JP3285355B2 - ｉｎｖｉｖｏ遺伝子治療のための方法及び組成物 - Google Patents

ｉｎｖｉｖｏ遺伝子治療のための方法及び組成物

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Description

【発明の詳細な説明】 序論 技術分野 本発明は、in vivoで哺乳類、特にヒトの細胞への外
因性遺伝物質の全身性導入のための方法及び組成物に関
する。
背景 異常な発現が生命を脅かすヒトの疾患に関連する遺伝
子のかなり長い配列がクローン化され同定されている。
このようなクローン化遺伝子のヒトにおける発現能は、
多くの重要なヒトの疾患の予防及び／又は治療を最終的
には可能にするであろう。このような疾患は、今、現在
有効な治療法によってごくわずかに治療されるか又は治
療不可能にある。例えば、ヒトの患者におけるコレステ
ロール調節遺伝子、HIVの複製を選択的に遮断する遺伝
子又は腫瘍抑制遺伝子のin vivo発現は、各々心臓疾
患、HIV及び癌の治療を劇的に改良する。しかし、現在
有効な遺伝子送達（delivery）戦略は、哺乳宿主への全
身性投与の後で、広範囲の組織におけるin vivoでの高
レベルの又は広汎性の注入遺伝子（transgene）発現を
もたらことはできていない。この不可能性は、殆どのヒ
トの疾患のための有効な遺伝子治療の開発を妨げてい
る。
遺伝子治療の手法には、異なる到達点とこれらの到達
点に達するための異なる方法が共に含まれる。この到達
点には、一般的に、遺伝子置換、遺伝子修正及び遺伝子
増大が含まれる。遺伝子置換では、変異遺伝子配列が、
特異的にゲノムから取り出され、正常な機能的遺伝子と
置換される。遺伝子修正では、変異遺伝子配列が、標的
ゲノムにおいて更に変化することなく修正される。遺伝
子増大では、欠陥細胞中の変異遺伝子の発現が、外来正
常遺伝子配列を導入することによって改変される。
他のよって用いられる上記到達点に達するための方法
には、標的細胞の“体外性（ex vivo）”トランスフェ
クションと、その後の宿主哺乳類における好適器官への
トランスフォームされた細胞の導入が含まれる。Ex viv
o技術には、裸のDNA又はDNAリポソーム結合体によるin
vivoでの細胞のトランスフェクションと、その後の宿主
器官への導入（“ex vivo"遺伝子治療）が含まれる。好
適標的器官又は組織の基準には、容易にアクセス可能で
あり、in vitroで操作することができ、遺伝的改変方法
が行いやすい標的器官及び組織であること並びに、理想
的には、非複製細胞又はサイクリング（細胞周期をまわ
っている）幹細胞を含み遺伝子修正を永続化できること
が含まれる。更に、遺伝的に改変された細胞を、機能的
及び安定な形態で生物へ再移植可能なことも必要であ
る。この基準に適合する標的器官の例は、哺乳類の骨髄
細胞である。ex vivo遺伝子治療の更なる基準には、レ
トロウィルスベクターを用いる場合、細胞が有糸分裂前
であることである；有糸分裂後の細胞は、レトロウィル
スベクターによる感染に無反応性である。これは報告さ
れていないが、例えば、修正遺伝子産物が所望の効果で
／標的細胞に、血液又は他の体液において循環して分泌
され影響を及ぼすならば、ex vivo遺伝子治療を用いて
標的器官又は組織以外からの細胞をトランスフェクト可
能となり得る。
ex vivo治療には幾つかの欠点がある。例えば、分化
し、複製中の細胞のみが感染すると、新たに導入された
遺伝子機能は、その細胞が成熟して死滅すれば失われて
しまう。ex vivo的手段は、また限られた数の細胞のト
ランスフェクションにしか利用できず、生体から最初に
取り出されたものでない細胞をトランスフェクトするた
めには利用できない。上記の方法は、一般的に細胞ゲノ
ムへ新たな遺伝物質を組み込むことに関連しており、従
って、永久的な変化を達成する。
リポソームは、特に薬物、放射性治療剤、酵素、ウィ
ルス、転写因子及び他の細胞性エフェクターを種々の培
養細胞株及び動物へ導入することに、効率的に用いられ
ている。導入させるための試薬は、普通、リポソーム、
または脂質小胞中に捕獲されているか、該試薬を該小胞
の外側に結合させ得る。リポソーム仲介薬物送達の効率
を試験するための首尾よい臨床実験が完成している。い
くつかの戦略が、特定の組織及び特定の細胞型にリポソ
ームを向けることによって、リポソーム仲介薬物送達の
効率を上げることを提案している。しかし、リポソーム
仲介ベクターの使用のための基本的な方法論が十分に開
発されている一方で、この技術がin vivo遺伝子治療に
おけるリポソーム主体トランスフェクションベクターに
ついては完成していない。
注入遺伝子のex vivo発現は、他によって報告されて
いるように、注入遺伝子の特定組織への直接的な注入、
例えば裸のDNA又はDNA−陽イオン性リポソーム複合体の
直接的な気管内、筋肉内若しくは動脈内注入に、又は宿
主細胞のex vivoトランスフェクション及びその後の再
注入に拘束されていた。該発現は低く、一般に、ひとつ
の組織に制限され、普通は注入された組織（例えば筋
肉）か；静脈注入が用いられた場合の肝臓若しくは肺
か；気管内注入が用いられた場合の肺かに限定され、こ
れらの組織内の全細胞の１％未満がトランスフェクトさ
れた。ある場合には、細胞のトランスフェクションは、
静脈投与の部位に輸入性の組織においてもたらされる。
現在有効な遺伝子送達の戦略は、in vivoでの高レベ
ル及び／又は広汎性の注入遺伝子発現をもたらすこと
に、一様に失敗している。従って、多くのヒト疾患のin
vivo治療、予防又は軽減のために、注入遺伝子の高レ
ベルの転写及び／又は種々の細胞及び組織タイプでの発
現のためのin vivo遺伝子治療の組成物及び送達方法を
開発することが興味の対象となっている。遺伝子治療の
他の方法としての遺伝子改変の使用もまた、興味の対象
となっている。遺伝子改変では、既に発現された遺伝子
の発現を、外因性正常遺伝子配列を導入することによっ
て増大させ、アンチセンス遺伝子若しくは遺伝子断片
（フラグメント）を導入することによって、又は特定mR
NAを開裂できるリボザイムをもたらすことができるベク
ターを導入することによって減少させる。遺伝子改変
は、遺伝子発現を範囲を改変し、又は遺伝子産物のプロ
セッシング、構築若しくは分泌に影響するタンパク質を
コードする外因性正常遺伝子配列を導入することによっ
て達成することもできる。
関連文献 多数の刊行物が哺乳類のin vivo及びex vivoトランス
フェクションに関連している。あるものは、注入遺伝子
の転写が達成できたことのみであり、他のものは、低レ
ベルの発現及び／又は限定数の組織若しくは細胞タイプ
での発現のみを示したデータを提示している。以下のも
のは、この領域の刊行物の例である。
機能的な新規遺伝物質の細胞への導入のための種々の
手段が、in vitro及びin vivoの両方で試みられた（フ
リードマン（Friedmann），（1989）Science,244:1275
−280）。これらの手段には、改変レトロウィルスへの
発現すべき遺伝子の組み込み（フリードマン，（1989）
前出）；ローゼンバーグ（Rosenberg）（1991）Cancer
Research 51（18）、追補:5074S−5079S）；非レトロウ
ィルスベクターへの組み込み（ローゼンフェルド（Rose
nfeld）ら、（1992）Cell,68:143−155;ローゼンフェル
ドら、（1991）Science,252:431−434）；又は、リポソ
ームを介した異種プロモーター−エンハンサー要素に連
結された注入遺伝子の送達（フリードマン、（1989）、
前出；ブリガムら、（1989）Am.J.Med.Sci.,298:278−2
81;ナーベル（Nabel）ら、（1990）Science,249:1285−
1288;ハジンスキ（Hazinski）ら、（1991）Am.J.Resp.C
ell Molec.Biol.,4:206−209;ワンとホァン（Huang）、
（1987）、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,84:7815−785
5）；リガンド特異性、陽イオン主体輸送システムとの
結合（ウー（Wu）及びウー、（1988）J.Biol.Chem.,26
3:14621−14624）又は裸のDNA発現ベクターの使用（ナ
ーベルら、（1990）、前出）；ウォルフ（Wolff）ら、
（1990）Science,247:1465−1468）が含まれる。注入遺
伝子の組織への直接的な注入は、局所的な発現のみをも
たらす（ローゼンフェルド、（1992）前出）；ローゼン
フェルドら、（1991），前出；ブリガムら（1989）、前
出；ナーベル、（1990）、前出；及びハジンスキら、
（1991）、前出）。ブリガムらのグループ（Am.J.Med.S
ci.（1989）298:278−281及びClinical Research（199
1）39（抄録））は、DNAリポソーム複合物の静脈内又は
気管内投与後でのマウスの肺のin vivoのトランスフェ
クションのみを報告している。ヒト遺伝子治療手法の総
説記事の例には；アンダーソン（Anderson）、Science
（1992）256:808−813がある。
PCT/US90/01515（フェルナー（Felgner）ら）は、in
vivoでの脊椎動物の細胞の内部への医薬的又は免疫原的
ポリペプチドをコードする遺伝子の送達方法に向けられ
ている。注入遺伝子の発現は、注入組織に限定されてい
る。PCT/US90/05993（ブリガム）は、発現コンストラク
ト（構築物）の静脈内又は気管内注入の後の哺乳類の肺
細胞における注入遺伝子の発現を得る方法に向けられて
いる。PCT89/02469及びPCT90/06997は、ex vivo遺伝子
治療に向けられ、これは、体内から取り出すことができ
る細胞例えばリンパ球における注入遺伝子の発現に限定
されている。PCT89/12109は、同様にex vivo遺伝子治療
に向けられている。PCT90/12878は、トランスフォーム
された細胞株と、ex vivoトランスフェクションを用い
たトランスジェニックマウスとの両方における高レベル
な発現を提供する。PCT/US92/08806は、哺乳類の非接触
細胞の粒子仲介トランスフォーメーションに向けられて
いる。EP出願91301819.8は、組み換え技術を用いて嚢胞
性繊維症膜貫通型コンダクタンス調節物質（CFTR）を生
成することに向けられている。
発明の概要 DNA発現カセットで哺乳類中の細胞をトランスフォー
ムする方法と哺乳トランスフォーメーションリポソーム
が提供される。この方法では、哺乳類へ発現カセットを
導入することを含む。この方法において、DNAカセット
は、プロモータ及びポリペプチドをコードするDNA配列
を含み、前記DNAカセットは、陽イオン及び非陽イオン
脂質を含む脂質キャリアと複合化しており、ここで、陽
イオン脂質対非陽イオン脂質のモル比は５％と100％の
間であり、これにより約100nmと約10μｍの間の平均直
径を有するDNA発現カセット−脂質キャリア複合体とな
る。また、in vivoで哺乳類中の細胞の最適なトランス
フォーメーションを提供するDNA対脂質キャリアの比を
決定する方法が提供される。この方法では、第１のDNA:
脂質キャリア比を有する第１のDNA:脂質キャリア複合体
と、第２のDNA:脂質キャリア比を有する第２のDNA:脂質
キャリア複合体とを各々、第１の哺乳類及び第２の哺乳
類に対して全身的に導入する工程、DNAでトランスフォ
ームされた細胞型のパーセンテージを各々測定する工
程、測定されたパーセンテージを比較する工程を含む。
更に、DNAを用いて哺乳類中の細胞をトランスフォーム
する方法が提供される。この方法では、水溶液中のDNA
を哺乳類へ全身的に投与することを含む。
図面の説明 図1Aは、トランスフェクションカセットで注入された
マウスからの、図1Bでは対照群のマウスからの、マウス
肺の切片の顕微鏡写真を示している。1Aの顕微鏡写真
は、pZN27:DDAB:コレステロール発現ベクター−陽イオ
ン性脂質キャリア複合体の静脈注入後48時間のマウス肺
の切片を示している。プラスミドは、CAT（クロラムフ
ェニコールアセチルトランスフェラーゼ）の発現のため
の配列を含む。脂質キャリア組成物は、１対１のDDAB:
コレステロールであった。キャリア：プラスミド比は、
5nmol陽イオン性脂質対１μgDNAであった。100μｇの投
与量のDNAを、マウス毎に注入した。この視野では、肺
胞及び肺胞管壁細胞が示されており、この殆ど（50〜70
％）が、抗CAT抗体でつり上げ、アルカリホスファター
ゼを用いて視覚化をした場合に、CATタンパク質の存在
について、赤く陽性に染まる（矢印で表示）。処理され
た動物の肺は、肺胞及び血管内皮細胞に拡散して不均一
に染まる。気道上皮の染色は、また、気道細胞もトラン
スフェクトされていることを示しているように見える。
CATタンパク質は、通常、哺乳細胞には存在せず、従っ
て、これらの細胞でのCATタンパク質の存在は、in vivo
でトランスフェクトされたものであることを示してい
る。1Bでの顕微鏡写真は、静脈注入された脂質キャリア
のみで処理され、抗CAT抗体でつり上げられた対照群マ
ウスからのマウス肺切片を示している。細胞は、顕著に
は染色されないが、低レベルのバックグラウンドの染色
が幾つかの肺胞マクロファージで検出され（矢印で表
示）、この細胞は、内因性のアルカリホスファターゼ活
性を有している。
図2Aは、DNA−陽イオン性脂質キャリア複合体の腹腔
内（ip）注入の48時間後に単離されたマウスＴリンパ球
の位相差顕微鏡写真を示している。脂質キャリアは、DD
AB:DOPE、１対１モル比であった。DNA−陽イオン性脂質
キャリア複合体は1mgのpCIS−CATと１μmolの陽イオン
性脂質であった。1mgのDNAをipで注入した。細胞を抗CA
Tマウスモノクローナル抗体と、その後にテキサスレッ
ド結合ヤギ抗マウスIgGと共にインキュベートした。図2
Bは、同一視野の蛍光顕微鏡写真を示しており、これ
は、処理動物から取り出され、存在する本質的に全ての
Ｔ細胞は、DNA/陽イオン性脂質キャリア複合体のip注入
後でのトランスフェクトされたCAT遺伝子の発現を証明
する免疫蛍光によって、赤く染色された。図2Cは、未注
入の対照マウスから単離されたＴリンパ球の位相差顕微
鏡写真を示している。図2Dは、同一視野の蛍光顕微鏡写
真を示し、これは、対照動物群からのこれらのリンパ球
ではCAT遺伝子発現がないことを示している。
図3Aは、48時間前にDNA:脂質キャリア複合体DDAB:コ
レステロール:pZN51で処理したマウスからの造血系骨髄
由来細胞を示している。細胞を、図１のようにCATタン
パク質について染めた。顕微鏡写真は、始原細胞又は芽
球細胞を含む約70％の骨髄由来細胞が赤く染まり（矢印
は芽球細胞を示している）、in vivoでトランスフェク
トされることを示している。脂質キャリアは1:1のDDAB:
コレステロールであった。DNA:陽イオン性脂質の比は、
１μｇのDNA対5nmolの陽イオン性脂質であった。100μ
ｇのDNAを各マウスへivで注入した。図3Bは、未処理の
対照マウスからの単離骨髄細胞を示している。顕微鏡写
真は赤く染まらず、これは、未処理動物においてCAT遺
伝子発現がないことを示している。
図4A−4Bは、培養でのCAT発現プラスミド−DNA複合体
によるヒトＴ細胞（CD4+）のトランスフェクションを示
している。脂質キャリア組成物は、1:1モル比のDDAB:DO
PEの小単ラメラ小胞（SUV）であった。50nmolの陽イオ
ン性脂質と複合化された25μｇのpZN27は、培養中の100
0万の細胞へ添加された。細胞を、抗CATマウスモノクロ
ーナル抗体と、その後に、テキサスレッド結合ヤギ抗マ
ウスIgGと共にインキュベートした。図4Aは、トランス
フェクション後48時間の新鮮な単離ヒトCD4+Tリンパ球
の位相差顕微鏡写真を示している。図4Bは、同一視野の
蛍光顕微鏡写真を示し、これは、本質的に100％のＴリ
ンパ球がCATタンパク質のついて陽性に染め、即ち、こ
れらはトランスフェクトされたことを証明している。
図５は、プラスミドpZN20のコンストラクションを示
している。
図6Aは、HCMV（Towne）の前初期エンハンサー及びプ
ロモーター領域の制限地図を示し、HCMV（AD169）のも
のは図6Cに示されている。図6Bは、２つのHCMVプロモー
タの配列比較を示している。Nco I部位の位置は、アル
タリスクで示してある。
図７（パネルａ−ｆ）は、電子顕微鏡写真を示し、こ
れの写真は、陽イオン性脂質キャリア:DNA複合体（DOTM
A:DOPE:pRSV−CAT）が、細胞表面リセプターに結合した
後、伝統的なリセプター仲介エンドサイトシスを介して
CV−１（アフリカミドリザルの肝臓）細胞によって内在
化されることを証明している。pRSVCATのコンストラク
ションは、ゴルマン（Gorman）ら、（1982）Proc.Natl.
Acad.Sci.,USA.,79:6777−6781を参照のこと。脂質キャ
リアは1:1のDOTMA:DOPEであった。20μｇのDNAを20nmol
の陽イオン性脂質と複合化して、２×106の細胞に添加
した。パネル（ａ）中の矢印はクラスリン被覆小胞に結
合している粒子を示し、パネル（ｂ）の矢印は、取り込
まれてエンドソーム内に存在している粒子を示してい
る。
図8A−8Cは、CMV−CAT陽イオン性脂質キャリア:DNA複
合体の静脈注入を受けたＢ−16メラノーマ発生動物から
の肺の組織学的解析の顕微鏡写真を示している。脂質キ
ャリアは1:1モル比のDOTAP:コレステロールであった。
陽イオン性脂質:DNA比は、6nmol:1μgDNAであった。用
いたプラスミドはpZN20（図５参照）であった。マウス
当たり100μgDNAを注入した。CATタンパク質の免疫組織
化学的解析は、多くの集中した実質の腫瘍の強い赤の染
色（図8Aでは矢印で表示）と、血管内の腫瘍塞栓（図8B
では矢印で表示）とを示し、これは、肺における多くの
B16メラノーマ腫瘍細胞が血管経由転移（blood−borne
metastases）と同様に、静脈注入後にトランスフェクト
されることを示している。図8Cは、DNA−脂質キャリア
複合体の注入を受けなかったB16メラノーマ発生マウス
からの組織において、CATタンパク質が、周囲の正常肺
又は肺腫瘍細胞のいずれにも存在しないことを示してい
る。
図９は、CATをコードしているプラスミドpZN27の構築
を示している。
図10A及び図10Bは、ヒトIL−２をコードしているプラ
スミドpZN46の構築を示している。
図11は、ヒトCFTRをコードしているプラスミドpZN32
の構築を示している。
図12A−12Eは、pZN32:陽イオン性脂質キャリア複合体
又は脂質キャリアのみ（対照群マウス）の静脈投与で処
理されたマウスからの肺組織の免疫組織的に（CFTRタン
パク質の対して）染色された凍結切片の顕微鏡写真を示
している。図12A、12C及び12Eは、各々50×、100×及び
250×の倍率によるDNA脂質キャリア複合体で処理された
マウスからの肺切片である。図12B及び12Dは、50×及び
100×の倍率による対照マウスからの肺切片であり、こ
れは、対照マウスの肺には検出可能なCFTR発現がないこ
とを示している。脂質キャリアは1:1モルのDDAB:コレス
テロール（SUV）であった。脂質キャリア−DNA複合体
は、5nmolの陽イオン性脂質体１μｇのDNAであった。マ
ウスに対して100μｇのDNAを注入した。動物を、注入後
24時間で犠牲死させた。これらの図は、気道及び気道管
壁細胞の両方の＞70％が強く赤く染まることを示し、こ
れはこれらの細胞が、CFTR遺伝子を発現していることを
示している。
図13は、CATをコードしているプラスミドpZN51の構築
を示している。
図14は、全てCATをコードしているプラスミドpZN60、
ZN61、pZN62及びpZN63の構築を示している。図14A及び1
4Bは、中間体プラスミドpZN52、pZN54、pZN56及びpZN58
の構築を示している。図14Cは、中間体からの最終プラ
スミドpZN60からpZN63の構築を示している。
図15は、マウスに静脈注入された６つの異なるプラス
ミドについてのCATアッセイの薄層クロマトグラフィの
オートラジオグラフを示している。レーン１−12は、肺
組織のCAT活性を示し、レーン13−24は、肝組織のCAT活
性を示し、レーン１、２、13、14はpZN51であり、レー
ン３、４、15、16はpZN60であり、レーン５、６、17、1
8はpZN61であり、レーン７、８、19、20はpZN62であ
り、レーン９、10、21、22はpZN63であり、レーン11、1
2、23、24はpZN27である。脂質キャリアはDDAB:コレス
テロール（1:1）であった。脂質キャリア−DNA複合体は
5nmolの陽イオン性脂質対１μｇのDNAであった。マウス
当たり100μｇのDNAを注入した。動物を48時間後に犠牲
死させた。各レーンは１匹マウスを表す。クロマトグラ
フィを、示されているように図の下部から上部に向けて
流している。図15の中カッコに示されるように、未反応
の14Cクロラムフェニコールは、TLCプレートの原点から
短い距離だけ移動している。14Cアセチル化クロラムフ
ェニコール種は、中カッコによって示されるようにプレ
ートの更に上にCAT酵素活性によって移動する。
図16A−16Eは、CATタンパク質について免疫組織化学
的に染色された凍結肺切片の顕微鏡写真を示している。
マウスには、尾静脈からpZN27（16A）が注入され、これ
は、CATについての赤い陽性染色が肺内部の内皮細胞、
肺胞、気道細胞であることを示している。これに対し
て、天然CFTRプロモータに凍結されたCAT遺伝子（pBE3.
8CAT）のリポソーム複合体は、主として気道上皮細胞に
CAT発現を示した（16B）。未注入の対照動物からの肺切
片は、赤い染色を示さず、これは、未トランスフェクト
細胞でのCAT発現がないことを示している（16C）。図16
Dは、pZN27処理マウスからの肺胞の高倍率の顕微鏡写真
を示し、これは、肺胞及び上皮細胞の両方におけるCAT
遺伝子産物についての高レベルの陽性赤染色を示してい
る。図16Eは、pBE3.8CAT注入マウスからの肺胞の高倍率
の顕微鏡写真を示し、これは、肺胞又は内皮細胞には、
いずれも顕著なCAT遺伝子発現がないことを示してい
る。100μｇのプラスミドを、SUVとしてのDDAB:コレス
テロールと複合化して静脈注入した。動物を24時間後に
犠牲死させた。
図16F−16Kは、未処理のマウス（レーン１−３）、pB
E3.8CAT（チュウ（Chou）ら、（1991）J.Biol.Chem.,26
6−24471−24476）をiv注入されたマウス（レーン４−
６）又はpCIS−CATを注入したマウス（レーン７−９）
からの組織であって、心臓（16F）、リンパ節（16G）、
脾臓（16H）、腎臓（16I）、肺（16J）及び肝臓（16K）
中のCAT活性の薄層クロマトグラフィのオートラジオグ
ラフを示している。脂質キャリアは、DDAB:コレステロ
ール、1:1SUV（１μgDNA対5nmol陽イオン性脂質）であ
って、マウス当たり100μｇを注入した。
図17はマウスGM−CSFをコードしているプラスミドpZN
84の構築を示している。
図18はヒトCFTRをコードしているプラスミドpZN102の
構築を示している。
図19Aは、TLCプレートのオートラジオグラフであり、
これは、全ての脂質キャリアを伴わないpZN27の注入後
の動物におけるCAT活性を示している。1mgを４時間にわ
たって２回ivで注入した。マウスを24時間後に犠牲死さ
せた。試験された種々の組織を各レーンの下に示す。
図19Bは、TLCプレートのオートラジオグラフであり、
これは、脂質キャリアと複合化されたpZN27を注入され
た動物におけるCAT活性を示している。脂質キャリア
は、DDAB:コレステロール１対１モルであり、５μｇの
プラスミドを1nmolの脂質と複合化した。100μｇをivで
注入し、動物を24時間後に犠牲死させた。試験された種
々の組織を各レーンの下に示す。
図20は、提示されている比のプラスミド：脂質におい
てDOTMA:DOPE（1:1）脂質キャリアと複合化されたpCIS
−CATの右脳室への注入のPLCプレートのオートラジオグ
ラフを示している。動物を2.5μｇの定位的な注入の48
時間後の犠牲死させた。１組のレーンは１匹のマウスを
示している。左（Ｌ）脳室は注入ていないので、左脳室
のトランスフェクションが、脳全体がトランスフェクト
されているかを証明する。
図21は、ヒト肺癌細胞株のトランスフェクションを示
している。TLCプレートのオートラジオグラフは、種々
の陽イオン性リポソームを用いてトランスフェクトされ
た３種の異なるヒト肺癌細胞株からの抽出物におけるCA
T活性を示している。肺癌細胞株NCI−H69、NCI−H82及
びNCI−H520を、プレート当たり２×106細胞で配置さ
せ、懸濁液でトランスフェクトさせた。細胞の個々のプ
レートを、５μｇのRSV−CAT（RC）のみ又は、合計で10
若しくは20nmolの精製DOTMA（Ｄ）、精製Ｌ−PE
（Ｌ）、若しくはＬ−PE/CEBA（L/CA）リポソームと複
合化したRSV−CAT5μｇでトランスフェクトした。細胞
をトランスフェクション後48時間で採取して、CAT活性
についてアッセイした。
図22は、DDAB:コレステロールリポソームと複合化し
た1mgのGM−CSFプラスミド（pZN84）（１μｇプラスミ
ド対1nmol脂質）をivで注入された１匹のヤギにおける
血清マウスGM−CSFレベルを示している。血清試料を、
注入後０、12、24,48、72、168及び840時間で採取し
た。マウスGM−CSFレベルを市販のキット（エンドゲ
ン）を用いてELISAによって測定した。
図23は、ヤギＡと同様にpZN84を注入した更に２匹の
ヤギ（Ｂ及びＣ）における血清マウスGM−CSFレベルを
示している。
特定具体例の説明 本発明によって、調製方法及び用途と共に核酸コンス
トラクトがもたらされ、これは、該核酸によって接触さ
れた組織及び細胞のトランスフェクションが起きるため
に十分に投与量で哺乳類宿主へコンストラクトを導入し
た後、該宿主の複数の組織において細胞の表現型のin v
ivo変化及び／又は改変をもたらす。トランスフェクシ
ョンベクターの成分は、一般に、転写の方向で連結され
た操作可能な成分として、転写開始領域、対象となるDN
A配列及び転写集結領域を含み、転写調節領域は、トラ
ンスフェクションの標的とされる宿主の哺乳類中で機能
する。任意には、イントロンを、該コンストラクトに好
ましくはコード化配列の5'末端に含み得る。一般に、該
コンストラクトは、宿主細胞ゲノム中へ組み込まれるよ
うにならず、主として染色体外に又はエピソーム形態で
維持される非組み込みプラスミドの一部として該宿主へ
導入される。該コンストラクトは、裸の核酸にも脂質キ
ャリアと会合した核酸にもすることができる。十分な投
与量とは、所望の効果、例えば動物又はヒトの疾患の予
防、緩和及び／又は治療、又は対象となる薬物の内因性
レベルの改変をもたらし得ることを意味する（“in viv
o"遺伝子治療）。この改変は広汎性であり得、即ち、多
数の細胞型若しくは組織において得られ、又は、この改
変は選択的に、例えば選択された細胞若しくは組織型に
のみにおいて及び／又はそこに誘導可能にし得る。
宿主への該核酸コンストラクトの導入部位にのみ又は
これに対して輸入性部分以外の複数の組織及び細胞のト
ランスフェクションが得られ、発現が高レベルで多数の
細胞及び細胞型において起こる。トランスフォームされ
得る組織には、正常な動物の肺、心臓、肝臓、骨髄、脾
臓、リンパ節、腎臓、胸腺、骨格筋、卵巣、子宮、胃、
小腸、大腸、膵臓及び脳と、腫瘍発生哺乳類の転移性腫
瘍及び脈管内腫瘍塞栓とが含まれる。トランスフェクト
される特定細胞には、マクロファージ、肺胞Ｉ型及びII
型細胞、肝細胞、気道上皮細胞、血管内皮細胞、心臓筋
細胞、骨髄芽球、赤芽球、Ｂリンパ球及びＴリンパ球が
含まれる。投与の経路は、普通は、循環性体液例えば血
液、脳脊髄液中であるが、投与の他の経路も用いること
ができる。該コンストラクトは、裸の核酸にも脂質キャ
リアと会合している核酸にもすることができる。任意に
は、脂質キャリア分子及び／又はコンストラクトは、特
定細胞型の標的化及び／又はそこに発現をもたらし得
る。
核酸コンストラクトを、合成、天然的に誘導又はこれ
らの組み合わせである核酸配列から調製することができ
る。この配列を、意図されているレシピエント宿主と相
同なドナー宿主から得ることができ、又は該核酸配列の
性質に基づいて、宿主の好ましいコドンを有する配列を
合成することもできる。宿主の好ましいコドンは、対象
となる特定宿主に大量に発現されているタンパク質に高
頻度はコドンから決定され得る。クローニングが細菌宿
主系において成されている場合には、コドン選択を変え
てこの細菌性宿主系における安定性を促進することが有
益である。意図される用途が、感染生物による疾患を治
療することである場合には、配列の適当な供給源は、RN
A又はDNAのいずれかのウィルス性の核酸とし得る。
遺伝子は高分子量であり、ポリカチオンであるので、
キャリア仲介送達は、通常、培養においてもin vivoに
おいても、細胞のDNAトランスフェクションに必ずしも
必要でない。陽イオン性脂質キャリア例えばリポソーム
を用いて、転写調節タンパク質を送達することができ
る。更に、リポソームそれ自身は、（ウィルスベクター
と異なり）in vivoで非免疫原のようである。リポソー
ム配合物には、陽イオン性脂質を有するものが包含さ
れ、ヒト患者において安全であり、よく寛容化されるこ
とが示されている（トリート（Treat）ら、（1990）J.N
atl.Cancer Instit.82:1706:1710）。多様なトランスフ
ェクション技術が、培養細胞における注入遺伝子の高レ
ベルの発現をもたらすことができるが、このような方法
のごく僅かには、リポソームを用いたものも含まれる
が、これらはin vivo遺伝子送達にも適用できる。陽イ
オン性リポソーム又は裸のDNAのいずれかを用いたin vi
voトランスフェクションを得る既存の試みは、１つの組
織のトランスフェクション及び／又は外因性DNAを導入
した組織のみのトランスフェクションをもたらしてい
る。トランスフェクションのこのパターンは、正常細胞
性機構により取り込まれるDNA及び／又はリポソームよ
りもむしろ、導入の組織中の細胞が、導入方法によって
傷つけられ、その後に導入される外因性DNAのいくつか
を取り込むことができる。
出願人は、驚くべきことに、広範囲の組織及び細胞型
のトランスフェクションと、哺乳類宿主への全身性投与
後の高レベルの注入遺伝子の発現とを共にもたらす変更
を発見した。これらの変化には、DNA:陽イオン性脂質キ
ャリア複合体の使用であって、DNA対脂質キャリアの陽
イオン性脂質の比はin vivo発現の獲得にかなり作用で
きる；以前用いられているよりも多くの量の複合体の使
用；適当なプロモータ成分の使用例えば、強く且つ継続
的な活性のもの例えばHCMV−IE1成分であり、これはin
vivoで多くの細胞型において増進された発現をもたらす
ために望ましい；並びに、注入遺伝子のコード化領域の
5'側の100bp以上のイントロンの置換又は、所望遺伝子
産物の生成に利用される全てのイントロンの除去が含ま
れる。更に、驚くべきことに、肺、肝臓、脾臓、腎臓、
リンパ節及び心臓を含む多数の組織を、高投与量の裸の
DNAを循環性体液例えば、血液又は脳脊髄液へ直接投与
した後にトランスフォームすることができることを発現
した。或いは、選択的な発現を、特定細胞及び組織型に
おいて所望に時期に（即ち、発現は誘導性である）、成
分特に用いコンストラクトのプロモータ及び／又はエン
ハンサーを変更することによって、又は、リポソームの
標的部分を使用することによって、得ることができる。
殆どの遺伝子治療戦略は、レトロウィルス性又はDNA
ウィルスベクターへの注入遺伝子挿入に依存している。
レトロウィルスの潜在的欠点には、裸のDNA又は陽イオ
ン性脂質キャリアの使用に対して、レトロウィルスのin
vivo（ex vivoとは逆に）注入遺伝子発現の制限された
仲介能；レトロウィルスベクターの非分裂細胞に対する
トランスフェクト無能性；感染性レトロウィルスをもた
らす複製欠陥レトロウィルスベクターにおける組み換え
現象の可能性；注入遺伝子の宿主細胞ゲノムDNAへのラ
ンダム挿入による癌遺伝子（オンコジン）の活性化又は
腫瘍抑制遺伝子の阻害可能性；サイズの制限、即ち、普
通15kb未満のDNAをレトロウィルスベクターにパッケー
ジすることができる；並びに、ベクターに対する宿主の
免疫応答を誘発する潜在的な免疫原性が含まれる。更
に、すべてのex vivo手段は、トランスフェクトされる
細胞を体外へ取り出し、一定期間培養系に維持すること
を必要とする。培養中では、細胞は有害又は潜在的に危
険な表現型的及び／又は遺伝子型的変更を実行するかし
れない。アデノウィルス及び他のDNAウィルスベクター
は、上記の潜在的制限の幾つかを共有する。従って、ア
デノウィルス若しくは他のDNAウィルスベクターを使用
しない本発明は、既存の技術を越える幾つかの利点を有
する。更に、本発明は、投与の容易さと他の方法によっ
て達成できない結果とを約束する。
本発明の用いられるコンストラクトには、当該コンス
トラクトの用途に応じて幾つかの形がある。従って、該
コンストラクトには、ベクター、転写カセット、発現カ
セット及びプラスミドが含まれる。転写及び翻訳開始領
域（時として“プロモータ”とも呼ばれる）は、転写開
始調節領域と翻訳されない5'側配列の翻訳開始調節領
域、リボソームへのmRNAの結合及び翻訳開始に寄与する
“リボソーム結合部位”が入っていることが望ましい。
開始制御領域の転写及び翻訳機能要素は、同一の遺伝子
から由来又はこれから入手可能であることが望ましい。
ある具体例では、プロモーターはエンハンサーなどの配
列の追加、又は必須でない及び／又は望ましくない配列
の削除によって改変される。“入手可能”とは、対象DN
Aの転写の所望な特異性を提供するために、本来のプロ
モーターと十分類似しているDNA配列を有するプロモー
ターを意図している。これには、天然配列と合成配列、
更には合成配列と天然配列の組合せによる配列が含まれ
る。
転写開始領域、即ちプロモーター要素については、対
象DNA配列の所望のレベルの転写を与えることを条件
に、どの領域を使われ得る。転写開始領域は、宿主細胞
に及び／又は転写されるべきDNA配列に、本来のもの若
しくは相同なもの、又は宿主細胞に固有でない及び／又
は転写されるべきDNA配列にとって外来の若しくは異種
のものとし得る。宿主細胞にとって固有でないとは、転
写開始領域を含むコンストラクトが挿入されるべき宿主
に、転写開始領域が正常では見つからないということを
意味する。DNA配列にとって外来とは、対象DNA配列に正
常では伴わない転写開始領域のことを意味する。転写開
始のための効率のよいプロモーター要素には、SV40（シ
ミアンウィルス40）初期プロモーター、RSV（ラウス肉
腫ウィルス）プロモーター、アデノウィルスメジャー後
期プロモーター、及びヒトCMV（サイトメガロウィル
ス）前初期１プロモーターが含まれる。
誘導プロモーターも、転写のタイミングを制御するの
が望ましい本発明で有用である。このプロモーターの例
には、β−インターフェロン遺伝子、熱ショック遺伝
子、メタロチオネイン遺伝子由来或いはエクジソンリセ
プターをコードするものなど昆虫の遺伝子を含むステロ
イドホルモン反応性遺伝子由来のもの等が含まれる。こ
のような誘導プロモーターは、インターフェロン又はグ
ルココルチコイドなど外部刺激を利用した注入遺伝子の
転写を調節するために用いることができる。真核プロモ
ーター要素の編成はかなり柔軟性があるので、構成的要
素と誘導要素との組合せを使用することもできる。２つ
以上の誘導プロモーター要素の縦列配置では、単一の誘
導要素で達成できるベースライン上の誘導レベルと比べ
た場合に、達せられる転写ベースライン上の誘導レベル
を上げ得る。
一般に、転写調節配列は遺伝子の転写開始の5'側に約
1.5kbまでのDNAを含むが、これよりはるかに小さくする
こともできる。必要があれば、この調節配列は、部位特
異的突然変異誘発により（クンケル（Kunkel）TA、198
5、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.82,488−492）、又は適当
な制限部位がＮ末端コドン近くで見つかれば、連結反応
（ライゲーション）によって都合のよいリンカーオリゴ
ヌクレオチドを導入することにより、希望するタンパク
質の最初のコドンに対応する位置で修飾され得る。理想
的な具体例では、互換性のある制限部位を持つコーディ
ング配列が、遺伝子のコドン＃１に対応する位置で連結
され得る。この置換物は、元のコーディング配列に完全
に置き換えるようにして挿入され得、従って置換された
配列は、その3'末端で遺伝子ターミネーター及びポリア
デニル化シグナルと隣接する。
転写エンハンサー要素は、任意的には転写又は発現カ
セットに含まれ得る。“転写エンハンサー要素”とは、
転写活性の基本的な調節因子であり、プロモーター要素
によって転写を増大するように作用でき、しかも一般に
転写活性を増強するためにプロモーターに対して5'方向
にしなくてもよいDNA配列を意図している。特定のカセ
ット中に使用されるプロモーター及びエンハンサー要素
の組合せは、特定作用を最大限発揮させる技術に精通し
ている者によって選択することができる。様々なエンハ
ンサー要素を、多様な組織や細胞型における所望レベル
の注入遺伝子の転写及び／又は発現を実現するために用
いることができる。例えば、ヒトCMV前初期プロモータ
ー−エンハンサー要素を、in vivoで様々な組織におい
て高レベルの注入遺伝子の転写及び発現をもたらすため
に用いることができる。
多くの種からの多様な細胞型中で、連結された遺伝子
に高レベルの転写をもたらす他のエンハンサー要素の例
には、SV40及びRSV−LTRからのエンハンサーが含まれ
る。SV40及びRSV−LTRは、必須な構成成分である。これ
らは特異的作用を有する他のエンハンサーと組み合わせ
ることもでき、特異的エンハンサーを単独で使用するこ
ともできる。従って、転写の特異的制御が所望されると
きは、組織、発達段階又は細胞特異性様式でのみ活性な
有効エンハンサー要素には、例えば免疫グロブリン、イ
ンターロイキン−２（IL−２）及びβ−グロビンエンハ
ンサーが含まれる。組織、発達段階又は細胞に特異的な
エンハンサーを使って、例えばＢリンパ球やＴリンパ球
などの特定の細胞型、或いはミエロイド若しくは赤血球
前駆細胞中で注入遺伝子の転写及び／又は発現をもたら
すことができる。或いは、高レベルの転写と組織特異性
注入遺伝子転写との両方を得るために、ヒト嚢胞性線維
症膜貫通型コンダクタンス調節物質（CFTR）遺伝子に由
来のものなど組織特異性プロモーターを、きわめて活性
が高く異種のエンハンサー要素、例えばSV40エンハンサ
ーに融合することができる。更に、LCKのような組織特
異性プロモーターの利用は、注入遺伝子転写をＴリンパ
球に向けることを可能にする。注入遺伝子の組織特異性
転写は、標的組織以外の組織で注入遺伝子の転写が生じ
ると有害な場合に、特に重要である。
２つ以上のエンハンサー要素又はエンハンサー要素の
組合せの縦列（タンデム）反復は、単一のコピーのエン
ハンサー要素の使用と比べて注入遺伝子の発現を有意に
増大し得る；それ故、エンハンサー要素は発現カセット
において有用である。単一プロモーターに隣接する若し
くはその内部にある、同一又は異なる供給源からの２つ
のエンハンサー要素の使用は、ある場合では、個々のエ
ンハンサーが単独で効果を有する各組織中での注入遺伝
子発現をもたらすことができ、それによって転写が達成
される組織の数が増加する。他の場合では、２つの異な
るエンハンサー要素の存在が、エンハンサー効果の沈黙
化（サイレンシング）を起こす。特別に希望する発現の
効果又は組織について、エンハンサー要素の特定の組合
せ方を評価することは、当該技術分野のレベル内であ
る。
一般には転写及び／又は発現カセットにイントロンを
含める必要はないが、静脈内又な腹腔内投与された注入
遺伝子の高レベルで且つ広範囲のin vivo転写及び／又
は発現を得るために十分な介在配列によって離間された
5'スプライス部位（供与接合部）及び3'スプライス部位
（受容接合部）を含むイントロンを、任意的に含めるこ
ともできる。概して、約100bpの介在配列は、希望する
発現パターン及び／又はレベルをもたらすが、希望する
結果を得るために、必要に応じて配列の大きさを変える
ことができる。任意的なイントロンをコーディング配列
の5'側に置くと、注入遺伝子の高レベルで且つ広範囲な
in vivo発現がもたらされるが、発現を得るためには一
般に必要ない。最適なのは、mRNA配列が誤ってスプライ
スされる結果をもたらす潜在スプライス部位を5'イント
ロンが特異的に欠損していることである。
これが用いられた場合、それぞれ5'から3'に編成され
たイントロン・スプライス供与部位とスプライス受容部
位が、転写開始部位と翻訳開始コドンの間に配置され
る。或いは、介在配列は翻訳終結コドン及び転写ターミ
ネーターの3'側又はコーディング領域の内に配置し得
る。イントロンは、介在配列との混成イントロン又はゲ
ノムコーディング配列から取ったイントロンとすること
ができる。コーディング領域の3'側のイントロン、100b
p未満のもの或いは潜在スプライス部位を含む全てのイ
ントロンは、一定の条件下でin vivoでもたらされる注
入遺伝子発現のレベルを実質的に低下し得る。しかし、
イントロンを欠くベクターを用いると、予期せずして、
注入遺伝子の高レベルのin vivo発現を達成することが
できる。従って、in vivoトランスフェクションでは、
このようなベクターは特に関心がもたれる。
転写及び／又は翻訳開始調節領域の下流で且つその制
御下には、対象の核酸配列を挿入するための多重クロー
ニング部位があり、対象の核酸配列は、宿主の表現型の
１以上の変更をもたらし、例えば、後天性免疫不全症候
群（AIDS）、嚢胞性繊維症、癌、心臓疾患、自己免疫疾
患及び多くの生命危機の感染に要求される治療を劇的に
改良する。便宜上、多重クローニング部位は、有効な方
法で核酸配列の多様性のために使用できる。クローニン
グ部位に挿入される核酸配列は、リボザイム配列をコー
ドすることができ、又はポリペプチド例えば、酵素活性
を有するタンパク質をコードすることができるが、但
し、コード化配列がペプチドをコードする場合に、適当
なmRNA分子の生成を遮断し、及び／又は異常なスプライ
ス若しくは異常なmRNA分子をもたらしてしまう潜在スプ
ライス部位を欠くべきである。ポリペプチドは、細胞内
的に活性があるもの、膜通過型タンパク質とすることが
でき、また分泌タンパク質とし得る。変異タンパク質例
えば、正常に分泌されるが、細胞内的に作用するように
変更されているものにもすることができる。核酸配列は
DNAにすることができる；ゲノム配列に相補的な配列
（“アンチセンス配列”）とすることもでき、ここで、
該ゲノム配列は１以上のオープンリーディングフレー
ム、イントロン、非コード化リーダー配列又は相補的配
列が転写、伝令RNAプロセッシング例えばスプライシン
グ若しくは翻訳を阻害し得る他の配列とすることもでき
る。
AIDSの治療のために、抗TAT、REV、TAR又は他の重要
な抗HIV配列を、特に、Ｔリンパ球、マクロファージ及
び単球において適当なコード配列の発現のために用いる
ことができ、これを、適当なコード配列のiv投与後に達
成することができる。従って、mRNA（HIV−REV若しくは
BCR−ABL配列に対するもののようなアンチセンス又はリ
ボザイム配列）をコードするDNA配列又はヒト細胞にお
いて、HIV遺伝子の宿主細胞ゲノムDNAへの組み込み、HI
V配列の複製、HIVタンパク質の翻訳、HIVmRNAのプロセ
ッシング又はウィルスパッケージングを特異的に妨害す
るトランスドミナント負方向変異体（transdominant ne
gative mutant）のようなタンパク質をコードするDNA配
列を用いることができる。
野性型のコンダクタンス調節物質（CFTR）遺伝子の嚢
胞性繊維症患者の肺における発現は、嚢胞性繊維症の治
療に用いることができる（コリンズ（Collins）、（199
2）Science 256:774−783を参照のこと）。CFTRのcDNA
は、ミシガン大学のコリンス博士とトロント病気小児病
院（Tronto Sick Children's Hospital）から得ること
ができる。
野性型p53の遺伝子がない又は異常に発現している癌
患者の腫瘍における野性型p53の発現は、これらの患者
の治療の方法として用いられることができる。p53は、
ジョン・ホプキンス大学のフォーゲルシュタイン（Voge
lstain）博士から入手可能である。癌治療の他の方法に
は、過剰発現しトランスフォームしている癌遺伝子例え
ば、腫瘍中のmyc又はrasに対するアンチセンス配列の転
写が含まれる。
ウィルス性肺炎は、かなりの若年及び老年層の死及び
障害の主な原因となっている。タンパク質例えば顆粒球
マクロファージコロニー刺激因子（GM−CSF）は、免疫
無防備状態の患者の骨髄からの白血球の生成を刺激する
ものであり、これは、ウィルス感染の進行を調節するこ
とに有用となり得る。特に、遺伝子移入により誘導され
るGM−CSFは、ウィルス性肺炎の発生の危険性に対する
予防条件及びこの感染の治療のための治療的条件として
作用するであろう。GM−CSFはまた顕著な抗腫瘍活性も
有する． 対象となる核酸配列の他の例には、LDL（低密度リポ
タンパク質）リセプターをコードするもの、これは特に
血清コレステロールを下げ、血清コレステロールレベル
の上昇に伴う患者の心臓発作の危険性を減らすことがで
きる；肺血症、慢性間接リウマチ及び喘息を含む感染に
関する状態の治療としてのIL−１リセプターをダウンレ
ギュレートするアンチセンスIL−１リセプターのような
配列；循環レベルが冠状動脈疾患（CAD）の危険に関連
するアポ（ａ）をコードしている遺伝子のダウンレギュ
レーション；並びに、多発性硬化症におけるミエリン又
は自己免疫疾患における他の標的を攻撃する活性化Ｔ細
胞クローンの活性を遮断する遺伝子が含まれる。ミエリ
ンを認識して攻撃するように活性化されるＴ細胞リンパ
球クローンは、アンチセンス配列、リボザイム配列又
は、ミエリン鞘細胞の認識及び／又は攻撃を仲介するＴ
細胞リセプター成分のＴ細胞上での表面発現を特異的に
遮断するトランスドミナント負方向変異体コードする注
入遺伝子を用いることによって、標的化することができ
る。他の有効な治療用核酸配列は、本発明を用いてin v
ivoで適当な細胞において発現することができ、これに
は、スーパーオキサイドジスムターゼ活性又はカタラー
ゼ活性を有し、酸化剤障害から肺を保護する分子をコー
ドする核酸配列；プロスタサイクリン及びプロスタグラ
ンジンE2を生成する内皮性プロスタグランジンシンター
ゼ；並びに、アンチプロテアーゼα−１アンチトリプシ
ン、及びエリスロポイエチンが含まれる。
用いられる終結領域は、終結領域が比較的交換可能の
ようであるため、都合のよいものとする。終結領域は、
意図された対象核酸配列本来のものでも、他の供給源か
ら誘導したものでもよい。都合のよい終結領域が利用で
き、遺伝子ターミネーターの3'末端及び、5'側の調節領
域を得た同一遺伝子からのポリアデニル化シグナルを或
いは、異なる遺伝子からのターミネーター及びポリアデ
ニル化シグナルを利用しても同じ様な結果が得られ得
る。転写後mRNAの安定性を調節する特定配列を任意的に
含み得る。例えば、特定のポリＡ配列（ヴォロック及び
ホウスマン、Cell（1981）23:509−514）及びβ−グロ
ビンmRNA要素はmRNAの安定性を高めることができ、一
方、mRNA中の特定のAU富裕配列は、mRNAの安定性を下げ
ることができる（シューら、Genes and Devel.（1989）
3:60−72）。更に、特定の用途においてmRNAの半減期が
短いほうが好ましい場合には、3'非コード化領域のAU領
域を使ってmRNAを不安定にしてもよい。
該コンストラクトには、選別のための配列として、例
えばネオマイシン耐性遺伝子若しくはジヒドロ葉酸レダ
クターゼ遺伝子及び／又は、異なる細胞性成分を標的と
し若しくは野性型の配列がない場合には分泌する組換え
タンパク質を発生するためのシグナル配列を含み得る。
様々なシグナル配列が全て用いられ、これは当業者によ
く知られている。シグナル配列は、新たなワクチン戦略
の形成を可能にし、又はトランスフォームした癌遺伝子
のような特異的再表面リセプターに向かう可溶性拮抗剤
を製造し得る。選別のための配列は、別のプラスミドに
置くことができ、治療性核酸を運ぶプラスミドと共に同
時トランスフェクトすることもできる。キャリアを使用
する場合には、選別プラスミドを異なるキャリアと又は
治療性プラスミドと同一のキャリアと複合体し得る。
ある場合には、高レベルで宿主細胞ゲノムDNAへ注入
遺伝子の組み込みによって又は安定はエピソーム形態で
in vivoで細胞の核での注入遺伝子の永続化によって、i
n vivoで長期にわたる注入遺伝子効果をもたらすコンス
トラクトを使用することが望ましい。所望する場合、in
vivoで宿主細胞のゲノムDNAへの注入遺伝子の組み込み
は、直鎖形態で注入遺伝子（コード領域のみでも、5'及
び3'調節配列を伴うコード領域でもよいが、プラスミド
配列の存在は伴わない）を投与することによって利用さ
れ得る。精製レトロウィルス酵素例えば、HIV−１イン
テグラーゼ酵素を脂質キャリア−DNA複合体へ取り込む
ことによって、ゲノムDNAへの注入遺伝子組み込みの発
生率を更に増加し得る。適当な隣接（フランキング）配
列が、注入遺伝子DNAの5'及び3'末端に置かれる。これ
らのフランキング配列が、HIV−１インテグラーゼの存
在下で宿主細胞ゲノムDNAへHIV−１のDNAの組み込みを
仲介することが示されている。或いは、ウィルス例えば
エスプタイン−バールウィルスの非トランスフォーミン
グ配列並びに、哺乳動物細胞において異種DNAをプラス
ミドとして複製させるために十分と思われるoriP及びEB
NA−１のような配列を含むコンストラクトを使用するこ
とで、in vivoにおける外来核酸の発現の持続期間を延
長することができる（ブハンス（Buhans）ら、Cell（19
86）52:955）。
宿主への導入後に宿主細胞への直接的なDNA取り込み
での使用のために、5'末端でプロモータ及び調節配列と
3'末端でターミネータ及び調節配列とに隣接している組
換えコード配列は、好適なクローニングプラスミド（例
えば、pUC18、pSP72）へ導入され得る。宿主へ導入され
るときに裸の核酸が、血液中の脂質キャリア例えばカイ
ロミクロンと会合することによって、ヌクレアーゼによ
る分解（消化）から保護されるということが、本発明の
理論である。従って、より効率的なトランスフェクショ
ンは、血中の脂質が食物の消化後で上昇したレベルにあ
るときに達成される。
核酸コンストラクトは、キャリア例えば脂質キャリア
特に、陽イオン性脂質キャリアと複合化（錯体化）し
て、複合体を形成し得る。複合体とは、発現カセット又
は転写カセットを含むプラスミドのような核酸コンスト
ラクトと脂質混合物との間での会合を意図する。複合体
の物理的形態は、リポソームの外側に複合化するか若し
くはリポソームの内部に取り込まれた核酸を有するリポ
ソーム、又は間に挿入さらた脂質及び核酸の形態とし
得、或いは、上記物理形態の幾つかの若しくは全ての混
合物とし得る。静脈投与のために、一般には、該混合物
を、使用される脂質混合物を音波処理し、その後、音波
処理済混合物と該核酸とを適当なDNA:脂質比で生理的に
許容可能な希釈剤中で、使用の直前に混合して調製す
る。該脂質キャリアは、種々の陽イオン性脂質から製造
されることができ、これには、DOTAP、DOTMA、DDAB、Ｌ
−PE等が含まれる。陽イオン性脂質例えば、“リポフェ
クチン”として知られるＮ［１−（2,3−ジオレイロキ
シ）プロピル］−N,N,N−トリエチルアンモニウムクロ
ライド（DOTMA）、ジメチルジオクタデシルアンモニウ
ムブロマイド（DDAB）、1,2−ジオレオイロキシ−３−
（トリメチルアンモニオ）プロパン（DOTAP）又はリシ
ニルホスファチジルエタノールアミン（Ｌ−PE）と、第
２脂質例えばジオレオイルホスファチジルエタノールア
ミン（DOPE）又はコレステロール（Chol）とを含有する
脂質キャリアは、特に対象となる。DOTMA合成はフェル
ナー（Felgner）らProc.Natl.Acad.Sci.,USA.,（1987）
84:7413−7414に記載されている。DOTAP合成はスタマタ
トス（Stamatatos）ら、Biochemistry（1988）27:3917
に記載されている。DOTMA:DOPE脂質キャリアは例えばBR
L社から購入できる。DOTAP:DOPE脂質キャリアはベーリ
ンガー・マンハイム社から購入できる。コレステロール
及びDDABはシグマ社から市販されている。DOPEはアバン
チ・ポーラー・リピド（Avanti、Polar、Lipids）社か
ら市販されている。DDAB:DOPEはプロメガ社から購入で
きる。生分解性陽イオン性両親媒物もまた、使用するこ
とができる（例えば、同時係属PCT出願、代理人整理番
号MEBI−002/00WO、1992年12月17日出願を参照のこ
と）。
脂質キャリア例えば陽イオン性リポソームは、核酸を
培養系で広範囲の細胞へ送達することによって、注入遺
伝子又はmRNAの高レベルでの細胞性発現を仲介すること
ができる。特定の陽イオン性脂質の使用は、in vivo送
達のための特殊な利点を確立できる。例えば、DOTAP含
有リポソーム若しくはエチルホスファチジルコリン（Ｅ
−PC）脂質キャリアに複合化した核酸の静脈注入は、主
として肺に注入遺伝子の発現を向けることができる。そ
の上、DOTAPと、Ｌ−PE及びコレステロールエステルβ
−アラニン（CEBA）とは、細胞によって十分に代謝され
るが、DOTMAは細胞によって十分に代謝されない。従っ
て、DOTAP、Ｅ−PC及びＬ−PEは、DOTMAと異なり、哺乳
宿主への反復注入に適している。更に、陽イオン性脂質
と第２脂質とを含む脂質キャリアを用いる場合、特にコ
レステロール又はDOPEがin vivoでの注入遺伝子の発現
を最大にすることができる。また、ステロイド例えばコ
レステロールをDOPEの代わりにDOTAP、DOTMA若しくはDD
ABと混合することは、実質的にin vivoにおける注入遺
伝子の発現を増加する。
投与の経路及び投与の部位に依存して、特定の細胞及
び組織が標的にされ得る。例えば、血流の方向で注入部
位に最も近い組織のトランスフェクションは、如何なる
特殊な標的化もなくトランスフェクトされ得る。更に、
所望するならば、脂質キャリアは部位指向性分子（site
−directing molecules）を用いて特定の型の細胞へ該
複合体を指向するように改変され得る。従って、特定の
リセプター又は他の細胞表面タンパク質に対する抗体又
はリガンドが、特定の表面タンパク質と会合された標的
細胞と共に用いられ得る。例えばAIDSウィルスは主とし
てCD4表面タンパク質を有する細胞に向かう。脂質キャ
リアの表面に結合した抗CD4抗体を担持することによっ
て、核酸脂質キャリア複合体はＴヘルパー細胞に主とし
て向くことができる。
特定リガンド又は抗体は、部位指向性分子を脂質に結
合することによって、又は部位指向性成分の機能性部位
（functionality）を連結するために該二重膜に存在す
る脂質上の連結基を提供することによって、慣用の方法
により脂質に結合されることができる。このような技術
は当業者にはよく知らている。リガンド指向性DNA−多
価陽イオン複合体が、静脈注入後に肝臓の肝細胞へトラ
ンスフェクトすることが示さている；この手段によって
他の細胞型又は組織型のトランスフェクトする能力は、
証明されていない。
非陽イオン性脂質キャリア、特にpH感受性リポソーム
は、in vivo遺伝子治療のための他の魅力的な手段の可
能性を提供する。しかし、陽イオン性リポソームに比べ
て、pH感受性リポソームは、DNAの被包化及び細胞内で
のDNAの送達において効率が劣り、血清の存在下で不活
化し得るので、静脈内における使用が制限される。
多数の因子は、トランスフェクトされた組織における
発現量に作用することができ、従って、特定の目的に合
うように発現のレベルを変更するために用いられ得る。
高レベルの発現が望ましい箇所では、全ての因子を最適
化することができ、わずかな発現が望ましい箇所では、
１以上のパラメータを変晒して所望のレベルの発現を得
ることができる。例えば、高い発現が治療範囲（therap
eutio window）を越える場合には、最適よりも少ない条
件を採用することができる。変更することができる因子
は以下のものがある： 注入される複合体の脂質組成又は脂質キャリアの平均
直径（粒子形状例えばリポソームの場合）は、in vivo
でもたらされる注入遺伝子発現のレベルに劇的に作用す
ることができる。従って、リポソーム脂質組成物は、一
般に、非陽イオン性脂質に対して50％モル比の組成の陽
イオン性脂質を有するが、５％から100％の範囲もとる
ことができる。脂質キャリアの直径は、一般に、100nm
から10μｍの範囲内にするべきである。脂質キャリア範
囲が100nmから数μｍの直径の陽イオン性脂質キャリア
−DNA複合体は、哺乳類宿主への全身性投与後に、かな
りのレベルの注入遺伝子発現をもたらすことができる。
500nmを越える脂質キャリアの使用（言い換えれば多
重ラメラ小胞（MLV）又は大単ラメラ小胞（LUV））は、
小単ラメラ小胞（SUV）と比較した場合、ある場合に
は、哺乳宿主において送達される注入遺伝子の発現のレ
ベルを有意に増加することができる。MLV及びLUVは乾燥
脂質フィルムに水性物質を添加した後に、音波粉砕より
もむしろボルテックス処理によって製造される。粒子を
使用しようとするならば、得られた脂質キャリアを、決
まったサイズのポリカーボネート膜を通して高圧下で押
し出して、特定の用途のためにより均一なサイズ分布に
達することができる。
特定の核酸対脂質キャリア比の使用は、また、トラン
スフェクションの量及び／又は対象となる核酸配列の転
写及び／又は発現のレベルを増加することもできる。用
いられる比が、注入遺伝子がin vivoで発現するか否か
及びそのレベルを規定し、従ってこれを最適化すること
ができ、これはコンストラクトの性質、脂質キャリアの
サイズ及び脂質組成物並びに、MLVかSUVか、投与の経路
及び宿主哺乳動物を含む種々の因子に依存する。例え
ば、リポーター遺伝子であるCAT（クロラムフェニコー
ルアセチルトランスフェラーゼ）を用いれば、約1:1
（0.5:1から2:1の範囲）のDNA対脂質キャリア比（μgDN
A対nmolの陽イオン性脂質）は、腹腔投与後の全ての器
官において、マウスで最も高い遺伝子発現をもたらし、
約1:4比（2:1から1:7の範囲）は、静脈投与後の全ての
器官において最も高いレベルの遺伝子発現をもたらす。
最適条件を用いた広範囲の組織での高いレベルの注入遺
伝子発現の達成に加えて、肺、脾臓、リンパ節及び骨髄
に存在する全ての細胞の大部分は、心臓に存在する全て
の内皮細胞の大部分と同様に、in vivoでトランスフェ
クトされる。
DNA:脂質キャリア比は、注入遺伝子が該複合体の全身
性投与後の哺乳宿主における発現レベルを決定する。い
くつかの因子が、所望の特定発現レベルのためのDNA:脂
質キャリア比を最適化するので重要である。従って、特
定のDNA:脂質キャリア比が、用いられた個々の脂質キャ
リアサイズ毎と、用いられた陽イオン性脂質のタイプ毎
に必要である。用いられた脂質キャリア組成物毎に、最
大発現を最適化するため、DNAは、DNA:脂質キャリア複
合体の凝集をもたらす比を最初に決定するために、6:1
から1:10（μｇのDNA対nmolの陽イオン性脂質）の範囲
となる、複数の異なる率で脂質キャリアと共に混合され
る。凝集をもたらす比は、in vivoでは用いることがで
きない。凝集をもたらさない比は、in vivoでの所望の
注入遺伝子の発現レベルを確保するDNA:脂質キャリア比
を決定するために、動物モデルにおいて試験される。例
えば、DOTMA:DOPE、DDAB:DOPE、DOTAP:DOPE、DOTAP:コ
レステロール、Ｌ−PE:CEBA、DDAB:コレステロール及び
Ｌ−PE:DOPEにおけるSUVの最適DNA:脂質キャリア比は、
各々、1:4、1:3、（全ての比でかなり低い活性）、1:
6、1:1、1:5及び2:1である。DNA:脂質キャリア複合体は
適当な生理学的溶液中で作製されなければならない。DN
A:脂質キャリア複合体は、それ自身DNA:脂質キャリア複
合体の凝集を誘導しない生理溶液（約290ミリ浸透圧モ
ル）に混合される。この溶液は、水又は通常の生理塩水
中に５％デキストロースを含む。陽イオン性脂質キャリ
アの対する細胞表面リセプターは、哺乳類宿主における
注入遺伝子発現の標的細胞特異性を調節及び提供を共に
するために用いられ得る。陽イオン性脂質キャリア:DNA
複合体は、陽イオン分子に対して特異的な結合部位を含
み且つこれを吸収することができる細胞表面リセプター
を用いて、伝統的なリセプター仲介エンドサイトシスに
よって細胞に取り込まれる（図７参照）。従って、薬剤
例えばサイトカイン、成長因子、他の可溶性タンパク質
及び特定の薬物を用いると、選択的にこれらの陽イオン
結合リセプターをアップ又はダウンレギュレートするこ
とが可能になる。適当な薬剤によるこれらリセプターの
アップ又はダウンレギュレーションの速度は、特定細胞
のin vivoにおけるトランスフェクションのレベルの上
げ下げの選択を可能にする。裸のDNAに対する細胞表面
リセプターは、哺乳動物宿主内の遺伝子導入発現におけ
る標的細胞特異性を、調節及び確保を共にするために用
いられることができる。
プラスミドDNAに複合化された、単及び多重ラメラ脂
質キャリアのいずれかであるDOTMA脂質キャリアと、種
々の細胞型（例えばCV−１サル腎臓細胞、U937ヒト骨髄
単球白血病細胞、K562、MEL（マウス赤芽球白血病細
胞）、ラット肺胞マクロファージ及び肺胞II型細胞）と
の間の最もよく起こる相互作用は、脂質キャリア付着及
び吸収によるものである。この相互作用は、リセプター
仲介エンドサイトシスのよく研究されている例に共通し
ている。陽イオン性脂質キャリア:DNA複合体に接触する
ような全ての細胞が、形質膜への該複合体の結合後に、
複合体を摂取する。これらの細胞型の全てが、同一の伝
統的リセプター仲介エンドサイトシス的な吸収経路を証
明している。
哺乳動物宿主は、全ての動物、特に遺伝子関連疾患又
は、遺伝子関連治療を受けることが可能な感染疾患の症
状を有する動物であり得る。従って、適用対象は、家
畜、飼育動物例えばウシ、ヒツジ、ブタでも、霊長類特
にヒトでも使用される。哺乳動物宿主は妊娠され得、遺
伝子関連治療の意図されたレシピエントは、妊娠したメ
ス及び胎児のいずれか又は両方とし得る。本発明の方法
では、in vivoトランスフェクションは、治療用転写又
は発現ベクターを哺乳動物宿主へ、裸のDNAと脂質キャ
リア特に陽イオン性脂質キャリアと複合されたDNAとの
いずれかを導入することによって得られる。コンストラ
クトは、注入遺伝子の安定な維持又は注入遺伝子のエピ
ソーム発現のために、宿主細胞ゲノムへ組み込むために
提供され得る。哺乳動物宿主への導入はいくつかの経路
のいずれかによってされ得、これには、静脈模試は腹腔
注入、気管内的、鞘内的、腸管外的、動脈内的、鼻腔内
的、筋肉内的、局所的、経皮的、全ての粘膜表面からの
投入、角膜点滴等が含まれる。治療用発現ベクターの循
環体液又は体口若しくは体腔例えば肺、大腸、膣等への
導入が特に対象となる。従って、静脈投与及び気管内投
与は、ベクターがこのような投与経路の後に広く拡散し
得るので特に対象となり、また、エアロゾル投与は体口
又は体腔への導入に用いられる。全て生理学的に許容可
能な媒体がDNA又は脂質キャリアの投与のために用いら
れ得、これには、例えば脱イオン水、生理塩水、リン酸
緩衝液、５％デキストロース水溶液等が含まれ、これら
は投与経路に依存する。他の成分がこの配合に含まれ
得、例えば緩衝液、安定剤、殺生物剤等である。これら
の成分は、文献において広く例示が認められ、特にここ
での説明の必要はない。該複合体の凝集の原因となる全
ての希釈剤又は希釈剤成分は、避けるべきであり、これ
には、高濃度塩類、キレート剤等が含まれる。
用いられる裸のDNA又は複合体の量は、DNA又は複合体
が血流へ侵入した後、種々の組織への適当な散布がもた
らされるために、及びトランスフェクトされた組織にお
ける治療的なレベルの発現をもたらすために、十分なも
のとする。治療レベルの発現は、宿主哺乳類の疾患又は
感染を予防、処置又は緩和するために十分な量の発現で
ある。更に、用いられる核酸ベクターの量は、in vivo
において対象の組織での所望のレベルでの注入遺伝子発
現をもたらすために十分なものとしなければならず、例
えば＞1mgの発現プラスミドのみを、マウスへ注入する
と、多数の組織においてCAT遺伝子の高レベル発現がも
たらされる。他のDNA配列例えばアデノウィルスVA遺伝
子は、投与媒体に含有されることができ、対象遺伝子と
共にトランスフェクトされることができる。アデノウィ
ルスVA遺伝子をコードする遺伝子の存在は、これが所望
されれば、プラスミドから転写されたmRNAの翻訳を有意
に促進し得る。
組み換え遺伝子の発現のレベル及び組織は、mRNAレベ
ルで及び／又はポリペプチド若しくはタンパク質のレベ
ルで測定され得る。遺伝子産物は、組織における生物活
性を測定することによって定量され得る。例えば、酵素
活性は、生物学的アッセイ又は、免疫染色技術例えば該
遺伝子産物若しくは発現カセットに存在するリポーター
遺伝子産物を特異的に認識する抗体を用いたプロービン
グ（釣り上げ）によってトランスフェクトされた細胞中
の遺伝子産物を同定することによって、測定されること
ができる。或いは、該遺伝子産物の潜在的治療効果は、
例えば対象DNA配列がGM−CSFをコードする場合には、GM
−CSF注入遺伝子を発現する致死量被爆動物の生き残り
における遺伝子発現の効果を測定することによって、測
定することができる。注入遺伝子産物の有意量の生成
は、これらのマウスの生き残りを実質的に延長する。
ポリペプチド／タンパク質の発現又はmRNA自身さえ
も、宿主における変化した生化学的表現型を確保する場
合、新しい表現型の存在又は古い表現型の欠失は評価さ
れ得る；例えば宿主細胞のトランスフェクションの結果
として、以前に不十分な量で生成されていた既存の所望
産物の生成が増進され得、又は、アンチセンス、リボザ
イム又は共同抑制技術を用いて望ましくない遺伝子産物
の減少又は更なる抑制が起こり得る；抑制の場合でも、
遺伝子産物の減少が測定され得る。普通、治療カセット
は、宿主細胞ゲノムへ組み込まれない。必要であれば、
治療は、達成される結果に依存した目的に応じて、繰り
返されることができる。治療が繰り返される場合、哺乳
動物宿主は治療に対する不利な免疫応答又は他の応答が
ないことを確保するためにモニターされる。
例えば、特定の疾患状態を治療することが望まれてい
る臨床環境では、治療様式の生物学的効能と臨床的効能
とが、可能であれば共に評価されることが必要である。
例えば、嚢胞性繊維症の治療では、広汎性上皮性機能不
全であり、これは、気道、汗腺、腸及び生殖路並びに膵
臓の管腔液又は“分泌物”の電解質及び水分含量におけ
る異常としてそれ自身が示される。従って、遺伝子治療
の生物学的効能は、例えば治療前及び相互作用後に、上
皮間の電位の差を測定することによって、評価すること
ができる。評価は、鼻細胞のトランスフェクション後に
及び肺細胞のトランスフェクション後に実行され得る。
呼吸上皮と嚢胞性繊維を横切って生物電位の差を測定す
るために用いることができる技術の例には、ノウレス
（Knowles）ら、（1981）New England General of Medi
cine 305:1489−1495;ノウレスら、（1983）General of
Clinical Invastigation 71:1410−1417;ノウレスら、
（1983）Science 221:1067−1070に記載されているもの
がある。臨床的効能は、注目される欠陥の治療が疾患の
進路を変えることに有効であるかどうかであり、これを
測定することは更に困難になり得る。生物学的効能の評
価が臨床的効能のための代わりの終点として実行されて
いるが、最終的なものではない。従って、例えば６ヵ月
の肺機能の指標となるいわゆる“肺活量測定”因子のよ
うな臨床的な終点を測定することは、治療レジメンの臨
床的効能の指標となり得る。典型的な測定には、肺の努
力肺活量（FVC）及び１秒間の最大努力吸気肺活量（FE
V）が含まれる。嚢胞性繊維症のための遺伝子治療の効
能を評価するために実行できる臨床研究のタイプの１例
は、肺疾患及び嚢胞性繊維症の治療のためにアミロライ
ドについて使用されているものである；ノウレスら、
（1990）Ner England General of Medicine 322:1189−
1194。同様に、当業者は、特定遺伝子治療のプロトコー
ルの生物学的及び臨床的効能を評価することができる。
本組成物は、１以上の手順の使用に提供されることが
できる。キットには通常、DNAが裸のDNA又は脂質キャリ
アと複合化されて含まれる。更に、脂質キャリアは、提
供されたDNAと複合化させるために、別容器で提供され
得る。直接投与及び脂質キャリアとの複合化のいずれか
のためのDNA又は脂質キャリア/DNA複合体は、使用前に
更に希釈され得る濃縮物として存在し得、又は使用濃度
で提供され得るが、この場合にはバイアルは、１回以上
の投与分を含み得る。都合上、医師又は獣医師がシリン
ジを直接用い得るように、単一投与量がシリンジで提供
され得、これは滅菌容器中に含まれている。ここで、該
シリンジは所望の量及び濃度の試薬を有する。従ってキ
ットには、適正な比率の量のDNA又はDNA/脂質キャリア
複合体を含む複数のシリンジが入っている。該シリンジ
が直接使用のための配合を含む場合、通常、本方法によ
る使用の際に他の使用試薬を必要としない。
本発明は、多くの疾患のin vivo予防、治療及び／又
は緩和に使用される。遺伝子のin vivo置換は、例えば
相同組み換え又は異常な遺伝子の初期ノックアウト及び
次の所望注入遺伝子との置換の技術によって達成される
ことができる。本発明を用いたin vivoで適当な細胞に
おける核酸の発現による更なる利益は、コード化された
タンパク質が、但しい方法でプロセッシングされて転写
後の改変に付されることである。
下記の例は、説明を意図したものであり、これに限定
されるものではない。
実施例 材料の一覧 実施例１ in vivo遺伝子治療のためにプラスミドの調
製 pRSVCAT p5'PRL3−CAT pSIS−CAT pZN20（図５参照） pZN27（図９参照） pZN46（図10A、Ｂ参照） pZN32（図11参照） pZN51（図13参照） pZN60、pZN61、pZN62、pZN63（図14A、BC参照） pCIS−CAT 実施例２ 脂質キャリア及び脂質キャリアとの複合化し
たDNAの調製 脂質キャリアの調製 プラスミド調製 脂質キャリア−プラスミドの調製 複合化 実施例３ pZN27−DDAB:コレステロール脂質キャリア複
合体（図１参照）の静脈（iv）注入後の肺におけるCAT
遺伝子の発現の免疫組織化学による証明 実施例４ pCIS−CATの腹腔投与後の発現 実施例５ p5'PRL3−CAT:L−PE:CEBA複合体の静脈（i
v） 注入後の脾臓におけるCAT遺伝子発現の証明 実施例６ DOTMA:DOPE＋pSIS−CATプラスミドの注入
は、明らかにin vivoで検出可能なCAT遺伝子発現をもた
らさない。
実施例７ DNA:脂質キャリア複合体と細胞表面リセプタ
ーとの相互作用（図７参照） 実施例８ マウスＴリンパ球がin vivoでトランスフェ
クトされることの証明（図2A、Ｂ参照） 実施例９ マウス造血系骨髄由来細胞がin vivoでトラ
ンスフェクトされることの証明 実施例10 正常ドナーから新たに単離したヒトCD4+リン
パ球がトランスフェクトされることの証明（図４参照） 実施例11 DNAの陽イオン性リポソーム仲介送達を用い
た種々のヒト肺癌細胞株の効率的なトランスフェクショ
ン（図21参照） 実施例12 陽イオン性脂質キャリア:DNA複合体の静脈注
入によるマウスでの肺癌細胞のトランスフェクション
（図8A、Ｂ参照） 実施例13 pZSN27のみ又はpZN27:DDAB:コレステロールS
UV複合体の静脈（iv）注入後の、多重組織における高レ
ベルCAT遺伝子発現の証明 実施例14 CMV−インターロイキン−２遺伝子と複合化
した陽イオン性脂質キャリアの静脈注入によるマウスの
脾臓及びリンパ節における高レベルのヒトインターロイ
キン−２の誘導 実施例15 pZN32:陽イオン性脂質キャリア複合体のiv投
与によって処置されたマウスにおけるヒトCFTR遺伝子の
高レベル発現の誘導（図12E参照） 実施例16 異なるCAT遺伝子含有プラスミドの静脈注入
後の肺及び腎臓におけるCAT遺伝子発現の証明（図15参
照） 実施例17 CMV−CAT−リポソーム又はCFTR−CAT−リポ
ソーム複合体の各iv注入によってもたらされる広汎性と
組織及び細胞型特異性とのCAT遺伝子発現（図16A−Ｋ参
照） 実施例18 プラスミドのみのiv注入と、脂質キャリアと
複合化されたプラスミドのiv注入に注目したトランスフ
ェクションの比較（図19A、Ｂ参照） 実施例19 GM−CSF発現プラスミド−陽イオン性リポソ
ーム複合体のIV注入は、顕著な抗腫瘍効果をもたらす pZN84（図17参照） 実施例20 DDAB:コレステロール（1:1）リポソームに複
合化されたpZN84のヤギへの静脈（iv）注入後のin vivo
での延長された高レベルのマウスGM−CSF遺伝子発現
（図22、23参照） 実施例21 マウスにおける実験的なウィルス性肺炎の進
行におけるリポソーム−GM−CSFプラスミド複合体の影
響 実施例22 中枢神経系への直接的なDNAのみ又はDNA−陽
イオン性リポソーム複合体の注入によってもたらされる
マウス脳におけるCAT遺伝子の高レベルの発現（図20参
照） 実施例23 pRSV−CAT:L−PE:CEBA複合体の静脈（iv）注
入後の肺におけるCAT遺伝子発現の証明 実施例24 pZN20−CAT:DDAB:DOPE複合体の静脈（iv）注
入後の多重組織におけるCAT遺伝子発現の証明 実施例１ in vivo遺伝子治療のためにプラスミドの調製 哺乳類細胞のトランスフェクションに用いたプラスミ
ドの詳細は以下の通りである。
pRSVCAT:このプラスミドの構築は、ゴルマン（Gorma
n）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,（1982）,79:6777−
6781に記載されている。このpRSVCATプラスミドには、
３′−RSVLTRが、CATコーディング配列の上流のプロモ
ータとして並置されている。LTR転写開始部位とCAT開始
コドン（開始部位の下流の最初のAUG）との距離は約70b
pである。
p5′PRL3−CAT:このプラスミドの構築は、サカイら、
Genes and Development（1988）2:1144−1154に記載さ
れている。
pSIS−CAT:このプラスミドの構築は、ホァン及びゴル
マン、Nucleic Acids Research（1990）18:937−948に
記載されている。
pZN20:このプラスミドの構築は、図５に説明されてい
る。このプラスミドは下記のようにして調製した。pCAT
wt760（スティンスキ（Stinski）とロウアー（Roeh
r）、（1985）J.Virol.,55:431−441）をHind IIIで処
理し、HCMV IE1エンハンサー及びプロモーター要素を
含むフラグメントを精製した。その後、単離フラグメン
トを、pSP72（プロメガ）のHind III部位へクローン化
してpZN9を作製した。エンハンサー及びプロモーター要
素が図５に示されているクローンをスクリーン（選抜）
した。pZN9の部分的Hind III消化の後、平滑末端にDNA
ポリメラーゼＩクレノウフラグメントを添加した。得ら
れたクローンpZN12は、エンハンサー及びプロモーター
要素の５′のHind III部位を失っていた。その後pZN12
をNco I及びHind IIIで処理し、大きいNco I−Hind III
フラグメントを精製し、pBC12/CMV/IL−２（クーレン
（Cullen）、Cell（1986）46:973−982）由来の精製さ
れた小さいNco I−Hind IIIフラグメントに連結した
（ライゲーション）。pBC12/CMV/IL−２はAD169株由来
のHCMVプロモーターを含む。得られたクローンをpZN13
とした。pZN13をBamH Iで部分消化し、DNAポリメラーゼ
Ｉクレノウフラグメントを添加し、得られたクローンを
エンハンサー及びプロモーター要素の５′末端でBamH I
部位を失っているクローンをスクリーンした。得られた
クローンをpZN17と呼んだ。pZN17をHind III及びBamH I
で処理し、得られたHind III−BamH I大フラグメントを
精製し、pSV2−CAT（ゴルマンら、（1982）Molecular C
ell Biology,2:1044−1051）から得られた精製小Hind I
II−BamH Iフラグメントと連結した。得られたクローン
をpZN20とした。HCMV（Towne）の完全制限地図は図6Aに
示されている。HCMV（AD169）は図6Cに示されている。
２つのプロモーターの比較は図6Bに示されている。Town
e株由来のものに炊いてAD株由来のプロモータを用いた
場合に、実質的により高い発現が得られる。pZN20は、N
co I部位の５′側にTowneの配列とNco I部位の３′側に
AD169の配列とを有する複合プロモーターを含む。Nco I
部位は、図6Bでアスタリスクによって表示されている。
pZN20はこの複合HCMVプロモーターと、その後にCAT遺伝
子、SV40のｔ−イントロン及びSX40のポリＡ付加部位と
を有する。
pZN27:このプラスミドのコンストラクトは図９に説明
されている。pZN27は複合HCMVプロモーターとその後にS
V40のｔ−イントロン、CATコーディング配列及びSV40の
ポリＡ付加部位を、この順で有する。
pZN46:このプラスミドのコンストラクトは図10A及び
図10Bに説明されている。pZN46は、複合HCMVプロモータ
ーとその後にヒトIL−２遺伝子、ラットのプレプロイン
シュリン２イントロン及びラットプレプロインシュリン
２遺伝子由来のポリＡ付加部位を含む。これらの最後の
３つの成分は、クーレン（Cell 46:973−982（1986））
のpBC12/CMV/IL−２プラスミド由来であった。ラットプ
レプロインシュリン２イントロンは、内部の162bpのNde
Iフラグメントを欠損することによって改変された。
pZN32:このプラスミドのコンストラクトは図11に説明
されている。pZN32は、複合HCMVプロモーターと、その
後にpZN46で説明されたラットの改変プレプロインシュ
リン２イントロン、CFTRのヒトcDNA及びpZN46で説明さ
れたプレプロインシュリン２遺伝子ポリＡ付加部位を含
む。CFTRのcDNAは、F.コリンズ（Collins）（ミシガン
大学）から供与されたpBQ4.7から得られた。
pZN51:このプラスミドのコンストラクトは図13に説明
されている。pZN51は、複合HCMVプロモーターとその後
にCATコーディング配列及びSV40ポリＡ部位を含む。
pZN60、pZN61、pZN62、pZN63:これらのプラスミドは
図14に示されている。pZN60はHCMV複合プロモーター
と、その後に改変ラットプレプロインシュリン２イント
ロン、CATコーディング配列及びSV40ポリＡ付加部位を
含む。pZN61はpZN60と同一であるが、イントロンの５′
側に166bpの付加を含む。この付加DNAはpBC12/CMV/IL−
２プラスミド中のイントロンのすぐ５′側の166bpであ
り、ラットプレプロインシュリン２遺伝子コーディング
配列を含み得る。pZN62は、イントロンがpZN60における
５′よりはむしろCATコーディング配列の３′側のもの
である以外はpZN60と類似している。pZN63はイントロン
の５′側の166bpの付加を除いてpZN62と同一である。こ
れはpZN61で記述されたものと同一の付加配列である。
pCIS−CAT:このプラスミドは、CMVプロモータ及び混
成イントロン配列を、プラスミドpML.I.CAT、ゴルマン
ら、（1990）DNA Protein Eng.Tech.,2:3−10中のSV40
プロモータに代えて使用した以外は、ファン（Huang）,
M.T.F.及びゴルマン,C.M.,（1990）Nucl.Acids Res.18:
937−947に記載されているように作製した。
実施例２ 脂質キャリア及び脂質キャリアと複合化したDNAの調製 陽イオン性脂質例えばＮ［１−２−３−ジオレイロキ
シ）プロピル］−N,N,N−トリエチルアンモニウムクロ
ライド（DOTMA）、ジメチルジオクタデシルアンモニウ
ムブロマイド（DDAB）又は1,2−ジオレオイロキシ−３
−（トリメチルアンモニオ）プロパン（DOTAP）又はリ
シニル−ホスファチジルエタノールアミン（Ｌ−PE）
と、第２脂質例えばジオイルホスファチジルエタノール
アミン（DOPE）又はコレステロールとを含む脂質キャリ
アが下記のように調製された。
脂質キャリアの調製 脂質例えば、DDAB、Ｌ−PE、コレステロール−エステ
ル−β−アラニン（CEBA）、DOTAPと、コレステロール
（Chol）とを、クロロホルムに溶解した。各脂質の好適
な量（最終脂質キャリア配合物における各脂質の所望の
モル比によって規定され、通常１対１モルの陽イオン性
脂質対非陽イオン性脂質であるが、５〜１対１〜５の範
囲を採る）を共に混合して、回転式蒸発器によって乾燥
するまで蒸発させた。その後、該脂質フィルムを、水又
は脂質キャリア緩衝液（25mMのトリス−HCl、pH7.4、10
0μＭのZnCl2、NaClに等張）中５％デキストロースを付
加した後にボルテックス処理によって再懸濁した。最終
脂質濃度20mMの多重ラメラ小胞（MLV）を作製するため
にである。小さい単ラメラ小胞（SUV）の調製には、そ
の後、この混合物を音波粉砕槽中で15分間、音波粉砕
し、脂質キャリアを使用まで４℃アルゴン下で保存し
た。
プラスミド調製： プラスミドを運ぶE.coli株HB101を37℃でTBにおいて
成育させた。プラスミド精製方法は、サムブロックら
（Molecular Cloning,第２版、1989、コールド・スプリ
ング・ハーバー・ラボラトリー・プレス社）によって記
述されている“アルカリ溶解”及び“ポリエチレングリ
コールを用いた沈殿によるプラスミドDNAの精製”の改
変手法とする。この改変はPEGによるDNAの沈殿を省いて
いることである。最終DNA調製物は、10mMのTris−HClpH
8.0に溶解した。
脂質キャリア−プラスミド複合体の調製 プラスミドを所望の濃度（通常、１μg/μｌ）の５％
デキストロース水溶液に別途希釈した。脂質キャリアも
プラスミドと同一の容量の５％デキストロース水に希釈
した。
使用される脂質キャリアの量は、脂質nmol対添加プラ
スミドμｇの比に基づいて規定され、例えば脂質キャリ
ア：プラスミド＝1:1であり、１ナノモルの陽イオン性
脂質を１μｇのプラスミドDNAと混合した。その後、プ
ラスミドと脂質キャリアとを共に混合してDNA:脂質キャ
リア複合体を形成した。
投与量注入 少なくとも50μｇであり、規則的には陽イ
オン性脂質キャリアに複合化されたプラスミドDNA100μ
ｇをマウス当たりに注入した。プラスミドのみの注入に
は、少なくとも500μｇ及び規則的には2mgのプラスミド
DNAをマウス当たりの尾静脈によって注入した。
実施例３ pZN27−DDAB:コレステロール脂質キャリア複合体の静脈
（iv）注入後の肺におけるCAT遺伝子発現の免疫組織化
学による証明 脂質キャリア:DDAB:コレステロール＝1:1、脂質キャリ
ア緩衝液中20mMで保存する。
プラスミド:pZN27 DNA:脂質キャリア比：脂質キャリア：プラスミド＝5nmo
l陽イオン性脂質:1μgDNA DNA投与量:5％デキストロース水溶液200μｌ中100μｇ
プラスミドDNAをマウス当たり尾静脈からivで注入し
た。
マウス:ICR、メス、25g。
in vivoで処理したマウスの肺切片におけるCATタンパク
質を検出するための免疫組織化学染色 方法:pZN27−DDAB:コレステロール複合体の注入後48時
間で、肺を取り出し、33％のOCT包埋媒体（ミルス社）
で還流し、OCT中で包埋してスナップ凍結した。凍結組
織は６μｍに切り、ガラススライド上へ回収して４℃ア
セトンで10分間固定して、その後0.2％Triton Ｘ−100
中に配置して膜を透過性にした。その後、切片を12〜48
時間、適当な希釈率でモノクローナル抗CAT抗体（アリ
ゾナ大学のパーカー・アンティン（Parker Antin）博士
から供与された）又はネガティブ対照用アイソタイプ抗
体と共にインキュベートした。洗浄後、一次抗体に直接
対するビオチン化抗体（ザイメッド社、S.サンフランシ
スコ）を60分間作用させ、その後、ストレプトアビジン
−アルカリホスファターゼ複合物（ザイメッド社）を60
分間添加した。その後、製造社の取扱書によって酵素標
識に好適な基質色素源を添加した。スライドを検査のた
めに水溶性マウント用媒体へオーバースライドさせた。
結果：結果は図１に示され、これは肺の拡散染色を証明
している。染色は肺胞壁に局在し、このことは、肺胞管
壁細胞と共に、Ｉ型及びII型細胞並びに肺胞マクロファ
ージを含めて70％を越える肺血管上皮細胞がDNA脂質キ
ャリア複合体の単回iv注入によってトランスフェクトさ
れることを示す。更に、有意な数の細気管支気道管理壁
細胞が、CATタンパク質に対してポジティブに染色し、
従って、脂質キャリア:DNA複合体のiv注入によってin v
ivoでトランスフェクトされる。従って、肺の全細胞の
大多数がpZN27−DDAB:Chol複合体のiv注入によってトラ
ンスフェクトした。
実施例４ 腹腔投与後のpCIS−CATの発現 in vivo CAT遺伝子発現のレベルにおけるip注入されたp
CIS−CAT−陽イオン性脂質キャリア複合体の量の効果 メスICRマウスを、0.01、0.1若しくは１μmolのDDAB:
DOPE脂質キャリアに複合された各々0.01、0.1、1mgのpC
IS−CAT発現プラスミドを含む５％デキストロース水溶
液1mlで腹腔注入した。マウスを48時間後の犠牲死さ
せ、器官を摘出してハンドヘルドのホモジナイザを用い
て組織を0.25Mのトリス−HCl緩衝液pH7.8中でホモジナ
イズした。細胞質抽出物を作製しタンパク質含量で基準
化して、その後、CATタンパク質のレベルを測定した。
実験は３匹を１群とし、結果はアセチル化クロラムフェ
ニコールの平均dpm±SEMで表す。
方法:DDABを含む脂質キャリアをDOPEに対して1:1モル比
で下記のようにして調製した：クロロホルム溶解DOPE10
μmolとエタノール溶解陽イオン性脂質10μmolとを回転
式蒸発器で乾燥状態まで蒸発させた。滅菌水1mlを添加
して、混合物を音波粉砕槽（ラボラトリー・サプライ
社、ヒックスビル、ニューヨーク州）中で20分間音波粉
砕した。脂質キャリアは約100±25nmの平均径を有して
いた。CATアッセイのための細胞抽出物を作製し、その
タンパク質含量を、クマジーブルーアッセイ（バイオラ
ド社、リッチモンド、カルフォルニア州）によって測定
した。肺、脾臓、肝臓及び心臓抽出物からの100μｇの
タンパク質及びリンパ節抽出物からの50μｇのタンパク
質を、既述（ゴルマン、前出）のように、14C標識化ク
ロラムフェニコールと反応させて、クロマトグラフィー
にかけた。dpmの算出のため、アセチル化物と非アセチ
ル化物とを共にTLCプレートから切出し、シンチレーシ
ョンカウンタで放射物活性を計測した。
結果:in vivoでの潜在的投与量反応性相関を評価する
ために、１群につき３匹の動物に、0.01μmol、0.1μmo
l又は１μmolのDDAB:DOPE脂質キャリアに複合された各
々0.01mg、0.1mg又は1mgのpCIS−CATプラスミドを注入
した。0.1mg及び1mgDNA投与量は共に、アッセイされた
全ての器官において高い有意なレベル（ｐ＜0.005）のC
ATタンパク質を生成した。各器官におけるCAT遺伝子発
現の最高レベルは1mgのDNA投与量でもたらされ、DNA−
脂質キャリア量の10倍増加は、リンパ節CATレベルを約
２倍増加させ、脾臓では３倍増加させた。
実施例５ p5′PRL3−CAT:L−PE:CEBA複合体の静脈（iv）注入後の
脾臓におけるCAT遺伝子発現の証明 脂質キャリア:L−PE:CEBA＝1:1、脂質キャリア緩衝液に
20mMで保存。
プラスミド:p5′PRL3−CAT（サカキら、（1988）Genes
and Development 2:1144−1154） DNA:脂質キャリア比：脂質キャリア：プラスミド＝1nmo
l陽イオン性脂質:1μｇプラスミドDNA DNA投与量:5％デキストロース水溶液200μｌ中200μｇ
のプラスミドDNAをマウス当たり尾静脈から注入した。
マウス:Balb/c、メス、25g 組織摘出手順：尾静脈注入後48時間で、マウスを犠牲
死させ、全脾臓を1mlの0.25Mのトリス−HCl、pH7.8、5m
MのEDTA、80μg/mlのPMSF中にホモジナイズして、得ら
れた抽出物を遠心分離し、その後上精を３サイクルの凍
結−溶解操作に付し、その後20分間65℃に加熱した。
CATアッセイ手順:100μｌの抽出物＋10μｌの20mMア
セチルCoA＋４μｌの14C−クロラムフェニコール（25μ
Ci/ml、55mCi/nmol、アマシャム社）を共に、37℃６時
間でインキュベートした。３時間で、更に10μｌのアセ
チルCoAを添加した。
結果：この実験は、有意なレベルのCAT活性が処理動
物の脾臓抽出物にあったが、脂質キャリアのみで注入さ
れた動物から得られた対照脾臓の抽出物にはなかったこ
とを示した。
実施例６ DOTMA:DOPE＋pSIS−CATプラスミドの注入は明らかに検
出可能なin vivoにおけるCAT遺伝子の発現をもたらさな
い 脂質キャリア:DOTMA:DOPE＝1:1、５％デキストロース水
溶液中 プラスミド:pSIS−CAT（ホァン、M.T.F.及びC.M.ゴルマ
ン、1990、Nucleic Acids Research 18:937−947） 比：陽イオン性脂質：プラスミド＝4nmol:1μｇ、投与
量:200μｌの５％デキストロース水溶液中100μgDNA マウス:ICR、メス、25g 注入：尾静脈 組織採取及び加工処理：マウスを２日目及び６日目で犠
牲死にして、肺、脾臓、肝臓及び心臓を採取した。器官
全体を、肝臓以外は0.5mlの、肝臓は2.0mlの、0.25Mの
トリス−HCl、pH7.8、5mMのEDTA、２μg/mlのアプロチ
ニン、１μg/mlのＥ−64及び0.5μg/mlのロイペプチン
（全てのプロテアーゼ阻害剤はベーリンガーマンハイム
社から購入）中にホモジナイズした。抽出物を３サイク
ルの凍結−溶解操作に付し、その後10分間65℃に加熱し
た。
CATアッセイ手順：アッセイのための抽出物100μｌと0.
3μCiの14C−クロラムフェニコール及び10μｌの20mMア
セチルCoAとを37℃で５時間か24.5時間かでインキュベ
ートし、その後、該物質をエチルアセテートを用いて抽
出し、TLCプレート上で解析した。
結果： 処理動物からの抽出物を、対照動物からのものとを比
較することによって測定したときに、アセチル化クロラ
ムフェニコール種は認められなかった。従って、高レベ
ルのpZN27の発現がもたらされるものと同様の実験上の
条件下でpSIS−CAT発現ベクターの使用は、in vivoでア
ッセイされた全ての組織における検出可能な連結CAT遺
伝子の如何なる発現も生じない。in vivoでのpSIS−CAT
の発現の欠落は、高レベルのin vivo発現を発揮するpZN
27ベクターと比較すると、異なるプロモーター−エンハ
ンサー要素（SV40）のためか、異なるイントロン配列の
ためかであろう。
実施例７ DNA:脂質キャリア複合体と細胞表面リセプターとの相互
作用 細胞及び細胞培養:CV−１（アフリカミドリ猿、肝
臓）、U937（ヒト、骨髄性白血病）、マウス赤白血病
（MEL）細胞、及びK562細胞（ヒト、赤白血病細胞）を
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ（ロック
ヴィル、メリーランド州）から得た。CV−１及びMEL細
胞を、５％ウシ胎児血清（FBS）添加ダルベッコ最少必
須培地DME−H21中に、37℃及び７％CO2で維持した。ラ
ット肺胞II型細胞及びラット肺胞マクロファージを既述
のように単離して精製した（デブス（Debs）ら、Amer.R
ev.Respiratory Disease（1987）135:731−737;ドッブ
ス（Dobbs）、Amer.Rev.Respiratory Disease（1986）1
34:141−145）。II型細胞を５％FBS添加DME−H16中に、
37℃及び７％CO2で維持した。20nmolのDOTMA:DOPE脂質
キャリアと20μｇのpRSV−CATプラスミドDNAとの複合体
を、60mmファルコンプラスチックディッシュ中で成長し
ている２×166細胞に添加して（SUV及びMLVのいずれ
か）、その後15分から２時間の時点でのEMのために固定
した。
電子顕微鏡のための固定及び処理 DOTMA脂質キャリアと組織培養中の又は血液若しくは
肺胞から新たに単離した細胞とを、１％シュークロース
を含有する0.1モルのカコジル酸ナトリウム緩衝液、pH
7.4、中の1.5％グルタルアルデヒドに、１時間室温で固
定した。タンニン酸及びウラニルアセテート増加の後、
組織をアルコールの段階シリーズ中で脱水し、エポキシ
812樹脂（アーネスト F.フラム（Ernest F.Fullam）イ
ンク社、ラザム、ニューヨーク州）に包埋し、ダイアモ
ンドナイフを用いてMT2ミクロトームにおいて切片を作
製し、80kVで操作したジョエル100CX透過型電子顕微鏡
で試験した。CV−１サル腎臓細胞中の脂質複合体の取り
込みの電子顕微鏡写真は、図７に示されている。パネル
（ａ）中の矢印は、クラスリン被覆小胞に結合している
粒子を示し；パネル（ｂ）中の矢印は、エンドソーム中
に取り込まれ存在している粒子の場所を示している。
プラスミドDNAに複合した単一又は多重ラメラ脂質キ
ャリアのDOTMA脂質キャリアと種々の細胞型（CV−１サ
ル腎臓細胞、U937ヒト骨髄単球白血病細胞、K562、MEL
赤芽球白血病細胞、ラット肺胞マクロファージ及びII型
肺胞細胞）との高頻度相互作用は、脂質キャリア付着と
典型的な被覆小胞経路におけるインターナライゼーショ
ンのものである（図7a−ｆ）。この相互作用は、リセプ
ター仲介エンドサイトシスのよく研究された例に共通し
ているものである。陽イオン性脂質キャリア:DNA複合体
と接触するように見える全ての細胞は、形質膜への結合
後に該複合物を取り込む。これらの全ての細胞型（げっ
歯類、サル及びヒト細胞由来）は、同一のインターナラ
イゼーションの伝統的なリセプター仲介エンドサイトシ
ス経路を証明する。DNA−陽イオン性リポソーム複合体
は、一般に、非ヒト及び同様の系統にある特定のげっ歯
類細胞と同じ位又はそれ以上に、ヒト細胞によって取り
込まれる。
実施例８ マウスＴリンパ球がin vivoでトランスフェクトされる
ことの証明 メスICRマウスに、１μmolのDDAB:DOPE（1:1モル、SU
V）脂質キャリアに複合化されたpZN27プラスミド1mgを
含む５％デキストロース水溶液1mlをip注入した。マウ
スを48時間後に犠牲死させ、脾臓及びリンパ節を摘出
し、血清含有培養液中でホモジナイズすることによって
単細胞懸濁液にした。その後、細胞をFITC結合抗Thy−
1.2抗体（J.ベック博士、サンフランシスコ退役軍人局
医学センターから入手）と共にインキュベートしてFACS
でソート（選択分離）した。Thy−1.2+Tリンパ球分画を
顕微鏡スライド上にサイトスパンして固定し、0.25％の
トライトンＸ−100を用いて細胞を透過性にした後に内
在化CATタンパク質の存在について釣り上げた。細胞を
抗CATモノクローナル抗体（P.アンティン（Antin）博
士、アリゾナ大学からの贈与）と共に、20℃でインキュ
ベートして、その後、テキサスレッド結合ヤギ抗マウス
IgGで１時間、20℃で染色した。図2Aは、位相差顕微鏡
によるＴリンパ球の視野を示し、2Bは、蛍光顕微鏡によ
る同一視野が示されている。これらの結果は、70％以上
のThy−1.2+Tリンパ球が、pZN27:DDAB:DOPE複合体の１
回のip注入によって、in vivoでトランスフェクトされ
る（赤い蛍光によって示されるように）ことを証明して
いる。未処理マウスからのThy−1.2+リンパ球は、図2D
に示されているように免疫蛍光染色を示さない；同一視
野の位相差顕微鏡写真は2Cに示されている。
実施例９ マウス造血系骨髄由来細胞がin vivoでトランスフェク
トされることの証明 メスICRマウスに、１μmolのDDAB:DOPE SUV脂質キャ
リアに複合化されたpZN27プラスミド1mgを含む５％デキ
ストロース水溶液1mlをipで注入した。マウスを48時間
後に犠牲死させ、それから、RPMI−1640培地で大腿腔を
洗い流すことによって骨髄由来造血細胞を得て、その
後、小塊をホモジナイズして単細胞懸濁液を得た。その
後、骨髄細胞をガラススライドに向けて遠心し、実施例
８で既述したように蛍光染色した。この実験では、約20
％のマウス骨髄造血細胞（形態に基づいた初期の骨髄芽
球及び赤芽球前駆体細胞である細胞を含む）が、pZN27:
DDAB:DOPE複合体の１回のip投与によって、in vivoでト
ランスフェクトされたことを証明した。
実施例10 正常ドナーから新たに単離されたヒトCD4+T細胞がin vi
troでトランスフェクトされることの証明 バフィコート調製物を、密度勾配遠心分離によって正
常ヒトドナーから新たに単離した。その後、細胞を抗CD
3（ベクトン−ディッキンソン社、マウンテンデュー、
カリフォルニア州）モノクローナル抗体を用いてパニン
グしてCD3+Tリンパ球分画を単離した。その後、これら
の細胞を下記のプロトコールを用いてトランスフェクト
した；即ち、10×106の細胞を100mmのディッシュ上に置
き、その後、50nmolのDDAB:DOPE（1:1）SUV脂質キャリ
アに複合化された25μｇのpZN27を48時間添加した。対
照群の細胞は、トランスフェクトされなかった。その
後、この細胞を、FITC結合モノクローナル抗CD4抗体
（ベクトン−ディッキンソン社）とインキュベートして
FACSによりソートした。得られたCD4+Tリンパ球を、顕
微鏡スライド上にサイトスパンして固定し、0.25％のト
ライトンＸ−100を用いて細胞を透過性化した後、細胞
内CATタンパク質の存在について釣り上げた。細胞を、
抗CATモノクローナル抗体で１時間20℃でインキュベー
トして、テキサスレッド結合ヤギ抗マウスIgGを用いて
１時間20℃で染色した。
結果： 結果は図４に示されており、これは、少なくとも70％
の新たに単離されたヒトCD4+Tリンパ球が、図4Bで細胞
の赤い蛍光によって示されるように、培養系でpZN27:DD
AB:DOPE複合体に晒された後トランスフェクトされたこ
とを証明している。対照群の未処理細胞は蛍光を示さな
かった。これらの結果は、この手段が、AIDS及び癌を含
む疾患の治療を劇的に改良し得ることを示唆している。
上記の結果が示すように、高レベルの注入遺伝子発現
が、全身性（iv又はip）の注入遺伝子投与後に、心臓、
腎臓、リンパ節、骨髄細胞、肝臓、肺及び脾臓において
達成された。成人への全身性（iv又はip）注入遺伝子投
与後の独立した心臓、腎臓、リンパ節又は骨髄細胞のト
ランスフェクションは、以前には達成されていない。DN
Aの全身性投与によるＴリンパ球、肺気道若しくは肺胞
細胞型、冠状内皮管壁細胞及び冠状筋肉細胞、並びに、
骨髄造血系前躯体細胞のin vivoでのトランスフェクシ
ョンは、以前に示されていない。特に、50％を越えるＴ
リンパ球、肺気道上皮、肺胞及び血管内皮細胞型、冠状
内皮管壁細胞及び骨髄造血前駆体細胞（約70％の芽細胞
を含む）は、CAT発現プラスミド−陽イオン性脂質キャ
リア複合体の１回のiv若しくはip注入の後に、in vivo
でトランスフェクトされる。全ての単一組織中に存在す
る高パーセントの全細胞のトランスフェクションは、以
前には報告されていなかった。
実施例11 DNAの陽イオン性リポソーム仲介送達を用いた種々のヒ
ト肺癌細胞株の効率的なトランスフェクション 方法： 細胞培養:NCI−H69、NCI−H82及びNCI−H520細胞を用い
た。H69及びH520細胞を、10％のウシ胎児血清（FBS）含
有RPMI−1640中で成育させ、H82細胞を、10％FBS含有の
ダルベッコ最小必須培地（DME）−H21中で成育させた。
リポソーム調製：リポソームは下記のようにして調製し
た。即ち、クロロホルム（又はエタノール（DDTAM））
に懸濁された総量４μmolの脂質を、回転式エバポレー
タで乾燥状態まで蒸発させた。50mMのトリス、0.5mMのE
DTA、50mMのNaCl、100μＭのZnCl2緩衝液1mlを20mmolの
脂質毎に添加し、混合物を音波処理槽（ラボラトリー・
サプライ社、ヒックスビル、ニューヨーク州）中で20分
間音波処理した。得られたリポソームは、約100±25nm
の平均直径である。下記のリポソーム調製物を用いた。
即ち、精製DOTMA、２〜１モル比のDOTMA:コレステロー
ル、精製Ｌ−PE又は６〜４モル比のＬ−PE:CEBAであっ
た。
細胞性トランスフェクション：細胞のトランスフェクシ
ョンのために、4mlの無血清培地中の２×106の細胞を10
0mmのプラスチックディッシュ（ファルコン社、オック
スナード、カリフォルニア州）に置いた。プラスミドDN
A−リポソーム複合体を、まず、１）DNAに、その後、
２）リポソームに添加して、ゆっくりと混合することに
よって調製した。その後、該混合物を1mlの無血清培地
に懸濁して、細胞へ添加した。４時間後に、細胞を２回
洗浄し、10mlの血清含有培地に再懸濁し、続いて44時間
後に採取した。採取の直前に、細胞を２回洗浄し、その
後、このプレートをラバーポリスマンで掻き取った。細
胞を1000×ｇで５分間遠心分離して、0.135mlの0.25Mの
トリス緩衝液、pH7.5、5mlのEDTAを各沈殿物に添加し
た。細胞を３回、凍結溶解して、65℃で10分間加熱し、
12500×ｇで10分間回転させた。上清をタンパク質につ
いてアッセイし、試料当たり20μｇの上清タンパク質を
用いて、実施例４で記述したようにCAT活性を測定し
た。
結果：結果は、２つの異なるヒト小細胞肺癌細胞（H69
及びH82）並びに偏平上皮細胞肺癌株（H520）の高レベ
ルのトランスフェクションに対する陽イオン性リポソー
ムの仲介能を証明している。３つの株の全ては、３つの
異なる陽イオン性リポソーム配合物に対して複合化した
場合に、RSV−CATによってかなり効率的にトランスフェ
クトされた（図21）。これらヒト細胞株は、比較条件下
でトランスフェクトされたげっ歯類の腫瘍細胞株と同等
又はそれよりも効率的にトランスフェクトされた。
実施例12 陽イオン性脂質キャリア:DNA複合体の静脈注入によるマ
ウスにおける肺癌細胞のトランスフェクション マウス:C57/black ６、メス、25g 癌:B16、肺に対してかなり転移性であるマウスメラノー
マ株である。該細胞株を、５％ウシ胎児血清を添加した
PRMI 1640中で成育させた。
脂質キャリア:DOTAP:コレステロール＝1:1、５％デキス
トロース水溶液中10mM プラスミド:pZN20 比：陽イオン性脂質:DNA＝6nmol:1μｇ、200μｌの５％
デキストロース水溶液中に100μｇを、マウス毎に尾静
脈から注入した。
マウスへの癌細胞株の接種及びCAT発現プラスミド−陽
イオン性脂質キャリア複合たの投与： B16細胞をトリプシン処理してプレートから剥がし、
マウス当たり50000細胞を尾静脈へ静脈注入で各マウス
に接種した。接種後２週間で、陽イオン性脂質キャリア
−DNA複合体を尾静脈から注入した。肺を注入後48時間
で採取してドライアイス−エタノール槽中の凍らせた33
％のOCTで浸潤させ、凍結切片にして、細胞内CATタンパ
ク質を検出するために免疫組織化学的解析のために処理
した。
免疫組織学的解析：手順： 器官を取り出し、適当に整えて、OCT中に包埋し、ス
ナップ凍結した。凍結組織を６μｍで切片にして、ガラ
ススライド上に集めて４℃アセトン中で10分間固定し
て、その後、0.2％トライトンＸ−100に置いて透過性化
した。その後、切片を1248時間、モノクローナル抗CAT
抗体と又はアイソタイプ陰性対照抗体と共に、適当な希
釈率でインキュベートした。洗浄後、一次抗体に対する
ビオチン化抗体（ザイメッド社、S.サンフランシスコ）
を最低60分間添加し、ストレプトアビジン−ペルオキシ
ダーゼ複合体（ザイメッド社）を60分間加えて、その
後、用いた酵素標識に適当な基質−色素源を適用した。
その後、スライドを希釈ヘマトキシリン中で対応染色し
て、又は未染色のままで、検査のために水溶性マウント
媒体中でカバーガラスを載せた。
結果： 免疫組織化学的解析は図８に示されており、これはＢ
−16メラノーマ肺腫瘍（8A、矢印で表示）と管内腫瘍塞
栓（8B、矢印で表示）とは、DNA−脂質キャリア複合体
のiv注入後に効率的にトランスフェクトされることを証
明している。肺腫瘍と管内腫瘍塞栓とは共に強く染色さ
れており、in vivoで効率よい広汎性トランスフェクシ
ョンを示している。腫瘍発生マウスは、DNA−脂質キャ
リア複合体の注入を受けてないが、肺又は全ての肺腫瘍
細胞にCAT活性が示されていない（8C）。クローン化し
た遺伝子の全身性投与による哺乳宿主内に存在する腫瘍
のトランスフェクト能は、以前には証明されていなかっ
た。
実施例13 pZN27のみ又はpZN27:DDAB:コレステロールSUV複合体の
静脈（iv）注入後の、多重組織における高レベルCAT遺
伝子発現の証明 脂質キャリア:DDAB:コレステロール＝1:1、５％デキス
トロース水溶液中10mMで保存。５％デキストロースを乾
燥脂質形態に添加後、SUVを20分間音波処理槽中で音波
処理して調製した。
プラスミド:pZN27 DNA:脂質キャリア比：陽イオン性脂質：プラスミドDNA
＝5nmol:1μgDNA DNA投与量： pZN27のみ：個々のマウスは、尾静脈注入により５％
デキストロース水溶液200μｌ中のpZN27を、500μｇ、1
mg、2mg又は500μｇ、４時間後に２回目の500μｇ投与
量で受けた。
脂質キャリアに複合化したpZN27:200μｌの５％デキ
ストロース水溶液中の500nmolのDDAB:コレステロールSU
V脂質キャリアに複合化された100μｇのプラスミドDNA
を、マウス当たり尾静脈により注入した。
マウス:ICR、メス、25g。
組織抽出方法：各器官を0.3mlの0.25Mトリス−HCl、pH
7.8、5mM EDTA中にホモジナイズして、得られた抽出物
を遠心分離し、その後、上清を３回、凍結−溶解操作に
かけ、その後、65℃で20分間加熱した。
CATアッセイ方法：各組織抽出物のタンパク質濃度を、
クマジーブルー主体タンパク質アッセイ（バイオ・ラド
社、リッチモンド）を用いて定量し、各組織抽出物から
の等量の総タンパク質を、37℃13時間、10μｌの20mMア
セチルCoA＋12μｌの14C−クロラムフェニコール（25μ
Ci/ml、55mCi/mmol、アマシャム社）と共に、CATアッセ
イに添加した。
結果： かなりのレベルのCAT遺伝子発現が、pZN27のみ、又は
DDAB:コレステロール脂質キャリアに複合化されたpZN27
の注入後に、アッセイされた６つの異なる組織（肺、心
臓、肝臓、腎臓、脾臓及びリンパ節）の各々で示され
た。裸の発現プラスミドの全身性投与後に、in vivoで
の多重組織における注入遺伝子の発現は以前に証明され
ていなかった。
実施例14 CMV−インターロイキン−２遺伝子と複合化した陽イオ
ン性脂質キャリアの静脈注入によるマウスの脾臓及びリ
ンパ節での高レベルのヒトインターロイキン−２の誘導 マウス:C57/Black ６、メス、25g 癌:B16、肺に対してかなり転移性であるマウスメラノー
マ株である。該細胞株を、５％ウシ胎児血清を添加した
PRMI 1640中で成育させた。
脂質キャリア:DDAB:コレステロール＝1:1、５％デキス
トロース水溶液中10mMで保存。
プラスミド:pZN46（ヒトインターロイキン−２をコード
化する配列に融合されたHCMVプロモータエンハンサー） 比：陽イオン性脂質:DNA＝注入当たりに投与された200
μｌの５％デキストロース水溶液中、5nmol:1μgDNA 腫瘍細胞株のマウスへの接種とヒトインターロイキン−
２発現プラスミド−陽イオン性脂質キャリア複合体の投
与 B16細胞をトリプシン処理してプレートから剥がし、
５×104細胞を尾静脈へ静脈注入によって各マウスに接
種した。腫瘍細胞注入後２日目に開始して、陽イオン性
脂質キャリア−DNA複合体を週に２回で合計２週間、尾
静脈から注入した。動物を腫瘍細胞注入の２週間後に犠
牲死させ、脾臓及びリンパ節を摘出し、組織粉砕器を用
いて単細胞懸濁液にして、その後、37℃の培養器中で10
0mmのプラスチックディッシュにRPMI−1640、10％ウシ
胎児血清中で24時間培養した。24時間後に、上清を回収
して、上清中のヒトインターロイキン−２の濃度をヒト
IL−2 ELISAを用いて測定した。
結果： pZN46−DDAB:コレステロール脂質キャリア複合体を注
入したマウスからの脾臓細胞懸濁液中には、100pg/mlの
ヒトIL−２が、リンパ節細胞懸濁液には91pg/mlのIL−
２が存在していた。ヒトIL−２は、Ｂ−16メラノーマ細
胞の同一の注入を受けたが、pZN46−DDAB:コレステロー
ル脂質キャリア複合体の注入を受けなかったマウス由来
の脾臓細胞又はリンパ節細胞懸濁液には検出されなかっ
た。従って、HCMV発現プラスミドにおけるCAT遺伝子コ
ード領域に対するヒトIL−２遺伝子コード領域の置換
は、マウスにおけるin vivoでのIL−２遺伝子の高レベ
ルでの発現と産生型ヒトIL−２タンパク質の大量の生成
とをもたらした。
実施例15 pZN32:陽イオン性脂質キャリア複合体のiv投与によって
処理されたマウスにおけるヒトCFTR遺伝子の高レベル発
現の誘導 マウス:ICR メス、25g 脂質キャリア:DDAB:コレステロール＝1:1 SUV、５％デ
キストロース水溶液中10mM。
プラスミド:pZN32（ヒトCFTRコード配列に融合されたHC
MVプロモータエンハンサー） 比：陽イオン性脂質:DNA＝5nmol:1μｇプラスミドDNA 投与量:iv尾静脈注入当たり投与された200μｌの５％デ
キストロース水溶液中、総量100μｇのプラスミドDNA 方法：注入後48時間で、マウスを犠牲死させ、肺を摘出
して整え、OCTに包埋して、スナップ凍結した。凍結組
織を６μｍの切片にして、ガラススライド上に集め、４
％アセトン中で10分間固定した。その後、CFTRの免疫局
在をアフィニティ精製ウサギモノクローナル抗CFRT抗
体、α−1468、コーン（Cohn）ら、（1991）Biochem.Bi
ophs.Res.Comm.181:36−43）を用いて行った。この方法
は、下記の変更をするが、マリノ（Marino）ら、（199
1）J.Clin.Invest.88:712に記載されているものと同一
であった。洗浄後、ウサギポリクローナル抗体に対する
ビオチン化抗体（ザイメッド）を、60分間添加し、その
後、ストレプトアビジンホスファターゼ複合体（ザイメ
ッド）を60分間添加して、その後、基質−色素源を添加
した。それから、スライドに、検査のために水溶性マウ
ント媒体中でカバーガラスを載せた。
結果： pZN32−DDAB:コレステロール（1:1）リポソーム複合
体についてiv注入した後48時間のマウス肺と未処理対照
群の肺との凍結切片の顕微鏡写真（違う倍率の視野）を
図12A−Ｅに示す。ポリクローナル抗CFTR抗体、α1468
による強い染色によって示されるように、圧倒的多数の
気道が、ヒトCFTR遺伝子によってトランスフェクト抗体
された。12A、12C及び12Eを参照のこと。視覚的検査に
より、トランスフェクトされた気道中の本質的に全ての
細胞が陽性に染まり、これは、気道細胞の圧倒的多数
が、処理されたDDAB:コレステロール（1:1）リポソーム
に複合化されたpZN32の１回の投与で、in vivoでヒトCF
TR遺伝子によりトランスフェクトされ、対照動物は組織
学的に区別できないことを証明している。ヒトCFTR遺伝
子の顕著な発現は、DDAB−コレステロール（1:1）リポ
ソームに複合化されたpZN32の１回のiv投与後少なくと
も60日で、マウス肺において、少なくとも50％の全ての
気道及び、少なくとも50％の全ての気道管壁細胞（視覚
的検査）に存在する。対照動物からのマウス肺の凍結切
片（12B及び12D）は、CFTRについて如何なる検出可能な
染色も示さず、これは、12A、12C及び12Eに示されてい
るCFTR発現全てが、ヒトCFTR遺伝子による肺細胞のトラ
ンスフェクションのためであることを証明している。
上記の結果に示されるように、１回のiv投与の発現コ
ンストラクトは、対象となる遺伝子を含むと共に、陽イ
オン性リポソームに複合化されたものであり、これは、
肺の誘導気道に沿った細胞の殆どをトランスフェクト
し、該遺伝子産物は、少なくとも60日間肺に存在し、こ
の発現は、気道細胞に特異的のようであり、暴露後に損
傷の組織的な証拠は認められない。これは、リポソーム
が十分に寛容化されて、非免疫原性であるので重要であ
る。更に、複合化されたpZN32:DDAB−コレステロール
（1:1）の静脈注入で処理されたマウスの外見、挙動及
び寿命は、正常のようであり、未処理の正常対照マウス
と何ら区別することができない。これらの動物からの広
範囲の組織の外見、挙動、寿命及び詳細な組織学的解析
の解析により証明されるように、この毒性の欠如は、pZ
N32−DDAB:コレステロール複合体のin vivo送達により
もたられる毒性の欠如を証明している。更に、DNA/リポ
ソーム複合体の反復iv投与の影響は、効果的且つ非毒性
である。iv注入による陽イオン性リポソーム仲介DNA送
達は、in vivoで高レベルで肺特異性注入遺伝子発現を
もたらす。
実施例16 異なるCAT遺伝子含有プラスミドの静脈注入後の肺及び
肝臓におけるCAT遺伝子発現の証明 脂質キャリア:DDAB:コレステロール＝1:1 ５％デキス
トロース水溶液中5mMで保存。
プラスミド：プラスミドは以下に示す。
DNA−脂質キャリア比：陽イオン性脂質：プラスミドDNA
＝1nmol:1μｇ 投与量:iv尾静脈注入により静脈注入された200μｌ容量
中、100μｌのDNA マウス:ICR メス、25g 方法：動物を注入後24時間で犠牲死させた。組織抽出方
法及びCATアッセイは、CATアッセイを３時間37℃でイン
キュベートして、2.0mMのパラオキソン（ライ（Lai）
ら、（1988）Carcinogenesis 9:1295−1302）を肝臓試
料に添加した以外は、実施例４で記述したようにした。
結果を図15に示す。レーン１−12は肺試料であり、レー
ン13−24は肝臓試料である。レーン１、２、13、14はpZ
N51;レーン３、４、15、16はpZN60;レーン５、６、17、
18はpZN61;レーン７、８、19、20はpZN62;レーン９、1
0、21、22はpZN63;レーン11、12、23、24はpZN27であ
る。
結果： pZN51はイントロンを含まないものであり、これはコ
ード配列の3'又は5'側のいずれかのイントロンを含むプ
ラスミドと同様に又はそれ以上に発現する。
実施例17 CMV−CAT−リポソーム又はCFTR−CAT−リポソーム複合
体の各iv注入によってもたらされる 広汎性と組織及び細胞型特異性とのCAT遺伝子発現 マウス:ICR メス、25g リポソーム:DDAB:コレステロール＝1:1 SUV、５％デキ
ストロース水溶液中10mM。
プラスミド:1）pZN27又は、２）pBE3.8CAT（構築は、チ
ュウ（Chou）ら、（1991）J.Biol.Chem.266:24471−244
76を参照のこと） 実験条件:1群につき３匹のマウスに、（ａ）未処理、又
は（ｂ）CAT遺伝子に融合されたヒトCFTR遺伝子の5'上
流側領域の3.8kb配列100μｇに複合化されたDDAB:コレ
ステロールリポソームの１回のiv尾静脈注入、又は
（ｃ）pZN27を与えた。マウスを24時間後に犠牲死さ
せ、実施例４で記述したように、肺、肝臓、脾臓、リン
パ節、腎臓及び心臓においてCAT活性をアッセイした。
各群のマウス各々のからの肺切片の免疫組織化学的解析
を、実施例３で記述したように実施した。
結果： これらのマウスからの凍結肺切片の免疫組織化学染色
は、CMV−CATリポソーム複合体のiv注入が高レベルの赤
い染色をもたらすことを示し、これは、肺内部の内皮、
肺胞及び気道細胞におけるCAT遺伝子発現を示している
（16A）。これに対して、CFTR−CAT−リポソーム複合体
は、気道上皮細胞に主として局在化したCAT遺伝子発現
をもたらした（18B）。これは、in situハイブリダイゼ
ーション研究によって検出されたように（トレザイズ
（Trezise）とブッチワルド（Buchwaod）、（1991）Nat
ure 353:434−437）、ラット肺における内因性CFTR遺伝
子発現のパターンに近似している。未注入マウスからの
肺切片は、赤い染色を示さず、これは,CAT遺伝子発現が
トランスフェクトされた細胞にのみ存在することを示し
ている（図16C）。図16Dは、CMV−CAT処理マウスからの
肺胞の高倍率の顕微鏡写真であり、これは肺胞細胞と肺
内皮細胞との両方で高レベルのCAT遺伝子発現を示して
いる。CFTR−CAT処理マウスからの肺胞の高倍率の顕微
鏡写真（図16E）は、肺胞でも内皮細胞でも顕著なCAT遺
伝子発現が認められないことを示し、これは、CFTRプロ
モータが注入遺伝子発現の標的を気道上皮細胞にしてい
ることを示している。これは、iv注入後に、広汎性と用
いられた調節要素に依存した細胞型特異的様式とのいず
れかで、マウス肺内部において注入遺伝子を発現するこ
とができることの、最初の証明である。
CATアッセイは、CMV−CATが、肺、肝臓、心臓、脾
臓、リンパ節及び腎臓において顕著なCAT遺伝子発現を
もたらし、一方、CFTR−CATが肺特異的遺伝子発現をも
たらすことを証明した。各組織のオートラジオグラフ解
析の写真は、図16（Ｆ−Ｋ）に示されている。従って、
CMVプロモータは広範囲の組織における連結遺伝子の発
現を誘導し、一方、ヒトCFTR遺伝子の5'フランキング領
域は、ivリポソーム主体投与後に、組織特異性注入遺伝
子発現に指向する。
実施例18 プラスミドのみのiv注入と、脂質キャリアと複合化され
たプラスミドのiv注入に注目したトランスフェクション
の比較 pZN27のみの静脈（iv）注入後のin vivoでの広範囲、高
レベルのCAT遺伝子発現の証明 プラスミド:pZN27 DNA:脂質キャリア比：リポソームを用いないでプラスミ
ドDNAのみを注入した。
DNA投与量:5％デキストロース水溶液200μｌ中1mgのプ
ラスミドDNAを、マウス当たり尾静脈から４時間にわた
って２回注入した。マウスを24時間後に犠牲死させ、17
の異なる組織をCAT遺伝子活性についてアッセイした。
マウス:ICR、メス、25g 組織抽出方法：各器官を0.3mlの0.25Mトリス−HCl、pH
7.8、5mM EDTA中にホモジナイズして、得られた抽出物
を遠心分離し、その後、上清を３回、凍結−溶解操作に
かけ、その後、65℃で20分間加熱した。
CATアッセイ方法：各組織抽出物のタンパク質濃度を、
ニンヒドリン主体タンパク質アッセイ（バイオ・ラド
社、リッチモンド）を用いて定量し、各組織抽出物から
の等量の総タンパク質を、37℃13時間、10μｌの20mMア
セチルCoA＋12μｌの14C−クロラムフェニコール（25μ
Ci/ml、55mCi/mmol、アマシャム社）と共に、CATアッセ
イに添加した。
結果：この実験のオートラジオグラフは、19Aに示され
ている。対照レベル（レーン１）と比較して、pZN27の
みのiv注入は、下記の組織において、かなり高レベルの
CAT遺伝子発現をもたらした：肺、胸腺、食道、心臓、
肝臓、脾臓、胃、小腸、盲腸、卵巣、膣、骨格筋、膵臓
及びリンパ節。従って、pZN27発現プラスミドのみのiv
注入は、体内のかなり多種多様な組織を効率的にトラン
スフェクトすることができる。
DDAB:コレステロール（1:1）リポソームに複合化された
pZN27の静脈（iv）注入後のin vivoにおける広範囲、高
レベルのCAT遺伝子発現の証明 プラスミド:pZN27 リポソーム:DDAB:コレステロール＝1:1、５％デキスト
ロース水溶液中10mMで保存 DNA:脂質キャリア比：リポソーム：プラスミド、5nmol:
1μｇ DNA投与量:5％デキストロース水溶液200μｌ中100μｇ
のプラスミドDNAを、マウス当たり尾静脈から注入し
た。マウスを24時間後に犠牲死させ、17の異なる組織を
CAT遺伝子活性についてアッセイした。
マウス:ICR、メス、25g 組織抽出方法：各器官を0.3mlの0.25Mのトリス−HCl、p
H7.8、5mM EDTA中にホモジナイズして、得られた抽出物
を遠心分離し、その後、上清を３回、凍結−溶解操作に
かけ、その後、65℃で20分間加熱した。
CATアッセイ方法：各組織抽出物のタンパク質濃度を、
ニンヒドリン主体タンパク質アッセイ（バイオアーラド
社、リッチモンド）を用いて定量し、各組織抽出物から
の等量の総タンパク質を、37℃13時間、10μｌの20mMア
セチルCoA＋12μｌの14C−クロラムフェニコール（25μ
Ci/ml、55mCi/mmol、アマシャム社）と共に、CATアッセ
イに添加した。
結果：この実験のオートラジオグラフは、19Bに示され
ている。対照レベル（レーン１）と比較して、pZN27:DD
AB:コレステロール複合体のiv注入は、下記の組織にお
いて高レベルのCAT遺伝子発現をもたらした：肺、胸
腺、食道、心臓、肝臓、脾臓、胃、小腸、大腸、盲腸、
子宮、卵巣、膣、骨格筋、膵臓及びリンパ筋。従って、
pZN27:DDAB:コレステロール複合体のiv注入は、体内の
かなり多種多様な組織を効率的にトランスフェクトする
ことができる。
実施例19 GM−CSF発現プラスミド−陽イオン性リポソーム複合体
のiv注入は、顕著な抗腫瘍効果をもたらす マウス:C57/black ６、メス、25g 癌:B16、肺に対してかなり転移性であるマウスメラノ
ーマ株である。
該細胞株を、５％ウシ胎児血清を添加したPRMI 1640
中で成育させた。
リポソーム:DDAB:コレステロール＝1:1、５％デキス
トロース水溶液中10mMで保存。25000のＢ−16細胞を尾
静脈からiv注入した。
プラスミド:pZN84（図17に示されるように、マウスGM−
CSFコード配列に融合されたHCMVプロモータエンハンサ
ー） 比：陽イオン性脂質:DNA＝5nmol:1μｇ。５％デキスト
ロース水溶液200μｌ中、合計100μｇのプラスミドDNA
を注入毎に投与した。
実験概略:1群につき８匹のマウスは、2.5×104のＢ−16
ミラノーマ細胞のiv尾静脈注入を１回受けた。グループ
１は未処理であり、グループ２はDDAB:コレステロール
リポソームに複合化されたpZN84100μｇを週２回受け、
実験は腫瘍細胞注入の４日前に始めて、腫瘍注入後２週
間まで続けた。全てのマウスを腫瘍注入後３週間で犠牲
死させ、表面肺腫瘍節は黒色であり、解剖顕微鏡を用い
て顕微鏡上でカウントした。
結果：対照マウスは肺当たり64.5±19.7（S.E.M.）の小
節を有していた。これに対して、GM−CSF−リポソーム
処理動物は、肺当たり11.9±3.6（スチューデントのｔ
試験による評価で対照群に対してｐ＜0.01）の腫瘍小節
を有していた。従って、サイトカイン遺伝子のiv注入
は、かなり顕著な抗腫瘍効果をもたらした。これは、遺
伝子のiv注入が抗腫瘍活性をin vivoでもたらすことが
できることの最初の証明である。
実施例20 DDAB:コレステロール（1:1）リポソームに複合化された
pZN84のヤギへの静脈（iv）注入後のin vivoでの延長さ
れた高レベルのマウスGM−CSF遺伝子発現 動物：ヤギ：メス、110ポンド プラスミド:pZN84 リポソーム:DDAB:コレステロール＝1:1、５％デキスト
ロース水溶液中10mMで保存 DNA:脂質キャリア比：リポソーム：プラスミド＝5:1 DNA投与量:5％デキストロース水溶液5ml中1.0mのプラス
ミドDNAを、ヤギ当たり頸静脈から注入した。
血液採取：血液をpZN84リポソーム複合体の注入の直前
と、注入後12、24、48、72、168及び840時間で抜き出し
た。
マウスGM−CSF ELISAアッセイ手順：マウスGM−CSFを、
エンドン（Endogen）から入手した市販マウスGM−CSF E
LISAキットを用いて、これらの血清試料中で測定した。
ELISAによるヤギとマウスのGM−CSF間に相互反応はな
い。
結果：図22及び23（ヤギＡ、Ｂ及びＣ）に示されるよう
に、対照レベルと比較して、pZN84:DDAB:コレステロー
ル複合体のiv注入は、少なくとも注入後168時間、高く
継続された循環レベルのマウスGM−CSFタンパク質をも
たらした。しかし、840時間（35日）では、GM−CSFレベ
ルは、かなり減少した（図27、ヤギＡ）。マウスGM−CS
Fタンパク質は、DDAB:コレステロールリポソームに複合
化された1mgのCAT遺伝子（pZN51）を同一のiv注入方法
によって受けたヤギの循環系中には検出されなかった。
CAT遺伝子を受けたヤギは、CAT抗原の免疫染色によって
測定した場合、注入後24時間で大部分の循環性白血細胞
にCAT抗原を発現した。CAT抗原は、GM−CSF遺伝子リポ
ソーム複合体で注入されたヤギの白血細胞に検出されな
かった。従って、pZN84:DDAB:コレステロール複合体のi
v注入は、ヤギにおいてマウスGM−CSF遺伝子の高レベル
の発現を延長した期間でもたらすことができる。pZN51:
DDAB:コレステロール複合体のiv注入は、ヤギにおいて
全ての循環性白血細胞の大分部で高レベルのCAT遺伝子
産物をもたらすことができる。
実施例21 マウスにおける実験的なウィルス性肺炎の進行における
リポソーム−GM−CSFプラスミド複合体の影響 内因性サイトカインは、ウィルス感染に対する宿主応
答に包含されると考えられている。従って、単一のサイ
トカインGM−CSFの増大された発現が、ウィルス性肺炎
の時間的進行に影響するかを測定することは興味がある
ところである。センダイウィルス試行に対する宿主応答
において、マウスGM−CSFプラスミド−リポソーム複合
体の２つの異なる経路を経た送達の影響を試験した。プ
ラスミド−リポソーム複合体を、マウスのある群にはiv
で、次の群には鼻腔内（in）で送達した。投与量、送達
時間、ウィルス試行投与量及び終了点は、両群共に同一
する。プラスミド−リポソーム複合体の投与量は、100
μg/マウス／投与とする。両方の方法の投与は、下記の
スケジュールで行う。
各実験群は、下記のように構成されている： マウスGM−CSFプラスミド−リポソーム＋ウィルス:3
匹 CATプラスミド−リポソーム＋ウィルス:3匹 未処理＋ウィルス:3匹 これは、各時点当たり９匹のマウス（各実験につき合
計27匹、全部で54匹のマウス）となった。全ての動物実
験は、適当な無痛法の使用を含むNIH及びAAAI.ACガイド
ラインに従って実施される。
ウィルス試行は、センダイウィルス株771076による鼻
腔的投与であり、この菌株は、マウスにおいて病原性で
あることが知られている。終了点では、下記のことが含
まれる（これらは、センダイ肺炎の終了点として有用で
あると示されている）： 1.肺重量対体重及び脳重量 2.肺組織病理 3.ウィルス回収量 4.センダイ特異的抗体反応 5.肺GM−CSF 6.肺TNF 実施例22 中枢神経系に直接的なDNAのみ又はDNA−陽イオン性リポ
ソーム複合体の注入によってもたらされるマウス脳にお
けるCAT遺伝子の高レベルの発現 マウス:ICR、メス、25g プラスミド:pCIS−CAT リポソーム:DDAB:DOPE（1:1） 注入されたマウス毎に、2.5μgDNAを５％デキストロー
スに希釈し、その後、５％デキストロースに同容量に希
釈されたリポソームと混合した。５μｌを、各マウスの
右脳室へ定位的に注入した。
比：プラスミド：リポソーム＝1:0（1mgDNA:0μmol DOT
MA） プラスミド：リポソーム＝1:1（1mgDNA:1μmol DOT
MA） プラスミド：リポソーム＝1:3（1mgDNA:3μmol DOT
MA） プラスミド：リポソーム＝1:4（1mgDNA:4μmol DOT
MA） プラスミド：リポソーム＝1:6（1mgDAN:6μmol DOT
MA） マウスを注入後48時間で犠牲死させた。脳を取り出
し、左と右の脳室に分けた。各脳室を、250μｌの0.25M
のトリスpH7.8、5mM EDTA中にホモジナイズして、その
後、凍結−溶解操作を３回繰り返し、10分間65℃に付し
た。
CATアッセイに用いた抽出物の量をタンパク質レベル
で標準化した。0.3mlの14C−クロラムフェニコールを各
アッセイに用いた。アッセイを37℃で一晩実行した。反
応生成物を、実施例４で記述したように、TLCプレート
上で分離させ、フィルムに露光した。
結果：これらの結果は、異種遺伝子の高レベルの発現
を、中枢神経系へ直接DNA−リポソーム複合体（適当な
割合で）の注入によって、脳全体にもたらすことができ
ることを証明している。これらはまた、発現プラスミド
のみの注入が、脳において顕著な注入遺伝子発現をもた
らすことができることを証明している。結果は図20に示
されている。
実施例23 pRSV−CAT:L−PE:CEBA複合体の静脈（iv）注入後の肺に
おけるCAT遺伝子発現の証明 脂質キャリア:L−PE:CEBA＝1:1、脂質キャリア緩衝液中
20mMで保存 プラスミド:pRSV−CAT DNA:脂質キャリア比：脂質キャリア：プラスミド＝1nmo
l陽イオン性脂質:1μｇプラスミドDNA DNA投与量:5％デキストロース水溶液200μｌ中100μｇ
のプラスミドDNAを、マウス当たり尾静脈から注入し
た。
マウス:Balb/c、メス、25g 組織抽出方法：尾静脈注入後48時間で、動物を犠牲死さ
せ、全肺を1mlの0.25Mのトリス−HCl、pH7.8、5mM EDT
A、80μg/ml PMSF中にホモジナイズして、得られた抽出
物を遠心分離し、その後、上清を３回、凍結−溶解操作
にかけ、その後、65℃で20分間加熱した。
CATアッセイ方法:100μｌの抽出物＋10μｌの20mMアセ
チルCoA＋４μｌの14C−クロラムフェニコール（25μCi
/ml、55mCi/mmol、アマシャム社）とを共に、37℃６時
間、インキュベートした。３時間で、更に10μｌのアセ
チルCoAを添加した。
結果：この実験は、顕著なレベルのCAT活性（注入遺伝
子の発現として表示）が、脂質キャリア:DNA複合体を用
いて注入した動物の肺に存在したが、対照動物からの肺
には存在しなかったことを示した。
実施例24 pZN20−CAT:DDAB:DOPE複合体の静脈（iv）注入後の多重
組織におけるCAT遺伝子発現の証明 脂質キャリア:DDAB:DOPE＝1:1、５％デキストロース中1
0mMで保存 プラスミド:pZN20 DNA:脂質キャリア比：脂質キャリア：プラスミド＝
（Ａ）3nmol陽イオン性脂質:1μｇプラスミドDNA（SU
V）。（Ｂ）6nmol陽イオン性脂質:1μｇプラスミドDNA
（MLV） DNA投与量:5％デキストロース水溶液200μｌ中100μｇ
のプラスミドDNAを、マウス当たり尾静脈から注入し
た。３匹のマウス各々は、この量のMLV:pZN20を、３匹
のマウスの各々は、この量のSUV:pZN20を受けた。
組織抽出方法：各器官を0.3mlの0.25Mトリス−HCl、pH
7.8、5mM EDTA中にホモジナイズして、得られた抽出物
を遠心分離し、その後、上清を３回、凍結−溶解操作に
かけ、その後、65℃で20分間加熱した。
CATアッセイ方法：各組織抽出物のタンパク質濃度をク
マジーブルー主体タンパク質アッセイ（バイオ・ラド
社、リッチモンド、カリフォルニア州）を用いて定量
し、各組織抽出物からの同量の総タンパク質を、10μｌ
の20mMアセチルCoA＋12μｌの14C−クロラムフェニコー
ル（25μCi/ml、55mCi/mmol、アマシャム社）と共に、3
7℃13時間、CATアッセイに添加た。
結果：この実験は、pZN20:DDAB:DOPE複合体のiv注入
が、肺、心臓、肝臓、脾臓、腎臓及びリンパ節を含む６
つの異なる組織の各々で顕著なレベルのCAT遺伝子発現
をもたらすことを証明した。更に、MLV脂質キャリア
は、同一脂質から構成されるSUV脂質キャリアよりも、
同等か又はより高いレベルのin vivo注入遺伝子発現を
仲介した。
実施例25 ワクチンの製造 本発明は、種々の疾患のための、in vivoでのワクチ
ンの製造において一般的に使用され得る。顆粒球−マク
ロファージコロニー刺激因子（GM−CSF）に連結された
キメラな、遺伝的に設計されたタンパク質（geneticall
y−engineered proteins）の抗原フラグメント、増強抗
原提示及びin vivoで注入されたときに抗原に対する増
加免疫応答は示されている（タオ（Tao）及びレヴィ（L
evy）、（1993）、Nature 362:755−758）。従って、特
定抗原をコードする核酸配列を、GM−CSFをコードする
核酸に融合して、本発明を用いてin vivoで適当な細胞
に発現し得る。この手段は、癌治療における悪性腫瘍の
増殖の調節を劇的に改良することができる。他の用途に
は、種々のウィルス性及び他の感染性疾患に対するin v
ivoワクチン製造が含まれ、特に、これらの疾患には、
免疫応答が慣用のワクチン戦略ではうまくいかない又は
弱いような疾患が含まれる。特に、HIVのような超可変
域によってタンパク質が特徴付けられているような疾患
の興味が引かれる。種々の潜在的超可変域配列をコード
する核酸配列は、GM−CSFに融合してin vivoで同時に発
現させ、多くの異なる株のウィルスに対する免疫応答を
引き出すことができる。
実施例26 腫瘍増殖の治療 タンパク質53をコードするような核酸配列は、腫瘍増
殖を治療することに有用となり得る。腫瘍抑制タンパク
質p53をコードする配列を、適当な発現ベクター−脂質
複合体を用いてin vivoで細胞内に発現することができ
る。このような複合体は、便宜上、この脂質複合体に結
合された適当な抗体又はリガンドによって、腫瘍細胞を
標的とすることができる。細胞のトランスフェクション
を伴う初期感染は、培養細胞例えば腫瘍細胞株K562を用
いて発生する。p53遺伝子発現がK562において一度確認
され、最適なベクターが同定されると、in vivo抗腫瘍
実験が実施される。SCIDマウスにマウス当たり約25×10
6のK562細胞が腹腔注入によって与えられる。注入後約
３週間で、10匹の腫瘍発生マウスは、下記のものを与え
られる：未処理／対照群；静脈注入によるp53ベクター
リポソーム複合体；腹腔注入によるp53ベクターリポソ
ーム複合体；報告済みの遺伝子ベクターリポソーム複合
体。p53の発現の抗腫瘍効果は、その後、マウスの生き
残りに基づいてアッセイされる。
実施例27 赤血球生成は、赤血球の生成であり、細胞崩壊に至る
までの連続的な全体の生涯を生じされることができる。
赤血球生成は、かなり正確に調節された生理機構であ
り、適当な組織酸素付与のための血液中に十分に利用で
きる量の赤血球を有するが、細胞が循環を妨げられる位
多い量ではない。赤血球の形成は骨髄で起こり、ホルモ
ン、エリスロポイエチンの調節下にある。エリスロポイ
エチンは赤血球形成の過程に必須であるので、このホル
モンは、低い又は不完全な赤血球の生成によって特徴付
けられる血液障害の両方の治療の診断のための適用に使
用することが可能である。エリスロポイエチンのコード
配列を使用した遺伝子治療は、種々の疾患状態、障害及
び、貧血を含む血液異常の状態特に、慢性腎不全等に関
連するタイプの貧血の修復において使用される。EPO活
性を有するポリペプチドをコードする核酸配列は、適当
な転写又は発現カセットへ挿入され、裸のDNA又は適当
な脂質キャリアと複合化されて宿主哺乳類へ導入され
る。活性EPOポリペプチドの生成のモニターを、USPN4,7
03,008号の実施例で記述されたように実施することがで
きる。
上記の結果に示されるように、複数の組織が、脂質キ
ャリアと複合化しても、裸の核酸としても、注入遺伝子
の全身性投与の後にトランスフォームされることができ
る。陽イオン性脂質キャリア／外因性DNA複合体の哺乳
類宿主への静脈注入後の外因性DNAの発現は、Ｔリンパ
球、転移性腫瘍及び管内腫瘍塞栓を含む多重の組織にお
いて示された。網内系のものを含むこれら多重の異なる
組織における外因性DNAの発現は、裸のDNAとして発現プ
ラスミドを静脈注入した後に得られた。in vivoでのＴ
リンパ球のトランスフェクト能は、AIDS、癌、多発性硬
化症及び関節炎の治療に劇的な影響力を有する。心臓内
皮細胞のin vivoトランスフェクションは、心臓疾患及
び心臓発作の治療に劇的な影響力を有する。肺細胞のin
vivoトランスフェクションは、嚢胞性繊維症、喘息、
気腫及び肺癌の治療に劇的な影響力を有する。骨髄細胞
のin vivoトランスフェクションは、癌、血液疾患及び
感染に劇的な影響力を有する。
上述したようなin vivo遺伝子治療送達技術は、動物
において非毒性であり、注入遺伝子発現は１回の投与
後、少なくとも60日間持続することが示された。注入遺
伝子はサザン解析による測定でin vivoにおいて検出可
能なレベルで宿主細胞DNAへ組み込まれるようであり、
これは、遺伝子治療のためのこの技術が、癌発生オンコ
ジンを活性化する正常細胞性遺伝子の発現の変更、又は
癌を予防する腫瘍抑制遺伝子をオフにすることによる宿
主哺乳類に対する問題を引き起こさないであろうという
ことを示唆している。更に、DNA発現ベクターのみの全
身性投与後の注入遺伝子の発現が示され；注入遺伝子発
現は、キャリアシステムを伴うことなく、DNA発現ベク
ターの１回の投与後少なくとも３週間、肺にもたらされ
る。
異種遺伝子の成体動物への全身性投与は、広範囲の組
織においてかなり高レベルの発現をもたらし、上述した
ように、これらの組織の多くに存在する全ての細胞の大
部分（＞70％）をトランスフェクトできる。これに対し
て、既存の研究は、成体動物への異種遺伝子の直接的な
転移を試みているものであり、１又はわずかな組織に限
られたトランスフェクション、これらの組織における低
いレベルの注入遺伝子発現及び（組織化学解析が含まれ
る場合全て）トランスフェクトされた組織において存在
する細胞の１％未満の細胞に限定されたトランスフェク
ションを報告していた。
肺に存在する全ての細胞の大部分とトランスフェクト
することに加えて、上記の方法及びコンストラクトを用
いて、高レベルの注入遺伝子発現は広範囲の他の組織及
び細胞型にもたらされた。これらには、以下のことが含
まれる： ・脾臓及びリンパ節に存在する全ての細胞の大部分のト
ランスフェクションであり、これには全てのＴリンパ球
の70％以上のトランスフェクションが含まれる。in viv
oでのＴリンパ球の効率的なトランスフェクト能は、抗H
IV治療及び免疫応答の選択的改変の両方に対する最初の
特異性分子手段を可能にする。
・腫瘍発生宿主へのDNAのiv注入後の内臓腫瘍及び管内
腫瘍塞栓の効果的な治療。以前は、癌に関する遺伝子転
移研究は、ex vivo手段にのみ拘束されていた。ここで
我々の仕事は、腫瘍発生宿主において、腫瘍抑制物、抗
オンコジン及び／又は腫瘍内部の抗転移活性をもたらす
注入遺伝子を用いた直接的トランスフェクションを可能
にする。
・異種遺伝子の全身性送達による、心臓血管内皮細胞の
大分部と骨髄に存在する芽球細胞のかなり大部分を含む
骨髄由来造血細胞との大部分のトランスフェクション。
これらにより、分子レベルでの虚血性心疾患及び造血を
調節する劇的な及び新たな方法を創りだす。
・ヒトCFTR、IL−２及びGM−CSFに例示されるような、
種々の生物学的に重要な注入遺伝子の高レベルのin viv
o発現の発生能の証明 多くの刊行物及び特許出願は、個々の刊行物又は特許
出願各々が援用されて本文の記載の一部となることを特
別に及び個別的に指示している場合には、同一の範囲
で、ここに援用されて本明細書の一部とする。
本発明はここで十分に説明されたので、当業者にとっ
て、多くの変更及び改変が添付のクレームの精神又は範
囲を逸脱することなく、行うことができるということは
明らかであろう。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ９９２，６８７ (32)優先日 平成４年12月17日(1992．12．17) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） 前置審査 (72)発明者 ツー、ニン アメリカ合衆国 94116 カリフォルニ ア州 サンフランシスコ セブンティー ンス アベニュ 2137 (56)参考文献 特開 平２−135092（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−108391（ＪＰ，Ａ) 国際公開91／16024（ＷＯ，Ａ１) Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｎｕ ｔｒ．，７（３），175−183（1989) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 A61K 48/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (9)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】哺乳類中の細胞をin vivoでトランスフォ
    ームするDNA発現ベクター−脂質キャリア複合体であっ
    て、 ここで前記DNAベクターは、プロモータ及びポリペプチ
    ドをコードするDNA配列を含み、 前記脂質キャリアは陽イオン及び非陽イオン脂質を含
    み、ここで、陽イオン脂質対非陽イオン脂質のモル比は
    ５％〜100％の間であって、これにより前記脂質キャリ
    アが約100nm〜約10μｍの平均直径を有することを特徴
    とし、 前記DNA発現ベクター及び脂質キャリアがin vitroで凝
    集しない、又はDNA:脂質キャリアが５％デキストロース
    を含む水溶液中で凝集しないことを特徴とする、DNA発
    現ベクター−脂質キャリア複合体。
  2. 【請求項２】in vivoで哺乳類中の細胞の最適なトラン
    スフォーメーションを提供するDNA対脂質キャリアの比
    の決定を可能とするDNA発現ベクター−脂質キャリア複
    合体であって、 第１の哺乳類に対して、第１のDNA:脂質キャリア複合体
    を提供し、ここで第１の複合体は第１のDNA:脂質キャリ
    ア比を有し、 第２の哺乳類に対して、第２のDNA:脂質キャリア複合体
    を提供し、ここで第２の複合体は第２のDNA:脂質キャリ
    ア比を有し、この場合、第１の比は第２の比とは異な
    り、 トランスフォーメーションのための第１及び第２の哺乳
    類において標的細胞型を選択し、これによって、哺乳類
    中の選択細胞型を得て、 第1DNA:脂質キャリア複合体を第１の哺乳類へ全身的に
    導入し、 第2DNA:脂質キャリア複合体を第２の哺乳類へ全身的に
    導入し、 DNAでトランスフォームされた第１及び第２哺乳類中の
    選択細胞型の細胞のパーセンテージを測定し、これによ
    って、第１の哺乳類中のトランスフォーム選択細胞型の
    細胞のパーセンテージ及び第２の哺乳類中のトランスフ
    ォーム選択細胞型の細胞のパーセンテージを得て、 第１の哺乳類中でトランスフォームされた選択型の細胞
    のパーセンテージと第２の哺乳類中でトランスフォーム
    された選択型の細胞のパーセンテージとを比較し、第1D
    NA:脂質キャリア複合体又は第2DNA:脂質キャリア複合体
    のいずれが最適なトランスフォーメーションを提供する
    複合体であるかを決定すること、 に用いられる請求の範囲第１項記載のDNA発現ベクター
    −脂質キャリア複合体。
  3. 【請求項３】前記DNA発現ベクター及び脂質キャリア比
    が、DNA（マイクログラム単位）対陽イオン脂質（ナノ
    モル単位）＝6:1〜1:10である請求の範囲第１項記載のD
    NA発現ベクター−脂質キャリア複合体。
  4. 【請求項４】前記脂質キャリアが非陽イオン脂質として
    更にステロイドまたはコレステロールを含む請求の範囲
    第３項記載のDNA発現ベクター−脂質キャリア複合体。
  5. 【請求項５】前記プロモータがHCMVプロモータである請
    求の範囲第３項記載のDNA発現ベクター−脂質キャリア
    複合体。
  6. 【請求項６】前記DNA発現ベクターを全身的に前記哺乳
    類へ導入し、１以上の細胞型の細胞をトランスフォーム
    可能であり、ここでトランスフォームされる細胞が任意
    的には哺乳類Ｔ細胞である請求の範囲第３項記載のDNA
    発現ベクター−脂質キャリア複合体。
  7. 【請求項７】前記脂質キャリアが、 DNA:脂質キャリア比が約1:4であって脂質キャリアがDOT
    MA:DOPEを含む； DNA:脂質キャリア比が約1:3であって脂質キャリアがDDA
    B:DOPEを含む； DNA:脂質キャリア比が約1:6であって脂質キャリアがDOT
    AP及びコレステロールを含む； DNA:脂質キャリア比が約1:1であって脂質キャリアがLPE
    及びCEBAを含む； DNA:脂質キャリア比が約1:5であって脂質キャリアがDDA
    B及びコレステロールを含む；並びに、 DNA:脂質キャリア比が約2:1であって脂質キャリアがLPE
    及びDOPEを含む、 から選択されるいずれか１つの条件を満たす請求の範囲
    第３項記載のDNA発現ベクター−脂質キャリア複合体。
  8. 【請求項８】in vivoで哺乳動物細胞をトランスフォー
    メーションするための陽イオン脂質及び非陽イオン脂質
    の使用における、陽イオン脂質、非陽イオン脂質、コレ
    ステロール、容器及び取扱説明書を含むキットであっ
    て、トランスフォーメーションに用いるDNA発現ベクタ
    ー及び脂質キャリアがin vitroで凝集しない、又はDNA:
    脂質キャリアが５％デキストロースを含む水溶液中で凝
    集しないことを特徴とするキット。
  9. 【請求項９】in vivoで哺乳類中の細胞の最適なトラン
    スフォーメーションを提供するDNA対脂質キャリアの比
    の決定を可能とするDNA発現ベクター−脂質キャリア複
    合体であって、 第１の哺乳類に対して、第１のDNA:脂質キャリア複合体
    を提供し、ここで第１の複合体は第１のDNA:脂質キャリ
    ア比を有し、 第２の哺乳類に対して、第２のDNA:脂質キャリア複合体
    を提供し、ここで第２の複合体は第２のDNA:脂質キャリ
    ア比を有し、この場合、第１の比は第２の比とは異な
    り、 トランスフォーメーションのための第１及び第２の哺乳
    類において標的細胞型を選択し、これによって、哺乳類
    中の選択細胞型を得て、 第1DNA:脂質キャリア複合体を第１の哺乳類へ全身的に
    導入し、 第2DNA:脂質キャリア複合体を第２の哺乳類へ全身的に
    導入し、 DNAでトランスフォームされた第１及び第２哺乳類中の
    選択細胞型の細胞のパーセンテージを測定し、これによ
    って、第１の哺乳類中のトランスフォーム選択細胞型の
    細胞のパーセンテージ及び第２の哺乳類中のトランスフ
    ォーム選択細胞型の細胞のパーセンテージを得て、 第１の哺乳類中でトランスフォームされた選択型の細胞
    のパーセンテージと第２の哺乳類中でトランスフォーム
    された選択型の細胞のパーセンテージとを比較し、第1D
    NA:脂質キャリア複合体又は第2DNA:脂質キャリア複合体
    のいずれが最適なトランスフォーメーションを提供する
    複合体であるかを決定すること、 に用いられ、かつ 前記DNA発現ベクター及び脂質キャリアがin vitroで凝
    集しない、又はDNA:脂質キャリアが５％デキストロース
    を含む水溶液中で凝集しないことを特徴とする、請求の
    範囲第１項記載のDNA発現ベクター−脂質キャリア複合
    体。
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