素受体(PRLR)的细胞，离心然后悬浮到含2％FBS和0.1％叠氮钠的1×PBS(FACS缓冲液)中，细胞浓度约为5×106/ml。人基因工程抗人PRLR抗体和抗KLH同种型对照抗体用FACS缓冲液稀释到2×终浓度，并加到适当的样品孔中(50ml/孔)。二抗对照和自发荧光对照孔内也加入50ml FACS缓冲液。每个样品孔加入50ml细胞悬液。样品在4℃孵育1小时，用2×冷FACS缓冲液洗涤，然后重悬到包含PE标记的羊抗人IgG(宾西法尼亚州西树林的杰克逊免疫研究公司(JacksonImmunoresearch，West Grove，PA))的FACS缓冲液中，以1∶100稀释。在4℃孵育30分钟后，用2X冷FACS缓冲液洗涤，然后重悬到含1mg/ml碘化丙啶(因维曲根公司，圣地亚哥，加州)的FACS缓冲液中，通过流式细胞仪分析。如表7所示，抗PRLR抗体可结合PRLR表达细胞，但是不结合亲本细胞。
表8
实施例13
Human EngineredTM抗体(人基因工程抗体)的亲和力
通过Biacore分析确定嵌合抗体和Human EngineeredTM抗体(人基因工程抗体)的亲和力。蛋白A/G(皮尔斯公司)通过NHS/EDC固定在CM5传感器芯片(Biacore)上，用于捕获芯片表面上约600RU的抗体。从5ug/ml(185nM)开始以1∶5的比例连续稀释到0.3nM，得到5个浓度的PRLR ECD，以动态滴定注射模式从最低浓度到最高浓度注射，收集15分钟的解离数据。试验设双参照，即自动扣减相邻流动细胞反应(adjacent flow cell response)，从试验数据组减去缓冲液注射试验的反应。通过拟合成1∶1朗缪尔模型来确定动态的和衍生的参数(ka、kd和KD)，拟合采用动态滴定注射模式定制的BiaEval软件进行。抗人和短尾猴PRLR的ECD的嵌合抗体和所有Human EngineeredTM抗体(人基因工程抗体)的亲和力测定数据总结在表9和表10中。
表8
  样品   KD   kd   ka   Chi2
  chXHA.06.275人   3.9E-10   2.7E-04   7.0E+05   0.574
  he.06.275-1人   5.0E-10   3.1E-04   6.2E+05   0.594
  he.06.275-2人   6.1E-10   3.7E-04   6.0E+05   0.532
  he.06.275-3人   4.3E-10   2.7E-04   6.4E+05   0.555
  he.06.275-4人   5.2E-10   3.2E-04   6.2E+05   0.69
  chXHA.06.275短尾猴   1.2E-09   5.0E-04   4.3E+05   1.48
  he.06.275-1短尾猴   1.6E-09   5.7E-04   3.6E+05   2.78
  he.06.275-2短尾猴   1.9E-09   6.9E-04   3.7E+05   1.49
  he.06.275-3短尾猴   1.3E-09   5.0E-04   3.9E+05   1.19
  he.06.275-4短尾猴   1.7E-09   6.0E-04   3.6E+05   1.2
  样品   KD   kd   ka   Chi2
  chXHA.06.642人   1.3E-09   4.6E-04   3.5E+05   5.15
  he.06.642-1人   2.0E-09   3.5E-04   1.7E+05   12.9
  he.06.642-2人   3.1E-09   5.3E-04   1.7E+05   12.6
  chXHA.06.642短尾猴   26E-08   4.3E-03   1.7E+05   12.6
  he.06.642-1短尾猴   3.1E-08   3.8E-03   1.2E+05   8.29
  he.06.642-2短尾猴   4.7E-08   8.3E-03   1.8E+05   11.1
表10
  样品   ka   kd   KD   Res SD
  he.06.6423-G1 lot1   1.038(1)e5   3.828(5)e-4   3.688(5)nM   0.977
  he.06.6423-G1 lot2   1.02E+5   3.88E-4   3.79977nM   1.06
  he.06.6423-G2   9.801(1)e4   4.210(7)e-4   4.296(6)nM   1.054
  chXHA.06.642   1.962(3)e5   6.47E-04   3.296(5)nM   1.389
  CHO.KLHG2-60   无结合   无结合   无结合   无结合
为了利用共价固定的抗体比较大鼠和小鼠的交叉反应，按照Biacore
Figure G2007800302847D01001
公司推荐的方法通过标准EDC-NHS胺偶联化学反应将he.06.642-2和he.06.275-4抗体偶联到CM4芯片上。注射5个浓度的PRLR的ECD，这5个浓度是以111nM开始，以1∶3的比例连续稀释到1.37nM得到的。用pH3.0的甘氨酸再生。XHA.06.642和XHA.06.275的所有HE突变体的亲和力与亲本嵌合抗体的亲和力非常相似。抗体he.06.642-2与人、小鼠和大鼠PRLR结合的亲和力相同。其与短尾猴PRLR结合的亲和力比与人PRLR结合的亲和力低15倍。抗体he.06.275-4与短尾猴PRLR结合的亲和力比与人PRLR结合的亲和力低5倍。抗体he.06.275-4不能有效结合小鼠或大鼠PRLR。这些数据总结在表11中。
表10-某些HE突变体与共价固定的抗体的交叉特异性亲和力分析he.06.642-2结果
  样品   kon   koff   KD(nM)
  he.06.642-2人   3.5E+05   9.1E-04   2.6
  he.06.642-2短尾猴   1.5E+05   6.0E-03   38.9
  he.06.642-2小鼠   1.1E+05   3.1E-04   2.7
  he.06.642-2大鼠   7.6E+04   1.4E-04   1.9
短尾猴KD/人KD＝15
小鼠KD/人KD＝1
大鼠KD/人KD＝0.75
he.06.275-4结果
  样品   kon   koff   KD(nM)
  he.06.275-4人   3.4E+05   4.5E-04   1.3
  he.06.275-4短尾猴   1.3E+05   8.2E-04   6.4
  he.06.275-4小鼠   2.1E+03   3.7E-02   17,613
  he.06.275-4大鼠   0.0E+00   0.0E-00   0
短尾猴KD/人KD＝5
小鼠KD/人KD＝13,548
大鼠KD/人KD＝
实施例14
抑制BaF/PRLR细胞的增殖和存活以及抑制PRLR-诱导的ERK1/2磷酸化
分析嵌合单克隆抗体抑制BaF/PRLR细胞增殖和存活的能力[图11]。结果发现所有被测嵌合抗体都保留了其相应杂交瘤克隆的潜能。事实上，这个试验的结果表明XHA.06.642和XHA.06.275在嵌合后获得了这种潜能。为了分析嵌合抗体在人乳腺癌模型中的PRLR信号中和能力，在用PRL刺激前先用1ug/ml mAb处理T47D细胞30分钟。同时，其他细胞样品只与抗体共孵育以检测候选抗体通过嵌合所获得的潜在激动作用。如图12所示，所有的嵌合抗体都保留了其阻断T47D细胞内PRL诱导的信号转导的能力，但是只有chXHA.06.983可以检测到对PRLR信号转导的诱导作用(虽然很弱，但是确实是具有重现性的效应)，其表现为磷酸-PRLR和磷酸-Stat5。
抗体对ERK1/2磷酸化的效应的测定
按照下文和上述实施例5的描述检测筛选出的Human EngineeredTM抗体(人基因工程抗体)抑制PRLR诱导的ERK1/2磷酸化的能力。
血清饥饿5小时后，T47D细胞接着到包含完全生长培养基的微孔滴定板中，37℃孵育24小时。细胞用于磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤两次，与抗体在37℃共孵育30分钟，其中抗体用包含0.1％BSA的无血清培养基稀释。抗体的终浓度为40ug/ml。去除培养基，添加终浓度为30ng/ml的用含0.1％BSA的无血清培养基稀释的促乳素。细胞与促乳素在37℃共孵育30分钟，然后用冰预冷的PBS洗涤两次。加入包含去污剂、螯合剂和各种蛋白酶以及磷酸酶抑制剂的标准裂解缓冲液以制备细胞裂解物。按照R&D系统公司的DUOSET
Figure G2007800302847D01021
IC磷酸-ERK1/ERK2的说明书利用标准ELISA测定磷酸化的ERK1/2(pERK1/2)的水平。典型试验的结果显示在图13中。
实施例15
A.候选单克隆抗体介导的抗PRLR表达靶细胞ADCC的能力
抗PRLR单克隆抗体的预期机制之一是能够介导抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)。为了分析候选抗体的ADCC能力，T47细胞作为表达PRLR的乳腺上皮靶细胞。如图14所示，两种嵌合的抗PRLR单克隆抗体能够诱导由纯化的人NK细胞介导的ADCC。试验证明chXHA.06.275在4小时内可特异性诱导杀伤约30％的靶细胞。由于chXHA.06.642的制备时间延迟，因此这个候选抗体并没有包括在最初的ADCC试验中。
B.抗PRLR抗体对细胞因子表达水平的影响
利用乳腺癌细胞检测了PRL调控的细胞因子。在这个试验中，MCF7或T47D细胞与PRL共孵育48小时，其中添加或不添加chXHA.06.642。利用MS诊断试剂公司(MesoScale Diagnostics)的多层夹心免疫分析试验测定chXHA.06.642对PRL调节的潜在细胞因子的影响。结果发现PRL可诱导T47D细胞分泌VEGF，但是这个效应可被抗体chXHA.06.642完全阻断。在这些试验中没有检测到PRL或抗PRLR单克隆抗体对IL-1
Figure G2007800302847D01022
、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、p70、IFN-γ或TNF-α的明显调节作用。这些结果说明PRL/PRLR通路可能对血管发生以及乳腺癌的细胞生长和存活有影响，抑制这种VEGF调节通路可能是抗PRLR治疗性抗体的另一种潜在体内作用机制。
C.利用抗PRLR单克隆抗体和化疗药物在体外进行组合试验
由于存在抗PRLR治疗性抗体与细胞毒药物治疗方案组合应用于临床的可能性，因此需要分析这种组合治疗方法对培养细胞的存活能力的效应。为达到此目的，BaF3/PRLR细胞用各种浓度的chXHA.06.642或chXHA.06.275以及化疗药物处理5天，然后利用CellTiter Glo测定细胞的存活能力，以细胞数为指标。下面一组临床相关和机制各异(mechanistically diverse)的细胞毒药物用于这个试验：阿霉素(蒽环类拓扑异构酶II抑制剂)、紫杉醇(微管稳定剂)、氟达拉滨(抗代谢药)和顺铂(以铂为基础的DNA交联药)。结果发现chXHA.06.275和chXHA.06.642与阿霉素有协同效应，可增加BaF/PRLR细胞的死亡，其中chXHA.06.642的作用更明显[参见图15]。添加或不添加抗PRLR单克隆抗体chXHA.06.642和chXHA.06.275的化疗IC50值之间的差异显示在表11中。
表11
  细胞毒药物   KLH(1ug/ml)   chXHA.06.642(1ug/ml)   chXHA.06.275(1ug/ml)
  阿霉素   6.44nM   2.14nM   2.56nM
  紫杉醇   4.14nM   2.07nM   2.45nM
  氟达拉滨   104.6uM   40.0uM   93.8uM
  顺铂   165.5nM   27.6nM   46.8nM
D.抗PRLR单克隆抗体的抗PRLR功能活性
利用靶调节和细胞增殖试验评价抗体。图16显示的是两个浓度的chXHA.06.642和Human EngineeredTM抗体(人基因工程抗体)he.06.642-1及he.06.642-2在T47D细胞内PRL诱导的Stat5磷酸化的影响。两个浓度的抗体都具有很强的拮抗活性，结果表现为p-Stat5信号完全被抑制。另外，所有抗体都没有激动活性，仅用单克隆抗体处理的细胞也是如此。chXHA.06.275突变体也得到了相似的结果。因此，Human EngineeringTM(人基因工程化)不会对这些抗体的整体拮抗或激动特性产生影响。
BaF/PRLR细胞增殖试验用于确定抗PRLR嵌合抗体和HumanEngineeredTM抗体(人基因工程抗体)的相对IC50值[参见图17]。这些试验的结果表明，所有Human EngineeredTM抗体(人基因工程抗体)都与其小鼠对应物的能力相似。
实施例16
在Nb2-C11大鼠淋巴瘤模型中评价抗PRLR抗体的抗肿瘤活性
在Nb2-C11肿瘤异种移植物模型中用chXHA.06.642进行单剂量PD试验以确定抗PRLR单克隆抗体释放能够作用于肿瘤并阻断信号转导。抗体chXHA.06.642用于此试验是基于它与大鼠PRLR的亲和力(如上所述)。监测的PD标志物是p-STAT5，这是PRLR信号途径的一个下游介质，利用免疫印迹或IHC方法可检测该物质。由于Nb2-C11肿瘤异种移植物中的基础p-STAT5水平太低，难以检测，因此小鼠要用外源的羊(o)PRL刺激以提高基础p-STAT5水平，这样可以提供一个更合适的动态范围。
通过蛋白质印迹和IHC试验检测携带Nb2-C11肿瘤的小鼠体内的p-STAT5，并且比较注射羊PRL和注射盐水的动物之间的差异[参见图18A和B]。结果显示，在oPRL注射前48小时用10mg/kg chXHA.06.642处理小鼠可抑制p-STAT5，但是用KLH IgG1处理的对照动物却没有出现这种结果。
为了确定PRLR信号转导的抑制是否与Nb2-C11肿瘤生长的抑制相关，通过每周一次给予chXHA.06.642进行多剂量效应研究[参见图19A和B]。在细胞植入后4天(肿瘤生长到可触及前)开始给予10mg/kg的chXHA.06.642或KLH IgG1或者盐水对照。腹膜内注射单克隆抗体，每周一次，连续四周。模型采用条件存活或发展到终点的时间来评价，由于这些肿瘤侵入肌肉而难以用卡钳准确测量。chXHA.06.642处理组的某些肿瘤直到植入后约11周也未检测到(第四次注射单克隆抗体后7.5周)，但是这个组的15只动物中有两只因肿瘤而死亡。盐水和KLH IgG1对照处理组的中位存活时间为细胞植入后20天(p＜0.0001)，在此时动物因肿瘤负荷过大而被处死。chXHA.06.642处理组的动物体重增加，而对照动物体重未增加或有下降，可能是因为疾病负担造成的。
这个试验还包括第二功效评定分支(second efficacy arm)，其中，在细胞植入后12天加入已建立肿瘤的动物[参见图20A和B]。在开始给药时肿瘤平均体积为135mm3。动物腹膜内注射10mg/kg chXHA.06.642，每周一次，或KLHIgG1对照抗体共两次。第二次给药后两天(植入后3周)肿瘤被完全抑制。但是，大约两周后肿瘤在小鼠体内又重新出现。与此相比，KLH IgG1对照动物有很大的肿瘤负荷，肿瘤平均体积超过600mm3。由于这些肿瘤直接长入肌肉，肿瘤平均体积可能比卡钳记录的还要大。盐水组和KLH IgG1组的平均存活时间为细胞植入后23天(p＝0＜0.0001)。在这个初步试验中，chXHA.06.642处理组的动物体重增加，而对照组的动物体重不变或下降。因此，chXHA.06.642mAb不仅可以有效抑制低数目的肿瘤细胞(植入后治疗开始4天)，而且能够完全抑制已建立超过两周的侵袭性Nb2-C11肿瘤。
Nb2-C11模型证明抗PRLR单克隆抗体能够有效靶向到体内的表达靶抗原的肿瘤，抑制肿瘤内PLR启动的信号转导，以及诱导肿瘤负荷出现可测量的结果，即使动物已经建立了侵袭性的肿瘤。
实施例17
PD评价所用的人乳腺癌T47D模型
利用乳腺癌T47D细胞和实施例16检测的抗体chXHA.06.642A进行体内单剂量PD研究。利用体内试验评价oPRL刺激PRLR信号转导的能力以及chXHA.06.642抑制这种信号转导的能力。植入肿瘤的动物腹膜内注射盐水、KLH IgG1对照单克隆抗体或chXHA.06.642，48小时后通过单次快速注射给予盐水或20ug oPRL。40分钟后收取肿瘤组织。通过蛋白质印迹分析发现，oPRL处理动物的肿瘤内可以看到明显的p-STAT5，但是盐水对照组动物的肿瘤没有观察到，虽然IHC分析的结果有些小的不同(图21)。oPRL体内刺激不会升高p-AKT和p-ERK的水平。有意义的是，用chXHA.06.642而不是KLH IgG1对照抗体处理可强烈抑制oPRL-注射后诱导的p-STAT5。IHC分析的结果通常与此结果一致。蛋白质印迹和IHC分析的结果都证明，所有4只chXHA.06.642处理动物的肿瘤内的p-STAT5都被抑制。
实施例18
PRLR表达以及PRLR表达与ER和Her2-neu表达的关系
通过RT-PCR定量检测发现，在正常组织中，PRLR的表达水平在乳腺和子宫中最高，随后是肾、肝脏、前列腺和卵巢。气管、脑和肺中的PRLR mRNA的水平最低(Pierce SK，等，J Endocr；171(1)：R1-R4(2001))。
免疫组化(IHC)分析按如下方法进行。取自癌症患者的冷冻组织样品放入最佳切割温度(OCT)化合物中，在含干冰的异戊醇中快速冷冻。用Leica 3050CM微切皮机(mictrotome)将样品切成5μm厚的冷冻切片，并融裱在vectabound-包被的玻片上。切片用-20℃的乙醇固定，室温下过夜使其干燥。固定的切片储存于-80℃备用。取出组织切片，首先放入封闭缓冲液(PBS，5％正常羊血清，0.1％吐温20)中，室温放置30分钟，然后与封闭缓冲液稀释的癌症相关蛋白特异性单克隆抗体和对照单克隆抗体(1μg/ml)共孵育120分钟。切片用封闭缓冲液洗涤三次。用羊抗鼠IgG+IgM(H+L)F(ab’)2-过氧化物酶和0.1M乙酸钠缓冲液(pH 5.05)溶解的过氧化物酶底物二氨基联苯(1mg/ml，西格玛(Sigma)，目录号D 5637)以及0.003％过氧化氢(西格玛，目录号H1009)检测结合的单克隆抗体。染色的玻片用苏木精反染色，然后在尼康显微镜下观察。
抗癌症相关蛋白(抗原)的单克隆抗体用于检测与不同类型的组织来源的各种细胞系的反应性。不用蛋白酶消化从生长表面上取下不同确立细胞系来源的细胞，包裹后包埋到OCT化合物中。细胞冷冻后切片，然后用标准IHC方法染色。CellArrayTM技术见于WO 01/43869的描述。手术切除得到的正常组织(人)冷冻并包埋。用Leica 3050CM微切皮机将样品切成5μm厚的冷冻切片，并融裱在vectabound-包被的玻片上。切片用-20℃的乙醇固定，室温下过夜使其干燥。PolyMICATM检测试剂盒用于确定癌症相关抗原特异性单克隆抗体与正常组织的结合。初级单克隆抗体的使用终浓度为1μg/ml。
为了检测PRLR的表达水平及其与ER和Her2-neuB表达的关系，利用免疫组化(IHC)技术分析122个侵润性乳腺癌患者的标本。总之，62/122(50％)的样品表达PRLR，58/122(47％)表达ER，32/122(26％)表达Her2-neu。96(78％)个样品是侵润性导管癌，其中有48(50％)个表达PRLR。在这些样品中，24/48(50％)也表达ER，13/48(26％)也表达Her2-neu。
上述所有美国专利、美国专利申请出版物、美国专利申请、外国专利、外国专利申请以及本说明书参考的和/或申请书数据表中所列的非专利出版物都已完整纳入作为参考。
从上文可以看出，虽然本文为了阐述本发明已经描述了本发明的特殊实施方式，但是只要不偏离本发明的精神和范围可以作出各种改变。
序列表
<110>贝丁格尔(Bedinger)等
<120>PRLR特异性抗体及其用途
<130>27527/43177
<150>60/838648
<151>2006-08-18
<150>60/946360
<151>2007-06-26
<160>98
<170>PatentIn版本3.4
<210>1
<211>1846
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>1
atgaaggaaa atgtggcatc tgcaaccgtt ttcactctgc tactttttct caacacctgc   60
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<210>2
<211>622
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>2
Met Lys Glu Asn Val Ala Ser Ala Thr Val Phe Thr Leu Leu Leu Phe
1               5                   10                  15
Leu Asn Thr Cys Leu Leu Asn Gly Gln Leu Pro Pro Gly Lys Pro Glu
            20                  25                  30
Ile Phe Lys Cys Arg Ser Pro Asn Lys Glu Thr Phe Thr Cys Trp Trp
        35                  40                  45
Arg Pro Gly Thr Asp Gly Gly Leu Pro Thr Asn Tyr Ser Leu Thr Tyr
    50                  55                  60
His Arg Glu Gly Glu Thr Leu Met His Glu Cys Pro Asp Tyr Ile Thr
65                  70                  75                  80
Gly Gly Pro Asn Ser Cys His Phe Gly Lys Gln Tyr Thr Ser Met Trp
                85                  90                  95
Arg Thr Tyr Ile Met Met Val Asn Ala Thr Asn Gln Met Gly Ser Ser
            100                 105                 110
Phe Ser Asp Glu Leu Tyr Val Asp Val Thr Tyr Ile Val Gln Pro Asp
        115                 120                 125
Pro Pro Leu Glu Leu Ala Val Glu Val Lys Gln Pro Glu Asp Arg Lys
    130                 135                 140
Pro Tyr Leu Trp Ile Lys Trp Ser Pro Pro Thr Leu Ile Asp Leu Lys
145                 150                 155                 160
Thr Gly Trp Phe Thr Leu Leu Tyr Glu Ile Arg Leu Lys Pro Glu Lys
                165                 170                 175
Ala Ala Glu Trp Glu Ile His Phe Ala Gly Gln Gln Thr Glu Phe Lys
            180                 185                 190
Ile Leu Ser Leu His Pro Gly Gln Lys Tyr Leu Val Gln Val Arg Cys
        195                 200                 205
Lys Pro Asp His Gly Tyr Trp Ser Ala Trp Ser Pro Ala Thr Phe Ile
    210                 215                 220
Gln Ile Pro Ser Asp Phe Thr Met Asn Asp Thr Thr Val Trp Ile Ser
225                 230                 235                 240
Val Ala Val Leu Ser Ala Val Ile Cys Leu Ile Ile Val Trp Ala Val
                245                 250                 255
Ala Leu Lys Gly Tyr Ser Met Val Thr Cys Ile Phe Pro Pro Val Pro
            260                 265                 270
Gly Pro Lys Ile Lys Gly Phe Asp Ala His Leu Leu Glu Lys Gly Lys
        275                 280                 285
Ser Glu Glu Leu Leu Ser Ala Leu Gly Cys Gln Asp Phe Pro Pro Thr
    290                 295                 300
Ser Asp Tyr Glu Asp Leu Leu Val Glu Tyr Leu Glu Val Asp Asp Ser
305                 310                 315                 320
Glu Asp Gln His Leu Met Ser Val His Ser Lys Glu His Pro Ser Gln
                325                 330                 335
Gly Met Lys Pro Thr Tyr Leu Asp Pro Asp Thr Asp Ser Gly Arg Gly
            340                 345                 350
Ser Cys Asp Ser Pro Ser Leu Leu Ser Glu Lys Cys Glu Glu Pro Gln
        355                 360                 365
Ala Asn Pro Ser Thr Phe Tyr Asp Pro Glu Val Ile Glu Lys Pro Glu
    370                 375                 380
Asn Pro Glu Thr Thr His Thr Trp Asp Pro Gln Cys Ile Ser Met Glu
385                 390                 395                 400
Gly Lys Ile Pro Tyr Phe His Ala Gly Gly Ser Lys Cys Ser Thr Trp
                405                 410                 415
Pro Leu Pro Gln Pro Ser Gln His Asn Pro Arg Ser Ser Tyr His Asn
            420                 425                 430
Ile Thr Asp Val Cys Glu Leu Ala Val Gly Pro Ala Gly Ala Pro Ala
        435                 440                 445
Thr Leu Leu Asn Glu Ala Gly Lys Asp Ala Leu Lys Ser Ser Gln Thr
    450                 455                 460
Ile Lys Ser Arg Glu Glu Gly Lys Ala Thr Gln Gln Arg Glu Val Glu
465                 470                 475                 480
Ser Phe His Ser Glu Thr Asp Gln Asp Thr Pro Trp Leu Leu Pro Gln
                485                 490                 495
Glu Lys Thr Pro Phe Gly Ser Ala Lys Pro Leu Asp Tyr Val Glu Ile
            500                 505                 510
His Lys Val Asn Lys Asp Gly Ala Leu Ser Leu Leu Pro Lys Gln Arg
         515                 520                 525
Glu Asn Ser Gly Lys Pro Lys Lys Pro Gly Thr Pro Glu Asn Asn Lys
    530                 535                 540
Glu Tyr Ala Lys Val Ser Gly Val Met Asp Asn Asn Ile Leu Val Leu
545                 550                 555                 560
Val Pro Asp Pro His Ala Lys Asn Val Ala Cys Phe Glu Glu Ser Ala
                565                 570                 575
Lys Glu Ala Pro Pro Ser Leu Glu Gln Asn Gln Ala Glu Lys Ala Leu
            580                 585                 590
Ala Asn Phe Thr Ala Thr Ser Ser Lys Cys Arg Leu Gln Leu Gly Gly
        595                 600                 605
Leu Asp Tyr Leu Asp Pro Ala Cys Phe Thr His Ser Phe His
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Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
            20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ash Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Thr Pro Val Val Val Ala Pro Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
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Val Thr Val
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<212>PRT
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Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
l               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
            20                  25                  30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Ile Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ala Ser Ser Thr Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
           100                 105                 110
Thr Val
<210>23
<211>110
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<221>misc_feature
<222>(84)..(84)
<223>Xaa可以是任何天然氨基酸
<400>23
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn
            20                  25                  30
Ala Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Asp Asn Tyr Arg Arg Pro Pro Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65                  70                  75                  80
Ser Glu Asp Xaa Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Val Trp Asp Gly Arg Leu
                85                  90                  95
Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
            100                 105                 110
<210>24
<211>113
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>24
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
            20                  25                  30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Val Val Ala Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Thr Thr Tyr Val Pro Tyr Ser Arg Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
            100                 105                 110
Val
<210>25
<211>110
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>25
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
            20                  25                  30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65                  70                  75                  80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
                85                  90                  95
Ser Gly Pro Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
            100                 105                 110
<210>26
<211>114
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>26
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr
            20                  25                  30
Pro Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Thr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Asp Asn Pro Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Ala
            100                 105                 110
Thr Val
<210>27
<211>112
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>27
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn
            20                  25                  30
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Asp Asn Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65                  70                  75                  80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Glu Ala Trp Asp Asp Thr Leu
                85                  90                  95
Asn Gly Pro His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
            100                 105                 110
<210>28
<211>116
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>28
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ser
            20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Ala Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ala Asp Ser Ser Gly Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Leu Val Thr Val
        115
<210>29
<211>110
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>29
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
l               5                   10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Asn Ser Asn Ile Gly Ser Asn
            20                  25                  30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Asp Asn Tyr Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65                  70                  75                  80
Ser Lys Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
                85                  90                  95
Asn Gly Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
            100                 105                 110
<210>30
<211>119
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>30
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Ala Ile Gly Gly Arg Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gly Ser Asn Trp Thr His Ala Leu Gly Phe Asp Pro Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Vat
        115
<210>31
<211>110
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>31
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
            20                  25                  30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65                  70                  75                  80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Gly Trp Asp Gly Arg Leu
                85                  90                  95
Ile Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
            100                 105                 110
<210>32
<211>116
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>32
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
l               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
            20                  25                  30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Leu Ile Ser Trp Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Thr Gly Ile Ala Val Ala Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Leu Val Thr Val
        115
<210>33
<211>110
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>33
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
            20                  25                  30
Ala Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Asp Ser Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65                  70                  75                  80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asn Ser Leu
                85                  90                  95
Asn Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
            100                 105                 110
<210>34
<211>114
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>34
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Leu Ile Ser Trp Asp Gly Tyr Arg Thr His Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Thr Thr Gly Ala Ser Tyr His Ala Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
            100                 105                 110
Thr Val
<210>35
<211>110
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>35
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Arg Ser Asn Ile Gly Asn Asn
            20                  25                  30
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Asp Asp Ile Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65                  70                  75                  80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Asp Ser Leu
                85                  90                  95
Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
            100                 105                 110
<210>36
<211>112
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>36
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
            20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Leu Ile Ser Phe Asp Gly Ser Lys Thr Asn Tyr Gly Gly Pro Val
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Glu Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Thr Arg Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
            100                 105                 110
<210>37
<211>109
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>37
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
            20                  25                  30
Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65                  70                  75                  80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
                85                  90                  95
Lys Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
            100                 105
<210>38
<211>115
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>38
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Phe Ite Ser Tyr Asp Gly Asn Lys Glu Ser Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Lys Gly Gly Tyr Gly Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
            100                 105                 110
Val Thr Val
        115
<210>39
<211>110
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>39
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Asn Ser SerAsn Ile Gly Ser Asn
            20                  25                  30
Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65                  70                  75                  80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
                85                  90                  95
Ser Gly Arg Val Phe Gly Gly Arg Thr Lys Leu Thr Val Leu
            100                 105                 110
<210>40
<211>118
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>40
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Ser Tyr
            20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Leu Ile Ser Trp Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Ser Ser Ile Ser Ala Ala Ala Thr Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val
        115
<210>41
<211>110
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>41
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Thr Ser Asn Ile Gly Ser Asn
            20                  25                  30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Val Pro Lys Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Glu Asn Lys Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65                  70                  75                  80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
                85                  90                  95
Ser Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
            100                 105                 110
<210>42
<211>119
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>42
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Phe Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Thr Arg Arg Ala Ile Ala Val Ala Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
        115
<210>43
<211>111
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>43
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ala Ser Asn Ile Gly Ile Asn
            20                  25                  30
Gly Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65                  70                  75                  80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
                85                  90                  95
Ser Gly Gln Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
            100                 105                 110
<210>44
<211>118
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>44
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
            20                  25                  30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Leu Ile Ser Trp Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Pro Ser Gly Ala Tyr Pro Thr Pro Phe Asp Asn Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val
        115
<210>45
<211>110
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>45
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
l               5                   10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Thr Ser Asn Ile Gly Ser Asn
            20                  25                  30
Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65                  70                  75                  80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
                85                  90                  95
Ser Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
            100                 105                 110
<210>46
<211>114
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>46
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Gly
            20                  25                  30
Pro Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gly Ala Glu Ile Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
            100                 105                 110
Thr Val
<210>47
<211>110
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>47
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
            20                  25                  30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Gly Asn Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65                  70                  75                  80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Asp Asp Ser Leu
                85                  90                  95
Ser Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
            100                 105                 110
<210>48
<211>111
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>48
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
            20                  25                  30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Leu Ile Ser Trp Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Thr Arg Gly Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
            100                 105                 110
<210>49
<211>108
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>49
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
            20                  25                  30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65                  70                  75                  80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Met Ile Trp Pro Ser Asn Ala
                85                  90                  95
Trp Val Phe Gly Gly Arg Thr Lys Leu Thr Val Leu
            100                 105
<210>50
<211>114
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>50
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Lys Ser Ser
            20                  25                  30
Pro Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Gly Val Ser Trp Asn Gly Ser Arg Thr His Tyr Val Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Arg Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gly Ala Pro Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
            100                 105                 110
Thr Val
<210>51
<211>110
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>51
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Thr Thr Ser Ser Ile Gly Ser Asn
            20                  25                  30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65                  70                  75                  80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
                85                  90                  95
Asn Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
            100                 105                 110
<210>52
<211>118
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>52
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Gly Val Gly Ser Ser Gly Val Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Val Gly Ala Thr Ser Ser Thr His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val
        115
<210>53
<211>110
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>53
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Arg Phe Asn Ile Gly Ser Asn
            20                  25                  30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Arg Asn Glu Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Ser Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65                  70                  75                  80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Gly Ser Leu
                85                  90                  95
Ser Ala Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
            100                 105                 110
<210>54
<211>116
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<221>misc_feature
<222>(103)..(103)
<223>Xaa可以是任何天然氨基酸
<400>54
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Ala Ile Ser Tyr Glu Gly Ser Thr Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Ser Gly Val Tyr Tyr Xaa Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Leu Val Thr Val
        115
<210>55
<211>110
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>55
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Thr Ser Asn Ile Gly Asn Ser
            20                  25                  30
His Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Asn Asp Asn Leu Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65                  70                  75                  80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu
                85                  90                  95
Ile Gly Trp Met Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Lys Val Leu
            100                 105                 110
<210>56
<211>116
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>56
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vat Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ata Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Leu Asn Arg Ala Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 1l0
Leu Val Thr Val
        115
<210>57
<211>110
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>57
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
 1              5                  10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Arg Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
            20                  25                  30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Lys Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65                  70                  75                  80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Val Trp Asp Gly Ser Leu
                85                  90                  95
Ser Gly Trp Ala Phe Gly Gly Arg Thr Lys Leu Thr Val Leu
            100                 105                 110
<210>58
<211>112
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>58
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Leu Ile Ser Trp Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gly Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
            100                 105                 110
<210>59
<211>110
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>59
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
            20                  25                  30
Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65                  70                  75                  80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Gly Ser Leu
                85                  90                  95
Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
            100                 105                 110
<210>60
<211>111
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>60
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Tyr
            20                  25                  30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Gly Val Ser Trp Asn Gly Ser Arg Thr Hi s Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Thr Thr Val Ser Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
            100                 105                 110
<210>61
<211>111
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>61
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
            20                  25                  30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
        35                  40                  45
Leu Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu
65                  70                  75                  80
Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
                85                  90                  95
Leu Ser Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
            100                 105                 110
<210>62
<211>118
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>62
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gly Gly Gly Gln Gln Leu Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val
        115
<210>63
<211>110
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>63
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
            20                  25                  30
Phe Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Gly Asn Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65                  70                  75                  80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Gly Ser Leu
                85                  90                  95
Ser Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
            100                 105                 110
<210>64
<211>117
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>64
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
            20                  25                  30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Thr Ala Phe Thr Gly Pro Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val
        115
<210>65
<211>110
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>65
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
l               5                   10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
            20                  25                  30
Ala Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Thr Asn Thr Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65                  70                  75                  80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
                85                  90                  95
Asn Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
            100                 105                 110
<210>66
<211>115
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>66
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr
            20                  25                  30
Pro Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Ala Ser Gln Thr Tyr Tyr Ala Glu Pro Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gly Thr Tyr Gly Leu Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
            100                 105                 110
Val Thr Val
        115
<210>67
<211>109
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<221>misc_feature
<222>(10)..(10)
<223>Xaa可以是任何天然氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(38)..(38)
<223>Xaa可以是任何天然氨基酸
<400>67
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Xaa Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn
            20                  25                  30
Tyr Val Ser Trp Tyr Xaa Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65                  70                  75                  80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
                85                  90                  95
Ser Gly Val Phe Gly Gly Arg Thr Lys Leu Thr Val Leu
            100                 105
<210>68
<211>112
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>68
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
            20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Leu Ile Ser Trp Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ile Gly Ser Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
            100                 105                 110
<210>69
<211>110
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<221>misc_feature
<222>(72)..(72)
<223>Xaa可以是任何天然氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(82)..(82)
<223>Xaa可以是任何天然氨基酸
<400>69
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
            20                  25                  30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Asp Asn Asp Arg Arg Pro Leu Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Xaa Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65                  70                  75                  80
Ser Xaa Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
                85                  90                  95
Ser Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
            100                 105                 110
<210>70
<211>116
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>70
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asn Tyr
            20                  25                  30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Ser Trp Leu Gln Val Asp Ala Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Leu Val Thr Val
        115
<210>71
<211>110
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>71
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
            20                  25                  30
Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65                  70                  75                  80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Asp Ser Leu
                85                  90                  95
Asn Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
            100                 105                 110
<210>72
<211>112
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>72
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
            20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Leu Ile Ser Phe Asp Gly Ser Lys Thr Asn Tyr Gly Gly Pro Val
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Glu Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Thr Arg Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
            100                 105                 110
<210>73
<211>109
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>73
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Arg Va1 Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
            20                  25                  30
Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65                  70                  75                  80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
                85                  90                  95
Lys Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
            100                 105
<210>74
<211>115
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>74
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
            20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Leu Ile Ser Trp Asp Gly Gly Arg Thr Ser Tyr Thr Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gly Leu Ile Gly Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
            100                 105                 110
Val Ser Ser
        115
<210>75
<211>111
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>75
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
            20                  25                  30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
        35                  40                  45
Leu Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu
65                  70                  75                  80
Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser
                85                  90                  95
Leu Asn Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
            100                 105                 110
<210>76
<211>384
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>76
atgaagtcac agacccaggt cttcgtattt ctactgctct gtgtgtctgg tgctcatggg   60
agtattgtga tgacccagac tcccaaattc ctgcttgtat cagcaggaga cagggttacc  120
ataacctgca aggccagtca gggtgtgagt aatgatgtag cttggttcca gcagaagcca  180
gggcagtctc ctaaactgct gatatactct gcatccactc gctacactgg agtccctgat  240
cgcctcactg gcagtggata tgggacggat ttcactttca ccatcaacac tgtgcaggct  300
gaagacctgg cagtttactt ctgtcagcag gattatacct ctccgacgtt cggtggaggc  360
accaagctgg aaatcaaacg ggct                                         384
<210>77
<211>399
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>77
atggactcca ggctcaattt agttttcctt gtccttattt taaaaggtgt ccagtgtgac   60
gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcttg gtgcagcctg gagggtcccg gaaactctcc  120
tgtgcagcct ctggattcgc tttcagtagt tttggaatgc agtgggttcg tcaggctcca  180
gagaaggggc tggagtgggt cgcatatatt agtagtggca gtagtaccat ctactatgca  240
gacacagtga agggccgatt caccatctcc agagacaatc ccaagaacac cctgttcctg  300
caaatgacca gtctaaggtc tgaggacacg gccatgtatt actgtgtaag atctgggagg  360
gactactggg gtcaaggaac ctcagtcacc gtcagctca                         399
<210>78
<211>387
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>78
atgaggttcc aggttcaggt tctggggctc cttctgctct ggatatcagg tgcccagtgt   60
gatgtccaga taacccagtc tccatcttat cttgctgcat ctcctggaga aaccattact  120
cttaattgca gggcaagtaa gaacatttac aaatatttag cctggtatca agaaaaacct  180
gggaaaacta ataaccttct tatctactct ggatccactt tgcattctgg aattccatca  240
aggttcagtg gcagtggatc tggtacagat ttcactctca ccatcagtag cctggatcct  300
gaagattttg caatgtatta ctgtcaacag cataatgatt acccgtacac gttcggaggg  360
gggaccaagc tggagataaa acgggct                                      387
<210>79
<211>405
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>79
atgagagtgc tgattctttt gtggctgttc acagcctttc ctggtatcct gtctgatgtg   60
cagcttcagg agtcgggacc tggcctggtg aagccttctc agtctctgtc cctcacctgc  120
actgtcactg gctactcaat caccagtgat tatgcctgga actggatccg gcagtttcca  180
ggaaacaaac tggagtggat gggctacata agttacagtg gtagtactag ctacaaccca  240
tctctcaaaa gtcgaatctc tatcactcga gacacatcca agaaccagtt cttcctgcag  300
ttgaattctg tgactactga ggacacagcc acatattttt gtgcaagaga ctacggctac  360
gtctttgact actggggcca aggcaccact ctcacagtct cctca                  405
<210>80
<211>399
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>80
atggagacag acacactcct gttatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt   60
gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gggggccacc  120
atctcatgca gggccagcaa aagtgtcagt acatctggct atacttatat gcactggtac  180
caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatc ttgcatccaa cctagaatct  240
ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat  300
cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc acagtgggga gcttcctccc  360
tcgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaacgggct                         399
<210>81
<211>429
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>81
atgaacttcg ggctcagctt gattttcctt gccctcattt taaaaggtgt ccagtgtgag   60
gtgcagctgg tggagtctgg gggagactta gtgaagcctg gagggtccct gaaactctcc  120
tgtgcagtct ctggattcac tttcagtagc tatggcatgt cttgggttcg ccagactcca  180
gacaagaggc tggagtgggt cgcaaccgtt agtagtggtg gtacttacac ctactatcca  240
gacagtgtga aggggcgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg  300
caaatgagca gtctgaagtc tgaggactca gccatgtatt actgtgcaag acatagggga  360
aactactatg ctacttatta ctatgctatg gactactggg gtcaaggaac ctcagtcacc  420
gtctcctcg                                                          429
<210>82
<211>108
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>82
Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Gly Val Ser Asn Asp
            20                  25                  30
Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ser Ala Ser Thr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Leu Thr Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Asn Thr Val Gln Ala
65                  70                  75                  80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Thr Ser Pro Thr
                85                  90                  95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala
            100                 105
<210>83
<211>114
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>83
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Phe
            20                  25                  30
Gly Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Phe
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Val Arg Ser Gly Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val
            100                 105                 110
Ser Ser
<210>84
<211>109
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>84
Asp Val Gln Ile Thr Gln Ser Pro Ser Tyr Leu Ala Ala Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Thr Ile Thr Leu Asn Cys Arg Ala Ser Lys Asn Ile Tyr Lys Tyr
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Thr Asn Asn Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ser Gly Ser Thr Leu His Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Asp Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Asp Tyr Pro Tyr
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala
            100                 105
<210>85
<211>117
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>85
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
            20                  25                  30
Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
        35                  40                  45
Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu
    50                  55                  60
Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65                  70                  75                  80
Leu Gln Leu Ash Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Asp Tyr Gly Tyr Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
            100                 105                 110
Leu Thr Val Ser Ser
        115
<210>86
<211>113
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>86
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Gln Gly Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
            20                  25                  30
Gly Tyr Thr Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
        35                  40                  45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
    50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65                  70                  75                  80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Gly
                85                  90                  95
Glu Leu Pro Pro Ser Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
            100                 105                 110
Ala
<210>87
<211>124
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>87
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
l               5                  10                  15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Thr Val Ser Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Ser Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg His Arg Gly Asn Tyr Tyr Ala Thr Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp
            100                 105                 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>88
<211>111
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>88
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
            20                  25                  30
Gly Tyr Thr Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
        35                  40                  45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp
    50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65                  70                  75                  80
Pro Val Gln Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Gly
                85                  90                  95
Glu Leu Pro Pro Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210>89
<211>124
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>89
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Thr Val Ser Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg His Arg Gly Asn Tyr Tyr Ala Thr Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp
            100                 105                 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>90
<211>124
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>90
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Thr Val Ser Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg His Arg Gly Asn Tyr Tyr Ala Thr Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp
            100                 105                 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>91
<211>107
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>91
Asp Val Gln Ile Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Ile Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Lys Asn Ile Tyr Lys Tyr
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Thr Asn Asn Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ser Gly Ser Thr Leu His Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Asp Tyr Pro Tyr
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105
<210>92
<21l>107
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>92
Asp Val Gln Ile Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Ile Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Lys Asn Ile Tyr Lys Tyr
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Ala Asn Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ser Gly Ser Thr Leu His Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Asp Tyr Pro Tyr
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105
<210>93
<211>117
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>93
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
            20                  25                  30
Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Lys Lys Leu Glu Trp
        35                  40                  45
Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu
    50                  55                  60
Lys Ser Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65                  70                  75                  80
Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Asp Tyr Gly Tyr Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
            100                 105                 110
Leu Thr Val Ser Ser
        115
<210>94
<211>117
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>94
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
            20                  25                  30
Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
        35                  40                  45
Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu
    50                  55                  60
Lys Ser Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65                  70                  75                  80
Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Asp Tyr Gly Tyr Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
            100                 105                 110
Leu Thr Val Ser Ser
        115
<210>95
<211>106
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>95
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Val Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Gly Val Ser Asn Asp
           20                  25                  30
Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ser Ala Ser Thr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Leu Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65                  70                  75                  80
Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Thr Ser Pro Thr
                85                  90                  95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105
<210>96
<211>106
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>96
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Val Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Gly Val Ser Asn Asp
            20                  25                  30
Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ser Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Leu Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65                  70                  75                  80
Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Thr Ser Pro Thr
                85                  90                  95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105
<210>97
<211>114
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>97
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Arg Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Phe
            20                  25                  30
Gly Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Val Arg Ser Gly Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
          100                 105                 110
Ser Ser
<210>98
<211>114
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>98
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Arg Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Phe
            20                  25                  30
Gly Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Val Arg Ser Gly Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
            100                 105                 110
Ser Ser

Claims (1)

1.与PRLR胞外域结合的抗体，所述抗体中VL的CDR1是SEQ ID NO：88中的氨基酸位点24-38，CDR2是SEQ ID NO:88中的位点54-60，和CDR3是SEQ ID NO:88中的位点93-101，其中VH的CDR1是SEQ ID NO:90的位点31-35,CDR2是SEQ ID NO:90的位点50-66，和CDR3是SEQ ID NO:90的位点99-113。
2.   如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体是嵌合抗体、人源化抗体、人基因工程抗体、人抗体。
3.   如权利要求1或2中所述的抗体，所述抗体包含人抗体序列的恒定区和人抗体序列的一个或多个重链和轻链可变框架区。
4.   如权利要求3所述的抗体，其特征在于，所述人抗体序列是个体人序列、人共有序列、个体人种系序列或人共有种系序列。
5.   如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述重链恒定区是修饰的或未修饰的IgG、IgM、IgA、IgD、IgE、其片段或其组合。
6.   如权利要求5所述的抗体，其特征在于，所述重链恒定区是修饰的或未修饰的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
7.   如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体与PRLR的平衡解离常数为10-6、10-7、10-8或10-9 M。
8.   如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述轻链恒定区是修饰的或未修饰的λ轻链恒定区、κ轻链恒定区、其片段或其组合。
9.   如权利要求1所述的抗体，所述抗体可抑制PRLR胞内磷酸化。
10. 如权利要求1中所述的抗体，所述抗体可抑制Stat5磷酸化的诱导。
11. 如权利要求1所述的抗体，所述抗体可抑制乳腺癌细胞增殖。
12. 如权利要求1中所述的抗体，所述抗体与另一诊断或治疗剂结合。
13. 如权利要求1所述的抗体，所述抗体经过纯化达到按重量计至少95%同质性。
14. 一种包含权利要求13所述抗体和药学上可接受的载体的药物组合物。
15. 一种试剂盒，该试剂盒包含包装在容器内的治疗有效量的权利要求1所述的抗体，所述试剂盒任选还包含第二治疗剂，以及还可以包含粘帖到容器上或者包装进容器内的标签，其中标签描述了容器的内容物和提供了关于使用容器内容物治疗乳腺癌的指导和/或说明。
16. 如权利要求15所述的试剂盒，其特征在于，所述容器是瓶子或预装注射器。
17.如权利要求16所述的试剂盒，其特征在于，所述瓶子是药瓶。
18. 一种可结合PRLR胞外域的抗体，该抗体包含轻链可变区氨基酸序列SEQ ID NO:88和重链可变区氨基酸序列SEQ ID NO:90。
19. 如权利要求1所述的抗体，该抗体与人PRLR胞外域结合的平衡解离常数KD比与小鼠PRLR胞外域结合的平衡解离常数低至少10,000到15,000倍。
20. 如权利要求1所述的抗体，所述抗体可与人PRLR胞外域、小鼠PRLR胞外域和大鼠PRLR胞外域结合。
21. 如权利要求1所述的抗体，所述抗体与SEQ ID NO:90的重链可变区和SEQ ID NO:88的轻链可变区结合相同表位。
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