CN117343193A - 双特异性抗体及其制备和使用方法 - Google Patents

Abstract

本公开提供了对人CTLA4、PD‑1或PD‑L1中的至少两种具有结合特异性的双特异性抗体。在一个实施方案中，双特异性抗体包括具有重链和轻链的IgG结构域，以及连接到重链的C端或轻链的N端的两个scFv部分，其中IgG结构域对第一抗原具有结合特异性，其中scFv部分对第二抗原具有结合特异性，并且其中第一抗原和第二抗原不同并且独立地选自α‑CTLA4、α‑PD‑1和α‑PD‑L1。

Description

双特异性抗体及其制备和使用方法

本申请是中国发明专利申请(申请号：2018800591309；发明名称：双特异性抗体及其制备和使用方法)的分案申请。

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年11月2日提交的题为“双特异性抗体及其制备和使用方法(BISPECIFIC ANTIBODIES AND METHODS OF MAKING AND USING THEREOF)”的美国临时专利申请第62580845号的权益，其全部内容通过引用明确地并入本文。

技术领域

本公开总体涉及生物治疗技术领域，更具体地涉及制备和使用双特异性抗体。所有参考文献均全文引入本文。

背景技术

癌细胞发展出各种策略来逃避免疫监视。特异性肿瘤抗原的缺乏和主要组织相容性复合物(MHC)分子表达的丧失阻碍了T淋巴细胞对癌细胞的识别。免疫抑制性肿瘤微环境还有助于降低免疫系统对肿瘤细胞的识别。肿瘤微环境是由调节性T细胞、髓系来源的抑制细胞、肿瘤相关巨噬细胞、抑制性B细胞、肿瘤或基质细胞产生的免疫抑制细胞因子(如TGF-β或IL-10)以及调节T细胞功能的免疫检查点分子组成的免疫抑制细胞群来呈现的[Marshall HT等人，Front Oncol 2018，8：315]。

已经证明使用患者自身的免疫系统在保持正常组织完整的同时，在控制肿瘤生长和特异性消除肿瘤细胞方面是有效的。免疫疗法为治疗癌症提供了另一个角度[Khalil DN等人，ADV Cancer Res 2015，128：1-68]。

联合免疫系统的多种调节剂是免疫肿瘤学领域迅速发展的一个新领域。新的治疗药物可以通过多途径调节对肿瘤细胞的免疫应答，可以提高患者的应答率，在某些情况下降低毒性，从而极大地有益于癌症患者。

在癌症治疗中使用一种以上靶向免疫系统的单克隆抗体的联合治疗已显示比使用单一药物治疗更有效[Hellman MD等人，ADVImmunol 2016，130：251-77]。除了提高疗效和应答率外，联合治疗往往比单一药物治疗具有更大的毒性。调节免疫系统的双特异性药物对患者的毒性较小和/或更有效，与包括具有相同特异性的单克隆抗体的组合的治疗相比具有额外的作用机制。

发明内容

本公开涉及双特异性抗体，具体地，含有IgG组份的双特异性抗体因此克服了BiTE分子的快速清除，作为不需要患者免疫细胞离体扩增的现成疗法，具有优于CAR-T细胞疗法的优点。双特异性抗体的另一个优点是通过同时接合两个检查点受体来增强克服抑制性肿瘤微环境的能力。

本公开中的双特异性抗体可以与其它试剂例如T细胞接合器组合，并且进一步增强它们的活性。

本公开涉及双特异性抗体，其结合在免疫和肿瘤细胞上表达的两个不同靶标。两个靶标可以都是检查点抗原。在一个实施方案中，两个靶标可以都是免疫细胞上的检查点抗原。在一个实施方案中，两个靶标可以都是肿瘤细胞上的检查点抗原。在一个实施方案中，一个靶标是免疫细胞上的检查点抗原，另一个靶标是肿瘤细胞上的检查点抗原。在一个实施方案中，检查点抗原可以选自PD-1、PD-L1和CTLA4。在一个实施方案中，靶标可以包括PD-1、PD-L1和CTLA4的任何组合。

本公开还提供双特异性药物的组合物及其用于治疗癌症和自身免疫缺陷的治疗用途。

在一个实施方案中，本申请公开了双特异性抗体，其包括IgG重链和轻链，以及连接到重链的C端或轻链的N端的两个scFv部分(components)，其中IgG对第一抗原具有结合特异性，其中scFv部分对第二抗原具有结合特异性，并且其中第一抗原和第二抗原不同且独立地选自α-CTLA4、α-PD-1和α-PD-L1。

在一个实施方案中，双特异性抗体具有连接到重链C端的两个scFv部分。在一个实施方案中，第一抗原包括α-CTLA4，第二抗原包括α-PD-1或α-PD-L1。在另一个实施方案中，第一抗原包括α-PD-1或α-PD-L1，第二抗原包括α-CTLA4。

在一个实施方案中，双特异性抗体具有连接到轻链N端的两个scFv部分。在一个实施方案中，第一抗原包括α-PD-1或α-PD-L1，第二抗原包括α-CTLA4。在另一个实施方案中，第一抗原包含α-CTLA4，第二抗原包含α-PD-1或α-PD-L1。

在一个实施方案中，双特异性抗体是分离的单克隆抗体。

在一个实施方案中，双特异性抗体包括具有本文公开的序列的抗原肽序列。在一个实施方案中，双特异性抗体可以具有与公开的氨基酸序列具有至少70％、80％、90％、95％、98％或99％相似性的抗原肽序列。

在一个实施方案中，双特异性抗体包括具有本文公开的序列的抗原结合片段。在一个实施方案中，双特异性抗体可以具有与所公开的抗体序列具有至少70％、80％、90％、98％或99％相似性的序列的抗原结合片段。

在一个实施方案中，双特异性抗体可以具有对α-CTLA4、α-PD-1或α-PD-L1的结合亲和力，Kd不大于70nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM或5nM。

在一个实施方案中，双特异性抗体可以具有对α-CTLA4和α-PD-1的结合亲和力，Kd不大于70nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM或5nM。

在一个实施方案中，双特异性抗体可以具有对α-CTLA4和α-PD-L1的结合亲和力，Kd不大于70nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM或5nM。

在一个实施方案中，双特异性抗体可以具有对α-CTLA4、α-PD-1或α-PD-L1中的两种的结合亲和力，Kd不大于70nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM或5nM。

在一个实施方案中，双特异性抗体可以表现出一种或多种选自以下的功能特性：与α-CTLA4、α-PD-1或α-PD-L1的高亲和力结合，抑制PD-L1与PD-1的结合，增强T细胞活化，刺激抗体应答的能力和/或逆转免疫抑制细胞的抑制功能的能力，例如调节性T细胞。

在一个实施方案中，增强T细胞活化包括T细胞增殖、IFN-γ和/或IL-2分泌或其组合。

在一个实施方案中，双特异性抗体包括人源框架区域。

在一个实施方案中，双特异性抗体可以是人源化抗体、嵌合抗体或重组抗体。

在一个实施方案中，双特异性抗体包括IgG1恒定区以延长双特异性分子的循环半衰期。在一个实施方案中，双特异性抗体的IgG1恒定区包括与SEQ ID No.136具有至少98％相似性的氨基酸序列。

在一个实施方案中，本申请公开了分离的双特异性抗体，其选自描述的或具有本文公开的所述特征的那些克隆。

在一个实施方案中，本申请公开了双特异性抗体的IgG1重链，其包括选自本文公开的序列的氨基酸序列。在一个实施方案中，IgG1重链可具有与SEQ ID No.02、06、08、10、12、14、16、18、20、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58、62、72、92、96、100、104、108、112、116、120、124、128或132具有至少70％、80％、90％、98％或99％相似性的氨基酸序列。

在一个实施方案中，本申请公开了双特异性抗体的κ轻链。在一个实施方案中，κ轻链可具有与SEQ ID No.04、28、32、36、40、44、48、52、56、60、和64具有至少70％、80％、90％、98％、或99％相似性的氨基酸序列。

在一个实施方案中，本申请公开了双特异性抗体的可变轻链，其包括本文公开的氨基酸序列。在一个实施方案中，可变轻链可以具有与SEQ ID No.94、98、102、106、110、114、118、122、126、130或134具有至少70％、80％、90％,98％或99％相似性的氨基酸序列。

在一个实施方案中，本申请公开了双特异性抗体的可变重链，其包括本文公开的氨基酸序列。在一个实施方案中，可变重链可具有与SEQ ID No.92、96、100、104、108、112、116、120、124、128或132具有至少70％、80％、90％、98％或99％相似性的氨基酸序列。

在一个实施方案中，本申请公开了编码双特异性抗体的分离的核酸，其包括本文公开的IgG1重链，本文公开的κ轻链，本文公开的可变轻链或本文公开的可变重链。在一个实施方案中，本申请公开了编码双特异性抗体的分离的核酸，其包括IgG1重链，所述IgG1重链具有与SEQ ID No.02、06、08、10、12、14、16、18、20、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58、62、72、92、96、100、104,108、112、116、120、124、128或132具有至少70％、80％、90％、98％或99％相似性的氨基酸序列，κ轻链具有与SEQ ID No.04、28、32、36、40、44、48、52、56、60和64具有至少70％、80％、90％、98％或99％相似性的氨基酸序列，可变轻链具有与SEQ IDNo.94、98、102、106、110、114、118、122、126、130或134具有至少70％、80％、90％、98％或99％相似性的氨基酸序列，可变重链具有与SEQ ID No.92、96、100、104、108、112、116、120、124、128或132具有至少70％、80％、90％、98％或99％相似性的氨基酸序列。

在一个实施方案中，本申请公开了包括本文公开的分离的核酸的表达载体(vector)。在一个实施方案中，表达载体(vector)包括具有与本文公开的核酸序列具有至少70％、80％、90％、98％或99％相似性的序列的分离的核酸。

在一个实施方案中，表达载体(vector)可在细胞中表达。

在一个实施方案中，本申请公开了包括本文公开的核酸的宿主细胞。

在一个实施方案中，本申请公开了包括表达载体(vector)的宿主细胞。

在一些实施方案中，本申请公开了宿主细胞，其中宿主细胞是原核细胞或真核细胞。

在一些实施方案中，本申请公开了产生抗体的方法，包括培养其提供的宿主细胞以产生抗体。

在一些实施方案中，本申请公开了包括双特异性抗体和细胞毒类药物(cytotoxicagent)的免疫偶联物。在一些实施方案中，细胞毒类药物是化疗药物、生长抑制剂、毒素或放射性同位素。

在一个实施方案中，本申请公开了药物组合物，其包括双特异性抗体和药学上可接受的载体(carrier)。在一个实施方案中，本申请公开了药物组合物，其包括免疫偶联物和药学上可接受的载体(carrier)。在一个实施方案中，药物组合物还包括放射性同位素、放射性核素、毒素、治疗剂、化疗药物或其组合。

在一个实施方案中，本申请公开了治疗患有癌症的受试者的方法，包括向受试者施用有效量的本文公开的双特异性抗体。在一个实施方案中，癌症包括乳腺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、头颈癌、黑素瘤、卵巢癌、前列腺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、神经胶质瘤、食管癌、鼻咽癌、肾癌、胃癌、肝癌、膀胱癌、宫颈癌、脑肿瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤。

在一个实施方案中，本申请公开了治疗患有癌症的受试者的方法，其中癌症包括表达PD-L1的细胞。

在一个实施方案中，本申请公开了治疗患有癌症的受试者的方法，进一步包括共同施用有效量的治疗剂。在一些实施方案中，治疗剂包括抗体、化疗药物、酶或其组合。

在一些实施方案中，治疗剂包括卡培他滨、顺铂、曲妥珠单抗、氟维司群、他莫昔芬、来曲唑、依西美坦、阿那曲唑、氨鲁米特、睾内酯、伏氯唑、福美坦、法曲唑、来曲唑、埃罗替尼、阿法替尼(lafatinib)、达沙替尼、吉非替尼、伊马替尼、帕唑替尼(pazopinib)、拉帕替尼、舒尼替尼、尼洛替尼、索拉非尼、nab-紫杉醇(nab-palitaxel)、其衍生物或组合。

在一个实施方案中，本申请公开了治疗患有癌症的受试者的方法，其中受试者是人。

在一个实施方案中，本申请公开了包括有效浓度的本文公开的双特异性抗体的溶液，其中溶液是受试者的血浆。

根据下面的详细描述，本申请的其他实施例对于本领域技术人员将变得显而易见，其中通过示出预期用于执行本申请的最佳模式来描述本申请的实施例。如将认识到的，本申请能够具有其它和不同的实施例，并且其若干细节能够在各种显而易见的方面进行修改，所有这些都不脱离本申请的精神和范围。因此，附图和详细描述将认为是说明性的，而不是限制性的。

附图说明

结合附图，通过下面的描述和所附权利要求，本公开的前述和其它特征将变得更加清楚。应当理解，这些附图仅描述了根据本公开安排的若干实施例，因此不应被认为是对其范围的限制，将通过使用附图以附加的特性和细节来描述本公开，其中：

图1示出了靶向CTLA4、PD-1和PD-L1抗原的示例性双特异性抗体的图；

图2示出了示例性抗PD-1抗体与CHO细胞系表面表达的PD-1抗原的结合；

图3描述了评估代表性双特异性抗体阻断CTLA4和CD80之间相互作用的能力的生化测定的结果；

图4示出了用超抗原SEB刺激PBMC；图4A示出了用PD224D1×CT4 IgG1空白和PL230C6×CT4 IgG1空白的处理；图4B示出了CT4×PD224D1 IgG1空白、CT4×PL221G5IgG1和CT4×PL221G5 IgG1空白的处理；

图5示出了PD-1/PDL-1途径的信号测定的结果；

图6示出了树突细胞混合淋巴细胞反应研究的结果；

图7示出了调节性T细胞抑制测定的结果；图7A示出了CD8+T细胞的增殖；图7B示出了IFNg的产生；

图8示出了CD8 T细胞脱粒对用示例性双特异性抗体处理的应答；

图9示出了MiXeno HCC287小鼠肿瘤模型的结果；

图10示出了示例性双特异性抗体对流感特异性(Flu-specific)CD8+T细胞增殖的影响；

图11示出了PBMC对CEFT肽库的记忆应答的结果；以及

图12示出了示例性双特异性抗体增强重定向T细胞的细胞毒性。

具体实施方式

在以下对本申请的实施例的详细描述中，参考了附图，在附图中，相同的附图标记表示类似的元素，并且在附图中以示例的方式示出了可以实践本申请的具体实施例。充分详细地描述这些实施例以使得本领域的技术人员能够实践该应用。在其它情况下，未详细示出公知的回路、结构和技术，以免混淆对本说明书的理解。因此，下面的详细描述不是限制性的，本申请的范围仅由所附权利要求限定。

本公开涉及特异性结合人CTLA4、PD-1或PD-L1的双特异性抗体。在一些实施方案中，双特异性抗体包括结合CTLA4的第一臂和结合PD-1或PD-L1的第二臂。在一些实施方案中，双特异性抗体包括结合PD-1或PD-L1的第一臂和结合CTLA4的第二臂。包括臂的结构域的实例包括但不限于Fab和scFv结构域。每个臂含有两个抗原结合结构域并通过Fc结构域与另一个臂连接。Fc结构域可以是人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或工程化同种型。

本申请的双特异性抗体(图1)靶向人CTLA4、人PD-1和人PD-L1。这些靶向双特异性抗体各自携带抗CTLA4(SEQ Ids 91、93)和抗人PD-1(SEQ IDs 95、97、131、133)或PD-L1结合结构域(SEQ IDs 99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129)。任一结合结构域被转化为scFv(VH-VL方向)用于放置在C端，或scFv(VL-VH方向)用于放置在N端(分别为图1A和B)。

在一些实施方案中，本文所述的scFv分子含有20个氨基酸的柔性gly-gly-gly-gly-ser(G4S)X4接头，其可操作地连接VH和VL，而与V区方向(LH或HL)无关。双特异性抗体中的其余位置可由人IgG1 Fc或IgG1空白Fc重链、VH-CH1-铰链-CH2-CH3及其相应的κ轻链VL-CL组成。scFv结构域通过10-氨基酸(G4S)×2接头遗传连接到IgG1重链的N端或C端，产生连续的～100kDa重链单体肽。当与合适的轻链共转染时，可以通过人IgG1 Fc(蛋白A)纯化最终的对称双特异性分子并测定以评估功能活性。

预先构建重链和轻链基因“盒”，使得可以使用任一限制性酶切位点克隆V-区(图1A实例：重链的HindIII/NotI和轻链的HindIII/BsiWI)。在一个实施方案中，使用“无限制克隆”NEBuilder(NEB，Ipswich，MA)。

双特异性抗体通过包括设计完整分子、合成和克隆每个结构域的核苷酸序列、在哺乳动物细胞中表达和纯化终产物的方法产生。使用Geneous 10.2.3软件包(Biomaterials，奥克兰，新西兰)组装核苷酸序列，并将其分解成其用于基因合成的组成结构域(Genewiz，南普莱恩菲尔德(South Plainfield)，新泽西州)。在一个实施例中(图1A)，CT4×PD224D1IgG1空白的双特异性抗体的重链(SEQ ID 2)由与人IgG1空白的Fc结构域(铰链，CH1和CH2)融合的抗CTLA4 VH结构域，随后与抗PD-1scFV结构域(克隆PD224D1)融合的10-氨基酸(G4S)x 2接头组成。使用基于NEBuilder Web的工具，将5'和3'核苷酸附加到每个结构域上，使得每个结构域与其侧翼结构域重叠20-30个核苷酸，这指导位点特异性重组，从而在单个基因组装步骤中遗传融合每个结构域。

CT4×PD224D1 IgG1空白的轻链由与人Cκ结构域融合的抗CTLA4 VL结构域组成。合成的基因片段用限制性酶HindIII和BsiWI酶切，然后与人Cκ结构域框内连接。对于这两种构建体，将小等分试样转化到大肠杆菌(E.coli)DH10b(Invitrogen，卡尔斯巴德(Carlsbad)，加利福尼亚州)中，并铺在TB+羧苄青霉素100μg/ml板(Teknova，霍利斯特(Hollister)，加利福尼亚州)上，在37℃孵育过夜。选择所得菌落并将2ml过夜培养物接种于TB+羧苄青霉素中。从过夜培养物中制备DNA(Thermo-Fisher，卡尔斯巴德(Carlsbad)，加利福尼亚州)，随后使用针对每个结构域侧翼序列的测序引物(Sigma，圣路易斯(St.Louis)，密苏里州(MO))对DNA进行测序(Genewiz，南普莱恩菲尔德(SouthPlainfield)，新泽西州)。所有DNA序列在Geneous中组装和分析。

实施例

实施例1：抗PD-L1抗体与PD-L1抗原的结合

在Fortebio Octet RED96仪器上通过表面等离子体共振(Surface PlasmonResonance)评价抗PD-L1抗体对PD-L1重组蛋白的结合亲和力和动力学。抗原固定在传感器芯片表面上，测试的抗体流过固定的抗原。所有分子显示出与抗原的强结合，例如如表1所示。

表1.抗PD-L1抗体与PD-L1抗原的结合

实施例2：抗PD-1抗体与PD-1抗原的结合

用流式细胞仪(FACS)法检测双特异性抗体及其部分与表达于CHO细胞表面的PD-1抗原的结合情况。将双特异性抗体与表达PD-1抗原的CHO细胞系孵育，然后用直接缀合Alexa Fluor 647荧光染料的第二抗人抗体检测。在流式细胞仪BD LSRFortessa上分析测试抗体的细胞结合。所有测试的抗体以个位数纳摩尔范围的KD与抗原结合(图2)。

实施例3：阻断CTLA4和CD80之间的相互作用

在生化相互作用测定(Cisbio)中测试双特异性抗体阻断CTLA4与其配体CD80之间相互作用的能力。简言之，将双特异性抗体与CTLA4和CD80蛋白孵育。然后向混合物中加入识别CTLA4和CD80蛋白并用HTRF供体/受体荧光对标记的检测抗体。CTLA4和CD80之间的相互作用通过FRET效率评估。所有测试的双特异性抗体都能够阻断CTLA4和CD80之间的相互作用(图3)。

实施例4：超抗原SEB刺激PBMC

评价双特异性抗体增强用超抗原SEB刺激后人外周血单核细胞(PBMC)释放细胞因子的能力。如图4A和图4B所示，所有双特异性分子在用SEB刺激后能够显著增强PBMC产生IL-2。

实施例5：PD-1/PD-L1通路信号传导

测试双特异性抗体阻断PD-1/PD-L1通路的能力。简言之，将测试分子与表达PD-1受体和荧光素酶NFAT报告基因的Jurkat报告基因细胞系和CHO-PD-L1细胞系(Promega)孵育。通过NFAT信号传导的增加评估测试抗体阻断通过PD-1/PD-L1通路的信号传导的能力。依次通过荧光素酶报告基因的活性监测NFAT信号传导。在平板读数器(Clariostar，BMG)上读取测定。所有测试的双特异性抗体和单克隆抗体对照都能够阻断PD-1/PD-L1信号传导(图5)。

实施例6：树突细胞混合白细胞反应

测试双特异性抗体增强树突细胞混合白细胞反应(MLR)的能力。将测试分子与来自一个供体的树突细胞和分离自另一个供体的T细胞孵育6天。树突细胞在GM-CSF和IL-4存在下从单核细胞体外分化。用干细胞分离试剂盒从PBMC中分离单核细胞和T细胞群。通过分泌的IFNγ评价测试分子增强MLR的能力。所有测试的双特异性抗体都能够增加IFNγ的产生，如图6所示。

实施例7：调节性T细胞对CD8 T细胞的抑制

测试双特异性抗体阻断调节性T细胞对效应CD8 T细胞增殖和细胞因子产生的抑制作用的能力。用干细胞分离试剂盒分离CD8 T细胞并用CellTrace染料(ThermoFisher)标记。如先前MLR研究中所述制备树突细胞。用干细胞分离试剂盒从PBMC中分离调节性T细胞并体外扩增。双特异性抗体与效应CD8 T细胞、树突细胞和调节性T细胞孵育4天。双特异性抗体在调节性T细胞存在下挽救效应CD8 T细胞功能的能力通过效应CD8 T细胞(图7A)和分泌的IFNγ的增殖来评估(图7B)。

实施例8：CD8 T细胞脱粒

在本研究中评估双特异性分子对细胞毒性CD8 T细胞具有作用的能力。简言之，用干细胞分离试剂盒纯化CD8 T细胞，并在双特异性测试分子存在下用CEFT肽库(JPTPeptide Technologies)刺激。培养基补充有IL-7和IL-21。在第11天，在存在布雷菲德菌素(Brefeldin)和莫能菌素(Monensin)以及直接用荧光染料标记的抗CD107a抗体的情况下用肽再刺激CD8 T细胞。24小时后，CD8 T细胞用直接缀合荧光染料的抗IFNγ抗体染色并在流式细胞仪BD LSRFortessa上检测。如图8所示，所有测试的双特异性抗体都能够增加细胞毒性IFNγ阳性T细胞的数量。

实施例9：Mixeno小鼠肿瘤模型

人源化小鼠模型用于评价这类双特异性抗体抑制体内肿瘤生长的能力。简言之，用人PBMC(每只小鼠5×10⁶个细胞)重建NOG小鼠。在第3天，给动物皮下接种人肺癌细胞系HCC827(0.5E6细胞/动物)，开始用双特异性抗体和对照抗体进行两周一次的处理。每2至3天测量肿瘤体积。监测动物体重。测试的双特异性抗体能够比对照抗体更好地抑制肿瘤生长(图9)。

实施例10：流感特异性T细胞的增殖

在本研究中评估双特异性抗体增加抗原特异性CD8 T细胞增殖的能力。用干细胞分离试剂盒从PBMC中纯化CD8 T细胞，用流感特异性肽(JPT Peptide Technologies)脉冲，并在双特异性抗体存在下孵育14天。培养基补充有IL-7和IL-21。在第15天，细胞用肽特异性MHC dextramers(Immudex)染色，并在流式细胞仪BD LSRFortessa上评估。所有测试的双特异性抗体都能够增加抗原特异性CD8 T细胞的数量(图10)。

实施例11：PBMC对CEFT肽库的记忆应答

评估双特异性抗体增强T细胞记忆应答的能力。简言之，PBMC在CMV、EBV、流感和破伤风特异性肽(JPT Peptide Technologies)存在下孵育4-5天。定量检测分泌的IFNγ的量。如图11所示，相比于对照处理，双特异性CT4×PD224D1能够提高IFNγ的产量数倍。

实施例12：增强重定向T细胞细胞毒性

测试双特异性抗体增强针对肿瘤细胞系靶标的重定向T细胞细胞毒性(RTCC)的能力。肿瘤细胞系稳定表达通过慢病毒转导(Sartorius)递送的核定位红色荧光蛋白(RFP)。肿瘤细胞与PBMC和给定肿瘤细胞系特异性T细胞接合分子共培养。将双特异性抗体加入到共培养物中。通过计数RFP标记的肿瘤细胞核评价肿瘤细胞的裂解。在活细胞成像仪IncuCyte(Sartorius)上获得图像。孵育96小时后评价抗体的活性。在本研究中测试了4个PBMC供体。所有测试的双特异性抗体能够在至少一个测试的PBMC供体中增强RTCC活性(图12)。

虽然已参考特定实施例或实例描述了本发明，但应了解，所述实施例是说明性的且本发明的范围不限于此。本公开的替代实施例对于本公开所属领域的普通技术人员来说是显而易见的。这些替代实施例被认为包括在本公开的范围内。因此，本发明的范围由所附权利要求书限定且由上文描述支持。本公开中引用或提及的所有参考文献在此全文引入作为参考。

序列表

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Claims (26)

1.一种双特异性抗体，其包括具有重链和轻链的IgG结构域，以及连接到所述重链的C端或所述轻链的N端的两个scFv部分，其中所述IgG结构域对第一抗原具有第一结合特异性，其中所述scFv部分对第二抗原具有第二结合特异性，并且其中所述第一抗原和所述第二抗原不同并且独立地选自CTLA4、PD-1和PD-L1。

2.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中，所述第一抗原为CTLA4，所述第二抗原为PD-L1，或所述第一抗原为PD-L1，所述第二抗原为CTLA4。

3.根据权利要求1或2所述的双特异性抗体，其中所述IgG结构域包含如SSYTMH所示的重链可变区CDR1氨基酸序列、如FISYDGNNKYYADSVKG所示的重链可变区CDR2氨基酸序列、如TGWLGPFDY所示的重链可变区CDR3氨基酸序列、如RASQSVGSSYLA所示的轻链可变区CDR1氨基酸序列、如GAFSRAT所示的轻链可变区CDR2氨基酸序列、如QQYGSSPWT所示的轻链可变区CDR3氨基酸序列；且所述scFv部分包含如SGYDMC所示的重链可变区CDR1氨基酸序列、CIAAGSAGITYDANWAKG所示的重链可变区CDR2氨基酸序列、如SAFSFDYAMDL所示的重链可变区CDR3氨基酸序列、如QASQSISSHLN所示的轻链可变区CDR1氨基酸序列、如KASTLAS所示的轻链可变区CDR2氨基酸序列、如QQGYSWGNVDNV所示的轻链可变区CDR3氨基酸序列。

4.根据权利要求3所述的双特异性抗体，其包括分别与SEQ ID No.92、94、120和122所示的重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列具有至少98％相似性的氨基酸序列。

5.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其包括人框架区域。

6.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中，所述抗体是人源化抗体、嵌合抗体或重组抗体。

7.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中，所述IgG结构域包括IgG1恒定区，其中所述IgG1恒定区包括与SEQ ID No.136或SEQ ID No.138具有至少98％相似性的氨基酸序列。

8.一种分离的核酸，其编码根据权利要求1-7任一项所述的双特异性抗体。

9.一种表达载体，其包括根据权利要求8所述的分离的核酸。

10.根据权利要求9所述的表达载体，其中，所述载体可在细胞中表达。

11.一种宿主细胞，其包括根据权利要求8所述的核酸。

12.一种宿主细胞，其包括根据权利要求9所述的表达载体。

13.根据权利要求11或12所述的宿主细胞，其中，所述宿主细胞是原核细胞或真核细胞。

14.一种产生双特异性抗体的方法，其包括培养根据权利要求11至12中的一个所述的宿主细胞，从而产生所述双特异性抗体。

15.一种免疫偶联物，其包括根据权利要求1-7任一项所述的双特异性抗体以及细胞毒类药物。

16.根据权利要求15所述的免疫偶联物，其中，所述细胞毒类药物包括化疗药物、生长抑制剂、毒素或放射性同位素。

17.一种药物组合物，其包括根据权利要求1-7任一项所述的双特异性抗体和药学上可接受的载体。

18.根据权利要求17所述的药物组合物，进一步包括放射性同位素、放射性核素、毒素、治疗剂、化疗药物或其组合。

19.一种药物组合物，其包括根据权利要求15或16所述的免疫偶联物和药学上可接受的载体。

20.权利要求1-7任一项所述的双特异性抗体在制备对患有癌症的受试者进行治疗的药物中的用途。

21.根据权利要求20所述的用途，其中，所述癌症包括表达PD-L1的细胞。

22.根据权利要求20所述的用途，其中，所述癌症包括乳腺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、头颈癌、黑素瘤、卵巢癌、前列腺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、神经胶质瘤、食管癌、鼻咽癌、肾癌、胃癌、肝癌、膀胱癌、宫颈癌、脑肿瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤。

23.根据权利要求20所述的用途，所述治疗进一步包括共同施用有效量的治疗剂。

24.根据权利要求23所述的用途，其中，所述治疗剂包括抗体、化疗药物、酶或其组合。

25.根据权利要求24所述的用途，其中，所述治疗剂包括卡培他滨、顺铂、曲妥珠单抗、氟维司群、他莫昔芬、来曲唑、依西美坦、阿那曲唑、氨鲁米特、睾内酯、伏氯唑、福美坦、法曲唑、来曲唑、埃罗替尼、阿法替尼(lafatinib)、达沙替尼、吉非替尼、伊马替尼、帕唑替尼(pazopinib)、拉帕替尼、舒尼替尼、尼洛替尼、索拉非尼、nab-紫杉醇(nab-palitaxel)、其衍生物或组合。

26.一种溶液，其包括有效浓度的根据权利要求1-7任一项所述的双特异性抗体，其中所述溶液是受试者的血浆。