JP4554370B2 - 多重遺伝子プラスミドおよび組み換えポリペプチドの発現増加法 - Google Patents
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Description
本出願は2002年3月29日出願の米国仮出願第60/368,530号の優先権を主張するものであり、その全文を本明細書に引用して援用する。
組み換えポリペプチド組成物は健康関連分野にわたり様々な処置や治療に使われることがますます多くなっている。組み換えポリペプチドは診断法、予防医学におけるツール、および投薬療法による直接救命法としてとして使用されてる。さらに、組み換えポリペプチドは生活の質を高めるために用いられる健康製品および化粧品の広い分野で使用されている。複合ポリペプチド生成物はまた、分析自体の最終生成物、または他の分子の研究または調製のための分析薬として、研究室で日常的に使用されている。この様な使用法により、病気の原因が発見され、隠れた病気の機序が理解されることが多く、診断および/または実行可能な治療の開発につながる。組み換えポリペプチドはまた、農業、食品加工、家畜の飼育から天然および合成副産物および廃棄物の触媒分解まで、様々な産業環境で重要な役割を果たす。
本発明は組み換えポリペプチドの発現を増加させる新規な方法と材料を提供する。第一の実施形態において、本発明の目的は宿主細胞由来の組み換えポリペプチドの発現を効率的に増加させる新規方法であって、目的とする価値のある高い濃度のタンパク質およびポリペプチドを生産する必要性を満足させることである。この様な方法の利点には時間、資源および/または生産コストの最小化が含まれる。他の実施形態では、本発明の目的は例えば、少なくとも1個の選択マーカー遺伝子で区切られた目的とする組み換えポリペプチドをコードする組み換えDNA配列の多重コピーを含む新規ベクターと、この様なベクターコンストラクトを内蔵する細胞株であって、高濃度の価値のあるおよび/または有用なポリペプチド生成物を効率的に生産し得るベクターと宿主細胞に対する必要性を満足させることである。
(a)少なくとも1個の選択マーカー遺伝子で区切られた、転写ユニットの多重コピーを含むベクターで形質転換または形質移入された細胞であって、転写ユニットはポリペプチドをコードする細胞を選択条件下で培養する工程;および
(b)転写ユニットの多重コピーからポリペプチドを発現する工程。
本発明によれば、ベクター上の転写ユニットのコピー数は少なくとも2個であるが3個、4個、5個、6個、7個、8個等々でも有り得る。転写ユニットのコピー数は任意のベクター上で少なくとも2個であり、8以下であることが好ましい。選択マーカー遺伝子で区切られた少なくとも2個の転写ユニットを含む個々のベクターを宿主細胞中に導入することができる。それぞれが異なった選択マーカー遺伝子を有することが好ましい別なベクターを逐次宿主細胞に導入して遺伝子導入量と発現を更に増加させることができる。好ましい宿主細胞にはCHO−K1細胞等のチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞が含まれる。本発明の方法はまた、例えば免疫グロブリン等の多量体タンパク質生成物を含む目的とする任意のポリペプチド生成物をコードする転写ユニットを提供する。
本発明は安定な細胞株からの発現を含む組み換えポリペプチドの発現の増加法を含む新規材料および方法を提供する。選択マーカー遺伝子で分離した、目的とするポリペプチドをコードする組み換えDNA配列を含む転写ユニットの多重コピーを有する新規発現ベクターが提供される。これらのベクターコンストラクトを内包する細胞株は、転写ユニットでコードされるポリペプチドの発現も可能である。免疫グロブリン等の多量体ポリペプチドを含む目的の任意のポリペプチドの発現の増加法が提供される。本明細書に記載されるポリペプチドの例は、γBPI21等のBPIタンパク質生成物である。他のポリペプチドの例は免疫グロブリン、または少なくとも免疫グロブリンの軽鎖および重鎖の可変領域を含むポリペプチドである。本明細書に記載される様に、少なくとも2個の組み換え遺伝子のコピーが発現ベクター中に挿入され、遺伝子は形質転換細胞または形質移入細胞、好ましくは哺乳動物形質転換細胞または形質移入細胞を調製および/または選択し、相同組み換えを最少にするため、または避けるため、gpt、neoまたはhis等の様々な選択マーカー遺伝子で分離される。その結果、これらのベクターコンストラクトに内包される組み換えポリペプチド生成物の見掛けの収率の増加が達成される。
(ベクターの構築)
本実施例は例示転写ユニットの多重コピーを含む(包含する)ベクターの構築を説明する。目的とするポリペプチドをコードする例示遺伝子配列の多重コピーを含む例示ベクターコンストラクトも説明する。
発現ベクターpING1729、pING4144、pING 4151およびpING4155をγBPI21配列(配列番号:3および4)をコードするDNA源として用いた。プラスミドpING4144およびpING4151はテオファン(Theofan)らが特許を共有する米国特許第5、674、834号に記載されている。pING4155は、G418耐性形質移入体を選択するためのneo遺伝子を含むこと以外はpING4144およびpING4151と類似している。pING1729は、マウス免疫グロブリン重鎖エンハンサーを欠失する以外はpING4144に類似している。このベクターはエンハンサーを含む約700bpのHindIII制限フラグントを除去して構築された。
γBPI21をコードするDNA源としてpING1732およびpING1740を用いて発現ベクターpING1744(図5)を構築した。neo遺伝子を含む以外はpING1732はpING1729に類似している。pING1732のNotIおよびHindIII部位の間に多重リンカー部位を最初にクローニングしてpING1740を構築し、G418耐性をコードするneo遺伝子を含むpING1736を形成した。このリンカーは最初のNotI部位を破壊し、XbaI部位に隣接して新しい部位を導入した。次に多重リンカー、CMVプロモーター、およびgpt遺伝子を含むpING4144由来の5600bpのXmn−XhoIフラグメントを有するpING1736由来のγBPI21遺伝子を含む2090bpのXmn−XhoIフラグメントをライゲーションしてpING1736由来のneo遺伝子をpING4144由来のgpt遺伝子で置換した。pING1744を構築するため、pING1732由来の約3700bpのHpaI−NotI γBPI21を含むフラグメントをXbaI消化で生成したpING1740由来の約7700bpのフラグメントとライゲーションし、T−4DNAポリメラーゼとデオキシリボヌクレアーゼで処理して平滑末端とし、NotIで消化した(図5)。pING1744はマイコフェノール酸耐性形質移入体を選択するためのgpt遺伝子とそれぞれCMVプロモーターとマウスκ軽鎖3’非翻訳領域の制御下にある、γBPI21遺伝子の2個のコピーとを含む。このベクターはIgエンハンサーを欠失している。pING1744をユニークXbaI部位で消化すると、gpt選択マーカー遺伝子が異なった2個の同等なγBPI21転写ユニットの間に位置する様に形成されたγBPI21の二つのコピーを含む直線状制限フラグメントを生じる。直線状DNAとして見ると、発現ベクター内の要素の順番は次の通りである:CMVプロモーター、γBPI21遺伝子、軽鎖3’非翻訳領域、gpt遺伝子、bla(Amp’)遺伝子、CMVプロモーター、γBPI21遺伝子、軽鎖3’非翻訳領域(図6)。
(形質移入クローンおよび細胞株の開発と特徴付け)
本実施例は、本発明の実施形態に続いて例示するベクターを有するクローンと細胞株の開発と特徴付けを説明する。γBPI21生産CHO−K1細胞株クローン51の開発と特徴付けを、実施例1に記載の2−遺伝子ベクターによる形質移入で説明する。クローン51の開発に用いられたCHO−K1細胞株はATCC(CCL61)から入手した。細胞を10%FBSを補充したハム(Ham)のF12培地中で生育した。
(第2の逐次ベクター形質移入による発現の増加:形質移入クローンと細胞株の開発と特徴付け)
本実施例は第2多重転写ユニットを用いる例示する細胞株の第2形質移入によるポリペプチドの発現と生産を更に増加させる方法を説明する。γBPI21生産CHO−K1細胞株であるクローン689の開発と特徴付けを説明する。クローン689は実施例2で説明した、2%FBSを補充したEx−Cell 301培地に、形質移入前にXbaIで消化したneo発現ベクターpING1733(図1)を用いて適応したクローン51の形質移入により開発された。2%FBSを補充した選択Ex−Cell 301培地中でなお生育を続ける(無血清生育に完全に適応するのでなく)クローン51細胞を、第2形質移入を速やかに開始させるため使用した。
2%FBS、MPAおよびキサンチンを補充した選択Ex−Cell 301培地中で生育するクローン51に、40μgのXbaI消化pING1733をエレクトロポーレーションした。2%FBSを補充した非選択Ex−Cell 301中での培地48時間の回復期間後、細胞を選択培地(0.8%mg/mlのG418と2%FBSを補充)中に入れ、約1×104細胞/ウエルで9ウエルプレートに移した。この時はMPAおよびキサンチンを培地に加えなかった。細胞を37°CでCO2インキュベーター中に置いた。2回の追加形質移入を上記の様に行った。
全体で1253個のクローンを96ウエルレベルで3回の形質移入からスクリーニングした。最高のγBPI21レベルを分泌する125個のクローンを2%FBSを補充した24ウエルプレート中の選択Ex−Cell 301培地(250μg/mlキサンチン、25μg/mlマイコフェノール酸および0.8mg/mlのG418)に移した。形質移入体が96ウエルプレート中で2%FBSを含むEx−Cell 301中で選択されていたが、この培地と共に24ウエルへ移した場合は最初の生育が悪かった。この問題は一時的にFBS濃度を4%に増加することで解決した。細胞は密集状態に生育し、マスターおよびレプリカ24ウエルプレート培養物をクローン51について上記の様に調製した。24ウエル培養で生産性をスクリーニングするため、細胞を4%FBSプラス40μlの滅菌S−セファロースビーズを含む1mlの選択Ex−Cell 301培地に移し、死滅するまでインキュベートした(7〜10日)。S−セファロースビーズを取り出し、1mlのトリス緩衝液(20mMトリス、pH7.4、0.1MNaCl)で1回洗浄し、γBPI21をビーズから1.5M NaClを含む1mlの同じ緩衝液中に溶出した。S−セファロースビーズから溶出した分泌γBPI21をサンドイッチELISAを用いて定量分析した。最高の46クローンを24ウエルプレートから25mlの4%FBSと形質移入体選択のために用いる濃度の半分の濃度の選択剤を補充したEx−Cell 301を含む125mlエレンマイヤー(振盪)フラスコに移した。フラスコ振盪試験を4%FBSを含むEx−Cell 301培地中でこれらのクローンで行った。これらとその後の試験から、いくつかの生産性の高いクローンが同定された(例えばクローン357、548、689および815を含む)。これらの試験の結果は、クローン689が約100μg/mlで最高の生産クローンであることを示した。引き続く振盪フラスコ試験で、クローン689が4%FBSを含むEx−Cell 301培地中での6回の試験で平均1043+1.99μg/mlで最良の生産株であることが示された。クローン689のバイアルを凍結した(リサーチセルバンクC3043と命名)。クローン689を4%FBSを補充したEx−Cell 301培地中で維持し、以下に示す初期安定性試験に用いた。
クローン689を、血清レベルを各継代培養毎に1/2に減らしてFBSフリーEx−Cell 301培地中での生育に適応させた。無血清生育への適応を完了し、バイアルを凍結した(リサーチセルバンクC3056と命名)。
クローン689で3回の安定性試験を行った。コントロールとしてクローン228と180(双方とも選択Ex−Cell 301培地中)の発現レベルもこれらの研究の一部としてモニターした。最初の試験は4%FBSを含むEx−Cell 301培地中で選択(マイコフェノール酸、キサンチン、G418)のある場合、ない場合で適応させたクローン689で、エレンマイヤーフラスコ(25ml細胞/フラスコ)中で開始した。培地を37°C、100rpmおよび週2回の継代培養でインキュベートした。週1回、細胞を50mlの2%FBSと2.5mlの殺菌SP−セファロース(ビッグビーズ)を補充した非選択Ex−Cell 301培地中へ接種した。これらの培養物を次いで37°Cで12日間生育させ、その後ビーズを集め、洗浄しγBPI21を溶出し、上記の様にHPLCで分析した。この研究は合計14週間後に終了した。この結果、選択のある場合、ない場合の双方で最初の減少後から6週間の細胞生育(クローン51で観察されたものと同じ結果)後、選択のある場合、ない場合で少なくとも7週間はクローン689は同様な生産性を示し(75〜80μg/ml)、その後選択のない場合は細胞生育の生産性は14週間で65〜70μg/mlのレベルへ極僅か減少する様に思われる。第2回目の実験は、クローン689の完全にFBSフリー培地への2回目の適応で得られたクローン689bで行われた。この研究は合計14週間行われた。双方の研究で、培養物を選択のある場合、ない場合でEx−Cell 301培地中でインキュベートし、上記の様に生産性を評価した。クローン689の安定性の研究結果は、14週間にわたる選択無しで発現レベルに有意の差がないことを示した。最初にEx−Cell 301に適応させたクローン689細胞でも同様な結果が得られた。
クローン689の平均の生産性はクローン228およびクローン51より少なくとも約1.5倍高かった。生産性は比生産性と細胞密度の関数であるので、様々なクローンの相対発現レベルが比生産性の差に反映しているかどうかを決めるために試験が行われた。従って、クローン180(1コピー)、クローン228および51(2コピー)の生産性がフラスコ振盪試験で比較された。各クローンで、細胞を対数期に生育させ、1〜2×105細胞/mlでそれぞれ2%FBSを補充した50mlのEx−Cell 301培地と2%のS−セファロースを含む7個の250mlエレンマイヤーフラスコ中に接種した。1個のフラスコを各時間ポイントのために用いた。以前の実験は、高濃度(>100μg/ml)のγBPI21がCHO−K1の生育を阻害することを示していた。従って、SP−セファロースを含まないフラスコにも各クローンを接種し、ビーズの有無による生育を比較した。細胞を37°Cでインキュベートし、SP−セファロースを第2、3、4、5、8および12日にフラスコから収穫した。
具体的には、接種後密封し、12日のインキュベーション期間後にのみ再度開いたエレンマイヤーフラスコ中でフラスコ振盪試験を行った。これらの条件下では、クローン689で平均75〜80μg/mlに対しクローン228では45〜50μg/mlであった。
以前の実験は、S−セファロースの存在が形質移入細胞の培養上澄からのγBPI21の効率的な検出と回収を促進することを示している[ホルビッツ(Horwitz)ら、Protein.Expr.Purif.18:77−85(2000)]。ビーズがない場合の培地上澄からのγBPI21の損失は、CHO細胞表面のヘパラン糖タンパク質との相互作用のためであると思われる。
γBPI21mRNAの相対的なレベルをクローン228と689で比較した。クローン228、689およびCHO−K1細胞をEx−Cell 301培地中で対数期に生育させ、全細胞質RNAを単離した[ゴーフ(Gaugh)、Anal.Biochem.173:93−95(1988)]。最初にRNA試料のリボソームRNAレベルをチェックし、ホルムアミド−1%アガロースゲル上で展開し、ニトロセルロースにブロッテイングし、軽鎖3’非翻訳領域に対する32P標識DNAプローブでハイブリダイゼーションした(図7)。膜を洗浄して非特異的に結合した計数値を除き、X線フィルムに露光した。図8に示す結果は、クローン689がγBPI21mRNAをクローン228より約1.6倍高いレベルでγBPI21を発現していることを示した。しかしながら、RNAase保護または定量的PCR等の方法がmRNAレベルのより正確な定量に必要であると思われる。
従って、本発明によればγBPI21をコードするcDNAの多重コピーを含む(包含する)ベクターが設計される。これらの二重転写ユニットはCHO−K1による逐次転写に用いられ、2個の1−転写ユニットベクターを含むクローン228のγBPI21レベルの約2倍を生産する細胞株クローン689が逐次形質移入の結果形成された。この生産性の増加は比生産性の2倍の増加(クローン228と比べて)の結果であると思われ、単に細胞密度の増加の結果ではない。実際、クローン689細胞はクローン228の細胞密度ほど高い密度で生育しないが、より高いγBPI21を生産する。さらに、クローン689は14週まで選択なしでその生産性を維持するが、これは大きな培養器中でスケールアップを行うに十分な時間である。本実施例は、驚異的な効率を有する少なくとも2つの異なった戦略における本発明の方法による発現の増加が、非増幅発現系で転写ユニット導入量により達成し得ることを示している。まず第一に、γBPI21遺伝子をコードする転写ユニットの多重コピー間に選択マーカー遺伝子を置くことにより、相同組み換えの問題を回避し、γBPI21遺伝子の多重コピーを発現する生産性の高い安定な細胞株を開発することができる。第2に、本発明の方法で細胞を逐次的に形質移入することにより、転写ユニットの多重組み込みコピー数を段階的に増加させて発現レベルを増加させることができる。本発明は関心のある任意のポリペプチドをコードする任意の転写ユニットの使用を想定しており、当業者が理解し得る様に、γBPI21で例示される様なBPIタンパク質に限定されるものではない。
(第3の逐次ベクター形質移入による発現のさらなる増加:形質移入クローンおよび細胞株)
本実施例は、第3の多重転写ユニットベクターを用いる例示細胞株の第3の逐次形質移入による発現と生産のさらなる増加と、その結果のポリペプチド生産レベルが増加したクローンおよび細胞株を説明する。
選択マーカー遺伝子で区切られた転写ユニットの多重コピーによるさらなる逐次形質移入を行って、転写ユニット発現の増加を試験した。2個のγBPI21遺伝子を含むベクターと第3の選択マーカーによる第3の逐次形質移入により、遺伝子導入量の増加に基づき、その遺伝子導入量が達成可能であるとすれば、クローン689の少なくとも1.5倍の発現レベルが得られると考えられる。クローン689は3回目に逐次形質移入される。この細胞株は、γBPI21の2個のコピーと、ヒスチジノール耐性を選択するための選択マーカーであるhis遺伝子を含むベクターpING1753で形質移入された。形質移入と選択に続き、合計で約500個の3重形質移入体クローンが96ウエルレベルおよび85個の3重形質移入体クローンが24ウエルレベルでS−セファロースによりスクリーニングされた。24ウエルレベルで試験した場合、最高の生産株はγBPI21をクローン689と比較して1.5倍まで高いレベルで分泌したが、密封フラスコ中で行われた最初の振盪フラスコ試験ではクローン689より20〜30%高いレベルで分泌したのみであった。最高の生産性のクローン(341)を以後の研究のために選んだ。
実施例3で説明したガス交換を行った場合の振盪フラスコ中での発現増加の驚くべき結果に続いて、振盪フラスコ試験を再度行ったが、このたびは開放フラスコを用いた。2%FBSを補充したEx−Cell 301培地中での開放振盪フラスコ試験でいくつかの3重形質移入体を評価した。その結果は、以前にクローン341(クローン689を形質移入して得られた3重形質移入体)で観察されたものより発現レベルが相当高いことが示された。事実、4回の独立の試験で、クローン341はクローン689(67.8μg/ml〜93.4μg/mlの範囲)より終始高いレベル(107.6μg/ml〜142.0μg/mlの範囲)で分泌した。従って、3重形質移入体であるクローン341は24ウエルレベルおよび開放振盪フラスコ中で約1.5倍の増加を達成した。
続いて、1%FBSを補充したEX細胞301培地中での生育に適応後のクローン341を試験した。Ex−Cell 301培地中、最初に3重逐次形質移入体を4%FBS中で選択し、次いで2%FBS中に適応させた。次にクローン341を1%FBSに適応させ、振盪フラスコ試験で再試験した。8回の振盪フラスコ試験の結果は、このクローンは、γBPI21の濃度が122.6μg/l〜144.8μg/lの範囲にあるその高い生産性を17週間にわたる少なくとも33回の継代培養で維持したことを示した。
クローン341を完全に無血清条件に適応させる試みは最初は成功しなかった。さらに、上記の発現レベルは最初の密封フラスコ実験のものより高く、クローン680のサブクローンで達成されたものより若干高かったが、発現レベルをさらに改善しより速く生育しより生産性の高いクローンを潜在的に選択するため、クローン341をサブクローニングした。細胞を1%FBSを含むEx−Cell 301培地中に30、15、7.5および3細胞/ウエルで播種した。単一コロニーのウエルからの合計69クローンを24ウエルプレートに移し、次いで生産性を評価するために振盪フラスコに移した。これらのうち、最高の6クローンを90日にわたる再評価のために最終的に確保し、γBPI21生産のためのスクリーニングを周期的に行った。スクリーニングの結果は、クローン83が振盪フラスコ試験で150〜165μg/ml(親クローン341の約135μg/mlと比較して)の範囲を分泌する最高のサブクローンであると同定されたことを示した。
完全選択条件下に6個のクローンをさらに8週間維持し、生産性を評価した。その結果は、クローン83が最良の生産株であり、2回の試験では180および195μg/mlを分泌し、常に親クローン341を上回ることを示した。
(エンハンサーが欠失する多重転写ユニットベクターによる逐次形質移入:クローンおよび細胞株の開発と特徴付け)
本実施例は、多重転写ユニットベクターによる逐次形質移入により、エンハンサーをベクターから除去しても一定の転写ユニットの発現量を有効に増加させることを示すものである。これは、クローン51と同様にγBPI21遺伝子を含みIgエンハンサーを持たない例示ベクターpING1744で形質移入されたクローン338である例示クローンの開発と特徴付けで示される。得られたクローン、すなわちクローン338は次にIgエンハンサーを持たない第2の2−遺伝子(γBPI21)ベクターであるpING1915で形質移入され、特徴付けされた。クローン58は逐次形質移入で得られ、スクリーニングにより単一形質移入体であるクローン338よりかなり高い濃度でγBPI21の発現を示した。
クローン338を、それぞれCMVプロモーターと、MPA耐性形質移入体を選択するためのgpt遺伝子を有するがIgエンハンサーを持たない軽鎖3’非翻訳領域の制御下にある2個のγBPI21遺伝子を含むベクターpING1744を有する付着したCHO−K1細胞の形質移入で開発した。pING1744は形質移入に先立ってXbaI部位で最初に消化され、選択マーカー遺伝子がγBPI21遺伝子の2個のコピー間に置かれた(図5)。
マイコフェノール酸に対する選択はEx−Cell 301培地中では相対的に弱く、高い発現レベルの維持はこのクローンが比較的安定であることを示している。安定性をさらに調べるため、培養体を1%FBSを補充したEx−Cell 301培地中で選択のある場合、ない場合で生育させた。細胞を週に2回継代培養し、振盪フラスコ試験を毎週設定した。その結果は、選択のある場合、ない場合で7週間にわたりγBPI21が約100μg/mlで発現したことを示したが、選択がない場合はこの期間中に約20μg/mlの発現の若干の現象が見られた。これらの結果は、選択のない細胞はγBPI21を若干低いレベルで発現したが、このクローンは選択なしで少なくとも7週間安定であった。この実験は第7週で中止した。
発現をさらに最適化させるため、1%FBSを補充したEx−Cell 301培地に適応させたクローン338を、G418耐性形質移入体を選択するためのneo遺伝子を含む以外はpING1744に類似しているが、Igエンハンサーを欠失するpING1951で再形質移入した。合計約600の形質移入体を96ウエルレベルでスクリーニングし、250をS−セファロースを含む24ウエルプレート中でスクリーニングした。このスクリーニングの結果は、30〜60μg/mlで分泌するいくつかのクローンを明らかにした。比較として、単一のIgエンハンサーを有する2−遺伝子ベクターに対する24ウエルプレート中の最高の発現レベルは、一般に約15μg/mlであり、2個のこの様な2−遺伝子ベクターのレベルは30〜35μg/mlであり、この様な2−遺伝子ベクターによる第3の形質移入によるレベルは同様な条件下で約45μg/mlであった。
(別な発現ベクターの構築)
本実施例は別な例示転写ユニットの多重コピーを含む発現ベクターの構築を説明する。記載される例示ベクターコンストラクトはまた、関心のあるポリペプチドをコードする例示遺伝子配列、例えば軽鎖および/または重鎖配列を含む免疫グロブリン遺伝子配列の多重コピーを含んでいる。
CHO−K1細胞中で最適発現のために必要な要素を含むマウス−ヒトキメラING−1軽鎖(配列番号:5および6)および重鎖(配列番号:7および8)をコードする配列を有するベクターが構築された。これらのING−1ベクターは共にヒト遺伝子操作抗体遺伝子の構築のための出発点となり、マウス−ヒトキメラING−1を発現するCHO−K1細胞株を開発するために用いられている。以下に述べる発現ベクターはCMVプロモーター、マウスκ軽鎖3’非翻訳領域および選択遺伝子マーカーと軽鎖および/または重鎖配列をコードする転写ユニットを有する。
マウス−ヒトキメラING−1重鎖遺伝子(配列番号:7)を有するマウス−ヒトキメラING−1重鎖ベクター(配列番号:7および8)pING1931がSaIプラスNaeIによるpING2225の消化で構築され(例えば米国特許第5、576、184号参照)、重鎖遺伝子配列を有する1433フラグメントを単離した。このフラグメントをXhoIでし、末端を平滑化するためにデオキシリボヌクレオチドの存在下にT4DNAポリメラーゼで処理し、次いでSalIで処理しマウス−ヒトING−1重鎖遺伝子(配列番号:7)をヒトCMVプロモーターとマウス軽鎖3’非翻訳領域(図10)の制御下に置くpING1736(実施例1に記載、gpt遺伝子の代わりにneo遺伝子を含む以外はpING1740に類似)由来の7352bpのベクターフラグメントとライゲーションした。キメラマウス−ヒトING−1重鎖は配列番号:7で示される。別な重鎖可変領域遺伝子も、以下に述べる様にヒト遺伝子操作抗体可変領域遺伝子を含めSal−ApaI部位にクローニングされる。
マウス−ヒトキメラING−1軽鎖プラス重鎖遺伝子配列(配列番号:5および7)を有するベクターが、pING1928およびpING1931を用いて構築された。pING1931はEcoRVで消化され、子牛腸アルカリホスファターゼ(CLP)で処理された。EcoRVはユニークNotI部位に隣接するユニーク部位(および円弧状マップ上で反時計回りに)で切断する。pING1928はNotIおよびHpaIで消化され、次いで末端を平滑化するためにデオキシリボヌクレオチドの存在下にT4DNAポリメラーゼで処理される。マウス−ヒトキメラ軽鎖遺伝子(配列番号:5)を含む3720bpのフラグメントを精製し、マウス−ヒトキメラ重鎖遺伝子(配列番号 7)を有するEcoRV消化pING1931とライゲーションされた。図11に示される様に、pING1932およびpING1932Rで示される二つの可能な配位が得られる。
ヒト抗体可変領域ドメインの遺伝子操作は抗体分子の結合活性を維持しながら免疫原性を減少させる方法としてスチュドニッカ(Studnicka)により記載されている[スチュドニッカら、米国特許第5、766、886号;スチュドニッカら、Protein Engineering、7:850−814(1994)]。この方法によれば、可変領域の各アミノ酸が置換のリスクで指定された。アミノ酸置換は3つのリスク分類の1つで区別される:(1)低リスク変化とは、抗原結合またはタンパク質の折り畳みの機会を最少にして免疫原性を減少させる最大の可能性を有するものを言う;(2)中程度のリスク変化とは、さらに免疫原性を減少させるが、抗原結合またはタンパク質の折り畳みに影響する機会が大きいものを言う;(3)高リスク残基とは、結合(例えばCRDループ)または抗体の構造を維持するのに重要であり、抗原結合またはタンパク質の折り畳みが影響されるリスクが最大であるものを言う。
ヒト遺伝子操作ING−1重鎖ベクターであるpING1936(図14)を、マウス−ヒトキメラING−1重鎖を含むpING1931をSalIプラスApaIで消化して構築し、CMVプロモーター、重鎖不変領域、軽鎖3’非翻訳領域、およびG418耐性形質移入体を選択するためのneo遺伝子を有する8344bpのフラグメントを単離した。このフラグメントを、合計13個の低リスクアミノ酸置換で遺伝子操作したヒトING−1重鎖可変領域を有する450bpのPCRで生成したSAlI−ApaIフラグメントとライゲーションし(図15;配列番号:22)、低リスクヒト遺伝子操作ING−1重鎖をCMVプロモーターとマウス軽鎖3’領域非翻訳領域の制御下に置いた。ING−1重鎖可変領域における低リスク変化と低プラス中リスク変化を図15に示す。重鎖では、上記の様に低リスク重鎖可変領域(配列番号:23)に対して合計で13個の低リスク変化が行われ、それとは別に合計20個の中リスク変化を低プラス中リスク可変領域(配列番号:24および25)に行った。別に付着するベクターpING1936は、13個の低リスク変化を含むPCRで生成したヒト遺伝子操作ING−1重鎖可変領域を含む。重鎖可変領域をコードするDNAフラグメントを6個の重複するオリゴヌクレオチドGL1(配列番号:26)、GL2(配列番号:27)、GL3(配列番号:28)、GL4(配列番号:29)、GL5(配列番号:30)およびGL6(配列番号:31)を用いて構築した。これらのセグメントを相互にアニーリングし、DNAポリメラーゼで延長し、組み立てた可変領域を5’前方向プライマーGF(配列番号:32)および3’逆方向プライマー(配列番号:33)を用いてPCRで増幅し、SalIおよびApaIを用いて消化して発現ベクターpING1931中に直接クローニングされた制限フラグメントを作成し、図14に示す様なpING1936を生成した。他の発現ベクターpING1942を同様な方法を用いて構築したが、これはpING1942が図15に示す様な低プラス中リスク変化で遺伝子操作されたヒトING−1重鎖可変領域(配列番号:24および25)を有する以外はpING1936に類似している。低プラス中リスク修飾重鎖可変領域を、上記の低リスク修飾可変領域の構築に用いられた2個を含む6個の重複オリゴヌクレオチドGL1(配列番号:26)、GM2(配列番号:34)、GM3(配列番号:35)、GM4(配列番号:36)、GM5(配列番号:37)およびGL6(配列番号:31)を用いて構築した。
ヒト遺伝子操作ING−1軽鎖プラス重鎖遺伝子を有するベクターpING1937をpING1933およびpING1936を用いて構築した(図16)。pING1936をXbaIで消化し、T4ポリメラーゼで処理し次いでNotIで消化した。8780bpの制限フラグメントを生成した。pINGをNhe1、次いでNotIおよびHpaIで消化し、ヒト遺伝子操作軽鎖遺伝子を有する3712bpのフラグメントを精製しXbal−NoIで消化したpING1936とライゲーションし、G418耐性形質移入体を選択するためのneo遺伝子を有するpING1937を生成した。軽鎖プラス重鎖発現ベクターを構築するために使用する前に、可変領域DNAを再配列した。pING1937の特徴を表1にまとめる。
マイコフェノール酸耐性形質移入体の選択用のgpt遺伝子を有する以外はpING1937に類似のベクターpING1959を、(それぞれCMVプロモーターと軽鎖3’非翻訳領域に融合したヒト遺伝子操作ING−1軽鎖および重鎖遺伝子を有する)pING1937由来の7696bpのHpaI−NotIフラグメントと、gptをコードする遺伝子を有するpING414由来の4441bpのフラグメントをライゲーションして、図17に示す様に構築した。
his遺伝子を有するpING4152由来の4639bpのHpaI−NotIフラグメント(上記実施例1に記載)をライゲーションして、図18に示す様に構築した。
ヒト遺伝子操作ING−1重鎖プラス軽鎖ベクターpING1937をNotIで処理し、デオキシリボヌクレオチドの存在下にT4DNAポリメラーゼで処理して平滑末端とし、自己クローニングさせ、NotI部位を破壊して図19に示す様にNotI部位が欠失したベクターpING1963を形成した。ベクターpING1937を次にNheIおよびEcoRVで消化し、9905bpのフラグメントを精製し10298bpのpING1963由来のnHeI−HpaIフラグメントとライゲーションし、図20に示す様に4個のING−1遺伝子(4−遺伝子ベクター)を有するベクターpING1964を形成した。pING1964はヒト遺伝子操作ING−1軽鎖遺伝子の2個のコピーと、ING−1重鎖遺伝子の2個のコピーを有し、4個の遺伝子のそれぞれはCMVプロモーター、軽鎖3’非翻訳領域およびG148耐性形質移入体を選択するためのneo遺伝子の制御下にある。マイコフェノール酸耐性形質移入体を選択するためのgpt遺伝子を含む以外はpING1964に類似したベクターpING1965を、pING1959由来のHpaI−SfiIフラグメントをpING1964由来のHpaI−SfiIフラグメントとライゲーションして図21に示す様に構築した。
(別な形質移入クローンおよび細胞株の開発と特徴付け)別な形質移入クローンおよび細胞株の開発と特徴付け
本実施例は、本発明による別な例示ベクターで形質移入された別なクローンと細胞株の開発と特徴付けを説明する。免疫グロブリン生産細胞株の開発と特徴付けを、実施例6に記載される例えば2個の遺伝子ベクターによる形質移入から説明する。
実施例6で説明した発現ベクターpING1932およびpING1932RをEx−Cell 301培地に適応したCHO−K1細胞中に形質移入した。具体的には、Ex−Cell 301培地中で懸濁生育に適応したCHO−K1細胞に40μgの直線化したベクターをエレクトロポーレーションした。pING1932およびpING1932Rの双方はユニークNotI部位を含む。形質移入のためのDNAを調製する場合、NotI部位での消化により直線状DNAが得られ、CMVプロモーターと軽鎖3’非翻訳領域の制御下にある軽鎖および/または重鎖遺伝子はCHO染色体中に挿入すると選択マーカー遺伝子で分離されている。pING1932では重鎖と軽鎖は同じ方向に配向し、pING1932Rではそれらは反対の方向に配向している。
ヒト遺伝子操作ING−1低リスク軽鎖および重鎖遺伝子とneo(C148耐性)遺伝子を各1個ずつ含む発現ベクターpING1937をXbaIで消化して直線化し、次いでEx−Cell 301培地中で無血清適応CHO−K1細胞中に形質移入した。G418耐性形質移入体を最高形質移入体の一つとして選択し、約60mg/mlまで振盪フラスコ中で、約200mg/Lまで培養器中で生産した。
(第2の逐次ベクター形質移入による発現の増加:別な形質移入クローンおよび細胞株の開発)
本実施例は例示細胞株の第2の多重転写ユニットベクターを用いる第2の形質移入によるポリペプチド、例えば免疫グロブリンのの発現と生産のさらなる増加を説明する。
クローン146を無血清培地(Rx−Cell 310)中でpING1957により形質移入した。まず、650個のクローンを96ウエルプレート中で2回形質移入してスクリーニングした。次いで142個のクローンを96ウエルプレートから選択し、次いで24ウエルプレートからスクリーニングした。最後に、31個のクローンを24ウエルプレートから選択し、振盪フラスコ中でスクリーニングした。HPLCで測定した、FBSのないEx−Cell 310培地中における最高の抗体生産株の結果は、最高の生産株が抗体を、クローン146より2倍高いレベルで抗体を発現することを示した。例えば、最高の生産株であるクローン146.2−259は、2回の異なった試験で172μg/mlおよび192μg/mlの抗体を発現した。
クローン146、すなわち最初のpING1937 G418耐性形質移入体にEx−Cell 301培地中でサブクローニングを行い、Ex−Cell 301培地中におけるクローン146の約65μg/mlに対しそのうちの1つのサブクローン146.3は約121μg/mlを分泌した。
(第3の逐次ベクター形質移入によるさらに増加した発現:別な形質移入クローンと細胞株の開発と特徴付け)
本実施例は第3の多重転写ユニットベクターを用いる、例示細胞株の第3の逐次形質移入による発現と生産の更なる増加と、ポリペプチド、例えば免疫グロブリンポリペプチド生産レベルが増加したクローンおよび細胞株の結果を説明する。
(別な多重転写ユニットベクターによる形質移入:別な形質移入クローンと細胞株の開発)
ヒト遺伝子操作ING−1軽鎖および重鎖遺伝子(pINh1959、2−遺伝子ベクター)をそれぞれ1コピー、またはヒト遺伝子操作INH−1軽鎖および/または重鎖遺伝子(pING1965、4−遺伝子ベクター)をそれぞれ2コピー含む発現ベクターpING1959(図17)およびpING1965(図21)をCHO−K1細胞に形質移入した。Ex−Cell 301培地中で懸濁生育に適応したCHO−K1細胞を各40μgの直線化ベクターでエレクトロポーレーションした。選択剤なしの2日間の回復期間後、細胞を5%FBS、マイコフェノール酸およびキサンチンを補充したハムのF12培地を含む96ウエルプレートに播種した。合計300および255個のクローンを96ウエルプレート中でスクリーニングし、pING1959およびpING1965でそれぞれ形質移入した。pING1959形質移入では、最高の18クローンを1%FBSを含むEx−Cell 301培地を含む24ウエルプレートに移した。pING1965形質移入では、最高の40クローンを1%FBSを含むEx−Cell 301培地を含む24ウエルプレートに移した。pING1959形質移入からの全部で18クローンを次に1%FBSを含むEx−Cell 301培地を含む振盪フラスコに移し、生産性を評価した。最高の2つの生産株であるクローン53と57はそれぞれ、1%のFBSの存在で116と133μg/mlを分泌した。FBSを補充しないEx−Cell 301培地中では、クローン53と57はそれぞれ157および121μg/mlを分泌した。pING1965形質移入では、最高の8クローンを振盪フラスコに移し、生産性を評価した。最高の生産株では、クローン17は1%FBSを補充したEx−Cell 301培地中で216μg/ml、FBSを補充しないx細胞301培地中で214μg/mlを分泌した。従って、ヒト遺伝子操作軽鎖および/または重鎖遺伝子をそれぞれ2コピー有する4−遺伝子ベクター(pING1965)で形質移入した細胞株は、ヒト遺伝子操作ING−1軽鎖および/または重鎖遺伝子をそれぞれ1コピー有する2−遺伝子ベクター(pING1959)で形質移入した細胞株より約2倍多い免疫グロブリンポリペプチドを生産した。
(免疫グロブリンポリペプチドの結合活性の評価)
実施例6に従って構築された、ヒト遺伝子操作ING−1軽鎖および/または重鎖遺伝子をコードするベクター、例えばpING1937(低リスクヒト遺伝子操作ING−1)およびpING1944(低プラス中リスク遺伝子操作ING−1)をXbaIで直線化し、無血清適応CHO−K1を形質移入し、その後G418耐性形質転換体を選択するために用いた。タンパク質を振盪フラスコ培地か上澄からプロテインAカラムを通して精製した。製造した免疫グロブリンポリペプチドの結合活性を評価するため、ヒト癌腫細胞株HT−29との競合結合を行った。この結腸直腸癌腫細胞株はEp−CAMとして知られる分子を表面に発現する。Ep−CAMは、ATCCに寄託された細胞株HB9812で生産されるマウス−ヒトキメラING−1抗体の抗原結合活性を有する免疫グロブリンポリペプチドで認識される。
(可溶性ヒトEp−CAMのクローニングと発現、およびEp−CAM結合分析)
実施例11で説明したHT−29細胞等のEp−CAM発現細胞との競合結合分析は、放射性同位元素の使用と、どの様な細胞系分析と同様に潜在的な可変性を有する各分析毎に細胞の維持と生育が必要である。可溶性Ep−CAMを用いる結合ELISA分析も開発され、本発明の形質移入細胞が生産した免疫グロブリンポリペプチドの結合活性を評価するために用いられている。これらの分析では、可溶性ヒトEp−CAM(配列番号:57および58)がクローニングされ発現された。使用された免疫グロブリンポリペプチドには、2Lまたは500L培養機の運転によるヒト遺伝子操作(低リスク)ING−1と、振盪フラスコまたは2L培養器からのING−1アフィニティークロマトグラフィーで精製された可溶性sEP−CAMが含まれる。
(別な発現ベクターの構築)
本実施例は別な例示転写ユニットの多重コピーを有する発現ベクターの構築を説明する。関連するポリペプチド、例えば軽鎖および/または重鎖並列を含む別な免疫グロブリン遺伝子をコードする例示遺伝子配列の多重コピーを有する例示ベクターコンストラクトも記載される。
ヒスチジノール耐性形質転換体選択のためのhis遺伝子を含む第2の抗CD18軽鎖プラス重鎖発現ベクターpING2057も、pING2052中のneo遺伝子をpING1957由来のhis遺伝子に交換して構築された。ベクターpING2052は最初に制限酵素HpaIおよびNotIで消化され、その後大きな直線状フラグメントを精製した。ベクターpING1957を次にHpaIおよびNotIで消化し、次いでより小さいhis遺伝子フラグメントを精製した。直線状ベクターpING2052およびhis遺伝子フラグメントをライゲーションして、図36に示す様なヒスチジノール耐性形質転換体選択のための軽鎖プラス重鎖発現ベクターpING2057を形成した。pING2057の特徴を表3にまとめる。
(実施例14)
(別な形質転換クローンおよび細胞株の開発と特徴付け)
本実施例は、本発明による別な例示ベクターで形質転換された別な形質転換クローンおよび細胞株の開発と特徴付けを説明する。別な形質転換クローンおよび細胞株の開発と特徴付けは、実施例13で述べた多重遺伝子ベクターを含むベクターによる形質移入から説明される。
(第2の逐次ベクター形質移入による発現の増加:別な形質移入体されたクローンと細胞株の開発と特徴付け)
本実施例は別な免疫グロブリンを含むポリペプチドの発現と生産の、例示細胞株の第2の多重転写ユニットを用いる第2の形質移入によるさらなる増加を説明する。
(いくつかの市販培地中でのポリペプチドの発現)
本実施例はいくつかの別な細胞培養培地の使用を説明する。多くの化学的に合成された、および/または動物生産物フリーの培地がCHO細胞中での高収量のタンパク質製造のために設計され、市販されている。バイオホイッタカー(BioWhittaker)で製造され、現在カンブレックス(Cambrex;カタログ番号12−762Q、12−029Qおよび12−766Q)として知られるProCHO3、ProCHO4およびProCHO5、およびハイクローン(HyClone;カタログ番号SF30359.02)で製造されたHyQ−PFCHOを含め4種のこの様な培地が形質移入体の培養に利用された。これらの各培地にグルタミン/ペニシリン/ストレプトマイシンおよび選択剤(例えばG148ゲネチシン(登録商標)および/またはヒスチジノール)を補充した。選択剤なしで振盪フラスコ試験をおこなった。第14日または培養物の生存率が20%以下に下がった時点で、力価をプロテインA HPLCで測定した。
(別な発現ベクターの構築)
本実施例は別な例示転写ユニットの多重コピーを含む発現ベクターの構築を説明する。この様な活性を有する、キメラまたは関連するポリペプチドをコードする例示遺伝子配列の多重コピーを含む例示ベクターコンストラクトも記載される。多重クローニング部位をCMVプロモターと軽鎖3’非翻訳領域の間に含むいくつかのモヂュラー発現ベクターが、実施例13に記載の様に構築され、補体阻害タンパク質をコードする別な発現ベクターの構築に利用された。これらの発現ベクターpING1732−RIClaRVおよびpING1736−RIClaKpnIが図29および30に示される。CAB2.1遺伝子を含むベクター(米国特許第6、316、253号の図1参照;配列番号:76および77)が、図40および図41それぞれに示される様にneo(G418耐性)発現ベクターpING1732−RIClaRVおよびpING1736−RICkaKpnIの多重クローニング部位にPCRによりクローン化された。得られたCAB2.1を含むベクターは図40に示す様にpING2053および図41に示すようにpING2054と命名された。図40にし示す様に、pING2053は最初にベクターpING1732−RIClaRVを制限酵素ClaIで消化し、次いで制限酵素EcoRIで消化して構築された。次に、CAB2.1をコードする遺伝子を、前方向プライマーCAB2RI5PrFwd(5’GTTAAGAATTCCACCATGGAGCCTCCCGG3’(配列番号:78))および逆方向プライマーCAB2Cla3PrRev(3’GAAGTCCATGATGGGCAACTTAGCTAAATCT5’(配列番号:79))を用いるPCRで増幅した。得られたPCR生成物を精製し、制限酵素EcoRIおよびClaIで消化し、EcoRIおよびClaIで直線化したpING1732−RIClaRVとライゲーションし、CAB2.1遺伝子(配列番号:76)を有するCAB2.1ベクターであるpING2053を生成した。
pING2055と呼ばれる、CAB2.1の2個のコピーを有し、G418耐性形質移入体を選択するためのneo遺伝子を有する別なベクターが図42に示す様に構築された。まずベクターpING2053を制限酵素HpaIで消化し、XbaIリンカーに滑末端ライゲーションし、そのリンカーをXbaIでトリミングした。次いでそのDNAをBglIIで消化し、CAB2.1遺伝子を有する大きな直線状ベクターフラグメントを精製した。ベクターpING2054をXbaIおよびBglIIで消化し、CAB2.1遺伝子を有する大きな直線状ベクターフラグメントを精製した。消化、精製したpING2053およびpINg2054の双方をライゲーションして、図42に示す様に2−遺伝子発現ベクターpING2055を生成した。pING2055の特徴を表5にまとめる。
pING2056と名付けられたCAB2。1遺伝子の2個のコピーを有する他のベクターも図43に示す様に構築した。pING2056は多重形質移入を促進するためのヒスチノール耐性をコードする以外は、his遺伝子neo2−遺伝子ベクターpING2055と同じ構造を有する。pING2056の特徴を表6にまとめる。
(実施例18)
(別な形質移入クローンおよび細胞株の開発と特徴付け)
本実施例は本発明による別な例示ベクターで形質移入体移入されたクローンおよび細胞株を説明する。ポリペプチド生産細胞株の開発と特徴付けは、図17に示す様な多重遺伝子ベクターを含むベクターによる形質移入から説明する。
(第2の逐次ベクター形質移入による発現の増加:場綱形質移入体移入クローンおよび細胞株の開発と特徴付け)
本実施例は補体阻害活性を有するポリペプチドの、多重形質移入ユニットベクターを用いる例示細胞株の第2の形質移入による発現と生産のさらなる増加を説明する。
Claims (124)
- (a)少なくとも1個の選択マーカー遺伝子で区切られた転写ユニットの多重コピーを有するベクターで形質転換または形質移入した細胞を選択条件下で培養する工程であって、該転写ユニットはポリペプチドをコードしている工程;および
(b)該ポリペプチドを該転写ユニットの多重コピーから発現する工程であって、ここで選択マーカー遺伝子が少なくとも2個の転写ユニットのコピーの間に、[(転写ユニット)x−選択マーカー遺伝子−(転写ユニット)x]として位置する様に該ベクターが直線化され、xが1〜4である工程、
を包含し、各転写ユニットがそれ自身のプロモーターと3’非翻訳領域の制御下にあることを特徴とする組み換えポリペプチドの製造法。 - (a)少なくとも1個の選択マーカー遺伝子で区切られた転写ユニットの多重コピーを含むベクターで細胞を形質転換または形質移入する工程であって、該転写ユニットがポリペプチドをコードする工程;
(b)工程(a)由来の該細胞を該少なくとも1個の選択マーカー遺伝子の選択条件下で培養し、それにより該ベクターで形質移入または形質転換した該細胞を選択する工程;および
(c)該転写ユニットの多重コピーから該ポリペプチドを発現する工程であって、ここで選択マーカー遺伝子が少なくとも2個の転写ユニットのコピーの間に、[(転写ユニット)x−選択マーカー遺伝子−(転写ユニット)x]として位置する様に該ベクターが直線化され、xが1〜4である工程、
を包含し、各転写ユニットがそれ自身のプロモーターと3’非翻訳領域の制御下にあることを特徴とする転写ユニットの多重コピーからの組み換えポリペプチドの製造法。 - (a)少なくとも1個の選択マーカー遺伝子で区切られた転写ユニットの多重コピーを含むベクターで細胞を形質転換または形質移入する工程であって、該転写ユニットがポリペプチドをコードする工程;
(b)工程(a)由来の該細胞を該少なくとも1個の選択マーカー遺伝子の選択条件下で培養し、それにより該ベクターで形質移入または形質転換した該細胞を選択する工程;
(c)工程(a)および(b)を該細胞に対し繰り返し、該細胞を工程(a)由来の別なそのベクターで逐次形質移入または形質転換する工程であって、該別なベクターのそれぞれは異なった選択マーカー遺伝子を有する工程;および
(d)該転写ユニットの多重コピーから該ポリペプチドを発現する工程であって、ここで選択マーカー遺伝子が少なくとも2個の転写ユニットのコピーの間に、[(転写ユニット)x−選択マーカー遺伝子−(転写ユニット)x]として位置する様に該ベクターが直線化され、xが1〜4である工程、
を包含し、各転写ユニットがそれ自身のプロモーターと3’非翻訳領域の制御下にあることを特徴とする転写ユニットの多重コピーからの組み換えポリペプチドの製造法。 - 前記細胞が別なベクターで逐次形質転換または形質移入され、該別なベクターのそれぞれが異なった選択マーカー遺伝子を有することを特徴とする請求項1または2に記載の方法。
- 前記選択マーカー遺伝子が少なくとも2個の前記転写ユニットのコピーの間に、[(転写ユニット)x−選択マーカー遺伝子−(転写ユニット)x]として位置する様に前記発現ベクターが制限酵素で直線化され、xが1〜4であることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記プロモーターがSV40、HSV、ウシ成長ホルモン、チミジンキナーゼ、MPSV、マウスβグロビン、ヒトEF1、MSV−LTR、RSV、MMTV−LTR、CMV、MLV、チャイニーズハムスター延長因子、またはマウスアベルソンLTRプロモーターであることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記発現ベクターが更に多重エンハンサーを有することを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記転写ユニットが多量体タンパク質の2つの異なったサブユニットをコードすることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記転写ユニットが免疫グロブリン軽鎖および重鎖ポリペプチドをコードすることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記転写ユニットが少なくとも免疫グロブリン軽鎖および重鎖ポリペプチドの可変領域をコードすることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記転写ユニットがBPIタンパク質生産物をコードすることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記転写ユニットの多重コピーが正方向反復配向していることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記転写ユニットの多重コピーが逆方向反復配向していることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記転写ユニットがバイシストロン性またはポリシストロン性のユニットであることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記転写ユニットが内部リボソーム侵入部位を有することを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記転写ユニットの多重コピーが25%から100%の間で同一であることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記転写ユニットの多重コピーが25%同一であることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記転写ユニットの多重コピーが少なくとも70%、少なくとも80%、または少なくとも90%同一であることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記転写ユニットの多重コピーが80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一であることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記転写ユニットの多重コピーが100%同一であることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記選択マーカー遺伝子がgpt、res、neo、his、DHFR、GS、アデノシンデアミナーゼ(ADA)、チミジンキナーゼ(TK)、アデニンホスフォリボシルトランスフェラーゼ(APRT)、ゼオシン耐性、ハイグロマイシン耐性またはピューロマイシン耐性遺伝子であることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記選択マーカー遺伝子が増幅可能な選択マーカー遺伝子であることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記少なくとも1個の選択マーカー遺伝子で分離される転写ユニットの少なくとも2個のコピーを有する発現ベクターが、細胞染色体中に組み込まれることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞が少なくとも1個、および6個以下の発現ベクターで形質転換または形質移入されることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞が真核細胞であることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞が植物、昆虫、哺乳動物または酵母細胞であることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞がチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞またはCHO−K1細胞であることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞がDHFR+CHO−K1細胞株、DHFR−DUKX−B11(DXB11)細胞株またはDG−44細胞株由来であることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞が付着状態であることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞が懸濁状態でることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ポリペプチドが細胞内区画に蓄積されることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ポリペプチドが細胞から培養液上澄中に分泌されることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ポリペプチドが単離されることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 少なくとも1個の選択マーカー遺伝子で分離される転写ユニットの多重コピーを有するベクターであって、該転写ユニットがポリペプチドをコードすることを特徴とし、ここで選択マーカー遺伝子が少なくとも2個の転写ユニットのコピーの間に、[(転写ユニット)x−選択マーカー遺伝子−(転写ユニット)x]として位置する様に該ベクターが直線化され、xが1〜4であり、各転写ユニットがそれ自身のプロモーターと3’非翻訳領域の制御下にある、ベクター。
- 前記選択マーカー遺伝子が少なくとも2個の前記転写ユニットのコピーの間に、[(転写ユニット)x−選択マーカー遺伝子−(転写ユニット)x]として位置する様に前記発現ベクターが制限酵素で直線化され、xが1〜4であることを特徴とする請求項34に記載のベクター。
- 前記プロモーターがSV40、HSV、ウシ成長ホルモン、チミジンキナーゼ、MPSV、マウスβグロビン、ヒトEF1、MSV−LTR、RSV、MMTV−LTR、CMV、MLV、チャイニーズハムスター延長因子、またはマウスアベルソンLTRプロモーターであることを特徴とする請求項34に記載のベクター。
- 前記ベクターがさらに多重エンハンサーを有することを特徴とする請求項34から36の任意の1項に記載のベクター。
- 前記転写ユニットが多量体タンパク質の2つの異なったサブユニットをコードすることを特徴とする請求項34から36の任意の1項に記載のベクター。
- 前記転写ユニットの多重コピーが免疫グロブリン軽鎖および重鎖ポリペプチドをコードすることを特徴とする請求項34から36の任意の1項に記載のベクター。
- 前記転写ユニットの多重コピーが少なくとも免疫グロブリン軽鎖および重鎖ポリペプチドの可変領域をコードすることを特徴とする請求項34から36の任意の1項に記載のベクター。
- 前記転写ユニットがBPIタンパク質生成物をコードすることを特徴とする請求項34から36の任意の1項に記載のベクター。
- 前記転写ユニットの多重コピーが正方向反復配向していることを特徴とする請求項34から36の任意の1項に記載のベクター。
- 前記転写ユニットの多重コピーが逆方向反復配向していることを特徴とする請求項34から36の任意の1項に記載のベクター。
- 前記転写ユニットがバイシストロン性またはポリシストロン性のユニットであることを特徴とする請求項34から36の任意の1項に記載のベクター。
- 前記転写ユニットが内部リボソーム侵入部位を有することを特徴とする請求項34から36の任意の1項に記載のベクター。
- 前記転写ユニットの多重コピーが25%から100%の間で同一であることを特徴とする請求項34から36の任意の1項に記載のベクター。
- 前記転写ユニットの多重コピーが25%同一であることを特徴とする請求項34から36の任意の1項に記載のベクター。
- 前記転写ユニットの多重コピーが少なくとも70%、少なくとも80%、または少なくとも90%同一であることを特徴とする請求項34から36の任意の1項に記載のベクター。
- 前記転写ユニットの多重コピーが80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一であることを特徴とする請求項34から36の任意の1項に記載のベクター。
- 前記転写ユニットの多重コピーが100%同一であることを特徴とする請求項34から36の任意の1項に記載のベクター。
- 前記選択マーカー遺伝子がgpt、res、neo、his、DHFR、GS、アデノシンデアミナーゼ(ADA)、チミジンキナーゼ(TK)、アデニンホスフォリボシルトランスフェラーゼ(APRT)、ゼオシン耐性、ハイグロマイシン耐性またはピューロマイシン耐性遺伝子であることを特徴とする請求項34から36の任意の1項に記載のベクター。
- 前記転写ユニットがγBPI21をコードし、hCMVプロモーターおよびマウス免疫グロブリン軽鎖3’非翻訳領域の制御下にあり、前記ベクターがさらにヒト免疫グロブリン重鎖エンハンサーの0、1または2個のコピー、およびgptまたはneo遺伝子のいずれかを有することを特徴とする請求項34から36の任意の1項に記載のベクター。
- 請求項34に記載のクローニングベクター。
- 請求項34に記載の発現ベクター。
- 請求項54に記載の発現ベクターを有することを特徴とする宿主細胞。
- 請求項54に記載の別な発現ベクターを有する宿主細胞であって、該発現ベクターは異なった選択マーカー遺伝子を有することを特徴とする請求項55に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が真核細胞であることを特徴とする請求項55に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が植物、昆虫、哺乳動物または酵母細胞であることを特徴とする請求項55に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞またはCHO−K1細胞であることを特徴とする請求項55に記載の宿主細胞。
- 前記発現ベクターが該宿主細胞染色体に組み込まれることを特徴とする請求項55に記載の宿主細胞。
- 請求項54に記載の発現ベクターを有することを特徴とする安定な細胞株。
- 前記細胞が少なくとも1個、6個以下の前記発現ベクターで形質転換または形質移入されることを特徴とする請求項61に記載の安定な細胞株。
- 請求項61または62に記載のDHFR+CHO−K1細胞株、DHFR−DUKX−B11(DXB11)細胞株またはDG−44細胞株。
- (a)それぞれが選択マーカー遺伝子で区切られた、転写ユニットの多重コピーを有するベクターで形質転換または形質移入された細胞を選択条件下で培養する工程であって、該転写ユニットはポリペプチドをコードしている工程;および
(b)該ポリペプチドを該転写ユニットの多重コピーから発現する工程であって、ここで選択マーカー遺伝子が少なくとも2個の転写ユニットのコピーの間に、[(転写ユニット)x−選択マーカー遺伝子−(転写ユニット)x]として位置する様に該ベクターが直線化され、xが1〜4である工程、
を有し、各転写ユニットがそれ自身のプロモーターと3’非翻訳領域の制御下にあることを特徴とする組み換えポリペプチドの製造法。 - 前記細胞が別なベクターで逐次形質転換または形質移入され、該別なベクターが異なった選択マーカー遺伝子を有することを特徴とする請求項64に記載の方法。
- 前記発現ベクターが制限酵素で直線化され、前記選択マーカー遺伝子が少なくとも2個の前記転写ユニットのコピー間に[(転写ユニット)x−選択マーカー遺伝子−(転写ユニット)x]として位置し、xが1〜4であることを特徴とする請求項64または65に記載の方法。
- 前記プロモーターがSV40、HSV、ウシ成長ホルモン、チミジンキナーゼ、MPSV、マウスβグロビン、ヒトEF1、MSV−LTR、RSV、MMTV−LTR、CMV、MLV、チャイニーズハムスター延長因子、またはマウスアベルソンLTRプロモーターであることを特徴とする請求項64または65に記載の方法。
- 前記発現ベクターがさらに多重エンハンサーを有することを特徴とする請求項64または65に記載の方法。
- 前記転写ユニットが多重体タンパク質の2個の異なったサブユニットをコードすることを特徴とする請求項64または65に記載の方法。
- 前記転写ユニットが免疫グロブリン軽鎖および重鎖ポリペプチドをコードすることを特徴とする請求項64または65に記載の方法。
- 前記転写ユニットが少なくとも免疫グロブリン軽鎖および重鎖ポリペプチド可変領域をコードすることを特徴とする請求項64または65に記載の方法。
- 前記転写ユニットがBPIタンパク質生成物をコードすることを特徴とする請求項64または65に記載の方法。
- 前記転写ユニットの多重コピーが正方向反復配向していることを特徴とする請求項64または65に記載の方法。
- 前記転写ユニットの多重コピーが逆方向反復配向していることを特徴とする請求項64または65に記載の方法。
- 前記転写ユニットがバイシストロン性またはポリシストロン性のユニットであることを特徴とする請求項64または65に記載の方法。
- 前記転写ユニットが内部リボソーム侵入部位を有することを特徴とする請求項64または65に記載の方法。
- 前記転写ユニットの多重コピーが25%〜100%同一であることを特徴とする請求項64または65に記載の方法。
- 前記転写ユニットの多重コピーが25%同一であることを特徴とする請求項64または65に記載の方法。
- 前記転写ユニットの多重コピーが少なくとも70%、少なくとも80%、または少なくとも90%同一であることを特徴とする請求項64または65に記載の方法。
- 前記転写ユニットの多重コピーが80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一であることを特徴とする請求項64または65に記載の方法。
- 前記転写ユニットの多重コピーが100%同一であることを特徴とする請求項64または65に記載の方法。
- 前記選択マーカー遺伝子がgpt、res、neo、his、DHFR、GS、アデノシンデアミナーゼ(ADA)、チミジンキナーゼ(TK)、アデニンホスフォリボシルトランスフェラーゼ(APRT)、ゼオシン耐性、ハイグロマイシン耐性またはピューロマイシン耐性遺伝子であることを特徴とする請求項64または65に記載の方法。
- 前記選択マーカー遺伝子が増幅可能な選択マーカー遺伝子であることを特徴とする請求項64または65に記載の方法。
- 少なくとも1個の前記選択マーカー遺伝子で区切られた少なくとも2個の前記転写ユニットのコピーを有する発現ベクターが、前記細胞染色体中に組み込まれていることを特徴とする請求項64または65に記載の方法。
- 前記細胞が少なくとも1個、6個以下の前記発現ベクターで形質転換または形質移入されていることを特徴とする請求項64または65に記載の方法。
- 前記細胞が真核細胞であることを特徴とする請求項64または65に記載の方法。
- 前記細胞が植物、昆虫、哺乳動物または酵母細胞であることを特徴とする請求項64または65に記載の方法。
- 前記細胞がチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞またはCHO−K1細胞であることを特徴とする請求項64または65に記載の方法。
- 前記細胞がDHFR+CHO−K1細胞株、DHFR−DUKX−B11(DXB11)細胞株またはDG−44細胞株由来であることを特徴とする請求項64または65に記載の方法。
- 前記細胞が付着状態であることを特徴とする請求項64または65に記載の方法。
- 前記細胞が懸濁状態であることを特徴とする請求項64または65に記載の方法。
- 前記ポリペプチドが細胞内区画に蓄積されることを特徴とする請求項64または65に記載の方法。
- 前記ポリペプチドが前記細胞から培養上澄中に分泌されることを特徴とする請求項64または65記載の方法。
- 前記ポリペプチドが単離されることを特徴とする請求項64または65に記載の方法。
- それぞれ選択マーカー遺伝子で分離され、ポリペプチドをコードする転写ユニットの多重コピーを有することを特徴とし、ここで選択マーカー遺伝子が少なくとも2個の転写ユニットのコピーの間に、[(転写ユニット)x−選択マーカー遺伝子−(転写ユニット)x]として位置する様に該ベクターが直線化され、xが1〜4であり、各転写ユニットがそれ自身のプロモーターと3’非翻訳領域の制御下にある、ベクター。
- 前記発現ベクターが制限酵素で直線化され、前記選択マーカー遺伝子が少なくとも2個の前記転写ユニットのコピー間に[(転写ユニット)x−選択マーカー遺伝子−(転写ユニット)x]として位置し、xが1〜4であることを特徴とする請求項95に記載のベクター。
- 前記プロモーターがSV40、HSV、ウシ成長ホルモン、チミジンキナーゼ、MPSV、マウスβグロビン、ヒトEF1、MSV−LTR、RSV、MMTV−LTR、CMV、MLV、チャイニーズハムスター延長因子、またはマウスアベルソンLTRプロモーターであることを特徴とする請求項95に記載のベクター。
- 前記ベクターがさらに多重エンハンサーを有することを特徴とする請求項95〜97の任意の1項に記載のベクター。
- 前記転写ユニットが多量体タンパク質の2つの異なったサブユニットをコードすることを特徴とする請求項95〜97の任意の1項に記載のベクター。
- 前記転写ユニットの多重コピーが免疫グロブリン重鎖および軽鎖ポリペプチドをコードすることを特徴とする請求項95〜97の任意の1項に記載のベクター。
- 前記転写ユニットの多重コピーが少なくとも免疫グロブリン重鎖および軽鎖ポリペプチドの可変領域をコードすることを特徴とする請求項95〜97の任意の1項に記載のベクター。
- 前記転写ユニットがBPIタンパク質生成物をコードすることを特徴とする請求項95〜97の任意の1項に記載のベクター。
- 前記転写ユニットの多重コピーが正方向反復配向していることを特徴とする請求項95〜97の任意の1項に記載のベクター。
- 前記転写ユニットの多重コピーが逆方向反復配向していることを特徴とする請求項95〜97の任意の1項に記載のベクター。
- 前記転写ユニットがバイシストロン性またはポリシストロン性のユニットであることを特徴とする請求項95〜97の任意の1項に記載のベクター。
- 前記転写ユニットが内部リボソーム侵入部位を有することを特徴とする請求項95〜97の任意の1項に記載のベクター。
- 前記転写ユニットの多重コピーが25%〜100%の間で同一であることを特徴とする請求項95〜97の任意の1項に記載のベクター。
- 前記転写ユニットの多重コピーが25%同一であることを特徴とする請求項95〜97の任意の1項に記載のベクター。
- 前記転写ユニットの多重コピーが少なくとも70%、少なくとも80%、または少なくとも90%同一であることを特徴とする請求項95〜97の任意の1項に記載のベクター。
- 前記転写ユニットの多重コピーが80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一であることを特徴とする請求項95〜97の任意の1項に記載のベクター。
- 前記転写ユニットの多重コピーが100%同一であることを特徴とする請求項95〜97の任意の1項に記載のベクター。
- 前記選択マーカー遺伝子がgpt、res、neo、his、DHFR、GS、アデノシンデアミナーゼ(ADA)、チミジンキナーゼ(TK)、アデニンホスフォリボシルトランスフェラーゼ(APRT)、ゼオシン耐性、ハイグロマイシン耐性またはピューロマイシン耐性遺伝子であることを特徴とする請求項95〜97の任意の1項に記載のベクター。
- 前記転写ユニットがγBPI21をコードしhCMVプロモーターおよびマウス免疫グロブリン軽鎖3’非翻訳領域の制御下にあり、前記ベクターがさらにヒト免疫グロブリン重鎖エンハンサーの0、1または2個のコピーと1個のgptまたはneo遺伝子を有することを特徴とする請求項95〜97の任意の1項に記載のベクター。
- 請求項95に記載のクローニングベクター。
- 請求項95に記載の発現ベクター。
- 請求項115に記載の発現ベクターを有する宿主細胞。
- 請求項115に記載の別な発現ベクターを有し、該別な発現ベクターが異なった選択マーカー遺伝子を有することを特徴とする請求項116に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が真核細胞であることを特徴とする請求項116に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が植物、昆虫、哺乳動物または酵母細胞であることを特徴とする請求項116に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞またはCHO−K1細胞であることを特徴とする請求項116に記載の宿主細胞。
- 前記発現ベクターが前記宿主細胞染色体に組み込まれていることを特徴とする請求項116に記載の宿主細胞。
- 請求項115に記載の発現ベクターを有することを特徴とする安定な細胞株。
- 前記細胞が少なくとも1個、6個以下の発現ベクターで形質転換または形質移入されることを特徴とする請求項122に記載の安定な細胞株。
- 請求項122または123に記載のDHFR+CHO−K1細胞株、DHFR−DUKX−B11(DXB11)細胞株またはDG−44細胞株。
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US20070224615A1 (en) * | 2003-07-09 | 2007-09-27 | Invitrogen Corporation | Methods for assaying protein-protein interactions |
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US20060154336A1 (en) * | 2004-12-14 | 2006-07-13 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Nucleic acid molecules for optimized CAB-2 expression and their use |
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RS53006B (en) * | 2009-07-29 | 2014-04-30 | Sigma-Tau Industrie Farmaceutiche Riunite S.P.A. | ADVANCED HUMAN LONG PENTRAXIN 3 EXPRESSION SYSTEM AND ITS APPLICATIONS |
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WO2012077128A1 (en) * | 2010-12-07 | 2012-06-14 | Intas Biopharmaceuticals Limited | A novel cell line development process to produce recombinant proteins using twin vector expression system |
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Family Cites Families (37)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4612282A (en) | 1981-12-15 | 1986-09-16 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Monoclonal antibodies reactive with human breast cancer |
US4880741A (en) | 1983-10-06 | 1989-11-14 | Pfizer Inc. | Process for transformation of Yarrowia lipolytica |
IN163393B (ja) * | 1983-10-06 | 1988-09-17 | Pfizer | |
US5198541A (en) | 1987-08-11 | 1993-03-30 | New York University | Dna encoding bactericidal/permeability-increasing proteins |
US5576184A (en) | 1988-09-06 | 1996-11-19 | Xoma Corporation | Production of chimeric mouse-human antibodies with specificity to human tumor antigens |
GB9115364D0 (en) | 1991-07-16 | 1991-08-28 | Wellcome Found | Antibody |
CA2103887C (en) | 1991-12-13 | 2005-08-30 | Gary M. Studnicka | Methods and materials for preparation of modified antibody variable domains and therapeutic uses thereof |
US5643570A (en) | 1992-05-19 | 1997-07-01 | Xoma Corporation | BPI-immunoglobulin fusion proteins |
WO1993023540A2 (en) | 1992-05-19 | 1993-11-25 | Xoma Corporation | Improved methods for the preparation of endotoxin-binding proteins |
US5420019A (en) | 1993-02-02 | 1995-05-30 | Xoma Corporation | Stable bactericidal/permeability-increasing protein muteins |
WO1994020532A1 (en) | 1993-03-12 | 1994-09-15 | Xoma Corporation | Biologically active peptides from functional domains of bactericidal/permeability-increasing protein and uses thereof |
US5348942A (en) | 1993-03-12 | 1994-09-20 | Xoma Corporation | Therapeutic uses of bactericidal/permeability increasing protein products |
US5652332A (en) | 1993-03-12 | 1997-07-29 | Xoma | Biologically active peptides from functional domains of bactericidal/permeability-increasing protein and uses thereof |
US5733872A (en) | 1993-03-12 | 1998-03-31 | Xoma Corporation | Biologically active peptides from functional domains of bactericidal/permeability-increasing protein and uses thereof |
CN1478543A (zh) | 1993-03-12 | 2004-03-03 | 杀菌/增强通透性蛋白质产物的治疗用途 | |
US5447913A (en) | 1994-03-11 | 1995-09-05 | Xoma Corporation | Therapeutic uses of bactericidal/permeability-increasing protein dimer products |
WO1996008509A1 (en) | 1994-09-15 | 1996-03-21 | Xoma Corporation | Anti-fungal peptides |
US5866402A (en) | 1995-05-05 | 1999-02-02 | Chiron Corporation | Chimeric MCP and DAF proteins with cell surface localizing domain |
CA2227292A1 (en) | 1995-07-20 | 1997-02-06 | Xoma Corporation | Anti-fungal peptides |
US5851802A (en) | 1996-03-22 | 1998-12-22 | Xoma Corporation | Methods for recombinant microbial production of fusion proteins and BPI-derived peptides |
US5998174A (en) * | 1997-05-12 | 1999-12-07 | University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education | Multigene vectors |
US6013631A (en) | 1998-06-19 | 2000-01-11 | Xoma Corporation | Bactericidal/permeability-increasing protein (BPI) deletion analogs |
EP2278022A3 (en) | 1999-11-01 | 2011-05-18 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Expression vectors, transfection systems, and method of use thereof |
US6908751B2 (en) * | 2000-04-26 | 2005-06-21 | Zymogenetics, Inc. | Methods for enhancing the expression of a protein of interest by recombinant host cells |
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US9402401B1 (en) | 2008-11-03 | 2016-08-02 | William P. Benzel | Extruded three loop pretzel having a twist-knot appearance at its middle portion, apparatus and die for making said pretzel, and method of forming said pretzel |
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