JP4554370B2 - 多重遺伝子プラスミドおよび組み換えポリペプチドの発現増加法 - Google Patents

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Description

（関連出願）
本出願は２００２年３月２９日出願の米国仮出願第６０／３６８，５３０号の優先権を主張するものであり、その全文を本明細書に引用して援用する。
（発明の背景）
組み換えポリペプチド組成物は健康関連分野にわたり様々な処置や治療に使われることがますます多くなっている。組み換えポリペプチドは診断法、予防医学におけるツール、および投薬療法による直接救命法としてとして使用されてる。さらに、組み換えポリペプチドは生活の質を高めるために用いられる健康製品および化粧品の広い分野で使用されている。複合ポリペプチド生成物はまた、分析自体の最終生成物、または他の分子の研究または調製のための分析薬として、研究室で日常的に使用されている。この様な使用法により、病気の原因が発見され、隠れた病気の機序が理解されることが多く、診断および／または実行可能な治療の開発につながる。組み換えポリペプチドはまた、農業、食品加工、家畜の飼育から天然および合成副産物および廃棄物の触媒分解まで、様々な産業環境で重要な役割を果たす。
前臨床および臨床評価のためのポリペプチドの生産は何グラムもの量が必要であることが多い（Ｋｅｌｌｅｙ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：２８−３１、１９９６）。この様なポリペプチドを工業的用途で用いる場合は、一般にさらに大量のポリペプチドを必要とし、生産コストが法外に高くなることが多い。アミノ酸配列が既知である場合、単純なポリペプチドを化学的に合成する様々な方法がある。しかしポリペプチドが大きくなると、本来の折り畳み構造から大きくずれていたり、細胞内翻訳後修飾が欠如していたり、生物活性が減少または制限されていたりなど、この生産法には問題がある。この様な理由、また他の理由によって、最も普通の生産法として組み換えＤＮＡ技術が選択され、高い効率および妥当なコストで大量生産を行い得る可能性が最も高い。従って、特に目的とするポリペプチドが最終的に修飾される場合、またはそのポリペプチドの生産が自然では極めて少量である場合、これらの重要なポリペプチドの有用な量の生産は、標準的な組み換えＤＮＡ技術で実現する。
ポリペプチドを発現するために用いられている現在の組み換えＤＮＡ技術には、例えば材料および試薬の莫大な製造コストおよび低い生産収率等の様々な限界がある。その上、生産には時間がかかり、十分なモニタリングが必要であるにも拘わらず制御に限界がある。組み換えポリペプチドの生産に含まれるこれらの問題、および／またはその他の問題は、組み換えポリペプチド生産の現在の方法の限界とあいまって、コスト、資源、健康および生命そのものをかなり犠牲にしていることとなる。従って、組み換えポリペプチドの無数の用途と、組み換えポリペプチド生産のための現在の技術の限界を考えると、タンパク質生産を最大にし、究極的には時間、費用および他の資源を節約する組み換え遺伝子発現法を採用することが最も重要である。従って、組み換えポリペプチドの生産を増やし、最大かつ最適化する方法が必要である。
プロモーターの強度、翻訳開始領域の周辺配列、３’非翻訳領域のポリアデニル化および転写の終結の効率、宿主染色体中に無秩序に組み込まれた組み換え遺伝子の挿入部位、および発現中の遺伝子の組み込まれたコピー数等を含むいくつかの因子が、動物細胞中での組み換え発現に影響し得る。これらの因子中で、プロモーターの選択および３’非翻訳領域が発現レベルに影響する。高い発現レベルを促すため、ウイルスプロモーターが用いられることが多い。コザックボックス（Ｋｏｚａｋ ｂｏｘ）としても知られる最適翻訳開始配列ＡＣＣＡＴＧＧがより効率的なポリペプチド合成、すなわちより高い発現レベルを促進することができる。
ポリペプチドの発現を増加させるために用いられる戦略の一つでは、所望の遺伝子の多重組み込みコピーを含む発現ベクターが用いられる。この様な方法で形質移入宿主細胞中で遺伝子量を効果的に増加させることで、哺乳動物細胞中での組み換えポリペプチド発現の改善が達成される。遺伝子コピー数を増加させることは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはグルタミンシンセターゼ（ＧＳ）等の酵素が欠失した細胞株と、これらの酵素をコードする遺伝子とを含む発現ベクターの組み合わせ、およびＤＨＦＲを阻害するメトトラキサン（ＭＴＸ）、ＧＳを阻害するメチオニンスルフォキサミン（ＭＳＸ）等の試薬を用いる遺伝子増幅で行われる。強いプロモーターの制御下で組み換え遺伝子を含む発現ベクターとＤＨＦＲまたはＧＲをコードする遺伝子とを使用し、ＤＨＦＲ＋またはＧＲ＋形質移入細胞をまず得てから、ＭＴＸまたはＭＳＸの濃度を徐々に上げて形質移入細胞を生育させることで遺伝子増幅を行う。
遺伝子増幅でより発現レベルを高くすることができるが、この方法には欠点もある。まず、選択した酵素をコードする遺伝子に突然変異のある細胞株が一般的に遺伝子増幅に用いられる。ＤＨＦＲの場合は、二つの染色体コピーが突然変異し、その結果細胞株は野生株より弱くなる。この結果、繁殖性のある安定したより強い細胞に比べ、対象とするタンパク質の見掛けの分泌量が少ない細胞が得られる。ＧＳの場合は、リンパ球株ＮＳＯが通常ＧＳ−であるが、一般に用いられる他の細胞株であるＣＨＯ−Ｋ１はＧＳ＋であり、ＭＳＸ耐性形質移入細胞を直接選択する必要がある。遺伝子増幅の現行法の第二の問題は、指定の圧力を加ずに増殖させると不安定な細胞株となるため、指定の圧力を維持する必要があることである。最後に、遺伝子増幅の現行法はきわめて時間がかかり、資源およびコストの配分をバランスよくするには数ヶ月も必要である。ポリペプチドの発現の増加に用いられる他の戦略は、それぞれ所望の遺伝子の単一コピーを含むが、ｇｐｔ、ｎｅｏおよびｈｉｓ等の異なった選択マーカーを有する発現ベクターの逐次移入である。第一回の形質移入の遺伝子コピー数が１、第二回の形質移入の遺伝子コピー数が２、以下順次増加する。この手法は発現レベルを高くすることができるが、三回の逐次形質移入後でも遺伝子コピー数の増加が僅かであることが欠点である。
従って、この様な問題すべてを考えると、突然変異細胞株および遺伝子増幅の現行法に依存しない方法に従って遺伝子コピー数を増加させることによる、新規な方法が切望される。
上記の全ての理由から、現行技術を改良して効率を最高にし、生産時間、資源およびコストを最小限に抑え、高い見掛け濃度で目的とするポリペプチドを安定な細胞株から発現させることが必要である。さらに、価値があり有用なポリペプチドを効率よく高濃度で生産し分泌し得るベクターを染色体中に取り込むか、および／または組み込む安定な発現ベクターおよび細胞株が必要である。
（発明の要旨）
本発明は組み換えポリペプチドの発現を増加させる新規な方法と材料を提供する。第一の実施形態において、本発明の目的は宿主細胞由来の組み換えポリペプチドの発現を効率的に増加させる新規方法であって、目的とする価値のある高い濃度のタンパク質およびポリペプチドを生産する必要性を満足させることである。この様な方法の利点には時間、資源および／または生産コストの最小化が含まれる。他の実施形態では、本発明の目的は例えば、少なくとも１個の選択マーカー遺伝子で区切られた目的とする組み換えポリペプチドをコードする組み換えＤＮＡ配列の多重コピーを含む新規ベクターと、この様なベクターコンストラクトを内蔵する細胞株であって、高濃度の価値のあるおよび／または有用なポリペプチド生成物を効率的に生産し得るベクターと宿主細胞に対する必要性を満足させることである。
本発明によれば、転写ユニットのコピー数、すなわち目的とする組み換えポリペプチドをコードする宿主細胞中に導入された組み換えＤＮＡ配列が、発現する転写ユニットのコピーがより多くなる様に増加する。このことは転写ユニットの少なくとも２個のコピーを同じベクター上に取り込むことで達成される。ある実施形態では、各転写ユニットコピーはそれ自体のプロモーターと３’非翻訳領域の制御下に置かれる。転写ユニット導入量と発現の増加はこの様なベクターによる形質移入で達成される。また別なベクターによるさらなる形質転換または形質移入、例えば個々に少なくとも２個の転写ユニットコピーを含むベクターによる第二および第三の逐次形質転換または形質移入は、単一転写ユニットのみを有するベクターと比較して転写ユニット導入量と発現を更に増加させ得る。各逐次形質転換または形質移入のための追加ベクターが異なった選択マーカーを含むことが好ましい。
同じベクター上に２個の転写ユニットコピーを含む直線状ＤＮＡ配列を宿主細胞染色体へ組み込むことは、遺伝子導入量、従って発現を増加し得るが、相同組み換えによる不安定をもたらすことにもなる。本発明によれば、この様な潜在的な不安定性、特に細胞株開発の初期段階での不安定性を、選択マーカーをコードする遺伝子が、目的とする組み換えポリペプチドをコードする少なくとも２個の類似の転写ユニットの間に位置する様に、ベクターを設計で克服することができる。ベクターが（例えば形質移入または形質転換前にユニーク制限酵素部位を経由して）選択マーカー遺伝子が少なくとも２個、８個以下の転写ユニットの間に位置する様に直線化され、個々の転写ユニットが目的とするポリペプチドをコードする様に直線化されていることが好ましい。例えば、ベクターは［（転写ユニット）ｘ−選択マーカー遺伝子−（転写ユニット）ｘ］（ｘは１〜４）である。この様なベクターを用いると、例えば２個または類似の転写ユニットＤＮＡ配列の間の任意の相同組み換えは、選択試薬する抵抗をコードする遺伝子を潜在的に削除または不活性化する。従って、この様なベクターで形質移入または形質転換され、相同組み換えを行った細胞は、選択肢薬の存在下で生育できないと考えられる。少なくとも二つの選択圧力を加えることは、この様な新規ベクター由来の転写ユニットの維持を助長するものである。
本発明のある実施形態にはベクター設計、構築および使用が含まれ、そのベクターは発現される目的とする組み換えポリペプチドをコードする少なくとも２個のコピー哺乳動物発現ベクターであることが好ましく、個々のコピーはプロモーターと３’非翻訳の制御下にあり、ベクターがユニーク制限酵素部位で消化により直線化されている場合、少なくとも２個の転写ユニットのコピーが直線配列中の選択マーカー遺伝子で分離されている。本発明のこの実施形態によれば、設計または構成には選択マーカー遺伝子を少なくとも２個の転写ユニット、例えば［（転写ユニット）−選択マーカー遺伝子−（転写ユニット）］の間に位置することが含まれ、その結果宿主細胞染色体中に組み込まれた転写ユニット間の選択マーカー遺伝子自身の位置により線状ベクターＤＮＡが安定化される。対照的に、転写ユニットの少なくとも２個のコピー間の相同組み換えにより、少なくとも１個の転写ユニットと選択マーカー遺伝子が失われる結果になる。さらに別な利点として、本発明のこの実施形態は多重エンハンサーを有するベクターを生じさせ得る。一例として、多重エンハンサーは転写ユニット発現を制御するプロモーター由来の数個と、選択マーカー遺伝子を制御するプロモーター由来の１個を含み得る。エンハンサーは双方向に一定距離で作用し得ることが知られているので、このベクターの設計と構築は転写を増加させ、その結果目的とするポリペプチドの見掛けの濃度を増加させる。
本発明の他の実施形態は、例えば哺乳動物形質移入体の選択用のｇｙｐ、ｎｅｏまたはｈｉｓを含む選択マーカー遺伝子を含む、少なくとも１個の転写ユニット（好ましくは２個かつ８個以下の間）を含むベクターの使用を提供する。これらの追加選択マーカーの使用により、形質移入体が転写ユニットの多重コピーと共に得られ、本発明のベクターを用いていくつかの逐次形質移入を行うことにより形質移入体が更に増加する。
形質移入体の選択用のｇｐｔ、ｎｅｏおよびｈｉｓ等の選択マーカーに加え、本明細書に記載のベクター構成をＤＨＦＲまたはＧＳ等の遺伝子をコードする増幅可能マーカー遺伝子と共に使用し得る。この様なベクターの増幅は、転写ユニットがＤＨＦＲまたはＧＳマーカー遺伝子で分離される様に宿主細胞染色体中に組み込まれたベクターＤＮＡを有する形質移入体を生成し得る。
本発明は、例えば２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個等々の目的とする組み換えポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を有する転写ユニットのコピーを含む多重転写ユニットベクターを提供する。少なくとも２個、８個以下の転写ユニットであることが好ましい。この様なベクターは、転写ユニットの間、またはそれらを分離する少なくとも１個の選択マーカーで構成され、宿主細胞染色体中に安定に組み込まれ、相同組み換えを減少、回避または無効にすることができる。それぞれ選択マーカー遺伝子で区切られた転写ユニットの多重コピーを有し、転写ユニットがポリペプチドをコードするベクターが本発明で提供される。多重転写ユニットコピーの並べ換えはすべて、本発明により当業者が本明細書の開示から理解し得ると予想される。
本発明の一つの実施形態には、２量体またはより高次の多量体タンパク質の転写ユニットを含むベクターが含まれる。本発明によれば、それぞれプロモーターおよび３’非翻訳領域の制御下にある多量体タンパク質の異なったサブユニットをコードする転写ユニットは選択マーカー遺伝子で分離されている。少なくとも２個の別個の遺伝子（例えば免疫グロブリン軽鎖および重鎖、または免疫グロブリン軽鎖および重鎖の少なくとも可変領域）でコードされる多量体タンパク質では、所望のサブユニットをコードする転写ユニットは最初に内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）と結合するか、あるいは結合せず、この２量体（または多量体）転写ユニットをプロモーターおよび３’非翻訳領域の制御下に置くことができる。これらの転写ユニットは次いで構成ベクターに組み込まれ、少なくとも２個の２量体シストロンユニットは選択マーカーで分離されている。例えば、ベクターは［（転写ユニット−ＩＲＥＳ−転写ユニット）−選択マーカー遺伝子−（転写ユニット−ＩＲＥＳ−転写ユニット）］を有する。また、例えばベクターは［（転写ユニット−転写ユニット）−選択マーカー遺伝子−（転写ユニット−転写ユニット）］を有することもできる。ある実施形態では、個々の転写ユニットコピーはそれ自体のピロモーター（Ｐ）と３’非翻訳領域（３’ＵＴ）の制御下に置かれる。例えばベクターは［（Ｐ−転写ユニット−３’ＵＴ）−（ＣＰ−転写ユニット−３’ＵＴ）−電卓マーカー遺伝子−（Ｐ−転写ユニット−３’ＵＴ）−（ＣＰ−転写ユニット−３’ＵＴ）］を有することができる。
本発明は以下の工程を有する組み換えポリペプチドの製造法および／または転写ユニットの発現増加法を提供する：
（ａ）少なくとも１個の選択マーカー遺伝子で区切られた、転写ユニットの多重コピーを含むベクターで形質転換または形質移入された細胞であって、転写ユニットはポリペプチドをコードする細胞を選択条件下で培養する工程；および
（ｂ）転写ユニットの多重コピーからポリペプチドを発現する工程。
本発明によれば、ベクター上の転写ユニットのコピー数は少なくとも２個であるが３個、４個、５個、６個、７個、８個等々でも有り得る。転写ユニットのコピー数は任意のベクター上で少なくとも２個であり、８以下であることが好ましい。選択マーカー遺伝子で区切られた少なくとも２個の転写ユニットを含む個々のベクターを宿主細胞中に導入することができる。それぞれが異なった選択マーカー遺伝子を有することが好ましい別なベクターを逐次宿主細胞に導入して遺伝子導入量と発現を更に増加させることができる。好ましい宿主細胞にはＣＨＯ−Ｋ１細胞等のチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が含まれる。本発明の方法はまた、例えば免疫グロブリン等の多量体タンパク質生成物を含む目的とする任意のポリペプチド生成物をコードする転写ユニットを提供する。
本発明は、少なくとも選択マーカーで区切られた転写ユニットの多重コピーにより発現ベクターまたはクローニングベクターを構築する工程を含むベクターまたはそのセグメントの構築法を提供する。本発明によれば、転写ユニットの多重コピー数は少なくとも２個である。単一ベクター上の転写ユニットの多重コピー数が８以下であることが好ましい。
本発明は少なくとも１個の選択マーカー遺伝子で分離された、目的とする組み換え哺乳類ポリペプチドをコードする転写ユニットの多重コピーを有するベクターを提供する。本発明によれば、ベクター上または形質転換／形質移入された転写ユニットの多重コピー数は少なくとも２個である。転写ユニットの多重コピー数は８個以下であることが好ましい。多重ベクターを用い、多重形質転換または形質移入を行って目的とするポリペプチドを発現するクローンまたは細胞株を作成することができる。本明細書に記載するベクターの例には例えばＢＰＩフラグメント、ＢＰＩアナログ、ＢＰＩ突然変異体またはＢＰＩ由来のペプチドト等のＢＰＩタンパク質生成物をコードする転写ユニットが含まれる。本明細書に記載する発現ベクターの例にはγＢＰＩ２１をコードする転写ユニットが含まれる。本発明はさらに、抗体の軽鎖および重鎖、または少なくとも軽鎖および重鎖の可変領域をコードする転写ユニットを有するベクターを含む、多量体タンパク質の異なったサブユニットをコードする転写ユニットを有するベクターを提供する。
本発明によれば、ベクターはｇｐｔ、ｎｅｏまたはｈｉｓ遺伝子を含むが、変わることもある選択マーカー遺伝子を含む。本発明によるベクターは正方向反復配向および／または逆方向反復配向の転写ユニットの多重コピーも含み得る。さらにまた、本発明は同一または類似である転写ユニットの多重コピーを含むベクターを提供する。この様なコピーは例えば２５％相同の相同コピーで有り得る。従って、コピーは２５％から１００％の間で、８０％、８１％、８２％、８２％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％を含む、好ましくは少なくとも８０％で同一または類似である。
本発明はさらに、本開示の範囲と主旨の範囲内で、または本開示および／または技術により当業者が理解または予想する様に、全てのベクターの変種またはそのセグメントを具象化する。
本発明はベクター［（転写ユニット）ｘ−選択マーカー遺伝子−（転写ユニット）ｘ］またはそのセグメントを含む宿主細胞を提供する。ここでｘ＝１〜４である。本発明によれば、宿主細胞には真核宿主細胞型の任意のもの、またはその全てが含まれる。例えば、真核宿主細胞型は任意の哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ＤＨＦＲ＋ＣＨＯ−Ｋ１細胞株、ＤＨＦＲ−ＤＵＫＸ−Ｂ１１（ＤＸＢ１１）細胞株またはＤＧ−４４細胞株を含み得る。真核宿主細胞型には植物、昆虫および酵母細胞も含まれる。さらに、本発明は本発明開示の範囲と主旨の範囲内、または当業者が本開示および／または技術で理解または予測し得る様な、ベクターまたはそのフラグメントを有する任意の安定な細胞株を提供する。この様な細胞を任意の手段で繁殖することが可能で、任意の生育または指示培地または維持溶液により付着または懸濁状態にある細胞が含まれる。
上記に議論した問題を含む当技術における現在の問題および限界を勘案して、当技術に対して本発明は多くの利点を有するが、それらは組み換えポリペプチド生産の増加、生産効率の増加、発現するポリペプチドの量に対する優れた制御および／または調節、細胞株の安定性の増加、および／または材料、試薬および／または資源コストの減少などである。例えば、本発明はベクター構築法を提供するが、この様なベクターを直線化した場合、目的とするポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む転写ユニットを少なくとも１個の選択マーカーで分離することにより、転写ユニットの多重コピーの相同組み換えを最小にするかそれを避けることができる。他の例として、本発明は多重転写ユニットコンストラクトによる逐次形質移入により、発現をさらに増加させる方法を提供する。これにより、目的とするポリペプチドのレベルが実質的に増加した生産を可能にするクローンおよび／または細胞株が得られ一方、それらのクローンおよび細胞株は生育培地中で生存率と安定性を維持している。
様々な変更が当業者により示唆されると思われるが、本発明は本明細書で保証される特許の範囲内のあらゆる実施形態を予想するものであり、合理的で正当であるこの様な変更の全ては本技術に対する本発明の寄与の範囲である。
（発明の詳細な説明）
本発明は安定な細胞株からの発現を含む組み換えポリペプチドの発現の増加法を含む新規材料および方法を提供する。選択マーカー遺伝子で分離した、目的とするポリペプチドをコードする組み換えＤＮＡ配列を含む転写ユニットの多重コピーを有する新規発現ベクターが提供される。これらのベクターコンストラクトを内包する細胞株は、転写ユニットでコードされるポリペプチドの発現も可能である。免疫グロブリン等の多量体ポリペプチドを含む目的の任意のポリペプチドの発現の増加法が提供される。本明細書に記載されるポリペプチドの例は、γＢＰＩ２１等のＢＰＩタンパク質生成物である。他のポリペプチドの例は免疫グロブリン、または少なくとも免疫グロブリンの軽鎖および重鎖の可変領域を含むポリペプチドである。本明細書に記載される様に、少なくとも２個の組み換え遺伝子のコピーが発現ベクター中に挿入され、遺伝子は形質転換細胞または形質移入細胞、好ましくは哺乳動物形質転換細胞または形質移入細胞を調製および／または選択し、相同組み換えを最少にするため、または避けるため、ｇｐｔ、ｎｅｏまたはｈｉｓ等の様々な選択マーカー遺伝子で分離される。その結果、これらのベクターコンストラクトに内包される組み換えポリペプチド生成物の見掛けの収率の増加が達成される。
本発明の方法を用いて発現するポリペプチドの例には、目的とする任意のポリペプチドが含まれ得る。本発明の組み換えポリペプチドは公知のまたは予想される任意の配列を含み得る。目的とするポリペプチドを、開示されたベクターコンストラクトを有する哺乳動物細胞等の宿主細胞の形質転換または形質移入を含む本明細書で開示される方法の使用による任意の手段で生産し得る。ポリペプチド生産を、細胞内区画中での蓄積または細胞から培養上澄中への分泌を含む任意の方法で行うことができる。培養試験管、フラスコ、ローラーボトル、振盪フラスコまたは培養器等を含むがそれに限定されない、公知のまたは予想される任意の方法で、本発明の宿主細胞を増殖または培養することができる。ポリペプチド生成物の単離および／または精製を公知のまたは予想される任意の方法で行い得る。
本発明によれば、目的とするポリペプチドをコードする転写ユニットの多重コピーを含むベクターが設計される。コードされたポリペプチド（複数）を発現する細胞株を調製するため、二重転写ユニットベクターが構築され、使用される。これらの二重転写ユニットベクターの２本が細胞株を生産するための細胞の逐次形質導入に用いられるが、このユニットベクターは逐次形質移入の結果、１本の２重転写ユニットベクター、または２本の１重転写ユニットベクターを含む細胞株の約２倍のレベルのポリペプチドを生産する。この生産性の増加は比生産性の２倍の増加の結果であると思われ、単に細胞密度の増加によるものではない。この結果は、非増幅発現系において少なくとも２つの異なった戦略を採用する、驚異的な効率を有する本発明の方法により、転写ユニット注入量の増加で発現が増加し得ることを示している。まず第一に、選択マーカー遺伝子を目的とする遺伝子をコードする転写ユニットのコピー間に位置させることにより、相同組み換えの問題を回避し、遺伝子の多重コピーを発現する生産性の高い安定な細胞株を開発することができる。第二に、本発明の方法で細胞に逐次形質移入することにより、転写ユニットの多重組み込みコピー数を段階的に増加させ、発現レベルを増加することができる。本発明は目的とする任意のポリペプチドをコードする任意の転写ユニットの使用を予想している。
従って、本発明は同一または類似である転写ユニットの多重コピーを含むベクターを提供する。本発明野ある実施形態には、２量体または高次多量体タンパク質のサブユニットをコードする転写ユニットを含むベクターが含まれる。この様なコピーは、例えば少なくとも２５％相同の相同コピーでも良い。従って、コピーは２５％〜１００％の間の任意にの比率で同一または類似であり得る。配列同一パーセントは、２つのポリペプチドのアミノ酸位置の類似性を比較するために通常用いられる標準法で決定することができる。ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡ等のコンピュータープログラムを用いて、２つのポリペプチドがそれぞれのアミノ酸の最適マッチング（１本または２本の配列の全長に沿って、または１本または２本の配列の所定の部分に沿って）で並べられる。プログラムにはデフォルトオープニングペナルティおよびデフォルトギャップペナルティが備えられ、ＰＡＭ２５０等のスコアリングマトリックス［デイホッフ（Ｄａｙｈｏｆ）ら、アトラスオフプロテインセーケンスアンドストラクチャー（Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）、第５巻、付録３、１９７８年］をコンピュータープログラムと組み合わせて使用することができる。例えば、同一パーセンテージを１００を掛けた一致数として計算し、次いで一致した鎖内のより長い配列の合計の長さでと、２本の配列を並べるためにより長い配列に導入されたギャップの数で割る。
転写ユニットとはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列のことであり、プロモーターおよび／または３’非翻訳領域を含み得る。
ＤＮＡ配列、または組み換えＤＮＡ配列とは、分子生物工学および／またはクローニング技術を用いて導かれた任意の天然または合成ＤＮＡ配列のことであり、ｃＤＮＡ配列、ゲノム配列、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅ＤＮＡ配列の他、当業者に公知の技術を用いて得られた任意の化学的に合成されたＤＮＡ配列を含むが、それに限定されない。本発明で用いる組み換えＤＮＡ配列を任意の原核ＤＮＡ配列または真核ＤＮＡ配列を含む天然または自然源、哺乳動物、植物、酵母、バクテリアまたはウイル等の起原、または化学的に合成したオリゴヌクレオチド等の任意の合成または非天然起から誘導し得る。
ポリペプチドとは、ペプチド結合で相互に結合したアミノ酸のポリマーを含む分子のことである。ポリペプチドには、タンパク質（例えば５０以上のアミノ酸）およびペプチド（例えば２〜４９のアミノ酸）を含む任意の長さのポリペプチドが含まれる［アルバーツ（Ａｌｂｅｒｔｓ）ら、モレキュラーバイオロジーオフセルズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｃｅｌｌｓ）、第３版、１９９４年］。ポリペプチドには、例えば酵素タンパクまたはペプチド等の生物活性ポリペプチド（例えばプロテアーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ）、レセプタータンパク質またはペプチド、輸送タンパク質またはペプチド、バクテリアおよび／または内毒素結合タンパク質またはペプチド、構造タンパク質またはペプチド、免疫タンパク質またはペプチド（例えば抗体またはその抗原結合部位）、サイトカインタンパク質またはペプチド、トキシン、化学療法剤、抗生物質、ホルモン、成長因子、ワクチン等を含む任意の活性または生物活性を有するタンパク質またはペプチドが含まれる。例えば、ポリペプチドには全長タンパク質、フラグメント、アナログ、タンパク質の改変体または誘導体、融合タンパク質、多量体タンパク質またはそのサブユニットが含まれるがそれに限定されない。ペプチドには抗菌性ペプチド、殺虫性ペプチド、ペプチドホルモン、神経ペプチド、毒素等が含まれるが、それに限定されない。
生物活性ポリペプチドとは、生理学的な目的で生体内で本来製造されるタンパク質またはペプチドの活性に似た生物活性を示すポリペプチド生成物の他、余分なタンパク質をコードするＤＮＡ配列の開裂、折り畳み、組み合わせ（インスリンのＡおよびＢ鎖、および免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の場合）、翻訳後修飾等によりこの様なタンパク質またはペプチドに加工される中間体のことである。
ベクターとはポリペプチド配列を運ぶための試薬またはビヒクル（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）のことである。従って、ベクターはこの様なポリペプチド配列を含む（即ち含む）といわれている。
クローニングベクターとは、プラスミド、ファージミドまたはファージを含むがそれに限定されない、自発的に複製し得る試薬またはビヒクルをのことであり、ＤＮＡ分子を含むポリペプチドヌクレオチド分子を含み、それにＤＮＡセグメントを含む少なくとも１個の別なポリヌクレオチドセグメントが付加している。
発現ベクターとは、その中に少なくとも１個の転写および翻訳制御配列が組み込まれたベクターのことである。
プロモーターとは、ＲＮＡポリメラーゼおよび／または任意の関連する因子が付着し、そこで転写が開始されるＤＮＡ分子上の部位のことである。プロモータにはＳＶ４０、ＨＳＶ、ウシ成長ホルモン、チミンキナーゼ、ＭＰＳＶ、マウスベータグロブリン、ヒトＥＦ１、ＭＳＶ−ＬＴＲ、ＲＳＶ、ＭＭＴＶ−ＬＴＲ、ＣＭＶ、ＭＬＶ、チャイニーズハムスター延長因子、マウスアルバートソンＬＴＲ、ヒトＣ−ｆｏｓプロモーター由来等を含む公知のものが含まれる。酵母、昆虫、植物および／またはバクテリアの発現も公知である。
エンハンサーとは遺伝子または遺伝子配列の発現を増加し得る制御要素のことである。
選択マーカーまた選択可能マーカーとは、選ばれた化合物または条件の存在、または不在で、細胞または器官の成長を促進または阻害し得る表現型をコードする遺伝子または任意の遺伝子材料のことである。選択マーカー遺伝子にはｇｐｔ、ｒｅｓまたはｈｉｓ遺伝子、またはアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、チミンキナーゼ（ＴＫ）、アデニンホスフォリボシルトランスフェラーゼ（ＡＰＲＴ）の遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、またはピューロマイシン耐性遺伝子を含み得る。
形質転換または形質移入とは、クローニングまたは発現ベクターを含むベクター等をの遺伝子材料を、遺伝子型を変化させ受容体細胞中で表現型を変化させる受容体宿主細胞中へ導入することである。形質転換または形質移入に成功した宿主細胞または宿主細胞から得られるコロニーは形質転換した、または形質移入されたと言われるか、または形質転換体または形質移入体と呼ばれる。
本発明は具体的には、宿主細胞中で機能し選択可能である２個および４個の転写ユニット発現を含むベクターの例の開発を行う。
ＢＰＩタンパク質生成物とγＢＰＩ２１をコードする２個のコピー含む一連のベクターの例が構築されたが、各ベクターはヒト重鎖エンハンサーと、形質転換体または形質移入体を選択するためのｇｐｔまたはｎｅｏ遺伝子のいずれか有する０、１または２個のコピーを有するｈＣＭＶプロモーターとマウス軽鎖３’非翻訳領域の制御下にある。ベクターはまた、ベクター上のγＢＰＩ２１の配向が異なる。これらのベクターの最初の試験で、ｇｐｔベクターｐＩＮＧ１７３７により好ましい構成が発現することが示された（図２）。このベクターとそのｎｅｏバージョンｐＩＮＧ１７３３がフルスケールの細胞株の開発に選ばれた。ｐＩＮＧ１７３７およびｐＩＮＧ１７３３中のγＢＰＩ２１遺伝子、フランキングプロモータおよび３’非翻訳領域配列の２個のコピーの存在が、遺伝子発現量を増加させてより高い発現を促進すると考えられる。しかしながら、この構成の潜在的な悪影響の一つは、二つの相同γＢＰＩ２１とフランキング配列の間の組み換えの結果としての組み込まれたＤＮＡの不安定性であり、γＢＰＩ２１コピーの一つが除去され発現が低下する。組み換えの機会を減少するため、本発明ではこれらのベクターがユニークＸｂａＩ部位で直線化された場合、γＢＰＩ２１遺伝子が宿主細胞染色体中に組み込まれると選択マーカー遺伝子で分離される様に設計された。この構成は、選択剤の存在で形質移入体が維持される限り、染色体中で最大の潜在的安定性を有すると考えられるが、その理由はγＢＰＩ２１のコピー間の相同組み換えが選択マーカー遺伝子も除去するからである。二つの遺伝子の発現とクローン安定性の硬化を評価するため、γＢＰＩ２１発現について双方の構成を以下の例に述べる細胞株開発で試験した。
殺菌性／透過性増加タンパク質（ＢＰＩ）は哺乳動物の多形核白血球（ＰＭＮまたは好中球）から単離されたタンパク質であり、進入する微生物に対する防御に必須の血液細胞である。ヒトＢＰＩが、イオン交換クロマトグラフィーと組み合わせた酸抽出［エルスバッハ（Ｅｌｓｂａｃｈ）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５４：１１０００（１９７９）］またはＥ．ｃｏｌｉアフィニティークロマトグラフィー［ワイス（Ｗｅｉｓｓ）ら、Ｂｌｏｏｄ、６９：６５２（１９８７）］でＰＭＮから単離されている。この様にして得られたＢＰＩは本明細書では天然ＢＰＩと呼び、グラム陰性バクテリアに対する殺菌活性を有することがエルスバッハとワイスにより最初に示された。ヒトＢＰＩの分子量は約５５、０００ダルトン（５５ｋＤ）である。全ヒトＢＰＩタンパク質のアミノ酸配列と、そのタンパク質をコードするＤＮＡの核酸配列が図１に報告されている（グレー（Ｇｒａｙ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６４：９５０５（１９８９））。
ＢＰＩタンパク質生成物は多様な有用な活性を持っている。ＢＰＩタンパク質生成物には自然の組み換えで生成したＢＰＩタンパク質、ＢＰＩタンパク質の天然、合成および組み換え生物活性ペプチドフラグメント；ハイブリッド融合タンパク質およびモノマーの多量体を含むＢＰＩタンパク質またはそのフラグメントの生物活性ポリペプチド改変体；システイン置換アナログを含むＢＰＩタンパク質の生物活性ポリペプチドアナログまたはフラグメントまたはその改変体；およびＢＰＩ由来のペプチドが含まれる。その全文が本明細書にふくまれ、参照される米国特許第５、１９８、５４１号および第５、６４１、８７４号は、γＢＰＩと呼ばれる組み換えＢＰＩホロタンパク質とＢＰＩの組み換えフラグメントを含むＢＰＩタンパク質をコードする組み換え遺伝子とその発現法を開示している。その全文が本明細書にふくまれ、参照される米国特許第５、４３９、８０７号および対応する国際特許公報ＷＯ９３／２３５４０（ＰＣＴ／ＵＳ９３／０４７５２）は、培地中で遺伝的に形質転換または形質移入された哺乳動物宿主細胞中で発現しそこから分泌された組み換えＢＰＩタンパク質生成物の新規精製法と、安定で均一な医薬製剤中に取り込むのに適した大量の組み換えＢＰＩ生産物の製造法を開示している。
ＢＰＩの生物活性フラグメント（ＢＰＩフラグメント）には、フラグメント分子はホロタンパク質のアミノ末端アミノ酸、中間アミノ酸および／またはカルボキシル末端アミノ酸がないこと以外は天然ＢＰＩホロタンパク質と同一または類似のアミノ酸配列を有する、米国特許第５、１９８、５４１号および第５、６４１、８７４号に記載のものを含む生物活性分子が含まれる。この様なフラグメントの非限定的例には［オオイ（Ｏｏｉ）ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７４：６４９（１９９１）］記載の約２５ｋＤの天然ヒトＢＰＩのＮ−末端フラグメント、またはγＢＰＩ２３と呼ばれる［ガッザーノ−サントロ（Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｒｏ）ら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、６０：４７５４−４７６１（１９９２）］記載の天然ヒトＢＰＩの１〜１９３または１９９残基由来のＮ−末端アミノ酸をコードするＤＮＡの組み換え発現生成物が含まれる。その文献では、図１（グレーら、前出）に示す様な３２残基の信号配列と、成熟ヒトＢＰＩのＮ−末端の最初の１９９個のアミノ酸を有する組み換え発現生成物（γＢＰＩ２１）をコードするＤＮＡ源として、発現ベクターが使用されるが、１５１位のバリンＧＴＣでなくＧＴＧで指定され、残基１８５がリジン（ＡＡＧで指定）でなくグルタミン酸（ＧＡＧで指定）である。図１（グレーら、前出）に示す配列（配列番号：１および２）を有する組み換えホロタンパク質（γＧＰＩ）も生成するが、γＢＰＩ２３で示され、残基４１７がバリン（ＧＴＴで指定）でなくアラニン（ＧＣＴで指定）である。ＢＰＩの残基１０〜１９３で構成される他のフラグメントも米国特許第６、０１３、６３１号、１９９９年６月１８日提出一部継続米国出願整理番号０９／３３６、４０２、および対応する国際特許公報ＷＯ９９／６６０４４（ＰＣＴ／ＵＳ９９／１３８６０）に記載され、その内容は全て本明細書に参照され援用される。他の例として米国特許第５、４４７、９１３号、第５、７０３、０３８号および第５、８５６、３０２号、および対応する国際特許公報ＷＯ９５／２４２０９（ＰＣＴ／ＵＳ９５／０３１２５）に記載されるＢＰＩフラグメントの２量体がり、その内容は全て本明細書に参照され援用される。好ましい２量体生成物には２量体ＢＰＩタンパク質生成物があり、そのモノマーはホロタンパク質の約１〜１７５および約１〜１９９残基由来のＮ−末端残基を有するアミノ末端ＢＰＩフラグメントである。特に好ましい２量体生成物はγＢＰＩ４２ダイマーと呼ばれるＮ−残基１〜１９３を有するＢＰＩフラグメントの２量体型である。
ＢＰＩの生物活性改変体（ＢＰＩ改変体）にはＢＰＩホロタンパク質またはその活性フラグメントと他のポリペプチドの少なくとも一個の少なくとも一部、またはＢＰＩ改変体の２量体型を含む組み換えハイブリッド融合タンパク質が含まれるが、それに限定されない。この様なハイブリッド癒合タンパク質および２量体型の例は、その全文が本明細書に引用され援用される米国特許第５、６４３、５７０号、および対応する国際特許公報ＷＯ９３／２３４３４（ＰＣＴ／ＵＳ９３／０４７５４）に記載され、アミノ末端にＢＰＩ他の悪質またはその生物活性フラグメント、カルボキシル末端に少なくとも１個の免疫グロブリン重鎖の定常ドメインまたはその対立改変体を有するハイブリッド融合タンパク質を含む。
ＢＰＩの生物活性アナログ（ＢＰＩアナログ）には、少なくとも１個のアミノ酸が異なったアミノ酸で置換されるＢＰＩタンパク質生成物が含まれが、それに限定されない。例えば、その全文を本明細書に引用して援用する米国特許第５、４２０、０１９号、第５、６７４、８３４号および５、８２７、８１６号、および対応する国際特許公報ＷＯ９４／１８３２３（ＰＣＴ／ＵＳ９４／０１２３５）は、システイン残基が異なったアミノ酸で置換されているＢＰＩおよびＢＰＩフラグメントのポリペプチドアナログを開示している。ＢＰＩホロタンパク質のＮ−末端アミノ酸の１〜１９３または１９９残基をコードするＤＮＡの発現生成物である安定なＢＰＩタンパク質生成物も記載されているが、残基番号１３２のシステインがアラニンで置換されている。この生成物はγＢＰＩ２１ΔｃｙｓまたはγＢＰＩ２１と呼ばれる。このＢＰＩ、γＢＰＩ２１のＮ−末端アナログの製造は［ホルビッツ（Ｈｏｒｗｉｔｚ）ら、タンパク質の発現精製（Ｐｔｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、８：２８−４０（１９９６）］に記載されている。同様に、１３２位のシステインがアラニンで置換されるＢＰＩの残基１０−１９３でなるアナログ（γＢＰＩ（１０−１９３）Ｃ１３２ＡまたはγＢＰＩ（１０−１９３）ａｌａ１３２と表される）が、その全文を本明細書に引用して援用する米国特許第６、０１３、６３１号、１９９９年６月１８日提出の一部継続米国特許第号出願整理番号０９／３３６、４０２、および対応する国際特許公報ＷＯ９９／６６０４４（ＰＣＴ／ＵＳ９９／１３８６０）に記載されている。他の例には、例えばその全文を本明細書に引用して援用する米国特許第５、４４７、９１３号、第５、７０３、０３８号および５、８５６、３０２号、および対応する国際特許公報ＷＯ９５／２４２０９（ＰＣＴ／ＵＳ９５／０３１２５）に記載のＢＰＩアナログの２量体型が含まれる。
本発明の方法による有用な他のタンパク質生成物は、１９９６年３月２１日提出の米国出願整理番号０８／６２１、２５９に対応する国際特許公報ＷＯ９７／０４００８（ＰＣＴ／ＵＳ９６／０３８４５）、米国特許第５、８５８、９７４号に対応する国際特許公報ＷＯ９６／０８５０９（ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９２６２）、米国特許第５、６５２、３３２号および第５、８５６、４３８号に対応する国際特許公報ＷＯ９５／１９３７２（ＰＣＴ／ＵＳ９４／１０４２７）、および米国特許第５、３４８、９４２号の一部継続である１９９３年１月１５日提出の米国出願整理番号０８／０９３、２０２（国際特許公報ＷＯ９４／２０１２８（ＰＣＴ／ＵＳ９４／０２４０１）に対応）、および国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／０５２８７の一部継続である１９９４年１月１４日提出の米国出願整理番号０８／１８３、２２２の継続である米国特許第５、７６３、５６７号に対応する国際特許公報ＷＯ９４／２０５３２（ＰＣＴ／ＵＳ９４／０２４６５）、および米国特許第５、８５１、８０２号に対応する国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／０５２８７に記載される合成または組み換え手段で製造されたＢＰＩ精製物由来、またはそれに基づくペプチドである。これらの特許はその全文を本明細書に引用して援用する。組み換えペプチドの製造法は米国特許第５、８５１、８０２号および国際特許公報ＷＯ９７／３５００９（ＰＣＴ／ＵＳ９７／０５２８７）に記載され、その全文を本明細書に引用して援用する。ＢＰＩ配列中のこれらの区切られた機能性ドメインが同定され、タンパク質の全生物活性に寄与するＢＰＩのアミノ酸配列領域を指定する（ドメインＩ−アミノ酸１７〜アミノ酸４５；ドメインＩＩ−アミノ酸６５〜アミノ酸９９；ドメインＩＩＩ−アミノ酸１４２〜アミノ酸１６９）。これらの機能性ドメイン由来の、またはそれらに基づくペプチド（すなわちＢＰＩ−由来のペプチド）の生物活性にはＬＰＳ結合、ＬＰＳ中和、ヘパリン結合、ヘパリン中和、または抗カビ性および（例えば抗グラム陰性菌および抗グラム陽性菌を含む）抗菌性を含む抗微生物性が含まれる。
γＢＰＩ２３およびγＢＰＩ２１を含むＢＰＩの多くの用途が、これらの生成物の多様な生物活性によると記載されている。
目的とする例示ポリペプチドγＢＰＩ２１をコードする多重転写ユニットを有する本発明によりベクターの例が開発されている。この様なベクターを用いて、例示クローンおよび細胞株が開発されている。例えば、以下に詳細に述べる様に振盪フラスコ中に１２５ｍｇまでのγＢＰＩ２１を分泌するＣＨＯ−Ｋ１細胞株、すなわちクローン６８９が開発されている。この細胞株は、マイコフェノール酸またはＧ４１８−耐性基質移入体を選択するためにそれぞれヒト前初期サイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）プロモーターおよびマウス軽鎖非翻訳領域、およびｇｐｔ（ｐＩＮＧ１７３７）またはｎｅｏ（ｐＩＮＧ１７３３）遺伝子の制御下にあるγＢＰＩ２１の２個のコピーを含む新規発現ベクターを用いて開発された。これらのベクターは、形質移入前にユニークＸｂａＩ部位で直線化された場合、γＢＰＩ２１二つのコピーは選択マーカー遺伝子で分離される様に設計されている。二つのγＢＰＩ２１遺伝子間の組み換えが選択マーカー遺伝子を除去する結果となり、そのためこれらのベクターで開発したクローンの安定性が増大するため、この構成により、組み換えに対する選択圧力が加えられる。
以下に詳細に述べる様に、全体で約５００個のマイコフェノール酸耐性形質移入体がｐＩＧＮ１７３７からスクリーニングされている。２４ウエルプレート培養による分泌が最高の形質移入体が２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したＥｘ−Ｃｅｌｌ（Ｅｘ−Ｃｅｌｌ）３０１培地中の懸濁生育に用いられ、Ｓ−セファロースビーズによるフラスコ振盪試験で試験された。細孔生産体であるクローン５１は振盪フラスコ中で終始約５０μｇ／ｍｌを分泌した。このレベルは、それぞれ１個のγＢＰＩ２１遺伝子を含むベクターによる逐次形質移入の結果である２個のγＢＰＩ２１遺伝子コピーを含むクローン２２８で生産される量とほぼ同じである。クローン５１は１４週間までの選択なしでこの生産性レベルを維持し、次いでＧ４１８耐性形質移入体を選択するためにｎｅｏベクターｐＩＮＧ１７３３で再形質移入された。全体で１２５３個のクローンがスクリーニングされ、クローン６８９が最初の振盪フラスコ試験に基づき約１００μｇ／ｍｌで最高の生産体であった。クローン６８９をＦＢＳフリーＥＸ−細胞３０１培地中での生育に使用し、クローン６８９ｂと再命名した。このクローンは選択無しで少なくとも２週間、その生産性を維持した。
以下の実施例にさらに詳細に述べる様に、最初の振盪フラスコ法の結果は、ＦＢＳフリーＥｘ−細胞３０１培地に適応後にクローン６８９ｂがクローン２２８の約５０μｇ／ｍｌに比べて約７５〜８０μｇ／ｍｌから５０μｇ／ｍｌを分泌することを示した。具体的には、これらの試験は２５０ｍｌフラスコを用いて行われ、ビーズを収穫するまでの１２日間は全て密封された。定期的にフラスコを開くことにより（即ちガス交換を行うことにより）クローン６８９の発現レベルは同じ条件下でクローン２２８の約６０μｇ／ｍｌと比較して約１２５μＧｇ／ｍｌに増加することが見出された。クローン２２８と６８９はそれぞれ、細胞がその最高生存率レベルにある期間中、約４および９ｐｇ／細胞／日を生産し、遺伝子同入量を増加することが比生産性の増加につながることを示している。これらの結果に一致して、クローン６８９がクローン２２８よりほぼ２倍も高いレベルのγＢＰＩ２１ｍＲＮＡを発現することがノーザンブロット解析で示された。これらのクローンに基づく数個の研究用細胞バンクが調製された。
抗Ｅｐ−ＣＡＭ免疫グロブリンをコードする多重転写ユニットを含む別なシリーズの例示ベクターが開発されたが、そのベクターにはマウス−ヒトキメラまたはヒト遺伝子操作抗Ｅｐ−ＣＡＭ抗体軽鎖プラス重鎖が含まれ、それぞれが形質転換体または形質移入体を選択するための０、１または２個のヒト重鎖エンハンサーとｇｐｔまたはｎｅｏ遺伝子のコピーを有するｈＣＭＶプロモーターおよびマウス軽鎖３’非翻訳領域の制御下にある。ベクターはまた、ベクター上の軽鎖および重鎖遺伝子の配向が異なる。
ＩＮＧ−１はマウス抗体Ｂｒ−１由来の可変領域およびヒト不変領域を有するマウス−ヒトキメラ抗体である（米国特許第５、５７６、１８４号参照）。マウス抗癌腫抗体Ｂｒ−１が上皮細胞付着分子（Ｅｐ−ＣＡＭ）を結合することが公知である。このマウス抗体はＢ３８．１ハイブリドーマ細胞株から（米国特許第４、６１２、２８２号に記載）コルヒャー（Ｃｏｌｈｅｒ）らにより最初に作成され、特徴付けされた。ＩＮＧ−１抗体はＢｒ−１のマウス−ヒトキメラバージョンであり、マウス−ヒトキメラ哺乳動物ＩＮＧ−１軽鎖をコードするベクターｐＩＮＧ２２０７、およびマウス−ヒトキメラＩＮＧ−１重鎖をコードするｐＩＮＧ２２２５ベクターを用いて以前に開発され、Ｓｐ２／０中で発現された（米国特許第５、５７６、１８４号参照）。
ＡＴＣＣに寄託された細胞株ＨＢ９８１２（例えば米国特許第５、５７６、１８４号参照）により生産されたＩＧＮ−１抗体由来のＥｐ−ＣＡＭを標的とする抗体生産物は、Ｅｐ−ＣＡＭ陽性癌細胞、特にＥｐ−ＣＡＭ陽性癌細胞への使用を含む、Ｅｐ−ＣＡＭの発現に関連する病気、不全または状態を含む診断、予防および／または治療用途に様々な有用な活性を有する。ＩＮＧ−１抗体生産物とは、少なくとも抗体可変領域を有する抗体重鎖および／または軽鎖タンパク質を含むタンパク質のことであり、重鎖および／または軽鎖可変領域はＥｐ−ＣＡＭと結合し、重鎖および／または軽鎖可変領域はＡＴＣＣに寄託された細胞株ＨＢ９８１２が生産するＩＮＧ−１抗体の重鎖および／または軽鎖可変領域と少なくとも８０％（例えば８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％）の配列同一性を共有する。
ＡＴＣＣに寄託された細胞株ＨＢ９８１２が生産するＩＮＧ−１抗体由来のマウス−ヒトキメラまたはヒト遺伝子操作抗Ｅｐ−ＣＡＭ抗体を含む、目的とする例示免疫グロブリンポリペプチドをコードする多重転写ユニットを有する本発明による例示ベクターが開発されている。この様なベクターを用いて、例示クローンおよび細胞株が開発されている。例えば、以下の実施例で詳細に述べるＣＨＯ−Ｋ１細胞株、すなわちクローン１４６が開発されているが、このクローンは振盪フラスコ中で６０μｇ／ｍｌまで、培養器中で約２００ｍｇ／Ｌの免疫グロブリンを分泌する。この細胞株は、２個の遺伝子、すなわちそれぞれＧ４１８耐性形質移入体を選択するためのヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）プロモーターおよび軽鎖３’非翻訳領域、およびｎｅｏ遺伝子の制御下にある低リスクヒト遺伝子操作ＩＮＧ−１軽鎖および重鎖の各１コピーおよびｎｅｏ（Ｇ４１８耐性）遺伝子を含む新規発現ベクターｐＩＮＧ１９３７を用いて開発された。
本発明は例示細胞株の第２多重転写ユニットべくたーによる第２形質移入により、遺伝子操作抗Ｅｐ−ＣＡＭ免疫グロブリンポリペプチドの発現と生産を提供する。例えば、以下の実施例で詳細に述べる様に、ｇｐｔ選択マーカー遺伝子を含む以外はｐＩＮＧ１９３７に類似する発現ベクターｐＩＮＧ１９５９によるサブクローン１４６、すなわち１４６．３の形質移入により、クローン３７３が開発された。クローン３７３は、Ｅｘ−細胞３０１培地中の振当フラスコの結果で測定して約２２５および２５７μｇ／ｍｌのヒト遺伝子操作抗Ｅｐ−ＣＡＭ抗体を発現した。
低リスクヒト遺伝子操作ＩＮＧ−１軽鎖および重鎖遺伝子（ｐＩＮＧ１９６５、４個の遺伝子のベクター）のそれぞれ２個のコピーである４個の遺伝子を含む一連の例示ベクターも構築されたが、それぞれが形質転換体または形質移入体を選択するためのｈＣＭＶプロモーターおよびヒト重鎖エンハンサーおよびｇｐｔまたはｎｅｏ遺伝子いずれかの０、１または２このコピーを有するマウス軽鎖３’非翻訳領域の制御下にある。この様なベクターを用いて、例示するクローンおよび細胞株が開発されている。例えば、以下の実施例で詳細に述べる様に、１％ＦＢＳを補充したＥｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地中で２１６μｇ／ｍｌまで、ＦＢＳフリーＥｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地中で約２１４μｇ／ｍｌの抗体を分泌するＣＨＯ−Ｋ１細胞株であるクローン１７が開発されている。この細胞株は４個の遺伝子を含む新規発現ベクターｐＩＮＧ１９６４を用いて開発されたが、それらはそれおれヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）プロモーターおよびマウス軽鎖３’非翻訳領域の制御下にある低リスクヒト遺伝子操作ＩＮＧ−１軽鎖および重鎖遺伝子およびｎｅｏ（Ｇ４１８耐性）遺伝子のそれぞれ２個のコピーである。
例示ベクターの別なシリーズは、抗ＣＤ１８抗体軽鎖および重鎖をコードする２つの遺伝子を含む抗ＣＤ１８免疫グロブリンポリペプチドをコードする多重転写ユニットを有し、各遺伝子は形質転換体または形質移入体を選択するためのｈＣＭＶプロモーターおよびヒト重鎖エンハンサーの０、１または２個のコピーを有するマウス軽鎖２’非翻訳領域およびｇｐｔまたｈＮＥＯ遺伝子の制御下にある。このベクターもベクター上の軽鎖および重鎖の配向が異なる。抗ＣＤ１８抗体は最初はヒトリンパ球表面抗原ＣＤ１８に対するラット抗体ＹＦＣ５１．１．１として開発され、その後米国特許第５、９８５、２７９号および第５、９９７、８６７号に記載される様にＣＤＲグラフトでヒト化された。
ＣＤ１８を標的とする抗体生産物は多様な有用な活性を有する。例えば、好中球の内皮細胞への抗ＣＤ１８付着およびステントおよびバルーン血管形成による霊長類モデルにおける再狭窄である。抗ＣＤ１８タンパク質生成物とは、ＹＦＣ５．１．１．１抗体由来のＣＤＲ抗ＣＤ１８抗体を含むタンパク質のことである（例えば米国特許第５、９８５、２７９号参照）。抗ＣＤ１８抗体精製物とは、少なくとも抗体可変領域を有する抗体重鎖および／または軽鎖を含むタンパク質のことであり、重鎖および／または軽鎖可変領域はＣＤ１８に結合し、ＣＤＲは米国特許第５、９８５、２７９号の配列番号：３−８および１１−１６に示されるＹＦＣ５．１．１．１抗体タンパク質であり、重鎖および／または軽鎖可変領域はＹＦＣ５．１．１．１抗体のマウス重鎖および／または軽鎖可変領域と少なくとも８０％（たとえば少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を含む）の配列の同一性を共有する。
本発明により、ヒト化抗ＣＤ１８免疫グロブリンを含む、目的とする別な例示免疫グロブリンポリペプチドをコードする多重転写ユニットを有する例示ベクターが開発されている。この様なベクターを用いて、例示するクローンおよび細胞株が開発されている。例えば、以下の実施例で詳細に述べる、振盪フラスコ中で約２００μｇ／ｍｌの抗体を分泌するクローン１２８Ｄ１２であるＣＨＯ−Ｋ１が開発されている。この細胞株は、抗ＣＤ１８重鎖および軽鎖遺伝子とｎｅｏ（Ｇ４１８耐性）遺伝子それぞれの１コピーである２個の遺伝子を含む新規ベクターｐＩＮＧ２０５２を用いて開発されたが、それぞれがＧ４１８耐性形質移入体を選択するためにヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）プロモーターとマウス軽鎖３’非翻訳領域、およびｎｅｏ遺伝子の制御下にある。
本発明は第２多重転写ユニットベクターを用いる例示細胞株の第２形質移入による抗ＣＤ１８免疫グロブリンの発現と生産の増加を提供する。例えば、ｈｉｓ選択マーカー遺伝子を含む以外はｐＩＮＧ２０５２に類似の発現ベクターｐＩＮＧ２０５７を有するクローン２６４Ｅ２がクローン１２８Ｄ１の逐次形質移入で開発された。Ｅｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地中のいくつかの振盪フラスコ試験におけるクローン２６４Ｅ２は、タンパク質のＡ−ＨＰＬＣで測定してクローン１２８Ｄ１２より約１．５〜２倍多い免疫グロブリンポリペプチドを生産した。
ＣＡＢ２．１と呼ばれる補体阻害剤ペプチドの多重コピーを含む補体阻害剤ポリペプチドをコードする多重転写ユニットを含む例示ベクターの別なシリーズが開発された（例えば米国特許第５、８６６、４０２号、第６、３１６、２５３および６、４５１、５３９参照）。例えば、ＣＡＢ２．１ポリペプチドをコードする遺伝子の２個のコピーを含み、それぞれがｈＣＭＶプロモーターおよびマウス軽鎖３’非翻訳領域、および形質転換体または形質移入体の選択のためのｎｅｏまたはｈｉｓ遺伝子の制御下にあるベクターが構築された。これらのベクターの最初の試験では、好ましい構成が選択のためのｎｅｏ遺伝子を有するベクターｐＩＮＧ２０５５であらわされた。このベクターとそのｈｉｓバージョンであるｐＩＮＧ２０５６がフルスケール細胞株開発のために選ばれた。
補体活性化ブロッカー−２（ＣＡＢ２．１）は２種ののヒト補体阻害剤タンパク質、即ちＮ−末端の膜共同因子タンパク質（ＭＣＰ、ＣＤ４６）およびＣ−末端の減衰加速因子で構成されるキメラまたは融合タンパク質である。ＣＡＢ２．１タンパク質はメトトレキセートの存在で、ＭＣＰ−特異性Ｍａｂ（ＧＢ２４）によるアフィニティークロマトグラフィーにより、または酸沈殿、陰イオン交換クロマトグラフィー、不溶化金属アフィニティークロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーを行うことにより、選択用ＤＨＦＲ遺伝子と共にＣＡＢ２．１を含むベクターで形質移入されたＣＨＯ−ＤｕＫＸ−Ｂ１１ ＤＦＨＲ−細胞から単離された［ヒギンス（Ｈｉｇｇｉｎｓ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５８：２８７２−２８８１（１９８９）］。この様にして得られたＣＡＢ２．１が因子１活性と減衰促進活性の双方を有し、Ｃ３／Ｃ５コンバーターゼを不活性化することにより補体活性化の古典的および代替経路の双方を不活性化することがヒギンス［ヒギンスら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５８：２８７２−２８８１（１９８９）］により最初に示された。ＣＡＢ２．１の分子量は約１１９、０００ダルトン（１１０ｋＤ）である。全ＣＡＢ２．１のアミノ酸配列およびそのタンパク質をコードするＤＮＡの核酸配列が報告されている（例えば米国特許第６、３１６、２５３号参照）。
ＣＡＢ２．１タンパク質精製物は正常な組織の補体媒介溶解、例えば過剰な補体活性化が正常な組織を損傷する急性疾患の予防に治療上の潜在能力を有する。補体が活性化することが知られている病気には全身性エリテマトーデス、急性心筋梗塞、火傷、敗血症および成人呼吸不全症候群がある。ＣＡＢ２．１タンパク質精製物とは組み換えで生成したＣＡＢ２．１タンパク質；ＣＡＢ２．１タンパク質の補体阻害ポリペプチドフラグメント；ＣＡＢ２．１タンパク質の補体阻害ポリペプチド改変体およびそのフラグメントのことであり、ハイブリッド融合タンパク質およびモノマーの多量体；ＣＡＢ２．１タンパク質の補体阻害アナログまたはそのフラグメントまたは改変体；および補体阻害ＣＡＢ２．１−由来のペプチドが含まれる。ＣＡＢ２．１の補体阻害フラグメントには全長ＣＡＢ２．１と同一または類似のアミン酸配列を有する生物活性分子が含まれるが、フラグメント分子には全長ＣＡＢ２．１のアミノ末端アミノ酸、中間アミノ酸および／またはカルボキシ末端アミノ酸が欠失している。ＣＡＢ２．１には少なくとも１個のアミノ酸が異なったアミノ酸に置換されているＣＡＢ２．１タンパク質生成物が含まれるが、それに限定されない。本発明の方法により有用である他のＣＡＢ２．１タンパク質生成物は、合成または組み換え手段により製造されたＣＡＢ２．１由来、またはそれに基づく補体阻害ペプチドである（ＣＡＢ２．１由来のペプチド）。
ＣＡＢ２．１をコードするベクターを用い、ＣＡＢ２．１をコードする例示クローンおよび細胞株が開発された。例えば以下の実施例で詳細に述べる様に、振盪フラスコ中で約２００μｇ／ｍｌまでを分泌するＣＨＯ−Ｋ１細胞株であるクローン２１７Ｂ４が開発された。この細胞株はそれぞれ、Ｇ４１８耐性またはヒスチジノール耐性形質移入体を選択するためのヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）プロモーターおよびマウス軽鎖３’非翻訳領域、およびｎｅｏ（ｐＩＮＧ２０５４）またはｈｉｓ（ｐＩＮＧ２０５６）遺伝子の制御下にあるＣＡＢ２．１遺伝子の１個および２個のコピーを含む新規発現ベクターを用いて開発された。
本発明の他の実施形態、バージョンおよび利点を以下の実施例の説明を考慮して理解し得ると思われるが、実施例１は本発明による目的とするポリペプチドをコードする一定の転写ユニットの多重コピーを含むベクターの構築を目的とし；実施例２は二重転写ユニットベクターｐＩＮＧ１７３７による形質移入によりγＢＰＩ２１生産ＣＨＯ−Ｋ１細胞株であるクローン５１の開発を目的とし；実施例３は例示クローン６８９を生成するための第２の二重転写ユニットベクターｐＩＮＧ１７３３によるクローン５１の形質移入を目的とし；実施例４は例示クローン３４１を生成するための二重転写ユニットベクターｐＩＮＧ１７５３による第３の逐次形質移入を目的とし；実施例５は例示クローン３３８および５８それぞれを生成するためのＩｇエンハンサーｐＩＮＧ１７４４およびｐＩＮＧ１９１５を欠失するユニットベクターによる逐次形質移入を目的とする。実施例６は免疫グロブリンポリペプチドをコードするベクターを含む本発明による一定の転写ユニットの多重コピーを含む別なベクターの構築を目的とし；実施例７は二重転写ユニットベクターｐＩＮＧ１９３２を用いる形質移入によるマウス−ヒトキメラＩＮＧ−１生産ＣＨＯ−Ｋ１細胞株であるクローン４０の開発と、二重転写ユニットベクターｐＩＮＧ１９３７を用いる形質移入によるクローン１４６の開発を含み；実施例８は二重転写ユニットベクターｐＩＮＧ１５９７を用いるクローン１４６の逐次形質移入によるクローン２５９および３７３、および二重転写ユニットベクターｐＩＮＧ１９５９を用いるサブクローン１４６．３の逐次形質移入によるクローン３７３の開発を目的とし；実施例９は二重転写ユニットベクターｐＩＮＧ１９５７を用いるクローン３７３の逐次形質移入によるクローン１３２の開発を目的とし；実施例１０はヒト遺伝子操作抗ＥｐＣＡＭ抗体の軽鎖および重鎖遺伝子それぞれの１個のコピーを含む二重転写ユニットベクターｐＩＮＧ１９５９を用いる形質移入によるクローン５３および１５７の開発と、ヒト遺伝子操作抗ＥｐＣＡＢ抗体の軽鎖および重鎖それぞれの２個のコピーを含む４−転写ユニットベクターｐＩＮＧ１９６４により形質移入されたクローン１７の開発を目的とし；実施例１１は抗ＥｐＣＡＢ免疫グロブリンポリペプチドをコードするベクターを含む例示免疫グロブリンポリペプチドの結合能を目的とし；実施例１２は可溶性ＥｐＣＡＭのクローニングと可溶性ＥｐＣＡＭを用いる直接結合ＥＬＩＳＡの開発を目的とし；実施例１３は別な免疫ぐろぶりんポリペプチドをコードするベクターを含む一定の転写ユニットの多重コピーを含む本発明による別な発現ベクターの構築を目的とし；実施例１４は二重転写ユニットベクターｐＩＮＧ２０５１を用いる抗ＣＤ１８抗体生産クローン１２８Ｄ１２の開発を目的とし；実施例１５は二重転写ユニットベクターｐＩＮＧ２６４Ｅ２を用いるクローン１２８Ｄ１２の逐次形質移入による抗ＣＤ−１８抗体生産クローン２６４Ｅ２の開発を目的とし；実施例１６は選択した細胞株中で抗ＣＤ１８抗体を生産するためのいくつかの別な細胞培養媒体の使用を目的とし；実施例１７は補体阻害ポリペプチドを含む一定の転写ユニットの多重コピーを含む発現ベクターの構築を目的とし；実施例１８は単一転写ユニットｎｅｏベクターｐＩＮＧ２０５４および二重転写ユニットｎｅｏベクターｐＩＮＧ２０５５で形質移入されたクローン１５６Ｂ８および１７６Ｃ６を含むＣＡＢ２．１をコードするベクターにより形質移入されたクローン３Ｇ８とそのサブクローンＧ５Ｆ１の開発を目的とし；実施例１９は二重転写ユニットｈｉｓｐＩＮＧ２０５６を用い、次いで生産性が最大のクローンをサブクローンすることによるクローン３Ｇ８の逐次形質移入による別なＣＡＢ２．１生産クローンの開発を目的とする。
（実施例１）
（ベクターの構築）
本実施例は例示転写ユニットの多重コピーを含む（包含する）ベクターの構築を説明する。目的とするポリペプチドをコードする例示遺伝子配列の多重コピーを含む例示ベクターコンストラクトも説明する。
（Ａ．２個のγＢＰＩ２１遺伝子を含む発現ベクターおよびマウス免疫グロブリン重鎖エンハンサーの単一コピーの構築）
発現ベクターｐＩＮＧ１７２９、ｐＩＮＧ４１４４、ｐＩＮＧ ４１５１およびｐＩＮＧ４１５５をγＢＰＩ２１配列（配列番号：３および４）をコードするＤＮＡ源として用いた。プラスミドｐＩＮＧ４１４４およびｐＩＮＧ４１５１はテオファン（Ｔｈｅｏｆａｎ）らが特許を共有する米国特許第５、６７４、８３４号に記載されている。ｐＩＮＧ４１５５は、Ｇ４１８耐性形質移入体を選択するためのｎｅｏ遺伝子を含むこと以外はｐＩＮＧ４１４４およびｐＩＮＧ４１５１と類似している。ｐＩＮＧ１７２９は、マウス免疫グロブリン重鎖エンハンサーを欠失する以外はｐＩＮＧ４１４４に類似している。このベクターはエンハンサーを含む約７００ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグントを除去して構築された。
プラスミドｐＩＮＧ１７３３はｐＩＮＧ４１５５およびｐＩＮＧ１７２９から構築された（図１）。ｐＩＮＧ４１５５はＩｇエンハンサーに隣接する特異的部位で切断するＸｂａＩで最初に設計された。４ｂｐの５’延長部を埋めて末端を平滑にするデオキシリボヌクレオチドの存在下に、ＸｂａＩ消化ＤＮＡをＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理し、次いで円弧状マップ上のＸｂａＩに対し反時計周りで約５００ｂｐのベクター内のユニーク部位で切断するＮｏｔＩで消化した。得られた約８７００ｂｐのベクターフラグメントをゲル濾過で精製した。ｐＩＮＧ１７２９をＮｏｔＩおよびＨｐａＩで消化し、γＢＰＩ２１およびマウスκ軽鎖３’非翻訳領域をコードする遺伝子であるヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）プロモータを含む約３７００ｂｐのフラグメントをゲル濾過で精製した。これらの制限フラグメントのライゲーションによりＸｂａｌＩ部位が再生され、ＮｏｔＩ部位が維持された。得られたベクターｐＩＮＧ１７３３（図１）はＧ４１８耐性形質移入体選択用のｎｅｏ遺伝子、それぞれＣＭＶプロモーターおよびマウスκ軽鎖３’非翻訳領域の制御下にあるγＢＰＩ２１の２個のコピー、およびＩｇＧエンハンサーユニットの１個のコピーを含む。
プラスミドｐＩＮＧ１７３７は、マイコフェノール酸耐性形質移入体を選択するためにｎｅｏ遺伝子の代わりにｇｐｔ遺伝子を含む以外はｐＩＮＧ１７３３と類似しており、ｐＩＮＧ１７３３およびｇｐｔベクターであるｐＩＮＧ４１４４から構築された（図２）。ｐＩＮＧ１７３３およびｐＩＮＧ４１４４それぞれをＨｐａＩおよびＮｏｔＩで消化し、ｐＩＮＧ１７３３（２個のγＢＰＩ２１転写ユニットを含む）由来の７６００ｂｐ制限フラグメントおよびｐＩＮＧ４１４４（ｇｐｔ遺伝子を含む）由来の４４００ｂｐ制限フラグメントをライゲーションした。ｐＩＮＧ１７３３と同様、ｐＩＮＧ１７３７はそれぞれ、１個のＩｇエンハンサーおよびユニークＸｂａＩおよびＮｏｔＩ部位を有するＣＭＶプロモーターの制御下にあるγＢＰＩ２１遺伝子の２個のコピーを含む。ｐＩＮＧ１７３７をＮｏｔＩ（図３Ａ）およびＸｂａＩ（図３Ｂ）で消化すると、ｎｅｏ遺伝子の代わりにｇｐｔ遺伝子を含む以外は同じ制限酵素で消化されたｐＩＮＧ１７３３に等しい直線状プラスミドが得られる。
ｇｐｔ含有ベクターｐＩＮＧ４１４４の代わりにヒスチジノール耐性形質移入体選択用のｈｉｓ遺伝子を含むベクターｐＩＮＧ４１５１を使用した以外はｐＩＮＧ１７３７と同様な方法で、プラスミドｐＩＮＧ１７５３を構築した。二つのプラスミドをＨｐａＩおよびＮｏｔＩで消化し、ｐＩＮＧ１７３３由来の２個のγＢＰＩ２１転写ユニットおよびｐＩＮＧ４１５１由来のｈｉｓ遺伝子を含むフラグメントをゲル濾過で精製しライゲーションした（図４）。ｐＩＮＧ１７３７およびｐＩＮＧ１７３３と同様、ｐＩＮＧ１７５３はγＢＰＩ２１遺伝子の２個のコピーを含み、それぞれが１個のＩｇエンハンサーとユニークＸｂａＩおよびＮｏｔＩ部位を有するＣＭＶプロモータの制御下にある。ｐＩＮＧ１７５３をＸｂａＩまたはＮｏｔＩで消化すると、ｐＩＮＧ１７５３がｎｅｏまたはｇｐｔ遺伝子の代わりにｈｉｓ遺伝子を含む以外は、同じ制限酵素で消化したｐＩＮＧ１７３３およびｐＩＮＧ１７３７のものと類似した直線状プラスミドマップが得られる。
ｐＩＮＧ１７３３、ｐＩＮＧ１７３７またはｐＩＮＧ１７５３をユニークＸｂａＩ部位で消化すると、選択マーカー遺伝子ｎｅｏ、ｇｐｔまたはｈｉｓが二つの同等な転写ユニット間に位置する様に形成されたγＢＰＩ２１遺伝子の二つのコピーを含む直線状制限フラグメントがそれぞれ得られる。例えば、ｐＩＮＧ１７３３を直線状ＸｂａＩ消化ＤＮＡとして見ると、ベクター内の各要素の順番は次の通りである：ＩｇＧエンハンサー、ＣＭＶプロモーター、γＢＰＩ２１遺伝子、軽鎖３’非翻訳領域、ｎｅｏ遺伝子、ｂｌａ（Ａｍｐ１）遺伝子、ＣＭＶプロモーター、γＢＰＩ２１遺伝子、軽鎖３’非翻訳領域。ｐＩＮＧ１７３３をユニークＮｏｔＩ部位で消化すると、２個のγＢＰＩ２１転写ユニットが相互に隣接し、選択マーカー遺伝子がこれらの２個の組み換えγＢＰＩ２１転写ユニットの外側に位置する直線状制限フラグメントが得られる。直線状ＮｏｔＩ消化ＤＮＡとして見ると、ベクター内の各要素の順番は次の通りである：ＣＭＶプロモーター、γＢＰＩ２１遺伝子、軽鎖３’非翻訳領域、ＩｇＧエンハンサー、ＣＭＶプロモーター、γＢＰＩ２１遺伝子、軽鎖３’非翻訳領域、ｎｅｏ遺伝子、ｂｌａ（Ａｍｐ１）遺伝子。
（Ｂ．免疫グロブリン重鎖エンハンサーを持たず２個のγＢＰＩ２１を含む発現ベクターの構築）
γＢＰＩ２１をコードするＤＮＡ源としてｐＩＮＧ１７３２およびｐＩＮＧ１７４０を用いて発現ベクターｐＩＮＧ１７４４（図５）を構築した。ｎｅｏ遺伝子を含む以外はｐＩＮＧ１７３２はｐＩＮＧ１７２９に類似している。ｐＩＮＧ１７３２のＮｏｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位の間に多重リンカー部位を最初にクローニングしてｐＩＮＧ１７４０を構築し、Ｇ４１８耐性をコードするｎｅｏ遺伝子を含むｐＩＮＧ１７３６を形成した。このリンカーは最初のＮｏｔＩ部位を破壊し、ＸｂａＩ部位に隣接して新しい部位を導入した。次に多重リンカー、ＣＭＶプロモーター、およびｇｐｔ遺伝子を含むｐＩＮＧ４１４４由来の５６００ｂｐのＸｍｎ−ＸｈｏＩフラグメントを有するｐＩＮＧ１７３６由来のγＢＰＩ２１遺伝子を含む２０９０ｂｐのＸｍｎ−ＸｈｏＩフラグメントをライゲーションしてｐＩＮＧ１７３６由来のｎｅｏ遺伝子をｐＩＮＧ４１４４由来のｇｐｔ遺伝子で置換した。ｐＩＮＧ１７４４を構築するため、ｐＩＮＧ１７３２由来の約３７００ｂｐのＨｐａＩ−ＮｏｔＩ γＢＰＩ２１を含むフラグメントをＸｂａＩ消化で生成したｐＩＮＧ１７４０由来の約７７００ｂｐのフラグメントとライゲーションし、Ｔ−４ＤＮＡポリメラーゼとデオキシリボヌクレアーゼで処理して平滑末端とし、ＮｏｔＩで消化した（図５）。ｐＩＮＧ１７４４はマイコフェノール酸耐性形質移入体を選択するためのｇｐｔ遺伝子とそれぞれＣＭＶプロモーターとマウスκ軽鎖３’非翻訳領域の制御下にある、γＢＰＩ２１遺伝子の２個のコピーとを含む。このベクターはＩｇエンハンサーを欠失している。ｐＩＮＧ１７４４をユニークＸｂａＩ部位で消化すると、ｇｐｔ選択マーカー遺伝子が異なった２個の同等なγＢＰＩ２１転写ユニットの間に位置する様に形成されたγＢＰＩ２１の二つのコピーを含む直線状制限フラグメントを生じる。直線状ＤＮＡとして見ると、発現ベクター内の要素の順番は次の通りである：ＣＭＶプロモーター、γＢＰＩ２１遺伝子、軽鎖３’非翻訳領域、ｇｐｔ遺伝子、ｂｌａ（Ａｍｐ’）遺伝子、ＣＭＶプロモーター、γＢＰＩ２１遺伝子、軽鎖３’非翻訳領域（図６）。
（実施例２）
（形質移入クローンおよび細胞株の開発と特徴付け）
本実施例は、本発明の実施形態に続いて例示するベクターを有するクローンと細胞株の開発と特徴付けを説明する。γＢＰＩ２１生産ＣＨＯ−Ｋ１細胞株クローン５１の開発と特徴付けを、実施例１に記載の２−遺伝子ベクターによる形質移入で説明する。クローン５１の開発に用いられたＣＨＯ−Ｋ１細胞株はＡＴＣＣ（ＣＣＬ６１）から入手した。細胞を１０％ＦＢＳを補充したハム（Ｈａｍ）のＦ１２培地中で生育した。
形質移入に先立ち、４０μｇのｐＩＮＧ１７３７をＮｏｔＩまたはＣｂａＩの何れかで直線化した。リサーチセルバンク（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ）由来のＣＨＯ−Ｋ１細胞株をＢｏｔＩまたはＸｂａｌ消化ｐＩＮＧ１７３７を用いエレクトロポーレーション［アンドリーソン（Ａｎｄｅｒｅａｓｏｎ）ら、バイオテクノロジー（Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）６：６５０（１９８８）］で形質移入した。１０％ＦＢＳを補充したハムのＦ１２培地中での４８時間の回復期間後、細胞をトリプシン消化し、選択培地（ハムのＦ１２培地；１０％ウシ胎児血清補充、２９２ｍｇ／Ｌグルタミン、１０％ユニット／Ｌペニシリン、１００ｍｇ／Ｌストレプトマイシン、０．０１ＭＨＥＰＥＳ、２５０ｍｇ／Ｌキサンチン、２５ｍｇ／Ｌマイコフェノール酸［ＭＰＡ］）中に希釈し、約１×１０４細胞／ウエルで９６ウエルプレートに移した。細胞を３７°ＣでＣＯ２インキュベーター中でインキュベートした。
約２週間のインキュベーションから出発して、ウエルあたり１個のみのコロニーを有する９６ウエルプレートからの培養上澄をＢＰＩサンドイッチＥＬＩＳＡでホワイト（Ｗｈｉｔｅ）らの方法［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１６７：２２７−２３５（１９８８）］でスクリーニングした。ＮｏｔＩおよびＸｂａｌ消化ｐＩＮＧ１７３７で消化した細胞につき、約５００クローンをスクリーニングした。最高レベルのγＢＰＩ２１を分泌するＮｏｔＩ消化ｐＩＮＧ１７３７由来の４２クローン（ＮｏｔＩクローン）、およびＸｂａＩ消化ｐＩＮＧ１７３７由来の２６クローン（ＸｂａＩクローン）を２４ウエルプレート中のハムのＦ１２選択培地に移した。細胞を密集状態に生育させ、マスターおよびレプリカ２４ウエルプレート培養液を調製した。生産性を評価するため、レプリカプレート中の細胞をハムのＦ１２培地中で密集状態に生育させ（４８〜７２時間）、培地を除き１ｍｌ／ウエルの無血清培地（ＨＢ−ＣＨＯ、アービンサイエンティフィック（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））プラス４０μｌの殺菌Ｓ−セファロースビーズに置換し、細胞をさらに７日間インキュベートした。次いでＳセファローズビーズを取り出し、約１ｍｌのトリス緩衝液（２０ｍＭトリス、ｐＨ７．４、０．１ＭＮａＣｌ）で１回洗浄し、γＢＰＩ２１を１ｍｌの１．５Ｍ ＮａＣｌ（２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０）でビーズから溶出した。Ｓセファローズビーズから溶出した分泌γＢＰＩ２１のレベルをサンドイッチＳＬＩＳＡを用いて定量分析した。その結果は、各グループからの最高の形質移入体は約３μｇ／ｍｌを分泌することを示した。最高の１０個のＸｂａＩクローン（例えばクローン５１と１２７を含む）と最高の１１個のＮｏｔＩクローン（例えばクローン２５５と２６６を含む）を次の研究のために選んだ。
２４ウエル培養からの細胞を２５μｇ／ｍｌのＭＰＡおよび２５０μｇ／ｍｌのキサンチン（選択Ｅｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地）プラス１０％ＦＢＳを含むＥｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地（ＪＲＨバイオサイエンス（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｌｅｎｅｘａ、Ｋａｎｓａｓ）を含む２４ウエルプレートに移した。密集状態で２４ウエルプレートウエルからの細胞を２％ＦＢＳを補充した２０ｍｌの選択Ｅｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地を含む１２５ｍｌのエレンマイヤーフラスコに移した。スクリーニング期間中、クローンを２％ＦＢＳを含むエレンマイヤーフラスコ中、選択Ｅｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地中に維持した。
初期生産性試験を最高の１１個のＮｏｔＩクローンと１０個のＸｂａＩクローンについて行った。この段階で、細胞は２％ＦＢＳ補充選択ＥｃＣｅｌｌ３０１培地中で生育中であった。細胞を全容量５０ｍｌのＥｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地プラス２％ＦＢＳ（カラム内を含む）および２ｍｌのＳＰセファローズ（ビッグビーズ）を含む２５０ｍｌのエレンマイヤーフラスコ（振盪）に移し、３７°Ｃ、１００ＲＰＭで１２日間生育した。コントロールとしてクローン１８０（γＢＰＩ２１遺伝子の単一コピーを含む）およびクローン２２８（γＢＰＩ２１の単一コピーの２回の逐次形質移入由来のγＢＰＩ２１の２個のコピーを含む）もこの試験でインキュベートした。インキュベート後、ビーズを取り出し、低塩緩衝液（２０ｍＭ燐酸ナトリウム、ｐＨ７．０、０．１５ＭＮａＣｌ）で洗浄し、γＢＰＩ２１を１．５ＭＮａＣｌを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）で溶出した。溶出液中のγＢＰＩ２１レベルをイオン交換ＨＰＬＣで測定した。その結果は、ＮｏｔＩ消化ＤＮＡによる形質移入からの３個のクローン、およびＸｂａＩ消化ＤＮＡによる形質移入からの２個のクローンが、クローン２２８の発現と同レベルでγＢＰＩ２１を発現することを示した。その結果はさらに、ｐＩＮＧ１７３７中の２つのγＢＰＩ２１コピーが少なくともクローンのいくつかで最高に発現していることを示した。
選択Ｅｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地（２％ＦＢＳ補充）中でこれらのクローンを懸濁細胞として生育し続けると、ＮｏｔＩ消化ＤＮＡによる形質移入で生じる細胞はγＢＰＩ２１の生産性を３７〜６０μｇ／ｍｌから５〜３５μｇ／ｍｌのレベルで１０週間の期間中に徐々に低下させ、選択性は維持するものの最終的になくなった。γＢＰＩ２１が１列に並んで位置し、組み換えが行われ得るため、この結果は全く予想できなかったわけではない。比較として、ＸｂａＩ消化ｐＩＮＧ１７３７による形質移入によるクローン５１は実験の１０週間にわたってその生産性を維持するか増加させた。これらの結果は、選択マーカー遺伝子（ｇｐｔ）を組み込まれた発現ベクター内の２個のγＢＰＩ２１遺伝子間に置くと、形質移入体中の双方のγＢＰＩ２１コピーの維持を助けることを示している。
クローン５１をさらに継代培養し続けると、ＦＢＳ含有量は徐々に減少し、無血清状態となった。ＦＢＳのないＥｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地中で生育するクローン５１をクローン５１ｂと再命名した。
２％ＦＢＳ補充のある場合とない場合のＥｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地中でのクローン５１および５１ｂの安定性をそれぞれ調べた。この試験のため、細胞を２％ＦＢＳのある（クローン５１）およびない（クローン５１ｂ）、各週中に完全な選択および２回の継代培養を行う、または行わず２５ｍｌのＥｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地を含む１２５ｍｌエレンマイヤーフラスコ中に維持した。週に１回、フラスコ振盪試験を設定し、上記の様に実施した。クローン５１および５１ｂの安定性試験を１６週間続けた。クローン５１ｂの試験では、発現レベルを選択Ｅｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地中に維持したクローン２２８の発現レベルと比較した。クローン５１の安定性試験の結果は、発現レベルが最初に低下した後、選択培地および非選択培地中の細胞は少なくとも第１１週まで同様なγＢＰＩ２１発現レベルを維持した。実験の１８週の期間中、クローン５１ｂは選択に有無にかかわらず同様な生産性を維持した。クローン５１ｂの試験中、生産性は１個のγＢＰＩ２１遺伝子を含むベクターによる逐次形質移入の結果として２個のγＢＰＩ２１遺伝子を含むクローン２２８の生産性に等しいか、それより大きかった。
（実施例３）
（第２の逐次ベクター形質移入による発現の増加：形質移入クローンと細胞株の開発と特徴付け）
本実施例は第２多重転写ユニットを用いる例示する細胞株の第２形質移入によるポリペプチドの発現と生産を更に増加させる方法を説明する。γＢＰＩ２１生産ＣＨＯ−Ｋ１細胞株であるクローン６８９の開発と特徴付けを説明する。クローン６８９は実施例２で説明した、２％ＦＢＳを補充したＥｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地に、形質移入前にＸｂａＩで消化したｎｅｏ発現ベクターｐＩＮＧ１７３３（図１）を用いて適応したクローン５１の形質移入により開発された。２％ＦＢＳを補充した選択Ｅｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地中でなお生育を続ける（無血清生育に完全に適応するのでなく）クローン５１細胞を、第２形質移入を速やかに開始させるため使用した。
（Ａ．クローン５１のｐＩＮＧ１７３３による形質移入）
２％ＦＢＳ、ＭＰＡおよびキサンチンを補充した選択Ｅｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地中で生育するクローン５１に、４０μｇのＸｂａＩ消化ｐＩＮＧ１７３３をエレクトロポーレーションした。２％ＦＢＳを補充した非選択Ｅｘ−Ｃｅｌｌ ３０１中での培地４８時間の回復期間後、細胞を選択培地（０．８％ｍｇ／ｍｌのＧ４１８と２％ＦＢＳを補充）中に入れ、約１×１０４細胞／ウエルで９ウエルプレートに移した。この時はＭＰＡおよびキサンチンを培地に加えなかった。細胞を３７°ＣでＣＯ２インキュベーター中に置いた。２回の追加形質移入を上記の様に行った。
（Ｂ．クローン６８９のスクリーニングと選択）
全体で１２５３個のクローンを９６ウエルレベルで３回の形質移入からスクリーニングした。最高のγＢＰＩ２１レベルを分泌する１２５個のクローンを２％ＦＢＳを補充した２４ウエルプレート中の選択Ｅｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地（２５０μｇ／ｍｌキサンチン、２５μｇ／ｍｌマイコフェノール酸および０．８ｍｇ／ｍｌのＧ４１８）に移した。形質移入体が９６ウエルプレート中で２％ＦＢＳを含むＥｘ−Ｃｅｌｌ ３０１中で選択されていたが、この培地と共に２４ウエルへ移した場合は最初の生育が悪かった。この問題は一時的にＦＢＳ濃度を４％に増加することで解決した。細胞は密集状態に生育し、マスターおよびレプリカ２４ウエルプレート培養物をクローン５１について上記の様に調製した。２４ウエル培養で生産性をスクリーニングするため、細胞を４％ＦＢＳプラス４０μｌの滅菌Ｓ−セファロースビーズを含む１ｍｌの選択Ｅｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地に移し、死滅するまでインキュベートした（７〜１０日）。Ｓ−セファロースビーズを取り出し、１ｍｌのトリス緩衝液（２０ｍＭトリス、ｐＨ７．４、０．１ＭＮａＣｌ）で１回洗浄し、γＢＰＩ２１をビーズから１．５Ｍ ＮａＣｌを含む１ｍｌの同じ緩衝液中に溶出した。Ｓ−セファロースビーズから溶出した分泌γＢＰＩ２１をサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて定量分析した。最高の４６クローンを２４ウエルプレートから２５ｍｌの４％ＦＢＳと形質移入体選択のために用いる濃度の半分の濃度の選択剤を補充したＥｘ−Ｃｅｌｌ ３０１を含む１２５ｍｌエレンマイヤー（振盪）フラスコに移した。フラスコ振盪試験を４％ＦＢＳを含むＥｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地中でこれらのクローンで行った。これらとその後の試験から、いくつかの生産性の高いクローンが同定された（例えばクローン３５７、５４８、６８９および８１５を含む）。これらの試験の結果は、クローン６８９が約１００μｇ／ｍｌで最高の生産クローンであることを示した。引き続く振盪フラスコ試験で、クローン６８９が４％ＦＢＳを含むＥｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地中での６回の試験で平均１０４３＋１．９９μｇ／ｍｌで最良の生産株であることが示された。クローン６８９のバイアルを凍結した（リサーチセルバンクＣ３０４３と命名）。クローン６８９を４％ＦＢＳを補充したＥｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地中で維持し、以下に示す初期安定性試験に用いた。
（Ｃ．クローン６８９のＦＢＳフリーＥｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地への適応）
クローン６８９を、血清レベルを各継代培養毎に１／２に減らしてＦＢＳフリーＥｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地中での生育に適応させた。無血清生育への適応を完了し、バイアルを凍結した（リサーチセルバンクＣ３０５６と命名）。
第２のより激しいクローン６８９の無血清Ｅｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地への適応を行った。この適応の前に、リサーチセルバンクＣ３０４３のバイアルを溶解し、培地に入れた。このＥｘ−Ｃｅｌｌ適応クローンをクローン６８９ｂと名付け、リサーチセルバンク（Ｃ３０７１と命名）を調製した。別なリサーチセルバンク（Ｃ３１３１およびＣ３２８７と命名）も調節した。
クローン６８９は無血清培地中出の生育への適応直後の１開の試験を含み、初期の振盪フラスコ試験で約１００μｇ／ｍｌを生産したが、その生産性は６週間の試験中に組み合わせた継代培養で徐々に低下し、約７５から８０μｇ／ｍｌとなった。クローン５１では何故低下が起こったか不明である。
（Ｄ．クローン６８９の安定性）
クローン６８９で３回の安定性試験を行った。コントロールとしてクローン２２８と１８０（双方とも選択Ｅｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地中）の発現レベルもこれらの研究の一部としてモニターした。最初の試験は４％ＦＢＳを含むＥｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地中で選択（マイコフェノール酸、キサンチン、Ｇ４１８）のある場合、ない場合で適応させたクローン６８９で、エレンマイヤーフラスコ（２５ｍｌ細胞／フラスコ）中で開始した。培地を３７°Ｃ、１００ｒｐｍおよび週２回の継代培養でインキュベートした。週１回、細胞を５０ｍｌの２％ＦＢＳと２．５ｍｌの殺菌ＳＰ−セファロース（ビッグビーズ）を補充した非選択Ｅｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地中へ接種した。これらの培養物を次いで３７°Ｃで１２日間生育させ、その後ビーズを集め、洗浄しγＢＰＩ２１を溶出し、上記の様にＨＰＬＣで分析した。この研究は合計１４週間後に終了した。この結果、選択のある場合、ない場合の双方で最初の減少後から６週間の細胞生育（クローン５１で観察されたものと同じ結果）後、選択のある場合、ない場合で少なくとも７週間はクローン６８９は同様な生産性を示し（７５〜８０μｇ／ｍｌ）、その後選択のない場合は細胞生育の生産性は１４週間で６５〜７０μｇ／ｍｌのレベルへ極僅か減少する様に思われる。第２回目の実験は、クローン６８９の完全にＦＢＳフリー培地への２回目の適応で得られたクローン６８９ｂで行われた。この研究は合計１４週間行われた。双方の研究で、培養物を選択のある場合、ない場合でＥｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地中でインキュベートし、上記の様に生産性を評価した。クローン６８９の安定性の研究結果は、１４週間にわたる選択無しで発現レベルに有意の差がないことを示した。最初にＥｘ−Ｃｅｌｌ ３０１に適応させたクローン６８９細胞でも同様な結果が得られた。
（Ｅ．生育と生産性）
クローン６８９の平均の生産性はクローン２２８およびクローン５１より少なくとも約１．５倍高かった。生産性は比生産性と細胞密度の関数であるので、様々なクローンの相対発現レベルが比生産性の差に反映しているかどうかを決めるために試験が行われた。従って、クローン１８０（１コピー）、クローン２２８および５１（２コピー）の生産性がフラスコ振盪試験で比較された。各クローンで、細胞を対数期に生育させ、１〜２×１０５細胞／ｍｌでそれぞれ２％ＦＢＳを補充した５０ｍｌのＥｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地と２％のＳ−セファロースを含む７個の２５０ｍｌエレンマイヤーフラスコ中に接種した。１個のフラスコを各時間ポイントのために用いた。以前の実験は、高濃度（＞１００μｇ／ｍｌ）のγＢＰＩ２１がＣＨＯ−Ｋ１の生育を阻害することを示していた。従って、ＳＰ−セファロースを含まないフラスコにも各クローンを接種し、ビーズの有無による生育を比較した。細胞を３７°Ｃでインキュベートし、ＳＰ−セファロースを第２、３、４、５、８および１２日にフラスコから収穫した。
ＳＰ−セファロースの有無による培養物の細胞生育結果は、最高の生産株でもＳＰ−セファロースの有無による有意な生育の差がないことを示した。これらの結果は、γＢＰＩ２１がＳＰ−セファロースで吸収されない条件下でも分泌されたγＢＰＩ２１が細胞生育に影響しないことを示唆した。最高の誠意ｋはクローン１８０（最大細胞密度約３．５×１０６細胞／ｍｌ）で観察され、クローン２２８（最大細胞密度約３×１０６細胞／ｍｌ）がそれに次いだ。２番目に高い密度はクローン６８９（最大細胞密度約２．５×１０６細胞／ｍｌ）であり、クローン５１は最低の最大細胞密度出会ったが、この結果は実際には細胞の凝集の結果であったと思われる。
ＳＰ−セファロースを加えた培養物に対する生産性試験の結果は、先に観察された様に、少なくとも第５日に測定した場合（クローン２２８が最大の生産性を達成した日）クローン２２８と５１の最大生産性はクローン１８０の生産性の約２倍であり（約５０対２５μｇ／ｍｌ）、クローン６８９の生産性はクローン２２８の生産性の約１．５倍であることを示した。しかしながら、クローン６８９はこの試験中、第１４日に約１００μｇ／ｍｌまで徐々に蓄積した。
上記の結果は、クローン１８０および２２８と同様にクローン５１および６８９が各形質移入から１個飲みのコピーを受け取ったと仮定した場合、クローン１８０、２２８、５および６８９に対する振盪フラスコ中での相対発現レベルは遺伝子導入量に正比例することを示した。この収量の増加がより高い比生産性（ｐｇ／細胞／日）の結果であることを確認するため、我々はクローン１８０に対してこの値を第２〜４日から見積もり、他の細胞株では第３〜５日から見積もったが、その期間では細胞の生存率が高く（＞９９％）、培養物がその最大密度であるか外れに近かった。この計算は、これらの２日間の毎日の平均生産量をこの期間中の平均細胞密度で割って行われた。その結果は、クローン６８９の比生産性（約９ｐｇ／細胞／日）はクローン２２８の比生産性（約４ｐｇ／細胞／日）の約２倍であり、これはクローン１８０の比生産性（約２ｐｇ／細胞／日）の約２倍であることを示した。２遺伝子ベクターによる最初の形質移入で得られ、クローン６８９の親株であるクローン５１は、クローン６８９とほぼ同じ比生産性を有したが、この値は細胞凝集の結果である異常に低い細胞数のために嵩上げされていると思われる。
（Ｆ．クローン６８９によるγＢＰＩ２１の発現に対する培養条件の効果）
具体的には、接種後密封し、１２日のインキュベーション期間後にのみ再度開いたエレンマイヤーフラスコ中でフラスコ振盪試験を行った。これらの条件下では、クローン６８９で平均７５〜８０μｇ／ｍｌに対しクローン２２８では４５〜５０μｇ／ｍｌであった。
Ｓ−セファロースの存在でクローン６８９の生育特性評価の一部として行った実験では、細胞を約１×１０５細胞／ｍｌで２％ＦＢＳとＳ−セファロースを含む３個のフラスコ中に接種した。フラスコの１個を友情の場合と同様に実験期間中閉じたままとし、一方、その他の２個は第２〜７、９、１１日に細胞計数を行うために用いた。第１１日後、Ｓ−セファロースを取り出し、洗浄、溶出しγＢＰＩ２１のレベルをＨＰＬＣで測定した。驚くべきことに、密封フラスコ中の細胞は予想通り７５μｇ／ｍｌでγＢＰＩ２１を発現したのに対し、細胞計数のために試料を取り出したフラスコ中の細胞は平均で約１３０μｇ／ｍｌを発現し、約７０％の増加を示した。先に観察された様に、クローン６８９細胞では第４〜５日に最大細胞密度が約２．５×１０６細胞／ｍｌに達し、“開いた”フラスコ中のγＢＰＩ２１の発現の増加は有意に高い細胞密度のためではないことを示している。
この現象をクローン６８９でさらに検討し、それが他のクローンでも生じるかを調べるため、クローン１８０、２２８および６８９でも同様な実験を行った。その結果は、試験したクローンのすべてで生じることを示した。先の結果と同様、クローン６８９は密封フラスコ中で７９μｇ／ｍｌを生産し、一方、開放フラスコ中では１２８μｇ／ｍｌを生産し６２％の増加であった。クローン２２８は“密封”および“開放”フラスコ中でそれぞれ４７および６２μｇ／ｍｌであり、３２％の増加であった。クローン１８０発現レベルは“開放”対“密封”で約２０％の増加であった。
クローン６８９で最初の開放フラスコ実験では、我々はまた開放されていたフラスコ中の培地がより酸性度が少ないことを観察した。これが第２の実験にも当てはまることを示すため、各フラスコからの培養上澄のｐＨ値を測定した。その結果、開放されていたフラスコからの培地のｐＨは密封されたままのフラスコのｐＨより０．２〜０．５単位高いことが示された。密封と開放フラスコ間の最大ｐＨ差はクローン６８９で生じた。フラスコを開いた時に生じるガス交換が細胞により効率的にグルコースを利用させ、多分乳酸の生産量がより少なくなることが考えられ、それが生育と生産の双方に逆に影響し得る。
これらの実験の結果は、最大の生産性がガス交換の条件下で観察されるので、今後の振盪フラスコ試験にガス交換工程を取り入れるべきであることを示した。
（Ｇ．Ｓ−セファロース無しのγＢＰＩ２１発現レベル）
以前の実験は、Ｓ−セファロースの存在が形質移入細胞の培養上澄からのγＢＰＩ２１の効率的な検出と回収を促進することを示している［ホルビッツ（Ｈｏｒｗｉｔｚ）ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．１８：７７−８５（２０００）］。ビーズがない場合の培地上澄からのγＢＰＩ２１の損失は、ＣＨＯ細胞表面のヘパラン糖タンパク質との相互作用のためであると思われる。
より高い発現レベルを達成することの潜在的な重要性は、γＢＰＩ２１に対する表面受容体が飽和し、Ｓ−セファロースがなくても上澄中のγＢＰＩ２１のレベルが上昇することである。これが当てはまるかどうかを決めるため、クローン１８０、２２８および６８９でＳＰ−セファローズの有無に対するγＢＰＩ２１の発現レベルを比較した。ビーズがない場合の培地の上澄中のγＢＰＩ２１レベルをＥＬＩＳＡで測定し、ビーズから溶出された。γＢＰＩ２１レベルをＥＬＩＳＡおよびＨＰＬＣの双方で測定した。その結果は、生産期間中およびインキュベーション期間の終わりにおけるγＢＰＩ２１レベルはクローン６８９ではより高い発現を生じて増加した。しかしながら、クローン６８９でもγＢＰＩ２１の最適の検出および回収のためにはＳＰ−セファローズビーズが必要であった。
（Ｈ．ＲＮＡレベル）
γＢＰＩ２１ｍＲＮＡの相対的なレベルをクローン２２８と６８９で比較した。クローン２２８、６８９およびＣＨＯ−Ｋ１細胞をＥｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地中で対数期に生育させ、全細胞質ＲＮＡを単離した［ゴーフ（Ｇａｕｇｈ）、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７３：９３−９５（１９８８）］。最初にＲＮＡ試料のリボソームＲＮＡレベルをチェックし、ホルムアミド−１％アガロースゲル上で展開し、ニトロセルロースにブロッテイングし、軽鎖３’非翻訳領域に対する３２Ｐ標識ＤＮＡプローブでハイブリダイゼーションした（図７）。膜を洗浄して非特異的に結合した計数値を除き、Ｘ線フィルムに露光した。図８に示す結果は、クローン６８９がγＢＰＩ２１ｍＲＮＡをクローン２２８より約１．６倍高いレベルでγＢＰＩ２１を発現していることを示した。しかしながら、ＲＮＡａｓｅ保護または定量的ＰＣＲ等の方法がｍＲＮＡレベルのより正確な定量に必要であると思われる。
（Ｉ．まとめ）
従って、本発明によればγＢＰＩ２１をコードするｃＤＮＡの多重コピーを含む（包含する）ベクターが設計される。これらの二重転写ユニットはＣＨＯ−Ｋ１による逐次転写に用いられ、２個の１−転写ユニットベクターを含むクローン２２８のγＢＰＩ２１レベルの約２倍を生産する細胞株クローン６８９が逐次形質移入の結果形成された。この生産性の増加は比生産性の２倍の増加（クローン２２８と比べて）の結果であると思われ、単に細胞密度の増加の結果ではない。実際、クローン６８９細胞はクローン２２８の細胞密度ほど高い密度で生育しないが、より高いγＢＰＩ２１を生産する。さらに、クローン６８９は１４週まで選択なしでその生産性を維持するが、これは大きな培養器中でスケールアップを行うに十分な時間である。本実施例は、驚異的な効率を有する少なくとも２つの異なった戦略における本発明の方法による発現の増加が、非増幅発現系で転写ユニット導入量により達成し得ることを示している。まず第一に、γＢＰＩ２１遺伝子をコードする転写ユニットの多重コピー間に選択マーカー遺伝子を置くことにより、相同組み換えの問題を回避し、γＢＰＩ２１遺伝子の多重コピーを発現する生産性の高い安定な細胞株を開発することができる。第２に、本発明の方法で細胞を逐次的に形質移入することにより、転写ユニットの多重組み込みコピー数を段階的に増加させて発現レベルを増加させることができる。本発明は関心のある任意のポリペプチドをコードする任意の転写ユニットの使用を想定しており、当業者が理解し得る様に、γＢＰＩ２１で例示される様なＢＰＩタンパク質に限定されるものではない。
（実施例４）
（第３の逐次ベクター形質移入による発現のさらなる増加：形質移入クローンおよび細胞株）
本実施例は、第３の多重転写ユニットベクターを用いる例示細胞株の第３の逐次形質移入による発現と生産のさらなる増加と、その結果のポリペプチド生産レベルが増加したクローンおよび細胞株を説明する。
（Ａ．逐次形質移入体の選択と開発）
選択マーカー遺伝子で区切られた転写ユニットの多重コピーによるさらなる逐次形質移入を行って、転写ユニット発現の増加を試験した。２個のγＢＰＩ２１遺伝子を含むベクターと第３の選択マーカーによる第３の逐次形質移入により、遺伝子導入量の増加に基づき、その遺伝子導入量が達成可能であるとすれば、クローン６８９の少なくとも１．５倍の発現レベルが得られると考えられる。クローン６８９は３回目に逐次形質移入される。この細胞株は、γＢＰＩ２１の２個のコピーと、ヒスチジノール耐性を選択するための選択マーカーであるｈｉｓ遺伝子を含むベクターｐＩＮＧ１７５３で形質移入された。形質移入と選択に続き、合計で約５００個の３重形質移入体クローンが９６ウエルレベルおよび８５個の３重形質移入体クローンが２４ウエルレベルでＳ−セファロースによりスクリーニングされた。２４ウエルレベルで試験した場合、最高の生産株はγＢＰＩ２１をクローン６８９と比較して１．５倍まで高いレベルで分泌したが、密封フラスコ中で行われた最初の振盪フラスコ試験ではクローン６８９より２０〜３０％高いレベルで分泌したのみであった。最高の生産性のクローン（３４１）を以後の研究のために選んだ。
（Ｂ．開放フラスコ条件下での生産）
実施例３で説明したガス交換を行った場合の振盪フラスコ中での発現増加の驚くべき結果に続いて、振盪フラスコ試験を再度行ったが、このたびは開放フラスコを用いた。２％ＦＢＳを補充したＥｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地中での開放振盪フラスコ試験でいくつかの３重形質移入体を評価した。その結果は、以前にクローン３４１（クローン６８９を形質移入して得られた３重形質移入体）で観察されたものより発現レベルが相当高いことが示された。事実、４回の独立の試験で、クローン３４１はクローン６８９（６７．８μｇ／ｍｌ〜９３．４μｇ／ｍｌの範囲）より終始高いレベル（１０７．６μｇ／ｍｌ〜１４２．０μｇ／ｍｌの範囲）で分泌した。従って、３重形質移入体であるクローン３４１は２４ウエルレベルおよび開放振盪フラスコ中で約１．５倍の増加を達成した。
（Ｃ．３４１の１％ＦＢＳへの適応）
続いて、１％ＦＢＳを補充したＥＸ細胞３０１培地中での生育に適応後のクローン３４１を試験した。Ｅｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地中、最初に３重逐次形質移入体を４％ＦＢＳ中で選択し、次いで２％ＦＢＳ中に適応させた。次にクローン３４１を１％ＦＢＳに適応させ、振盪フラスコ試験で再試験した。８回の振盪フラスコ試験の結果は、このクローンは、γＢＰＩ２１の濃度が１２２．６μｇ／ｌ〜１４４．８μｇ／ｌの範囲にあるその高い生産性を１７週間にわたる少なくとも３３回の継代培養で維持したことを示した。
（Ｄ．クローン３４１のサブクローニングおよびクローン８３の開発）
クローン３４１を完全に無血清条件に適応させる試みは最初は成功しなかった。さらに、上記の発現レベルは最初の密封フラスコ実験のものより高く、クローン６８０のサブクローンで達成されたものより若干高かったが、発現レベルをさらに改善しより速く生育しより生産性の高いクローンを潜在的に選択するため、クローン３４１をサブクローニングした。細胞を１％ＦＢＳを含むＥｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地中に３０、１５、７．５および３細胞／ウエルで播種した。単一コロニーのウエルからの合計６９クローンを２４ウエルプレートに移し、次いで生産性を評価するために振盪フラスコに移した。これらのうち、最高の６クローンを９０日にわたる再評価のために最終的に確保し、γＢＰＩ２１生産のためのスクリーニングを周期的に行った。スクリーニングの結果は、クローン８３が振盪フラスコ試験で１５０〜１６５μｇ／ｍｌ（親クローン３４１の約１３５μｇ／ｍｌと比較して）の範囲を分泌する最高のサブクローンであると同定されたことを示した。
（Ｅ．クローン３４１サブクローンであるクローン８３の生産性および安定性）
完全選択条件下に６個のクローンをさらに８週間維持し、生産性を評価した。その結果は、クローン８３が最良の生産株であり、２回の試験では１８０および１９５μｇ／ｍｌを分泌し、常に親クローン３４１を上回ることを示した。
クローン８３の安定性を、サブクローンを選択のある場合、ない場合でＥＸ細胞３０１培地中で生育させて試験した。細胞を各週２回継代培養し、毎週振盪フラスコ試験を設定した。その結果は、クローン８３は選択のある場合は安定な範囲である約１６０μｇ／ｍｌを維持することを示した。しかしながら、クローン８３は選択がない場合少なくとも５週間は生産性を維持したが、選択を行わない場合、第７周にγＢＰＩ２１のレベルが約１２０μｇ／ｍｌに低下した。これらの結果は、このサブクローンが選択なしで少なくとも５週間（１０回の継代培養、３０〜３５世代）安定であることを示している。その他のクローン６８９サブクローンは選択なしでより長い期間安定であることが示された。選択なしの生産性の低下は、組み込まれたＤＮＡがコードするヒスチジノール耐性の不安定性によるものと思われる。もしそうであれば、初期のスケールアップ段階でヒスチジノールを培地中に維持することで高い生産性が維持されると思われる。
（実施例５）
（エンハンサーが欠失する多重転写ユニットベクターによる逐次形質移入：クローンおよび細胞株の開発と特徴付け）
本実施例は、多重転写ユニットベクターによる逐次形質移入により、エンハンサーをベクターから除去しても一定の転写ユニットの発現量を有効に増加させることを示すものである。これは、クローン５１と同様にγＢＰＩ２１遺伝子を含みＩｇエンハンサーを持たない例示ベクターｐＩＮＧ１７４４で形質移入されたクローン３３８である例示クローンの開発と特徴付けで示される。得られたクローン、すなわちクローン３３８は次にＩｇエンハンサーを持たない第２の２−遺伝子（γＢＰＩ２１）ベクターであるｐＩＮＧ１９１５で形質移入され、特徴付けされた。クローン５８は逐次形質移入で得られ、スクリーニングにより単一形質移入体であるクローン３３８よりかなり高い濃度でγＢＰＩ２１の発現を示した。
（Ａ．ｐＩＮＧ１７４４による形質移入：クローン３３８）
クローン３３８を、それぞれＣＭＶプロモーターと、ＭＰＡ耐性形質移入体を選択するためのｇｐｔ遺伝子を有するがＩｇエンハンサーを持たない軽鎖３’非翻訳領域の制御下にある２個のγＢＰＩ２１遺伝子を含むベクターｐＩＮＧ１７４４を有する付着したＣＨＯ−Ｋ１細胞の形質移入で開発した。ｐＩＮＧ１７４４は形質移入に先立ってＸｂａＩ部位で最初に消化され、選択マーカー遺伝子がγＢＰＩ２１遺伝子の２個のコピー間に置かれた（図５）。
Ｅｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地に適応したクローン３３８細胞を最初に２％ＦＢＳの存在で生育させ、振盪フラスコ試験で約１００μｇ／ｍｌを生産した。次に細胞を１％ＦＢＳを補充したＥｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地に適応させ、８０〜１００μｇ／ｍｌの生産性を維持した。
（Ｂ．選択によるクローン３３８の安定性）
マイコフェノール酸に対する選択はＥｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地中では相対的に弱く、高い発現レベルの維持はこのクローンが比較的安定であることを示している。安定性をさらに調べるため、培養体を１％ＦＢＳを補充したＥｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地中で選択のある場合、ない場合で生育させた。細胞を週に２回継代培養し、振盪フラスコ試験を毎週設定した。その結果は、選択のある場合、ない場合で７週間にわたりγＢＰＩ２１が約１００μｇ／ｍｌで発現したことを示したが、選択がない場合はこの期間中に約２０μｇ／ｍｌの発現の若干の現象が見られた。これらの結果は、選択のない細胞はγＢＰＩ２１を若干低いレベルで発現したが、このクローンは選択なしで少なくとも７週間安定であった。この実験は第７週で中止した。
（Ｃ．ｐＩＮＧ１９１５による形質移入：クローン５８）
発現をさらに最適化させるため、１％ＦＢＳを補充したＥｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地に適応させたクローン３３８を、Ｇ４１８耐性形質移入体を選択するためのｎｅｏ遺伝子を含む以外はｐＩＮＧ１７４４に類似しているが、Ｉｇエンハンサーを欠失するｐＩＮＧ１９５１で再形質移入した。合計約６００の形質移入体を９６ウエルレベルでスクリーニングし、２５０をＳ−セファロースを含む２４ウエルプレート中でスクリーニングした。このスクリーニングの結果は、３０〜６０μｇ／ｍｌで分泌するいくつかのクローンを明らかにした。比較として、単一のＩｇエンハンサーを有する２−遺伝子ベクターに対する２４ウエルプレート中の最高の発現レベルは、一般に約１５μｇ／ｍｌであり、２個のこの様な２−遺伝子ベクターのレベルは３０〜３５μｇ／ｍｌであり、この様な２−遺伝子ベクターによる第３の形質移入によるレベルは同様な条件下で約４５μｇ／ｍｌであった。
スクリーニングされた、２０〜６４μｇ／ｍｌを分泌する約６００個の形質移入体由来の最高の７６クローンを振盪フラスコ中に移し、最初は４％ＦＢＳを補充したＥｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地中で生育させた（振盪フラスコ生育へスムースに移行するため）。２シリーズの形質移入体に対する最初の振盪フラスコ試験の結果は、分析の時点でクローン６８９およびクローン３４１のサブクローン（先の逐次形質移入体由来のサブクローン６８９．４７および３４１．８３）のレベル以上を分泌するいくつかのクローンがあることを示した。
最高のクローンを２％ＦＢＳを含むＥｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地に維持し適応させ、更に数回再スクリーニングした。その結果は、クローン５８はサブクローン６８９および３４１（サブクローンサブクローン６８９．４７および３４１．８３）と等しいかそれより高いレベルで終始分泌し、各サブクローンが由来するクローン３３８よりかなり高いレベルであることを示した。例えば、クローン３３８のサブクローンはは７週間にわたり８０．８〜１０１．４μｇ／ｍｌの分泌レベルでスクリーニングされ、クローン６８９のサブクローン（サブクローン６８９．４７）は１１２．０μｇ／ｍｌ〜１３４．８μｇ／ｍｌで分泌し、クローン３４１のサブクローン（サブクローン３４１．８３）は同じ期間で９５．２μｇ／ｍｌ〜１２１．４μｇ／ｍｌであった。対照的に、クローン５８はこの試験期間中に１１９μｇ／ｍｌ〜１３４．４μｇ／ｍｌで分泌した。上記で試験したクローン３３８の逐次形質移入体はクローン３３８より高いレベルで分泌したが、逐次形質移入により転写ユニットコピーの数は効果的に２倍になったが、それらは２倍のレベルでは分泌しなかった。これは生育に関連する差か、培地中の限度か、および／またはプラスミドｐＩＮＧ１９１５がｐＩＮＧ１７４４と同じレベルで発現する、クローン３３８を形成するために用いられた形質移入体をこれらの実験では形成できなかったためと思われる。それにも関わらず、この実施例は本発明による転写ユニットの多重コピーを含むベクターを用いる逐次形質移入が、ベクターからエンハンサーを除去した場合でも効果的に発現レベルを増加させることを明らかに示している。
（実施例６）
（別な発現ベクターの構築）
本実施例は別な例示転写ユニットの多重コピーを含む発現ベクターの構築を説明する。記載される例示ベクターコンストラクトはまた、関心のあるポリペプチドをコードする例示遺伝子配列、例えば軽鎖および／または重鎖配列を含む免疫グロブリン遺伝子配列の多重コピーを含んでいる。
（Ａ．マウス−ヒトキメラＩＮＧ−１軽鎖遺伝子）
ＣＨＯ−Ｋ１細胞中で最適発現のために必要な要素を含むマウス−ヒトキメラＩＮＧ−１軽鎖（配列番号：５および６）および重鎖（配列番号：７および８）をコードする配列を有するベクターが構築された。これらのＩＮＧ−１ベクターは共にヒト遺伝子操作抗体遺伝子の構築のための出発点となり、マウス−ヒトキメラＩＮＧ−１を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞株を開発するために用いられている。以下に述べる発現ベクターはＣＭＶプロモーター、マウスκ軽鎖３’非翻訳領域および選択遺伝子マーカーと軽鎖および／または重鎖配列をコードする転写ユニットを有する。
マウス軽鎖３’非翻訳領域と融合したマウス−ヒトキメラＩＮＧ−１軽鎖遺伝子（配列番号：５）を有するｐＩＮＧ２２０７をＳａｌＩプラスＨｐａＩで消化してマウス−ヒトキメラＩＮＧ−１軽鎖ベクターｐＩＮＧ１９２８を構築し（例えば米国特許第５、５７６、１８４号参照）、軽鎖を含む約２２００ｂｐフラグメントを単離した（図９）。このフラグメントはｐＩＮＧ１７３２由来の約６３００ｂｐのＳａｌＩ−ＨｐａＩベクターフラグメントとライゲーションされ、マウス−ヒトキメラＩＮＧ−１軽鎖遺伝子（配列番号：５）をＣＭＶプロモーターとマウス軽鎖３’非翻訳領域の制御下に置いている（図９）。キメラマウス−ヒトＩＮＧ−１軽鎖の配列は配列番号：５として示される。また別な軽鎖可変領域遺伝子も以下に述べるヒト遺伝子操作抗体可変領域遺伝子配列を含みｐＩＮＧ１９２８のＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローンニングすることができる。
（Ｂ．マウス−ヒトキメラＩＮＧ−１重鎖遺伝子を有する発現ベクターの構築）
マウス−ヒトキメラＩＮＧ−１重鎖遺伝子（配列番号：７）を有するマウス−ヒトキメラＩＮＧ−１重鎖ベクター（配列番号：７および８）ｐＩＮＧ１９３１がＳａＩプラスＮａｅＩによるｐＩＮＧ２２２５の消化で構築され（例えば米国特許第５、５７６、１８４号参照）、重鎖遺伝子配列を有する１４３３フラグメントを単離した。このフラグメントをＸｈｏＩでし、末端を平滑化するためにデオキシリボヌクレオチドの存在下にＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理し、次いでＳａｌＩで処理しマウス−ヒトＩＮＧ−１重鎖遺伝子（配列番号：７）をヒトＣＭＶプロモーターとマウス軽鎖３’非翻訳領域（図１０）の制御下に置くｐＩＮＧ１７３６（実施例１に記載、ｇｐｔ遺伝子の代わりにｎｅｏ遺伝子を含む以外はｐＩＮＧ１７４０に類似）由来の７３５２ｂｐのベクターフラグメントとライゲーションした。キメラマウス−ヒトＩＮＧ−１重鎖は配列番号：７で示される。別な重鎖可変領域遺伝子も、以下に述べる様にヒト遺伝子操作抗体可変領域遺伝子を含めＳａｌ−ＡｐａＩ部位にクローニングされる。
（Ｃ．マウス−ヒトキメラ軽鎖プラス重鎖発現ベクター（２−遺伝子ベクター）の構築）
マウス−ヒトキメラＩＮＧ−１軽鎖プラス重鎖遺伝子配列（配列番号：５および７）を有するベクターが、ｐＩＮＧ１９２８およびｐＩＮＧ１９３１を用いて構築された。ｐＩＮＧ１９３１はＥｃｏＲＶで消化され、子牛腸アルカリホスファターゼ（ＣＬＰ）で処理された。ＥｃｏＲＶはユニークＮｏｔＩ部位に隣接するユニーク部位（および円弧状マップ上で反時計回りに）で切断する。ｐＩＮＧ１９２８はＮｏｔＩおよびＨｐａＩで消化され、次いで末端を平滑化するためにデオキシリボヌクレオチドの存在下にＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理される。マウス−ヒトキメラ軽鎖遺伝子（配列番号：５）を含む３７２０ｂｐのフラグメントを精製し、マウス−ヒトキメラ重鎖遺伝子（配列番号 ７）を有するＥｃｏＲＶ消化ｐＩＮＧ１９３１とライゲーションされた。図１１に示される様に、ｐＩＮＧ１９３２およびｐＩＮＧ１９３２Ｒで示される二つの可能な配位が得られる。
（Ｄ．ヒト遺伝子操作ＩＮＧ−１軽鎖遺伝子を有する発現ベクターの構築）
ヒト抗体可変領域ドメインの遺伝子操作は抗体分子の結合活性を維持しながら免疫原性を減少させる方法としてスチュドニッカ（Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ）により記載されている［スチュドニッカら、米国特許第５、７６６、８８６号；スチュドニッカら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、７：８５０−８１４（１９９４）］。この方法によれば、可変領域の各アミノ酸が置換のリスクで指定された。アミノ酸置換は３つのリスク分類の１つで区別される：（１）低リスク変化とは、抗原結合またはタンパク質の折り畳みの機会を最少にして免疫原性を減少させる最大の可能性を有するものを言う；（２）中程度のリスク変化とは、さらに免疫原性を減少させるが、抗原結合またはタンパク質の折り畳みに影響する機会が大きいものを言う；（３）高リスク残基とは、結合（例えばＣＲＤループ）または抗体の構造を維持するのに重要であり、抗原結合またはタンパク質の折り畳みが影響されるリスクが最大であるものを言う。
ヒト遺伝子操作ＩＮＧ−１軽鎖ベクターｐＩＮＧ１９３３（図１２）が、マウス−ヒトキメラＩＮＧ−１軽鎖遺伝子を含むｐＩＮＧ９２８をＳａｌＩプラスＮｏｔＩで消化して構築され（図９）、１５１８ｂｐのフラグメントをＣＭＶプロモーターで分離し、ｐＩＮＧ１９２８をＨｉｎｄＩＩＩプラスＮｏｔＩで別途消化して、ヒト軽鎖不変領域、マウス軽鎖３’非翻訳領域およびＧ４１８耐性形質移入体を選択するためのｅｏ遺伝子を有する６５６６ｂｐのフラグメントを単離した。これらのフラグメントを４００ｂｐのＰＣＲで生成した、合計６個の低リスクアミノ酸置換で遺伝子操作されたヒトＩＮＧ−１軽鎖可変領域（図１３；配列番号：９）を有するＳＡｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとライゲーションし、低リスクヒト遺伝子操作ＩＮＧ−１軽鎖遺伝子をＣＭＶプロモーターとマウス軽鎖３’非翻訳領域の制御下に置いた。ＩＮＧ−１軽鎖可変領域における低リスク変化と共に低プラス中リスク変化が図１３に示される。軽鎖では、記載された様に合計６個の低リスク変化が低リスク可変領域（配列番号：１０）に行われ、別個に合計１０個の低プラス中リスク変化が軽鎖中の低プラス中リスク可変領域に行われた（配列番号：１１および１２）。ベクターｐＩＮＧ１９３３はＰＣＲで生成した、６個の低リスク変化を含むヒト遺伝子操作ＩＮＧ−１軽鎖可変領域を有する。低リスク修飾軽鎖可変領域をコードするＤＮＡフラグメントを６個の重複オリゴヌクレオチドＫＬ１（配列番号：１３）、ＫＬ２（配列番号：１４）、ＫＬ３（配列番号：１５）、ＫＬ４（配列番号：１６）、ＫＬ５（配列番号：１７）およびＫＬ６（配列番号：１８）を用いて構築した。これらのセグメントは相互にアニールし、ＤＮＡポリメラーゼで延長し、次いで組み立てた可変領域を５’前方向プライマーＫＦ（配列番号：１９）および２’逆方向プライマーを用いてＫＲ（配列番号：２０）を用いてＰＣＲで増幅、ＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化して発現ベクターｐＩＮＧ１９２８内に直接クローニングし制限フラグメントを作成し、図１２に示すｐＩＮＧ１９３３を得た。別な発現ベクターｐＩＮＧ１９３９を同様な方法を用いて構築したが、これは図１３（配列番号：１１および１２）に示す様に、ｐＩＮＧ１９３９が低プラス中リスク変化で遺伝子操作されたヒトＩＮＧ−１軽鎖可変領域を有する以外はｐＩＮＧ１９３３に類似している。低プラス中リスク修飾軽鎖可変領域が、上記の低リスク修飾可変領域に用いられた５個を含む６個の重複オリゴヌクレオチド、即ちＫＬ１（配列番号：１３）、ＫＭ２（配列番号：２１）、ＫＬ３（配列番号：１５）、ＫＬ４（配列番号：１６）、ＫＬ５（配列番号：１７）およびＫＬ６（配列番号：１８）を用いて構築された。
（Ｅ．ヒト遺伝子操作ＩＮＧ−１重鎖遺伝子を有する発現ベクターの構築）
ヒト遺伝子操作ＩＮＧ−１重鎖ベクターであるｐＩＮＧ１９３６（図１４）を、マウス−ヒトキメラＩＮＧ−１重鎖を含むｐＩＮＧ１９３１をＳａｌＩプラスＡｐａＩで消化して構築し、ＣＭＶプロモーター、重鎖不変領域、軽鎖３’非翻訳領域、およびＧ４１８耐性形質移入体を選択するためのｎｅｏ遺伝子を有する８３４４ｂｐのフラグメントを単離した。このフラグメントを、合計１３個の低リスクアミノ酸置換で遺伝子操作したヒトＩＮＧ−１重鎖可変領域を有する４５０ｂｐのＰＣＲで生成したＳＡｌＩ−ＡｐａＩフラグメントとライゲーションし（図１５；配列番号：２２）、低リスクヒト遺伝子操作ＩＮＧ−１重鎖をＣＭＶプロモーターとマウス軽鎖３’領域非翻訳領域の制御下に置いた。ＩＮＧ−１重鎖可変領域における低リスク変化と低プラス中リスク変化を図１５に示す。重鎖では、上記の様に低リスク重鎖可変領域（配列番号：２３）に対して合計で１３個の低リスク変化が行われ、それとは別に合計２０個の中リスク変化を低プラス中リスク可変領域（配列番号：２４および２５）に行った。別に付着するベクターｐＩＮＧ１９３６は、１３個の低リスク変化を含むＰＣＲで生成したヒト遺伝子操作ＩＮＧ−１重鎖可変領域を含む。重鎖可変領域をコードするＤＮＡフラグメントを６個の重複するオリゴヌクレオチドＧＬ１（配列番号：２６）、ＧＬ２（配列番号：２７）、ＧＬ３（配列番号：２８）、ＧＬ４（配列番号：２９）、ＧＬ５（配列番号：３０）およびＧＬ６（配列番号：３１）を用いて構築した。これらのセグメントを相互にアニーリングし、ＤＮＡポリメラーゼで延長し、組み立てた可変領域を５’前方向プライマーＧＦ（配列番号：３２）および３’逆方向プライマー（配列番号：３３）を用いてＰＣＲで増幅し、ＳａｌＩおよびＡｐａＩを用いて消化して発現ベクターｐＩＮＧ１９３１中に直接クローニングされた制限フラグメントを作成し、図１４に示す様なｐＩＮＧ１９３６を生成した。他の発現ベクターｐＩＮＧ１９４２を同様な方法を用いて構築したが、これはｐＩＮＧ１９４２が図１５に示す様な低プラス中リスク変化で遺伝子操作されたヒトＩＮＧ−１重鎖可変領域（配列番号：２４および２５）を有する以外はｐＩＮＧ１９３６に類似している。低プラス中リスク修飾重鎖可変領域を、上記の低リスク修飾可変領域の構築に用いられた２個を含む６個の重複オリゴヌクレオチドＧＬ１（配列番号：２６）、ＧＭ２（配列番号：３４）、ＧＭ３（配列番号：３５）、ＧＭ４（配列番号：３６）、ＧＭ５（配列番号：３７）およびＧＬ６（配列番号：３１）を用いて構築した。
（Ｆ．ヒト遺伝子操作ＩＮＧ−１軽鎖プラス重鎖遺伝子を有する発現ベクターの構築）
ヒト遺伝子操作ＩＮＧ−１軽鎖プラス重鎖遺伝子を有するベクターｐＩＮＧ１９３７をｐＩＮＧ１９３３およびｐＩＮＧ１９３６を用いて構築した（図１６）。ｐＩＮＧ１９３６をＸｂａＩで消化し、Ｔ４ポリメラーゼで処理し次いでＮｏｔＩで消化した。８７８０ｂｐの制限フラグメントを生成した。ｐＩＮＧをＮｈｅ１、次いでＮｏｔＩおよびＨｐａＩで消化し、ヒト遺伝子操作軽鎖遺伝子を有する３７１２ｂｐのフラグメントを精製しＸｂａｌ−ＮｏＩで消化したｐＩＮＧ１９３６とライゲーションし、Ｇ４１８耐性形質移入体を選択するためのｎｅｏ遺伝子を有するｐＩＮＧ１９３７を生成した。軽鎖プラス重鎖発現ベクターを構築するために使用する前に、可変領域ＤＮＡを再配列した。ｐＩＮＧ１９３７の特徴を表１にまとめる。
Figure 0004554370
ａＮＳ−未同定の制限部位
マイコフェノール酸耐性形質移入体の選択用のｇｐｔ遺伝子を有する以外はｐＩＮＧ１９３７に類似のベクターｐＩＮＧ１９５９を、（それぞれＣＭＶプロモーターと軽鎖３’非翻訳領域に融合したヒト遺伝子操作ＩＮＧ−１軽鎖および重鎖遺伝子を有する）ｐＩＮＧ１９３７由来の７６９６ｂｐのＨｐａＩ−ＮｏｔＩフラグメントと、ｇｐｔをコードする遺伝子を有するｐＩＮＧ４１４由来の４４４１ｂｐのフラグメントをライゲーションして、図１７に示す様に構築した。
ヒスチジノール耐性形質移入体を選択するためのｈｉｓ遺伝子を有する以外はｐＩＮＧ１９３７およびｐＩＮＧ１９５９に類似するベクターｐＩＮＧ１９５７を、ｐＩＮＧ１９３７由来の７６９６ｂｐのＨＰＡｉ−ＮｏｔＩフラグメント（上記）と、
ｈｉｓ遺伝子を有するｐＩＮＧ４１５２由来の４６３９ｂｐのＨｐａＩ−ＮｏｔＩフラグメント（上記実施例１に記載）をライゲーションして、図１８に示す様に構築した。
他のベクターｐＩＮＧ１９４４を上記ｐＩＮＧ１９３７の構築に用いられたものと同様な方法で構築したが、これはｐＩＮＧ１９４４がｐＩＮＧ１９３３の代わりにｐＩＮＧ１９３９を用い、ｐＩＮＧ１９３６の代わりにｐＩＮＧ１９４２を用いて構築された以外はｐＩＮＧ１９３７と類似している。得られたベクターｐＩＮＧ１９４４は図１３および１５に示される様に低プラス中リスク形質移入体の双方を有する軽鎖および重鎖可変領域（配列番号：１１、１２、２４、２５）を含んでいる。こうして、低リスクＩＮＧ−１（ｐＩＮＧ１９３７）および低リスクＩＮＧ−１（ｐＩＮＧ１９４４）双方のための発現ベクターが調製された。
（Ｇ．ヒト遺伝子操作ＩＮＧ−１軽鎖および重鎖遺伝子の２−コピーを有する発現ベクターの構築（４−遺伝子ベクター））
ヒト遺伝子操作ＩＮＧ−１重鎖プラス軽鎖ベクターｐＩＮＧ１９３７をＮｏｔＩで処理し、デオキシリボヌクレオチドの存在下にＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑末端とし、自己クローニングさせ、ＮｏｔＩ部位を破壊して図１９に示す様にＮｏｔＩ部位が欠失したベクターｐＩＮＧ１９６３を形成した。ベクターｐＩＮＧ１９３７を次にＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＶで消化し、９９０５ｂｐのフラグメントを精製し１０２９８ｂｐのｐＩＮＧ１９６３由来のｎＨｅＩ−ＨｐａＩフラグメントとライゲーションし、図２０に示す様に４個のＩＮＧ−１遺伝子（４−遺伝子ベクター）を有するベクターｐＩＮＧ１９６４を形成した。ｐＩＮＧ１９６４はヒト遺伝子操作ＩＮＧ−１軽鎖遺伝子の２個のコピーと、ＩＮＧ−１重鎖遺伝子の２個のコピーを有し、４個の遺伝子のそれぞれはＣＭＶプロモーター、軽鎖３’非翻訳領域およびＧ１４８耐性形質移入体を選択するためのｎｅｏ遺伝子の制御下にある。マイコフェノール酸耐性形質移入体を選択するためのｇｐｔ遺伝子を含む以外はｐＩＮＧ１９６４に類似したベクターｐＩＮＧ１９６５を、ｐＩＮＧ１９５９由来のＨｐａＩ−ＳｆｉＩフラグメントをｐＩＮＧ１９６４由来のＨｐａＩ−ＳｆｉＩフラグメントとライゲーションして図２１に示す様に構築した。
ｐＩＮＧ１９６４またはｐＩＮＧ１９６５をユニークＮｏｔＩ部位で消化すると、４個の転写ユニットを含む直線状の制限フラグメントが得られるが、ヒト遺伝子操作ＩＮＧ−１軽鎖プラス重鎖遺伝子の２個のコピーは、選択マーカー遺伝子ｎｅｏまたはｇｐｔ遺伝子が２個の同じ軽鎖および重鎖転写ユニットの間に置かれる様にそれぞれ形成される。直線状ＮｏｔＩ消化ＤＮＡとして見ると、ベクター内の要素の順番は次の通りである：ＣＭＶプロモター、軽鎖遺伝子、軽鎖３’非翻訳領域、ＣＭＶプロモーター、重鎖遺伝子、軽鎖３’非翻訳領域、ｎｅｏ（ｐＩＮＧ１９６４）またはｇｐｔ（ｐＩＮＧ１９６５）遺伝子、ｂｌａ（Ａｍｐ１）遺伝子、ＣＭＶプロモーター、軽鎖遺伝子、軽鎖３’非翻訳領域、ＣＭＶプロモーター、重鎖遺伝子、軽鎖３’非翻訳領域。
（実施例７）
（別な形質移入クローンおよび細胞株の開発と特徴付け）別な形質移入クローンおよび細胞株の開発と特徴付け
本実施例は、本発明による別な例示ベクターで形質移入された別なクローンと細胞株の開発と特徴付けを説明する。免疫グロブリン生産細胞株の開発と特徴付けを、実施例６に記載される例えば２個の遺伝子ベクターによる形質移入から説明する。
（Ａ．ｐＩＮＧ１９３２およびｐＩＮＧ１９３２Ｒ）
実施例６で説明した発現ベクターｐＩＮＧ１９３２およびｐＩＮＧ１９３２ＲをＥｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地に適応したＣＨＯ−Ｋ１細胞中に形質移入した。具体的には、Ｅｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地中で懸濁生育に適応したＣＨＯ−Ｋ１細胞に４０μｇの直線化したベクターをエレクトロポーレーションした。ｐＩＮＧ１９３２およびｐＩＮＧ１９３２Ｒの双方はユニークＮｏｔＩ部位を含む。形質移入のためのＤＮＡを調製する場合、ＮｏｔＩ部位での消化により直線状ＤＮＡが得られ、ＣＭＶプロモーターと軽鎖３’非翻訳領域の制御下にある軽鎖および／または重鎖遺伝子はＣＨＯ染色体中に挿入すると選択マーカー遺伝子で分離されている。ｐＩＮＧ１９３２では重鎖と軽鎖は同じ方向に配向し、ｐＩＮＧ１９３２Ｒではそれらは反対の方向に配向している。
細胞を２％ＦＢＳとＧ４１８を補充したＥｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地を含む９６ウエルプレートに播種した。ｐＩＮＧ１９３２およびｐＩＮＧ１９３２Ｒそれぞれにつき、合計１５５および１６８個のクローンを９６ウエルプレート中でスクリーニングした。各形質移入のための最高の２２個のクローンをＦＢＳフリーＥｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地を含む２４ウエルプレートに移した。
２％ＦＢＳのある場合、ない場合で２４ウエルプレート中、Ｅｘ−Ｃｅｌｌ ３１０培地中の生産性試験を行った。細胞が死滅するまで培養し、培養上澄中に分泌された抗体のレベルをＩｇＧ用の免疫グロブリンＥＬＩＳＡ分析で試験した。その結果は、ｐＩＮＧ１９３２形質移入体は一般的にｐＩＮＧ１９３２Ｒ形質移入体より高いレベルの免疫グロブリンポリペプチドを分泌したことを示した。興味があるのは、免疫グロブリンポリペプチドの分泌レベルがＦＢＳ補充した培地中よりＦＢＳのない培地中の方が高いことである。各グループの最高の形質移入体は約７μｇ／ｍｌから約３０μｇ／ｍｌ以上の範囲のポリペプチドを分泌した。
ｐＩＮＧ１９３２形質移入由来の最高の７クローン（例えばクローン２７、４０および８２を含む）、およびｐＩＮＧ１９３２Ｒ形質移入由来の最高のクローン（クローン１６８Ｒ）を、Ｅｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地を含む振盪フラスコに移した。細胞が懸濁生育に適応すると直ちに、２％ＦＢＳを含む、または含まないＥｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地中でこれらのクローンの振盪フラスコ試験を行った。２５ｍｌの培地を含む１２５ｍｌのエレンマイヤーフラスコ中で細胞を１０日間まで生育させた。フラスコをほとんどのインキュベーション期間中密封し、インキュベーション期間の終わりに培養培地中の免疫グロブリンポリペプチドのレベルをＩｇＧ ＥＬＩＳＡで測定した。最初の振盪フラスコ試験の結果は、最高のクローン（クローン４０）が６６μｇ／ｍｌまでのポリペプチドを分泌したことを示した。多くの場合、ＦＢＳの有無による培養間で生産性にほとんど差がなかった。
インキュベーション期間中、定期的に開かなかったフラスコで最初の振盪フラスコ試験を行った。少なくとも１日おきにガス交換工程を行うことは、あるγＢＰＩ２１生産ＣＨＯ−Ｋ１クローンの生産性に重大な影響を与えることが上記実施例３および４で見出されているので、この手法をクローン２７、４０、８２および１６８Ｒで評価した。細胞を１．５×１０５細胞／ｍｌで２個の１２５ｍｌエレンマイヤーフラスコ中の１％ＦＢＳを含む２５ｍｌＥｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地中に播種し、３７°Ｃ、１００ＲＰＭでインキュベートした。フラスコの１つはインキュベーション期間中密封したままとし、他のフラスコを細胞計数と通気のために毎日開いた。その結果は、定期的に開いたフラスコ中で生育した細胞は、フラスコが閉じたままであったもの（例えば約３５μｇ／ｍｌ〜約８１μｇ／ｍｌ）より高いレベル（例えば約５０μｇ／ｍｌ〜約１１６μｇ／ｍｌ）で免疫グロブリンポリペプチドを発現したことを示した。これらの結果は、条件が若干異なるが（第２の試験では１％ＦＢＳ、第１の試験では２％ＦＢＳ）、最初に振盪フラスコ試験で得られた結果（例えば約４５μｇ／ｍｌ〜約６６μｇ／ｍｌ）に対応する。
定期的に開いた培養の、様々な時間における生育と生産性を試験した。クローン２７および４０に対する解析結果は、対数期および定常期の双方で細胞がマウス−ヒトキメラ抗体を生産することを示した。
（Ｂ．ｐＩＮＧ１９３７）
ヒト遺伝子操作ＩＮＧ−１低リスク軽鎖および重鎖遺伝子とｎｅｏ（Ｃ１４８耐性）遺伝子を各１個ずつ含む発現ベクターｐＩＮＧ１９３７をＸｂａＩで消化して直線化し、次いでＥｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地中で無血清適応ＣＨＯ−Ｋ１細胞中に形質移入した。Ｇ４１８耐性形質移入体を最高形質移入体の一つとして選択し、約６０ｍｇ／ｍｌまで振盪フラスコ中で、約２００ｍｇ／Ｌまで培養器中で生産した。
（実施例８）
（第２の逐次ベクター形質移入による発現の増加：別な形質移入クローンおよび細胞株の開発）
本実施例は例示細胞株の第２の多重転写ユニットベクターを用いる第２の形質移入によるポリペプチド、例えば免疫グロブリンのの発現と生産のさらなる増加を説明する。
低リスクヒト遺伝子操作ＩＮＧ−１軽鎖遺伝子と低リスクヒト遺伝子操作重鎖遺伝子を有する、それぞれ２個の転写ユニットを含む、ヒスチジノール耐性をコードするｈｉｓ遺伝（ｐＩＮＧ１９５７）またはマイコフェノール酸耐性をコードするｇｐｔ遺伝子（ｐＩＮＧ１９５９）を有する以外はｐＩＮＧ１９７３と同じ２個の別なベクター（実施例６に記載）を用いた。ＩＮＧ−１免疫グロブリン生産ＣＨＯ細胞株であるクローン２５９の開発が記載される。クローン２５９をクローン１４６細胞（実施例７に記載）をｈｉｓ発現ベクターｐＩＮＧ１９５７で形質移入して開発した。他のＩＮＧ−１免疫グロブリン生産ＣＨＯ細胞株であるクローン３７３も記載される。クローン３７３はクローン１４６のサブクローンであるクローン１４６．３をｇｐｔ発現ベクターｐＩＮＧ１９５９で形質移入して開発された。
（Ａ．クローン１４６のｐＩＮＧ１９５７による形質移入、およびクローン２５９の開発）
クローン１４６を無血清培地（Ｒｘ−Ｃｅｌｌ ３１０）中でｐＩＮＧ１９５７により形質移入した。まず、６５０個のクローンを９６ウエルプレート中で２回形質移入してスクリーニングした。次いで１４２個のクローンを９６ウエルプレートから選択し、次いで２４ウエルプレートからスクリーニングした。最後に、３１個のクローンを２４ウエルプレートから選択し、振盪フラスコ中でスクリーニングした。ＨＰＬＣで測定した、ＦＢＳのないＥｘ−Ｃｅｌｌ ３１０培地中における最高の抗体生産株の結果は、最高の生産株が抗体を、クローン１４６より２倍高いレベルで抗体を発現することを示した。例えば、最高の生産株であるクローン１４６．２−２５９は、２回の異なった試験で１７２μｇ／ｍｌおよび１９２μｇ／ｍｌの抗体を発現した。
クローン１４６．２−２５９をＥｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地中でサブクローニングし、２４ウエルプレート中でスクリーニングした。最高のクローンを、無血清Ｅｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地中で振盪フラスコ生産性に基づいてさらに選択した。ＨＰＬＣで測定した、無血清Ｅｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地中における最高の生産株の免疫グロブリンポリペプチドの振盪フラスコ試験の結果は、クローン２５９サブクローンが親クローン２５９（例えば約１１５μｇ／ｍｌ）より約１．５から２倍高いレベル（例えば約２２９μｇ／ｍｌ〜約２７１μｇ／ｍｌ）の抗体を発現することを示した。
（Ｂ．クローン１４６のサブクローンであるクローン１４６．３のｐＩＮＧ１９５９による形質移入、およびクローン３７３の開発）
クローン１４６、すなわち最初のｐＩＮＧ１９３７ Ｇ４１８耐性形質移入体にＥｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地中でサブクローニングを行い、Ｅｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地中におけるクローン１４６の約６５μｇ／ｍｌに対しそのうちの１つのサブクローン１４６．３は約１２１μｇ／ｍｌを分泌した。
クローン１４６．３は１回の形質移入で比較的高いレベルで分泌するので、ｐＩＮＧ１９５９で形質移入した。無血清培地（Ｅｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地）に適応したクローン１４６．３細胞をｐＩＮＧ１９５９（実施例６に記載のマイコフェノール酸耐性以外はｐＩＮＧ１９３７と同じ）で形質移入し、選択のために５％ＦＢＳ／マイコフェノール酸およびキサンチンを含むハムのＦ１２培地に播種した。まず、２５０個のクローンを９６ウエルプレート中の２回の形質移入でスクリーニングした。次いで１０６個のクローンを２４ウエルプレートから選択しスクリーニングした。最後に、２６個のクローンを２４ウエルプレートから選択し、振盪フラスコ中でスクリーニングした。クローン１４６．３のｐＩＮＧ１９５９による逐次形質移入により、Ｅｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地中の振盪フラスコの結果で測定して２２５および２５７μｇ／ｍｌの免疫グロブリンポリペプチドを発現するクローン３７３が選択された。
（実施例９）
（第３の逐次ベクター形質移入によるさらに増加した発現：別な形質移入クローンと細胞株の開発と特徴付け）
本実施例は第３の多重転写ユニットベクターを用いる、例示細胞株の第３の逐次形質移入による発現と生産の更なる増加と、ポリペプチド、例えば免疫グロブリンポリペプチド生産レベルが増加したクローンおよび細胞株の結果を説明する。
実施例８に記載したクローン３７３を以後の研究に選び、ｐＩＮＧ１９５７（ヒスチジノール耐性以外はｐＩＮＧ１９３７と同じ）を用いるまた別な逐次形質移入に用い、ＦＢＳとヒスチジノールを補充したＥｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地に播種した。クローンを選択すると、Ｇ４１８、すなわちＭＰＡ／キサンチン／ヒスチジノールで維持した。
まず、１６０個のクローンを９６ウエルプレート中の２回形質移入からスクリーニングした。次に４８個のクローンを９６ウエルプレートから選択し、２４ウエルプレートでスクリーニングした。最後に、１２個のクローンを２４ウエルプレートから選択し、振盪フラスコ中でスクリーニングした。Ｅｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地中の振盪フラスコ試験の結果、８個の最高生産クローンが得られた。
最高生産クローンは、発現レベル約３１７μｇ／ｍｌを有するクローン１３２を含め約３１０〜約３７０μｇ／ｍｌの範囲の発現レベルを示した。
（実施例１０）
（別な多重転写ユニットベクターによる形質移入：別な形質移入クローンと細胞株の開発）
ヒト遺伝子操作ＩＮＧ−１軽鎖および重鎖遺伝子（ｐＩＮｈ１９５９、２−遺伝子ベクター）をそれぞれ１コピー、またはヒト遺伝子操作ＩＮＨ−１軽鎖および／または重鎖遺伝子（ｐＩＮＧ１９６５、４−遺伝子ベクター）をそれぞれ２コピー含む発現ベクターｐＩＮＧ１９５９（図１７）およびｐＩＮＧ１９６５（図２１）をＣＨＯ−Ｋ１細胞に形質移入した。Ｅｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地中で懸濁生育に適応したＣＨＯ−Ｋ１細胞を各４０μｇの直線化ベクターでエレクトロポーレーションした。選択剤なしの２日間の回復期間後、細胞を５％ＦＢＳ、マイコフェノール酸およびキサンチンを補充したハムのＦ１２培地を含む９６ウエルプレートに播種した。合計３００および２５５個のクローンを９６ウエルプレート中でスクリーニングし、ｐＩＮＧ１９５９およびｐＩＮＧ１９６５でそれぞれ形質移入した。ｐＩＮＧ１９５９形質移入では、最高の１８クローンを１％ＦＢＳを含むＥｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地を含む２４ウエルプレートに移した。ｐＩＮＧ１９６５形質移入では、最高の４０クローンを１％ＦＢＳを含むＥｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地を含む２４ウエルプレートに移した。ｐＩＮＧ１９５９形質移入からの全部で１８クローンを次に１％ＦＢＳを含むＥｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地を含む振盪フラスコに移し、生産性を評価した。最高の２つの生産株であるクローン５３と５７はそれぞれ、１％のＦＢＳの存在で１１６と１３３μｇ／ｍｌを分泌した。ＦＢＳを補充しないＥｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地中では、クローン５３と５７はそれぞれ１５７および１２１μｇ／ｍｌを分泌した。ｐＩＮＧ１９６５形質移入では、最高の８クローンを振盪フラスコに移し、生産性を評価した。最高の生産株では、クローン１７は１％ＦＢＳを補充したＥｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地中で２１６μｇ／ｍｌ、ＦＢＳを補充しないｘ細胞３０１培地中で２１４μｇ／ｍｌを分泌した。従って、ヒト遺伝子操作軽鎖および／または重鎖遺伝子をそれぞれ２コピー有する４−遺伝子ベクター（ｐＩＮＧ１９６５）で形質移入した細胞株は、ヒト遺伝子操作ＩＮＧ−１軽鎖および／または重鎖遺伝子をそれぞれ１コピー有する２−遺伝子ベクター（ｐＩＮＧ１９５９）で形質移入した細胞株より約２倍多い免疫グロブリンポリペプチドを生産した。
（実施例１１）
（免疫グロブリンポリペプチドの結合活性の評価）
実施例６に従って構築された、ヒト遺伝子操作ＩＮＧ−１軽鎖および／または重鎖遺伝子をコードするベクター、例えばｐＩＮＧ１９３７（低リスクヒト遺伝子操作ＩＮＧ−１）およびｐＩＮＧ１９４４（低プラス中リスク遺伝子操作ＩＮＧ−１）をＸｂａＩで直線化し、無血清適応ＣＨＯ−Ｋ１を形質移入し、その後Ｇ４１８耐性形質転換体を選択するために用いた。タンパク質を振盪フラスコ培地か上澄からプロテインＡカラムを通して精製した。製造した免疫グロブリンポリペプチドの結合活性を評価するため、ヒト癌腫細胞株ＨＴ−２９との競合結合を行った。この結腸直腸癌腫細胞株はＥｐ−ＣＡＭとして知られる分子を表面に発現する。Ｅｐ−ＣＡＭは、ＡＴＣＣに寄託された細胞株ＨＢ９８１２で生産されるマウス−ヒトキメラＩＮＧ−１抗体の抗原結合活性を有する免疫グロブリンポリペプチドで認識される。
ＨＴＧ２９細胞を９６ウエルプレート内で密着状態に生育させた（約２×１０５細胞／ウエル）。マウス−ヒトキメラＩＮＧ−１をＮａ１２５Ｉ（ヨードゲン（Ｉｏｄｏ−ｇｅｎ）（登録商標）、ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）社）で標識した。競合条件は例えば１００μｌ分析容量、０．１ｎＭ標識マウス−ヒトキメラＩＮＧ−１、ｐＩＮＧ１９３７およびｐＩＮＧ１９４４で形質転換下細胞で生産された未標識免疫グロブリンポリペプチドの２倍逐次希釈であった。標識および未標識免疫グロブリンポリペプチドをＨＴ−２９細胞と４°Ｃで５時間インキュベーションした後に洗浄した、標識細胞をＮａＯＨで分離し計数した。データ解析をリガンド（Ｌｉｇａｎｄ）を用いて行った（マンソン（Ｍｕｎｓｏｎ）およびレッドバード（Ｒｅｄｂａｒｄ）、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０７：２２０−２３９（１９８０））。
ｐＩＮＧ１９３７（低リスク）ベクターによる形質転換から得られた免疫グロブリンポリペプチドを用いる競合結合分析の結果を図２３に示す。未修飾ＩＮＧ−１マウス可変領域を含むマウス−ヒトキメラＩＮＧ−１と、可変ドメインが低リスク部位で修飾されたヒト遺伝子操作ＩＮＧ−１に対する親和性は、極めて類似した親和性を示した（２〜５ｎＭ；図２３）。
低リスクプラス中リスク位置で修飾されたヒト遺伝子操作ＩＮＧ−１も、競合結合分析を用いて評価された。ｐＩＮＧ１９４４形質移入細胞倍溶液上澄から精製されたヒト遺伝子操作ＩＮＧ−１による結果が図２４に示される。マウス−ヒトキメラとヒト遺伝子操作（低リスク）ＩＮＧ−１の間の差は観察されなかった。ベクターｐＩＮＧ１９４４による形質移入から得られたヒト遺伝子操作（低プラス中リスク）ＩＮＧ−１は、図２４に示されるように競合の減少を示した。
軽鎖および重鎖中リスク変化のＩＮＧ−１結合活性に対する寄与を調べるため、免疫グロブリンポリペプチドを低リスク軽鎖と低プラス中リスク重鎖、または低リスク重鎖と低プラス中リスク軽鎖ベクターいずれかの組み合わせで構築したベクターから発現した。修飾ＩＮＧ−１軽鎖プラス重鎖の双方を含むベクターが、無血清培地適応ＶＨＯ−Ｋ１細胞を形質移入するために用いられた。約１００個のクローンがマイクロタイタープレート中でスクリーニングされ、振盪フラスコ評価のために８〜１０個の最高クローンを選択した。生産目的のため、最良の生産株を振盪フラスコ中で生育させ、修飾ＩＮＧ−１ ＩｇＧをプロテインＡカラム上で精製し、Ａ２８０で濃度を測定した。
ヨード化ヒト遺伝子操作（低リスク）ＩＮＧ−１とＥｐ−ＣＡＭ発現ＨＴ−２９細胞を用いる競合結合分析を、修飾ＩＮＧ−１免疫グロブリンポリペプチドを特徴付けるために用いた。結果の例を図２５に示す。軽鎖に加えられた中リスク変化は、修飾ＩＮＧ−１抗体に最大の影響を及ぼしたと思われる。重鎖に加えられた中リスク変化も、結合に影響すると思われるが、軽鎖の変化の程度より少なかった。この結果は、個々の鎖で観察された効果は加算的であることを示唆する。
中リスク変化にはプロリンが関与する変化が含まれる（図１３および１５参照）。中リスクＩＮＧ−１軽鎖は骨格１（アミノ酸１−５９（配列番号：１２））に導入された３個のプロリンを有し、中リスクＩＮＧ−１重鎖は骨格１（アミノ酸１−５７（配列番号：２５））から除去された１このプロリンを有する。プロリンの変化の効果を詳しく調べるため、低リスクヒト遺伝子操作ＩＮＧ−１軽鎖可変領域を１回に１個、例えば軽鎖のプロリン１（Ｐ１）（配列番号：３８および３９）、プロリン２（Ｐ２）（配列番号：４０および４１））、プロリン３（Ｐ３）（配列番号：４２および４３））、またはプロリンの組み合わせＰ１Ｐ２（配列番号：４４および４５）、Ｐ１Ｐ３（配列番号：４６および４７）、Ｐ２Ｐ３（配列番号：４８および４９）でプロリンを置換して構築した。図１３に示す様に、プロリンに換えられた低リスク軽鎖中の合計３個のアミノ酸位置が骨格１の中にある。従って、プロリンの全ての組み合わせが、２個の重複オリゴヌクレオチドを用いて取り込まれる。ＫＬ１（配列番号：１３）は変化せず、実施例６で低リスクＩＮＧ−１軽鎖ベクターｐＩＮＧ１９３３の構築用であると説明された通りである。用いられた第２のオリゴヌクレオチドは、実施例６に低プラス中リスクＩＮＧ−１軽鎖ベクターｐＩＮＧ１９３９の構築用であると記載されたオリゴヌクレオチドＫＭ２の６つの変化の１つである（配列番号：２１）。選ばれたＫＭ２の変化は、どのプロリンの組み合わせが低リスク軽鎖配列に導入されるべきであるかに依存する。低リスク軽鎖可変領域はさらに、低リスクＩＮＧ−１軽鎖の８位のアラニン（配列番号：３９）を置換する第１の中リスクプロリン（Ｐ）で修飾されていた。低リスク可変領域は低リスクＩＮＧ−１軽鎖の１５位のロイシン（配列番号：４１）を置換する第２の中リスクプロリン（Ｐ２）で修飾されていた。低リスク可変領域は１８位のセリン（配列番号：４３）を置換する第３の中リスクプロリン（Ｐ３）で修飾されていた。ＫＭ２オリゴヌクレオチド（配列番号：２１）の６個の変化の１つを用いることにより、各プロリン残基がオリゴヌクレオチドＰ１（配列番号：５０）、Ｐ２（配列番号：５１）、Ｐ３（配列番号：５２）を用いて最初に別々に変化し、次いでオリゴヌクレオチドＰ１Ｐ２（配列番号：５３）、Ｐ１Ｐ３（配列番号：５４）またはＰ２Ｐ３（配列番号：５５）を用いて対で変化した。低リスクヒト遺伝子操作ＩＮＧ−１軽鎖中に取り込まれた、中リスクプロリン残基の異なった組み合わせで、様々なＩＮＧ−１軽鎖をコードする発現ベクターを構築するために用いられたクローニング戦略が図２６Ａに示される。未修飾ＫＬ１オリゴヌクレオチドで修飾ＫＭ２改変体をアニーリングした後、アニーリング反応をＤＮＡポリメラーゼで延長し、ＩＮＧ−１軽鎖前方向プライマーＫＦおよび逆方向プライマーＫＢｓｒ（配列番号：５６）を用いるＰＣＲで増幅した。得られた生成物をＳａｌＩおよびＢｓｒＦ１で消化し、その後、これらの位置の１つ、またはその様々な組み合わせでプロリン残基導入で修飾した低リスクＩＮＧ−１軽鎖骨格１領域に対応する得られた１３０塩基対フラグメントを精製した。ベクターｐＩＮＧ１９３９を次いでＳａｌＩおよびＨｐａＩで消化し、大きな直線状ベクターフラグメントを精製した。異なった反応中のベクターｐＩＮＧ１９３９をＢｓｒＦ１とＨｐａＩで消化し、２ｋｂフラグメントを精製した。
３方向ライゲーションを行ったが、最初にｐＩＮＧ１９３９直線状ベクターのＨｐａＩ末端をＩＮＧ−１軽鎖マイナス骨格１領域を有する２ｋｂフラグメントとライゲーションした。１３０ｂｐプロリン修飾フラグメントのＢｓｒＦ１末端をＩＮＧ−１軽鎖マイナス骨格１領域を有する２ｋＢフラグメントのＢｓｒＦ１末端とライゲーションして、全長ＩＮＧ−１軽鎖を再構築した。次に１３０ｂｐプロリン修飾骨格１のＳａｌＩ末端をｐＩＮＧ１９３９直線状ベクターのＳａｌＩ末端とライゲーションしてベクターを閉じた。次に様々なプロリン位置で修飾された軽鎖を低リスク重鎖で発現した。
ヨード化ヒト遺伝子操作（低リスク）ＩＮＧ−１およびＥｐ−ＶＡＭ発現ＨＴ−２９細胞を用いる競合結合分析を用いて結合活性に対するプロリンの効果を調べた。Ｐ１、Ｐ２、Ｐ１Ｐ２またはＰ１Ｐ３と組み合わせてＩＮＧ−１を低リスク重鎖で修飾したＩＮＧ−１の結果が図２６Ｂに示される。相互に比較すると、試験したプロリンの任意の１個所または２個所の組み合わせにおける変化は類似の効果を有する。プロリンの３個所全てを変えることは最大の効果を有する。
（実施例１２）
（可溶性ヒトＥｐ−ＣＡＭのクローニングと発現、およびＥｐ−ＣＡＭ結合分析）
実施例１１で説明したＨＴ−２９細胞等のＥｐ−ＣＡＭ発現細胞との競合結合分析は、放射性同位元素の使用と、どの様な細胞系分析と同様に潜在的な可変性を有する各分析毎に細胞の維持と生育が必要である。可溶性Ｅｐ−ＣＡＭを用いる結合ＥＬＩＳＡ分析も開発され、本発明の形質移入細胞が生産した免疫グロブリンポリペプチドの結合活性を評価するために用いられている。これらの分析では、可溶性ヒトＥｐ−ＣＡＭ（配列番号：５７および５８）がクローニングされ発現された。使用された免疫グロブリンポリペプチドには、２Ｌまたは５００Ｌ培養機の運転によるヒト遺伝子操作（低リスク）ＩＮＧ−１と、振盪フラスコまたは２Ｌ培養器からのＩＮＧ−１アフィニティークロマトグラフィーで精製された可溶性ｓＥＰ−ＣＡＭが含まれる。
可溶性Ｅｐ−ＣＡＭは、ＣＨＯ−Ｋ１細胞中の発現およびその細胞からの分泌のために昆虫細胞中で以前に発現され、切りつめられたＥｐ−ＣＡＭ（ｓＥｐ−ＣＡＭ）がＣＭＶプロモーターとＧ４１８耐性をコードするｎｅｏ遺伝子と共に発現ベクター中にクローニングされた。クローニング戦略がの概略が図２７に示される。ベクターｐＩＮＧ１７３６（上記実施例６に記載）をＸｈｏＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理されて平滑末端となっている。平滑末端を有する直線状ベクターは次にＳａｌＩで消化され、大きなフラグメントが単離された。ＲＴ ＰＣＲ反応を用いてＥｐ−ＣＡＭ遺伝子がＨＴ−２９ｍＲＮＡから得られ、その遺伝子には５’ＳａｌＩ部位と３’ＳｍａＩ部位が含まれ、Ｅｐ−ＣＡＭ遺伝子をアミノ酸位置２６６（配列番号：５７または５８）に停止コドンを導入して切りつめた。その停止コドンがなければ、Ｅｐ−ＣＡＭ配列は（配列番号：５９および６０）に示す様に３１４アミノ酸を有する。ＲＴ ＰＣＲでは２つのプライマーＥｐ−ＣＡＭ前方向プライマー（配列番号：６１）およびＥｐ−ＣＡＭ逆方向プライマー（配列番号：６２）が使用された。ＲＴ ＰＣＲ反応生成物はＳｍａＩおよびＳａｌＩで消化され、得られた８００塩基対フラグメントを精製し消化されたｐＩＮＧ１７３６の大きなフラグメントとライゲーションしベクターｐＩＮＧ１９５４を製造した。
無血清培地に適応したＣＨＯ−Ｋ１細胞を直線化されたｐＩＮＧ１９５４で形質移入した。次いで形質転換体を２％ＦＢＳを含むＥｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地中で選択した。スクリーニングを２４ウエルプレート中、および直接ＥＬＩＳＡによる振盪フラスコ法で行った。ＩＮＧ−１とその後のパーオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧで検出した。ＦＢＳ無しで生育する様に適応した１５０個のクローンを２４ウエルプレートに移した。細胞を死滅するまで生育させ、５０μｌの上澄を用いてイムロン（Ｉｍｍｕｌｏｎ）ＩＩプレートをプレコートした。次に最高の６個のクローンを振盪フラスコに移した。次にクローン５１の生産性を振盪フラスコおよび２リッター培養器中で約２０〜３５ｍｇ／Ｌであると見積もった。
ＥＬＩＳＡ信号が特定のタンパク質に対応することを確認するため、ウエスターンブロット解析を行った。Ｅｐ−Ｃａｍ上澄で複数のバンドが順次観察された。これらの多量体は精製Ｅｐ−ＣＡＭでも観察され、工程の粗培養上澄の人工産物ではなく、従ってＥＬＩＳＡに基づく直接結合分析に上澄を使用することに悪影響を及ぼさなかった。さらに、還元ゲル上で検出されなかったことは、抗原結合性ＩＮＧ−１を有する免疫グロブリンポリペプチドで認められる既知のＥｐ−ＣＡＭエピトープ構造の非直線性と符合している。
イムロンＩＩプレートをｓＥｐ−ＣＯＭ抗体でプレコートし、マイクロプレートに固定化した。プレコーティングを行うため、ｓＥｐ−ＣＡＭ抗体を最初にＰＢＳコーティング液で希釈した。０．２５〜２０μｇ／ｍｌの範囲のｓＥｐ−ＣＡＭ試験濃度を５０μｌ／ウエルで添加し、４°Ｃで終夜インキュベーションした。プレートをＰＢＳ−０．０５％ツイーンで３回洗浄した。ＰＢＳ−０．０５％ツイーン１％ＢＳＡを添加してプレートを保護し、次いで３７°Ｃで３０分間インキュベーションした。
免疫グロブリンポリペプチドの希釈液をＰＢＳ−０．０５％ツイーン１％ＢＳＡ溶液中で調製した。２〜３倍逐次希釈液を調製し、２重または３重に添加した（１００μｌ／ウエル）。３７°Ｃで９０分間インキュベーション後、マイクロプレートをＰＢＳ−０．０５％ツイーンで３回洗浄した。シグナルを発生させるため、パーオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ−またはＦｃ特異性）２次抗体を各ウエルに加え、３７°Ｃで６０分間インキュベーションし、次いで０．４ｍｌ／ｍｌのＯＰＤをクエン酸緩衝液プラス０．０１２％Ｈ２Ｏ２中で加えた。室温で５〜１０分後、１００μｌの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４加えてを分析を停止し、プレートを４９０ｎｍで読み取った。ヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ−特異性）およびヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ−特異性）抗体を使用した。可溶性Ｅｐ−ＣＡＭ上のヒト遺伝子操作（低リスク）ＩＮＧ−１に対する直接結合ＥＬＩＳＡの結果を図２８に示す。
（実施例１３）
（別な発現ベクターの構築）
本実施例は別な例示転写ユニットの多重コピーを有する発現ベクターの構築を説明する。関連するポリペプチド、例えば軽鎖および／または重鎖並列を含む別な免疫グロブリン遺伝子をコードする例示遺伝子配列の多重コピーを有する例示ベクターコンストラクトも記載される。
本発明で有用な別な遺伝子の例示発現ベクター中へのクローニングを促進するため、ＣＭＶプロモーターと軽鎖３’非翻訳領域の間の亜重クローニング部位を含むモヂュラー発現ベクターを構築した。２個の相補ＤＮＡオリゴヌクレオチド（ｐＩＮＧ１７３６ポリリンカー５’ＴＣＧＡＣＧＡＡＴＴＣＡＴＣＧＡＴＧＧＴＡＣＣ３’（配列番号：６３）および３’ＧＣＴＴＡＡＧＴＡＧＣＴＡＣＣＡＴＧＧ５（配列番号：６４）’）（ｐＩＮＧ１７３２ポリリンカー５’ＴＣＧＡＧＧＡＡＴＴＣＡＴＣＧＡＴＧＡＴＡＴＣ３’（配列番号：６５））および３’ＧＣＴＴＡＡＧＴＡＧＣＴＡＣＴＡＴＡＧ５’（配列番号：６６）からポリリンカーを組み立て、アニーリングで数個のユニーク部位（ｐＩＮＧ１７３２用のＳａｌＩ、ＥｃｏＲＩ、ＣｌａＩ、ＥｘｏＲＶ、およびｐＩＮＧ１７３６用のＳａｌＩ、ＥｃｏＲＩ、ＣｌａＩ、ＫｐｎＩ）を含む２重インサートを形成し、それぞれがＧ４１８耐性クローンを選択するためのｎｅｏ遺伝子を含む２個の区切られたベクターｐＩＮＧ１１７３２およびｐＩＮＧ１７３６にかぶさっている。ｐＩＮＧ１７３２およびｐＩＮＧ１７３６の双方が最初にＸｈｏｌＩで消化され、Ｔ４ポリメラーゼで処理され、次いで直線状ベクターがＳａｌＩで２回目に消化された。精製直線状ベクターとポリリンカーインサートを精製し、ライゲーションした。図２９および３０に示す様に、得られた２個のベクターｐＩＮＧ１７３２−ＲＩＣｌａＲＶとｐＩＮＧ１７３６−ＲＩＣａＫｐｎＩをプロモーター／スプライス領域の３’末端とポリアデニル化領域の５’末端の間に数個のユニーク制限部位を有し、関心のあるポリペプチドをコードする任意の挿入遺伝子の発現に有用である様に設計された。
図３１および３２に示す様に、ＣＤ１８に対するヒト化抗体由来の軽鎖および重鎖（米国特許第５、９８５、２７８号および第５、９９９、８６７号参照）を軽鎖および重鎖を有するベクターからｐＩＮＧ１７３２−ＲＩＣｌａＲＶおよびｐＩＮＧ１７３６−ＲＩＣｌａＫｐｎＩそれぞれの中にＰＣＲでクローニングした。ｐＩＮＧ２０５０と呼ばれる新しい軽鎖ベクターを図３に概要を示す様に調製し、最初にベクターｐＩＮＧ１７３２−ＲＩＣｌａＲＶをＸｈｏｌＩおよびＥｃｏＲＩで消化して構築し、次いで直線状ベクターを精製した。抗ＣＤ１８軽鎖（図３１でＬＤＰ−１ ＬＣで示される；配列番号：６７および６８）をコードする遺伝子を、その遺伝子を有するベクターから、前方向プライマーＬＤＰ５ＰｒＦｗｄ（５’ＴＧＴＡＴＴＧＡＡＴＴＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＧＣＴＧ３’；配列番号：６９）と逆方向プライマーＬＤＰＬＣ３ＰｒＸｈｏＲｅｖ（配列＝５’ＧＡＴＡＡＣＴＣＧＡＧＣＴＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧ３’（配列番号：７０））を用いてＰＣＲで増幅した。得られたＰＣＤ精製物を精製し、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏｌＩで消化し、ｐＩＮＧ１７３２−ＲＩＣｌａＲＶとライゲーションし、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏｌＩで消化して直線化した。得られた軽鎖ベクターを図３１に示すようにｐＩＮＧ２０５０とした。
ｐＩＮＧ１７３６−ＲＩＣｌａＫｐｎＩと名付けられた新しい重鎖ベクターを、図３にその概略を示す様に調製された。ベクターｐＩＮＧ１７３６−ＲＩＣｌａＫｐｎＩは最初にＸｈｏＩおよびＥｘｏＲＩで消化され、次いで直線化したベクターを精製した。抗ＣＤ−１８重鎖（図３２にＬＰＤ−１ ＨＣで指定；配列番号：７１および７２）をコードする遺伝子を次にその遺伝子から前方向プライマーＬＰＤ５ＰｒＦｗｄ（５’ＴＧＴＡＴＴＧＡＡＴＴＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＧＣＴＧ３’：配列番号：７３）および逆方向プライマーＬＤＰＬＸ３ＰｒＸｈｏＲｅｖ（５’ＣＴＴＡＴＣＴＣＧＡＧＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＣＧ３’（配列番号：７４））を用いてＰＣＲで増幅した。えられたＰＣＲ生産物を精製し、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化し、ＥｃｏＲＩとＸｈｏｌで消化して直線化したｐＩＮＧ１７３６−ＴＩＣｌａＫｐｎＩとライゲーションした。得られた重鎖ベクターを図３２に示すようにｐＩＮＧ２０５１とした。ｐＩＮＧ２０５０およびｐＩＮＧ２０５１それぞれの軽鎖および重鎖の配列をＤＮＡ配列解析で実証した。重鎖および軽鎖ＤＮＡとアミノ酸配列を図３３（配列番号：６４および７０）と図３４（配列番号：６８および７２）にそれぞれ示す。
抗ＣＤ１８軽鎖プラス重鎖遺伝子およびＧ４１８耐性をコードするｎｅｏ遺伝子を有するｐＩＮＧ２０５２ベクターを図３５に示す様に構築した。ベクターｐＩＮＧ２０５０をまず制限酵素ＨｐａＩおよびＮｈｅＩで消化し、大きな直線状ベクターフラグメントを精製した。ベクターｐＩＮＧ２０５１をＸｂａＩで消化し、Ｔ４ポリメラーゼで処理して平滑末端とし、ＮｈｅＩで消化し、大きな直線状ベクターフラグメントを精製した。消化、精製されたｐＩＮＧ２０５０およびｐＩＮＧ２０５１ベクターをライゲーションして、Ｇ４１８耐性をコードするｎｅｏ遺伝子を含む軽鎖プラス重鎖発現ベクターｐＩＮＧ２０５２を形成した。図３５に示す様に、ｐＩＮＧ２０５２ベクターは形質転換体調製のための直線状ＤＮＡを精製するための数個のユニーク制限部位を含む。ｐＩＮＧ２０５２の特徴を表２にまとめる。
Figure 0004554370
ａＮＳ−制限部位は同定されていない
ヒスチジノール耐性形質転換体選択のためのｈｉｓ遺伝子を含む第２の抗ＣＤ１８軽鎖プラス重鎖発現ベクターｐＩＮＧ２０５７も、ｐＩＮＧ２０５２中のｎｅｏ遺伝子をｐＩＮＧ１９５７由来のｈｉｓ遺伝子に交換して構築された。ベクターｐＩＮＧ２０５２は最初に制限酵素ＨｐａＩおよびＮｏｔＩで消化され、その後大きな直線状フラグメントを精製した。ベクターｐＩＮＧ１９５７を次にＨｐａＩおよびＮｏｔＩで消化し、次いでより小さいｈｉｓ遺伝子フラグメントを精製した。直線状ベクターｐＩＮＧ２０５２およびｈｉｓ遺伝子フラグメントをライゲーションして、図３６に示す様なヒスチジノール耐性形質転換体選択のための軽鎖プラス重鎖発現ベクターｐＩＮＧ２０５７を形成した。ｐＩＮＧ２０５７の特徴を表３にまとめる。
Figure 0004554370
ａＮＳ−制限部位は同定されていない
（実施例１４）
（別な形質転換クローンおよび細胞株の開発と特徴付け）
本実施例は、本発明による別な例示ベクターで形質転換された別な形質転換クローンおよび細胞株の開発と特徴付けを説明する。別な形質転換クローンおよび細胞株の開発と特徴付けは、実施例１３で述べた多重遺伝子ベクターを含むベクターによる形質移入から説明される。
Ｅｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地に適応したＣＨＯ−Ｋ１細胞のエレクトロポーレーションにより細胞株が開発された。形質移入前に、抗ＣＤ１８系ｓプラス重鎖ｎｅｏベクターｐＩＮＧ２０５２を図３７に示す様にＸｂａＩで直線化した。具体的には、エレクトロポーレーションのために４０μｇの直線化したＤＮＡを約１×１０７個の細胞と組み合わせて使用した。少なくとも３回のエレクトロポーレーションが任意の日に行われた（約３×１０７個の細胞と共に使用した合計１２０μｇのＤＮＡ）。２％のＦＢＳと５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを補充した非選択Ｅｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地中で２日間の回復期の後、細胞を４０００細胞／ウエル（２００μＬ／ウエル）で、ｎｅｏベクターを有する形質転換体用のグルタミン／ペニシリン／ストレプトマイシン、１％ＦＢＳおよび０。８ｍｇ／ｍＬのＧ４１８硫酸塩、ゲネチシンＲ（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を補充した９６ウエルプレート中のＥｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地中に播種した。プレートをＣＯ２インキュベーター中で３７°Ｃでインキュベートした。第１０〜１２日スタートして、９６ウエルプレートを単一クローンを含むウエルにつき走査し、上澄をサンプリングしＥＬＩＳＡでスクリーニングした。
ＥＬＩＳＡのために、９６または２４ウエルプレートまたは振盪フラスコからの培養上澄をＦＢＳ、１％ＢＳＡおよび０．０５％ツイーン２０を含む９６ウエル希釈プレート中にピペッティングし、４°Ｃで終夜保存した。上澄の免疫グロブリンポリペプチドを抗ヒトＩｇＧγ被覆抗体（抗ヒトＩｇＧ、Ｆｄフラグメント、カタログＮｏ．４１１４１１、または抗ヒトＩｇＧ、Ｊ．チェイン（Ｃｈａｉｎ）、カタログＮｏ．４０１４４１、カルバイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で４°Ｃで終夜プレコートしたイムロン４プレートを用いてＥＬＩＳＡで分析した。１％ＢＳＡと０。０５％ツイーンを含むＰＢＳによるブロッキング工程後、希釈した上澄をプレートの加えた。プレートシェーカー上で室温で１時間インキュベーション後、プレートを０．０５％ツイーンを加えたＰＢＳで３回洗浄した。ビオチン化した抗ヒトκ特異性第２抗体（ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）、ロックフォード（ロックフォード）ＩＩ、製品Ｎｏ．３１７８０）を加え、プレートをプレートシェーカー上で室温で３０分間インキュベートした。さらに洗浄後、エクストラビジン（シグマケミカル（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を加え、プレートを３０分間インキュベートした。ＫＰＬ／ＡＢＴＳシステム（ＫＰＬ、Ｇａｉｔｈえｒぶｒｇ、ＭＤ）で検出した。発色後、等容積のＫＰＬ停止緩衝液を加えて反応を停止した。ぷれーとを４０５ｎｍで読み取り、４−パラメーターｐメーターカーブフィット法を用いるプログラムで濃度を計算した。
任意の形質転換に対し７日間で合計３〜４回のＥＬＩＳＡを行った。一定のレベル以上の免疫グロブリンポリペプチドを分泌するクローンを密集状態の時点で２４ウエルプレートに移し、２４ウエルレプリカプレートを調製した。１４日間のポストプレーティングで細胞が死滅した時点で、最初の２４ウエルプレート培養物をＥＬＩＳＡでスクリーニングした。２４ウエルプレート中の最高の生産クローンを６ウエルプレートに移し、次いで振盪フラスコに移した。分析に基づき、ＣＨＯ−Ｋ１形質転換体を１２５ｍＬ振盪フラスコ中の２５ｍＬのＥｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地に１〜２×１０５細胞／ｍＬで接種した。上記の様にＥｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地にグルタミン／ペニシリン／ストレプトマイシンを補充した。維持培養物を死滅するまでインキュベーションする場合を除いて、通常は選択剤を振盪フラスコ試験に用いられる培地に添加しなかｔった。生存率が２０％になるまで（通常１４日間）細胞を３７°Ｃ、１００ＲＰＭでインキュベーションした。生育と生産性実験では、生存細胞の密度をヘモサイトメーターおよび／またはグアバ（Ｇｕａｖａ）フローサイトメーター（グアバテクノロジーズ社、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ９４０１０）で２〜４日おきに測定した。生存細胞密度を測定しない実験では、フラスコを開きバイオセーフフード内で振り回し２〜３日おきにてガス交換を行わせた。インキュベーション期間の終わりに、細胞を遠心分離で除き、上澄の免疫グロブリンポリペプチドの濃度をＥＬＩＳＡで分析した。ＥＬＩＳＡで同定された最高の生成物をプロテインＡＨＰＬＣでも分析した。プロテインＡＨＰＬＣでは、形質転換体からの試料中の免疫グロブリンポリペプチドの濃度を島津ＬＣ−１０ＡＨＰＬＣシステム（Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）とパーセプティブバイオシステム（Ｐｅｒｃｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）のプロテインＡカラム（Ａｌｂｅｒｔｖｉｌｌｅ、ＭＮ；多孔性アフィニティー、２０μｍ、Ａ／Ｍ、４．６×１００ｍｍ、カタログＮｏ．１−５０２２−２６）で測定した。ＨＰＣＬ緩衝液ＡはｐＨ７．２のホスフェート緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ＨＰＬＣ緩衝液Ｂは０．１Ｍグリシン／２％酢酸、ｐＨ３．０であった。カラムの流速は４．０ｍｌ／分でありグラディエントは以下の通りである：０−３分間１００％Ａ；３．１−５分間１００％Ｂ；５．１−８分間１００％Ａ、検出２８０ｎｍ。
それぞれ３回のエレクトロポーレーションで構成される形質移入セットが、ネオベクターｐＩＮＧ２０５２を用いて行われた。９６ウエルプレートから合計３５６４のクローンがスクリーニングされた。これらのクローンのうち、４７１個が９６ウエルから２４ウエルプレートへ移され、死滅培地をＥＬＩＳＡでスクリーニングした。最高の８０クローンを振盪フラスコに移し、死滅培地をＥＬＩＳＡでスクリーニングし、いくつかの最高のクローンをプロテインＡ ＨＰＬＣでスクリーニングした。最高の８個のクローンの結果は、１４日間の（死滅）振盪フラスコ生産性（ＨＰＬＣで測定）が１３４、８９、１５７および１２７μｇ／ｍｌで、クローン１２８Ｄ１２がＥｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地中で最高の生産株であることを示した。ＥＬＩＳＡで測定した生産性はＨＰＬＣで得られた値より約２倍高い様に思われた。
６個の最高のクローンを１２５ｍＬ振盪フラスコ中で生育と生産性試験について評価した。培養体を１×１０５細胞／ｍＬでＥｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地接種し、１３日間インキュベーションした。図３８に示す結果は、クローン１２８Ｄ１２が生育と生産性の双方で最適のクローンであることを示した。ｎｅｏ選択マーカーのみを含むクローンは、維持レベルのＧ４１８の存在で生育した。
（実施例１５）
（第２の逐次ベクター形質移入による発現の増加：別な形質移入体されたクローンと細胞株の開発と特徴付け）
本実施例は別な免疫グロブリンを含むポリペプチドの発現と生産の、例示細胞株の第２の多重転写ユニットを用いる第２の形質移入によるさらなる増加を説明する。
ｐＩＮＧ２０５２による形質移入で選択された最高生産クローンであるクローン１２８Ｄ１２、すなわち実施例１３に記載の抗ＣＤ１８軽鎖プラス重鎖ｎｅｏベクターを、実施例１３に記載のｐＩＮＧ２０５７ｈｉｓベクターで再形質移入した。例えば、クローン１２８Ｄ１２を２つのセットの形質移入（１セットあたり３回のエレクトロポーレーション）でにｐＩＮＧ２０５７で再形質移入した。形質移入の準備として、ベクターｏＩＮＧ２０５７をＸｂａｌＩによる消化で直線化した。９６ウエルプレート由来の合計１１０１クローンをＥＬＩＳＡでスクリーニングした。２１８個の最高のクローンを２４ウエルプレートに移し、死滅したレプリカ培養物をＥＬＩＳＡでスクリーニングした。最高の８クローンは２４ウエル段階のスクリーニング免疫グロブリンポリペプチドをでクローン１２８Ｄ１２より３倍のレベルで発現した。最高の１２０クローンはＥｘ−Ｃｅｌｌ培地中の死滅振盪フラスコ培養で２９０μｇ／ｍｌを分泌した。ｎｅｏおよびｈｉｓ選択マーカー双方を含む細胞は維持レベルのゲネチシンおよびヒスチジノールの存在で生育した。
クローン２６４Ｅ２、２５４Ｇ１２、２５７Ｇ８、２６２Ｅ８、２５９Ｂ２および２５３Ｅ１０は２５０〜２９０μｇ／ｍｌを分泌し、クローン２５４Ｅ２を最高の生産株として選択した。くろーん２６４Ｅ２は、Ｅｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地中のいくつかの振盪フラスコ試験で、プロテインＡ−ＨＰＬＣで測定してクローン１２８Ｄ１２より１．５倍多い免疫グロブリンポリペプチドを生産した。
（実施例１６）
（いくつかの市販培地中でのポリペプチドの発現）
本実施例はいくつかの別な細胞培養培地の使用を説明する。多くの化学的に合成された、および／または動物生産物フリーの培地がＣＨＯ細胞中での高収量のタンパク質製造のために設計され、市販されている。バイオホイッタカー（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）で製造され、現在カンブレックス（Ｃａｍｂｒｅｘ；カタログ番号１２−７６２Ｑ、１２−０２９Ｑおよび１２−７６６Ｑ）として知られるＰｒｏＣＨＯ３、ＰｒｏＣＨＯ４およびＰｒｏＣＨＯ５、およびハイクローン（ＨｙＣｌｏｎｅ；カタログ番号ＳＦ３０３５９．０２）で製造されたＨｙＱ−ＰＦＣＨＯを含め４種のこの様な培地が形質移入体の培養に利用された。これらの各培地にグルタミン／ペニシリン／ストレプトマイシンおよび選択剤（例えばＧ１４８ゲネチシン（登録商標）および／またはヒスチジノール）を補充した。選択剤なしで振盪フラスコ試験をおこなった。第１４日または培養物の生存率が２０％以下に下がった時点で、力価をプロテインＡ ＨＰＬＣで測定した。
共にクローン１２８Ｄ１２の再形質移入体であるクローン２６４Ｅ２および２５４Ｇ１２をこれらの培地中に直接継代培養し、適応期間後、振盪フラスコ試験で評価した。細胞は容易にこれらの培地に適応し、速やかに高細胞密度（３〜４×１０６細胞／ｍＬ）で生育した。図２９に示す様に、ＰｒｏＣＨＯ４およびＰｒｏＣＨＯ５中の４個のクローン２５４Ｇ１２または５個の２６４Ｅ２の振盪フラスコ試験の結果は、クローン２６４Ｅ２はＰｒｏＣＨＯ４およびＰｒｏＣＨＯ５中で４００μｇ／ｍｌまで発現したが、クローン２５４Ｇ１２はこれらの培地それぞれの中で３４０μｇ／ｍｌまで発現することを示した。ＨｙＱおよびＰｒｏＣＨ３培地中の力価は他の市販培地中より低かった。例えば、ＰｒｏＣＨＯ３中でクローン２６５Ｅ２は３２１μｇ／ｍＬを生産しクローン２５４Ｇ１２は２５２μｇ／ｍＬを生産したが、クローン２６４Ｅ２は１４６μｇ／ｍＬを生産しクローン２５４Ｇ１２は１４０μｇ／ｍＬを生産した。様々な細胞培養培地が、本発明で得られたクローンおよび細胞質を含め形質移入に有用である。
（実施例１７）
（別な発現ベクターの構築）
本実施例は別な例示転写ユニットの多重コピーを含む発現ベクターの構築を説明する。この様な活性を有する、キメラまたは関連するポリペプチドをコードする例示遺伝子配列の多重コピーを含む例示ベクターコンストラクトも記載される。多重クローニング部位をＣＭＶプロモターと軽鎖３’非翻訳領域の間に含むいくつかのモヂュラー発現ベクターが、実施例１３に記載の様に構築され、補体阻害タンパク質をコードする別な発現ベクターの構築に利用された。これらの発現ベクターｐＩＮＧ１７３２−ＲＩＣｌａＲＶおよびｐＩＮＧ１７３６−ＲＩＣｌａＫｐｎＩが図２９および３０に示される。ＣＡＢ２．１遺伝子を含むベクター（米国特許第６、３１６、２５３号の図１参照；配列番号：７６および７７）が、図４０および図４１それぞれに示される様にｎｅｏ（Ｇ４１８耐性）発現ベクターｐＩＮＧ１７３２−ＲＩＣｌａＲＶおよびｐＩＮＧ１７３６−ＲＩＣｋａＫｐｎＩの多重クローニング部位にＰＣＲによりクローン化された。得られたＣＡＢ２．１を含むベクターは図４０に示す様にｐＩＮＧ２０５３および図４１に示すようにｐＩＮＧ２０５４と命名された。図４０にし示す様に、ｐＩＮＧ２０５３は最初にベクターｐＩＮＧ１７３２−ＲＩＣｌａＲＶを制限酵素ＣｌａＩで消化し、次いで制限酵素ＥｃｏＲＩで消化して構築された。次に、ＣＡＢ２．１をコードする遺伝子を、前方向プライマーＣＡＢ２ＲＩ５ＰｒＦｗｄ（５’ＧＴＴＡＡＧＡＡＴＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＣＣＴＣＣＣＧＧ３’（配列番号：７８））および逆方向プライマーＣＡＢ２Ｃｌａ３ＰｒＲｅｖ（３’ＧＡＡＧＴＣＣＡＴＧＡＴＧＧＧＣＡＡＣＴＴＡＧＣＴＡＡＡＴＣＴ５’（配列番号：７９））を用いるＰＣＲで増幅した。得られたＰＣＲ生成物を精製し、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＣｌａＩで消化し、ＥｃｏＲＩおよびＣｌａＩで直線化したｐＩＮＧ１７３２−ＲＩＣｌａＲＶとライゲーションし、ＣＡＢ２．１遺伝子（配列番号：７６）を有するＣＡＢ２．１ベクターであるｐＩＮＧ２０５３を生成した。
ｐＩＮＧ２０５４と命名された別なＣＡＢ２．１単一遺伝子ベクターが図４１に示す様に調製された。ベクターｐＩＮＧ１７３６−ＲＩＣａｌＫｐｎＩをまずＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、次いでその直線状ベクターを精製した。次にＣＡＢ２．１をコードする遺伝子を、上記前方向プライマーＣＡＢ２ＲＩ５ＰｒＦｗｄ（配列番号：７８）および逆方向プライマーＣＡＢ２．１ＫｐｎｅＰｒＲｅｖ（配列番号：８０）を用いてＰＣＲで増幅した。得られたＰＣＲ生成物を精製し、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで消化し、ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで消化して直線化したｐＩＮＧ１７３６−ＲＩＣｌａＫｐｎＩとライゲーションした。ＣＡＢ２．１遺伝子（配列番号：７６）を含むこの別なベクターは、図４１に示す様にｐＩＮＧ２０５４と命名された。ｐＩＮＧ２０５４の特徴を表４にまとめる。
Figure 0004554370
ａＮＳ−制限部位は同定されていない
ｐＩＮＧ２０５５と呼ばれる、ＣＡＢ２．１の２個のコピーを有し、Ｇ４１８耐性形質移入体を選択するためのｎｅｏ遺伝子を有する別なベクターが図４２に示す様に構築された。まずベクターｐＩＮＧ２０５３を制限酵素ＨｐａＩで消化し、ＸｂａＩリンカーに滑末端ライゲーションし、そのリンカーをＸｂａＩでトリミングした。次いでそのＤＮＡをＢｇｌＩＩで消化し、ＣＡＢ２．１遺伝子を有する大きな直線状ベクターフラグメントを精製した。ベクターｐＩＮＧ２０５４をＸｂａＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、ＣＡＢ２．１遺伝子を有する大きな直線状ベクターフラグメントを精製した。消化、精製したｐＩＮＧ２０５３およびｐＩＮｇ２０５４の双方をライゲーションして、図４２に示す様に２−遺伝子発現ベクターｐＩＮＧ２０５５を生成した。ｐＩＮＧ２０５５の特徴を表５にまとめる。
Figure 0004554370
ａＮＳ−制限部位は同定されていない
ｐＩＮＧ２０５６と名付けられたＣＡＢ２。１遺伝子の２個のコピーを有する他のベクターも図４３に示す様に構築した。ｐＩＮＧ２０５６は多重形質移入を促進するためのヒスチノール耐性をコードする以外は、ｈｉｓ遺伝子ｎｅｏ２−遺伝子ベクターｐＩＮＧ２０５５と同じ構造を有する。ｐＩＮＧ２０５６の特徴を表６にまとめる。
Figure 0004554370
ａＮＳ−制限部位は同定されていない
（実施例１８）
（別な形質移入クローンおよび細胞株の開発と特徴付け）
本実施例は本発明による別な例示ベクターで形質移入体移入されたクローンおよび細胞株を説明する。ポリペプチド生産細胞株の開発と特徴付けは、図１７に示す様な多重遺伝子ベクターを含むベクターによる形質移入から説明する。
まず単一遺伝子（ｐＩＮＧ２０５４）および２−遺伝子（ｐＩＮＧ２０５５）ｎｅｏベクターを用いて形質移入を行った。Ｅｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地に適応したＣＨＯ−Ｋ１細胞のエレクトロポーレーションにより、細胞株をアンドリーソン（Ａｎｄｒｅａｓｏｎ）らの手法［ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６５０（１９８８）］で開発した。ＡＴＣＣ（ＣＣＬ６１）からＣＨＯ−Ｋ１細胞を入手した。
形質移入に先立ち、４０μｇの単一遺伝子ｎｅｏベクターｐＩＮＧ２０５４または２−遺伝子ｎｅｏベクターｐＩＮＧ２０５５のいずれかをＸｂａｌＩで消化し、図４４ＡおよびＢそれぞれに示す直線化ＤＮＡ構造を作成した。具体的には、各形質移入毎に約１×１０７個の細胞と組み合わせて４０μｇの直線化ＤＮＡを用いた。一般に、任意の定められた日に１〜３回のエレクトロポーレーションを行った。ＦＢＳを補充した非選択Ｅｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地中での２日間の回復期間後、９６ウエルプレート中のグルタミン−ペン−ストレップ（Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ）、１％ＦＢＳおよび０．８ｍｇ／ｍｌのＧ１４８（ジェネチシン（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）（登録商標）、インビトロゲン社）を補充したＥｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地中に細胞を４０００細胞／ウエルで播種した。プレートをＣＯ２インキュベーター中で３７°Ｃでインキュベートした。
第１０〜１２日に開始し、単一遺伝子ｎｅｏベクターｐＩＮＧ２０５４または２−遺伝子ｐＩＮＧ２０５５用の９６ウエルプレートを単一クローンコロニーにつき走査し、サンプリングしてＥＬＩＳＡでスクリーニングした。合計３〜４回のＥＬＩＳＡを７日間にわたり行った。培養上澄を９６ウエルプレートから取り出してＥＬＩＳＡを行い（２４ウエルプレートおよび振盪フラスコでも同じ）、ｐＢＳおよび１％ＢＳＡを含む９６ウエル希釈プレートにピペッティングし、４°Ｃで終夜保存した。ＧＢ２４（ＰＢＳ中で２μｇ／ｍｌに希釈したマウス抗ＤＡＦモノクローン抗体）で４°Ｃで終夜プレコートしたイムロン（Ｉｍｍｕｌｏｎ）４プレートを用いるＥＬＩＳＡで、上澄のポリペプチドレベルを分析した。洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．１％ツイーン）で２回洗浄し、０．０５％ツイーンおよび１％ＢＳＡを含むＰＢＳによるブロッキング工程後、希釈した上澄をＰＢＳ−１％ＢＳＡ緩衝液に加え３５°Ｃで１時間インキュベートした。次にプレートを０．０５％ツイーンと０．５μｇ／ｍｌのウサギ抗ヒトＣＡＢ２．１第２抗体を加えたＰＢＳで２回洗浄し、３７°Ｃで１時間インキュベートした。３回洗浄後、１：１５、０００希釈のセイヨウワサビペルオキシダーゼ−結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ピアース）を加え、１時間インキュベートした。ＴＭＢシステム（ＫＬＰ）で検出した。発色後、等容積の１Ｎ Ｈ２ＳＯ４を加えて反応を停止し、プレートを４５０ｎｍで読み取った。
ＥＬＩＳＡで測定した、上記の確立されたベースライン以上のポリペプチドを分泌するクローンを９６ウエルから２４ウエルプレートに移し、レプリカプレートを調製した。９６ウエルプレートにつき上記の死滅した２４ウエルプレート培養物のＥＬＩＳＡスクリーニングを行った。２４ウエルプレート中の最高の生産クローンを振盪フラスコに移した。分析条件により、１〜２×１０５細胞／ｍｌで２５ｍｌのＥｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地に接種して振盪フラスコ実験を行った。ＥＸ３０１細胞培地は上記の様に補充した。維持培養物を死滅するまでインキュベートする場合以外は通常は選択剤を振盪フラスコ時化んに用いる培地に加えなかった。生存率が２０％になるまで（通常約１４日）細胞を３７°Ｃ、１００ＲＰＭでインキュベートした。生育と生産性の実験では、生存細胞密度をヘモサイトメーターおよび／またはガウバパーソナルフロー（Ｇａｕｂａ Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｆｌｏｗ）サイトメーターで２から４日おきに測定した。生存細胞密度を測定しなかった実験では、フラスコを２から３日おきにバイオセーフフード中で数秒間開いてガス交換を行った。実験の最後に細胞を遠心分離と濾過で除き、上澄のＣＡＢ２．１濃度を上記のＥＬＩＳＡまたは逆相ＨＰＬＣで分析した。
具体的には、ｐＩＮＧ２０５４による形質移入では２セットの形質移入を行ったが、その一つは１回、他方は２回のエレクトロポーレーションが行われた。これらの形質移入それぞれから合計３８個の９６ウエルプレートを調製した。１０〜１２日間のインキュベーション後、いくつかのウエルで多重コロニーが観察された。単一コロニーを含む５２８ウエルを上記の様にＥＬＩＳＡでスクリーニングした。多重コロニーを有するウエルを掻き取り、ＦＩＴＣ結合マウス抗ヒトＣＤ４６モノクローン抗体で標識し、ＦＡＣＳバンテージＳＥディバ（ＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅ ＳＥ−Ｄｉｖａ；ＢＤバイオサイエンス（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ））を用いる蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）分析にかけた。ＦＡＣＳでソートしたクローンを９６ウエルプレートに再播種し、２２３個の個々のクローンをＥＬＩＳＡでスクリーニングした。
ｐ６ウエルフォーマット由来の最高の１２５個のｐＩＮＧ２０５４形質移入体−そのうち２９個はＦＡＣＳ保存プール由来−を２４ウエルプレートに移し、死滅した培養体を上記の様にＥＬＩＳＡでスクリーニングした。その結果は、２４ウエルプレート中の最高の形質移入体（例えばクローン３Ｇ８、１３Ａ５および１９Ａ６を含み）は９〜１６μｇ／ｍｌを生産したことを示した。これらのクローンのうち最高の３０クローン−４個はＦＡＣＳ保存プール由来−を振盪フラスコに移し、ＥＸ細胞３０１培地（ＦＢＳなし）中で２０％生存率まで生育させた。死滅培養物をＥＬＩＳＡでスクリーニングした。振盪フラスコ試験による最高の３個のクローンにはクローン３Ｇ８、１２Ａ５および１９Ａ６が含まれた。クローン３Ｇ８はＥｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地中で最高の生産クローンであると思われ、１４日間の（死滅）振盪フラスコでの生産性（ＨＰＬＣで測定）は１０７、８６、１１６μｇ／ｍｌであった。
高発現をさらに選択するため、クローン３Ｇ８をサブクローニングした。細胞を９６ウエルプレートに５、３および１細胞／ウエルでＥｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地中に播種した。合計４１７個のサブクローンを上記の様に９６ウエルプレートレベルでスクリーニングし、最高のサブクローン（例えば３Ｇ８−Ｇ５−Ｆ１、３Ｇ８Ｇ１３−Ｃ１２および３Ｇ８−Ｇ１０−Ｈ４を含む）は１４μｇ／ｍｌまでを分泌した。次に６０個の最高のサブクローンを２４ウエルプレート中でスクリーニングし、最高の生産クローン（例えば３Ｇ８−Ｇ５−Ｆ１、３Ｇ８−Ｇ１３−Ｃ−１２、および３Ｇ８−ＧＡ１１を含む）は４８μｇ／ｍｌを分泌した。１２個のクローンを選び、振盪フラスコのＦＢＳのないＥｘ−Ｃｅｌｌ培地中に移した。細胞を死滅するまで生育させ、培養上澄を逆相ＨＰＬＣで分析した。クローンＧ５Ｆ１がＥｘ−Ｃｅｌｌ３１０培地中、１４日の（死滅）振盪フラスコで最高の生産クローンである（ＨＰＬＣで測定）と考えられ、生産性は１８４、１９４および１８２μｇ／ｍｌであった。このレベルは親クローン３Ｇ８で観察された値よりほぼ２倍高かった。クローンＧ５Ｆ１を１２５ｍＬ振盪フラスコ中のせいいくおよび生産性試験で評価した。培養物を１×１０５で接種し、１２〜１３日間インキュベーションした。図４５に示すその結果は、クローンＧ５Ｆ１は生育と生産性の双方につき満足すべきものであり、第１２日で生存率４９％と第１３日で生産性１７５μｇ／ｍｌを維持した。
ｐＩＮＧ２０５４で形質移入されたクローン３Ｇで説明した様に、ｐＩＮＧ２０５５を用いて形質移入およびクローン開発を行った。具体的には、それぞれ３回のエレクトロポーレーションを含む独立した２セットの形質移入を、上記の様に調製したｐＩＮＧ２０５５を用いて行った。９６ウエルプレートから合計３３７４個の個々のクローンがスクリーニングされた。最高の２６３クローンを２４ウエルプレートに移し、死滅培養物をＥＬＩＳＡでスクリーニングした。その結果は、最高の形質移入体（例えば４４Ｃ８、１１Ｃ８、１２２Ｂ１０、１７６Ｃ６および１３４Ｇ３を含む）は２４ウエルプレート中で９〜３７μｇ／ｍｌを生産した。これらのクローンのうち最高の８５クローンを振盪フラスコに移し、死滅培養物を上記の様にＥＬＩＳＡまたはＲＰ−ＨＰＬＣでスクリーニングした。クローン１５６Ｂ８および１７６Ｃ６が、Ｅｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地中の１４日間の（死滅）振盪フラスコ中での生産性が１４０μｇ／ｍｌ（ＨＰＬＣで測定）に達し、最高の生産クローンである様に思われた。
（実施例１９）
（第２の逐次ベクター形質移入による発現の増加：場綱形質移入体移入クローンおよび細胞株の開発と特徴付け）
本実施例は補体阻害活性を有するポリペプチドの、多重形質移入ユニットベクターを用いる例示細胞株の第２の形質移入による発現と生産のさらなる増加を説明する。
単一遺伝子ｎｅｏベクター（クローン３Ｇ８）および２−遺伝子ｂｅｏベクター（クローン１５６Ｂ８および１７６Ｃ６）を用いて開発された最高のＣＡＢ２．１生産クローンをＣＡＢ２．１の２−遺伝子ヒスチジノールベクターｐＩＮＧ２０５６で再形質移入した。具体的には、ｎｅｏ単一遺伝子ベクターｐＩＮＧ２０５４で形質移入したクローン３Ｇ８を、ｎｅｏベクターについて図４４で示す様に２個のｎｅｏＣＡＢ２．１遺伝子の間のヒスチジノール耐性選択マーカー遺伝子の位置で直線化したｈｉｓ ２−遺伝子ベクターｐＩＮＧ２０５６で再形質移入した。細胞を上記の様に形質移入した。合計３８７個のクローンを９６ウエルプレート中のＥｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地中でスクリーニングし、２４ウエルプレート中のスクリーニングのために選択した。６８μｇ／ｍｌまで分泌する最高の生産クローンの内の１２個を振盪フラスコ中のＦＢＳなしのＥｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地中に移した。細胞を死滅まで生育させ、培養上澄を逆相ＨＰＬＣで分析した。最高分泌クローン（例えば３Ｇ８−２１７Ｂ４、３Ｇ８−２０６Ｃ３、３Ｇ８−１９６Ｅ３、３Ｇ８−１９０Ｃ７、３Ｇ８−１８５Ｅ９、３Ｇ８−１７８Ｇ２、３Ｇ８−１９０Ｅ５を含む）は１４２〜２１８μｇ／ｍｌの範囲を分泌した。例えば、これらの最高の生産クローンでは、クローン２１７Ｂ４は２００μｇ／ｍｌ以上を継続的にに分泌し、クローン２０６Ｃ３は１９９μｇ／ｍｌまで分泌し、クローン１８５Ｅ９１７７μｇ／ｍｌまで分泌した。
クローン３Ｇ８、クローン２１７Ｂ４、クローン２０６Ｃ６およびクローン１８５Ｅ２の最高の再形質移入体をサブクローニングした。具体的には、クローン２１７Ｂ４、２０６Ｃ３および１８５Ｅ９を１、３または５細胞／ウエルでＥｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地に播種してサブクローニングした。合計２８２個のクローン２１７Ｂ４の個々のサブクローン、３０１個のクローン２０６Ｃ３の個々のサブクローン、および３０８個のクローン１８５Ｅ２の個々のサブクローンを、クローン３Ｇ８の開発で先に記した様に９６ウエルプレート中でスクリーニングした。これらのうち、クローン２１７Ｂ４の５９個のサブクローン、クローン２０６Ｃ３の５５個のサブクローン、およびクローン１８５Ｅ９の５２個のサブクローンを２４ウエルプレートに移し、死滅培養物をクローン３Ｇ８の開発で上記に説明した様にＥＬＩＳＡでスクリーニングした。生産最高の２１７Ｂ４サブクローンは３５〜５７μｇ／ｍｌの範囲を分泌した。生産最高の２０６Ｃ３サブクローンは３１〜４０μｇ／ｍｌの範囲を分泌し、生産最高の１８５Ｅ９サブクローンは１７〜６２μｇ／ｍｌの範囲を分泌した。これらのうち、それぞれ２１７Ｂ４、２０６Ｃ３および１８５Ｅ９のための最高の２０、１６および１６クローンを振盪フラスコに移した。先に説明した様に、死滅培養物をＥＬＩＳＡで、場合によってはＲＰ−ＨＰＬＣでスクリーニングした。クローンＢ３Ｂ８、Ｂ５Ｂ１０、Ｂ３Ｅ１１、Ｂ６Ｅ３、Ｂ７Ｃ４、Ｂ７Ｂ７、およびＢ９Ｂ４を含む最高の２１７Ｂ４サブクローンは、振盪フラスコ中で１７０〜２１６μｇ／ｍｌを分泌した。Ｃ２Ｂ７、Ｃ２Ｄ１０、Ｃ３Ｆ１、Ｃ７Ｈ７およびＣ９Ａ２を含む最高の２０６Ｃ３サブクローンは、振盪フラスコ中で１４７〜１８８μｇ／ｍｌの範囲を分泌した。Ｅ７Ｅ９、Ｅ３Ｃ１１、Ｅ１０Ｈ５、およびＥ２Ｄ２を含む最高のクローン１８５Ｅ９は振盪フラスコ中で１６３〜２１０μｇ／ｍｌの範囲を分泌した。これらのサブクローンはＥｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地中でその親クローンより高いレベルのＣＡＢ２．１を生産せず、その力価はその親クローンと同程度に止まった。
Ｅｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地中での発現を更に評価するため、クローン２１７Ｂ４、クローン２０６Ｃ３、およびクローン２０６Ｃ３のサブクローンＣ２Ｂ７およびＣ７Ｈ７、およびクローン２１７Ｂ４のサブクローンＢ６Ｅ３およびＢ５Ｂ１０を、生育と生産性を実験中にわたって測定する振盪フラスコ試験で評価した。この実験のため、Ｅｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地中で生育した細胞を１×１０５細胞／ｍｌで接種した。細胞を上記のクローン３Ｇ８の開発と同様に生育させた。クローン３Ｇ８、クローン２１７Ｂ４および２０６Ｃ３の再形質移入体の生育と生産性を測定した。２週間目に細胞はまだ生存し（クローン１０６Ｃ３で１×１０６細胞／ｍｌ、クローン２１７Ｂ４で４×１０５細胞／ｍｌ）、力価１５０μｇ／ｍｌを維持した。クローン２０６Ｃ３のサブクローンＣ２Ｂ７およびＣ７Ｈ７の生育と生産性の結果も測定した。その結果は親クローン２０６Ｃ３と同様であり、２週間で細胞の生存率の減少が測定可能で生産性は１５０μｇ／ｍｌ以下であった。クローン２１７Ｅ４のサブクローンＢ６Ｅ３およびＢ５Ｂ１０の生育と生産性も測定した。クローン２０６Ｃ３とそのサブクローンＣ２Ｂ７およびＣ７Ｈ７を比較すると、これらの結果は２週間目の生産性がＢ６Ｅ３でのＢ６Ｅ３で約２００μｇ／ｍｌ、Ｂ％Ｂ１０で約１５０μｇ／ｍｌ以上であった。
本技術における現在の問題と限界を考えると、ポリペプチド生産の増加、生産効率、発現したポリペプチドの量の制御と管理の増加、細胞株の安定性の増加、および材料、試薬および他の資源コストの減少等、本発明には従来技術を越える多くの利点がある。従って、本発明は当業界に従来存在した多くの問題を解決する。本発明がこれらの問題を解決し、従来術と比較して有利である一つの方法は、ベクター構築の開示された方法行われる。すなわち、ベクターを直線化した場合、転写ユニットの多重コピーの相同組み換えを、転写ユニットのＤＮＡ配列を少なくとも１個の選択マーカー遺伝子で分離することで回避される。上記の例は２個および４個の転写ユニットベクターの使用を示すが、本発明は３個、４個、５個、６個等々を含む全ての転写ユニットＤＮＡ配列の使用を想定している。この様なベクターは転写ユニットを分離する少なくとも１個の選択マーカー遺伝子の使用で構築され、相同組み換えを避けるかなくすることができる。多重転写ユニットコピーの順番の全ては、本発明開示により当業者が理解し得るものと本発明は予想している。本発明が従来技術の問題を解決する第２の方法は、多重転写ユニットコンストラクトによる逐次形質移入により発現をさらに増加させることである。これにより、実質的にレベルが増加したタンパク質およびポリペプチドを生産することができる一方、生育培地中で生存率と安定性を維持し続け、当技術の多くの問題を解決する。
全ての特許、特許出願、公刊文献および本明細書に引用した試験法を本発明に採用し参照する。読者の関心は、本明細書に関連した、本明細書と同時、または以前に提出され、本明細書の公開審査に開放されたたあらゆる特許と試料に向けられるが、この様な出版物と試料の全ての内容が本明細書に参考資料として採用される。
本明細書に開示された全ての実施形態（クレーム、要約および図面に付随する任意のものを含め）は、明らか記述されない限り、同じ、等価または類似の目的に供する別に別な実施形態で置き換え得る。従って、開示された各実施形態は一連の等価または類似の実施形態の一般的な例にすぎない。
本発明をいくつかの好ましい変法を参照してかなり詳細に説明したが、他の別法も可能である。本発明の変法の多くは、上記の詳細な開示に鑑みて、当業者にそれ自体を示唆するものである。この様な変法の全ては付属の特許請求の範囲が意図する範囲内である。従って、付随する特許請求の範囲の主旨と範囲は、本明細書に含まれる好ましい実施形態に制約されるものではない。
本発明の様々な機能、特徴および利点を以下の説明、付随する請求項および添付する図面を参照すればより良く理解することができる。
図１はベクターｐＩＮＧ１７３３の構築マップを示す。 図２はベクターｐＩＮＧ１７３７の構築マップを示す。 図３ＡはＸｂａＩで直線化されたベクターｐＩＮＧ１７３７の構造を示す。 図３ＢはＮｏｔＩで直線化されたベクターｐＩＮＧ１７３７の構造を示す。 図４はベクターｐＩＮＧ１７５３の構築マップを示す。 図５はベクターｐＩＮＧ１７４４の構築マップを示す。 図６はＸｂａＩで直線化されたベクターｐＩＮＧ１７４４の構造を示す。 図７はγＢＰＩ２１の結合場所を示すベクターｐＩＮＧ４１５５の直線マップを示す。 図８は形質移入されないＣＨＯ−Ｋ１細胞であるクローン２２８およびクローン６８９から単離されたγＢＰＩ２１ＲＮＡのノーザンブロットを示す。 図９はベクターｐＩＮＧ１９２８の構築マップを示す。 図１０はベクターｐＩＮＧ１９３１の構築マップを示す。 図１１はベクターｐＩＮＧ１９３２およびｐＩＮＧ１９３２Ｒの構築マップを示す。 図１２はベクターｐＩＮＧ１９３３の構築マップを示す。 図１３はマウスおよびヒトの軽鎖可変領域配列、ヒト遺伝子操作法のリスクライン、および低および中リスク変化を含むＩＮＧ−１軽鎖可変領域のヒト遺伝子操作中に作成されたアミノ酸の変化（下線）を示す。 図１４はベクターｐＩＮＧ１９３６の構築マップを示す。 図１５はマウスおよびヒトの重鎖可変領域配列、人為的操作法のリスクライン、および低および中リスク変化を含むＩＮＧ−１重鎖可変領域の人為的操作によって作成されたアミノ酸の変化（下線）を示す。 図１６はベクターｐＩＮＧ１９３７の構築マップを示す。 図１７はベクターｐＩＮＧ１９５９の構築マップを示す。 図１８はベクターｐＩＮＧ１９５７の構築マップを示す。 図１９はベクターｐＩＮＧ１９６３の構築マップを示す。 図２０はベクターｐＩＮＧ１９６４の構築マップを示す。 図２１はベクターｐＩＮＧ１９６５の構築マップを示す。 図２２はＮｏｔ１で直線化したベクターｐＩＮＧ１９６４の構造を示す。 図２３は人為的に操作した低リスクＩＮＧ−１の競合的結合の結果を示す。 図２４はマウス−ヒトキメラＩＮＧ−１と比較した、低リスクおよび低プラス中リスクＩＮＧＩ−１を含む人為的に操作した抗Ｅｐ−ＣＡＭ抗体に対する競合的結合の結果を示す。 図２５は低または低プラス中リスク位置のいずれかで修飾された軽鎖および重鎖と組み合わせた、ＩＮＧ−１に対する競合的結合の結果を示す。ＩＮＧ−１（ｈｅＭａｂ）は低リスク位置で修飾された重鎖および軽鎖の双方を有する。 図２６は中リスクプロリン変化の追加（Ｐ２またはＰ３）または組み合わせ対（Ｐ１Ｐ２またはＰ１Ｐ３）を有する人為的に操作した低リスクｈｔ鎖に対する競合的結合の結果を示す。 図２６は中リスクプロリン変化の追加（Ｐ２またはＰ３）または組み合わせ対（Ｐ１Ｐ２またはＰ１Ｐ３）を有する人為的に操作した低リスクｈｔ鎖に対する競合的結合の結果を示す。 図２７はベクターｐＩＮＧ１９５４の構築マップを示す。 図２８は人為的に操作した（低リスク）ＩＮＧ−１に対する可溶性Ｅｐ−ＣＡＭによる直接結合ＥＬＩＳＡを示す。 図２９はベクターｐＩＮＧ１７３２−Ｒ１ＣｌａＲＶの構築マップを示す。 図３０はベクターｐＩＮＧ１７３６−Ｒ１ＣｌａＫｐｎｌの構築マップを示す。 図３１はベクターｐＩＮＧ２０５０の構築マップを示す。 図３１はベクターｐＩＮＧ２０５１の構築マップを示す。 図３３は抗ＣＤ１８軽鎖（ＬＤＰ−０１またはＬＤＰ−１ＬＣで示す）のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。 図３４は抗ＣＤ１８重鎖（ＬＤＰ−０１またはＬＤＰ−１ＨＣで示す）のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。 図３５はベクターｐＩＮＧ２０５２の構築マップを示す。 図３６はベクターｐＩＮＧ２０５７の構築マップを示す。 図３７はＸｂａＩで直線化したベクターｐＩＮＧ２０５２の構造を示す。 図３８は１−１５、１−３７、６６Ｂ９、８４Ｃ４、１２８Ｄ１２、９０Ｂ６を含む様々な抗ＣＤ１８生産クローンの生育および生産性を示す。 図３９はＰｒｏＣＨ０４およびＰｒｏＣＨ０５を含む、別な市販の培地中のクローン２６４ＥＺおよび２５４Ｇ１２からの発現レベルを示す。 図４０はベクターｐＩＮＧ２０５３の構築マップを示す。 図４１はベクターｐＩＮＧ２０５４の構築マップを示す。 図４２はベクターｐＩＮＧ２０５５の構築マップを示す。 図４３はベクターｐＩＮＧ２０５６の構築マップを示す。 図４４はＸｂａＩで直線化したベクターｐＩＮＧ２０５４およびｐＩＮＧ２０５５の構造を示す。 図４５はクローン３Ｇ８ｎｅｏサブクローンＧ５Ｆ１の生育と生産性を示す。

Claims (124)

  1. （ａ）少なくとも１個の選択マーカー遺伝子で区切られた転写ユニットの多重コピーを有するベクターで形質転換または形質移入した細胞を選択条件下で培養する工程であって、該転写ユニットはポリペプチドをコードしている工程；および
    （ｂ）該ポリペプチドを該転写ユニットの多重コピーから発現する工程であって、ここで選択マーカー遺伝子が少なくとも２個の転写ユニットのコピーの間に、［（転写ユニット）ｘ−選択マーカー遺伝子−（転写ユニット）ｘ］として位置する様に該ベクターが直線化され、ｘが１〜４である工程、
    を包含し、各転写ユニットがそれ自身のプロモーターと３’非翻訳領域の制御下にあることを特徴とする組み換えポリペプチドの製造法。
  2. （ａ）少なくとも１個の選択マーカー遺伝子で区切られた転写ユニットの多重コピーを含むベクターで細胞を形質転換または形質移入する工程であって、該転写ユニットがポリペプチドをコードする工程；
    （ｂ）工程（ａ）由来の該細胞を該少なくとも１個の選択マーカー遺伝子の選択条件下で培養し、それにより該ベクターで形質移入または形質転換した該細胞を選択する工程；および
    （ｃ）該転写ユニットの多重コピーから該ポリペプチドを発現する工程であって、ここで選択マーカー遺伝子が少なくとも２個の転写ユニットのコピーの間に、［（転写ユニット）ｘ−選択マーカー遺伝子−（転写ユニット）ｘ］として位置する様に該ベクターが直線化され、ｘが１〜４である工程、
    を包含し、各転写ユニットがそれ自身のプロモーターと３’非翻訳領域の制御下にあることを特徴とする転写ユニットの多重コピーからの組み換えポリペプチドの製造法。
  3. （ａ）少なくとも１個の選択マーカー遺伝子で区切られた転写ユニットの多重コピーを含むベクターで細胞を形質転換または形質移入する工程であって、該転写ユニットがポリペプチドをコードする工程；
    （ｂ）工程（ａ）由来の該細胞を該少なくとも１個の選択マーカー遺伝子の選択条件下で培養し、それにより該ベクターで形質移入または形質転換した該細胞を選択する工程；
    （ｃ）工程（ａ）および（ｂ）を該細胞に対し繰り返し、該細胞を工程（ａ）由来の別なそのベクターで逐次形質移入または形質転換する工程であって、該別なベクターのそれぞれは異なった選択マーカー遺伝子を有する工程；および
    （ｄ）該転写ユニットの多重コピーから該ポリペプチドを発現する工程であって、ここで選択マーカー遺伝子が少なくとも２個の転写ユニットのコピーの間に、［（転写ユニット）ｘ−選択マーカー遺伝子−（転写ユニット）ｘ］として位置する様に該ベクターが直線化され、ｘが１〜４である工程、
    を包含し、各転写ユニットがそれ自身のプロモーターと３’非翻訳領域の制御下にあることを特徴とする転写ユニットの多重コピーからの組み換えポリペプチドの製造法。
  4. 前記細胞が別なベクターで逐次形質転換または形質移入され、該別なベクターのそれぞれが異なった選択マーカー遺伝子を有することを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
  5. 前記選択マーカー遺伝子が少なくとも２個の前記転写ユニットのコピーの間に、［（転写ユニット）ｘ−選択マーカー遺伝子−（転写ユニット）ｘ］として位置する様に前記発現ベクターが制限酵素で直線化され、ｘが１〜４であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記プロモーターがＳＶ４０、ＨＳＶ、ウシ成長ホルモン、チミジンキナーゼ、ＭＰＳＶ、マウスβグロビン、ヒトＥＦ１、ＭＳＶ−ＬＴＲ、ＲＳＶ、ＭＭＴＶ−ＬＴＲ、ＣＭＶ、ＭＬＶ、チャイニーズハムスター延長因子、またはマウスアベルソンＬＴＲプロモーターであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記発現ベクターが更に多重エンハンサーを有することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記転写ユニットが多量体タンパク質の２つの異なったサブユニットをコードすることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  9. 前記転写ユニットが免疫グロブリン軽鎖および重鎖ポリペプチドをコードすることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  10. 前記転写ユニットが少なくとも免疫グロブリン軽鎖および重鎖ポリペプチドの可変領域をコードすることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記転写ユニットがＢＰＩタンパク質生産物をコードすることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  12. 前記転写ユニットの多重コピーが正方向反復配向していることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  13. 前記転写ユニットの多重コピーが逆方向反復配向していることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  14. 前記転写ユニットがバイシストロン性またはポリシストロン性のユニットであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 前記転写ユニットが内部リボソーム侵入部位を有することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  16. 前記転写ユニットの多重コピーが２５％から１００％の間で同一であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  17. 前記転写ユニットの多重コピーが２５％同一であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  18. 前記転写ユニットの多重コピーが少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％同一であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  19. 前記転写ユニットの多重コピーが８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  20. 前記転写ユニットの多重コピーが１００％同一であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  21. 前記選択マーカー遺伝子がｇｐｔ、ｒｅｓ、ｎｅｏ、ｈｉｓ、ＤＨＦＲ、ＧＳ、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、アデニンホスフォリボシルトランスフェラーゼ（ＡＰＲＴ）、ゼオシン耐性、ハイグロマイシン耐性またはピューロマイシン耐性遺伝子であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  22. 前記選択マーカー遺伝子が増幅可能な選択マーカー遺伝子であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  23. 前記少なくとも１個の選択マーカー遺伝子で分離される転写ユニットの少なくとも２個のコピーを有する発現ベクターが、細胞染色体中に組み込まれることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  24. 前記細胞が少なくとも１個、および６個以下の発現ベクターで形質転換または形質移入されることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  25. 前記細胞が真核細胞であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  26. 前記細胞が植物、昆虫、哺乳動物または酵母細胞であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  27. 前記細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはＣＨＯ−Ｋ１細胞であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  28. 前記細胞がＤＨＦＲ＋ＣＨＯ−Ｋ１細胞株、ＤＨＦＲ−ＤＵＫＸ−Ｂ１１（ＤＸＢ１１）細胞株またはＤＧ−４４細胞株由来であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  29. 前記細胞が付着状態であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  30. 前記細胞が懸濁状態でることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  31. 前記ポリペプチドが細胞内区画に蓄積されることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  32. 前記ポリペプチドが細胞から培養液上澄中に分泌されることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  33. 前記ポリペプチドが単離されることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  34. 少なくとも１個の選択マーカー遺伝子で分離される転写ユニットの多重コピーを有するベクターであって、該転写ユニットがポリペプチドをコードすることを特徴とし、ここで選択マーカー遺伝子が少なくとも２個の転写ユニットのコピーの間に、［（転写ユニット）ｘ−選択マーカー遺伝子−（転写ユニット）ｘ］として位置する様に該ベクターが直線化され、ｘが１〜４であり、各転写ユニットがそれ自身のプロモーターと３’非翻訳領域の制御下にある、ベクター。
  35. 前記選択マーカー遺伝子が少なくとも２個の前記転写ユニットのコピーの間に、［（転写ユニット）ｘ−選択マーカー遺伝子−（転写ユニット）ｘ］として位置する様に前記発現ベクターが制限酵素で直線化され、ｘが１〜４であることを特徴とする請求項３４に記載のベクター。
  36. 前記プロモーターがＳＶ４０、ＨＳＶ、ウシ成長ホルモン、チミジンキナーゼ、ＭＰＳＶ、マウスβグロビン、ヒトＥＦ１、ＭＳＶ−ＬＴＲ、ＲＳＶ、ＭＭＴＶ−ＬＴＲ、ＣＭＶ、ＭＬＶ、チャイニーズハムスター延長因子、またはマウスアベルソンＬＴＲプロモーターであることを特徴とする請求項３４に記載のベクター。
  37. 前記ベクターがさらに多重エンハンサーを有することを特徴とする請求項３４から３６の任意の１項に記載のベクター。
  38. 前記転写ユニットが多量体タンパク質の２つの異なったサブユニットをコードすることを特徴とする請求項３４から３６の任意の１項に記載のベクター。
  39. 前記転写ユニットの多重コピーが免疫グロブリン軽鎖および重鎖ポリペプチドをコードすることを特徴とする請求項３４から３６の任意の１項に記載のベクター。
  40. 前記転写ユニットの多重コピーが少なくとも免疫グロブリン軽鎖および重鎖ポリペプチドの可変領域をコードすることを特徴とする請求項３４から３６の任意の１項に記載のベクター。
  41. 前記転写ユニットがＢＰＩタンパク質生成物をコードすることを特徴とする請求項３４から３６の任意の１項に記載のベクター。
  42. 前記転写ユニットの多重コピーが正方向反復配向していることを特徴とする請求項３４から３６の任意の１項に記載のベクター。
  43. 前記転写ユニットの多重コピーが逆方向反復配向していることを特徴とする請求項３４から３６の任意の１項に記載のベクター。
  44. 前記転写ユニットがバイシストロン性またはポリシストロン性のユニットであることを特徴とする請求項３４から３６の任意の１項に記載のベクター。
  45. 前記転写ユニットが内部リボソーム侵入部位を有することを特徴とする請求項３４から３６の任意の１項に記載のベクター。
  46. 前記転写ユニットの多重コピーが２５％から１００％の間で同一であることを特徴とする請求項３４から３６の任意の１項に記載のベクター。
  47. 前記転写ユニットの多重コピーが２５％同一であることを特徴とする請求項３４から３６の任意の１項に記載のベクター。
  48. 前記転写ユニットの多重コピーが少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％同一であることを特徴とする請求項３４から３６の任意の１項に記載のベクター。
  49. 前記転写ユニットの多重コピーが８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であることを特徴とする請求項３４から３６の任意の１項に記載のベクター。
  50. 前記転写ユニットの多重コピーが１００％同一であることを特徴とする請求項３４から３６の任意の１項に記載のベクター。
  51. 前記選択マーカー遺伝子がｇｐｔ、ｒｅｓ、ｎｅｏ、ｈｉｓ、ＤＨＦＲ、ＧＳ、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、アデニンホスフォリボシルトランスフェラーゼ（ＡＰＲＴ）、ゼオシン耐性、ハイグロマイシン耐性またはピューロマイシン耐性遺伝子であることを特徴とする請求項３４から３６の任意の１項に記載のベクター。
  52. 前記転写ユニットがγＢＰＩ２１をコードし、ｈＣＭＶプロモーターおよびマウス免疫グロブリン軽鎖３’非翻訳領域の制御下にあり、前記ベクターがさらにヒト免疫グロブリン重鎖エンハンサーの０、１または２個のコピー、およびｇｐｔまたはｎｅｏ遺伝子のいずれかを有することを特徴とする請求項３４から３６の任意の１項に記載のベクター。
  53. 請求項３４に記載のクローニングベクター。
  54. 請求項３４に記載の発現ベクター。
  55. 請求項５４に記載の発現ベクターを有することを特徴とする宿主細胞。
  56. 請求項５４に記載の別な発現ベクターを有する宿主細胞であって、該発現ベクターは異なった選択マーカー遺伝子を有することを特徴とする請求項５５に記載の宿主細胞。
  57. 前記宿主細胞が真核細胞であることを特徴とする請求項５５に記載の宿主細胞。
  58. 前記宿主細胞が植物、昆虫、哺乳動物または酵母細胞であることを特徴とする請求項５５に記載の宿主細胞。
  59. 前記宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはＣＨＯ−Ｋ１細胞であることを特徴とする請求項５５に記載の宿主細胞。
  60. 前記発現ベクターが該宿主細胞染色体に組み込まれることを特徴とする請求項５５に記載の宿主細胞。
  61. 請求項５４に記載の発現ベクターを有することを特徴とする安定な細胞株。
  62. 前記細胞が少なくとも１個、６個以下の前記発現ベクターで形質転換または形質移入されることを特徴とする請求項６１に記載の安定な細胞株。
  63. 請求項６１または６２に記載のＤＨＦＲ＋ＣＨＯ−Ｋ１細胞株、ＤＨＦＲ−ＤＵＫＸ−Ｂ１１（ＤＸＢ１１）細胞株またはＤＧ−４４細胞株。
  64. （ａ）それぞれが選択マーカー遺伝子で区切られた、転写ユニットの多重コピーを有するベクターで形質転換または形質移入された細胞を選択条件下で培養する工程であって、該転写ユニットはポリペプチドをコードしている工程；および
    （ｂ）該ポリペプチドを該転写ユニットの多重コピーから発現する工程であって、ここで選択マーカー遺伝子が少なくとも２個の転写ユニットのコピーの間に、［（転写ユニット）ｘ−選択マーカー遺伝子−（転写ユニット）ｘ］として位置する様に該ベクターが直線化され、ｘが１〜４である工程、
    を有し、各転写ユニットがそれ自身のプロモーターと３’非翻訳領域の制御下にあることを特徴とする組み換えポリペプチドの製造法。
  65. 前記細胞が別なベクターで逐次形質転換または形質移入され、該別なベクターが異なった選択マーカー遺伝子を有することを特徴とする請求項６４に記載の方法。
  66. 前記発現ベクターが制限酵素で直線化され、前記選択マーカー遺伝子が少なくとも２個の前記転写ユニットのコピー間に［（転写ユニット）ｘ−選択マーカー遺伝子−（転写ユニット）ｘ］として位置し、ｘが１〜４であることを特徴とする請求項６４または６５に記載の方法。
  67. 前記プロモーターがＳＶ４０、ＨＳＶ、ウシ成長ホルモン、チミジンキナーゼ、ＭＰＳＶ、マウスβグロビン、ヒトＥＦ１、ＭＳＶ−ＬＴＲ、ＲＳＶ、ＭＭＴＶ−ＬＴＲ、ＣＭＶ、ＭＬＶ、チャイニーズハムスター延長因子、またはマウスアベルソンＬＴＲプロモーターであることを特徴とする請求項６４または６５に記載の方法。
  68. 前記発現ベクターがさらに多重エンハンサーを有することを特徴とする請求項６４または６５に記載の方法。
  69. 前記転写ユニットが多重体タンパク質の２個の異なったサブユニットをコードすることを特徴とする請求項６４または６５に記載の方法。
  70. 前記転写ユニットが免疫グロブリン軽鎖および重鎖ポリペプチドをコードすることを特徴とする請求項６４または６５に記載の方法。
  71. 前記転写ユニットが少なくとも免疫グロブリン軽鎖および重鎖ポリペプチド可変領域をコードすることを特徴とする請求項６４または６５に記載の方法。
  72. 前記転写ユニットがＢＰＩタンパク質生成物をコードすることを特徴とする請求項６４または６５に記載の方法。
  73. 前記転写ユニットの多重コピーが正方向反復配向していることを特徴とする請求項６４または６５に記載の方法。
  74. 前記転写ユニットの多重コピーが逆方向反復配向していることを特徴とする請求項６４または６５に記載の方法。
  75. 前記転写ユニットがバイシストロン性またはポリシストロン性のユニットであることを特徴とする請求項６４または６５に記載の方法。
  76. 前記転写ユニットが内部リボソーム侵入部位を有することを特徴とする請求項６４または６５に記載の方法。
  77. 前記転写ユニットの多重コピーが２５％〜１００％同一であることを特徴とする請求項６４または６５に記載の方法。
  78. 前記転写ユニットの多重コピーが２５％同一であることを特徴とする請求項６４または６５に記載の方法。
  79. 前記転写ユニットの多重コピーが少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％同一であることを特徴とする請求項６４または６５に記載の方法。
  80. 前記転写ユニットの多重コピーが８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であることを特徴とする請求項６４または６５に記載の方法。
  81. 前記転写ユニットの多重コピーが１００％同一であることを特徴とする請求項６４または６５に記載の方法。
  82. 前記選択マーカー遺伝子がｇｐｔ、ｒｅｓ、ｎｅｏ、ｈｉｓ、ＤＨＦＲ、ＧＳ、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、アデニンホスフォリボシルトランスフェラーゼ（ＡＰＲＴ）、ゼオシン耐性、ハイグロマイシン耐性またはピューロマイシン耐性遺伝子であることを特徴とする請求項６４または６５に記載の方法。
  83. 前記選択マーカー遺伝子が増幅可能な選択マーカー遺伝子であることを特徴とする請求項６４または６５に記載の方法。
  84. 少なくとも１個の前記選択マーカー遺伝子で区切られた少なくとも２個の前記転写ユニットのコピーを有する発現ベクターが、前記細胞染色体中に組み込まれていることを特徴とする請求項６４または６５に記載の方法。
  85. 前記細胞が少なくとも１個、６個以下の前記発現ベクターで形質転換または形質移入されていることを特徴とする請求項６４または６５に記載の方法。
  86. 前記細胞が真核細胞であることを特徴とする請求項６４または６５に記載の方法。
  87. 前記細胞が植物、昆虫、哺乳動物または酵母細胞であることを特徴とする請求項６４または６５に記載の方法。
  88. 前記細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはＣＨＯ−Ｋ１細胞であることを特徴とする請求項６４または６５に記載の方法。
  89. 前記細胞がＤＨＦＲ＋ＣＨＯ−Ｋ１細胞株、ＤＨＦＲ−ＤＵＫＸ−Ｂ１１（ＤＸＢ１１）細胞株またはＤＧ−４４細胞株由来であることを特徴とする請求項６４または６５に記載の方法。
  90. 前記細胞が付着状態であることを特徴とする請求項６４または６５に記載の方法。
  91. 前記細胞が懸濁状態であることを特徴とする請求項６４または６５に記載の方法。
  92. 前記ポリペプチドが細胞内区画に蓄積されることを特徴とする請求項６４または６５に記載の方法。
  93. 前記ポリペプチドが前記細胞から培養上澄中に分泌されることを特徴とする請求項６４または６５記載の方法。
  94. 前記ポリペプチドが単離されることを特徴とする請求項６４または６５に記載の方法。
  95. それぞれ選択マーカー遺伝子で分離され、ポリペプチドをコードする転写ユニットの多重コピーを有することを特徴とし、ここで選択マーカー遺伝子が少なくとも２個の転写ユニットのコピーの間に、［（転写ユニット）ｘ−選択マーカー遺伝子−（転写ユニット）ｘ］として位置する様に該ベクターが直線化され、ｘが１〜４であり、各転写ユニットがそれ自身のプロモーターと３’非翻訳領域の制御下にある、ベクター。
  96. 前記発現ベクターが制限酵素で直線化され、前記選択マーカー遺伝子が少なくとも２個の前記転写ユニットのコピー間に［（転写ユニット）ｘ−選択マーカー遺伝子−（転写ユニット）ｘ］として位置し、ｘが１〜４であることを特徴とする請求項９５に記載のベクター。
  97. 前記プロモーターがＳＶ４０、ＨＳＶ、ウシ成長ホルモン、チミジンキナーゼ、ＭＰＳＶ、マウスβグロビン、ヒトＥＦ１、ＭＳＶ−ＬＴＲ、ＲＳＶ、ＭＭＴＶ−ＬＴＲ、ＣＭＶ、ＭＬＶ、チャイニーズハムスター延長因子、またはマウスアベルソンＬＴＲプロモーターであることを特徴とする請求項９５に記載のベクター。
  98. 前記ベクターがさらに多重エンハンサーを有することを特徴とする請求項９５〜９７の任意の１項に記載のベクター。
  99. 前記転写ユニットが多量体タンパク質の２つの異なったサブユニットをコードすることを特徴とする請求項９５〜９７の任意の１項に記載のベクター。
  100. 前記転写ユニットの多重コピーが免疫グロブリン重鎖および軽鎖ポリペプチドをコードすることを特徴とする請求項９５〜９７の任意の１項に記載のベクター。
  101. 前記転写ユニットの多重コピーが少なくとも免疫グロブリン重鎖および軽鎖ポリペプチドの可変領域をコードすることを特徴とする請求項９５〜９７の任意の１項に記載のベクター。
  102. 前記転写ユニットがＢＰＩタンパク質生成物をコードすることを特徴とする請求項９５〜９７の任意の１項に記載のベクター。
  103. 前記転写ユニットの多重コピーが正方向反復配向していることを特徴とする請求項９５〜９７の任意の１項に記載のベクター。
  104. 前記転写ユニットの多重コピーが逆方向反復配向していることを特徴とする請求項９５〜９７の任意の１項に記載のベクター。
  105. 前記転写ユニットがバイシストロン性またはポリシストロン性のユニットであることを特徴とする請求項９５〜９７の任意の１項に記載のベクター。
  106. 前記転写ユニットが内部リボソーム侵入部位を有することを特徴とする請求項９５〜９７の任意の１項に記載のベクター。
  107. 前記転写ユニットの多重コピーが２５％〜１００％の間で同一であることを特徴とする請求項９５〜９７の任意の１項に記載のベクター。
  108. 前記転写ユニットの多重コピーが２５％同一であることを特徴とする請求項９５〜９７の任意の１項に記載のベクター。
  109. 前記転写ユニットの多重コピーが少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％同一であることを特徴とする請求項９５〜９７の任意の１項に記載のベクター。
  110. 前記転写ユニットの多重コピーが８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であることを特徴とする請求項９５〜９７の任意の１項に記載のベクター。
  111. 前記転写ユニットの多重コピーが１００％同一であることを特徴とする請求項９５〜９７の任意の１項に記載のベクター。
  112. 前記選択マーカー遺伝子がｇｐｔ、ｒｅｓ、ｎｅｏ、ｈｉｓ、ＤＨＦＲ、ＧＳ、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、アデニンホスフォリボシルトランスフェラーゼ（ＡＰＲＴ）、ゼオシン耐性、ハイグロマイシン耐性またはピューロマイシン耐性遺伝子であることを特徴とする請求項９５〜９７の任意の１項に記載のベクター。
  113. 前記転写ユニットがγＢＰＩ２１をコードしｈＣＭＶプロモーターおよびマウス免疫グロブリン軽鎖３’非翻訳領域の制御下にあり、前記ベクターがさらにヒト免疫グロブリン重鎖エンハンサーの０、１または２個のコピーと１個のｇｐｔまたはｎｅｏ遺伝子を有することを特徴とする請求項９５〜９７の任意の１項に記載のベクター。
  114. 請求項９５に記載のクローニングベクター。
  115. 請求項９５に記載の発現ベクター。
  116. 請求項１１５に記載の発現ベクターを有する宿主細胞。
  117. 請求項１１５に記載の別な発現ベクターを有し、該別な発現ベクターが異なった選択マーカー遺伝子を有することを特徴とする請求項１１６に記載の宿主細胞。
  118. 前記宿主細胞が真核細胞であることを特徴とする請求項１１６に記載の宿主細胞。
  119. 前記宿主細胞が植物、昆虫、哺乳動物または酵母細胞であることを特徴とする請求項１１６に記載の宿主細胞。
  120. 前記宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはＣＨＯ−Ｋ１細胞であることを特徴とする請求項１１６に記載の宿主細胞。
  121. 前記発現ベクターが前記宿主細胞染色体に組み込まれていることを特徴とする請求項１１６に記載の宿主細胞。
  122. 請求項１１５に記載の発現ベクターを有することを特徴とする安定な細胞株。
  123. 前記細胞が少なくとも１個、６個以下の発現ベクターで形質転換または形質移入されることを特徴とする請求項１２２に記載の安定な細胞株。
  124. 請求項１２２または１２３に記載のＤＨＦＲ＋ＣＨＯ−Ｋ１細胞株、ＤＨＦＲ−ＤＵＫＸ−Ｂ１１（ＤＸＢ１１）細胞株またはＤＧ−４４細胞株。
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