JP2016130250A - Ｐｒｌｒ特異的抗体およびその使用 - Google Patents

Ｐｒｌｒ特異的抗体およびその使用 Download PDF

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Abstract

【課題】ＰＲＬＲ特異的抗体、このような抗体を含有する薬剤製剤、抗体および薬剤製剤を調製する方法および薬剤製剤および化合物を用いて患者を治療する方法を提供する。【解決手段】本発明の抗体は、ＰＲＬＲとの結合および／またはＰＲＬＲの二量体化の阻害および／またはＰＲＬＲ細胞内リン酸化の阻害および／または例えば、Ｊａｋ２、Ｍａｐｋ、Ｓｔａｔ５、Ｅｒｋｌ／２および／またはＡｋｔのリン酸化による、ＰＲＬＲ下流シグナル伝達の阻害および癌または腫瘍と関連している細胞増殖の阻害についての所望の生物活性を有し得る。本発明の抗体はまた、癌細胞上で発現されたＰＲＬＲとの結合についての所望の生物活性を有し、ひいては、細胞傷害性治療法を癌細胞にターゲッティングするよう働き得る。【選択図】なし

Description

関連出願への相互参照
この出願は、２００７年６月２６日に出願された米国仮特許出願第６０／９４６，３６０号および２００６年８月１８日に出願された米国仮特許出願第６０／８３８，６４８号への優先権を主張する。
本発明は、ＰＲＬＲ特異的抗体を投与することによって癌を予防および治療する方法に関する。
癌は、米国では第２位の死因である。「癌」は、多数の異なる種類の癌、すなわち、乳癌、前立腺癌、肺癌、結腸癌、膵臓癌を記載するために用いられるが、各種類の癌は、表現型レベルおよび遺伝子レベルの両方で異なる。癌の未制御の増殖特徴は、１種以上の遺伝子の発現が、突然変異のために調節不全になり、細胞増殖がもはや制御され得ない場合に生じる。
遺伝子は、２つのクラス、発癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子に分類されることが多い。発癌遺伝子とは、その正常な機能が、特定の条件下のみで、細胞増殖を促進することである遺伝子である。発癌遺伝子が突然変異を獲得すると、その制御を失い、すべての条件下で増殖を促進する。しかし、癌が本当に上手くいくには、癌が腫瘍抑制遺伝子において突然変異を獲得しなくてはならないということがわかっている。腫瘍抑制遺伝子の正常な機能は、細胞増殖を停止することである。腫瘍抑制遺伝子の例として、ｐ５３、ｐｌ６、ｐ２１およびＡＰＣが挙げられ、これらのすべては、正常に作用する場合には、細胞が、無制限に分裂し、増殖するのを停止する。腫瘍抑制遺伝子が突然変異されるか、失われると、細胞増殖に対する抑制も失われ、そして細胞が制限なく増殖することが可能となる。
プロラクチン受容体（ＰＲＬＲ）は、サイトカインスーパーファミリーのメンバーの受容体、例えば、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、エリスロポエチンおよびＧＭ−ＣＳＦの受容体と相同である、一回膜貫通型クラス１サイトカイン受容体である。ＰＲＬＲは、複数の生物学的機能、例えば、細胞増殖、分化、発達、乳汁分泌および再生に関与している。内因性のチロシンキナーゼ活性はなく、リガンド結合は受容体二量体化、Ｊａｋ２の交差リン酸化および下流シグナル伝達をもたらす。ヒトプロラクチン受容体ｃＤＮＡは、最初、肝細胞腫および乳癌ライブラリーから単離された（非特許文献１）。ヌクレオチド配列から、ラット肝臓ＰＲＬ受容体よりもかなり長い細胞質ドメインを有する、５９８個のアミノ酸の成熟タンパク質が予測された。プロラクチン受容体遺伝子は、５；１３−ｐｌ２にマッピングされている成長ホルモン受容体遺伝子と同一染色体領域中に存在する（Ａｒｄｅｎ、Ｋ．Ｃ．らＣｙｔｏｇｅｎｅｔ．Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅ ５３：１６１〜１６５頁、１９９０年；Ａｒｄｅｎ，Ｋ．Ｃ．ら、（要約）ＡＭ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．４５（付録）：Ａ１２９のみ、１９８９年）。成長ホルモンはまた、プロラクチン受容体とも結合し、この受容体を活性化する。
ヒトＰＲＬＲ遺伝子のゲノム構成は決定されている（非特許文献２）。ＰＲＬＲ遺伝子の５−プライム−非翻訳領域は、２つの代替第１エキソン、Ｅ１３、ラットおよびマウスＥ１３のヒト対応物と、Ｅ１Ｎと呼ばれる代替第１エキソンの新規ヒト型とを含む。５−プライム−非翻訳領域はまた、共通の非コードエキソン２および転写開始コドンを含むエキソン３の一部を含む。Ｅ１３およびＥ１Ｎエキソンは、互いに８００塩基対内にある。これら２種のエキソンは、ヒト乳房組織、乳癌細胞、生殖腺および肝臓において発現される。概して、Ｅ１３を含有する転写物は、ほとんどの組織に広がっている。ＰＲＬＲ遺伝子産物は、エキソン３〜１０によってコードされ、そのうちエキソン１０は、細胞内ドメインのほとんどをコードする。Ｅ１３およびＥ１Ｎエキソンは、それぞれ、代替プロモーターＰＩＩＩおよびＰＮから転写される。ＰＩＩＩプロモーターは、げっ歯類プロモーターにおけるものと同一であり、ラットおよびマウスにおける領域−４８０／−１０６と８１％同様であるＳｐ１およびＣ／ＥＢＰエレメントを含む。ＰＮプロモーターは、ＥＴＳファミリータンパク質の推定結合部位および核受容体の半分の部位を含む。
ＰＲＬＲは、その細胞質ドメインの長さが異なる、いくつかの異なるアイソフォームで存在する。ヒト皮下腹部脂肪組織および乳房脂肪組織では、４種のＰＲＬＲ ｍＲＮＡアイソフォーム（Ｌ、Ｉ、Ｓ１ａおよびＳ１ｂ）が実証されている（非特許文献３）。さらに、彼らは、イムノブロット分析を用いて、ヒト皮下腹部脂肪組織および乳房脂肪組織において、Ｌ−ＰＲＬＲおよびＩ−ＰＲＬＲタンパク質発現を検出した。ＰＲＬは、対照と比較して、ヒト脂肪組織においてリポタンパク質リパーゼ活性を低下させた。Ｌｉｎｇらは、これらの結果は、ヒト脂肪組織におけるＬＰＬ活性の低減における、機能的ＰＲＬＲを介したＰＲＬの直接的効果を実証したことおよびこれらの結果が、ＬＰＬはまた、乳汁分泌の際に、この方法で低減され得ることを示唆したと示唆している。ラットにおけるこれらのＰＲＬＲアイソフォームの機能は解明されている（Ｐｅｒｒｏｔ−Ａｐｐｌａｎａｔ，Ｍ．ら、Ｍｏｌｅｃ．Ｅｎｄｏｃｒ．１１：１０２０〜１０３２頁、１９９７年）。既知の長い形（５９１個のアミノ酸）と同様に、細胞質ドメインの１９８個のアミノ酸を欠くＮｂ２の形も、乳腺刺激性シグナルを伝達できる。対照的に、細胞質ドメインの２９１個のアミノ酸を欠く短い形は、不活性である。短い形の機能は、長い形と短い形両方の同時トランスフェクション後に調べた。これらの結果は、短い形は、不活性なヘテロ二量体の形成によってドミナントネガティブ阻害剤として作用し、その結果、ヤヌスキナーゼ２活性化の阻害をもたらすことを示す。Ｐｅｒｒｏｔ−Ａｐｐｌａｎａｔらは、ＰＲＬＲのヘテロ二量体化は、ＰＲＬ転写を正または負に活性し得るということを示唆している。
最近の報告によれば、ＰＲＬＲは、ヒト乳癌および前立腺癌組織において過剰発現されると示唆されている（非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）。Ｌｉらは、Ｓｔａｔ５活性化およびＰＲＬＲ発現は、５４％の前立腺癌試料において、高い組織学的グレードと関係していることを報告した（非特許文献４）。その他の報告は、原発性乳癌試料は、コロニー形成アッセイにおいてＰＲＬに対して反応性であること、および血漿ＰＲＬ濃度は、乳癌の危険と相関することを示唆している（非特許文献７；非特許文献８）。別の報告は、ＰＲＬトランスジェニックマウスは悪性乳癌または前立腺肥大を発症することを示した（非特許文献９；非特許文献１０）。
ＰＲＬＲモノクローナル抗体は、マウスにおいて乳房腫瘍の罹患率を減少させた（非特許文献１１）。さらに、ＰＲＬアンタゴニスト（Ｓ１７９Ｄ変異株ＰＲＬ）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてヒト前立腺癌腫細胞株、ＤＵ−１４５、およびｉｎ ｖｉｖｏにおいてＤＵ−１４５誘導性腫瘍の増殖を阻害した（非特許文献１２）。
Ｂｏｕｔｉｎ、Ｊ．−Ｍ．ら、Ｍｏｌｅｃ．Ｅｎｄｏｃｒ．（１９８９年）３：１４５５〜１４６１頁 Ｈｕ，Ｚ．−Ｚ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒ．Ｍｅｔａｂ．（１９９９年）８４：１１５３〜１１５６頁 Ｌｉｎｇ，Ｃ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒ．Ｍｅｔａｂ．（２００３年）８８：１８０４〜１８０８頁 Ｌｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２００４年）６４：４７７４〜４７８２頁 Ｇｉｌｌら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ．（２００１年）５４：９５６〜９６０頁 Ｔｏｕｒａｉｎｅら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ．（１９９８年）８３：６６７〜６７４頁 Ｔｗｏｒｏｇｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２００４年）６４：６８１４〜６８１９頁 Ｔｗｏｒｏｇｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２００６年）６６：２４７６〜２４８２頁 Ｗｅｎｎｂｏら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．（１９９７年）１００：２７４４〜２７５１頁 Ｗｅｎｎｂｏら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ（１９９７年）１３８：４４１０〜４４１５頁 Ｓｉｓｓｏｍら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．（１９８８年）１３３：５８９〜５９５頁 Ｘｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２００１年）６１：６０９８〜６１０４頁
したがって、ＰＲＬＲを調節する組成物および方法ならびにこのような癌におけるその役割を同定する必要がある。本発明は、これらならびにその他の重要な必要性を対象とする。
要旨
ＰＲＬＲのヌクレオチド配列は、配列番号１に示されており、アミノ酸配列は、配列番号２に示されている。細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、配列番号２のアミノ酸２５〜２３４からなり、これは２つの主要なドメイン、Ｓ１（アミノ酸２５〜１２２）およびＳ２（アミノ酸１２３〜２３４）に分けることができる。ＰＲＬＲのいくつかの異なるアイソフォームが同定されている：長いもの（Ｌ）中間のもの（Ｉ）、ΔＳ１、不活性可溶型（ＰＲＬＢＰ）および不活性な短い型Ｓ１ａおよびＳ１ｂ。各アイソフォーム内に含まれるエキソンおよびヌクレオチド領域は、図１に示されている。例示的実施形態では、本発明は、Ｓ１ドメインおよび／またはＳ２ドメインと結合する抗体を考慮する。Ｓ２ドメインと結合するこのような抗体は、すべての活性なアイソフォームをターゲッティングし得る。本発明はまた、１種のアイソフォームと特異的に結合し、別のものとは結合しないか（例えば、中間のものとは結合し、Ｓ１ａまたはＳ１ｂとは結合しない）、または活性なアイソフォーム（長いもの、中間ものもおよびΔＳ１）とは結合するが、不活性なアイソフォーム（Ｓ１ａおよびＳ１ｂ）とは結合しない抗体を考慮する。
本発明の材料および方法は、前記の必要性および当技術分野におけるその他の関連する必要性を満たす。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下の抗体などが提供される：
（項目１）
平衡解離定数（ＫＤ）が１０−６Ｍ以下であり、ＰＲＬＲとの結合について７５％を超えて、抗体
Figure 2016130250
 のいずれかと競合する、ＰＲＬＲの細胞外ドメインと結合する抗体。
（項目２）
抗体
Figure 2016130250
 のいずれかと同じＰＲＬＲのエピトープと結合する項目１に記載の抗体。
（項目３）
抗体
Figure 2016130250
 のいずれかの１、２、３、４、５または６つのＣＤＲを含む抗体。
（項目４）
キメラ抗体、ヒト化抗体、ｈｕｍａｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ抗体、ヒト抗体、一本鎖抗体または抗体断片である、項目１から３のいずれかに記載の抗体。
（項目５）
ＣＤＲ内の少なくとも１個のアミノ酸が、別の抗ＰＲＬＲ抗体の対応するＣＤＲの対応する残基によって置換されている、項目１〜４のいずれかに記載の抗体。
（項目６）
ＣＤＲ内の１または２個のアミノ酸が修飾されている、項目１〜５のいずれかに記載の抗体。
（項目７）
以下：
Figure 2016130250
 の抗体に対して、可変軽鎖または重鎖領域のいずれかにわたって、少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％同一性を保持する、項目１〜６のいずれかに記載の抗体。
（項目８）
ヒト抗体配列の定常領域と、ヒト抗体配列の１以上の重鎖および軽鎖可変フレームワーク領域とを含む、項目１〜７のいずれかに記載の抗体。
（項目９）
前記ヒト抗体配列が、個々のヒト配列、ヒトコンセンサス配列、個々のヒト生殖系配列またはヒトコンセンサス生殖系配列である、項目８に記載の抗体。
（項目１０）
重鎖定常配列が、修飾または非修飾ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、それらの断片またはそれらの組み合わせである、項目１〜９のいずれかに記載の抗体。
（項目１１）
重鎖定常領域が、修飾または非修飾ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４である、項目１０に記載の抗体。
（項目１２）
ＰＲＬＲに対して、１０−６、１０−７、１０−８または１０−９Ｍ以下の平衡解離定数を有する、項目１〜１１のいずれかに記載の抗体。
（項目１３）
前記ＣＤＲ中に保存的置換を含む、項目１〜１２のいずれかに記載の抗体。
（項目１４）
低いおよび中程度の危険度の残基における保存的または非保存的変更を含む、項目１〜１３のいずれかに記載の抗体。
（項目１５）
軽鎖定常領域が、修飾または非修飾λ軽鎖定常領域、κ軽鎖定常領域、それらの断片またはそれらの組み合わせである、項目１〜１４のいずれかに記載の抗体。
（項目１６）
ＰＲＬＲ二量体化を阻害する、項目１〜１５のいずれかに記載の抗体。
（項目１７）
ＰＲＬＲ細胞内リン酸化を阻害する、項目１〜１６のいずれかに記載の抗体。
（項目１８）
ＭＡＰＫリン酸化の誘導を阻害する、項目１〜１７のいずれかに記載の抗体。
（項目１９）
Ｓｔａｔ５リン酸化の誘導を阻害する、項目１〜１８のいずれかに記載の抗体。
（項目２０）
ＡＫＴリン酸化の誘導を阻害する、項目１〜１９のいずれかに記載の抗体。
（項目２１）
ＰＲＬのＰＲＬＲとの結合を阻害する、項目１〜２０のいずれかに記載の抗体。
（項目２２）
ＶＥＧＦ産生および／または血管形成を阻害する、項目１〜２１のいずれかに記載の抗体。
（項目２３）
癌細胞の増殖を阻害する、項目１〜２２のいずれかに記載の抗体。
（項目２４）
乳癌、前立腺癌または肺癌の細胞の増殖を阻害する、項目２３に記載の抗体。
（項目２５）
別の診断薬または治療薬とコンジュゲートしている、項目１〜２４のいずれかに記載の抗体。
（項目２６）
癌の治療に有用なＰＲＬＲタンパク質の細胞外ドメインに対する抗体をスクリーニングする方法であって、該方法は、
ＰＲＬＲのＥＣＤを含むポリペプチドを、抗体
Figure 2016130250
 の少なくとも１、２、３、４、５または６つのＣＤＲを含む候補抗体と接触させるステップと、
該候補抗体の、該ポリペプチドに対する結合親和性を検出するステップと、
１０−６Ｍ以下の平衡解離定数が検出される場合に、該候補抗体を、癌の治療に有用な抗体として同定するステップと
を含む方法。
（項目２７）
抗体を系統的に変更し、癌の治療に有用なＰＲＬＲタンパク質の細胞外ドメインに対する抗体をスクリーニングする方法であって、該方法は、
抗体
Figure 2016130250
 のＣＤＲ内の１または２個のアミノ酸に対する修飾を含む候補抗体を調製するステップと、
ＰＲＬＲのＥＣＤを含むポリペプチドを、該候補抗体と接触させるステップと、
該候補抗体の、該ポリペプチドに対する結合親和性を検出するステップと、
１０−６Ｍ以下の平衡解離定数が検出される場合に、該候補抗体を、癌の治療に有用な抗体として同定するステップと
を含む方法。
（項目２８）
癌の治療に有用なＰＲＬＲタンパク質の細胞外ドメインに対する抗体をスクリーニングする方法であって、該方法は、
乳房、肺または前立腺の細胞を、抗体
Figure 2016130250
 の少なくとも１、２、３、４、５または６つのＣＤＲを含む候補抗体または１つ以上のＣＤＲ内の１個または２個のアミノ酸の修飾を含む抗体と接触させるステップと、
該細胞の増殖または生存を検出するステップと、
細胞増殖または生存の低減が検出される場合に、該候補抗体を、癌の治療に有用な抗体として同定するステップと
を含む方法。
（項目２９）
癌を患っている被験体を治療する方法であって、治療上有効な量の項目１〜２８のいずれかに記載の抗体を投与するステップを含む、方法。
（項目３０）
前記癌が乳癌、肺癌または前立腺癌である、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
第２の治療薬を投与する、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記第２の治療薬がドキソルビシンまたはダウノルビシンである、項目３０に記載の方法。
（項目３３）
前記抗体がｃｈＸＨＡ．０６．６４２、ｃｈＸＨＡ．０６．２７５、ｈｅ．０６．６４２−１、ｈｅ．０６．６４２−２、ｈｅ．０６．２７５−１、ｈｅ．０６．２７５−２、ｈｅ．０６．２７５−３、ｈｅ．０６．２７５−４である、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記被験体がＰＲＬＲ発現およびＨＥＲ２−ｎｅｕ発現について陽性であり、前記の第２の治療薬が抗Ｈｅｒ２−ｎｅｕ抗体である、項目３０に記載の方法。
（項目３５）
前記被験体がＰＲＬＲ発現およびＥＲ発現について陽性であり、前記第２の治療薬が抗ＥＲ抗体である、項目３０に記載の方法。
（項目３６）
前記被験体を、放射線療法または手術で、さらに治療する、項目３０に記載の方法。
（項目３７）
ＰＲＬＲを発現する腫瘍細胞をターゲッティングする方法であって、放射性核種またはその他の毒素とコンジュゲートしている、項目１〜３６のいずれかに記載の抗体を投与するステップを含む方法。
（項目３８）
前記被験体が哺乳類である、項目３０から３７に記載の方法。
（項目３９）
前記被験体がヒトである、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
項目１から２３のいずれかに記載の抗体の重鎖または軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
（項目４１）
調節制御配列と作動可能に連結している、項目４０に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
（項目４２）
項目４１に記載のベクターまたは項目４０に記載の核酸分子を含む宿主細胞。
（項目４３）
抗体を作製するために項目４２に記載の宿主細胞を用いる方法であって、項目３６に記載の宿主細胞を、適した条件下で培養するステップと、該抗体を回収するステップとを含む方法。
（項目４４）
項目４３に記載の方法によって作製される抗体。
（項目４５）
重量で少なくとも９５％の均一性まで精製される、項目１から２３または４４のいずれかに記載の抗体。
（項目４６）
項目４５に記載の抗体と、製薬上許容される担体とを含む薬剤組成物。
（項目４７）
容器にパッケージングされた、治療上有効な量の本発明の抗体を含む、項目１〜４６のいずれかに記載の抗体を含むキットであって、該キットは、第２の治療薬を場合により含んでいてもよく、該容器に取り付けられた、またはともにパッケージングされたラベルをさらに含み、該ラベルが該容器の内容物を記載し、癌を治療するための該容器の内容物の使用に関する指示および／または使用説明書を提供する、キット。
（項目４８）
前記容器がバイアルまたはビンまたはプレフィルドシリンジである、項目４７に記載のキット。
（項目４９）
配列番号
Figure 2016130250
 からなる群から選択される可変軽鎖アミノ酸配列を含むＰＲＬＲの細胞外ドメインと結合する抗体。
（項目５０）
配列番号
Figure 2016130250
 からなる群から選択される可変重鎖アミノ酸配列を含むＰＲＬＲの細胞外ドメインと結合する抗体。
（項目５１）
配列番号８８の可変軽鎖アミノ酸配列と、配列番号８９の可変重鎖アミノ酸配列とを含むＰＲＬＲの細胞外ドメインと結合する抗体。
（項目５２）
配列番号８８の可変軽鎖アミノ酸配列と、配列番号９０の可変重鎖アミノ酸配列とを含むＰＲＬＲの細胞外ドメインと結合する抗体。
（項目５３）
配列番号９１の可変軽鎖アミノ酸配列と、配列番号９３の可変重鎖アミノ酸配列とを含むＰＲＬＲの細胞外ドメインと結合する抗体。
（項目５４）
配列番号９１の可変軽鎖アミノ酸配列と、配列番号９４の可変重鎖アミノ酸配列とを含むＰＲＬＲの細胞外ドメインと結合する抗体。
（項目５５）
配列番号９２の可変軽鎖アミノ酸配列と、配列番号９３の可変重鎖アミノ酸配列とを含むＰＲＬＲの細胞外ドメインと結合する抗体。
（項目５６）
配列番号９２の可変軽鎖アミノ酸配列と、配列番号９４の可変重鎖アミノ酸配列とを含むＰＲＬＲの細胞外ドメインと結合する抗体。
（項目５７）
配列番号９５の可変軽鎖アミノ酸配列と、配列番号９７の可変重鎖アミノ酸配列とを含むＰＲＬＲの細胞外ドメインと結合する抗体。
（項目５８）
配列番号９５の可変軽鎖アミノ酸配列と、配列番号９８の可変重鎖アミノ酸配列とを含むＰＲＬＲの細胞外ドメインと結合する抗体。
（項目５９）
配列番号９６の可変軽鎖アミノ酸配列と、配列番号９７の可変重鎖アミノ酸配列とを含むＰＲＬＲの細胞外ドメインと結合する抗体。
（項目６０）
配列番号９６の可変軽鎖アミノ酸配列と、配列番号９８の可変重鎖アミノ酸配列とを含むＰＲＬＲの細胞外ドメインと結合する抗体。
（項目６１）
マウスＰＲＬＲの細胞外ドメインの多くとも１０、０００分の１〜１５，０００分の１の平衡解離定数（ＫＤ）を有する、ヒトＰＲＬＲの細胞外ドメインと結合する抗体。
（項目６２）
ｈｅ．０６．２７５−４と同一のエピトープと結合する、項目６１に記載の抗体。
（項目６３）
ヒトＰＲＬＲの細胞外ドメイン、マウスＰＲＬＲの細胞外ドメインおよびラットＰＲＬＲの細胞外ドメインと結合する抗体。
（項目６４）
１０−６Ｍ以下の平衡解離定数（ＫＤ）を有する、ヒト、マウスおよびラットＰＲＬＲの細胞外ドメインと結合する抗体。
（項目６５）
ｈｅ．０６．６４２−２と同一のエピトープと結合する、項目６４に記載の抗体。
（項目６６）
項目１から２３および４９から６５のいずれか一項に記載の抗ＰＲＬＲ抗体を用いる治療を必要とする被験体を同定する方法であって、該方法は、
（ａ）該被験体からサンプルを得るステップと、
（ｂ）該サンプルを、ＰＲＬＲ、Ｊａｋ２、Ｍａｐｋ、Ｓｔａｔ５、Ｅｒｋｌ／２および／またはＡｋｔのリン酸化のレベルについて分析するステップと
を含み、
ＰＲＬＲ、Ｊａｋ２、Ｍａｐｋ、Ｓｔａｔ５、Ｅｒｋｌ／２および／またはＡｋｔのリン酸化のレベルが、抗ＰＲＬＲ抗体を用いる治療を必要としていることを示す方法。
（項目６７）
癌に罹患した被験体において癌治療をモニタリングする方法であって、
（ａ）該被験体から得た第１のサンプルを、癌治療薬を用いる治療の開始に先立ってＰＲＬＲのリン酸化のレベルについて分析するステップと、
（ｂ）該癌治療薬を用いる治療の開始後の第２のサンプルを分析するステップと
を含み、
該癌治療薬を用いた治療の開始後のリン酸化ＰＲＬＲのレベルの低減が、該患者が治療上有効な用量の該癌治療薬を受けていることを示す、方法。
（項目６８）
前記癌治療薬が項目１から２３および４９から６５のいずれか一項に記載の抗体である、項目６７に記載の方法。
一実施形態では、１０−６以下の平衡解離定数（ＫＤ）を有し、ＰＲＬＲとの結合について、７５％を超えて、抗体
Figure 2016130250
 のいずれかと競合するＰＲＬＲの細胞外ドメインと結合する抗体が提供される。用語「１０−６以下の平衡解離定数（ＫＤ）」とは、例えば、１０−６、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍまたは１０−１２Ｍ（すなわち、１０−６よりも数字が小さい）の平衡解離定数を意味する。もう１つの実施形態では、抗体は、抗体
Figure 2016130250
 のいずれかと同じＰＲＬＲのエピトープと結合する。
もう１つの実施形態では、前記の抗体は、抗体
Figure 2016130250
 のいずれかの１、２、３、４、５または６つのＣＤＲを含む。もう１つの実施形態では、前記の抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、ｈｕｍａｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ抗体、ヒト抗体、一本鎖抗体または抗体断片である。さらにもう１つの実施形態では、ＣＤＲ内の少なくとも１個のアミノ酸が、別の抗ＰＲＬＲ抗体の対応するＣＤＲの対応する残基によって置換されている、前記の抗体が提供される。例示的実施形態では、
Figure 2016130250
 から成る群から選択される抗体に由来するＣＤＲ内の少なくとも１個のアミノ酸が、別の抗ＰＲＬＲ抗体の対応するＣＤＲの対応する残基で置換されている、前記の抗体が提供される。もう１つの例示的実施形態では、
Figure 2016130250
 からなる群から選択される抗体に由来するＣＤＲ内の少なくとも１個のアミノ酸が、
Figure 2016130250
 からなる群から選択される別の抗体の対応するＣＤＲの対応する残基で、置換されている、前記の抗体が提供される。さらにもう１つの実施形態では、ＣＤＲ内の１個または２個のアミノ酸が修飾されている前記の抗体が提供される。
本発明のもう１つの実施形態では、
Figure 2016130250
 の抗体の可変軽鎖または重鎖領域にわたって、少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を保持する、前記の抗体が提供される。
もう１つの実施形態では、前記の抗体は、ヒト抗体配列の定常領域と、ヒト抗体配列の１以上の重鎖および軽鎖可変フレームワーク領域とを含む。本発明のさらにもう１つの実施形態では、ヒト抗体配列が、個々のヒト配列、ヒトコンセンサス配列、個々のヒト生殖系配列またはヒトコンセンサス生殖系配列である前記の抗体が提供される。
さらにもう１つの実施形態では、重鎖定常領域が、修飾または非修飾ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、それらの断片または組み合わせである、前記の抗体が提供される。もう１つの実施形態では、重鎖定常領域が、修飾または非修飾ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４である、前記の抗体が提供される。もう１つの実施形態では、ＰＲＬＲに対して、１０−６、１０−７、１０−８または１０−９Ｍ以下の平衡解離定数を有する、前記の抗体が提供される。さらにもう１つの実施形態では、ＣＤＲ中に保存的置換を含む、前記の抗体が提供される。もう１つの実施形態では、低いおよび中程度の危険度の残基における保存的または非保存的変更を含む、前記の抗体が提供される。さらにもう１つの実施形態では、軽鎖定常領域が、修飾または非修飾λ軽鎖定常領域、κ軽鎖定常領域、それらの断片またはそれらの組み合わせである、前記の抗体が提供される。
さらにもう１つの実施形態では、ＰＲＬＲ二量体化を阻害する、ＰＲＬＲ細胞内リン酸化を阻害する、ＭＡＰＫリン酸化の誘導を阻害する、Ｓｔａｔ５リン酸化の誘導を阻害する、ＡＫＴリン酸化の誘導を阻害する、ＰＲＬのＰＲＬＲとの結合を阻害する、前記の抗体が提供される。
その他の実施形態では、前記の抗体は、ＶＥＧＦ産生および／または血管形成をさらに阻害する。
さらにもう１つの実施形態では、癌細胞の増殖を阻害する、前記の抗体が提供される。さらにもう１つの実施形態では、抗体は、乳癌、前立腺癌または肺癌の細胞の増殖を阻害する。
癌に加え、本発明のもう１つの実施形態は、自己免疫および炎症性疾患または障害を予防および／または治療するために前記の抗体を提供する。抗体は、自己免疫および／または炎症性要素を含む疾患の予防、緩解（ａｍｅｌｏｒｉａｔｉｎｇ）または治療において特に有用である。これらの疾患として、それだけには限らないが、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、円板状ループス、ループス腎炎、サルコイドーシス、炎症性関節炎、例えば、それだけには限らないが、若年性関節炎、リウマチ関節炎、乾癬性関節炎、ライター症候群、強直性脊椎炎および痛風性関節炎、臓器または組織移植の拒絶反応、超急性、急性または慢性拒絶反応および／または移植片対宿主病、多発性硬化症、高ＩｇＥ症候群、結節性多発性動脈炎、原発性胆汁性肝硬変、炎症性腸疾患、クローン病、セリアック病（グルテン過敏性腸症）、自己免疫性肝炎、悪性貧血、自己免疫性溶血性貧血、乾癬、強皮症、重症筋無力症、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性甲状腺炎、グレーブス病、橋本甲状腺炎、免疫複合体病、慢性疲労免疫不全症候群（ＣＦＩＤＳ）、多発性筋炎および皮膚筋炎、クリオグロブリン血症、血栓溶解、心筋症、尋常性天疱瘡、間質性肺繊維症、Ｉ型およびＩＩ型糖尿病、１、２、３および４型遅延型過敏症、アレルギーまたはアレルギー性障害、治療用タンパク質に対する不要な／意図せぬ免疫応答、喘息、チャーグ−ストラウス症候群（アレルギー性肉芽腫症）、アトピー性皮膚炎、アレルギー性および刺激性接触皮膚炎、蕁麻疹、ＩｇＥ媒介性アレルギー、アテローム性動脈硬化症、脈管炎、特発性炎症性筋疾患、溶血性疾患、アルツハイマー病、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチーなどといった自己免疫および炎症性疾患が挙げられる。
もう１つの実施形態では、別の診断薬または治療薬とコンジュゲートしている前記の抗体が提供される。
さらにもう１つの実施形態では、以下のステップを含む、癌の治療に有用なＰＲＬＲタンパク質の細胞外ドメインに対する抗体をスクリーニングする方法が提供される：ＰＲＬＲのＥＣＤを含むポリペプチドを、抗体
Figure 2016130250
 の少なくとも１、２、３、４、５または６つのＣＤＲを含む候補抗体と接触させるステップと、候補抗体の、ポリペプチドに対する結合親和性を検出するステップと、１０−６Ｍ以下の平衡解離定数が検出される場合に、前記候補抗体を、癌の治療に有用な抗体として同定するステップ。
もう１つの実施形態では、抗体
Figure 2016130250
 のＣＤＲ内の１または２個のアミノ酸に対する修飾を含む候補抗体を調製するステップと、ＰＲＬＲのＥＣＤを含むポリペプチドを、前記候補抗体と接触させるステップと、候補抗体の、ポリペプチドに対する結合親和性を検出するステップと、１０−６Ｍ以下の平衡解離定数が検出される場合に、前記候補抗体を、癌の治療に有用な抗体として同定するステップとを含む、抗体を系統的に変更し、癌の治療に有用なＰＲＬＲタンパク質の細胞外ドメインに対する抗体をスクリーニングする方法が提供される。
さらにもう１つの実施形態では、乳房、肺または前立腺の細胞を、抗体
Figure 2016130250
 の少なくとも１、２、３、４、５または６つのＣＤＲを含む候補抗体または１つ以上のＣＤＲ内の１個以上のアミノ酸の修飾を含む抗体と接触させるステップと、前記細胞の増殖または生存を検出するステップと、細胞増殖または生存の低減が検出される場合に、前記候補抗体を、癌の治療に有用な抗体として同定するステップを含む、癌の治療に有用なＰＲＬＲタンパク質の細胞外ドメインについて抗体をスクリーニングする方法。
さらにもう１つの実施形態では、治療上有効な量の前記の抗体を投与するステップを含む、癌を患っている被験体、例えば、ステージ０、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶまたはＶの癌を患っている被験体を治療する方法。関連実施形態では、癌は、乳癌、肺癌または前立腺癌である。もう１つの実施形態では、第２の治療薬が投与される。例示的一実施形態では、第２の治療薬として、ドキソルビシン、ダウノルビシンまたはその他のアントラサイクリンまたはトポイソメラーゼ阻害剤がある。さらなる実施形態では、前記のトポイソメラーゼ阻害剤のうちいずれかが、ｃｈＸＨＡ．０６．６４２、ｃｈＸＨＡ．０６．２７５、ｈｅ．０６．６４２−１、ｈｅ．０６．６４２−２、ｈｅ．０６．２７５−１、ｈｅ．０６．２７５−２、ｈｅ．０６．２７５−３、ｈｅ．０６．２７５−４とともに投与される。さらにもう１つの実施形態では、被験体は、放射線療法または手術で、さらに治療される。本発明のさらにもう１つの実施形態では、被験体は、ＰＲＬＲ発現およびＨＥＲ２−ｎｅｕ発現について陽性であり、前記の第２の治療薬は抗Ｈｅｒ２−ｎｅｕ抗体である。関連する一実施形態では、被験体は、ＰＲＬＲ発現およびＥＲ発現について陽性であり、前記の第２の治療薬は抗ＥＲ抗体である。さらなる一実施形態では、本発明は、医薬において使用するための、例えば、癌の治療において使用するための本発明の抗体を提供する。その他の実施形態では、本発明は、癌を治療するための薬剤の製造における本発明の抗体の使用を提供する。薬剤は、第２の治療薬と、および／または放射線療法と組み合わせて患者に投与してもよい。
本発明のもう１つの実施形態では、放射性核種またはその他の毒素とコンジュゲートしている前記の抗体を投与するステップを含む、ＰＲＬＲを発現する腫瘍細胞をターゲッティングする方法が提供される。もう１つの実施形態では、被験体は哺乳類である。さらにもう１つの実施形態では、被験体はヒトである。
さらにもう１つの実施形態では、前記抗体の重鎖または軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子が提供される。さらにもう１つの実施形態では、調節制御配列と作動可能に連結している前記の核酸分子を含む発現ベクターが提供される。さらにもう１つの実施形態では、前記ベクターまたは前記核酸分子を含む宿主細胞が提供される。
さらにもう１つの実施形態では、宿主細胞を適した条件下で培養するステップと、前記抗体を回収するステップとを含む、抗体を作製するために前記宿主細胞を用いる方法が提供される。さらにもう１つの実施形態では、前記方法によって作製された抗体が提供される。
さらにもう１つの実施形態では、重量で少なくとも９５％の均一性まで精製されている前記抗体が提供される。もう１つの実施形態では、前記抗体と、製薬上許容される担体とを含む薬剤組成物が提供される。
さらにもう１つの実施形態では、容器にパッケージングされた、治療上有効な量の本発明の抗体を含む前記抗体を含むキットであって、第２の治療薬を場合により含んでいてもよく、容器に取り付けられた、またはともにパッケージングされたラベルをさらに含み、ラベルが容器の内容物を記載し、癌を治療するための容器の内容物の使用に関する指示および／または使用説明書を提供するキットが提供される。もう１つの実施形態では、容器がバイアルまたはビンまたはプレフィルドシリンジであるキットが提供される。
本発明のもう１つの実施形態では、配列番号
Figure 2016130250
 からなる群から選択される可変軽鎖アミノ酸配列を含むＰＲＬＲの細胞外ドメインと結合する抗体が提供される。もう１つの実施形態では、配列番号
Figure 2016130250
 からなる群から選択される可変重鎖アミノ酸配列を含むＰＲＬＲの細胞外ドメインと結合する抗体が提供される。さらにもう１つの実施形態では、配列番号８８の可変軽鎖アミノ酸配列と、配列番号８９の可変重鎖アミノ酸配列とを含むＰＲＬＲの細胞外ドメインと結合する抗体が提供される。さらにもう１つの実施形態では、配列番号８８の可変軽鎖アミノ酸配列と、配列番号９０の可変重鎖アミノ酸配列とを含むＰＲＬＲの細胞外ドメインと結合する抗体が提供される。
本発明のさらにもう１つの実施形態では、配列番号９１の可変軽鎖アミノ酸配列と、配列番号９３の可変重鎖アミノ酸配列とを含むＰＲＬＲの細胞外ドメインと結合する抗体。もう１つの実施形態では、配列番号９１の可変軽鎖アミノ酸配列と、配列番号９４の可変重鎖アミノ酸配列とを含むＰＲＬＲの細胞外ドメインと結合する抗体が提供される。さらにもう１つの実施形態では、配列番号９２の可変軽鎖アミノ酸配列と、配列番号９３の可変重鎖アミノ酸配列とを含むＰＲＬＲの細胞外ドメインと結合する抗体。本発明のさらにもう１つの実施形態では、配列番号９２の可変軽鎖アミノ酸配列と、配列番号９４の可変重鎖アミノ酸配列とを含むＰＲＬＲの細胞外ドメインと結合する抗体。
本発明のさらにもう１つの実施形態では、配列番号９５の可変軽鎖アミノ酸配列と、配列番号９７の可変重鎖アミノ酸配列とを含むＰＲＬＲの細胞外ドメインと結合する抗体が提供される。もう１つの実施形態では、配列番号９５の可変軽鎖アミノ酸配列と、配列番号９８の可変重鎖アミノ酸配列とを含むＰＲＬＲの細胞外ドメインと結合する抗体が提供される。さらにもう１つの実施形態では、配列番号９６の可変軽鎖アミノ酸配列と、配列番号９７の可変重鎖アミノ酸配列とを含むＰＲＬＲの細胞外ドメインと結合する抗体が提供される。もう１つの実施形態では、配列番号９６の可変軽鎖アミノ酸配列と、配列番号９８の可変重鎖アミノ酸配列とを含むＰＲＬＲの細胞外ドメインと結合する抗体が提供される。
本発明のもう１つの実施形態では、マウスＰＲＬＲの細胞外ドメインよりも少なくとも１０〜２５、０００倍、１００〜２０，０００倍、１，０００〜１８，０００倍、５，０００〜１７，０００倍、８，０００〜１６，０００倍、１０，０００〜１５，０００倍、１２，０００〜１５，０００倍または１３，０００〜１４，０００倍低いＫＤを有する、ヒトＰＲＬＲの細胞外ドメインと結合する抗体が提供される。関連実施形態では、前記抗体は、ｈｅ．０６．２７５−４と同一のエピトープと結合する。さらにもう１つの実施形態では、ヒトＰＲＬＲの細胞外ドメイン、マウスＰＲＬＲの細胞外ドメインおよびラットＰＲＬＲの細胞外ドメインと結合する抗体が提供される。もう１つの実施形態では、１０−６Ｍ以下の平衡解離定数（ＫＤ）を有する、ヒト、マウスおよびラットＰＲＬＲの細胞外ドメインと結合する抗体が提供される。関連実施形態では、前記抗体は、ｈｅ．０６．６４２−２と同一のエピトープと結合する
さらにもう１つの実施形態では、上記方法を用いて、例えば、（ａ）被験体からサンプルを得、（ｂ）サンプルを、ＰＲＬＲ、Ｊａｋ２、Ｍａｐｋ、Ｓｔａｔ５、Ｅｒｋｌ／２および／またはＡｋｔのリン酸化のレベルについて分析し、ＰＲＬＲ、Ｊａｋ２、Ｍａｐｋ、Ｓｔａｔ５、Ｅｒｋｌ／２および／またはＡｋｔのリン酸化のレベルが、抗ＰＲＬＲ抗体を用いる治療を必要としていることを示すことによって、抗ＰＲＬＲ抗体を用いた治療を必要とする被験体を同定できる。もう１つの実施形態では、（ａ）被験体から得た第１のサンプルを、癌治療薬を用いる治療の開始に先立ってＰＲＬＲのリン酸化のレベルについて分析するステップと、（ｂ）癌治療薬を用いる治療の開始後の第２のサンプルを分析するステップとを含み、癌治療薬を用いた治療の開始後のリン酸化ＰＲＬＲのレベルの低減が、患者が治療上有効な用量の癌治療薬を受けていることを示す、癌に罹患した被験体において癌治療をモニタリングする方法が提供される。関連する一実施形態では、癌治療薬は、上記の実施形態のいずれか１つの抗体である。
ＰＲＬＲの種々のアイソフォームにおける遺伝子配置およびエキソンを示す図である。 ｐＥＲＫ１／２リン酸化に対する、選択されたＰＲＬＲ特異的抗体の効果を示す図である。［ｍＡｂ １１６７は、対照マウス抗ＰＲＬＲモノクローナル抗体である；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＭＡＢ１１６７］ ｐＥＲＫ１／２リン酸化に対する、選択されたＰＲＬＲ特異的抗体の効果を示す図である。［ｍＡｂ １１６７は、対照マウス抗ＰＲＬＲモノクローナル抗体である；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＭＡＢ１１６７］ ｐＥＲＫ１／２リン酸化に対する、選択されたＰＲＬＲ特異的抗体の効果を示す図である。［ｍＡｂ １１６７は、対照マウス抗ＰＲＬＲモノクローナル抗体である；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＭＡＢ１１６７］ ＰＲＬ反応性腫瘍細胞株の増殖に対する、ＰＲＬＲ特異的抗体の効果を示す図である。 ＰＲＬＲ細胞内リン酸化に対する、ＰＲＬＲ特異的抗体の効果を示す図である。 ｐＥＲＫアッセイにおいて８０％を超える阻害を有していた、ＶＨおよびＶＬアミノ酸配列、ならびに抗体
Figure 2016130250
 のＣＤＲ（下線）の位置を示す図である。
ｐＥＲＫアッセイにおいて８０％を超える阻害を有していた、ＶＨおよびＶＬアミノ酸配列、ならびに抗体
Figure 2016130250
 のＣＤＲ（下線）の位置を示す図である。
ｐＥＲＫアッセイにおいて８０％を超える阻害を有していた、ＶＨおよびＶＬアミノ酸配列、ならびに抗体
Figure 2016130250
 のＣＤＲ（下線）の位置を示す図である。
抗体ＸＰＡ．０６．１４５のＶＨおよびＶＬアミノ酸配列を示す図である。 抗体ＸＨＡ．０６．９８３、ＸＨＡ．０６．２７５およびＸＨＡ．０６．６４２のリーダーおよびＶＨおよびＶＬヌクレオチド配列を示す図である。 抗体ＸＨＡ．０６．９８３、ＸＨＡ．０６．２７５およびＸＨＡ．０６．６４２（ＣＤＲ下線が引かかれている）のＶＨおよびＶＬアミノ酸配列を示す図である。 キメラ抗ＰＲＬＲ ｍＡｂｓ ｃｈＸＨＡ．０６．６４２、ｃｈＸＨＡ．０６．２７５およびｃｈＸＨＡ．０６．９８３が、ＢａＦ／ＰＲＬＲ細胞の増殖および生存を強く阻害することを示す図である。ＫＬＨ−Ｇ１は、非特異的アイソタイプに対応した対照抗体である。右のパネルは、対応するマウスｍＡｂのＩＣ５０値を示す。 キメラ抗ＰＲＬＲ ｍＡｂが、Ｔ４７Ｄ細胞におけるＳＴＡＴ５シグナル伝達を阻害することを示す図である。細胞は、１μｇ／ｍｌのｍＡｂで前処理し、その後、５０ｎｇ／ｍｌのＰＲＬを用いて３０分刺激した。溶解物は、ＰＲＬＲのホスホチロシン残基５４６および６１１に特異的な抗体を用いてホスホ−ＰＲＬＲの存在について分析した。 ｐＥＲＫ１／２リン酸化に対する、Ｈｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）抗体の効果を示す図である。 キメラ抗ＰＲＬＲ ｍＡｂによって媒介されたＡＤＣＣを示す図である。Ｔ４７Ｄ−Ｔ２細胞は、カルセイン−ＡＭで標識し、その後、ｍＡｂ（１μｇ／ｍｌ）を適用し、１０：１のエフェクター対標的の比でヒトＮＫ細胞を精製した。４時間インキュベートした後、上清中へのカルセイン−ＡＭ放出を測定した。抗ＫＬＨ抗体およびヘルセプチンを、それぞれ、負および正の対照として用いた。特異的溶解％は、（実験に基づく放出−自然発生による放出）／（最大放出−自然発生による放出）×１００として算出した。 組み合わせ研究において、抗ＰＲＬＲ ｍＡｂが、細胞傷害性薬と協力することを示す図である。ドキソルビシン（上のパネル）およびシスプラチン（下のパネル）を、抗ＫＬＨ対照Ａｂ、抗ＰＲＬＲ ｍＡｂ ｃｈＸＨＡ．０６．６４２または抗ＰＲＬＲ ｍＡｂ ｃｈＸＨＡ．０６．２７５（すべて１μｇ／ｍｌで）と同時投与した。細胞生存は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏ分析によって調べ、ＲＬＵ（ｙ軸）として報告されている。 ＳＴＡＴ５リン酸化アッセイにおいて、Ｈｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）ｍＡｂが、抗ＰＲＬＲ機能的特徴を保持することを示す図である。Ｔ４７Ｄ細胞を、１またはｌ０μｇ／ｍｌ ｍＡｂとともにインキュベートし、次いで、ＰＲＬ（５０ｎｇ／ｍｌ）とともに、または伴わずに、さらに３０分間インキュベートした。 図１７ＡおよびＢは、ヒト化抗ＰＲＬＲ抗体候補が、ＰＲＬ依存性ＢａＦ３／ＰＲＬＲ細胞の増殖を強く阻害することを示す図である。ＢａＦ３／ＰＲＬＲ細胞は、ＰＲＬ（５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下、抗ＫＬＨ対照抗体（上部の線）、キメラ抗体またはＨｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）型のいずれかとともに４８時間増殖した。ＥＣ５０値は、曲線適合の非線形回帰分析を用いて算出した。 図１８ＡおよびＢは、ｃｈＸＨＡ．０６．６４２処理動物のＮｂ２−Ｃ１１腫瘍におけるｐ−ＳＴＡＴ５の阻害を示す図である。皮下Ｎｂ２−ｃ１１腫瘍を有する胸腺欠損マウスに、ｃｈＸＨＡ．０６．６４２またはＫＬＨ対照ＩｇＧ１ ｍＡｂを腹膜内に注射した。２日後、２０μｇのｏＰＲＬのボーラス腹膜内注射を投与した。対照動物には生理食塩水を注射した。２日後、２０μｇのｏＰＲＬのボーラス注射を腹膜内に投与し、４０分後、腫瘍を採取し、イムノブロットまたはＩＨＣによってｐ−ＳＴＡＴ５について評価した。図１８Ａ、８０μｇのＴｙｒ６９４ ｐ−ＳＴＡＴ５のウェスタンブロット；図１８Ｂ、Ｔｙｒ６９４ ｐ−ＳＴＡＴ５のＩＨＣ。 図１９ＡおよびＢは、２つの異なる研究で、ｃｈＸＨＡ．０６．６４２が、ＳＣＩＤマウスにおけるＮｂ２−ｃ１１ラットリンパ腫モデルにおいて有効であるということを示す図である。 図２０ＡおよびＢは、ｃｈＸＨＡ．０６．６４２が、ＳＣＩＤマウスにおいて確立されたＮｂ２−Ｃ１１ラットリンパ腫腫瘍を退行させることを示す図である。図２０Ａは、腫瘍量を示し、図２０Ｂは、条件付き生存を示す。 図２１ＡおよびＢは、ｏＰＲＬの腹膜内ボーラス注射が、ｐ−ＳＴＡＴ５を誘導し、ｃｈＡ６４．１での処理が、Ｔ４７Ｄヒト乳房異種移植片におけるｐ−ＳＴＡＴ５誘導を阻害することを示す図である。ｃｈＸＨＡ．０６．６４２またはＫＬＨ対照ＩｇＧ１は、増殖を支援するために０．１８ｍｇ／日のエストラジオール（Ｅ２）ペレットが移植された、Ｔ４７Ｄ腫瘍保有免疫不全マウスに腹膜内に注射した。２日後、２０μｇのｏＰＲＬのボーラス注射を腹膜内に投与し、４０分後、Ｔ４７Ｄ腫瘍を採取し、イムノブロットまたはＩＨＣによってｐ−ＳＴＡＴ５について評価した。ｐ−ＥＲＫまたはｐ−ＡＫＴレベルもイムノブロットによって評価した。図２１Ａ、８０μｇのＴｙｒ６９４ ｐ−ＳＴＡＴ５のウェスタンブロット、図２１Ｂ、Ｔｙｒ６９４ ｐ−ＳＴＡＴ５のＩＨＣ。
詳細な説明
本発明は、ＰＲＬＲ特異的抗体、このような抗体を含有する薬剤製剤、抗体および薬剤製剤を調製する方法および薬剤製剤および化合物を用いて患者を治療する方法を提供する。本発明の抗体は、ＰＲＬＲとの結合および／またはＰＲＬＲの二量体化の阻害および／またはＰＲＬＲ細胞内リン酸化の阻害および／または例えば、Ｊａｋ２、Ｍａｐｋ、Ｓｔａｔ５、Ｅｒｋｌ／２および／またはＡｋｔのリン酸化による、ＰＲＬＲ下流シグナル伝達の阻害および癌または腫瘍と関連している細胞増殖の阻害についての所望の生物活性を有し得る。このようにして、ＰＲＬＲのリン酸化の検出による、またはその他の下流シグナル伝達パートナー、例えば、Ｊａｋ２、Ｓｔａｔ５、Ｅｒｋ１／２および／またはＡｋｔのリン酸化状態の評価による、ＰＲＬＲ活性化の直接分析が考慮される。したがって、下流シグナル伝達経路の分析を用いて、抗ＰＲＬＲ抗体を必要とする患者を同定でき、またはこれを用いて、抗ＰＲＬＲ抗体を用いて治療された患者をモニターできる。
あるいは（またはさらに）本発明の抗体は、癌細胞上で発現されたＰＲＬＲとの結合についての所望の生物活性を有し、ひいては、細胞傷害性治療法を癌細胞にターゲッティングするよう働き得る。
本発明は、さらに、ＰＲＬＲ遺伝子または遺伝子産物およびその変異体のアンタゴニストまたはアゴニストを同定するためのスクリーニングアッセイに関する。したがって、本発明は、ＰＲＬＲ遺伝子または遺伝子産物およびその変異体のアゴニストまたはアンタゴニストを同定する方法および本明細書に記載されるような癌を治療または予防するための前記アゴニストまたはアンタゴニストの使用に関する。さらに、本発明は、例えば、それだけには限らないが、肺、乳房および前立腺などの癌を含む、ＰＲＬＲの異常な発現または活性を特徴とする障害を、スクリーニング、診断、予防および／または治療するための、ＰＲＬＲ遺伝子によってコードされる遺伝子産物の、核酸分子、ポリペプチドおよび／またはアンタゴニストもしくはアゴニストの使用を考慮する。
高親和性および効力を有することがｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイによって測定される、いくつかの好ましいマウスまたはキメラ抗体は、ＳｔｕｄｎｉｃｋａらのＨｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（商標）法に基づいて、ヒトにおいて免疫原性が低くなるよう修飾されている。手短には、抗原結合またはタンパク質フォールディングのいずれかに有害な影響を及ぼす可能性が高いと決定された位置において、表面に露出した重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸残基を、ヒト残基に修飾し、ヒト環境に関するその免疫原性を低減する。修飾重鎖および／または軽鎖可変領域を含有する合成遺伝子を構築し、ヒトγ重鎖および／またはκ軽鎖定常領域と結合される。任意のヒト重鎖および軽鎖定常領域を、Ｈｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）抗体可変領域と組み合わせて用いることができる。ヒト重鎖および軽鎖遺伝子が哺乳類細胞に導入され、得られた組換え免疫グロブリン産物が得られ、特性決定される。
本発明の例示的抗体として、
Figure 2016130250
 が挙げられる。以下の抗体分泌ハイブリドーマは、２００６年８月１７日に、ブタペスト条約の条項に従って、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０−２２０９（ＵＳＡ）に寄託された。
Figure 2016130250
 以下の定義は、本発明をより完全に理解するための助けとして提供される。
一般定義
本明細書において、標的抗原ヒト「ＰＲＬＲ」とは、配列番号２と実質的に同じアミノ酸配列を有するヒトポリペプチドならびにその天然に存在する対立遺伝子および／またはスプライス変異体を指す。本明細書において「ＰＲＬＲのＥＣＤ」とは、配列番号２のアミノ酸２５〜２３４によって表されるＰＲＬＲの細胞外部分を指す。
本明細書において、「腫瘍」とは、悪性であろうと、良性であろうとすべての新生細胞成長および増殖、ならびにすべての前癌性および癌性細胞および組織を指す。
用語「癌」および「癌性」とは、通常、未制御の細胞増殖を特徴とする哺乳類における生理学的状態を指すか説明する。癌の例として、それだけには限らないが、乳癌、結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、リンパ系癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌または皮膚癌が挙げられる。
「治療」とは、障害の発症を防ぐ、または障害の病状を変えるという意図をもって実施される介入である。したがって、「治療」とは、治療的処置および予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）もしくは予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）措置の両方を指す。治療を必要とするものとして、すでに障害を有するものならびに障害が予防されるべきものが挙げられる。腫瘍（例えば、癌）の治療では、治療薬は、腫瘍細胞の病状を直接低減する場合もあるし、腫瘍細胞を、その他の治療薬による治療、例えば、放射線および／または化学療法に対してより感受性にする場合もある。疾患の臨床症状、生化学的症状、放射線学的症状または自覚症状を患う患者の治療は、このような症状の一部もしくはすべてを軽減することまたは疾病素因を低減することを含み得る。癌の「病状」は、患者の幸福を損なうすべての現象を含む。これとしては、制限するものではないが、異常なまたは制御できない細胞増殖、転移、隣接細胞の正常な機能の干渉、異常なレベルでのサイトカインまたはその他の分泌産物の放出、炎症応答または免疫学的応答の抑制または増悪などが挙げられる。従って、治療後の改善は、腫瘍の大きさの減少、腫瘍増殖速度の減退、既存の腫瘍細胞もしくは転移細胞の破壊および／または転移の大きさもしくは数の減少として現れ得る。
治療の目的上、「哺乳類」とは、哺乳類として分類される任意の動物、例えば、ヒト、家畜（ｄｏｍｅｓｔｉｃ ａｎｉｍａｌ）および家畜（ｆａｒｍ ａｎｉｍａｌ）および動物園の動物、スポーツ動物またはペット動物、例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ウシなどを指す。哺乳類はヒトであることが好ましい。
本明細書において、語句「治療上有効な量」とは、所望の治療計画に従って投与された場合に、本発明の実施形態にとって適当であり、所望の治療もしくは予防効果もしくは反応、例えば、疾患のこのような症状の一部もしくはすべてを軽減することまたは疾病素因を低減することを引き出す治療抗体または予防抗体の量を指すものとする。
抗体
「親和性」または「結合親和性」とは、平衡結合定数（ＫＡ）または平衡解離定数（ＫＤ）によって計られることが多い。用語「免疫特異的」または「特異的結合」とは、抗体がＰＲＬＲまたはそのＥＣＤと、約１０６Ｍ−１以上、約１０７Ｍ−１以上、約１０８Ｍ−１以上または約１０９Ｍ−１、１０１０Ｍ−１、１０１１Ｍ−１または１０１２Ｍ−１以上の平衡結合定数（ＫＡ）で結合することを意味する。抗体は、その他の無関係の分子と比較して、標的抗原に対して実質的に高い親和性を有し得る。抗体はまた、相同分子種または相同体と比較して、標的抗原に対して実質的に高い親和性を、標的抗原に対して、例えば、少なくとも１．５倍、２倍、５倍、１０倍、１００倍、１０３倍、１０４倍、１０５倍、１０６倍以上高い相対親和性を有し得る。あるいは、抗体にとって、既知相同体または相同分子種と交差反応することが有用である場合もある。
本発明の抗体はまた、平衡解離定数（ＫＤ）１０−４Ｍ、１０−６Ｍ〜１０−７Ｍまたは１０−８Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍまたは１０−１２Ｍ以下によって特徴付けることができる。このような親和性は、従来技術を用いて、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ ２０００機器を用い、製造業者によって概説された一般手順を用いることによる平衡透析によって、放射性標識された標的抗原を用いるラジオイムノアッセイによって、または当業者に公知の別の方法によって容易に測定できる。親和性データは、例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄら、Ａｎｎ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、５１：６６０頁（１９４９年）の方法によって分析できる。
「中和抗体」とは、結合する標的抗原のエフェクター機能を除去するか、大幅に低減する抗体分子を意味する。したがって、抗標的抗体を「中和すること」によって、酵素活性、リガンド結合または細胞内シグナル伝達などのエフェクター機能を除去または大幅に低減できる。
用語「抗体」は、最も広い意味で用いられ、十分に構築された抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、抗原と結合できる抗体断片（例えば、Ｆａｂ’、Ｆ’（ａｂ）２、Ｆｖ、一本鎖抗体、ダイアボディー）、キャメルボディー（ｃａｍｅｌ ｂｏｄｉｅｓ）および所望の生物活性を示す限り前記のものを含む組換えペプチドを含む。抗体断片は、組換えＤＮＡ技術によって、または無傷の抗体の酵素的もしくは化学的切断によって作製でき、以下にさらに記載される。モノクローナル抗体の限定されない例として、以下に、各々さらに記載される、マウス、キメラ、ヒト化、ヒトおよびＨｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリンに由来する配列を有するキメラ融合タンパク質、またはそれらの突然変異体もしくは誘導体が挙げられる。無傷の分子および／または断片のマルチマーまたは集合体、例えば、化学的に誘導された抗体も考慮される。本発明にしたがって、任意のアイソタイプクラスまたはサブクラスの抗体が考慮される。
本明細書において、用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に相同な抗体の集団から得られた抗体、すなわち、集団を含む個々の抗体が、天然に存在する、少量で存在し得る突然変異の可能性を除いて同一であることを指す。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原部位に対して向けられる。さらに、通常、種々の決定基（エピトープ）に対して向けられる種々の抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して向けられる。モノクローナル抗体は、その特異性に加え、それらが、異なる特異性および特徴を有するその他の免疫グロブリンによって汚染されていない、均一な培養によって合成されるという点で有利である。
修飾語句「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られているというような抗体の特徴を示すものであって、任意の特定の方法による抗体の作製を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５頁［１９７５１によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製してもよく、または組換えＤＮＡ法によって作製してもよい（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号参照のこと）。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、組換え、キメラ、ヒト化、ヒト、Ｈｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）または抗体断片であり得る。
「単離」抗体とは、その天然環境の成分から同定、分離、回収されているものである。その天然環境の混入成分は、抗体の診断上または治療上の使用を干渉する物質であり、これとしては、酵素、ホルモンおよびその他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を挙げることができる。好ましい実施形態では、抗体は、（１）ローリー法によって測定される、抗体の９５重量％を超えて、最も好ましくは、９９重量％を超えて、（２）スピニングカップシークエネーターの使用によって、少なくとも１５残基のＮ末端または内部アミノ酸配列を得るのに十分な程度に、または（３）クーマシーブルーまたは、好ましくは、銀染色を用いて、還元または非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一性まで精製される。単離抗体は、抗体の天然環境の少なくとも１種の成分が存在しないので、組換え細胞内のその場の抗体を含む。しかし、通常、単離抗体は、少なくとも１つの精製ステップによって調製される。
「免疫グロブリン」または「天然抗体」は、四量体の糖タンパク質である。天然に存在する免疫グロブリンでは、各四量体は、２つの同一のポリペプチド鎖の対からなり、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）と、１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）とを有する。各鎖のアミノ末端部分は、主に、抗原認識に関与する約１００〜１１０またはそれより多いアミノ酸の「可変」領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能に関与する定常領域を規定する。免疫グロブリンは、その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて種々のクラスに割り当てられ得る。重鎖は、ミュー（μ）、デルタ（Δ）、ガンマ（γ）、アルファ（α）およびイプシロン（ε）として分類され、抗体のアイソタイプを、それぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥとして規定する。これらのうちいくつかは、サブクラスまたはアイソタイプにさらに分割できる、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２。異なるアイソタイプは異なるエフェクター機能を有し、例えば、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３アイソタイプは、ＡＤＣＣ活性を有する。ヒト軽鎖は、カッパ（κ）およびラムダ（λ）軽鎖として分類される。軽鎖および重鎖内で、可変および定常領域が、約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって結合されており、重鎖はまた、約１０個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。全般的に、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、７章（Ｐａｕｌ，Ｗ．編、第２版Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９年））参照のこと。
抗体の構造および生成の詳細な説明については、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、Ｒｏｔｈ，Ｄ．Ｂ．およびＣｒａｉｇ，Ｎ．Ｌ．、Ｃｅｌｌ、９４：４１１〜４１４頁（１９９８年）参照のこと。手短には、重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子をコードするＤＮＡが生成するプロセスは、主に、Ｂ細胞の発生において起こる。種々の免疫グロブリン遺伝子セグメントの再編成および結合に先立って、Ｖ、Ｄ、Ｊおよび定常（Ｃ）遺伝子セグメントが、通常、単一の染色体上に相対的に極接近して見られる。Ｂ細胞分化の間に、Ｖ、Ｄ、Ｊ（または、軽鎖遺伝子の場合には、ＶおよびＪのみ）遺伝子セグメントの適当なファミリーのメンバーのうち各１種が組換えられて、機能的に再編成された重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子が形成される。この遺伝子セグメント再編成プロセスは、逐次的であると思われる。まず、重鎖Ｄ対Ｊ結合が行われ、続いて、重鎖Ｖ対ＤＪ結合および軽鎖Ｖ対Ｊ結合が行われる。Ｖ、ＤおよびＪセグメントの再編成に加え、軽鎖中のＶおよびＪセグメントが結合される位置および重鎖のＤおよびＪセグメントが結合される位置での可変組み換えによる免疫グロブリン重鎖および軽鎖の初期レパートリーにおいてさらなる多様性が生じる。軽鎖中のこのような変動は、通常、Ｖ遺伝子セグメントの最後のコドンおよびＪセグメントの最初のコドン内に生じる。ＤおよびＪＨセグメント間の重鎖染色体上で結合において同様の不正確さが生じ、１０ヌクレオチドにもわたって及び得る。さらに、ゲノムＤＮＡによってコードされていない、ＤおよびＪＨ間およびＶＨおよびＤ遺伝子セグメント間にいくつかのヌクレオチドが挿入され得る。これらのヌクレオチドの付加は、Ｎ領域多様性として知られている。このような結合の際に生じ得る可変領域遺伝子セグメントおよび可変組換えにおけるこのような再編成の正味の効果は、初期抗体レパートリーの生成である。
「抗体断片」は、無傷の全長抗体（例えば、ヒト抗体を含む）の一部、好ましくは、無傷の抗体の抗原結合または可変領域を含み、抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。抗体断片の限定されない例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体断片、ダイアボディー、トリアボディー（ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ）、テトラボディー（ｔｅｔｒａｂｏｄｉｅｓ）、ミニボディー、線形抗体（Ｚａｐａｔａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、８（１０）：１０５７〜１０６２頁（１９９５））；キレート化組換え抗体、トリボディー（ｔｒｉｂｏｄｉｅｓ）またはビボディー（ｂｉｂｏｄｉｅｓ）、イントラボディー（ｉｎｔｒａｂｏｄｉｅｓ）、ナノボディー（ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ）、スモール・モジュラー・イミュノファーマシューティカルズ（ｓｍａｌｌ ｍｏｄｕｌａｒ
ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）（ＳＭＩＰ）、抗原結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質、キャメライズド（ｃａｍｅｌｉｚｅｄ）抗体、ＶＨＨ含有抗体またはそれらの突然変異体もしくは誘導体、ならびに抗体が所望の生物活性を保持する限り、ＣＤＲ配列などのポリペプチドとの特異的抗原結合を付与するのに十分な免疫グロブリンの少なくとも一部を含むポリペプチドが挙げられる。
抗体のパパイン消化によって、「Ｆａｂ」断片と呼ばれ、各々、単一の抗原結合部位を含む、２つの同一の抗原結合断片と、残存する「Ｆｃ」断片とが得られ、この名称は、３５を容易に結晶化するその能力を反映する。ペプシン処理によって、２つの「Ｆｖ」断片を有するＦ（ａｂ’）２断片が得られる。「Ｆｖ」断片は、完全な抗原認識および結合部位を含む最小の抗体断片である。この領域は、緊密な、非共有結合にある、１つの重鎖と１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。この配置では、各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用して、ＶＨ ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を規定する。まとめて、６つのＣＤＲが、抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な、３つだけのＣＤＲを含むＦｖの半分）は、抗原を認識および結合する能力を有する。
「一本鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖中に存在する。Ｆｖポリペプチドは、Ｆｖが、抗原結合にとって所望の構造を形成するのを可能にする、ＶＨおよびＶＬドメインの間のポリペプチドリンカーをさらに含むことが好ましい。ｓＦｖの総説については、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、第１１３巻、ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２６９〜３１５頁（１９９４年）中、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎを参照のこと。
Ｆａｂ断片はまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ断片は、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端での２、３個の残基、例えば、抗体ヒンジ領域からの１個以上のシステインの付加によってＦａｂ’断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書において、定常ドメインのシステイン残基（複数の残基）が遊離チオール基を保有するＦａｂ’の意味である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元々は、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として作製された。
用語「超可変」領域とは、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」またはＣＤＲ［すなわち、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１年）によって記載される、軽鎖可変ドメイン中の残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメイン中の３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ３）］および／または超可変ループに由来する残基（すなわち、［Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７頁（１９８７年）によって記載される、軽鎖可変ドメイン中の残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）および９１〜９６（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメイン中の２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）および９６〜１０１（Ｈ３）］に由来するアミノ酸残基を含む。
「フレームワーク」またはＦＲ残基とは、超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
語句「定常領域」とは、エフェクター機能を付与する抗体分子の部分を指す。
本明細書において、語句「キメラ抗体」とは、通常、異なる種を起源とする２種の異なる抗体に由来する配列を含有する抗体を指す（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号参照のこと）。最も通常は、キメラ抗体は、ヒトおよびマウス抗体断片、通常、ヒト定常およびマウス可変領域を含む。
用語「変異タンパク質」または「変異体」は、同義的に用いられることができ、変異タンパク質または変異体が、所望の結合親和性または生物活性を保持するという条件で、可変領域または可変領域と同等の部分中に少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失または挿入を含む抗体のポリペプチド配列を指す。変異タンパク質は、親抗体と実質的に相同であるか、または実質的に同一であり得る。
用語「誘導体」とは、本発明の抗体に関連して用いられる場合には、ユビキチン化、治療薬または診断薬とのコンジュゲーション、標識化（例えば、放射性核種または種々の酵素を用いた）、ペグ化（ポリエチレングリコールを用いた誘導体化）などの共有結合性ポリマー結合および非天然アミノ酸の化学合成による挿入または置換のような技術によって共有結合的に修飾された抗体を指す。本発明の誘導体は、本発明の非誘導体化分子の結合特性を保持する。
本明細書において用いられる場合、用語「抗体」は、ＰＲＬＲの細胞外部分と結合する能力を保持する以下のうち任意の１種を具体的に含む：
１）図７Ａ〜７Ｃまたは図８に示されるアミノ酸配列を有する親抗体のアミノ酸変異タンパク質、例えば、相同性決定について類似のアミノ酸を考慮して、親アミノ酸配列と、少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％相同である可変重鎖アミノ酸配列を含む、および／または親アミノ酸配列と、少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％相同である可変軽鎖アミノ酸配列を含む変異タンパク質；
２）図７Ａ〜７Ｃまたは図８に示されるアミノ酸配列を有する親抗体の１以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、好ましくは、少なくとも重鎖のＣＤＲ３を含む、好ましくは、２以上または３以上または４以上または５以上または６つすべてのＣＤＲを含むＰＲＬＲ結合性ポリペプチド；
３）Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、米国特許第５，７６６，８８６号および本明細書において実施例５に示される方法に従い、低い、中程度のおよび高い危険度の残基を同定するためのＫａｂａｔ番号付けを用いて、親配列を変更することによって作製されたＨｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）抗体；以下の重鎖のうち少なくとも１種と、以下の軽鎖のうち少なくとも１種とを含むこのような抗体：（ａ）ヒト参照免疫グロブリン配列中の対応する残基とは異なる、すべての低い危険度のげっ歯類残基が、ヒト参照免疫グロブリン配列中のヒト残基と同一であるよう修飾されている重鎖または（ｂ）すべての低いおよび中程度の危険度のげっ歯類残基が、必要に応じて、ヒト参照免疫グロブリン配列中と同一残基であるよう修飾されている重鎖、（ｃ）すべての低い危険度の残基が、必要に応じて、ヒト参照免疫グロブリン配列と同一残基であるよう修飾されている軽鎖または（ｂ）すべての低いおよび中程度の危険度の残基が、必要に応じて、ヒト参照免疫グロブリン配列と同一残基であるよう修飾されている軽鎖
４）元のげっ歯類軽鎖と、少なくとも６０％、より好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも８５％、より好ましくは、少なくとも９０％、最も好ましくは、少なくとも９５％、のアミノ酸配列同一性、例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％および１００％の同一性を有する、重鎖もしくは軽鎖または重鎖可変領域もしくは軽鎖可変領域を含む前節（３）の前記抗体の変異タンパク質；
５）げっ歯類抗体の１以上のＣＤＲの高い危険度の残基を含む、好ましくは、２以上、または３以上、または４以上、または５以上、または６つすべてのＣＤＲの高い危険度の残基を含み、場合により、危険度の低いまたは中程度の残基に１以上の変更を含んでもよい、ＰＲＬＲ結合性ポリペプチド；
例えば、低い危険度の残基に１以上の変更と、中程度の危険度の残基に保存的置換とを含む、または
例えば、中程度および高い危険度のアミノ酸残基を保持し、低い危険度の残基に１以上の変更を含み、
この場合、変更は、挿入、欠失または置換を含み、保存的置換であり得、操作された抗体が配列において、ヒト軽鎖または重鎖配列、ヒト生殖系列軽鎖または重鎖配列、コンセンサスヒト軽鎖または重鎖配列、またはコンセンサスヒト生殖系列軽鎖または重鎖配列とより近くになるようにさせ得る。このように考慮された変更はまた、以下のように配列形式で示すこともできる。ＡＫＫＬＶＨＴＰＹＳＦＫＥＤＦという仮定上の配列では、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、米国特許第５，７６６，８８６号に従って各残基に割り当てられた個々の危険は、ＨＭＬＨＭＬＨＭＬＨＭＬＨＭＬ（Ｈ＝高い、Ｍ＝中程度、Ｌ＝低い）であり、仮定上の配列の危険度の低い残基への例示的変更は、ＡＫＸＬＶＸＴＰＸＳＦＸＥＤＸ（式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、あるいは、Ｘはその位置での元の残基の保存的置換である）として示すことができ、危険度の低いまたは中程度の残基の例示的変更は、同様に示すことができる、例えば、ＡＹＸＬＹＸＴＹＸＳＹＸＥＹＸ（式中、Ｘは、任意のアミノ酸であり、Ｙは、その位置での元の残基の保存的置換である）。
用語「競合抗体」とは以下を含む
１）抗体
Figure 2016130250
 と同じＰＲＬＲのエピトープと結合すると、例えば、Ｘ線結晶学によって調べられた、非マウスまたは非げっ歯類モノクローナル抗体；および／または
２）抗体
Figure 2016130250
 と、７５％を超えて、８０％を超えて、または８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％または９５％を超えて競合する非マウスまたは非げっ歯類モノクローナル抗体；あるいは、
Figure 2016130250
 の結合を、少なくとも２、３、４、５、６、１０、２０、５０、１００倍以上低減する非マウスまたは非げっ歯類モノクローナル抗体。一実施形態では、非マウスまたは非げっ歯類モノクローナル抗体は、５０倍モル過剰である。
本発明の抗体は、１０−６、１０−７、１０−８、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ以下の平衡解離定数でＰＲＬＲのＥＣＤと結合することが好ましく、例えば、ＳＴＡＴ５、ＭＡＰＫまたはＡＫＴの活性化によって、ＰＲＬＲ細胞内リン酸化および下流ＰＲＬＲシグナル伝達の活性化を阻害することが好ましい。
本明細書の出願日より前に公開された、または本明細書の出願日より前に出願された出願に公開された任意のキメラ、ヒトまたはヒト化抗体は、本発明の範囲から場合により排除される。
「非げっ歯類」モノクローナル抗体とは、げっ歯類ハイブリドーマによって生成された完全な無傷のげっ歯類モノクローナル抗体ではない、本明細書において広く定義される、任意の抗体である。したがって、非げっ歯類抗体は、具体的には、それだけには限らないが、げっ歯類抗体の変異タンパク質、げっ歯類抗体断片、線形抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体ｓ、Ｈｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）抗体およびヒト抗体、例えば、トランスジェニック動物から、またはファージディスプレイ技術によって産生されたヒト抗体を含む。同様に、非マウス抗体として、それだけには限らないが、マウス抗体の変異タンパク質、マウス抗体断片、線形抗体、キメラ、ヒト化、Ｈｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）およびヒト抗体が挙げられる。
標的抗原
抗体の作製に用いられる標的抗原は、例えば、ＰＲＬＲの細胞外部分、またはエピトープがその天然コンホメーションでディスプレイされるのを可能にする、別のポリペプチドと場合により融合していてもよい、所望のエピトープを保持する断片であり得る。あるいは、細胞の表面に発現された無傷のＰＲＬＲを用いて抗体を作製することができる。このような細胞は、ＰＲＬＲを発現するよう形質転換してもよいし、またはＰＲＬＲを発現するその他の天然に存在する細胞であり得る。抗体を作製するのに有用なＰＲＬＲポリペプチドのその他の形は、当業者には明らかである。
ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、関連抗原およびアジュバントの複数回の皮下（ｓｃ）または腹膜内（ｉｐ）注射によって動物において作製されることが好ましい。改善された抗体反応は、二官能性剤または誘導体化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介したコンジュゲーション）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基を介した）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸または当技術分野で公知のその他の薬剤を用いて、関連抗原を、免疫化される種において免疫原性であるタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリンまたはダイズトリプシンインヒビターとコンジュゲートすることによって得ることができる。
例えば、１００μｇまたは５μｇのタンパク質またはコンジュゲート（それぞれ、ウサギまたはマウスに対して）を、３容積のフロイントの完全アジュバントと組み合わせ、この溶液を複数の部位に皮内注射することによって、抗原、免疫原性コンジュゲートまたは誘導体に対して動物を免疫化する。１ヵ月後、フロイントの完全アジュバント中、ペプチドまたはコンジュゲートの元の量の１／５｛割合（１／１０）｝を用い、複数の部位に皮下注射することによって動物をブーストする。ブースター注射の７〜１４日後、動物を出血させ、血清を抗体力価についてアッセイする。力価がプラトーに達するまで動物をブーストする。動物を同一抗原であるが異なるタンパク質と、かつ／または異なる架橋試薬によってコンジュゲートされているコンジュゲートを用いてブーストすることが好ましい。コンジュゲートはまた、組換え細胞培養においてタンパク質融合物として作製することもできる。また、ミョウバンなどの凝集剤も、免疫応答を増強するために適切に用いられる。
モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５頁（１９７５年）によって最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製してもよく、または組換えＤＮＡ法によって作製してもよい。
ハイブリドーマ法では、マウスまたはその他の適当な宿主動物、例えば、ハムスターまたはマカクザルを、本明細書に記載されるように免疫化して、免疫化に用いられたタンパク質と特異的に結合する抗体を産生するか、産生できるリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫化してもよい。次いで、適した融合剤、例えば、ポリエチレングリコールを用いてリンパ球を骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマ細胞を形成するか（Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ、５９〜１０３頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８６年））、または電気細胞融合を用いて融合できる。
このように調製されたハイブリドーマ細胞を播種し、好ましくは、融合していない、親骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する１種以上の物質を含む適した培養培地で増殖させる。例えば、親骨髄腫細胞は、酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠き、ハイブリドーマの培養培地は、通常、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン（ＨＡＴ培地）含み、これらの物質は、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を妨げる。
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベル産生を支援し、培地に対して感受性であるものである。ヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株はまた、ヒトモノクローナル抗体の産生についても記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３３：３００１頁（１９８４年）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、５１〜６３頁（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８７年））。例示的マウス骨髄腫株としては、Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．ＵＳＡから入手可能であるＭＯＰ−２１およびＭ．Ｃ．−１１マウス腫瘍に由来するもの、およびＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．ＵＳＡから入手可能であるＳＰ−２またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞が挙げられる。
ハイブリドーマ細胞が増殖している培養培地を、抗原に対して向けられたモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によって、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ結合実験、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって調べることが好ましい。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、スキャッチャード解析法（Ｍｕｎｓｏｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０７：２２０頁（１９８０年））によって調べることができる。
所望の特異性、親和性、および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後、クローンを限界希釈手順によってサブクローニングし、標準法によって増殖させることができる（Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、５９〜１０３頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８６年））。この目的上、適した培養培地として、例えば、Ｄ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。さらに、ハイブリドーマ細胞を、動物において腹水腫瘍としてｉｎ ｖｉｖｏで増殖させることができる。サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析またはアフィニティークロマトグラフィーなどによって培養培地、腹水または血清から分離する モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来手順を用いて（例えば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子と特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）、ハイブリドーマ細胞から単離および配列決定できる。配列決定には、通常、注目する遺伝子またはｃＤＮＡの少なくとも一部の単離が必要となる。通常、これには、モノクローナル抗体をコードするＤＮＡ、好ましくは、ｍＲＮＡ（すなわち、ｃＤＮＡ）をクローニングすることが必要である。クローニングは、標準技術を用いて実施する（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｇｕｉｄｅ、１〜３巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ参照のこと）。例えば、ｃＤＮＡライブラリーを、ポリＡ＋ ｍＲＮＡ、好ましくは、膜結合型ｍＲＮＡの逆転写によって構築し、このライブラリーをヒト免疫グロブリンポリペプチド遺伝子配列に特異的なプローブを用いてスクリーニングしてもよい。しかし、好ましい実施形態では、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、注目する免疫グロブリン遺伝子セグメント（例えば、軽鎖可変セグメント）をコードするｃＤＮＡ（または全長ｃＤＮＡの一部）を増幅する。増幅された配列は、任意の適したベクター、例えば、発現ベクター、ミニ遺伝子ベクターまたはファージディスプレイベクターに容易にクローニングできる。当然のことではあるが、用いられた特定のクローニング方法は、注目する免疫グロブリンポリペプチドのいくらかの部分の配列を調べることが可能である限り、決定的なものではない。本明細書において、「単離」核酸分子または「単離」核酸配列とは、（１）同定され、核酸の天然供給源中では通常関連している、少なくとも１種の夾雑核酸分子から分離されているか、または（２）クローニングされ、増幅され、タグがつけられるか、そうでなければ、注目する核酸の配列を決定することができるようバックグラウンド核酸と区別されているのいずれかである核酸分子が、単離されていると考えられる。単離核酸分子は、天然に見られる形または設定以外である。したがって、単離核酸分子は、天然の細胞中に存在するような核酸分子と区別される。しかし、単離核酸分子は、通常、天然細胞のものとは異なる染色体位置にある、抗体を発現する細胞中に含まれる核酸分子を含む。
クローニングおよび配列決定に用いたＲＮＡの１種の供給源として、トランスジェニックマウスからＢ細胞を得、このＢ細胞を不死細胞と融合することによって作製されたハイブリドーマがある。ハイブリドーマを用いることの利点は、それらを容易にスクリーニングでき、注目するヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが選択されることである。あるいは、ＲＮＡは、免疫化された動物のＢ細胞（または脾臓全体）から単離できる。ハイブリドーマ以外の供給源が用いられる場合には、特異的結合特性を有する免疫グロブリンまたは免疫グロブリンポリペプチドをコードする配列をスクリーニングすることが望ましい場合がある。このようなスクリーニングのための１つの方法として、ファージディスプレイ技術の使用がある。ファージディスプレイは、例えば、各々、参照により本明細書に組み込まれる、Ｄｏｗｅｒら、ＷＯ９１／１７２７１、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、ＷＯ９２／０１０４７ならびにＣａｔｏｎおよびＫｏｐｒｏｗｓｋｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：６４５０〜６４５４頁（１９９０年）に記載されている。ファージディスプレイ技術を用いる一実施形態では、免疫化されたトランスジェニックマウス（例えば、全脾臓ｃＤＮＡ）から得たｃＤＮＡを単離し、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、免疫グロブリンポリペプチドの一部、例えば、ＣＤＲ領域をコードするｃＤＮＡ配列を増幅し、増幅された配列をファージベクターに挿入する。所望の結合特性を有する、注目するペプチド、例えば、可変領域ペプチドをコードするｃＤＮＡを、パニングなどの標準技術によって同定する。
次いで、増幅されるか、クローニングされた核酸の配列を調べる。通常、免疫グロブリンポリペプチドの全可変領域をコードする配列を調べるが、可変領域の一部のみ、例えば、ＣＤＲをコードする部分を配列決定することが適当である場合がある。通常、配列決定される部分は、少なくとも３０塩基の長さであるが、コードに基づいて、可変領域の長さの少なくとも約１／３または少なくとも約１／２が配列決定されることがより多い。
配列決定は、ｃＤＮＡライブラリーから単離されたクローンで、またはＰＣＲが用いられる場合には、増幅された配列をサブクローニングした後に、または増幅されたセグメントの直接ＰＣＲ配列決定によって実施できる。配列決定は、標準技術を用いて実施する（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｇｕｉｄｅ、１〜３巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ＰｒｅｓｓおよびＳａｎｇｅｒ，Ｆ．ら（１９７７年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：５４６３〜５４６７頁参照のこと）。クローニングされた核酸の配列を、ヒト免疫グロブリン遺伝子およびｃＤＮＡの公開された配列と比較することによって、当業者ならば、配列決定された領域に応じて、（ｉ）ハイブリドーマ免疫グロブリンポリペプチド（重鎖のアイソタイプを含む）の生殖系列セグメント使用および（ｉｉ）Ｎ領域付加および体細胞突然変異の過程から得られた配列を含む、重鎖および軽鎖可変領域の配列を容易に決定することができる。免疫グロブリン遺伝子配列情報の１つの供給源として、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄがある。
抗体断片
上記のように、抗体断片は、無傷の全長抗体の一部、好ましくは、無傷抗体の抗原結合または可変領域を含み、抗体断片から形成された線形抗体および多重特異性抗体を含む。抗体断片の限定されない例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｄ、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体断片、ダイアボディー、トリアボディー（ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ）、テトラボディー（ｔｅｔｒａｂｏｄｉｅｓ）、ミニボディー、線形抗体、キレート化組換え抗体、トリボディー（ｔｒｉｂｏｄｉｅｓ）またはビボディー（ｂｉｂｏｄｉｅｓ）、イントラボディー（ｉｎｔｒａｂｏｄｉｅｓ）、ナノボディー（ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ）、スモール・モジュラー・イミュノファーマシューティカルズ（ｓｍａｌｌ ｍｏｄｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）（ＳＭＩＰ）、抗原結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質、キャメライズド（ｃａｍｅｌｉｚｅｄ）抗体、ＶＨＨ含有抗体またはそれらの変異タンパク質もしくは誘導体、ならびに抗体が所望の生物活性を保持する限り、ＣＤＲ配列などのポリペプチドとの特異的抗原結合を付与するのに十分な免疫グロブリンの少なくとも一部を含むポリペプチドが挙げられる。このような抗原断片は、全抗体の修飾によって作製してもよいし、または組換えＤＮＡ技術またはペプチド合成を用いてｄｅ ｎｏｖｏ合成してもよい。
用語「ダイアボディー」とは、２つの抗原結合部位を含む小さな抗体断片を指し、この断片は、同一ポリペプチド鎖中で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と連結している重鎖可変ドメイン（ＶＨ）（ＶＨ ＶＬ）を含む。同一鎖上の２つのドメイン間に、短すぎて対形成できないリンカーを用いることによって、ドメインは、別の鎖の相補的ドメインと対形成を強いられ、２つの抗原結合部位が作られる。ダイアボディーは、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；および３０ Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：６４４４〜６４４８頁（１９９３年）により十分に記載されている。
「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖中に存在し、ＶＨとＶＬドメインの間に、Ｆｖが、抗原結合にとって所望の構造を形成するのを可能にするポリペプチドリンカーを場合により含んでもよい（Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３〜４２６頁、１９８８年およびＨｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ８５：５８７９〜５８８３頁、１９８８年）。Ｆｄ断片は、ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなる。
さらなる抗体断片は、ＶＨドメインからなるドメイン抗体（ｄＡｂ）断片（Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４〜５４６頁、１９８９年）を含む。
「線形抗体」は、１対のタンデムなＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含み、これが１対の抗原結合領域を形成する。線形抗体は、二重特異性または単一特異性であり得る（Ｚａｐａｔａら、タンパク質 Ｅｎｇ．８：１０５７〜６２頁（１９９５年））。
ペプチドリンカー（ヒンジなし（ｈｉｎｇｅｌｅｓｓ））を介して、またはＩｇＧヒンジを介してＣＨ３と融合しているｓｃＦｖからなる「ミニボディー」が、Ｏｌａｆｓｅｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ．２００４ Ａｐｒ；１７（４）：３１５〜２３頁に記載されている。
軽鎖を欠く機能的重鎖抗体は、ナースシャーク（ｎｕｒｓｅ ｓｈａｒｋｓ）（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ ３７４：１６８〜７３頁、１９９５年）、ウォビゴンシ
ャーク（ｗｏｂｂｅｇｏｎｇ ｓｈａｒｋｓ）（Ｎｕｔｔａｌｌら、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３８：３１３〜２６頁、２００１年）およびラクダ科、例えば、ラクダ、ヒトコブラクダ、アルパカおよびラマ（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ３６３：４４６〜８頁、１９９３年；Ｎｇｕｙｅｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７５：４１３頁、１９９８年）では天然に存在する。抗原結合部位は、これらの動物では、単一のドメイン、ＶＨＨドメインに減少している。これらの抗体は、重鎖可変領域のみを用いて抗原結合領域を形成する。すなわち、これらの機能的抗体は、重鎖のみのホモ二量体であり、構造Ｈ２Ｌ２を有する（「重鎖抗体」または「ＨＣＡｂｓ」と呼ばれる）。キャメライズド（ｃａｍｅｌｉｚｅｄ）ＶＨＨは、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含み、ＣＨ１ドメインを欠くＩｇＧ２およびＩｇＧ３定常領域と再結合すると報告されている（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎら、前掲）。例えば、ラマＩｇＧ１は、ＶＨが、ヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む定常領域と再結合する従来の（Ｈ２Ｌ２）抗体アイソタイプであるが、ラマＩｇＧ２およびＩｇＧ３は、ＣＨ１ドメインを欠き、軽鎖を含まない重鎖のみのアイソタイプである。従来のＶＨのみの断片は、可溶性型を産生することが困難であるが、溶解度および特異的結合の改善は、フレームワーク残基がよりＶＨＨ様であるよう変更される場合に得ることができる。（例えば、Ｒｅｉｃｈｍａｎら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １９９９、２３１：２５〜３８頁参照のこと）。キャメライズド（ｃａｍｅｌｉｚｅｄ）ＶＨＨドメインは、高親和性を有する抗原と結合し（Ｄｅｓｍｙｔｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２６２８５〜９０頁、２００１年）、溶液中で高い安定性を有すること（Ｅｗｅｒｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４１：３６２８〜３６頁、２００２年）がわかっている。キャメライズド（ｃａｍｅｌｉｚｅｄ）重鎖を有する抗体を作製する方法は、例えば、米国特許公報第２００５０１３６０４９号および同２００５００３７４２１号に記載されている。
重鎖抗体の可変ドメインは、分子量がわずか１５ｋＤａである、最も小さい十分に機能的な抗原結合断片であるので、この実体はナノボディーと呼ばれる（Ｃｏｒｔｅｚ−Ｒｅｔａｍｏｚｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６４：２８５３〜５７頁、２００４年）。ナノボディーライブラリーは、Ｃｏｎｒａｔｈら（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ４５：２８０７〜１２頁、２００１年）に記載されるように免疫化されたヒトコブラクダから、またはに記載される組換え法を用いて作製できる。
イントラボディー（ｉｎｔｒａｂｏｄｉｅｓ）は、細胞内発現を示し、細胞内タンパク質機能を操作できる一本鎖抗体である（Ｂｉｏｃｃａら、ＥＭＢＯ Ｊ．９：１０１〜１０８頁、１９９０年；Ｃｏｌｂｙら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１０１：１７６１６〜２１頁、２００４年）。抗体構築物を細胞内領域に保持する細胞シグナル配列を含むイントラボディー（ｉｎｔｒａｂｏｄｉｅｓ）は、Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒら（ＥＭＢＯ Ｊ １４：１５４２〜５１頁、１９９５年）およびＷｈｅｅｌｅｒら（ＦＡＳＥＢ Ｊ．１７：１７３３〜５頁、２００３年）に記載されるように作製できる。トランスボディー（Ｔｒａｎｓｂｏｄｉｅｓ）は、タンパク質遺伝子導入ドメイン（ＰＴＤ）が、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）抗体と融合している細胞透過性抗体である、Ｈｅｎｇら（Ｍｅｄ Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ．６４：１１０５〜８頁、２００５年）。
さらに考慮されるものとして、標的タンパク質に特異的なＳＭＩＰまたは結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質である抗体がある。これらの構築物は、抗体エフェクター機能を実施するのに必要な免疫グロブリンドメインと融合している抗原結合ドメインを含む一本鎖ポリペプチドである。例えば、ＷＯ０３／０４１６００、米国特許公報第２００３０１３３９３９号および米国特許公報第２００３０１１８５９２参照のこと。
多価抗体
いくつかの実施形態では、多価またはさらに多重特異性（例えば、二重特異性、三重特異性など）モノクローナル抗体を作製することが望ましい場合がある。このような抗体は、標的抗原の少なくとも２種の異なるエピトープに対して結合特異性を有し得るか、あるいは、２種の異なる分子と、例えば、標的抗原とおよび細胞表面タンパク質または受容体と結合し得る。例えば、二重特異性抗体は、標的と結合するアームと、白血球に対する誘発分子、例えば、Ｔ細胞受容体分子（例えば、ＣＤ２またはＣＤ３）またはＩｇＧのＦｃ（ＦｃγＲ）、例えば、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）受容体と結合して、細胞防御機構を標的発現細胞に集中させるもう１つのアームとを含み得る。別の例として、二重特異性抗体を用いて、細胞傷害剤を、標的抗原を発現する細胞に局在化させることができる。これらの抗体は、標的結合アームと、細胞傷害剤（例えば、サポリン、抗インターフェロン−６０、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキサートまたは放射性同位元素ハプテン）と結合するアームとを有する。多重特異性抗体は、全長抗体または抗体断片として調製できる。
二重特異性抗体は、架橋または「ヘテロコンジュゲート」抗体を含む。例えば、ヘテロコンジュゲート中の抗体の一方は、アビジンとカップリングでき、もう一方はビオチンとカップリングできる。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の好都合な架橋法を用いて作製できる。適した架橋剤は、当技術分野で周知であり、米国特許第４，６７６，９８０号に、いくつかの架橋技術とともに開示されている。
二重特異性抗体を作製するためのもう１つのアプローチによれば、抗体分子対の間の界面を、組換え細胞培養から回収されるヘテロ二量体のパーセンテージを最大にするよう設計できる。好ましい界面は、少なくとも抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの一部を含む。この方法では、第１の抗体分子の界面に由来する１以上の小さなアミノ酸側鎖を、大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）と置換する。大きな側鎖（複数の側鎖）と同一または類似の大きさの補整性「空洞」を、大きなアミノ酸側鎖を小さなもの（例えば、アラニンまたはトレオニン）と置換することによって第２の抗体分子の界面に作製する。これによって、その他の不要な最終産物、例えば、ホモ二量体を上回って、ヘテロ二量体の収率を増大する機序が提供される。１９９６年９月６日に公開されたＷＯ９６／２７０１１参照のこと。
抗体断片から二重特異性抗体を作製する技術は、文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体は、化学結合を用いて調製できる。Ｂｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１頁（１９８５年）には、無傷の抗体をタンパク質分解的に切断して、Ｆ（ａｂ’）２断片を作製する手順が記載されている。これらの断片を、ジチオール錯化剤亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元して、隣接するジチオールを安定化し、分子内ジスルフィド形成を防ぐ。次いで、作製されたＦａｂ’断片を、チオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に変換する。次いで、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の一方を、メルカプトエチルアミンを用いる還元によってＦａｂ’−チオールに再変換し、等モル量のもう一方のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合して二重特異性抗体を形成する。作製された二重特異性抗体を、酵素の選択的固定化のための物質として用いることができる。Ｂｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１〜１０４３頁（１９８８年）には、細菌からの機能性抗体断片の分泌が開示されている（例えば、Ｂｅｔｔｅｒら、Ｓｋｅｒｒａら． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０３８〜１０４１頁（１９８８年）参照のこと）。例えば、Ｆａｂ’−ＳＨ断片は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から直接回収し、化学的にカップリングして、二重特異性抗体を形成できる（Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３〜１６７頁（１９９２年）；Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７〜２２５頁（１９９２年））。
Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７〜２２５頁（１９９２年）には、十分にヒト化された二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の作製が記載されている。各Ｆａｂ’断片を、大腸菌から別個に分泌させ、ｉｎ ｖｉｔｒｏで定方向化学的カップリングに付し、二重特異性抗体を形成する。このように形成された二重特異性抗体は、ＨＥＲ２受容体を過剰発現する細胞および正常ヒトＴ細胞と結合でき、ならびに、ヒト乳腺腫瘍標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解活性を誘発した
組換え細胞培養物から直接、二重特異性抗体を作製および単離するための種々の技術も記載されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパー、例えば、ＧＣＮ４を用いて作製されている（大まかには、Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（５）：１５４７〜１５５３頁（１９９２）参照のこと）。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドを、遺伝子融合によって２種の異なる抗体のＦａｂ’部分と連結した。抗体ホモ二量体を、ヒンジ領域で還元して単量体を形成し、次いで、再酸化して抗体ヘテロ二量体を形成する。この方法はまた、抗体ホモ二量体の作製のために利用できる。
用語「ダイアボディー」とは、２つの抗原結合部位を含む小さい抗体断片を指し、この断片は、同一ポリペプチド鎖中で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と連結している重鎖可変ドメイン（ＶＨ）（ＶＨ ＶＬ）を含む。同一鎖上の２つのドメイン間に、短すぎて対形成できないリンカーを用いることによって、ドメインは、別の鎖の相補的ドメインと対形成を強いられ、２つの抗原結合部位が作られる。例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：６４４４〜６４４８頁（１９９３年）参照のこと。
二重特異性抗体断片を作製するための別の戦略も報告されている。Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８頁（１９９４年）参照のこと。
あるいは、二重特異性抗体は、Ｚａｐａｔａら、タンパク質 Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７〜１０６２頁（１９９５年）に記載されるとおりに作製された「線形抗体」であり得る。手短には、これらの抗体は、１対のタンデムなＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含み、これが１対の抗原結合領域を形成する。線形抗体は、二重特異性または単一特異性であり得る。
２より多い結合価を有する抗体も考慮される。例えば、三重特異性抗体を調製できる（Ｔｕｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０頁（１９９１年））。
「キレート化組換え抗体」とは、標的抗原の隣接するオーバーラップしていないエピトープを認識する二重特異性抗体であり、両エピトープと同時に結合するのに十分なよう曲がりやすい（Ｎｅｒｉら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２４６：３６７〜７３頁、１９９５年）。
二重特異性Ｆａｂ−ｓｃＦｖ（「ビボディー（ｂｉｂｏｄｙ）」）および三重特異性Ｆａｂ−（ｓｃＦｖ）（２）（「トリボディー（ｔｒｉｂｏｄｙ）」）の作製が、Ｓｃｈｏｏｎｊａｎｓら（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：７０５０〜５７頁、２０００年）およびＷｉｌｌｅｍｓら（Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ Ａｎａｌｙｔ Ｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｍｅｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．７８６：１６１〜７６頁、２００３年）に記載されている。ビボディー（ｂｉｂｏｄｉｅｓ）またはトリボディー（ｔｒｉｂｏｄｉｅｓ）については、ｓｃＦｖ分子を、ＶＬ−ＣＬ（Ｌ）およびＶＨ−ＣＨ１（Ｆｄ）鎖の一方または両方と融合する。例えば、トリボディー（ｔｒｉｂｏｄｙ）を作製するために、２つのｓｃＦｖｓを、ＦａｂのＣ末端と融合するのに対し、ビボディー（ｂｉｂｏｄｙ）では、１つのｓｃＦｖをＦａｂのＣ末端と融合する。
抗体の組換え製造
抗体は、当技術分野で周知の抗体発現系の１つを用いて組換えＤＮＡ法によって作製できる（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８年）参照のこと）。
本発明の抗体をコードするＤＮＡは、発現ベクターに入れることができ、次いで、これを、大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、ヒト胚腎臓２９３細胞（例えば、２９３Ｅ細胞）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはそうでなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトして、組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成を得る。抗体の組換え製造は、当技術分野では周知である。抗体断片は、無傷の抗体のタンパク質消化によって得られてきた（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：１０７〜１１７頁（１９９２年）およびＢｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１（１９８５年）参照のこと）。しかし、これらの断片は、今では、組換え宿主細胞によって直接産生され得る。ペプチド合成および共有結合をはじめとする抗体断片を作製するためのその他の技術は、当業者には明らかである。
発現制御配列とは、特定の宿主生物における、機能し得る形で連結しているコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に適している制御配列として、例えば、プロモーター、場合により、オペレーター配列およびリボソーム結合部位が挙げられる。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを利用することがわかっている。
核酸は、別の核酸配列と機能的関係におかれている場合に機能し得る形で連結している。例えば、プレ配列または分泌リーダーＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合に、ポリペプチドのＤＮＡと作動可能に連結しており；プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合に、コード配列と作動可能に連結しており；リボソーム結合部位は、翻訳を促進するよう位置している場合に、機能し得る形で連結している。通常、ＤＮＡ配列が連結している機能し得る形で連結している手段は、近接しており、分泌リーダーの場合には、近接しており、リーディング相にある。しかし、エンハンサーは、近接している必要はない。連結は、好都合な制限部位でのライゲーションによって達成される。このような部位が存在しない場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを、従来の実施にしたがって用いる。
細胞、細胞株および細胞培養は、同義的に用いられることが多く、本明細書において、すべてのこのような表示は後代を含む。形質転換体および形質転換された細胞は、初代対象細胞および移動の数に関わらずそれに由来する培養物を含む。また、すべての後代は、意図的なまたは偶発的な突然変異のために、ＤＮＡ含量において厳密には同一ではない可能性があるということも理解される。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされたものと同一の機能または生物活性を有する突然変異後代が含まれる。個々の表示が対象とされる場合には、文脈から明らかである。
代替実施形態では、注目する免疫グロブリンのアミノ酸配列は、直接タンパク質配列決定によって調べることができる。適したコード化ヌクレオチド配列は、一般的なコドン表に従って設計できる。
所望の抗体のアミノ酸配列変異タンパク質は、コード化ＤＮＡに適当なヌクレオチド変更を導入することによって、またはペプチド合成によって調製できる。このような変異タンパク質は、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失および／または抗体のアミノ酸配列内の残基への挿入および／または抗体のアミノ酸配列内の残基の置換を含む。最終構築物が所望の特徴を有するという条件で、任意の組み合わせの欠失、挿入および置換が最終構築物に達するよう作製される。アミノ酸の変更はまた、グリコシル化部位の数または位置を変更するなど、モノクローナル、ヒト、ヒト化、Ｈｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）または変異タンパク質抗体の翻訳後プロセスも変更し得る。
抗体のアミノ酸配列変異タンパク質をコードする核酸分子は、当技術分野で公知の種々の方法によって調製される。これらの方法として、それだけには限らないが、天然供給源からの単離（天然に存在するアミノ酸配列変異タンパク質の場合には）またはオリゴヌクレオチド媒介性（または部位指定）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発および先に調製された変異タンパク質または非変異タンパク質型の抗体のカセット突然変異誘発による調製が挙げられる。
本発明はまた、宿主細胞によって認識される制御配列と作動可能に連結されている本発明の抗体をコードする単離核酸、核酸を含むベクターおよび宿主細胞ならびに核酸が発現されるよう宿主細胞を培養することおよび宿主細胞培養物または培養培地から抗体を場合により回収することを含み得る、抗体を作製するための組換え技術を提供する。
抗体の組換え製造には、それをコードする核酸を単離し、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）のために、または発現のために複製ベクターに挿入する。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来手順を用いて（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子と特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）、容易に単離され、配列決定される。多数のベクターが利用可能である。ベクター成分は、通常、それだけには限らないが、以下のうち１種以上を含む：シグナル配列、複製起点、１種以上の選択マーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーターおよび転写終結配列。
（１）シグナル配列成分
本発明の抗体は、直接的にだけでなく、成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端に特定の切断部位を有するシグナル配列またはその他のポリペプチドであることが好ましい、異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとしても組換えによって製造できる。選択されるシグナル配列は、宿主細胞によって認識され、プロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものであることが好ましい。原核生物の宿主細胞が、天然抗体シグナル配列を認識およびプロセシングしない場合には、シグナル配列は、例えば、ペクチン酸リアーゼ（例えば、ｐｅｌＢ）アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐまたは熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーからなる群から選択されるシグナル配列によって置換されてもよい。酵母分泌には、天然シグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー（サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）およびクリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）α−因子リーダーを含む）または酸性ホスファターゼリーダー、Ｃ．アルビカンス（ａｌｂｉｃａｎｓ）グルコアミラーゼリーダーまたはＷＯ９０／１３６４６に記載されるシグナルによって置換されてもよい。哺乳類細胞発現では、哺乳類シグナル配列ならびにウイルス分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスｇＤシグナルが利用可能である。
このような前駆体領域のＤＮＡを、リーディングフレームで、抗体をコードするＤＭＡとライゲーションする。
（２）複製起点成分
発現およびクローニングベクターの両方とも、１種以上の選択された宿主細胞においてベクターが複製するのを可能にする核酸配列を含む。通常、クローニングベクターでは、この配列は、ベクターが、宿虫染色体ＤＮＡを独立に複製するのを可能にするものであり、複製起点または自立複製配列を含む。このような配列は、種々の細菌、酵母およびウイルスについて周知である。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製起点は、ほとんどのグラム陰性菌に適しており、２μのプラスミド起点が酵母に適しており、種々のウイルス起点が、哺乳類細胞におけるクローニングベクターにとって有用である。通常、複製起点成分は、哺乳類発現ベクター（通常、ＳＶ４０起点が使用できるが、これは初期プロモーターを含むためである）には必要ではない。
（３）選択マーカー成分
発現およびクローニングベクターは、選択マーカーとも呼ばれる、選択遺伝子を含み得る。通常の選択遺伝子は、（ａ）抗生物質およびその他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、テトラサイクリン、Ｇ４１８、ジェネティシン、ヒスチジノールまたはミコフェノール酸に対する耐性を付与する、（ｂ）栄養要求性の欠陥を補完する、（ｃ）複合培地からは利用できない重要な栄養、例えば、桿菌のＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子を供給するタンパク質をコードする。
選択スキームの一例は、宿主細胞の増殖を停止する薬物を利用する。異種遺伝子を用いる形質転換に成功した細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を産生し、したがって、選択計画を生き残る。このような優性選択には、薬物メトトレキサート、ネオマイシン、ヒスチジノール、ピューロマイシン、ミコフェノール酸およびハイグロマイシン使用する。
哺乳類細胞に適した選択マーカーの別の例として、抗体をコードする核酸を取り込む能力がある細胞の同定を可能にするもの、例えば、ＤＨＦＲ、チミジン キナーゼ、メタロチオネイン−Ｉおよび−ＩＩ、好ましくは、霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなどがある。
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換された細胞は、まず、すべての形質転換体を、メトトレキサート（Ｍｔｘ）、ＤＨＦＲの競合アンタゴニストを含む培養培地で培養することによって同定される。野生型ＤＨＦＲが用いられる場合には、適当な宿主細胞として、ＤＨＦＲ活性に欠陥のあるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株がある。
あるいは、本発明の抗体をコードするＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲタンパク質およびアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）などの別の選択マーカーを用いて形質転換された、または同時形質転換された宿主細胞（特に、内因性ＤＨＦＲを含む野生型宿主）を、選択マーカーの選択物質、例えば、アミノグリコシド系抗生物質、例えば、カナマイシン、ネオマイシンまたはＧ４１８を含有する培地での細胞増殖によって選択できる。米国特許第４，９６５，１９９参照のこと。
酵母において使用するための適した選択遺伝子として、酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子がある（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら、Ｎａｔｕｒｅ、２８２：３９頁（１９７９年））。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファンにおいて増殖する能力を欠く酵母の突然変異株、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６またはＰＥＰ４−１の選択マーカーを提供する。Ｊｏｎｅｓ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、８５：１２頁（１９７７年）。酵母宿主細胞ゲノム中のｔｒｐ１破壊の存在は、次には、トリプトファンの不在下での増殖によって形質転換を検出するのに有効な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２に欠陥のある酵母株（ＡＴＣＣ２０，６２２または３８，６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を保有する既知プラスミドによって補完される。Ｕｒａ３に欠陥のある酵母株は、ｕｒａ３遺伝子を保有するプラスミドによって補完される。
さらに、１．６μｍの環状プラスミドｐＫＤ１に由来するベクターは、クリベロマイセス属酵母の形質転換に使用できる。あるいは、組換えウシキモシンの大規模製造のための発現系がＫ．ｌａｃｔｉｓ．について報告された。Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、８：１３５頁（１９９０年）。クリベロマイセス属の工業用株による成熟組換えヒト血清アルブミンの分泌のための安定なマルチコピー発現ベクターも、開示されている。Ｆｌｅｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９：９６８〜９７５頁（１９９１年）。
（４）プロモーター成分
発現およびクローニングベクターは、通常、宿主生物によって認識され、抗体をコードする核酸と作動可能に連結しているプロモーターを含む。原核生物宿主とともに用いるのに適したプロモーターとして、アラビノース（例えば、ａｒａＢ）プロモーターｐｈｏＡプロモーター、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系およびハイブリッドプロモーター、例えば、ｔａｃプロモーターが挙げられる。しかし、その他の既知細菌プロモーターも適している。細菌系において使用するためのプロモーターはまた、本発明の抗体をコードするＤＮＡと作動可能に連結しているシャイン−ダルガノ（Ｓ．Ｄ．）配列を含む。
プロモーター配列は真核生物についても知られている。事実上すべての真核細胞遺伝子は、転写が開始される部位から約２５〜３０塩基上流に位置するＡＴリッチ領域を有する。多数の遺伝子の転写の開始から７０〜８０塩基上流に見られる別の配列として、ＣＮＣＡＡＴ領域（式中、Ｎは任意のヌクレオチドであり得る）がある。ほとんどの真核細胞遺伝子の３’末端には、コード配列の３’末端へのポリＡテールの付加のためのシグナルであり得るＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列のすべては、真核細胞発現ベクターに適切に挿入される。
酵母宿主とともに用いるための適した促進配列の例として、３−ホスホグリセレートキナーゼまたはその他の解糖酵素、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼのプロモーターが挙げられる。
増殖条件によって制御される転写のさらなる利点を有する誘導プロモーターであるその他の酵母プロモーターとして、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝と関連している分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼおよびマルトースおよびガラクトース利用に関与する酵素のプロモーター領域がある。酵母発現において使用するための適したベクターおよびプロモーターは、ＥＰ７３，６５７にさらに記載されている。酵母エンハンサーはまた、酵母プロモーターとともに有利に用いられる。
哺乳類宿主細胞におけるベクターからの抗体転写は、例えば、エイブルソン白血病ウイルス、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、最も好ましくは、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、サルウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから得られたプロモーター、異種哺乳類プロモーターから得られたプロモーター、例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターから得られたプロモーターによって制御される（ただし、このようなプロモーターは宿主細胞系と適合する）。
ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターは、好都合なことに、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含むＳＶ４０制限断片として得られる。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、好都合なことに、ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片として得られる。ベクターとしてウシパピローマウイルスを用いて哺乳類宿主においてＤＮＡを発現する系が、米国特許第４，４１９，４４６号に開示されている。この系の改変が、米国特許第４，６０１，９７８号に記載されている。単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの制御下でのマウス細胞におけるヒトβ−インターフェロンｃＤＮＡの発現については、Ｒｅｙｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ２９７：５９８〜６０１頁（１９８２年）も参照のこと。あるいは、プロモーターとして、ラウス肉腫ウイルス長い末端反復配列を使用できる。
（５）エンハンサーエレメント成分
高等真核生物による本発明の抗体をコードするＤＮＡの転写は、ベクターにエンハンサー配列を挿入することによって増大されることが多い。今では、哺乳類遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテインおよびインスリン）から、多数のエンハンサー配列が知られている。しかし、通常、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーを用いる。例として、複製起点の後側（ｂｐ１００〜２７０）のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後側のポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。真核細胞のプロモーターの活性化のためのエンハンサーエレメントに関してはＹａｎｉｖ、Ｎａｔｕｒｅ ２９７：１７〜１８頁（１９８２年）も参照のこと。エンハンサーは、抗体をコードする配列の５’または３’でベクターにスプライスされ得るが、プロモーターから５’の部位に位置することが好ましい。
（６）転写終結成分
真核細胞の宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒトまたはその他の多細胞生物由来の有核細胞）において用いられる発現ベクターはまた、転写の終結に、およびｍＲＮＡを安定化するのに必要な配列も含む。このような配列は、通常、真核生物またはウイルスＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’末端、場合により３’非翻訳領域から利用できる。これらの領域は、抗体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分においてポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。１つの有用な転写終結成分として、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域がある。ＷＯ９４／１１０２６およびその中で開示される発現ベクターを参照のこと。もう１つとして、マウス免疫グロブリン軽鎖転写ターミネーターがある。
（７）宿主細胞の選択および形質転換
本明細書においてベクターにおいてＤＮＡをクローニングまたは発現するのに適した宿主細胞として、上記の原核生物、酵母または高等真核生物細胞がある。この目的上、適した原核生物として、真正細菌、例えば、グラム陰性またはグラム陽性菌、例えば、エシェリキア属、例えば、大腸菌、エンテロバクター属、エルウィニア属、クレブシエラ属、プロテウス属、サルモネラ菌属、例えば、ネズミチフス菌、セラチア属、例えば、セラチア・マルセスカン（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）および赤痢菌属などの腸内細菌科ならびにバチルス属、例えば、枯草菌およびリケニホルミス菌（例えば、１９８９年４月１２日に公開されたＤＤ２６６，７１０に開示されるリケニホルミス菌４１ Ｐ）、シュードモナス属、例えば、緑膿菌およびストレプトマイセス属が挙げられる。１つの好ましい大腸菌クローニング宿主として、大腸菌２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）があるが、大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）および大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）などのその他の株も適している。これらの例は、制限というよりも、例示的なものである。
原核生物に加え、真核細胞の微生物、例えば、糸状菌または酵母は、抗体をコードするベクターにとって適したクローニングまたは発現宿主である。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）または一般的なパン酵母は、低級真核細胞の宿主微生物の中で最もよく用いられているものである。しかし、いくつかのその他の属、種および株、例えば、分裂酵母；クリベロマイセス属宿主、例えば、Ｋ．ラクチス（ｌａｃｔｉｓ）、Ｋ．フラギリス（ｆｒａｇｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ１２，４２４）、Ｋ．ブルガリカス（ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ１６，０４５）、Ｋ．ウィケラミー（ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ）（ＡＴＣＣ２４，１７８）、Ｋ．ワルチー（ｗａｌｔｉｉ）（ＡＴＣＣ５６，５００）、Ｋ．ドロソフィラルム（ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ３６，９０６）、Ｋ．サーモトレランス（ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）およびＫ．マルキシアナス（ｍａｒｘｉａｎｕｓ）；ヤロウイア属（ＥＰ４０２，２２６）；ピキア・パストルス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｓ）（ＥＰ１８３，０７０）；カンジダ；トリコデルマ・レーシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ）（ＥＰ２４４，２３４）；アカパンカビ；シュワニオマイセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、例えば、シュワニオマイセス・オシーデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）；および糸状菌、例えば、アカパンカビ属、アオカビ属、トリポクラジウム属およびアスペルギルス属、例えばＡ．ニデュランス（ｎｉｄｕｌａｎｓ）およびＡ．ニガー（ｎｉｇｅｒ）は、一般に入手可能であり、本明細書において有用である。
グリコシル化抗体の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物に由来する。無脊椎動物細胞の例として、植物および昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株および変異体ならびにヨトウガ（イモムシ）、ネッタイシマカ（蚊）、ヒトスジシマカ（蚊）、キイロショウジョウバエ（ショウジョウバエ）およびカイコなどの宿主由来の対応する許容昆虫宿主細胞が同定されている。トランスフェクションのための種々のウイルス株、例えば、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＮＰＶのＬ−１変異体およびカイコＮＰＶのＢｍ−５株は、公的に入手可能であり、このようなウイルスは、特に、ヨトウガ細胞のトランスフェクションのために、本発明に従って本明細書においてウイルスとして使用できる。
綿、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマト、タバコ、レムナ（ｌｅｍｎａ）およびその他の植物細胞の植物細胞培養物も、宿主として利用できる。
しかし、興味は、脊椎動物細胞において最大であり、脊椎動物細胞の培養（組織培養）における増殖は慣例の手順となっている。有用な哺乳類宿主細胞株として、チャイニーズハムスター卵巣細胞、例えば、ＣＨＯＫ１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ６１）、ＤＸＢ−１１、ＤＧ−４４およびチャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６頁（１９８０年））；ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胚腎臓株（２９３または懸濁培養での増殖のためにサブクローニングされた２９３細胞［Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９頁（１９７７年）］；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３〜２５１頁（１９８０年））；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４〜６８頁（１９８２年））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝細胞腫株（Ｈｅｐ Ｇ２）がある。
宿主細胞は、抗体製造のために上記の発現またはクローニングベクターを用いて形質転換されるか、トランスフェクトされ、プロモーターを導入し、形質転換体を選択するか、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために、必要に応じて改変された従来の栄養培地で培養される。さらに、新規ベクターおよび選択マーカーによって分離される複数コピーの転写単位を用いてトランスフェクトされた細胞株は、特に有用であり、抗体の発現にとって好ましい。
（８）宿主細胞の培養
本発明の抗体を製造するために用いられる宿主細胞は、種々の培地で培養できる。Ｈａｍ’ｓ Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、基礎培地（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）およびダルベッコの改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地は、宿主細胞を培養するのに適している。さらに、Ｈａｍら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４頁（１９７９年）、Ｂａｒｎｅｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５頁（１９８０年）、米国特許第４，７６７，７０４号；同４，６５７，８６６号；同４，９２７，７６２号；同４，５６０，６５５号；または同５，１２２，４６９号；ＷＯ９０１０３４３０；ＷＯ８７／００１９５；または米国特許再発行番号３０，９８５に記載される培地のいずれも、宿主細胞の培養培地として使用してよい。これらの培地のいずれも、必要に応じて、ホルモンおよび／またはその他の増殖因子（例えば、インスリン、トランスフェリンまたは上皮細胞増殖因子）、塩（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびホスフェート）、バッファー（例えば、ＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えば、アデノシンおよびチミジン）、抗生物質（例えば、ゲンタマイシン（商標）薬）、微量元素（通常、マクロモル範囲の最終濃度で存在する、無機化合物として定義される）およびグルコースまたは同等のエネルギー供給源を補給され得る。任意のその他の必要な栄養補助剤はまた、当業者に公知である適当な濃度で含まれ得る。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞について先に用いたものであり、当業者には明らかである。
（９）抗体の精製
組換え技術を用いる場合には、抗体は、原形質周辺空間において細胞内で産生され得るか、または、例えば、微生物培養物から培地中に直接分泌される。抗体が細胞内で産生される場合には、第１のステップとして、微粒子細片、宿主細胞または溶解した断片のいずれかを、例えば、遠心分離または限外濾過によって除去する。ＢｅｔｔｅｒらＳｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１〜１０４３頁（１９８８年）；ＩＣＳＵ Ｓｈｏｒｔ Ｒｅｐｏｒｔｓ１０：１０５頁（１９９０年）；およびＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：４５７〜４６１頁（１９９３年）には、大腸菌の原形質周辺空間に分泌される抗体を単離する手順が記載されている。（［Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３〜１６７頁（１９９２年）］も参照のこと。
微生物または哺乳類細胞から調製された抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー陽イオンまたは鳥類交換クロマトグラフィーおよびアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製できるが、アフィニティークロマトグラフィーが好ましい精製技術である。アフィニティーリガンドとしての、プロテインＡの適合性は、抗体中に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種およびアイソタイプに応じて変わる。プロテインＡを用いて、ヒトγ１、γ２またはγ４重鎖に基づく抗体を精製できる（Ｌｉｎｄｍａｒｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１〜１３頁（１９８３年））。プロテインＧは、すべてのマウスアイソタイプに対して、およびヒトγ３に対して推奨される（Ｇｕｓｓら、ＥＭＢＯ Ｊ．５：１５６７１５７５（１９８６年））。アフィニティーリガンドが結合しているマトリックスは、ほとんどの場合アガロースであるが、その他のマトリックスも利用可能である。細孔性（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ）ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定なマトリックスによって、アガロースを用いて達成され得るものよりも速い流速および短い処理時間が可能となる。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合には、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、Ｎ．Ｊ．）は、精製にとって有用である。イオン交換カラム、エタノール沈殿法、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンセファロース（商標）でのクロマトグラフィー陰イオンまたは陽イオン交換樹脂（例えば、ポリアスパラギン酸カラム）でのクロマトグラフィー、等電点電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび硫酸アンモニウム沈殿での分画などのタンパク質精製のためのその他の技術も、回収される抗体に応じて利用可能である。
キメラ抗体
単独またはコンジュゲートとしてのいずれかで、ヒトにおけるｉｎ ｖｉｖｏ投与で反復されたげっ歯類抗体は、げっ歯類抗体に対するレシピエントにおける免疫応答；いわゆるＨＡＭＡ応答（ヒト抗マウス抗体）を引き起こす。ＨＡＭＡ応答は、反復投与が必要とされる場合に医薬品の有効性を制限し得る。抗体の免疫原性は、ポリエチレングリコールなどの親水性ポリマーを用いる抗体の化学修飾によって、または抗体構造を、よりヒト様、例えば、キメラ、ヒト化、ヒトまたはＨｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）抗体にする遺伝子操作法を用いることによって低減され得る。このように操作された抗体は、親のマウスモノクローナル抗体よりもヒトにおいて免疫原性が低いので、アナフィラキシーの危険をかなり低くしてヒトの治療に用いることができる。したがって、これらの抗体は、ヒトへのｉｎ ｖｉｖｏ投与を含む治療的適応において好ましいものであり得る。
マウスモノクローナル抗体の可変Ｉｇドメインが、ヒト定常Ｉｇドメインと融合しているキメラモノクローナル抗体は、当技術分野で公知の標準手順を用いて作製できる。（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．ら（１９８４年）Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ；Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎｓ ｗｉｔｈ Ｈｕｍａｎ Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ｒｅｇｉｏｎ Ｄｏｍａｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１、６８４１〜６８５５頁；およびＢｏｕｌｉａｎｎｅ，Ｇ．Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２、６４３〜６４６頁（１９８４年）参照のこと）。例えば、ＣＥＡと結合するげっ歯類抗体の可変ドメインの遺伝子配列を、ヒト骨髄腫タンパク質の可変ドメインと置換し、このように組換えキメラ抗体を作製できる。これらの手順は、ＥＰ１９４２７６、ＥＰ０１２０６９４、ＥＰ０１２５０２３、ＥＰ０１７１４９６、ＥＰ０１７３４９４およびＷＯ８６／０１５３３に詳述されている。いくつかのキメラモノクローナル抗体が、ヒトにおいて免疫原性が低いことが証明されているが、マウス可変Ｉｇドメインは、依然、相当なヒト抗マウス反応を導き得る。
ヒト化抗体
ヒト化抗体は、例えば、（１）非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）を、ヒトフレームワークおよび定常領域へグラフトすること（当技術分野で、「ＣＤＲグラフト」によるヒト化と呼ばれる工程）、あるいは、（２）全非ヒト可変ドメインを移植するが、表面残基の置換によってヒト様表面でそれらを「覆うこと（ｃｌｏａｋｉｎｇ）」（「ベニア化」と当技術分野で呼ばれる工程）をはじめとする種々の方法によって達成できる。本発明では、ヒト化抗体は、「ヒト化」および「ベニア化」抗体の両方を含む。これらの方法は、例えば、各々、参照により本明細書に組み込まれる、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２ ５２５（１９８６年）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、Ｕ．Ｓ．Ａ．、８１：６８５１ ６８５５（１９８４年）；ＭｏｒｒｉｓｏｎおよびＯｉ、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４４：６５ ９２（１９８８年）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４ １５３６（１９８８年）；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．２８：４８９ ４９８（１９９１年）；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１（３）：１６９ ２１７（１９９４年）；およびＫｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ、Ｃ．Ａ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．４（７）：７７３ ８３（１９９１年）に開示されている。
例えば、げっ歯類抗体のＣＤＲの遺伝子配列は、単離または合成し、相同ヒト抗体遺伝子の対応する配列領域と置換し、元のげっ歯類抗体の特異性を有するヒト抗体を作製できる。これらの手順は、ＥＰ０２３９４０、ＷＯ９０／０７８６１およびＷＯ９１／０９９６７に記載されている。
ＣＤＲグラフトは、マウス重鎖および軽鎖可変Ｉｇドメイン由来の６つのＣＤＲのうち１つ以上を、ヒト可変Ｉｇドメインの適当な４つのフレームワーク領域に導入することを含み、ＣＤＲグラフトとも呼ばれる。この技術（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２、３２３頁（１９８８年））は、主に抗原と接触するＣＤＲループを支持するための足場として保存されたフレームワーク領域（ＦＲ１〜ＦＲ４）を利用する。しかし、ＣＤＲグラフトの不利点は、フレームワーク領域のアミノ酸が抗原結合に寄与し得るために、また、ＣＤＲループのアミノ酸が、２つの可変Ｉｇドメインの結合に影響を及ぼし得るために、元のマウス抗体よりも実質的に低い結合親和性を有するヒト化抗体をもたらし得るということである。ヒト化モノクローナル抗体の親和性を維持するために、ＣＤＲグラフト技術は、元のマウス抗体のフレームワーク領域と最も酷似するヒトフレームワーク領域を選択することによって、および抗原結合部位のコンピュータモデリングによって支援された、フレームワークまたはＣＤＲ内の単一のアミノ酸の位置指定突然変異誘発によって改善できる（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ら（１９９４年）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２、２９６８〜２９７６頁）。
抗体をヒト化する一方法は、ヒト重鎖および軽鎖配列に対して非ヒト重鎖および軽鎖配列をアラインすることと、ヒト化配列のコンホメーションを予測するためのこのようなアラインメント、分子モデリングに基づいて非ヒトフレームワークを選択および置換することと、親抗体のコンホメーションと比較することとを含む。この工程に、ヒト化配列モデルの予測されるコンホメーションが、親非ヒト抗体の非ヒトＣＤＲのコンホメーションと密接に近似するまで、ＣＤＲの構造を妨げるＣＤＲ領域中の残基の反復逆突然変異を続ける。このようなヒト化抗体は、例えば、Ａｓｈｗｅｌｌ受容体による取り込みおよびクリアランスを促進するよう、さらに誘導体化できる（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，５３０，１０１号および同５，５８５，０８９号参照のこと）。
いくつかの、合理的設計によるマウスモノクローナル抗体のヒト化が報告されている（例えば、２００２年７月１１日に公開された２００２００９１２４０、ＷＯ９２／１１０１８および米国特許第５，６９３，７６２号、同５，７６６，８６６号参照のこと。
Ｈｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）抗体
語句「Ｈｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）抗体」とは、非ヒト抗体、通常、マウスモノクローナル抗体由来の抗体を指す。あるいは、Ｈｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）抗体は、親の、非ヒト抗体の抗原結合特性を保持するか、実質的に保持するが、ヒトに投与された場合に、親抗体と比較して減少した免疫原性を示す、キメラ抗体に由来するものであり得る。
抗体可変ドメインのＨｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（商標）は、抗体分子の結合活性を維持しながら免疫原性を減少させる方法としてＳｔｕｄｎｉｃｋａによって記載されている［例えば、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら米国特許第５，７６６，８８６号；ＳｔｕｄｎｉｃｋａらＰｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７：８０５〜８１４頁（１９９４年）参照のこと］。この方法によれば、各可変領域アミノ酸に、置換の危険度が割り当てられている。アミノ酸置換は、３種の危険度カテゴリーのうちの１種によって区別されている：（１）低い危険度の変更とは、抗原結合を混乱させる見込みが最小で、免疫原性を減少させる最大の可能性を有するものであり；（２）中程度の危険度の変更とは、抗原結合またはタンパク質フォールディングに影響を及ぼす、より大きな見込みを有するが、さらに免疫原性を減少させるものであり；（３）高い危険度の残基とは、結合にとってまたは抗体構造の維持にとって重要であり、抗原結合またはタンパク質フォールディングが影響を受ける最高の危険を保持するものである。プロリンの三次元構造的役割のために、プロリンでの修飾は、位置が、通常、低い危険度の位置にあっても、一般に、少なくとも中程度の危険度の変更であると考えられる。
げっ歯類抗体の軽鎖および重鎖の可変領域は、以下のとおり、抗原結合またはタンパク質フォールディングのいずれかに悪影響を及ぼす可能性が少ないが、ヒト環境において免疫原性を減少させる可能性が高いと決定された位置でヒトアミノ酸を置換するＨｕｍａｎ
Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）である。「低い危険度」の位置にあり、本方法による修飾の候補であるアミノ酸残基は、げっ歯類可変領域のアミノ酸配列を、ヒト可変領域配列とアラインすることによって同定される。個々のＶＨまたはＶＬ配列またはヒトコンセンサスＶＨまたはＶＬ配列または個々のもしくはコンセンサス生殖系配列を含む、任意のヒト可変領域を使用できる。低い危険度の位置の任意の数のアミノ酸残基または低い危険度の位置のすべてのアミノ酸残基を変更できる。例えば、アラインされたマウスおよびヒトアミノ酸残基が異なる、低い危険度の位置の各々で、げっ歯類残基をヒト残基で置換するアミノ酸修飾を導入する。あるいは、低い危険度の位置のすべてのアミノ酸残基および中程度の危険度の位置の任意の数のアミノ酸残基を変更できる。理想的には、最小の免疫原性を達成するために、低および中程度の危険度の位置のすべてを、げっ歯類からヒト配列に変更する。
修飾された重鎖および／または軽鎖可変領域を含有する合成遺伝子を構築し、ヒトγ重鎖および／またはκ軽鎖定常領域と連結する。ＩｇＡ（任意のサブクラスのもの、例えば、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（任意のサブクラスのもの、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）またはＩｇＭをはじめとする、任意のヒト重鎖および軽鎖定常領域を、Ｈｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）抗体可変領域と併用できる。ヒト重鎖および軽鎖遺伝子を、哺乳類細胞などの宿主細胞に導入し、得られた組換え免疫グロブリン産物を獲得し、特性決定する。
トランスジェニック動物由来のヒト抗体
抗原を標的とするヒト抗体は、内因性免疫グロブリン産生がなく、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むよう操作されたトランスジェニック動物を用いても作製できる。例えば、ＷＯ９８／２４８９３には、内因性重鎖および軽鎖遺伝子座の不活性化のために機能的内因性免疫グロブリンを産生しない、ヒトＩｇ遺伝子座を有するトランスジェニック動物が開示されている。ＷＯ９１／１０７４１にはまた、免疫原に対する免疫応答を開始できるトランスジェニック非霊長類哺乳類宿主が開示されており、これでは、抗体は、霊長類定常領域および／または可変領域を有し、遺伝子座をコードする内因性免疫グロブリンは、置換または不活性化されている。ＷＯ９６／３０４９８には、哺乳類において免疫グロブリン遺伝子座を修飾するため、例えば、定常領域または可変領域のすべてまたは一部を置換して修飾された抗体分子を形成するためのＣｒｅ／Ｌｏｘ系の使用が開示されている。ＷＯ９４／０２６０２には、不活性化された内因性Ｉｇ遺伝子座と機能性ヒトＩｇ遺伝子座とを有する非ヒト哺乳類宿主が開示されている。米国特許第５，９３９，５９８号には、内因性重鎖を欠き、１種以上の異種定常領域を含む外因性免疫グロブリン遺伝子座を発現するトランスジェニックマウスを作製する方法が開示されている。
上記のトランスジェニック動物を用いて、選択された抗原分子に対して免疫応答を引き起こすことができ、動物から抗体産生細胞を回収し、ヒトモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作製するために用いることができる。免疫化プロトコール、アジュバントなどは、当技術分野で公知であり、ＷＯ９６／３３７３５に記載されるように、例えば、トランスジェニックマウスの免疫化に用いられる。この刊行物は、ＩＬ６、ＩＬ８、ＴＮＦａ、ヒトＣＤ４、Ｌセレクチン、ｇｐ３９および破傷風菌毒素をはじめとする種々の抗原分子に対するモノクローナル抗体を開示する。モノクローナル抗体は、対応するタンパク質の生物活性または生理学的効果を阻害または中和するその能力について試験できる。ＷＯ９６／３３７３５には、ＩＬ−８で免疫化されたトランスジェニックマウスの免疫細胞に由来するＩＬ−８に対するモノクローナル抗体が、好中球の、ＩＬ−８によって誘導される機能を妨げたことが開示されている。トランスジェニック動物を免疫化するために用いた抗原に対して特異性を有するヒトモノクローナル抗体も、ＷＯ９６／３４０９６および米国特許出願第２００３０１９４４０４号；および米国特許出願第２００３００３１６６７号に開示されている）。Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：２５５１頁（１９９３年）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３６２：２５５〜２５８頁（１９９３年）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏ．、７：３３頁（１９９３年）；および米国特許第５，５９１，６６９号、米国特許第５，５８９，３６９号、米国特許第５，５４５，８０７号；および米国特許出願第２００２０１９９２１３号、ＷＯ９６／３４０９６および米国特許出願第２００３０１９４４０４号；および米国特許出願第２００３００３１６６７号も参照のこと。
モノクローナル抗体を作製するのに有用なさらなるトランスジェニック動物として、米国特許第５，７７０，４２９号およびＦｉｓｈｗｉｌｄら（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４５〜８５１頁、１９９６年）に記載される、Ｍｅｄａｒｅｘ ＨｕＭＡｂ−ＭＯＵＳＥ（登録商標）が挙げられ、これは、ヒト抗体の重鎖および軽鎖をコードする再編成されたヒト抗体に由来する遺伝子配列を含む。ＨｕＭＡｂ−ＭＯＵＳＥ（登録商標）は、標的タンパク質に対するモノクローナル抗体を産生できる。
また、Ｉｓｈｉｄａら（Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．４：９１〜１０２頁、２００２年）は、ヒトＤＮＡのメガ塩基対の大きさのセグメントを含むＴｒａｎｓＣｈｒｏｍｏ Ｍｏｕｓｅ（ＴＣＭＯＵＳＥ（商標））を記載しており、これは全ヒト免疫グロブリン（ｈＩｇ）遺伝子座を取り込んでいる。ＴＣＭＯＵＳＥは、ＩｇＧ（ＩｇＧ１〜Ｇ４）のすべてのサブクラスを含む、ｈＩｇの十分に多様なレパートリーを有する。種々のヒト抗原を用いるＴＣマウスの免疫化は、ヒト抗体を含む抗体反応を引き起こす。
米国特許出願第２００３００９２１２５号には、所望のエピトープに対する動物の免疫応答を偏らせるための方法が記載されている。ヒト抗体はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性化Ｂ細胞によって作製してもよい（米国特許第５，５６７，６１０号および同５，２２９，２７５号参照のこと。
ファージディスプレイ技術に由来する抗体
組換えヒト抗体遺伝子のレパートリーを作製する技術の開発および糸状バクテリオファージの表面上でのコードされる抗体断片のディスプレイが、ヒト抗体を直接作製および選択するための組換え手段を提供し、これはまた、ヒト化、キメラ、ネズミまたは変異タンパク質抗体にも当てはまり得る。ファージ技術によって作製された抗体は、細菌において抗原結合断片−通常、ＦｖまたはＦａｂ断片として産生され、したがって、エフェクター機能を欠く。エフェクター機能は、１以上の戦略によって導入できる。断片は、哺乳類細胞における発現のための完全抗体に、またはエフェクター機能を誘発できる第２の結合部位を有する二重特異性抗体断片に操作できる。
通常、抗体のＦｄ断片（ＶＨ−ＣＨ１）および軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）は、ＰＣＲによって別個にクローニングし、コンビナトリアルファージディスプレイライブラリーにおいて無作為に組換えし、次いで、これを特定の抗原に対する結合について選択できる。Ｆａｂ断片は、ファージ表面上に発現される、すなわち、それらをコードする遺伝子と物理的に結合される。したがって、抗原結合によるＦａｂの選択は、Ｆａｂをコードする配列を同時に選択し、続いて、これを増殖できる。数ラウンドの抗原結合および再増幅、パニングと呼ばれる手順によって、抗原に特異的なＦａｂが濃縮され、最終的に単離される。
１９９４年には、「誘導選択（ｇｕｉｄｅｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」と呼ばれる抗体のヒト化のためのアプローチが記載された。誘導選択（ｇｕｉｄｅｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）は、マウスモノクローナル抗体のヒト化のためにファージディスプレイ技術の力を利用する。（Ｊｅｓｐｅｒｓ，Ｌ．Ｓ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２、８９９〜９０３頁（１９９４年）を参照のこと）。このために、マウスモノクローナル抗体のＦｄ断片を、ヒト軽鎖ライブラリーと組み合わせてディスプレイでき、次いで、得られたハイブリッドＦａｂライブラリーを、抗原を用いて選択できる。それによって、マウスＦｄ断片は、選択を誘導する鋳型を提供する。続いて、選択されたヒト軽鎖を、ヒトＦｄ断片ライブラリーと組み合わせる。得られたライブラリーの選択によって完全なヒトＦａｂが生じる。
ファージディスプレイライブラリーからヒト抗体を誘導するための種々の手順が記載されている（例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１頁（１９９１年）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ、２２２：５８１〜５９７頁（１９９１年）；米国特許第５，５６５，３３２号および同５，５７３，９０５号；Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．およびＷｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．、ＴＩＢＴＥＣＨ １２、１７３〜１８４頁（１９９４年）参照のこと）。特に、ファージディスプレイライブラリーから得られた抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ選択および発展は強力なツールとなった（Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．、およびＢａｒｂａｓ ＩＩＩ，Ｃ．Ｆ．、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５７、１９１〜２８０頁（１９９４年）；およびＷｉｎｔｅｒ，Ｇ．ら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２、４３３〜４５５頁（１９９４年）；米国特許出願第２００２０００４２１５号およびＷＯ９２／０１０４７；２００３年１０月９日に公開された米国特許出願第２００３０１９０３１７号および米国特許第６，０５４，２８７号；米国特許第５，８７７，２９３号参照のこと。
Ｗａｔｋｉｎｓ、「Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ Ｐｈａｇｅ−Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｂｙ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｌｉｆｔ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ １７８：１８７〜１９３頁および２００３年３月６日に公開された米国特許出願第２００１２００３００４４７７２号には、捕獲リフトによってファージによって発現された抗体ライブラリーまたはその他の結合分子をスクリーニングする方法、固体支持体上での候補結合分子の固定化を含む方法が記載されている。
抗体産物は、本明細書において「スクリーニング法」と題された項に記載されるアッセイを用いて、または当技術分野で公知の任意の適したアッセイを用いて本発明の処理方法における活性についておよび適合性についてスクリーニングできる。
アミノ酸配列変異タンパク質
本発明の抗体は、親抗体の変異タンパク質または変異体を含み、これでは、親抗体のポリペプチド配列が、変異タンパク質または変異体が所望の結合親和性または生物活性を保持するという条件で、可変領域または可変領域と同等の部分、例えば、ＣＤＲ内において、少なくとも１個のアミノ酸置換、欠失または挿入によって変更されている。変異タンパク質は、親抗体と実質的に相同または実質的に同一、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一または相同であり得る。この配列に関する同一性または相同性は、本明細書において、配列をアラインし、最大パーセント配列同一性を達成するために、必要に応じてギャップを導入した後の、保存的置換はいずれも、配列同一性の一部と考えない、親配列と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。抗体配列へのＮ末端、Ｃ末端または内部伸長、欠失または挿入のうち、配列同一性または相同性に影響を及ぼすと見なされるべきものはない。したがって、配列同一性は、２種のポリペプチドのアミノ酸の位置において類似性を比較するためによく用いられる標準法によって求めることができる。ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡなどのコンピュータプログラムを用いて、２種のポリペプチドを、それらの個々のアミノ酸の最適マッチングのために（一方または両方の配列の全長に沿って、または一方または両方の配列の予め決定した部分に沿ってのいずれかで）アラインする。これらのプログラムは、デフォルト開始ペナルティーおよびデフォルトギャップペナルティーを提供し、ＰＡＭ２５０［標準スコアリングマトリックス；Ｄａｙｈｏｆｆら、ｉｎ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、第５巻、付録３（１９７８年）参照のこと］などのスコアリングマトリックスをコンピュータプログラムとともに使用できる。例えば、次いで、同一性パーセントを、同一マッチの総数に１００を乗じ、次いで、マッチされたスパン内のより長い配列の長さと、２種の配列をアラインするためにより長い配列に導入されたギャップ数の合計で除したものとして算出できる。
本発明の抗体はまた、結合親和性に影響を及ぼさないが、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）またはクリアランスおよび取り込み（および半減期に対する得られた効果）などのエフェクター機能を変更し得る定常領域のポリペプチド配列の変更を含み得る。
挿入
アミノ酸配列挿入は、１残基〜１００個以上の残基を含むポリペプチドの長さにわたるアミノおよび／またはカルボキシル末端融合ならびに単一もしくは複数のアミノ酸残基、例えば、２、３またはそれより多くの配列内挿入を含む。末端挿入の例として、Ｎ末端メチオニル残基を含む抗体またはエピトープタグもしくはサルベージ受容体エピトープと融合している抗体（抗体断片を含む）が挙げられる。その他の抗体分子の挿入性変異タンパク質は、グリコシル化部位の付加、分子内または分子間結合のためのシステインの付加または例えば、Ｎ末端もしくはＣ末端での抗体の血清半減期を増大するポリペプチドとの融合を含む。例えば、抗体にシステイン結合（複数の結合）を付加して、その安定性を（特に、抗体がＦｖ断片などの抗体断片である場合に）改善することができる。
抗体のグリコシル化は、通常、Ｎ結合型またはＯ結合型のいずれかである。Ｎ結合型とは、アスパラギン残基の側鎖との炭水化物部分の結合を指す。トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（式中、Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸である）は、炭水化物部分の、アスパラギン側鎖との酵素的結合のための認識配列である。ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列のいずれかが存在することで、グリコシル化部位の可能性が高まる。したがって、１以上のこれらのトリペプチド配列を含むようアミノ酸配列を変更することによって、Ｎ結合型グリコシル化部位を抗体に加えることができる。Ｏ結合型グリコシル化とは、Ｎ−アセイルガラクトサミン（ａｃｅｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ）、ガラクトースまたはキシロースのうちの１種の、ヒドロキシアミノ酸、通常は、セリンまたはトレオニンとの結合を指すが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンも使用できる。Ｏ結合型グリコシル化部位は、１個以上のセリンまたはトレオニン残基を、元の抗体の配列に挿入または置換することによって抗体に加えることができる。
用語「エピトープタグを付けた」とは、エピトープタグと融合している抗体を指す。エピトープタグポリペプチドは、それに対する抗体が作製され得るエピトープを提供するのに十分な残基を有するが、抗体の活性を干渉しないよう十分に短い。エピトープタグは、それに対する抗体が、その他のエピトープと実質的に交差反応しないよう、十分に独特であることが好ましい。適したタグポリペプチドは、通常、少なくとも６個、通常、約８〜５０個の間のアミノ酸残基のアミノ酸残基（好ましくは、約９〜３０残基の間）を有する。例として、ｆｌｕ ＨＡタグポリペプチドおよびその抗体１２ＣＡ５［Ｆｉｅｌｄら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：２１５９〜２１６５頁（１９８８年）］；ｃ−ｍｙｃタグおよびそれへの８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７および９Ｅ１０抗体［Ｅｖａｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５（１２）：３６１０〜３６１６頁（１９８５年）］；ならびに単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグおよびその抗体［Ｐａｂｏｒｓｋｙら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ３（６）：５４７〜５５３頁（１９９０年）］が挙げられる。その他の例示的タグとして、ポリ−ヒスチジン配列、通常、約６個のヒスチジン残基があり、これは、ニッケルキレート化を用いてそのように標識された化合物の単離を可能にする。当技術分野でよく知られており、通常、用いられるＦＬＡＧ（登録商標）タグ（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）などのその他の標識およびタグは、本発明に包含される。
本明細書において、用語「サルベージ受容体結合エピトープ」とは、ＩｇＧ分子のｉｎ
ｖｉｖｏ血清半減期の延長に関与する、ＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープを指す。
欠失
アミノ酸配列欠失は、標的抗原に対する結合親和性を保持する断片をもたらす、１〜１００個以上の残基の長さにわたるアミノおよび／またはカルボキシル末端欠失、ならびに単一もしくは複数のアミノ酸残基、例えば、２、３またはそれより多くの配列内欠失を含む。例えば、グリコシル化部位は、トリペプチドの一部もしくはすべてまたはその他のグリコシル化の認識配列を欠失することによって、欠失または別の位置に移動され得る。
置換
もう１つの種類の変異タンパク質として、アミノ酸置換変異タンパク質がある。これらの変異タンパク質は、抗体分子中に、除去された少なくとも１個のアミノ酸残基と、その場所に挿入された異なる残基を有する。任意の超可変またはＣＤＲ領域またはフレームワーク領域内の置換的突然変異誘発が考慮される。保存的置換は、表１に示されている。最も保存的な置換は、「好ましい置換」という見出しの下に見られる。このような置換が生物活性の変化をもたらさない場合には、表１において「例示的置換」と命名された、またはアミノ酸のクラスに関連して以下にさらに記載されるような、より実質的な変化を導入し、生成物をスクリーニングできる。
Figure 2016130250
 抗体の生物学的特性における実質的な修飾は、（ａ）例えば、シートまたはらせん状コンホメーションのような、置換の領域におけるポリペプチド主鎖の構、（ｂ）標的部位での分子の電荷または疎水性または（ｃ）側鎖のかさを維持することに対するその効果が大幅に異なる置換を選択することによって達成される。天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいて群にわけることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；
（２）中性親水性の：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；
（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；
（５）鎖の配向に影響を及ぼす残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ； および
（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。
保存的置換は、アミノ酸を、そのクラスの別のメンバーと置換することを含む。非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを、別のクラスのメンバーと置換することを含む。
抗体の適切なコンホメーションの維持に関与していないシステイン残基もいずれも、分子の酸化的安定性を改善し、異常な架橋を防ぐために、通常、セリンで置換してよい。
親和性成熟は、通常、親抗体のＣＤＲ内に置換を有する抗体変異体を調製することと、スクリーニングすること、ならびに結合親和性などの生物学的特性が、親抗体と比較して改善された変異体を選択することとを含む。このような置換変異体を作製するための従来法として、ファージディスプレイを用いる親和性成熟がある。手短には、いくつかの超可変領域部位（例えば、６〜７部位）を突然変異させて、各部位で、すべてのあり得るアミノ酸置換を作製する。このように作製された抗体変異体は、各粒子内にパッケージングされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物との融合物として、糸状ファージ粒子から一価様式でディスプレイされる。次いで、ファージにディスプレイされた変異体を、その生物活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。例えば、ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９３／１１２３６６、ＷＯ９５／１５３８８およびＷＯ９３／１９１７２参照のこと。
現在の抗体親和性成熟法は、２つの突然変異誘発カテゴリー：確率的および非確率的に属する。エラープローンＰＣＲ、ミューテーター細菌株（Ｌｏｗら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６０、３５９〜６８頁、１９９６年）および飽和突然変異誘発（Ｎｉｓｈｉｍｉｙａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１２８１３〜２０頁、２０００年；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｐ．Ｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７８、２６９〜８５頁、２００２年）が、確率的突然変異誘発法の代表例である（Ｒａｊｐａｌら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１０２：８４６６〜７１頁、２００５年）。非確率的技術は、アラニン−スキャニングまたは位置指定突然変異誘発を用いて、特定の変異体の限定された収集物を作製することが多い。いくつかの方法が以下にさらに詳細に記載されている。
パニング法による親和性成熟−組換え抗体の親和性成熟は、一般に、漸減量の抗原の存在下での候補抗体の数ラウンドのパニングによって実施される。ラウンドあたり抗原の量を漸減することで、抗原に対して最大の親和性を有する抗体が選択され、出発材料の大きなプールから高親和性の抗体が得られる。パニングによる親和性成熟は、当技術分野で周知であり、例えば、ＨｕＩｓら（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５０：１６３〜７１頁、２００１年）に記載されている。ファージディスプレイ技術を用いる親和性成熟の方法は、本明細書において別の場所に記載されており、当技術分野で公知である（例えば、Ｄａｕｇｈｅｒｔｙら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９７：２０２９〜３４頁、２０００年参照のこと）。
ルック−スルーミュータジェネシス（Ｌｏｏｋ−ｔｈｒｏｕｇｈ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）−ルック−スルーミュータジェネシス（Ｌｏｏｋ−ｔｈｒｏｕｇｈ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（ＬＴＭ）（Ｒａｊｐａｌら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１０２：８４６６〜７１頁、２００５年）は、抗体−結合部位を迅速にマッピングする方法を提供する。ＬＴＭには、２０個の天然アミノ酸によって提供される主要側鎖化学を代表する９つのアミノ酸が、抗体の６つのＣＤＲすべてにおける位置毎の結合に対する機能的側鎖寄与を精査するために選択される。ＬＴＭにより、ＣＤＲ内に、各「野生型」残基が、９種の選択されたアミノ酸のうちの１種によって系統的に置換されている、単一の突然変異の位置シリーズが作製される。突然変異されたＣＤＲは、すべての変異体の定量的ディスプレイに対して禁止的になることなく、複雑度および大きさの漸増したコンビナトリアル一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）ライブラリーを作製するために組み合わされる。ポジティブ選択の後、結合が改善されたクローンを配列決定し、有益な突然変異をマッピングする。
エラープローンＰＣＲ−エラープローンＰＣＲは、異なる選択ラウンド間の核酸のランダム化を含む。ランダム化は、用いたポリメラーゼの内因性の誤り率によって低率で起こるが、転写の際に高い内因性の誤り率を有するポリメラーゼ（Ｈａｗｋｉｎｓら、Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９〜９６頁、１９９２年）を用いるエラープローンＰＣＲによって増大することができる（Ｚａｃｃｏｌｏら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８５：７７５〜７８３頁、１９９９年）。突然変異サイクルの後、抗原に対する親和性が改善されたクローンが、当技術分野で慣例の方法を用いて選択される。
ＤＮＡシャッフリング−核酸シャッフリングは、変異体ポリヌクレオチドを作製するための、より短い、またはより小さいポリヌクレオチドのｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ相同組換えのための方法である。ＤＮＡシャッフリングは、米国特許第６，６０５，４４９号、米国特許第６，４８９，１４５号、ＷＯ０２／０９２７８０およびＳｔｅｍｍｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：１０７４７〜５１頁（１９９４年）に記載されている。一般に、ＤＮＡシャッフリングは、３ステップ：ＤＮアーゼＩでの、シャッフルされる遺伝子の断片化、断片のランダムハイブリダイゼーションおよびＤＮＡポリメラーゼの存在下でのＰＣＲ（セクシャルＰＣＲ）による断片化された遺伝子の再構築または充填および従来のＰＣＲによる再構築された生成物の増幅からなる。
ＤＮＡシャッフリングは、逆鎖反応であるという点でエラー−プローンＰＣＲとは異なる。エラー−プローンＰＣＲでは、ポリメラーゼ開始部位の数および分子の数が、指数関数的に増える。対照的に、ランダムポリヌクレオチドの核酸再構築またはシャッフリングでは、開始部位の数およびランダムポリヌクレオチドの数（大きさではない）が経時的に減少する。
抗体の場合には、ＤＮＡシャッフリングによって、例えば、ＣＤＲ１のすべての、ＣＤＲ２のすべてとの、ＣＤＲ３のすべてとの遊離コンビナトリアル結合が可能となる。同一反応において、複数のファミリーの配列をシャッフルできることが考慮される。さらに、通常、シャッフリングは、相対的な順序を保存し、その結果、例えば、ＣＤＲ１はＣＤＲ２の位置には見られない。稀なシャッフラント（ｓｈｕｆｆｌａｎｔ）は、多数の最高の（例えば、最高の親和性）ＣＤＲを含み、これらの稀なシャッフラント（ｓｈｕｆｆｌａｎｔ）は、それらの優れた親和性に基づいて選択できる。
ＤＮＡシャッフリングに使用できる鋳型ポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。再組み合わせされるか、再構築される、遺伝子またはより短いもしくはより小さいポリヌクレオチドの大きさに応じて種々の長さのものであり得る。鋳型ポリヌクレオチドは、５０ｂｐ〜５０ｋｂであることが好ましい。鋳型ポリヌクレオチドは、二本鎖であるべきことが多い。
鋳型ポリヌクレオチドに対して同一性の領域および鋳型ポリヌクレオチドに対して異種性の領域を有する、一本鎖または二本鎖核酸ポリヌクレオチドを、遺伝子選択の最初のステップの間に鋳型ポリヌクレオチドに加えることができることが考慮される。また、２種の異なるが関連するポリヌクレオチド鋳型は、最初のステップの間に混合され得るということも考慮される。
アラニンスキャニング−アラニンスキャニング突然変異誘発を実施して、抗原結合に大きく寄与する超可変領域残基を同定できる。ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ、（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１〜１０８５頁、１９８９年）。残基または標的残基の群が同定され（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓおよびｇｌｕなどの電荷を有する残基）、中性または負の電荷を有するアミノ酸（最も好ましくは、アラニンまたはポリアラニン）によって置換され、アミノ酸と抗原の相互作用に影響を及ぼす。次いで、置換部位で、または置換部位に、さらなる、またはその他の変異体を導入することによって、機能的感受性を示すアミノ酸位置が正確にされる。したがって、アミノ酸配列変異体を導入する部位は予め定められるが、突然変異自体の性質は予め定められる必要はない。例えば、所与の部位での突然変異の性能を分析するために、標的コドンまたは領域でａｌａスキャニングまたはランダム突然変異誘発を実施し、発現された抗体変異タンパク質を所望の活性についてスクリーニングする。
コンピュータを使った設計−あるいは、またはさらに、抗原−抗体複合体の結晶構造を分析して、抗体と抗原の間の接触点を同定すること、またはコンピュータソフトウェアを用いて、このような接触点に倣って作ることが有益であり得る。このような接触残基および隣接する残基は、本明細書に詳しく述べられる技術による置換の候補である。ひとたび、このような変異体が作製されると、変異体のパネルを、本明細書に記載されるようなスクリーニングに付し、１以上の関連アッセイにおいて優れた特性を有する抗体を、さらなる開発のために選択できる。
親和性成熟は、親抗体のＣＤＲ内に置換を有する抗体変異タンパク質を調製することと、スクリーニングすること、ならびに結合親和性などの生物学的特性が、親抗体と比較して改善された変異タンパク質を選択することとを含む。このような置換変異タンパク質を作製するための従来法として、ファージディスプレイを用いる親和性成熟がある。手短には、いくつかの超可変領域部位（例えば、６〜７部位）を突然変異させて、各部位ですべてのあり得るアミノ酸置換を作製する。このように作製された抗体変異タンパク質は、各粒子内にパッケージングされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物との融合物として、糸状ファージ粒子から一価様式でディスプレイされる。次いで、ファージにディスプレイされた変異タンパク質を、その生物活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。
アラニンスキャニング突然変異誘発を実施して、抗原結合に大きく寄与する超可変領域残基を同定できる。あるいは、またはさらに、抗原−抗体複合体の結晶構造を分析して、抗体と抗原の間の接触点を同定することは有益であり得る。このような接触残基および隣接する残基は、本明細書に詳しく述べられる技術による置換の候補である。ひとたび、このような変異タンパク質が作製されると、変異タンパク質のパネルを、本明細書に記載されるようなスクリーニングに付し、１以上の関連アッセイにおいて優れた特性を有する抗体を、さらなる開発のために選択できる。
変更されたエフェクター機能
抗体のその他の修飾が考慮される。例えば、癌の治療における抗体の有効性を増強するよう、エフェクター機能に関して本発明の抗体を修飾することが望ましいものであり得る。例えば、Ｆｃ領域にシステイン残基（複数の残基）を導入し、それによってこの領域における鎖間ジスルフィド結合形成を可能にしてもよい。このように作製されたホモ二量体抗体は、改善された内部移行能および／または増大された媒介性細胞死滅および補体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を有し得る。Ｃａｒｏｎら、Ｊ．Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１７６：１１９１〜１１９５頁（１９９２年）およびＳｈｏｐｅｓ、Ｂ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２９１８〜２９２２頁（１９９２年）参照のこと。活性の増強されたホモ二量体抗体はまた、Ｗｏｌｆｆら、、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５３：２５６０〜２５６５頁（１９９３年）に記載されるような、ヘテロ二機能性架橋剤を用いて調製できる。あるいは、二重のＦｃ領域を有し、それによって、増強された補体溶解およびＡＤＣＣ能を有し得る抗体を設計できる。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ３：２１９〜２３０頁（１９８９年）参照のこと。さらに、ＣＤＲ内の配列は、抗体をＭＨＣクラスＩＩと結合させ、望まれていないヘルパーＴ細胞応答を誘発し得るということがわかっている。保存的置換は、抗体が、望まれていないＴ細胞応答を誘発する能力を失ってもなお結合活性を保持するのを可能にし得る。マウス可変領域がヒトγ１、γ２、γ３およびγ４定常領域と結合しているキメラ抗体を記載した、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、Ｓｔｅｐｌｅｗｓｋｉら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９８８年；８５（１３）：４８５２〜６頁も参照のこと。
本発明の特定の実施形態では、例えば、腫瘍浸透を増大するために、無傷の抗体よりもむしろ抗体断片を用いることが望ましいことであり得る。この場合には、抗体断片を、例えば、半減期を延長するために、抗体断片に、ＰＥＧまたは多糖ポリマーをはじめとするその他の水溶性ポリマーなどの分子を付加して、その血清半減期を延長するよう修飾することが望ましいことであり得る。これはまた、例えば、抗体断片にサルベージ受容体結合エピトープを（例えば、抗体断片中の適当な領域の突然変異によって、または例えば、ＤＮＡまたはペプチド合成によって、ペプチドタグにエピトープを組み込み、次いで、それが、末端または中央のいずれかで抗体断片と融合されることによって）組み込むことによって達成できる（例えば、ＷＯ９６／３２４７８参照のこと）。
サルベージ受容体結合エピトープは、Ｆｃドメインの１つまたは２つのループから、任意の１個以上のアミノ酸残基が、抗体断片の類似の位置に移されている領域を構成することが好ましい。Ｆｃドメインの１つまたは２つのループから３個以上の残基が移されていることが、いっそうより好ましい。エピトープがＦｃ領域の（例えば、ＩｇＧの）ＣＨ２ドメインからとられて、抗体のＣＨ１、ＣＨ３またはＶＨ領域、または１を超えるこのような領域に移されていることがさらにより好ましい。あるいは、エピトープは、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインからとられ、抗体断片のＣＬ領域またはＶＬ領域または両方に移される。Ｆｃ変異体およびサルベージ受容体とのそれらの相互作用を記載する国際出願ＷＯ９７／３４６３１およびＷＯ９６／３２４７８も参照のこと。
したがって、本発明の抗体は、ヒトＦｃ部分、ヒトコンセンサスＦｃ部分またはＦｃサルベージ受容体と相互作用する能力を保持するその変異タンパク質、例えば、ジスルフィド結合に含まれるシステインが修飾または除去されている、かつ／またはＮ末端にｍｅｔが付加されており、Ｎ末端の２０個のアミノ酸のうち１個以上が除去されている、かつ／または補体と相互作用する領域、例えば、Ｃ１ｑ結合部位が除去されている、かつ／またはＡＤＣＣ部位が除去されている変異タンパク質を含み得る［Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（５）：６３３〜９頁（１９９２年）参照のこと］。ＩｇＧクラスの抗体はまた、異なる定常領域を含み得る。例えば、ＩｇＧ２抗体は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４定常領域をディスプレイするよう修飾され得る。
ＩｇＧ１の場合には、定常領域、特に、ヒンジまたはＣＨ２領域への修飾は、エフェクター機能、例えば、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性を増大または低減し得る。その他の実施形態では、ＩｇＧ２定常領域は、抗体−抗原凝集体形成を低減するよう修飾される。ＩｇＧ４の場合には、定常領域、特に、ヒンジ領域への修飾は、半抗体の形成を誘導し得る。特定の例示的実施形態では、ＩｇＧ４ヒンジ配列Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓを、ＩｇＧ１ヒンジ配列Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓに突然変異することが提供される。
これまでの研究によって、ＦｃＲのヒトおよびマウスＩｇＧ上の結合部位は、主に、ＩｇＧ残基２３３〜２３９からなる下部ヒンジ領域にマッピングされた。その他の研究は、さらなる広いセグメント、例えば、ヒトＦｃ受容体ＩのＧｌｙ３１６〜Ｌｙｓ３３８、ヒトＦｃ受容体ＩＩＩのＬｙｓ２７４〜Ａｒｇ３０１およびＴｙｒ４０７〜Ａｒｇ４１６を提案し、またはマウスＦｃ受容体ＩＩと相互作用する下部ヒンジの外側の数個の特定の残基、例えば、マウスＩｇＧ２ｂのＡｓｎ２９７およびＧｌｕ３１８見い出した。ヒトＦｃ受容体ＩＩＩＡを含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃ断片の３．２Å結晶構造の報告には、Ｆｃ受容体ＩＩＩＡとの結合に関与する、ＩｇＧ１残基Ｌｅｕ２３４〜Ｓｅｒ２３９、Ａｓｐ２６５〜Ｇｌｕ２６９、Ａｓｎ２９７〜Ｔｈｒ２９９およびＡｌａ３２７〜Ｉｌｅ３３２が描かれていた。結晶構造に基づいて、下部ヒンジ（Ｌｅｕ２３４〜Ｇｌｙ２３７）に加え、ＩｇＧ ＣＨ２ドメインループＦＧ中の残基（残基３２６〜３３０）およびＢＣ中の残基（残基２６５〜２７１）も、Ｆｃ受容体ＩＩＡとの結合において役割を果たす可能性があるということが示唆されている。参照によりその全文が組み込まれる、Ｓｈｉｅｌｄｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７６（９）：６５９１〜６６０４頁（２００１年）参照のこと。Ｆｃ受容体結合部位内の残基の突然変異は、エフェクター機能の変更、ＡＤＣＣもしくはＣＤＣ活性の変更または半減期の変更をもたらし得る。上記のように、可能性ある突然変異として、１個以上の残基の挿入、欠失または置換、例えば、アラニンでの置換、保存的置換、非保存的置換または異なるＩｇＧサブクラスに由来する同一位置の対応するアミノ酸残基での置換（例えば、ＩｇＧ１残基を、その位置で対応するＩｇＧ２残基で置換）が挙げられる。
Ｓｈｉｅｌｄｓらは、すべてのヒトＦｃ受容体との結合に関与するＩｇＧ１残基は、ヒンジの近位にあるＣＨ２ドメイン中に位置し、以下の２つのカテゴリー：１）すべてのＦｃＲと直接相互作用し得、Ｌｅｕ２３４〜Ｐｒｏ２３８、Ａｌａ３２７およびＰｒｏ３２９（およびおそらくはＡｓｐ２６５）を含む位置；２）炭水化物性に影響を及ぼす位置、Ａｓｐ２６５およびＡｓｎ２９７を含む位置に入ると報告した。Ｆｃ受容体ＩＩとの結合に影響を及ぼしたさらなるＩｇＧ１残基は、以下のとおりである：（最大の効果）Ａｒｇ２５５、Ｔｈｒ２５６、Ｇｌｕ２５８、Ｓｅｒ２６７、Ａｓｐ２７０、Ｇｌｕ２７２、Ａｓｐ２８０、Ａｒｇ２９２、Ｓｅｒ２９８および（弱い効果）Ｈｉｓ２６８、Ａｓｎ２７６、Ｈｉｓ２８５、Ａｓｎ２８６、Ｌｙｓ２９０、Ｇｌｎ２９５、Ａｒｇ３０１、Ｔｈｒ３０７、Ｌｅｕ３０９、Ａｓｎ３１５、Ｌｙｓ３２２、Ｌｙｓ３２６、Ｐｒｏ３３１、Ｓｅｒ３３７、Ａｌａ３３９、Ａｌａ３７８およびＬｙｓ４１４。Ａ３２７Ｑ、Ａ３２７Ｓ、Ｐ３２９Ａ、Ｄ２６５ＡおよびＤ２７０Ａは、結合を低減させた。すべてのＦｃＲについて、上記で同定された残基に加え、Ｆｃ受容体ＩＩＩＡとの結合を４０％以上低減させたさらなるＩｇＧ１残基は、以下のとおりである：Ｓｅｒ２３９、Ｓｅｒ２６７（Ｇｌｙのみ）、Ｈｉｓ２６８、Ｇｌｕ２９３、Ｇｌｎ２９５、Ｔｙｒ２９６、Ａｒｇ３０１、Ｖａｌ３０３、Ｌｙｓ３３８およびＡｓｐ３７６。ＦｃＲＩＩＩＡとの結合を改善した変異タンパク質として、Ｔ２５６Ａ、Ｋ２９０Ａ、Ｓ２９８Ａ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４ＡおよびＡ３３９Ｔが挙げられる。Ｌｙｓ４１４は、ＦｃＲＩＩＡおよびＦｃＲＩＩＢに対する結合において４０％の低減、Ａｒｇ４１６は、ＦｃＲＩＩＡおよびＦｃＲＩＩＩＡに対して３０％の低減、Ｇｌｎ４１９は、ＦｃＲＩＩＡに対して３０％の低減およびＦｃＲＩＩＢに対して４０％の低減、ならびにＬｙｓ３６０は、ＦｃＲＩＩＩＡに対して２３％の改善を示した。Ｐｒｅｓｔａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．（２００１年）３０、４８７〜４９０頁も参照のこと。
例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，１９４，５５１号には、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域中、アミノ酸位置３２９、３３１または３２２（Ｋａｂａｔ番号付けを用いて）に突然変異を含有する、エフェクター機能が変更された変異タンパク質が記載されており、そのうちいくつかはＣ１ｑ結合またはＣＤＣ活性の低減を示している。別の例として、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，７３７，０５６号には、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域中、アミノ酸位置
Figure 2016130250
 （Ｋａｂａｔ番号付けを用いて）に突然変異を含有する、エフェクターまたはＦｃ−γ−受容体結合が変更された変異タンパク質が記載されており、そのうちいくつかは、ＡＤＣＣまたはＣＤＣ活性の低減と関連している受容体結合プロフィールを示している。これらのうち、アミノ酸位置２３８、２６５、２６９、２７０、３２７または３２９での突然変異は、ＦｃＲＩとの結合を低減すると記載されており、アミノ酸位置
Figure 2016130250
 での突然変異は、ＦｃＲＩＩとの結合を低減すると記載されており、アミノ酸位置
Figure 2016130250
 での突然変異は、ＦｃＲＩＩＩとの結合を低減すると記載されている。
参照によりその全文が本明細書に組み込まれる米国特許第５，６２４，８２１号は、マウス抗体のＣ１ｑ結合活性は、重鎖のアミノ酸残基３１８、３２０または３２２を突然変異することによって変更できることおよび残基２９７（Ａｓｎ）を置換することは、溶解活性の除去をもたらすことを報告している。
参照によりその全文が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００４０１３２１０１号には、アミノ酸位置
Figure 2016130250
 （Ｋａｂａｔ番号付けを用いて）に突然変異を含む変異タンパク質が記載されており、そのうち、位置
Figure 2016130250
 での突然変異は、ＡＤＣＣ活性を低減し、Ｆｃγ受容体との結合を低減し得る。
参照によりその全文が本明細書に組み込まれるＣｈａｐｐｅｌら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９１年；８８（２０）：９０３６〜４０頁には、ＩｇＧ１の細胞親和性活性は、その重鎖ＣＨ２ドメインの内因性の特性であると報告されている。ＩｇＧ１のアミノ酸残基２３４〜２３７のいずれかでの単一点突然変異は、その活性を大幅に低下させるか、または無効にした。全結合活性を回復させるには、ＩｇＧ１残基２３４〜２３７（ＬＬＧＧ）すべてのＩｇＧ２およびＩｇＧ４への置換が必要とされた。全ＥＬＬＧＧＰ配列（残基２３３〜２３８）を含むＩｇＧ２抗体は、野生型ＩｇＧ１よりも活性であることが観察された。
参照によりその全文が本明細書に組み込まれるＩｓａａｃｓら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８；１６１（８）：３８６２〜９頁には、ＦｃγＲ結合にとって重要なモチーフ内の突然変異（グルタミン酸２３３のプロリンへ、ロイシン／フェニルアラニン２３４の バリンへ、およびロイシン２３５のアラニンへ）が、標的細胞の枯渇を完全に妨げたと報告されている。グルタミン酸３１８のアラニンへの突然変異は、マウスＩｇＧ２ｂのエフェクター機能を排除し、また、ヒトＩｇＧ４の効力も低減させた。
参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、Ａｒｍｏｕｒら、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３；４０（９）：５８５〜９３頁では、活性化受容体ＦｃγＲＩＩａと、野生型ＩｇＧ１よりも少なくとも１０倍効率悪く反応するが、抑制性受容体、ＦｃγＲＩＩｂとのその結合は４倍低減されているだけである、ＩｇＧ１変異タンパク質が同定された。突然変異は、アミノ酸２３３〜２３６の領域で、および／またはアミノ酸位置３２７、３３０および３３１で行われた。参照によりその全文が本明細書に組み込まれるＷＯ９９／５８５７２も参照。
参照によりその全文が本明細書に組み込まれるＸｕら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９４；２６９（５）：３４６９〜７４頁には、ＩｇＧ１ Ｐｒｏ３３１をＳｅｒに突然変異させることによって、Ｃ１ｑ結合が著しく低下し、溶解活性が実質的に排除されたと報告されている。対照的に、ＩｇＧ４におけるＳｅｒ３３１のＰｒｏの置換は、ＩｇＧ４ Ｐｒｏ３３１変異タンパク質に部分溶解活性（４０％）を与えた。
参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、Ｓｃｈｕｕｒｍａｎら、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１；３８（１）：１〜８頁には、重鎖間結合形成に関与しているヒンジシステインの１個、Ｃｙｓ２２６をセリンに突然変異させることによって、より安定な重鎖間結合が得られたと報告されている。ＩｇＧ４ヒンジ配列Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓを、ＩｇＧ１ヒンジ配列Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓに突然変異させることも、重鎖間の共有結合性相互作用を著しく安定化させる。
参照によりその全文が本明細書に組み込まれるＡｎｇａｌら、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９３；３０（１）：１０５〜８頁には、ＩｇＧ４中、アミノ酸位置２４１のセリンをプロリン（ＩｇＧ１およびＩｇＧ２においてその位置で見られる）に突然変異させることによって均一な抗体の製造ならびに血清半減期の延長および元のキメラＩｇＧ４と比較して組織分布の改善がもたらされたと報告されている。
本発明はまた、炭水化物構造が変更され、その結果、エフェクター活性が変更され抗体分子、例えば、ＡＤＣＣ活性の改善を示す、フコシル化が異常な、またはフシコル化が減少した抗体分子の製造も考慮する。これを達成するための、種々の方法が当技術分野で公知である。例えば、ＡＤＣＣエフェクター活性は、抗体分子の、ＦｃγＲＩＩＩ受容体との結合によって媒介され、これはＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７でのＮ結合型グリコシル化の炭水化物構造に応じて変わることがわかっている。非フコシル化抗体は、この受容体と増大した親和性で結合し、ＦｃγＲＩＩＩ媒介性エフェクター機能を、天然のフコシル化抗体よりも効率的に誘発する。例えば、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ酵素がノックアウトされているＣＨＯ細胞における非フコシル化抗体の組換え製造は、１００倍増大されたＡＤＣＣ活性を有する抗体をもたらす［Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．２００４年９月５日；８７（５）：６１４〜２２頁］。同様の効果は、例えば、ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡ処理によって、フコシル化経路においてこの酵素またはその他の酵素の活性を低下させること、酵素（複数の酵素）をノックアウトする細胞株を設計すること、または選択的グリコシル化阻害剤とともに培養することによって達成できる［Ｒｏｔｈｍａｎら、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８９年１２月；２６（１２）：１１１３〜２３頁］。いくつかの宿主細胞株、例えば、Ｌｅｃｌ３またはラットハイブリドーマＹＢ２／０細胞株は、天然に、フコシル化レベルの低い抗体を産生する。Ｓｈｉｅｌｄｓら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００２年７月２６日；２７７（３０）：２６７３３〜４０頁；Ｓｈｉｎｋａｗａら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００３年１月３１日；２７８（５）：３４６６〜７３頁。例えば、ＧｎＴＩＩＩ酵素を過剰発現する細胞における抗体の組換え製造による二分された炭水化物レベルの増大もまた、ＡＤＣＣ活性を増大すると決定されている。Ｕｍａｎａら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９９年２月；１７（２）：１７６〜８０頁。２個のフコース残基のうち１個のみがないことがＡＤＣＣ活性を増大させるのに十分であり得ると予測されている。Ｆｅｒｒａｒａら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００５年１２月５日；［印刷に先行してＥｐｕｂ］。
その他の共有結合性修飾
抗体の共有結合性修飾もまた本発明の範囲内に含まれる。それらは、必要に応じて、化学合成によって行ってもよく、または抗体の酵素的もしくは化学的切断によって行ってもよい。その他の種類の抗体の共有結合性修飾は、標的とされる抗体のアミノ酸残基を、選択された側鎖またはＮもしくはＣ末端残基と反応できる有機誘導体化剤と反応させることによって分子に導入される。
システイニル残基は、通常、α−ハロアセテート（および対応するアミン）、例えば、クロロ酢酸またはクロロアセトアミドと反応して、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を生じる。システイニル残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロメルクリベンゾエート、２−クロロメルクリ−４−ニトロフェノールまたはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応によって誘導体化される。
ヒスチジル残基は、ｐＨ５．５〜７．０でジエチルピロカルボネートとの反応によって誘導体化されるが、これは、この薬剤が、ヒスチジル側鎖に比較的特異的であるためである。パラ−ブロモフェナシルブロミドも有用である；この反応は、０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中、ｐＨ６．０で実施されることが好ましい。
リシニル残基およびアミノ末端残基を、コハク酸またはその他の無水カルボン酸と反応させる。これらの薬剤を用いる誘導体化は、リシニル残基の変更を逆転させる効果を有する。α−アミノ含有残基を誘導体化するのに適したその他の試薬として、イミドエステル、例えば、メチルピコリンイミデート、ピリドキサルホスフェート、ピリドキサル、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソウレア、２，４−ペンタンジオンおよびトランスアミナーゼによって触媒されるグリオキシレートとの反応が挙げられる。
アルギニル残基は、１種または数種の従来試薬、中でも、フェニルグリオキサル、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオンおよびニンヒドリンとの反応によって修飾される。アルギニン残基の誘導体化には、グアニジン官能基の高ｐＫａのために、反応がアルカリ条件下で実施されることが必要である。さらに、これらの試薬は、リシンの基ならびにアルギニンε−アミノ基と反応させてもよい。
チロシル残基の特異的修飾は、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によるチロシル残基へのスペクトル標識の導入に特に注目して行うことができる。通常、Ｎ−アセチルイミジゾールおよびテトラニトロメタンを用いて、それぞれ、Ｏ−アセチルチロシル種および３−ニトロ誘導体を形成する。チロシル残基を、１２５Ｉまたは１３１Ｉを用いてヨード化し、ラジオイムノアッセイに用いるための標識されたタンパク質を調製する。
カルボキシル側基（アスパルチルまたはグルタミル）は、カルボジイミドとの反応によって選択的に修飾され（Ｒ−Ｎ．ｄｂｄ．Ｃ．ｄｂｄ．Ｎ−Ｒ’）、式中、ＲおよびＲ’は、異なるアルキル基、例えば、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドである。さらに、アスパルチルおよびグルタミル残基を、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニルおよびグルタミニル残基に変換する。
グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、それぞれ、対応するグルタミルおよびアスパルチル残基に脱アミド化されることが多い。これらの残基は、中性または塩基性条件下で脱アミド化される。これらの残基の脱アミド化型は、本発明の範囲内に入る。
その他の修飾として、プロリンおよびリシンの水酸化、セリルのヒドロキシル基またはトレオニル残基のリン酸、リシン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化が挙げられる（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、７９〜８６頁（１９８３年））、Ｎ−末端アミンのアセチル化および任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。
共有結合性修飾のもう１つの種類は、グリコシドを抗体と化学的または酵素的カップリングすることを含む。これらの手順は、ＮまたはＯ結合型グリコシル化のグリコシル化能を有する宿主細胞における抗体の産生を必要としないという点で有利である。用いるカップリング様式に応じて、糖（複数の糖）を（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）遊離スルフヒドリル基、例えば、システインのもの（ｄ）遊離ヒドロキシル基、例えば、セリン、トレオニンまたはヒドロキシプロリンのもの、（ｅ）芳香族残基、例えば、フェニルアラニン、チロシンもしくはトリプトファンのものまたは（ｆ）グルタミンのアミド基と結合できる。これらの方法は、１９８７年９月１１に公開されたＷＯ８７／０５３３０に、ならびにＡｐｌｉｎおよびＷｒｉｓｔｏｎ、ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２５９〜３０６頁（１９８１年）に記載されている。
抗体上に存在する任意の炭水化物部分の除去は、化学的に達成してもよいし、または酵素的に達成してもよい。化学的脱グリコシル化には、化合物トリフルオロメタンスルホン酸または同等の化合物に対する抗体の曝露が必要である。この処理は、連結している糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）を除くほとんどまたはすべての糖の切断をもたらすが、抗体は無傷で残す。化学的脱グリコシル化は、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２頁（１９８７年）によって、およびＥｄｇｅらＡｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１１８：１３１頁（１９８１）によって記載されている。抗体上の炭水化物部分の酵素的切断は、ＴｈｏｔａｋｕｒａらＭｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０頁（１９８７年）に記載されるように、種々のエンド−およびエキソ−グリコシダーゼの使用によって達成できる。
抗体の共有結合性修飾のもう１つの種類は、抗体を種々の非タンパク質性ポリマーの１種、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリオキシエチル化ソルビトール、ポリオキシエチル化グルコース、ポリオキシエチル化グリセロール、ポリオキシアルキレンまたはデキストランなどの多糖ポリマーと連結することを含む。このような方法は、当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第４，６４０，８３５号；同４，４９６，６８９号；同４，３０１，１４４号；同４，６７０，４１７号；同４，７９１，１９２号、同４，１７９，３３７号、同４，７６６，１０６号、同４，１７９，３３７号、同４，４９５，２８５号、同４，６０９，５４６号またはＥＰ３１５４５６参照のこと。
各抗体分子は１以上（すなわち、１、２、３、４、５以上）のポリマー分子と結合できる。ポリマー分子は、リンカー分子によって抗体と結合することが好ましい。ポリマーは、通常、合成または天然に存在するポリマー、例えば、場合により置換されていてもよい直鎖または分岐鎖ポリアルケン、ポリアルケニレンまたはポリオキシアルキレンポリマーまたは分岐もしくは非分岐多糖、例えば、ホモ−もしくはヘテロ−多糖であり得る。好ましいポリマーとして、ポリオキシエチレンポリオールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）がある。ＰＥＧは、室温で水溶性であり、一般式：Ｒ（Ｏ−−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎＯ-−Ｒ（式中、Ｒは水素またはアルキルまたはアルカノール基などの保護基であり得る
）を有する。保護基は、１〜８個の間の炭素を有することが好ましく、メチルであることがより好ましい。記号ｎは、好ましくは、１〜１，０００の間、より好ましくは、２〜５００の間の正の整数である。ＰＥＧは、１０００〜４０，０００の間の、好ましい平均分子量を有し、より好ましくは、２０００〜２０，０００の間、最も好ましくは、３，０００〜１２，０００の間である。ＰＥＧは、少なくとも１個のヒドロキシ基を有することが好ましく、末端ヒドロキシ基であることがより好ましい。活性化され、阻害剤上の遊離アミノ基と反応するのが好ましいのは、このヒドロキシ基である。しかし、共有結合によってコンジュゲートされた本発明のＰＥＧ／抗体を達成するためには、反応基の種類および量は変わり得るということは理解される。それらをペプチドと結合するのに好ましいポリマーおよび方法は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、米国特許第４，７６６、１０６号；同４，１７９、３３７号；同４，４９５、２８５号；および同４，６０９、５４６号に示されている。
遺伝子療法
治療用抗体の、適当な細胞への送達は、当技術分野で公知の任意の適したアプローチの使用によって、例えば、物理的ＤＮＡ導入法（例えば、リポソームまたは化学処理）によって、またはウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスまたはレトロウイルス）の使用によって、遺伝子療法を介して、ｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｓｉｔｕまたはｉｎ ｖｉｖｏで達成できる。例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ治療には、所望の抗体をコードする核酸を、単独またはベクター、リポソームまたは沈殿物とともにのいずれかで、被験体に直接注射してもよく、いくつかの実施形態では、抗体化合物の発現が望まれる部位に注射してもよい。ｅｘ ｖｉｖｏ治療には、被験体の細胞を摘出し、これらの細胞に核酸を導入し、修飾された細胞を被験体に直接戻すか、または、例えば、多孔質膜内にカプセル化し、これを患者に移植する。例えば、米国特許第４，８９２，５３８号および同５，２８３，１８７号参照のこと。核酸を生存細胞に導入するために利用可能な種々の技術がある。これらの技術は、核酸がｉｎ ｖｉｔｒｏで培養細胞に導入されるか、またはｉｎ ｖｉｖｏで意図される宿主の細胞に導入されるかどうかに応じて変わる。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの哺乳類細胞への核酸の導入に適した技術として、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストランおよびリン酸カルシウム沈殿の使用が挙げられる。核酸のｅｘ ｖｉｖｏ送達のためによく用いられるベクターとして、レトロウイルスがある。
その他のｉｎ ｖｉｖｏ核酸導入技術として、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ型またはアデノ随伴ウイルス）を用いるトランスフェクションおよび脂質ベースの系が挙げられる。核酸およびトランスフェクション剤は、微粒子と場合により結合していてもよい。例示的トランスフェクション剤として、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、第四級アンモニウム両親媒性物質ＤＯＴＭＡ（（ジオレオイルオキシプロピル）トリメチルアンモニウムブロミド、ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬによってリポフェクチンとして市販されている））（Ｆｅｌｇｎｅｒら、（１９８７年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４、７４１３〜７４１７頁；Ｍａｌｏｎｅら（１９８９年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６ ６０７７〜６０８１頁）；ペンダントトリメチルアンモニウムヘッドを有する親油性グルタミン酸ジエステル（Ｉｔｏら（１９９０年）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １０２３、１２４〜１３２頁）；カチオン性脂質ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ）およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミルスペルミン（ＤＰＰＥＳ）などの代謝可能親脂質（Ｊ．Ｐ．Ｂｅｈｒ（１９８６年）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２７、５８６１〜５８６４頁；Ｊ．Ｐ．Ｂｅｈｒら（１９８９年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６、６９８２〜６９８６頁）；代謝可能な第四級アンモニウム塩（ＤＯＴＢ、Ｎ−（１−［２，３−ジオレオイルオキシ］プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルスルフェート（ＤＯＴＡＰ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ジオレオイルエステル、ＣｈｏＴＢ、ＣｈｏＳＣ、ＤＯＳＣ）（Ｌｅｖｅｎｔｉｓら（１９９０年）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｉｎｔｅｒ．２２、２３５〜２４１頁）；１対１混合物で、３β［Ｎ−（Ｎ’、Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）／３β［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロールＤＣ−Ｃｈｏｌ（Ｇａｏら、（１９９１年）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１０６５、８〜１４頁）、スペルミン、スペルミジン、リポポリアミン（Ｂｅｈｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ、１９９４、５：３８２〜３８９頁）、親油性ポリリシン（ＬＰＬＬ）（Ｚｈｏｕら、（１９９１年）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ９３９、８〜１８頁）、過剰のホスファチジルコリン／コレステロールとともの［［（１，１，３，３−テトラメチルブチル）クレ−ソキシ］エトキシ］エチル］ジメチルベンジル水酸化アンモニウム（ＤＥＢＤＡヒドロキシド）（Ｂａｌｌａｓら、（１９８８年）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ９３９、８〜１８頁）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）／ＤＯＰＥ混合物（Ｐｉｎｎａｄｕｗａｇｅら、（１９８９年）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ９８５、３３〜３７頁）、ホスファチジルエタノールアミンとの混合物中、ＤＯＰＥ、ＣＴＡＢ、ＤＥＢＤＡ、ジドデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）およびステアリルアミンとのグルタミン酸の親油性ジエステル（ＴＭＡＧ）（Ｒｏｓｅら、（１９９１年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ １０、５２０〜５２５頁）、ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ（ＴｒａｎｓｆｅｃｔＡＣＥ、ＢＲＬ）およびオリゴガラクトース保有脂質が挙げられる。導入の効率を高める例示的トランスフェクションエンハンサー剤として、例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリブレン、リソソーム破壊性（ｌｙｓｏｓｏｍｅ−ｄｉｓｒｕｐｔｉｖｅ）ペプチド（Ｏｈｍｏｒｉ Ｎ Ｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ Ｊｕｎ．２７、１９９７年；２３５（３）：７２６〜９頁）、コンドロイタン（ｃｈｏｎｄｒｏｉｔａｎ）ベースのプロテオグリカン、硫酸プロテオグリカン、ポリエチルイミン、ポリリジン（Ｐｏｌｌａｒｄ Ｈら Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、１９９８年２７３（１３）：７５０７〜１１頁）、インテグリン結合ペプチドＣＹＧＧＲＧＤＴＰ、直鎖デキストランノナサッカライド、グリセロール、オリゴヌクレオチドの３’−末端ヌクレオシド間結合で結合されているコレステリル基（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ．１９８９年Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６：（１７）：６５５３〜６頁）、リソホスファチド、リソホスファチジルコリン、リソホスファチジルエタノールアミンおよび１−オレオイルリソホスファチジルコリンが挙げられる。
いくつかの状況では、核酸を含有するベクターを標的細胞へ向ける薬剤を用いて核酸を送達することが望ましいことであり得る。このような「ターゲッティング」分子として、標的細胞に対する細胞表面膜タンパク質に特異的な抗体、または標的細胞上の受容体のリガンドが挙げられる。リポソームが用いられる場合には、ターゲッティングに、および／または取り込みを促進するために、エンドサイトーシスと関係している細胞表面膜タンパク質と結合するタンパク質質を用いることができる。このようなタンパク質の例として、特定の細胞種に向性のキャプシッドタンパク質およびその断片、循環においてインターナリゼーションを受けるタンパク質に対する抗体、および細胞内局在を標的とし、細胞内半減期を増大するタンパク質が挙げられる。その他の実施形態では、受容体媒介性エンドサイトーシスを使用できる。このような方法は、例えば、Ｗｕら、１９８７年またはＷａｇｎｅｒら、１９９０年に記載されている。現在知られている遺伝子マーキングおよび遺伝子療法プロトコールの概説については、Ａｎｄｅｒｓｏｎ １９９２年参照のこと。ＷＯ９３／２５６７３およびそれに引用される参照文献も参照のこと。遺伝子療法技術のさらなる概説については、Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１２７５〜１２８１頁（１９８９年）；Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ、第３９２巻の付録、６６７９号、２５〜３０頁（１９９８年）；Ｖｅｒｍａ、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ：６８〜８４頁（１９９０年）；およびＭｉｌｌｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ、３５７：４５５４６０頁（１９９２年）参照のこと。
スクリーニング法
本発明のもう１つの態様は、ＰＲＬＲを抗体と接触させることと、抗体がＰＲＬＲの活性を修飾するかどうかを調べることを含む、ＰＲＬＲの活性を調節する（すなわち、低減する）抗体を同定する方法を対象とする。試験抗体の存在下での活性を、試験抗体の不在下での活性に対して比較する。試験抗体を含有するサンプルの活性が、試験抗体を欠くサンプルにおける活性よりも低い場合に、抗体は阻害された活性を有する。有効な治療薬は、大きな毒性のない効果的な薬剤を同定することによって決まる。抗体は、当技術分野で公知の方法によって結合親和性についてスクリーニングできる。例えば、ゲル−シフトアッセイ、ウェスタンブロット、放射性標識競合アッセイ、クロマトグラフィーによる同時分画、共沈殿、架橋、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標））、時間分解蛍光測定（例えば、ＤＥＬＦＩＡ）などを使用でき、これらは、例えば、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９年）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００７年）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆
Ｓｏｎｓ、ＮＹに記載されている。さらに、表面プラズモン共鳴（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標））を用いて、２種の抗体間の競合を評価できる（例えば、以下の実施例７参照のこと）。また、時間分解蛍光測定（例えば、ＤＥＬＦＩＡ）を用いて、２種の抗体間の競合のレベルを評価できる。例えば、マイクロプレートに基づく競合スクリーニングＤＥＬＦＩＡ（登録商標）アッセイ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を、製造業者によって提供されるプロトコールに従って実施できる。
標的抗原上の所望のエピトープと結合する抗体を最初にスクリーニングするために、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＨａｒｌｏｗおよびＤａｖｉｄ Ｌａｎｅ編（１９８８）に記載されるものなどの通常の架橋アッセイを実施できる。未知の抗体が、標的の、本発明の標的特異的抗体との結合を阻害するその能力によって特性決定される、通常の競合結合実験も使用できる。無傷の抗原、その断片、例えば、細胞外ドメインまたは線形エピトープを使用できる。エピトープマッピングは、Ｃｈａｍｐｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３８８〜１３９４頁（１９９５年）に記載されている。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ 結合アッセイの１つの変法では、本発明は、（ａ）固定化されたＰＲＬＲを、候補抗体と接触させるステップと、（ｂ）候補抗体の、ＰＲＬＲとの結合を検出するステップとを含む方法を提供する。一代替実施形態では、候補抗体を固定化し、ＰＲＬＲの結合を検出する。固定化は、当技術分野で周知の方法、例えば、支持体、ビーズまたはクロマトグラフィー樹脂との共有結合形成、ならびに抗体結合形成などの非共有結合高親和性相互作用またはストレプトアビジン／ビオチン結合の使用（これでは、固定化される化合物はビオチン部分を含む）のいずれかを用いて達成される。結合の検出は、（ｉ）固定化されていない化合物上の放射性標識を用いて、（ｉｉ）固定化されていない化合物上の蛍光標識を用いて、（ｉｉｉ）固定化されていない化合物に対して免疫特異的な抗体を用いて、（ｉｖ）固定化された化合物が結合している蛍光支持体を励起する固定化されていない化合物上の標識ならびに当技術分野で周知であり、通常実施されるその他の技術を用いて達成できる。
標的抗原の調節（すなわち、増大、低減または遮断）する抗体は、候補抗体を、標的抗原（または標的抗原を発現する細胞）とともにインキュベートすることと、候補抗体の、標的抗原の活性または発現に対する効果を調べることとによって同定できる。試験抗体の存在下での活性を、試験抗体の不在下での活性に対して比較する。試験抗体を含有するサンプルの活性が、試験抗体を欠くサンプルにおける活性よりも低い場合に、抗体は阻害された活性を有する。標的抗原ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの活性を調節する抗体の選択性は、標的抗原に対するその効果を、その他の関連化合物に対するその効果に対して比較することによって評価できる。
特定の例示的実施形態では、抗体が、ＳＴＡＴ５および／またはＭＡＰＫおよび／またはＡＫＴリン酸化を誘導すること、またはＰＲＬＲシグナル伝達のその他の指標において、ＰＲＬＲ二量体化を妨げるその能力および／またはＰＲＬＲを中和するその能力を調べるための培養細胞系におけるその効果について試験されることが考慮される。さらに、本明細書に記載される、増殖アッセイ、軟寒天アッセイおよび／または細胞傷害性アッセイをはじめとする細胞アッセイを用いて、個々のＰＲＬＲ抗体を評価できる。
個々の抗体または抗体の組み合わせの生物活性は、適した動物モデルを用いてｉｎ ｖｉｖｏで評価できる。例えば、ＳＣＩＤマウスなどの免疫低下動物に、ヒト癌細胞が導入されている異種間癌モデルを使用できる。有効性は、腫瘍形成の阻害、腫瘍退縮または転移などを測定するアッセイを用いて予測できる。
本発明はまた、標的抗原の生物活性と相互作用するか、阻害する（すなわち、酵素活性、結合活性、細胞内シグナル伝達などを阻害する）抗体を同定するためのハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）アッセイも包含する。ＨＴＳアッセイによって、効率的な多数の化合物のスクリーニングが可能となる。標的抗原とその結合パートナー間の相互作用を調べるための細胞ベースのＨＴＳ系が考慮される。ＨＴＳアッセイは、所望の特性を改善するよう設計され得る修飾に由来する、所望の特性を有する「ヒット」または「リード化合物」を同定するよう設計される。
本発明のもう１つの実施形態では、標的抗原ポリペプチドに対して適した結合親和性を有する、ＣＤＲ内に、１、２、３またはそれより多いアミノ酸の修飾を含む、抗体断片またはＣＤＲのハイスループットスクリーニングが用いられる。
併用療法
動物モデルにおいて有効である、１種を超える抗体が同定されると、２種以上のこのような抗体（同一または異なる標的高原と結合する）を一緒に混合して、さらに改善された有効性を提供することがさらに有利であり得る。１種以上の抗体を含む組成物を、癌を患う、または癌にかかりやすくなったヒトまたは哺乳類に投与できる。２種の治療薬の同時投与には、薬剤がその治療効果を発揮している間の時間に重複がある限り、薬剤が同時にまたは同一の経路によって投与されることは必要ではない。異なる日または週での投与のように、同時または逐次投与が考慮される。
抗体治療は、すべてのステージの癌に有用であり得るが、抗体治療は、進行癌または転移癌において特に適当であり得る。抗体治療法を、化学療法薬または放射線投与計画と組み合わせることは、化学療法薬治療を受けていない患者において好ましいことであり得るが、抗体治療での治療は、１種以上の化学療法を受けている患者に適応され得る。さらに、抗体治療はまた、特に、化学療法薬の毒性にあまり耐容性を示さない患者における、併用化学療法の減少された投与量の使用を可能にし得る。
本発明の方法は、単一の抗体ならびに組み合わせまたは種々の抗体の「カクテル」の投与を考慮する。このような抗体カクテルは、異なるエフェクター機構を用いる抗体を含む、または細胞傷害性抗体と免疫エフェクター機能に頼る抗体を直接組み合わせるので、特定の利点を有し得る。組み合わせた、このような抗体は、相乗治療効果を示し得る。例として、本発明の方法は、Ｍ−ＣＳＦ、ＲＡＮＫＬに対する抗体、タキソテール（商標）、ヘルセプチン（商標）、アバスチン（商標）、アービタックス（商標）または抗ＥＧＦＲ抗体およびタモキシフェンを投与することを考慮する。
細胞傷害性薬とは、細胞の機能を阻害する、または妨げる、かつ／または細胞の破壊を引き起こす物質を指す。この用語は、放射性同位元素（例えば、Ｉ１３１、１１２５、Ｙ９０およびＲｅ１８６）、化学療法薬および細菌、真菌、植物または動物起源の酵素的に活性な毒素または合成毒素またはその断片を含むものとする。非細胞傷害性薬とは、細胞の機能を阻害しない、または妨げない、かつ／または細胞の破壊を引き起こさない物質を指す。非細胞傷害性薬は、細胞傷害性であるよう活性化されうる薬剤を含み得る。非細胞傷害性薬は、ビーズ、リポソーム、マトリックスまたは粒子を含み得る（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許公報第２００３／００２８０７１号および同２００３／００３２９９５号参照のこと）。このような薬剤は、本発明の抗体とコンジュゲート、カップリング、連結または結合させてもよい。
癌化学療法薬としては、それだけには限らないが、アルキル化剤、例えば、カルボプラチンおよびシスプラチン；ナイトロジェンマスタードアルキル化剤；ニトロソ尿素アルキル化剤、例えば、カルムスチン（ＢＣＮＵ）；代謝拮抗物質、例えば、メトトレキサート；フォリン酸；プリン類似体代謝拮抗物質、メルカプトプリン；ピリミジン類似体代謝拮抗物質、例えば、フルオロウラシル（５−ＦＵ）およびゲムシタビン（ジェムザール（登録商標））；抗腫瘍性ホルモン薬、例えば、ゴセレリン、ロイプロリドおよびタモキシフェン；天然抗悪性腫瘍薬、例えば、アルデスロイキン、インターロイキン−２、ドセタキセル、エトポシド（ＶＰ−１６）、インターフェロンα、パクリタキセル（タキソール（登録商標））およびトレチノイン（ＡＴＲＡ）；抗生物質天然抗悪性腫瘍薬、例えば、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ダウノマイシンおよびマイトマイシンＣをはじめとするマイトマイシン；およびビンカアルカロイド天然抗悪性腫瘍薬、例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン；ヒドロキシ尿素；アセグラトン、アドリアマイシン、イフォスファミド、エノシタビン、エピチオスタノール、アクラルビシン、アンシタビン、ニムスチン、塩酸プロカルバジン、カルボコン、カルボプラチン、カルモフール、クロモマイシンＡ３、抗腫瘍性多糖、抗腫瘍性血小板因子、シクロホスファミド（サイトキシン（登録商標））、シゾフィラン、シタラビン（シトシンアラビノシド）、ダカルバジン、チオイノシン、チオテパ、テガフール、ドラスタチン、ドラスタチン類似体、例えば、オーリスタチン、ＣＰＴ−Ｉｌ（イリノテカン）、ミトザントロン（ｍｉｔｏｚａｎｔｒｏｎｅ）、ビノレルビン、テニポシド、アミノプテリン、カルミノマイシン、エスペラミシン（例えば、米国特許第４，６７５，１８７号参照のこと）、ネオカルチノスタチン、ＯＫ−４３２、ブレオマイシン、フルツロン、ブロクスウリジン、ブスルファン、ホンバン、ペプロマイシン、ベスタチン（ウベニメクス（登録商標））、インターフェロン−β、メピチオスタン、ミトブロニトール、メルファラン、ラミニンペプチド、レンチナン、カワラタケ（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）抽出物、テガフール／ウラシル、エストラムスチン（エストロゲン／メクロレタミン）が挙げられる。
さらに、癌患者のための治療として用いられるさらなる薬剤として、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ガンシクロビル；抗生物質、ロイプロリド；メペリジン；ジドブジン（ＡＺＴ）；突然変異体および類似体を含むインターロイキン１〜１８；インターフェロンまたはサイトカイン、例えば、インターフェロンα、βおよびγホルモン、例えば、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）および類似体、ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）；増殖因子、例えば、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、成長ホルモン放出因子（ＧＨＲＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子相同因子（ＦＧＦＨＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）およびインスリン増殖因子（ＩＧＦ）；腫瘍壊死因子−α＆β（ＴＮＦ−α＆β）；浸潤阻害因子−２（ＩＩＦ−２）；骨形成タンパク質１〜７（ＢＭＰ１〜７）；ソマトスタチン；チモシン−α−１；γ−グロブリン；スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）；ＥＧＦＲ（上皮細胞増殖因子受容体）アンタゴニスト、例えば、セツキシマブおよびゲフィチニブなど；ＰＲ（プロゲステロン受容体）アンタゴニストおよびモジュレーター、例えば、ミフェプリストンおよびオナプリストン（商標）；アロマトアーゼ（ａｒｏｍａｔｏａｓｅ）阻害剤、例えば、アナストロゾール、エキセメスタンおよびレトロゾールなど；抗エストロゲン剤、エストロゲン受容体アンタゴニストおよびモジュレーター、例えば、タモキシフェン、トレミフェンおよびフルベストラントなど；補体因子；抗血管形成因子；抗原性物質；およびプロドラッグが挙げられる。
プロドラッグとは、親薬物と比較して、腫瘍細胞に対して細胞傷害性の低いまたは非細胞傷害性であり、活性なまたはより活性な親の形へ酵素的に活性化され得る、または変換され得る製薬上活性な物質に由来する前駆体または誘導体を指す。例えば、Ｗｉｌｍａｎ、「Ｐｒｏｄｒｕｇｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ」 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ、１４、３７５〜３８２頁、６１５ｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ Ｂｅｌｆａｓｔ（１９８６年）およびＳｔｅｌｌａら、「Ｐｒｏｄｒｕｇｓ：Ａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ｔａｒｇｅｔｅｄ
Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、Ｂｏｒｃｈａｒｄｔら（編）、２４７〜２６７頁、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（１９８５）参照のこと。プロドラッグとして、それだけには限らないが、より活性な細胞傷害性遊離薬物へ変換できる、ホスフェート含有プロドラッグ、チオホスフェート含有プロドラッグ、硫酸塩含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ−アミノ酸修飾プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、β−ラクタム含有プロドラッグ、場合により置換されていてもよいフェノキシアセトアミド含有プロドラッグまたは場合により置換されていてもよいフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、５−フルオロシトシンおよびその他の５−フルオロウリジンプロドラッグが挙げられる。本明細書において使用するための、プロドラッグの形に誘導体化できる細胞傷害性薬の例として、それだけには限らないが、前記の化学療法薬が挙げられる。
投与および調製
本発明の抗体は、所望の送達法に適した担体を含む薬剤組成物に製剤できる。適した担体として、抗体と組み合わせた場合に、抗体の所望の活性を保持し、被験体の免疫系と非反応性である任意の物質が挙げられる。例として、それだけには限らないが、任意のいくつかの標準的な薬剤担体、例えば、滅菌リン酸緩衝生理食塩水溶液、静菌水などが挙げられる。種々の水性担体、例えば、水、緩衝水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシンなどを使用でき、安定性の増強のために、穏やかな化学修飾などに付された、アルブミン、リポタンパク質、グロブリンなどといったその他のタンパク質を含み得る。
抗体の治療用製剤は、貯蔵のために、所望の程度の純度を有する抗体を、任意の生理学上許容される担体、賦形剤または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０年））と混合することによって、凍結乾燥製剤または水溶液の形に調製される。許容される担体、賦形剤または安定剤は、用いられる投与量および濃度でレシピエントにとって非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩およびその他の有機酸などのバッファー；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸およびメチオニン；保存料（例えば、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；ヘキサメトニウムクロリド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリシン；単糖、二糖およびその他の炭水化物、例えば、グルコース、マンノースまたはデキストリン；キレート薬、例えば、ＥＤＴＡ；糖類、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；および／または非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。
本明細書において製剤は、治療される特定の適応症のために必要に応じて、１種を越える活性化合物、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない補完的な活性を有するものを含み得る。このような分子は、意図される目的にとって有効な量の組み合わせで適切に存在する。
活性成分はまた、例えば、コロイド薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子およびナノカプセル）において、またはマクロエマルションにおいて、コアセルベーション技術によって、または界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタシレート（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセルに封入され得る。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０）に開示されている。
ｉｎ ｖｉｖｏ投与に用いられる製剤は、無菌でなくてはならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過によって容易に達成される。
抗体は、非経口、皮下、腹腔内、肺内および鼻腔内投与、および必要に応じて、局所治療用に、病巣内投与をはじめとする、任意の適した手段によって投与される。非経口注入は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮内または皮下投与を含む。さらに、抗体は、特に、抗体の用量を低下させながら、パルス注入によって適宜投与される。好ましくは、投薬は注射によって行われることが好ましく、静脈内または皮下注射が最も好ましい。局所（ｔｏｐｉｃａｌ）、特に、経皮、経粘膜、直腸、経口または局所（ｌｏｃａｌ）投与、例えば、所望の部位に近接して置かれたカテーテルによるをはじめとするその他の投与法が考慮される。
鼻腔投与には、薬剤製剤および医薬は、適当な溶媒（複数の溶媒）と、場合により、その他の化合物、例えば、それだけには限らないが、安定化剤、抗菌剤、抗酸化剤、ｐＨ変更因子、界面活性剤、バイオアベイラビリティ変更因子およびこれらの組み合わせとを含有するスプレーまたはエアゾールであり得る。エアゾール製剤の噴射剤は、圧縮空気、窒素、二酸化炭素または炭化水素ベースの低沸点溶媒を含み得る。
注射用投与形は、通常、適した分散剤または湿潤剤および懸濁剤を用いて調製できる水性懸濁液または油性懸濁液を含む。注射用形態は、溶媒または希釈剤を用いて調製される液相で、または懸濁液の形であり得る。許容される溶媒またはビヒクルとして、滅菌水、リンガー溶液または等張生理食塩水溶液が挙げられる。
注射には、薬剤製剤および／または医薬は、上記の適当な溶液で再構成するのに適した粉末であり得る。これらの例として、それだけには限らないが、凍結乾燥、回転乾燥または噴霧乾燥された粉末、非晶質粉末、顆粒、沈殿物または微粒子が挙げられる。注射には、製剤は、安定化剤、ｐＨ変更因子、界面活性剤、バイオアベイラビリティ変更因子およびこれらの組み合わせを場合により含んでもよい。
徐放製剤を調製できる。徐放製剤の適した例として、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、これらのマトリックスは、造形品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形である。徐放マトリックスの例として、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸およびｙエチル−Ｌ−グルタメートの共重合体、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸共重合体、例えば、リュープロンデポー（Ｌｕｐｒｏｎ Ｄｅｐｏｔ）（商標）（乳酸−グリコール酸共重合体および酢酸ロイプロリドからなる注射用ミクロスフェア）およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸などのポリマーによって、１００日間にわたる分子の放出が可能となるが、特定のヒドロゲルは、よりミ次官期間の間タンパク質を放出する。カプセル化された抗体は、身体において長期間残存する場合に、３７℃で湿度に対する曝露の結果として変性または凝集し、その結果、生物活性の喪失および免疫原性の可能性ある変更をもたらす場合がある。安定化のための合理的な戦略は、関与する機構に応じて考案できる。例えば、凝集機構が、チオ−ジスルフィド交換による分子内Ｓ−−Ｓ結合形成であると見い出されている場合には、安定化は、スルフヒドリル残基を修飾すること、酸性溶液から凍結乾燥すること、水分含量を制御すること、適当な添加物を用いることおよび特定のポリマーマトリックス組成物を開発することによって達成され得る。当技術分野で公知のその他の戦略を使用できる。
本発明の製剤は、本明細書に記載される、短時間作用型、迅速放出製、長時間作用型または徐放性であるよう設計できる。したがって、薬剤製剤はまた、制御放出のために、または持続放出（ｓｌｏｗ ｒｅｌｅａｓｅ）のために製剤できる。
本組成物はまた、例えば、ミセルまたはリポソームまたはいくつかのその他のカプセル化された形を含むことができ、持続放出（ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ）型で投与して、貯蔵および／または送達効果の延長を提供できる。したがって、薬剤製剤および医薬は、ペレットまたはシリンダーに圧縮でき、デポー注射として、またはステントなどのインプラントとして筋肉内にまたは皮下に移植できる。このようなインプラントは、既知不活性材料、例えば、シリコンおよび生分解性ポリマーを用いることができる。
上記の代表的な投与形のほかに、製薬上許容される賦形剤および担体は、通常、当業者に知られており、したがって、本発明に含まれる。このような賦形剤および担体は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ（１９９１）に記載されている。
特定の投与形は、疾患の状態、被験体の年齢、体重、一般的健康状態、遺伝子型、性別および食事、投与間隔、投与経路、排泄速度および薬物の組み合わせに応じて調整できる。有効量を含有する上記の投与形はいずれも、十分に通常の実験の範囲内であり、したがって、十分に本発明の範囲内である。
本発明の抗体は、その他の天然に存在する免疫グロブリンまたはその他の生体分子を実質的に含まずに調製されることが多い。好ましい抗体はまた、癌に苦しむ、または癌を患う傾向のある哺乳類に投与された場合に、最小の毒性しか示さない。
本発明の組成物は、従来の、周知の滅菌技術によって滅菌できる。得られた溶液は、使用するためにパッケージングしてもよいし、無菌状態下で濾過し、凍結乾燥し、凍結乾燥した製品を、滅菌溶液と組み合わせ、その後、投与する。本組成物は、生理学的条件を近づけるために必要とされる製薬上許容される補助物質、例えば、ｐＨ調整剤および緩衝剤、張性調整剤など、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリイウム、塩化カルシウムおよび安定剤（例えば、１２０％マルトースなど）を含み得る。
本発明の抗体はまた、種々の種類の脂質および／またはリン脂質および／または界面活性剤からなる小さな小胞であり、薬物（例えば、本明細書に開示される抗体および場合により、化学療法薬）の送達に有用であるリポソームを介して投与できる。リポソームは、エマルション、泡、ミセル、不溶性単層、リン脂質分散物、ラメラ層などを含み、抗体を特定の組織にターゲッティングするための、ならびに、組成物の半減期を延長するためのビヒクルとして働き得る。リポソームを調製するには、例えば、参照に医より本明細書に組み込まれる、米国特許第４，８３７，０２８号および同５，０１９，３６９号に記載される種々の方法が利用可能である。
抗体を含有するリポソームは、Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：３６８８頁（１９８５年）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４０３０頁（１９８０年）；および米国特許第４，４８５，０４５号および同４，５４４，５４５号に記載されるなどの当技術分野で公知の方法によって調製される。循環時間の増大されたリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いる逆相蒸発法によって作製できる。リポソームは、所望の径を有するリポソームが生成するよう規定の細孔径のフィルターを通して押し出される。本発明の抗体のＦａｂ’断片は、Ｍａｒｔｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：２８６〜２８８頁（１９８２年）に記載されるように、ジスルフィド交換反応によってリポソームとコンジュゲートできる。化学療法薬（例えば、ドキソルビシン）は、リポソーム内に場合により含まれてもよい［例えば、Ｇａｂｉｚｏｎら、Ｊ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８１（１９）：１４８４頁（１９８９年）］。
これらの組成物中の抗体の濃度は、大きく、すなわち、重量で約１０％未満、通常、少なくとも約２５％から７５％または９０％にまで異なる場合があり、選択された個々の投与様式に従って、主に液量、粘度などによって選択される。実際の、経口的に、局所的におよび非経口的に投与可能な組成物を調製する方法は、当業者には公知であるか明らかであり、例えば、参照によって本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１９版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ（１９９５年）に詳細に記載されている。
患者において疾患を治療するための本発明の組成物の有効量の決定は、当技術分野で周知である標準的な経験的方法によって達成できる。
本発明の組成物は、乳癌、前立腺癌または肺癌にすでに患っている、または傾向がある、またはその危険にある哺乳類に、疾患の進行を防ぐまたは、少なくとも部分的に停止するのに十分な量で投与される。これを達成するのに適当な量は、「治療上有効な用量」と定義される。有効な量の抗体は変化し、疾患の重篤度および治療されている患者の体重および全身状態に応じて変わるが、通常、約１．０μｇ／体重１ｋｇ〜約１００ｍｇ／体重１ｋｇの範囲である。例示的用量は、適用あたり、約１０μｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇまたは約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇまたは約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。抗体はまた、体表面積によって投薬され得る（例えば、最大４．５ｇ／平方メートル）。抗体のその他の例示的用量として、単回投与において最大総計８ｇが挙げられる（８０ｋｇの体重または１．８平方メートルの体表面積を仮定して）。
投与は、当技術分野で公知の任意の手段によってであり得る。例えば、抗体は、１以上の分離されたボーラス投与によって、例えば、５、１０、１５、３０、６０、９０、１２０分またはそれ以上の期間をかけた短期間または長期間注入によって投与してもよい。最初の治療期間の後、患者の応答および治療の耐容性に応じて、維持用量を、患者の応答を維持するのに必要とされるよう、例えば、毎週、隔週で、３週間毎に、４週間毎に、毎月、隔月で、３ヶ月毎に、または６ヶ月毎に投与すればよい。疾患症状の所望の抑制が生じるまでに、より頻繁な投与量が必要である場合もあり、投与量は必要に応じて調整すればよい。この治療の進行は、従来技術およびアッセイによって容易にモニターされる。この治療は、規定の期間の間である場合もあるし、疾患進行または死亡まで数年の期間にわたる、慢性的なものおよび連続である場合もある。
組成物の単回または複数回投与は、治療医師によって選択される用量レベルおよびパターンで実施できる。疾患の予防または治療には、抗体の適当な投与量は、上記で定義される、治療される疾患の種類、疾患の重篤度および経過、抗体が予防目的または治療目的のために投与されるかどうか、これまでの治療、患者の病歴および抗体に対する応答、主治医の裁量に応じて変わる。抗体は、１回または一連の治療にわたって患者に適切に投与される。
いずれにしても、製剤は、所望の生物活性を発揮する、例えば、癌の重篤度を防ぐまたは最小化するのに十分である一定量の治療用抗体を経時的に提供するはずである。本発明の組成物はまた、このような疾患の治療のために、単独で、または補助療法としての、当技術分野で公知のその他の治療薬とともに投与されてもよい。
抗体組成物は、良好な医療行為と合致した様式で、製剤、投薬および投与される。これに関連して考慮する因子として、治療される特定の傷害、治療される特定の哺乳類、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与形欠くおよび医師に公知であるその他の因子が挙げられる。投与されるべき抗体の治療上有効な量は、このような考慮によって支配されており、標的によって媒介される疾患、障害の状態を予防、寛解または治療するために必要な最小量である。このような量は、宿主にとって毒性である、または宿主を感染に対して大きく、より感受性にする量よりも少ないことが好ましい。
抗体は、そうでなくともよいが、場合により、問題の障害を予防または治療するために現在用いられている１種以上の薬剤とともに製剤される。このようなその他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗体の量、疾患の種類、状態または障害または治療および上記で論じられたその他の因子に応じて変わる。これらは、通常、同一投与形で、本明細書において先に用いられた投与経路または従来用いられた投与形の約１〜９９％で用いられる。
本発明のもう１つの実施形態では、所望の状態の治療に有用な物質を含有する製品が提供される。本製品は、容器および表示を含む。適した容器として、例えば、ビン、バイアル、シリンジおよび試験管が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなど、種々の材料から形成されてよい。容器は、状態を治療するのに有効である組成物を保持し、無菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射用ニードルによって穴を開けることができる栓を有する静脈用溶液バッグまたはバイアルであり得る）。組成物中の活性薬剤は、本発明の抗体である。容器上の表示または容器に付随する表示は、組成物が、選択された状態を治療するために用いられることを示す。本製品は、第２の治療薬（例えば、本明細書において論じられる、または当技術分野で公知の疾患のための任意の第２の治療薬）を含有する第２の容器をさらに含み得る。本製品は、凍結乾燥された抗体製剤を再構成するための、製薬上許容されるバッファー、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液またはデキストロース溶液を含有する別の容器をさらに含み得る。商業上およびユーザーの見地から望ましいその他の物質、例えば、その他のバッファー、希釈剤、フィルター、ニードル、シリンジおよび使用のための指示を含む添付文書をさらに含み得る。
免疫療法
癌を有する患者を治療するのに有用な抗体として、腫瘍に対して強力な免疫応答を開始できるものおよび細胞傷害性を指示できるものが挙げられる。細胞傷害性薬剤とコンジュゲートしている抗体を用いて、細胞傷害性薬剤を、ＰＲＬＲを発現する腫瘍組織にターゲッティングできる。あるいは、抗体は、補体媒介性または抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）機構のいずれかによって腫瘍細胞溶解を誘発することができ、それらの両方とも、エフェクター細胞Ｆｃ受容体部位または補体タンパク質との相互作用に免疫グロブリン分子の無傷のＦｃ部分を必要とする。さらに、腫瘍増殖に対して直接的な生物学的効果を発揮する抗体は、本発明の実施において有用である。このような直接的な細胞傷害性抗体が作用し得る可能性ある機構として、細胞増殖の阻害、細胞分化の調節、腫瘍血管形成因子プロフィールの調節およびアポトーシスの誘導が挙げられる。特定の抗体が抗腫瘍作用を発揮する機構は、ＡＤＣＣ、ＡＤＭＭＣ、補体媒介性細胞溶解などを調べるよう設計され、全般的に、当技術分野で公知の、任意の数のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを用いて評価することができる。
一実施形態では、免疫療法は、ＰＲＬＲと結合し、ＰＲＬＲの活性化を阻害する抗体を用いて実施される。
抗ＰＲＬＲ抗体は、その「裸の」またはコンジュゲートしていない形で投与してもよく、その他の治療薬もしくは診断薬と直接コンジュゲートしていてもよく、またはこのような治療薬もしくは診断薬を含む担体ポリマーと間接的にコンジュゲートしていてもよい。
抗体は、放射性同位体、親和性標識（例えば、ビオチン、アビジンなど）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）蛍光または発光または生物発光標識（例えば、ＦＩＴＣまたはローダミンなど）、常磁性原子などの使用によって検出可能なように標識できる。このような標識を達成するための手順は、当技術分野で周知であり、例えば、（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ，Ｌ．Ａ．ら、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．１８：３１５頁（１９７０年）；Ｂａｙｅｒ，Ｅ．Ａ．ら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．６２：３０８頁（１９７９年）；Ｅｎｇｖａｌ，Ｅ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０９：１２９頁（１９７２年）；Ｇｏｄｉｎｇ，Ｊ．Ｗ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１３：２１５頁（１９７６年））参照のこと。
抗体部分のコンジュゲーションは、米国特許第６，３０６，３９３号に記載されている。一般技術はまた、Ｓｈｉｈら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４１：８３２〜８３９頁（１９８８年）；Ｓｈｉｈら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４６：１１０１〜１１０６頁（１９９０年）；およびＳｈｉｈら、米国特許第５，０５７，３１３号に記載されている。この一般法は、酸化された炭水化物部分を有する抗体成分を、少なくとも１個の遊離アミン官能基を有し、複数の薬物、毒素、キレート剤、ホウ素付加物（ａｄｄｅｎｄ）またはその他の治療薬を保持している担体ポリマーと反応させることを含む。この反応は、最初のシッフ塩基（イミン）結合をもたらし、これは、第二級アミンに還元して最終コンジュゲートを形成することによって安定化できる。
担体ポリマーは、例えば、少なくとも５０個のアミノ酸残基のアミノデキストランまたはポリペプチドであり得る。薬物またはその他の薬剤を担体ポリマーとコンジュゲートする種々の技術が、当技術分野で公知である。ポリペプチド担体を、アミノデキストランの代わりに使用できるが、ポリペプチド担体は、鎖中に少なくとも５０個のアミノ酸残基、好ましくは、１００〜５０００個のアミノ酸残基を有さなくてはならない。少なくともいくつかのアミノ酸は、リシン残基またはグルタミン酸またはアスパラギン酸残基でなくてはならない。リシン残基のペンダントアミンおよびグルタミンおよびアスパラギン酸のペンダントカルボキシレートは、薬物、毒素、免疫調節薬、キレート剤、ホウ素含有物（ａｄｄｅｎｄ）またはその他の治療薬を結合するのに好都合である。適したポリペプチド担体の例として、得られた負荷された担体およびコンジュゲートに望ましい溶解特性を与える、ポリリジン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、それらの共重合体およびこれらのアミノ酸とその他のもの、例えば、セリンの混合ポリマーが挙げられる。
あるいは、コンジュゲートしている抗体は、抗体成分を治療薬と直接コンジュゲートすることによって調製できる。一般手順は、治療薬が酸化された抗体成分と直接結合していることを除いて、コンジュゲーションの間接法と類似している。例えば、抗体の炭水化物部分を、半減期を延長するためにポリエチレングリコールと結合させることができる。
あるいは、治療薬を、ジスルフィド結合形成を介して、またはヘテロ二官能性架橋剤、例えば、Ｎ−スクシニル３−（２−ピリジルジチオ）プロプリオネート（ＳＰＤＰ）を用いて、還元された抗体成分のヒンジ領域に結合できる。Ｙｕら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ５６：２４４頁（１９９４年）。このようなコンジュゲーションのための一般技術は、当技術分野で周知であり、例えば、Ｗｏｎｇ、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９９１年）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｂｉｒｃｈら（編）、１８７〜２３０頁（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．１９９５年）中、Ｕｐｅｓｌａｃｉｓら、「Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ」； Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、Ｅｎｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ、Ｒｉｔｔｅｒら（編）、６０〜８４頁（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９５年）中、Ｐｒｉｃｅ、「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ａｎｔｉｂｏｅｉｅｓ」参照のこと。Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミデートＨＣＬ）、活性エステル（例えば、ジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド（例えば、グルタルエルデヒド（ｇｌｕｔａｒｅｌｄｅｈｙｄｅ））、ビス−アジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トリエン（ｔｏｌｙｅｎｅ）２，６−ジイソシアネート）およびビス−活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）など、種々の二官能性タンパク質カップリング剤が当技術分野で公知である。
最後に、１種以上の抗−ＰＲＬＲ抗体部分と、別のポリペプチドとを含む融合タンパク質は構築できる。抗体融合タンパク質を作製する方法は、当技術分野で周知である。例えば、米国特許第６，３０６，３９３号参照のこと。インターロイキン−２部分を含む抗体融合タンパク質は、Ｂｏｌｅｔｉら、Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．６：９４５（１９９５）、Ｎｉｃｏｌｅｔら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：１６１頁（１９９５年）、Ｂｅｃｋｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：７８２６頁（１９９６年）、Ｈａｎｋら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２：１９５１頁（１９９６年）およびＨｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：４９９８頁（１９９６年）によって記載されている。
一実施形態では、本発明の抗体は、放射線増感剤として用いられる。このような実施形態では、抗体は、放射線増感剤とコンジュゲートされている。本明細書において、用語「放射線増感剤」とは、電磁放射に対して放射線感作される細胞の感受性を増大するために、かつ／または電磁放射を用いて治療可能である疾患の治療を促進するために、治療上有効な量で動物に投与される分子、好ましくは、低分子量分子と定義される。電磁放射を用いて治療可能である疾患として、新生物性疾患、良性および悪性腫瘍ならびに癌性細胞が挙げられる。
本明細書において、用語「電磁放射」および「放射」として、それだけには限らないが、１０−２０〜１０００メートルの波長を有する放射が挙げられる。本発明の好ましい実施形態は、以下の電磁放射を用いる：γ放射（１０−２０〜１０−１３ｍ）、Ｘ線放射（１０−１２〜１０−９ｍ）、紫外光（１０ｎｍ〜４００ｎｍ）、可視光（４００ｎｍ〜７００ｎｍ）、赤外線放射（７００ｎｍ〜１．０ｍｍ）およびマイクロ波放射（１ｍｍ〜３０ｃｍ）。
放射線増感剤は、電磁放射の毒性作用に対する癌性細胞の感受性を増大することがわかっている。多数の癌治療プロトコールは、現在、Ｘ線の電磁放射によって活性化された放射線増感剤を用いている。Ｘ線によって活性化された放射線増感剤の例として、それだけには限らないが、以下が挙げられる：メトロニダゾール、ミソニダゾール、デスメチルミソニダゾール、ピモニダゾール、エタニダゾール、ニモラゾール、マイトマイシンＣ、ＲＳＵ１０６９、ＳＲ４２３３、ＥＯ９、ＲＢ６１４５、ニコチンアミド、５−ブロモデオキシウイリジン（ＢＵｄＲ）、５−ヨードデオキシウリジン（ＩＵｄＲ）、ブロモデオキシシチジン、フルオロデオキシウリジン（ＦＵｄＲ）、ヒドロキシ尿素、シスプラチンならびにこれらの治療上有効な類似体および誘導体。
癌の光線力学療法（ＰＤＴ）は、増感剤の放射線アクチベーターとして可視光を用いる。光線力学的放射線増感剤の例として、それだけには限らないが以下が挙げられる：ヘマトポルフィリン誘導体、フォトフリン（ｒ）、ベンゾポルフィリン誘導体、ＮＰｅ６、スズエチオポルフィリン（ＳｎＥＴ２）、フェオボルビド（ｐｈｅｏｂｏｒｂｉｄｅ）−ａ、バクテリオクロロフィル−ａ、ナフタロシアニン、フタロシアニン、亜鉛フタロシアニンおよびこれらの治療上有効な類似体および誘導体。
もう１つの実施形態では、抗体は、抗体−受容体コンジュゲートが患者に投与され、続いて、除去剤を用いて結合していないコンジュゲートが循環から除去され、次いで、細胞傷害性薬剤（例えば、放射性核種）とコンジュゲートしているリガンド（例えば、アビジン）が投与される、腫瘍プレターゲッティングにおいて利用するために、受容体（ストレプトアビジンのような）とコンジュゲートしてもよい。
「標識」とは、抗体と直接または間接的にコンジュゲートしている検出可能な化合物または組成物を指す。標識は、自身によって、それ自体、検出可能であり得（例えば、放射性同位元素標識または蛍光標識）、酵素標識の場合には、検出可能である、基質化合物または組成物の化学的変化を触媒し得る。あるいは、標識は、そのままで検出可能でなくともよいが、検出可能である別の薬剤によって結合されている要素であり得る（例えば、エピトープタグまたはビオチン−アビジンなどといった結合パートナー対の一方）。したがって、抗体は、その淡理を容易にする標識またはタグを含むことができ、抗体を同定するための本発明の方法は、標識またはタグとの相互作用によって抗体を単離するステップを含む。
例示的治療免疫複合体は、化学療法薬、毒素（例えば、細菌、真菌、植物または動物起源の酵素的に活性な毒素、またはその断片）、放射性同位元素（すなわち、放射性コンジュゲート）などの細胞障害性薬剤とコンジュゲートしている本明細書に記載される抗体を含む。融合タンパク質は、以下にさらに詳細に記載されている。
放射性金属または磁気共鳴エンハンサーのキレート剤は、当技術分野で周知である。代表的なものとして、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）およびジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）の誘導体がある。これらのキレート剤は、通常、側鎖に、キレート剤が担体に結合され得る基を有する。このような基として、例えば、ＤＴＰＡまたはＥＤＴＡが、担体のアミン基にカップリングされ得るベンジルイソチオシアネートが挙げられる。あるいは、すべて周知の手段によって、活性化または先の誘導体化およびその後のカップリングによって、キレート剤上のカルボキシル基またはアミン基を担体にカップリングできる。
ホウ素含有物（ａｄｄｅｎｄ）、例えば、カルボランは、従来法によって抗体成分と結合できる。例えば、カルボランは、当技術分野で周知であるように、ペンダント側鎖上のカルボキシル基を用いて調製できる。このようなカルボランの、担体、例えば、アミノデキストランとの結合は、カルボランのカルボキシル基の活性化と、担体上のアミンとの縮合によって達成でき、中間体コンジュゲートが得られる。次いで、以下に記載されるように、このような中間体コンジュゲートを抗体成分と結合して、治療上有用な免疫コンジュゲートを得ることができる。
ポリペプチド担体は、アミノデキストランの代わりに用いることができるが、ポリペプチド担体は、鎖中に少なくとも５０個のアミノ酸残基、好ましくは、１００〜５０００個のアミノ酸残基を有さなくてはならない。少なくともいくつかのアミノ酸は、リシン残基またはグルタミン酸またはアスパラギン酸残基でなくてはならない。リシン残基のペンダントアミンおよびグルタミンおよびアスパラギン酸のペンダントカルボキシレートは、薬物、毒素、免疫調節薬、キレート剤、ホウ素含有物（ａｄｄｅｎｄ）またはその他の治療薬を結合するのに好都合である。適したポリペプチド担体の例として、得られた負荷された担体および免疫複合体に望ましい溶解特性を与える、ポリリジン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、それらの共重合体およびこれらのアミノ酸とその他のもの、例えば、セリンの混合ポリマーが挙げられる。
抗体成分を含む中間体コンジュゲートのコンジュゲーションは、抗体成分の炭水化物部分を酸化することと、得られたアルデヒド（およびケトン）カルボニルを、薬物、毒素、キレート剤、免疫調節薬、ホウ素含有物（ａｄｄｅｎｄ）またはその他の治療薬を負荷した後に担体上に残っているアミン基と反応させることとによって達成される。あるいは、中間体コンジュゲートを、治療薬の負荷後に、中間体コンジュゲート中に導入されているアミン基を介して酸化された抗体成分と結合させてもよい。酸化は、化学的に、例えば、ＮａＩＯ４またはその他の解糖試薬を用いて、または酵素的に、例えば、ノイラミニダーゼおよびガラクトースオキシダーゼを用いて達成されることが好都合である。アミノデキストラン担体の場合には、通常、アミノデキストランのアミンのすべてが、治療薬の負荷に用いられるわけではない。アミノデキストランの残存するアミンが、酸化された抗体成分と縮合して、シッフ塩基付加物を形成し、次いで、これは、通常、水素化ホウ素還元剤を用いて還元的に安定化される。
本発明のその他の免疫複合体を製造するためには、類似の手順が用いられる。負荷されたポリペプチド担体は、抗体成分の酸化された炭水化物部分との縮合のために、残存する遊離リシン残基を有することが好ましい。ポリペプチド担体上のカルボキシルは、例えば、ＤＣＣを用いる活性化および過剰のジアム（ｄｉａｍｍｅ）との反応によって、必要に応じて、アミンに変化できる。
最終免疫複合体は、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００でのサイジングクロマトグラフィーまたは１種以上のＣＤ８４Ｈｙエピトープを用いるアフィニティークロマトグラフィーなどの従来技術を用いて精製される。
あるいは、免疫複合体は、抗体成分を、治療薬と直接コンジュゲートすることによって調製できる。一般手順は、治療薬が酸化された抗体成分と直接結合していることを除いて、コンジュゲーションの間接法と類似している。
当然のことではあるが、その他の治療薬を本明細書に記載されるキレート剤と置換することができる。当業者ならば、過度の実験を行うことなく、コンジュゲーションスキームを考案することができる。
さらなる例示として、治療薬を、ジスルフィド結合形成を介して、還元された抗体成分のヒンジ領域に結合できる。例えば、テタヌストキソイドペプチドは、ペプチドを抗体成分と結合するために用いられる単一のシステイン残基を用いて構築することができる。別の方法として、ヘテロ二官能性架橋剤、例えば、Ｎ−スクシニル３−（２−ピリジルジチオ）プロプリオネート（ＳＰＤＰ）を用いて、このようなペプチドを抗体成分と結合できる。Ｙｕら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ５６：２４４頁（１９９４年）。このようなコンジュゲーションのための一般技術は、当技術分野で周知である。例えば、Ｗｏｎｇ、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９９１年）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｂｉｒｃｈら（編）、１８７〜２３０頁（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．１９９５年）中、Ｕｐｅｓｌａｃｉｓら、「Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ」；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、Ｅｎｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ、Ｒｉｔｔｅｒら（編）、６０〜８４頁（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９５年）中、Ｐｒｉｃｅ、「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ａｎｔｉｂｏｅｉｅｓ」参照のこと。
抗体と細胞傷害性薬剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミデートＨＣＬ）、活性エステル（例えば、ジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド（例えば、グルタルエルデヒド（ｇｌｕｔａｒｅｌｄｅｈｙｄｅ））、ビス−アジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トリエン（ｔｏｌｙｅｎｅ）２，６−ジイソシアネート）およびビス−活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を用いて作製される。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１０９８頁（１９８７年）に記載のとおり調製できる。炭素−１４−標識された１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性核種の抗体とのコンジュゲーションのための例示的キレート薬である（例えば、ＷＯ９４／１１０２６参照のこと）。
上記のように、抗体のＦｃ領域中の炭水化物部分を用いて、治療薬をコンジュゲートできる。しかし、免疫複合体の抗体成分として、抗体断片が用いられる場合には、Ｆｃ領域が存在しない場合がある。それにもかかわらず、抗体または抗体断片の軽鎖可変領域に炭水化物部分を導入することが可能である。例えば、Ｌｅｕｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５９１９頁（１９９５年）；Ｈａｎｓｅｎら、米国特許第５，４４３，９５３号参照のこと。次いで、操作された炭水化物部分を用いて治療薬を結合できる。
さらに、当業者ならば、コンジュゲーション法の多数の可能性ある変法を認識する。例えば、血液、リンパまたはその他の細胞外液における、無傷の抗体またはその抗原結合断片の半減期を延長するために、炭水化物部分を用いてポリエチレングリコールを結合できる。さらに、治療薬を、炭水化物部分と、および遊離スルフヒドリル基と結合することによって「二価免疫複合体」を構築することが可能である。このような遊離スルフヒドリル基は、抗体成分のヒンジ領域に位置し得る。
抗体融合タンパク質
本発明は、１種以上の抗体部分と、別のポリペプチド、例えば、免疫調節薬または毒素部分とを含む融合タンパク質の使用を考慮する。抗体融合タンパク質を作製する方法は、当技術分野で周知である。例えば、米国特許第６，３０６，３９３号参照のこと。インターロイキン−２部分を含む抗体融合タンパク質は、Ｂｏｌｅｔｉら、Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．６：９４５頁（１９９５年）、Ｎｉｃｏｌｅｔら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：１６１頁（１９９５年）、Ｂｅｃｋｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：７８２６頁（１９９６年）、Ｈａｎｋら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．２：１９５１頁（１９９６年）およびＨｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：４９９８頁（１９９６年）によって記載されている。さらに、Ｙａｎｇら、Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ６：１２９頁（１９９５年）には、Ｆ（ａｂ’）２断片と、腫瘍壊死因子α部分とを含む融合タンパク質が記載されている。
組換え分子が、１種以上の抗体成分と、毒素または化学療法薬とを含む、抗体−毒素融合タンパク質を作製する方法は、当等業者には公知である。例えば、抗体−シュードモナス外毒素Ａ融合タンパク質は、Ｃｈａｕｄｈａｒｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３３９：３９４頁（１９８９年）、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：８６１６頁（１９９１年）、Ｂａｔｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：５８６７頁（１９９２年）、Ｆｒｉｅｄｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：３０５４頁（１９９３年）、Ｗｅｌｓら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎ．６０：１３７頁（１９９５年）、Ｆｏｍｉｎａｙａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１０５６０頁（１９９６年）、Ｋｕａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５：２８７２頁（１９９６年）およびＳｃｈｍｉｄｔら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎ．６５：５３８頁（１９９６年）によって記載されている。ジフテリア毒素部分を含有する抗体−毒素融合タンパク質は、Ｋｒｅｉｔｍａｎら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ７：５５３頁（１９９３年）、Ｎｉｃｈｏｌｌｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：５３０２頁（１９９３年）、Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２８０３７頁（１９９５年）およびＶａｌｌｅｒａら、Ｂｌｏｏｄ ８８：２３４２頁（１９９６年）に記載されている。Ｄｅｏｎａｒａｉｎら、Ｔｕｍｏｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ１：１７７頁（１９９５年）には、ＲＮアーゼ部分を有する抗体−毒素融合タンパク質が記載されており、一方で、Ｌｉｎａｒｄｏｕら、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４−２５：２４３頁（１９９４年）は、ＤＮアーゼＩ成分を含む、抗体−毒素融合タンパク質を製造した。ゲロニンは、Ｗａｎｇら、第２０９回ＡＣＳ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ、Ａｎａｈｅｉｍ、Ｃａｌｉｆ．、１９９５年４月２〜６日パート１、ＢＩＯＴ００５の要約の抗体−毒素融合タンパク質中の毒素部分として用いられることが多かった。さらなる例として、Ｄｏｈｌｓｔｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：８９４５頁（１９９４年）では、ブドウ球菌内毒素−Ａを含む抗体−毒素融合タンパク質が報告された。
このようなコンジュゲートの調製において適宜用いられる毒素の例として、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ、ＤＮアーゼＩ、ブドウ球菌内毒素−Ａ、ブタクサ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒、シュードモナス外毒素およびシュードモナス内毒素がある。例えば、Ｐａｓｔａｎら、Ｃｅｌｌ ４７：６４１頁（１９８６年）およびＧｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，ＣＡ−−Ａ Ｃａｎｃｅｒ Ｊｏｕｒｎａｌ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ ４４：４３頁（１９９４年）参照のこと。その他の適した毒素は、当業者に知られている。
抗体を、プロドラッグ（例えば、ぺプチジル化学療法薬、ＷＯ８１／０１１４５参照のこと）を活性抗癌剤に変換するプロドラッグ活性化酵素とコンジュゲートすることによって、本発明の抗体をＡＤＥＰＴにおいて用いることができる。例えば、ＷＯ８８／０７３７８および米国特許第４，９７５，２７８号参照のこと。
ＡＤＥＰＴに有用な免疫複合体の酵素成分として、より活性な細胞傷害性の形に変換するような方法でプロドラッグを活性化できる任意の酵素が挙げられる。
本発明の方法において有用な酵素として、それだけには限らないが、リン酸含有プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なアルカリホスファターゼ；硫酸含有プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なアリールスルファターゼ；非毒性５−フルオロシトシンを抗癌剤、５−フルオロウラシルに変換するのに有用なシトシンデアミナーゼ；セラチアプロテアーゼ、などのプロテアーゼが挙げられる。サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼおよびペプチド含有プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用であるカテプシン（例えば、カテプシンＢおよびＬ）；Ｄ−アミノ酸置換基を含むプロドラッグを変換するのに有用なＤ−アラニルカルボキシペプチダーゼ；β−ガラクトシダーゼおよびグリコシル化プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なノイラミニダーゼなどの炭水化物切断酵素； β−ラクタムを用いて誘導体化された薬物を遊離薬物に変換するのに有用なβ−ラクタマーゼ；およびペニシリンアミダーゼ、例えば、そのアミン窒素で、それぞれ、フェノキシアセチルまたはフェニルアセチル基を用いて誘導体化されている薬物を、遊離薬物に変換するのに有用なペニシリンＶアミダーゼまたはペニシリンＧアミダーゼが挙げられる。あるいは、抗体酵素としても当技術分野で知られる、酵素活性を有する抗体を用いて、本発明のプロドラッグを遊離活性薬物に変換できる（例えば、Ｍａｓｓｅｙ、Ｎａｔｕｒｅ ３２８：４５７〜４５８頁（１９８７年）参照のこと）。腫瘍細胞集団への抗体酵素の送達のために、抗体−抗体酵素コンジュゲートを本明細書に記載されるとおり調製できる。
本発明の酵素は、当技術分野で周知の技術、例えば、上記で論じられたヘテロ二官能性架橋試薬の使用によって共有結合によって結合させることができる。あるいは、少なくとも本発明の酵素の機能的に活性な部分と連結している少なくとも本発明の抗体の抗原結合領域を含む融合タンパク質は、当技術分野で周知の組換えＤＮＡ技術を用いて構築できる（例えば、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４〜６０８頁（１９８４年）参照のこと）。
非治療的使用
本発明の抗体を、標的抗原に対する、または表ｔ系抗原についての診断アッセイ、例えば、特定の細胞、組織または血清におけるその発現の検出においてアフィニティー精製剤として使用できる。抗体はまた、診断アッセイにおいて使用できる。一般に、これらの目的上、抗体は、放射性核種（例えば、１１１Ｉｎ、９９Ｔｃ、１４Ｃ、１３１Ｉ、１２５１、３Ｈ、３２Ｐまたは３５Ｓ）で標識され、その結果、イムノシンチオグラフィー（ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｏｇｒａｐｈｙ）を用いて腫瘍を局在化できる。
本発明の抗体は、競合結合アッセイ、直接および間接サンドイッチアッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡおよび免疫沈降アッセイなどの任意の既知アッセイ法において使用できる。Ｚｏｌａ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１４７〜１５８頁（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．１９８７年）。抗体はまた、免疫組織化学のために、当技術分野で公知の方法を用いて腫瘍サンプルを標識するために使用できる。
便宜上、本発明の抗体はキット、すなわち、パッケージ化された、所定量の試薬の組み合わせおよび診断アッセイを実施するための使用説明書において提供され得る。抗体が酵素で標識されている場合には、キットは、基質および酵素によって必要とされる補助因子（例えば、検出可能な発色団またはフルオロフォアを提供する基質前駆体）を含む。さらに、安定化剤、バッファー（例えば、ブロックバッファーまたは溶解バッファー）などといったその他の添加剤も含まれ得る。アッセイの感度を実質的に最適化する試薬の溶液中の濃度を提供するための種々の試薬の相対量は大きく変わり得る。特に、試薬は、通常、凍結乾燥された乾燥粉末、例えば、溶解すると適当な濃度を有する試薬溶液を提供する賦形剤として提供され得る。
本発明は、以下の実施例によって例示されるが、これは決して制限であるよう意図されるものではない。
（実施例１）
ＰＲＬＲのＥＣＤ、Ｓ１およびＳ２ドメイン断片の調製
ＰＲＬＲの細胞外ドメイン（ＥＣＤ、配列番号２のアミノ酸２５〜２３４）、Ｓ１ドメイン（配列番号２のアミノ酸２５〜１２５）およびＳ２ドメイン（配列番号２のアミノ酸１２６〜２３４）に相当するＰＲＬＲの断片の組換え発現および精製を、以下のように実施した。ＥＣＤ、Ｓ１およびＳ２の昆虫発現のための発現構築物を、表２に示されるように設計し、プライマーは、断片をそれぞれのアミノ酸配列に基づいてクローニングするために設計した（表３に示されるとおり）。
Figure 2016130250
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 Ｓ１およびＳ２ドメインをクローニングするために、ネステッドＰＣＲアプローチを採用してタグを組み込み、３’／５’領域を設計した。Ｓ１には、クローニングのための６種のフォワードネステッドプライマーおよび１種のリバースプライマーがある。Ｓ２には、クローニングのための５種のフォワードネステッドプライマーおよび３種のリバースプライマーがある。
ＰＣＲ増幅は、ＰｆｕＵｌｔｒａ（商標）Ｈｏｔｓｔａｒｔ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、製造業者の推奨に従って実施した。増幅に用いられる鋳型は、ｐＤＥＳＴ３２１８においてクローニングされたＰＲＬＲ ＥＣＤ断片である（データは示されていない）。ＥＣＤ ＰＣＲ産物は、トポイソメラーゼクローニング戦略を用いてＢｌｕｅＢａｃ４．５／Ｖ５−Ｈｉｓ ＴＯＰＯ−ＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングする。Ｓ１およびＳ２ＰＣＲ産物は、Ｇａｔｅｗａｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて社内で適応させたｐＡｃＭＰ３にクローニングする。最終選択クローンは、二本鎖配列決定によって確認した。昆虫トランスフェクションのために１０〜２０μｇのＤＮＡを調製した。
以下のように、昆虫細胞において、組換え構築物を用いてそれぞれのＰＲＬＲ断片を発現させた。バキュロウイルスは、Ｓａｐｐｈｉｒｅ（商標）ゲノムオートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＤＮＡとの、ＰＲＬＲの細胞外ドメインをコードするプラスミドＤＮＡの同時トランスフェクションのプラーク精製によって単離した。組換えウイルスは増幅し、これを用いて、１０Ｌ（可動範囲）ウェーブバイオリアクター中、１ｍｌあたり１×ｌ０６〜１．５×ｌ０６個細胞の範囲の密度、２〜１０の感染効率範囲でＴｎ５昆虫細胞感染させた。４８時間感染させた後、細胞および上清を回収、遠心分離し、上清を濃縮のために調製した。上清を０．４５μｍ中空糸カートリッジで清澄化し、その後、接線流１０ｋＤａ ＭＷカットオフメンブランを用いて５×濃縮した。タンパク質精製の前に、まず、上清を濾過滅菌した、ｗ／１Ｌ、０．２μｍ孔真空フラスコ。
Ｓ１断片が精製の前に濃縮されておらず、Ｓ２断片が５ｋＤａ ＭＷカートリッジで濃縮されたという点を除いて、同様の方法を用いて、昆虫細胞においてＳ１およびＳ２ドメインを発現させた。
ＰＲＬＲ断片は以下のとおり精製した。発現されたＰＲＬＲ ＥＣＤまたはサブドメインを含有する昆虫細胞−培養上清を、そのままのまたは積層メンブランカセット装置（Ｐａｌｌ Ｆｉｌｔｒｏｎ）を、１または５ｋＤ名目分子量カットオフを用いて最大１０×濃縮された発現群から回収した。実用的な場合は、上清を０．２ミクロンフィルターを通して濾過した。上清を、ＰＢＳで平衡化したカラム上に直接乗せた。
Ｈｉｓタグがついているタンパク質を、１−または５−ｍＬ ＨｉｓＴｒａｐカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で、製造業者の推奨する流速で精製した。Ｇｌｕタグがついているタンパク質は、以下のとおり、固定化された抗ｇｌｕモノクローナル抗体カラムで精製した：３〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度の、ＰＢＳ中の精製した抗ｇｌｕモノクローナル抗体を、Ａｆｆｉ−ｇｅｌ １０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、ｎ−ヒドロキシスクシンイミドによって活性化されたアガロースゲルに、製造業者の使用説明書によってコンジュゲートした。抗ｇｌｕアガロースは、ＸＫ１６カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に詰め、１５〜３０ｃｍ／時の線流速で流した。
ＨｉｓＴｒａｐカラムのタンパク質の溶出は、バッファーＡ（ＰＢＳ）からバッファーＢ（ＰＢＳ＋０．２５Ｍイミダゾール（ＩＸ−０００５、ＥＭ Ｍｅｒｃｋ）ｐＨ７．４）への２０カラム容積勾配溶出によってとした。抗ｇｌｕカラムからのタンパク質の溶出は、Ｇｌｕ−Ｇｌｕエピトープと競合する０．１ｍｇ／ｍＬのペプチドＥＹＭＰＴＤを含有するＰＢＳによってとした。画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットまたは質量分析によって調べ、適切にプールする。
プールされたＰＲＬＲ ＥＣＤまたはサブドメインを、ＰＢＳ中で平衡化され、２．５ｍＬ／分で流されるＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ２６／６０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いるサイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製した。わずか１０ｍＬをこれらのカラムに乗せた。画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって調べ、適切にプールした。
（実施例２）
ヒト抗体ファージディスプレイライブラリーからの標的特異的抗体の単離
ヒトＰＲＬＲの活性を中和できる抗体のパネルを単離するために、ｓｃＦｖ断片を発現する、３種のヒト抗体ファージディスプレイライブラリーを、並行して調べた。ライブラリーパニングに用いた標的は、実施例１において上記で記載したように調製したプロラクチン受容体の可溶性細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（ヒトプロラクチン受容体アミノ酸２５〜２３４）とした。受容体をビオチン化し（ＮＨＳ−ＬＣ ビオチン、Ｐｉｅｒｃｅ）、ビオチン化ＥＣＤで可溶性パニングを実施した。
ファージディスプレイからの標的特異的抗体の選択を、Ｍａｒｋｓら（Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２４８：１６１〜７６頁、２００４年）によって記載される方法に従って実施した。手短には、ファージディスプレイライブラリーを、５０ｐｍｏｌｓのビオチン化ＥＣＤとともに室温で１時間インキュベートし、次いで、形成された複合体を、１００μｌのストレプトアビジンビーズ懸濁液（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２８０ストレプトアビジン、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて獲得した。洗浄バッファー（ＰＢＳ＋５％ミルク）でビーズを洗浄することによって非特異的ファージを除去した。結合しているファージを、０．５ｍｌの１００ｎＭトリエチルアミン（ＴＥＡ）を用いて溶出し、等容積の１Ｍ ＴＲＩＳ−Ｃｌ ｐＨ７．４を加えることによって直ちに中和した。溶出されたファージプールを用いて、対数増殖期の増殖しているＴＧ１大腸菌細胞に感染させ、ファージミドを記載されるように救出した（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２４８：１６１〜７６頁、２００４年）。選択は、３ラウンドのすべてについて反復した。パニングの３回目のラウンドから溶出されたファージに感染したＴｇ１細胞から得られたシングルコロニーを、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて結合活性についてスクリーニングした。手短には、溶出されたファージに感染したＴＧ１細胞から得られたシングルコロニーを用いて、９６ウェルプレート中の培地に播種した。マイクロカルチャーを、ＯＤ６００＝０．６に増殖させ、その時点で、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加し、３０℃のシェーカーインキュベーターで一晩培養することによって、可溶性抗体断片の発現を誘導した。細菌を遠心沈殿させ、原形質周辺の抽出物を調製し、これを用い、マイクロプレート製造業者によって提供される標準ＥＬＩＳＡプロトコールに従って、９６ウェルマイクロプレート（９６ウェル平底Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂプレート、Ｎｕｎｃ）上に固定されたＥＣＤに対する抗体結合活性を検出した。
組換え細胞外ドメイン（ＥＣＤ）との結合についての、抗プロラクチン受容体（ＰＲＬＲ）抗体の親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）２０００を用いて推定し、抗体の親和性ランキングのために用いた。ヒトｓｃＦｖ−Ｆｃ融合物には、プロテインＡ／Ｇ捕獲表面を用い、ハイブリドーマによって産生された抗体にはウサギ抗マウスＩｇＧ−Ｆｃ（ＲＡＭ−Ｆｃ）抗体捕獲表面を用いた。プロテインＡ／ＧおよびＲＡＭ−Ｆｃ捕獲チップは両方とも、最大レベルの捕獲分子（プロテインＡ／ＧまたはＲＡＭ−Ｆｃのいずれか）が、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｉｎｃ．から推奨されるプロトコールにしたがって、標準ＥＤＣ−ＮＨＳアミンカップリング化学によって４つのフローセル上に固定化されているＣＭ５センサーチップであった。ランニングバッファーは、ＨＢＳ−ＥＰ（Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標），Ｉｎｃ．）とし、温度は２５℃に設定し、流速は、最初１０μＬ／分とした。精製された抗体を、１〜３μｇ／ｍＬの間の適当な濃度に、ＨＢＳ−ＥＰに希釈し、１〜２分間、捕獲チップ上に注入した。流速は、２５〜３０μＬ／分に増大させた。ＰＲＬＲの組換えＥＣＤは、１μｇ／ｍＬに希釈し、５〜６分間注入し、１０分解離させた。
ＢＩＡＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを用いてフィットを実施し、動力学的結合および解離速度定数（それぞれ、ｋｏｎおよびｋｏｆｆ）を算出するために用いた。物質移行補正を用いる１：１ラングミュア相互作用モデルを用いて、各サンプルで同時ｋａ／ｋｄフィットを実施した。いくつかのサンプルを、同時にフィットし、Ｒｍａｘ、ｋｏｎおよびｋＯｆｆパラメータをフィットローカルに設定した。ベースラインドリフトが生じた場合には、ドリフトするベースラインモデルを用い、ドリフト値を定数に設定し、手作業で入力した。ドリフト値は−０．０３〜＋０．０５ＲＵ／秒に変化した。
抗体結合はまた、蛍光活性化細胞ソーティング（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ）（ＦＡＣＳ）分析および蛍光定量的マイクロ体積アッセイ技術（Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ Ｍｉｃｒｏｖｏｌｕｍｅ Ａｓｓａｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（ＦＭＡＴ）を用いて、プロラクチン受容体発現細胞との結合を測定することによって評価した（Ｓｗａｒｔｚｍａｎら、Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７１：１４３〜５１頁、１９９９年）。ＦＡＣＳまたはＦＭＡＴアッセイのいずれかによって結合を示したクローンを、配列分析し、独特の重鎖ＣＤＲ３および軽鎖ＣＤＲ３タンパク質配列をコードするクローンを、以下の実施例３に記載されるように、ｓｃＦｖ−Ｆｃに再編成した。これらのｓｃＦｖ−Ｆｃを、以下の実施例５および６に記載されるように、ＰＲＬＲ誘導性ＥＲＫ１／２リン酸化およびＢａＦ３／ＰＲＬＲ細胞株のＰＲＬＲ誘導性増殖を阻害する能力について試験した。実施例７に記載されるように、選択された抗体を、ＥＣＤ、Ｓ１およびＳ２との結合について、ならびにＰＲＬＲ ＥＣＤとの結合についての抗体対間の相対的競合についてさらに特性決定した。選択された抗体のデータは、以下の表４に示されている。
Figure 2016130250
 （実施例３）
ｓｃＦｖ−Ｆｃ形式へのクローンの再編成
実施例２において同定された独特のｓｃＦｖクローン各々について、ファージディスプレイベクターから、ｓｃＦｖ断片をコードするｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅し、ＸＯＭＡの専売発現ベクターの改変である哺乳類発現ベクター（カッパ（κ）、ラムダ（λ）またはガンマ−２（γ２）定常領域遺伝子のいずれかをコードする、ＷＯ２００４／０３３６９３に記載される）中にライゲーションし、ｓｃＦｖ−Ｆｃタンパク質での各抗体の発現を可能にし、これではタンパク質のＦｃ部分は、ＩｇＧ１分子のＣＨ２およびＣＨ３ドメインに相当する。ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質の構築は、当技術分野では周知であり、例えば、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋｓら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ ２００４年１月；１７（１）：９５〜１０６頁、Ｐｏｗｅｒｓら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００１年５月１日；２５１（ｌ−２）：１２３〜３５頁またはＳｈｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９３年、９０、７９９５〜７９９８頁参照のこと。米国特許第５，８９２，０１９号にも、Ｆｃ融合タンパク質ベクターの構築およびｓｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質の発現が記載されている。
融合タンパク質の発現は、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）での、製造業者の使用説明書を用いる、２９３Ｅ懸濁細胞のトランスフェクションによって実施される。５日後、細胞を遠心分離によって除去し、プロテインＡセファロース（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用い、製造業者によって示唆されるプロトコールを用いて上清からｓｃＦｖ−Ｆｃ融合物を精製する。
（実施例４）
マウスハイブリドーマによって分泌される標的特異的抗体の同定
ヒトプロラクチン受容体（ＰＲＬＲ）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対するマウス抗体を、以下のとおり作製した。６匹のＢａｌｂ／Ｃマウスを、組換えＰＲＬＲ細胞外ドメイン（上記）を用い、皮下注射によって免疫化した。マウスには２８日間かけて１０回の注射を施した。最後の注射の４日後、マウスを屠殺し、流入領域リンパ節を採取した。リンパ節由来の細胞を懸濁した後、それらを、ＢＴＸ ＥＣＭ２００１ Ｅｌｅｃｔｒｏ−Ｃｅｌｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を用いて電気的細胞融合によってマウス骨髄腫細胞株Ｐ３ｘＡｇ８．６５３と融合した。
融合後、細胞を約４０の９６ウェルプレートにプレーティングした。１２日後、組換えＥＣＤおよびに対してＥＬＩＳＡによって、およびＦＭＡＴにおいて、これらのプレートをスクリーニングした。ＦＭＡＴアッセイでは、高レベルのＰＲＬＲ受容体を発現するよう安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞株を用いた。
選択されたハイブリドーマを、以下の実施例５および６に記載されるように、ＰＲＬＲ誘導性ＥＲＫ１／２リン酸化およびＢａＦ３／ＰＲＬＲ細胞株のＰＲＬＲ誘導性増殖を阻害する能力について試験した。実施例７に記載されるように、選択された抗体を、組換えＥＣＤ、Ｓ１およびＳ２との結合について、ならびにＰＲＬＲ ＥＣＤとの結合についての抗体対間の相対的競合についてさらに特性決定した。選択された抗体のデータは、表４において上記で示されている。
（実施例５）
ＥＲＫ１／２リン酸化に対する抗体効果の決定
５時間の血清飢餓後、Ｔ４７Ｄ細胞を、マイクロタイタープレート中、完全増殖培地に３７℃で２４時間播種する。細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、０．１％ＢＳＡを含有する血清不含培地で希釈した抗体とともに、３７℃で３０分間インキュベートした。抗体の最終出発濃度は、４０μｇ／ｍｌとした。培地を除去し、０．１％ＢＳＡを含有する血清不含培地で希釈したプロラクチンを３０ｎｇ／ｍｌの最終濃度に加えた。細胞を、プロラクチンとともに３７℃で３０分間インキュベートし、続いて、氷冷ＰＢＳで２回洗浄した。洗浄剤、キレートならびに種々のプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含有する標準溶解バッファーを加えて細胞溶解物を作製した。リン酸化ＥＲＫ１／２（ｐＥＲＫ１／２）のレベルを、標準ＥＬＩＳＡを、ＤＵＯＳＥＴ（登録商標）ＩＣ Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＲＫ１／ＥＲＫ２、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．の使用説明書に従って用いて測定した。代表的なアッセイの結果が図２、３および４に示されており、選択された抗体のアッセイの結果が上記表４に示されている。
図７Ａ〜７Ｃは、ｐＥＲＫアッセイにおいて８０％より高い阻害を有していた抗体のＶＨおよびＶＬアミノ酸配列を示す。
（実施例６）
ＰＲＬ応答性細胞株の増殖に対する抗体効果の決定
ＢａＦ３／ＰＲＬＲ細胞を、全長ヒトＰＲＬＲおよびネオマイシンカセットを含む発現ベクターを用いてマウスプロＢ細胞株ＢａＦ３をエレクトロポレーションすることによって作製した。細胞は、Ｇ４１８（１ｍｇ／ｍｌ）およびｒｍＩＬ−３（１０ｎｇ／ｍｌ）を補給した培地で７日間選択し、Ｇ４１８またはＩＬ−３を含まないｒｈＰＲＬ（１μｇ／ｍｌ）における７日の選択期間を続けた。１４日間にわたって、培地ＰＲＬ濃度は、５０ｎｇ／ｍｌの維持レベルに達するまで、段階的に低下した。実験当日に、１×１０４個細胞を、平底９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。５０ｎｇ／ｍｌｒｈＰＲＬを含むか含まないウェルに、１０μｇ／ｍｌの濃度の抗体（ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合形式の）を加えた。プレートを４８時間インキュベートし、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏ試薬を用いて分析した。サンプルを３連で実施し、ＰＲＬの不在下で抗体によって誘導される細胞増殖によってアゴニズムを評価したのに対し、アンタゴニズムは、ＰＲＬの存在下での細胞増殖によって調べた。選択された抗体についての、この増殖アッセイの結果は、上記表４に示されている。
ＰＲＬ誘導性増殖および抗ＰＲＬＲ抗体による増殖の阻害を分析するために、Ｔ４７ＤまたはＭＣＦ７−ＮＣＩ細胞を、１ｍｌの通常増殖培地（フェノールレッド不含ＲＰＭＩ／１０％ ＦＣＳ）あたり１×１０６個細胞の密度で、Ｔ７５フラスコ（１２ｍｌ総容積）に分けた。分割の７２時間後、細胞をトリプシン処理し、計数し、平底９６ウェルプレートのウェルあたり５Ｋ（Ｔ４７Ｄ）またはウェルあたり２０Ｋ（ＭＣＦ７）の密度で播種した（ウェルあたり１００μｌ）。ＭＣＦ７細胞は、血清不含およびフェノールレッド不含ＲＰＭＩに播種し、Ｔ４７Ｄ細胞は、血清不含ＲＰＭＩまたは１０％チャコール−ストリップド（ｃｈａｒｃｏａｌ−ｓｔｒｉｐｐｅｄ）血清を含有するＲＰＭＩのいずれかに播種した。播種の２４時間後、ウェルにＰＲＬおよび抗ＰＲＬＲ抗体を加えた（５０μｌ、３×濃縮された）。７２時間インキュベーションした後、プレートに３［Ｈ］チミジン（ウェルあたり１μｃｉ）を、３７℃のインキュベーター中、最小で６時間加えた。トリプシンおよびＴｏｍｔｅｃ９６ウェルプレート細胞収穫器を用いて細胞を回収した。次いで、フィルターを、Ｔｒｉｌｕｘルミノメーターに移し、分析した（１分カウント）。図５における増殖研究の結果は、ｓｃＦｖが、増殖におけるプロラクチン媒介性増大を阻害することを示す。
（実施例７）
ＢＩＡＣＯＲＥによる結合親和性および競合の測定
上記実施例２において記載されるように、ＢＩＡＣＯＲＥ分析を反復して、選択された抗体の、上記のＰＲＬＲのＥＣＤ、Ｓ１およびＳ２ドメインとの相対結合を調べた。ただし、Ｓ１、Ｓ２またはＥＣＤタンパク質は、１０μｇ／ｍＬで、１５μＬ／分で２分間注入した。このアッセイから得られたデータを、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録書評）コントロールソフトウェアによって報告点（レゾナンスユニット（ＲＵ））として集め、結合している抗原の量を、捕獲された抗体の量で除すことによって正規化した。データは、以下の表５に示されている。
Figure 2016130250
 精製抗体の親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）２０００で一連の注入を実施することによって調べた。生じた親和性および速度定数は、ＨＢＳ−ＥＰバッファー系において２５℃でプロラクチン受容体（ＰＲＬＲ）の組換え細胞外ドメイン（ＥＣＤ）と結合するこれらの抗体に対して関連がある。約５０００〜１０００ＲＵのプロテインＡ／Ｇを含むＣＭ５センサーチップを、標準ＥＤＣ−ＮＨＳアミンカップリング化学によって、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｉｎｃ．から推奨されるプロトコールに従って調製し、抗体を捕獲するのに用いた。精製抗体を、捕獲のためにＨＢＳ−ＥＰバッファー中、約１μｇ／ｍＬに希釈した。２５０〜４００ＲＵの間の抗体捕獲を与えるのに必要とされる注入時間を調べた。抗体を１０μＬ／分で、捕獲レベル最適化の結果に応じて１．５〜３分間注入することによって、動態解析のための抗体の捕獲を実施した。
動態解析には、流速は、４０μＬ／分に設定した。１４８ｎＭ（４μｇ／ｍＬ）または３７ｎＭ（１μｇ／ｍＬ）のいずれかからの１：３段階希釈でＰＲＬＲ ＥＣＤの５種の濃度を調製した。各濃度およびバッファー対照（ゼロ濃度）を、２連で注入した。データセットは参照される２つであり、１：１ラングミュア結合相互作用モデルを用いて全体的にフィットした。この同じ分析を、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２構築物の両方についてのＸＰＡ．０６．１６７のＩｇＧ再編成された構築物についても実施した。
選択された抗体の、ＰＲＬＲのＥＣＤとの結合の速度定数および親和性は、以下の表６に示されている。
Figure 2016130250
 同様の手順を用いて、さらなる抗体の速度定数および親和性をを調べた（以下の表７に要約される）。
Figure 2016130250
 ＰＲＬＲとの結合についての抗体対間の相対競合または干渉（例えば、対合分析）を、連続競合アッセイ戦略において以下のように調べた。このアプローチでは、１種の抗体がセンサーチップ上に、直接または捕獲剤を介して固定化されており、ＥＣＤが固定化された抗体上に注入されるとＥＣＤの結合が可能となる。必要な場合には、高濃度の無関係なＩｇＧ（例えば、ウサギ抗マウスＩｇＧ捕獲表面を用いて２種のマウス抗体を試験する場合に）を注入することによって、過剰の捕獲剤がブロックされる。続いて、競合について試験される抗体が注入され、第１の抗体によって捕獲されたＥＣＤと結合するその能力が調べられる。２種の抗体が、ＥＣＤ上の空間的に分離されたエピトープと結合する場合には、第２の抗体はＥＣＤ／第１の抗体複合体と結合できなくてはならない。２種の抗体が干渉または競合する場合には、第２の抗体は、ＥＣＤ／第１の抗体複合体と同様には、または全く結合できない。この競合分析の結果は、上記表４に示されている（２種の抗体が同一エピトープビン数を有する場合には、ＥＣＤとの結合について互いに競合し、その他のビンに由来する抗体に対して同一の競合パターンを示す）。本発明は、本明細書に記載されるビン中の任意の抗体と同一のＰＲＬＲのエピトープと結合する、またはＲＰＬＲ ＥＣＤとの結合について、このような抗体と競合するその他の抗体の同定を具体的に考慮する。
（実施例８）
ウェスタンブロットによるＰＲＬ誘導性ＰＲＬＲ、ＳＴＡＴ５＆ＡＫＴリン酸化に対する効果
選択された抗体の、ＳＴＡＴ５およびＡＫＴのＰＲＬ誘導性リン酸化を阻害する能力を、以下のとおり調べた。細胞を、６ウェルプレートにおいて、３×１０５個細胞／ｍｌの密度でフェノールレッド不含ＲＰＭＩ／１０％ＦＢＳに一晩播種した。翌日、培地を血清不含ＲＰＭＩと３０分間交換した。いくつかの実験では、抗ＰＲＬＲまたは非特異的対照抗体を、この血清飢餓期間の間、細胞とともにインキュベートした。次いで、ウェルに５０ｎｇ／ｍｌのＰＲＬを３０分間加え、その後、細胞をＰＢＳで１回すすぎ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＮＰ−４０、１ｍＭ Ｎａ３ＯＶ４、５０ｍＭ ＮａＦ、０．２５％デオキシコレートおよびプロテアーゼ阻害剤からなるバッファーに溶解した。試験管を、冷蔵した微量遠心管において１４，０００ｒｐｍで沈降させ、ＢＣＡ試薬を用いて溶解物を定量化した。３０μｇの全細胞溶解物を、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ＳＴＡＴ５Ａ／Ｂ（Ｙ６９４／Ｙ６９９、Ｕｐｓｔａｔｅ）またはＰＲＬＲ（Ｙ５４６／Ｙ６１１、社内）およびＥＣＬに対するホスホ特異的抗体を用いてタンパク質を検出した。膳ＳＴＡＴ５（ＢＤ）またはＰＲＬＲ（Ｚｙｍｅｄ）またはＡＫＴ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）に特異的な抗体を用いて染色することによって同等タンパク質ローディングを調べた。ＰＲＬＲ細胞内リン酸化に対するＰＲＬＲ特異的抗体の効果の代表的なアッセイの結果が図６に示されている。
（実施例９）
マウス抗体のヒト化
この実施例は、マウス抗ＰＲＬＲ抗体のヒト化の手順を示す。
ヒト化ＰＲＬＲ抗体軽鎖および重鎖の遺伝子の設計
マウス抗体ＸＨＡ．０６．９８３、ＸＨＡ．０６．２７５およびＸＨＡ．０６．６４２のＶＬおよびＶＨアミノ酸配列は、図１０に示されている。Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｒｅｓｏｕｒｃｅまたは同様のデータベースを用いて同定されたヒト抗体の配列を用いて、ヒト化抗体のフレームワークを提供する。ヒト化重鎖の配列を選択するためには、マウス重鎖配列がヒト抗体重鎖の配列とアラインされる。各位置で、その位置が、以下に定義される４つのカテゴリーのうちのいずれか１つに入らない限り、ヒト化配列にヒト抗体アミノ酸が選択され、その場合には、マウスアミノ酸が選択される：
（１）位置が、Ｋａｂａｔ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２５、９６１〜９６９頁（１９８０年）によって定義される相補性決定領域（ＣＤＲ）範囲内に入る；
（２）ヒト抗体アミノ酸が、ヒト重鎖にとってその位置で稀であるが、マウスアミノ酸はヒト重鎖にとってその位置でよくあるものである；
（３）位置が、マウス重鎖のアミノ酸配列においてＣＤＲのすぐ隣であるか；
（４）マウス抗体の三次元モデリングが、アミノ酸が抗原結合領域と物理的に引接していることを示唆する。
ヒト化軽鎖の配列を選択するためには、マウス軽鎖配列がヒト抗体軽鎖の配列とアラインされる。各位置で、その位置が、上記カテゴリーのうちの１つに再度入らない限り、ヒト化配列にヒト抗体アミノ酸が選択され、以下に反復される：
（１）ＣＤＲ；
（２）マウスアミノ酸が、ヒト抗体よりも標準的；
（３）ＣＤＲに隣接する；または
（４）結合領域に近い３次元の可能性
重鎖および軽鎖遺伝子の実際のヌクレオチド配列は、以下のように選択される：
（１）上記のように選択されたアミノ酸配列のヌクレオチド配列コード；
（２）これらのコード配列の５’、ヌクレオチド配列はリーダー（シグナル）配列をコードする。これらのリーダー配列は、抗体の典型的なものとして選択された；
（３）コード配列の３’、ヌクレオチド配列は、マウス配列の一部である、マウス軽鎖Ｊ５セグメントおよびマウス重鎖Ｊ２セグメントに続く配列である。これらの配列は、それらがスプライスドナーシグナルを含むので含まれ；
（４）各末端で配列にＸｂａ Ｉ部位があり、これがＸｂａ Ｉ部位で切断することおよびベクターのＸｂａ Ｉ部位にクローニングすることを可能にする。
ヒト化軽鎖および重鎖遺伝子の構築
重鎖を合成するためには、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３８０Ｂ ＤＮＡシンセサイザーを用いて４種のオリゴヌクレオチドを合成する。オリゴヌクレオチドのうち２種は、重鎖の各鎖の一部であり、各オリゴヌクレオチドは、アニーリングが可能となるよう次のものと約２０ヌクレオチド重複している。合わせて、オリゴヌクレオチドは全ヒト化重鎖可変領域および、Ｘｂａ Ｉ部位での切断を可能にする各末端のいくつかの余分のヌクレオチドに及ぶ。オリゴヌクレオチドは、ポリアクリルアミドゲルから精製する。
各オリゴヌクレオチドを、ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用い、標準手順（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９年））によってリン酸化する。リン酸化されたオリゴヌクレオチドをアニーリングするために、４０μｌのＴＡ（３３ｍＭ 酢酸Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．９、６６ｍＭ酢酸カリウム、１０ｍＭ 酢酸マグネシウム）に、各約３．７５μＭの濃度で一緒に懸濁し、９５℃に４分間加熱し、４℃にゆっくりと冷却する。各オリゴヌクレオチドの逆ストランドを合成することによって、オリゴヌクレオチドから完全遺伝子を合成するために、以下の成分を加え、１００μｌの最終容積にする：
１０μｌ アニーリングされたオリゴヌクレオチド
０．１６ｍＭ 各デオキシリボヌクレオチド
０．５ｍＭ ＡＴＰ
０．５ｍＭ ＤＴＴ
１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ
３．５μｇ／ｍｌ Ｔ４ｇ４３タンパク質（ＤＮＡポリメラーゼ）
２５μｇ／ｍｌ Ｔ４ｇ４４／６２タンパク質（ポリメラーゼアクセサリータンパク質）
２５μｇ／ｍｌ ４５タンパク質（ポリメラーゼアクセサリータンパク質）。
混合物を３７℃で３０分間インキュベートする。次いで、１０ｕのＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、３７℃でのインキュベーションを３０分間再開する。反応物を７０℃で１５分間インキュベーションすることによってポリメラーゼおよびリガーゼを不活化した。遺伝子をＸｂａ Ｉで消化するために、反応物に、５０μｌの、２００μｇ／ｍｌのＢＳＡおよび１ｍＭのＤＴＴを含有する２×ＴＡ、４３μｌの水および５μｌ中、５０ｕのＸｂａ Ｉを加える。反応物を３７℃で３時間インキュベートし、次いで、ゲルで精製する。標準法によって、Ｘｂａ Ｉ断片をゲルから精製し、プラスミドｐＵＣ１９のＸｂａ Ｉ部位にクローニングする。プラスミドは、標準技術を用いて精製し、ジデオキシ法を用いて配列決定する。
ヒト化軽鎖および重鎖を発現するようプラスミドを構築することは、挿入されているｐＵＣ１９プラスミドから軽鎖および重鎖Ｘｂａ Ｉ断片を単離することと、次いで、それを、適当な発現ベクターのＸｂａ Ｉ部位に挿入し、これが、適当な宿主細胞にトランスフェクトされた場合に、高レベルの完全重鎖を発現することとによって達成される。
ヒト化抗体の合成および親和性
マウスＳｐ２／０細胞に発現ベクターをトランスフェクトし、プラスミドを組み込む細胞を、標準法によって発現ベクターによって付与される選択マーカーに基づいて選択する。これらの細胞が、ＰＲＬＲと結合する抗体を分泌したことを確認するために、細胞から得た上清を、過剰のＰＲＬＲを発現することがわかっている細胞とともにインキュベートする。洗浄後、細胞を、フルオレセインコンジュゲートヤギ抗ヒト抗体とともにインキュベートし、洗浄し、ＦＡＣＳＣＡＮサイトフルオロメーターで分析した。
ヒト化抗体を産生する細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養する。ヒト化抗体は、細胞上清から、標準技術に従って、プロテインＡのアフィニティーカラム（Ｐｒｏ−Ｃｈｅｍ Ｉｎｃ．、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、ＭＡまたは同等物）を通すことによって、実質的な均一性まで精製する。元のマウス抗体と比較したヒト化抗体の親和性を、当技術分野で公知の技術にしたがって調べる。
（実施例１０）
マウス抗体のＨｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）
この実施例は、Ｈｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）抗体のクローニングおよび発現ならびにこのような抗体の精製および結合活性についての試験を記載する。
Ｈｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）配列のデザイン
抗体可変ドメインのＨｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（商標）は、抗体分子の結合活性を維持しながら免疫原性を低減する方法として、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａによって記載されている［例えば、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら米国特許第５，７６６，８８６号；ＳｔｕｄｎｉｃｋａらＰｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７：８０５〜８１４頁（１９９４年）参照のこと］。この方法によれば、各可変領域アミノ酸に、置換の危険度が割り当てられている。アミノ酸置換は、３つの危険カテゴリーのうちの１つに区別されている：（１）低い危険度の変更とは、抗原結合を混乱させる見込みが最小で、免疫原性を減少させる最大の可能性を有するものであり；（２）中程度の危険度の変更とは、抗原結合またはタンパク質フォールディングに影響を及ぼすより大きな見込みを有するが、さらに免疫原性を減少させるものであり；（３）高い危険度の残基とは、結合にとってまたは抗体構造の維持にとって重要であり、抗原結合またはタンパク質フォールディングが影響を受ける最高の危険を保持するものである。プロリンの三次元構造的役割のために、プロリンでの修飾は、位置が、通常、低い危険度の位置にあっても、一般に、少なくとも中程度の危険度の変更であると考えられる。図１０は、マウス抗体ＸＨＡ．０６．９８３、ＸＨＡ．０６．２７５およびＸＨＡ．０６．６４２の軽鎖および重鎖可変領域アミノ酸配列を示す。
マウス抗体の軽鎖および重鎖の可変領域は、本方法を用いるＨｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）である。低い危険度の位置にある、本方法による修飾の候補であるアミノ酸残基は、マウス可変領域のアミノ酸配列を、ヒト可変領域配列とアラインすることによって同定される。個々のＶＨまたはＶＬ配列またはヒトコンセンサスＶＨまたはＶＬ配列を含む、任意のヒト可変領域を使用できる。低い危険度の位置の任意の数のアミノ酸残基または低い危険度の位置のすべてのアミノ酸残基を変更できる。
同様に、低および中程度の危険度の位置の、すべての本方法による修飾の候補であるアミノ酸残基は、マウス可変領域のアミノ酸配列を、ヒト可変領域配列とアラインすることによって同定される。低および中程度の危険度の位置の任意の数で、または低および中程度の危険度の位置のすべてで、アミノ酸残基を変更できる。
Ｈｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）抗体配列の調製
Ｈｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）重鎖および軽鎖Ｖ領域配列を、シグナル配列（例えば、抗体由来シグナル配列）とともにコードするＤＮＡ断片を、合成的ヌクレオチド合成を用いて構築する。本明細書に記載される軽鎖Ｖ領域アミノ酸配列の各々をコードするＤＮＡを、ヒトκまたはλ軽鎖定常領域を含有するベクターに挿入する。本明細書に記載される重鎖Ｖ領域アミノ酸配列の各々をコードするＤＮＡを、ヒトγ−１，２，３または４重鎖定常領域を含有するベクターに挿入する。これらのベクターのすべてが、一時的な発現または安定な細胞株開発のためのその使用に応じて、プロモーター（例えば、ｈＣＭＶプロモーター）および３’非翻訳領域（例えば、マウスκ軽鎖３’非翻訳領域）を、さらなる調節配列とともに含む（ＵＳ２００６／０１２１６０４）。
前記の、可変領域配列を含有するベクターを用いる、Ｈｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）抗体の発現のために、低い危険度の軽鎖、低＋中程度の危険度の軽鎖、低い危険度の重鎖および低＋中程度の危険度の重鎖の種々の組み合わせから、少なくとも４種の変異体が生じ得る。それら場合には、軽鎖または重鎖のいずれか、または両方において中程度の危険度の変更が含まれない場合に、より少ない変異体が、対応して生じる。
一時的な発現のための発現ベクターの調製
上記の軽鎖または重鎖遺伝子のいずれかを含有するベクターを、一時的なトランスフェクションのために構築する。これらのベクターは、上記のＨｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）抗体配列、プロモーターおよび軽鎖３’非翻訳領域に加え、エプスタイン−バーウイルス核抗原を発現するＨＥＫ２９３細胞における複製のために、エプスタイン−バーウイルスｏｒｉＰを含むことが好ましい。
ＨＥＫ２９３Ｅ細胞におけるＨｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）ＰＲＬＲ抗体の一時的な発現
ＵＳ２００６／０１２１６０４に記載されるように、各々、エプスタイン−バーウイルス由来のｏｒｉＰおよび上記の軽鎖または重鎖遺伝子を含有する別個のベクターを、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞に一時的にトランスフェクトする。一時的にトランスフェクトされた細胞を、最大１０日間インキュベートさせ、その後、上清を回収し、抗体を、プロテインＡクロマトグラフィーを用いて精製する。
永久細胞株開発のための発現ベクターの調製
永久細胞株開発のためのベクターは、上記のＨｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）抗体配列、プロモーターおよび軽鎖３’非翻訳領域に加え、それぞれ、Ｇ４１８またはヒスチジノール耐性トランスフェクタントの選択のためのｎｅｏまたはｈｉｓなどの選択マーカー遺伝子を含む。重鎖コード領域の１コピーと、軽鎖コード領域の１コピーとを含む最終ベクターを構築する。
永久にトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１細胞の開発
軽鎖および重鎖遺伝子の各１コピーを一緒に含有する上記のベクターを、Ｅｘ−Ｃｅｌｌ３０２適応ＣＨＯ−Ｋ１細胞にトランスフェクトする。Ｅｘ−Ｃｅｌｌ３０２培地における懸濁増殖に適応したＣＨＯ−Ｋ１細胞を、通常、直線化ベクターを用い、直線ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いてトランスフェクトする。細胞を、１％ ＦＢＳおよびＧ４１８を補給したＥｘ−Ｃｅｌｌ３０２培地を含む９６ウェルプレートに入れる。９６ウェルプレートにおいてクローンをスクリーニングし、核トランスフェクションから上位約１０％のクローンを、Ｇ４１８を補給したＥｘ−Ｃｅｌｌ３０２培地を含む深いウェルの９６ウェルプレートに移す。
深いウェルの９６ウェルプレートにおいて、１４日間増殖させた培養物のＥｘ−Ｃｅｌｌ３０２培地において産生力試験を実施し、その時点で培養上清を、ＩｇＧの免疫グロブリンＥＬＩＳＡアッセイによって分泌された抗体のレベルについて試験する。
上位クローンを、Ｅｘ−Ｃｅｌｌ３０２培地を含む振盪フラスコに移す。Ｅｘ−Ｃｅｌｌ３０２培地において、これらのクローンを用いて振盪フラスコ試験を実施する。２５ｍｌの培地を含む１２５ｍｌのエルレンマイヤーフラスコにおいて細胞を１４日間増殖させる。インキュベーション期間の最後に、培養培地中の免疫グロブリンポリペプチドのレベルを、ＩｇＧ ＥＬＩＳＡまたはＨＰＬＣによって調べる。２または３の多ユニット転写ベクターを用いる同一細胞株の複数の逐次トランスフェクションによって、好ましくは、３００μｇ／ｍｌ以上への免疫グロブリン産生レベルのさらなる増大を示すクローンおよび細胞株が得られる。
精製
本発明のベクターおよびすべての下部からの免疫グロブリンポリペプチドの精製過程を設計できる（例えば、ＵＳ２００６／０１２１６０４参照のこと）。例えば、当技術分野で周知の方法によれば、終結後、濾過によって細胞を除去する。濾液をプロテインＡカラム（必要に応じて、マルチプルパスで）上に載せる。カラムを洗浄し、次いで、発現され、分泌された免疫グロブリンポリペプチドを、カラムから溶出する。抗体産物の調製のために、ウイルス不活化ステップとして、プロテインＡプールを低ｐＨ（最小３０分間、最大１時間ｐＨ３）に保つ。吸着性陽イオン交換ステップを次に用いて生成物をさらに精製する。吸着性分離カラムからの溶出物をウイルス保持フィルターを通して、あり得るウイルス粒子のさらなる排除を提供する。濾液を、生成物は結合しない陰イオン交換カラムを通すことによってさらに精製する。最後に、生成物を、製剤バッファーに移すことによって精製過程を終了する。保持液を、少なくとも１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度に調整し、安定化剤を加える。
結合活性
組換えＨｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）抗体のＰＲＬＲ結合活性を評価する。振盪フラスコ培養上清から、プロテインＡカラムを通すことによってタンパク質を精製し、続いて、Ａ２８０によって濃度を測定する。その他の実施例に記載されるように結合アッセイを実施する。
（実施例１１）
Ｈｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ抗体
前記のマウス抗体のうち３種は、全般的に、実施例１０に記載されるＨｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）であった。
プロラクチン受容体抗体ＸＨＡ．０６．６４２およびＸＨＡ．０６．２７５のＨｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（商標）
ＸＨＡ．０６．６４２については、重鎖は、１１の低い危険度または１３の低い危険度および中程度の危険度の位置でＨｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）し、軽鎖は、中程度の危険度の位置のすべてが、すでにヒトアミノ酸であったために、低い危険度の位置（１４の変更）でのみＨｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）した。ＸＨＡ．０６．２７５については、重鎖は、７の低い危険度または１１の低い危険度および中程度の危険度の位置のいずれかでＨｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）し、軽鎖は、８の低い危険度または１０の低い危険度および中程度の危険度の位置でＨｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）した。
ＸＨＡ．０６．６４２、ＸＨＡ．０６．２７５およびＸＨＡ．０６．９８３に由来するＨｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）可変領域のアミノ酸配列が、以下に示されている（ＣＤＲには下線が引かれている）。これらの可変領域は、種々の組み合わせで組み立てられた（例えば、配列番号８８および配列番号８９；配列番号８８および配列番号９０；配列番号９１および配列番号９３；配列番号９１および配列番号９４；配列番号９２および配列番号９３；または配列番号９２および配列番号９４）、Ｈｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）抗体ｈｅ．０６．６４２−１、ｈｅ．０６．６４２−２、ｈｅ．０６．２７５−１、ｈｅ．０６．２７５−２、ｈｅ．０６．２７５−３、ｈｅ．０６．２７５−４．ｈｅ．０６．６４２ＬＣが生じた。
ｈｅ．０６．６４２ ＬＣ可変領域低い危険度（配列番号８８）：
Figure 2016130250
 ｈｅ．０６．６４２ ＨＣ可変領域低い危険度（配列番号８９）：
Figure 2016130250
 ｈｅ．０６．６４２ ＨＣ可変領域低い危険度＋中程度の危険度（配列番号９０）：
Figure 2016130250
 ｈｅ．０６．２７５ ＬＣ可変領域低い危険度（配列番号９１）：
Figure 2016130250
 ｈｅ．０６．２７５ ＬＣ可変領域低い危険度＋中程度の危険度（配列番号９２）：
Figure 2016130250
 ｈｅ．０６．２７５ ＨＣ可変領域低い危険度（配列番号９３）：
Figure 2016130250
 ｈｅ．０６．２７５ ＨＣ可変領域低い危険度＋中程度の危険度（配列番号９４）：
Figure 2016130250
 ｈｅ．０６．９８３ ＬＣ可変領域低い危険度（配列番号９５）：
Figure 2016130250
 ｈｅ．０６．９８３ ＬＣ可変領域低い危険度＋中程度の危険度（配列番号９６）：
Figure 2016130250
 ｈｅ．０６．９８３ ＨＣ可変領域低い危険度（配列番号９７）：
Figure 2016130250
 ｈｅ．０６．９８３ ＨＣ可変領域低い危険度＋中程度の危険度（配列番号９８）：
Figure 2016130250
 （実施例１２）
ｈｅ．０６．６４２およびｈｅ．０６．２７５抗体の発現および精製
Ｈｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）ｈｅ．０６．６４２およびｈｅ．０６．２７５軽鎖および重鎖Ｖ領域を、それぞれ、ヒトκおよびγ−１またはγ−２定常領域と融合した。次いで、重鎖および軽鎖遺伝子を、強力なプロモーターおよび効率的な３’非翻訳領域と融合し、エプスタインバーウイルス複製起点を含む一時的な発現ベクターにクローニングした。
抗体を、全般的に、実施例１０に記載される、種々の低い危険度または低い危険度＋中程度の危険度の組み合わせで抗体重鎖および軽鎖配列をコードする別個のプラスミドを用いて、ＨＥＫ２９３細胞において一時的に発現させた。重鎖：軽鎖ＤＮＡの割合は１：２とした。細胞のトランスフェクションは、１：２のＤＮＡ：ＰＥＩの割合のＰＥＩおよび１μｇ／ｍｌのＤＮＡ濃度を用いて実施した。細胞密度は、８ｅ５個細胞／ｍＬとした。ＤＮＡは、標準Ｑｉａｇｅｎキットを用いて調製した。発現培養は、フラスコあたり４００ｍＬの培地を含む２Ｌのフラスコ中、ＩＳ２９３培地（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）＋１％低Ｉｇ ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）で増殖させた。培養条件は、３７℃、５％ＣＯ２および９０〜９５ＲＰＭで撹拌とした。５〜７日培養した後、培養培地を回収し、精製インプットとして清澄化した。
キメラおよびＨｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）が他の前記の抗体の精製を、発現培養上清を直接組換えプロテインＡファストフローカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を通すことによって一段階で達成した。主要ピークの溶出は、０．１ｍＭグリシンｐＨ３．５によってとした。プールされた物質を、ＰＢＳに透析し、３０ｋＤの名目分子量カットオフを用いて遠心濃縮器で濃縮した。最終純度は＞９５％であり、全収率は約６０％であった。最終プールを、Ｅｎｄｏｓａｆｅ ＰＴＳ ＬＡＬユニット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）またはＱＣＬ−１０００ Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ ＬＡＬ Ｅｎｄｐｏｉｎｔ Ａｓｓａｙ（Ｌｏｎｚａ）を用いてエンドトキシンについてアッセイし、結果は、すべての抗体について＜０．０５ＥＵ／ｍｇ（検出限界より低い）であった。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのＳＥＣによって、キメラ抗体ｈｅ．０６．６４２−２の凝集状態は、単量体であると調べられた。
ｃｈＸＨＡ．０６．６４２を、単一のクロマトグラフィーステップと、それに続く、バッファー交換のための透析で＞９５％の純度に単離する。ｃｈＸＨＡ．０６．６４２は、３ｍｇ／ｍＬでＰＢＳに可溶性であり、サイズ排除クロマトグラフィーによって測定されるように、主要な不純物または凝集は検出されない。
フローサイトメトリーによるＨｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ抗ヒトＰＲＬＲ抗体の試験
ＣＨＯ−Ｋ１親およびヒトプロラクチン受容体（ＰＲＬＲ）発現細胞を回収し、遠心分離し、約５×ｌ０６個細胞／ｍｌで、２％ ＦＢＳおよび０．１％アジ化ナトリウムを含有する１×ＰＢＳ（ＦＡＣＳバッファー）に再懸濁した。Ｈｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ抗ヒトＰＲＬＲおよび抗ＫＬＨアイソタイプ対照抗体を、ＦＡＣＳバッファー中２×最終濃度に希釈し、適当なサンプルウェルに加えた（５０ｍｌ／ウェル）。二次抗体および自己蛍光対照については、適当なウェルに５０ｍｌ ＦＡＣＳバッファーを加えた。各サンプルウェルに５０ｍｌの細胞懸濁液を加えた。サンプルを、４℃で１時間インキュベートし、冷ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、１：１００希釈のＰＥコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）を含有するＦＡＣＳバッファーに再懸濁した。４℃で３０分間インキュベートした後、細胞を冷ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、１ｍｇ／ｍｌヨウ化プロピジウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を含有するＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、フローサイトメトリーによって分析した。表７に示されるように、抗ＰＲＬＲ抗体は、ＲＬＲ発現細胞と結合するが、親細胞とは結合しない。
Figure 2016130250
 （実施例１３）
Ｈｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）抗体の親和性
Ｂｉａｃｏｒｅ分析によって調べられた、キメラ化およびＨｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）抗体の親和性。手短には、ＮＨＳ／ＥＤＣを介してプロテインＡ／Ｇ（Ｐｉｅｒｃｅ）で固定化されたＣＭ５センサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）を用いて、約６００ＲＵの抗体をチップ表面に捕獲した。５μｇ／ｍＬ（１８５ｎＭ）で始まり、５×希釈で、０．３ｎＭに段階希釈した５種の濃度のＰＲＬＲ ＥＣＤを、最低濃度から最高濃度まで動力学的滴定注射様式で注射し、１５分の解離データを集めた。実験は二重参照した。すなわち、隣接するフローセル応答を自動的に差し引き、バッファー注射実験に由来する応答を実験データセットから差し引いた。動力学的滴定注射様式にカスタマイズしたＢｉａＥｖａｌソフトウェアを用いて、１：１ラングミュアモデルにフィッティングすることによって、動力学的および導かれたパラメータ（ｋａ、ｋｄおよびＫＤ）を求めた。ヒトおよびカニクイザルＰＲＬＲ ＥＣＤに対する、キメラおよびすべてのＨｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）抗体の両方の親和性測定値は、表９および表１０に要約されている。
Figure 2016130250
Figure 2016130250
 共有結合によって固定化された抗体を用いてラットおよびマウス交差反応を比較するために、ＣＭ４チップを、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｉｎｃ．からの推奨されるプロトコールに従って、標準ＥＤＣ−ＮＨＳアミンカプリング化学によってｈｅ．０６．６４２−２およびｈｅ．０６．２７５−４抗体とカップリングした。ＰＲＬＲ ＥＣＤ注射は、１１１ｎＭで始まり１．３７ｎＭに低下する３倍滴定シリーズの５種の濃度で実施した。再生は、グリシンｐＨ３．０を用いて実施した。ＸＨＡ．０６．６４２およびＸＨＡ．０６．２７５のすべてのＨＥ変異体の親和性は、親キメラ抗体の親和性と極めて類似している。抗体ｈｅ．０６．６４２−２は、ヒト、マウスおよびラットＰＲＬＲと同等の親和性で結合する。カニクイザルＰＲＬＲと、ヒトＰＲＬＲよりも１５倍弱い親和性で結合する。抗体ｈｅ．０６．２７５−４は、カニクイザルＰＲＬＲと、ヒトＰＲＬＲよりも５倍弱い親和性で結合する。抗体ｈｅ．０６．２７５−４は、マウスまたはラットＰＲＬＲと効果的に結合しない。データの概要は表１１に示される。
Figure 2016130250
 （実施例１４）
ＢａＦ／ＰＲＬＲ細胞増殖および生存の阻害ならびにＰＲＬＲ誘導性ＥＲＫ１／２リン酸化の阻害
キメラｍＡｂを、ＢａＦ／ＰＲＬＲ細胞の増殖および生存を阻害するその能力について分析した［図１１］。試験したすべてのキメラが、対応するハイブリドーマクローンと比較してその効力を保持していることがわかった。実際、ＸＨＡ．０６．６４２およびＸＨＡ．０６．２７５は、キメラ化後に、このアッセイにおいて増大した効力を有することがわかった。ヒト乳癌モデルにおけるキメラ抗体のＰＲＬＲシグナル中和能を評価するために、Ｔ４７Ｄ細胞を、１μｇ／ｍｌのｍＡｂで３０分間処理し、その後、ＰＲＬ刺激を施した。同時に、さらなる細胞サンプルを、抗体単独とともにインキュベートし、抗体候補のキメラ化によって得た任意のアゴニズムの可能性を調べた。図１２に見られるように、すべてのキメラ抗体は、Ｔ４７ＤにおいてＰＲＬ誘導性シグナル伝達を遮断するその能力を保持していたが、ｃｈＸＨＡ．０６．９８３のみは、ホスホＰＲＬＲおよびホスホＳｔａｔ５によって表される、ＰＲＬＲシグナル伝達の検出可能な誘導（小さいが再現性のある効果）を示した。
ＥＲＫ１／２リン酸化に対する抗体効果の測定
以下および上記実施例５において記載されるように、選択されたＨｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）抗体を、ＰＲＬＲ誘導性ＥＲＫ１／２リン酸化を阻害するその能力について試験した。
５時間の血清飢餓後、Ｔ４７Ｄ細胞を、マイクロタイタープレートにおいて完全増殖培地に３７℃で２４時間播種した。細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、０．１％ ＢＳＡを含有する血清不含培地で希釈した抗体とともに３７℃で３０分間インキュベートした。抗体の最終出発濃度は、４０μｇ／ｍｌとした。培地を除去し、０．１％ ＢＳＡを含有する血清不含培地で希釈したプロラクチンを、３０ｎｇ／ｍｌの最終濃度に加えた。細胞をプロラクチンとともに３７℃で３０分間インキュベートし、続いて、氷冷ＰＢＳで２回洗浄した。洗浄剤、キレート剤および種々のプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含有する標準溶解バッファーを加えて細胞溶解物を作製した。リン酸化ＥＲＫ１／２（ｐＥＲＫ１／２）のレベルを、標準ＥＬＩＳＡを、ＤＵＯＳＥＴ（登録商標）ＩＣ Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＲＫ１／ＥＲＫ２、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．の使用説明書に従って用いて測定した。代表的なアッセイの結果が図１３に示されている。
（実施例１５）
Ａ．ｍＡｂ候補の、ＰＲＬＲ発現標的細胞に対してＡＤＣＣを媒介する能力
抗ＰＲＬＲ ｍＡｂの目的とされる作用機序の１つは、抗体依存性細胞細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する能力である。候補抗体のＡＤＣＣの能力を評価するために、ＰＲＬＲ発現乳房上皮標的としてＴ４７Ｄ細胞を用いた。図１４に示されるように、２種のキメラ抗ＰＲＬＲ ｍＡｂは、精製ヒトＮＫ細胞によって媒介されるＡＤＣＣを誘導できる。ｃｈＸＨＡ．０６．２７５は、４時間以内に標的細胞の約３０％の特異的溶解を誘導することが実証された。ｃｈＸＨＡ．０６．６４２の生成時間のために、この候補は、元のＡＤＣＣアッセイには含まれなかった。
Ｂ．サイトカインレベルに対する抗ＰＲＬＲ抗体効果
乳癌細胞におけるＰＲＬによるサイトカイン調節の可能性を調べた。この実験では、ＭＣＦ７またはＴ４７Ｄ細胞を、ｃｈＸＨＡ．０６．６４２とともに、または伴わずにＰＲＬに４８時間曝露した。ＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ製のマルチプレックスサンドイッチイムノアッセイを用いて、ＰＲＬによって調節されたサイトカインに対するｃｈＸＨＡ．０６．６４２効果を測定した。ＰＲＬはＴ４７Ｄ細胞からのＶＥＧＦ分泌を誘導すること、およびこの効果は抗体ｃｈＸＨＡ．０６．６４２の添加で完全に抑制されることがわかった。これらの実験では、ＩＬ−ｌβ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ ｐ７０、ＩＦＮ−γまたはＴＮＦ−αの大幅な調節は検出されなかった。これらの結果は、ＰＲＬ／ＰＲＬＲ経路は、乳房腫瘍において血管形成ならびに細胞増殖および生存に寄与し得ること、およびこのＶＥＧＦ調節経路を阻害することは、抗ＰＲＬＲ治療用抗体のもう１つの可能性あるｉｎ ｖｉｖｏ作用機序であり得るということを示唆する。
Ｃ． 抗ＰＲＬＲ ｍＡｂおよび化学療法薬を用いるＩｎ ｖｉｔｒｏ組み合わせ研究
臨床では、可能性ある抗ＰＲＬＲ治療用抗体は、細胞傷害性投薬計画とともに投与してもよいという可能性のために、培養における細胞生存に対するこのような併用療法の効果が調べられた。この最後には、ＢａＦ３／ＰＲＬＲ細胞を、５日間の化学療法薬と同時に、種々の濃度のｃｈＸＨＡ．０６．６４２またはｃｈＸＨＡ．０６．２７５で処理し、その後、細胞数のマーカーとしてＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏを用いて細胞生存を評価した。このアッセイには、床上関連するおよび機構的に多様な細胞傷害性薬剤のアレイを用いた：ドキソルビシン（アントラサイクリンＴｏｐｏ ＩＩ阻害剤）、タキソール（微小管分解防止剤）、フルダラビン（抗代謝物）およびシスプラチン（白金ベースのＤＮＡ架橋剤）。ｃｈＸＨＡ．０６．２７５および、より高い程度にｃｈＸＨＡ．０６．６４２は、ＢａＦ／ＰＲＬＲ細胞においてドキソルビシンと協力して細胞死を増大させることがわかった［図１５参照のこと］。抗ＰＲＬＲ ｍＡｂ ｃｈＸＨＡ．０６．６４２およびｃｈＸＨＡ．０６．２７５とともの、伴わない、化学療法薬ＩＣ５０値において得られた相違は、表１２に要約されている。
Figure 2016130250
 Ｄ． 抗ＰＲＬＲ ｍＡｂの抗ＰＲＬＲ機能活性
抗体を、標的調節および細胞増殖アッセイにおいて評価した。図１６は、Ｔ４７Ｄ細胞におけるＰＲＬ誘導性Ｓｔａｔ５リン酸化に対する２つの濃度のｃｈＸＨＡ．０６．６４２およびＨｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）抗体ｈｅ．０６．６４２−１およびｈｅ．０６．６４２−２の効果を表す。両方とも、完全ｐ−Ｓｔａｔ５シグナルシグナル抑止によって明らかな、強力なアンタゴニスト特性を保持していた。さらに、抗体またはｍＡｂ単独で処理された細胞も、アゴニスト活性を全く示さなかった。同様の結果がｃｈＸＨＡ．０６．２７５編痛いについても見られた。したがって、Ｈｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（商標）は、これらの抗体のアンタゴニストまたはアゴニスト性に全体的に影響を与えなかった。
ＢａＦ／ＰＲＬＲ細胞増殖アッセイを用いて、抗ＰＲＬＲキメラおよびＨｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）抗体の相対ＩＣ５０値を調べた［図１７参照のこと］。これらの実験の結果として、すべてのＨｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）抗体は、ネズミ対応物に対してほぼ等しい効力を有していた。
（実施例１６）
Ｎａｂ−Ｃ１１ラットリンパ腫モデルにおける抗ＰＲＬＲ抗体の抗腫瘍活性の評価
Ｎｂ２−Ｃ１１腫瘍異種移殖片モデルにおいて、ｃｈＸＨＡ．０６．６４２を用いて単回用量ＰＤ研究を実施し、抗ＰＲＬＲ ｍＡｂが腫瘍に到達し、シグナル伝達を遮断できるかどうかを調べた。ラットＰＲＬＲに対する親和性（上記）に基づくこの研究において、抗体ｃｈＸＨＡ．０６．６４２を用いた。モニターしたＰＤマーカーは、ｐ−ＳＴＳＴ５、ＰＲＬＲシグナル伝達の下流媒介物質であり、これはイムノブロットまたはＩＨＣ法を用いて検出できる。Ｎｂ２−Ｃ１１腫瘍異種移殖片におけるベースラインｐ−ＳＴＡＴ５レベルがあまりにも低く適切に検出できなかったので、マウスに外因性ヒツジ（ｏ）ＰＲＬ刺激を与えてベースラインｐ−ＳＴＡＴ５レベルを増大し、このようにして、より適したダイナミックレンジを提供した。
ｐ−ＳＴＡＴの誘導を、ヒツジＰＲＬを注射されたＮｂ２−Ｃｃ１１腫瘍保持動物において、生理食塩水を注射された対照と比較して、ウェスタンおよびＩＨＣ分析によって検出した［図１８ＡおよびＢ参照のこと］。ｐ−ＳＴＡＴ５の阻害は、１０ｍｇ／ｋｇのｃｈＸＨＡ．０６．６４２で４８時間処理され、次いで、ｏＰＲＬ注射されたマウスにおいて観察されたが、ＫＬＨ ＩｇＧ１処理した対照動物では観察されなかった。
ＰＲＬＲシグナル伝達の阻害が、Ｎｂ２−Ｃ１１腫瘍増殖阻害と相関するかどうかを調べるために、複数回用量有効性研究を、ｃｈＸＨＡ．０６．６４２の週１回投与を用いて実施した［図１９ＡおよびＢ参照のこと］。投与は、１０ｍｇ／ｋｇのｃｈＸＨＡ．０６．６４２またはＫＬＨ ＩｇＧ１または生理食塩水対照を用いて細胞移植の４日後に開始した（腫瘍が触知できる前）。ｍＡｂの４週間の腹膜内用量を与えた。モデルは、これらの腫瘍が筋肉を浸潤し、従って、ノギスを用いて正確に測定することが困難であるので、条件付き生存および無増悪時間エンドポイントを用いた。ｃｈＸＨＡ．０６．６４２処理群における腫瘍は、この群の１５匹の動物のうち２匹が腫瘍量に屈した、移植の約１１週後（４回目のｍＡｂ用量後７．５週）まで検出されなかった。生理食塩水およびＫＬＨ ＩｇＧ１対照処理群における生存のメジアンは、細胞移植後２０日であり（ｐ＜０．０００１）、その時点で、腫瘍量のために動物を安楽死させた。ｃｈＸＨＡ．０６．６４２処理群では、動物は体重が増加したのに対し、対照動物は体重を維持するか、または、主に疾患の苦しみのために減少した。
この研究には、第２の有効アームが含まれており、細胞移植の１２日後に定着腫瘍を有する動物が研究に登録された［図２０ＡおよびＢ］。投薬開始時点での平均腫瘍容積は１３５ｍｍ３であった。動物には、１０ｍｇ／ｋｇ、週１回で、ｃｈＸＨＡ．０６．６４２またはＫＬＨ ＩｇＧ１対照抗体のいずれかを用いて、２用量の間、腹膜内に投与した。腫瘍は、２回目の用量の２日後までに完全に退行したと思われた（移植後３週間）。しかし、約２週間後、腫瘍がマウスにおいて再出現し始めた。比較して、ＫＬＨ ＩｇＧ１対照動物は深刻な腫瘍量を有しており、＞６００ｍｍ３の平均容積を有していた。これらの腫瘍が筋肉中に直接増殖したので、平均油症容積は、ノギス測定によって記録されたものよりも大きかった可能性がある。生理食塩水およびＫＬＨ ＩｇＧ１両群における生存のメジアンは、移植２３日後であった（ｐ＝０＜０．０００１）。初期の研究においてと同様、ｃｈＸＨＡ．０６．６４２処理群における動物は、体重増加したのに対し、対照動物は体重を維持するか、または減少した。したがって、ｃｈＸＨＡ．０６．６４２ ｍＡｂは、少ない腫瘍細胞数（移植４日後処理開始）だけでなく、進行性の定着したＮｂ２−Ｃ１１腫瘍も２週間を超えて完全に退行することができた。
Ｎｂ２−Ｃ１１モデルは、抗ＰＲＬＲ ｍＡｂは、ｉｎ ｖｉｖｏで抗原を発現する腫瘍を効率的にターゲッティングし、ＰＬＲによって駆動される腫瘍内のシグナル伝達を阻害し、動物が進行性の定着腫瘍を有する場合であっても、腫瘍量において測定可能な結果を導く能力を有するということを実証した。
（実施例１７）
ＰＤ評価のためのヒト乳癌Ｔ４７Ｄモデル
単回用量ＰＤ研究を、乳癌Ｔ４７Ｄ細胞を用いて実施例１６において試験された抗体ｃｈＸＨＡ．０６．６４２を用いてｉｎ ｖｉｖｏで実施した。ｏＰＲＬの、ＰＲＬＲシグナル伝達を刺激する能力ならびにｃｈＸＨＡ．０６．６４２の、このシグナル伝達をｉｎ
ｖｉｖｏで阻害する能力を評価した、腫瘍を移植された動物には、生理食塩水。ＫＬＨ
ＩｇＧ１対照およびｍＡｂまたはｃｈＸＨＡ．０６．６４２の腹膜内注射を施し、４８時間後、ボーラス注射によって生理食塩水または２０μｇのｏＰＲＬのいずれかを与えた。４０分後、腫瘍組織を回収した。ｏＰＲＬボーラス処理した動物から得た腫瘍において、ｐ−ＳＴＡＴ５の相当な誘導が観察されたが、生理食塩水対照動物では観察されなかったことが、ウェスタンブロッティングによって評価されたが、ＩＨＣ分析によってわずかにより変わりやすい（図２１）。ｐ−ＡＫＴおよびｐ−ＥＲＫのレベルは、ｉｎ ｖｉｖｏでｏＰＲＬ刺激によって増大しなかった。ＫＬＨ ＩｇＧ１対照ではなくｃｈＸＨＡ．０６．６４での処理が、ｏＰＲＬボーラス注射後のｐ−ＳＴＡＴ５誘導の強力な阻害を実証したことは、重大なことである。ＩＨＣ分析によって、概して、この結果が確認された。ウェスタンブロッティングおよびＩＨＣ両方の分析によって、ｐ−ＳＴＡＴ５が、４匹のｃｈＸＨＡ．０６．６４２処理動物うちの４匹において腫瘍において阻害されたことは重大なことである。
（実施例１８）
ＰＲＬＲ発現およびＰＲＬＲ発現の、ＥＲおよびＨｅｒ２−ｎｅｕ発現との相関
正常組織では、ＲＴ−ＰＣＲによって定量化されるＰＲＬＲ発現は、乳房および子宮において最高であり、続いて、腎臓、肝臓、前立腺および卵巣である。ＰＲＬＲ ｍＲＮＡレベルは、気管、脳および肺において最低である（Ｐｉｅｒｃｅ ＳＫら、Ｊ Ｅｎｄｏｃｒ；１７１（１）：Ｒ１〜Ｒ４（２００１年））。
免疫組織化学的（ＩＨＣ）分析は以下のとおり実施できる。癌患者から得た凍結組織サンプルを、最適切断温度（ＯＣＴ）化合物に包埋し、ドライアイスを含むイソペンタン中で瞬間凍結した。Ｌｅｉｃａ３０５０ ＣＭミクロトームを用いて凍結切片を、５μｍの厚さに切断し、ｖｅｃｔａｂｏｕｎｄコーティングしたスライド上で解凍−マウントする。切片を、−２０℃でエタノールを用いて固定し、室温で一晩風乾させる。固定した切片を使用まで−８０℃で保存する。組織切片を回収し、まず、ブロッキングバッファー（ＰＢＳ、５％正常ヤギ血清、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）中、室温で３０分間インキュベートし、次いで、ブロッキングバッファーで希釈した（１μｇ／ｍｌ）、癌関連タンパク質特異的モノクローナル抗体および対照モノクローナル抗体とともに１２０分間インキュベートする。次いで、切片をブロッキングバッファーで３回洗浄する。結合しているモノクローナル抗体を、０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファー、ｐＨ５．５および０．００３％過酸化水素（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｈ１００９）中、ヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）Ｆ（ａｂ’）２−ペルオキシダーゼコンジュゲートおよびペルオキシダーゼ基質ジアミノベンジジン（１ｍｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｄ５６３７）を用いて検出する。染色されたスライドを、ヘマトキシリンで対比染色し、Ｎｉｋｏｎ顕微鏡下で調べた。
癌関連タンパク質（抗原）に対するモノクローナル抗体を用いて、種々の種類の組織から得られた種々の細胞株との反応性を調ベル。種々の確立された細胞株に由来する細胞を、プロテアーゼを用いずに増殖表面から採取し、充填し、ＯＣＴ化合物に包埋する。細胞を凍結し、切片を作製し、次いで、標準ＩＨＣプロトコールを用いて染色する。ＣｅｌｌＡｒｒａｙ（商標）技術は、ＷＯ０１／４３８６９に記載されている。外科的切除によって得られた正常組織（ヒト）を、凍結し、マウントする。Ｌｅｉｃａ３０５０ ＣＭミクロトームを用いて凍結切片を、５μｍの厚さに切断し、ｖｅｃｔａｂｏｕｎｄコーティングしたスライド上で解凍−マウントする。切片を、−２０℃でエタノールを用いて固定し、室温で一晩風乾させる。固定した切片を使用まで−８０℃で保存する。ＰｏｌｙＭＩＣＡ（商標）検出キットを用いて、癌関連抗原特異的モノクローナル抗体の、正常組織との結合を調べる。一次モノクローナル抗体は、１μｇ／ｍｌの最終濃度で用いる。
ＰＲＬＲ発現の出現率およびＥＲおよびＨｅｒ２−ｎｅｕ発現ＥＲおよびＨｅｒ２−ｎｅｕ発現とのその相関を調べるために、免疫組織化学（ＩＨＣ）を用いて１２２の浸潤性乳癌患者サンプルを評価した。全体として、６２／１２２（５０％）のサンプルがＰＲＬＲを発現し、５８／１２２（４７％）がＥＲを発現し、３２／１２２（２６％）がＨｅｒ２−ｎｅｕを発現した。９６（７８％）のサンプルが浸潤性乳管癌からなり、そのうち４８（５０％）がＰＲＬＲを発現した。これらのサンプルの間で、２４／４８（５０％）はまた、ＥＲ＋を発現し、１３／４８（２６％）はまたＨｅｒ２−ｎｅｕを発現した。
本明細書においてかつ／または出願データシートにおいて参照される、上記の米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許出願は、その全文が参照により本明細書に組み込まれる。
前記から、当然のことではあるが、本明細書には、例示の目的上、本発明の具体的な実施形態が記載されているが、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく種々の改変を行うことができる。

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  1. ＰＲＬＲ特異的抗体およびその使用など。
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