KR20120105446A - 대식세포-자극 단백질의 헵신 활성화를 조정하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 헵신 활성 및 MSP/Ron 경로를, 특히 헵신에 의한 프로-MSP 활성화의 조절에 의해 조정하는 방법 및 조성물을 제공한다.

Description

대식세포-자극 단백질의 헵신 활성화를 조정하기 위한 방법 및 조성물 {METHODS AND COMPOSITIONS FOR MODULATING HEPSIN ACTIVATION OF MACROPHAGE-STIMULATING PROTEIN}

관련 출원에 대한 상호 참조

본원은 2009년 10월 22일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 61/253,990 (그 내용이 본원에 참조로 포함됨)의 이익을 주장한다.

발명의 분야

본 발명은 일반적으로 분자 생물학 및 성장 인자 조절 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 대식세포-자극 단백질의 효소적 활성화의 조정, 및 상기 조정제의 용도에 관한 것이다.

대식세포-자극 단백질 (MSP)은 Met-프로토-종양유전자 패밀리의 구성원인 수용체 티로신 키나제 Ron의 결합 및 활성화를 통해 그의 생물학적 활성을 조절한다 (문헌 [Leonard & Danilkovitch, 2000]). MSP와 그의 수용체의 상호작용은 수용체 인산화 및 키나제 활성화를 유발한다. MSP/Ron 경로는 다양한 암의 종양형성과 관련되어 왔다 (예를 들어, 문헌 [Wagh et al., 2008] 참조). MSP는 주로 간 실질성 세포에서 구성적으로 합성되는 혈장 단백질이지만, 이는 또한 폐, 부신 및 태반에서 낮은 수준으로 발현된다. MSP는 불활성 단일-쇄 전구체 (프로-MSP)로서 혈액 중에 순환되며, 이것은 기능적 활성를 획득하기 위하여 Ser-Lys-Leu-Arg483↓Val484 (서열 1) 결합에서의 단백질분해 절단을 필요로 한다 (문헌 [Skeel et al., 1991]) (문헌 [Yoshimura et al., 1993]). 활성 MSP는 디술피드 결합에 의해 함께 유지되는 α- 및 β-서브유닛의 이종이량체이다. MSP는 몇몇 트립신-유사 세린 프로테아제에 의해 혈관외 부위에서 활성화되는 것으로 공지되어 있다 (문헌 [Bhatt et al., 2007]; [Kawaguchi et al., 2009]; [Wang et al., 1994b]; [Wang et al., 1996]; [Wang et al., 1994c]).

헵신은 유형 II 막횡단 세린 프로테아제 패밀리의 구성원이고 (문헌 [Netzel-Arnett et al., 2003]; [Wu & Parry, 2007]), 전립선암에서 가장 고도로 상향조절되는 유전자 중 하나로서 확인되었다 (문헌 [Dhanasekaran et al., 2001]; [Luo et al., 2001]; [Magee et al., 2001]; [Stamey et al., 2001]; [Stephan et al., 2004]; [Welsh et al., 2001]). 면역조직화학 염색은 후기 단계의 종양 및 전이성 골 병변에서 강하게 발현되는 것으로 나타나며 (문헌 [Morrissey et al.], [2008; Xuan et al., 2006]), 이는 종양 진행에서의 헵신의 역할을 시사한다. 더욱이, 유전자 발현 분석을 바탕으로, 헵신은 또한 난소암 (문헌 [Tanimoto et al., 1997]), 신세포 암종 (문헌 [Betsunoh et al., 2007]; [Zacharski et al., 1998]) 및 자궁내막암 (문헌 [Matsuo et al., 2008])에 관련되어 왔다. 벨리보(Beliveau) 등은 헵신이 프로-MSP를 절단하지 않는다고 언급한 바 있다 (문헌 [Beliveau et al., (2009) FEBS J. 276:2213-26]).

헵신의 생리학적 기질의 포괄적 이해에 대한 명백한 필요성이 존재한다. 본 발명은 이 필요를 충족시키고, 다른 유용성을 제공한다.

본원에 인용된 모든 참고문헌 (특허 출원 및 공보 포함)은 그 전문이 참조로서 포함된다.

본원에는 헵신이 Arg₄₈₃-Val₄₈₄ 펩티드 결합에서의 절단에 의해 프로-대식세포-자극 단백질 (프로-MSP)이 대식세포-자극 단백질 (MSP)로 효율적으로 전환된다는 것이 개시되어 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 헵신에 대한 생리학적 기질은 Met-프로토-종양유전자 패밀리의 구성원인 수용체 티로신 키나제 Ron의 리간드인 프로-대식세포 자극 단백질이다. 본원에서 헵신은 프로-MSP를 강력한 활성으로 절단하여 정상적인 생물학적 활성을 나타내는 활성화된 MSP를 생성하는 것으로 나타난다. 본 발명은 이러한 발견의 적어도 일부를 바탕으로 하는 방법 및 조성물을 제공하며, 이는 본원에 상세히 기재되어 있다. 헵신 및 그의 프로-MSP와의 상호작용은 비정상적 또는 불필요한 헵신 및/또는 MSP/Ron-매개 생물학적 활성과 관련된 병적 상태에 대한 예방적 및/또는 치료적 접근법을 설계함에 있어서 보다 미세한 조정을 위한 독특하고 유리한 표적이다. 따라서, 본 발명은 MSP 활성화의 조절에 관련된 분자 상호작용의 조정을 통하여 헵신 및/또는 MSP/Ron-매개 생물학적 경로를 조정할 수 있는 물질을 확인하고 사용하기 위한 방법, 조성물, 키트 및 제조품을 제공한다.

따라서, 한 측면에서, 본 발명은 (a) 후보 물질을, 헵신 및 프로-MSP 기질을 포함하는 제1 샘플과 접촉시키는 것 및 (b) 샘플에서의 프로-MSP 기질 활성화의 양을, 제1 샘플과 유사한 양의 헵신 및 프로-MSP 기질을 포함하지만 상기 후보 물질과 접촉시키지 않은 참조 샘플에서의 프로-MSP 기질 활성화의 양과 비교하는 것을 포함하며, 여기서 참조 샘플과 비교하여 제1 샘플에서의 프로-MSP 기질 활성화의 양의 감소는 후보 물질이 프로-MSP의 헵신 활성화를 억제할 수 있다는 것을 나타내는 것인, 프로-MSP의 헵신 활성화를 억제하는 후보 억제제 (즉, 길항제) 물질을 스크리닝하는 (또는 확인하는) 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 샘플 내의 헵신은 상기 프로-MSP 기질을 활성화시키기 위한 유효량으로 존재한다. 이러한 방법에 사용하기에 적합한 프로-MSP 기질은 그가 프로-MSP 상의 헵신 절단 부위의 특성을 모방하는 한 수많은 형태로 존재할 수 있다.

프로-MSP 기질의 예는 Arg₄₈₃-Val₄₈₄ 펩티드 결합의 야생형 형태를 포함하는 전장 단일 쇄 MSP, 및 이 펩티드 연결을 포함하는 MSP의 임의의 단편을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 단편은 임의의 길이, 예를 들어 적어도 (약) 5, 7, 10, 15, 20, 25개 아미노산 길이, 또는 (약) 4 내지 25, 5 내지 20, 7 내지 15개 아미노산 길이일 수 있다. 일반적으로 및 바람직하게는, 프로-MSP 기질은 야생형 헵신에 의해 절단될 수 있는 Arg₄₈₃-Val₄₈₄ 펩티드 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로-MSP 기질은 합성 프로-MSP 기질이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 헵신 또는 프로-MSP에 결합 (바람직하게는, 반드시는 아니지만, 특이적으로 결합)하고 헵신과 프로-MSP 사이의 특이적 상호작용 (예를 들어, 결합)을 차단하는 물질을 스크리닝하는 것을 포함하는, 헵신에 의해 프로-MSP 활성화를 차단하는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 물질은 MSP에 대한 결합에 대해 헵신과 경쟁한다. 일부 실시양태에서, 물질은 헵신에 대한 결합에 대해 프로-MSP와 경쟁한다. 한 실시양태에서, 물질은 프로-MSP (예를 들어, 인간), 예를 들어 Val₄₈₄에 연결된 아미노산 잔기 Arg₄₈₃ 펩티드를 포함하는 인간 MSP의 단편에 대해 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 서열 유사성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 본질적으로 이로 이루어진다. 물질이 상기 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 본질적으로 이로 이루어진 일부 실시양태에서, 단편은 활성, 예를 들어 Ron의 활성화와 관련된 MSP 서열의 적어도 일부가 결여되거나, 또는 돌연변이된다.

당업자에게 명백한 바와 같이, 상기 기재된 것과 일치하는 스크리닝 검정은 또한 헵신-MSP 복합체의 형성에 대한 스크리닝으로 제1 세트의 후보 조정 물질을 수득하는 제1 단계, 후속으로 제1 세트의 후보 조정 물질이 프로-MSP의 활성화를 조정하고/거나 프로-MSP를 생물학적 활성인 형태로 전환시키는 능력을 기반으로 스크리닝하는 제2 단계를 포함할 수 있다. 적합한 판독은 효소-기질 복합체 형성 및/또는 헵신/MSP/Ron 신호전달 경로와 관련된 생물학적 활성의 지식을 기반으로 당업자에게 명백한 임의의 것일 수 있다. 효소-기질 복합체 형성은, 예를 들어 통상적인 생화학적 검정 (예를 들어, 겔 전기영동, 크로마토그래피, NMR 등)을 이용하여 측정될 수 있다.

한 측면에서, 본 발명은 헵신/MSP 상호작용을 방해하는 길항제를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 프로-MSP의 헵신 절단 (예를 들어, Arg₄₈₃-Val₄₈₄ 위치에서의 절단)을 억제하는 분자를 제공한다. 분자는 헵신 또는 프로-MSP에 결합하여 프로-MSP의 헵신 절단이 억제되도록 하고/거나 헵신-프로-MSP 복합체에 결합하여 프로-MSP의 절단이 억제되도록 하고/거나 프로-MSP 또는 헵신 (단독 또는 복합체)에 결합하여 헵신에 의한 MSP 절단의 효과가 억제되도록 하는 것 (예를 들어, 헵신에 의해 절단에 이어지는 MSP의 방출의 억제)을 비롯하여, 다양한 방식으로 그의 억제 기능을 발휘할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 길항제 분자는 프로-MSP/Ron 활성화와 관련된 생물학적 활성을 억제한다.

한 측면에서, 본 발명의 길항제는 간세포 성장 인자 활성화제 억제제 (HAI-1, HAI-1B, HAI-2)로부터의 단편이 프로-MSP의 헵신 활성화의 강력한 억제제라는 본원에 기재된 발견으로부터 유도된다. 한 실시양태에서, 본 발명은 헵신에 의한 프로-MSP 활성화의 길항제를 제공하고, 상기 길항제는 인간 HAI-1, HAI-1B 또는 HAI-2의 적어도 일부 (모두 포함)를 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 일부는 헵신에 의해 프로-MSP 활성화를 억제할 수 있는 쿠니츠 도메인 (KD) 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 쿠니츠 도메인 서열은 HAI-1 또는 HAI-1B의 쿠니츠 도메인 1 (KD1)이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 길항제는 인간 HAI-1의 야생형 KD1과 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%의 서열 동일성을 갖는 변이체 KD1 서열을 포함하며, 여기서 상기 변이체 서열은 인간 프로-MSP의 헵신 절단을 억제함에 있어서 야생형 KD1과 적어도 유사한 능력을 갖는다. 한 실시양태에서, 본 발명의 길항제는 인간 HAI-1의 야생형 KD1과 약 70% 내지 99%, 약 75% 내지 98%, 약 80% 내지 97%, 85% 내지 95%의 서열 동일성을 갖는 변이체 KD1 서열을 포함하고, 여기서 상기 서열은 인간 프로-MSP의 헵신 절단을 억제함에 있어서 야생형 KD1과 적어도 유사한 능력을 갖는다. 한 실시양태에서, 상기 쿠니츠 도메인 서열은 HAI-2의 쿠니츠 도메인 중 하나 또는 둘 모두이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 길항제는 야생형 인간 HAI-2의 상응하는 쿠니츠 도메인(들)과 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%의 서열 동일성을 갖는 변이체 HAI-2 쿠니츠 도메인 서열을 포함하며, 여기서 상기 변이체 서열은 인간 프로-MSP의 헵신 절단을 억제함에 있어서 야생형 HAI-2와 적어도 유사한 능력을 갖는다. 한 실시양태에서, 본 발명의 길항제는 야생형 인간 HAI-2의 상응하는 쿠니츠 도메인(들)과 약 70% 내지 99%, 약 75% 내지 98%, 약 80% 내지 97%, 85% 내지 95%의 서열 동일성을 갖는 변이체 HAI-2 쿠니츠 도메인 서열을 포함하고, 여기서 상기 서열은 인간 프로-MSP의 헵신 절단을 억제함에 있어서 야생형 HAI-2와 적어도 유사한 능력을 갖는다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 길항제는 소분자, 펩티드, 항체, 항체 단편, 압타머 또는 그의 조합이거나, 또는 그를 포함한다. 본원에 기재된 길항제는 본원에 기재된 바와 같은 헵신과 프로-MSP의 상호작용의 발견을 기초로 (하기 보다 상세하게 기재된 것들을 비롯하여) 당업계에 공지된 기술을 이용하여 통상적으로 수득될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 발명의 길항제는 프로-MSP에 대한 결합에 대해 헵신과 경쟁하지만 헵신 절단 부위에서 (예를 들어, Arg₄₈₃-Val₄₈₄에서) 프로-MSP를 절단하는 능력을 갖지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 길항제는 헵신에 대한 결합에 대해 프로-MSP와 경쟁한다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 상기 길항제는 프로-MSP (예를 들어, 인간 프로-MSP)에 대해 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%의 서열 유사성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 본질적으로 이로 이루어지며, 실질적으로 헵신에 결합할 수 있지만, 헵신 절단 부위 (예를 들어, 프로-MSP Arg₄₈₃-Val₄₈₄ 펩티드 연결)가 결여되고/거나 생물학적 활성이 결여된다 (예를 들어, MSP β 쇄가 돌연변이되어 그의 기능이 실질적으로 감소되거나 제거되도록 하는 경우 등). 한 실시양태에서, 본 발명의 길항제는 헵신에 결합할 수 있는 프로-MSP 단편을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 본질적으로 이로 이루어지며, 여기서 상기 단편은 생물학적 활성과 관련된 MSP 서열의 적어도 일부가 결여된다.

따라서, 본 발명은 헵신에 실질적으로 결합할 수 있지만 야생형 MSP와 비교하여 감소된 MSP 생물학적 활성을 갖는 MSP (또는 프로-MSP) 돌연변이체, 예를 들어 MSP 활성의 길항제, 또는 MSP 생물학적 활성의 감소를 나타내는 (부재하는 것은 아님) MSP 변이체를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 길항제는 야생형 (시험관내 또는 생체내) MSP의 생물학적 활성을 억제할 수 있다 (이러한 생물학적 활성은 기질로서의 플라스미노겐에 대한 생물학적 활성을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다). 한 실시양태에서, 본 발명의 길항제는 감소된 MSP 생물학적 활성을 제공한다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 길항제는 프로-MSP의 헵신 활성화를 차단하는 항-헵신 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-헵신 항체는 (a) (i) 서열

를 포함하는 HVR-L1; (ii) 서열 를 포함하는 HVR-L2; (iii) 서열

를 포함하는 HVR-L3을 포함하는 경쇄; 및/또는 (b) (i) 서열

를 포함하는 HVR-H1; (ii) 서열

를 포함하는 HVR-H2; (iii) 서열

를 포함하는 HVR-H3을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-헵신 항체는 서열

을 포함하는 경쇄 가변 영역 및/또는 서열

를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 모노클로날 항체이다. 다른 실시양태에서, 항체는 폴리클로날 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 키메라 항체, 친화도 성숙 항체, 인간화 항체 및 인간 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 항체는 항체 단편이다. 일부 실시양태에서, 항체는 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂ 또는 scFv이다.

일부 실시양태에서, 헵신에 대한 본 발명의 물질 또는 분자의 결합은 헵신 기질의 헵신 활성화를 억제한다. 일부 실시양태에서, 헵신에 대한 본 발명의 물질 또는 분자의 결합은 헵신 기질의 헵신 활성화를 경쟁적으로 억제한다. 한 실시양태에서, 물질은 헵신 활성 (예를 들어, 촉매적 활성) 부위를 차단하는 화합물의 부재 하에 헵신에 결합하지만, 헵신 활성 부위를 차단하는 화합물의 존재 하에 헵신에 결합하지 않는다.

일부 실시양태에서, 헵신에 대한 상기 물질 또는 분자의 결합은 MSP에 의해 유도된 세포 성장 (예컨대, 세포 증식, 생존, 혈관신생, 형태발생, 이동)을 억제한다. 일부 실시양태에서, 헵신에 대한 상기 물질 또는 분자의 결합은 Ron 수용체 활성화를 억제한다. 일부 실시양태에서, 헵신에 대한 본 발명의 물질 또는 분자의 결합은 헵신에 결합하는 헵신 기질을 억제한다. 일부 실시양태에서, 헵신에 대한 본 발명의 물질 또는 분자의 결합은 헵신에 대한 기질 결합을 억제하지 않는다. 일부 실시양태에서, 헵신에 대한 본 발명의 물질 또는 분자의 결합은 헵신 활성, 예컨대 헵신 효소적 활성을 억제한다. 일부 실시양태에서, 헵신 효소적 활성은 헵신의 폴리펩티드 기질의 절단을 포함한다. 한 실시양태에서, 헵신의 폴리펩티드 기질은 프로-MSP이다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 길항제는 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 스크리닝 또는 확인 방법에 의해 수득된다.

한 측면에서, 본 발명의 길항제 분자는 독소, 예컨대 세포독성제에 연결된다. 이러한 분자는 첨가제/증강제, 예컨대 방사선 및/또는 화학요법제와 함께 제제화되거나 투여될 수 있다.

본 발명은 또한 헵신/MSP/Ron 축의 조절이상과 관련된 질환 상태를 조정하는데 유용한 방법 및 조성물을 제공한다. 따라서, 한 측면에서, 본 발명은 대상체에게 본 발명의 헵신/MSP 조절제 분자 (예를 들어, 프로-MSP의 헵신 절단을 억제하는 본원에 기재된 바와 같은 길항제 분자)를 투여하여 프로-MSP 활성화를 조정하는 것을 포함하는, 대상체에서 프로-MSP 활성화를 조절하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 분자는 MSP 활성을 억제하는 길항제이다. 한 측면에서, 본 발명은 대상체에게 본 발명의 길항제 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 헵신에 의한 프로-MSP 절단의 임의의 길항제)를 투여하여, 프로-MSP 활성화를 억제하는 것을 포함하는, 대상체에서 MSP의 조절이상과 관련된 병적 상태를 치료하는 방법을 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 대상체에게 본 발명의 MSP/Ron 조정제 분자 (예를 들어, 프로-MSP의 헵신 절단을 억제하는 본원에 기재된 바와 같은 길항제 분자)를 투여하여 Ron 활성화를 조정하는 것을 포함하는, 대상체에서 Ron 활성화를 조정하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 분자는 MSP/Ron 활성을 억제하는 MSP/Ron 길항제이다. 한 측면에서, 본 발명은 대상체에게 본 발명의 Ron 길항제 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 헵신에 의한 프로-MSP 절단의 임의의 길항제)를 투여하여 Ron 활성화를 억제하는 것을 포함하는, 대상체에서 Ron의 조절이상과 관련된 병적 상태를 치료하는 방법을 제공한다.

MSP/Ron 신호전달 경로는, 예를 들어 세포 성장 자극 (예를 들어, 세포 증식, 세포 생존, 세포 이동, 세포 형태발생) 및 면역 반응 (예를 들어, 증가된 염증 반응, 대식세포에 의한 증가된 NO 생산)을 비롯하여, 다수의 생물학적 및 생리학적 작용에 관련된다.

따라서, 한 측면에서, 본 발명은 Ron 또는 MSP, 또는 이들 둘 모두를 발현하는 세포를 본 발명의 길항제와 접촉시켜 상기 세포의 성장 (예를 들어, 세포 성장, 증식 또는 생존) (여기서, 세포의 성장은 헵신, Ron 및/또는 MSP에 적어도 부분적으로 의존적임)의 억제를 유발하는 것을 포함하는, 상기 세포의 성장을 억제하는 방법을 제공한다.

한 측면에서, 본 발명은 세포의 이동이 헵신, Ron 및/또는 MSP에 적어도 부분적으로 의존적인 세포를 유효량의 본 발명의 길항제와 접촉시켜 상기 세포의 성장을 억제하는 것을 포함하는, 상기 세포의 이동을 억제하는 방법을 제공한다.

따라서, 한 측면에서, 본 발명은 세포의 생존이 헵신, Ron 및/또는 MSP에 적어도 부분적으로 의존적이며 Ron 또는 MSP, 또는 이들 둘 모두를 발현하는 세포를 본 발명의 길항제와 접촉시켜 상기 세포의 성장의 억제를 유발하는 것을 포함하는, 상기 세포의 아폽토시스를 촉진하는 방법을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 비정상적 면역 반응과 관련된 상태를 갖는 세포, 조직 및/또는 대상체에게 본 발명의 길항제를 투여하여 면역 반응을 억제하는 것을 포함하는, 헵신, Ron 및/또는 MSP에 적어도 부분적으로 의존적인 면역 반응 (예를 들어, 염증)을 억제하는 방법을 제공한다.

한 측면에서, 본 발명은 질환, 예컨대 암, 종양, 세포 증식성 장애 및/또는 면역 (예컨대 자가면역) 장애의 치유적 및/또는 예방적 치료를 위한 의약의 제조에서의 본 발명의 길항제의 용도를 제공한다. 길항제는 항체, 항체 단편, 소분자 (예를 들어, 유기 분자), 폴리펩티드 (예를 들어, 올리고펩티드), 핵산 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드, 예컨대 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 간섭 RNA), 압타머 또는 그의 조합을 비롯한 본원에 기재된 임의의 형태의 것일 수 있다.

한 측면에서, 본 발명은 질환, 예컨대 암, 종양, 세포 증식성 장애 및/또는 면역 (예컨대, 자가면역) 장애의 치유적 및/또는 예방적 치료를 위한 의약의 제조에서의 본 발명의 핵산의 용도를 제공한다.

한 측면에서, 본 발명은 질환, 예컨대 암, 종양, 세포 증식성 장애 및/또는 면역 (예컨대 자가면역) 장애의 치유적 및/또는 예방적 치료를 위한 의약의 제조에서의 본 발명의 발현 벡터의 용도를 제공한다.

한 측면에서, 본 발명은 질환, 예컨대 암, 종양, 세포 증식성 장애 및/또는 면역 (예컨대 자가면역) 장애의 치유적 및/또는 예방적 치료를 위한 의약의 제조에서의 본 발명의 숙주 세포의 용도를 제공한다.

한 측면에서, 본 발명은 질환, 예컨대 암, 종양, 세포 증식성 장애, 면역 (예컨대 자가면역) 장애 및/또는 혈관신생-관련 장애 (상처 치유)의 치유적 및/또는 예방적 치료를 위한 의약의 제조에서의 본 발명의 제조품의 용도를 제공한다.

한 측면에서, 본 발명은 질환, 예컨대 암, 종양, 세포 증식성 장애 및/또는 면역 (예컨대 자가면역) 장애의 치유적 및/또는 예방적 치료를 위한 의약의 제조에서의 본 발명의 키트의 용도를 제공한다.

본 발명의 방법은 임의의 적합한 병적 상태, 예를 들어 헵신 및/또는 Ron/MSP 신호전달 경로의 조절이상과 관련된 세포 및/또는 조직에 영향을 미치는데 사용될 수 있다. 예시적 장애는 본원에 기재되어 있으며, 비소세포 폐암, 난소암, 갑상선암, 고환암, 자궁내막암, 두경부암 (예를 들어, 두경부 편평 세포 암종), 뇌암 (예를 들어, 신경모세포종 또는 수막종), 피부암 (예를 들어, 흑색종, 기저 세포 암종 또는 편평 세포 암종), 방광암 (예를 들어, 이행 세포 암종), 유방 암종, 위암, 결장직장암 (CRC), 간세포 암종, 자궁경부암, 폐암, 췌장암, 전립선암 및 신암 및 자궁내막암으로 이루어진 군으로부터 선택된 암을 포함한다.

한 실시양태에서, 본 발명의 방법에서 표적화되는 세포는 암 세포이다. 예를 들어, 암 세포는 유방암 세포, 결장직장암 세포, 폐암 세포 (예를 들어, 비소세포 폐암 세포), 갑상선암 세포, 다발성 골수종 세포, 고환암 세포, 유두상 암종 세포, 결장암 세포, 췌장암 세포, 난소암 세포, 자궁경부암 세포, 중추신경계 암 세포, 골원성 육종 세포, 신장 암종 세포, 간세포 암종 세포, 방광암 세포 (예를 들어, 이행 세포 암종 세포), 위 암종 세포, 두경부 편평세포 암종 세포, 흑색종 세포, 백혈병 세포, 자궁내막암 세포 및 결장 선종 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 방법에서 표적화되는 세포는 과다증식성 및/또는 과형성 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 방법에서 표적화되는 세포는 이형성 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 방법에서 표적화되는 세포는 전이성 세포이다.

본 발명의 방법은 부가의 치료 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서는, 방법이 표적화된 세포 및/또는 조직 (예를 들어, 암 세포)을 방사선 치료 또는 화학요법제에 노출시키는 단계를 추가로 포함한다.

본원에 기재된 바와 같이, Ron 활성화는 그의 조절이상이 다수의 병적 상태로 이어지는 중요한 생물학적 과정이다. 따라서, 본 발명의 방법의 한 실시양태에서, 표적화되는 세포 (예를 들어, 암 세포)는 Ron의 활성화가 동일한 조직 기원의 정상 세포와 비교하여 개선된 것이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 표적화된 세포의 사멸을 유발한다. 예를 들어, 본 발명의 길항제와의 접촉은 Ron 경로를 통한 신호에 대한 세포의 불능화를 초래할 수 있다.

Ron 활성화 (및 이에 따른 신호전달)의 조절이상은, 예를 들어 MSP (Ron의 동족 리간드) 및/또는 Ron 그 자체의 과다발현을 비롯한 수많은 세포 변화로부터 초래될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 동일한 조직 기원의 정상 세포와 비교하여 Ron 또는 MSP, 또는 이들 둘 모두를 보다 풍부하게 발현하는 세포 (예를 들어, 암 세포)를 표적으로 하는 것을 포함한다.

프로-MSP 활성화 (및 이에 따른 Ron의 활성화)의 조절이상은, 예를 들어 헵신, 프로-MSP 및/또는 Ron의 과다발현을 비롯한 수많은 세포 변화로부터 초래될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 상응하는 정상 세포 또는 조직과 비교하여 헵신, 프로-MSP 및/또는 Ron을 보다 풍부하게 발현하는 세포 또는 조직 (예를 들어, 암 세포 또는 조직)을 표적으로 하는 것을 포함한다.

한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 길항제 및 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 담체는 제약상 허용되는 것이다.

한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 길항제를 코딩하는 핵산을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 핵산은 폴리펩티드 (예를 들어, 올리고펩티드)이거나 또는 이를 포함하는 길항제를 코딩하한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 핵산은 항체 또는 그의 단편이거나 또는 이를 포함하는 길항제를 코딩한다.

한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.

한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 벡터는 임의의 종류의 것, 예를 들어 재조합 벡터, 예를 들어 발현 벡터일 수 있다. 임의의 다양한 숙주 세포를 사용할 수 있다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 원핵 세포, 예를 들어 이. 콜라이(E. coli)이다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵세포, 예를 들어 포유동물 세포, 예를 들어 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포이다.

한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 길항제의 제조 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 항체 (또는 그의 단편)를 코딩하는 서열을 포함하는 본 발명의 재조합 벡터를 적합한 숙주 세포에서 발현시키는 것, 및 상기 항체 (또는 그의 단편)를 회수하는 것을 포함하는, 항체 (또는 그의 단편)이거나 또는 이를 포함하는 길항제의 제조 방법을 제공한다. 또 다른 예에서, 본 발명은 폴리펩티드 (예컨대 올리고펩티드)를 코딩하는 본 발명의 재조합 벡터를 적합한 숙주 세포에서 발현시키는 것, 및 상기 폴리펩티드 (예컨대 올리고펩티드)를 회수하는 단계를 포함하는, 폴리펩티드 (예컨대 올리고펩티드)이거나 또는 이를 포함하는 길항제의 제조 방법을 제공한다.

한 측면에서, 본 발명은 용기; 및 용기 내에 함유된, 본 발명의 하나 이상의 길항제를 포함하는 조성물을 포함하는 제조품을 제공한다. 한 실시양태에서, 조성물은 본 발명의 핵산을 포함한다. 한 실시양태에서, 길항제를 포함하는 조성물은 담체를 추가로 포함하며, 이는 일부 실시양태에서 제약상 허용되는 것이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 제조품은 조성물 (예를 들어, 길항제)을 대상체에게 투여하기 위한 설명서를 추가로 포함한다.

한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 길항제를 포함하는 조성물을 포함하는 제1 용기; 및 완충제를 포함하는 제2 용기를 포함하는 키트를 제공한다. 한 실시양태에서, 완충제는 제약상 허용가능한 것이다. 한 실시양태에서, 길항제를 포함하는 조성물은 담체를 추가로 포함하며, 이는 일부 실시양태에서 제약상 허용되는 것이다. 한 실시양태에서, 키트는 조성물 (예를 들어, 길항제)을 대상체에게 투여하기 위한 설명서를 추가로 포함한다.

한 측면에서, 본 발명은 정제된 프로-MSP 및 헵신을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 Ron을 발현하는 세포를 추가로 포함한다.

한 측면에서, 본 발명은 (1) MSP의 헵신 단백질분해 프로세싱을 허용하는 조건 하에 샘플을 헵신과 접촉시키는 것 및 (2) 헵신 활성화된 MSP의 존재를 검출하는 것을 포함하는, 샘플에서 프로-MSP를 검출하는 방법을 제공한다.

한 측면에서, 본 발명은 (1) MSP의 헵신 단백질분해 프로세싱을 허용하는 조건 하에 샘플을 프로-MSP와 접촉시키는 것 및 (2) 헵신 활성화된 MSP의 존재를 검출하는 것을 포함하는, 샘플에서 헵신을 검출하는 방법을 제공한다.

도 1: 헵신에 의한 프로-MSP의 시험관내 활성화. 재조합 헵신은 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시 용량 의존성 방식으로 프로-MSP를 활성화시켰다. 생성물을 환원 조건 하에 SDS-PAGE 상에서 분리하였다. 약 25 kDa 밴드의 N-말단 서열분석 (도시됨)에서 이는 β-쇄인 것으로 나타났으며, 따라서 헵신은 Arg₄₈₃-Val₄₈₄ 결합에서 프로-MSP를 절단하였다. 도 1에 서열 17이 개시되어 있다.
도 2: LnCap-34 세포에서의 세포 표면 발현 헵신에 의한 프로-MSP의 활성화. 헵신을 안정하게 과다발현하는 LnCap-34 세포를 혈청 고갈시키고, ¹²⁵I-프로-MSP 단독으로 또는 다양한 억제제와 조합하여 3시간 동안 처리하였다. 재조합 헵신 (10 nM)을 양성 대조군으로서 이용하였다. 실험 시작 시점과 비교하여 3시간 후에 프로-MSP 프로세싱의 유의한 증가가 관찰되었다. 억제제 KQLR (서열 10), KD1 및 항-헵신 항체 Fab25는 프로-MSP의 활성화를 효과적으로 차단하였다.
도 3: Ron에 대한 헵신-활성화된 MSP의 결합. (a) 표면 플라즈몬 공명 실험을 위해, 항-Fc 특이적 항체에 커플링된 아민인 CM5 칩을 이용하여 바이오센서 상에 Ron-Fc를 포획하였다. Ron에 대한 프로-MSP (1 μM)의 어떠한 검출가능한 결합도 관찰되지 않은 반면, 헵신-활성화된 MSP는 Ron에 대한 고 친화도 결합 (K_D 7 nM)을 나타내었고, 데이터를 1:1 결합 모델로 피팅하였다. (b) Ron에 대한 MSP 결합을 측정하기 위한 ELISA 실험에서, 절반-최대 결합을 일으키는 유효 농도 (EC₅₀)는 0.519 nM인 것으로 결정되었다.
도 4: S6 및 MAP 키나제의 인산화. 헵신 또는 프로-MSP 단독 어느 것도 Ron 신호전달 경로를 활성화함에 있어 효과적이지 않았으나, 프로-MSP의 헵신 처리는 용량 의존성 방식으로 MAP 키나제 및 S6 키나제 둘 모두의 강력한 인산화를 나타내었다.
도 5: 복막 대식세포 형태 변화 검정. 헵신-활성화된 MSP로 자극시에, 복막 대식세포는 돌출 및 연장으로 나타나는 세포 형상의 명백한 변화를 일으켰다. 헵신-활성화된 MSP의 효과는 상업적으로 입수가능한 MSP 뿐만 아니라 HGFA-활성화된 MSP의 효과와 유사하였다.
도 6: 화학주성 검정. 헵신으로의 프로-MSP의 처리는 복막 대식세포의 이동에서 현저한 증가 (p<0.001)를 유발하였고, 이 효과는 상업적 공급원으로부터의 성숙 MSP와 유사하였다. 항-헵신 억제제 (항-헵신 항체 Fab25)로의 전처리는 대식세포의 이동에서 현저한 감소를 나타내었다.
도 7: 산화질소 합성의 억제. 1차 마우스 골수 대식세포는 LPS에 반응하여 산화질소의 강력한 생산을 나타내었다. 헵신-활성화된 MSP는 골수 유래 대식세포에서 NO 생산을 유의하게 감쇄시켰다. 헵신-활성화된 MSP의 효과는 상업적으로 입수가능한 MSP의 효과와 유사하였다. 프로-MSP, 또는 헵신 및 항-헵신 항체 Fab25와 혼합된 프로-MSP로의 처리는 LPS에 반응한 산화질소의 강력한 생산을 억제하지 않았다.
도 8: 천연 인간 헵신의 아미노산 서열의 한 실시양태 (서열 18).
도 9: (a) & (b) 천연 인간 헵신의 아미노산 서열의 또 다른 실시양태 (서열 19).
도 10: 천연 인간 프로-대식세포-자극 단백질 (프로-MSP)의 아미노산 서열의 한 실시양태 (서열 20).

발명의 상세한 설명

본 발명은 MSP/Ron 신호전달 경로의 조정제를 포함하는 방법, 조성물, 키트 및 제조품 (상기 조정제의 사용 방법 포함)을 제공한다.

상기 방법, 조성물, 키트 및 제조품에 대한 상세한 설명을 본원에서 제공한다.

일반적 기술

달리 나타내지 않는 한, 본 발명의 실시는 분자 생물학 (재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기술을 이용할 것이고, 이들은 당업계의 기술 범위 내에 속한다. 상기 기술은 예를 들어 문헌 ["Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook et al., 1989)]; ["Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984)]; ["Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1987)]; ["Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.)]; ["Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, and periodic updates)]; ["PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., ed., 1994)]; ["A Practical Guide to Molecular Cloning" (Perbal Bernard V., 1988)]; ["Phage Display: A Laboratory Manual" (Barbas et al., 2001)]과 같은 문헌에 상세하게 설명되어 있다.

정의

본원에 사용된 용어 "헵신"은 야생형 헵신과 유사한 방식으로 프로-MSP를 절단할 수 있는, 천연 서열 폴리펩티드, 폴리펩티드 변이체, 및 천연 서열 폴리펩티드 및 폴리펩티드 변이체의 단편 (본원에서 추가로 규정됨)을 포함한다. 본원에서 설명된 헵신 폴리펩티드는 다양한 공급원으로부터, 예를 들어 인간 조직 유형으로부터 또는 다른 공급원으로부터 단리되거나, 또는 재조합 또는 합성 방법으로 제조된 것일 수 있다. 용어 "헵신", "헵신 폴리펩티드", "헵신 효소", 및 "헵신 단백질"도 본원에 개시된 헵신 폴리펩티드의 변이체를 포함한다.

"천연 서열 헵신 폴리펩티드"는 자연에서 유도된 상응하는 헵신 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 천연 서열 헵신 폴리펩티드는 도 8의 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 천연 서열 헵신 폴리펩티드는 도 9의 아미노산 서열을 포함한다. 상기 천연 서열 헵신 폴리펩티드는 자연으로부터 단리될 수 있거나 또는 재조합 또는 합성 수단에 의해 생산될 수 있다. 용어 "천연 서열 헵신 폴리펩티드"는 구체적으로 자연 발생의 말단절단된 또는 분비된 형태의 특이적인 헵신 폴리펩티드 (예를 들어, 세포외 도메인 서열), 폴리펩티드의 자연 발생 변이체 형태 (예를 들어, 선택적으로 스플라이싱된 형태) 및 자연 발생 대립유전자 변이체를 포함한다.

"헵신 폴리펩티드 변이체", 또는 그의 변형체는 본원에 개시된 임의의 천연 서열 헵신 폴리펩티드 서열과 적어도 약 80%의 아미노산 서열 동일성을 갖는, 본원에서 규정된 헵신 폴리펩티드, 일반적으로 활성 헵신 폴리펩티드를 의미한다. 상기 헵신 폴리펩티드 변이체는 예를 들어 하나 이상의 아미노산 잔기가 천연 아미노산 서열의 N- 또는 C-말단에서 부가되거나 결실된 헵신 폴리펩티드를 포함한다. 보통, 헵신 폴리펩티드 변이체는 본원에 개시된 천연 서열 헵신 폴리펩티드 서열과 적어도 약 80%의 아미노산 서열 동일성, 대안적으로 적어도 약 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 아미노산 서열 동일성을 가질 것이다. 보통, 헵신 변이체 폴리펩티드는 적어도 약 10개의 아미노산 길이, 대안적으로 적어도 약 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600개의 아미노산 또는 이를 초과하는 길이이다. 임의로, 헵신 변이체 폴리펩티드는 천연 헵신 폴리펩티드 서열에 비해 1개 이하의 보존적 아미노산 치환, 대안적으로 천연 헵신 폴리펩티드 서열에 비해 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이하의 보존적 아미노산 치환을 가질 것이다.

펩티드 또는 폴리펩티드 서열에 대한 "아미노산 서열 동일성 백분율 (％)"은 서열을 정렬시키고 필요한 경우 최대 서열 동일성 백분율을 달성하도록 갭을 도입시킨 후, 특정 펩티드 또는 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로 정의되고, 임의의 보존적 치환은 서열 동일성 부분으로 간주하지 않는다. 아미노산 서열 동일성 백분율을 결정하기 위한 정렬은 당업계 기술 범위 내의 다양한 방법, 예를 들어 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메갈린(Megalign) (DNASTAR) 소프트웨어를 이용하여 달성할 수 있다. 당업자는 비교될 전장 서열에 대한 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여 정렬 측정에 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적을 위해, 아미노산 동일성 % 값은 미국 특허 번호 6,828,146에 기재되어 있는 바와 같은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 얻을 수 있다.

본원에 사용된 용어 "벡터"는 그가 연결된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭하려는 의도이다. 벡터의 한 종류는 추가의 DNA 절편이 그 내부에 라이게이션될 수 있는 환상 이중가닥 DNA 루프를 지칭하는 "플라스미드"이다. 또 다른 유형의 벡터는 파지 벡터이다. 또 다른 유형의 벡터는 추가의 DNA 절편이 바이러스 게놈 내로 라이게이션될 수 있는 바이러스 벡터이다. 특정 벡터는 그것이 도입된 숙주 세포 내에서 자율 복제가 가능하다 (예를 들어, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터 (예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내로 도입시에 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있고, 이에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터는 벡터가 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터가 본원에서 "재조합 발현 벡터" (또는 간단히, "재조합 벡터")로서 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태로 존재한다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 상호교환적으로 사용될 수 있는데, 이는 플라스미드가 가장 흔히 사용되는 형태의 벡터이기 때문이다.

"폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 지칭하고, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형 뉴클레오티드 또는 염기, 및/또는 그의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해, 또는 합성 반응에 의해 중합체 내로 혼입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예를 들어 메틸화 뉴클레오티드 및 그의 유사체를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 구조에 대한 변형이 존재하는 경우, 이러한 변형은 중합체의 어셈블리 이전 또는 이후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열에 비뉴클레오티드 성분이 개재될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 합성 후에, 예컨대 표지와의 접합에 의해 추가로 변형될 수 있다. 다른 유형의 변형은 예를 들어 1종 이상의 천연 발생 뉴클레오티드의 유사체로의 "캡" 치환, 뉴클레오티드간 변형, 예를 들어 하전되지 않은 연결부 (예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카르바메이트 등) 및 하전된 연결부 (예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형, 펜던트 모이어티, 예를 들어 단백질 (예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩티드, 폴리-L-리신 등)을 함유하는 것, 인터칼레이터(intercalator) (예를 들어, 아크리딘, 프소랄렌 등)을 갖는 것, 킬레이터 (예를 들어, 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화 금속 등)을 함유하는 것, 알킬레이터(alkylator)를 함유하는 것, 변형 연결부 (예를 들어, 알파 아노머 핵산 등)를 갖는 것 뿐만 아니라, 폴리뉴클레오티드(들)의 변형되지 않은 형태를 포함한다. 추가로, 당 내에 통상적으로 존재하는 임의의 히드록실기가 예를 들어 포스포네이트기, 포스페이트기로 대체되거나, 표준 보호기로 보호되거나, 추가의 뉴클레오티드에 대한 추가의 연결부가 제조되도록 활성화될 수 있거나, 또는 고체 또는 반고체 지지체에 접합될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH는 인산화되거나 또는 아민 또는 1개 내지 20개 탄소 원자의 유기 캡핑기 모이어티로 치환될 수 있다. 다른 히드록실이 표준 보호기로 유도체화될 수도 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한 일반적으로 당업계에 공지된 리보스 또는 데옥시리보스 당의 유사형, 예를 들어 2'-O-메틸-, 2'-O-알릴, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보스, 카르보시클릭 당 유사체, α-아노머 당, 에피머 당, 예컨대 아라비노스, 크실로스 또는 릭소스, 피라노스 당, 푸라노스 당, 세도헵툴로스, 비-시클릭 유사체 및 무염기성 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 메틸 리보시드를 함유할 수 있다. 하나 이상의 포스포디에스테르 연결부가 대안적 연결기로 대체될 수 있다. 이들 대안적인 연결기는 포스페이트가 P(O)S ("티오에이트"), P(S)S ("디티오에이트"), (O)NR₂ ("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH₂ ("포름아세탈") (여기서, 각각의 R 또는 R'는 독립적으로 H이거나 또는 임의로 에테르 (-O-) 연결부를 함유하는 치환 또는 비치환 알킬 (1-20 C), 아릴, 알케닐, 시클로알킬, 시클로알케닐 또는 아르알딜임)로 대체되는 실시양태를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 폴리뉴클레오티드 내의 모든 연결부가 동일할 필요는 없다. 전술한 설명은 RNA 및 DNA를 비롯하여 본원에서 언급되는 모든 폴리뉴클레오티드에 적용된다.

본원에 사용된 "올리고뉴클레오티드"는 일반적으로, 반드시는 아니지만, 일반적으로 길이가 뉴클레오티드 약 200개 미만으로 짧은, 일반적으로 단일가닥의, 일반적으로 합성 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 용어 "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"는 상호 배타적이지 않다. 폴리뉴클레오티드에 대한 상기 기재는 올리고뉴클레오티드에 동일하고 완전하게 적용가능하다.

구체적으로 또는 문맥상으로 달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대식세포-자극 단백질" 및 "MSP" 또는 "프로-대식세포-자극 단백질" 및 "프로-MSP"는 플라스미노겐을 활성화시킬 수 있는 것이 허용되는 조건 하에 플라스미노겐을 활성화시킬 수 있는 임의의 천연 또는 변이체 (자연 발생 변이체이든 합성 변이체이든) MSP 폴리펩티드; 또는 상기 조건 하에 플라스미노겐을 활성화시킬 수 있는, 헵신에 의해 활성화된 MSP로 활성화될 수 있는 MSP 폴리펩티드를 지칭한다. 용어 "야생형 MSP"는 일반적으로, 예를 들어 도 10에 기재된 바와 같은, 그리고 스위스프롯(SwissProt) 등록 번호 P26927에 기입된 (상기 등록 번호에 기입된 조회물은 본원에 참조로 포함됨), 자연 발생 MSP 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다.

용어 "항체" 및 "이뮤노글로불린"은 가장 넓은 의미에서 상호교환적으로 사용되고, 모노클로날 항체 (예를 들어, 전장 또는 무손상 모노클로날 항체), 폴리클로날 항체, 다가 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이중특이적 항체)를 포함하고, 또한 특정 항체 단편 (본원에서 보다 상세히 기재되어 있음)을 포함할 수 있다. 항체는 인간, 인간화 및/또는 친화도 성숙 항체일 수 있다.

"항체 단편"은 무손상 항체의 일부 만을 포함하며, 여기서 상기 일부는 바람직하게는, 무손상 항체 내에 존재하는 경우에 그 일부와 정상적으로 연관된 기능 중 적어도 하나, 바람직하게는 대부분 또는 전부를 보유한다. 한 실시양태에서, 항체 단편은 무손상 항체의 항원 결합 부위를 포함하여 항원에 결합하는 능력을 보유한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 단편, 예를 들어 Fc 영역을 포함하는 항체 단편은, 무손상 항체 내에 존재하는 경우에 Fc 영역과 통상적으로 연관된 생물학적 기능들, 예를 들어 FcRn 결합, 항체 반감기 조정, ADCC 기능 및 보체 결합 중 적어도 하나의 기능을 보유하고 있다. 한 실시양태에서, 항체 단편은 무손상 항체와 실질적으로 유사한 생체내 반감기를 갖는 1가 항체이다. 예를 들어, 이같은 항체 단편은 단편에 생체내 안정성을 부여할 수 있는 Fc 서열에 연결된 항원 결합 아암(arm)을 포함할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 얻은 항체를 나타내는데, 즉 집단을 구성하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이고, 단일 항원에 대하여 지정된다. 추가로, 전형적으로 상이한 결정자 (에피토프)에 대해 지정된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 달리, 각각의 모노클로날 항체는 항원상의 단결정자에 대해 지정된다.

구체적으로, 본원에서의 모노클로날 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 클래스 또는 하위클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이고, 쇄(들)의 나머지 부분은 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 클래스 또는 하위클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체, 뿐만 아니라 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한은 이러한 항체의 단편을 포함한다 (미국 특허 번호 4,816,567; 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)]).

비인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 비인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역의 잔기가 목적하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류와 같은 비인간 종 (공여자 항체)의 초가변 영역의 잔기로 대체된 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체)이다. 일부 경우에, 인간 이뮤노글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 상응하는 비인간 잔기에 의해 대체된다. 추가로, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서는 발견되지 않는 잔기를 포함할 수도 있다. 이러한 변형은 항체 성능이 추가로 개선되게 한다. 일반적으로, 인간화 항체는 하나 이상, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비인간 이뮤노글로불린의 초가변 루프에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 이뮤노글로불린 서열의 FR이다. 임의로, 인간화 항체는 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로는 인간 이뮤노글로불린의 불변 영역의 적어도 일부를 또한 포함할 것이다. 보다 상세한 내용은 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)]; 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다. 또한 하기 종설 논문 및 그에 인용된 참고문헌을 참조한다: 문헌 [Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998)]; [Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995)]; [Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)].

"인간 항체"는 인간에 의해 생성된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유하고/거나 본원에 개시된 바와 같은 인간 항체 제조 기술 중 임의의 것을 이용하여 생산된 것이다. 인간 항체의 이러한 정의에서 비-인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화 항체는 명확하게 제외된다.

"친화도 성숙" 항체는 변경(들)을 보유하지 않는 모 항체에 비해 항원에 대한 항체의 친화도를 개선시키는, 하나 이상의 CDR에 하나 이상의 변경을 갖는 항체이다. 바람직한 친화도 성숙 항체는 표적 항원에 대해 나노몰 또는 심지어는 피코몰의 친화도를 가질 것이다. 친화도 성숙 항체는 당업계에 공지된 절차에 의해 제조된다. 문헌 [Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992)]에서는 VH 및 VL 도메인 셔플링(shuffling)에 의한 친화도 성숙을 설명하고 있다. CDR 및/또는 프레임워크 잔기의 무작위 돌연변이유발이 문헌 [Barbas et al., Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813 (1994)]; [Schier et al., Gene 169:147-155 (1995)]; [Yelton et al., J. Immunol. 155:1994-2004 (1995)]; [Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995)]; 및 [Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)]에 기재되어 있다.

"차단" 항체 또는 "길항제" 항체는 이것이 결합하는 항원의 생물학적 활성을 억제 또는 감소시키는 것이다. 바람직한 차단 항체 또는 길항제 항체는 항원의 생물학적 활성을 실질적으로 또는 완전히 억제한다.

본원에 사용된 "작용제 항체"는 관심 대상 폴리펩티드의 적어도 하나의 기능적 활성을 모방하는 항체이다.

"장애"는 본 발명의 조성물 또는 방법을 이용한 치료가 유익할 임의의 상태이다. 여기에는 만성 및 급성 장애 또는 질환 (포유동물이 당해 장애에 걸리기 쉬운 병적 상태 포함)이 포함된다. 본원에서 치료하고자 하는 장애의 비-제한적 예에는 악성 및 양성 종양; 비-백혈병 및 림프성 악성종양; 뉴런, 신경교, 성상세포, 시상하부 및 기타 선상, 대식세포, 상피, 기질 및 포배강 장애; 및 기타 혈관신생 관련 장애가 포함된다.

용어 "세포 증식성 장애" 및 "증식성 장애"는 어느 정도의 비정상적인 세포 증식과 관련된 장애를 지칭한다. 한 실시양태에서, 세포 증식성 장애는 암이다.

본원에서 사용된 "종양"은 모든 신생물성 세포 성장 및 증식 (악성 또는 양성 여부와 상관 없음), 및 모든 전암성 및 암성 세포 및 조직을 지칭한다. 본원에서 지칭되는 바와 같이, 용어 "암", "암성", "세포 증식성 장애", "증식성 장애" 및 "종양"은 상호 배타적인 것이 아니다.

용어 "암" 및 "암성"은 통상적으로 탈조절된 세포 성장/증식 및/또는 침습을 특징으로 하는 포유동물의 생리학적 상태를 지칭하거나 또는 설명한다. 암의 예는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 암의 보다 구체적인 예로는 편평세포암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종, 폐의 편평세포 암종, 복막암, 간세포성 암, 위장암, 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포양, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종 및 여러 유형의 두경부암이 포함된다.

본원에서 사용된 "치료"는 치료될 개체 또는 세포의 자연적인 과정을 변경하려는 시도에서의 임상적 개입을 지칭하고, 예방을 위해 또는 임상 병리상태의 과정 도중에 수행될 수 있다. 바람직한 치료 효과는 질환의 발생 또는 재발 방지, 증상의 호전, 질환의 임의의 직접 또는 간접적인 병리적 결과의 축소, 전이의 예방, 질환 질행 속도의 감소, 질환 상태의 호전 또는 완화, 및 차도 또는 개선된 예후를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및/또는 방법은 질환 또는 장애의 발생을 지연시키기 위해 사용된다.

"유효량"은 목적하는 치료 또는 예방 결과 달성에 필요한 투여량에서 이러한 기간 동안 유효한 양을 지칭한다.

본 발명의 분자 (예를 들어, 길항제)의 "치료 유효량"은 개체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 개체에게서 목적하는 반응을 도출하는 분자 (예를 들어, 길항제)의 능력과 같은 요인들에 따라 달라질 수 있다. 치료 유효량은 또한 치료상 유익한 효과가 분자의 임의의 독성 또는 유해 효과를 능가하도록 하는 양이다. "예방 유효량"은 목적하는 예방 결과 달성에 필요한 투여량 및 이러한 기간 동안 유효한 양을 지칭한다. 반드시는 아니지만 대개, 예방 용량은 질환의 보다 초기 단계 전에, 또는 보다 초기 단계에서 대상체에서 사용되기 때문에, 예방 유효량은 치료 유효량보다 적을 것이다.

본원에 사용된 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제 또는 방지하고/거나 세포의 파괴를 야기하는 물질을 지칭한다. 상기 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어, At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³² 및 Lu의 방사성 동위원소), 화학요법제, 예를 들어 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 빈카 알칼로이드 (빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 기타 인터칼레이팅제, 효소 및 그의 단편, 예컨대 뉴클레오티드분해 효소, 항생제, 및 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소 (이의 단편 및/또는 변이체 포함) 또는 소분자 독소와 같은 독소, 및 하기에 개시되는 다양한 항종양 또는 항암 작용제를 포함하도록 의도된다. 다른 세포독성제는 하기 기재되어 있다. 종양사멸제는 종양 세포의 파괴를 야기한다.

"화학요법제"는 암 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 예는 알킬화제, 예를 들어, 티오테파 및 시톡산(CYTOXAN)® 시클로스포스파미드; 알킬 술포네이트, 예를 들어, 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예를 들어, 벤조도파, 카르보쿠온, 메트우레도파 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸아멜라민 (알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸올로멜라민 포함); 아세토게닌 (특히, 불라타신 및 불라타시논); 델타-9-테트라히드로칸나비놀 (드로나비놀, 마리놀(MARINOL)®); 베타-라파콘; 라파콜; 콜히친; 베툴린산; 캄포테신 (합성 유사체 토포테칸 (하이캄틴(HYCAMTIN)®), CPT-11 (이로노테칸, 캄프토사르(CAMPTOSAR)®), 아세틸캄토테신, 스코폴렉틴 및 9-아미노캄토테신 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (그의 아도제레신, 카르제레신 및 비제레신 합성 유사체 포함); 포도필로톡신; 포도필린산; 테니포시드; 크립토파이신 (특히, 크립토파이신 1 및 크립토파이신 8); 돌라스타틴; 두오카르마이신 (합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 에류테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰기스타틴; 질소 머스타드, 예를 들어, 클로람부실, 클로나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예를 들어, 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라니무스틴; 항생제, 예를 들어, 에네디인 항생제 (예를 들어, 칼리케아미신, 특히, 칼리케아미신 감마1I 및 칼리케아미신 오메가I1 (예를 들어, 문헌 [Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)] 참조); 다이네미신 (다이네미신 A 포함); 에스페라미신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 색단백질 에네디인 항생제 발색단, 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신 (아드리아마이신(ADRIAMYCIN)®, 모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신, 데옥시독소루비신 HCl 리포솜 주사 (독실(DOXYL)®) 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예를 들어, 미토마이신 C, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포르피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신, 항대사제, 예를 들어, 메토트렉세이트, 겜시타빈 (겜자르(GEMZAR)®), 테가푸르 (유프토랄(UFTORAL)®), 세파시타빈 (젤로다(XELODA)®), 에포틸론, 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 폴산 유사체, 예를 들어, 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예를 들어, 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예를 들어, 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플로스우리딘; 안드로겐, 예를 들어, 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항부신제, 예를 들어, 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 폴산 보충제, 예를 들어, 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트렉세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘립티늄 아세테이트; 질산갈륨; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드, 예를 들어, 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미토크산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로소크산트론; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK® 폴리사카라이드 복합체 (JHS 내추럴 프로덕츠(JHS Natural Products), 오레곤주 유진); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히, T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안귀딘); 우레탄; 빈데신 (엘디신(ELDISINE)®, 필데신(FILDESIN)®); 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 티오테파; 탁소이드, 예를 들어, 파클리탁셀 (탁솔(TAXOL)®), 파클리탁셀의 알부민-처리된 나노입자 제제 (아브락산(ABRAXANE)™), 및 독세탁셀 (탁소테레(TAXOTERE)®); 클로람부실; 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예를 들어, 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴 (벨반(VELBAN)®); 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미토크산트론; 빈크리스틴 (온코빈(ONCOVIN)®); 옥살리플라틴; 류코보빈; 비노렐빈 (나벨빈(NAVELBINE)®); 노반트론; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드, 예를 들어, 레티노산; 상기 임의의 물질의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체; 뿐만 아니라 2개 이상의 상기 물질의 조합물, 예를 들어, CHOP (시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴, 및 플레드니솔론의 조합 요법의 약어) 및 FOLFOX (5-FU 및 류코보빈과 조합한 옥살리플라틴 (엘록사틴(ELOXATIN)™)을 사용한 치료 요법의 약어)를 포함한다.

또한, 상기 정의에는 암의 성장을 촉진할 수 있는 호르몬의 효과를 조절하거나 감소시키거나 차단하거나 억제하는 작용을 하고, 종종 전신 또는 신체-전반 치료의 형태인 항-호르몬제도 포함된다. 이들은 그 자체가 호르몬일 수 있다. 예로는 항-에스트로겐 및 선택적 에스트로겐 수용체 조정자 (SERM), 예를 들어 타목시펜 (놀바덱스(NOLVADEX)® 타목시펜 포함), 랄록시펜 (에비스타(EVISTA)®), 드롤록시펜, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤 및 토레미펜 (파레스톤(FARESTON)®); 항-프로게스테론; 에스트로겐 수용체 하향-조절제 (ERD); 에스트로겐 수용체 길항제 예컨대 풀베스트란트 (파슬로덱스(FASLODEX)®); 난소를 저해하거나 정지시키는 기능을 하는 작용제, 예를 들어, 황체형성 호르몬-방출 호르몬 (LHRH) 효능제, 예컨대 류프롤리드 아세테이트 (루프론(LUPRON)® 및 엘리가드(ELIGARD)®), 고세렐린 아세테이트, 부세렐린 아세테이트 및 트리프테렐린; 항-안드로겐제 예컨대 플루타미드, 닐루타미드 및 비칼루타미드; 및 부신에서의 에스트로겐 생산을 조절하는 효소 아로마타제를 억제하는 아로마타제 억제제, 예를 들어, 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, 메게스트롤 아세테이트 (메가세(MEGASE)®), 엑세메스탄 (아로마신(AROMASIN)®), 포르메스타니에, 파드로졸, 보로졸 (리비졸(RIVISOR)®), 레트로졸 (페마라(FEMARA)®), 및 아나스트로졸 (아리미덱스(ARIMIDEX)®)이 포함된다. 또한, 상기 화학요법제의 이러한 정의는 비스포스포네이트, 예컨대 클로드로네이트 (예를 들어, 보네포스(BONEFOS)® 또는 오스탁(OSTAC)®), 에티드로네이트 (디드로칼(DIDROCAL)®), NE-58095, 졸레드론산/졸레드로네이트 (조메타(ZOMETA)®), 알렌드로네이트 (포사맥스(FOSAMAX)®), 파미드로네이트 (아레디아(AREDIA)®), 틸루드로네이트 (스켈리드(SKELID)®) 또는 리세드로네이트 (악토넬(ACTONEL)®), 뿐만 아니라 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 이상 세포 증식과 관련이 있는 신호전달 경로의 유전자의 발현을 억제하는 것, 예를 들어 PKC-알파, Raf, H-Ras 및 표피 성장 인자 수용체 (EGF-R); 백신, 예컨대 테라토프(THERATOPE)® 백신 및 유전자 요법 백신, 예를 들어 알로벡틴(ALLOVECTIN)® 백신, 류벡틴(LEUVECTIN)® 백신 및 박시드(VAXID)® 백신; 토포이소머라제 1 억제제 (예를 들어, 루르토테칸(LURTOTECAN)®); rmRH (예를 들어, 아바렐릭스(ABARELIX)®); 라파티닙 디토실레이트 (GW572016으로도 공지된 ErbB-2 및 EGFR 이중 티로신 키나제 소분자 억제제); COX-2 억제제, 예컨대 셀레콕시브 (셀레브렉스(CELEBREX)®; 4-(5-(4-메틸페닐)-3-(트리플루오로메틸)-1H-피라졸-1-일) 벤젠술폰아미드; 및 임의의 상기 물질의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함한다.

본원에 사용된 "성장 억제제"는 시험관내 또는 생체내에서 MSP 활성화에 의존적인 세포의 성장을 억제하는 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 따라서, 성장 억제제는 S기에서 MSP-의존성 세포의 백분율을 유의하게 감소시키는 것일 수 있다. 성장 억제제의 예는 세포 주기 진행을 (S기 이외의 다른 단계에) 차단하는 작용제, 예컨대 G1 정지 및 M기 정지를 유도하는 작용제를 포함한다. 통상적인 M기 차단제는 빈카 (빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁산 및 토포이소머라제 II 억제제, 예컨대 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포시드 및 블레오마이신을 포함한다. G1을 정지시키는 작용제, 예를 들어 DNA 알킬화제, 예컨대 타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로레타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실 및 ara-C는 S기 정지로까지 이어진다. 추가의 정보는 문헌 [The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, entitled "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" by Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995)] (특히, p. 13)에서 찾아볼 수 있다. 탁산 (파클리탁셀 및 도세탁셀)은 둘 모두 주목 나무에서 유래된 항암 약물이다. 유럽형 주목 나무에서 유래된 도세탁셀 (탁소테레®, 론-프랑 로러)은 파클리탁셀 (탁솔®, 브리스톨-마이어스 스퀴브)의 반합성 유사체이다. 파클리탁셀 및 도세탁셀은 튜불린 이량체로부터의 미세소관 어셈블리를 촉진하고, 탈중합을 방지함으로써 미세소관을 안정화시켜서 세포에서의 유사분열 억제를 야기한다.

"독소루비신"은 안트라시클린 항생제이다. 독소루비신의 완전한 화학명은 (8S-시스)-10-[(3-아미노-2,3,6-트리데옥시-α-L-릭소-헥사피라노실)옥시]-7,8,9,10-테트라히드로-6,8,11-트리히드록시-8-(히드록시아세틸)-1-메톡시-5,12-나프타센디온이다.

본 발명의 조성물 및 방법

A. 항체

한 실시양태에서, 본 발명은 치료제 및/또는 진단제로서 본원에서 유용할 수 있는 길항제 항체를 제공한다. 예시적인 항체는 폴리클로날, 모노클로날, 인간화, 이중특이적 및 이종접합체 항체를 포함한다.

1. 폴리클로날 항체

폴리클로날 항체는 관련 항원 및 아주반트의 다중 피하 (sc) 또는 복강내 (ip) 주사에 의해 동물에서 바람직하게 생성된다. 면역화될 종에서 면역원성인 단백질에 관련 항원 (특히, 합성 펩티드가 사용되는 경우)을 접합시키는 것이 유용할 수 있다. 예를 들어, 이관능성 작용제 또는 유도체화제, 예를 들어 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통한 접합), N-히드록시숙신이미드 (리신 잔기를 통함), 글루타르알데히드, 숙신산 무수물, SOCl₂ 또는 R¹N=C=NR (여기서, R 및 R¹은 상이한 알킬기임)을 사용하여, 항원을 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH), 혈청 알부민, 소 티로글로불린 또는 대두 트립신 억제제에 접합시킬 수 있다.

예를 들어 단백질 또는 접합체 100 ㎍ 또는 5 ㎍ (각각, 토끼 또는 마우스의 경우)을 3 부피의 프로인트 완전 아주반트와 합하고, 상기 용액을 여러 부위에 피내 주사함으로써, 동물을 항원, 면역원성 접합체 또는 유도체에 대해 면역화한다. 1개월 후, 프로인트 완전 아주반트에 포함된 펩티드 또는 접합체의 최초 양의 1/5 내지 1/10을 여러 부위에 피하 주사함으로써 상기 동물을 부스팅한다. 7일 내지 14일 후에는 상기 동물에서 채혈하여 혈청의 항체 역가를 검정한다. 역가가 정점지속에 도달할 때까지 동물을 부스팅한다. 접합체는 또한 재조합 세포 배양물에서 단백질 융합체로서 제조될 수도 있다. 또한, 백반과 같은 응집제를 적합하게 사용하여 면역 반응을 증진시킨다.

2. 모노클로날 항체

모노클로날 항체를 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 최초로 기재된 하이브리도마 방법을 사용하여 제조할 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (미국 특허 번호 4,816,567)에 의해 제조할 수 있다.

하이브리도마 방법에서는, 마우스 또는 기타 적절한 숙주 동물, 예컨대 햄스터를 상기한 바와 같이 면역화시켜서, 면역화에 사용된 단백질에 특이적으로 결합할 항체를 생성하거나 생성할 수 있는 림프구를 유발한다. 대안적으로, 림프구를 시험관내에서 면역화시킬 수 있다. 면역화 후, 림프구를 단리하고, 이후에 적합한 융합제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 골수종 세포주와 융합시켜서 하이브리도마 세포를 형성시킨다 (문헌 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)]).

이로써 제조된 하이브리도마 세포를 융합되지 않은 모 골수종 세포 (또한, 융합 파트너라 지칭되기도 함)의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유하는 것이 바람직한 적합한 배양 배지에 시딩하여 성장시킨다. 예를 들어, 모 골수종 세포에 효소 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT)가 없는 경우, 하이브리도마를 위한 선택적인 배양 배지는 전형적으로 HGPRT-결핍 세포의 성장을 저해하는 물질인 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함할 것이다 (HAT 배지).

바람직한 융합 파트너 골수종 세포는 효율적으로 융합되고, 선택된 항체-생성 세포에 의한 항체의 안정적인 고수준 생성을 지지하는 세포이며, 융합되지 않은 모 세포에 대해 선택하는 선택 배지에 감수성이 있다. 바람직한 골수종 세포주는 뮤린 골수종 세포주, 예를 들어 솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터(Salk Institute Cell Distribution Center, 미국 캘리포니아주 샌디에고)로부터 입수가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양, 및 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection, 미국 버지니아주 매나서스)으로부터 입수가능한 SP-2 및 유도체, 예를 들어 X63-Ag8-653 세포로부터 유리된 것이다. 인간 골수종 및 마우스-인간 헤테로골수종 세포주 역시 인간 모노클로날 항체 생성과 관련하여 기재된 바 있다 (문헌 [Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)]; 및 [Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)]).

하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지를 항원에 대해 지시된 모노클로날 항체의 생산에 대해 검정한다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 모노클로날 항체의 결합 특이성을 면역침전에 의해 또는 시험관내 결합 검정, 예를 들어 방사성면역검정 (RIA) 또는 효소 연결된 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 결정한다.

모노클로날 항체의 결합 친화도는 예를 들어 문헌 [Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)]에 기재된 스캐차드(Scatchard) 분석으로 결정할 수 있다.

원하는 특이성, 친화도 및/또는 활성의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포가 일단 확인된 후에는, 상기 클론을 한계 희석 절차로 서브클로닝하고 표준 방법으로 성장시킬 수 있다 (문헌 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)]). 이러한 목적에 적합한 배양 배지는, 예를 들어 D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 예를 들어 하이브리도마 세포를 마우스에게 i.p. 주사함으로써 상기 하이브리도마 세포를 동물에서 복수 종양으로서 생체내 성장시킬 수 있다.

서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는 통상적인 항체 정제 절차, 예를 들어 친화도 크로마토그래피 (예를 들어, 단백질 A 또는 단백질 G-세파로스(Sepharose)의 사용) 또는 이온-교환 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 등에 의해 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 적합하게 분리된다.

모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 절차 (예를 들어, 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브 사용)를 이용하여 쉽게 단리 및 서열분석된다. 하이브리도마 세포는 이같은 DNA의 바람직한 공급원으로 기능한다. 일단 단리되면, DNA를 발현 백터 내로 넣을 수 있고, 이후에 이를 달리 항체 단백질을 생산하지 않는 숙주 세포, 예컨대 이. 콜라이 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포 내로 형질감염시켜, 재조합 숙주 세포에서의 모노클로날 항체의 합성을 달성한다. 항체를 코딩하는 DNA의 박테리아에서의 재조합 발현에 대한 검토 문헌으로는 문헌 [Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993)] 및 [Plueckthun, Immunol. Revs. 130:151-188 (1992)]이 포함된다.

추가의 실시양태에서, 모노클로날 항체 또는 항체 단편을 문헌 [McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990)]에 기재된 기술을 이용하여 생성된 항체 파지 라이브러리로부터 단리할 수 있다. 문헌 [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)] 및 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)]에는 파지 라이브러리를 사용하여 뮤린 및 인간 항체를 각각 단리시키는 방법이 기재되어 있다. 후속 공개 문헌에는 매우 큰 파지 라이브러리를 구축하기 위한 전략으로서 조합 감염 및 생체내 재조합 (문헌 [Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res. 21:2265-2266 (1993)]) 뿐만 아니라 연쇄 셔플링 (문헌 [Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)])에 의해 고 친화도 (nM 범위) 인간 항체를 생성시키는 것이 기재되어 있다. 따라서, 이러한 기술은 모노클로날 항체 단리를 위한 전통적인 모노클로날 항체 하이브리도마 기술의 실행가능한 대안이다.

항체를 코딩하는 DNA는 예를 들어 상동성 뮤린 서열을 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인 (C_H 및 C_L) 서열로 치환시키거나 (미국 특허 번호 4,816,567 및 문헌 [Morrison, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)]), 또는 이뮤노글로불린 코딩 서열에 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드 (이종 폴리펩티드)에 대한 코딩 서열의 전부 또는 일부를 융합시켜서 변형시킴으로써 키메라 또는 융합 항체 폴리펩티드를 생성할 수 있다. 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드 서열은 항체의 불변 도메인을 대체할 수 있거나, 또는 이것이 항체의 한 항원 결합 부위의 가변 도메인을 대체하여 항원에 대한 특이성을 갖는 하나의 항원 결합 부위 및 상이한 항원에 대한 특이성을 갖는 또 다른 항원 결합 부위를 포함하는 키메라 2가 항체를 생성시킨다.

3. 인간 및 인간화 항체

본 발명의 항체는 인간화 항체 또는 인간 항체를 추가로 포함할 수 있다. 비-인간 (예를 들어 뮤린) 항체의 인간화 형태는 비-인간 이뮤노글로불린에서 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 이뮤노글로불린, 이뮤노글로불린 쇄 또는 그의 단편 (예를 들어 Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ 또는 항체의 다른 항원-결합 하위서열)이다. 인간화 항체는 수용자의 상보성 결정 영역 (CDR)의 잔기가 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 비-인간 종 (공여자 항체), 예를 들어 마우스, 래트 또는 토끼의 CDR의 잔기로 대체된 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체)을 포함한다. 일부 예에서, 인간 이뮤노글로불린의 Fv 프레임워크 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 도입된 CDR 또는 프레임워크 서열 어느 것에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수도 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 1개 이상, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-인간 이뮤노글로불린의 것에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 이뮤노글로불린 컨센서스 서열의 것이다. 인간화 항체는 또한 적어도 일부의 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc), 전형적으로 인간 이뮤노글로불린의 일부의 이뮤노글로불린 불변 영역을 포함하는 것이 최적일 것이다 (문헌 [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature. 332:323-329 (1988)]; 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]).

비-인간 항체를 인간화하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 비-인간 공급원으로부터 도입된 1개 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비인간 아미노산 잔기는 종종 "유입" 잔기라 지칭되고, 전형적으로는 "유입" 가변 도메인으로부터의 것이다. 인간화는 필수적으로, 인간 항체의 상응하는 서열을 설치류 CDR 또는 CDR 서열로 치환함으로써, 윈터(Winter) 및 동료들의 방법 (문헌 [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988)]; [Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)])에 따라서 수행할 수 있다. 따라서, 이같은 "인간화" 항체는 무손상 인간 가변 도메인보다 실질적으로 더 적은 서열이 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열로 치환된 키메라 항체 (미국 특허 번호 4,816,567)이다. 실제로, 인간화 항체는 전형적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사 부위로부터의 잔기로 치환된 인간 항체이다.

인간화 항체의 제조에 사용되는 인간 가변 도메인 경쇄 및 중쇄 둘다의 선택은 항체가 인간 치료용으로 의도된 경우에 항원성 및 HAMA 반응 (인간 항-마우스 항체)을 감소시키는데 매우 중요하다. 소위 "최적-맞춤(best-fit)" 방법에 따라, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열을 공지된 인간 가변 도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝한다. 설치류의 서열에 가장 근접한 인간 V 도메인 서열을 확인하고, 그 내에 있는 인간 프레임워크 영역 (FR)을 인간화 항체에 대해 허용한다 (문헌 [Sims et al., J. Immunol. 151:2296 (1993)]; [Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)]). 또 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위군의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 특정 프레임워크 영역을 이용한다. 동일한 프레임워크를 여러 상이한 인간화 항체에 사용할 수 있다 (문헌 [Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)]; [Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993)]).

추가로, 항체가 항원에 대해 높은 친화도를 보유하고 기타 유리한 생물학적 특성을 보유하도록 인간화하는 것이 중요하다. 이를 달성하기 위해서, 바람직한 방법에 따라, 인간화 항체는 모 서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 이용하는 모 서열 및 다양한 개념적 인간화 생성물의 분석 방법에 의해 제조된다. 3차원 이뮤노글로불린 모델은 통상적으로 이용가능하고, 당업자에게 익숙하다. 선택된 후보 이뮤노글로불린 서열의 가능한 3차원 입체형태 구조를 예시하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 이러한 디스플레이를 조사하면 후보 이뮤노글로불린 서열의 기능에 있어서 잔기의 가능한 역할의 분석, 즉 후보 이뮤노글로불린이 그의 항원에 결합하는 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석이 가능하다. 이러한 방식으로, FR 잔기는 수용자 서열 및 도입 서열로부터 선택 및 조합되어 목적하는 항체 특징, 예컨대 표적 항원(들)에 대한 친화성 증가를 달성할 수 있다. 일반적으로, 항원 결합에 대한 영향에는 초가변 영역 잔기가 직접적이고 가장 실질적으로 관여한다.

다양한 형태의 인간화 항체가 고려된다. 예를 들어 인간화 항체는 면역접합체를 생성하기 위해 1종 이상의 세포독성제(들)과 임의로 접합된 항체 단편, 예를 들어 Fab일 수 있다. 대안적으로, 인간화 항체는 무손상 항체, 예를 들어 무손상 IgG1 항체일 수 있다.

인간화에 대한 대안책으로서 인간 항체를 생성할 수 있다. 예를 들어, 면역화 시, 내인성 이뮤노글로불린 생산의 부재 하에 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 마우스)을 생산하는 것이 현재 가능하다. 예를 들어, 키메라 및 배선 돌연변이체 마우스에서 항체 중쇄 연결 영역 (JH) 유전자를 동형접합 결실시키면 내인성 항체의 생산이 완전히 억제된다는 것이 기재되어 있다. 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자 어레이를 이러한 배선 돌연변이체 마우스에게 전달하면, 항원 접종시에 인간 항체가 생성될 것이다. 예를 들어, 문헌 [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993)]; [Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993)]; [Bruggemann et al., Year in Immuno. 7:33 (1993)]; 및 미국 특허 번호 5,545,806, 5,569,825, 5,591,669 (모두 GenPharm); 5,545,807; 및 WO 97/17852를 참조한다.

대안적으로, 파지 디스플레이 기술 (문헌 [McCafferty et al., Nature 348:552-553[1990]])을 사용하여, 비면역화된 공여체로부터의 이뮤노글로불린 가변 (V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 인간 항체 및 항체 단편을 시험관 내에서 생산할 수 있다. 이러한 기술에 따라, 항체 V 도메인 유전자를 필라멘트형 박테리오파지, 예컨대 M13 또는 fd의 주요 또는 소수의 코트 단백질 유전자로 인 프레임으로 클로닝하고, 파지 입자의 표면상에 기능적 항체 단편으로서 디스플레이한다. 필라멘트형 입자는 파지 게놈의 단일 가닥 DNA 카피를 함유하기 때문에, 항체의 기능적 특성에 기초한 선택에 의해 이러한 특성을 나타내는 항체를 코딩하는 유전자도 선택된다. 따라서, 파지는 B 세포의 특성의 일부를 모방한다. 파지 디스플레이는 다양한 포맷으로 수행될 수 있고, 예를 들어 문헌 [Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)]에서 검토된다. V-유전자 절편의 여러 공급원이 파지 디스플레이에 사용될 수 있다. 문헌 [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)]에서는 면역화된 마우스의 비장으로부터 유래된 V 유전자의 소형 무작위 조합형 라이브러리로부터 항-옥사졸론 항체의 다양한 어레이가 단리되었다. 본질적으로 문헌 [Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)], 또는 [Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)]에 기재된 기술에 따라 비면역화 인간 공여자로부터 V 유전자 레퍼토리를 구축할 수 있고, 항원 (자가-항원을 포함)의 다양한 어레이에 대한 항체를 단리할 수 있다. 또한, 미국 특허 번호 5,565,332 및 5,573,905를 참조한다.

상기 논의된 바와 같이, 인간 항체는 또한 시험관내 활성화된 B 세포에 의해 생성될 수도 있다 (미국 특허 5,567,610 및 5,229,275 참조).

4. 항체 단편

특정 상황에서는, 온전한 항체가 아닌 항체 단편을 사용하는 것이 유리하다. 단편의 크기가 작을수록 제거가 신속하고, 고형 종양에 대한 접근을 개선시킬 수 있다.

항체 단편 생성을 위한 다양한 기술이 개발되었다. 전통적으로, 이들 단편은 무손상 항체의 단백질분해적 소화를 통해 유래되었다 (예를 들어, 문헌 [Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)]; 및 [Brennan et al., Science, 229:81 (1985)] 참조). 그러나, 현재 이러한 단편들이 재조합 숙주 세포에 의해 직접적으로 생산될 수 있다. Fab, Fv 및 ScFv 항체 단편은 모두가 이. 콜라이에서 발현되어 분비될 수 있고, 이에 의해 다량의 이들 단편을 쉽게 생성할 수 있다. 항체 단편은 상기 논의된 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 대안적으로, Fab'-SH 단편은 이. 콜라이로부터 직접 회수되어 화학적으로 커플링되어 F(ab')₂ 단편을 형성할 수 있다 (문헌 [Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]). 또 다른 접근법에 따라, F(ab')₂ 단편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 단리될 수 있다. 샐비지(salvage) 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하는, 생체내 반감기가 증가된 Fab 및 F(ab')₂ 단편은 미국 특허 번호 5,869,046에 기재되어 있다. 항체 단편의 생산을 위한 또 다른 기술들이 당업자에게 명백할 것이다. 다른 실시양태에서, 선택된 항체는 단일 쇄 Fv 단편 (scFv)이다. WO 93/16185; 미국 특허 번호 5,571,894; 및 미국 특허 번호 5,587,458을 참조한다. Fv 및 sFv는 불변 영역이 결여된 무손상 결합 부위를 갖는 유일한 종이어서, 생체내 사용 동안 비특이적 결합을 감소시키는데 적합하다. sFv의 아미노 또는 카르복시 말단에서 이펙터 단백질의 융합체가 생성되도록 sFv 융합 단백질을 구축할 수 있다. 상기 문헌 [Antibody Engineering, ed. Borrebaeck]을 참조한다. 예를 들어, 항체 단편은 또한 예를 들어 미국 특허 5,641,870에 기재된 바와 같은 "선형 항체"일 수도 있다. 이러한 선형 항체 단편은 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다.

5. 이중특이적 항체

이중특이적 항체는 적어도 2종의 상이한 에피토프에 결합 특이성을 갖는 항체이다. 예시적인 이중특이적 항체는 본원에 기재된 바와 같은 헵신, MSP 및/또는 헵신:MSP 복합체의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 다른 이러한 항체는 이들 개체에 대한 결합 부위를 또 다른 폴리펩티드에 대한 결합 부위와 조합할 수 있다. 대안적으로, 항체 아암은 헵신 및/또는 MSP-발현 및/또는 결합 세포에 대한 세포성 방어 메카니즘에 집중하고 편재시키기 위해, 백혈구 상의 촉발 분자, 예를 들어 T-세포 수용체 분자 (예를 들어 CD3), 또는 IgG에 대한 Fc 수용체 (FcγR), 예를 들어 FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16)에 결합하는 아암과 조합될 수 있다. 이중특이적 항체는 또한 세포독성제를 헵신, MSP 및/또는 헵신:MSP 복합체를 발현하고/거나 이에 결합하는 세포에 국소화시시키는데 사용될 수도 있다. 이들 항체는 폴리펩티드 결합 아암, 및 세포 독성제 (예를 들어, 사포린, 항-인터페론-α, 빈카 알칼로이드, 리신 A 쇄, 메토트렉세이트 또는 방사성 동위원소 합텐)에 결합하는 아암을 보유한다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, F(ab')₂ 이중특이적 항체)으로 제조될 수 있다.

WO 96/16673은 이중특이적 항-ErbB2/항-FcγRIII 항체를 기재하고, 미국 특허 번호 5,837,234는 이중특이적 항-ErbB2/항-FcγRI 항체를 개시한다. 이중특이적 항-ErbB2/Fcα 항체는 WO 98/02463에 제시되어 있다. 미국 특허 번호 5,821,337는 이중특이적 항-ErbB2/항-CD3 항체를 교시한다.

이중특이적 항체의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다. 전통적인 완전한 길이의 이중-특이적 항체의 생성 방법은 2개의 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍을 동시 발현시키는 것에 기초하는데, 상기 2개의 쇄는 상이한 특이성을 갖는다 (문헌 [Millstein et al., Nature 305:537-539 (1983)]). 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 분류로 인해, 이들 하이브리도마 (쿼드로마(quadroma))는 10종의 상이한 항체 분자들의 잠재적인 혼합물을 생성하며, 이 중에서 오직 1종만이 정확한 이중특이적 구조를 갖는다. 통상적으로 친화도 크로마토그래피 단계에 의해 수행되는 상기 정확한 분자의 정제는 다소 성가시고 생성 수율이 낮다. 유사한 절차가 WO 93/08829, 및 문헌 [Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659 (1991)]에 개시되어 있다.

다른 접근법에 따라, 목적하는 결합 특이성 (항체 항원 결합 부위)을 갖는 항체 가변 도메인을 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열에 융합시킨다. 바람직하게는, 융합은 힌지의 적어도 일부, C_H2 및 C_H3 영역을 포함하는 Ig 중쇄 불변 도메인을 이용한다. 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (C_H1)이 융합체의 적어도 하나에 존재하는 것이 바람직하다. 이뮤노글로불린 중쇄 융합체 및 원한다면 이뮤노글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 별개의 발현 벡터에 삽입하고, 적합한 숙주 세포로 동시형질감염시킨다. 이는, 구축에 사용된 3종의 폴리펩티드 쇄의 동일하지 않은 비율이 원하는 이중특이적 항체의 최적 수율을 제공하는 실시양태에서 3종의 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조정하는데 있어서 큰 유연성을 제공한다. 그러나, 동일한 비율의 적어도 2종의 폴리펩티드 쇄의 발현이 고수율을 유도하거나 상기 비율이 원하는 쇄 조합의 수율에 유의한 영향을 갖지 않는 경우에는 단일 발현 벡터 내에 2개 또는 3개 모두의 폴리펩티드 쇄의 코딩 서열을 삽입하는 것이 가능하다.

이러한 접근법의 바람직한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 한쪽 아암에 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 이뮤노글로불린 중쇄, 및 다른 쪽 아암에 하이브리드 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍 (제2 결합 특이성을 제공함)으로 이루어진다. 이중특이적 분자의 절반에만 이뮤노글로불린 경쇄가 존재하는 것이 용이한 분리 방법을 제공하기 때문에, 이러한 비대칭 구조는 원치않는 이뮤노글로불린 쇄 조합물로부터 목적하는 이중특이적 화합물의 분리를 용이하게 하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 접근법은 WO 94/04690에 개시되어 있다. 이중특이적 항체를 생성하는 것에 관한 추가의 상세사항에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986)]을 참조한다.

미국 특허 번호 5,731,168에 기재된 또 다른 접근법에 따라, 한쌍의 항체 분자들 사이의 계면은 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이종이량체의 백분율을 최대화되도록 조작될 수 있다. 바람직한 경계면은 C_H3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 이러한 방법에서, 제1 항체 분자의 경계면으로부터의 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄가 보다 큰 측쇄 (예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체된다. 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 아미노산 측쇄 (예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)로 교체함으로써 큰 측쇄(들)에 대한 동일하거나 유사한 크기의 보상 "공동(cavity)"이 제2 항체 분자의 경계면 상에 생성된다. 이는 동종이량체와 같은 다른 원치않는 최종-생성물에 비해 이종이량체의 수율을 증가시키는 메카니즘을 제공한다.

이중특이적 항체는 가교된 또는 "이종접합" 항체를 포함한다. 예를 들어, 이종접합체 내의 항체들 중 하나는 아비딘에 커플링되고, 다른 것은 비오틴에 커플링될 수 있다. 이러한 항체는 예를 들어 면역계 세포의 원치않는 세포로의 표적화 (미국 특허 번호 4,676,980) 및 HIV 감염의 치료 (WO 91/00360, WO 92/200373, 및 EP 03089)를 위해 제안된 바 있다. 임의의 편리한 가교 방법을 이용하여 이종접합체 항체가 제조될 수 있다. 적합한 가교제가 당업계에 공지되어 있고, 수많은 가교 기술과 함께 미국 특허 번호 4,676,980에 개시되어 있다.

항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성시키는 기술이 또한 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 화학적 연결을 이용하여 이중특이적 항체를 제조할 수 있다. 문헌 [Brennan et al., Science 229:81 (1985)]은 무손상 항체를 단백질 분해로 절단하여 F(ab')₂ 단편을 생성하는 절차를 기재한다. 이들 단편은 인접 디티올을 안정화시키고 분자간 디술피드 형성을 방지하기 위해 디티올 착화제인 아비산나트륨의 존재하에 환원된다. 그 후 생성된 Fab' 단편을 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환시킨다. 그 후 Fab'-TNB 유도체 중 하나를 메르캅토에틸아민으로의 환원에 의해 Fab'-티올로 재전환시키고 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합하여 이중특이적 항체를 형성시킨다. 생산된 이중특이적 항체를 효소의 선택적 고정화를 위한 작용제로서 사용할 수 있다.

최근의 진보는 이중특이적 항체를 형성하도록 화학적으로 커플링될 수 있는, 이. 콜라이로부터의 Fab'-SH 단편의 직접 회수를 용이하게 하였다. 문헌 [Shalaby et al., J. Exp. Med. 175: 217-225 (1992)]은 완전히 인간화된 이중특이적 항체 F(ab')₂ 분자의 생성을 기재한다. 각각의 Fab' 단편을 이. 콜라이로부터 따로 분비시키고, 이중특이적 항체를 형성하도록 시험관내 유도 화학 커플링 반응을 실시하였다. 이로써 형성된 이중특이적 항체는 ErbB2 수용체를 과다발현하는 세포 및 정상 인간 T 세포에 결합할 수 있을 뿐만 아니라, 인간 유방 종양 표적에 대한 인간 세포독성 림프구의 용해 활성을 촉발할 수도 있었다. 재조합 세포 배양물로부터 직접적으로 이중특이적 항체 단편을 제조 및 단리하기 위한 다양한 기술이 또한 기술되었다. 예를 들어, 류신 지퍼를 사용하여 이중특이적 항체가 생산되었다. 문헌 [Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)]. Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드가 2개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 유전자 융합에 의해 연결되었다. 항체 동종이량체가 힌지 영역에서 환원되어 단량체가 형성된 후, 다시 산화되어 항체 이종이량체가 형성되었다. 이러한 방법은 항체 동종이량체의 생산에 또한 이용될 수 있다. 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)]에 기재된 "디아바디" 기술은 이중특이적 항체 단편의 제조를 위한 대안적인 메카니즘을 제공한다. 상기 단편은 동일 쇄의 2개 도메인 사이에서 쌍형성을 허용하기에는 지나치게 짧은 링커에 의해 V_L에 연결된 V_H를 포함한다. 따라서, 한 단편의 V_H 및 V_L 도메인이 또 다른 단편의 상보적인 V_L 및 V_H 도메인과 쌍을 이루게 되어, 2개의 항원 결합 부위가 형성된다. 단일-쇄 Fv (sFv) 이량체를 사용하여 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 또 다른 전략이 또한 보고되었다. 문헌 [Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)]을 참조한다.

2가 초과의 항체가 고려된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체를 제조할 수 있다. 문헌 [Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)].

6. 이종접합체 항체

이종접합체 항체도 또한 본 발명의 범주에 속한다. 이종접합체 항체는 2개의 공유 결합된 항체로 구성된다. 이러한 항체는 예를 들어 면역계 세포의 원치않는 세포로의 표적화 (미국 특허 번호 4,676,980) 및 HIV 감염의 치료 (WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089)를 위해 제안된 바 있다. 항체는 가교제를 사용하는 것을 포함하는, 합성 단백질 화학에 공지된 방법을 이용하여 시험관내 제조될 수 있는 것으로 고려된다. 예를 들어, 디술피드 교환 반응을 이용하거나 티오에테르 결합을 형성하여 면역독소를 구축할 수 있다. 이러한 목적에 적합한 시약의 예는 이미노티올레이트 및 메틸-4-메르캅토부티르이미데이트 및, 예를 들어 미국 특허 번호 4,676,980에 개시된 것을 포함한다.

7. 다가 항체

다가 항체는 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포에 의해 2가 항체보다 신속하게 내재화 (및/또는 이화)될 수 있다. 본 발명의 항체는 3개 이상의 항원 결합 부위를 갖는 (예를 들어, 4가 항체) 다가 항체 (IgM 클래스 이외의 것)일 수 있고, 이는 항체의 폴리펩티드 쇄를 코딩하는 핵산의 재조합 발현에 의해 쉽게 생성될 수 있다. 다가 항체는 이량체화 도메인 및 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 수 있다. 바람직한 이량체화 도메인은 Fc 영역 또는 힌지 영역을 포함한다 (또는 이것으로 이루어진다). 이러한 시나리오에서, 항체는 Fc 영역, 및 Fc 영역의 아미노 말단에 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 것이다. 본원에서의 바람직한 다가 항체는 3개 내지 약 8개, 그러나 바람직하게는 4개의 항원 결합 부위를 포함한다 (또는 이것으로 이루어진다). 다가 항체는 적어도 1개의 폴리펩티드 쇄 (바람직하게는 2개의 폴리펩티드 쇄)를 포함하고, 여기서의 상기 폴리펩티드 쇄(들)은 2개 이상의 가변 도메인을 포함한다. 예를 들어 폴리펩티드 쇄(들)는 VD1-(X1)_n-VD2-(X2)_n-Fc (여기서, VD1은 제1 가변 도메인이고, VD2는 제2 가변 도메인이고, Fc는 Fc 영역의 1개의 폴리펩티드 쇄이고, X1 및 X2는 아미노산 또는 폴리펩티드를 나타내고, n은 0 또는 1임)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 쇄(들)는 VH-CH1-가요성 링커-VH-CH1-Fc 영역 쇄; 또는 VH-CH1-VH-CH1-Fc 영역 쇄를 포함할 수 있다. 본원에서의 다가 항체는 바람직하게는 적어도 2개 (바람직하게는 4개)의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 본원에서의 다가 항체는 예를 들어 약 2개 내지 약 8개의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 본원에서 고려되는 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드는 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 임의로 CL 도메인을 추가로 포함한다.

8. 이펙터 기능 조작

본 발명의 항체를 예를 들어 항체의 항원-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC) 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)이 증진되도록 이펙터 기능과 관련하여 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 이것은 항체의 Fc 영역에 하나 이상의 아미노산 치환을 도입함으로써 달성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 시스테인 잔기(들)을 Fc 영역 내에 도입하여, 이 영역 내에서의 사슬간 디술피드 결합 형성을 허용할 수 있다. 이로써 생성된 동종이량체 항체는 개선된 내재화 능력 및/또는 증가된 보체-매개 세포 사멸 및 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC)을 가질 수 있다. 문헌 [Caron et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992)] 및 [Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992)]을 참조한다. 항종양 활성이 증진된 동종이량체 항체는 문헌 [Wolff et al., Cancer Research 53:2560-2565 (1993)]에 기재된 바와 같이 이종이관능성 가교제를 사용하여 제조할 수 있다. 대안적으로, 이중 Fc 영역을 갖는 항체를 조작할 수 있고, 이에 의해 보체 용해 및 ADCC 능력이 증진될 수 있다. 문헌 [Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989)]을 참조한다. 항체의 혈청 반감기를 증가시키기 위해, 예를 들어 미국 특허 번호 5,739,277에 기재된 바와 같이 샐비지 수용체 결합 에피토프를 항체 (특히, 항체 단편)에 혼입시킬 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "샐비지 수용체 결합 에피토프"는 IgG 분자 (예를 들어, IgG₁, IgG₂, IgG₃ 또는 IgG₄)의 생체내 혈청 반감기 증가를 담당하는 상기 IgG 분자의 Fc 영역의 에피토프를 지칭한다.

9. 면역접합체

본 발명은 또한 세포독성제 예컨대 화학요법제, 약물, 성장 억제제, 독소 (예를 들어, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소, 또는 그의 단편), 또는 방사성 동위원소 (즉, 방사성접합체)에 접합된 항체를 포함하는 면역접합체 또는 항체-약물 접합체 (ADC)에 관한 것이다.

암의 치료에서 세포독성제 또는 세포증식억제제, 즉 종양 세포를 사멸시키거나 억제하는 약물의 국소적 전달을 위해 항체-약물 접합체를 사용하는 것 (문헌 [Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614]; [Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26:151-172]; 미국 특허 4,975,278)은 종양에 대한 약물 모이어티의 표적화 전달 및 그곳에서의 세포내 축적을 가능하게 하고, 여기서 접합되지 않은 이러한 약물 작용제의 전신 투여는 제거하려고 하는 종양 세포뿐만 아니라 정상 세포에 허용할 수 없는 수준의 독성을 초래할 수 있다 (문헌 [Baldwin et al., (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05]; [Thorpe, (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera et al. (ed.s), pp. 475-506]). 이에 의해 최소 독성과 함께 최대 효능이 추구된다. 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체 둘 다가 이러한 전략에 유용하다고 보고되었다 (문헌 [Rowland et al., (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21:183-87]). 상기 방법에 사용되는 약물은 다우노마이신, 독소루비신, 메토트렉세이트, 및 빈데신을 포함한다 (상기 문헌 [Rowland et al., (1986)]). 항체-독소 접합체에 사용되는 독소는 박테리아 독소, 예를 들어 디프테리아 독소, 식물 독소, 예를 들어 리신, 소분자 독소, 예를 들어 겔다나마이신 (문헌 [Mandler et al. (2000) Jour. of the Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581]; [Mandler et al. (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028]; [Mandler et al. (2002) Bioconiugate Chem. 13:786-791]), 메이탄시노이드 (EP 1391213; 문헌 [Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623]), 및 칼리케아미신 (문헌 [Lode et al. (1998) Cancer Res. 58:2928]; [Hinman et al. (1993) Cancer Res. 53:3336-3342])을 포함한다. 독소는 튜불린 결합, DNA 결합, 또는 토포이소머라제 억제를 포함하는 메카니즘에 의해 그의 세포독성 및 세포증식억제 효과를 나타낼 수 있다. 일부 세포독성 약물은 큰 항체 또는 단백질 수용체 리간드에 접합되는 경우에 불활성이 되거나 활성이 감소되는 경향이 있다.

제발린(ZEVALIN)® (이브리투모맙 티욱세탄, 비오겐((Biogen)/이덱(Idec))은 정상 및 악성 B 림프구의 표면 상에서 발견되는 CD20 항원에 대해 지정된 뮤린 IgG1 카파 모노클로날 항체 및 티오우레아 링커-킬레이터에 의해 결합된 ¹¹¹In 또는 ⁹⁰Y 방사성동위원소로 구성된 항체-방사성동위원소 접합체이다 (문헌 [Wiseman et al. (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77]; [Wiseman et al. (2002) Blood 99(12):4336-42]; [Witzig et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63]; [Witzig et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69]). 제발린은 B-세포 비-호지킨 림프종 (NHL)에 대해 활성을 갖지만, 투여는 대부분의 환자에서 중증 및 장기 혈구감소증을 일으킨다. 밀로타르그(MYLOTARG)™ (겜투주맙 오조가미신, 와이어쓰 파마슈티칼스(Wyeth Pharmaceuticals)) (칼리케아미신에 연결된 hu CD33 항체로 이루어진 항체 약물 접합체)는 2000년에 주사에 의한 급성 골수성 백혈병의 치료를 위해 승인되었다 (문헌 [Drugs of the Future (2000) 25(7):686]; 미국 특허 번호 4970198; 5079233; 5585089; 5606040; 5693762; 5739116; 5767285; 5773001). 칸투주맙 메르탄신 (이뮤노겐, 인크.(Immunogen, Inc.)) (디술피드 링커 SPP를 통해 메이탄시노이드 약물 모이어티, DM1에 연결된 huC242 항체로 이루어진 항체 약물 접합체)은 CanAg를 발현하는 암, 예컨대 결장암, 췌장암, 위암 등의 치료를 위해 제II상 임상 시험이 진행되고 있다. MLN-2704 (밀레니엄 팜(Millennium Pharm.), 비지엘 바이올로직스(BZL Biologics), 이뮤노겐 인크.) (메이탄시노이드 약물 모이어티, DM1에 연결된 항-전립선 특이적 막 항원 (PSMA) 모노클로날 항체로 이루어진 항체 약물 접합체)는 전립선 종양의 잠재적인 치료를 위해 개발되고 있다. 아우리스타틴 펩티드, 아우리스타틴 E (AE) 및 모노메틸아우리스타틴 (MMAE) (돌라스타틴의 합성 유사체)은 키메라 모노클로날 항체 cBR96 (암종에서의 루이스 Y에 특이적임) 및 cAC10 (혈액 악성종양에서의 CD30에 특이적임)에 접합되었으며 (문헌 [Doronina et al. (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784]), 치료학적 개발 하에 있다.

이러한 면역접합체의 생성에 유용한 화학치료제는 상기 기재되어 있다. 사용될 수 있는 효소 활성 독소 및 그의 단편은 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비-결합 활성 단편, 외독소 A 쇄 (슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터 유래됨), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피토라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함한다. 방사성접합된 항체의 생성을 위한 다양한 방사선핵종이 이용가능하다. 예는 212Bi, 131I, 131In, 90Y, 및 186Re를 포함한다. 항체 및 세포독성제의 접합체는 다양한 이관능성 단백질-커플링제, 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올) 프로피오네이트 (SPDP), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예컨대 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예컨대 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대 비스(p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 플루오린 화합물 (예컨대 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조한다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌 [Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14 표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 항체에 대한 방사성뉴클레오티드의 접합을 위한 예시적인 킬레이트화제이다. WO94/11026을 참조한다.

항체 및 하나 이상의 소분자 독소, 예를 들어 칼리케아미신, 메이탄시노이드, 트리코테센 및 CC1065, 및 독소 활성을 갖는 이들 독소의 유도체의 접합체가 또한 본원에서 고려된다.

메이탄신 및 메이탄시노이드

한 실시양태에서, 본 발명의 항체 (전장 또는 단편)는 1개 이상의 메이탄시노이드 분자에 접합된다.

메이탄시노이드는 튜불린 중합을 억제함으로써 작용하는 유사분열 억제제이다. 메이탄신은 동아프리카 관목 메이테누스 세라타(Maytenus serrata)로부터 처음 단리되었다 (미국 특허 번호 3,896,111). 이후, 특정 미생물이 또한 메이탄시노이드, 예컨대 메이탄시놀 및 C-3 메이탄시놀 에스테르를 생성하는 것으로 발견되었다 (미국 특허 번호 4,151,042). 합성 메이탄시놀 및 그의 유도체 및 유사체는 예를 들어 미국 특허 번호 4,137,230; 4,248,870; 4,256,746; 4,260,608; 4,265,814; 4,294,757; 4,307,016; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929; 4,317,821; 4,322,348; 4,331,598; 4,361,650; 4,364,866; 4,424,219; 4,450,254; 4,362,663; 및 4,371,533 (이들 개시내용은 명백히 본원에 참조로 포함됨)에 개시되어 있다.

메이탄시노이드-항체 접합체

메이탄신 및 메이탄시노이드의 치료 지수를 개선시키기 위한 시도로서, 이들을 종양 세포 항원과 특이적으로 결합하는 항체에 접합시켰다. 메이탄시노이드를 함유하는 면역접합체 및 그의 치료 용도는 예를 들어 미국 특허 번호 5,208,020, 5,416,064 및 유럽 특허 EP 0 425 235 B1에 개시되어 있으며, 이들의 개시 내용은 명백히 본원에 참조로 포함된다. 문헌 [Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996)]에는 인간 결장직장암에 대해 작용하는 모노클로날 항체 C242에 연결된 DM1로 명명된 메이탄시노이드를 포함하는 면역접합체가 기재되어 있다. 상기 접합체는 배양된 결장암 세포에 대해 고도로 세포독성인 것으로 밝혀졌고, 생체내 종양 성장 검정에서 항종양 활성을 나타냈다. 문헌 [Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992)]에서는 메이탄시노이드가 인간 결장암 세포주 상의 항원에 결합하는 뮤린 항체 A7에 또는 HER-2/neu 종양유전자에 결합하는 다른 뮤린 모노클로날 항체 TA.1에 디술피드 링커를 통해 접합된 면역접합체를 설명하고 있다. TA.1-메이탄시노이드 접합체의 세포독성은 세포 1개 당 3x10⁵개 HER-2 표면 항원을 발현하는 인간 유방암 세포주 SK-BR-3에 대해 시험관내 시험되었다. 약물 접합체는 유리 메이탄시노이드 약물에 유사한 수준의 세포독성을 달성하였고, 이것은 항체 분자당 메이탄시노이드 분자의 수를 증가시켜 증가시킬 수 있다. A7-메이탄시노이드 접합체는 마우스에서 낮은 전신 세포독성을 나타냈다.

항체-메이탄시노이드 접합체 (면역접합체)

항체-메이탄시노이드 접합체는 항체 또는 메이탄시노이드 분자의 생물학적 활성을 유의하게 감소시키지 않으면서 항체를 메이탄시노이드 분자에 화학적으로 연결시킴으로써 제조된다. 항체 분자 당 평균 3-4개로 접합된 메이탄시노이드 분자는 항체의 기능 또는 용해도에 부정적인 영향 없이 표적 세포의 세포독성을 증진시키는 효능을 나타냈지만, 1개의 독소/항체 분자일지라도 네이키드 항체의 사용에 비해 세포독성을 증진시킬 것이라 예상된다. 메이탄시노이드는 당업계에 공지되어 있으며, 공지의 기술에 의해 합성될 수도 있고 천연 공급원으로부터 단리될 수도 있다. 적합한 메이탄시노이드는 예를 들어 미국 특허 번호 5,208,020 및 본원에서 상기 언급된 다른 특허 및 비특허 간행물에 개시되어 있다. 바람직한 메이탄시노이드는 메이탄시놀, 및 메이탄시놀 분자의 방향족 고리 또는 다른 위치에서 변형된 메이탄시놀 유사체, 예컨대 다양한 메이탄시놀 에스테르이다.

항체-메이탄시노이드 접합체를 제조하는 것으로 당업계에 공지된 많은 연결기가 있으며, 예를 들어 미국 특허 번호 5,208,020 또는 EP 특허 0 425 235 B1, 및 문헌 [Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992)]에 개시된 것을 포함한다. 연결기는 상기 언급된 특허에 개시된 바와 같이 디술피드 기, 티오에테르 기, 산 불안정성 기, 광분해성 기, 펩티다제 불안정성 기 또는 에스테라제 불안정성 기를 포함하고, 디술피드 및 티오에테르 기가 바람직하다.

각종 이관능성 단백질 커플링제, 예를 들어 N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트, 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예를 들어, 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예컨대, 디석신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예: 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 [예컨대, 비스 (p-아지도벤조일)헥산디아민], 비스-디아조늄 유도체 [예컨대, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민], 디이소시아네이트 (예: 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 플루오린 화합물 (예컨대, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여, 항체와 마이탄시노이드의 접합체를 만들 수 있다. 특히 바람직한 커플링제로는 디술피드 연결을 제공하는 N-숙신이미딜-4-(2-피리딜티오)펜타노에이트 (SPP) 및 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP) (문헌 [Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737 [1978]])가 포함된다.

링커는 연결 유형에 따라 다양한 위치에서 메이탄시노이드 분자에 부착될 수 있다. 예를 들어, 에스테르 연결부는 통상적인 커플링 기술을 이용하여 히드록실기와의 반응으로 형성될 수 있다. 반응은 히드록실기를 갖는 C-3 위치, 히드록시메틸로 변형된 C-14 위치, 히드록실기로 변형된 C-15 위치, 및 히드록실기를 갖는 C-20 위치에서 일어날 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 상기 연결은 메이탄시놀 또는 메이탄시놀 유사체의 C-3 위치에서 형성된다.

칼리케아미신

관심 대상의 또 다른 면역접합체는 하나 이상의 칼리케아미신 분자와 접합된 항체를 포함한다. 칼리케아미신 패밀리의 항생제는 피코몰 미만의 농도에서 이중 가닥 DNA 절단부를 생성할 수 있다. 칼리케아미신 패밀리의 접합체의 제조에 대해서는, 미국 특허 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, 5,877,296 (모두 아메리칸 시아나미드 캄파니(American Cyanamid Company))을 참조한다. 사용할 수 있는 칼리케아미신의 구조적 유사체는 γ₁ ^I, α₂ ^I, α₃ ^I, N-아세틸-γ₁ ^I, PSAG 및 θ^I ₁을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다 (문헌 [Hinman et al., Cancer Research 53:3336-3342 (1993)], [Lode et al., Cancer Research 58:2925-2928 (1998)] 및 상기 언급된 아메리칸 시아나미드의 미국 특허). 항체가 접합될 수 있는 또 다른 항-종양 약물은 항폴레이트인 QFA이다. 칼리케아미신 및 QFA는 둘 다 세포내 작용 부위를 갖고, 원형질막을 쉽게 통과하지 않는다. 따라서, 항체-매개 내재화를 통한 이들 작용제의 세포 흡수는 이들의 세포독성 효과를 크게 증진시킨다.

다른 세포독성제

본 발명의 항체에 접합될 수 있는 다른 항종양제로는 BCNU, 스트렙토조신, 빈크리스틴 및 5-플루오로우라실, 미국 특허 5,053,394, 5,770,710호에 기재된, 집합적으로 LL-E33288 복합체로 공지된 물질의 패밀리, 및 에스페라미신 (미국 특허 5,877,296)을 들 수 있다.

사용할 수 있는 효소 활성 독소 및 그의 단편은 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄 (슈도모나스 아에루기노사로부터 유래됨), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이 단백질, 디안틴 단백질, 피토라카 아메리카나 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함한다. 예를 들어, 1993년 10월 28일 공개된 WO 93/21232를 참조한다.

본 발명은 항체와 핵산분해 활성을 갖는 화합물 (예를 들어 리보뉴클레아제 또는 DNA 엔도뉴클레아제, 예컨대 데옥시리보뉴클레아제; DNase) 사이에 형성된 면역접합체를 추가로 고려한다.

종양의 선택적 파괴를 위해서, 항체는 고도의 방사성 원자를 포함할 수 있다. 다양한 방사성동위원소가 방사성 접합된 항체의 생산을 위해 이용가능하다. 그 예는 At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³², Pb²¹², 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다. 접합체는 검출용으로 사용되는 경우에 신티그래피 연구를 위한 방사성 원자, 예를 들어 tc^99m 또는 I¹²³을 포함하거나, 핵자기 공명 (NMR) 영상화 (자기 공명 영상화, mri로도 공지됨)용 스핀 표지, 예를 들어 아이오딘-123, 아이오딘-131, 인듐-111, 플루오린-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망가니즈 또는 철을 포함할 수 있다.

방사성- 또는 다른 표지를 공지된 방식으로 접합체에 혼입시킬 수 있다. 예를 들어, 펩티드는 생합성될 수도 있고, 또는 예를 들어 수소 대신에 플루오린-19를 포함하는 적합한 아미노산 전구체를 사용한 화학적 아미노산 합성에 의해 합성될 수도 있다. tc^99m 또는 I¹²³, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸ 및 In¹¹¹과 같은 표지가 펩티드 내의 시스테인 잔기를 통해 부착될 수 있다. 이트륨-90은 리신 잔기를 통해 부착될 수 있다. 아이오도겐 (IODOGEN) 방법 (문헌 [Fraker et al. (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80:49-57])을 사용하여 아이오딘-123을 혼입시킬 수 있다. 문헌 [Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy (Chatal, CRC Press 1989)]에는 다른 방법이 상세히 기재되어 있다.

항체 및 세포독성제의 접합체는 다양한 이관능성 단백질 커플링제, 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트, 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르 (예컨대 디메틸 아디프이미데이트 HCl)의 이관능성 유도체, 활성 에스테르 (예컨대 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대 비스 (p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대 톨루엔 2,6-디이소시아네이트)과 비스-활성 플루오린 화합물 (예컨대 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)를 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌 [Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 항체에 대한 방사성뉴클레오티드의 접합의 예시적 킬레이트화제이다. WO94/11026을 참조한다. 링커는 세포 내에서 세포독성 약물의 방출을 용이하게 하는 "절단가능한 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산 불안정성 링커, 펩티다제-감수성 링커, 광분해성 링커, 디메틸 링커 또는 디술피드-함유 링커 (문헌 [Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992)]; 미국 특허 번호 5,208,020)가 사용될 수 있다.

본 발명의 화합물은 상업적으로 입수가능한 (예를 들어 피어스 바이오테크놀로지, 인크.(Pierce Biotechnology, Inc., 미국 일리노이주 록포드)로부터의) 가교결합 시약: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 술포-EMCS, 술포-GMBS, 술포-KMUS, 술포-MBS, 술포-SIAB, 술포-SMCC, 및 술포-SMPB, 및 SVSB (숙신이미딜-(4-비닐술폰)벤조에이트)을 사용하여 제조된 ADC를 명백하게 고려하지만, 이에 제한되지는 않는다. 문헌 [2003-2004 Applications Handbook and Catalog]의 467-498 페이지를 참조한다.

항체 약물 접합체의 제조

본 발명의 항체 약물 접합체 (ADC)에서, 항체 (Ab)는 링커 (L)를 통해 항체 당 하나 이상의 약물 모이어티 (D), 예를 들어 약 1 내지 약 20개의 약물 모이어티에 접합된다. 화학식 I의 ADC는 (1) 항체의 친핵성 기를 2가 링커 시약과 반응시켜, 공유 결합을 통하여 Ab-L을 형성시킨 후, 이를 약물 모이어티 D와 반응시키는 방법; 및 (2) 약물 모이어티의 친핵성 기를 2가 링커 시약과 반응시켜, 공유 결합을 통하여 D-L을 형성시킨 다음, 이를 항체의 친핵성 기와 반응시키는 방법을 비롯한 당업자에게 공지된 유기 화학 반응, 조건 및 시약을 사용하여 여러 경로에 의해 제조될 수 있다.

<화학식 I>

항체상의 친핵성 기는 (i) N-말단 아민기, (ii) 측쇄 아민기, 예를 들어 리신, (iii) 측쇄 티올기, 예를 들어 시스테인, 및 (iv) 항체가 글리코실화되는 당 히드록실기 또는 아미노기를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 아민, 티올 및 히드록실기는 친핵성이고, 반응하여 링커 모이어티 및 링커 시약 상의 친전자성 기, 예를 들어 (i) 활성 에스테르, 예컨대 NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트 및 산 할라이드; (ii) 알킬 및 벤질 할라이드, 예컨대 할로아세트아미드; (iii) 알데히드, 케톤, 카르복실 및 말레이미드기와 공유 결합을 형성할 수 있다. 특정 항체는 환원가능한 쇄간 디술피드, 즉 시스테인 브릿지를 갖는다. 환원제, 예컨대 DTT (디티오트레이톨) 처리를 통해 항체를 링커 시약과의 접합에 반응성이 되도록 할 수 있다. 따라서, 각각의 시스테인 브릿지는 이론상 2개의 반응성 티올 친핵성 기를 형성할 것이다. 리신을 2-이미노티올란 (트라우트 시약)과 반응시켜서 아민을 티올로 전환시킴으로써 추가의 친핵성 기를 항체에 도입할 수 있다.

본 발명의 항체 약물 접합체는 또한 링커 시약 또는 약물 상의 친핵성 치환기와 반응할 수 있는 친전자성 모이어티를 도입하는 항체의 개질에 의해 제조될 수도 있다. 글리코실화된 항체의 당을, 예를 들어 퍼아이오데이트 산화 시약으로 산화시켜서 링커 시약 또는 약물 모이어티의 아민기와 반응할 수 있는 알데히드 또는 케톤 기를 형성할 수 있다. 생성되는 이민 쉬프 염기성 기는 안정적인 연결부를 형성할 수도 있거나, 또는 예를 들어 보로히드라이드 시약에 의해 환원되어 안정적인 아민 연결부를 형성할 수도 있다. 한 실시양태에서, 글리코실화된 항체의 탄수화물 부분을 갈락토스 옥시다제 또는 나트륨 메타-퍼아이오데이트와 반응시키면, 약물상의 적절한 기와 반응할 수 있는 카르보닐 (알데히드 및 케톤)기가 단백질 내에 생성될 수 있다 (헤르만슨, 바이오컨쥬케이트 테크닉스(Hermanson, Bioconjugate Techniques)). 또 다른 실시양태에서, N-말단 세린 또는 트레오닌 잔기를 함유하는 단백질을 나트륨 메타-퍼아이오데이트와 반응시키면, 첫번째 아미노산 대신에 알데히드가 생성될 수 있다 (문헌 [Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146]; US 5362852). 그러한 알데히드는 약물 모이어티 또는 링커 친핵체와 반응할 수 있다.

유사하게, 약물 모이어티 상의 친핵성 기는 (i) 활성 에스테르, 예컨대 NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트 및 산 할라이드; (ii) 알킬 및 벤질 할라이드, 예컨대 할로아세트아미드; (iii) 알데히드, 케톤, 카르복실 및 말레이미드기를 포함하는, 링커 모이어티 및 링커 시약 상의 친전자성 기와 반응하여 공유 결합을 형성할 수 있는, 아민, 티올, 히드록실, 히드라지드, 옥심, 히드라진, 티오세미카르바존, 히드라진 카르복실레이트, 및 아릴히드라지드기를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.

대안적으로, 항체 및 세포독성제를 포함하는 융합 단백질은 예를 들어 재조합 기술 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. DNA의 길이는 서로 인접하거나 접합체의 목적하는 특성을 파괴하지 않는 링커 펩티드를 코딩하는 영역에 의해 분리된, 접합체의 2개 부분을 코딩하는 각각의 영역을 포함할 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 항체를 종양 예비표적화에 활용하기 위해 "수용체" (상기, 스트렙타비딘)에 접합시킬 수 있고, 항체-수용체 접합체를 환자에게 투여한 다음, 제거제를 사용하여 결합되지 않은 접합체를 순환계로부터 제거하고, 이어서 세포독성제 (예를 들어, 방사성 뉴클레오티드)에 접합된 "리간드" (예를 들어, 아비딘)를 투여한다.

10. 이뮤노리포솜

본원에 개시된 항체는 또한 이뮤노리포솜으로서 제제화될 수 있다. "리포솜"은 약물을 포유동물에게 전달하는 데에 유용한, 각종 유형의 지질, 인지질 및/또는 계면활성제로 구성된 작은 소포이다. 통상적으로, 리포솜의 성분들은 생체막의 지질 배열과 유사한 이중층 형태로 배열되어 있다. 항체를 함유하는 리포솜은 문헌 [Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985)]; [Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030 (1980)]; 미국 특허 번호 4,485,045 및 4,544,545; 및 WO97/38731 (1997년 10월 23일 공개)에 기재된 것과 같은 당업계에 공지된 방법에 의해 제조된다. 순환 시간이 증진된 리포솜은 미국 특허 번호 5,013,556에 개시되어 있다.

특히 유용한 리포솜은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 사용한 역상 증발 방법으로 생성될 수 있다. 규정된 기공 크기의 필터를 통해 리포솜을 압출하여 목적하는 직경의 리포솜을 생성한다. 본 발명의 항체의 Fab' 단편을 디술피드 쇄간 반응을 통하여 문헌 [Martin et al., J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982)]에 기재된 바와 같이 리포솜에 접합시킬 수 있다. 임의로, 화학요법제를 리포솜 내에 함유시킨다. 문헌 [Gabizon et al., J. National Cancer Inst. 81(19):1484 (1989)]을 참조한다.

B. 올리고펩티드 결합

본 발명의 결합 올리고펩티드는 본원에 기재된 바와 같은 헵신, MSP 및/또는 헵신:MSP 복합체에 결합, 바람직하게는 특이적으로 결합하는 올리고펩티드이다. 결합 올리고펩티드는 공지된 올리고펩티드 합성 방법을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있거나, 또는 재조합 기술을 사용하여 제조 및 정제될 수 있다. 결합 올리고펩티드는 통상적으로는 적어도 약 5개 아미노산 길이, 대안적으로는 적어도 약 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100개 또는 그 초과의 아미노산 길이이고, 폴리펩티드에 결합, 바람직하게는 특이적으로 결합할 수 있다. 결합 올리고펩티드는 널리 공지된 기술을 이용하여 과도한 실험없이 확인할 수 있다. 이와 관련하여, 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고펩티드에 대해 올리고펩티드 라이브러리를 스크리닝하는 기술이 당업계에 공지되어 있음에 주목한다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,556,762, 5,750,373, 4,708,871, 4,833,092, 5,223,409, 5,403,484, 5,571,689, 5,663,143; PCT 공보 번호 WO 84/03506 및 WO84/03564; 문헌 [Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:3998-4002 (1984)]; [Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82:178-182 (1985)]; [Geysen et al., in Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986)]; [Geysen et al., J. Immunol. Meth., 102:259-274 (1987)]; [Schoofs et al., J. Immunol., 140:611-616 (1988)], [Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378]; [Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry, 30:10832]; [Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352: 624]; [Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol., 222:581]; [Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363] 및 [Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668] 참조).

이와 관련하여, 박테리오파지 (파지) 디스플레이는 공지의 기술이며, 큰 규모의 올리고펩티드 라이브러리를 스크리닝하여 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 라이브러리의 구성원(들)을 확인할 수 있는 기술이다. 파지 디스플레이는 변이체 폴리펩티드가 박테리오파지 입자의 표면 상에 코트 단백질에 대한 융합 단백질로서 디스플레이되는 기술이다 (문헌 [Scott, J.K. and Smith, G. P. (1990) Science, 249: 386]). 파지 디스플레이의 유용성은, 선택적으로 무작위화된 단백질 변이체 (또는 무작위로 클로닝된 cDNA)의 대규모 라이브러리가 표적 분자에 고친화도로 결합하는 서열에 대하여 빠르고 효율적으로 분류될 수 있다는 사실에 있다. 파지 상의 펩티드 (문헌 [Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378]) 또는 단백질 (문헌 [Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry, 30:10832]; [Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352:624]; [Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol., 222:581]; [Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363]) 라이브러리의 디스플레이는 특이적 결합 성질이 있는 것에 대해 수백만 개의 폴리펩티드 또는 올리고펩티드를 스크리닝하는데 사용되어 왔다 (문헌 [Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668]). 무작위 돌연변이체의 파지 라이브러리 분류는 많은 변이체를 구축하여 증식시키는 전략, 표적 수용체를 사용하여 친화도 정제하는 절차, 및 결합 증가의 결과를 평가하는 수단을 필요로 한다. 미국 특허 번호 5,223,409, 5,403,484, 5,571,689 및 5,663,143.

대부분의 파지 디스플레이 방법에서 필라멘트형 파지가 사용되어 왔지만, 람다형 파지 디스플레이 시스템 (WO 95/34683; U.S. 5,627,024), T4 파지 디스플레이 시스템 (문헌 [Ren et al., Gene, 215: 439 (1998)]; [Zhu et al., Cancer Research, 58(15): 3209-3214 (1998)]; [Jiang et al., Infection & Immunity, 65(11): 4770-4777 (1997)]; [Ren et al., Gene, 195(2):303-311 (1997)]; [Ren, Protein Sci., 5: 1833 (1996)]; [Efimov et al., Virus Genes, 10: 173 (1995)]) 및 T7 파지 디스플레이 시스템 (문헌 [Smith and Scott, Methods in Enzymology, 217: 228-257 (1993)]; U.S. 5,766,905)가 또한 공지되어 있다.

현재까지 기본적인 파지 디스플레이 개념에 대한 다수의 다른 개선 및 변형이 개발되어 왔다. 이러한 개선은 선택된 표적 분자와의 결합에 대해 펩티드 라이브러리를 스크리닝하고 이러한 단백질을 원하는 특성에 대해 스크리닝하는 능력을 이용하여 기능성 단백질을 디스플레이하는 디스플레이 시스템의 능력을 증진시킨다. 파지 디스플레이 반응에 대한 조합 반응 장치가 개발되었으며 (WO 98/14277), 파지 디스플레이 라이브러리를 이용하여 2개 분자간의 상호작용 (WO 98/20169, WO 98/20159) 및 억제된 나선형 펩티드의 특성 (WO 98/20036)을 분석 및 제어하였다. WO 97/35196은 파지 디스플레이 라이브러리를, 리간드가 표적 분자에 결합하는 제1 용액 및 친화도 리간드가 표적 분자에 결합하지 않는 제2 용액과 접촉시켜서 친화도 리간드를 단리함으로써 결합 리간드를 선택적으로 단리하는 방법을 기재한다. WO 97/46251은 친화도 정제된 항체를 사용하여 무작위 파지 디스플레이 라이브러리를 바이오패닝한 후에 결합 파지를 단리하고, 이후에 마이크로플레이트 웰을 사용하는 마이크로패닝 방법으로 고친화도 결합 파지를 단리하는 것을 기재한다. 친화성 태그로서의 황색 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphlylococcus aureus) 단백질 A의 용도가 또한 보고되었다 (문헌 [Li et al. (1998) Mol Biotech., 9:187]). WO 97/47314는 파지 디스플레이 라이브러리일 수 있는 조합 라이브러리를 사용하여 효소 특이성을 구별하는 기질 제외 라이브러리의 사용을 기재한다. 파지 디스플레이를 이용할 때 세제 중에 사용하기에 적합한 효소를 선택하는 방법은 WO 97/09446에 기재되어 있다. 특이적 결합 단백질을 선택하는 추가의 방법은 미국 특허 번호 5,498,538, 5,432,018 및 WO 98/15833에 기재되어 있다.

펩티드 라이브러리를 생성시키고 이러한 라이브러리를 스크리닝하는 방법이 미국 특허 번호 5,723,286, 5,432,018, 5,580,717, 5,427,908, 5,498,530, 5,770,434, 5,734,018, 5,698,426, 5,763,192 및 5,723,323에 또한 개시되어 있다.

C. 결합 소분자

바람직하게는, 결합 소분자는 본원에 기재된 바와 같은 헵신, MSP 및/또는 헵신:MSP 복합체에 결합, 바람직하게는 특이적으로 결합하는, 본원에 정의된 바와 같은 올리고펩티드 또는 항체 이외의 유기 분자이다. 결합 유기 소분자는 공지된 방법을 이용하여 확인되고 화학적으로 합성될 수 있다 (예를 들어, PCT 공보 번호 WO00/00823 및 WO00/39585 참조). 결합 유기 소분자는 일반적으로 크기가 약 2000 달톤 미만이고, 대안적으로는 크기가 약 1500, 750, 500, 250 또는 200 달톤 미만이며, 이때 본원에 기재된 바와 같은 표적에 결합, 바람직하게는 특이적으로 결합할 수 있는 이같은 유기 소분자를 주지된 기술을 사용하여 과도한 실험 없이 확인할 수 있다. 이와 관련하여, 표적에 결합할 수 있는 분자에 대해 유기 소분자 라이브러리를 스크리닝하는 기술은 당업계에 주지되어 있는 것으로 인지된다 (예를 들어, PCT 공보 번호 WO00/00823 및 WO00/39585 참조). 결합 유기 소분자는 예를 들어 알데히드, 케톤, 옥심, 히드라존, 세미카르바존, 카르바지드, 1급 아민, 2급 아민, 3급 아민, N-치환된 히드라진, 히드라지드, 알콜, 에테르, 티올, 티오에테르, 디술피드, 카르복실산, 에스테르, 아미드, 우레아, 카르바메이트, 카르보네이트, 케탈, 티오케탈, 아세탈, 티오아세탈, 아릴 할라이드, 아릴 술포네이트, 알킬 할라이드, 알킬 술포네이트, 방향족 화합물, 헤테로시클릭 화합물, 아닐린, 알켄, 알킨, 디올, 아미노 알콜, 옥사졸리딘, 옥사졸린, 티아졸리딘, 티아졸린, 엔아민, 술폰아미드, 에폭시드, 아지리딘, 이소시아네이트, 술포닐 클로라이드, 디아조 화합물, 산 염화물 등일 수 있다.

D. 바람직한 특성을 갖는 항체, 결합 올리고펩티드 및 결합 소분자에 대한 스크리닝

본 발명의 항체, 올리고펩티드 및 소분자를 생성하기 위한 기술은 앞서 기재된 바 있다. 원한다면, 특정한 생물학적 특징을 갖는 항체, 올리고펩티드 또는 다른 소분자를 추가로 선택할 수 있다.

본 발명의 항체, 올리고펩티드 또는 다른 소분자의 억제 효과는 당업계에 공지된 방법에 의해, 예를 들어 헵신 및/또는 프로-MSP를 내인성 발현하거나 각각의 유전자(들)로의 형질감염 후에 발현하는 세포를 사용하여 평가할 수 있다. 예를 들어, 적절한 종양 세포주, 및 헵신 및/또는 프로-MSP 폴리펩티드-형질감염된 세포를 수 일 (예를 들어, 2 내지 7일) 동안 다양한 농도의 본 발명의 모노클로날 항체, 올리고펩티드 또는 다른 소분자로 처리하고, MSP 활성화와 관련된 것으로 공지되어 있는 생물학적 활성(들) (하기 실시예에 따라 평가된 생물학적 활성 포함)을 분석할 수 있다. 항체, 결합 올리고펩티드 또는 결합 유기 소분자는 시험관내 또는 생체내에서 헵신 및/또는 MSP-발현 종양 세포의 활성을 비처리된 종양 세포와 비교하여, 약 25 내지 100% 만큼, 바람직하게는 약 30 내지 100% 만큼, 보다 바람직하게는 약 50 내지 100% 또는 70 내지 100% 만큼 (한 실시양태에서, 약 0.5 내지 30 ㎍/ml의 항체 농도에서) 억제할 것이다. 활성 억제는 세포 배양물 또는 다른 적합한 실험 시스템 중 항체 농도 약 0.5 내지 30 ㎍/ml 또는 약 0.5 nM 내지 200 nM에서 측정될 수 있고, 이때의 활성 억제는 종양 세포를 항체에 노출시킨지 1일 내지 10일 후에 결정된다. 약 1 ㎍/kg 내지 약 100 mg/kg 체중의 항체 투여가 상기 항체의 1차 투여로부터 약 5일 내지 3개월 이내, 바람직하게는 약 5일 내지 30일 이내에 종양 크기의 감소 또는 종양 세포 침습의 감소 등을 야기하는 경우, 상기 항체는 생체내에서 억제성이다.

관심 대상의 표적 상의 에피토프에 결합하는 항체, 올리고펩티드 또는 다른 유기 소분자를 스크리닝하기 위해, 문헌 [Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)]에 기재된 바와 같은 통상적인 교차-차단 검정을 수행할 수 있다. 상기 검정은 시험 항체, 올리고펩티드 또는 다른 소유기 분자가 공지의 항체와 동일한 부위 또는 에피토프에 결합하는지 여부를 결정하는데 이용될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 에피토프 맵핑을 당업계에 공지된 방법으로 수행할 수 있다. 예를 들어, 접촉 잔기를 확인하기 위해서 항체 서열을 예컨대 알라닌 스캐닝을 통해 돌연변이유발시킬 수 있다. 돌연변이체 항체는 초기에 적절한 폴딩을 보장하기 위해 폴리클로날 항체와의 결합에 대해 시험된다. 다른 방법에서, 폴리펩티드의 다른 영역에 상응하는 펩티드를 시험 항체들 또는 시험 항체 및 에피토프 특성이 규명되고 공지된 항체와의 경쟁 검정에 사용할 수 있다.

E. 항체 의존성 효소 매개 전구약물 요법 (ADEPT)

본 발명의 항체는 또한 전구약물 (예를 들어, 펩티딜 화학요법제, WO81/01145 참조)을 활성 항암 약물로 전환시키는 전구약물-활성화 효소에 항체를 접합함으로써 ADEPT에서 사용할 수 있다. 예를 들어 WO 88/07378 및 미국 특허 번호 4,975,278을 참조한다.

ADEPT에 유용한 면역접합체의 효소 성분은 전구약물을 그의 보다 활성인 세포독성 형태로 전환시키는 방식으로 전구약물에 대해 작용할 수 있는 임의의 효소를 포함한다.

본 발명의 방법에 유용한 효소는 포스페이트-함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 알칼리성 포스파타제; 술페이트-함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 아릴술파타제; 비독성 5-플루오로시토신을 항암 약물인 5-플루오로우라실로 전환시키는데 유용한 시토신 데아미나제; 펩티드-함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 프로테아제, 예를 들어 세라티아 프로테아제, 테르몰리신, 섭틸리신, 카르복시펩티다제 및 카텝신 (예를 들어 카텝신 B 및 L); D-아미노산 치환기를 함유하는 전구약물을 전환시키는데 유용한 D-알라닐카르복시펩티다제; 글리코실화된 전구약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 탄수화물-절단 효소, 예를 들어 β-갈락토시다제 및 뉴라미니다제; β-락탐으로 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 β-락타마제; 및 아민 질소에서 각각 페녹시아세틸기 또는 페닐아세틸기로 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 페니실린 아미다제, 예컨대 페니실린 V 아미다제 또는 페니실린 G 아미다제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 대안적으로, 본 발명의 전구약물을 유리 활성 약물로 전환시키기 위해 효소적 활성을 갖는 항체 (당업계에서 "아브자임 (abzyme)"으로도 알려짐)를 사용할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Massey, Nature 328:457-458 (1987)] 참조). 항체-아브자임 접합체는 종양 세포 집단에 아브자임을 전달하기 위해 본원에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다.

본 발명의 효소는 당업계 공지의 기술에 의해, 예를 들어 상기 논의된 이종이관능성 가교 시약을 사용하여 항-폴리펩티드 항체에 공유 결합될 수 있다. 대안적으로, 적어도 본 발명의 효소의 기능적 활성 부분에 연결된 본 발명의 항체의 항원 결합 영역을 적어도 포함하는 융합 단백질은 당업계에 잘 공지된 재조합 DNA 기술을 이용하여 제작할 수 있다 (예를 들어, [Neuberger et al., Nature 312:604-608 (1984)] 참조).

F. 항체 변이체

본원에 기재된 항체 이외에도, 항체 변이체가 제조될 수 있다는 것이 고려된다. 항체 변이체는 코딩 DNA에 적절한 뉴클레오티드 변화를 도입함으로써 및/또는 목적하는 항체의 합성에 의해 제조할 수 있다. 당업자는 아미노산 변화로 항체의 번역후 프로세스가 변경될 수 있고, 예컨대 글리코실화 부위의 수 또는 위치가 변화되거나 막 고정 특성이 변경될 수 있다는 것을 인지할 것이다.

본원에 기재된 항체에서의 변이는, 예를 들어 미국 특허 5,364,934에 기재된 보존적 및 비-보존적 돌연변이를 위한 임의의 기술 및 지침을 이용하여 형성시킬 수 있다. 변이는 천연 서열 항체 또는 폴리펩티드와 비교할 때 아미노산 서열에서의 변화를 야기하는, 항체를 코딩하는 1개 이상의 코돈의 치환, 결실 또는 삽입일 수 있다. 임의로, 이러한 변이는 항체의 하나 이상의 도메인 중의 1개 이상의 아미노산을 임의의 다른 아미노산으로 치환시킨 것이다. 어느 아미노산 잔기가 원하는 활성에 불리한 영향을 주지 않으면서 삽입, 치환 또는 결실될 수 있는지를 결정할 때의 지침은 항체의 서열을 공지의 상동성 단백질 분자의 서열과 비교하고, 높은 상동성 영역에서 이루어진 아미노산 서열 변화의 수를 최소화함으로써 찾아볼 수 있다. 아미노산 치환은 하나의 아미노산을 구조적 및/또는 화학적 특성이 유사한 또 다른 아미노산으로 대체한 결과일 수 있고, 예를 들어 류신을 세린으로 대체한, 즉, 보존적 아미노산 대체의 결과일 수 있다. 삽입 또는 결실은 임의로 약 1개 내지 5개의 아미노산 범위에 걸쳐 이루어질 수 있다. 허용되는 변이는 서열에서 체계적으로 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환을 생성하고, 생성된 변이체를 모 서열이 나타내는 활성에 대해 시험하여 결정될 수 있다.

항체 및 폴리펩티드 단편이 본원에 제공된다. 이러한 단편은 예를 들어 전장 천연 항체 또는 단백질과 비교할 때 N-말단 또는 C-말단에서 말단절단된 것일 수도 있고, 또는 내부 잔기가 결여된 것일 수도 있다. 특정 단편은 항체 또는 폴리펩티드의 원하는 생물학적 활성에 필수적이지 않은 아미노산 잔기가 결여되어 있다.

항체 및 폴리펩티드 단편은 임의의 수많은 통상의 기술로 제조될 수 있다. 원하는 펩티드 단편을 화학적으로 합성할 수 있다. 대안적인 접근법은 효소적 소화에 의해, 예를 들어 특정 아미노산 잔기로 한정되는 부위에서 단백질을 절단하는 것으로 공지된 효소로 단백질을 처리하거나 적합한 제한 효소로 DNA를 소화시켜서 항체 또는 폴리펩티드 단편을 생성하고, 원하는 단편을 단리하는 것을 포함한다. 또 다른 적합한 기술은 원하는 항체 또는 폴리펩티드 단편을 코딩하는 DNA 단편을 단리하고 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 증폭시키는 것을 포함한다. DNA 단편의 원하는 말단을 한정하는 올리고뉴클레오티드를 PCR에서의 5' 및 3' 프라이머에서 사용한다. 바람직하게는, 항체 및 폴리펩티드 단편은 적어도 하나의 생물학적 및/또는 면역학적 활성을 본원에 개시된 천연 항체 또는 폴리펩티드와 공유한다.

특별한 실시양태에서, 관심 대상 보존적 치환은 하기 표에서 바람직한 치환이라는 제목하에 제시되어 있다. 이러한 치환이 생물학적 활성을 변화시키는 경우에는 하기 표에 예시적인 치환이라 명명되거나 아미노산 클래스에 대해 아래에서 추가로 기재된 바와 같은 보다 실질적인 변화를 도입하고 생성물을 스크리닝한다.

항체 또는 폴리펩티드의 기능 또는 면역학적 정체에 있어서의 실질적인 변형은 (a) 예를 들어 시트 또는 나선 입체 형태로서, 치환 영역 내의 폴리펩티드 백본의 구조, (b) 표적 부위에서의 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 부피를 유지하는 것에 대한 효과가 유의하게 상이한 치환을 선택함으로써 달성된다. 아미노산은 그의 측쇄 특성의 유사성에 따라 하기 군으로 나뉠 수 있다 (문헌 [A. L. Lehninger, in Biochemistry, second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)]):

(1) 비-극성: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M)

(2) 비하전 극성: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q)

(3) 산성: Asp (D), Glu (E)

(4) 염기성: Lys (K), Arg (R), His(H)

대안적으로, 자연 발생 잔기는 공통적인 측쇄 특성에 따라 하기 군으로 나뉠 수 있다:

(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) 산성: Asp, Glu;

(4) 염기성: His, Lys, Arg;

(5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;

(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.

비-보존적 치환은 이들 부류 중의 하나의 구성원을 또 다른 부류로 교환하는 것을 수반할 것이다. 이러한 치환된 잔기를 또한 보존적 치환 부위에, 또는 더욱 바람직하게는 나머지 (비-보존된) 부위에 도입할 수 있다.

변이는 당업계 공지의 방법, 예컨대 올리고뉴클레오티드-매개 (부위-지정) 돌연변이유발, 알라닌 스캐닝 및 PCR 돌연변이유발을 이용하여 이루어질 수 있다. 부위 지정 돌연변이유발 (문헌 [Carter et al., Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986)]; [Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)]), 카세트 돌연변이유발 (문헌 [Wells et al., Gene, 34:315 (1985)]), 제한 선택 돌연변이유발 (문헌 [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)]) 또는 다른 공지의 기술을 클로닝된 DNA에 대해 수행하여 항체 또는 폴리펩티드 변이체 DNA를 생산할 수 있다.

인접한 서열을 따라 하나 이상의 아미노산을 확인하기 위해 스캐닝 아미노산 분석을 이용할 수도 있다. 바람직한 스캐닝 아미노산은 비교적 작은 중성 아미노산이다. 이러한 아미노산은 알라닌, 글리신, 세린 및 시스테인을 포함한다. 베타-탄소 너머의 측쇄를 제거하고, 변이체의 주쇄 형상을 덜 변형시킬 것 같기 때문에, 이러한 군 중에서 알라닌이 전형적으로 바람직한 스캐닝 아미노산이다 (문헌 [Cunningham and Wells, Science, 244: 1081-1085 (1989)]). 알라닌은 또한 가장 흔한 아미노산이기 때문에 전형적으로 바람직하다. 추가로, 알라닌은 종종 매립된 위치 및 노출된 위치 모두에서 발견된다 (문헌 [Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.)]; [Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)]). 알라닌 치환이 적당량의 변이체를 생성하지 않을 경우에는 이소테릭(isoteric) 아미노산을 사용할 수 있다.

또한, 항체 또는 폴리펩티드의 적절한 입체형태 유지에 관여하지 않는 임의의 시스테인 잔기가 일반적으로 세린으로 치환되어 분자의 산화 안정성을 개선시키고 이상 가교를 방지할 수 있다. 반대로, 시스테인 결합(들)을 항체 또는 폴리펩티드에 부가하여 그의 안정성을 개선시킬 수 있다 (특히, 항체가 Fv 단편과 같은 항체 단편인 경우).

특히 바람직한 유형의 치환 변이체는 모 항체 (예를 들어 인간화 또는 인간 항체)의 1개 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 수반한다. 일반적으로, 추가적인 개발용으로 선택된 생성된 변이체(들)는 이들이 생성되는 모 항체에 비해 생물학적 특성이 개선될 것이다. 이러한 치환 변이체를 생성하는 편리한 방법은 파지 디스플레이를 사용한 친화도 성숙이다. 간략하게, 몇몇 초가변 영역 부위 (예를 들어, 6 내지 7개 부위)가 각각의 부위에서 모든 가능한 아미노 치환이 생성되도록 돌연변이된다. 이로써 생성된 항체 변이체를 필라멘트형 파지 입자로부터 각 입자 내에 패키지된 M13의 유전자 III 생성물에 대한 융합체로서 1가 방식으로 디스플레이시킨다. 이어서, 파지-디스플레이된 변이체를 본원에 개시된 바와 같이 그의 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화도)에 대해 스크리닝한다. 변형을 위한 후보 초가변 영역 부위를 확인하기 위해, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발을 수행하여 항원 결합에 유의하게 기여하는 초가변 영역 잔기를 확인할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 항체 및 항원 폴리펩티드 사이의 접촉 지점을 확인하기 위해서는 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하는 것이 유익할 수 있다. 이같은 접촉 잔기 및 인접 잔기는 본원에서 상술된 기술에 따른 치환을 위한 후보이다. 일단 이같은 변이체가 생성되면, 변이체들의 패널을 본원에 기술된 바와 같이 스크리닝하고, 한가지 이상의 관련 검정에서 탁월한 특성을 갖는 항체를 추가적인 개발을 위해 선택할 수 있다.

항체의 아미노산 서열 변이체를 코딩하는 핵산 분자는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조된다. 이러한 방법에는 천연 공급원으로부터의 단리 (자연 발생 아미노산 서열 변이체의 경우), 또는 항체의 앞서 제조된 변이체 또는 비-변이체 버전의 올리고뉴클레오티드-매개 (또는 부위-지정) 돌연변이유발, PCR 돌연변이유발 및 카세트 돌연변이유발에 의한 제조가 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다.

G. 항체 및 폴리펩티드의 변형

항체 및 폴리펩티드의 공유 변형이 본 발명의 범위 내에 포함된다. 공유 변형 중 한 유형은 항체 또는 폴리펩티드의 표적화된 아미노산 잔기를, 항체 또는 폴리펩티드의 선택된 측쇄 또는 N- 또는 C-말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 반응시키는 것을 포함한다. 이관능성 작용제를 사용한 유도체화는 예를 들어 항체를 정제하기 위한 방법에서 사용하기 위한 수불용성 지지체 매트릭스 또는 표면에 항체 또는 폴리펩티드를 가교결합시키기 위해, 및 그 반대를 위해 유용하다. 통상적으로 사용되는 가교결합제는 예를 들어 1,1-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데히드, N-히드록시숙신이미드 에스테르, 예를 들어 4-아지도살리실산을 갖는 에스테르, 동종이관능성 이미도에스테르, 예를 들어 디숙신이미딜 에스테르, 예를 들어 3,3'-디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트), 이관능성 말레이미드, 예를 들어 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄 및 메틸-3-[(p-아지도페닐)디티오]프로피오이미데이트와 같은 작용제를 포함한다.

다른 변형은 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기의 각각 상응하는 글루타밀 및 아스파르틸 잔기로의 탈아미드화, 프롤린 및 리신의 히드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 히드록실기의 인산화, 리신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 α-아미노기의 메틸화 (문헌 [T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)]), N-말단 아민의 아세틸화, 및 임의의 C-말단 카르복실기의 아미드화를 포함한다.

본 발명의 범위 내에 포함되는 항체 또는 폴리펩티드의 또 다른 유형의 공유 변형은 상기 항체 또는 폴리펩티드의 천연 글리코실화 패턴의 변경을 포함한다. "천연 글리코실화 패턴의 변경"은 본원의 목적에서 천연 서열 항체 또는 폴리펩티드에서 발견된 하나 이상의 탄수화물 모이어티의 삭제 (근원적인 글리코실화 부위의 제거에 의해 또는 화학적 및/또는 효소적 수단에 의한 글리코실화의 삭제에 의해), 및/또는 천연 서열 항체 또는 폴리펩티드에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위의 부가를 의미하는 것으로 의도된다. 추가로, 상기 어구는 존재하는 다양한 탄수화물 모이어티의 성질 및 비율의 변화를 수반하는, 천연 단백질의 글리코실화의 정성적 변화를 포함한다.

항체 및 다른 폴리펩티드의 글리코실화는 전형적으로 N-연결되거나 O-연결된다. N-연결은 탄수화물 모이어티가 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착된 것을 지칭한다. 트리펩티드 서열, 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)이 아스파라긴 측쇄로 탄수화물 모이어티를 효소적으로 부착시키기 위한 인식 서열이다. 따라서, 이러한 트리펩티드 서열 중 어느 하나가 폴리펩티드에 존재함으로써 잠재적인 글리코실화 부위가 생성된다. O-연결된 글리코실화는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 크실로스 중의 하나가 히드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌에 부착되는 것을 지칭하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신이 또한 사용될 수 있다.

항체 또는 폴리펩티드에 글리코실화 부위를 부가하는 것은 이것이 하나 이상의 상기 기재된 트리펩티드 서열을 함유하도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 편리하게 달성된다 (N-연결된 글리코실화 부위의 경우). 또한 변경은 원래의 항체 또는 폴리펩티드의 서열에 대한 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가 또는 치환에 의해 달성될 수 있다 (O-연결된 글리코실화 부위의 경우). 항체 또는 폴리펩티드 아미노산 서열은 DNA 수준에서의 변화를 통해, 특히 상기 항체 또는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 원하는 아미노산으로 번역될 코돈이 생성되도록 미리 선택된 염기에서 돌연변이시킴으로써 임의적으로 변경될 수 있다.

항체 또는 폴리펩티드 상의 탄수화물 모이어티의 수를 증가시키는 또 다른 수단은 폴리펩티드에 글리코시드를 화학적으로 또는 효소에 의해 커플링시키는 것이다. 상기 방법은 예를 들어 1987년 9월 11일 공개된 WO 87/05330 및 문헌 [Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem. pp. 259-306 (1981)]에 기재되어 있다.

항체 또는 폴리펩티드 상에 존재하는 탄수화물 모이어티의 제거는 화학적으로 또는 효소에 의해, 또는 글리코실화의 표적으로 기능하는 아미노산 잔기를 코딩하는 코돈의 돌연변이에 의한 치환에 의해 달성할 수 있다. 화학적 탈글리코실화 기술은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophvs., 259:52 (1987)] 및 [Edge et al., Anal. Biochem. 118:131 (1981)]에 기재되어 있다. 폴리펩티드 상의 탄수화물 모이어티의 효소에 의한 절단은 문헌 [Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138:350 (1987)]에 기재된 바와 같이 다양한 엔도- 및 엑소-글리코시다제의 사용에 의해 달성할 수 있다.

항체 또는 폴리펩티드의 또 다른 유형의 공유 변형은 상기 항체 또는 폴리펩티드를 다양한 비-단백질성 중합체 중 하나, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌에 미국 특허 번호 4,640,835, 4,496,689, 4,301,144, 4,670,417, 4,791,192 또는 4,179,337에 기재된 방식으로 연결시키는 것을 포함한다. 상기 항체 또는 폴리펩티드는 또한 예를 들어 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합으로 제조된 마이크로캡슐 (예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐) 내에, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어 리포솜, 알부민 미소구, 마이크로유화액, 나노입자 및 나노캡슐) 내에 또는 마크로유화액 내에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A., Ed., (1980)]에 개시되어 있다.

본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 또한 다른 이종 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 융합된 항체 또는 폴리펩티드를 포함하는 키메라 분자를 형성하는 방식으로 변형될 수 있다.

한 실시양태에서, 상기 키메라 분자는 항-태그 항체가 그에 대해 선택적으로 결합할 수 있는 에피토프를 제공하는 태그 폴리펩티드와 항체 또는 폴리펩티드의 융합체를 포함한다. 에피토프 태그는 일반적으로 항체 또는 폴리펩티드의 아미노- 또는 카르복실-말단에 위치한다. 이같은 에피토프 태그가 부착된 형태의 항체 또는 폴리펩티드의 존재를 태그 폴리펩티드에 대한 항체를 사용하여 검출할 수 있다. 또한, 에피토프 태그를 제공함으로써 항-태그 항체 또는 에피토프 태그에 결합하는 또 다른 유형의 친화도 매트릭스를 사용한 친화도 정제에 의해 항체 또는 폴리펩티드를 쉽게 정제할 수 있다. 다양한 태그 폴리펩티드 및 이들 각각의 항체는 당업계에 공지되어 있다. 그 예는 폴리-히스티딘 (폴리-his) 또는 폴리-히스티딘-글리신 (폴리-his-gly) 태그; flu HA 태그 폴리펩티드 및 그의 항체 12CA5 (문헌 [Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)]); c-myc 태그 및 그에 대한 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 및 9E10 항체 (문헌 [Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)]); 및 단순 포진 바이러스 당단백질 D (gD) 태그 및 그의 항체 (문헌 [Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)])를 포함한다. 기타 태그 폴리펩티드에는 Flag-펩티드 (문헌 [Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)]); KT3 에피토프 펩티드 (문헌 [Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)]); α-튜불린 에피토프 펩티드 (문헌 [Skinner et al., J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)]); 및 T7 유전자 10 단백질 펩티드 태그 (문헌 [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)])가 포함된다.

대안적인 실시양태에서, 키메라 분자는 이뮤노글로불린 또는 이뮤노글로불린의 특정 영역과 항체 또는 폴리펩티드의 융합체를 포함할 수 있다. 2가 형태의 키메라 분자 (본원에서는 "이뮤노어드헤신"이라고 지칭하기도 함)의 경우, 이러한 융합체는 IgG 분자의 Fc 영역에 대한 것일 수 있다. Ig 융합체는 바람직하게는 Ig 분자 내의 적어도 하나의 가변 영역 대신에 항체 또는 폴리펩티드의 가용성 형태 (막횡단 도메인이 결실되거나 불활성화된 형태)의 치환을 포함한다. 특히 바람직한 실시양태에서, 이뮤노글로불린 융합체는 힌지, CH₂ 및 CH₃, 또는 IgG1분자의 힌지, CH₁, CH₂ 및 CH₃ 영역을 포함한다. 이뮤노글로불린 융합체의 생산에 대해서는 또한 미국 특허 번호 5,428,130 (1995년 6월 27일 허여됨)를 참조한다.

H. 항체 및 폴리펩티드의 제조

하기 기재는 주로 항체- 및 폴리펩티드 코딩 핵산을 함유하는 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 세포를 배양하여 항체 및 폴리펩티드를 생성하는 것에 관한 것이다. 물론, 항체 및 폴리펩티드를 제조하기 위해 당업계에 공지되어 있는 대안적 방법을 사용할 수 있음이 고려된다. 예를 들어, 적절한 아미노산 서열, 또는 그의 일부분을 고체-상 기술을 사용하여 직접적인 펩티드 합성에 의해 생산할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969)]; [Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154 (1963)] 참조). 시험관내 단백질 합성은 수동 기술 또는 자동화에 의해 수행될 수 있다. 자동화 합성은 예를 들어 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) 펩티드 합성기 (미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재)를 제조업체의 지침에 따라 사용하여 달성될 수 있다. 항체 또는 폴리펩티드의 다양한 부분들은 별개로 화학적으로 합성되고, 원하는 항체 또는 폴리펩티드를 생성하기 위해 화학적 또는 효소적 방법을 사용하여 조합될 수 있다.

1. 항체 및 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 단리

항체 또는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA는 항체 또는 폴리펩티드 mRNA를 보유하고 이를 검출가능한 수준으로 발현하는 것으로 여겨지는 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 얻을 수 있다. 따라서, 인간 항체 또는 폴리펩티드 DNA는 인간 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 편리하게 얻을 수 있다. 항체- 또는 폴리펩티드-코딩 유전자는 또한 게놈 라이브러리로부터 또는 공지의 합성 절차 (예를 들어, 자동화 핵산 합성)에 의해 얻을 수 있다.

라이브러리는 관심 대상 유전자 또는 그에 의해 코딩되는 단백질을 확인하도록 설계된 프로브 (예를 들어 적어도 약 20개 내지 80개 염기의 올리고뉴클레오티드)를 사용하여 스크리닝할 수 있다. 선택된 프로브를 사용한 cDNA 또는 게놈 라이브러리의 스크리닝은 예컨대 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)]에 기재된 표준 절차를 이용하여 수행될 수 있다. 항체 또는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 단리하는 별도의 수단은 PCR 방법을 사용하는 것이다 (상기 문헌 [Sambrook et al.]; 문헌 [Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)]).

cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 기술은 당업계에 공지되어 있다. 프로브로서 선택된 올리고뉴클레오티드 서열은 가양성이 최소화되도록 충분한 길이이고 충분히 분명해야 한다. 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 스크리닝될 라이브러리 내의 DNA에 대한 혼성화시에 검출될 수 있도록 표지된다. 표지 방법은 당업계에 공지되어 있고, 32P-표지된 ATP와 같은 방사능표지, 바이오티닐화 또는 효소 표지의 사용을 포함한다. 중간 정도의 엄격도 및 고엄격도를 포함하는 혼성화 조건은 상기 문헌 [Sambrook et al.]에서 제공된다.

이러한 라이브러리 스크리닝 방법에서 확인된 서열은 공공 데이터베이스, 예를 들어 진뱅크(GenBank) 또는 다른 사설 서열 데이터베이스에 기탁되고 이로부터 이용가능한 다른 공지의 서열과 비교 및 정렬될 수 있다. 분자의 한정된 영역 내의 서열 동일성 또는 전장 서열에 걸친 서열 동일성 (아미노산 또는 뉴클레오티드 수준)은 당업계에 공지되고 본원에 기재된 바와 같은 방법을 이용하여 결정될 수 있다.

단백질 코딩 서열을 갖는 핵산은 본원에서 최초로 개시된 추정 아미노산 서열을 사용하고, 필요한 경우에는 cDNA로 역전사될 수 없는 mRNA의 전구체 및 프로세싱 중간체를 검출하기 위해 상기 문헌 [Sambrook et al.]에 기재된 바와 같은 통상적인 프라이머 연장 절차를 이용함으로써, 선택된 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 스크리닝하여 얻을 수 있다.

2. 숙주 세포의 선택 및 형질전환

숙주 세포를 항체 또는 폴리펩티드 생성을 위해 본원에 기재된 발현 또는 클로닝 벡터로 형질감염 또는 형질전환시키고, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선택하거나, 목적하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키기 위해 적절하게 변형된 통상적인 영양 배지 내에서 배양한다. 배양 조건, 예컨대 배지, 온도, pH 등은 당업자가 과도한 실험 없이 선택할 수 있다. 일반적으로, 세포 배양물의 생산성을 최대화하기 위한 원리, 프로토콜 및 실제 기술은 문헌 [Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991)] 및 상기 문헌 [Sambrook et al.]에서 찾아볼 수 있다.

진핵 세포 형질감염 및 원핵 세포 형질전환의 방법, 예를 들어 CaCl₂, CaPO₄, 리포솜-매개 및 전기천공은 당업자에게 공지되어 있다. 사용된 숙주 세포에 따라, 형질전환은 이러한 세포에 적절한 표준 기술을 이용하여 수행된다. 상기 문헌 [Sambrook et al.]에 기재된 바와 같이 염화칼슘을 사용한 칼슘 처리, 또는 전기천공은 일반적으로 원핵생물에 대해 사용된다. 문헌 [Shaw et al., Gene, 23:315 (1983)] 및 WO 89/05859 (1989년 6월 29일 공개)에 기재된 바와 같이, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)를 사용한 감염은 특정 식물 세포의 형질전환에 사용된다. 이러한 세포벽이 없는 포유동물 세포의 경우에는, 문헌 [Graham and van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)]의 인산칼슘 침전 방법을 이용할 수 있다. 포유동물 세포 숙주 시스템 형질감염의 일반적인 측면은 미국 특허 번호 4,399,216에 기재되어 있다. 효모로의 형질전환은 전형적으로 문헌 [Van Solingen et al., J. Bact., 130:946 (1977)] 및 [Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979)]의 방법에 따라 수행된다. 그러나, DNA를 세포에 도입하기 위한 다른 방법, 예를 들어 핵 미세주입, 전기천공, 무손상 세포와 박테리아 원형질체의 융합, 또는 다가양이온, 예를 들어 폴리브렌, 폴리오르니틴에 의한 방법이 이용될 수도 있다. 포유동물 세포를 형질전환하는 다양한 기술에 대해서는 문헌 [Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)] 및 [Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988)]을 참조한다.

본원의 벡터에서 DNA를 클로닝하거나 발현시키기에 적합한 숙주 세포는 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포를 포함한다. 적합한 원핵생물은 유박테리움, 예컨대 그람-음성 또는 그람-양성 유기체, 예를 들어 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae), 예컨대 이. 콜라이를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 다양한 이. 콜라이 균주가 공개적으로 이용 가능하며, 예컨대 이. 콜라이 K12 균주 MM294 (ATCC 31,446); 이. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537); 이. 콜라이 균주 W3110 (ATCC 27,325) 및 K5 772 (ATCC 53,635)가 있다. 다른 적합한 원핵 숙주 세포는 엔테로박테리아세아에, 예컨대 에스케리키아(Escherichia), 예를 들어 이. 콜라이, 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 클레브시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예를 들어, 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예를 들어, 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans) 및 시겔라(Shigella), 뿐만 아니라 바실루스(Bacilli), 예컨대 비. 서브틸리스(B. subtilis) 및 비. 리케니포르미스(B. licheniformis) (예를 들어, 1989년 4월 12일자로 공개된 DD 266,710에 개시되어 있는 비. 리케니포르미스(B. licheniformis) 41P), 슈도모나스(Pseudomonas), 예컨대 피. 아에루기노사(P. aeruginosa) 및 스트렙토미세스(Streptomyces)를 포함한다. 이러한 예는 제한적이기 보다는 예시적인 것이다. 균주 W3110이 재조합 DNA 생성물 발효를 위한 통상적인 숙주 균주이기 때문에, 특히 바람직한 숙주 또는 모 숙주이다. 바람직하게는, 숙주 세포는 최소량의 단백질분해 효소를 분비한다. 예를 들어, 균주 W3110을 변형시켜 숙주에 내인성인 단백질을 코딩하는 유전자에서 유전자 돌연변이를 유발할 수 있으며, 이러한 숙주의 예로는 완전한 유전자형 tonA를 갖는 이.콜라이 W3110 균주 1A2; 완전한 유전자형 tonA ptr3을 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 9E4; 완전한 유전자형 tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT kan^r을 갖는 이.콜라이 W3110 균주 27C7 (ATCC 55,244); 완전한 유전자형 tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kan^r을 갖는 이.콜라이 W3110 균주 37D6; 비-카나마이신 내성 degP 결실 돌연변이를 갖는 균주 37D6인 이.콜라이 W3110 균주 40B4; 및 돌연변이체 주변세포질 프로테아제를 갖는 이.콜라이 균주 (1990년 8월 7일자로 공개된 미국 특허 번호 4,946,783에 개시됨)가 포함된다. 대안적으로, 시험관내 클로닝 방법, 예를 들어 PCR 또는 다른 핵산 폴리머라제 반응이 적합하다.

전장 항체, 항체 단편 및 항체 융합 단백질은 특히 글리코실화 및 Fc 이펙터 기능이 필요하지 않는 경우, 예컨대 치료 항체가 세포독성제 (예를 들어 독소)에 접합되고 면역접합체 자체가 종양 세포 파괴에 효과를 나타내는 경우에 박테리아에서 생성될 수 있다. 전장 항체는 순환 반감기가 더 길다. 이. 콜라이에서의 생성은 보다 신속하고 보다 비용 효율적이다. 항체 단편 및 폴리펩티드를 박테리아에서 발현시키는 경우에는, 예를 들어 발현 및 분비를 최적화하기 위한 번역 개시 영역 (TIR) 및 신호 서열이 기재되어 있는 U.S. 5,648,237 (Carter et. al.), U.S. 5,789,199 (Joly et al.) 및 U.S. 5,840,523 (Simmons et al.) (이들 특허는 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 발현 후에, 항체를 가용성 분획물 중의 이. 콜라이 세포 페이스트로부터 단리하고, 예를 들어 이소형에 따라 단백질 A 또는 G 칼럼을 통해 정제할 수 있다. 최종 정제는 예를 들어 CHO 세포 내에서 발현된 항체를 정제하는 방법과 유사하게 수행될 수 있다.

원핵생물 뿐만이 아니라 진핵 미생물, 예를 들어 사상 진균 또는 효모 역시 항체- 또는 폴리펩티드-코딩 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)는 통상적으로 사용되는 보다 낮은 진핵 숙주 미생물이다. 기타 미생물에는 스키조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) (문헌 [Beach and Nurse, Nature. 290:140 [1981]]; EP 139,383 (1985년 5월 2일 공개)); 클루이베로미세스(Kluyveromyces) 숙주 (미국 특허 번호 4,943,529; 문헌 [Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)]), 예를 들어, 케이. 락티스(K. lactis) (MW98-8C, CBS683, CBS4574; 문헌 [Louvencourt et al., J. Bacteriol., 154(2):737-742 [1983]]), 케이. 프라길리스(K. fragilis) (ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스(K. bulgaricus) (ATCC 16,045), 케이. 위케라미이(K. wickeramii) (ATCC 24,178), 케이. 왈티이(K. waltii) (ATCC 56,500), 케이. 드라소필라룸(K. drosophilarum) (ATCC 36,906; 문헌 [Van den Berg et al., Bio/Technology, 8:135 (1990)]), 케이. 테르모톨레란스(K. Thermotolerans), 및 케이. 마르시아누스(K. marxianus); 야로위아(yarrowia) (EP 402,226); 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) (EP 183,070; 문헌 [Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28:265-278 [1988]]); 칸디다(Candida); 트리코데르마 리시아(Trichoderma reesia) (EP 244,234); 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa) (문헌 [Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 [1979]]); 슈완니오미세스(Schwanniomyces) 예컨대 슈완니오미세스 오시덴탈리스(Schanniomyces occidentalis) (EP 394,538 (1990년 10월 31일 공개)); 및 사상 진균, 예를 들어, 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium) (WO 91/00357 (1991년 1월 10일 공개)), 및 아스페르길루스(Aspergillus) 숙주 예컨대 에이. 니둘란스(A. nidulans) (문헌 [Ballance et al., Biochem. Biophvs. Res. Commun., 112:284-289 [1983]]; [Tilburn et al., Gene, 26:205-221 [1983]]; [Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]]) 및 에이. 니게르(A. niger) (문헌 [Kelly and Hynes, EMBO J., 4:475-479 [1985]])가 포함된다. 메틸영양요구성 효모가 본원에서 적합하고, 한세눌라(Hansenula), 칸디다, 클로에케라(Kloeckera), 피치아, 사카로미세스, 토룰롭시스(Torulopsis) 및 로도토룰라(Rhodotorula)로 이루어진 속으로부터 선택된, 메탄올에서 성장할 수 있는 효모를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이러한 클래스의 효모의 예시적인 특정 종의 목록은 문헌 [C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)]에서 찾아볼 수 있다.

글리코실화된 항체 또는 폴리펩티드의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 곤충 세포, 예컨대 드로소필라(Drosophila) S2 및 스포도프테라(Spodoptera) Sf9 뿐만 아니라, 식물 세포, 예컨대 면화, 옥수수, 감자, 대두, 페튜니아, 토마토 및 담배의 세포 배양물을 포함한다. 수많은 바큘로바이러스 균주 및 변이체, 및 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) (쐐기벌레), 아에데스 아에집티(Aedes aegypti) (모기), 아에데스 알보픽투스(Aedes albopictus) (모기), 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster) (과실파리) 및 봄빅스 모리(Bombyx mori)와 같은 숙주로부터의 상응하는 허용성 곤충 숙주 세포가 확인된 바 있다. 다양한 형질감염용 바이러스 균주, 예를 들어 아우토그라파 칼리포르니카(Autographa californica) NPV의 L-1 변이체, 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주가 공개적으로 입수가능하고, 이같은 바이러스들은, 특히 스포도프테라 프루기페르다 세포의 형질감염을 위해, 본 발명에 따라 본원에서 바이러스로 사용될 수 있다.

그러나, 관심은 척추동물 세포에서 가장 컸으며, 배양물 (조직 배양물)에서의 척추동물 세포의 증식이 일상적인 절차가 되었다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주 (293 또는 현탁 배양 하에 성장하도록 서브클로닝된 293 세포, 문헌 [Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)]); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, 문헌 [Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)]); 마우스 세르톨리 세포 (TM4, 문헌 [Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)]); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 (문헌 [Mather et al., Annals N. Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)]); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간종양 세포주 (Hep G2)이다.

숙주 세포를 상기 기재된 항체 또는 폴리펩티드 생산을 위한 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환시킨 다음, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선택하거나, 목적하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키기 위해 적절하게 변형시킨 통상의 영양 배지에서 배양시킨다.

3. 복제가능한 벡터의 선택 및 사용

항체 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 (예를 들어, cDNA 또는 게놈 DNA)은 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위해 복제가능한 벡터 내로 삽입될 수 있다. 다양한 벡터가 공개적으로 이용가능하다. 벡터는, 예를 들어 플라스미드, 코스미드, 바이러스 입자 또는 파지의 형태일 수 있다. 적절한 핵산 서열을 다양한 절차를 통해 벡터에 삽입할 수 있다. 일반적으로, 당업계 공지의 기술을 이용하여, DNA를 적절한 제한 엔도뉴클레아제 부위(들)에 삽입한다. 벡터 성분은 일반적으로 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열 중 하나 이상을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이들 성분 중 하나 이상을 함유하는 적합한 벡터의 구축은 당업자에게 공지된 표준 라이게이션 기술을 이용한다.

폴리펩티드는 직접적으로, 뿐만 아니라 신호 서열, 또는 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특이적 절단 부위를 갖는 다른 폴리펩티드일 수 있는 이종성 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드로서 재조합 방식으로 생산할 수 있다. 일반적으로, 신호 서열은 벡터의 성분일 수 있거나, 또는 벡터 내로 삽입되는 항체- 또는 폴리펩티드-코딩 DNA의 일부일 수 있다. 신호 서열은 예를 들어 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, lpp, 또는 열-안정성 장독소 II 리더의 군으로부터 선택된 원핵생물 신호 서열일 수 있다. 효모 분비를 위해, 신호 서열은 예를 들어 효모 인버타제 리더, 알파 인자 리더 (사카로미세스 및 미국 특허 번호 5,010,182에 기재된 클루이베로미세스 α-인자 리더 포함) 또는 산 포스파타제 리더, 씨. 알비칸스(C. albicans) 글루코아밀라제 리더 (1990년 4월 4일자로 공개된 EP 362,179) 또는 WO 90/13646 (1990년 11월 15일 공개)에 기재된 신호일 수 있다. 포유동물 세포 발현시에, 포유동물 신호 서열, 예컨대 동일 또는 관련 종의 분비된 폴리펩티드로부터의 신호 서열 뿐만 아니라 바이러스 분비 리더가 단백질의 분비를 지시하는데 사용될 수 있다.

발현 벡터 및 클로닝 벡터는 둘 다 벡터가 하나 이상의 선택된 숙주 세포 내에서 복제될 수 있게 하는 핵산 서열을 함유한다. 이러한 서열은 다양한 박테리아, 효모 및 바이러스에 대해 널리 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기점은 대부분의 그람-음성 박테리아에 적합하고, 2μ 플라스미드 기점은 효모에 적합하며, 다양한 바이러스 기점 (SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)은 포유동물 세포에서의 클로닝 벡터에 유용하다.

발현 및 클로닝 벡터는 전형적으로 선택이능한 마커라고도 불리는 선택 유전자를 함유할 것이다. 전형적인 선택 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라시클린에 대한 내성을 부여하거나, (b) 영양요구성 결핍을 보완하거나, 또는 (c) 복합 배지로부터 얻을 수 없는 중요 영양분을 공급하는 단백질을 코딩하고, 예를 들어 바실루스의 경우에는 D-알라닌 라세마제를 코딩하는 유전자이다.

포유동물 세포에 대한 적절한 선택 마커의 예는 항체- 또는 폴리펩티드-코딩 핵산을 받아들이는데 적격인 세포의 확인을 가능하게 하는 것, 예컨대 DHFR 또는 티미딘 키나제이다. 야생형 DHFR을 사용할 때 적절한 숙주 세포는 문헌 [Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)]에 기재된 바와 같이 제조하여 증식시킨, DHFR 활성이 결여된 CHO 세포주이다. 효모에서 사용하기 적합한 선택 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1 유전자이다 (문헌 [Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)]; [Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979)]; [Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)]). trp1 유전자는 트립토판 내에서 성장하는 능력이 결여된 효모의 돌연변이체 균주, 예를 들어 ATCC 번호 44076 또는 PEP4-1에 대한 선택 마커를 제공한다 (문헌 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)]).

발현 및 클로닝 벡터는 대체로 mRNA 합성을 지시하도록 항체- 또는 폴리펩티드-코딩 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 다양한 잠재적인 숙주 세포에 의해 인식되는 프로모터는 공지되어 있다. 원핵생물 숙주와 사용하기에 적절한 프로모터로는 β-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템 (문헌 [Chang et al., Nature, 275:615 (1978)]; [Goeddel et al., Nature. 281:544 (1979)]), 알칼리성 포스파타제, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템 (문헌 [Goeddel, Nucleic acids Res., 8:4057 (1980)]; EP 36,776), 및 하이브리드 프로모터 예컨대 tac 프로모터 (문헌 [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80:21-25 (1983)])가 포함된다. 박테리아 시스템에 사용하기 위한 프로모터는 또한 항체 또는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가노 (S.D.)서열도 함유할 것이다.

효모 숙주와 함께 사용하기에 적합한 프로모터 서열의 예는 3-포스포글리세레이트 키나제 (문헌 [Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)]) 또는 다른 당분해 효소 (문헌 [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968)]; [Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)]), 예컨대 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카르복실라제, 포스포프럭토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제 및 글루코키나제에 대한 프로모터를 포함한다.

성장 조건에 의해 제어되는 전사의 추가의 이점을 갖는 유도성 프로모터인 다른 효모 프로모터는 알콜 데히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사와 관련된 분해 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 및 말토스 및 갈락토스 이용을 담당하는 효소에 대한 프로모터 영역이다. 효모 발현에 사용하기에 적합한 벡터 및 프로모터는 EP 73,657에 추가로 기재되어 있다.

포유동물 숙주 세포에서 벡터로부터의 항체 또는 폴리펩티드 전사는 예를 들어 바이러스, 예컨대 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스 (1989년 7월 5일자로 공개된 UK 2,211,504), 아데노바이러스 (예를 들어 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 시토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 원숭이 바이러스 40 (SV40)의 게놈에서 얻은 프로모터, 이종 포유동물 프로모터, 예를 들어 액틴 프로모터 또는 이뮤노글로불린 프로모터, 및 열 충격 프로모터 (단, 이러한 프로모터가 숙주 세포 시스템과 상용가능한 경우)에 의해 제어된다.

보다 고등한 진핵생물에 의한 항체 또는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 전사는 인핸서 서열을 벡터 내로 삽입함으로써 증가시킬 수 있다. 인핸서는 해당 DNA의 전사가 증가되도록 프로모터에 작용하는, 통상적으로 약 10 내지 300 bp인 DNA의 시스-작용(cis-acting) 요소이다. 많은 인핸서 서열이 현재 포유동물 유전자 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-태아단백질 및 인슐린)로부터 공지되어 있다. 그러나, 전형적으로는 진핵 세포 바이러스로부터의 인핸서를 사용할 것이다. 이것의 예는 복제 기점의 하류 쪽 (bp 100-270)의 SV40 인핸서, 시토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점 하류 쪽의 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 인핸서는 항체 또는 폴리펩티드 코딩 서열의 위치 5' 또는 3'에서 벡터 내로 스플라이싱될 수 있지만, 바람직하게는 프로모터로부터 5'의 부위에 위치한다.

진핵 숙주 세포 (효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간, 또는 다른 다세포 유기체로부터의 유핵 세포)에 사용되는 발현 벡터 역시 전사의 종결 및 mRNA의 안정화에 필요한 서열을 함유할 것이다. 이러한 서열은 진핵 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및 때때로 3' 비번역 영역으로부터 흔히 이용가능하다. 이들 영역은 항체 또는 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA의 비번역 부분 내의 폴리아데닐화 단편으로서 전사된 뉴클레오티드 절편을 함유한다.

재조합 척추동물 세포 배양물에서 항체 또는 폴리펩티드의 합성에 이용하기에 적합한 다른 방법, 벡터 및 숙주 세포는 문헌 [Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981)], [Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979)], EP 117,060 및 EP 117,058에 기재되어 있다.

4. 숙주 세포의 배양

본 발명의 항체 또는 폴리펩티드를 생성하는데 사용되는 숙주 세포는 다양한 배지 중에서 배양될 수 있다. 시판 배지, 예컨대 햄 F10 (시그마(Sigma)), 최소 필수 배지 (MEM) (시그마), RPMI-1640 (시그마) 및 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM) (시그마)가 숙주 세포의 배양에 적합하다. 또한, 문헌 [Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979)], [Barnes et al., Anal. Biochem.102:255 (1980)], 미국 특허 번호 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; 또는 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국 특허 등록 30,985에 기재되어 있는 임의의 배지를 숙주 세포를 위한 배양 배지로서 사용할 수 있다. 임의의 이들 배지에는 필요에 따라 호르몬 및/또는 다른 성장 인자 (예컨대 인슐린, 트랜스페린 또는 표피 성장 인자), 염 (예컨대 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충제 (예컨대 HEPES), 뉴클레오티드 (예컨대 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예컨대 겐타마이신(GENTAMYCIN)™ 약물), 미량 원소 (통상적으로 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로서 정의됨) 및 글루코스 또는 등가의 에너지원이 보충될 수 있다. 또한, 임의의 다른 필요한 보충물을 당업자에게 공지된 적절한 농도로 포함시킬 수도 있다. 배양 조건, 예컨대 온도, pH 등은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 이전에 이용된 것이고, 당업자에게 명백할 것이다.

5. 유전자 증폭/발현의 검출

유전자 증폭 및/또는 발현은 예를 들어 본원에 제시된 서열을 기초로 하여, mRNA의 전사를 정량하는 통상적인 서던 블로팅, 노던 블로팅 (문헌 [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:5201-5205 (1980)]), 도트 블로팅 (DNA 분석), 또는 적절하게 표지된 프로브를 사용한 계내 혼성화에 의해 샘플 내에서 직접 측정할 수 있다. 대안적으로, DNA 듀플렉스, RNA 듀플렉스, 및 DNA-RNA 하이브리드 듀플렉스 또는 DNA-단백질 듀플렉스를 포함한 특정 듀플렉스를 인식할 수 있는 항체를 사용할 수 있다. 다시, 항체를 표지할 수 있고, 듀플렉스가 표면에 결합하는 검정을 수행하여, 표면 상에 듀플렉스가 형성되었을 때 듀플렉스에 결합된 항체의 존재가 검출될 수 있도록 할 수 있다.

대안적으로 유전자 발현은 유전자 생성물의 발현을 직접적으로 정량화하기 위해, 면역학적 방법, 예컨대 세포 또는 조직 절편의 면역조직화학 염색 및 세포 배양물 또는 체액의 검정에 의해 측정될 수 있다. 면역조직화학 염색 및/또는 샘플 유체의 검정에 유용한 항체는 모노클로날이거나 폴리클로날일 수 있고, 임의의 포유동물에서 제조될 수 있다. 편리하게는, 항체는 천연 서열 폴리펩티드에 대항하여, 또는 본원에 제공된 DNA 서열에 기반한 합성 펩티드에 대항하여, 또는 폴리펩티드 DNA에 융합되고 특이적 항체 에피토프를 코딩하는 외인성 서열에 대항하여 제조할 수 있다.

6. 항체 및 폴리펩티드의 정제

항체 및 폴리펩티드의 형태물을 배양 배지로부터 또는 숙주 세포 용해물로부터 회수할 수 있다. 막 결합형인 경우에는, 적합한 세제 용액 (예를 들어, 트리톤(Triton)-X 100)을 사용하거나 효소적 절단에 의해 이것을 막으로부터 방출시킬 수 있다. 항체 및 폴리펩티드의 발현에 사용되는 세포는 다양한 물리적 또는 화학적 수단, 예컨대 동결-해동 주기, 초음파처리, 기계적 파괴 또는 세포 용해제에 의해 파괴할 수 있다.

재조합 세포 단백질 또는 폴리펩티드로부터 항체 및 폴리펩티드를 정제하는 것이 바람직할 수 있다. 하기 절차는 적합한 정제 절차의 예시이다: 이온-교환 칼럼 상에서의 분획화; 에탄올 침전; 역상 HPLC; 실리카 또는 양이온-교환 수지, 예컨대 DEAE 상에서의 크로마토그래피; 크로마토포커싱; SDS-PAGE; 황산암모늄 침전; 예를 들어 세파덱스 G-75를 사용하는 겔 여과; 오염물, 예컨대 IgG를 제거하기 위한 단백질 A 세파로스 칼럼; 및 항체 및 폴리펩티드의 에피토프-태그 부착된 형태에 결합하기 위한 금속 킬레이팅 칼럼. 다양한 단백질 정제 방법을 이용할 수 있고, 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990)]; [Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)]에 기재되어 있다. 선택되는 정제 단계(들)은 예를 들어 이용된 생성 공정의 성질, 및 생성된 특정 항체 또는 폴리펩티드에 따라 결정될 것이다.

재조합 기술을 이용하는 경우, 항체는 세포 내에서 또는 주변세포질 공간 내에서 생성될 수 있거나, 또는 배지로 직접 분비될 수 있다. 항체가 세포 내에서 생성되는 경우, 제1 단계로서 입자형 잔해인 숙주 세포 또는 용해된 단편을 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거하였다. 문헌 [Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]에는 이. 콜라이의 주변세포질 공간에 분비되는 항체를 단리하는 절차가 기재되어 있다. 간략하게 설명하면, 세포 페이스트를 아세트산나트륨 (pH 3.5), EDTA 및 페닐메틸술포닐플루오라이드 (PMSF)의 존재하에 약 30분에 걸쳐 해동시킨다. 세포 잔해는 원심분리로 제거할 수 있다. 항체가 배지로 분비되는 경우, 일반적으로는 우선 이러한 발현 시스템으로부터의 상청액을 시판되는 단백질 농축 필터, 예를 들어 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘(Millipore Pellicon) 한외여과 장치를 사용하여 농축시킨다. 단백질분해를 억제하기 위해 프로테아제 억제제, 예컨대 PMSF를 임의의 이전 단계에 포함시킬 수 있고, 우발적인 오염물의 성장을 방지하기 위해 항생제를 포함시킬 수 있다.

세포로부터 제조된 항체 조성물은, 예를 들어 히드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 및 친화도 크로마토그래피를 이용하여 정제할 수 있는데, 친화도 크로마토그래피가 바람직한 정제 기술이다. 친화성 리간드로서의 단백질 A의 적합성은 종 및 항체 내에 존재하는 임의의 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 이소형에 따라 달라진다. 단백질 A를 사용하여 인간 γ1, γ2 또는 γ4 중쇄를 기초로 하는 항체를 정제할 수 있다 (문헌 [Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)]). 단백질 G는 모든 마우스 이소형 및 인간 γ3에 대해 권장된다 (문헌 [Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)]). 친화성 리간드가 부착되는 매트릭스는 가장 흔하게는 아가로스이지만, 다른 매트릭스도 이용가능하다. 기계적으로 안정한 매트릭스, 예컨대 공극이 제어된 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠은 아가로스로 달성할 수 있는 것보다 더 빠른 유량 및 더 짧은 프로세싱 시간을 가능하게 한다. 항체가 C_H3 도메인을 포함하는 경우, 베이커본드(Bakerbond) ABX™수지 (제이. 티. 베이커(J. T. Baker), 뉴저지주 필립스버그)가 정제에 유용하다. 회수할 항체에 따라, 단백질 정제를 위한 다른 기술, 예컨대 이온-교환 칼럼에서의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카에서의 크로마토그래피, 헤파린 세파로스™에서의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 (예를 들어, 폴리아스파르트산 칼럼)에서의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE 및 황산암모늄 침전이 또한 이용될 수도 있다.

임의의 예비 정제 단계(들) 후에, 관심 대상 항체 및 오염물을 포함하는 혼합물에 대해 pH 약 2.5-4.5의 용리 완충제를 사용하는, 바람직하게는 낮은 염 농도 (예를 들어 약 0 내지 0.25 M 염)에서 수행되는 낮은 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피를 실시할 수 있다.

I. 제약 제제

본 발명에 따라 사용되는 항체, 결합 올리고펩티드, 결합 유기 또는 무기 소분자 및/또는 폴리펩티드의 치료 제제는 목적하는 순도를 갖는 항체, 폴리펩티드, 올리고펩티드 또는 유기/무기 소분자를 임의의 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제 (문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)])와 혼합하여 동결건조된 제제 또는 수용액의 형태로 보관을 위해 제조된다. 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 무독성이고, 완충제, 예를 들어 아세테이트, 트리스, 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제 (예를 들어 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레솔); 저분자량 (약 10개 미만 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라진, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드 및 다른 탄수화물, 예컨대 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 등장화제, 예컨대 트레할로스 및 염화나트륨; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 계면활성제, 예컨대 폴리소르베이트; 염-형성 반대이온, 예를 들어 나트륨; 금속 착체 (예를 들어 Zn-단백질 착체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예를 들어 트윈®, 플루로닉스® 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다. 제제는 항체를 5 내지 200 mg/mL, 바람직하게는 10 내지 100 mg/mL의 농도로 포함할 수 있다.

본원의 제제는 또한 치료할 특정 적응증에 필요한 경우에는 1종 초과의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 유해한 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 화합물을 함유할 수 있다. 예를 들어, 항체, 결합 올리고펩티드, 또는 결합 유기 또는 무기 소분자에 이외에도, 하나의 제제 내에, 추가의 항체, 예를 들어, 상기 폴리펩티드 상의 상이한 에피토프에 결합하는 제2 항체, 또는 특정 암의 성장에 영향을 미치는 성장 인자와 같은 일부 다른 표적에 대한 항체를 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 상기 조성물은 화학요법제, 세포독성제, 시토카인, 성장 억제제, 항-호르몬제 및/또는 심장보호제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 분자는 의도된 목적에 유효한 양으로 조합되어 적합하게 존재한다.

활성 성분은 또한 예를 들어 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에, 또는 매크로에멀젼에 포획될 수 있다. 이같은 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.

지속-방출 제제를 제조할 수 있다. 지속-방출 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 소수성 고체 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 상기 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐 형태이다. 지속 방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 번호 3,773,919), L-글루탐산 및 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 루프론 데포(LUPRON DEPOT)™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 이루어진 주사가능한 마이크로스피어), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다.

생체내 투여에 사용될 제제는 멸균되어야 한다. 이는 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다.

J. 항체, 결합 올리고펩티드 및 결합 유기/무기 소분자로의 치료

암에서 폴리펩티드 (헵신 및/또는 MSP) 발현을 측정하기 위해, 다양한 검출 검정이 이용 가능하다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드 과다발현은 면역조직화학 (IHC)에 의해 분석할 수 있다. 종양 생검으로부터 파라핀 포매 조직 절편을 IHC 검정에 적용하고, 다음과 같이 폴리펩티드 염색 강도 기준을 부여할 수 있다:

스코어 0 - 염색이 관찰되지 않거나, 10％ 미만의 종양 세포에서 막 염색이 관찰됨.

스코어 1+ - 희미한/거의 지각할 수 없는 막 염색이 10％ 초과의 종양 세포에서 검출됨. 세포는 단지 그의 막의 일부에서만 염색된다.

스코어 2+ - 약한 내지 중간 정도의 완전한 막 염색이 10％ 초과의 종양 세포에서 관찰됨.

스코어 3+ - 중간 정도 내지 강력한 정도의 완전한 막 염색이 10％ 초과의 종양 세포에서 관찰됨.

폴리펩티드 발현에 대해 0 또는 1+ 스코어를 갖는 종양은 폴리펩티드를 과다발현하지 않는 것으로 특성화될 수 있는 반면, 2+ 또는 3+ 스코어를 갖는 종양은 폴리펩티드를 과다발현하는 것으로 특성화될 수 있다.

대안적으로 또는 추가로, FISH 검정, 예컨대 인폼(INFORM)® (벤타나(Ventana) (아리조나주)에 의해 시판됨) 또는 파트비젼(PATHVISION)® (비시스(Vysis), 일리노이주)을 포르말린-고정되고 파라핀-매립된 종양 조직에 대해 수행하여, 종양에서 폴리펩티드 과다발현 (존재하는 경우)의 정도를 결정할 수 있다.

폴리펩티드 과다발현 또는 증폭은 예를 들어 검출할 분자에 결합하고 검출가능한 표지 (예를 들어, 방사성 동위원소 또는 형광 표지)로 태깅된 분자 (예를 들어 항체, 올리고펩티드 또는 유기 소분자)를 투여하고 표지의 위치 결정을 위해 환자를 외부에서 스캐닝함으로써 생체내 검출 검정을 사용하여 평가할 수 있다.

상기한 바와 같이, 본 발명의 항체, 올리고펩티드 및 유기/무기 소분자는 다양한 비-치료 용도를 갖는다. 본 발명의 항체, 올리고펩티드 및 유기/무기 소분자는 폴리펩티드-발현 암의 병기 결정에 (예를 들어, 방사선촬영에서) 유용할 수 있다. 항체, 올리고펩티드 및 유기/무기 소분자는 또한 세포로부터 폴리펩티드의 정제 또는 면역침전을 위해, 시험관내, 예를 들어 ELISA 또는 웨스턴 블롯에서 폴리펩티드의 검출 및 정량화를 위해, 다른 세포의 정제에서 하나의 단계로서 혼합된 세포의 집단으로부터 폴리펩티드-발현 세포를 사멸 및 제거하기 위해 유용하다.

현재, 암의 단계에 따라, 암 치료는 하기 요법 중 하나 또는 조합을 수반한다: 암성 조직의 제거 수술, 방사선 요법 및 화학요법. 항체, 올리고펩티드 또는 유기/무기 소분자 요법은 화학요법의 독성 및 부작용을 잘 견디지 못하는 노인 환자에서, 및 방사선 요법의 유용성이 제한적인 전이성 질환에서 특히 바람직할 수 있다. 본 발명의 종양 표적화 항체, 올리고펩티드 및 유기/무기 소분자는 질환의 초기 진단시에 또는 재발 동안 폴리펩티드-발현 암을 완화시키는데 유용하다. 치료 용도를 위해, 항체, 올리고펩티드 또는 유기/무기 소분자는 단독으로 사용될 수 있거나, 또는 예를 들어 호르몬, 항혈관신생제 또는 방사능표지된 화합물과 조합되어 사용될 수 있거나, 또는 수술, 저온요법 및/또는 방사선 요법과 조합되어 사용될 수 있다. 항체, 올리고펩티드 또는 유기/무기 소분자 치료제는 다른 형태의 통상적인 요법과 함께, 통상의 요법과 연속적으로 또는 통상의 요법 이전 또는 이후에 투여될 수 있다. 화학요법 약물, 예를 들어 탁소테레® (도세탁셀), 탁솔® (파클리탁셀), 에스트라무스틴 및 미톡산트론은 특히 저위험군 환자에서 암을 치료하는데 사용된다. 암을 치료 또는 완화하기 위한 본 발명의 방법에서, 암 환자에게 항체, 올리고펩티드 또는 유기/무기 소분자를 하나 이상의 상기한 화학요법제를 사용한 치료와 함께 투여할 수 있다. 특히, 파클리탁셀 및 변형된 유도체를 사용한 조합 요법 (예를 들어 EP0600517 참조)이 고려된다. 항체, 올리고펩티드 또는 유기/무기 소분자는 치료 유효 용량의 화학요법제와 함께 투여될 것이다. 또 다른 실시양태에서, 항체, 올리고펩티드 또는 유기/무기 소분자는 화학요법제와 함께 투여되어, 화학요법제 예를 들어 파클리탁셀의 활성 및 효능을 증진시킨다. 문헌 [Physicians' Desk Reference (PDR)]은 다양한 암의 치료에 사용되었던 이들 작용제의 용량을 개시한다. 이들 언급된 화학요법 약물의 치료 효과적인 투약법 및 용량은 치료할 특정 암, 질환의 정도 및 당업계 전문의가 잘 알고 있는 기타 인자에 따라 달라질 것이고, 전문의가 결정할 수 있다.

한 특정 실시양태에서, 세포독성제에 접합된 항체, 올리고펩티드 또는 유기/무기 소분자를 포함하는 접합체가 환자에게 투여된다. 바람직하게는, 단백질에 결합된 면역접합체는 세포에 의해 내재화되어, 이것이 결합하는 암 세포를 사멸시키는데 있어서 면역접합체의 치료 효능을 증가시킨다. 바람직한 실시양태에서, 세포독성제는 암 세포에서 핵산을 표적으로 하거나 방해한다. 이러한 세포독성제의 예는 상기 기재되어 있고, 메이탄시노이드, 칼리케아미신, 리보뉴클레아제 및 DNA 엔도뉴클레아제를 포함한다.

항체, 올리고펩티드, 유기/무기 소분자 또는 이들의 독소 접합체는 인간 환자에게 공지의 방법에 따라, 예컨대 볼루스로서 예를 들어 정맥내 투여되거나, 또는 일정 기간에 걸친 연속 주입에 의해, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활액막내, 경막내, 경구, 국소 또는 흡입 경로에 의해 투여된다. 항체, 올리고펩티드 또는 유기/무기 소분자의 정맥내 또는 피하 투여가 바람직하다.

다른 치료 요법이 항체, 올리고펩티드 또는 유기/무기 소분자의 투여와 조합될 수 있다. 조합 투여는 별개의 제제 또는 단일 제약 제제를 사용하는 동시 투여, 및 임의의 순서로의 연속 투여를 포함하고, 이때 바람직하게는 둘 모두의 (또는 모든) 활성제가 이들의 생물학적 활성을 동시에 발휘하는 일정 기간이 존재한다. 바람직하게는 이러한 조합 요법은 상승작용적 치료 효과를 야기한다.

항체 또는 항체들, 올리고펩티드 또는 유기/무기 소분자의 투여를 특정 암과 관련이 있는 또 다른 종양 항원에 대해 지정된 항체의 투여와 조합하는 것이 또한 바람직할 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 치유적 치료 방법은 항체 (또는 항체들), 올리고펩티드 또는 유기/무기 소분자 및 1종 이상의 화학요법제 또는 성장 억제제의 조합 투여 (상이한 화학요법제들의 칵테일의 동시 투여를 포함함)를 포함한다. 화학요법제는 에스트라무스틴 포스페이트, 프레드니무스틴, 시스플라틴, 5-플루오로우라실, 멜팔란, 시클로포스파미드, 히드록시우레아 및 히드록시우레아탁산 (예를 들어 파클리탁셀 및 도세탁셀) 및/또는 안트라시클린 항생제를 포함한다. 이러한 화학요법제에 대한 제조 및 투여 스케줄은 제조업체의 지침에 따라 또는 숙련된 진료의가 경험적으로 결정하는 바에 따라 이용될 수 있다. 또한, 상기 화학치료제의 제조 및 투여 계획은 문헌 [Chemotherapy Service Ed., M. C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992)]에 기재되어 있다.

항체, 올리고펩티드 또는 유기/무기 소분자는 항-호르몬 화합물; 예를 들어 항-에스트로겐 화합물, 예를 들어 타목시펜; 항-프로게스테론, 예컨대 오나프리스톤 (EP 616 812 참조); 또는 항-안드로겐, 예를 들어 플루타미드와 이러한 분자에 대해 공지된 용량으로 조합될 수 있다. 치료할 암이 안드로겐에 비-의존적인 암인 경우에, 환자는 항-안드로겐 요법을 미리 받았을 수 있고, 암이 안드로겐에 비-의존적으로 된 후에 항체, 올리고펩티드 또는 유기/무기 소분자 (및 임의로는 본원에 기재된 바와 같은 다른 작용제)를 상기 환자에게 투여할 수 있다.

때로는, 또한 심장보호제 (요법과 관련이 있는 심근 기능이상을 예방 또는 감소시키기 위해서임) 또는 1종 이상의 시토카인을 환자에게 동시 투여하는 것이 유익할 수 있다. 상기 치료 요법에 추가하여, 환자에게 항체, 올리고펩티드 또는 유기/무기 소분자 요법 이전에, 그와 동시에 또는 그 이후에 암 세포의 수술 제거 및/또는 방사선 요법을 실시할 수 있다. 상기 동시 투여되는 임의의 작용제에 대한 적합한 투여량은 현재 사용되고 있는 양이고, 상기 작용제와 항체, 올리고펩티드 또는 유기/무기 소분자의 조합 작용 (상승작용)으로 인해 낮춰질 수 있다.

질환의 예방 또는 치료를 위해, 투여량 및 투여 방식은 공지된 기준에 따라 전문의가 선택할 것이다. 항체, 올리고펩티드 또는 유기/무기 소분자의 적절한 투여량은 상기 규정한 바와 같은 치료할 질환의 유형, 질환의 중증도 및 과정, 항체, 올리고펩티드 또는 유기/무기 소분자가 예방 목적으로 투여되는지 치료 목적으로 투여되는지 여부, 선행 요법, 환자의 임상력 및 항체, 올리고펩티드 또는 유기/무기 소분자에 대한 반응, 및 담당의의 판단에 따라 결정될 것이다. 항체, 올리고펩티드 또는 유기/무기 소분자는 환자에게 적합하게는 1회 또는 일련의 치료에 걸쳐 투여된다. 바람직하게는, 항체, 올리고펩티드 또는 유기/무기 소분자는 정맥내 주입 또는 피하 주사에 의해 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라, 예를 들어 1회 이상의 별개 투여에 의해서든 연속 주입에 의해서든 약 1 ㎍/kg 내지 약 50 mg/kg 체중 (예를 들어 약 0.1-15 mg/kg/용량)의 항체가 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 투여 요법은 항체를 약 4 mg/kg의 초기 부하 용량으로 투여한 후에 약 2 mg/kg씩의 항체를 매주 유지 용량으로 투여하는 것을 포함한다. 그러나, 다른 투여 요법이 유용할 수 있다. 전형적인 1일 용량은 상기 언급된 인자에 따라 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 또는 그보다 높은 값의 범위일 수 있다. 수일 이상에 걸친 반복 투여의 경우, 상태에 따라 목적하는 질환 증상이 억제될 때까지 치료를 지속한다. 이러한 요법의 진행은 통상의 방법 및 검정을 이용하고 전문의 또는 다른 당업자에게 공지되어 있는 기준에 기초하여 쉽게 모니터링될 수 있다.

항체 단백질을 환자에 투여하는 것 이외에도, 본 명세서는 유전자 요법에 의한 항체의 투여를 고려한다. 항체를 코딩하는 핵산의 그러한 투여는 표현 "치료 유효량의 항체의 투여"에 포함된다. 세포내 항체를 생성하기 위한 유전자 요법의 사용에 관해서는 예를 들어, 1996년 3월 14일자로 공개된 WO96/07321을 참조한다.

핵산 (임의로 벡터에 함유된 것)을 생체내 및 생체외에서 환자의 세포에 도입하기 위한 2가지 주요 접근법이 존재한다. 생체내 전달의 경우, 핵산은 통상적으로 항체가 필요한 부위에서 환자에게 직접 주사된다. 생체외 치료의 경우, 환자의 세포를 떼어내고, 핵산을 이들 단리된 세포에 도입하고, 변형된 세포를 직접 또는 예를 들어 환자에게 이식되는 다공성 막 내에 캡슐화시켜 환자에게 투여한다 (예를 들어 미국 특허 번호 4,892,538 및 5,283,187 참조). 핵산을 살아있는 세포에 도입하는 다양한 기술이 이용가능하다. 이러한 기술은 핵산이 배양된 세포로 시험관내 전달되는지 또는 의도된 숙주의 세포로 생체내 전달되는지에 따라 달라진다. 핵산을 포유동물 세포로 시험관내 전달하는데 적합한 기술은 리포솜, 전기천공, 미세주사, 세포 융합, DEAE-덱스트란, 인산칼슘 침전 방법 등의 이용을 포함한다. 유전자의 생체외 전달에 통상적으로 사용되는 벡터는 레트로바이러스 벡터이다.

현재 바람직한 생체내 핵산 전달 기술은 바이러스 벡터 (예컨대 아데노바이러스, 제I형 단순 포진 바이러스 또는 아데노-관련 바이러스) 및 지질-기재의 시스템 (유전자의 지질 매개 전달에 유용한 지질은 예를 들어 DOTMA, DOPE 및 DC-Chol임)을 사용한 형질감염을 포함한다. 현재 공지된 유전자 표지 및 유전자 요법 프로토콜에 관한 검토는 [Anderson et al., Science 256:808-813 (1992)]을 참조한다. 또한 WO 93/25673 및 여기에 인용된 참고문헌을 참조한다.

본 발명의 항체는 본원에서의 "항체"의 정의에 포함되는 여러가지 형태일 수 있다. 따라서, 상기 항체는 전장 또는 무손상 항체, 항체 단편, 천연 서열 항체 또는 아미노산 변이체, 인간화, 키메라 또는 융합 항체, 면역접합체, 및 이들의 기능적 단편을 포함한다. 융합 항체에서, 항체 서열은 이종 폴리펩티드 서열에 융합된다. 항체는 원하는 이펙터 기능이 제공되도록 Fc 영역에서 변형될 수 있다. 본원의 섹션에서 더욱 상세하게 논의된 바와 같이, 세포 표면에 결합된 네이키드 항체는 적절한 Fc 영역을 사용하여 예를 들어 항체-의존적 세포성 세포독성 (ADCC)을 통해 또는 보체-의존적 세포독성에서 보체를 동원함으로써, 또는 일부 다른 메카니즘에 의해 세포독성을 유도할 수 있다. 대안적으로, 부작용 또는 치료 합병증을 최소화하도록 이펙터 기능을 제거하거나 감소시키는 것이 바람직한 경우에는 특정 다른 Fc 영역을 사용할 수 있다.

한 실시양태에서, 항체는 본 발명의 항체와 동일한 에피토프에의 결합에 대해 경쟁하거나 그러한 에피토프에 실질적으로 결합한다. 본 발명의 항체의 생물학적 특징, 구체적으로는 예를 들어 생체내 종양 표적화 및 임의의 세포 증식 억제 또는 세포독성 특징을 갖는 항체가 또한 고려된다.

상기 항체의 생성 방법은 본원에 상세하게 기재되어 있다.

본 발명의 항체, 올리고펩티드 및 유기/무기 소분자는 포유동물에서 헵신 및/또는 MSP-발현 암을 치료하거나 상기 암의 하나 이상의 증상을 완화시키는데 유용하다. 본 발명의 방법은 이러한 암과 관련된 전이성 종양의 치료 및/또는 그의 증상의 완화에서의 길항제의 유용성을 포함한다. 상기 항체, 올리고펩티드 또는 유기/무기 소분자는 포유동물에서 폴리펩티드(들) (헵신 및/또는 MSP)를 발현하는 암 세포의 적어도 일부에 결합할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항체, 올리고펩티드 또는 유기/무기 소분자는 폴리펩티드에 결합시에 시험관내 또는 생체내에서 폴리펩티드-발현 및/또는 -반응성 종양 세포를 파괴하거나 사멸시키는 데, 또는 그러한 종양 세포의 성장을 억제하는 데 효과적이다. 이러한 항체는 네이키드 항체 (임의의 작용제에 접합되지 않은 것)를 포함한다. 세포독성 또는 다른 억제 특성을 갖는 네이키드 항체에는 종양 세포 파괴에서 이것을 훨씬 더 강력하게 하는 세포독성제를 추가로 포함시킬 수 있다. 세포독성 특성은 예를 들어 항체를 세포독성제와 접합시켜서 본원에 기재된 바와 같은 면역접합체를 형성함으로써 항체에 부여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포독성제 또는 성장 억제제가 소분자이다. 일부 실시양태에서, 독소, 예컨대 칼리케아미신 또는 메이탄시노이드 및 그의 유사체 또는 유도체가 사용된다.

본 발명은 본 발명의 항체, 올리고펩티드 또는 유기/무기 소분자, 및 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 암 치료 목적을 위해, 상기 조성물은 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 투여될 수 있고, 이때의 조성물은 면역접합체 또는 네이키드 항체로서 존재하는 1종 이상의 항체를 포함할 수 있다. 추가의 실시양태에서, 상기 조성물은 이들 항체, 올리고펩티드 또는 유기/무기 소분자를 다른 치료제, 예를 들어 세포독성제 또는 성장 억제제, 예컨대 화학요법제와 조합하여 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 항체, 올리고펩티드 또는 유기/무기 소분자, 및 담체를 포함하는 제제를 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 제제는 제약상 허용되는 담체를 포함하는 치료 제제이다.

본 발명의 또 다른 측면은 항체를 코딩하는 단리된 핵산이다. 천연 서열 항체, 뿐만 아니라 상기 항체의 변이체, 변형체 및 인간화 버전을 코딩하는 쇄인 H 및 L 쇄 둘 모두, 특히 초가변 영역 잔기를 코딩하는 핵산이 포함된다.

본 발명은 또한 포유동물에게 치료 유효량의 항체, 올리고펩티드 또는 유기/무기 소분자를 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 암을 치료하거나 상기 암의 하나 이상의 증상을 완화시키는데 유용한 방법을 제공한다. 항체, 올리고펩티드 또는 유기/무기 소분자 치료 조성물은 전문의의 지시에 따라 단기 (급성) 또는 장기 또는 간헐적으로 투여될 수 있다. 또한, 폴리펩티드 (헵신 및/또는 MSP)-발현 및/또는 -반응성 세포의 성장을 억제하고, 이를 사멸시키는 방법도 제공된다.

본 발명은 또한 하나 이상의 항체, 올리고펩티드 또는 유기/무기 소분자를 함유하는 키트 및 제조품을 제공한다. 항체, 올리고펩티드 또는 유기/무기 소분자를 함유하는 키트는, 예를 들어 세포 사멸 검정, 종양 세포 침습 억제, 및 세포로부터 폴리펩티드의 정제 또는 면역침전에 유용하다. 예를 들어, 폴리펩티드의 단리 및 정제를 위해, 상기 키트는 비드 (예를 들어 세파로스 비드)에 커플링된 항체, 올리고펩티드 또는 유기/무기 소분자를 함유할 수 있다. 시험관내에서, 예를 들어 ELISA 또는 웨스턴 블롯에서 폴리펩티드를 검출하고 정량화하기 위해서 항체, 올리고펩티드 또는 유기/무기 소분자를 함유하는 키트가 제공될 수 있다. 검출에 유용한 이러한 항체, 올리고펩티드 또는 유기/무기 소분자는 표지, 예컨대 형광 또는 방사능표지와 함께 제공될 수 있다.

K. 제조품 및 키트

본 발명의 또 다른 실시양태는 폴리펩티드 (헵신 및/또는 MSP)를 발현하는 암, 예컨대 전립선암 및 난소암의 치료에 유용한 물질을 함유하는 제조품이다. 제조품은 용기, 및 용기상에 있거나 용기와 결합된 라벨 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알, 시린지 등을 포함한다. 용기는 다양한 물질, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로 형성될 수 있다. 용기는 암 상태의 치료에 효과적인 조성물을 보유하고, 멸균 입구를 가질 수 있다 (예를 들어 용기는 정맥내 용액 백 또는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 바이알일 수 있음). 조성물의 하나 이상의 활성제는 본 발명의 항체, 올리고펩티드 또는 유기/무기 소분자이다. 라벨 또는 포장 삽입물은 상기 조성물이 암의 치료에 사용됨을 나타낸다. 라벨 또는 포장 삽입물은 암 환자에게 항체, 올리고펩티드 또는 유기/무기 소분자 조성물을 투여하는 것에 대한 지침서를 추가로 포함할 것이다. 추가로, 제품은 제약상 허용되는 완충액, 예컨대 정균 주사용수 (BWFI), 인산염 완충 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 용기를 더 포함할 수 있다. 이것은 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질, 예를 들어 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 시린지를 추가로 포함할 수 있다.

다양한 목적, 예를 들어 폴리펩티드-발현 또는 세포 사멸 검정, 세포로부터 폴리펩티드의 정제 또는 면역침전에 유용한 키트가 또한 제공된다. 폴리펩티드의 단리 및 정제를 위해, 상기 키트는 비드 (예를 들어 세파로스 비드)에 커플링된 항체, 올리고펩티드 또는 유기/무기 소분자를 함유할 수 있다. 시험관내에서, 예를 들어 ELISA 또는 웨스턴 블롯에서 폴리펩티드를 검출하고 정량화하기 위해서 항체, 올리고펩티드 또는 유기/무기 소분자를 함유하는 키트가 제공될 수 있다. 제품과 마찬가지로, 키트는 용기, 및 용기 상의 또는 용기와 결합된 라벨 또는 포장 삽입물을 포함한다. 용기는 본 발명의 1종 이상의 항체, 올리고펩티드 또는 유기/무기 소분자를 포함하는 조성물을 보유한다. 예를 들어 희석제 및 완충액, 대조군 항체를 함유하는 추가의 용기가 포함될 수 있다. 표지 또는 패키지 삽입물은 당해 조성물에 관한 설명 뿐만 아니라 의도된 시험관내 또는 검출 용도에 관한 지시 사항을 제공할 수 있다.

L. 폴리펩티드 및 폴리펩티드-코딩 핵산 - 특정 형태 및 용도

본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (또는 그의 보체)은 분자 생물학의 당업계에서의 다양한 용도, 뿐만 아니라 요법 등에서의 용도를 갖는다. 폴리펩티드 코딩 핵산은 또한 본원에 기재된 재조합 기술에 의한 폴리펩티드의 제조에 유용할 것이고, 여기서 이들 폴리펩티드는 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 항체의 제조에 유용할 수 있다.

전장 천연 서열 폴리펩티드 유전자 또는 그의 일부는 본원에 개시된 천연 폴리펩티드 서열에 원하는 서열 동일성을 갖는 다른 cDNA (예를 들어, 폴리펩티드의 천연 발생 변이체 또는 다른 종으로부터의 폴리펩티드를 코딩하는 것)를 단리하는데 있어서 cDNA 라이브러리에 대한 혼성화 프로브로서 사용될 수 있다. 임의로, 프로브는 약 20개 내지 약 50개 염기의 길이일 것이다. 혼성화 프로브는 과도한 실험 없이 결정될 수 있는, 전장 천연 뉴클레오티드 서열의 적어도 부분적으로 신규한 영역 또는 천연 서열 폴리펩티드의 프로모터, 인핸서 요소 및 인트론을 포함하는 게놈 서열로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 스크리닝 방법은 공지의 DNA 서열을 사용하여 폴리펩티드 유전자의 코딩 영역을 단리함으로써 약 40개 염기의 선택된 프로브를 합성하는 단계를 포함할 것이다. 혼성화 프로브는 ³²P 또는 ³⁵S와 같은 방사선뉴클레오티드, 또는 아비딘/바이오틴 커플링 시스템을 통해 상기 프로브에 커플링된 알칼리성 포스파타제와 같은 효소 표지를 비롯한 다양한 표지로 표지될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드 유전자의 서열에 상보적인 서열을 갖는 표지된 프로브를 사용하여 인간 cDNA, 게놈 DNA 또는 mRNA의 라이브러리를 스크리닝함으로써 이러한 라이브러리 중에서 상기 프로브가 혼성화되는 구성원을 결정할 수 있다. 혼성화 기술은 하기 실시예에 더욱 상세하게 기재되어 있다. 본원에 개시된 방법을 이용하여, 본원에 개시된 임의의 EST 서열을 프로브로서 유사하게 사용할 수 있다.

폴리펩티드 코딩 핵산의 다른 유용한 단편은 표적 폴리펩티드 mRNA (센스) 또는 폴리펩티드 DNA (안티센스) 서열에 결합할 수 있는 단일-가닥 핵산 서열 (RNA 또는 DNA)을 포함하는 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명에 따르면, 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드는 본원에 기재된 바와 같은 헵신, 프로-MSP 또는 결합 단편을 코딩하는 DNA의 코딩 영역의 단편을 포함한다. 이러한 단편은 일반적으로 약 14개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 14개 내지 30개의 뉴클레오티드를 포함한다. 소정의 단백질을 코딩하는 cDNA 서열을 기초로 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드를 유도하는 능력이, 예를 들어, 문헌 [Stein and Cohen, Cancer Res. 48:2659, 1988] 및 [van der Krol et al., BioTechniques, 6:958, 1988]에 기술되어 있다.

안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드와 표적 핵산 서열의 결합은 이중나선의 형성을 야기하고, 이것은 이중나선의 분해 증진, 전사 또는 번역의 조기 종결을 비롯한 여러가지 수단 중 하나 또는 기타 수단에 의해 표적 서열의 전사 또는 번역을 차단한다. 이러한 방법은 본 발명에 포함된다. 따라서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 포유동물에서 암을 유도하는데 있어서 소정의 역할을 수행할 수 있는 단백질의 발현을 차단하는데 사용될 수 있다. 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드는 변형된 당-포스포디에스테르 백본 (또는 다른 당 연결부, 예컨대 WO 91/06629에 기재된 것)를 갖는 올리고뉴클레오티드를 추가로 포함하며, 여기서 이러한 당 연결부는 내인성 뉴클레아제에 내성이 있다. 내성이 있는 당 연결부를 갖는 이러한 올리고뉴클레오티드는 생체내 안정적이지만 (즉, 효소 분해에 대해 내성을 가질 수 있음), 표적 뉴클레오티드 서열에 결합할 수 있는 서열 특이성을 보유한다.

안티센스 결합에 바람직한 유전자내 부위는 유전자의 오픈 리딩 프레임 (ORF)의 번역 개시/출발 코돈 (5'-AUG/5'-ATG) 또는 종결/정지 코돈 (5'-UAA, 5'-UAG 및 5-UGA/5'-TAA, 5'-TAG 및 5'-TGA)이 혼입된 영역을 포함한다. 이러한 영역은 번역 개시 또는 종결 코돈으로부터 어느 한쪽 방향 (즉, 5' 또는 3')으로의 약 25개 내지 약 50개의 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 mRNA 또는 유전자의 일부를 지칭한다. 안티센스 결합에 바람직한 다른 영역은 다음을 포함한다: 인트론; 엑손; 인트론-엑손 접합부; 번역 개시 코돈과 번역 종결 코돈 사이의 영역인 오픈 리딩 프레임 (ORF) 또는 "코딩 영역"; 5'-5' 트리포스페이트 연결부를 통해 mRNA의 가장 5'쪽의 잔기에 연결된 N7-메틸화 구아노신 잔기를 포함하고, 5' 캡 구조 자체 뿐만 아니라 상기 캡에 인접한 최초 50개의 뉴클레오티드를 포함하는 mRNA의 5' 캡; 번역 개시 코돈으로부터 5' 방향이고, 따라서 mRNA의 5' 캡 부위와 번역 개시 코돈 사이의 뉴클레오티드 또는 유전자상의 상응하는 뉴클레오티드를 포함하는 mRNA의 일부인 5' 비번역 영역 (5'UTR); 및 번역 종결 코돈으로부터 3' 방향이고, 따라서 mRNA의 번역 종결 코돈과 3' 말단 사이의 뉴클레오티드 또는 유전자상의 상응하는 뉴클레오티드를 포함하는 mRNA의 일부인 3' 비번역 영역 (3'UTR).

폴리펩티드의 발현 억제에 유용한 바람직한 안티센스 화합물의 구체적인 예는 변형된 백본 또는 비-천연 뉴클레오시드간 연결부를 함유하는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 변형된 백본을 갖는 올리고뉴클레오티드는 백본 내에 인 원자를 보유하는 것들 및 백본 내에 인 원자를 갖지 않는 것들을 포함한다. 본 명세서의 목적상, 및 당업계에서 종종 언급되는 바와 같이, 뉴클레오시드간 백본에 인 원자를 갖지 않는 변형된 올리고뉴클레오티드 역시 올리고뉴클레오시드인 것으로 간주될 수 있다. 바람직한 변형된 올리고뉴클레오티드 백본은 예를 들어 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 메틸 및 다른 알킬 포스포네이트, 예를 들어 3'-알킬렌 포스포네이트, 5'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트, 포스피네이트, 포스포르아미데이트, 예를 들어 3'-아미노 포스포르아미데이트 및 아미노알킬포스포르아미데이트, 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 통상의 3'-5' 연결부를 갖는 셀레노포스페이트 및 보라노-포스페이트, 이들의 2'-5' 연결 유사체, 및 1개 이상의 뉴클레오티드간 연결부가 3'-3', 5'-5' 또는 2'-2' 연결부인, 역극성을 갖는 것을 포함한다. 역극성을 갖는 바람직한 올리고뉴클레오티드는 가장 3'쪽의 뉴클레오티드간 연결부에서의 단일 3'-3' 연결부, 즉, 염기가 소실될 수 있는 (핵염기가 소실되거나 그 대신에 히드록실기를 가짐) 단일의 역전된 뉴클레오시드 잔기를 포함한다. 다양한 염, 혼합 염 및 유리 산 형태 역시 포함된다. 인-함유 연결부의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허로는 미국 특허 번호 3,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5,177,196; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496; 5,455,233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,306; 5,550,111; 5,563,253; 5,571,799; 5,587,361; 5,194,599; 5,565,555; 5,527,899; 5,721,218; 5,672,697 및 5,625,050 (각각 본원에 참조로 포함됨)이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.

인 원자를 내부에 포함하지 않는 바람직한 변형된 올리고뉴클레오티드 백본은 단쇄 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오티시드간 연결부, 혼합 헤테로원자 및 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오시드간 연결부, 또는 1개 이상의 단쇄 헤테로원자 또는 헤테로시클릭 뉴클레오시드간 연결부에 의해 형성된 백본을 갖는다. 이들은 모르폴리노 연결부 (뉴클레오시드의 당 부분으로부터 부분적으로 형성됨)를 갖는 것들; 실록산 백본; 술피드, 술폭시드 및 술폰 백본; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 백본; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 백본; 리보아세틸 백본; 알켄 함유 백본; 술파메이트 백본; 메틸렌이미노 및 메틸렌히드라지노 백본; 술포네이트 및 술폰아미드 백본; 아미드 백본; 및 혼합된 N, O, S 및 CH₂ 성분 부분을 갖는 기타 백본을 포함한다. 이같은 올리고뉴클레오시드의 제조가 교시된 대표적인 미국 특허로는 미국 특허 번호 5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,264,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677; 5,541,307; 5,561,225; 5,596,086; 5,602,240; 5,610,289; 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437; 5,792,608; 5,646,269 및 5,677,439 (각각 본원에 참조로 포함됨)가 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다.

다른 바람직한 안티센스 올리고뉴클레오티드에서, 뉴클레오티드 단위의 당 및 뉴클레오시드간 연결부 둘다, 즉 백본은 새로운 기로 대체된다. 염기 단위는 적절한 핵산 표적 화합물과의 혼성화를 위해 유지된다. 우수한 혼성화 특성을 갖는 것으로 나타난 올리고뉴클레오티드 모방체인 이러한 올리고머 화합물은 펩티드 핵산 (PNA)이라 지칭된다. PNA 화합물에서, 올리고뉴클레오티드의 당-백본은 특정 아미노에틸글리신 백본에서 아미드 함유 백본으로 대체된다. 핵염기는 보유되고, 백본 아미드 부분의 아자 질소 원자에 직접 또는 간접적으로 결합된다. PNA 화합물의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 미국 특허 번호 5,539,082, 5,714,331 및 5,719,262 (각각 본원에 참조로 포함됨)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. PNA 화합물의 추가적인 교시를 [Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500]에서 확인할 수 있다.

바람직한 안티센스 올리고뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 백본 및/또는 헤테로원자 백본, 특히 상기 언급된 미국 특허 번호 5,489,677에 기재된 -CH₂-NH-O-CH₂-, -CH₂-N(CH₃)-O-CH₂- [메틸렌 (메틸이미노) 또는 MMI 백본으로 공지됨], -CH₂-O-N(CH₃)-CH₂-, -CH₂-N(CH₃)-N(CH₃)-CH₂- 및 -O-N(CH₃)-CH₂-CH₂- [여기서, 천연 포스포디에스테르 백본은 -O-P-O-CH₂-로 표시됨], 및 상기 언급된 미국 특허 번호 5,602,240의 아미드 백본을 포함한다. 또한, 미국 특허 5,034,506의 모르폴리노 백본 구조를 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 바람직하다.

변형된 올리고뉴클레오티드는 또한 1개 이상의 치환된 당 모이어티를 함유할 수 있다. 바람직한 올리고뉴클레오티드는 2' 위치에서 다음 중 하나를 포함한다: OH; F; O-알킬, S-알킬 또는 N-알킬; O-알케닐, S-알케닐 또는 N-알케닐; O-알키닐, S-알키닐 또는 N-알키닐; 또는 O-알킬-O-알킬 (여기서, 알킬, 알케닐 및 알키닐은 치환되거나 치환되지 않은 C₁ 내지 C₁₀ 알킬 또는 C₂ 내지 C₁₀ 알케닐 및 알키닐일 수 있음). O[(CH₂)_nO]_mCH₃, O(CH₂)_nOCH₃, O(CH₂)_nNH₂, O(CH₂)_nCH₃, O(CH₂)_nONH₂, 및 O(CH₂)_nON[(CH₂)_nCH₃)]₂ (여기서, n 및 m은 1 내지 약 10임)이 특히 바람직하다. 다른 바람직한 안티센스 올리고뉴클레오티드는 2' 위치에서 다음 중 하나를 포함한다: C₁ 내지 C₁₀ 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알케닐, 알키닐, 알크아릴, 아르알킬, O-알크아릴 또는 O-아르알킬, SH, SCH₃, OCN, Cl, Br, CN, CF₃, OCF₃, SOCH₃, SO₂, CH₃, ONO₂, NO₂, N₃, NH₂, 헤테로시클로알킬, 헤테로시클로알크아릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실릴, RNA 절단기, 리포터기, 인터칼레이터, 올리고뉴클레오티드의 약력학적 특성을 개선시키는 기, 또는 올리고뉴클레오티드의 약동학적 특성을 개선시키는 기, 및 유사한 특성을 갖는 기타 치환기. 바람직한 변형은 2'-메톡시에톡시 (2'-O-CH₂CH₂OCH₃, 2'-O-(2-메톡시에틸) 또는 2'-MOE로도 알려짐) (문헌 [Martin et al., Helv. Chim. Acta., 1995, 78, 486-504]), 즉 알콕시알콕시기를 포함한다. 추가의 바람직한 변형은 2'-디메틸아미노옥시에톡시, 즉, 하기 실시예에 기재된 바와 같은 2'-DMAOE라고도 공지된 O(CH₂)₂ON(CH₃)₂ 기, 및 2'-디메틸아미노에톡시에톡시 (당업계에서 2'-O-디메틸아미노에톡시에틸 또는 2'-DMAEOE라고도 공지되어 있음), 즉, 2'-O-CH₂-O-CH₂-N(CH₂)를 포함한다.

추가의 바람직한 변형은 2'-히드록실기가 당 고리의 3' 또는 4' 탄소 원자에 연결되어 비시클릭 당 모이어티를 형성한 잠금 핵산 (LNA)을 포함한다. 상기 연결부는 바람직하게는 2' 산소 원자 및 4' 탄소 원자를 가교시키는 메틸렌 (-CH₂-)_n기 (여기서, n은 1 또는 2임)이다. LNA 및 그의 제법은 WO 98/39352 및 WO 99/14226에 기재되어 있다.

다른 바람직한 변형은 2'-메톡시 (2'-O-CH₃), 2'-아미노프로폭시 (2'-OCH₂CH₂CH₂NH₂), 2'-알릴 (2'-CH₂-CH=CH₂), 2'-O-알릴 (2'-O-CH₂-CH=CH₂) 및 2'-플루오로 (2'-F)를 포함한다. 2'-변형은 아라비노 (상부) 위치 또는 리보 (하부) 위치에 있을 수 있다. 바람직한 2'-아라비노 변형은 2'-F이다. 또한, 유사한 변형이 올리고뉴클레오티드 상의 다른 위치에서, 특히 3' 말단 뉴클레오티드 상의 당 또는 2'-5' 연결된 올리고뉴클레오티드에서의 3' 위치에서, 및 5' 말단 뉴클레오티드의 5' 위치에서도 이루어질 수 있다. 또한, 올리고뉴클레오티드는 펜토푸라노실 당 대신에 당 모방체, 예컨대 시클로부틸 모이어티를 가질 수 있다. 이러한 변형된 당 구조의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허로는 미국 특허 번호 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633; 5,792,747; 및 5,700,920 (각각 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.

올리고뉴클레오티드는 핵염기 (당업계에서 간단히 "염기"로 종종 지칭됨) 변형 또는 치환을 또한 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 "변형되지 않은" 또는 "천연" 핵염기에는 퓨린 염기인 아데닌 (A) 및 구아닌 (G), 및 피리미딘 염기인 티미딘 (T), 시토신 (C) 및 우라실 (U)이 포함된다. 변형된 핵염기는 다른 합성 및 천연 핵염기, 예컨대 5-메틸시토신 (5-me-C), 5-히드록시메틸 시토신, 크산틴, 하이포크산틴, 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸 및 다른 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 다른 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로우라실 및 시토신, 5-프로피닐 (-C≡C-CH₃ 또는 -CH₂-C≡CH) 우라실 및 시토신 및 피리미딘 염기의 다른 알키닐 유도체, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실 (슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-히드록실 및 다른 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로, 특히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 다른 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 2-F-아데닌, 2-아미노-아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌을 포함한다. 추가적인 변형된 핵염기에는 3고리형 피리미딘 예컨대 페녹사진 시티딘 (1H-피리미도[5,4-b][1,4]벤족사진-2(3H)-온), 페노티아진 시티딘 (1H-피리미도[5,4-b][1,4]벤조티아진-2(3H)-온), G-클램프, 예컨대 치환된 페녹사진 시티딘 (예를 들어 9-(2-아미노에톡시)-H-피리미도[5,4-b][1,4]벤족사진-2(3H)-온), 카르바졸 시티딘 (2H-피리미도[4,5-b]인돌-2-온), 피리도인돌 시티딘 (H-피리도[3',2':4,5]피롤로[2,3-d]피리미딘-2-온)이 포함된다. 변형된 핵염기는 또한 퓨린 또는 피리미딘 염기가 다른 헤테로시클로 대체된 것들, 예를 들어 7-데아자-아데닌, 7-데아자구아노신, 2-아미노피리딘 및 2-피리돈을 포함할 수도 있다. 추가적인 핵염기에는 미국 특허 번호 3,687,808에 개시된 것들, 문헌 [The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990]에 개시된 것들, 및 문헌 [Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613]에 개시된 것들이 포함된다. 이들 핵염기 중 일부는 본 발명의 올리고머 화합물의 결합 친화도를 증가시키는데 특히 유용하다. 이들에는 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린, 예를 들어 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신이 포함된다. 5-메틸시토신 치환은 핵산 이중나선 안정성을 0.6℃ 내지 1.2℃만큼 증가시키는 것으로 나타났고 (문헌 [Sanghvi et al., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278]), 이것은 바람직한 염기 치환이며, 훨씬 더욱 특히 2'-O-메톡시에틸 당 변형과 조합될 때 바람직한 염기 치환이다. 변형된 핵 염기의 제조가 교시된 대표적인 미국 특허에는 미국 특허 번호 3,687,808, 뿐만 아니라 미국 특허 번호 4,845,205; 5,130,302; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121, 5,596,091; 5,614,617; 5,645,985; 5,830,653; 5,763,588; 6,005,096; 5,681,941 및 5,750,692 (각각 본원에 참조로 포함됨)가 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다.

안티센스 올리고뉴클레오티드의 또 다른 변형은 상기 올리고뉴클레오티드에 이것의 활성, 세포 분포 또는 세포 흡수를 증진시키는 1개 이상의 모이어티 또는 접합체를 화학적으로 연결시키는 것이다. 본 발명의 화합물은 관능기, 예컨대 1급 또는 2급 히드록실기에 공유 결합된 접합체 기를 포함할 수 있다. 본 발명의 접합체 기는 인터칼레이터, 리포터 분자, 폴리아민, 폴리아미드, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에테르, 올리고머의 약동학적 특성을 증진시키는 기, 및 올리고머의 약력학적 특성을 증진시키는 기를 포함한다. 전형적인 접합체 기는 콜레스테롤, 지질, 양이온 지질, 인지질, 양이온성 인지질, 바이오틴, 페나진, 폴레이트, 페난트리딘, 안트라퀴논, 아크리딘, 플루오로세인, 로다민, 쿠마린 및 염료를 포함한다. 본 발명의 내용에서, 약동학적 특성을 증진시키는 기는 올리고머 흡수를 개선시키고/시키거나, 분해에 대한 올리고머 내성을 증진시키고/시키거나, RNA와의 서열-특이적 혼성화를 강화시키는 기를 포함한다. 본 발명의 내용에서, 약력학적 특성을 증진시키는 기는 올리고머 흡수, 분포, 대사 또는 배출을 개선시키는 기를 포함한다. 접합체 모이어티에는 지질 모이어티 예컨대 콜레스테롤 모이어티 (문헌 [Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556]), 콜산 (문헌 [Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060]), 티오에테르, 예를 들어, 헥실-S-트리틸티올 (문헌 [Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309]; [Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770]), 티오콜레스테롤 (문헌 [Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538]), 지방족 쇄, 예를 들어, 도데칸디올 또는 운데실 잔기 (문헌 [Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 1111-1118]; [Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330]; [Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-54]), 인지질, 예를 들어, 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸-암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트 (문헌 [Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654]; [Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783]), 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 쇄 (문헌 [Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973]), 또는 아다만탄 아세트산 (문헌 [Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654]), 팔미틸 모이어티 (문헌 [Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237]), 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카르보닐-옥시콜레스테롤 모이어티가 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 활성 약물 물질, 예를 들어 아스피린, 와르파린, 페닐부타존, 이부프로펜, 수프로펜, 펜부펜, 케토프로펜, (S)-(+)-프라노프로펜, 카르프로펜, 단실사르코신, 2,3,5-트리아이오도벤조산, 플루페남산, 폴린산, 벤조티아디아지드, 클로로티아지드, 디아제핀, 인도메티신, 바르비투레이트, 세팔로스포린, 술파 약물, 항-당뇨병제, 항균제 또는 항생제에 접합될 수도 있다. 올리고뉴클레오티드-약물 접합체 및 그의 제조가 미국 특허 출원 일련 번호 09/334,130 (1999년 6월 15일 출원) 및 미국 특허 출원 번호 4,828,979; 4,948,882; 5,218,105; 5,525,465; 5,541,313; 5,545,730; 5,552,538; 5,578,717, 5,580,731; 5,580,731; 5,591,584; 5,109,124; 5,118,802; 5,138,045; 5,414,077; 5,486,603; 5,512,439; 5,578,718; 5,608,046; 4,587,044; 4,605,735; 4,667,025; 4,762,779; 4,789,737; 4,824,941; 4,835,263; 4,876,335; 4,904,582; 4,958,013; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,245,022; 5,254,469; 5,258,506; 5,262,536; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098; 5,371,241, 5,391,723; 5,416,203, 5,451,463; 5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5,565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923; 5,599,928 및 5,688,941 (각각 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.

주어진 화합물의 모든 위치가 균일하게 변형될 필요는 없고, 사실상 1개 초과의 상기 언급된 변형이 단일 화합물 또는 심지어 올리고뉴클레오티드 내의 단일 뉴클레오시드에 도입될 수 있다. 본 발명은 또한 키메라 화합물인 안티센스 화합물도 포함한다. "키메라" 안티센스 화합물 또는 "키메라"는, 본 발명의 정황에서, 각각 1개 이상의 단량체 단위 (즉 올리뉴클레오티드 화합물의 경우에는 뉴클레오티드)로 이루어진 2개 이상의 화학적으로 상이한 영역을 함유하는 안티센스 화합물, 특히 올리고뉴클레오티드이다. 전형적으로, 이들 올리고뉴클레오티드는, 뉴클레아제 분해에 대한 증가된 내성, 증가된 세포 흡수 및/또는 표적 핵산에 대한 증가된 결합 친화도가 올리고뉴클레오티드에게 부여되도록 올리고뉴클레오티드가 변형된 1개 이상의 영역을 함유한다. 올리고뉴클레오티드의 추가의 영역은 RNA:DNA 또는 RNA:RNA 하이브리드를 절단할 수 있는 효소에 대한 기질로서 작용할 수 있다. 예를 들어, RNase H는 RNA:DNA 이중나선의 RNA 가닥을 절단하는 세포성 엔도뉴클레아제이다. 따라서, RNase H의 활성화로 인해 RNA 표적이 절단되어 유전자 발현의 올리고뉴클레오티드 억제의 효율이 크게 증진된다. 결과적으로, 키메라 올리고뉴클레오티드가 사용되는 경우, 동일한 표적 영역에 혼성화되는 포스포로티오에이트 데옥시올리고뉴클레오티드와 비교할 때 더 짧은 올리고뉴클레오티드를 사용하여 유사한 결과가 종종 달성될 수 있다. 본 발명의 키메라 안티센스 화합물은 상기한 바와 같은 2개 이상의 올리고뉴클레오티드, 변형된 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오시드 및/또는 올리고뉴클레오티드 모방체의 복합 구조물로서 형성될 수 있다. 바람직한 키메라 안티센스 올리고뉴클레오티드에는 3' 말단에 뉴클레아제 내성을 부여하는 1개 이상의 2' 변형된 당 (바람직하게는 2'-O-(CH₂)₂-O-CH₃) 및 RNase H 활성을 부여하는 4개 이상의 인접한 2'-H 당이 혼입되어 있다. 이러한 화합물은 당업계에서 하이브리드 또는 갭머(gapmer)라고도 지칭된다. 바람직한 갭머는 4개 이상의 인접한 2'-H 당을 갖는 1개 이상의 영역에 의해 분리된 3'-말단 및 5' 말단에서 2' 변형된 당 (바람직하게는 2'-O-(CH₂)₂-O-CH₃)의 영역을 갖고, 바람직하게는 포스포로티오에이트 백본 연결부가 혼입되어 있다. 이러한 하이브리드 구조물의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허에는 미국 특허 번호 5,013,830; 5,149,797; 5,220,007; 5,256,775; 5,366,878; 5,403,711; 5,491,133; 5,565,350; 5,623,065; 5,652,355; 5,652,356; 및 5,700,922 (각각 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에 따라 사용되는 안티센스 화합물은 공지의 고체 상 합성 기술을 통해 편리하고 통상적으로 제조될 수 있다. 예를 들어 어플라이드 바이오시스템즈 (미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재)를 포함하는 여러 판매처에서 이러한 합성을 위한 장치를 시판한다. 당업계에 공지된 이러한 합성을 위한 임의의 다른 수단을 추가로 또는 대안적으로 사용할 수 있다. 올리고뉴클레오티드, 예컨대 포스포로티오에이트 및 알킬화된 유도체를 제조하는 유사한 기술을 이용하는 것이 공지되어 있다. 본 발명의 화합물은 또한 섭취, 분포 및/또는 흡수를 보조하기 위해 다른 분자, 분자 구조물 또는 화합물들의 혼합물, 예를 들어 리포솜, 수용체 표적화 분자, 경구, 직장, 국소 또는 기타 제제와 혼합되거나 이에 포획되거나 이와 접합되거나 또는 다른 방식으로 조합될 수도 있다. 이러한 섭취, 분포 및/또는 흡수 보조 제제의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허에는 미국 특허 번호 5,108,921; 5,354,844; 5,416,016; 5,459,127; 5,521,291; 5,543,158; 5,547,932; 5,583,020; 5,591,721; 4,426,330; 4,534,899; 5,013,556; 5,108,921; 5,213,804; 5,227,170; 5,264,221; 5,356,633; 5,395,619; 5,416,016; 5,417,978; 5,462,854; 5,469,854; 5,512,295; 5,527,528; 5,534,259; 5,543,152; 5,556,948; 5,580,575; 및 5,595,756 (각각 본원에 참조로 포함됨)이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.

센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 다른 예로는 유기 모이어티, 예를 들어, WO 90/10048에 기재된 모이어티, 및 표적 핵산 서열에 대한 올리고뉴클레오티드의 친화성을 증가시키는 다른 모이어티, 예를 들어, 폴리-(L-리신)과 공유결합적으로 연결된 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 있다. 추가로, 엘립티신과 같은 인터칼레이팅제, 및 알킬화제 또는 금속 착제를 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 부착시켜서 표적 뉴클레오티드 서열에 대한 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드의 결합 특이성을 변형시킬 수 있다.

안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 CaPO₄-매개 DNA 형질감염, 전기천공을 포함하는 임의의 유전자 전달 방법을 이용하거나 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스와 같은 유전자 전달 벡터를 사용함으로써 표적 핵산 서열을 함유하는 세포에 도입될 수 있다. 바람직한 절차에서, 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드를 적합한 레트로바이러스 벡터에 삽입한다. 표적 핵산 서열을 함유하는 세포를 생체내 또는 생체외에서 재조합 레트로바이러스 벡터와 접촉시킨다. 적합한 레트로바이러스 벡터는 뮤린 레트로바이러스 M-MuLV, N2 (M-MuLV로부터 유래된 레트로바이러스), 또는 DCT5A, DCT5B 및 DCT5C라고 지칭되는 이중 카피 벡터 (WO 90/13641 참조)로부터 유래된 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

또한, WO 91/04753에 기재된 바와 같이, 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 리간드 결합 분자와의 접합체 형성을 통해서 표적 뉴클레오티드 서열을 함유하는 세포에 도입할 수도 있다. 적합한 리간드 결합 분자는 세포 표면 수용체, 성장 인자, 다른 시토카인, 또는 세포 표면 수용체에 결합하는 다른 리간드를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 리간드 결합 분자의 접합은, 이것이 그의 상응하는 분자 또는 수용체에 결합하는 능력을 실질적으로 방해하지 않거나, 또는 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 그의 접합 버전의 세포로의 진입을 실질적으로 차단하지 않는다.

대안적으로, WO 90/10448에 기재된 바와 같이, 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 올리고뉴클레오티드-지질 복합체의 형성을 통해 표적 핵산 서열을 함유하는 세포에 도입할 수 있다. 이러한 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드-지질 복합체는 바람직하게는 세포내에서 내인성 리파제에 의해 해리된다.

안티센스 또는 센스 RNA 또는 DNA 분자는 일반적으로 적어도 약 5개 뉴클레오티드 길이, 대안적으로는 적어도 약 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990 또는 1000개 뉴클레오티드 길이이고, 이러한 내용에서 용어 "약"은 언급된 뉴클레오티드 서열 길이 ± 언급된 길이의 10％를 의미한다.

또한, 프로브를 PCR 기술에 사용하여 밀접하게 관련된 폴리펩티드 코딩 서열의 확인을 위한 서열 풀(pool)을 생성할 수도 있다.

폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 또한 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 맵핑 및 유전적 장애가 있는 개체의 유전자 분석을 위한 혼성화 프로브를 구축하는데 사용될 수 있다. 본원에서 제공되는 뉴클레오티드 서열은 계내 혼성화, 공지된 염색체 마커에 대한 연관성 분석, 및 라이브러리를 사용한 혼성화 스크리닝과 같은 공지의 기술을 이용하여 염색체 및 염색체의 특정 영역에 맵핑될 수 있다.

폴리펩티드는 폴리펩티드와의 결합 상호작용에 관련된 다른 단백질 또는 분자를 확인하기 위해 검정에 사용될 수 있다. 이러한 방법에 의해, 수용체/리간드 결합 상호작용의 억제제를 확인할 수 있다. 또한, 이러한 결합 상호작용에 관여하는 단백질을 사용하여 상기 결합 상호작용의 펩티드 또는 소분자 억제제를 스크리닝할 수도 있다. 스크리닝 검정은 천연 폴리펩티드 또는 폴리펩티드에 대한 수용체의 생물학적 활성을 모방하는 리드 화합물을 찾도록 설계될 수 있다. 이러한 스크리닝 검정은 화학적 라이브러리의 고처리량 스크리닝이 가능한 검정을 포함하여, 소분자 약물 후보를 확인하는데 특히 적합하다. 고려되는 소분자는 합성 유기 또는 무기 화합물을 포함한다. 검정은 당업계에 널리 특징규명되어 있는 다양한 포맷, 예를 들어 단백질-단백질 결합 검정, 생화학적 스크리닝 검정, 면역검정 및 세포-기재 검정으로 수행될 수 있다.

또한, 폴리펩티드 또는 그의 변형된 형태를 코딩하는 핵산을 사용하여 치료학적으로 유용한 시약의 개발 및 스크리닝에 유용한 트랜스제닉 동물 또는 "녹 아웃" 동물을 발생시킬 수 있다. 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 마우스 또는 래트)은 트랜스진을 함유하는 세포를 갖는 동물이고, 트랜스진은 태아기, 예를 들어 배아 단계에서 상기 동물 또는 상기 동물의 조상에 도입된다. 트랜스진은 세포의 게놈에 통합되는 DNA이며, 이 세포로부터 트랜스제닉 동물이 발생한다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA를 확립된 기술에 따라 사용하여 폴리펩티드를 코딩하는 게놈 DNA를 클로닝할 수 있고, 상기 게놈 서열을 사용하여 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 발현하는 세포를 함유하는 트랜스제닉 동물을 생성할 수 있다. 트랜스제닉 동물, 특히 마우스 또는 래트와 같은 동물을 생성하는 방법은 당업계에서 통상적인 것이 되었으며, 예를 들어 미국 특허 번호 4,736,866 및 4,870,009에 기재되어 있다. 전형적으로, 특정 세포가 조직 특이적 인핸서를 사용한 폴리펩티드 트랜스진 혼입의 표적이 된다. 배아 단계에서 동물의 배선에 도입된 폴리펩티드를 코딩하는 트랜스진의 카피를 포함하는 트랜스제닉 동물을 이용하여, 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 증가된 발현의 효과를 시험할 수 있다. 이러한 동물은, 예를 들어 폴리펩티드의 과다발현과 관련이 있는 병리 상태로부터의 보호를 제공할 것으로 여겨지는 시약에 대한 시험 동물로서 사용될 수 있다. 본 발명의 이러한 측면에 따라, 동물에게 상기 시약을 처리하고, 트랜스진을 보유하는 미처리 동물에 비해 병리 상태의 발생이 감소되는 것은 상기 병리 상태에 대한 잠재적인 치료적 개입을 나타낸다.

대안적으로, 폴리펩티드의 비-인간 상동체를 사용하여 폴리펩티드를 코딩하는 내인성 유전자와 이 동물의 배아 줄기세포에 도입된, 폴리펩티드를 코딩하는 변경된 게놈 DNA 사이의 상동성 재조합의 결과로서 폴리펩티드를 코딩하는 결함 또는 변형 유전자를 갖는 유전자 "녹 아웃" 동물을 구축할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA를 사용하여 확립된 기술에 따라 폴리펩티드를 코딩하는 게놈 DNA를 클로닝할 수 있다. 폴리펩티드를 코딩하는 게놈 DNA의 일부를 결실시키거나 이것을 또 다른 유전자, 예를 들어 통합을 모니터링하는데 사용될 수 있는 선택 마커를 코딩하는 유전자로 대체할 수 있다. 일반적으로, 수 킬로베이스의 비변형된 플랭킹 DNA (5' 및 3' 모두에)가 벡터에 포함된다 (예를 들어, 상동성 재조합 벡터에 대한 설명은 문헌 [Thomas and Capecchi, Cell, 51:503 (1987)] 참조). 상기 벡터는 배아줄기세포주 내로 (예를 들어 전기천공에 의해) 도입되고, 도입된 DNA가 내인성 DNA와 상동성 재조합된 세포를 선택한다 (예를 들어, 문헌 [Li et al., Cell, 69:915 (1992)] 참조). 이어서, 선택된 세포를 동물 (예를 들어, 마우스 또는 래트)의 배반포에 주입하여 응집 키메라를 형성한다 (예를 들어, 문헌 [Bradley, in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152] 참조). 이어서, 키메라 배아는 적합한 가임신 암컷 대리모 동물에 착상되고, 태아는 분만하여 "녹아웃" 동물을 생산할 수 있다. 생식 세포에 상동성 재조합된 DNA를 보유하는 자손을 표준 기술로 확인할 수 있고, 이것을 이용하여 모든 세포가 상동성 재조합된 DNA를 보유하는 동물을 번식시킬 수 있다. 녹아웃 동물은 예를 들어 특정 병태에 대해 방어하는 능력 및 폴리펩티드의 부재에 의한 병태 발생에 대해 특성화될 수 있다.

폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 또한 유전자 요법에도 사용될 수 있다. 유전자 요법 용도에서, 유전자는 예를 들어 결함 유전자를 대체하는 치료 효과적인 유전자 생성물의 생체내 합성을 달성하기 위하여 세포에 도입된다. "유전자 요법"은 단일 치료에 의해 지속적인 효과가 달성되는 통상적인 유전자 요법, 및 치료적으로 효과적인 DNA 또는 mRNA의 1회 또는 반복 투여가 수반되는 유전자 치료제의 투여 둘다를 포함한다. 안티센스 RNA 및 DNA를 생체내 특정 유전자의 발현 차단을 위한 치료제로서 사용할 수 있다. 짧은 안티센스 올리고뉴클레오티드는 세포 막에 의한 제한된 흡수로 인해 세포내 농도가 낮음에도 불구하고 세포에 도입될 수 있고 여기서 억제제로 작용한다는 것이 이미 확인된 바 있다. (문헌 [Zamecnik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4143-4146 [1986]]). 예를 들어, 음으로 대전된 포스포디에스테르기를 대전되지 않는 기로 치환함으로써 올리고뉴클레오티드를 변형시켜서 그의 흡수를 증진시킬 수 있다.

핵산을 살아있는 세포에 도입하는 다양한 기술이 이용가능하다. 이러한 기술은 핵산이 배양된 세포로 시험관내 전달되는지 또는 의도된 숙주의 세포로 생체내 전달되는지에 따라 달라진다. 핵산을 포유동물 세포로 시험관내 전달하는데 적합한 기술은 리포솜, 전기천공, 미세주사, 세포 융합, DEAE-덱스트란, 인산칼슘 침전 방법 등의 이용을 포함한다. 현재 바람직한 생체내 유전자 전달 기술은 바이러스 (일반적으로 레트로바이러스) 벡터를 사용한 형질감염 및 바이러스 코트 단백질-리포솜 매개된 형질감염을 포함한다 (문헌 [Dzau et al., Trends in Biotechnology 11, 205-210]). 일부 상황에서는, 표적 세포를 표적화하는 작용제, 예컨대 세포 표면 막 단백질 또는 표적 세포에 특이적인 항체, 표적 세포상의 수용체에 대한 리간드 등을 핵산 공급원에 제공하는 것이 바람직하다. 리포솜이 사용되는 경우, 표적화하고/하거나 흡수를 용이하게 하기 위해서 세포내이입과 관련이 있는 세포 표면 막 단백질에 결합하는 단백질, 예를 들어 특정 세포 유형에 대해 작용하는 캡시드 단백질 또는 그의 단편, 세포주기 동안 내재화되는 단백질에 대한 항체, 및 세포내 국소화를 표적화하고 세포내 반감기를 증진시키는 단백질을 사용할 수 있다. 수용체-매개 세포내이입 기술은 예를 들어 문헌 [Wu et al., J. Biol. Chem. 262, 4429-4432 (1987)] 및 [Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990)]에 기재되어 있다. 유전자 마킹 및 유전자 요법 프로토콜에 관한 검토를 위해서는 문헌 [Anderson et al., Science 256, 808-813 (1992)]을 참조한다.

본원에 기재된 폴리펩티드 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산 분자는 염색체의 확인에 유용하다. 이와 관련하여, 계속해서 새로운 염색체 마커를 확인할 필요가 있는데, 이는 실제 서열 데이터에 기초하는 사용가능한 염색체 마킹 시약이 현재로서는 비교적 적기 때문이다. 본 발명의 핵산 분자 각각은 염색체 마커로 사용될 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드 및 핵산 분자는, 폴리펩티드가 다른 조직에 비해 한 조직에서, 바람직하게는 동일한 조직 유형의 정상 조직에 비해 질환 조직에서 차별적으로 발현될 수 있는 경우에, 조직 유형 분석을 위해 진단용으로 사용될 수 있다. 핵산 분자는 PCR, 노던 분석, 서던 분석 및 웨스턴 분석용 프로브를 생성하는데 유용할 것이다.

본 발명은 폴리펩티드의 효과를 방지하는 물질 (길항제)을 확인하기 위해 화합물을 스크리닝하는 방법을 포함한다. 길항제 약물 후보에 대한 스크리닝 검정은 본원에서 확인된 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드에 결합하거나 그와 복합체를 형성하거나, 또는 다르게는 예를 들어 세포로부터 폴리펩티드의 발현을 억제하는 것을 포함하는, 코딩된 폴리펩티드와 다른 세포성 단백질의 상호작용을 방해하는 화합물을 확인하도록 설계된다. 이러한 스크리닝 검정은 화학적 라이브러리의 고처리량 스크리닝이 가능한 검정을 포함하여, 소분자 약물 후보를 확인하는데 특히 적합하다.

검정은 당업계에 널리 특징규명되어 있는 다양한 포맷, 예를 들어 단백질-단백질 결합 검정, 생화학적 스크리닝 검정, 면역검정 및 세포-기재 검정으로 수행될 수 있다.

길항제에 관한 모든 검정의 공통점은 약물 후보물질과 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체를 이들 성분이 상호작용하도록 하기에 충분한 조건 및 시간 동안 접촉시켜야 한다는 것이다.

결합 검정에서, 상호작용은 결합이고, 형성된 복합체는 반응 혼합물에서 단리 또는 검출될 수 있다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 약물 후보를 공유결합 또는 비-공유결합 부착에 의해 고체상 상에, 예를 들어, 마이크로타이터 플레이트 상에 고정한다. 비-공유결합 부착은 고체 표면을 폴리펩티드의 용액으로 코팅하고 건조시킴으로써 일반적으로 달성된다. 대안적으로, 폴리펩티드에 특이적인 고정된 항체, 예를 들어, 모노클로날 항체를 사용하여 폴리펩티드를 고체 표면에 고정시킬 수 있다. 상기 검정은 검출가능한 표지로 표지될 수 있는 고정되지 않은 성분을 고정된 성분, 예를 들어 고정된 성분을 함유하는 코팅된 표면에 첨가함으로써 수행된다. 반응이 완료되면, 미반응 성분을 예를 들어 세척에 의해 제거하고, 고체 표면에 고정된 복합체를 검출한다. 본래 고정되지 않은 성분이 검출가능한 표지를 보유하는 경우, 표면에 고정된 표지의 검출은 복합체 형성이 일어났음을 나타낸다. 본래 고정되지 않은 성분이 표지를 보유하지 않는 경우, 복합체 형성은 예를 들어 고정된 복합체에 특이적으로 결합하는 표지된 항체를 사용하여 검출될 수 있다.

후보 화합물이 폴리펩티드와 상호작용하지만 이에 결합하지는 않는 경우, 상기 폴리펩티드와의 상호작용을 단백질-단백질 상호작용의 검출에 대해 널리 공지된 방법에 의해 검정할 수 있다. 이러한 검정은 예를 들어 가교, 동시-면역침전, 및 구배 또는 크로마토그래피 칼럼을 통한 동시-정제와 같은 통상적인 접근법을 포함한다. 또한, 문헌 [Chevray and Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5789-5793 (1991)]에 개시된 바와 같이 필즈(Fields) 및 동료들에 의해 기재된 (문헌 [Fields and Song, Nature (London), 340:245-246 (1989)]; [Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9578-9582 (1991)]), 효모를 기초로 하는 유전자 시스템을 사용함으로써 단백질-단백질 상호작용을 모니터링할 수 있다. 많은 전사 활성자, 예컨대 효모 GAL4는 2개의 물리적으로 구분되는 모듈 메인으로 구성되고, 이중 하나는 DNA-결합 도메인으로 작용하고, 다른 하나는 전사-활성화 도메인으로 기능한다. 상기 간행물들에 기술된 효모 발현 시스템 (일반적으로, "2-하이브리드 시스템"으로 지칭됨)은 이러한 성질의 이점을 취하고, 2개의 하이브리드 단백질을 사용하는데, 이 중 하나에서는 표적 단백질이 GAL4의 DNA-결합 도메인에 융합되고, 다른 하나에서는 후보 활성화 단백질이 활성화 도메인에 융합된다. GAL4-활성화된 프로모터 제어하에 GAL1-lacZ 리포터 유전자의 발현은 단백질-단백질 상호작용을 통한 GAL4 활성의 재구성에 의존적이다. 상호작용 폴리펩티드를 함유하는 콜로니는 β-갈락토시다제에 대한 발색 기질을 사용하여 검출된다. 이중 하이브리드 기술을 사용하여 두 특이적인 단백질 사이의 단백질-단백질 상호작용을 확인하기 위한 완전한 키트 (매치마커(MATCHMAKER)™)는 클론테크(Clontech)로부터 상업적으로 이용가능하다. 상기 시스템은 또한 특이적 단백질 상호작용에 관여하는 단백질 도메인을 맵핑하고, 또한 이들 상호작용에 중대한 아미노산 잔기를 정확하게 제시하도록 확장될 수도 있다.

본원에서 확인된 폴리펩티드를 코딩하는 유전자와 다른 세포내 또는 세포외 성분의 상호작용을 방해하는 화합물은 다음과 같이 시험될 수 있다: 통상적으로, 유전자 생성물 및 세포내 또는 세포외 성분을 함유하는 반응 혼합물을 상기 2가지 생성물의 상호작용 및 결합을 허용하는 조건하에 이를 허용하는 시간 동안 제조한다. 결합을 억제하는 후보 화합물의 능력을 시험하기 위해, 시험 화합물의 부재 및 존재하에 상기 반응을 실시한다. 추가로, 양성 대조군으로 기능하도록 위약을 제3 반응 혼합물에 첨가할 수 있다. 시험 화합물 및 상기 혼합물 중에 존재하는 세포내 또는 세포외 성분 사이의 결합 (복합체 형성)을 본원에서 상기한 바와 같이 모니터링한다. 대조군 반응물(들)에서는 복합체가 형성되고 시험 화합물을 함유하는 반응 혼합물에서는 형성되지 않는 것은, 시험 화합물이 시험 화합물과 그의 반응 파트너의 상호작용을 방해함을 나타낸다.

길항제에 대해 검정하기 위해, 폴리펩티드를 특정 활성에 대해 스크리닝할 화합물과 함께 세포에 첨가할 수 있고, 폴리펩티드의 존재하에 관심 대상 활성을 억제하는 화합물의 능력은 상기 화합물이 폴리펩티드에 대한 길항제임을 나타낸다. 대안적으로, 길항제는 경쟁적 억제 검정에 적절한 조건하에 폴리펩티드 및 잠재적인 길항제를 막-결합 폴리펩티드 수용체 또는 코딩 수용체와 조합함으로써 검출할 수 있다. 수용체에 결합된 폴리펩티드 분자의 수를 이용하여 잠재적인 길항제의 효과를 결정할 수 있도록, 폴리펩티드를 예를 들어 방사능으로 표지할 수 있다. 수용체를 코딩하는 유전자는 당업자에게 공지된 수많은 방법, 예를 들어 리간드 패닝 및 FACS 분류에 의해 확인할 수 있다. 문헌 [Coligan et al., Current Protocols in Immun., 1(2): Chapter 5 (1991)]. 바람직하게는, 폴리아데닐화된 RNA를 폴리펩티드에 반응성인 세포로부터 제조하고 상기 RNA로부터 생성된 cDNA 라이브러리를 풀로 나누고 이것을 사용하여 COS 세포 또는 폴리펩티드에 반응성이 아닌 다른 세포를 형질감염시키는 발현 클로닝이 이용된다. 유리 슬라이드에서 성장시킨 형질감염된 세포를 표지된 폴리펩티드에 노출시킨다. 폴리펩티드는 아이오딘화, 또는 부위-특이적 단백질 키나제에 대한 인식 부위의 도입을 포함하는 다양한 수단으로 표지될 수 있다. 고정 및 인큐베이션 후에, 상기 슬라이드로 자기방사기록 분석을 실시한다. 양성 풀을 확인하여 하위 풀을 제조하고, 상호작용성 하위 풀의 수거 및 재-스크리닝 과정을 이용하여 다시 형질감염시켜서, 최종적으로는 추정적인 수용체를 코딩하는 단일 클론을 생성시킨다.

효능있는 길항제의 보다 구체적인 예는 폴리클로날 및 모노클로날 항체 및 항체 단편, 단일-쇄 항체, 항-개체특이형 항체, 및 상기 항체 또는 단편의 키메라 또는 인간화 형태, 뿐만 아니라 인간 항체 및 항체 단편 (이로 제한되지 않음)을 비롯한 항체를 포함한다. 대안적으로, 잠재적인 길항제는 밀접하게 관련된 단백질, 예를 들어 수용체를 인식하지만 효과를 나타내지 못하여 폴리펩티드의 작용을 경쟁적으로 억제하는 돌연변이된 형태의 폴리펩티드일 수 있다.

또 다른 잠재적인 길항제는 안티센스 기술로 제조된 안티센스 RNA 또는 DNA 구축물이고, 여기서, 예를 들어 상기 안티센스 RNA 또는 DNA 분자는 표적 mRNA에 혼성화하여 단백질 번역을 저해함으로써 mRNA의 번역을 직접 차단하는 작용을 한다. 안티센스 기술을 이용하여 삼중-나선 형성 또는 안티센스 DNA 또는 RNA를 통해 유전자 발현을 제어할 수 있는데, 이러한 방법은 둘 모두 폴리뉴클레오티드의 DNA 또는 RNA에 대한 결합을 기초로 한다. 예를 들어, 본원에서 성숙 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 5' 코딩 부분은 약 10 내지 40 염기쌍 길이의 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드를 설계하는데 사용될 수 있다. DNA 올리고뉴클레오티드는 전사에 수반되는 유전자의 영역에 대해 상보적이도록 설계됨으로써 (삼중-나선 - 문헌 [Lee et al., Nucl. Acids Res., 6:3073 (1979)]; [Cooney et al., Science, 241:456 (1988)]; [Dervan et al., Science, 251:1360 (1991)] 참조), 폴리펩티드의 전사 및 생산을 방지한다. 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드는 생체 내에서 mRNA와 혼성화하여, mRNA 분자가 폴리펩티드로 번역되는 것을 차단한다 (안티센스 - 문헌 [Okano, Neurochem., 56:560 (1991)]; [Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press: Boca Raton, FL, 1988)]). 또한, 안티센스 RNA 또는 DNA가 생체내에서 발현되어 폴리펩티드의 생성을 억제할 수 있도록 상기한 올리고뉴클레오티드를 세포에 전달할 수도 있다. 안티센스 DNA를 사용하는 경우, 번역-개시 부위로부터 유래된 올리고데옥시리보뉴클레오티드, 예를 들어 표적 유전자 뉴클레오티드 서열의 약 -10 위치 내지 +10 위치 사이가 바람직하다.

잠재적인 길항제는 폴리펩티드의 활성 부위, 수용체 결합 부위 또는 성장 인자 또는 다른 관련 결합 부위에 결합하여 폴리펩티드의 정상적인 생물학적 활성을 차단하는 소분자를 포함한다. 소분자의 예는 소형 펩티드 또는 펩티드-유사 분자, 바람직하게는 가용성 펩티드, 및 합성 비-펩티딜 유기 또는 무기 화합물을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.

리보자임은 RNA의 특이적 절단을 촉매할 수 있는 효소 활성의 RNA 분자이다. 리보자임은 상보적 표적 RNA에 대한 서열-특이적 혼성화에 이은 엔도뉴클레아제성 절단에 의해 작용한다. 잠재적인 RNA 표적 내의 특이적 리보자임 절단 부위는 공지의 기술로 확인될 수 있다. 추가의 상세한 내용은, 예를 들어 문헌 [Rossi, Current Biology 4:469-471 (1994)] 및 PCT 공보 제 WO 97/33551 (1997년 9월 18일 공개)을 참조한다.

전사 억제에 사용되는 삼중-나선 형성에 있어서의 핵산 분자는 단일-가닥이어야 하며, 데옥시뉴클레오티드로 구성되어야 한다. 이러한 올리고뉴클레오티드의 염기 조성은 이것이 후그스틴(Hoogsteen) 염기-쌍형성 규칙을 통해 삼중-나선 형성을 촉진하도록 설계되는데, 이때 일반적으로 이중나선 중 한쪽 가닥에 상당한 크기의 퓨린 또는 피리미딘 스트레치가 필요하다. 추가의 세부사항에 대해서는, 예를 들어 상기 PCT 공보 번호 WO 97/33551을 참고한다.

이러한 소분자들은 임의의 1종 이상의 상기 논의된 스크리닝 검정 및/또는 당업자에게 공지된 임의의 다른 스크리닝 기술에 의해 확인될 수 있다.

본원에서, 단리된 폴리펩티드-코딩 핵산은, 당업계에 공지되고 본원에 기재된 바와 같은 기술을 이용하여 폴리펩티드가 재조합 방식으로 생성되도록 사용될 수 있다. 이후, 생성된 폴리펩티드를 당업계에 공지되고 본원에 기재된 바와 같은 기술을 이용하여 항체를 생성하는데 사용할 수 있다.

본원에서 확인된 폴리펩티드, 뿐만 아니라 본원에서 상기 개시된 스크리닝 검정에 의해 확인된 다른 분자에 특이적으로 결합하는 항체는 암을 포함하는 다양한 장애의 치료를 위해서 제약 조성물의 형태로 투여될 수 있다.

폴리펩티드가 세포내 생성되고 온전한 항체가 억제제로서 사용되는 경우에는 내재화 항체가 바람직하다. 그러나, 항체 또는 항체 단편을 세포 내로 전달하기 위해 리포펙션 또는 리포솜을 사용할 수도 있다. 항체 단편이 사용되는 경우, 표적 단백질의 결합 도메인에 특이적으로 결합하는 최소 크기의 억제 단편이 바람직하다. 예를 들어 항체의 가변-영역 서열을 기초로 하여, 표적 단백질 서열에 결합하는 능력을 보유하는 펩티드 분자를 디자인할 수 있다. 이러한 펩티드는 화학적으로 합성하고/하거나 재조합 DNA 기술에 의해 생산할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993)]을 참조한다.

본원의 제제는 또한 치료할 특정 적응증에 필요한, 바람직하게는 서로 악영향을 미치지 않는 상보적인 활성을 갖는, 하나를 초과하는 활성 화합물을 함유할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 조성물은 그의 기능을 증진시키는 작용제, 예를 들어 세포독성제, 시토카인, 화학요법제 또는 성장-억제제를 포함할 수 있다. 이러한 분자는 의도된 목적에 유효한 양으로 조합되어 적합하게 존재한다.

하기 실시예는 단지 예시 목적으로만 제공되며, 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.

실시예

물질 및 방법

재조합 단백질의 클로닝, 발현 및 정제: 인간 재조합 헵신의 세포외 도메인을 문헌 [Moran et al., 2006]에 기재된 바와 같이 발현시키고 정제하였다. 항-헵신 항체 Fab25를 2009년 10월 22일 출원된 공동 계류 중인 공동 소유의 US 가특허 출원 번호 61/253,953에 기재된 바와 같이 발현시키고 정제하였다. 발현 및 수율을 향상시키기 위해 C672A 돌연변이를 포함하는 재조합 인간 MSP를 문헌 [Wahl et al., 1997]에 기재된 바와 같이 차이니즈 햄스터 난소 세포에서 발현시켰다. KD1을 문헌 [Shia et al., 2005]에 기재된 바와 같이 발현시키고 정제하였다.

SDS-PAGE를 이용한, 헵신에 의한 프로-MSP의 시험관내 활성화의 분석: 프로-MSP (25 ㎍/ml)를 50 mM 트리스-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.05% 트리톤-X100 및 2 mM CaCl₂를 함유하는 완충제 중에서 다양한 농도의 헵신 (1.25 nM, 2.5 nM, 5 nM 및 10 nM)과 함께 37℃에서 인큐베이션하였다. 다양한 시점에서의 반응 혼합물의 분취액을 6X-SDS 샘플 완충제와 혼합하고, 샘플을 95℃에서 5분 동안 비등시키고, 4→20% 구배 겔을 이용하여 SDS-PAGE에 의해 분리하였다. 심플리블루 세이프 스테인(SimplyBlue Safe Stain) (인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드)으로 염색한 후 단백질이 가시화되었다. Arg₄₈₃-Val₄₈₄에서 절단될 수 없도록 돌연변이된 프로-MSP (프로-MSP-R483E)를 사용하여 유사한 실험을 수행함으로써, 단백질분해 절단 부위가 프로-MSP에서 예상된 Arg₄₈₃-Val₄₈₄ 결합 이외의 상이한 부위에서 발생하는지를 평가하였다.

LnCap 세포에서의 세포 표면 발현 헵신에 의한 프로-MSP 활성화: LnCaP-34 세포를 문헌 [Moran et al., 2006]에 기재된 바와 같이 헵신을 안정하게 과다발현하도록 생성하여, 모 LnCaP 세포와 비슷하게 내인성 헵신만을 상대적으로 낮은 수준으로 발현하는 LnCaP-17 세포와 비교하여 5-배 증가된 헵신 세포 표면 발현 및 3-배 증가된 헵신 효소적 활성을 유발하였다. 24-웰 플레이트에서 배양된 전면배양 LnCap-34 세포를 혈청-무함유 RPMI-1640 배지로 세척하고, 혈청-무함유 RPMI-1640 배지 중에서 단독으로 또는 다양한 항-헵신 억제제 (1 μM의 항-헵신 항체 Fab25 / 1 μM의 KD1 / 1 μM의 Ac-KQLR-cmk (서열 10으로서 개시된 "KQLR"))와 함께 37℃에서 15분 동안 인큐베이션한 후, ¹²⁵I-표지된 프로-MSP (25 ㎍/ml)를 첨가하였다. 37℃에서 3 시간 동안 인큐베이션한 후, 분취액을 취하여 SDS-PAGE (4→20% 구배 겔) (인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드)에 의해 분석하고, 이어서 X선 필름에 노출시켰다.

표면-플라즈몬 공명 및 ELISA에 의한, Ron에 대한 헵신-활성화된 프로-MSP의 결합: 인간 Ron에 대한 헵신-활성화된 프로-MSP의 결합 친화도를 결정하기 위해, 표면 플라즈몬 공명 측정을 비아코어(BIAcore)™-3000 기기 (GE 헬쓰 케어, 뉴저지주) 상에서 수행하였다. 토끼 항-인간 IgG를 CM5 바이오센서 칩 상에 화학적으로 고정 (아민 커플링)시키고, Ron (Sema IPT1)-IgG 융합 단백질을 포획하여 대략 250의 반응 단위 (RU)를 얻었다. 동역학적 측정을 위해, 다양한 농도의 헵신-활성화된 MSP 또는 상업적으로 입수가능한 MSP (알앤디 시스템즈(R&D systems))를 30 ㎕/분의 유량으로 25℃에서 HBS-P 완충제에 주입하였다. 회합 속도 (k_on) 및 해리 속도 (k_off)를 일-대-일 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델 (비아-이밸류에이션(BIA-Evaluation))을 이용하여 수득하고, 평형 해리 상수 (K_D)를 계산하였다 (k_off/k_on). ELISA 실험을 위해, 맥시소르프(maxiSorp) 마이크로타이터 플레이트 (눈크(Nunc), 덴마크 로스킬레)를 50 mM 탄산나트륨 완충제, pH 9.6 중 2 ㎍/ml의 토끼 항-인간 IgG Fc 특이적 항체 (잭슨 이뮤노리서치 래보래토리(Jackson ImmunoResearch Laboratory), 펜실베이니아주 웨스트 그로브)를 사용하여 4℃에서 밤새 코팅하였다. 검정 완충제 (PBS pH 7.4, 0.5% BSA 및 0.05% 트윈-20, 15 ppm 프로클린)을 사용하여 차단한 후, 1 ㎍/ml Ron (Sema IPT1)-IgG 융합 단백질을 첨가하고, 플레이트를 부드럽게 진탕시키면서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 완충제 (PBS, 0.05% 폴리소르베이트 20)로 세척한 후, His 태그가 부착된 MSP 단백질을 1 시간 동안 첨가하였다. 결합 MSP를 항-His-HRP (퀴아젠(Qiagen), 캘리포니아주 발렌시아)를 사용하여 검출하고, 이어서 TMB/H₂O₂ 기질 (KPL, 메릴랜드주 게이더스버그)을 첨가하였다. 1M H₃PO₄를 사용하여 반응을 중단시키고, A₄₅₀을 몰레큘라 디바이시스(Molecular Devices) (캘리포니아주 서니배일) 스펙트라맥스 플러스(SpectraMax Plus)³⁸⁴ 마이크로플레이트 리더 상에서 측정하였다. 절반-최대 결합을 일으키는 유효 농도 (EC₅₀)를 칼레이다그래프(Kaleidagraph) (시너지 소프트웨어(Synergy Software), 펜실베이니아주 리딩)를 이용하여 4 파라미터 피트에 의해 결정하였다.

복막 대식세포 화학주성 및 형태 변화 검정: 뮤린 복막 정주 대식세포를, C57BL/6 마우스로부터 마우스당 15 ml의 혈청-무함유 RPMI-1640 배지로 복막 강을 세척함으로써 수득하였다. 세포를 세척하고, 25 mM Hepes를 함유하는 RPMI-1640 배지 중에 1 x 10⁶개 세포·mL^-1로 재현탁시켰다. 대식세포 화학주성 검정을 5 μm의 기공 크기를 갖는 QCM 화학주성 검정 키트 (밀리포어)를 이용하여 수행하였다. 복막 대식세포 현탁액 100 마이크로리터 (즉, 10⁵개 세포)를 화학주성 세포의 상부 웰에 첨가하였다. 하부 웰을, 단독의 정제된 프로-MSP 또는 37℃에서 2시간 동안 헵신으로 처리된 정제된 프로-MSP를 함유하는 RPMI-1640 배지로 채웠다. 인간 MSP (알앤디 시스템즈)의 재조합 활성 형태를 양성 대조군으로서 이용하였다. 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션한 후, 막의 상부 표면 상의 세포를 면봉으로 닦아 내고, 이동된 세포를 제조업체의 권고에 따라 박리 완충제를 사용하여 박리하였다. 다양한 웰로부터의 분취액을 용해 완충제 및 CYPRO 염료 혼합물과 함께 15분 동안 인큐베이션하였다. 480 nm의 여기 파장 및 520 nm의 방출 파장에서 마이크로플레이트 리더 (스펙트라맥스(Spectramax)-M5, 몰레큘라 디바이시스, 캘리포니아주 서니배일)를 이용하여 형광을 측정함으로써 이동을 정량화하였다.

형태에 대한 MSP의 효과를 평가하기 위해, 복막 대식세포 (1 x 10⁶개 세포 ·mL^-1)를 혈청-무함유 RPMI-1640 배지 중에서 밤새 배양하였다. 인큐베이션한 후, 비-부착 세포를 제거하고, 단독의 또는 헵신으로 전처리된 프로-MSP (1.0 nM)를 배양 배지에 첨가하였다. 37℃에서 1시간 동안 추가로 인큐베이션한 후, 대식세포의 형태 변화를 위상차 현미경검사로 관찰하였다.

성숙 MSP에 의한 NO 합성의 억제: 수집된 마우스 대퇴골로부터 수득한 골수 세포를 단일-세포 현탁액에 피펫팅한 후, 회전 침강시켰다. 실온에서 5분 동안 적혈구 용해 완충제에와 함께 인큐베이션하여 적혈구를 용해시켰다. 이어서, 세포를 대식세포 분화 배지 (10% FBS, 1X Pen/strep 및 50 ng/ml 재조합 mCSF-1을 함유하는 글루타민 함유 DMEM) 중에 현탁시켰다. 이어서, 세포를 멸균 24-웰 비-조직 배양 접시 상에 플레이팅하였다. 다음 날, 배지를 교환하고, 이어서 2 일마다 교환하였다. 배양 하에 6 일 후, 대식세포가 성숙하였고, 이들 성숙 세포를 혈청-무함유 DMEM로 세척하고, 추가로 2시간 동안 인큐베이션하였다. 재조합 MSP (10 ng/ml), 프로-MSP (10 ng/ml), 헵신 (1 nM) 및 Fab25 (500 nM)로 이루어진, 도면에 나타낸 바와 같은 다양한 반응물 (전체 부피 300 ㎕)을 각각의 웰에 첨가하고, 조직 배양 인큐베이터에서 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 그리스(Griess) 반응 (몰레큘라 프로브스)을 제조업체의 권고에 따라 이용하여 NO 생산을 정량화하였다.

인산화된 키나제의 검출을 위한 면역블롯: 인간 Ron을 과다발현하는 인간 난소 암종 세포주 (A2780)를 Ron 및 다른 하류 키나제의 인산화를 연구하는데 사용하였다. 세포를 2x10⁵개 세포/웰의 밀도로 12-웰 플레이트에서 배양하고, 24시간 동안 혈청-고갈시켰다. 이어서, 세포를 단독의 또는 10 nM 헵신의 존재 하의 프로-MSP (10 및 50 ng/ml)로 1시간 동안 자극하였다. 상업적 공급원으로부터의 성숙 MSP 및 헵신을 대조군으로서 사용하였다. 세포를 차가운 PBS로 2회 세척하여 샘플을 제조하고, 이어서 용해 완충제 200 ul를 첨가하였다. 이어서, 샘플을 4→12% 트리스-글리신 겔 (인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드) 상에서 SDS/PAGE에 의해 분석하였다. 단백질을 니트로셀룰로스 막으로 이동시키고, 이이서 항-Ron 항체 또는 항-포스포-AKT 항체 또는 항-포스포-MAPK 항체 또는 항-포스포-S6 항체로 4℃에서 밤새 처리하였다. 세척한 후, 막을 IRDye800-접합된 염소 항-마우스 IgG (로크랜드(Rockland), 펜실베이니아주 길버츠빌) 및 알렉사플루오르(AlexaFluor) 680 염소 항-토끼 IgG (인비트로젠)와 함께 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 단백질을 오디세이(Odyssey) 적외선 영상화 시스템 (LI-COR 바이오사이언시즈, 네브래스카주 링컨)으로 검출하였다.

결과

재조합 헵신에 의한 프로-MSP의 시험관내 활성화

PS-SCL (위치 스캐닝-합성 조합 라이브러리)에 의한 헵신에 대한 기질 프로파일링을 바탕으로, 컨센서스 서열은 (P/K)-(K/Q)-(T/L/N)-R로서 P4-P1에 대해 선호를 나타내었다 (문헌 [Herter et al., 2005]). 이는 절단 부위 서열이 대부분 PS-SCL 기질 프로파일링과 일치하는 이전에 확인된 헵신-기질의 목록 (문헌 [Kazama et al., 1995]; [Kirchhofer et al., 2005]; [Moran et al., 2006]; [Tripathi et al., 2008]) (표 1)으로부터 명백해진다. 특히, proHGF (KQLR↓V) (서열 11) 및 Ln-332 (SQLR↓L) (서열 12)에 대한 기질 인식 서열은 프로-MSP (SKLR↓V) (서열 1)의 절단 서열과 밀접한 유사성을 지닌다. 그러나, 인식 서열이 프로-HGF 및 프로-uPA로부터의 것의 하이브리드이기 때문에, 이러한 추론은 또 다른 지모겐, 프로-tPA가 왜 불량한 헵신 기질인지를 설명하지 못한다 (표 1).

헵신은 37℃에서 다양한 농도의 헵신과 함께 인큐베이션한 경우에 용량-의존성 및 시간 의존성 방식으로 프로-MSP를 활성화시켰다. 활성화를 환원 조건 하에 4→20% 구배 트리스-글리신 SDS-PAGE 상에서 겔-이동도 옮김에 의해 모니터링하였다 (도 1). 절단 생성물을 N-말단 서열분석에 의해 분석하여 프로세싱 부위를 확인하였다. 헵신에 의한 프로-MSP의 단백질분해 절단이 Arg483-Val484 결합에서 발생하였고, 이로써 활성 MSP (α/β) 이종이량체가 형성되었다. 프로-MSP (프로-MSP-R483E)의 절단-부위 돌연변이체를 발현시키고 정제하고, 헵신에 의해 단백질분해 프로세싱 처리하였다. 헵신은 장기간 인큐베이션 (24시간)에도 불구하고 상기 돌연변이체 프로-MSP를 절단하지 않았으며, 이로써 활성화의 특이성을 재확인하였다.

세포 표면-발현된 헵신에 의한 프로-MSP 활성화

세포 표면 상에서 선천적으로 발현되는 헵신에 의한 프로-MSP의 단백질분해 프로세싱을 LnCap-34 세포주 상에서 모니터링하였다 (문헌 [Moran et al., 2006]). 헵신 발현 LnCap-34 세포는 ¹²⁵I-프로-MSP를 프로세싱할 수 있었다 (도 2). 프로-MSP 프로세싱의 단백질분해 활성은 주로 헵신으로 인한 것이었으며, 이는 3개의 모든 헵신 억제제 (Ac-KQLR-클로로메틸케톤 (서열 10으로서 개시된 'KQLR'), KD1 및 Fab25)가 단백질분해 절단을 효과적으로 차단하였기 때문이다.

헵신-활성화된 MSP의 생물학적 활성

Ron에 대한 MSP 결합

본 발명자들은 표면-플라즈몬 공명 (비아코어)을 이용하여 인간 Ron에 대한 MSP의 결합 친화도를 결정하였다. 단일-쇄 프로-MSP의 단백질분해 절단은 수용체 Ron에 대한 결합에 있어서 결정적이었다. 프로-MSP 또는 절단 부위 돌연변이체 (프로-MSP-R483E) 어느 것도 1 μM의 농도까지 Ron에 어떠한 검출가능한 결합도 갖지 않았다. 대조적으로, 헵신-활성화된 MSP는 Ron에 대한 고 친화도 결합을 나타내었다 (K_D = 7 nM) (도 3a). 헵신-활성화된 MSP의 친화도는 상업적으로 입수가능한 MSP (K_D = 4.4 nM)와 매우 유사하였다. 추가로, 본 발명자들은 ELISA 실험에서 Ron에 대한 MSP 결합을 측정하였다. 절반-최대 결합을 일으키는 유효 농도 (EC₅₀)는 0.519 nM인 것으로 결정되었다 (도 3b).

MSP/RON 경로의 하류 키나제의 인산화

미토겐-활성화된 단백질 (MAP) 키나제 및 리보솜 단백질 S6 키나제를 포함하는 하류 키나제의 인산화에 의해 Ron 신호전달 경로의 헵신-처리된 프로-MSP의 생물학적 효과를 모니터링하였다. 헵신 또는 프로-MSP 단독 어느 것도 Ron 신호전달 경로의 활성화에 있어 효과적이지 않았지만, 헵신-처리된 프로-MSP는 용량 의존성 방식으로 MAP 키나제 및 S6 키나제 둘 모두의 강력한 인산화를 나타내었다. 헵신-처리된 프로-MSP의 인산화의 정도는 상업적 공급원으로부터의 성숙 MSP 샘플의 것과 유사하였다.

복막 대식세포 형태 변화 및 화학주성 검정

헵신-활성화된 MSP의 생물학적 활성을 1차 대식세포 배양물에서 추가로 평가하였다. 성숙 MSP는 대식세포의 특징적 형태 변화의 원인이 되는 것으로 공지되어 있다. 헵신-활성화된 MSP로 자극시에, 복막 대식세포는 돌출 및 연장으로 나타나는 세포 형상의 명백한 변화를 일으켰다 (도 5). 헵신-활성화된 MSP의 효과는 상업적으로 입수가능한 MSP 뿐만 아니라 HGFA-활성화된 MSP의 것과 유사하였다.

화학주성 검정에서, 프로-MSP의 헵신으로의 처리는 복막 대식세포의 이동에서의 유의한 증가 (p<0.001)를 유발하였고 (도 6), 이 효과는 상업적 공급원으로부터의 성숙 MSP와 유사하였다. 항-헵신 억제제로의 전처리는 대식세포의 이동에서 현저한 감소를 나타내었다.

산화질소 (NO) 합성의 억제

왕(Wang) 등은 성숙 MSP가 다양한 자극에 반응하여 대식세포 산화질소 신타제 mRNA의 증가 및 그와 연관된 NO의 생산의 증가를 차단할 수 있음을 앞서 밝힌 바 있다 (문헌 [Wang et al., 1994a]). 1차 마우스 골수 대식세포는 LPS에 반응하여 산화질소의 강력한 생산을 나타내었다. 헵신-활성화된 MSP는 골수 유래 대식세포에서 NO 생산을 유의하게 감쇄시켰고 (도 7), 상기 효과는 항-헵신 항체의 존재 하에 완전히 억제된 반면, 프로-MSP 단독은 이 반응을 억제하지 않았다.

부분 참고문헌 목록

상기 본 발명이 이해를 명확하게 하고자 하는 목적으로 예시 및 실시예로서 약간 상세하게 설명되었지만, 상기 설명 및 실시예가 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

SEQUENCE LISTING <110> GENENTECH, INC. et al. <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR MODULATING HEPSIN ACTIVATION OF MACROPHAGE-STIMULATING PROTEIN <130> P4379R1 WO <140> <141> <150> 61/253,990 <151> 2009-10-22 <160> 20 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Pro-MSP cleavage sequence" <400> 1 Ser Lys Leu Arg Val 1 5 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 2 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala Val Ala 1 5 10 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 3 Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser 1 5 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 4 Gln Gln Tyr Tyr Ser Ser Tyr Tyr Leu Leu Thr 1 5 10 <210> 5 <211> 10 <212> 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Val Asp Glu Gly Arg Leu Pro His Thr 115 120 125 Gln Arg Leu Leu Glu Val Ile Ser Val Cys Asp Cys Pro Arg Gly Arg 130 135 140 Phe Leu Ala Ala Ile Cys Gln Asp Cys Gly Arg Arg Lys Leu Pro Val 145 150 155 160 Asp Arg Ile Val Gly Gly Arg Asp Thr Ser Leu Gly Arg Trp Pro Trp 165 170 175 Gln Val Ser Leu Arg Tyr Asp Gly Ala His Leu Cys Gly Gly Ser Leu 180 185 190 Leu Ser Gly Asp Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Phe Pro Glu Arg 195 200 205 Asn Arg Val Leu Ser Arg Trp Arg Val Phe Ala Gly Ala Val Ala Gln 210 215 220 Ala Ser Pro His Gly Leu Gln Leu Gly Val Gln Ala Val Val Tyr His 225 230 235 240 Gly Gly Tyr Leu Pro Phe Arg Asp Pro Asn Ser Glu Glu Asn Ser Asn 245 250 255 Asp Ile Ala Leu Val His Leu Ser Ser Pro Leu Pro Leu Thr Glu Tyr 260 265 270 Ile Gln Pro Val Cys Leu Pro Ala Ala Gly Gln Ala Leu Val Asp Gly 275 280 285 Lys Ile Cys Thr Val Thr Gly Trp Gly Asn Thr Gln Tyr Tyr Gly Gln 290 295 300 Gln Ala Gly Val Leu Gln Glu Ala Arg Val Pro Ile Ile Ser Asn Asp 305 310 315 320 Val Cys Asn Gly Ala Asp Phe Tyr Gly Asn Gln Ile Lys Pro Lys Met 325 330 335 Phe Cys Ala Gly Tyr Pro Glu Gly Gly Ile Asp Ala Cys Gln Gly Asp 340 345 350 Ser Gly Gly Pro Phe Val Cys Glu Asp Ser Ile Ser Arg Thr Pro Arg 355 360 365 Trp Arg Leu Cys Gly Ile Val Ser Trp Gly Thr Gly Cys Ala Leu Ala 370 375 380 Gln Lys Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Ser Asp Phe Arg Glu Trp Ile 385 390 395 400 Phe Gln Ala Ile Lys Thr His Ser Glu Ala Ser Gly Met Val Thr Gln 405 410 415 Leu <210> 19 <211> 476 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Met Ala Gln Lys Glu Gly Gly Arg Thr Val Pro Cys Cys Ser Arg Pro 1 5 10 15 Lys Val Ala Ala Leu Thr Ala Gly Thr Leu Leu Leu Leu Thr Ala Ile 20 25 30 Gly Ala Ala Ser Trp Ala Ile Val Ala Val Leu Leu Arg Ser Asp Gln 35 40 45 Glu Pro Leu Tyr Pro Val Gln Val Ser Ser Ala Asp Ala Arg Leu Met 50 55 60 Val Phe Asp Lys Thr Glu Gly Thr Trp Arg Leu Leu Cys Ser Ser Arg 65 70 75 80 Ser Asn Ala Arg Val Ala Gly Leu Ser Cys Glu Glu Met Gly Phe Leu 85 90 95 Arg Ala Leu Thr His Ser Glu Leu Asp Val Arg Thr Ala Gly Ala Asn 100 105 110 Gly Thr Ser Gly Phe Phe Cys Val Asp Glu Gly Arg Leu Pro His Thr 115 120 125 Gln Arg Leu Leu Glu Val Ile Ser Val Cys Asp Cys Pro Arg Gly Arg 130 135 140 Phe Leu Ala Ala Ile Cys Gln Gly Glu Ile Leu Lys Leu Arg Thr Leu 145 150 155 160 Ser Phe Arg Pro Leu Gly Arg Pro Arg Pro Leu Lys Leu Pro Arg Met 165 170 175 Gly Pro Cys Thr Phe Arg Pro Pro Arg Ala Gly Pro Ser Leu Gly Ser 180 185 190 Gly Asp Leu Gly Ser Ser Pro Leu Ser Pro Pro Pro Ala Asp Pro Cys 195 200 205 Pro Thr Asp Cys Gly Arg Arg Lys Leu Pro Val Asp Arg Ile Val Gly 210 215 220 Gly Arg Asp Thr Ser Leu Gly Arg Trp Pro Trp Gln Val Ser Leu Arg 225 230 235 240 Tyr Asp Gly Ala His Leu Cys Gly Gly Ser Leu Leu Ser Gly Asp Trp 245 250 255 Val Leu Thr Ala Ala His Cys Phe Pro Glu Arg Asn Arg Val Leu Ser 260 265 270 Arg Trp Arg Val Phe Ala Gly Ala Val Ala Gln Ala Ser Pro His Gly 275 280 285 Leu Gln Leu Gly Val Gln Ala Val Val Tyr His Gly Gly Tyr Leu Pro 290 295 300 Phe Arg Asp Pro Asn Ser Glu Glu Asn Ser Asn Asp Ile Ala Leu Val 305 310 315 320 His Leu Ser Ser Pro Leu Pro Leu Thr Glu Tyr Ile Gln Pro Val Cys 325 330 335 Leu Pro Ala Ala Gly Gln Ala Leu Val Asp Gly Lys Ile Cys Thr Val 340 345 350 Thr Gly Trp Gly Asn Thr Gln Tyr Tyr Gly Gln Gln Ala Gly Val Leu 355 360 365 Gln Glu Ala Arg Val Pro Ile Ile Ser Asn Asp Val Cys Asn Gly Ala 370 375 380 Asp Phe Tyr Gly Asn Gln Ile Lys Pro Lys Met Phe Cys Ala Gly Tyr 385 390 395 400 Pro Glu Gly Gly Ile Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Phe 405 410 415 Val Cys Glu Asp Ser Ile Ser Arg Thr Pro Arg Trp Arg Leu Cys Gly 420 425 430 Ile Val Ser Trp Gly Thr Gly Cys Ala Leu Ala Gln Lys Pro Gly Val 435 440 445 Tyr Thr Lys Val Ser Asp Phe Arg Glu Trp Ile Phe Gln Ala Ile Lys 450 455 460 Thr His Ser Glu Ala Ser Gly Met Val Thr Gln Leu 465 470 475 <210> 20 <211> 711 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Met Gly Trp Leu Pro Leu Leu Leu Leu Leu Thr Gln Cys Leu Gly Val 1 5 10 15 Pro Gly Gln Arg Ser Pro Leu Asn Asp Phe Gln Val Leu Arg Gly Thr 20 25 30 Glu Leu Gln His Leu Leu His Ala Val Val Pro Gly Pro Trp Gln Glu 35 40 45 Asp Val Ala Asp Ala Glu Glu Cys Ala Gly Arg Cys Gly Pro Leu Met 50 55 60 Asp Cys Arg Ala Phe His Tyr Asn Val Ser Ser His Gly Cys Gln Leu 65 70 75 80 Leu Pro Trp Thr Gln His Ser Pro His Thr Arg Leu Arg Arg Ser Gly 85 90 95 Arg Cys Asp Leu Phe Gln Lys Lys Asp Tyr Val Arg Thr Cys Ile Met 100 105 110 Asn Asn Gly Val Gly Tyr Arg Gly Thr Met Ala Thr Thr Val Gly Gly 115 120 125 Leu Pro Cys Gln Ala Trp Ser His Lys Phe Pro Asn Asp His Lys Tyr 130 135 140 Thr Pro Thr Leu Arg Asn Gly Leu Glu Glu Asn Phe Cys Arg Asn Pro 145 150 155 160 Asp Gly Asp Pro Gly Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Ala Val 165 170 175 Arg Phe Gln Ser Cys Gly Ile Lys Ser Cys Arg Glu Ala Ala Cys Val 180 185 190 Trp Cys Asn Gly Glu Glu Tyr Arg Gly Ala Val Asp Arg Thr Glu Ser 195 200 205 Gly Arg Glu Cys Gln Arg Trp Asp Leu Gln His Pro His Gln His Pro 210 215 220 Phe Glu Pro Gly Lys Phe Leu Asp Gln Gly Leu Asp Asp Asn Tyr Cys 225 230 235 240 Arg Asn Pro Asp Gly Ser Glu Arg Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro 245 250 255 Gln Ile Glu Arg Glu Phe Cys Asp Leu Pro Arg Cys Gly Ser Glu Ala 260 265 270 Gln Pro Arg Gln Glu Ala Thr Thr Val Ser Cys Phe Arg Gly Lys Gly 275 280 285 Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Ala Asn Thr Thr Thr Ala Gly Val Pro Cys 290 295 300 Gln Arg Trp Asp Ala Gln Ile Pro His Gln His Arg Phe Thr Pro Glu 305 310 315 320 Lys Tyr Ala Cys Lys Asp Leu Arg Glu Asn Phe Cys Arg Asn Pro Asp 325 330 335 Gly Ser Glu Ala Pro Trp Cys Phe Thr Leu Arg Pro Gly Met Arg Ala 340 345 350 Ala Phe Cys Tyr Gln Ile Arg Arg Cys Thr Asp Asp Val Arg Pro Gln 355 360 365 Asp Cys Tyr His Gly Ala Gly Glu Gln Tyr Arg Gly Thr Val Ser Lys 370 375 380 Thr Arg Lys Gly Val Gln Cys Gln Arg Trp Ser Ala Glu Thr Pro His 385 390 395 400 Lys Pro Gln Phe Thr Phe Thr Ser Glu Pro His Ala Gln Leu Glu Glu 405 410 415 Asn Phe Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Ser His Gly Pro Trp Cys Tyr 420 425 430 Thr Met Asp Pro Arg Thr Pro Phe Asp Tyr Cys Ala Leu Arg Arg Cys 435 440 445 Ala Asp Asp Gln Pro Pro Ser Ile Leu Asp Pro Pro Asp Gln Val Gln 450 455 460 Phe Glu Lys Cys Gly Lys Arg Val Asp Arg Leu Asp Gln Arg Arg Ser 465 470 475 480 Lys Leu Arg Val Val Gly Gly His Pro Gly Asn Ser Pro Trp Thr Val 485 490 495 Ser Leu Arg Asn Arg Gln Gly Gln His Phe Cys Gly Gly Ser Leu Val 500 505 510 Lys Glu Gln Trp Ile Leu Thr Ala Arg Gln Cys Phe Ser Ser Cys His 515 520 525 Met Pro Leu Thr Gly Tyr Glu Val Trp Leu Gly Thr Leu Phe Gln Asn 530 535 540 Pro Gln His Gly Glu Pro Ser Leu Gln Arg Val Pro Val Ala Lys Met 545 550 555 560 Val Cys Gly Pro Ser Gly Ser Gln Leu Val Leu Leu Lys Leu Glu Arg 565 570 575 Ser Val Thr Leu Asn Gln Arg Val Ala Leu Ile Cys Leu Pro Pro Glu 580 585 590 Trp Tyr Val Val Pro Pro Gly Thr Lys Cys Glu Ile Ala Gly Trp Gly 595 600 605 Glu Thr Lys Gly Thr Gly Asn Asp Thr Val Leu Asn Val Ala Leu Leu 610 615 620 Asn Val Ile Ser Asn Gln Glu Cys Asn Ile Lys His Arg Gly Arg Val 625 630 635 640 Arg Glu Ser Glu Met Cys Thr Glu Gly Leu Leu Ala Pro Val Gly Ala 645 650 655 Cys Glu Gly Asp Tyr Gly Gly Pro Leu Ala Cys Phe Thr His Asn Cys 660 665 670 Trp Val Leu Glu Gly Ile Ile Ile Pro Asn Arg Val Cys Ala Arg Ser 675 680 685 Arg Trp Pro Ala Val Phe Thr Arg Val Ser Val Phe Val Asp Trp Ile 690 695 700 His Lys Val Met Arg Leu Gly 705 710

Claims (34)

1. (a) 후보 물질을, 헵신 및 프로-대식세포-자극 단백질 (프로-MSP) 기질을 포함하는 제1 샘플과 접촉시키는 것 및 (b) 샘플에서의 프로-MSP 기질 활성화의 양을, 제1 샘플과 유사한 양의 헵신 및 프로-MSP 기질을 포함하지만 상기 후보 물질과 접촉시키지 않은 참조 샘플에서의 프로-MSP 기질 활성화의 양과 비교하는 것을 포함하며, 여기서 참조 샘플과 비교하여 제1 샘플에서의 프로-MSP 기질 활성화의 양의 감소는 후보 물질이 단일 쇄 MSP (프로-MSP)의 헵신 활성화를 억제할 수 있다는 것을 나타내는 것인, 프로-대식세포-자극 단백질 (프로-MSP)의 헵신 활성화를 억제하는 후보 억제제 물질을 확인하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 샘플 내의 헵신이 상기 프로-MSP를 활성화시키기 위한 유효량으로 존재하는 것인 방법.
3. 제1항에 있어서, 프로-MSP 기질이 Arg₄₈₃-Val₄₈₄ 펩티드 연결의 야생형 형태를 포함하는 프로-MSP 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드인 방법.
4. 헵신 및 프로-MSP의 상호작용을 억제하는 길항제 분자.
5. 제4항에 있어서, 분자가 항체 또는 그의 단편을 포함하는 것인 길항제 분자.
6. 제4항에 있어서, 분자가 쿠니츠 도메인 1 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 것인 길항제 분자.
7. 제4항에 있어서, 분자가 유기 소분자를 포함하는 것인 길항제.
8. 제6항에 있어서, 분자가 헵신에 의해 프로-MSP 활성화를 억제할 수 있는 쿠니츠 도메인 (KD) 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 것인 분자.
9. 제8항에 있어서, 쿠니츠 도메인 (KD) 서열이 쿠니츠 도메인 1 서열 (KD-1)을 포함하는 것인 분자.
10. 제9항에 있어서, KD-1 서열이 인간 간세포 성장 인자 활성화제 억제제-1, -1B (HAI-1, HAI-1B)의 것, 또는 그의 변이체인 분자.
11. 제8항에 있어서, 쿠니츠 도메인 (KD) 서열이 인간 간세포 성장 인자 활성화제 억제제-2 (HAI-2)의 쿠니츠 도메인 중 하나 또는 둘 모두, 또는 그의 변이체인 분자.
12. 제6항에 있어서, 분자가 인간 간세포 성장 인자 활성화제 억제제-1, -1B 또는 -2 (HAI-1, HAI-1B 또는 HAI-2)의 적어도 일부분, 또는 그의 변이체를 포함하는 것인 분자.
13. 제12항에 있어서, 일부분이 헵신에 의해 프로-MSP 활성화를 억제할 수 있는 쿠니츠 도메인 (KD) 서열을 포함하는 것인 분자.
14. 제13항에 있어서, 쿠니츠 도메인 (KD) 서열이
    (i) 인간 간세포 성장 인자 활성화제 억제제-1, -1B (HAI-1, HAI-1B)의 쿠니츠 도메인 1 서열 (KD-1), 또는 그의 변이체; 또는
    (ii) 인간 간세포 성장 인자 활성화제 억제제-2 (HAI-2)의 쿠니츠 도메인 중 하나 또는 둘 모두, 또는 그의 변이체
    인 분자.
15. 제6항에 있어서, 분자가 Ron에 대한 결합에 대해 헵신과 경쟁하는 것인 분자.
16. 제6항에 있어서, 분자가 헵신에 대한 결합에 대해 프로-MSP와 경쟁하는 것인 분자.
17. 제16항에 있어서, 분자가, 헵신에 결합할 수 있으며 야생형 MSP와 비교하여 감소된 Ron 활성화 활성을 갖는 돌연변이체 MSP를 포함하는 것인 분자.
18. 제17항에 있어서, 돌연변이체 MSP에 MSP β 쇄의 적어도 일부가 결여되어 있는 것인 분자.
19. 제6항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 분자가 독소에 연결되는 것인 분자.
20. 제6항 내지 제18항 중 어느 한 항의 분자를 코딩하는 단리된 핵산.
21. 제20항의 핵산을 포함하는 벡터.
22. 제20항의 핵산 또는 제21항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
23. 제6항 내지 제18항 중 어느 한 항의 분자를 발현할 수 있는 숙주 세포에서 제21항의 벡터를 발현시키는 것을 포함하는, 상기 분자를 제조하는 방법.
24. 제6항 내지 제18항 중 어느 한 항의 분자 및 담체를 포함하는 조성물.
25. 제24항에 있어서, 담체가 제약상 허용되는 담체인 조성물.
26. 용기, 및 용기 내에 함유된 조성물을 포함하며, 여기서 조성물은 제6항 내지 제18항 중 어느 한 항의 분자를 포함하는 것인 제조품.
27. 제6항 내지 제18항 및 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 Ron의 활성화와 관련된 병적 상태를 치료하기 위한 분자.
28. 정제된 프로-MSP 및 헵신 단백질을 포함하는 조성물.
29. 세포 또는 조직을 유효량의 제4항 내지 제19항 중 어느 한 항의 길항제 분자와 접촉시키는 것을 포함하는, 프로-MSP/Ron 활성화와 관련된 생물학적 활성을 억제하는 방법.
30. 대상체에게 유효량의 제4항 내지 제19항 중 어느 한 항의 길항제 분자를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 프로-MSP/Ron 활성화와 관련된 병적 상태를 치료하는 방법.
31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 상태가 암, 종양, 세포 증식성 장애 또는 면역 장애인 방법.
32. 제31항에 있어서, 암이 유방암, 결장직장암, 폐암, 유두상 암종, 결장암, 췌장암, 난소암, 자궁경부암, 중추신경계 암, 전립선암, 골원성 육종, 신장 암종, 간세포 암종, 방광암, 위 암종, 두경부 편평세포 암종, 흑색종 또는 백혈병인 방법.
33. (a) MSP의 헵신 단백질분해 프로세싱을 허용하는 조건 하에 샘플을 헵신과 접촉시키는 것 및 (b) 헵신 활성화된 MSP의 존재를 검출하는 것을 포함하는, 샘플에서 MSP를 검출하는 방법.
34. (a) MSP의 헵신 단백질분해 프로세싱을 허용하는 조건 하에 샘플을 MSP와 접촉시키는 것 및 (b) 헵신 활성화된 MSP의 존재를 검출하는 것을 포함하는, 샘플에서 헵신을 검출하는 방법.

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