KR20090114360A - Ｅｐｈｂ３에 대한 길항제 항체 - Google Patents

Ｅｐｈｂ３에 대한 길항제 항체 Download PDF

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Abstract

EphB3-특이적 항체를, 상기 항체를 함유하는 제약 조성물, 상기 제약 조성물을 함유하는 키트, 및 EphB3-관련 질병 또는 질환을 예방 및 치료하는 방법과 함께 제공한다.
EphB3-특이적 항체, EphB3-관련 질병, 제약 조성물, 키트, 치료, 예방

Description

ＥＰＨＢ３에 대한 길항제 항체 {ANTAGONIST ANTIBODIES AGAINST EPHB3}
본 발명은 EphB3-길항제 항체를 투여함으로써 EphB3-관련 질병 또는 질환을 예방 및 치료하는 방법에 관한 것이다.
EphB3은 에프린 수용체 티로신 키나제 부류의 수용체이다. 현재 14개의 Eph 수용체 및 9개의 에프린 리간드가 인간에서 알려져 있다. 에프린 수용체 (Eph) 및 그의 리간드 에프린은 특히 신경계 및 혈관계에서 수많은 발생 과정을 매개한다. 에프린은 또한 종양 발달, 혈관신생, 전이 성장 및 세포 생존에서 소정의 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 그의 구조 및 서열 관계에 기초하여, 에프린은 에프린-A (EFNA) 클래스 (글리코실포스파티딜이노시톨 연결에 의해 막에 앵커링됨) 및 에프린-B (EFNB) 클래스 (막횡단 단백질임)로 나누어진다. Eph 부류의 수용체는 그들의 세포외 도메인 서열의 유사성 및 에프린-A 및 에프린-B 리간드에 대한 결합에 대한 그들의 친화도에 기초하여 2개의 군으로 나누어진다. Eph 수용체는 수용체 티로신 키나제 (RTK) 부류의 최대 하위군을 형성한다.
Eph는 활성화 시에 신호전달에 의해 기능하는 것으로 보인다. 에프린 결합은 Eph 수용체 올리고머화를 유도하여, Eph의 막근접 (juxtamembrane) 잔기의 인산화를 일으킨다. 활성화된 Eph는 신호전달 단백질 (예를 들어 RasGAP, Src, LMW- PTP, PLCg, PI3-키나제, Grb2 및 PDZ 함유 단백질)에 대한 연결 부위로서 작용하는 다수의 인산화된 티로신을 갖는다.
Eph 수용체 (EphA1, EphA2, EphB2)의 과다발현은 수용체 과다-인산화의 부재 하에 형질전환을 일으킨다. 인산화된 EphB 수용체는 Ras-MAP-키나제 경로 및 FAK 신호전달을 음성적으로 조절하여, 세포 성장을 손상시킨다.
EphB3은 다양한 질병 상태에서 소정의 역할을 하는 것으로 관련되었다. 예를 들어, EphB3 발현은 복강 질병에서 보이는 특징적인 과다형성 및 융모위축과 연관된다 (Diasdado et al., Gut, 53(7): 944-951(2004)). EphB3은 또한 뇌졸중 및 신경퇴행성 질병에서 신경보호성인 것으로 제안되었다. 손상 후 EphB3 발현의 상향조절은 또한 축삭 재생에 억제성인 척수 내의 환경에 기여할 수 있다 (Willson et al., Cell Transplant, 12(3):279-90(2003)). EphB3 리간드인 에프린 B2는 눈 혈관신생 질병에서 상향조절되는 것으로 관찰된다 (Ozaki et al., Am. J. Opthalmol., 138(2):270-9(2004)).
따라서, 상기 질병에서 EphB3 및 그의 역할을 조정하는 조성물 및 방법을 확인할 필요가 있다. 본 발명은 상기 및 다른 중요한 필요에 관한 것이다.
<발명의 개요>
EphB3에 대한 뉴클레오티드 서열을 서열 1에 제시하고, 아미노산 서열을 서열 2에 제시한다. 세포외 도메인 (ECD)은 서열 2의 아미노산 1 내지 559로 이루어진다. 별법으로, ECD는 서열 2의 34 내지 555로 이루어진다 (단백질 서열의 NCBI Entrez 데이타베이스에 인간 EphB3에 상응하는 2개의 로커스 번호가 존재함을 주목 한다. 두 경우에, (a) ATG 개시 코돈으로부터 종결 코돈까지의 코딩 구역에 의해 코딩되는 아미노산의 수; (b) 전구체 서열 내의 어느 아미노산 스트레치 (stretch)가 분비 신호 서열 (상기 서열은 성숙 단백질 생성을 위해 성숙 과정 동안 절단될 것임)을 나타내는지의 여부; 및 (c) 잔기의 어느 스트레치가 막횡단 구역을 나타내는지의 여부에 대한 예측이 서열을 기탁한 연구자들에 의해 이루어졌다. 성숙 단백질의 "세포외" 도메인은 신호 서열과 막횡단 도메인 사이에 위치하기 때문에, ECD의 예측된 정도는 신호 및 TM 구역을 어디에 위치시키는지에 따라 결정된다. 두 로커스 기탁물 (NP_004434 및 P54753)은 전구체의 길이가 998개의 아미노산이고, 분비 신호는 잔기 1 - 33에 걸친다고 예측한다. 따라서, 이 둘은 모두 ECD의 출발 잔기가 잔기 34라는데 동의한다. 그러나, TM 구역의 출발에 대해서는 동의하지 않는다: NP_004434는 출발 잔기가 잔기 556이고 (ECD가 아미노산 번호 555에서 끝남), P54753은 잔기 560에서 TM이 출발한다고 예측한다 (ECD가 아미노산 번호 559에서 끝남)). 본원의 실시예에서 설명된 바와 같이, 아미노산 37-558로 이루어진 ECD를 항체 생성을 위한 면역화에 사용하였다.
본 발명의 물질 및 방법은 당업계에서 상기 언급된 필요 및 다른 관련 필요를 충족시킨다. 본 발명은 일반적으로 EphB3 수용체의 활성을 저하시키는 EphB3 길항제 항체, 상기 항체의 제조 방법, 및 EphB3-관련 질병 또는 질환의 치료를 위한 EphB3 길항제 항체의 사용 방법에 관한 것이다.
본 발명의 한 실시태양에서, EphB3의 세포외 도메인에 10-6 M 이하의 친화도 (KD)로 결합하고, EphB3에 대한 결합을 위해 항체 XPA.04.017, XHA.05.172, XHA.05.849, XPA.04.031, 또는 XPA.04.019 중 어느 하나와 75％를 초과하는 수준으로 경쟁하는 길항제 항체를 제공한다. 용어 "10-6 M 이하의 친화도 (KD)"는 예를 들어 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M 또는 10-12 M (즉, 10-6 M보다 작은 값)의 친화도를 의미한다. 다른 실시태양에서, 길항제 항체는 항체 XPA.04.017, XHA.05.172, XHA.05.849, XPA.04.031, 또는 XPA.04.019 중 어느 하나가 결합하는 에피토프와 동일한 EphB3의 에피토프에 결합한다. 또다른 실시태양에서, 항체 XPA.04.017, XHA.05.172, XHA.05.849, XPA.04.031, 또는 XPA.04.019 중 어느 하나의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함하는 길항제 항체가 제공된다. 또다른 실시태양에서, 상기 언급한 항체는 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 조작된 (human engineered) 항체, 인간 항체, 단일쇄 항체 또는 항체 단편이다.
본 발명의 다른 실시태양에서, CDR 내의 적어도 하나의 아미노산이 다른 항-EphB3 항체의 상응하는 CDR의 상응하는 잔기로 치환된 상기 언급한 길항제 항체가 제공된다. 다른 실시태양에서, CDR 내의 1개 또는 2개의 아미노산이 변형된 상기 언급한 길항제 항체가 제공된다. 또다른 실시태양에서, 길항제 항체는 XPA.04.017, XHA.05.172, XHA.05.849, XPA.04.031, 또는 XPA.04.019의 항체에 대해 가변 경쇄 또는 중쇄 구역에 걸쳐 적어도 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99％의 동일성을 보유한다. 또다른 실시태양에서, 길항제 항체는 인간 항체 서열의 불변 구역 및 인간 항체 서열의 하나 이상의 중쇄 및 경쇄 가변 프레임워크 구역을 포함한다. 또다른 실시태양에서, 인간 항체 서열이 개별적인 인간 서열, 인간 컨센서스 서열, 개별적인 인간 생식계열 (germline) 서열, 또는 인간 컨센서스 생식계열 서열인 상기 언급된 길항제 항체가 제공된다.
또다른 실시태양에서, 본 발명은 중쇄 불변 구역이 변형되거나 또는 변형되지 않은 IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, 그의 단편, 또는 그의 조합물인 상기 언급한 길항제 항체를 제공한다. 다른 실시태양에서, 길항제 항체의 EphB3에 대한 결합 친화도는 10-7, 10-8, 10-9, 10-10 또는 10-11 M 이하이다. 또다른 실시태양에서, CDR에 보존적 치환을 포함하는 상기 언급한 길항제 항체가 제공된다. 또다른 실시태양에서, 저위험 및 중간 위험 잔기에 보존적 또는 비-보존적 변화를 포함하는 상기 언급한 길항제 항체가 제공된다. 다른 실시태양에서, 경쇄 불변 구역이 변형되거나 또는 변형되지 않은 람다 경쇄 불변 구역, 카파 경쇄 불변 구역, 그의 단편, 또는 그의 조합물인 상기 언급한 길항제 항체가 제공된다.
EphB3 활성의 억제를 측정하기 위한 시험관내 분석은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 세포 이동 분석 (예를 들어, 혈관신생, 복강 질병에 대한 장관 세포 이동, 뇌졸중에서 염증 세포에 대한 HUVEC 이동 분석) 및 세포 매트릭스 부착 분석 (예를 들어, 라미닌, 피브로넥틴)이 고려된다 ([Miao, H. et al., J. Biol. Chem., 280(2): 923-931 (2005)]; [Wang, Y. et al., Angiogenesis, 7:335-345 (2004)]; [Nakada, M et al., Cancer Res., 66(17):8492-8500 (2006)]; 및 [Gupta, S.K. et al., J. Leuko. Biol. 66(1): 135-143 (1999)]).
다른 추가의 예시적인 실시태양에서, 세포 증식, 예를 들어, 뉴런 세포 증식 및/또는 재생을 향상시키는 상기 언급한 길항제 항체가 제공된다. 다른 예시적인 실시태양에서, 예를 들어 복강 질병에서 장관 세포와, 또는 예를 들어 혈관신생에서 혈관 또는 내피 세포와 연관된 세포 증식을 억제하는 길항제 항체가 유용하다.
수많은 방법이 본 발명에서 고려된다. 본 발명의 한 실시태양에서, EphB3-관련 질병 또는 질환의 치료에 유용한 EphB3 단백질의 세포외 도메인에 대한 길항제 항체를 스크리닝하는 방법을 제공하고, 이 방법은 EphB3의 ECD를 포함하는 폴리펩티드를 항체 XPA.04.017, XHA.05.172, XHA.05.849, XPA.04.031, 또는 XPA.04.019의 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 함유하는 후보 항체와 접촉시키는 단계; 폴리펩티드에 대한 후보 항체의 결합 친화도를 검출하는 단계, 및 적어도 10-6 M의 결합 친화도가 검출될 경우에 후보 항체를 EphB3-관련 질병 또는 질환의 치료에 유용한 길항제 항체로서 확인하는 단계를 포함한다. 또다른 실시태양에서, 항체를 체계적으로 변경시키고 EphB3-관련 질병 또는 질환의 치료에 유용한 EphB3 단백질의 세포외 도메인에 대한 길항제 항체를 스크리닝하는 방법을 제공하고, 이 방법은 항체 XPA.04.017, XHA.05.172, XHA.05.849, XPA.04.031, 또는 XPA.04.019의 CDR 내에 1개 또는 2개의 아미노산에 대한 변형을 함유하는 후보 항체를 제조하는 단계; EphB3의 ECD를 포함하는 폴리펩티드를 후보 항체와 접촉시키는 단계; 폴리펩티드에 대한 후보 항체의 결합 친화도를 검출하는 단계, 및 적어도 10-6 M의 결합 친화도가 검출될 경우에 후보 항체를 EphB3-관련 질병 또는 질환의 치료에 유용한 길항제 항체로서 확인하는 단계를 포함한다.
또다른 실시태양에서, EphB3-관련 질병 또는 질환의 치료에 유용한 EphB3 단백질의 세포외 도메인에 대한 길항제 항체를 스크리닝하는 방법을 제공하고, 이 방법은 장관, 내피 또는 뉴런 세포를 항체 XPA.04.017, XHA.05.172, XHA.05.849, XPA.04.031, 또는 XPA.04.019의 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 함유하는 후보 항체 또는 하나 이상의 CDR 내에 1개 또는 2개의 아미노산의 변형을 함유하는 항체와 접촉시키는 단계; 세포의 증식 또는 생존을 검출하는 단계; 및 세포 증식 또는 생존의 변화가 검출되면 후보 항체를 EphB3-관련 질병 또는 질환의 치료에 유용한 길항제 항체로서 확인하는 단계를 포함한다.
또다른 실시태양에서, 복강 질병 또는 병적 장관 세포 증식와 연관된 다른 질병으로 고통받고 있는 대상을 치료하는 방법이 제공되고, 이 방법은 상기 언급된 항체 중의 하나를 치료상 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다. 또다른 실시태양에서, 신경퇴행성 질병의 치료, 또는 신경 또는 척수에 대한 허혈성 또는 외상성 또는 다른 손상 후에 축삭 또는 다른 신경 재생의 자극을 위한 방법이 제공된다. 예시적인 신경 질병은 외상성 손상, 뇌 또는 국소 혈관성 허혈, 독소, 또는 감염, 예를 들어 바이러스, 세균, 진균 또는 기생충 감염에 의한 뉴런 손상, 및 파킨슨 (Parkinson) 병, 헌팅턴 (Huntington) 병, 알츠하이머 (Alzheimer) 병, 노인성 치매, 아밀로이드 측삭 경화증 (ALS), 다발 경화증 (MS), 말초 신경병증, 척수성 근위축, 크로이츠펠트-야콥 (Creutzfeldt-Jakob) 병, 또는 AIDS 치매를 포함한다. 다른 실시태양에서, 치료상 유효량의 상기 언급된 항체 중의 하나를 투여하는 단계 를 포함하는, 혈관신생 질병 또는 병적 혈관 세포 증식과 연관된 다른 질병의 치료 방법이 제공된다. 예시적인 혈관신생 질병은 눈 질병, 예를 들어 당뇨 망막병증 또는 미숙아 망막병증, 노화-관련 황반 변성, 및 건선, 류마티스 관절염, 죽종 (atheroma), 동맥 재협착, 혈관종, 자가면역 질병, 다른 급성 또는 만성 염증, 흉터 또는 유착 형성과 연관된 혈관신생, 또는 자궁내막증을 포함한다. 또다른 실시태양에서, 제2 치료제가 투여된다. 또다른 실시태양에서, 대상은 다른 치료제 또는 수술로 추가로 치료된다.
본 발명의 또다른 실시태양에서, 방사성 핵종 또는 다른 독소에 컨쥬게이팅된 상기 언급된 길항제 항체의 투여 단계를 포함하는, EphB3을 발현하는 세포를 표적화하는 방법이 제공된다. 또다른 실시태양에서, 대상이 포유동물인 상기 언급된 방법이 제공된다. 또다른 실시태양에서, 대상은 인간이다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 상기 언급한 길항제 항체의 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자가 제공된다. 또다른 실시태양에서, 조절 제어 서열에 작동가능하게 연결된 상기 언급된 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 또다른 실시태양에서, 상기 언급된 벡터 또는 상기 언급된 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 또다른 실시태양에서, 숙주 세포를 적합한 조건 하에 배양하고, 항체를 회수하는 것을 포함하는, 길항제 항체를 생산하기 위해 상기 언급된 숙주 세포를 사용하는 방법을 제공한다. 다른 실시태양에서, 상기 언급된 방법에 의해 생산된 길항제 항체가 제공된다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 적어도 95 중량％의 균일성으로 정제된 상기 언급한 길항제 항체가 제공된다. 또다른 실시태양에서, 상기 언급한 길항제 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물이 제공된다. 또다른 실시태양에서, 치료상 유효량의 본 발명의 항체를 포함하는 상기 언급한 길항제 항체를 포함하는, 용기 내에 포장된 키트가 제공되고, 상기 키트는 임의로 제2 치료제를 함유하고, 용기에 부착되거나 용기와 함께 포장된 라벨을 추가로 포함하고, 라벨은 용기의 내용물을 설명하고, EphB3-관련 질병 또는 질환의 치료를 위한 용기의 내용물의 용도에 대한 지침 및/또는 사용설명서를 제공한다. 다른 실시태양에서, 용기가 바이알 또는 병 또는 사전충전형 (prefilled) 시린지인 상기 언급된 키트가 제공된다.
도 1은 XPA.04.017, XPA.04.031, 및 XPA.04.019 경쇄 및 중쇄에 대한 위험 선 (H=고위험, M=중간 위험, L=저위험), XPA.04.017, XPA.04.031, 및 XPA.04.019 경쇄 및 중쇄 가변 구역 아미노산 서열 (서열 3-8), 및 아미노산 서열 내의 CDR H1, H2 및 H3의 위치를 보여준다.
본 발명은 EphB3-특이적 길항제 항체, 상기 길항제 항체를 함유하는 제약 제제, 길항제 항체 및 제약 제제의 제조 방법, 및 제약 제제 및 화합물로 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 상기 길항제 항체는 리간드 (예를 들어, 에프린 B2, 에프린 B1, 에프린 B3)의 EphB3에 대한 결합을 억제하고, EphB3 이량체화를 억제하고, EphB3 인산화를 억제하고, 리간드-유도 EphB3 수용체 활성화를 억제하고/하거나 EphB3-매개된 세포-세포 부착을 조정할 수 있다. 본원에서 제공되는 길항제 항체의 한 클래스는 EphB3 수용체에 대한 에프린 B2의 결합을 억제하고, 경쟁적 억제제로서 작용할 수 있다. 본원에서 제공되는 길항제 항체의 다른 클래스는 EphB3 수용체에 대한 에프린 B2의 결합을 억제하지 않지만, 수용체 활성화의 척도인 EphB3 인산화 및/또는 이량체화의 수준을 저하시킨다. 이와 유사하게, 본원에서 제공되는 길항제 항체의 또다른 클래스는 에프린 B1 및/또는 에프린 B3의 EphB3 수용체에 대한 결합을 억제하고, 경쟁적 억제제로서 작용할 수 있다. 본원에서 제공되는 길항제 항체의 또다른 클래스는 EphB3 수용체에 대한 에프린 B1 및/또는 에프린 B3의 결합을 억제하지 않지만, EphB3 인산화 및/또는 이량체화의 수준을 저하시킨다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 길항제 항체는 본원에 개시된 에피토프, 또는 그의 일부에 결합한다. 일부 실시태양에서, 수용체에 대한 길항제 항체의 결합은 수용체 인산화를 억제한다. 일부 실시태양에서, 수용체에 대한 길항제 항체의 결합은 EphB3에 대한 리간드의 결합을 억제한다. 일부 실시태양에서, 수용체에 대한 길항제 항체의 결합은 EphB3 이량체화를 억제한다. 일부 실시태양에서, 수용체에 대한 길항제 항체의 결합은 리간드-유도 수용체 활성화를 억제한다. 수용체 활성화 (즉, 신호전달)는 당업계에 공지된 기술에 의해 결정할 수 있다. 예를 들어, 수용체 활성화는 면역침전 및 웨스턴 블롯 분석에 의해 수용체 또는 그의 기질의 인산화 (예를 들어, 티로신 또는 세린/트레오닌)를 검출함으로써 결정할 수 있다. 일부 실시태양에서, 리간드 활성 또는 수용체 활성을 항체의 부재 하에서의 활성에 비해 적어도 95％, 적어도 90％, 적어도 85％, 적어도 80％, 적어도 75％, 적어도 70％, 적어도 60％, 또는 적어도 50％ 억제하는 길항제 항체가 제공된다.
일부 실시태양에서, EphB3 항체는 세포내 어댑터 (adaptor) 단백질에 대한 EphB3 결합을 억제한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "세포내 어댑터 단백질"은 신호전달 복합체의 상이한 세그먼트를 연결하는 단백질을 의미한다. 어댑터는 효소 활성을 보유하거나 보유하지 않을 수 있다. 어댑터 단백질의 예는 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, Grb2는 내재하는 효소 활성을 갖지 않는 어댑터 단백질인 반면에, RasGAP은 효소 활성을 갖는 어댑터 단백질이다.
시험관내 분석에서 높은 친화도 및 효능을 갖는 것으로 측정된 몇몇 바람직한 뮤린 또는 키메라 항체는 스터드닉카 (Studnicka) 등의 인간 조작 (Human Engineering)™ 방법을 기초로 하여 인간에서 보다 덜 면역원성이 되도록 변형된다. 간단히 설명하면, 인간 환경과 관련하여 그의 면역원성을 감소시키면서, 중쇄 및 경쇄 가변 구역의 표면 노출된 아미노산 잔기를 항원 결합 또는 단백질 폴딩에 역효과를 내지 않을 것으로 결정된 위치에서 인간 잔기로 변형시킨다. 변형된 중쇄 및/또는 경쇄 가변 구역을 코딩하는 합성 유전자를 제작하여 인간 감마 중쇄 및/또는 카파 경쇄 불변 구역에 연결시킨다. 임의의 인간 중쇄 및 경쇄 불변 구역을 인간 조작™ 항체 가변 구역과 함께 사용할 수 있다. 인간 중쇄 및 경쇄 유전자를 포유동물 세포 내로 도입하고, 생성된 재조합 면역글로불린 생성물을 얻어 특성화한다.
본 발명에 따른 예시적인 길항제 항체는 XPA.04.017, XHA.05.172, XHA.05.849, XPA.04.031, 또는 XPA.04.019를 포함한다. 다음 항체-분비 하이브리도마가 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 [American Type Culture Collection (ATCC), 미국 20110-2209 버지니아주 매너사스 유니버시티 불러바드 10801]에 부다페스트 조약의 규정에 따라 2006년 11월 17일에 기탁되었다:
하이브리도마 명칭 ATCC 기탁 번호
XHA.05.172
XHA.05.849
본 발명을 보다 완전히 이해하는 데 도움이 되도록 용어의 정의를 아래에서 설명한다.
<일반적인 정의>
본원에서 사용되는 바와 같이, 표적 항원 인간 "EphB3"은 서열 2와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 인간 폴리펩티드 및 그의 자연 발생하는 대립유전자 변이체를 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "EphB3의 ECD"는 서열 2의 아미노산 37 - 558로 제시되는 EphB3의 세포외 부분을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "EphB3-관련 질병 또는 질환"은 복강 질병 또는 병적 장관 세포 증식과 연관된 다른 질병, 혈관신생 질병 또는 병적 혈관 세포 증식과 연관된 다른 질병, 예를 들어, 눈 혈관신생 질병, 예를 들어 당뇨 망막병증 또는 미숙아 망막병증, 또는 노화-관련 황반 변성, 및 건선, 류마티스 관절염, 죽종, 동맥 재협착, 혈관종, 자가면역 질병, 다른 급성 또는 만성 염증, 흉터 또는 유착 형성과 연관된 혈관신생, 또는 자궁내막증; 예를 들어 외상성 손상, 뇌 또는 국소 혈관성 허혈, 독소, 또는 감염, 예를 들어 바이러스, 세균, 진균 또는 기생충 감염에 의한 뉴런 손상; 신경퇴행성 질병, 예를 들어, 파킨슨병, 헌팅턴 병, 알츠하이머 병, 노인성 치매, 아밀로이드 측삭 경화증 (ALS), 다발 경화증 (MS), 말초 신경병증, 척수성 근위축, 크로이츠펠트-야콥 병, 또는 AIDS 치매; 또는 암, 예를 들어, 폐, 난소, 식도, 대장 또는 유방암을 의미한다.
"치료"는 질환의 진전을 막거나 병적 상태를 변경시키려는 의도로 중간에 개입하는 행위를 의미한다. 따라서, "치료"는 치유를 위한 치료 및 예방 또는 방지 수단을 모두 의미한다. 치료를 필요로 하는 대상은 이미 질환이 발생하였거나 발병을 예방하려는 대상 모두를 포함한다. 질병의 임상적, 생화학적, 방사선적 또는 주관적 증상이 있는 환자의 치료는 그와 같은 증상의 일부 또는 전부의 완화 또는 질병의 소인 감소를 포함할 수 있다.
치료를 위한 "포유동물"은 포유동물로서 분류되는 임의의 포유동물, 예를 들어 인간, 가축 및 농장 동물, 및 동물원, 스포츠 또는 애완 동물, 예를 들어 개, 말, 고양이, 소 등을 의미한다. 바람직하게는, 포유동물은 인간이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 구문 "치료상 유효량"은 목적하는 치료 계획으로 투여될 때 질병 증상의 일부 또는 전부를 완화시키거나 또는 발병 소인을 감소시키는 것을 포함하여, 목적하는 치료 또는 예방 효과 또는 반응을 유도하는, 본 발명의 실시태양에 적절한 치료 또는 예방 항체의 양을 의미한다.
항체
용어 "면역특이적" 또는 "특이적으로 결합하는"은 항체가 EphB3 또는 그의 ECD에 약 104 M-1 이상, 바람직하게는 약 105 M-1 이상, 보다 바람직하게는 약 106 M-1 이상의 Ka로 결합하는 것을 의미한다. 항체는 관련 없는 분자에 비해 표적 항원에 대해 실질적으로 더 큰 친화도를 가질 수 있다. 또한, 항체는 동등체 (ortholog) 또는 상동체에 비해 표적 항원에 대해 실질적으로 더 큰 친화도, 예를 들어 표적 항원에 대해 적어도 1.5배, 2배, 5배, 10배, 100배, 103배, 104배, 105배, 106배 이상 큰 상대적인 친화도를 가질 수 있다. 별법으로, 항체가 공지의 상동체 또는 동등체와 교차 반응하는 것이 유용할 수 있다.
발명의 항체는 또한 적어도 10-4 M, 바람직하게는 적어도 약 10-4 M 내지 약 10-12 M, 보다 바람직하게는 적어도 약 10-5 M, 10-6 M, 10-7 M 또는 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 또는 10-11 M의 친화도 (KD)로 특징지을 수 있다. 항체에 대한 적절한 친화도는 치료 용도에 따라 상이할 수 있다. 이러한 친화도는 통상적인 기술, 예를 들어 평형 투석; 제조자가 약술한 일반적인 과정을 사용한 BIAcore 2000 기기의 사용; 방사선 표지된 표적 항원을 사용하는 방사성 면역 분석; 또는 당업자에 알려진 다른 방법으로 쉽게 측정될 수 있다. 친화도 데이터는 예를 들어 문헌 (Scatchard et al., Ann N.Y. Acad. Sci., 51:660 (1949))의 방법에 의해 분석될 수 있다.
"길항제 항체"는 EphB3의 활성화를 억제할 수 있는 항체 분자를 의미한다. 따라서, "길항제" 항-EphB3 항체는 EphB3에 대한 리간드 결합을 억제하여, 인산화 활성, EphB3 올리고머화, EphB3 내재화, 및/또는 EphB3 하류의 신호전달을 억제할 수 있다. 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 완전히 조립된 항체, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 항원에 결합할 수 있는 항체 단편 (예를 들어, Fab', F'(ab)2, Fv, 단일쇄 항체, 디아바디 (diabody)), 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한도 내에서 상기 항체를 포함하는 재조합 펩티드를 포함한다. 항체 단편은 재조합 DNA 기술에 의해 또는 무손상 항체의 효소 또는 화학 절단에 의해 생산할 수 있으며, 아래에서 추가로 설명한다. 모노클로날 항체의 비제한적인 예는 뮤린, 키메라, 인간화, 인간 및 인간 조작된™ 면역글로불린, 항체, 면역글로불린으로부터 유도된 서열을 갖는 키메라 융합 단백질, 또는 그의 뮤테인 또는 유도체를 포함하며, 이들은 각각 아래에서 추가로 설명된다. 화학적으로 유도된 항체를 포함하여, 무손상 분자 및/또는 단편의 다량체 또는 응집체가 또한 고려된다. 임의의 이소형 클래스 또는 서브클래스의 항체도 또한 본 발명에 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된 항체를 말하는데, 즉 이러한 집단을 구성하는 개개의 항체는 소량으로 존재할 수도 있는, 가능한 자연 발생 돌연변이 또는 선택적인 번역후 변형을 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이고, 상이한 결정자 (에피토프)에 대해 작용하는 상이한 항체를 일반적으로 포함하는 통상적인 폴리클로날 항체 제제에 비해, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정자에 대해 작용한다. 그의 특이성에 추가하여, 모노클로날 항체는 상이한 특이성 및 특성을 갖는 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않은 균질한 배양에 의해 합성된다는 점에서 유리하다.
변경 표현 "모노클로날"은 항체의 실질적으로 균질한 집단으로부터 얻은 항체의 특성을 나타내고, 임의의 특정 방법에 의한 항체 제조를 필요로 하는 것으로서 생각하지 않아야 한다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature 256:495 (1975)]에 처음 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조할 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (예를 들어 미국 특허 4,816,567 참조)에 의해 제조할 수 있다. "모노클로날 항체"는 또한 재조합, 키메라, 인간화, 인간, 인간 조작된™, 또는 항체 단편일 수 있다.
"단리된" 항체는 그의 자연 환경의 성분으로부터 확인 및 분리 및 회수된 것이다. 그의 자연 환경의 오염 성분은 항체의 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 항체는 (1) 로우리 (Lowry) 방법에 의해 측정시에 항체의 95 중량％ 초과, 가장 바람직하게는 99 중량％ 초과 수준까지, (2) 스피닝 컵 (spinning cup) 서열분석기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개의 잔기를 얻기에 충분한 수준까지 또는 (3) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 균질할 때까지 정제될 것이다. 단리된 항체는 항체의 자연 환경의 적어도 한 성분도 존재하지 않을 것이기 때문에 재조합 세포 내의 계내 항체를 포함한다. 그러나, 단리된 항체는 하나 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
"면역글로불린" 또는 "천연 항체"는 사량체 당단백질이다. 자연 발생 면역글로불린에서, 각 사량체는 두 개의 동일한 쌍의 폴리펩티드 사슬로 이루어지며, 각 쌍은 하나의 "경쇄"(약 25 kDa) 및 하나의 "중쇄"(약 50 내지 70 kDa)를 갖는다. 각 사슬의 아미노 말단부는 약 100 내지 110개 이상의 아미노산으로 된 "가변" ("V") 구역을 포함하는데, 이는 주로 항원 인식을 담당한다. 각 사슬의 카르복시 말단부는 불변 구역을 구성하며, 이는 주로 효과기 기능을 담당한다. 그들의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 상이한 클래스로 분류될 수 있다. 중쇄는 뮤 (μ), 델타 (δ), 감마 (γ), 알파 (α), 및 엡실론 (ε)으로서 분류되고, 항체의 이소형을 각각 IgM, IgD, IgG, IgA, 및 IgE로서 분류한다. 이들 중 몇몇은 서브클래스 또는 이소형, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 나누어질 수 있다. 상이한 이소형은 상이한 효과기 기능을 갖고; 예를 들어, IgG1 및 IgG3 이소형은 항체 의존적 세포성 세포독성 (ADCC) 활성을 갖는다. 인간 "경쇄"는 카파 (κ) 및 람다 (λ) 경쇄로 분류된다. 경쇄 및 중쇄 내에서, 가변 및 불변 구역은 약 12개 이상의 아미노산의 "J" 구역에 의해 연결되어 있으며, 중쇄는 또한 약 10개 이상의 아미노산의 "D" 구역을 포함한다 (일반적인 사항에 관해서는, 문헌 [Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)] 참고).
항체의 구조 및 생성에 대한 상세한 설명에 대해서는, 그 전문이 본원에 참고로 포함되는 문헌 [Roth, D.B., and Craig, N.L., Cell, 94:411-414 (1998)]을 참조한다. 간단히 설명하면, 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 서열을 코딩하는 DNA를 생산하는 과정은 주로 B 세포 발달시에 일어난다. 각종 면역글로불린 유전자 세그먼트의 재배열 및 결합 이전에, V, D, J 및 불변 (C) 유전자 세그먼트가 일반적으로 단일 염색체 상에서 상대적으로 근접한 위치에서 발견된다. B 세포 분화 중에, V, D, J (또는 경쇄 유전자의 경우 단지 V 및 J) 유전자 세그먼트의 각각의 적절한 부류 구성원 중의 하나가 재조합되어 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자의 기능적으로 재배열된 가변 구역을 형성한다. 이와 같은 유전자 세그먼트 재배열 과정은 연속적인 것으로 보인다. 먼저, 중쇄 D에서 J로의 연결부가 만들어진 후, 중쇄 V에서 DJ로의 연결부 및 경쇄 V에서 J로의 연결부가 만들어진다. V, D 및 J 세그먼트의 재배열에 추가하여, 추가의 다양성은 경쇄 내의 V 및 J 세그먼트가 연결되는 위치 및 중쇄의 D 및 J 세그먼트가 연결되는 위치에서의 다양한 재조합을 통하여 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 일차적 레퍼토리에서 생성된다. 경쇄 내에서의 상기 변화는 일반적으로 V 유전자 세그먼트의 마지막 코돈 및 J 세그먼트의 첫번째 코돈에서 일어난다. 연결에 있어서의 유사한 현상이 중쇄 염색체 상에서 D 및 JH 세그먼트 사이에서 일어나며, 많게는 10개의 뉴클레오티드에 걸쳐 연장될 수 있다. 또한, 게놈 DNA에 의해 코딩되지 않은 수 개의 뉴클레오티드가 D 및 JH 유전자 세그먼트 사이 및 VH 및 D 유전자 세그먼트 사이에 삽입될 수 있다. 이들 뉴클레오티드의 부가는 N-구역 다양성으로 알려져 있다. 가변 구역 유전자 세그먼트 내의 상기 재배열 및 상기 연결시에 일어날 수 있는 다양한 재조합의 순효과는 일차 항체 레퍼토리의 생성이다.
"항체 단편"은 무손상 전장 항체의 일부, 바람직하게는 무손상 항체의 항원 결합 또는 가변 구역을 포함하고, 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다. 항체 단편의 비제한적인 예는 항체가 목적하는 생물학적 활성을 보유하는 한, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 도메인 항체 (dAb), 상보성 결정 구역 (CDR) 단편, 단일쇄 항체 (scFv), 단일쇄 항체 단편, 디아바디, 트리아바디 (triabody), 테트라바디 (tetrabody), 미니바디 (minibody), 선형 항체 (Zapata et al., Protein Eng., 8(10): 1057-1062 (1995)); 킬레이팅 (chelating) 재조합 항체, 트리바디 (tribody) 또는 바이바디 (bibody), 인트라바디 (intrabody), 나노바디 (nanobody), 소형 모듈 면역약제 (small modular immunopharmaceutical (SMIP)), 항원 결합-도메인 면역글로불린 융합 단백질, 낙타화 항체, VHH 함유 항체, 또는 뮤테인 또는 그의 유도체, 및 폴리펩티드에 대한 특이적인 항원 결합을 부여하기에 충분한, 면역글로불린의 적어도 일부, 예를 들어 CDR 서열을 함유하는 폴리펩티드를 포함한다.
항체를 파파인 소화시키면, 각각 단일 항원 결합 부위를 갖는 "Fab" 단편으로 불리는 2개의 동일한 항원 결합 단편, 및 나머지 "Fc" 단편 (상기 명칭은 쉽게 결정화하는 그의 능력을 반영한다)을 생성시킨다. 펩신 처리는 2개의 "Fv" 단편을 갖는 F(ab')2 단편을 생성시킨다. "Fv" 단편은 완전한 항원 인식 및 결합 부위를 포함하는 최소 항체 단편이다. 상기 구역은 강하게 비공유 회합된 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 구성된다. 상기 형태에서, 각 가변 도메인의 3개의 CDR은 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면 상에 항원 결합 부위를 규정한다. 집합적으로, 6개의 CDR이 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)도 항원을 인식하여 결합하는 능력을 갖는다.
"단일쇄 Fv" 또는 "sFv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하고, 상기 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬에 존재한다. 바람직하게는, Fv 폴리펩티드는 Fv가 항원 결합에 요구되는 구조를 형성할 수 있도록 하는, VH 도메인과 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv에 대해서는, 문헌 [Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조한다.
Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 포함한다. Fab 단편은 항체 힌지 구역으로부터 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 수개의 잔기가 부가된다는 점에서 Fab' 단편과 다르다. Fab'-SH는 본원에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리 티올기를 갖는 Fab'에 대한 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 원래 그들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로서 생산되었다.
용어 "초가변 구역"은 항원 결합에 필요한 항체의 아미노산 잔기를 의미한다. 초가변 구역은 일반적으로 "상보성 결정 구역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기 (예를 들어, 경쇄 가변 도메인의 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3) 및 중쇄 가변 도메인의 31-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3) [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)] 및/또는 "초가변 루프"로부터의 잔기 (예를 들어, 경쇄 가변 도메인의 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3) 및 중쇄 가변 도메인의 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3); Chothia et al., J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987))를 포함한다.
"프레임워크" 또는 FR 잔기는 초가변 구역 잔기 이외의 다른 가변 도메인 잔기이다.
구문 "불변 구역"은 효과기 기능를 부여하는 항체 분자의 부분을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 구문 "키메라 항체"는 일반적으로 상이한 종으로부터 유래하는 2개의 상이한 항체로부터 유도된 서열을 함유하는 항체를 의미한다 (예를 들어, 미국 특허 4,816,567 참조). 가장 일반적으로는, 키메라 항체는 인간 및 뮤린 항체 단편, 일반적으로 인간 불변 구역 및 마우스 가변 구역을 포함한다.
용어 "뮤테인"은 그들이 목적하는 결합 친화도 또는 생물학적 활성을 보유하는 한도 내에서 가변 구역 또는 가변 구역과 동등한 부분에서 적어도 하나의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 함유하는 항체의 폴리펩티드 서열을 의미한다. 뮤테인은 모 항체에 실질적으로 상동성이거나 실질적으로 동일할 수 있다.
본 발명의 항체와 관련되어 사용되는 "유도체"는 유비퀴틴화, 치료제 또는 진단제에 대한 컨쥬게이션, 표지화 (예를 들어, 방사성 핵종 또는 각종 효소를 사용한), PEG화 (폴리에틸렌 글리콜을 사용한 유도체화)와 같은 공유 중합체 부착 및 비천연 아미노산의 화학적 합성에 의한 삽입 또는 치환과 같은 기술에 의하여 공유 변형된 항체를 의미한다. 본 발명의 유도체는 본 발명의 비유도체화된 분자의 결합 특성을 보유할 것이다.
본 명세서에서, "항체"는 구체적으로 EphB3의 세포외 부분에 결합하는 능력을 보유하는 다음 성분들 중의 임의의 하나를 포함한다:
1) 모 아미노산 서열에 적어도 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99％ 상동성인 가변 중쇄 아미노산 서열 및/또는 모 아미노산 서열에 적어도 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99％ 상동성인 가변 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 뮤테인을 포함하는 (상동성 결정을 위해 유사한 아미노산을 고려함), 도 1에 제시된 아미노산 서열을 갖는 모 항체의 아미노산 뮤테인;
2) 도 1에 제시된 아미노산 서열을 갖는 모 항체의 하나 이상의 상보성 결정 구역 (CDR)을 포함하는 EphB3-결합 폴리펩티드로서, 바람직하게는 적어도 중쇄의 CDR3, 바람직하게는 두 개 이상, 또는 세 개 이상, 또는 네 개 이상, 또는 다섯 개 이상, 또는 여섯 개 모두의 CDR을 포함하는 폴리펩티드;
3) 문헌 (Studnicka et al., 미국 특허 5,766,886) 및 본원의 실시예 8에 기재된 방법 (저, 중간 및 고 위험 잔기를 확인하기 위해 카바트 (Kabat) 넘버링 사용)에 따라 모 서열을 변경하여 제조한 인간 조작된™ 항체로서, 적어도 하나의 다음 중쇄 및 적어도 하나의 다음 경쇄를 포함하는 항체: (a) 인간 참조 면역글로불린 서열 내의 상응하는 잔기와 다른 저위험 설치류 잔기 모두가 인간 참조 면역글로불린 서열 내의 인간 잔기와 동일하도록 변형된 중쇄, 또는 (b) 모든 저위험 및 중간 위험 설치류 잔기가, 필요에 따라, 인간 참조 면역글로불린 서열 내에 있는 것과 동일한 잔기로 변형된 중쇄, (c) 모든 저위험 잔기가, 필요에 따라, 인간 참조 면역글로불린 서열 내에 있는 것과 동일한 잔기로 변형된 경쇄, 또는 (d) 모든 저위험 및 중간 위험 잔기가, 필요에 따라, 인간 참조 면역글로불린 서열 내에 있는 것과 동일한 잔기로 변형된 경쇄;
4) 상기 단락 (3)에 언급된 항체의 뮤테인으로서, 본래의 설치류 경쇄와 60％ 이상, 바람직하게는 80％ 이상, 보다 바람직하게는 85％ 이상, 보다 바람직하게는 90％ 이상, 가장 바람직하게는 95％ 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 중쇄 또는 경쇄를 포함하는 뮤테인 (예를 들어, 65％, 70％, 75％, 80％, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 및 100％ 동일한 것 포함);
5) 설치류 항체의 하나 이상의 CDR의 고위험 잔기, 및 바람직하게는 두 개 이상, 또는 세 개 이상, 또는 네 개 이상, 또는 다섯 개 이상, 또는 여섯 개 모두의 CDR의 고위험 잔기, 및 임의로 저위험 또는 중간 위험 잔기에서의 하나 이상의 변화를 포함하는 EphB3-결합 폴리펩티드;
예를 들어, 저위험 잔기에서 하나 이상의 변화 및 중간 위험 잔기에서 보존적 치환을 포함하는 폴리펩티드, 또는
예를 들어, 중간 위험 및 고위험 아미노산 잔기를 보유하며, 저위험 잔기에서 하나 이상의 변화를 포함하는 폴리펩티드 (상기 폴리펩티드에서, 변화는 삽입, 결실 또는 치환을 포함하며, 보존적 치환이거나, 조작된 항체가 서열에 있어서 인간 경쇄 또는 중쇄 서열, 인간 생식계열 경쇄 또는 중쇄 서열, 컨센서스 인간 경쇄 또는 중쇄 서열 또는 컨센서스 인간 생식계열 경쇄 또는 중쇄 서열에 근접해지도록 하는 것을 포함한다). 상기 고려되는 변화는 다음과 같은 서열 포맷으로 제시될 수 있다. 가상 서열 AKKLVHTPYSFKEDF에서 (여기서, 문헌 (Studnicka et al., 미국 특허 5,766,886)에 따라 각각의 잔기에 부여된 각각의 위험이 HMLHMLHMLHMLHML (H = 고위험, M = 중간 위험, L = 저위험)일 때, 가상 서열의 저위험 잔기에 대한 예시적인 변화는, 예를 들어, AKXLVXTPXSFXEDX (여기서, X는 임의의 아미노산이거나, 또는 X는 그 위치에서 본래의 잔기의 보존적 치환임)로 표시될 수 있고, 저위험 및 중간 위험 잔기에 대한 예시적인 변화는 유사하게, 예를 들어, AYXLYXTYXSYXEYX (여기서, X는 임의의 아미노산이고, Y는 그 위치에서 본래의 잔기의 보존적 치환임)로 표시될 수 있다.
용어 "경쟁 항체"는 다음을 포함한다:
1) 예를 들어 X-선 결정구조 분석을 통해 측정된 바에 따라, 항체 XPA.04.017, XHA.05.172, XHA.05.849, XPA.04.031, 또는 XPA.04.019가 결합하는 에피토프와 동일한 EphB3의 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체; 및
2) 항체 XPA.04.017, XHA.05.172, XHA.05.849, XPA.04.031, 또는 XPA.04.019와 75％ 초과, 80％ 초과, 또는 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％ 또는 95％를 초과하는 정도로 경쟁하는 모노클로날 항체.
본 발명의 항체는 바람직하게는 EphB3의 ECD에 적어도 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-10 또는 10-11 M 이하의 친화도 KD로 결합하며, 바람직하게는 수용체 인산화, 신호전달, 리간드 결합, EphB3 이량체화, 리간드-유도 수용체 활성화, 및/또는 EphB3-매개 세포-세포 부착을 억제한다.
임의로, 본 출원의 출원일 이전에 공개되거나, 본 출원일 이전에 출원된 출원서에 개시된 임의의 키메라, 인간 또는 인간화 항체는 본 발명의 범주에서 제외된다.
"비-설치류" 모노클로날 항체 항체는, 본원에서 넓은 의미로 규정된 바와 같은, 설치류 하이브리도마에 의해 생산된 완전하게 무손상 상태의 설치류 모노클로날 항체가 아닌 임의의 항체이다. 따라서, 비-설치류 항체는 구체적으로 설치류 항체의 뮤테인, 설치류 항체 단편, 선형 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 조작된™ 항체 및 인간 항체 (트랜스제닉 (transgenic) 동물 또는 파지 디스플레이 기술을 이용하여 생산된 인간 항체 포함)를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 이와 유사하게, 비-뮤린 항체는 뮤린 항체의 뮤테인, 뮤린 항체 단편, 선형 항체, 키메라, 인간화, 인간 조작된™ 및 인간 항체를 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
표적 항원
항체의 생산에 사용되는 표적 항원은, 예를 들어 임의로 에피토프가 그의 천연 입체형태로 제시되도록 다른 폴리펩티드에 융합된, EphB3의 세포외 부분, 또는 목적하는 에피토프를 보유하는 그의 단편일 수 있다. 별법으로, 세포 표면 상에 발현된 무손상 EphB3이 항체 생산에 사용될 수 있다. 그러한 세포는 EphB3을 발현하도록 형질전환되거나, 또는 EphB3를 발현하는 다른 자연 발생 세포일 수 있다. 항체를 생산하는 데 유용한 EphB3 폴리펩티드의 다른 형태는 당업자에게 자명할 것이다.
EphB3의 다양한 도메인은 리간드 결합 도메인 (서열 2의 아미노산 잔기 39-212), TNFR 도메인 (서열 2의 아미노산 잔기 256-331), 제1 피브로넥틴 도메인 (서열 2의 아미노산 잔기 340-435), 및 제2 피브로넥틴 도메인 (서열 2의 아미노산 잔기 453-535)을 포함한다. EphB3의 리간드 결합 도메인의 예시적인 에피토프는 서열 9-143으로 이루어지는 군 중에서 선택된다. EphB3의 TNFR 도메인의 예시적인 에피토프는 서열 159-257로 이루어지는 군 중에서 선택된다. EphB3의 제1 피브로넥틴 도메인의 예시적인 에피토프는 서열 257-299로 이루어지는 군 중에서 선택된다. EphB3의 제2 피브로넥틴 도메인의 예시적인 에피토프는 서열 378-419로 이루어지는 군 중에서 선택된다.
하기 표 1은 항 EphB3 항체에 의한 인식에 적합한 선형 에피토프로서 확인된 EphB3 (서열 2)의 구역을 제공한다.
Figure 112009041043858-PCT00001
Figure 112009041043858-PCT00002
Figure 112009041043858-PCT00003
Figure 112009041043858-PCT00004
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Figure 112009041043858-PCT00006
Figure 112009041043858-PCT00007
Figure 112009041043858-PCT00008
Figure 112009041043858-PCT00009
폴리클로날 항체
폴리클로날 항체는 바람직하게는 관련 항원 및 아주반트 (adjuvant)의 다수회의 피하 (sc) 또는 복강내 (ip) 주사에 의해 동물에서 생성시킬 수 있다. 개선된 항체 반응은 2기능성 물질 또는 유도체화제, 예를 들어, 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통한 컨쥬게이션), N-히드록시숙신이미드 (라이신 잔기를 통한), 글루타르알데히드, 숙신산 무수물 또는 당업계에 공지된 다른 물질을 사용하여, 면역화되는 종에 면역원성인 단백질, 예를 들어 키홀 림펫 (keyhole limpet) 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린 및 대두 트립신 억제제에 관련 항원을 컨쥬게이팅시켜 얻을 수 있다.
동물은 예를 들어 100 ㎍ 또는 5 ㎍의 단백질 또는 컨쥬게이트 (각각 토끼 또는 마우스에 대해)를 3 부피의 프로인트 (Freund) 완전 아주반트와 합한 후, 용액을 다중 부위에 피내 주사함으로써 항원, 면역원성 컨쥬게이트, 또는 유도체에 대해 면역화된다. 1개월 후에, 동물은 프로인트 완전 아주반트 중의 펩티드 또는 컨쥬게이트를 처음 양의 1/5 내지 1/10로 다중 부위에 피하 주사하여 부스터된다. 부스터 주사 7일 내지 14일 후에, 동물에서 채혈하여 혈청의 항체 역가를 분석한다. 동물은 역가 평탄역까지 부스터한다. 바람직하게는, 동물은 상이한 단백질에 및/또는 상이한 가교결합 시약을 통해 컨쥬게이팅된 동일한 항원의 컨쥬게이트로 부스터된다. 컨쥬게이트는 또한 단백질 융합체로서 재조합 세포 배양액으로 제조될 수도 있다. 또한, 면역 반응을 증강시키기 위해 응집제, 예를 들어 명반을 적절하게 사용한다.
모노클로날 항체
모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 처음 기재된 하이브리도마 방법을 사용하여 제조할 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법에 의해 제조할 수 있다.
하이브리도마 방법에서, 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물, 예를 들어 햄스터 또는 짧은 꼬리 원숭이는 면역화를 위해 사용된 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 생성하거나 생성할 수 있는 림프구를 유도하기 위해 상기 설명한 바와 같이 면역화된다. 별법으로, 림프구는 시험관 내에서 면역화될 수 있다. 이어서, 림프구는 하이브리도마 세포를 형성하기 위해 적합한 융합제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 골수종 세포와 융합된다 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)).
이와 같이 제조한 하이브리도마 세포는 바람직하게는 융합되지 않은 모 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유하는 적합한 배지에 접종하여 성장시킨다. 예를 들어, 모 골수종 세포에 효소 히포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT)가 결핍된 경우, 하이브리도마의 배지는 일반적으로 히포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘 (HAT 배지)을 포함할 것이고, 이들 물질은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 억제한다.
바람직한 골수종 세포는 효율적으로 융합하고, 선택된 항체 생산 세포에 의한 항체의 안정적인 높은 수준의 생산을 지지하고, 배지에 민감한 세포이다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주도 인간 모노클로날 항체 생성을 위해 설명된 바 있다 ([Kozbor, J. Immunol, 133:3001 (1984)]; [Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)]). 예시적인 뮤린 골수종 세포주는 MOPC-21 및 M.C.-11 마우스 종양 (솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터 (Salk Institute Cell Distribution Center, 미국 캘리포니아주 샌디에고)) 및 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포 (아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection, 미국 매릴랜드주 록빌))에서 유도된 것이다.
하이브리도마 세포가 성장하는 배지는 항원에 대해 작용하는 모노클로날 항체의 생성에 대해 분석된다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생성되는 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침전 또는 시험관내 결합 분석, 예를 들어 방사성 면역 분석 (RIA) 또는 효소-결합 면역흡착 분석 (ELISA)에 의해 결정될 수 있다. 모노클로날 항체의 결합 친화도는 예를 들어 스캐챠드 (Scatchard) 분석에 의해 결정될 수 있다 (Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)).
목적하는 특이성, 친화도 및/또는 활성의 항체를 생성하는 하이브리도마 세포가 확인된 후에, 클론은 제한 희석 과정에 의해 서브클로닝하고 표준 방법 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986))으로 성장시킬 수 있다. 상기 목적에 적합한 배지는 예를 들어 D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수 종양으로서 생체 내에서 성장시킬 수 있다. 서브클론에서 분비되는 모노클로날 항체는 통상적인 면역글로불린 정제 과정, 예를 들어 단백질 A-세파로스, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화도 크로마토그래피에 의해 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 적합하게 분리된다.
모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 쉽게 단리되고, 통상적인 절차를 사용하여 (예를 들어 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 서열을 결정할 수 있다. 서열 결정은 일반적으로 관심있는 유전자 또는 cDNA의 적어도 일부를 단리할 것을 필요로 할 것이다. 보통 이 과정은 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA, 또는 바람직하게는 mRNA (즉, cDNA)를 클로닝하는 것을 필요로 한다. 클로닝은 표준 기술을 사용하여 수행된다 (예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Guide, Vols 1-3, Cold Spring Harbor Press] 참조). 예를 들어, cDNA 라이브러리는 폴리A+ mRNA, 바람직하게는 막-결합 mRNA의 역전사에 의해 제조되며, 인간 면역글로불린 폴리펩티드 유전자 서열에 특이적인 프로브를 사용하여 라이브러리를 스크리닝한다. 그러나, 바람직한 실시태양에서, 관심있는 면역글로불린 유전자 세그먼트 (예를 들어, 경쇄 가변 세그먼트)를 코딩하는 cDNA (또는 전장 cDNA의 일부)를 증폭시키기 위해 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 사용한다. 증폭된 서열은 임의의 적절한 벡터, 예를 들어, 발현 벡터, 미니유전자 (minigene) 벡터 또는 파지 디스플레이 벡터 내로 쉽게 클로닝될 수 있다. 관심 있는 면역글로불린 폴리펩티드의 일부의 서열을 결정할 수 있는 한, 어떤 클로닝 방법을 사용하였는지는 중요하지 않다는 것이 자명할 것이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "단리된" 핵산 분자 또는 "단리된" 핵산 서열은 (1) 핵산의 자연 공급원에서 그와 통상적으로 회합되는 적어도 하나의 오염 핵산 분자로부터 확인 및 분리되거나 또는 (2) 관심있는 핵산의 서열이 결정될 수 있도록 배경 핵산으로부터 클로닝, 증폭, 태깅 또는 다른 방식으로 구별되는 핵산 분자를 의미한다. 단리된 핵산 분자는 자연에서 발견되는 형태 또는 환경과 다른 것이다. 따라서, 단리된 핵산 분자는 자연 세포에 존재하는 핵산 분자와 구분된다. 그러나, 단리된 핵산 분자는 예를 들어 핵산 분자가 자연 세포와 상이한 염색체 위치에 존재하는 경우에, 항체를 통상적으로 발현하는 세포에 함유된 핵산 분자를 포함한다.
클로닝 및 서열 결정에 사용되는 RNA의 하나의 공급원은 트랜스제닉 마우스로부터 B 세포를 얻고 이를 불멸 세포에 융합시켜 얻은 하이브리도마이다. 하이브리도마를 사용하는 것의 잇점은 이들이 쉽게 스크리닝되어 관심있는 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마가 선택된다는 점이다. 별법으로, RNA를 면역화된 동물의 B 세포 (또는 비장 전체)로부터 단리할 수 있다. 하이브리도마가 아닌 다른 공급원을 사용하는 경우, 특이적 결합 특성을 갖는 면역글로불린 또는 면역글로불린 폴리펩티드를 코딩하는 서열에 대해 스크리닝하는 것이 바람직할 수있다. 그러한 스크리닝 방법 중의 하나는 파지 디스플레이 기술을 사용하는 것이다. 파지 디스플레이 기술은 예를 들어 그 전문이 각각 본원에 참조로 포함되는 WO 91/17271 (Dower et al.), WO 92/01047 (McCafferty et al.), 및 문헌 [Caton and Koprowski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6450-6454 (1990)]에 기재되어 있다. 파지 디스플레이 기술을 사용하는 하나의 실시태양에서, 면역화된 트랜스제닉 마우스로부터 cDNA (예를 들어, 총 비장 cDNA)를 단리하고, 폴리머라제 연쇄 반응을 사용하여 면역글로불린 폴리펩티드의 일부, 예를 들어, CDR 구역을 코딩하는 cDNA 서열을 증폭시키고, 증폭된 서열을 파지 벡터 내로 삽입한다. 관심있는 펩티드, 예를 들어, 요구되는 결합 특성을 갖는 가변 구역 펩티드를 코딩하는 cDNA는 패닝 (panning)과 같은 표준 기술로 확인한다.
이어서, 증폭 또는 클로닝된 핵산의 서열을 결정한다. 일반적으로, 면역글로불린 폴리펩티드의 전체 가변 구역을 코딩하는 서열을 결정하지만, 때로는 단지 가변 구역의 일부, 예를 들어, CDR 코딩 부분만을 서열 결정하는 것으로 적절한 경우가 있다. 일반적으로, 서열 결정되는 부분은 30개 염기 이상의 길이이며, 보다 일반적으로는 가변 구역 길이의 약 3분의 1 이상 또는 약 2분의 1 이상을 코딩하는 염기가 서열 결정될 것이다.
서열 결정은 cDNA 라이브러리로부터 단리된 클론에 대하여, 또는 PCR이 사용된 경우 증폭된 서열을 서브클로닝한 후에, 또는 증폭된 세그먼트의 직접적인 PCR 서열에 의해 수행할 수 있다. 서열 결정은 표준 기술을 사용하여 수행할 수 있다 (예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Guide, Vols 1-3, Cold Spring Harbor Press, 및 [Sanger, F. et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467] 참조). 클로닝된 핵산의 서열과 공개된 인간 면역글로불린 유전자 및 cDNA의 서열을 비교하여, 당업자는 서열 결정된 구역에 따라, (i) 하이브리도마 면역글로불린 폴리펩티드 (중쇄의 이소형 포함)의 생식계열 세그먼트 이용, 및 (ii) 중쇄 및 경쇄 가변 구역의 서열 (N-구역 부가 및 체세포 돌연변이 과정에 기인한 서열 포함)을 쉽게 결정할 수 있다. 면역글로불린 유전자 서열 정보 공급처 중의 하나는 내셔날 센터 포 바이오테크놀로지 인포메이션, 내셔널 라이브러리 오브 메디신, 내셔날 인스티튜트 오브 헬쓰 (National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, National Institutes of Health, 미국 메릴랜드주 베데스다)이다.
항체 단편
상기한 바와 같이, 항체 단편은 무손상 전장 항체의 일부, 바람직하게는 무손상 항체의 항원 결합 또는 가변 구역을 포함하고, 선형 항체 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다. 항체 단편의 비제한적인 예는 목적하는 생물학적 활성을 보유하는 한, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fd, 도메인 항체 (dAb), 상보성 결정 구역 (CDR) 단편, 단일쇄 항체 (scFv), 단일쇄 항체 단편, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 미니바디, 선형 항체, 킬레이팅 재조합 항체, 트리바디 또는 바이바디, 인트라바디, 나노바디, 소형 모듈 면역약제 (SMIP), 항원 결합-도메인 면역글로불린 융합 단백질, 낙타화 항체, VHH 함유 항체, 또는 뮤테인 또는 그의 유도체, 및 폴리펩티드에 대한 특이적인 항원 결합을 부여하기에 충분한, 면역글로불린의 적어도 일부, 예를 들어 CDR 서열을 함유하는 폴리펩티드를 포함한다. 상기 항원 단편은 전체 항체의 변형에 의해 생성되거나 또는 재조합 DNA 기술 또는 펩티드 합성을 사용하여 드 노보 (de novo)로 합성될 수 있다.
용어 "디아바디"는 2개의 항원 결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 나타내고, 상기 단편은 동일한 폴리펩티드 사슬 (VH-VL) 내의 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 동일한 사슬 상에서 2개의 도메인 사이의 페어링을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인은 다른 사슬의 상보성 도메인과 페어링하여 2개의 항원 결합 부위를 생성하게 된다. 디아바디는 예를 들어 EP 404,097; WO93/11161; 및 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)]에 상세히 기재되어 있다.
"단일쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하고, 여기서 상기 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬에 존재하고, 임의로 Fv가 항원 결합에 요구되는 구조를 형성하도록 하는 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다 ([Bird et al., Science 242:423-426, 1988], 및 [Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883, 1988]). Fd 단편은 VH 및 CH1 도메인으로 구성된다.
추가의 항체 단편은 VH 도메인으로 이루어지는 도메인 항체 (dAb) 단편을 포함한다 (Ward et al., Nature 341:544-546, 1989).
"선형 항체"는 한 쌍의 항원 결합 구역의 쌍을 형성하는 한 쌍의 일렬 (tandem) Fd 세그먼트 (VH-CH1-VH-CH1)의 쌍을 포함한다. 선형 항체는 이중특이성 또는 단일특이성일 수 있다 (Zapata et al. Protein Eng. 8:1057-62 (1995)).
펩티드 링커를 통해 (힌지가 없는) 또는 IgG 힌지를 통해 CH3에 융합된 scFv로 이루어진 "미니바디"가 문헌에 개시되어 있다 (Olafsen, et al., Protein Eng Des Sel. 2004 Apr;17(4):315-23).
경쇄가 없는 기능적 중쇄 항체가 대서양 수염상어 (nurse shark) (Greenberg et al., Nature 374:168-73, 1995), 워베공 상어 (wobbegong shark) (Nuttall et al., Mol Immunol. 38:313-26, 2001) 및 낙타, 단봉낙타, 알파카 및 라마와 같은 낙타과 (Camelidae) ([Hamers-Casterman et al., Nature 363: 446-8, 1993]; [Nguyen et al., J. Mol. Biol. 275: 413, 1998])에 천연적으로 존재한다. 이들 동물에서 항원 결합 부위는 단일 도메인인 VHH 도메인으로 축소된다. 이들 항체는 단지 중쇄 가변 구역을 사용하여 항원 결합 영역을 형성한다. 즉, 이들 기능적 항체는 단지 구조 H2L2 ("중쇄 항체" 또는 "HCAb"로 지칭)를 갖는 중쇄의 동종이량체 (homodimer)이다. 낙타화 (camelized) VHH는 보고에 따르면 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 함유하나 CH1 도메인이 결여된 IgG2 및 IgG3 불변 구역과 재조합된다 (Hamers-Casterman et al., 상기 문헌). 예를 들어, 라마 IgG1은 VH가 힌지, CH1, CH2 및 CH3 도메인을 함유하는 불변 구역과 재조합된 통상적인 (H2L2) 항체 이소형인 반면, 라마 IgG2 및 IgG3는 CH1 도메인이 결여되어 있고 경쇄가 하나도 없는 중쇄로만 된 이소형이다. 전통적인 VH-단독 단편은 가용성 형태로 생산하기 어렵지만, 프레임워크 잔기를 보다 VHH와 유사하게 변화시킬 때 용해도 및 특이적 결합의 개선을 가져올 수 있다 (예를 들어, [Reichman, et al., J Immunol Methods 1999, 231:25-38]). 낙타화 VHH 도메인은 항원에 높은 친화도로 결합하는 것으로 나타났으며 (Desmyter et al., J. Biol. Chem. 276:26285-90, 2001), 용액 중 안정성이 높다 (Ewert et al., Biochemistry 41:3628-36, 2002). 낙타화 중쇄를 갖는 항체 생산 방법은 예를 들어 미국 특허 공개 20050136049 및 20050037421에 기재되어 있다.
중쇄 항체의 가변 도메인은 분자량이 단지 15 kDa에 이르는 가장 작은 완전 기능적 항원 결합 단편이므로 나노바디로 불리운다 (Cortez-Retamozo et al., Cancer Research 64:2853-57, 2004). 나노바디 라이브러리는 문헌 (Conrath et al., Antimicrob Agents Chemother 45: 2807-12, 2001)에 기재된 바와 같이 면역화된 단봉낙타로부터 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 재조합 방법으로 생산될 수 있다.
인트라바디는 세포내 발현을 나타내고 세포내 단백질 기능을 조절할 수 있는 단일쇄 항체이다 ([Biocca, et al., EMBO J. 9:101-108, 1990]; [Colby et al., Proc Natl Acad Sci USA. 101:17616-21, 2004]). 세포내 구역에서 항체 구조를 보유하는 세포 신호 서열을 포함하는 인트라바디는 문헌에 기재된 바와 같이 생산될 수 있다 ([Mhashilkar et al., EMBO J 14:1542-51, 1995]; 및 [Wheeler et al., FASEB J. 17:1733-5. 2003]). 트랜스바디는 단백질 전달 도메인 (PTD)이 단일쇄 가변 단편 (scFv) 항체와 융합되어 있는 세포 투과성 항체이다 (Heng et al., Med Hypotheses. 64:1105-8, 2005).
또다른 항체는 SMIP 또는 표적 단백질에 특이적인 결합 도메인 면역글로불린 융합 단백질이다. 이들 구성체는 항체 효과기 기능을 수행하는 데 필요한 면역글로불린 도메인에 융합된 항원 결합 도메인을 포함하는 단일쇄 폴리펩티드이다 (예를 들어, WO 03/041600, 미국 특허 공개 20030133939 및 20030118592 참조).
다가 항체
일부 실시태양에서, 다가 또는 심지어는 다중특이적 (예를 들어, 이중특이적, 삼중 특이적 등) 모노클로날 항체를 생산하는 것이 바람직할 수 있다. 상기 항체는 표적 항원의 적어도 두 개의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 가질 수 있거나, 별법으로는, 두 개의 상이한 분자, 예를 들어, 표적 항원 및 세포 표면 단백질 또는 수용체에 결합할 수 있다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 표적에 결합하는 암 (arm), 및 세포 방어 메카니즘을 표적 발현 세포에 집중시키도록 T 세포 수용체 분자 (예를 들어, CD2 또는 CD3), 또는 IgG에 대한 Fc 수용체 (FcγR), 예를 들어 FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16)와 같은 백혈구 상의 촉발 분자에 결합하는 다른 암을 포함할 수 있다. 또다른 예로서, 이중특이적 항체는 세포독성제를 표적 항원을 발현하는 세포에 편재시키는데 사용될 수 있다. 이들 항체는 표적-결합 암 및 세포독성제 (예를 들어, 사포린, 항-인터페론-60, 빈카 알칼로이드, 리신 A 사슬, 메토트렉세이트 또는 방사성 동위원소 합텐)에 결합하는 암을 갖는다. 다중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로서 제조될 수 있다.
이중특이적 항체는 가교결합된 또는 "이종컨쥬게이트" 항체를 포함한다. 예를 들어, 이종컨쥬게이트 내의 항체 중 하나는 아비딘에 커플링되고, 다른 하나는 비오틴에 커플링될 수 있다. 이종컨쥬게이트 항체는 임의의 편리한 가교결합 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 적합한 가교결합제는 당업계에 잘 알려져 있고, 많은 가교결합 기술과 함께 미국 특허 4,676,980에 개시되어 있다.
다른 이중특이적 항체의 제조 방법에 따르면, 한쌍의 항체 분자들 사이의 계면은 재조합 세포 배양액으로부터 회수되는 이종이량체의 비율을 최대화하도록 처리될 수 있다. 바람직한 계면은 항체 불변 도메인의 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 상기 방법에서, 제1 항체 분자의 계면으로부터 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄가 보다 큰 측쇄 (예, 티로신 또는 트립토판)으로 교체된다. 큰 아미노산 측쇄를 보다 작은 것 (예, 알라닌 또는 트레오닌)으로 교체함으로써 큰 측쇄(들)에 동일하거나 유사한 크기의 보상적 "캐비티 (cavity)"가 제2 항체 분자의 계면 상에 생성된다. 이는 다른 원치 않는 최종 생성물, 예를 들어 동종이량체에 비해 이종이량체의 수율을 증가시키기 위한 메카니즘을 제공한다 (1996년 9월 6일 공개된 WO96/27011 참조).
항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성하기 위한 기술도 문헌에서 설명되었다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 화학적 연결을 이용하여 제조될 수 있다. 문헌 [Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)]에서는 무손상 항체가 단백질 분해 방식으로 절단되어 F(ab')2 단편을 생성하는 절차를 기술하고 있다. 이들 단편은 인접 디티올을 안정화시키고 분자간 디술피드 형성을 방지하기 위해 디티올 착화제인 아비소산나트륨의 존재 하에 환원된다. 이어서 생성된 Fab' 단편은 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환된다. 이어서 Fab'-TNB 유도체 중 하나는 머캅토에틸아민으로 환원시켜 Fab'-티올로 재전환되고, 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합되어 이중특이적 항체를 형성한다. 생산된 이중특이적 항체는 효소의 선택적 고정화를 위한 물질로서 사용될 수 있다. 문헌 [Better et al., Science 240: 1041-1043 (1988)]은 세균으로부터 기능성 항체 단편의 분비를 개시하고 있다 (예를 들어, [Better et al., Skerra et al. Science 240: 1038-1041 (1988)] 참조). 예를 들어, Fab'-SH 단편은 이. 콜라이 (E. coli)로부터 직접 회수될 수 있고, 이중특이적 항체를 형성하도록 화학적으로 커플링될 수 있다 ([Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]; [Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992)]).
문헌 [Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)]에서는 완전 인간화 이중특이적 항체 F(ab')2 분자의 생산을 기술하고 있다. 각각의 Fab' 단편은 이. 콜라이로부터 개별적으로 분비되었고, 이중특이적 항체를 형성하도록 시험관 내에서 유도 화학 커플링 반응에 적용되었다. 이렇게 형성된 이중특이적 항체는 HER2 수용체를 과다발현하는 세포 및 정상 인간 T 세포에 결합할 뿐만 아니라 인간 유방 종양 표적에 대한 인간 세포독성 림프구의 용해 활성을 촉발시킬 수 있었다.
이중특이적 항체 단편을 재조합 세포 배양액으로부터 직접 제조하고 단리하기 위한 다양한 기술이 또한 설명되었다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 류신 지퍼 (zipper), 예를 들어 GCN4를 사용하여 생산되었다 (일반적으로, 문헌 [Kostelny et al., J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992)] 참조). Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드가 유전자 융합에 의해 2개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 연결되었다. 항체 동종이량체는 힌지 구역에서 환원되어 단량체를 형성한 다음, 재산화되어 항체 이종이량체를 형성하였다. 이 방법은 또한 항체 동종이량체의 생산에 이용될 수 있다.
용어 "디아바디"는 2개의 항원 결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 나타내고, 상기 단편은 동일한 폴리펩티드 사슬 (VH-VL) 내의 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 동일한 사슬 상의 2개의 도메인 사이의 페어링을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인은 다른 사슬의 상보성 도메인과 페어링하여 2개의 항원 결합 부위를 생성하게 된다 (예를 들어, 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)] 참조).
단일쇄 Fv (sFv) 이량체를 사용한 이중특이적 항체 단편의 다른 제조 전략도 보고된 바 있다 ([Gruber et al., J. Immunol., 152: 5368 (1994)] 참조).
별법으로, 이중특이적 항체는 문헌 [Zapata et al. Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995)]에 기재된 바와 같이 생산된 "선형 항체"일 수 있다. 간단히 설명하면, 상기 항체는 항원 결합 구역의 쌍을 형성하는 일렬 Fd 세그먼트 (VH-CH1-VH-CH1)의 쌍을 포함한다. 선형 항체는 이중특이성 또는 단일특이성일 수 있다.
2가 초과의 항체도 고려된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체가 제조될 수 있다 (Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)).
"킬레이팅 재조합 항체"는 표적 항원의 근접하고 비-중첩된 에피토프를 인식하는 이중특이적 항체로서, 두 에피토프에 동시에 결합하기에 충분히 유연하다 (Neri et al., J Mol Biol. 246:367-73, 1995).
이중특이적 Fab-scFv ("바이바디") 및 삼중 특이적 Fab-(scFv)(2) ("트리바디")의 생산 방법이 문헌에 기재되어 있다 ([Schoonjans et al., J Immunol. 165:7050-57, 2000]; 및 [Willems et al., Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 786:161-76, 2003]). 바이바디 및 트리바디를 위해, scFv 분자가 VL-CL (L) 및 VH-CH1 (Fd) 사슬 중의 하나 또는 둘 모두에 융합되며, 예를 들어, 트리바디 생산을 위해서는 두 개의 scFv가 Fab의 C-말단에 융합되는 반면, 바이바디 생산을 위해서는 하나의 scFv가 Fab의 C-말단에 융합된다.
항체의 재조합 생산
항체는 당업계에 잘 알려진 항체 발현 시스템 중의 하나를 사용하여 재조합 DNA 방법으로 제조될 수 있다 (예를 들어, [Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)] 참조).
본 발명의 항체를 코딩하는 DNA를 발현 벡터 내에 넣은 다음, 이를 숙주 세포, 예를 들어, 이. 콜라이 세포, 원숭이 COS 세포, 인간 배아 신장 293 세포 (예를 들어, 293E 세포), 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 다른 경우에는 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 골수종 세포 내로 형질감염시켜 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체를 합성시켜 얻는다. 항체의 재조합 생산은 당업계에 잘 알려져 있다. 항체 단편은 무손상 항체의 단백질 분해 소화를 통해 유도되었다 (예를 들어, 문헌 [Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)] 및 [Brennan et al., Science 229:81 (1985)] 참조). 그러나, 이들 단편은 지금은 재조합 숙주 세포에 의해 직접 생산될 수 있다. 펩티드 합성 및 공유 결합을 포함하는, 항체 단편을 생산하기 위한 다른 기술은 당업자에게 자명할 것이다.
발현 제어 서열은 특정 숙주 유기체에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 나타낸다. 예를 들어, 원핵세포에 적합한 제어 서열은 프로모터, 임의로 작동유전자 (operator) 서열, 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호, 및 인핸서를 이용하는 것으로 알려져 있다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 있을 때 작동가능하게 연결된다. 예를 들어, 예비 서열 또는 분비 리더용 DNA는 폴리펩티드의 분비에 참여하는 예비 단백질 (preprotein)로서 발현될 경우 폴리펩티드용 DNA에 작동가능하게 연결되고, 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 줄 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 리보솜 결합 부위는 번역을 촉진하도록 위치할 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결되는 DNA 서열이 인접함을 의미하고, 분비 리더의 경우 인접하고 리딩 페이스 (reading phase)로 존재한다. 그러나, 인핸서는 인접할 필요는 없다. 연결은 편리한 제한 부위에서 라이게이션에 의해 달성된다. 상기 부위가 존재하지 않을 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 통상적인 용례에 따라 사용된다.
세포, 세포주 및 세포 배양액은 종종 서로 교환가능하게 사용되고, 상기 모든 용어는 본원에서 자손체를 포함한다. 형질전환체 및 형질전환된 세포는 1차 대상 세포 및 이전 횟수에 상관없이 그로부터 유도된 배양액을 포함한다. 또한, 모든 자손체가 계획적인 또는 우연한 돌연변이 때문에 DNA 함량이 정확하게 동일하지 않을 수 있음이 이해된다. 본래 형질전환된 세포에서 스크리닝된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손체가 포함된다. 다른 명칭이 의도되는 경우에, 이것은 문맥으로부터 분명히 알 수 있을 것이다.
다른 실시태양에서, 관심있는 면역글로불린의 아미노산 서열은 직접적인 단백질 서열 결정에 의해서 결정될 수 있다. 적절한 코딩 뉴클레오티드 서열은 공통 코돈 표 (universal codon table)에 따라 설계될 수 있다.
목적하는 항체의 아미노산 서열 뮤테인은 코딩 DNA 내로 적절한 뉴클레오티드 변화를 도입하거나, 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 그러한 뮤테인은, 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 내의 잔기의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 최종 구성체가 목적하는 특징을 갖는 한, 어떠한 결실, 삽입 및 치환의 조합도 최종 구성체에 존재할 수 있다. 아미노산 변화는 또한 모노클로날, 인간, 인간화, 인간 조작된™ 또는 뮤테인 항체의 번역후 과정을 변경, 예를 들어, 글리코실화 부위의 수 및 위치를 변화시킬 수 있다.
항체의 아미노산 서열 뮤테인을 코딩하는 핵산 분자는 당업계에 공지된 다양한 방법으로 제조된다. 상기 방법은 자연 공급원으로부터의 단리 (자연 발생하는 아미노산 서열 뮤테인의 경우) 또는 올리고뉴클레오티드-매개 (또는 부위 지정) 돌연변이 유발, PCR 돌연변이 유발, 및 항체의 조기 제조된 뮤테인 또는 비-뮤테인 형태의 카세트 돌연변이 유발을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
본 발명은 또한 임의로 숙주 세포에 의해 인식되는 제어 서열에 작동 가능하게 연결된, 본 발명의 항체를 코딩하는 단리된 핵산, 그러한 핵산을 포함하는 벡터 및 숙주 세포, 및 핵산이 발현되도록 상기 숙주 세포를 배양하고, 숙주 세포 배양물 또는 배양 배지로부터 항체를 회수하는 단계를 포함할 수 있는 항체 생산의 재조합 기술을 제공한다.
항체의 재조합 제조를 위해, 그를 코딩하는 핵산을 단리하여 추가 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위해 복제가능한 벡터에 삽입한다. 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 절차를 사용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 쉽게 단리되고 서열 결정된다. 많은 벡터가 이용가능하다. 벡터 성분은 일반적으로 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 선택 마커 유전자, 인핸서 엘리먼트, 프로모터 및 전사 종결 서열 중의 하나 이상을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
(1) 신호 서열 성분
본 발명의 항체는 직접적으로 재조합 생산될 수 있을 뿐만 아니라, 바람직하게는 신호 서열인 이종 폴리펩티드 또는 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특이적인 절단 부위를 갖는 다른 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드로서 재조합 생산될 수 있다. 선택된 이종 신호 서열은 바람직하게는 숙주 세포에 의해 인식되고 프로세싱 (즉, 신호 펩티다제에 의해 절단됨)되는 것이다. 천연 항체 신호 서열을 인식하여 프로세싱하지 못하는 원핵 숙주 세포의 경우, 신호 서열은 예를 들어, 알칼린 포스파타제, 페니실리나제, lpp, 또는 열-안정성 엔테로톡신 Ⅱ 리더의 군으로부터 선택되는 원핵 신호 서열로 대체된다. 효모에서의 분비를 위해, 천연 신호 서열은 예를 들어, 효모 인버타제 리더, α 인자 리더 (사카로마이세스 (Saccharomyces) 및 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) α-인자 리더 포함), 또는 산 포스파타제 리더, 씨. 알비칸스 (C. albicans) 글루코아밀라제 리더, 또는 WO 90/13646에 기술된 신호로 대체될 수 있다. 포유동물 세포 발현에서, 포유동물 신호 서열뿐만 아니라 바이러스 분비 리더, 예를 들어 단순 헤르페스 gD 신호가 이용가능하다.
이러한 전구체 구역을 위한 DNA는 항체를 코딩하는 DNA에 리딩 프레임 (reading frame)으로 라이게이션된다.
(2) 복제 기점 성분
발현 및 클로닝 벡터 둘 모두는 하나 이상의 선택된 숙주 세포에서 벡터를 복제시킬 수 있는 핵산 서열을 포함한다. 일반적으로, 클로닝 벡터에서 상기 서열은 숙주 염색체 DNA와 상관없이 벡터를 복제시킬 수 있는 것이고, 복제 기점 또는 자동 복제 서열을 포함한다. 상기 서열은 다양한 세균, 효모 및 바이러스에 대해 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기점은 대부분의 그람 음성 세균에 적합하고, 2μ 플라스미드 복제 기점은 효모에 적합하고, 다양한 바이러스 복제 기점은 포유동물 세포에서 벡터를 클로닝하는 데 유용하다. 일반적으로, 복제 기점 성분은 포유동물 발현 벡터에 대해서는 필요하지 않다 (SV40 기점은 단지 초기 프로모터를 포함하기 때문에 일반적으로 사용될 수 있다).
(3) 선택 마커 성분
발현 및 클로닝 벡터는 선택가능 마커로도 언급되는 선택 유전자를 포함할 수 있다. 전형적인 선택 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트, 테트라사이클린, G418, 게네티신, 히스티디놀, 또는 미코페놀산에 대한 내성을 부여하거나, (b) 영양요구성 결핍을 보완하거나, 또는 (c) 복합 배지로부터 이용가능하지 않은 중요한 영양분을 공급하는 단백질, 예를 들어 바실러스의 D-알라닌 라세마제를 코딩한다.
선택 방식의 일례는 숙주 세포의 성장을 정지시키는 약물을 이용한다. 이종 유전자로 성공적으로 형질전환된 상기 세포는 약물 내성을 부여하는 단백질을 생성하고, 따라서 선택 방식에서 생존할 수 있다. 상기 우세한 선택의 예는 약물 메토트렉세이트, 네오마이신, 히스티디놀, 퓨로마이신, 마이코페놀산 및 하이그로마이신을 이용한다.
포유동물 세포에 적합한 선택가능 마커의 다른 예는 항체 코딩 핵산, 예를 들어 DHFR, 티미딘 키나제, 메탈로티오네인-I 및 -II, 바람직하게는 영장류 메탈로티오네인 유전자, 아데노신 데아미나제, 오르니틴 데카르복실라제 등을 섭취하는 능력을 갖는 세포의 확인을 가능하게 하는 것이다.
예를 들어, DHFR 선택 유전자로 형질전환된 세포는 먼저 DHFR의 경쟁적 길항제인 메토트렉세이트 (Mtx)를 포함하는 배양 배지에서 모든 형질전환체를 배양함으로써 확인한다. 야생형 DHFR을 사용할 때 적합한 숙주 세포는 DHFR 활성이 결여된 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주이다.
별법으로, 본 발명의 항체를 코딩하는 DNA 서열, 야생형 DHFR 단백질, 및 다른 선택가능한 마커, 예를 들어 아미노글리코시드 3'-포스포트랜스퍼라제 (APH)로 형질전환된 또는 동시-형질전환된 숙주 세포 (특히 내인성 DHFR을 포함하는 야생형 숙주)는 선택가능 마커에 대한 선택제, 예를 들어, 아미노글리코시드계 항생제, 예를 들어, 카나마이신, 네오마이신, 또는 G418를 포함하는 배지에서 세포의 성장에 의해 선택될 수 있다 (미국 특허 4,965,199 참조).
효모에 사용하기 적합한 선택 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1 유전자이다 (Stinchcomb et al., 1979, Nature, 282:39). trp1 유전자는 트립토판에서 성장하는 능력이 결여된 효모의 돌연변이체 균주, 예를 들어 ATCC No. 44076 또는 PEP4-1에 대한 선택 마커를 제공한다 (Jones, Genetics, 85:12 (1977)). 이어서, 효모 숙주 세포 게놈 내의 trp1 병소의 존재는 트립토판 부재시의 성장에 의해 형질전환을 검출하기 위한 효과적인 환경을 제공한다. 유사하게, Leu2-결여 효모 균주 (ATCC 20,622 또는 38,626)는 Leu2 유전자를 포함하는 공지의 플라스미드에 의해 보완된다. Ura3-결여 효모 균주는 ura3 유전자를 보유하는 플라스미드에 의해 보완된다.
또한, 1.6 ㎛ 환상 플라스미드 pKD1에서 유래한 벡터는 클루이베로마이세스 효모의 형질전환에 사용될 수 있다. 별법으로, 재조합 송아지 키모신의 대량 생산용 발현 시스템이 케이. 락티스 (K. lactis)에 대해 문헌에 보고되었다 [Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990)]. 성숙 재조합 인간 혈청 알부민의 클루이베로마이세스의 산업적 균주에 의한 분비를 위한 안정한 다중 카피 발현 벡터도 문헌에 개시되어 있다 (Fleer et al., Bio/Technology, 9: 968-975 (1991)).
(4) 프로모터 성분
발현 및 클로닝 벡터는 대체로 숙주 유기체에 의해 인식되고 항체 코딩 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 원핵 숙주에 사용하기 적합한 프로모터는 아라비노스 (예를 들어, araB) 프로모터 phoA 프로모터, β-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템, 알칼린 포스파타제, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템, 및 하이브리드 프로모터, 예를 들어 tac 프로모터를 포함한다. 그러나, 다른 공지의 세균 프로모터도 적합하다. 또한, 세균 시스템에 사용하기 위한 프로모터도 본 발명의 항체를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가노 (Shine-Dalgarno; S.D.) 서열을 포함할 것이다.
프로모터 서열이 진핵세포에 대해 공지되어 있다. 실질적으로 모든 진핵세포 유전자는 전사가 개시되는 부위의 약 25 내지 30개 염기 상류에 위치하는 AT 풍부 구역을 갖는다. 많은 유전자의 전사 개시점으로부터 70 내지 80개 염기 상류에 존재하는 또다른 서열은 N이 임의의 뉴클레오티드일 수 있는 CNCAAT 구역이다. 코딩 서열의 3' 말단에 폴리 A 테일 (tail)의 부가를 위한 신호일 수 있는 AATAAA 서열이 대부분의 진핵세포 유전자의 3' 말단에 존재한다. 상기 모든 서열은 진핵세포 발현 벡터에 적합하게 삽입된다.
효모 숙주에 사용하기 위해 적합한 프로모터 서열의 예는 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 당분해 효소, 예를 들어 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카르복실라제, 포스포프럭토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제 및 글루코키나제용 프로모터를 포함한다.
성장 조건에 의해 조절되는 추가의 전사 잇점을 갖는 유도가능 프로모터인 다른 효모 프로모터는 알콜 데히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사에 관여하는 분해 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 및 말토스 및 갈락토스 이용에 작용하는 효소용 프로모터 구역을 포함한다. 효모 발현에 사용하기 위해 적합한 벡터 및 프로모터는 EP 73,657에 추가로 기재되어 있다. 또한, 효모 인핸서도 효모 프로모터와 함께 유리하게 사용된다.
포유동물 숙주 세포 내의 벡터로부터 항체의 전사는 프로모터가 숙주 세포 시스템과 상용성일 경우 바이러스, 예를 들어 아벨슨 (Abelson) 백혈병 바이러스, 폴리오마 바이러스, 조류폭스 바이러스, 아데노바이러스 (예를 들어 아데노바이러스 2), 소 파필로마 바이러스, 조류 육종 바이러스, 가장 바람직하게는 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스, 원숭이 바이러스 40 (SV40)의 게놈으로부터, 이종 포유동물 프로모터, 예를 들어 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터로부터, 열 충격 프로모터로부터 얻은 프로모터에 의해 조절된다.
SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 또한 SV40 바이러스 복제 기점을 포함하는 SV40 제한 단편으로서 편리하게 얻는다. 인간 사이토메갈로바이러스의 최조기 (immediate early) 프로모터는 HindIII E 제한 단편으로서 편리하게 얻는다. 소 파필로마 바이러스를 벡터로서 사용하는 포유동물 숙주에서 DNA를 발현하기 위한 시스템은 미국 특허 4,419,446에 기재되어 있다. 이 시스템의 변형은 미국 특허 4,601,978에 기재되어 있다. 또한, 단순 헤르페스 바이러스로부터의 티미딘 키나제 프로모터의 조절 하에 마우스 세포에서 인간 β-인터페론 cDNA를 발현하는 것에 대해서는 문헌 [Reyes et al., Nature 297: 598-601 (1982)]을 참조한다. 별법으로, 라우스 (rous) 육종 바이러스의 긴 말단 반복체 (repeat)가 프로모터로서 사용될 수 있다.
(5) 인핸서 엘리먼트 성분
보다 고등한 진핵세포에 의한 본 발명의 항체를 코딩하는 DNA의 전사는 종종 인핸서 서열을 벡터 내로 삽입함으로써 증가된다. 많은 인핸서 서열이 현재 포유동물 유전자 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, 알파-페토단백질 및 인슐린)로부터 공지되어 있다. 그러나, 일반적으로 진핵세포 바이러스로부터의 인핸서를 사용할 것이다. 그 예는 복제 기점의 하류 쪽의 SV40 인핸서 (bp 100-270), 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점 하류 쪽의 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 또한, 진핵세포 프로모터의 활성화를 위한 인핸서 성분은 문헌 [Yaniv, Nature 297:17-18 (1982)]을 참조한다. 인핸서는 위치 5' 또는 3'에서 항체 코딩 서열까지 벡터 내로 스플라이싱될 수 있지만, 바람직하게는 프로모터로부터 5'의 부위에 위치한다.
(6) 전사 종결 성분
진핵 숙주 세포 (효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 다른 다세포 유기체로부터의 유핵 (nucleated) 세포)에 사용되는 발현 벡터도 전사 종결 및 mRNA 안정화에 필요한 서열을 포함할 것이다. 상기 서열은 진핵세포 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및 때때로 3' 비번역 구역으로부터 통상 얻을 수 있다. 이들 구역은 항체를 코딩하는 mRNA의 비번역 부분 내의 폴리아데닐화 단편으로서 전사되는 뉴클레오티드 세그먼트를 포함한다. 한 유용한 전사 종결 성분은 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 구역이다. W094/11026 및 본원에 개시된 발현 벡터를 참조한다. 다른 성분은 마우스 면역글로불린 경쇄 전사 터미네이터이다.
(7) 숙주 세포의 선택 및 형질전환
본원에서 벡터 내에 DNA를 클로닝하거나 발현시키기 위한 적합한 숙주 세포는 상기한 원핵세포, 효모 또는 보다 고등한 진핵세포이다. 본 목적에 적합한 원핵세포는 진정세균, 예를 들어 그람 음성 또는 그람 양성 유기체, 예를 들어, 엔테로박테리아새 (Enterobacteriaceae), 예를 들어 에스케리치아 (Escherichia), 예를 들어, 이. 콜라이, 엔테로박터 (Enterobacter), 에르위니아 (Erwinia), 클렙시엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 살모넬라 (Salmonella), 예를 들어, 살모넬라 티피무륨 (Salmonella typhimurium), 세라티아 (Serratia), 예를 들어, 세라티아 마르세스칸스 (Serratia marcescans) 및 시겔라 (Shigella), 및 바실리 (Bacilli), 예를 들어 비. 섭틸리스 (B. subtilis) 및 비. 리케니포르미스 (B. licheniformis) (예를 들어, 1989년 4월 12일 공개된 DD 266,710에 개시된 비. 리케니포르미스 41P), 슈도모나스 (Pseudomonas), 예를 들어 피. 애루기노사 (P. aeruginosa) 및 스트렙토마이세스 (Streptomyces)를 포함한다. 하나의 바람직한 이. 콜라이 클로닝 숙주는 이. 콜라이 294 (ATCC 31,446)이지만, 다른 균주, 예를 들어 이. 콜라이 B, 이. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537) 및 이. 콜라이 W3110 (ATCC 27,325)가 적합하다. 이들 예는 제한적인 것이 아니라 예시적인 것이다.
원핵세포 외에, 진핵 미생물, 예를 들어 필라멘트성 진균 또는 효모가 항체-코딩 벡터에 대한 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 또는 보통의 제빵용 효모가 저등 진핵 숙주 미생물 사이에 가장 흔히 사용된다. 그러나, 많은 다른 속, 종 및 균주, 예를 들어 쉬조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로마이세스 숙주, 예를 들어 케이. 락티스 (K. lactis), 케이. 프라길리스 (K. fragilis) (ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스 (K. bulgaricus) (ATCC 16,045), 케이. 위커라미 (K. wickeramii) (ATCC 24,178), 케이. 왈티 (K. waltii) (ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸 (K. drosophilarum) (ATCC 36,906), 케이. 테르모톨레란스 (K. thermotolerans) 및 케이. 마르시아누스 (K. marxianus); 야로위아 (yarrowia) (EP 402,226); 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris) (EP 183,070); 칸디다 (Candida); 트리코데르마 레에시아 (Trichoderma reesia (EP 244,234)); 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa); 쉬바니오마이세스 (Schwanniomyces), 예를 들어 쉬바니오마이세스 옥시덴탈리스 (occidentalis); 및 필라멘트성 진균, 예를 들어 뉴로스포라, 페니실리움 (Penicillium), 톨리포클라디움 (Tolypocladium) 및 아스퍼질러스 (Aspergillus) 숙주, 예를 들어 에이. 니둘란스 (nidulans) 및 에이. 니거 (niger)가 일반적으로 이용가능하고 본원에서 유용하다.
글리코실화 항체 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체로부터 유래한다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 많은 바큘로바이러스 균주 및 변이체 및 숙주, 예를 들어 스포돕테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda; 쐐기벌레), 아에데스 아에깁티 (Aedes aegypti, 모기), 아에데스 알보픽투스 (albopictus, 모기), 드로소필라 멜라노가스터 (Drosophila melanogaster, 과일파리), 및 봄빅스 모리 (Bombyx mori)로부터의 대응하는 허용되는 곤충 숙주 세포가 확인되었다. 형질감염을 위한 다양한 바이러스 균주, 예를 들어 오토그라파 칼리포르니카 (Autographa californica) NPV의 L-1 변이체 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주가 이용가능하고, 상기 바이러스는 특히 스포돕테라 프루기페르다 세포의 형질감염을 위해 본 발명에 따라 본원에서 바이러스로서 이용할 수 있다.
면화, 옥수수, 감자, 대두, 페튜니아, 토마토, 담배, 개구리밥 (lemna) 및 다른 식물 세포의 식물 세포 배양액도 숙주로서 이용할 수 있다.
그러나, 척추동물 세포가 가장 관심의 대상이 되어 왔고, 배양 (조직 배양)에서 척추동물 세포의 증식은 일상적인 방법이 되었다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 차이니즈 햄스터 난소 세포, 예를 들어 CHOK1 세포 (ATCC CCL61), DXB-11, DG-44, 및 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980); SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장주 (현탁 배양으로 성장을 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포들 [Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1997)]; 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 마우스 세르톨리 세포 (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL 1587); 인간 경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐세포 (W138, ATCC CCL 75), 인간 간세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68 (1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간암세포주 (Hep G2)이다.
숙주 세포는 항체 생산을 위한 상기한 발현 또는 클로닝 벡터를 사용하여 형질전환 또는 형질감염시키고, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선택하거나 또는 목적하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키기 위해 적절하게 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양한다. 또한, 선택 마커에 의해 분리된 전사 단위의 여러 카피를 갖는 신규한 벡터 및 형질감염된 세포주가 항체의 발현을 위해 특히 유용하고 바람직하다.
(8) 숙주 세포의 배양
본 발명의 항체를 생산하기 위해 사용된 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양할 수 있다. 상업적으로 이용가능한 배지, 예를 들어 햄 (Ham) F10 (시그마 (Sigma)), 최소 필수 배지 (MEM, 시그마), RPMI-1640 (시그마) 및 둘베코 (Dulbecco) 개질 이글 (Eagle) 배지 (DMEM, 시그마)가 숙주 세포를 배양하기에 적합하다. 또한, 문헌 ([Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979)], [Barnes et al., Anal. Biochem. 102:225 (1980)]), 미국 특허 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; 또는 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국 특허 Re. 30,985에 설명된 임의의 배지를 숙주 세포를 위한 배지로서 사용할 수 있다. 임의의 상기 배지는 필요하다면 호르몬 및/또는 다른 성장 인자 (예를 들어, 인슐린, 트랜스페린 또는 외피 성장 인자), 염 (예를 들어, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 버퍼 (예를 들어 HEPES), 뉴클레오티드 (예를 들어, 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예를 들어, GENTAMYCIN™), 미량 원소 (보통 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로서 정의됨) 및 글루코스 또는 동등 에너지원으로 보충될 수 있다. 임의의 다른 필수 보충물이 또한 당업계의 숙련인에게 잘 알려진 적절한 농도로 포함될 수 있다. 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 이전에 사용된 것이며, 통상적인 기술자에게 명백할 것이다.
(9) 항체의 정제
재조합 기술을 사용할 때, 항체는 세포내, 주변 세포질 공간에 생산되거나, 미생물 배양액을 포함하여 배지 내로 직접 분비될 수 있다. 항체가 세포내 생산되면, 제1 단계로서, 입자형 파편, 숙주 세포 또는 용해된 단편은 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거된다. 문헌 ([Better et al. Science 240: 1041-1043 (1988)]; [ICSU Short Reports 10: 105 (1990)]; 및 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 457-461 (1993)])은 이. 콜라이의 주변 세포질 공간 내로 분비된 항체의 단리 과정을 설명하고 있다 (또한, 문헌 [Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)] 참조).
미생물 또는 포유동물 세포로부터 제조된 항체 조성물은 예를 들어 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 양이온 또는 음이온 교환 크로마토그래피 및 친화도 크로마토그래피를 사용하여 정제할 수 있고, 친화도 크로마토그래피가 바람직한 정제 기술이다. 친화도 리간드로서 단백질 A의 적합성은 항체 내에 존재하는 임의의 면역글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소형에 의존한다. 단백질 A는 인간 γ1, γ2 또는 γ4 중쇄를 기초로 한 항체를 정제하기 위해 사용될 수 있다 (Lindmark et al. J. Immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)). 단백질 G는 모든 마우스 이소형 및 인간 γ3에 대해 추천된다 (Guss et al. EMBO J. 5: 15671575 (1986)). 친화도 리간드가 부착되는 매트릭스는 가장 종종 아가로스이지만, 다른 매트릭스도 이용가능하다. 기계적으로 안정한 매트릭스, 예를 들어 제어된 공극 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠이 아가로스를 사용하여 달성될 수 있는 것보다 더 빠른 유동 속도와 더 짧은 처리 시간을 허용한다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우, Bakerbond ABX™ 수지 (제이.티. 베이커 (J.T. Baker), 미국 뉴저지주 필립스버그)가 정제에 유용하다. 단백질 정제를 위한 다른 기술, 예를 들어 이온-교환 컬럼 상의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상의 크로마토그래피, 헤파린 세파로스™ 상의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 (예를 들어 폴리아스파르트산 컬럼) 상의 크로마토그래피, 크로마토포커싱 (chromatofocusing), SDS-PAGE, 및 황산암모늄 침전도 회수되는 항체에 따라 사용될 수 있다.
키메라 항체
설치류 항체를 단독으로 또는 컨쥬게이트로서 인간에게 생체 내에서 반복적으로 투여할 때 수여자에게서 설치류 항체에 대항하는 면역 반응이 일어나는데, 이를 소위 HAMA (인간 항-마우스 항체) 반응이라 한다. HAMA 반응은 반복되는 투여가 필요할 때 약제의 효과를 제한할 수 있다. 항체의 면역원성은 항체를 폴리에틸렌 글리콜과 같은 친수성 중합체로 화학적으로 변형시키거나, 항체의 구조를 보다 인간과 유사하게 만드는, 예를 들어, 키메라, 인간화, 인간 또는 인간 조작된™ 항체로 만드는 유전 공학 방법을 사용하여 감소시킬 수 있다. 그와 같이 조작된 항체는 모 마우스 모노클로날 항체보다 인간에서 덜 면역원성이기 때문에, 아나필락시스 (anaphylaxis)의 위험이 훨씬 낮은 상태로 인간을 치료하는 데 사용할 수 있다. 따라서, 이들 항체는 인간에 대해 생체내 투여하는 것을 포함하는 치료 용도에 바람직할 수 있다.
마우스 모노클로날 항체의 가변 Ig 도메인이 인간 불변 Ig 도메인에 융합된 키메라 모노클로날 항체는 당업계에 알려진 표준 절차를 사용하여 생산할 수 있다 ([Morrison, S. L., et al. (1984) Chimeric Human Antibody Molecules; Mouse Antigen Binding Domains with Human Constant Region Domains, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6841-6855]; 및 [Boulianne, G. L., et al, Nature 312, 643-646 (1984)] 참조). 예를 들어, CEA에 결합하는 설치류 항체의 가변 도메인에 대한 유전자 서열로 인간 골수종 단백질의 가변 도메인을 치환하여 재조합 키메라 항체를 생산할 수 있다. 이러한 과정은 EP 194276, EP 0120694, EP 0125023, EP 0171496, EP 0173494 및 WO 86/01533에 상세히 기재되어 있다. 몇몇 키메라 모노클로날 항체가 인간에서 덜 면역원성인 것으로 증명되기는 하였지만, 마우스 가변 Ig 도메인은 여전히 유의한 인간 항-마우스 반응을 일으킬 수 있다.
인간화 항체
인간화 항체는 예를 들어 (1) 비-인간 상보성 결정 구역 (CDR)을 인간 프레임워크 및 불변 구역 상에 그라프팅 (grafting) (당업계에서 "CDR 그라프팅"을 통한 인간화로 불리는 방법)하거나, 또는 (2) 전체 비-인간 가변 도메인을 이식하지만, 표면 잔기를 치환하여 인간-유사 표면으로 "감추는 (cloaking)" 방법 (당업계에서 "베니어링 (veneering)"으로 불리는 방법)을 포함하는 다양한 방법으로 얻을 수 있다. 본 발명에서, 인간화 항체는 "인간화" 및 "베니어링된" 항체 모두를 포함할 것이다. 이들 방법은 예를 들어, 각각 본원에 참조로 포함되는 문헌 ([Jones et al., Nature 321:522 525 (1986)]; [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:6851 6855 (1984)]; [Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65 92 (1988)]; [Verhoeyer et al., Science 239:1534 1536 (1988)]; [Padlan, Molec. Immun. 28:489 498 (1991)]; [Padlan, Molec. Immunol. 31(3):169 217 (1994)]; 및 [Kettleborough, CA. et al., Protein Eng. 4(7):773 83 (1991)])에 개시되어 있다.
예를 들어, 설치류 항체의 CDR의 유전자 서열을 단리 또는 합성한 다음, 상동성 인간 항체 유전자의 상응하는 서열 구역을 치환하여 본래의 설치류 항체의 특이성을 갖는 인간 항체를 생산할 수 있다. 이들 과정은 EP 023940, WO 90/07861 및 WO 91/09967에 기재되어 있다.
CDR 그라프팅은 마우스 중쇄 및 경쇄 가변 Ig 도메인으로부터의 6개의 CDR 중 하나 이상을 인간 가변 Ig 도메인의 적절한 4개의 프레임워크 구역으로 도입하는 것을 포함한다. 이 기술 (Riechmann, L., et al., Nature 332, 323 (1988))은 보존된 프레임워크 구역 (FR1-FR4)을, 항원과 일차 접촉하는 CDR 루프를 지지하는 스캐폴드 (scaffold)로 이용한다. 그러나, CDR 그라프팅의 단점은 본래의 마우스 항체보다 실질적으로 낮은 결합 친화도를 갖는 인간화 항체가 만들어질 수 있다는 것이고, 이는 프레임워크 구역의 아미노산이 항원 결합에 기여할 수 있고, CDR 루프의 아미노산이 두 개의 가변 Ig 도메인의 회합에 영향을 줄 수 있기 때문이다. 인간화 모노클로날 항체의 친화도를 유지하기 위하여, CDR 그라프팅 기술은 본래의 마우스 항체의 프레임워크 구역과 가장 근사한 인간 프레임워크 구역을 선택하고, 항원 결합 부위의 컴퓨터 모델링의 도움을 받아 프레임워크 또는 CDR 내의 단일 아미노산을 부위 지정 돌연변이를 유발하여 개선될 수 있다 (예를 들어, Co, M. S., et al. (1994), J. Immunol. 152, 2968-2976).
항체를 인간화하는 하나의 방법은 비-인간 중쇄 및 경쇄 서열을 인간 중쇄 및 경쇄 서열에 정렬시키고, 그와 같은 정렬에 기초하여 비-인간 프레임워크를 인간 프레임워크로 선택 및 교체하고, 인간화 서열의 입체형태를 예측하기 위해 분자 모델링하고 이를 모 항체의 입체형태와 비교하는 것을 포함한다. 이 과정에 이어서, 인간화 서열 모델의 예측된 입체형태가 모 비-인간 항체의 비-인간 CDR의 입체형태와 근사하게 될 때까지, CDR의 구조를 방해하는 CDR 구역 내 잔기의 역돌연변이 유발을 반복한다. 그러한 인간화 항체는, 예를 들어, 애쉬웰 (Ashwell) 수용체를 통해 흡수 및 제거를 촉진하기 위해 더욱 유도될 수 있다 (예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 5,530,101 및 5,585,089 참조).
합리적인 설계에 의해 마우스 모노클로날 항체를 인간화한 많은 사례가 보고되어 왔다 (예를 들어, 20020091240 (2002년 7월 11일 공개), WO 92/11018 및 미국 특허 5,693,762, 미국 특허 5,766,866 참조).
인간 조작된™ 항체
"인간 조작된™ 항체"는 비-인간 항체, 일반적으로 마우스 모노클로날 항체로부터 유도된 항체를 말한다. 또한, 모 비-인간 항체의 항원 결합 특성을 보유하거나 실질적으로 보유하지만, 인간에 투여될 때 모 항체에 비하여 감소된 면역원성을 나타내는 키메라 항체로부터 유도될 수 있다.
항체 가변 도메인의 인간 조작™은 스터드닉카에 의해 항체 분자의 결합 활성을 유지하면서 면역원성을 감소시키는 방법으로서 설명되었다 [예를 들어, 미국 특허 5,766,886 (Studnicka et al); 문헌 [Studnicka et al. Protein Engineering 7: 805-814 (1994)] 참조]. 이 방법에 따르면, 각각의 가변 구역 아미노산에 대해 치환 위험도가 배정되었다. 아미노산 치환은 세 개의 위험도 카테고리 중의 하나로 구별된다: (1) 저위험 변경은 항원 결합을 최소한의 확률로 방해하면서 면역원성을 최대한으로 감소시키는 변경이고; (2) 중간 위험 변경은 항원 결합이나 단백질 폴딩에 영향을 미칠 확률이 보다 크지만, 면역원성을 더 감소시킬 수 있는 변경이고; (3) 고위험 잔기는 결합 또는 항원 구조를 유지하는 데 중요하고, 항원 결합 또는 단백질 폴딩이 영향받을 위험이 가장 큰 잔기이다. 프롤린의 3차원 구조 역할 때문에, 위치가 일반적으로 저위험 위치라 할지라도, 프롤린에서의 변형은 일반적으로 적어도 중간 위험 변경으로 간주된다.
설치류 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 구역은 다음과 같이 인간 조작™되어 항원 결합이나 단백질 폴딩에 역효과를 미칠 것 같지는 않으나 인간 환경에서 면역원성을 감소시킬 것으로 결정된 위치에서 인간 아미노산으로 치환된다. "저위험" 위치에 존재하며, 상기 방법에 따른 변형을 위한 후보인 아미노산 잔기는 설치류 가변 구역의 아미노산 서열을 인간 가변 구역 서열과 정렬시켜 확인한다. 개개의 VH 또는 VL 서열 또는 인간 컨센서스 VH 또는 VL 서열 또는 개개의 또는 컨센서스 인간 생식세포 서열을 포함하여 임의의 인간 가변 구역을 사용할 수 있다. 저위험 위치 중 임의의 일부 또는 모든 저위험 위치의 아미노산 잔기가 변경될 수 있다. 예를 들어, 정렬된 뮤린 및 인간 아미노산 잔기가 다른 각각의 저위험 위치에서, 설치류 잔기를 인간 잔기로 교체하는 아미노산 변형이 도입된다. 별법으로, 모든 저위험 위치 및 중간 위험 위치의 임의의 일부의 아미노산 잔기가 변경될 수 있다. 이상적으로는, 최소한의 면역원성을 얻도록, 모든 저위험 및 중간 위험 위치를 설치류에서 인간으로 변경한다.
변형된 중쇄 및/또는 경쇄 가변 구역을 함유하는 합성 유전자를 제작하여 인간 γ 중쇄 및/또는 카파 경쇄 불변 구역에 연결시킨다. 어떠한 인간 중쇄 및 경쇄 불변 구역도 인간 조작된™ 항체 가변 구역과 조합하여 사용할 수 있으며, 이들은 IgA (임의의 서브클래스, 예를 들어 IgA1 또는 IgA2), IgD, IgE, IgG (임의의 서브클래스, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4) 또는 IgM을 포함한다. 인간 중쇄 및 경쇄 유전자를 포유동물 세포와 같은 숙주 세포 내로 도입하고, 생산된 재조합 면역글로불린 생성물을 수득하여 특성화한다.
트랜스제닉 동물로부터의 인간 항체
표적 항원에 대한 인간 항체는 내인성 면역글로불린을 생산하지 않으며 인간 면역글로불린 로커스를 함유하도록 조작된 트랜스제닉 동물을 사용하여 생산될 수 있다. 예를 들어, WO 98/24893은 인간 Ig 로커스를 갖는 트랜스제닉 동물을 개시하고 있는데, 이 동물은 내인성 중쇄 및 경쇄 로커스의 불활성화 때문에 기능적 내인성 면역글로불린을 생산하지 못한다. WO 91/10741도 면역원에 대해 면역 반응을 나타낼 수 있는 트랜스제닉 비-영장류 포유동물 숙주를 개시하고 있는데, 항체는 영장류 불변 및/또는 가변 구역을 가지며, 내인성 면역글로불린 코딩 로커스는 치환되거나 불활성화되었다. WO 96/30498은 포유동물에서 면역글로불린 로커스를 변형시키기 위해, 예를 들어, 불변 또는 가변 구역의 전부 또는 일부를 교체하여 변형된 항체 분자를 형성하기 위해 Cre/Lox 시스템을 사용하는 것을 개시하고 있다. WO 94/02602는 불활성화된 내인성 Ig 로커스 및 기능성 인간 Ig 로커스를 갖는 비-인간 포유동물 숙주를 개시하고 있다. 미국 특허 5,939,598은 내인성 중쇄가 결여되어 있으며, 하나 이상의 이종 (xenogeneic) 불변 구역을 포함하는 외인성 면역글로불린 로커스를 발현하는 트랜스제닉 마우스를 만드는 방법을 개시하고 있다.
상기한 바와 같은 트랜스제닉 동물을 사용하여, 선택된 항원성 분자에 대하여 면역 반응을 유발시킬 수 있으며, 항체 생산 세포를 동물로부터 회수하여 인간 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마를 생성시킬 수 있다. 면역화 프로토콜, 아주반트 등은 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어 WO 96/33735에 기재된 바와 같이 트랜스제닉 마우스를 면역화시키는데 사용된다. 이 공개 문헌은 각종 항원성 분자, 예를 들어, IL6, IL8, TNFa, 인간 CD4, L 셀렉틴, gp39, 및 파상풍 독소 등에 대한 모노클로날 항체를 개시하고 있다. 모노클로날 항체는 상응하는 단백질의 생물학적 활성 또는 생리학적 효과를 억제 또는 중화하는 능력에 대해 시험될 수 있다. WO 96/33735는 IL-8로 면역화된 트랜스제닉 마우스의 면역 세포로부터 유도된, IL-8에 대한 모노클로날 항체가 호중구의 IL-8 유도된 기능을 차단하는 것을 개시하고 있다. 트랜스제닉 동물을 면역화하는 데 사용된 항원에 대한 특이성을 갖는 인간 모노클로날 항체는 또한 WO 96/34096 및 미국 특허 출원 20030194404; 및 미국 특허 출원 20030031667에 개시되어 있다. 또한, 문헌 ([Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993)]; [Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993)]; [Bruggermann et al., Year in Immune, 7:33 (1993)]; 및 미국 특허 5,591,669, 미국 특허 5,589,369, 미국 특허 5,545,807; 및 미국 특허 출원 20020199213, WO96/34096 및 미국 특허 출원 20030194404; 및 미국 특허 출원 20030031667)을 참조할 수 있다.
모노클로날 항체를 만드는 데 유용한 또다른 트랜스제닉 동물은 메다렉스 (Medarex) HuMAb-MOUSE® (미국 특허 5,770,429 및 문헌 [Fishwild, et al., Nat. Biotechnol. 14:845-851, 1996])를 포함하며, 이는 인간 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는, 재배열되지 않은 인간 항체 유전자로부터의 유전자 서열을 함유한다. HuMAb-MOUSE®를 면역화시킴으로써 표적 단백질에 대한 모노클로날 항체를 생산할 수 있다.
또한, 문헌 (Ishida et al., Cloning Stem Cells. 4:91-102, 2002)은 인간 DNA의 메가염기-크기의 세그먼트를 포함하며 전체 인간 면역글로불린 (hIg) 로커스를 포함하는 트랜스크로모 마우스 (TransChromo Mouse; TCMOUSE™)를 개시하고 있다. TCMOUSE는 IgG의 모든 서브클래스 (IgG1-G4)를 포함하는, hIg의 완전히 다양한 레퍼토리를 갖는다. TC MOUSE를 각종 인간 항원으로 면역화시키면 인간 항체를 포함하는 항체 반응이 일어난다.
미국 특허 출원 20030092125는 동물의 면역 반응을 목적하는 에피토프로 바이어싱하는 방법을 기재하고 있다. 인간 항체는 시험관 내에서 활성화된 B 세포에 의해 생산될 수도 있다 (미국 특허 5,567,610 및 5,229,275).
파지 디스플레이 기술에 의한 항체
재조합 인간 항체 유전자의 레퍼토리를 만드는 기술 및 코딩된 항체 단편을 필라멘트성 박테리오파지의 표면 상에 디스플레이하는 기술의 개발은 인간 항체를 직접 만들고 선택하는 재조합 수단을 제공하였으며, 이 기술은 또한 인간화, 키메라, 뮤린 또는 뮤테인 항체에도 적용될 수 있다. 파지 기술에 의해 생산된 항체는 세균 중 항원 결합 단편, 주로 Fv 또는 Fab 단편으로 생산되며, 따라서 효과기 기능이 없다. 효과기 기능은 다음 두 전략 중의 하나에 의해 도입될 수 있다: 단편을 포유동물 세포에서 발현시키기 위한 완전한 항체 내로, 또는 효과기 기능을 촉발할 수 있는 제2의 결합 부위를 갖는 이중특이적 항체 단편 내로 조작하여 넣는다.
일반적으로, 항체의 Fd 단편 (VH-CH1) 및 경쇄(VL-CL)를 PCR에 의해 별도로 클로닝하여, 조합 파지 디스플레이 라이브러리 내에 랜덤하게 재조합한 다음, 특정 항원에 대한 결합 여부에 대해 선택할 수 있다. Fab 단편은 파지 표면 상에 발현되며, 즉 그것을 코딩하는 유전자에 물리적으로 연결되어 있다. 따라서, 항원 결합에 의한 Fab의 선택은 Fab 코딩 서열을 동시에 선택하게 하며, 이는 후에 증폭될 수 있다. 패닝으로 불리는, 항원 결합 및 재증폭을 수 차례 수행함으로써, 항원에 특이적인 Fab가 농축되고, 최종적으로 단리된다.
1994년에, "가이디드 선택 (guided selection)"이라 불리는 항체의 인간화 방법이 설명되었다. 가이디드 선택은 마우스 모노클로날 항체를 인간화하기 위하여 파지 디스플레이 기술을 이용한다 (Jespers, L. S., et al., Bio/Technology 12, 899-903 (1994)). 이를 위해, 마우스 모노클로날 항체의 Fd 단편을 인간 경쇄 라이브러리와 함께 디스플레이할 수 있으며, 생성된 하이브리드 Fab 라이브러리를 항원을 사용하여 선택할 수 있다. 마우스 Fd 단편은 이와 같이 선택을 가이드하는 템플레이트 (template)를 제공한다. 후속적으로, 선택된 인간 경쇄가 인간 Fd 단편 라이브러리와 조합된다. 생성된 라이브러리의 선택으로 완전한 인간 Fab가 수득된다.
파지 디스플레이 라이브러리로부터 인간 항체를 유도하는 각종 방법이 문헌에 기재되어 있다 (예를 들어, [Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381 (1991)]; [Marks et al., J. Mol. Biol, 222:581-597 (1991)]; 미국 특허 5,565,332 및 5,573,905; [Clackson, T., and Wells, J. A., TIBTECH 12, 173-184 (1994)] 참조). 특히, 파지 디스플레이 라이브러리로부터 유도된 항체를 시험관 내에서 선택하고 전개시키는 것이 강력한 수단이 되었다 ([Burton, D. R., and Barbas III, C. F., Adv. Immunol. 57, 191-280 (1994)]; 및 [Winter, G., et al., Annu. Rev. Immunol. 12, 433-455 (1994)]; 미국 특허 출원 20020004215 및 WO 92/01047; 미국 특허 출원 20030190317 (2003년 10월 9일 공개) 및 미국 특허 6,054,287; 미국 특허 5,877,293).
왓킨스의 문헌 (Watkins, "Screening of Phage-Expressed Antibody Libraries by Capture Lift," Methods in Molecular Biology, Antibody Phage Display: Methods and Protocols 178: 187-193) 및 미국 특허 출원 200120030044772 (2003년 3월 6일 공개)는 캡쳐 리프트에 의해 파지 발현 항체 라이브러리 또는 다른 결합 분자를 스크리닝하는 방법을 기재하고 있는데, 이 방법은 후보 결합 분자를 고체 지지체 상에 고정시키는 것을 포함한다.
항체 생성물은 본 명세서 중 "스크리닝 방법"란에 기재되었거나 당업계에 알려진 적절한 분석법을 사용하여 활성 및 본 발명의 치료 방법에서의 적합성에 대해 스크리닝될 수 있다.
아미노산 서열 뮤테인
본 발명의 항체는 목적하는 결합 친화도 또는 생물학적 활성을 보유하는 한 모 항체의 뮤테인을 포함하는데, 이들에서 모 항체의 폴리펩티드 서열은 CDR 내를 포함하여 가변 구역 내 또는 가변 구역에 동등한 부분 내에서 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 삽입에 의해 변경되어 있다. 뮤테인은 모 항체에 실질적으로 상동성이거나 실질적으로 동일할 수 있으며, 예를 들어, 적어도 65％, 70％, 75％, 80％, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 100％ 동일성 또는 상동성일 수 있다. 이 서열과 관련하여 동일성 또는 상동성은 본 명세서에서 서열들을 정렬하고 최대 서열 동일성 퍼센트를 달성하기 위해 필요에 따라 갭 (gap)을 도입한 후에 (임의의 보존적 치환은 서열 동일성의 부분으로서 고려하지 않음), 모 서열과 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 퍼센트로서 정의된다. 항체 서열 내로의 N-말단, C-말단 또는 내부 연장, 결실 또는 삽입 중 어느 것도 서열 동일성 또는 상동성에 영향을 주는 것으로 간주되지 않는다. 따라서, 서열 동일성은 두 폴리펩티드에서 아미노산 위치의 유사성을 비교하는 데 통상적으로 사용되는 표준 방법에 의해 결정될 수 있다. BLAST 또는 FASTA와 같은 컴퓨터 프로그램을 사용하여, 두 폴리펩티드를 그들 각각의 아미노산의 최적 매칭 (matching)을 위해 정렬시킨다 (하나 또는 두 서열의 전 길이를 따라서, 또는 하나 또는 두 서열의 예정된 부분을 따라서). 이 프로그램은 디폴트 오프닝 패널티 (default opening penalty)와 디폴트 갭 패널티를 제공하며, PAM 250 [표준 스코어링 매트릭스; [Dayhoff et al., in Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, supp. 3 (1978)] 참조]와 같은 스코어링 매트릭스를 컴퓨터 프로그램과 함께 사용할 수 있다. 예를 들어, 퍼센트 동일성을 다음과 같이 계산할 수 있다: 동일한 매치의 총수에 100을 곱한 것을, 매칭된 스팬 내의 보다 긴 서열의 길이와 두 서열을 정렬시키기 위해 보다 긴 서열 내로 도입된 갭의 수의 합으로 나눈다.
본 발명의 항체는 또한 불변 구역의 폴리펩티드 서열 내에 변화를 포함할 수 있는데, 이와 같은 변화는 결합 친화도에는 영향을 미치지 않지만, 항체 의존적 세포성 세포독성 (ADCC), 보체 의존적 세포독성 (CDC) 또는 제거 및 흡수 (및 반감기에 대한 결과적인 효과)와 같은 효과기 기능을 변화시킬 수 있다.
삽입
아미노산 서열 삽입은 길이가 하나의 잔기에서 백 개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드에 이르는 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합뿐만 아니라 하나 또는 여러 개의 아미노산 잔기, 예를 들어, 2, 3 또는 그 이상의 아미노산 잔기의 서열 내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체, 또는 에피토프 태그 또는 샐비지 (salvage) 수용체 에피토프에 융합된 항체 (항체 단편 포함)를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입형 뮤테인은 글리코실화 부위의 부가, 분자내 또는 분자간 결합을 위한 시스테인 부가, 또는 예를 들어 N-말단 또는 C-말단에서 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드에 대한 융합을 포함한다. 예를 들어, 안정성을 개선시키기 위해 (특히, 항체가 Fv 단편과 같은 항체 단편인 경우), 항체에 시스테인 결합(들)을 부가할 수 있다.
항체의 글리코실화는 일반적으로 N-연결 또는 O-연결된다. N-연결은 아스파라긴 잔기의 측쇄에 대한 탄수화물 모이어티의 부착을 의미한다. 트리펩티드 서열, 즉 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은 아스파라긴 측쇄에 대한 탄수화물 모이어티의 효소에 의한 부착을 위한 인식 서열을 의미한다. 폴리펩티드 내의 상기 트리펩티드 서열의 존재는 효능있는 글리코실화 부위를 생성시킨다. 따라서, N-연결 글리코실화 부위는 하나 이상의 이들 트리펩티드 서열을 함유하도록 아미노산 서열을 변경하여 부가될 수 있다. O-연결 글리코실화는 히드록시아미노산, 가장 일반적으로는 세린 또는 트레오닌에 대한 당 N-아세일갈락토사민, 갈락토스, 또는 크실로스 중의 하나의 부착을 의미하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시라이신도 사용될 수 있다. O-연결 글리코실화 부위는 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 본래의 항체 서열에 삽입 또는 치환하여 항체에 부가될 수 있다.
용어 "에피토프 태깅된 (tagged)"은 에피토프 태그에 융합된 항체를 나타낸다. 에피토프 태그 폴리펩티드는 그에 대해 작용하는 항체가 만들어질 수 있는 에피토프를 제공하기에 충분한 잔기를 갖지만 항체의 활성을 간섭하기에는 너무 짧다. 에피토프 태그는 바람직하게는 그에 대해 작용하는 항체가 실질적으로 다른 에피토프와 교차 반응하지 않을 정도로 충분히 특유하여야 한다. 적절한 태그 폴리펩티드는 일반적으로 6 개 이상의 아미노산 잔기, 대체로 약 8 내지 50 개의 아미노산 잔기 (바람직하게는 약 9 내지 30 개의 잔기)를 갖는다. 태그의 예는 flu HA 태그 폴리펩티드 및 그의 항체 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol. 8: 2159-2165 (1988)]; c-myc 태그 및 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 및 9E10 항체 [Evan et al., Mol. Cell. Biol. 5(12): 3610-3616 (1985)]; 단순 헤르페스 바이러스 당단백질 D (gD) 태그 및 그의 항체 [Paborsky et al., Protein Engineering 3(6): 547-553 (1990)]를 포함한다. 다른 태그의 예로서 니켈 킬레이션을 사용하여 그와 같이 표지된 화합물의 단리를 가능하게 하는, 일반적으로 약 6개의 히스티딘 잔기로 이루어진 폴리-히스티딘 서열이 있다. 다른 표지 및 태그, 예를 들어, FLAG® 태그 (이스트만 코닥 (Eastman Kodak, 미국 뉴욕주 로체스터))가 잘 알려져 있으며, 당업계에서 통상적으로 사용되고 있으며, 본 발명에 포함된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "샐비지 수용체 결합 에피토프"는 IgG 분자의 생체내 혈청 반감기를 증가시키는 역할을 하는, IgG 분자 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4)의 Fc 구역의 에피토프를 의미한다.
결실
아미노산 서열 결실은 결과적으로 표적 항원에 대한 결합 친화도를 보유하는 단편을 생성시키는, 길이가 하나 내지 백 개 또는 그 이상의 잔기에 이르는 아미노- 및/또는 카르복시-말단 결실뿐만 아니라 하나 또는 여러 아미노산 잔기, 예를 들어, 2, 3 또는 그 이상의 아미노산 잔기의 서열 내의 결실을 포함한다. 예를 들어, 글리코실화 부위는 트리펩티드 또는 다른 글리코실화 인식 서열의 전부 또는 일부를 제거하여 결실되거나 다른 위치로 이동될 수 있다.
치환
뮤테인의 다른 형태는 아미노산 치환 뮤테인이다. 이들 뮤테인은 항체 분자 내의 적어도 하나의 아미노산 잔기가 제거되고 그 자리에 다른 잔기가 삽입된 것이다. 임의의 초가변 또는 CDR 구역 또는 프레임워크 구역 내의 치환 돌연변이 유발이 고려될 수 있다. 보존적 치환은 표 2에 나타나 있다. 가장 보존적인 치환은 "바람직한 치환"이라는 항목 아래에 있다. 상기 치환이 생물학적 활성에 아무런 변화를 가져오지 않을 때, 표 2에서 "예시적인 치환"이라고 나타내거나 또는 하기에서 아미노산 클래스와 관련하여 기재된 것과 같은 보다 실질적인 변화를 도입하고, 생성물을 스크리닝할 수 있다.
처음 잔기 예시적인 치환 바람직한 잔기 치환
Ala (A) val; leu; ile val
Arg (R) lys; gln; asn lys
Asn (N) gln; his; asp; lys; gln arg
Asp (D) glu; asn glu
Cys (C) ser; ala ser
Gln (Q) asn; glu asn
Glu (E) asp; gln asp
Gly (G) ala
His (H) asn; gln; lys; arg
Ile (I) leu; val; met; ala; phe; 노르류신 leu, 노르류신
Leu (L) 노르류신; ile; val; met; ala; phe ile
Lys (K) arg; gln; asn arg
Met (M) leu; phe; ile leu
Phe (F) leu; val; ile; ala; tyr
Pro (P) ala
Ser (S) thr
Thr (T) ser ser
Trp (W) tyr; phe tyr
Tyr (Y) trp; phe; thr; ser phe
Val (V) ile; leu; met; phe; ala; 노르류신 leu
항체의 생물학적 특성의 실질적인 변형은 (a) 예를 들어, 시트 또는 나선 입체형태로서의 치환 영역 내의 폴리펩티드 백본의 구조, (b) 표적 부위의 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 대부분의 측쇄를 유지하는 것에 대한 그의 효과가 크게 상이한 치환을 선택함으로써 달성된다. 자연 발생 잔기는 통상적인 측쇄 특성을 기초로 하여 다음 군으로 분류된다.
(1) 소수성: 노르뉴신, met, ala, val, leu, ile;
(2) 중성 친수성: cys, ser, thr;
(3) 산성: asp, glu;
(4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg;
(5) 사슬 배향에 영향을 주는 잔기: gly, pro; 및
(6) 방향족: trp, tyr, phe.
보존적 치환은 아미노산을 같은 클래스의 다른 아미노산으로 교체하는 것을 포함한다. 비보존적 치환은 어느 한 클래스의 아미노산을 다른 클래스의 아미노산으로 교체하는 것을 포함한다.
또한, 항체의 적절한 입체형태를 유지하는 데 관여하지 않는 임의의 시스테인 잔기는 분자의 산화 안정성을 개선하고 비정상적 가교결합을 방지하기 위해, 일반적으로 세린으로 치환될 수 있다.
친화도 성숙은 일반적으로 모 항체의 CDR 내에 치환을 갖는 항체 뮤테인을 제조 및 스크리닝하고, 모 항체에 비하여 결합 친화도와 같은 생물학적 특성이 개선된 뮤테인을 선택하는 것을 포함한다. 그러한 치환 뮤테인을 생산하는 편리한 방법은 파지 디스플레이를 사용한 친화도 성숙이다. 간단히 설명하면, 수 개의 초가변 구역 부위 (예를 들어, 6 내지 7 개의 부위)를 변이시켜 각 부위에서 모든 가능한 아미노산 치환을 생성시킨다. 이와 같이 생성된 항체 뮤테인을 각 입자 내에 패키징된 M13의 유전자 III 생성물에 대한 융합체로서 필라멘트성 파지 입자로부터 1가 방식으로 디스플레이한다. 이어서, 파지-디스플레이된 뮤테인을 그의 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화도)에 대해 스크리닝한다 (예를 들어, WO 92/01047, WO 93/112366, WO 95/15388 및 WO 93/19172 참조).
현재의 항체 친화도 성숙 방법은 두 가지 돌연변이 유발 카테고리, 즉, 확률론적 (stochastic) 및 비확률론적 (nonstochastic) 방법에 속한다. 오류 유발 (error prone) PCR, 변이유발 (mutator) 세균주 (Low et al., J. Mol. Biol. 260, 359-68, 1996) 및 포화 돌연변이 유발 ([Nishimiya et al., J. Biol. Chem. 275:12813-20, 2000]; [Chowdhury, P. S. Methods Mol. Biol. 178, 269-85, 2002])은 확률론적 돌연변이 유발 방법의 전형적인 예이다 (Rajpal et al., Proc Natl Acad Sci USA. 102:8466-71, 2005). 비확률론적 기술은 종종 특이적 뮤테인의 제한된 컬렉션을 얻기 위하여 알라닌-스캐닝 또는 부위 지정 돌연변이 유발을 이용한다. 몇몇 방법을 하기 상세히 설명한다.
패닝 방법을 통한 친화도 성숙 - 재조합 항체의 친화도 성숙은 통상적으로는 감소하는 양의 항원의 존재 하에 후보 항체를 몇 차례 패닝하여 수행한다. 회마다 항원의 양을 감소시켜 항원에 대해 가장 높은 친화도를 갖는 항체를 선택함으로써, 출발 물질의 대형 풀 (pool)로부터 높은 친화도의 항체를 수득한다. 패닝을 통한 친화도 성숙은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 문헌 (Huls et al., Cancer Immunol Immunother. 50:163-71, 2001)에 기재되어 있다. 파지 디스플레이 기술을 이용한 친화도 성숙 방법은 본 명세서에 기재되고 당업계에 알려져 있다 (예를 들어, [Daugherty et al., Proc Natl Acad Sci USA. 97:2029-34, 2000] 참조).
룩- 쓰루 ( Look - through ) 돌연변이 유발 - 룩-쓰루 돌연변이 유발 (LTM) (Rajpal et al., Proc Natl Acad Sci USA. 102:8466-71, 2005)은 항체-결합 부위를 신속히 매핑하는 방법을 제공한다. LTM에 있어서, 20 개의 천연 아미노산에 의해 제공되는 주요한 측쇄 화학적 성질을 나타내는 9 종의 아미노산을 선택하여 항체의 6개의 CDR 모두 내의 각 위치에서 결합에 대한 기능적 측쇄의 기여도를 상세히 분석한다. LTM은 CDR 내의 위치상 일련의 단일 돌연변이를 일으키는데, 여기서 각 "야생형" 잔기는 선택된 9개의 아미노산 중의 하나로 체계적으로 치환된다. 돌연변이된 CDR을 조합하여 모든 뮤테인의 정량적 디스플레이가 가능한 상태에서 증가하는 복잡성 및 크기의 조합 단일쇄 가변 단편 (scFv) 라이브러리를 생산한다. 양성 선택 후에, 개선된 결합을 갖는 클론을 서열 결정하고, 유익한 돌연변이를 매핑한다.
오류 유발 PCR - 오류 유발 PCR은 다른 회차의 선택 과정 사이에서 핵산의 랜덤화를 포함한다. 랜덤화는 사용된 폴리머라제의 내재 에러율에 의해 낮은 비율로 일어나지만, 전사 중 높은 내재 에러율을 갖는 폴리머라제를 사용하는 오류 유발 PCR (Zaccolo et al., J. Mol. Biol. 285:775-783, 1999)에 의해 증가될 수 있다 (Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-96, 1992). 돌연변이 사이클 후에, 항원에 대한 개선된 친화도를 갖는 클론을 당업계에서 통상적인 방법으로 선택한다.
DNA 셔플링 ( shuffling ) - 핵산 셔플링은 변이체 폴리뉴클레오티드를 생산하기 위해 보다 짧거나 작은 폴리뉴클레오티드의 풀을 시험관 내에서 또는 생체 내에서 상동 재조합하는 방법이다. DNA 셔플링은 미국 특허 6,605,449, 미국 특허 6,489,145, WO 02/092780 및 문헌 (Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 91:10747-51 (1994))에 기재되어 있다. 일반적으로, DNA 셔플링은 3 단계로 이루어지는데, 셔플링될 유전자를 DNase I로 단편화하는 단계, 단편을 랜덤 혼성화하고 단편화 유전자를 DNA 폴리머라제 존재 하의 PCR (섹슈얼 (sexual) PCR)에 의해 재조립 또는 충전하는 단계 및 재조립된 생성물을 통상적인 PCR로 증폭시키는 단계이다.
DNA 셔플링은 오류 유발 PCR과 역 연쇄 반응이라는 점에서 다르다. 오류 유발 PCR에서, 폴리머라제 개시 부위의 수와 분자의 수는 지수적으로 증가한다. 이와 대조적으로, 랜덤 폴리뉴클레오티드의 핵산 재조립 또는 셔플링에서 개시 부위의 수 및 랜덤 폴리뉴클레오티드의 수 (크기가 아님)는 시간이 지남에 따라 감소한다.
항체의 경우에, DNA 셔플링은 예를 들어 모든 CDR1이 모든 CDR2와 또한 모든 CDR3과 자유롭게 조합될 수 있게 한다. 같은 반응에서 다수의 서열 부류가 셔플링될 수 있음도 고려된다. 또한, 셔플링은 일반적으로 상대적인 순서를 보존하는데, 예를 들어, CDR1은 CDR2의 위치에서 발견되지 않는다. 극소수의 셔플란트 (shufflant)만이 다수의 최상의 (예를 들어, 최고 친화도) CDR을 포함할 것이며, 이들 극소수의 셔플란트는 그들의 월등한 친화도에 의해 선택될 수 있다.
DNA 셔플링에 사용될 수 있는 템플레이트 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA일 수 있다. 재조합 또는 재조립될 유전자 또는 보다 작거나 짧은 폴리뉴클레오티드 크기에 따라서 다양한 길이일 수 있다. 바람직하게는, 템플레이트 폴리뉴클레오티드는 50 bp 내지 50 kb이다. 템플레이트 폴리뉴클레오티드는 종종 이중 가닥이어야 한다.
유전자 선택의 초기 단계에, 템플레이트 폴리뉴클레오티드와 일치하는 구역 및 템플레이트 폴리뉴클레오티드와 다른 구역을 갖는 단일 가닥 또는 이중 가닥 핵산 폴리뉴클레오티드를 템플레이트 폴리뉴클레오티드에 부가할 수 있는 것이 고려된다. 또한, 초기 단계 동안 두 개의 상이하지만 관련된 폴리뉴클레오티드 템플레이트를 혼합할 수 있다.
알라닌 스캐닝 - 항원 결합에 유의하게 기여하는 초가변 구역 잔기를 확인하기 위해 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발을 수행할 수 있다 (Cunningham and Wells, Science 244: 1081-1085, 1989). 표적 잔기 또는 일군의 표적 잔기 (예를 들어, arg, asp, his, lys, 및 glu과 같은 하전된 잔기)를 확인하고, 중성 또는 음으로 하전된 아미노산 (가장 바람직하게는 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 치환하여 아미노산과 항원의 상호작용에 영향을 준다. 치환 부위를 위해 또는 치환 부위에 추가의 또는 다른 돌연변이를 도입하여 치환에 기능적 감수성을 나타내는 아미노산 위치들을 세밀하게 찾아낸다. 이와 같이, 아미노산 서열 변화를 도입할 부위는 미리 결정되지만, 돌연변이 자체의 특성은 미리 결정될 필요가 없다. 예를 들어, 주어진 부위에서 돌연변이의 결과를 분석하기 위하여, ala 스캐닝 또는 랜덤 돌연변이 유발을 표적 코돈 또는 구역에서 수행하고, 발현된 항체 뮤테인을 목적하는 활성에 대해 스크리닝한다.
컴퓨터 보조 설계 - 별법으로 또는 추가의 방법으로, 항체와 항원 사이의 접촉점을 확인하기 위해 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하거나, 그와 같은 접촉점을 모델링하기 위해 컴퓨터 소프트웨어를 사용하는 것이 유익할 수 있다. 그러한 접촉 잔기 및 인접 잔기는 본 명세서에 설명된 기술에 따른 치환을 위한 후보 위치이다. 일단 그러한 뮤테인이 생성되면, 뮤테인 패널을 본 명세서에 기재된 바와 같이 스크리닝하고, 하나 이상의 관련 분석에서 월등한 특성을 갖는 항체를 추후 개발을 위해 선택한다.
친화도 성숙은 모 항체의 CDR 내에 치환을 갖는 항체 뮤테인을 제조 및 스크리닝하고, 모 항체에 비하여 결합 친화도와 같은 생물학적 특성이 개선된 뮤테인을 선택하는 것을 포함한다. 그러한 치환 뮤테인을 생산하는 편리한 방법은 파지 디스플레이를 사용한 친화도 성숙이다. 간단히 설명하면, 수 개의 초가변 구역 부위 (예를 들어, 6 내지 7 개의 부위)를 돌연변이시켜 각 부위에서 모든 가능한 아미노산 치환을 생성시킨다. 이와 같이 생성된 항체 뮤테인을 각 입자 내에 패키징된 M13의 유전자 III 생성물에 대한 융합체로서 필라멘트성 파지 입자로부터 1가 방식으로 디스플레이한다. 파지-디스플레이된 뮤테인을 그들의 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화도)에 대해 스크리닝한다.
알라닌 스캐닝 돌연변이 유발은 결합에 유의하게 기여하는 초가변 구역 잔기를 확인하기 위해 수행할 수 있다. 별법으로 또는 추가의 방법으로, 항체와 항원 사이의 접촉점을 찾아내기 위해 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하는 것이 유익할 수 있다. 그러한 접촉 잔기 및 인접 잔기는 본 명세서에 설명된 기술에 따른 치환을 위한 후보 위치이다. 일단 그러한 뮤테인이 생성되면, 뮤테인 패널을 본 명세서에 기재된 바와 같이 스크리닝하고, 하나 이상의 관련 분석에서 월등한 특성을 갖는 항체를 추후 개발을 위해 선택한다.
변경된 효과기 기능
항체의 다른 변형을 고려할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체를 효과기 기능과 관련하여 변형시켜, 예를 들어, phB3-관련 질병 또는 질환을 치료하는 데 있어서 항체의 효과를 향상시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기(들)를 Fc 구역 내로 도입함으로써, 이 구역에서 사슬간 디술피드 결합을 형성할 수 있다. 이와 같이 제조된 동종이량체 항체는 개선된 내재화 능력 및/또는 증가된 보체 매개 세포 사멸 및 항체 의존적 세포성 세포독성 (ADCC)을 가질 수 있다 ([Caron et al., J. Exp Med. 176: 1191-1195 (1992)] 및 [Shopes, B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)]). 향상된 활성을 갖는 동종이량체 항체는 또한 문헌에 기재된 바와 같은 이종이기능성 가교결합제를 사용하여 제조될 수 있다 (Wolff et al., Cancer Research 53: 2560-2565 (1993)). 별법으로, 이중 Fc 구역을 가짐으로써 향상된 보체 분해 및 ADCC 성능을 갖는 항체를 조작할 수 있다 (Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989). 또한, CDR 내의 서열은 항체가 MHC 클래스 II에 결합하게 하여 원치 않는 헬퍼 T 세포 반응을 촉발하게 할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 보존적 치환은 항체가 결합 활성은 보유하지만 원치 않는 헬퍼 T 세포 반응을 촉발하는 능력은 상실하게 할 수 있다. 또한, 본원에 참고로 포함되는 문헌 (Steplewski et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1988;85(13):4852-6)은 뮤린 가변 구역이 인간 감마 1, 감마 2, 감마 3, 및 감마 4 불변 구역에 결합된 키메라 항체를 기재하고 있다.
본 발명의 특정 실시태양에서, 무손상 항체를 사용하는 것보다 항체 단편을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 이 경우에, 예를 들어, 그의 혈청 반감기를 증가시키기 위해, 예를 들어 PEG 또는 다당류 중합체를 포함하는 다른 수용성 중합체와 같은 분자를 항체 단편에 부가하여 항체 단편을 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 반감기 증가는 예를 들어 항체 단편 내로 샐비지 수용체 결합 에피토프를 도입하여 (예를 들어, 항체 단편 내의 적절한 구역을 돌연변이시키거나, 에피토프를 펩티드 태그 내로 포함시킨 후, 이를 항체 단편에 어느 한 쪽 말단 또는 중간에, 예를 들어 DNA 또는 펩티드 합성에 의해 융합시켜) 달성할 수 있다 (예를 들어, WO 96/32478 참조).
샐비지 수용체 결합 에피토프는 바람직하게는 Fc 도메인의 하나 또는 두 루프로부터의 임의의 하나 이상의 아미노산 잔기가 항체 단편의 유사한 위치로 이동된 구역을 구성한다. 훨씬 더 바람직하게는, Fc 도메인의 하나 또는 두 루프로부터의 세 개 이상의 잔기가 이동된다. 보다 더 바람직하게는, 에피토프는 Fc 구역 (예를 들어, IgG의)의 CH2 도메인으로부터 취해져, CH1, CH3 또는 VH 구역, 또는 둘 이상의 상기 구역으로 이동된다. 별법으로, 에피토프는 Fc 구역의 CH2 도메인으로부터 취해져, 항체 단편의 CL 구역 또는 VL 구역 또는 둘 모두로 이동된다. 또한, 국제 특허 출원 공개 WO 97/34631 및 WO 96/32478는 Fc 변이체 및 그의 샐비지 수용체와의 상호작용을 기재하고 있다.
따라서, 본 발명의 항체는 인간 Fc 부분, 인간 컨센서스 Fc 부분, 또는 Fc 샐비지 수용체와 상호작용할 수 있는 능력을 보유한 그의 뮤테인을 포함할 수 있으며, 뮤테인은 디술피드 결합에 관여하는 시스테인이 변형 또는 제거되고/되거나 메티오닌이 N-말단에 부가되고/되거나 N-말단 20개 아미노산 중 하나 이상이 제거되고/되거나 보체와 상호작용하는 구역, 예를 들어, C1q 결합 부위가 제거되고/되거나 ADCC 부위가 제거된 뮤테인을 포함한다 (예를 들어, [Molec. Immunol. 29 (5): 633-9 (1992)] 참조). IgG 클래스의 항체는 또한 상이한 불변 구역을 포함할 수 있으며, 예를 들어, IgG2 항체를 변형시켜 IgG1 또는 IgG4 불변 구역을 제시하게 할 수 있다.
IgG1의 경우에, 특히 힌지 또는 CH2 구역과 같은 불변 구역의 변형은 ADCC 및/또는 CDC 활성과 같은 효과기 기능을 증가시키거나 감소시킬 수 있다. 다른 실시태양에서, IgG2 불변 구역을 변형시켜 항체-항원 응집체 형성을 감소시킨다. IgG4의 경우, 불변 구역, 특히 힌지 구역의 변형은 반-항체의 형성을 감소시킬 수 있다. 예시적인 특정 실시태양에서, IgG4 힌지 서열 Cys-Pro-Ser-Cys를 IgG1 힌지 서열 Cys-Pro-Pro-Cys로 변이시킨다.
이전의 연구는 FcR에 대한 인간 및 뮤린 IgG 상의 결합 부위를 주로 IgG 잔기 233-239로 이루어진 낮은 힌지 구역에 매핑하였다. 다른 연구는 추가의 넓은 세그먼트, 예를 들어, 인간 Fc 수용체 I에 대해 Gly316-Lys338, 인간 Fc 수용체 III에 대해 Lys274-Arg301 및 Tyr407-Arg416을 제안하거나, 낮은 힌지 구역 바깥쪽의 몇몇 특이적 잔기, 예를 들어, 뮤린 IgG2b가 뮤린 Fc 수용체 II와 상호작용하는 Asn297 및 Glu318을 발견하였다. 인간 IgG1 Fc 단편과 인간 Fc 수용체 IIIA의 3.2-Å 결정 구조의 보고는 IgG1 잔기 Leu234-Ser239, Asp265-Glu269, Asn297-Thr299, 및 Ala327-Ile332가 Fc 수용체 IIIA에 대한 결합에 관여하는 것으로 기술하였다. 결정 구조에 기초하여, 낮은 힌지 (Leu234-Gly237)뿐만 아니라 IgG CH2 도메인 루프 FG (잔기 326-330) 및 BC (잔기 265-271) 내의 잔기가 Fc 수용체 IIA에 대한 결합에서 역할을 수핼할 수 있을 것이라고 제시되었다 (그 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Shields et al., J. Biol. Chem., 276(9):6591-6604 (2001)] 참조). Fc 수용체 결합 부위 내의 잔기의 돌연변이는 변화된 효과기 기능, 예를 들어, 변화된 ADCC 또는 CDC 활성, 또는 변화된 반감기를 야기할 수 있다. 상기한 바와 같이, 가능한 돌연변이는 하나 이상의 잔기의 삽입, 결실 또는 치환을 포함하며, 치환은 또한 알라닌으로의 치환, 보존적 치환, 비보존적 치환, 또는 다른 IgG 서브클래스에서 동일한 위치에 있는 상응하는 잔기로의 치환 (예를 들어, IgG1 잔기를 그 위치에 있는 상응하는 IgG2 잔기로 교체)을 포함한다.
쉴즈 (Shields) 등은 모든 인간 Fc 수용체에 대한 결합에 관여하는 IgG1 잔기는 CH2 도메인 내에 힌지에 근접하여 위치하며, 다음의 두 카테고리로 분류된다고 보고하였다: 1) 모든 FcR과 직접 상호작용할 수 있는 위치는 Leu234-Pro238, Ala327, 및 Pro329 (및 가능하게는 Asp265)를 포함한다; 2) 탄수화물 특성 또는 위치에 영향을 주는 위치는 Asp265 및 Asn297을 포함한다. Fc 수용체 II에 대한 결합에 영향을 주는 추가의 IgG1 잔기는 다음과 같다: (최대 효과) Arg255, Thr256, Glu258, Ser267, Asp270, Glu272, Asp280, Arg292, Ser298, 및 (더 적은 효과) His268, Asn276, His285, Asn286, Lys290, Gln295, Arg301, Thr307, Leu309, Asn315, Lys322, Lys326, Pro331, Ser337, Ala339, Ala378 및 Lys414. A327Q, A327S, P329A, D265A 및 D270A는 결합을 감소시켰다. 모든 FcR에 대하여 상기 밝혀진 잔기 외에, Fc 수용체 IIIA에 대한 결합을 40％ 이상 감소시키는 IgG1 잔기는 다음과 같다: Ser239, Ser267 (단지 Gly), His268, Glu293, Gln295, Tyr296, Arg301, Val303, Lys338, 및 Asp376. FcRIIIA에 대한 결합을 개선시킨 뮤테인은 T256A, K290A, S298A, E333A, K334A, 및 A339T을 포함한다. Lys414는 FcRIIA 및 FcRIIB에 대한 결합에 있어 40％ 감소를, Arg416은 FcRIIA 및 FcRIIIA에 대한 결합에 있어 30％ 감소를, Gln419는 FcRIIA에 대해서는 30％ 감소를, FcRIIB에 대해서는 40％ 감소를, Lys360은 FcRIIIA에 대해서 23％ 개선을 나타냈다 (Presta et al., Biochem. Soc. Trans. (2001) 30, 487-490).
예를 들어, 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 6,194,551은 아미노산 위치 329, 331 또는 322 (카바트 넘버링 사용)에서 인간 IgG Fc 구역에 돌연변이를 함유하는, 효과기 기능이 변화된 뮤테인을 기재하고 있는데, 그들 중 일부는 감소된 C1q 결합 또는 CDC 활성을 나타낸다. 다른 예로서, 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 6,737,056은 아미노산 위치 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 또는 439 (카바트 넘버링 사용)에서 인간 IgG Fc 구역에 돌연변이를 함유하는, 효과기 기능 또는 Fc-감마-수용체 결합이 변화된 뮤테인을 기재하고 있는데, 그들 중 일부는 감소된 ADCC 또는 CDC 활성과 관련된 수용체 결합 프로파일을 나타낸다. 이들 중, 아미노산 위치 238, 265, 269, 270, 327 또는 329에서의 돌연변이는 FcRI에 대한 결합을 감소시키고, 아미노산 위치 238, 265, 269, 270, 292, 294, 295, 298, 303, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 373, 376, 414, 416, 419, 435, 438 또는 439에서의 돌연변이는 FcRII에 대한 결합을 감소시키고, 아미노산 위치 238, 239, 248, 249, 252, 254, 265, 268, 269, 270, 272, 278, 289, 293, 294, 295, 296, 301, 303, 322, 327, 329, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 416, 434, 435 또는 437에서의 돌연변이는 FcRIII에 대한 결합을 감소시키는 것으로 기재되어 있다.
그 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 5,624,821은 뮤린 항체의 C1q 결합 활성이 중쇄의 아미노산 잔기 318, 320 또는 322를 돌연변이시켜 변경될 수 있으며, 잔기 297 (Asn)의 교체는 용해 활성의 제거를 가져온다고 보고하고 있다.
그 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 출원 20040132101은 아미노산 위치 240, 244, 245, 247, 262, 263, 266, 299, 313, 325, 328 또는 332 (카바트 넘버링 사용)에서, 또는 아미노산 위치 234, 235, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 269, 296, 297, 298, 299, 313, 325, 327, 328, 329, 330 또는 332 (카바트 넘버링 사용)에서 돌연변이를 갖는 뮤테인을 기재하고 있으며, 이 중 위치 234, 235, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 269, 296, 297, 298, 299, 313, 325, 327, 328, 329, 330 또는 332에서의 돌연변이는 ADCC 활성을 감소시키거나 또는 Fc 감마 수용체에 대한 결합을 감소시킬 수 있는 것으로 기재하고 있다.
그 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Chappel et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1991;88(20):9036-40]에서는 IgG1의 세포 친화 (cytophilic) 활성은 그의 중쇄 CH2 도메인의 고유한 특성임을 보고하고 있다. IgG1의 임의의 아미노산 잔기 234-237에서의 단일 점 돌연변이는 그의 활성을 유의하게 저하 또는 소멸시켰다. 완전한 결합 활성을 회복하기 위해서 모든 IgG1 잔기 234-237 (LLGG)을 IgG2 및 IgG4로 치환하는 것이 필요하였다. 전체 ELLGGP 서열 (잔기 233-238)을 함유하는 IgG2 항체는 야생형 IgG1보다 활성인 것으로 관찰되었다.
그 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 (Isaacs et al., J Immunol. 1998;161(8):3862-9)은 FcγR 결합에 중요한 모티프 내의 돌연변이 (글루타메이트 233을 프롤린으로, 류신/페닐알라닌 234를 발린으로, 및 류신 235를 알라닌으로)가 표적 세포의 고갈을 완전히 막는 것으로 보고하고 있다. 글루타메이트 318의 알라닌으로의 돌연변이는 마우스 IgG2b의 효과기 기능을 제거하고, 또한 인간 IgG4의 효능을 감소시켰다.
그 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 (Armour et al., Mol Immunol. 2003;40(9):585-93)은 활성화 수용체 FcγRIIa와는 야생형 IgG1보다 10배 이상 덜 효율적으로 반응하지만, 억제 수용체 FcγRIIb에 대한 결합은 단지 4배 감소된 IgG1 뮤테인을 확인하였다. 돌연변이는 아미노산 위치 233-236의 구역 및/또는 아미노산 위치 327, 330 및 331에서 만들어졌다. 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 WO 99/58572를 또한 참조할 수 있다.
그 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 (Xu et al., J Biol Chem. 1994;269(5):3469-74)은 IgG1 Pro331을 Ser으로 돌연변이시키는 것이 C1q 결합을 현저하게 감소시키고, 실질적으로 용해 활성을 제거하는 것으로 보고하고 있다. 이와 대조적으로, IgG4에 Ser331 대신에 Pro를 사용하면 IgG4 Pro331 뮤테인에 부분적 용해 활성 (40％)을 부여하였다.
그 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 (Schuurman et al., Mol Immunol. 2001;38(1): 1-8)은 중쇄간 결합 형성에 관여하는 힌지 시스테인 중의 하나인 Cys226을 세린으로 돌연변이시키면 보다 안정한 중쇄간 결합이 형성된다고 보고하고 있다. IgG4 힌지 서열 Cys-Pro-Ser-Cys를 IgG1 힌지 서열 Cys-Pro- Pro-Cys으로 돌연변이시키는 것도 중쇄 사이의 공유 상호작용을 현저히 안정화시킨다.
그 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 (Angal et al., Mol Immunol. 1993;30(1): 105-8)은 IgG4에서 아미노산 위치 241의 세린을 프롤린 (IgG1 및 IgG2에서 같은 위치에서 발견됨)으로 돌연변이시키는 것이 균질한 항체를 생산할 뿐만 아니라 본래의 키메라 IgG4에 비해 혈청 반감기를 연장시키고 조직 분포를 개선하는 것으로 보고하고 있다.
본 발명은 또한 효과기 활성을 변경시키는 변경된 탄수화물 구조를 갖는 항체 분자, 예를 들어, 푸코실화가 없거나 감소되어 개선된 ADCC 활성을 나타내는 항체 분자를 생산하는 것을 고려한다. 이러한 목적을 달성하기 위한 여러 방법이 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, ADCC 효과기 활성은 항체 분자가 FcγRIII 수용체에 결합함으로써 매개되는데, 이는 CH2 도메인의 Asn-297에서의 N-연결된 글리코실화의 탄수화물 구조에 달려있다는 것이 밝혀졌다. 비-푸코실화 항체는 이 수용체에 증가된 친화도로 결합하여 천연 푸코실화 항체보다 더 효율적으로 FcγRIII 매개 효과기 기능을 촉발시킨다. 예를 들어, 알파-1,6-푸코실 트랜스퍼라제 효소가 녹 아웃된 CHO 세포에서 비-푸코실화 항체의 재조합 생산을 통해 100배 증가된 ADCC 활성을 갖는 항체를 얻었다 [Yamane-Ohnuki et al., Biotechnol Bioeng. 2004 Sep 5;87(5):614-22]. 예를 들어 siRNA 또는 안티센스 RNA 처리, 효소(들)을 녹아웃시키기 위한 세포주의 조작, 또는 선택적 글리코실화 억제제와 함께 배양하는 등의 방법으로, 푸코실화 경로에서 상기 효소 또는 다른 효소의 활성을 감소시켜 유사한 효과를 달성할 수 있다 [Rothman et al., Mol Immunol. 1989 Dec;26(12): 1113-23]. 몇몇 숙주 세포주, 예를 들어, Lec13 또는 래트 하이브리도마 YB2/0 세포주는 천연적으로 푸코실화 수준이 낮은 항체를 생산한다 ([Shields et al., J Biol Chem. 2002 Jul 26;277(30):26733-40]; [Shinkawa et al., J Biol Chem. 2003 Jan 31;278(5):3466-73]). GnTIII 효소를 과다발현하는 세포에서 항체를 재조합 생산하는 방법 등을 통해 이분 탄수화물의 수준을 증가시키는 것 또한 ADCC 활성을 증가시키는 것으로 결정되었다 (Umana et al., Nat Biotechnol. 1999 Feb;17(2):176-80). 두 개의 푸코스 잔기 중 단지 하나만 없어도 ADCC 활성을 증가시키기에 충분할 수 있을 것으로 예측되었다 (Ferrara et al., J Biol Chem. 2005 Dec 5).
다른 공유 변형
항체의 공유 변형도 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 변형은 화학적 합성 또는 적절한 경우 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 만들어질 수 있다. 항체의 다른 형태의 공유 변형은 항체의 표적 아미노산 잔기를 선택된 측쇄 또는 N- 또는 C-말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 반응시킴으로써 분자 내로 도입될 수 있다.
시스테이닐 잔기를 가장 통상적으로는 α-할로아세테이트 (및 상응하는 아민), 예를 들어, 클로로아세트산 또는 클로로아세트아미드와 반응시켜 카르복시메틸 또는 카르복시아미도메틸 유도체를 형성한다. 시스테이닐 잔기를 또한 브로모트리플루오로아세톤, α-브로모-β-(5-이미다졸릴)프로피온산, 클로로아세틸 포스페이트, N-알킬말레이미드, 3-니트로-2-피리딜 디술피드, 메틸 2-피리딜 디술피드, p-클로로머큐리벤조에이트, 2-클로로머큐리-4-니트로페놀, 또는 클로로-7-니트로벤조-2-옥사-1,3-디아졸과 반응시켜 유도체화한다.
히스티딜 잔기를 pH 5.5 내지 7.0에서 디에틸피로카르보네이트와 반응시켜 유도체화하는데, 이 반응제가 히스티딜 측쇄에 비교적 특이적이기 때문이다. 파라-브로모펜아실 브로마이드 또한 유용하며, 반응은 바람직하게는 0.1 M 나트륨 카코딜레이트 중에서 pH 6.0에서 수행한다.
리시닐 및 아미노-말단 잔기를 숙신산 또는 다른 카르복실산 무수물과 반응시킨다. 이들 반응제를 사용한 유도체화는 리시닐 잔기의 하전을 역전시키는 효과가 있다. 알파-아미노 함유 잔기를 유도체화하는 다른 적절한 시약은 메틸 피콜린이미데이트와 같은 이미도에스테르, 피리독살 포스페이트, 피리독살, 클로로보로히드라이드, 트리니트로벤젠술폰산, O-메틸이소우레아, 2,4-펜탄디온, 및 글리옥실레이트와의 트랜스아미나제-촉매 반응을 포함한다.
아르기닐 잔기는 하나 또는 수 종의 통상적인 시약, 예를 들어, 페닐글리옥살, 2,3-부탄디온, 1,2-시클로헥산디온 및 닌히드린 등과 반응시켜 변형한다. 아르기닌 잔기의 유도체화는 구아니딘 관능기의 높은 pKa 때문에 알칼리 조건에서 수행될 것을 필요로 한다. 또한, 이러한 시약은 아르기닌의 엡실론-아미노기뿐만 아니라 라이신의 기와도 반응할 수 있다.
티로실 잔기의 구체적인 변형으로 특히 주목되는 것은, 티로실 잔기를 방향족 디아조늄 화합물 또는 테트라니트로메탄과 반응시켜 티로실 잔기 내에 스펙트럼 표지를 도입하는 것이다. 가장 통상적으로는 N-아세틸이미디졸 및 테트라니트로메탄이 각각 O-아세틸 티로실 종 및 3-니트로 유도체를 형성하는 데 사용된다. 티로실 잔기는 방사성 면역 분석에 사용하기 위한 표지된 단백질을 제조하기 위해 125I 또는 131I로 요오드화된다.
카르복실 측쇄기 (아스파르틸 또는 글루타밀)는 카르보디이미드 (R-N=C=N-R'; 여기서 R 및 R'는 상이한 알킬기임), 예를 들어, 1-시클로헥실-3-(2-모르폴리닐-4-에틸)카르보디이미드 또는 1-에틸-3-(4-아조니아-4,4-디메틸펜틸)카르보디이미드와 반응시켜 선택적으로 변형시킨다. 또한, 아스파르틸 및 글루타밀 잔기를 암모늄 이온과 반응시켜 아스파라기닐 및 글루타미닐 잔기로 전환시킨다.
글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기는 종종 탈아미드화되어 각각 상응하는 글루타밀 및 아스파르틸로 전환된다. 이들 잔기는 중성 또는 염기성 조건 하에 탈아미드된다. 이들 잔기의 탈아미드 형태도 본 발명의 범위에 포함된다.
다른 변형은 프롤린 및 라이신의 히드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 히드록실기의 인산화, 라이신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 알파-아미노기의 메틸화 (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)), N-말단 아민의 아세틸화 및 임의의 C-말단 카르복실기의 아미드화를 포함한다.
다른 종류의 공유 변형은 항체에 글리코시드를 화학적으로 또는 효소적으로 커플링하는 것을 포함한다. 이들 절차는 N- 또는 O-연결된 글리코실화에 대한 글리코실화 능력을 갖는 숙주 세포 내에서 항체의 생산을 요구하지 않는다는 점에서 유리하다. 사용된 커플링 방식에 따라, 당(들)은 (a) 아르기닌 및 히스티딘; (b) 유리 카르복실기; (c) 유리 술프히드릴기, 예를 들어 시스테인의 것; (d) 유리 히드록실기, 예를 들어 세린, 트레오닌 또는 히드록시프롤린의 것; (e) 방향족 잔기, 예를 들어 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판의 것; 또는 (f) 글루타민의 아미드기에 부착될 수 있다. 이들 방법은 WO87/05330 (1987년 9월 11일 공개) 및 문헌 [Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)]에 기재되어 있다.
항체 상에 존재하는 임의의 탄수화물 모이어티의 제거는 화학적으로 또는 효소적으로 달성할 수 있다. 화학적 탈글리코실화는 항체를 화합물 트리플루오로메탄술폰산 또는 동등한 화합물에 노출시키는 것을 포함한다. 상기 처리는 항체를 무손상 상태로 유지하면서, 연결 당 (N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸갈락토사민)을 제외한 대부분의 또는 모든 당의 절단을 일으킨다. 화학적 탈글리코실화는 문헌 ([Hakimuddin, et al. Arch. Biochem. Biophys. 259: 52 (1987)] 및 [Edge et al. Anal. Biochem., 118: 131 (1981)])에 설명되어 있다. 항체 상의 탄수화물 모이어티의 효소적 절단은 문헌 [Thotakura et al. Meth. Enzymol. 138: 350 (1987)]에 설명된 바와 같이 다양한 엔도- 및 엑소-글리코시다제를 사용하여 달성할 수 있다.
다른 유형의 항체의 공유결합적 변형은 항체를 각종 비단백질성 중합체 중의 하나, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸화 폴리올, 폴리옥시에틸화 소르비톨, 폴리옥시에틸화 글루코스, 폴리옥시에틸화 글리세롤, 폴리옥시알킬렌, 또는 덱스트란과 같은 다당류 중합체에 결합시키는 것을 포함한다. 상기 방법은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어 미국 특허 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192, 4,179,337, 4,766,106, 4,179,337, 4,495,285, 4,609,546 또는 EP 315 456 참조).
각각의 항체 분자는 하나 이상의 (즉, 1, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의) 중합체 분자에 부착될 수 있다. 중합체 분자는 바람직하게는 항체에 링커 분자에 의해 부착된다. 중합체는 일반적으로 합성 또는 자연 발생 중합체일 수 있으며, 예를 들어, 임의로 치환된 직쇄 또는 분지쇄 폴리알켄, 폴리알케닐렌 또는 폴리옥시알킬렌 중합체 또는 분지 또는 비분지 다당류, 예를 들어, 호모- 또는 헤테로-다당류일 수 있다. 바람직한 중합체는 폴리옥시에틸렌 폴리올 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이다. PEG는 실온에서 수용성이며, 일반식 R(O-CH2-CH2)nO-R (여기서, R은 수소, 또는 알킬 또는 알칸올기와 같은 보호기임)을 갖는다. 바람직하게는 보호기는 1 내지 8 개의 탄소를 가지며, 보다 바람직하게는 메틸이다. 부호 n은 양의 정수, 바람직하게는 1 내지 1,000, 보다 바람직하게는 2 내지 500이다. PEG의 바람직한 평균 분자량은 1000 내지 40,000, 보다 바람직하게는 2000 내지 20,000, 가장 바람직하게는 3,000 내지 12,000이다. 바람직하게는, PEG는 적어도 하나의 히드록시기를 갖고, 보다 바람직하게는 히드록시기는 말단 히드록시기이다. 이 히드록시기가 바람직하게는 활성화되어 억제제 상의 유리 아미노기와 반응한다. 그러나, 공유 컨쥬게이팅된 PEG/본 발명의 항체를 얻기 위한 반응성 기의 유형 및 양이 상이할 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 바람직한 중합체 및 그를 펩티드에 부착시키는 방법은 모두 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 4,766,106; 4,179,337; 4,495,285; 및 4,609,546에 기재되어 있다.
유전자 요법
적절한 세포로 치료 항체를 전달하는 것은 당업계에 알려진 적절한 방법, 예를 들어, 물리적 DNA 전달 방법 (예를 들어, 리포좀 또는 화학적 처리)을 사용하거나 바이러스 벡터 (예를 들어, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스 또는 레트로바이러스)를 사용하여 생체외, 계내 또는 생체내에서 이루어질 수 있다. 예를 들어, 생체내 치료에서, 목적하는 항체를 코딩하는 핵산을 단독으로 또는 벡터, 리포좀 또는 침전물과 함께 대상에 직접 주사할 수 있으며, 일부 실시태양에서는 항체 화합물의 발현이 요구되는 부위에 주사할 수 있다. 생체외 치료에서, 대상의 세포를 채취하여, 핵산을 세포 내로 도입시킨 다음, 변형된 세포를 대상에 직접적으로 또는 환자 내로 이식되는 다공성 막 내에 캡슐화된 상태로 돌려보낸다 (예를 들어, 미국 특허 4,892,538 및 5,283,187 참조). 핵산을 생존가능한 세포 내로 도입하는 다양한 기술이 있다. 이 기술은 핵산이 시험관 내에서 배양된 세포로 전달되는지 또는 목적하는 숙주의 세포 내로 생체 내에서 전달되는지에 따라 상이하다. 핵산을 시험관 내에서 포유동물 세포 내로 전달하는 데 적절한 기술은 리포좀, 전기천공, 마이크로주사, 세포 융합, DEAE-덱스트란 및 인산칼슘 침전을 사용하는 것을 포함한다. 핵산의 생체외 전달에 통상적으로 사용되는 벡터는 레트로바이러스이다.
다른 생체내 핵산 전달 기술은 바이러스 벡터 (예를 들어, 아데노바이러스, 단순 헤르페스 I 바이러스, 또는 아데노-연관 바이러스) 및 지질-기재 시스템을 사용한 형질감염을 포함한다. 핵산 및 형질감염제는 경우에 따라 마이크로입자와 결합된다. 형질감염제의 예는 인산칼슘 또는 염화칼슘 동시침전, DEAE-덱스트란 매개 형질감염, 4급 암모늄 양쪽성 DOTMA ((디올레오일옥시프로필) 트리메틸암모늄 브로마이드, GIBCO-BRL에 의해 상표명 리포펙틴 (Lipofectin)으로 시판) ([Felgner et al, (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7413-7417]; [Malone et al. (1989) Proc. Natl Acad. Sci. USA 86 6077-6081]); 매달린 (pendant) 트리메틸암모늄 헤드가 있는 친지성 글루타메이트 디에스테르 (Ito et al. (1990) Biochem. Biophys. Acta 1023, 124-132); 대사가능한 모 지질, 예를 들어, 양이온성 지질 디옥타데실아미도 글리실스페르민 (DOGS, 트랜스펙탐, 프로메가 (Promega)) 및 디팔미토일포스파디딜 에탄올아밀스페르민 (DPPES) ([J. P. Behr (1986) Tetrahedron Lett. 27, 5861-5864]; [J. P. Behr et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6982-6986]); 대사 가능한 4급 암모늄 염 (DOTB, N-(1-[2,3-디올레오일옥시프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 메틸술페이트 (DOTAP) (뵈링거 만하임 (Boehringer Mannheim)), 폴리에틸렌이민 (PEI), 디올레오일 에스테르, ChoTB, ChoSC, DOSC (Leventis et al. (1990) Biochim. Inter. 22, 235-241); 3베타[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-카르바모일]콜레스테롤 (DC-Chol), 디올레오일포스파디딜 에탄올아민 (DOPE)/3베타[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-카르바모일]콜레스테롤 DC-Chol 1:1 혼합물 (Gao et al., (1991) Biochim. Biophys. Acta 1065, 8-14), 스페르민, 스페르미딘, 리포폴리아민 (Behr et al., Bioconjugate Chem, 1994, 5: 382-389), 친지성 폴리라이신 (LPLL) (Zhou et al., (1991) Biochim. Biophys. Acta 939, 8-18), 과량의 포스파디딜콜린/콜레스테롤과 함께 [[(1,1,3,3-테트라메틸부틸)크레족시]에톡시]에틸]디메틸벤질벤질암모늄 히드록시드 (DEBDA 히드록시드) (Ballas et al., (1988) Biochim. Biophys. Acta 939, 8-18), 세틸트리메틸암모늄 브로마이드 (CTAB)/DOPE 혼합물 (Pinnaduwage et al, (1989) Biochim. Biophys. Acta 985, 33-37), 글루탐산과 (TMAG)과 DOPE의 친지성 디에스테르, CTAB, DEBDA, 디도데실암모늄 브로마이드 (DDAB), 및 포스파디딜에탄올아민과 혼합된 스테아릴아민 (Rose et al., (1991) Biotechnique 10, 520-525), DDAB/DOPE (TransfectACE, BRL), 및 올리고갈락토스 함유 지질을 포함한다. 전달 효율을 증가시키는 형질감염 증진제의 예는 DEAE-덱스트란, 폴리브렌, 라이소좀-파괴 펩티드 (Ohmori N I et al, Biochem Biophys Res Commun Jun. 27, 1997;235(3):726-9), 콘드로이탄-기재 프로테오글리칸, 황산화 프로테오글리칸, 폴리에틸렌이민, 폴리라이신 (Pollard H et al. J Biol Chem, 1998 273 (13):7507-11), 인테그린-결합 펩티드 CYGGRGDTP, 선형 덱스트란 논사카라이드 (nonasaccharide), 글리세롤, 올리고뉴클레오티드의 3'-말단 뉴클레오시드간 결합에 매인 (tethered) 콜레스테릴기 (Letsinger, R. L. 1989 Proc Natl Acad Sci USA 86: (17):6553-6), 리소포스파타이드, 리소포스파티딜콜린, 리소포스파티딜에탄올아민 및 1-올레오일 리소포스파티딜콜린을 포함한다.
일부의 경우에, 핵산을 핵산 함유 벡터를 표적 세포로 유도하는 물질과 함께 전달하는 것이 바람직할 수 있다. 상기 "표적 유도" 분자는 표적 세포 상의 세포-표면 막 단백질에 특이적인 항체, 또는 표적 세포 상의 수용체에 대한 리간드를 포함한다. 리포좀이 사용되는 경우, 세포내 이입 (endocytosis) 작용과 관련된 세포-표면 막 단백질에 결합하는 단백질을 표적 유도를 위해 또는 흡수를 촉진하기 위해 사용할 수 있다. 상기 단백질의 예는 특정 세포 유형에 대해 친화성인 캡시드 단백질 및 그의 단편, 순환 중 내재화되는 단백질에 대한 항체, 세포내 편재를 표적으로 하고 세포내 반감기를 향상시키는 단백질을 포함한다. 다른 실시태양에서, 수용체 매개 세포내 이입을 이용할 수 있다. 상기 방법은 문헌 ([Wu et al., 1987] 또는 [Wagner et al., 1990])에 기재되어 있다. 현재 알려진 유전자 마킹 (marking) 및 유전자 요법 프로토콜에 대해서는 문헌 [Anderson 1992]을 참조한다 (또한 WO 93/25673 및 여기에 인용된 참조문 참조). 유전자 요법 기술에 대해서는 추가로 문헌 ([Friedmann, Science, 244: 1275-1281 (1989)]; [Anderson, Nature, supplement to vol. 392, no 6679, pp. 25-30 (1998)]; [Verma, Scientific American: 68-84 (1990)]; 및 [Miller, Nature, 357: 455460 (1992)]을 참조한다.
스크리닝 방법
본 발명의 또다른 측면은 EphB3을 항체와 접촉시키는 단계 및 항체가 EphB3 활성을 변화시키는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는, EphB3 활성을 감소시키는 항체를 확인하는 방법에 관한 것이다. 시험 항체 존재 하의 활성을 시험 항체 부재 하의 활성과 비교한다. 시험 항체를 함유하는 샘플 중에서의 활성이 시험 항체가 없는 샘플 중에서의 활성보다 낮은 경우, 항체가 활성을 상실시키거나 활성을 감소시킬 것이다. 유효한 치료는 심각한 독성이 없는 효율적인 치료제를 찾아내는 것에 달려있다. 항체는 당업계에 알려진 방법에 따라 결합 친화도에 대해 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, 겔-쉬프트 (gel-shift) 분석, 웨스턴 블롯, 방사선 표지된 경쟁 분석, 크로마토그래피에 의한 공-분획화, 공-침전, 가교 결합, ELISA 등이 사용될 수 있으며, 이 방법은 예를 들어 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 (Current Protocols in Molecular Biology (1999), Current Protocols in Immunology (2007) John Wiley & Sons, NY)에 기재되어 있다.
표적 항원 상의 목적하는 에피토프에 결합하는 항체를 초기에 스크리닝하기 위하여, 문헌 (Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988))에 기재된 것과 같은 통상적인 교차 차단 분석을 수행할 수 있다. 통상적인 경쟁 결합 분석을 또한 수행할 수 있는데, 여기서 미지의 항체를, 표적이 본 발명의 표적 특이적 항체에 결합하는 것을 억제하는 능력에 의해 특성화한다. 무손상 항원, 세포외 도메인과 같은 그의 단편, 또는 선형 에피토프를 사용할 수 있다. 에피토프 매핑은 문헌 (Champe et al., J. Biol. Chem. 270: 1388-1394 (1995))에 기재되어 있다.
시험관내 결합 분석의 한 변형으로서, 본 발명은 (a) 고정된 EphB3을 후보 항체와 접촉시키는 단계, 및 (b) 후보 항체의 EphB3에 대한 결합을 검출하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 다른 실시태양에서는, 후보 항체가 고정되고, EphB3의 결합을 검출한다. 고정은 당업계에 잘 알려진 임의의 방법을 사용하여 수행하여도 무방하며, 예를 들어, 지지체, 비드 또는 크로마토그래피 수지에 대한 공유 결합뿐만 아니라 항체 결합과 같은 비-공유 고친화도 상호작용, 또는 스트렙타비딘/비오틴 결합 (고정된 화합물이 비오틴 모이어티를 포함함)의 사용을 포함한다. 결합의 검출은 (i) 고정되지 않은 화합물 상에 방사성 표지를 사용하거나, (ii) 비-고정된 화합물 상에 형광 표지를 사용하거나, (iii) 비-고정된 화합물에 면역특이적인 항체를 사용하거나, (iv) 고정된 화합물이 부착된 형광 지지체를 여기시키는 표지를 비-고정된 화합물 상에 사용하거나, 또는 당업계에 잘 알려져 있고 통상적으로 실시되는 다른 기술을 이용하여 수행될 수 있다.
표적 항원의 활성을 감소시키는 항체는 표적 항원 (또는 표적 항원을 발현하는 세포)을 후보 항체와 인큐베이션한 다음, 후보 항체가 표적 항원의 활성 또는 발현에 미치는 효과를 결정하여 확인할 수 있다. 시험 항체의 존재 하의 활성을 시험 항체의 부재 하의 활성과 비교한다. 시험 항체를 함유하는 샘플 중에서의 활성이 시험 항체가 없는 샘플 중에서의 활성보다 낮은 경우, 항체가 활성을 억제한 것이 된다. 표적 항원 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 활성을 조정하는 항체의 선택성은 표적 항원에 대한 그의 효과를 다른 관련 화합물에 대한 그의 효과와 비교하여 평가할 수 있다.
특정 실시태양에서, 수용체 인산화, 신호전달, 리간드 결합, EphB3 이량체화, 리간드-유도 수용체 활성화, 및/또는 EphB3-매개 세포-세포 부착을 억제하는 그의 능력을 결정하기 위해, 항체를 배양 세포 시스템에 있어서 그의 효과에 대해 시험한다. 추가로, 본 명세서에 기재된 바와 같은 증식 분석, 연질 아가 분석 및/또는 세포독성 분석 등의 세포 분석을 특정 EphB3 항체를 평가하는 데 사용할 수 있다.
특정 항체 또는 항체 조합물의 생물학적 활성은 적절한 동물 모델을 사용하여 생체 내에서 평가될 수 있다. 예를 들어, 성체 래트 척수의 형질감염 및 EphB3 및 리간드 발현의 상향조절의 모니터링이 고려된다 (Cell Transplant. 2003;12(3):279-90).
본 발명은 또한 표적 항원과 상호작용하거나 그의 생물학적 활성을 억제하는 (즉, 인산화, 이량체화, 리간드 유도-수용체 활성화, 또는 세포내 신호전달 등을 억제하는) 항체를 확인하기 위한 고속 스크리닝 (HTS) 분석을 포함한다. HTS 분석은 많은 화합물을 효율적인 방식으로 스크리닝할 수 있게 한다. 세포-기반 HTS 시스템은 표적 항원과 그의 결합 파트너 사이의 상호작용을 검사하기 위한 것이다. HTS 분석은 목적하는 특성을 갖는 "히트 (hit)" 또는 "리드 (lead) 화합물"을 확인하도록 설계되며, 이들로부터 목적하는 특성을 개선시키기 위한 변형이 설계될 수 있다.
본 발명의 다른 실시태양에서, CDR 내의 아미노산에 대한 1개, 2개, 3개 또는 그 이상의 변형을 갖는, 표적 항원 폴리펩티드에 대한 적절한 결합 친화도를 갖는 항체 단편 또는 CDR을 찾기 위한 고속 스크리닝이 이용된다.
조합 요법
동물 모델에서 효과적인 하나 이상의 항체를 확인한 다음에는 2 이상의 상기 항체 (동일하거나 상이한 표적 항원에 결합하는)를 함께 혼합하여 더욱 개선된 효과를 얻는 것이 유익할 수 있다. 하나 이상의 항체를 포함하는 조성물을 EphB3-관련 질병 또는 질환으로 고통받고 있거나 그러할 소인이 있는 사람 또는 포유동물에 투여할 수 있다. 두 가지 치료제를 병용 투여하는 것은, 두 치료제가 그의 치료 효과를 발휘하는 기간이 겹치는 한, 치료제가 같은 시간에 또는 같은 경로로 투여되어야할 필요는 없다. 동시 투여 또는 다른 날 또는 다른 주에 투여되는 것과 같은 순차 투여가 고려된다.
본 발명의 방법은 단일 항체뿐만 아니라 상이한 항체의 조합물, 또는 "칵테일 (cocktail)"을 투여하는 것을 고려한다. 그러한 항체 칵테일은, 그들이 상이한 효과기 메카니즘을 이용하는 항체들을 함유하거나 직접적으로 세포독성 항체를 면역 효과기 기능에 의존하는 항체와 조합한 것인 한, 특정 잇점을 가질 수 있다. 상기 조합된 항체는 상승적 치료 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 치료되는 특정 질병 또는 질환의 치료를 위한, 의료계에서 승인된 표준물질과 조합한 단일 항체 또는 항체 칵테일의 투여를 고려한다.
세포독성제는 세포의 기능을 억제 또는 방지하고/하거나 세포의 파괴를 일으키는 물질을 의미한다. 이 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어, I131, 1125, Y90 및 Re186), 화학치료제 및 독소, 예를 들어, 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소 또는 합성 독소 또는 그의 단편을 포함하는 의미로 사용된다. 비-세포독성제는 세포의 기능을 억제 또는 방지하지 않고/않거나 세포의 파괴를 일으키지 않는 물질을 이른다. 비-세포독성제는 활성화되어 세포독성으로 될 수 있는 물질을 포함할 수 있다. 비-세포독성제는 비드, 리포좀, 매트릭스 또는 입자 (예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 공개 2003/0028071 및 2003/0032995 참조)을 포함할 수 있다. 그러한 물질은 본 발명에 따른 항체에 컨쥬게이션, 커플링, 연결 또는 회합될 수 있다.
투여 및 제제
본 발명의 항체는 목적하는 전달 방법에 적합한 담체를 포함하는 제약 조성물로 제제화될 수 있다. 적절한 담체는 항체와 합해질 때 항체의 목적하는 활성을 유지하며 대상의 면역계와 비반응성인 임의의 물질을 포함한다. 담체의 예는 임의의 많은 표준 제약용 담체, 예를 들어, 멸균 포스페이트 완충 염수 용액, 정균수 등을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 각종 수성 담체, 예를 들어, 물, 완충수, 0.4％ 염수, 0.3％ 글라이신 등이 사용될 수 있으며, 이들은 안정성 증진을 위해 다른 단백질, 예를 들어, 약간의 화학적 변형이 있을 수 있는 알부민, 지단백질, 글로불린 등을 포함할 수 있다.
항체의 치료 제제는 목적하는 정도의 순도를 갖는 항체를 선택적인 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))와 혼합함으로써 보관을 위해 동결건조된 제제 또는 수용액의 형태로 제조된다. 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제는 사용된 용량 및 농도에서 투여 대상에게 비독성이고, 버퍼, 예를 들어 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제 (예를 들어 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레졸시놀; 시클로헥사놀; 3-펜타놀 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신; 단당류, 이당류, 및 다른 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린; 킬레이팅제, 예를 들어 EDTA; 당, 예를 들어 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대 이온, 예를 들어 나트륨; 금속 복합체 (예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예를 들어 TWEEN™, PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다.
본원에서 제제는 또한 치료되는 특정 적응증에 필요한 하나 초과의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 유해한 영향을 주지 않는 상보 활성을 갖는 것을 포함할 수 있다. 상기 분자는 적합하게는 의도된 목적에 효과적인 양으로 조합되어 존재한다.
활성 성분은 또한 예를 들어 액적 형성 기술 또는 계면 중합에 의해 제조되는 마이크로캡슐, 예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포좀, 알부민 미세구, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에 또는 마크로에멀젼에 봉입될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
생체내 투여를 위해 사용되는 제제는 멸균 상태여야 한다. 이는 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다.
항체는 비경구, 피하, 복강내, 폐내 및 비내 투여를 포함하는 임의의 적절한 수단에 의해, 국소 처치가 바람직한 경우에는, 병변내 투여에 의해 투여된다. 비경구 주입은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 피내 또는 피하 투여를 포함한다. 또한, 항체는 적절하게는 펄스 주입에 의해, 특히 감소되는 항체 용량으로 투여된다. 투여는 바람직하게는 주사에 의해서, 가장 바람직하게는 정맥내 또는 피하 주사를 통해 이루어진다. 고려되는 다른 투여 방법은 국소 투여, 특히 경피, 경점막, 직장, 경구 또는 예를 들어 목적하는 부위에 근접하게 위치된 카테테르를 통한 국소 투여를 포함한다.
비내 투여를 위해, 제약 제제 및 의약은 적절한 용매(들)와 임의의 다른 화합물, 비제한적인 예로서 안정화제, 항미생물제, 항산화제, pH 조절제, 계면활성제, 생체이용률 변경제 및 이들의 조합물을 함유하는 스프레이 또는 에어로졸일 수 있다. 에어로졸 제제를 위한 추진제는 압축 공기, 질소, 이산화탄소 또는 탄화수소계 저비점 용매를 포함할 수 있다.
주사가능 투여형은 일반적으로 적절한 분산제, 습윤제 또는 현탁화제를 사용하여 제조할 수 있는 수성 현탁액 또는 오일 현탁액을 포함한다. 주사가능 형태는 용액상 또는 현탁액 형태일 수 있으며, 이는 용매 또는 희석제를 사용하여 제조된다. 허용가능한 용매 또는 비히클은 멸균수, 링거액 또는 등장성 염수 수용액을 포함한다.
주사를 위해, 제약 제제 및/또는 의약은 상기한 바와 같은 적절한 용액으로 재구성할 수 있는 분말일 수 있다. 이의 예는 동결 건조, 회전 건조 또는 분무 건조된 분말, 무정형 분말, 과립, 침전물, 또는 입자를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 주사를 위해, 제제는 임의로 안정화제, pH 조절제, 계면활성제, 생체이용률 변경제 및 이들의 조합물을 함유할 수 있다.
지연 방출 제제를 제조할 수 있다. 지연 방출 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 소수성 고체 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 상기 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 지연 방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 3,773,919), L-글루탐산과 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어 Lupron Depot™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사가능 미세구) 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다. 중합체, 예를 들어 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산은 100일 이상 동안 분자의 방출을 가능하게 하지만, 특정 히드로겔은 단백질을 더 짧은 기간 동안 방출한다. 캡슐화된 항체가 장기간 동안 신체에서 유지될 때, 이들은 37℃에서 습기에 노출될 때 변성 또는 응집되어 생물학적 활성의 상실 및 가능하게는 면역원성의 변경을 야기할 수 있다. 관련되는 메카니즘에 따라 안정화를 위한 합리적인 전략을 고안할 수 있다. 예를 들어, 응집 메카니즘이 티오-디술피드 교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀지면, 안정화는 술프히드릴 잔기의 변형, 산성 용액으로부터의 동결건조, 습기 함량의 조절, 적절한 첨가제의 사용 및 특이적 중합체 매트릭스 조성물의 개발에 의해 달성할 수 있다. 당업계에 공지된 다른 전략이 사용될 수 있다.
본 발명의 제제는 단기 작용, 급속 방출, 장기 작용 또는 상기한 바와 같이 지연 방출을 위해 설계될 수 있다. 따라서, 제약 제제는 조절 방출 또는 느린 방출용으로 제형화될 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한, 예를 들어, 미셀 또는 리포좀, 또는 다른 캡슐화된 형태를 포함할 수 있거나, 장기 보관 및/또는 전달 효과를 제공하기 위해 장기 방출 형태로 투여될 수 있다. 따라서, 제약 제제 및 의약은 펠렛 또는 실린더로 압착되어, 데포 (depot) 주사 또는 스텐트 (stent)와 같은 임플란트로서 근육내 또는 피하 이식될 수 있다. 그러한 임플란트는 실리콘 및 생분해성 중합체와 같은 공지의 불활성 물질을 사용할 수 있다.
상기한 바와 같은 대표적인 투여형 이외에, 제약상 허용되는 부형제 및 담체가 당업자에게 일반적으로 알려져 있으며, 따라서 본 발명에 포함된다. 그러한 부형제 및 담체는 예를 들어 본원에 참조로 포함되는 문헌 ["Remingtons Pharmaceutical Sciences" Mack Pub. Co., New Jersey (1991)]에 기재되어 있다.
특이적인 용량은 질병의 상태, 투여 대상의 연령, 체중, 일반적 건강 상태, 유전자형, 성별 및 식사, 투여 간격, 투여 경로, 배출 속도 및 약물의 조합에 따라 조정될 수 있다. 유효량을 함유하는 임의의 상기 투여형이 통상적인 실험의 범주에 포함되고, 따라서, 본 발명의 범위에 속한다.
본 발명의 항체는 종종 다른 자연 발생 면역글로불린 또는 다른 생물학적 분자가 실질적으로 없는 상태로 제조된다. 바람직한 항체는 EphB3-관련 질병 또는 질환으로 고통받고 있거나 그러할 소인이 있는 포유동물에 투여될 때 최소의 독성을 나타낼 것이다.
본 발명의 조성물은 통상적인 공지의 멸균 기술로 멸균될 수 있다. 생성되는 용액은 사용을 위해 포장되거나 무균 조건 하에 여과되어 동결건조될 수 있으며, 동결 건조된 제제는 투여 전에 멸균 용액과 혼합할 수 있다. 조성물은 생리적 상태에 맞추기 위해 필요한 제약상 허용되는 보조 물질, 예를 들어, pH 조절제 및 완충제, 긴장성 (tonicity) 조절제, 예를 들어 아세트산나트륨, 락트산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘 및 안정화제 (예를 들어, 120％ 말토스 등)를 함유할 수 있다.
본 발명의 항체는 또한 리포좀을 통해 투여될 수 있는데, 리포좀은 각종 유형의 지질 및/또는 인지질, 및/또는 약물 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체, 및 임의로 화학치료제)을 전달하는 데 유용한 계면활성제로 이루어진 작은 주머니이다. 리포좀은 에멀젼, 포움, 미셀, 불용성 단층, 인지질 분산액, 라멜라 층 등을 포함하며, 항체를 특정 조직을 표적으로 하여 유도할 뿐만 아니라 조성물의 반감기를 증가시키는 비히클로서 작용할 수 있다. 리포좀을 제조하기 위한 각종 방법이 예를 들어 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 4,837,028 및 5,019,369에 기재되어 있다.
항체를 함유하는 리포좀은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 문헌 ([Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3688 (1985)]; [Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77: 4030 (1980)]) 및 미국 특허 4,485,045 및 4,544,545에 기재된 바와 같이 제조된다. 향상된 순환 시간을 갖는 리포좀이 미국 특허 5,013,556에 기재되어 있다. 특히 유용한 리포좀은 포스파디딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도 포스파디딜에탄올아민을 포함하는 지질 조성물을 사용하여 역상 증발법으로 제조될 수 있다. 리포좀은 규정된 공극 크기의 필터를 통해 압출되어 목적하는 직경을 갖는 리포좀으로 된다. 본 발명의 항체의 Fab' 단편은 디술피드 교환 반응을 통해 리포좀에 컨쥬게이팅될 수 있다 (Martin et al., J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)). 화학치료제 (예를 들어, 독소루비신)도 임의로 리포좀 내에 함유된다 (예를 들어, [Gabizon et al., J. National Cancer Inst. 81(19): 1484 (1989)] 참조).
상기 조성물 내의 항체의 농도는 다양한 범위, 즉, 약 10 중량％ 미만으로부터, 대체로 약 25 중량％ 이상에서 많게는 75 중량％ 또는 90 중량％까지 변할 수 있으며, 선택된 특정 투여 방식에 따라, 액체 부피 또는 점도 등에 의해 주로 선택될 것이다. 경구, 국소 및 비경구 투여가능한 조성물의 실제 제조 방법은 당업자에게 알려져 있거나 자명할 것이며, 예를 들어 본원에 참조로 포함되는 문헌 (Remington's Pharmaceutical Science, 19th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1995))에 상세하게 기재되어 있다.
환자의 질병 치료를 위한 본 발명의 조성물의 유효량을 결정하는 것은 당업계에 알려진 표준 경험적 방법에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 목적을 달성하기에 충분한 양을 "치료 유효 용량"으로 정의한다. 항체 유효량은 질병의 중증도, 치료되는 환자의 체중 및 일반적 상태에 따라서 달라지는 것이지만, 일반적으로는 약 1.0 ㎍/kg 내지 약 100 mg/kg (체중) 범위 내이다. 용량의 예는 1회 투여 당 약 10 ㎍/kg 내지 약 30 mg/kg, 또는 약 0.1 mg/kg 내지 약 20 mg/kg, 또는 약 1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg일 수 있다. 항체는 또한 체표면을 통해 투여될 수 있다 (예를 들어, 최대 4.5 g/m2). 항체의 다른 예시적 투여량은 1회 투여시 최대 총 8 g을 포함한다 (체중 80 kg 또는 체표면적 1.8 m2 가정).
투여는 당업계에 알려진 임의의 수단으로 수행할 수 있다. 예를 들어, 항체는 1회 이상의 별개의 볼러스 투여, 또는 예를 들어, 5, 10, 15, 30, 60, 90, 120분 또는 그 이상의 시간에 걸친 단시간 또는 장시간 주입으로 행해질 수 있다. 초기 치료기 후에, 환자의 반응 및 치료를 감내하는 정도에 따라서, 환자의 반응을 유지시키기 위해 필요한, 매주, 매 2, 3 또는 4 주마다, 매월, 매 2, 3 또는 6개월마다 유지 용량을 투여할 수 있다. 질병 증상의 억제가 원하는 만큼 일어날 때까지, 보다 빈번한 투여가 필요할 수 있고, 용량은 필요에 따라 조정될 수 있다. 상기 치료의 진전은 통상적인 기술 및 분석으로 쉽게 모니터링할 수 있다. 치료는 정해진 기간 동안만 하거나, 계속적으로 실시되거나 또는 질병이 진전되거나 사망시까지 수년에 걸쳐 이루어질 수 있다.
조성물의 투여는 담당 의사에 의해 선택된 용량 수준 및 패턴에 따라 한 차례 또는 수 차례 이루어질 수 있다. 질병의 예방 또는 치료를 위하여, 항체의 적절한 용량은 상기 규정된 바와 같은 치료될 질병의 종류, 질병의 중증도 및 경과, 예방용인지 치료용인지의 여부, 이전의 치료, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응, 담당의의 재량에 따라 달라질 것이다. 항체는 환자에게 1회로 또는 연속되는 치료 시기에 걸쳐 적절하게 투여된다.
어떠한 경우에도, 제제는 목적하는 생물학적 활성을 발휘하기에, 예를 들어, EphB3-관련 질병 또는 질환을 방지하거나 중증도를 최소화하기에 충분한 시간 동안 치료 항체를 제공하여야 한다. 본 발명의 조성물은 단독으로 또는 상기 질병의 치료를 위해 당업계에 알려진 다른 치료제와 함께 보조 요법으로 투여될 수 있다.
항체 조성물은 적절한 의료 지침에 따른 방식으로 제제화, 용량 결정 및 투여될 수 있다. 이때 고려되어야 할 사항은 치료되는 특정 질환, 치료되는 특정 포유동물, 개별 환자의 임상 상태, 질환의 원인, 치료제 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케쥴 및 의사에 알려진 다른 요소 등을 포함한다. 투여될 항체의 치료상 유효량은 위와 같은 사항을 고려하여 결정될 것이며, 표적 매개 질병, 병태 또는 질환을 방지, 개선 또는 치료하는 데 필요한 최소량이다. 상기 양은 바람직하게는 숙주에게 독성을 나타내거나 숙주를 상당히 감염되기 쉽게 만드는 양보다 적은 것이다.
항체는 목적하는 질환을 예방하거나 치료하는 데 현재 사용되고 있는 하나 이상의 치료제와 함께 제제화될 필요가 있는 것은 아니지만 경우에 따라 제제화할 수 있다. 그와 같은 다른 치료제의 유효량은 제제 중의 항체의 양, 질병, 병태, 질환 또는 치료의 종류 및 상기한 바와 같은 다른 인자에 따라서 달라질 수 있다. 이들은 일반적으로 본원에서 상기한 바와 같은 투여 경로로 동일한 용량으로 투여되거나, 이제까지 사용된 용량의 약 1 내지 99％로 사용된다.
본 발명의 또다른 실시태양에서, 목적하는 병태의 치료에 유용한 물질을 함유하는 제품이 제공된다. 제품은 용기와 라벨을 포함한다. 적절한 용기는, 예를 들어, 병, 바이알, 시린지 및 시험관을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱 등의 각종 재료로 제조될 수 있다. 병태를 치료하는 데 유용한 조성물을 함유하며, 멸균 접근 포트 (예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘에 의해 찢어질 수 있는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있음)를 가질 수 있다. 조성물 중의 활성제는 본 발명의 항체이다. 용기와 결합되거나 그 위에 있는 라벨은 조성물이 선택된 병태의 치료에 사용되는 것임을 나타낸다. 제품은 또한 제2 치료제 (본 명세서에서 논의되거나 당업계에 알려진 임의의 제2 치료제 포함)를 함유하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 제품은 또한 동결건조된 항체 제제를 재구성하기 위한 제약상 허용되는 버퍼, 예를 들어, 포스페이트 완충 염수, 링거액 또는 덱스트로스 용액을 함유하는 다른 용기를 추가로 포함할 수 있다. 제품은 또한 상업적 또는 생산자 측면에서 바람직한 다른 물질, 예를 들어, 다른 버퍼, 희석제, 필터, 바늘, 시린지 및 사용 설명서가 있는 포장 삽입물을 추가로 포함할 수 있다.
면역요법
EphB3-관련 질병 또는 질환이 있는 환자를 치료하는 데 유용한 항체는 EphB3을 발현하는 세포에 대해 강력한 면역 반응을 개시할 수 있거나 세포독성을 나타낼 수 있는 항체를 포함한다. 세포독성제에 컨쥬게이팅된 항체는 세포독성제를, EphB3을 발현하는 조직을 표적으로 하여 유도하기 위해 사용될 수 있다. 별법으로, 항체는 보체 매개 또는 항체 의존적 세포 세포독성 (ADCC) 메카니즘에 의한 세포 용해를 일으킬 수 있는데, 둘 모두는 효과기 세포 Fc 수용체 부위 또는 보체 단백질과 상호작용하기 위해 면역글로불린 분자의 무손상 Fc 부분을 필요로 한다. 또한, 세포 성장에 직접적인 생물학적 효과를 나타내는 항체는 본 발명의 실시에 유용하다.
항-EphB3 항체는 그들의 "네이키드 (naked)" 또는 비컨쥬게이팅된 형태로 투여될 수 있거나, 다른 치료제 또는 진단제에 직접 컨쥬게이팅되거나, 다른 치료제 또는 진단제를 포함하는 캐리어 중합체에 간접적으로 컨쥬게이팅될 수 있다.
항체는 방사성 동위원소, 친화도 표지 (예를 들어, 비오틴, 아비딘 등), 효소 표지 (예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타제 등), 형광 또는 발광 또는 생물발광 표지 (예를 들어, FITC 또는 로다민 등), 상자성 원자 등을 사용하여 검출가능하게 표지될 수 있다. 상기 표지를 달성하기 위한 절차는 당업계에 잘 알려져 있다 (예를 들어, ([Sternberger, L.A. et al., J. Histochem. Cytochem. 18:315 (1970)]; [Bayer, E.A. et al., Meth. Enzym. 62:308 (1979)]; [Engval, E. et al., Immunol. 109:129 (1972)]; [Goding, J.W. J. Immunol. Meth. 13:215 (1976)] 참조).
항체 모이어티의 컨쥬게이션은 미국 특허 6,306,393에 기재되어 있다. 일반적인 기술은 또한 문헌 ([Shih et al., Int. J. Cancer 41:832-839 (1988)]; [Shih et al., Int. J. Cancer 46:1101-1106 (1990)]; 및 미국 특허 5,057,313 (Shih et al.))에 기재되어 있다. 상기 일반적인 방법은 산화된 탄수화물 부분을 갖는 항체 성분을 적어도 하나의 유리 아민 관능기를 가지며 다수의 약물, 독소, 킬레이터, 붕소 어덴드 (boron addend), 또는 다른 치료제가 부착된 캐리어 중합체와 반응시키는 것을 포함한다. 이 반응은 초기에 쉬프 (Schiff) 염기 (이민) 연결을 형성시키며, 이후 2차 아민으로의 환원에 의해 안정화되어 최종 컨쥬게이트를 형성할 수 있다.
캐리어 중합체는 예를 들어 아미노덱스트란 또는 아미노산 잔기 50개 이상의 폴리펩티드일 수 있다. 약물 또는 다른 물질을 캐리어 중합체에 컨쥬게이팅시키는 다양한 기술이 당업계에 알려져 있다. 아미노덱스트란 대신 폴리펩티드 캐리어를 사용할 수 있으나, 폴리펩티드 캐리어는 사슬 내에 적어도 50개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 100 내지 5000개의 아미노산 잔기를 가져야 한다. 아미노산 잔기의 적어도 일부는 라이신 잔기, 또는 글루타메이트 또는 아스파르테이트 잔기이어야 한다. 라이신 잔기의 매달린 아민 및 글루타메이트 및 아스파르테이트의 매달린 카르복실레이트는 약물, 독소, 면역조절제, 킬레이터, 붕소 어덴드 또는 다른 치료제를 부착시키기에 편리하다. 적절한 폴리펩티드 캐리어의 예는 폴리라이신, 폴리글루탐산, 폴리아스파르트산, 이들의 공중합체, 및 이들 아미노산과 다른 아미노산, 예를 들어, 세린의 혼합 중합체를 포함하며, 생성되는 부착된 캐리어 및 컨쥬게이트에 바람직한 용해도 특성을 부여한다.
별법으로, 컨쥬게이팅된 항체는 항체 성분을 치료제와 직접 컨쥬게이팅시켜 제조할 수 있다. 일반적인 과정은 치료제가 산화된 항체 성분에 직접 부착되는 것을 제외하고는 간접 컨쥬게이션 방법과 유사하다. 예를 들어, 항체의 탄수화물 모이어티는 반감기를 증가시키기 위해 폴리에틸렌 글리콜에 부착될 수 있다.
별법으로, 치료제는 환원된 항체 성분의 힌지 구역에 디술피드 결합 형성을 통해, 또는 N-숙시닐 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP)와 같은 이종이기능성 가교결합 링커를 사용하여 부착될 수 있다 (Yu et al., Int. J. Cancer 56:244 (1994)). 상기 컨쥬게이션을 위한 일반적인 기술은 당업계에 잘 공지되어 있다 (예를 들어, [Wong, Chemistry Of Protein Conjugation and Cross-Linking (CRC Press 1991)]; [Upeslacis et al., "Modification of Antibodies by Chemical Methods," in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch et al. (eds.), pages 187-230 (Wiley-Liss, Inc. 1995)]; [Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Production, Enineering and Clinical Application, Ritter et al. (eds.), pages 60-84 (Cambridge University Press 1995)] 참조). 각종 이기능성 단백질 커플링제가 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어, N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올) 프로피오네이트 (SPDP), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이기능성 유도체 (예를 들어, 디메틸 아디피미데이트 HCL), 활성 에스테르 (예를 들어, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예를 들어, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예를 들어, 비스(p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예를 들어, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예를 들어, 톨리엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물 (예를 들어, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)이 있다.
마지막으로, 하나 이상의 항-EphB3 항체 모이어티 및 다른 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질이 제조될 수 있다. 항체 융합 단백질을 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다 (예를 들어, 미국 특허 6,306,393 참조). 인터루킨-2 모이어티를 포함하는 항체 융합 단백질이 문헌 ([Boleti et al., Ann. Oncol. 6:945 (1995)], [Nicolet et al., Cancer Gene Ther. 2:161 (1995)], [Becker et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 93:7826 (1996)], [Hank et al., Clin. Cancer Res. 2:1951 (1996)], 및 [Hu et al., Cancer Res. 56:4998 (1996)])에 기재되어 있다.
본 발명의 항체는 그의 "네이키드" 또는 비컨쥬게이팅된 형태로 투여될 수 있거나, 치료제가 컨쥬게이팅될 수 있다.
본 발명은 또한 상기한 항체를 검출가능하게 표지된 형태로 제공한다. 항체는 방사성 동위원소, 친화도 표지 (예를 들어, 비오틴, 아비딘 등), 효소 표지 (예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타제 등), 형광 또는 발광 또는 생물발광 표지 (예를 들어, FITC 또는 로다민 등), 상자성 원자 등을 사용하여 검출가능하게 표지될 수 있다. 이러한 표지화 과정은 당업계에 잘 알려져 있다 (예를 들어, 문헌 ([Sternberger, L.A. et al., J. Histochem. Cytochem. 18:315 (1970)]; [Bayer, E.A. et al., Meth. Enzym. 62:308 (1979)]; [Engval, E. et al., Immunol. 109:129 (1972)]; [Goding, J.W. J. Immunol. Meth. 13:215 (1976)]) 참조).
"표지"는 항체에 직접 또는 간접적으로 컨쥬게이팅되는 검출가능한 화합물 또는 조성물이다. 표지는 그 자체로 검출가능한 것이거나 (예를 들어, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지), 또는 효소 표지의 경우, 기질 화합물 또는 조성물의 검출가능한 화학적 변화를 촉매할 수 있다. 별법으로, 표지는 그 자체로는 검출될 수 없으나, 검출가능한 다른 화합물에 결합된 요소 (예를 들어, 에피토프 태그 또는 비오틴-아비딘과 같은 결합 파트너 쌍 중의 하나)일 수 있다. 따라서, 항체는 그의 단리를 용이하게 하는 표지 또는 태그를 포함할 수 있으며, 항체를 확인하는 본 발명의 방법은 항체를 표지 또는 태그와의 상호작용을 통해 단리하는 단계를 포함한다.
면역컨쥬게이트의 생산은 미국 특허 6,306,393에 기재되어 있다. 면역컨쥬게이트는 치료제를 항체 성분에 간접적으로 컨쥬게이팅함으로써 제조할 수 있다. 일반적인 기술은 또한 문헌 ([Shih et al., Int. J. Cancer 41:832-839 (1988)]; [Shih et al., Int. J. Cancer 46:1101-1106 (1990)]; 및 미국 특허 5,057,313 (Shih et al.))에 기재되어 있다. 일반적인 방법은 산화된 탄수화물 부분을 갖는 항체 성분을 적어도 하나의 유리 아민 관능기를 가지며 다수의 약물, 독소, 킬레이터, 붕소 어덴드, 또는 다른 치료제가 부착된 캐리어 중합체와 반응시키는 것을 포함한다. 이 반응은 초기에 쉬프 염기 (이민) 결합을 형성시키며, 이후 2차 아민으로의 환원에 의해 안정화되어 최종 컨쥬게이트를 형성할 수 있다.
캐리어 중합체는 바람직하게는 아미노덱스트란 또는 아미노산 잔기 50개 이상의 폴리펩티드이지만, 다른 실질적으로 동등한 중합체 캐리어도 사용될 수 있다. 바람직하게는, 최종 면역컨쥬게이트는 투여 용이성 및 요법에 사용하기 위한 효과적인 표적화를 위해 수성 용액, 예를 들어 포유동물 혈청에 가용성이다. 따라서, 캐리어 중합체에 대한 가용화 관능기는 최종 면역컨쥬게이트의 혈청 용해도를 향상시킬 것이다. 특히, 아미노덱스트란이 바람직할 것이다.
아미노덱스트란 캐리어를 사용하여 면역컨쥬게이트를 제조하는 방법은 일반적으로 덱스트란 중합체, 유리하게는 평균 분자량이 약 10,000-100,000인 덱스트란으로 시작한다. 알데히드기를 생성시키기 위해 그의 탄수화물 고리의 일부에 대한 조절된 산화에 영향을 주기 위해 덱스트란을 산화제와 반응시킨다. 산화는 당분해 화학 시약, 예를 들어 NaIO4를 통상적인 절차에 따라 편리하게 수행한다.
이어서, 산화된 덱스트란을 폴리아민, 바람직하게는 디아민, 보다 바람직하게는 모노- 또는 폴리히드록시 디아민과 반응시킨다. 적합한 아민은 에틸렌 디아민, 프로필렌 디아민, 또는 다른 유사한 폴리메틸렌 디아민, 디에틸렌 트리아민 또는 유사한 폴리아민, 1,3-디아미노-2-히드록시프로판, 또는 다른 유사한 히드록실화 디아민 또는 폴리아민 등을 포함한다. 알데히드 관능기의 쉬프 염기기로의 실질적으로 완전한 전환을 보장하기 위해 덱스트란의 알데히드기에 대해 과량의 아민을 사용한다.
환원제, 예를 들어 NaBH4, NaBH3 CN 등을 사용하여 생성되는 쉬프 염기 중간체의 환원에 의한 안정화를 수행한다. 생성되는 애덕트는 가교결합된 덱스트란을 제거하기 위해서 통상적인 사이징 (sizing) 컬럼을 통과시켜 정제할 수 있다.
또한, 아민 관능기를 도입하기 위해 덱스트란을 유도체화하는 다른 통상적인 방법, 예를 들어 브롬화시안과의 반응, 이어서 디아민과의 반응을 사용할 수 있다.
이어서, 아미노덱스트란은 통상적인 수단, 예를 들어 디시클로헥실카르보디이미드 (DCC) 또는 그의 수용성 변이체를 사용하여 제조된, 부착되는 특정 약물, 독소, 킬레이터, 면역조절제, 붕소 어덴드, 또는 다른 치료제의 활성화된 형태의 유도체, 바람직하게는 카르복실-활성화된 유도체와 반응하여 중간체 애덕트를 형성한다.
별법으로, 폴리펩티드는 글루타르알데히드 축합에 의해 또는 단백질 상의 활성화된 카르복실기와 아미노덱스트란 상의 아민과의 반응에 의해 아미노덱스트란에 커플링될 수 있다.
방사성 금속 또는 자기 공명 증진제를 위한 킬레이터는 당업계에 잘 알려져 있다. 전형적인 것은 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA) 및 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA)의 유도체이다. 이들 킬레이터는 일반적으로 킬레이터를 캐리어에 부착시킬 수 있는 기를 측쇄 상에 갖는다. 그러한 기의 예로는 벤질이소티오시아네이트가 있으며, 이에 의해 DTPA 또는 EDTA가 캐리어의 아민기에 커플링될 수 있다. 별법으로, 킬레이터 상의 카르복실기 또는 아민기가 잘 알려진 수단에 의해 활성화 또는 예비 유도체화 후의 커플링에 의해 캐리어에 커플링될 수 있다.
카르보란과 같은 붕소 어덴드는 통상적인 방법으로 항체 성분에 부착될 수 있다. 예를 들어, 매달린 측쇄 상에 카르복실 관능기를 갖는 카르보란을 당업계에 알려진 바와 같이 제조할 수 있다. 상기 카르보란을 아미노덱스트란과 같은 캐리어에 부착시키는 것은 카르보란의 카르복실기를 활성화시킨 후에 캐리어 상의 아민과 축합시켜 중간체 컨쥬게이트를 생성함으로써 수행될 수 있다. 상기 중간체 컨쥬게이트를 항체 성분에 부착시켜 아래에서 설명되는 바와 같은 치료상 유용한 면역컨쥬게이트를 생산한다.
폴리펩티드 캐리어가 아미노덱스트란 대신에 사용될 수 있지만, 폴리펩티드 캐리어는 사슬에 적어도 50개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 100-5000개의 아미노산 잔기를 가져야 한다. 아미노산 잔기의 적어도 일부는 라이신 잔기, 또는 글루타메이트 또는 아스파르테이트 잔기이어야 한다. 라이신 잔기의 매달린 아민 및 글루타메이트 및 아스파르테이트의 매달린 카르복실레이트는 약물, 독소, 면역조절제, 킬레이터, 붕소 어덴드 또는 다른 치료제를 부착시키기에 편리하다. 적절한 폴리펩티드 캐리어의 예는 폴리라이신, 폴리글루탐산, 폴리아스파르트산, 이들의 공중합체, 및 이들 아미노산과 다른 아미노산, 예를 들어, 세린의 혼합 중합체를 포함하며, 생성되는 부착된 캐리어 및 면역컨쥬게이트에 바람직한 용해도 특성을 부여한다.
중간체 컨쥬게이트를 항체 성분과 컨쥬게이션시키는 것은 항체 성분의 탄수화물 부분을 산화시키고, 생성되는 알데히드 (및 케톤) 카르보닐을 약물, 독소, 킬레이터, 면역조절제, 붕소 어덴드, 또는 다른 치료제를 부착시킨 후에 캐리어 상에 잔존하는 아민기와 반응시켜 수행한다. 별법으로, 중간체 컨쥬게이트를 치료제를 부착시킨 후에 중간체 컨쥬게이트에 도입된 아민기를 통하여 산화된 항체 성분에 부착시킬 수 있다. 산화는 NaIO4 또는 다른 당분해 시약을 사용하여 화학적으로, 또는 예를 들어 뉴라미니다제 및 갈락토스 옥시다제를 사용하여 효소적으로 편리하게 수행할 수 있다. 아미노덱스트란 캐리어의 경우, 일반적으로 아미노덱스트란의 아민 전부가 치료제의 부착에 사용되는 것은 아니다. 아미노덱스트란의 잔존하는 아민이 산화된 항체 성분과 축합하여 쉬프 염기 애덕트를 생산하며, 이를 통상적으로는 보로히드라이드 환원제를 사용하여 환원에 의해 안정화시킨다.
본 발명에 따른 다른 면역컨쥬게이트를 제조하기 위하여 유사한 방법이 사용된다. 부착된 폴리펩티드 캐리어는 바람직하게는 항체 성분의 산화된 탄수화물 부분과의 축합을 위하여 남겨진 유리 라이신 잔기를 갖는다. 폴리펩티드 캐리어 상의 카르복실은 필요에 따라, 예를 들어, DCC로 활성화시킨 후 과량의 디아민과 반응시켜 아민으로 전환시킬 수 있다.
최종 면역컨쥬게이트를 통상적인 방법, 예를 들어, 세파크릴 S-300 상의 사이징 크로마토그래피 또는 하나 이상의 CD84Hy 에피토프를 사용한 친화도 크로마토그래피에 의해 정제한다.
별법으로, 면역컨쥬게이트는 항체 성분을 치료제와 직접 컨쥬게이팅시켜 제조할 수 있다. 일반적인 과정은 치료제가 산화된 항체 성분에 직접 부착되는 것을 제외하고는 간접 컨쥬게이션 방법과 유사하다.
또다른 예로서, 치료제는 환원된 항체 성분의 힌지 구역에 디술피드 결합 형성을 통해 부착될 수 있다. 예를 들어, 파상풍 독소 펩티드는 펩티드를 항체 성분에 부착시키는 단일 시스테인 잔기를 갖도록 제작될 수 있다. 또다른 방법으로서, 상기 펩티드는 N-숙시닐 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP)와 같은 이종이기능성 가교결합 링커를 사용하여 항체 성분에 부착될 수 있다 (Yu et al., Int. J. Cancer 56:244 (1994)). 상기 컨쥬게이션을 위한 일반적인 기술은 당업계에 잘 알려져 있다 (예를 들어, [Wong, Chemistry Of Protein Conjugation and Cross-Linking (CRC Press 1991)]; [Upeslacis et al., "Modification of Antibodies by Chemical Methods," in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch et al. (eds.), pages 187-230 (Wiley-Liss, Inc. 1995)]; [Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Production, Enineering and Clinical Application, Ritter et al. (eds.), pages 60-84 (Cambridge University Press 1995)] 참조).
항체와 세포독성제의 컨쥬게이트는 각종 이기능성 단백질 커플링제, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올) 프로피오네이트 (SPDP), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이기능성 유도체 (예를 들어, 디메틸 아디피미데이트 HCL), 활성 에스테르 (예를 들어, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예를 들어, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예를 들어, 비스(p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예를 들어, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예를 들어, 톨리엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 불소 화합물 (예를 들어, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조한다. 예를 들어, 펩티드 컨쥬게이트는 문헌 (Vitetta et al., Science 238: 1098(1987))에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 예시적인 킬레이팅제이다 (예를 들어, WO 94/11026 참조).
상기한 바와 같이, 항체의 Fc 구역 내의 탄수화물 모이어티는 치료제를 컨쥬게이팅시키는데 사용될 수 있다. 그러나, 항체 단편이 면역컨쥬게이트의 항체 성분으로 사용되는 경우, Fc 구역은 존재하지 않을 수 있다. 그럼에도 불구하고, 항체 또는 항체 단편의 경쇄 가변 구역 내로 탄수화물 모이어티를 도입할 수 있다 (예를 들어, [Leung et al., J. Immunol. 154:5919 (1995)]; 국 특허 5,443,953 (Hansen et al.) 참조). 조작된 탄수화물 모이어티는 치료제를 부착시키는데 사용된다.
또한, 당업자는 컨쥬게이션 방법의 여러 가능한 변형법을 알 수 있을 것이다. 예를 들어, 탄수화물 모이어티는 무손상 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 혈액, 림프, 또는 다른 세포외 체액 내에서의 반감기를 증가시키기 위해 폴리에틸렌 글리콜을 부착시키는데 사용될 수 있다. 또한, 치료제를 탄수화물 모이어티 및 유리 술프히드릴기에 부착시켜 "2가 면역컨쥬게이트"를 제조할 수 있다. 상기 유리 술프히드릴기는 항체 성분의 힌지 구역에 위치할 수 있다.
항체 융합 단백질
본 발명은 하나 이상의 항체 모이어티와, 면역조절제 또는 다른 치료제와 같은 다른 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질의 사용에 관한 것이다. 항체 융합 단백질의 제조 방법은 당업계에 알려져 있다 (예를 들어, 미국 특허 6,306,393 참조). 인터루킨-2 잔기를 포함하는 항체 융합 단백질이 문헌 ([Boleti et al., Ann. Oncol. 6:945 (1995)], [Nicolet et al., Cancer Gene Ther. 2:161 (1995)], [Becker et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 93:7826 (1996)], [Hank et al., Clin. Cancer Res. 2:1951 (1996)], 및 [Hu et al., Cancer Res. 56:4998 (1996)])에 기재되어 있다. 또한, 문헌 (Yang et al., Hum. Antibodies Hybridomas 6:129 (1995))은 F(ab')2 단편 및 종양 괴사 인자 알파 모이어티를 포함하는 융합 단백질을 기재하고 있다.
재조합 분자가 하나 이상의 항체 성분 및 다른 치료제를 포함하는 융합 단백질의 제조 방법이 또한 당업자에게 알려져 있다 (예를 들어, 문헌 [Chaudhary et al., Nature 339:394 (1989)], [Brinkmann et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 88:8616 (1991)], [Batra et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 89:5867 (1992)], [Friedman et al., J. Immunol. 150:3054 (1993)], [Wels et al., Int. J. Can. 60:137 (1995)], [Fominaya et al., J. Biol. Chem. 271:10560 (1996)], [Kuan et al., Biochemistry 35:2872 (1996)], 및 [Schmidt et al., Int. J. Can. 65:538 (1996)]; [Kreitman et al., Leukemia 7:553 (1993)], [Nicholls et al., J. Biol. Chem. 268:5302 (1993)], [Thompson et al., J. Biol. Chem. 270:28037 (1995)], 및 [Vallera et al., Blood 88:2342 (1996)]; [Deonarain et al., Tumor Targeting 1:177 (1995)], [Linardou et al., Cell Biophys. 24-25:243 (1994)], [Wang et al., Abstracts of the 209th ACS National Meeting, Anaheim, Calif., Apr. 2-6, 1995, Part 1, BIOT005]; [Dohlsten et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 91:8945 (1994)] 참조).
본 발명의 방법에 유용한 효소는 포스페이트 함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키는 데 유용한 알칼린 포스파타제; 술페이트 함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키는 데 유용한 아릴술파타제; 펩티드 함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키는 데 유용한 프로테아제, 예를 들어 세라티아 프로테아제, 써몰리신, 서브틸리신, 카르복시펩티다제 및 카텝신 (예를 들어, 카텝신 B 및 L); D-아미노산 치환체를 함유하는 전구약물을 전환시키는 데 유용한 D-알라닐카르복시펩티다제; 글리코실화된 전구약물을 유리 약물로 전환시키는 데 유용한 탄수화물-절단 효소, 예를 들어, β-갈락토시다제 및 뉴라미니다제; β-락탐으로 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환시키는 데 유용한 β-락타마제; 및 페니실린 아미다제, 예를 들어 그의 아민 질소에서 각각 페녹시아세틸 또는 페닐아세틸기로 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환시키는 데 유용한 페니실린 V 아미다제 또는 페니실린 G 아미다제를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 별법으로, 효소 활성을 갖는 항체 (당업계에 아브자임 (abzyme)이라고도 알려짐)가 본 발명의 전구약물을 유리 활성 약물로 전환시키는데 사용될 수 있다 (예를 들어, Massey, Nature 328: 457-458 (1987)). 항체-아브자임 컨쥬게이트는 본 명세서에 기재된 바와 같이 아브자임을 요구되는 세포 집단에 전달하기 위해 제조될 수 있다.
본 발명의 효소는 당업계에 잘 알려진 기술로, 예를 들어, 상기 논의된 이종이기능성 가교결합 시약을 사용하여 항체에 공유결합될 수 있다. 별법으로, 본 발명의 항체의 적어도 하나의 항원 결합 구역이 본 발명의 효소의 적어도 기능적 활성 부분에 연결된 융합 단백질이 당업계에 잘 알려진 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조될 수 있다 (예를 들어, [Neuberger et al., Nature 312: 604-608 (1984)] 참조).
비-치료 용도
본 발명의 항체는 표적 항원에 대한 친화도 정제를 위한 물질로서, 또는 표적 항원에 대한 진단 분석에서, 예를 들어, 특정 세포, 조직 또는 혈청에서 그의 발현을 검출하는 데 사용될 수 있다. 항체는 또한 생체내 진단 분석에도 사용될 수 있다. 일반적으로, 상기 목적을 위해 면역신티오그래피 (immunoscintiography)를 사용하여 부위를 확인할 수 있도록 항체는 방사선 핵종 (예를 들어, 111In, 99Tc, 14C, 131I, 125I, 3H, 32P 또는 35S)으로 표지된다.
본 발명의 항체는 임의의 공지된 분석 방법, 예를 들어, 경쟁 결합 분석, ELISA와 같은 직접 및 간접 샌드위치 분석, 및 면역침전 분석에 사용될 수 있다 (Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc. 1987)). 항체는 또한 당업계에 알려진 방법을 사용하여 세포 샘플을 표지하기 위해 면역조직화학에 사용될 수 있다.
편의를 위하여, 본 발명의 항체는 키트로, 즉, 진단 분석 수행에 관한 사용설명서와 함께 소정량의 시약들의 포장된 조합체로 제공될 수 있다. 항체가 효소로 표지된 경우, 키트는 효소에 의해 요구되는 기질과 보조인자 (예를 들어, 검출가능한 발색단 또는 형광단을 제공하는 기질 전구체)를 포함할 것이다. 또한, 다른 첨가제, 예를 들어, 안정화제, 버퍼 (예를 들어, 차단 버퍼 또는 용해 버퍼) 등이 포함될 수 있다. 각종 시약의 상대적인 양은 분석 감도를 실질적으로 최적화시키는 시약 용액 중의 농도를 제공하기 위해 넓은 범위에서 변화될 수 있다. 특히, 시약은 용해 시에 적절한 농도를 갖는 시약 용액을 제공하는 부형제를 포함하며, 대체로 동결건조된 건조 분말로서 제공될 수 있다.
본 발명은 다음 실시예에 의해 예시되고, 실시예는 어떠한 방식으로도 제한으로 의도되지 않는다.
실시예 1
EPHB3 세포외 도메인 ( ECD )의 제조
EphB3의 ECD의 재조합 발현을 위해, 발현 벡터 내로의 도입을 위한 태그를 도입시키고 코딩 구역의 말단부를 공학적으로 처리하기 위해 이중 (nested) PCR 방법을 먼저 수행하였다. 사용된 프라이머는 다음과 같았다 (모두 5'에서 3' 방향으로의 서열로 표기한다):
정방향 #1:
TCGTATACATTTCTTACATCTATGCGCTGGAAGAGACCCTCATGGACACAAA (서열 420)
정방향 #2:
GGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTACGAAGGAGATATACATATGAAATTCTTAGTCAACGTTGCCCTTGTTTTTATGGTCGTATACATTTCTTACATCTATGCG (서열 421)
역방향 #1:
CGGGTCGTCGAGGTCCTCGTCGAAGGGCCTCGTGTAGTGGTAGTGGTAGTGCCT (서열 422)
역방향 #2:
CCTCGTGTAGTGGTAGTGGTAGTGCCTCGAATTTGGGTCGAAAGAACATGTTTCACCAGGG (서열 423)
PCR 증폭은 PfuUltra™ Hotstart PCR 마스터 믹스 (Master Mix) (스트라타젠 (Stratagene))를 사용하여 제조사의 권장사항에 따라 수행하였다. 증폭을 위해 사용된 템플레이트는 pDONOR201 내에서 클로닝된 EphB3 ECD 단편이었다. ECD PCR 생성물을 토포이소머라제 클로닝 계획을 이용하여 pBlueBac4.5GW 내로 클로닝하였다. 최종 선택된 클론은 이중-가닥 서열 결정에 의해 확인하였다. 각각의 클론을 나타내는 DNA 10-20 ㎍을 곤충 형질감염을 위해 준비하였다.
곤충 세포에서 EphB3 ECD를 발현하기 위해 다음과 같이 재조합 구성체를 사용하였다. EphB3의 세포외 도메인을 코딩하는 플라스미드 DNA와 Sapphire™ 게놈 오토그라파 칼리포르니카 DNA의 동시-형질감염의 플라크 (plaque) 정제에 의해 바큘로바이러스를 단리하였다. 재조합 바이러스를 증폭시키고, 1-1.5×106개 세포/ml의 밀도, 2-10의 감염 다중도 (moi)에서 10L (작업 부피) 웨이브 생물반응기 (wave bioreactor) 내에서 Tn5 곤충 세포를 감염시키기 위해 사용하였다. 감염 48시간 후, 세포 및 상등액을 모으고 원심분리하고, 상등액을 농축을 위해 준비하였다. 상등액을 0.45 ㎛ 중공 섬유 카트리지 상에서 청정화한 후, 접선 유동 (tangential flow) 10 kDa MW 컷오프 막을 사용하여 8X 농축하였다. 단백질 정제 전에, 상등액을 1L의 0.2 ㎛ 공극 진공 플라스크로 멸균 여과하였다.
EphB3 ECD를 다음과 같이 정제하였다. EphB3 ECD를 함유하는 곤충 세포 배양 상등액을 13 ml/min의 유속으로 버퍼 A (PBS/0.35M NaCl/5 mM 이미다졸) 내에 평형화시킨 25 mL Ni 킬레이팅 (Chelating) 컬럼 (G.E. 수지 카탈로그 번호 17-5318-03) 위로 통과시켰다. EphB3 ECD를 함유하는 결합된 단백질은 버퍼 A에서 버퍼 B (PBS/0.35M NaCl/250 mM 이미다졸)로 30-컬럼-부피 구배를 사용하여 용출하였다. 분획을 SDS-PAGE로 검사하고, 목적하는 순도로 EphB3 ECD를 함유하는 분획을 모았다. 풀을 버퍼 A에 대해 투석하고, 2×5 mL HisTrap (G.E.) 컬럼 위로 통과시켰다. HisTrap 컬럼을 제1 Ni 킬레이팅 컬럼과 동일한 방식으로 용출하였다. 분획을 SDS-PAGE로 검사하고, 목적하는 순도로 EphB3 ECD 단백질을 함유하는 분획을 모았다. 최종 풀을 PBS/0.1M 아르기닌에 대해 투석하였다. 최종 물질을 N-말단 서열 결정 및 환원 및 비-환원 SDS-PAGE (쿠마시 (Coomassie) 염색 및 웨스턴 (Western) 분석)에 의해 동일성 및 순도에 대해 분석하였다.
실시예 2
뮤린 하이브리도마에 의해 분비된 표적 특이적 항체의 확인
하이브리도마 생성을 위해 사용되는 면역원은 인간 EphB3의 세포외 도메인 (ECD) (서열 2의 아미노산 37 - 558에 상응함)의 재조합 형태였고, 이는 바큘로바 이러스/곤충 세포 발현 시스템을 사용하여 생성되었다. 면역화를 위해, ECD를 동일한 부피의 아주반트와 혼합하고, 혼합물을 뒷다리 발바닥의 배쪽 표면 상에 피하 주사하였다. 마우스에게 면역원을 다양한 면역화 스케쥴에 따라 3-14일마다 주사하여, 강한 면역 반응을 일으켰다. 이어서, 우수한 면역 반응을 보이는 마우스를 희생시키고, 림프절을 수거하고, 림프절 내의 B 세포를 모았다. 이어서, B 세포를 당업계에 잘 알려진 기술에 따라 골수종 세포에 융합시켜 하이브리도마를 생성하고, ELISA 및 FACS 분석으로 하이브리도마를 EphB3 단백질을 인식하는 항체를 생산하는 것에 대해 스크리닝하였다.
실시예 3
파지 디스플레이에 의한 표적 특이적 항체의 확인
항체 스크리닝.
항-EphB3 항체의 패널을 단리하기 위해, EphB3의 세포외 도메인 (ECD)으로 과면역화된 마우스로부터 생성된 Omniclonal 파지 디스플레이 라이브러리 (미국 특허 6,057,098 (Buechler et al.))를 스크리닝하였다.
미국 특허 6,057,098의 프로토콜에 따라 Omniclonal 라이브러리로부터 얻은 단일 콜로니를 ELISA 분석으로 결합 활성에 대해 스크리닝하였다. 간단히 설명하면, 미세배양액을 OD600=0.6으로 성장시키고, 이 시점에 0.2％ w/v의 아라비노스를 첨가한 후, 진탕 인큐베이터 내에서 30℃에서 밤새 배양하여 가용형 항체 단편의 발현을 유도하였다. 세균을 원심분리하고, 주변 세포질 추출물을 제조하고 마이크 로플레이트 제조사에서 제공된 표준 ELISA 프로토콜에 따라 Nunc MaxiSorp™ 마이크로플레이트 상에 고정된 EphB3-ECD에 대한 항체 결합 활성을 검출하기 위해 사용하였다. 항체 결합은 또한 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 분석을 이용하여 CHO-K1-EphB3 발현 세포에 대한 결합을 측정함으로써 평가하였다.
파지 디스플레이에 의해 확인된 항체 후보의 전체 IgG 로의 전환
초기 스크린으로부터 선도 후보 결합물질을 항체 중쇄 및 경쇄 불변 구역을 포함하는 항체로 전환시키기 위해, 결합물질의 중쇄 및 경쇄 모두의 가변 구역에 대한 코딩 서열을 카파 (κ) 및 감마-1 (γ1) 불변 구역 유전자를 코딩하는 포유동물 발현 벡터 (WO 2004/033693) 내로 클로닝하였다.
항체를 문헌 [Handa et al, 2004 American Society of Cancer Biology Poster #1937]에 설명된 바와 같이 293E 세포 내에서 일시적으로 발현시켰다. 형질감염된 세포의 상등액을 배양 제6일에 수거하고, IgG를 제조사의 프로토콜에 따라 단백질 A 세파로스 (지이 헬쓰케어 (GE Healthcare))를 사용하여 정제하였다.
실시예 4
EPHB3 항체 에피토프 바이닝 ( binning )
항-EphB3 항체를 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 기술을 사용하는 연속 경쟁 분석 계획에 의해 에피토프 빈 (bin)에 배정하였다. 본 방법에서, 하나의 항체를 직접 또는 포획제를 통해 센서 칩 상에 고정시키고, 리간드 (EphB3 ECD)가 고정된 항체 위로 주입될 때 결합하도록 하였다. 후속적으로 제2 시험 항체를 주입하고, 제1 항체에 의해 포획된 리간드에 결합하는 그의 능력을 결정하였다. 항체들이 리간드 상의 공간적으로 분리된 에피토프에 결합하면, 제2 항체는 리간드/제1 항체 복합체에 또한 결합할 수 있어야 한다. 리간드의 동일한 분자에 동시에 결합하는 2개의 상이한 항체의 능력을 페어링 (pairing)으로서 칭한다.
1. 제1 시리즈의 실험에서는 모든 유동 세포 상에 높은 밀도의 토끼 항-마우스 Fc 특이적 항체 (RAM-Fc)으로 코팅된 CM5 센서 칩을 사용하였다.
a. 러닝 (running) 버퍼는 HBS-EP (비아코어, 인크 (Biacore®, Inc.))이고, 온도는 25℃로 설정하고, 유속은 10 ㎕/min이었다.
b. 1-10 ㎍/mL 희석액을 1-3분 동안 주입하여 200-1000 RU의 포획 수준을 생성시킴으로써 상이한 항체가 각각의 유동 세포 상에 포획되었다.
c. 이어서, HBS-EP 내의 100 ㎍/mL 마우스 IgG를 30분 동안 주입함으로써 표면을 차단하였다.
d. 칩이 효과적으로 차단되었음을 입증하고 항체의 배경 결합 수준을 결정하기 위해, 페어링에 대해 시험할 항체를 1 ㎍/mL로 주입하였다.
e. 리간드를 2-10 ㎍/mL로 2-4분 동안 주입하였다.
f. 페어링시킬 항체를 상기 단계 1d에서와 같이 다시 주입하였다. 항체가 주입 동안 결합되면, 2개의 항체는 쌍을 형성하고, 따라서 별개의 에피토프 빈에 놓인다. 제2 항체가 결합하지 않으면, 결합에 대해 제1 항체와 경쟁하고, 이들은 동일한 또는 중복하는 에피토프 빈에 놓인다.
g. 자가-페어링에 대한 대조군으로서, 각각의 포획된 항체를 자신과의 페어링에 대해 시험하였다.
2. 일단 몇몇 에피토프 빈, 또는 특유한 세트의 비-페어링 항체가 설명되면, 이들 항체를 사용하여 더 많은 항체를 추가로 조사하였다. 4개의 항체를 동시에 사용하여 항체를 연속 방식으로 조사하였다. 각각의 4개의 유동 세포 상에 상이한 에피토프 빈으로부터 하이브리도마 항체를 포획한 후, 상기 설명된 페어링 프로토콜을 4가지 모두에 동시에 수행함으로써, 보다 큰 샘플 세트가 조사되었다.
3. 본 과정을 사용하여 인간 항체 Fab 단편을 또한 평가하였고, RAM-Fc 표면은 인간 Fab를 포획하지 않으므로 100 ㎍/mL 마우스 IgG를 사용하는 차단 단계를 이용하지 않도록 변형하였다.
실시예 5
EPHB3 인산화 및 분해의 유동 세포측정-기반 분석 및 검출을 이용하는
길항제 EPHB3 항체의 선택
EphB3에 표적화되는 길항 항체를 확인하기 위해, 수용체 활성화의 하류 효과를 모니터링하도록 유동 세포측정 (FACS)-기반 분석을 개발하였다 (예를 들어, 신호전달 경로의 활성화의 척도로서 총 세포성 포스포-티로신 (pY) 분석).
총 세포성 티로신 인산화
총 세포성 pY 분석에서는 높은 수준의 수용체를 발현하는 현탁액-적응된 (adapted) 안정적으로 형질감염된 CHO 세포주를 사용하였다. 상기 분석을 이용하여 하이브리도마 상등액, 정제된 하이브리도마-유래 항체, 및 정제된 전체 IgG 재초기화된 파지 디스플레이-유래 항체를 스크리닝하였다.
EphB3을 과다발현하는 현탁액 적응된 CHO-K1 세포를 둥근 바닥 96-웰 플레 이트로 2×105개 세포/웰로 접종하였다. 이어서, EphB3에 대한 항체를 각각의 샘플 웰 내로 1:10으로 직접 희석하였다. 샘플을 40-45분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 2％ 포름알데히드로 20분 동안 실온에서 고정시켰다. 이어서, 세포를 침투 (permeabilization) 버퍼로 2X 세척하고, PE 컨쥬게이팅된 마우스 항-포스포티로신 항체 (PY20)를 함유하는 침투 버퍼 내에 재현탁시켰다. 세포를 1시간 동안 4℃에서 인큐베이션하고, 침투 버퍼로 2X 세척하고, 유동 세포측정에 의해 분석하였다.
시험된 항체의 약 24％가 pY 분석에서 효능제 활성을 보여주었다. 3개의 항체 (XPA.04.017, XHA.05.172, 및 XHA.05.849)는 FACS 포스포티로신 염색을 약 1.5배로 감소시켰고, 이들 항체 중 2개 (XPA.04.017 및 XHA.05.172)는 효능제 항체에 비해 별개의 에피토프 빈에 매핑되고, 이는 이들 2개의 항체가 EphB3 길항 효과와 연관된 독특한 에피토프를 확인함을 나타낸다. 최소 효능제 활성을 보여주는 2개의 항체 (XPA.04.019 및 XPA.04.031)는 에프린 B2의 결합을 방지하였다 (아래에 추가로 설명된).
실시예 6
에프린 B2 결합 경쟁 분석 및 에피토프 경쟁 분석
A. Flexchip 센서 칩 제조
Flexchip 분석 플랫폼 (비아코어 (Biacore, 스웨덴 웁살라))을 사용하여 3개의 확인된 항-EphB3 길항 항체를 다른 7개의 확인된 에피토프 빈으로부터의 대표적 인 것과 결합 경쟁에 대해 신속하게 시험하고, 또한 다른 7개의 빈으로부터의 길항제 및 효능제 항체가 EphB3-ECD에 대한 결합을 위해 에프린 B2 리간드와 경쟁하는지의 여부를 결정하였다.
정제된 항체를 25 ㎕ 피펫 팁을 사용하여 나금 (bare gold) Flexchip 슬라이드 상에 희석하지 않고 2중으로 점적하였다. 재조합 EphB3-ECD 및 단백질 A/G를 3중으로 점적하였다. 단백질 농도를 표 4에 요약한다. 점적 후, 칩을 85％ 습도 챔버에 1.5시간 동안 넣은 후, 4℃에서 밤새 놓아두었다.
Flexchip 센서 칩 표면 상에 점적한 시약.
샘플 농도 (mg/mL)
EphB3-ECD 1.8
재조합 마우스 에프린-B2/Fc 키메라 0.5
XHA.05.849 1.1
XHA.05.172 4.4
XPA.04.017-IgG 0.5
XPA.04.031-IgG 1.4
XPA.04.019-IgG 단백질 A/G 2.1 0.5
칩을 점적한 후, Flexchip을 PBST (0.05 ％ Tween 20이 존재하는 포스페이트 완충 염수) 러닝 버퍼로 평형화시켰다. 칩을 도킹하고, 1X Flexchip 차단 용액 (비아코어)을 사용하여 차단을 수행하였다.
B. 에프린 B2 경쟁 분석
러닝 버퍼 내에 2 ㎍/mL의 에프린 B2을 5분 동안 500 ㎕/분으로 주입하여, 고정된 항체에 대한 비-특이적 결합이 없는 것을 입증하고, 또한 점적된 EphB3-ECD에 결합됨을 입증하였다. 이 후, 러닝 버퍼 내에 2 ㎍/mL의 EphB3-ECD을 5분 주입한 직후, 다시 에프린 B2을 5분 주입하였다. XHA.05.849는 본 시험에서 효과적으로 평가되기에 충분한 양의 ECD에 결합하지 않았다. 다른 모든 항체는 유의한 수준의 EphB3-ECD에 결합하였고, XPA.04.031 및 XPA.04.019를 제외한 모두는 항체에 의해 포획된 ECD에 에프린 B2의 결합을 허용하였다 (하기 표 5 참조). XPA.04.031 및 XPA.04.019에 의해 포획된 재조합 EphB3-ECD에 대한 에프린 B2의 결합이 검출되지 않았다.
점적된 항체에 대한 에프린 B2 및 EphB3-ECD의 결합
포획된 EphB3 ECD에 대한 에프린 B2의 결합
평균값
항체 포획된 ECD 포획된 에프린 B2
XPA.04.017 225.32 214.75
XHA.05.172 508.36 511.88
XHA.05.849 -2.11 -5.74
XPA.04.031 461.77 7.68
XPA.04.019 129.94 -0.47
C. 에피토프 경쟁 분석
모든 주입은 달리 나타내지 않으면 500 ㎕/min에서 5분이었고, 모든 샘플은 PBST 러닝 버퍼로 희석하였다. EphB3-ECD를 1 ㎍/mL로 주입하고, 그 직후 시험 항체를 2 ㎍/mL로 주입하였다. 각각의 항체 경쟁 시험에 이어, 10 mM 글라이신 (pH 2.5)을 30초 주입한 후, 5분 버퍼 유동하고, 이어서 10분 차단 버퍼 유동 단계에 이어, 추가로 5분 버퍼 유동함으로써 칩을 재생하였다. Flexchip 평가 소프트웨어의 보고점 특징을 사용함으로써 에피토프 경쟁 데이타를 분석하였고, 여기서 Begin, Mid 및 End로 지정된 구역이 선택되고, 선택된 영역 위의 평균 반응이 표에 기재된다.
주입된 샘플을 모든 점적된 항체에 대해 시험할 때 항체 XHA.05.172, XHA.05.849, XPA.04.017, 및 효능제 항체를 사용하였다. 각각의 에피토프 경쟁 분석 사이클로부터의 데이타를 아래 표 6-8에 제시한다.
Flexchip 분석에서 점적된 항체와 EphB3-ECD 결합 경쟁에 대한 XHA.05.172의 시험.
XHA.05.172에 대한 EphB3 Flexchip 페어링
평균값
항체 포획된 ECD 포획된 XHA.05.172
XPA.04.017 96.00 -4.10
XHA.05.172 143.78 -39.09
XHA.05.849 5.77 -12.31
XPA.04.031 161.67 456.86
XPA.04.019 48.27 112.56
Flexchip 분석에서 점적된 항체와 EphB3-ECD 결합 경쟁에 대한 XPA.04.017의 시험.
XHA.04.017에 대한 EphB3 Flexchip 페어링
평균값
항체 포획된 ECD 포획된 XPA.04.017
XPA.04.017 168.61 -0.99
XHA.05.172 307.26 -42.69
XHA.05.849 1.76 -5.78
XPA.04.031 316.07 397.40
XPA.04.019 57.51 99.72
Flexchip 분석에서 점적된 항체와 EphB3-ECD 결합 경쟁에 대한 XHA.05.849의 시험.
XHA.05.849에 대한 EphB3 Flexchip 페어링
평균값
항체 포획된 ECD 포획된 XHA.05.849
XPA.04.017 174.85 -3.79
XHA.05.172 352.48 -33.51
XHA.05.849 11.80 -9.29
XPA.04.031 343.22 -17.20
XPA.04.019 81.29 -8.81
D. 결론
길항 항체 및 각각의 효능제 빈으로부터의 대표적인 것을, EphB3 세포외 도메인 (ECD)에 대한 그들의 결합이 ECD에 대한 에프린 B2 리간드의 결합을 방지하는지 여부를 결정하기 위해 시험하였다. 상기 나타낸 바와 같이, 2개의 EphB3 길항 항체 XPA.04.017 및 XHA.05.172는 임의의 효능제 빈과 상이한 특유한 빈을 구성하였다. 새로운 빈은 서로 경쟁하고 다른 7개의 빈으로부터의 다른 항체와 경쟁하지 않는 2개의 항체의 능력에 의해 규정되었다. 2개의 항체 XPA.04.017 및 XHA.05.172는 또한 포획된 ECD가 에프린 B2 리간드에 결합하는 것을 방지하지 않았다. 상기 데이타는 본원에서 확인되고 설명된 항체가 길항 활성을 갖고, 효능제 항체의 것과 구분되는 에피토프에 결합하고, 에프린 B2 리간드의 직접 경쟁과 다른 작용 메카니즘을 갖는다는 것을 확인한다. 2개의 항체 XPA.04.019 및 XPA.04.031은 최소의 효능제 활성을 가졌지만, 포획된 ECD (즉, 리간드 경쟁자)에 대한 에프린 B2의 결합을 방지하였고, 따라서 길항제로서 특징지을 수 있다. 효능제 항체는 그러한 리간드 결합 경쟁을 나타내지 않았다.
실시예 7
뮤린 항체의 인간화
본 실시예는 뮤린 항-EphB3 항체의 인간화 과정을 설명한다.
인간화 XPA .04.017, XPA .04.031 및 XPA .04.019 경쇄 및 중쇄에 대한 유전자의 설계
뮤린 항체 XPA.04.017, XPA.04.031 및 XPA.04.019에 대한 경쇄 및 중쇄 가변 구역 아미노산 서열을 도 1에 제시한다. NBFPIR (National Biomedical Foundation Protein Identification Resource) 또는 유사한 데이터베이스를 사용하여 확인된 인간 항체의 서열을 사용하여 인간화 항체의 프레임워크를 제공한다. 인간화 중쇄의 서열을 선택하기 위해, 뮤린 중쇄 서열을 인간 항체 중쇄의 서열과 정렬시킨다. 각각의 위치에서, 그 위치가 각각의 경우에 뮤린 아미노산 서열이 선택되는 아래의 4개의 카테고리 중 하나에 속하지 않는다면, 인간화 서열을 위해 인간 항체 아미노산을 선택한다:
(1) 위치가 상보성 결정 구역 (CDR) 내에 있거나 (문헌 [Kabat, J. Immunol., 125, 961-969 (1980)]에 의해 규정될 때);
(2) 인간 항체 아미노산은 그 위치에서 인간 중쇄에 희귀한 반면, 뮤린 아미노산은 그 위치에서 인간 중쇄에 통상적이거나;
(3) 위치가 뮤린 중쇄의 아미노산 서열 내의 CDR에 바로 인접하거나;
(4) 뮤린 항체의 3차원 모델링은, 아미노산이 항원 결합 구역과 물리적으로 가까운 것을 제안한다.
인간화 경쇄의 서열을 선택하기 위해, 뮤린 경쇄 서열을 인간 항체 경쇄의 서열과 정렬시킨다. 위치가 상기 설명하고 아래 반복된 카테고리 중 하나에 속하지 않는다면, 인간화 서열을 위해 각각의 위치에서 인간 항체 아미노산을 선택한다:
(1) CDR;
(2) 뮤린 아미노산 서열이 인간 항체보다 더 전형적이거나;
(3) CDR에 인접하거나;
(4) 결합 구역에 대한 가능한 3차원 근접성.
중쇄 및 경쇄 유전자의 실제 뉴클레오티드 서열은 다음과 같이 선택한다:
(1) 상기한 바와 같이 선택된 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열;
(2) 이들 코딩 서열의 5'에서, 뉴클레오티드 서열은 리더 (신호) 서열을 코딩한다. 이들 리더 서열은 항체에 전형적인 것으로 선택되었다;
(3) 코딩 서열의 3'에서, 뉴클레오티드 서열은 뮤린 서열의 일부인 마우스 경쇄 J5 세그먼트 및 마우스 중쇄 J2 세그먼트를 뒤따르는 서열이다. 이들 서열은 스플라이스 공여 신호를 함유하기 때문에 포함된다.
(4) 서열의 각각의 말단에 Xba I 부위가 존재하여, Xba I 부위에서 절단되어 벡터의 Xba I 부위 내로 클로닝되는 것을 허용한다.
인간화 경쇄 및 중쇄 유전자의 제작
중쇄를 합성하기 위해, 어플라이드 바이오시스템즈 (Applied Biosystems) 380B DNA 합성기를 사용하여 4개의 올리고뉴클레오티드를 합성한다. 올리고뉴클레오티드 중 2개는 중쇄의 각각의 가닥의 일부이고, 각각의 올리고뉴클레오티드는 다음 것과 약 20개 뉴클레오티드가 겹쳐져 있어 어닐링을 가능하게 한다. 올리고뉴클레오티드는 함께 전체 인간화 중쇄 가변 구역을 덮으며, 각각의 말단에서 수개의 추가의 뉴클레오티드에 의해 Xba I 부위에서 절단을 가능하게 한다. 올리고뉴클레오티드는 폴리아크릴아미드 겔로부터 정제된다.
각각의 올리고뉴클레오티드는 ATP 및 T4 폴리뉴클레오티드 키나제를 사용하여 표준 절차에 의해 인산화시킨다 (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). 인산화된 올리고뉴클레오티드를 어닐링하기 위해, 이들을 40 ㎕의 TA (33 mM Tris 아세테이트 (pH 7.9), 66 mM 아세트산칼륨, 10 mM 아세트산마그네슘) 중에 각각 약 3.75 μM의 농도로 함께 현탁시키고, 95℃로 4분 동안 가열하고, 서서히 4℃로 냉각시킨다. 각각의 올리고뉴클레오티드의 반대쪽 가닥을 합성함으로써 올리고뉴클레오티드로부터 완전한 유전자를 합성하기 위해, 다음 성분들을 최종 부피 100 ㎕로 첨가한다:
10 ㎕ 어닐링된 올리고뉴클레오티드
0.16 mM 각각의 데옥시리보뉴클레오티드
0.5 mM ATP
0.5 mM DTT
100 ㎍/ml BSA
3.5 ㎍/ml T4 g43 단백질 (DNA 폴리머라제)
25 ㎍/ml T4 g44/62 단백질 (폴리머라제 보조 단백질)
25 ㎍/ml 45 단백질 (폴리머라제 보조 단백질)
혼합물을 37℃에서 30분 동안 인큐베이션한다. 이어서, 10 u의 T4 DNA 리가제를 첨가하고, 37℃에서 다시 30분 동안 인큐베이션한다. 반응물을 70℃에서 15분 동안 인큐베이션하여 폴리머라제 및 리가제를 불활성화시킨다. 유전자를 Xba I로 소화시키기 위해, BSA 200 ㎍/ml 및 DTT 1 mM, 43 ㎕의 물, 및 50 u의 Xba I 5 ㎕를 함유하는 2X TA 50 ㎕을 반응물에 첨가한다. 반응물을 3시간 동안 37℃에서 인큐베이션한 후, 겔 상에서 정제한다. Xba I 단편을 겔로부터 정제하고, 표준 방법에 의해 플라스미드 pUC19 내의 Xba I 부위 내로 클로닝한다. 플라스미드를 표준 기술로 정제하고, 디데옥시 방법으로 서열을 결정한다.
인간화 경쇄 및 중쇄를 발현하는 플라스미드의 제작은 경쇄 및 중쇄 Xba I 단편을 그들이 삽입된 pUC19 플라스미드로부터 단리한 후, 이를 적절한 숙주 세포 내로 형질감염될 때 높은 수준의 완전한 중쇄를 발현할 적절한 발현 벡터의 Xba I 부위 내로 삽입함으로써 달성된다.
인간화 항체의 합성 및 친화도
발현 벡터를 마우스 Sp2/0 세포 내로 형질감염시키고, 플라스미드를 통합한 세포를 표준 방법에 의해 발현 벡터에 의해 부여된 선택가능한 마커(들)에 기초하여 선택한다. 이들 세포가 EphB3에 결합하는 항체를 분비하는 것을 입증하기 위해, 세포로부터의 상등액을 EphB3을 발현하는 것으로 알려진 세포와 함께 인큐베이션한다. 세척 후, 세포를 플루오레세인-컨쥬게이팅된 염소 항-인간 항체와 함께 인큐베이션하고, 세척하고, FACSCAN 세포형광 측정기 상에서 형광에 대해 분석한다.
다음 실험을 위해, 인간화 항체를 생산하는 세포를 마우스에 주사하고, 생성되는 복수를 모은다. 인간화 항체는 복수로부터 표준 기술에 따라 Affigel-10 지지체 (바이오-라드 래보래토리스, 인크. (Bio-Rad Laboratories, Inc., 미국 캘리포니아주 리치먼드)) 상에 제조된 염소 항-인간 면역글로불린 항체의 친화도 컬럼을 통해 통과시켜 실질적인 균질도로 정제한다. 원래의 뮤린 항체에 비해 인간화 항체의 친화도를 당업계에 공지된 기술에 따라 결정한다.
실시예 8
뮤린 항체의 인간 조작
본 실시예는 인간 조작된™ 항체의 클로닝 및 발현뿐만 아니라 그러한 항체의 정제 및 결합 활성 시험에 대해 기재하고 있다.
인간 조작된™ 서열의 설계
항체 가변 도메인의 인간 조작™은 항체 분자의 결합 활성을 유지하면서 면역원성을 감소시키는 방법으로서 스터드닉카에 의해 설명되었다 [예를 들어, 미국 특허 5,766,886 (Studnicka et al.); [Studnicka et al. Protein Engineering 7: 805-814 (1994)] 참조). 상기 방법에 따라, 각각의 가변 구역 아미노산이 치환 위험에 배정된다. 아미노산 치환은 3개의 위험 카테고리 중 하나로 구분된다: (1) 저위험 변화는 항원 결합을 파괴할 가능성은 최소이면서 면역원성을 감소시킬 가능성이 아주 큰 변화이고; (2) 중간 위험 변화는 면역원성을 더욱 감소시킬 것이지만, 항원 결합 또는 단백질 폴딩에 영향을 줄 가능성이 보다 큰 변화이고; (3) 고위험 잔기는 결합 또는 항체 구조의 유지에 중요하고, 항원 결합 또는 단백질 폴딩에 영향을 줄 최고 위험을 수반하는 잔기이다. 프롤린의 3차원 구조의 역할 때문에, 프롤린에서의 변형은 그 위치가 일반적으로 저위험 위치인 경우에라도 일반적으로 적어도 중간 위험 변화인 것으로 간주된다. 치환 변화가 바람직하지만, 삽입 및 결실이 또한 가능하다. 도 7은 고, 중간 또는 저위험 변화로서 분류된, XPA.04.017, XPA.04.031 및 XPA.04.019 경쇄 및 중쇄의 각각의 아미노산 잔기에 대한 위험 배정을 보여준다.
뮤린 항체의 경쇄 및 중쇄의 가변 구역은 상기 방법을 이용하여 인간 조작™된다. 저위험 위치에서 상기 방법에 따른 변형에 대해 후보인 아미노산 잔기는 뮤린 가변 구역의 아미노산 서열을 인간 가변 구역 서열과 정렬시켜 확인된다. 개별 VH 또는 VL 서열 또는 인간 컨센서스 VH 또는 VL 서열을 비롯한 임의의 인간 가변 구역이 사용될 수 있다. 임의의 많은 저위험 위치에서, 또는 모든 저위험 위치에서 아미노산 잔기가 변화될 수 있다.
이와 유사하게, 모든 저위험 및 중간 위험 위치에서 상기 방법에 따른 변형에 대한 후보인 아미노산 잔기는 뮤린 가변 구역의 아미노산 서열을 인간 가변 구역 서열과 정렬시켜 확인된다. 임의의 많은 저위험 또는 중간 위험 위치에서, 또는 모든 저위험 및 중간 위험 위치에서 아미노산 잔기가 변화될 수 있다.
영구적인 세포주 개발을 위한 발현 벡터의 제조
항체-유래 신호 서열과 함께 각각의 상기 설명된 중쇄 및 경쇄 V 구역 서열을 코딩하는 DNA 단편을 합성 뉴클레오티드 합성을 이용하여 제작한다. 상기 설명된 각각의 경쇄 V 구역 아미노산 서열을 코딩하는 DNA를 인간 카파 경쇄 불변 구역을 함유하는 벡터 pMXP10 내로 삽입한다. 상기 설명된 각각의 중쇄 V 구역 아미노산 서열을 코딩하는 DNA를 인간 감마-1, 2, 3 또는 4 중쇄 불변 구역을 함유하는 벡터 pMXP6 내로 삽입한다. 이들 벡터는 모두 hCMV 프로모터 및 마우스 카파 경쇄 3' 비번역된 구역 및 선택가능 마커 유전자, 예를 들어, 각각 G418- 또는 히스티디놀-내성 형질감염체의 선택을 위한 neo 또는 his를 함유한다.
일시적인 발현을 위한 발현 벡터의 제조
상기 설명된 경쇄 또는 중쇄 유전자를 함유하는 벡터를 또한 일시적인 형질감염을 위해 제작하였다. 이들 벡터는 neo 또는 his 유전자 대신에, 엡스타인-바 (Epstein-Barr) 바이러스 핵 항원을 발현하는 HEK293 세포 내에서 복제를 위해 엡스타인-바 바이러스 oriP를 함유하는 것을 제외하고는 영구적인 형질감염에 대해 상기 설명된 것과 유사하다.
HEK293E 세포 내에서 인간 조작된 항- EphB3 항체의 일시적인 발현
각각 엡스타인-바 바이러스로부터의 oriV 및 상기 설명된 경쇄 및 중쇄 유전자를 함유하는 별개의 벡터를 HEK293E 세포 내로 일시적으로 형질감염시킨다. 일시적으로 형질감염된 세포를 10일까지 인큐베이션한 후, 상등액을 회수하고, 단백질 A 크로마토그래피를 이용하여 항체를 정제하였다.
영구적으로 형질감염된 CHO - K1 세포의 개발
각각 하나의 카피의 경쇄 및 중쇄 유전자를 함께 함유하는 상기 설명된 벡터를 엑스-셀 (Ex-Cell) 302-적응된 CHO-K1 세포 내로 형질감염시킨다. 엑스-셀 302 배지 내에서 현탁 성장에 적응된 CHO-K1 세포는 전형적으로 40 ㎍의 선형화 벡터로 전기천공한다. 별법으로, 선형화 DNA를 선형 폴리에틸렌이민 (PEI)과 복합체화하고, 형질감염을 위해 사용할 수 있다. 세포를 1％ FBS 및 G418을 보충한 엑스-셀 302 배지를 함유하는 96 웰 플레이트에 플레이팅한다. 클론을 96 웰 플레이트 내에서 스크리닝하고, 각각의 형질감염으로부터 상층 약 10％의 클론을 엑스-셀 302 배지를 함유하는 24 웰 플레이트로 옮긴다.
생산력 시험은 7 및 14일 동안 성장시킨 배양액에 대해 엑스-셀 302 배지 내에서 24 웰 플레이트 내에서 수행하고, 이때 배양 상등액을 IgG에 대한 면역글로불린 ELISA 분석에 의해 분비된 항체 수준에 대해 시험한다.
상층 클론을 엑스-셀 302 배지를 함유하는 진탕 플라스크로 옮긴다. 세포가 현탁 성장에 적응되자마자, 엑스-셀 302 배지 내에서 이들 클론을 사용하여 진탕 플라스크 시험을 수행한다. 세포를 10일까지 25 ml 배지를 함유하는 125 ml 엘렌마이어 (Erlenmeyer) 플라스크 내에서 성장시킨다. 플라스크를 인큐베이션 기간에 적어도 2일마다 열어서 기체 교환시키고, 배지 내의 면역글로불린 폴리펩티드의 수준을 인큐베이션 기간의 끝에 IgG ELISA에 의해 결정한다. 2 또는 3개의 다단위 전사 벡터를 사용하여 동일한 세포주를 다수 순차 형질감염시켜 면역글로불린 생산의 수준이 바람직하게는 300 ㎍/ml 이상 더욱 증가한 클론 및 세포주를 얻는다.
정제
본 발명에 따른 벡터 및 모든 세포주로부터 면역글로불린 폴리펩티드를 정제하기 위한 공정을 설계할 수 있다. 예를 들어, 당업계에 잘 알려진 방법에 따라, 세포는 종료 후 여과에 의해 제거된다. 여액을 단백질 A 컬럼 (필요한 경우 다수 통과로) 상에 로딩한다. 컬럼을 세척한 후, 발현되고 분비된 면역글로불린 폴리펩티드를 컬럼으로부터 용출시킨다. 항체 생성물의 제조를 위해, 단백질 A 풀을 바이러스 불활성화 단계로서 낮은 pH (최소 30분 및 최대 1시간 동안 pH 3)에서 유지한다. 이어서 흡착 양이온 교환 단계를 사용하여 생성물을 더욱 정제한다. 흡착 분리 칼럼으로부터의 용출물을 바이러스 보유 필터를 통해 통과시켜 잠재적인 바이러스 입자를 더욱 제거한다. 여액을 생성물이 결합하지 않는 음이온 교환 칼럼을 통해 통과시켜 더욱 정제한다. 마지막으로, 생성물을 투석여과를 통해 제제화 버퍼 내로 이동시켜 정제 과정을 끝낸다. 보유물을 적어도 1 mg/mL의 단백질 농도로 조정하고, 안정화제를 첨가한다.
결합 활성
재조합 인간 조작™ 항체의 EphB3 결합 활성을 평가한다. 단백질을 단백질 A 칼럼 위로 통과시켜 진탕 플라스크 배양 상등액으로부터 정제한 후, A280에 의해 농도를 결정한다. 결합 분석은 다른 실시예에 설명된 바와 같이 수행한다.
실시예 9
서열
서열 1 (EphB3의 nt 서열)
Figure 112009041043858-PCT00010
Figure 112009041043858-PCT00011
서열 2 (EphB3의 단백질 서열)
Figure 112009041043858-PCT00012
Figure 112009041043858-PCT00013
본 명세서에 인용되고/되거나 출원 데이터 시트에 기록된 모든 미국 특허, 미국 특허 공개, 미국 특허 출원, 외국 특허 및 외국 특허 출원 및 비-특허 공개 문헌은 그 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 명세서에 예시의 목적으로 본 발명의 구체적인 실시태양이 기재되어 있지만, 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 변형이 가능하다는 것이 상기한 바로부터 명백해질 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Novartis AG and Xoma Ltd. (Masat, et al.) <120> Antagonist Antibodies Against EphB3 <130> PP028395.0002 (27527/42271A) <150> US 60/873,386 <151> 2006-12-07 <160> 423 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 4096 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 cgtgagcggc gcagcaagat cccagctcgg accccggacg gcgcgcgccc ccgaagcccc 60 ggatcccagt cgggcccgca gctgaccgcc agattactgt gcatcccgaa tcacgaccac 120 ctgcaccctc ctgccccggc ccgcccccca agtcctcagg cacccagctc cccggcgccc 180 cggatcctcc tggaccggtc cgtccagatt cccgcgggac cgacctgtcc gcatccccag 240 gaccgccggg ctcggtgcac cgcctcggtc ccggagccgc ccgcctggat tgcattccct 300 cctctcctgg atctcctggg acccgacgcg agcctgcccc ggagcccgcc gagcgcaccc 360 tctctcgggt gcctgcagcc ccgccggcgc ggcccggccc ggcgcggccc ggctcggctc 420 ctagagctgc cacggccatg gccagagccc gcccgccgcc gccgccgtcg ccgccgccgg 480 ggcttctgcc gctgctccct ccgctgctgc tgctgccgct gctgctgctg cccgccggct 540 gccgggcgct ggaagagacc ctcatggaca caaaatgggt aacatctgag ttggcgtgga 600 catctcatcc agaaagtggg tgggaagagg tgagtggcta cgatgaggcc atgaatccca 660 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ccgcacggtc ccagattaca caaccttcac gacagttggt gattggctgg 3240 atgccatcaa gatggggcgg tacaaggaga gcttcgtcag tgcggggttt gcatcttttg 3300 acctggtggc ccagatgacg gcagaagacc tgctccgtat tggggtcacc ctggccggcc 3360 accagaagaa gatcctgagc agtatccagg acatgcggct gcagatgaac cagacgctgc 3420 ctgtgcaggt ctgacaccgg ctcccacggg gaccctgagg accgtgcagg gatgccaagc 3480 agccggctgg actttcggac tcttggactt ttggatgcct ggccttaggc tgtggcccag 3540 aagctggaag tttgggaaag gcccaagctg ggacttctcc aggcctgtgt tccctcccca 3600 ggaagtgcgc cccaaacctc ttcatattga agatggatta ggagaggggg tgatgacccc 3660 tccccaagcc cctcagggcc cagaccttcc tgctctccag caggggatcc ccacaacctc 3720 acacttgtct gttcttcagt gctggaggtc ctggcagggt caggctgggg taagccgggg 3780 ttccacaggg cccagccctg gcaggggtct ggccccccag gtaggcggag agcagtccct 3840 ccctcaggaa ctggaggagg ggactccagg aatggggaaa tgtgacacca ccatcctgaa 3900 gccagcttgc acctccagtt tgcacaggga tttgttctgg gggctgaggg ccctgtcccc 3960 acccccgccc ttggtgctgt cataaaaggg caggcagggg caggctgagg agttgccctt 4020 tgccccccag 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<213> Homo sapiens <400> 334 Ala Val Asn Ile Thr Thr Asn Gln Ala 1 5 <210> 335 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 335 Val Asn Ile Thr Thr Asn Gln Ala Ala 1 5 <210> 336 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 336 Asn Ile Thr Thr Asn Gln Ala Ala Pro 1 5 <210> 337 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 337 Ile Thr Thr Asn Gln Ala Ala Pro Ser 1 5 <210> 338 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 338 Thr Thr Asn Gln Ala Ala Pro Ser Glu 1 5 <210> 339 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 339 Thr Asn Gln Ala Ala Pro Ser Glu Val 1 5 <210> 340 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 340 Asn Gln Ala Ala Pro Ser Glu Val Pro 1 5 <210> 341 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 341 Gln Ala Ala Pro Ser Glu Val Pro Thr 1 5 <210> 342 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 342 Ala Ala Pro Ser Glu Val Pro Thr Leu 1 5 <210> 343 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 343 Ala Pro Ser Glu Val Pro Thr Leu Arg 1 5 <210> 344 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 344 Pro Ser Glu Val Pro Thr Leu Arg Leu 1 5 <210> 345 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 345 Ser Glu Val Pro Thr Leu Arg Leu His 1 5 <210> 346 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 346 Glu Val Pro Thr Leu Arg Leu His Ser 1 5 <210> 347 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 347 Val Pro Thr Leu Arg Leu His Ser Ser 1 5 <210> 348 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 348 Pro Thr Leu Arg Leu His Ser Ser Ser 1 5 <210> 349 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 349 Thr Leu Arg Leu His Ser Ser Ser Gly 1 5 <210> 350 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 350 Leu Arg Leu His Ser Ser Ser Gly Ser 1 5 <210> 351 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 351 Arg Leu His Ser Ser Ser Gly Ser Ser 1 5 <210> 352 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 352 Leu His Ser Ser Ser Gly Ser Ser Leu 1 5 <210> 353 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 353 Pro Leu Pro Pro Arg Tyr Ala Ala Val Asn 1 5 10 <210> 354 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 354 Leu Pro Pro Arg Tyr Ala Ala Val Asn Ile 1 5 10 <210> 355 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 355 Pro Pro Arg Tyr Ala Ala Val Asn Ile Thr 1 5 10 <210> 356 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 356 Pro Arg Tyr Ala Ala Val Asn Ile Thr Thr 1 5 10 <210> 357 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 357 Arg Tyr Ala Ala Val Asn Ile Thr Thr Asn 1 5 10 <210> 358 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 358 Tyr Ala Ala Val Asn Ile Thr Thr Asn Gln 1 5 10 <210> 359 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 359 Ala Ala Val Asn Ile Thr Thr Asn Gln Ala 1 5 10 <210> 360 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 360 Ala Val Asn Ile Thr Thr Asn Gln Ala Ala 1 5 10 <210> 361 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 361 Val Asn Ile Thr Thr Asn Gln Ala Ala Pro 1 5 10 <210> 362 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 362 Asn Ile Thr Thr Asn Gln Ala Ala Pro Ser 1 5 10 <210> 363 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 363 Ile Thr Thr Asn Gln Ala Ala Pro Ser Glu 1 5 10 <210> 364 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 364 Thr Thr Asn Gln Ala Ala Pro Ser Glu Val 1 5 10 <210> 365 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 365 Thr Asn Gln Ala Ala Pro Ser Glu Val Pro 1 5 10 <210> 366 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 366 Asn Gln Ala Ala Pro Ser Glu Val Pro Thr 1 5 10 <210> 367 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 367 Gln Ala Ala Pro Ser Glu Val Pro Thr Leu 1 5 10 <210> 368 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 368 Ala Ala Pro Ser Glu Val Pro Thr Leu Arg 1 5 10 <210> 369 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 369 Ala Pro Ser Glu Val Pro Thr Leu Arg Leu 1 5 10 <210> 370 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 370 Pro Ser Glu Val Pro Thr Leu Arg Leu His 1 5 10 <210> 371 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 371 Ser Glu Val Pro Thr Leu Arg Leu His Ser 1 5 10 <210> 372 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 372 Glu Val Pro Thr Leu Arg Leu His Ser Ser 1 5 10 <210> 373 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 373 Val Pro Thr Leu Arg Leu His Ser Ser Ser 1 5 10 <210> 374 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 374 Pro Thr Leu Arg Leu His Ser Ser Ser Gly 1 5 10 <210> 375 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 375 Thr Leu Arg Leu His Ser Ser Ser Gly Ser 1 5 10 <210> 376 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 376 Leu Arg Leu His Ser Ser Ser Gly Ser Ser 1 5 10 <210> 377 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 377 Arg Leu His Ser Ser Ser Gly Ser Ser Leu 1 5 10 <210> 378 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 378 Gln Leu Asp Gly Leu Arg Pro Asp 1 5 <210> 379 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 379 Leu Asp Gly Leu Arg Pro Asp Ala 1 5 <210> 380 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 380 Asp Gly Leu Arg Pro Asp Ala Arg 1 5 <210> 381 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 381 Gly Leu Arg Pro Asp Ala Arg Tyr 1 5 <210> 382 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 382 Leu Arg Pro Asp Ala Arg Tyr Val 1 5 <210> 383 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 383 Arg Pro Asp Ala Arg Tyr Val Val 1 5 <210> 384 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 384 Pro Asp Ala Arg Tyr Val Val Gln 1 5 <210> 385 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 385 Asp Ala Arg Tyr Val Val Gln Val 1 5 <210> 386 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 386 Ala Arg Tyr Val Val Gln Val Arg 1 5 <210> 387 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 387 Arg Tyr Val Val Gln Val Arg Ala 1 5 <210> 388 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 388 Tyr Val Val Gln Val Arg Ala Arg 1 5 <210> 389 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 389 Val Val Gln Val Arg Ala Arg Thr 1 5 <210> 390 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 390 Val Gln Val Arg Ala Arg Thr Val 1 5 <210> 391 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 391 Gln Val Arg Ala Arg Thr Val Ala 1 5 <210> 392 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 392 Val Arg Ala Arg Thr Val Ala Gly 1 5 <210> 393 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 393 Gln Leu Asp Gly Leu Arg Pro Asp Ala 1 5 <210> 394 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 394 Leu Asp Gly Leu Arg Pro Asp Ala Arg 1 5 <210> 395 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 395 Asp Gly Leu Arg Pro Asp Ala Arg Tyr 1 5 <210> 396 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 396 Gly Leu Arg Pro Asp Ala Arg Tyr Val 1 5 <210> 397 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 397 Leu Arg Pro Asp Ala Arg Tyr Val Val 1 5 <210> 398 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 398 Arg Pro Asp Ala Arg Tyr Val Val Gln 1 5 <210> 399 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 399 Pro Asp Ala Arg Tyr Val Val Gln Val 1 5 <210> 400 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 400 Asp Ala Arg Tyr Val Val Gln Val Arg 1 5 <210> 401 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 401 Ala Arg Tyr Val Val Gln Val Arg Ala 1 5 <210> 402 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 402 Arg Tyr Val Val Gln Val Arg Ala Arg 1 5 <210> 403 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 403 Tyr Val Val Gln Val Arg Ala Arg Thr 1 5 <210> 404 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 404 Val Val Gln Val Arg Ala Arg Thr Val 1 5 <210> 405 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 405 Val Gln Val Arg Ala Arg Thr Val Ala 1 5 <210> 406 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 406 Gln Val Arg Ala Arg Thr Val Ala Gly 1 5 <210> 407 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 407 Gln Leu Asp Gly Leu Arg Pro Asp Ala Arg 1 5 10 <210> 408 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 408 Leu Asp Gly Leu Arg Pro Asp Ala Arg Tyr 1 5 10 <210> 409 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 409 Asp Gly Leu Arg Pro Asp Ala Arg Tyr Val 1 5 10 <210> 410 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 410 Gly Leu Arg Pro Asp Ala Arg Tyr Val Val 1 5 10 <210> 411 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 411 Leu Arg Pro Asp Ala Arg Tyr Val Val Gln 1 5 10 <210> 412 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 412 Arg Pro Asp Ala Arg Tyr Val Val Gln Val 1 5 10 <210> 413 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 413 Pro Asp Ala Arg Tyr Val Val Gln Val Arg 1 5 10 <210> 414 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 414 Asp Ala Arg Tyr Val Val Gln Val Arg Ala 1 5 10 <210> 415 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 415 Ala Arg Tyr Val Val Gln Val Arg Ala Arg 1 5 10 <210> 416 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 416 Arg Tyr Val Val Gln Val Arg Ala Arg Thr 1 5 10 <210> 417 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 417 Tyr Val Val Gln Val Arg Ala Arg Thr Val 1 5 10 <210> 418 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 418 Val Val Gln Val Arg Ala Arg Thr Val Ala 1 5 10 <210> 419 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 419 Val Gln Val Arg Ala Arg Thr Val Ala Gly 1 5 10 <210> 420 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 420 tcgtatacat ttcttacatc tatgcgctgg aagagaccct catggacaca aa 52 <210> 421 <211> 108 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 421 gggacaagtt tgtacaaaaa agcaggctac gaaggagata tacatatgaa attcttagtc 60 aacgttgccc ttgtttttat ggtcgtatac atttcttaca tctatgcg 108 <210> 422 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 422 cgggtcgtcg aggtcctcgt cgaagggcct cgtgtagtgg tagtggtagt gcct 54 <210> 423 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 423 cctcgtgtag tggtagtggt agtgcctcga atttgggtcg aaagaacatg tttcaccagg 60 g 61

Claims (44)

  1. EphB3의 세포외 도메인에 10-6 M 이하의 친화도 (KD)로 결합하고, EphB3에 대한 결합을 위해 항체 XPA.04.017, XHA.05.172, XHA.05.849, XPA.04.031, 또는 XPA.04.019 중 어느 하나와 75％를 초과하는 수준으로 경쟁하는 길항제 항체.
  2. 제1항에 있어서, 항체 XPA.04.017, XHA.05.172, XHA.05.849, XPA.04.031, 또는 XPA.04.019 중 어느 하나가 결합하는 에피토프와 동일한 EphB3의 에피토프에 결합하는 항체.
  3. 항체 XPA.04.017, XHA.05.172, XHA.05.849, XPA.04.031, 또는 XPA.04.019 중 어느 하나의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함하는 길항제 항체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 조작된 (human engineered) 항체, 인간 항체, 단일쇄 항체 또는 항체 단편인 항체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, CDR 내의 적어도 하나의 아미노산이 다른 항-EphB3 항체의 상응하는 CDR의 상응하는 잔기로 치환된 것인 항체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, CDR 내의 1개 또는 2개의 아미노산이 변형된 것인 항체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 XPA.04.017, XHA.05.172, XHA.05.849, XPA.04.031, 또는 XPA.04.019의 가변 경쇄 또는 중쇄 구역에 대하여 적어도 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99％의 동일성을 보유하는 항체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 항체 서열의 불변 구역 및 인간 항체 서열의 하나 이상의 중쇄 및 경쇄 가변 프레임워크 구역을 포함하는 항체.
  9. 제8항에 있어서, 인간 항체 서열이 개별 인간 서열, 인간 컨센서스 서열, 개별 인간 생식계열 서열, 또는 인간 컨센서스 생식계열 서열인 항체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 불변 구역이 변형되거나 또는 변형되지 않은 IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, 그의 단편, 또는 그의 조합물인 항체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, EphB3에 대한 결합 친화도가 10-7, 10-8 또는 10-9 M 이하인 항체.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, CDR 내에 보존적 치환을 포함하는 항체.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 저위험 및 중간 위험 잔기에 보존적 또는 비-보존적 변화를 포함하는 항체.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 경쇄 불변 구역이 변형되거나 또는 변형되지 않은 람다 경쇄 불변 구역, 카파 경쇄 불변 구역, 그의 단편, 또는 그의 조합물인 항체.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, EphB3 인산화를 억제하는 항체.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, EphB3 이량체화를 억제하는 항체.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, EphB3 리간드-유도된 수용체 활성화를 억제하는 항체.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, EphB3 신호전달을 억제하는 항체.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, EphB3에 대한 에프린 B2의 결합을 억제하는 항체.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, EphB3에 대한 에프린 B1의 결합을 억제하는 항체.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, EphB3에 대한 에프린 B3의 결합을 억제하는 항체.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 장관 세포의 증식을 억제하는 항체.
  23. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 혈관 세포의 증식을 억제하는 항체.
  24. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴런 세포의 증식을 촉진하는 항체.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 다른 진단제 또는 치료제에 컨쥬게이팅된 항체.
  26. EphB3의 ECD를 포함하는 폴리펩티드를 항체 XPA.04.017, XPA.04.031, 또는 XPA.04.019의 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 함유하는 후보 항체와 접촉시키는 단계;
    폴리펩티드에 대한 후보 항체의 결합 친화도를 검출하는 단계, 및
    적어도 10-6 M의 결합 친화도가 검출될 경우에 상기 후보 항체를 EphB3-관련 질병 또는 질환의 치료에 유용한 항체로서 확인하는 단계
    를 포함하는, EphB3-관련 질병 또는 질환의 치료에 유용한 EphB3 단백질의 세포외 도메인에 대한 길항제 항체를 스크리닝하는 방법.
  27. 항체 XPA.04.017, XHA.05.172, XHA.05.849, XPA.04.031, 또는 XPA.04.019의 CDR 내에 1개 또는 2개의 아미노산에 대한 변형을 함유하는 후보 항체를 제조하는 단계;
    EphB3의 ECD를 포함하는 폴리펩티드를 상기 후보 항체와 접촉시키는 단계;
    폴리펩티드에 대한 후보 항체의 결합 친화도를 검출하는 단계, 및
    적어도 10-6 M의 결합 친화도가 검출될 경우에 상기 후보 항체를 EphB3-관련 질병 또는 질환의 치료에 유용한 항체로서 확인하는 단계
    를 포함하는, 길항제 항체를 체계적으로 변경시키고 EphB3-관련 질병 또는 질환의 치료에 유용한 EphB3 단백질의 세포외 도메인에 대한 길항제 항체를 스크리닝하는 방법.
  28. 세포를 항체 XPA.04.017, XHA.05.172, XHA.05.849, XPA.04.031, 또는 XPA.04.019의 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 함유하는 후보 항체 또는 하나 이상의 CDR 내에 1개 또는 2개의 아미노산의 변형을 함유하는 항체와 접촉시키는 단계;
    상기 세포의 증식 또는 생존을 검출하는 단계; 및
    세포 증식 또는 생존의 감소 또는 증가가 검출되면 상기 후보 항체를 EphB3-관련 질병 또는 질환의 치료에 유용한 항체로서 확인하는 단계
    를 포함하는, EphB3-관련 질병 또는 질환의 치료에 유용한 EphB3 단백질의 세포외 도메인에 대한 길항제 항체를 스크리닝하는 방법.
  29. 치료상 유효량의 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 복강 질병으로 고통받고 있는 대상의 치료 방법.
  30. 치료상 유효량의 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 혈관신생 질병으로 고통받고 있는 대상의 치료 방법.
  31. 치료상 유효량의 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 뉴런 손상으로 고통받고 있는 대상의 치료 방법.
  32. 치료상 유효량의 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 신경퇴행성 질병으로 고통받고 있는 대상의 치료 방법.
  33. 다른 치료제에 컨쥬게이팅된 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 항체를 투여하는 단계를 포함하는, EphB3을 발현하는 세포를 표적화하는 방법.
  34. 제29항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 대상이 포유동물인 방법.
  35. 제34항에 있어서, 대상이 인간인 방법.
  36. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 항체의 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
  37. 조절 제어 서열에 작동가능하게 연결된 제36항에 따른 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
  38. 제37항의 벡터 또는 제36항의 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포.
  39. 제38항에 따른 숙주 세포를 적합한 조건 하에 배양하고, 상기 항체를 회수하는 것을 포함하는, 항체를 생산하기 위해 제38항에 따른 숙주 세포를 사용하는 방법.
  40. 제39항에 따른 방법에 의해 생산된 항체.
  41. 제1항 내지 제23항 및 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 95 중량％의 균일성으로 정제되는 항체.
  42. 제41항의 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  43. 용기 내에 포장된, 치료상 유효량의 본 발명의 항체를 포함하는 제1항 내지 제25항, 제40항 및 제41항 중 어느 한 항의 항체를 포함하고, 임의로 제2 치료제를 포함하며, 추가로 용기에 부착되거나 용기와 함께 포장된, 용기의 내용물을 설명하고 EphB3-관련 질병 또는 질환의 치료를 위한 용기의 내용물의 용도에 대한 지침 및/또는 사용설명서를 제공하는 라벨을 포함하는 키트.
  44. 제43항에 있어서, 용기가 바이알 또는 병 또는 사전충전형 시린지인 키트.
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