CN102711826B - 用于调控巨噬细胞刺激性蛋白的hepsin活化的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于调控hepsin活性和MSP/Ron途径的方法和组合物，特别是通过调节hepsin对MSP原的活化来进行。

Description

用于调控巨噬细胞刺激性蛋白的HEPSIN活化的方法和组合物
对相关申请的交叉引用
此申请要求2009年10月22日提交的美国临时专利申请No.61/253,990的权益，通过述及将其内容收入本文。
发明领域
一般而言，本发明涉及分子生物学和生长因子调控领域。更具体的说，本发明关注巨噬细胞刺激性蛋白的酶活性的调控剂，及所述调控剂的用途。
发明背景
巨噬细胞刺激性蛋白(MSP)经结合和活化受体酪氨酸激酶Ron来介导其生物学活性，Ron是Met-原癌基因家族的一个成员(Leonard & Danilkovitch,2000)。MSP与其受体的相互作用导致受体磷酸化和激酶活化。已经将MSP/Ron途径与多种癌症的肿瘤发生联系起来(参见例如Wagh et al.,2008)。MSP是一种血浆蛋白质，它主要在肝实质细胞中组成性合成，但是它还在肺、肾上腺和胎盘中以低水平表达。MSP在血液中作为无活性单链前体（MSP原(pro-MSP)）循环，它需要Ser-Lys-Leu-Arg483↓Val484(SEQ ID NO:1)键处的蛋白水解切割来获得功能活性(Skeel et al.,1991)(Yoshimura et al.,1993)。活性MSP是通过二硫键保持在一起的α-和β-亚基的异二聚体。已知MSP在血管外位点处被几种胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶活化(Bhatt et al.,2007;Kawaguchi et al.,2009;Wang et al.,1994b;Wang etal.,1996;Wang et al.,1994c)。
hepsin是II型跨膜丝氨酸蛋白酶家族的一个成员(Netzel-Arnett et al.,2003;Wu & Parry,2007)且被鉴定为前列腺癌中受到最高度调节的基因之一(Dhanasekaran etal.,2001;Luo et al.,2001;Magee et al.,2001;Stamey et al.,2001;Stephan et al.,2004;Welsh et al.,2001)。免疫组织化学染色揭示了晚期肿瘤和转移性骨损害中的强表达(Morrissey et al.,2008;Xuan et al.,2006)，提示hepsin在肿瘤进展中的作用。此外，基于基因表达分析，hepsin还涉及卵巢癌(Tanimoto et al.,1997)、肾细胞癌(Betsunohet al.,2007;Zacharski et al.,1998)和子宫内膜癌(Matsuo et al.,2008)。Beliveau等人提出hepsin不切割MSP原(Beliveau et al.,(2009)FEBS J.276:2213-26)。
显然需要综合了解hepsin的生理学底物。本发明满足了此需求并提供了其它好处。
通过述及将本文中所引用的所有参考文献（包括专利申请和出版物）完整收入本文。
发明概述
本文中公开了hepsin通过Arg483-Val484肽键处的切割有效地将巨噬细胞刺激性蛋白原(pro-macrophage-stimulating protein)(pro-MSP)（MSP原）转变成巨噬细胞刺激性蛋白(MSP)。如本文中描述的，hepsin的一种生物学底物是巨噬细胞刺激性蛋白原，它是Met-原癌基因家族成员受体酪氨酸激酶Ron的一种配体。本文中显示了hepsin以有力的活性切割MSP原，产生展现正常生物学活性的活化的MSP。本发明提供了至少部分基于这些发现的方法和组合物，本文中有详细描述。hepsin及其与MSP原的相互作用是设计针对与异常或不想要的hepsin和/或MSP/Ron介导的生物学活性有关的病理状况的预防和/或治疗办法时用于实现重要细调的一种独特且有利的靶物。如此，本发明提供了用于鉴定和使用能够经由调控MSP活化的调节所涉及的分子相互作用来调控hepsin和/或MSP/Ron介导的生物学途径的物质的方法、组合物、试剂盒和制品。
因而，在一个方面，本发明提供一种筛选（或鉴定）抑制MSP原的hepsin活化的候选抑制剂（即拮抗剂）物质的方法，所述方法包括：(a)使候选物质与包含hepsin和MSP原底物的第一样品接触，并(b)比较该样品中MSP原活化单链量与包含与该第一样品相似量的hepsin和MSP原底物但未与所述候选物质接触的参照样品中MSP原活化的量，由此与该参照样品相比该第一样品中MSP原活化的量减少指示该候选物质能够抑制MSP原的hepsin活化。在一个实施方案中，样品中hepsin的量有效活化所述MSP原底物。适合在这些方法中使用的MSP原底物可以是多种形式，只要它模拟MSP原上的hepsin切割位点的特征。
MSP原底物的例子包括但不限于包含野生型形式的Arg483-Val484肽键的全长单链MSP和MSP的包含这个肽键的任何片段。此类片段可以是任何长度，例如长度为至少（约）5、7、10、15、20、25个氨基酸，或者长度介于（约）4和25、5和20、7和15个氨基酸之间。一般地和优选地，MSP原底物包含能够被野生型hepsin切割的Arg483-Val484肽键。在一些实施方案中，该MSP原底物为合成的MSP原底物。
在另一个方面，本发明提供一种筛选阻断hepsin对MSP原的活化的物质的方法，所述方法包括筛选结合（优选但不必须特异性）hepsin或MSP原且阻断hepsin和MSP原之间特定相互作用（例如结合）的物质。在一些实施方案中，该物质与hepsin竞争对MSP的结合。在一些实施方案中，该物质与MSP原竞争对hepsin的结合。在一个实施方案中，该物质包含相对于MSP原（例如人MSP原），例如人MSP的包含以肽键连接的氨基酸残基Arg483和Val484的片段具有至少约60%、70%、80%、90%、95%、99%序列相似性或同一性的氨基酸序列，由相对于MSP原（例如人MSP原），例如人MSP的包含以肽键连接的氨基酸残基Arg483和Val484的片段具有至少约60%、70%、80%、90%、95%、99%序列相似性或同一性的氨基酸序列组成，或基本上由相对于MSP原（例如人MSP原），例如人MSP的包含以肽键连接的氨基酸残基Arg483和Val484的片段具有至少约60%、70%、80%、90%、95%、99%序列相似性或同一性的氨基酸序列组成。在该物质包含此类氨基酸序列、由此类氨基酸序列组成、或基本上由此类氨基酸序列组成的一些实施方案中，该片段是突变的或至少缺乏与活性(例如Ron的活化)有关的MSP序列的一部分。
正如本领域技术人员会清楚的，与上文所述的那些一致的筛选测定法还可包括筛选hepsin-MSP复合物形成以获得第一组候选调控性物质的第一步骤，接着是基于第一组候选调控性物质调控MSP原活化和/或MSP原转变成生物学活性形式的能力的筛选的第二步骤。合适的读出结果(readout)可以是本领域技术人员基于酶-底物复合物形成和/或与hepsin/MSP/Ron信号传导途径有关的生物学活性的知识会清楚的任何读出结果。酶-底物复合物形成可使用例如常规生物化学测定法（例如凝胶电泳、层析、NMR、等）来测定。
在一个方面，本发明提供破坏hepsin/MSP相互作用的拮抗剂。例如，本发明提供抑制MSP原的hepsin切割（例如Arg483-Val484位置处的切割）的分子。该分子可以以任何数目的方式发挥其抑制功能，包括但不限于结合hepsin或MSP原使得MSP原的hepsin切割受到抑制、结合hepsin-MSP原复合物使得MSP原的切割受到抑制、和/或结合MSP原或hepsin（单独的或复合物中的）使得hepsin切割MSP的效果（例如抑制hepsin的切割作用之后的MSP释放）受到抑制。在一个实施方案中，本发明的拮抗剂分子抑制与MSP原/Ron活化有关的生物学活性。
在一个方面，本发明的拮抗剂衍生自本文中描述的发现，即来自肝细胞生长因子激活物抑制剂（HAI-1、HAI-1B、HAI-2）的片段是MSP原的hepsin活化的有力抑制剂。在一个实施方案中，本发明提供hepsin对MSP原的活化的拮抗剂，所述拮抗剂至少包含人HAI-1、HAI-1B或HAI-2的一部分（包括整个）。在一个实施方案中，所述部分包含能够抑制hepsin对MSP原的活化的库尼茨(Kunitz)域(KD)序列。在一个实施方案中，所述库尼茨域序列为HAI-1或HAI-1B的库尼茨域1(KD1)。在一个实施方案中，本发明的拮抗剂包含与人HAI-1的野生型KD1具有至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%序列同一性的变异型KD1序列，其中所述变异型序列至少具有在抑制人MSP原的hepsin切割方面与野生型KD1可比的能力。在一个实施方案中，本发明的拮抗剂包含与人HAI-1的野生型KD1具有约70%至99%、约75%至98%、约80%至97%、85%至95%序列同一性的变异型KD1序列，其中所述序列至少具有在抑制人MSP原的hepsin切割方面与野生型KD1可比的能力。在一个实施方案中，所述库尼茨域序列为HAI-2的库尼茨域之一或二者。在一个实施方案中，本发明的拮抗剂包含与野生型人HAI-2的相应库尼茨域具有至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%序列同一性的变异型HAI-2库尼茨域序列，其中所述变异型序列至少具有在抑制人MSP原的hepsin切割方面与野生型HAI-2可比的能力。在一个实施方案中，本发明的拮抗剂包含与野生型人HAI-2的相应库尼茨域具有约70%至99%、约75%至98%、约80%至97%、85%至95%序列同一性的变异型HAI-2库尼茨域序列，其中所述序列至少具有在抑制人MSP原的hepsin切割方面与野生型HAI-2可比的能力。
在一些实施方案中，本发明的拮抗剂是或包含小分子、肽、抗体、抗体片段、适体、或其组合。本文中描述的拮抗剂可以使用本领域已知技术（包括下文更为详细描述的那些）基于本文所述hepsin和MSP原相互作用的发现常规获得。例如，在一些实施方案中，本发明的拮抗剂与hepsin竞争对MSP原的结合，但是没有在hepsin切割位点处（例如在Arg483-Val484处）切割MSP原的能力。在一些实施方案中，本发明的拮抗剂与MSP原竞争对hepsin的结合。例如，在一个实施方案中，所述拮抗剂包含相对于MSP原（例如人MSP原）具有至少约60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%序列相似性或同一性的氨基酸序列，由相对于MSP原（例如人MSP原）具有至少约60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%序列相似性或同一性的氨基酸序列组成，或基本上由相对于MSP原（例如人MSP原）具有至少约60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%序列相似性或同一性的氨基酸序列组成，且能够实质性结合hepsin，但缺少hepsin切割位点（例如MSP原Arg483-Val484肽连接）和/或缺少生物学活性（例如其中MSPβ链是突变的，使得其功能实质性降低或消除，等）。在一个实施方案中，本发明的拮抗剂包含能够结合hepsin的MSP原片段，由能够结合hepsin的MSP原片段组成，或基本上由能够结合hepsin的MSP原片段组成，其中所述片段至少缺乏与生物学活性有关的MSP序列的一部分。
如此，本发明提供能够实质性结合hepsin但具有与野生型MSP相比降低的MSP生物学活性的MSP（或MSP原）突变体，例如MSP活性的拮抗剂或展现MSP生物学活性降低而非缺失的MSP变体。在一个实施方案中，本发明的拮抗剂能够抑制野生型（在体外或在体内）MSP的生物学活性（此类生物学活性包括但不限于纤溶酶原作为底物的生物学活性）。在一个实施方案中，本发明的拮抗剂提供降低的MSP生物学活性。
在一些实施方案中，本发明的抗体拮抗剂包含阻断MSP原的hepsin活化的抗hepsin抗体。在一些实施方案中，该抗hepsin抗体包含(a)轻链，该轻链包含(i)HVR-L1，其序列RASQSVSSAVA(SEQ ID NO:2)；(ii)HVR-L2，其包含序列SASSLYS(SEQ ID NO:3)；和(iii)HVR-L3，其包含序列QQYYSSYYLLT(SEQ ID NO:4)；和/或(b)重链，该重链包含(i)HVR-H1，其包含序列GFNFSYSYMH(SEQ ID NO:5)；(ii)HVR-H2，其包含序列ASIYSYYGSTYYADSVKG(SEQ ID NO:6)；和(iii)HVR-H3，其包含序列ARSDSWSYKSGYTQKIYSKGLDY(SEQ ID NO:7)。在一些实施方案中，该抗hepsin抗体包含轻链可变区和/或重链可变区，该轻链可变区包含序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASSLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSSYYLLTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:8)，该重链可变区包含序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNFSYSYMHWVRQAPGKGLEWVASIYSYYGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSDSWSYKSGYTQKIYSKGLDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:9)。在一些实施方案中，该抗体是单克隆抗体。在其它实施方案中，该抗体是多克隆抗体。在一些实施方案中，该抗体选自下组：嵌合抗体，亲和力成熟抗体，人源化抗体，和人抗体。在某些实施方案中，该抗体是抗体片段。在一些实施方案中，该抗体是Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、或scFv。
在一些实施方案中，本发明的物质或分子对hepsin的结合抑制hepsin底物的hepsin活化。在一些实施方案中，本发明的物质或分子对hepsin的结合竞争性抑制hepsin底物的hepsin活化。在一个实施方案中，该物质在封闭hepsin活性（例如催化）位点的化合物缺失下结合hepsin，但是在封闭hepsin活性位点的化合物存在下不结合hepsin。
在一些实施方案中，所述物质或分子对hepsin的结合抑制由MSP诱导的细胞生长（诸如细胞增殖、存活、血管发生、形态发生、迁移）。在一些实施方案中，所述物质或分子对hepsin的结合抑制Ron受体活化。在一些实施方案中，本发明的物质或分子对hepsin的结合抑制hepsin底物结合hepsin。在一些实施方案中，本发明的物质或分子对hepsin的结合不抑制底物结合hepsin。在一些实施方案中，本发明的物质或分子对hepsin的结合抑制hepsin活性，诸如hepsin酶活性。在一些实施方案中，hepsin酶活性包含切割hepsin的多肽底物。在一个实施方案中，hepsin的多肽底物是MSP原。
在一些实施方案中，本发明的拮抗剂通过本文所述本发明的筛选或鉴定方法来获得。
在一个方面，本发明的拮抗剂分子连接有毒素，诸如细胞毒剂。这些分子可以与叠加/增强剂，诸如放射和/或化疗剂组合配制或施用。
本发明还提供可用于调控与hepsin/MSP/Ron轴失调有关的疾病状态的方法和组合物。如此，在一个方面，本发明提供一种调控受试者中的MSP原活化的方法，所述方法包括对该受试者施用本发明的hepsin/MSP调控剂分子（例如本文所述抑制MSP原的hepsin切割的拮抗剂分子），由此MSP原活化得到调控。在一个实施方案中，所述分子是抑制MSP活性的拮抗剂。在一个方面，本发明提供一种治疗受试者中与MSP失调有关的病理状况的方法，所述方法包括对该受试者施用本发明的拮抗剂（例如本文所述hepsin的MSP原切割的任何拮抗剂），由此MSP原活化得到抑制。在一个方面，本发明提供一种调控受试者中的Ron活化的方法，所述方法包括对该受试者施用本发明的MSP/Ron调控剂分子（例如本文所述抑制MSP原的hepsin活化的拮抗剂分子），由此Ron活化得到调控。在一个实施方案中，所述分子是抑制MSP/Ron活性的MSP/Ron拮抗剂。在一个方面，本发明提供一种治疗受试者与Ron失调有关的病理状况的方法，所述方法包括对该受试者施用本发明的Ron拮抗剂（例如本文所述hepsin的MSP原切割的任何拮抗剂），由此Ron活化得到抑制。
MSP/Ron信号传导途径涉及多种生物学和生理学功能，例如细胞生长刺激（例如细胞增殖、细胞存活、细胞迁移、细胞形态发生）和免疫应答（例如升高的炎症应答、巨噬细胞升高的NO生成）。
如此，在一个方面，本发明提供一种抑制表达Ron或MSP或二者的细胞生长（例如细胞生长、增殖或存活）的方法，其中该细胞生长至少部分依赖于hepsin、Ron和/或MSP，所述方法包括使所述细胞与本发明的拮抗剂接触，由此引起所述细胞的生长的抑制。
在一个方面，本发明提供一种用于抑制细胞迁移的方法，其中所述细胞的迁移至少部分依赖于hepsin、Ron和/或MSP，所述方法包括使所述细胞与有效量的本发明拮抗剂接触，由此抑制所述细胞的生长。
如此，在一个方面，本发明提供一种促进表达Ron或MSP或二者的细胞凋亡的方法，其中该细胞存活至少部分依赖于hepsin、Ron和/或MSP，所述方法包括使所述细胞与本发明的拮抗剂接触，由此引起对所述细胞生长的抑制。
在还有另一个方面，本发明提供一种抑制免疫应答（例如炎症）的方法，其中该免疫应答至少部分依赖于hepsin、Ron和/或MSP，所述方法包括对细胞、组织、和/或具有与异常免疫应答有关的状况的受试者施用本发明的拮抗剂，由此免疫应答得到抑制。
在一个方面，本发明提供本发明的拮抗剂在制备药物中的用途，该药物用于治疗性和/或预防性处理疾病，诸如癌症、肿瘤、细胞增殖性病症、和/或免疫性（诸如自身免疫性）病症。该拮抗剂可以是本文所述任何形式的，包括抗体、抗体片段、小分子（例如有机分子）、多肽（例如寡肽）、核酸（例如寡核苷酸，诸如反义寡核苷酸或干扰RNA）、适体、或其组合。
在一个方面，本发明提供本发明的核酸在制备药物中的用途，该药物治疗性和/或预防性处理疾病，诸如癌症、肿瘤、细胞增殖性病症和/或免疫性（诸如自身免疫性）病症。
在一个方面，本发明提供本发明的表达载体在制备药物中的用途，该药物用于治疗性和/或预防性处理疾病，诸如癌症、肿瘤、细胞增殖性病症和/或免疫性（诸如自身免疫性）病症。
在一个方面，本发明提供本发明的宿主细胞在制备药物中的用途，该药物用于治疗性和/或预防性处理疾病，诸如癌症、肿瘤、细胞增殖性病症和/或免疫性（诸如自身免疫性）病症。
在一个方面，本发明提供本发明的制品在制备药物中的用途，该药物用于治疗性和/或预防性处理疾病，诸如癌症、肿瘤、细胞增殖性病症、免疫性（诸如自身免疫性）病症和/或血管发生相关病症（伤口愈合）。
在一个方面，本发明提供本发明的试剂盒在制备药物中的用途，该药物用于治疗性和/或预防性处理疾病，诸如癌症、肿瘤、细胞增殖性病症和/或免疫性（诸如自身免疫性）病症。
本发明的方法可用于影响任何合适病理状态，例如与hepsin和/或Ron/MSP信号传导途径失调有关的细胞和/或组织。本文中描述了例示性病症，而且包括选自下组的癌症：非小细胞肺癌，卵巢癌，甲状腺癌，睾丸癌，子宫内膜癌，头颈癌（例如头颈鳞状细胞癌），脑癌（例如成神经细胞瘤或脑膜瘤），皮肤癌（例如黑素瘤、基底细胞癌、或鳞状细胞癌），膀胱癌（例如移行细胞癌），乳腺癌，胃癌，结肠直肠癌(CRC)，肝细胞癌，宫颈癌，肺癌，胰腺癌，前列腺癌，和肾癌，和子宫内膜癌。
在一个实施方案中，在本发明的方法中被靶向的细胞是癌细胞。例如，所述癌细胞可以是选自下组的癌细胞：乳腺癌细胞，结肠直肠癌细胞，肺癌细胞（非小细胞肺癌细胞），甲状腺癌细胞，多发性骨髓瘤细胞，睾丸癌细胞，乳头状癌细胞，结肠癌细胞，胰腺癌细胞，卵巢癌细胞，宫颈癌细胞，中枢神经系统癌细胞，骨源性肉瘤细胞，肾癌细胞，肝细胞性癌细胞，膀胱癌细胞（例如移行细胞癌细胞），胃癌细胞，头颈鳞癌细胞，黑素瘤细胞，白血病细胞，子宫内膜癌细胞，和结肠腺瘤细胞。在一个实施方案中，在本发明的方法中被靶向的细胞是过度增生的和/或增生的细胞。在另一个实施方案中，在本发明的方法中被靶向的细胞是发育不良的细胞。在又一个实施方案中，在本发明的方法中被靶向的细胞是转移的细胞。
本发明的方法可进一步包含别的治疗步骤。例如，在一个实施方案中，该方法进一步包含将被靶定的细胞和/或组织（例如癌细胞）暴露于辐射处理(radiation treatment)或化疗剂的步骤。
如本文所述，Ron活化是一种重要的生物学过程，其失调导致众多病理状况。因而，在本发明的方法的一个实施方案中，靶定的细胞（例如癌细胞）是Ron的活化与相同组织起源的正常细胞相比增强的细胞。在一个实施方案中，本发明的方法引起靶定细胞死亡。例如，与本发明的拮抗剂接触可导致细胞失去经由Ron途径发信号的能力。
Ron活化（及如此信号传导）的失调可源自多种细胞变化，包括例如MSP（Ron的关联配体）和/或Ron自身的过表达。因而，在一些实施方案中，本发明的方法包括靶向如下的细胞，其中所述细胞（例如癌细胞）的Ron或MSP或二者表达与相同组织起源的正常细胞相比更加丰富。
MSP原活化（及如此Ron的活化）的失调可源自多种细胞变化，包括例如hepsin、MSP原、和/或Ron的过表达。因而，在一些实施方案中，本发明的方法包括靶向如下的细胞或组织，其中所述细胞或组织（例如癌细胞或组织）的hepsin、MSP原和/或Ron表达与正常对应细胞或组织相比更加丰富。
在一个方面，本发明提供组合物，其包含一种或多种本发明拮抗剂和载体。在一个实施方案中，该载体是药学可接受的。
在一个方面，本发明提供核酸，其编码本发明的拮抗剂。在一个实施方案中，本发明的核酸编码拮抗剂，该拮抗剂是或包含多肽（例如寡肽）。在一个实施方案中，本发明的核酸编码拮抗剂，该拮抗剂是或包含抗体或其片段。
在一个方面，本发明提供载体，其包含本发明的核酸。
在一个方面，本发明提供宿主细胞，其包含本发明的核酸或载体。载体可以是任何类型的，例如重组载体，诸如表达载体。可以使用多种宿主细胞任一。在一个实施方案中，宿主细胞是原核细胞，例如大肠杆菌。在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，例如哺乳动物细胞，诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
在一个方面，本发明提供用于制备本发明的拮抗剂的方法。例如，本发明提供一种制备拮抗剂的方法，该拮抗剂是或包含抗体（或其片段），所述方法包括在合适的宿主细胞中表达本发明的重组载体（其包含编码所述抗体（或其片段）的序列），并回收所述抗体（或其片段）。在另一个例子中，本发明提供一种制备拮抗剂的方法，该拮抗剂是或包含多肽（诸如寡肽），所述方法包括在合适的宿主细胞中表达本发明的重组载体（其编码所述多肽（诸如寡肽）），并回收所述多肽（诸如寡肽）。
在一个方面，本发明提供一种制品，其包含容器；和该容器中装的组合物，其中该组合物包含一种或多种本发明拮抗剂。在一个实施方案中，该组合物包含本发明的核酸。在一个实施方案中，包含拮抗剂的组合物进一步包含载体，该载体在一些实施方案中是药学可接受的。在一个实施方案中，本发明的制品进一步包含关于将该组合物（例如该拮抗剂）施用于受试者的说明。
在一个方面，本发明提供一种试剂盒，其包含第一容器，该第一容器中装有包含一种或多种本发明拮抗剂的组合物；和第二容器，该第二容器中装有缓冲剂。在一个实施方案中，该缓冲剂是药学可接受的。在一个实施方案中，包含拮抗剂的组合物进一步包含载体，该载体在一些实施方案中是药学可接受的。在一个实施方案中，试剂盒进一步包含关于将该组合物（例如该拮抗剂）施用于受试者的说明。
在一个方面，本发明提供一种组合物，其包含纯化的MSP原和hepsin。在一些实施方案中，该组合物进一步包含表达Ron的细胞。
在一个方面，本发明提供用于在样品中检测MSP原的方法，包括(1)在允许hepsin水解加工MSP的条件下使该样品与hepsin接触，并(2)检测hepsin活化的MSP的存在。
在一个方面，本发明提供用于在样品中检测hepsin的方法，包括(1)在允许hepsin蛋白水解加工MSP的条件下使该样品与MSP原接触，并(2)检测hepsin活化的MSP的存在。
附图简述
图1：在体外hepsin对MSP原的活化。在于37°C温育1小时时，重组hepsin以剂量依赖性方式活化MSP原。将产物在还原性条件下在SDS-PAGE上分开。约25kDa条带（描绘的）N端测序指示这是β链，而且因此hepsin在Arg483-Val484键处切割MSP原。图1公开SEQ ID NO:17。
图2：LnCap-34细胞中细胞表面表达的hepsin对MSP原的活化。将稳定过表达hepsin的LnCap-34细胞血清饥饿并用125I-MSP原单独或与不同抑制剂组合处理3小时。重组hepsin(10nM)用作阳性对照。在3小时后观察到MSP原加工与实验起点相比的显著升高。抑制剂KQLR(SEQ ID NO 10)、KD1和抗hepsin抗体Fab25有效阻断MSP原的活化。
图3：hepsin活化的MSP对Ron的结合。(a)为了表面等离振子共振实验，使用胺偶联抗Fc特异性抗体的CM5芯片在生物传感器上捕捉Ron-Fc。没有观察到可检测的MSP原(1μM)对Ron的结合，而hepsin活化的MSP显示对Ron的高结合亲和力(KD 7nM)，用1:1结合模型拟合数据。(b)在测量MSP对Ron的结合的ELISA实验中，给出半最大结合的测定有效浓度(EC50)为0.519nM。
图4：S6和MAP激酶的磷酸化。单独的hepsin或MSP原均没有有效激活Ron信号传导途径，而用hepsin处理MSP原以剂量依赖性方式显示出有力的对MAP激酶和S6激酶二者的磷酸化。
图5：腹膜巨噬细胞形态变化测定法。在用hepsin活化的MSP刺激时，腹膜巨噬细胞经历细胞形状的独特变化，表现为突出和伸长。hepsin活化的MSP的影响与商品化MSP以及HGFA活化的MSP的效果相当。
图6：趋化性测定法。用hepsin处理MSP原导致腹膜巨噬细胞迁移的显著升高(p<0.001)，而且影响与来自商业来源的成熟MSP相当。抗hepsin抑制剂（抗hepsin抗体Fab25）预处理展示出巨噬细胞迁移的显著降低。
图7：对氮氧化物合成的抑制。原代小鼠骨髓巨噬细胞显示LPS存在下有力的氮氧化物生成。hepsin活化的MSP显著削弱骨髓衍生巨噬细胞中的NO生成。hepsin活化的MSP的影响与可商购的MSP相当。用MSP原或与hepsin和抗hepsin抗体Fab25混合的MSP原处理不抑制响应LPS发生的有力的氮氧化物生成。
图8：天然人hepsin的氨基酸序列的一个实施方案(SEQ ID NO:18)。
图9：(A)和(B)天然人hepsin的氨基酸序列的另一个实施方案(SEQ ID NO:19)。
图10：天然人巨噬细胞刺激性蛋白原（MSP原）的氨基酸序列的一个实施方案(SEQID NO:20)。
发明详述
本发明提供了包含MSP/Ron信号传导途径调控剂的方法、组合物、试剂盒和制品，包括使用此类调控剂的方法。
本文中提供了这些方法、组合物、试剂盒和制品的详情。
通用技术
除非另有说明，本发明的实施将采用分子生物学（包括重组技术）、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些都在本领域的技术范围内。文献中充分阐述了此类技术，诸如“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”,second edition(Sambrooket al.,1989);“Oligonucleotide Synthesis”(M.J.Gait,ed.,1984);“Animal CellCulture”(R.I.Freshney,ed.,1987);“Methods in Enzymology”(Academic Press,Inc.);“Current Protocols in Molecular Biology”(F.M.Ausubel et al.,eds.,1987,andperiodic updates);“PCR:The Polymerase Chain Reaction”,(Mullis et al.,ed.,1994);“A Practical Guide to Molecular Cloning”(Perbal Bernard V.,1988);“PhageDisplay:A Laboratory Manual”(Barbas et al.,2001)。
定义
术语“hepsin”在用于本文时涵盖能够以与野生型hepsin相似的方式进行MSP原切割的天然序列多肽、多肽变体、及天然序列多肽和多肽变体的片段（本文中有进一步定义）。本文所述hepsin多肽可以从多种来源分离，诸如人组织类型或其它来源，或者通过重组或合成方法制备。术语“hepsin”、“hepsin多肽”、“hepsin酶”、和“hepsin蛋白”还包括本文中所公开的hepsin多肽的变体。
“天然序列hepsin多肽”包括与衍生自自然界的相应hepsin多肽具有相同氨基酸序列的多肽。在一个实施方案中，天然序列hepsin多肽包含图8的氨基酸序列。在一个实施方案中，天然序列hepsin多肽包含图9的氨基酸序列。此类天然序列hepsin多肽可以从自然界分离，或者可通过重组或合成手段生成。术语“天然序列hepsin多肽”明确涵盖天然存在的截短或分泌形式的特定hepsin多肽（例如胞外结构域序列）、该多肽的天然存在变异形式（例如可变剪接形式）和天然存在等位变体。
“hepsin多肽变体”或其变异意指与本文中所公开的天然序列hepsin多肽序列具有至少约80%氨基酸序列同一性的hepsin多肽，一般是本文中所定义的活性hepsin多肽。此类hepsin多肽变体包括例如在天然氨基酸序列的N-或C-末端添加或删除一个或多个氨基酸残基的hepsin多肽。通常，hepsin多肽变体与本文中所公开的天然序列hepsin多肽序列具有至少约80%的氨基酸序列同一性，或者至少约81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的氨基酸序列同一性。通常，hepsin变异多肽的长度为至少约10个氨基酸，或者长度为至少约20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600个氨基酸，或更多。任选的是，hepsin变异多肽与天然hepsin多肽序列相比具有不超过一处保守氨基酸替代，或者与天然hepsin多肽序列相比具有不超过2、3、4、5、6、7、8、9或10处保守氨基酸替代。
关于肽或多肽序列的“百分比(%)氨基酸序列同一性”定义为对比序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与特定肽或多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的比对可以本领域技术范围内的多种方式进行，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可决定用于测量比对的适宜参数，包括对所比较序列全长获得最大比对所需的任何算法。然而，为了本发明的目的，%氨基酸序列同一性值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2获得的，如美国专利No.6,828,146中记载的。
术语“载体”在用于本文时意指能够运输与其连接的其它核酸的核酸分子。一类载体是“质粒”，指其中可连接另外的DNA区段的环状双链DNA环。另一类载体是噬菌体载体。另一类载体是病毒载体，其中可将另外的DNA区段连接到病毒基因组中。某些载体能够在其所导入的宿主细胞中自主复制（例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体）。其它载体（例如非附加型哺乳动物载体）可在导入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，由此随着宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其可操作连接的基因表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”（或简称为“重组载体”）。通常，在重组DNA技术中有用的表达载体常常是质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是载体的最常用形式。
“多核苷酸”或“核酸”在本文中可互换使用，指任何长度的核苷酸聚合物，包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经过修饰的核苷酸或碱基、和/或其类似物，或者是可通过DNA或RNA聚合酶或者通过合成反应掺入聚合物的任何底物。多核苷酸可包含经过修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸及其类似物。如果有的话，对核苷酸结构的修饰可以在装配聚合物之前或之后进行。核苷酸序列可以由非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在合成后进一步修饰，诸如通过与标记物偶联。其它类型的修饰包括例如“帽”，将一个或多个天然存在的核苷酸用类似物替代，核苷酸间修饰诸如例如具有不带电荷连接（例如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺酯(phosphoamidate)、氨基甲酸酯等）和具有带电荷连接（例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等）的修饰，含有悬垂模块(pendant moiety)诸如例如蛋白质（例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚L-赖氨酸等）的修饰、具有嵌入剂（例如吖啶、补骨脂素等）的修饰、含有螯合剂（例如金属、放射性金属、硼、氧化性金属等）的修饰、含有烷化剂的修饰、具有经修饰连接（例如α端基异构核酸(anomeric nucleic acid)等）的修饰、以及未修饰形式的多核苷酸。另外，通常存在于糖类中的任何羟基可以用例如膦酸(phosphonate)基团、磷酸(phosphate)基团替换，用标准保护基团保护，或活化以制备与别的核苷酸的别的连接，或者可偶联至固体或半固体支持物。5'和3'末端OH可磷酸化或者用胺或1-20个碳原子的有机加帽基团模块取代。其它羟基也可衍生成标准保护基团。多核苷酸还可含有本领域普遍知道的核糖或脱氧核糖糖类的类似物形式，包括例如2'-氧-甲基、2'-氧-烯丙基、2'-氟-或2'-叠氮-核糖，碳环糖类似物，α-端基异构糖，差向异构糖诸如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖，无环类似物及脱碱基核苷类似物诸如甲基核糖核苷。可用备选连接基团替换一个或多个磷酸二酯连接。这些备选连接基团包括但不限于以下实施方案，其中磷酸酯用P(O)S（“硫代酸酯”(thioate)）、P(S)S（“二硫代酸酯”(dithioate)）、(O)NR2（“酰胺酯”(amidate)）、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2（“甲缩醛”(formacetal)）替代，其中R或R'各自独立为H或者取代的或未取代的烃基（1-20个C），任选含有醚(-O-)连接、芳基、烯基、环烃基、环烯基或芳烃基(araldyl)。并非多核苷酸中的所有连接都必需是相同的。前述描述适用于本文中提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。
“寡核苷酸”在用于本文时一般指短的多核苷酸，一般是单链，一般是合成的，长度一般但不是必需小于约200个核苷酸。术语“寡核苷酸”与“多核苷酸”并不互相排斥。上文关于多核苷酸的描述同样且完全适用于寡核苷酸。
如本文中所使用的，除非另有明确的或上下文说明，术语“巨噬细胞刺激性蛋白”和“MSP”或“巨噬细胞刺激性蛋白原”和“MSP原”指任何天然的或变异的（无论是天然存在的或合成的）能够在容许下述过程发生的条件下活化纤溶酶原的MSP多肽或能被hepsin活化成能够在容许下述过程发生的条件下活化纤溶酶原的活化MSP的MSP多肽。术语“野生型MSP”通常指包含天然存在MSP蛋白质的氨基酸序列的多肽，例如图10所示和SwissProt登录号P26927所列（通过述及将此登录号处所列参考文献收入本文）。
术语“抗体”和“免疫球蛋白”以最广义互换使用，包括单克隆抗体（例如全长或完整单克隆抗体）、多克隆抗体、多价抗体、多特异性抗体（例如双特异性抗体，只要它们展现出期望的生物学活性），而且还可以包括某些抗体片段（如本文中更为详细描述的）。抗体可以是人的、人源化的和/或亲和力成熟的。
“抗体片段”只包含完整抗体的一部分，其中所述部分优选保留该部分存在于完整抗体中时通常与之有关的至少一项、优选大多数或所有功能。在一个实施方案中，抗体片段包含完整抗体的抗原结合位点，如此保留结合抗原的能力。在另一个实施方案中，抗体片段，例如包含Fc区的抗体片段，保留与Fc区存在于完整抗体中时通常与之有关的至少一项生物学功能，诸如FcRn结合、抗体半衰期调控、ADCC功能和补体结合。在一个实施方案中，抗体片段是体内半衰期与完整抗体基本上相似的单价抗体。例如，这样的抗体片段可包含一个抗原结合臂且其与能够赋予该片段以体内稳定性的Fc序列相连。
术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体包含本质上相同的氨基酸序列，除了可能以极小量存在的可能的天然存在突变外。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原。此外，与典型的包含针对不同决定簇（表位）的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。
单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(美国专利No.4,816,567和Morrison etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。
非人（例如鼠）抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体指人免疫球蛋白（受体抗体）中的高变区残基用具有期望特异性、亲和力和能力的非人物种（供体抗体）诸如小鼠、大鼠、家兔或非人灵长类的高变区残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的框架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有找到的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体将包含至少一个、通常两个基本上整个如下可变域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Jones等,Nature321:522-525(1986);Riechmann等,Nature 332:323-329(1988);Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。还可参见以下综述及其引用的参考文献：Vaswani和Hamilton,Ann.Allergy，Asthma & Immunol.1:105-115(1998);Harris,Biochem.Soc.Transactions 23:1035-1038(1995);Hurle和Gross,Curr.Op.Biotech.5:428-433(1994)。
“人抗体”指拥有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/或使用本文所公开的用于生成人抗体的任何技术生成的抗体。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“亲和力成熟的”抗体指在抗体的一个或多个CDR中具有一处或多处改变、导致该抗体对抗原的亲和力与没有这些改变的亲本抗体相比有所改进的抗体。优选的亲和力成熟的抗体将具有纳摩尔或甚至皮摩尔量级的对靶抗原的亲和力。亲和力成熟的抗体可通过本领域已知规程来生成。Marks等,Bio/Technology 10:779-783(1992)记载了通过VH和VL结构域改组进行的亲和力成熟。以下文献记载了CDR和/或框架残基的随机诱变：Barbas等,PNAS(USA)91:3809-3813(1994);Schier等,Gene 169:147-155(1995);Yelton等,J.Immunol.155:1994-2004(1995);Jackson等,J.Immunol.154(7):3310-9(1995);及Hawkins等,J.Mol.Biol.226:889-896(1992)。
“阻断性”抗体或“拮抗性”抗体指抑制或降低其所结合的抗原的生物学活性的抗体。优选的阻断性抗体或拮抗性抗体基本上或完全抑制抗原的生物学活性。
“激动性抗体(agonist antibody)”在用于本文时指模拟感兴趣多肽的至少一项功能性活性的抗体。
“病症”指任何会受益于本发明的组合物或方法的治疗的疾患。这包括慢性和急性病症或疾病，包括那些使哺乳动物倾向于所讨论病症的病理状况。本文中待治疗的病症的非限制性例子包括恶性和良性肿瘤；非白血病(non-leukemia)和淋巴样恶性肿瘤；神经元、神经胶质、星形细胞、下丘脑和其它腺、巨噬细胞、上皮、基质(stromal)和囊胚腔病症；和其它血管发生相关病症。
术语“细胞增殖性病症”和“增殖性病症”指与一定程度的异常细胞增殖有关的病症。在一个实施方案中，细胞增殖性病症指癌症。
“肿瘤”在用于本文时指所有赘生性细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。术语“癌症”、“癌性”、“细胞增殖性病症”、“增殖性病症”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。
术语“癌症”和“癌性”指向或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长/增殖和/或侵入性不受调控的生理疾患。癌症的例子包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。此类癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌、肺的鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(livercancer)、膀胱癌、肝肉瘤(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)及各种类型的头和颈癌。
在用于本文时，“治疗”或“处理”指试图改变所治疗个体或细胞的自然进程的临床干预，可以是为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的期望效果包括预防疾病的发生或复发、缓解症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、防止转移、减缓疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态、及免除或改善预后。在有些实施方案中，本发明的组合物和/或方法用于延迟疾病或病症的发生/发展。
“有效量”指在必需的剂量和时间上有效实现期望的治疗或预防效果的量。
本发明的分子（例如拮抗剂）的“治疗有效量”可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重及该分子（例如拮抗剂）在个体中引发期望应答的能力等因素而变化。治疗有效量还指该分子（例如拮抗剂）的治疗有益效果胜过任何有毒或有害后果的量。“预防有效量”指在必需的剂量和时间上有效实现期望的预防效果的量。通常而非必然，由于预防剂量是在疾病发作之前或在疾病的早期用于受试者的，因此预防有效量低于治疗有效量。
术语“细胞毒剂”在用于本文时指抑制或防止细胞的功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意图包括：放射性同位素，例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素；化疗剂，例如甲氨蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamycin)、长春花生物碱类(vinca alkaloids)（长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide)）、多柔比星(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素(mitomycin)C、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂；酶及其片段，诸如溶核酶；抗生素；和毒素，诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物起源的酶活毒素，包括其片段和/或变体；及下文披露的各种抗肿瘤药或抗癌药。下文记载了其它细胞毒剂。杀肿瘤药引起肿瘤细胞的破坏。
“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括烷化剂类(alkylating agents)，诸如塞替派(thiotepa)和环磷酰胺(cyclophosphamide)；磺酸烃基酯类(alkyl sulfonates)，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，诸如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和乌瑞替派(uredepa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenin)（尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone)）；δ-9-四氢大麻酚(tetrahydrocannabinol)（屈大麻酚(dronabinol)，）；β-拉帕醌(lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙素类(colchicines)；白桦脂酸(betulinic acid)；喜树碱(camptothecin)（包括合成类似物托泊替康(topotecan)CPT-11（伊立替康(irinotecan)，）、乙酰喜树碱、东莨菪亭(scopoletin)和9-氨基喜树碱）；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065（包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物）；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷(teniposide)；隐藻素类(cryptophycins)（特别是隐藻素1和隐藻素8）；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin（包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1）；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustards)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosoureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(enediyne)（例如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1（参见例如Agnew，Chem.Intl.Ed.Engl.33:183-186(1994)）；蒽环类抗生素(dynemicin)，包括dynemicin A；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团）、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)（包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星、盐酸多柔比星脂质体注射液和脱氧多柔比星）、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolicacid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如甲氨蝶呤、吉西他滨(gemcitabine)替加氟(tegafur)卡培他滨(capecitabine)埃坡霉素(epothilone)、和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(folinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptinium acetate；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；多糖复合物（JHS NaturalProducts,Eugene,OR）；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2″-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)（尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin)）；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)（ ）；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)（“Ara-C”）；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇(taxoids)，例如帕利他塞(paclitaxel)清蛋白改造的纳米颗粒剂型帕利他塞（ABRAXANETM）和多西他塞(doxetaxel)苯丁酸氮芥(chlorambucil)；6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；铂类似物，诸如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)铂；依托泊苷(etoposide)（VP-16）；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)奥沙利铂(oxaliplatin)；亚叶酸(leucovorin)；长春瑞滨(vinorelbine)能灭瘤(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；伊本膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄酸(retinoids)，诸如视黄酸(retinoic acid)；任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍生物；以及两种或多种上述物质的组合，诸如CHOP（环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙联合疗法的缩写）和FOLFOX（奥沙利铂（ELOXATINTM）联合5-FU和亚叶酸的治疗方案的缩写）。
该定义还包括作用为调节、降低、阻断、或抑制可促进癌生长的激素效果的抗激素剂，且常常是系统或全身治疗的形式。它们自身可以是激素。例子包括抗雌激素类和选择性雌激素受体调节剂类(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)（包括他莫昔芬）、雷洛昔芬(raloxifene)屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)抗孕酮类；雌激素受体下调剂类(ERD)；雌激素受体拮抗剂诸如氟维司群(fulvestrant)功能为抑制或关闭卵巢的药剂，例如促黄体生成激素释放激素(LHRH)激动剂，诸如醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)（和）、醋酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、醋酸布舍瑞林（buserelin acetate）和曲普瑞林(triptorelin)；其它抗雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide)；及抑制在肾上腺中调节雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制剂，诸如例如4(5)-咪唑、氨鲁米特(aminoglutethimide)、醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)依西美坦(exemestane)福美坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、伏罗唑(vorozole)来曲唑(letrozole)和阿那曲唑(anastrozole)另外，化疗剂的这种定义包括二膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)（例如或）、依替膦酸钠(etidronate)NE-58095、唑来膦酸/唑来膦酸盐(zoledronicacid/zoledronate)阿伦膦酸盐(alendronate)帕米膦酸盐(pamidronate)替鲁膦酸盐(tiludronate)或利塞膦酸盐(risedronate)以及曲沙他滨(troxacitabine)（1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物）；反义寡核苷酸，特别是抑制涉及异常(abherant)细胞增殖的信号传导途径中的基因表达的反义寡核苷酸，诸如例如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，诸如疫苗和基因疗法疫苗，例如疫苗、疫苗和疫苗；拓扑异构酶1抑制剂（例如）；rmRH（例如）；lapatinib ditosylate（ErbB-2和EGFR双重酪氨酸激酶小分子抑制剂，也称为GW572016）；COX-2抑制剂诸如塞来考昔(celecoxib)（4-(5-(4-甲基苯基)-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基)苯磺酰胺）；及任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍生物。
“生长抑制剂”在用于本文时指在体外或在体内抑制其生长依赖于MSP活化的细胞生长的化合物或组合物。因此，生长抑制剂可以是显著降低处于S期的MSP依赖性细胞百分比的药剂。生长抑制剂的例子包括阻断细胞周期行进（处于S期以外的位置）的药剂，诸如诱导G1停滞和M期停滞的药剂。经典的M期阻断剂包括长春药类(vincas)（长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine)）、紫杉烷类(taxanes)、和拓扑异构酶II抑制剂诸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)和博来霉素(bleomycin)。那些阻滞G1的药剂也溢出进入S期停滞，例如DNA烷化剂类诸如他莫昔芬(tamoxifen)、泼尼松(prednisone)、达卡巴嗪(dacarbazine)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、顺铂(cisplatin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)和ara-C。更多信息可参见《The Molecular Basis of Cancer》，Mendelsohn和Israel编，第1章，题为“Cell cycle regulation,oncogenes,and antieioplasticdrugs”，Murakaini等，WB Saunders，Philadelphia，1995，尤其是第13页。紫杉烷类（帕利他塞(paclitaxel)和多西他赛(docetaxel)）是衍生自紫杉树的抗癌药。衍生自欧洲紫杉的多西他赛(Rhone-Poulenc Rorer)是帕利他塞(Bristol-MyersSquibb)的半合成类似物。帕利他塞和多西他赛促进由微管蛋白二聚体装配成微管并通过防止解聚使微管稳定，导致对细胞中有丝分裂的抑制。
“多柔比星(Doxorubicin)”是蒽环类抗生素。多柔比星的完整化学名是(8S-顺式)-10-[(3-氨基-2,3,6-三脱氧-α-L-来苏-吡喃己糖基)氧基]-7,8,9,10-四氢-6,8,11-三羟基-8-(羟基乙酰基)-1-甲氧基-5,12-萘二酮。
(8S-cis)-10-[(3-amino-2,3,6-trideoxy-α-L-lyxo-hexapyranosyl)oxy]-7,8,9,10-tetra hydro-6,8,11-trihydroxy-8-(hydroxyacetyl)-1-methoxy-5,12-naphthacenedione
本发明的组合物和方法
A.抗体
在一个实施方案中，本发明提供了可在本文中用作治疗剂和/或诊断剂的拮抗性抗体。例示性的抗体包括多克隆的、单克隆的、人源化的、双特异性的、和异源偶联的抗体。
1．多克隆抗体
多克隆抗体优选通过在动物中多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂来生成。将相关抗原（尤其在使用合成肽时）与在待免疫的物种中有免疫原性的蛋白质偶联可能是有用的。例如，可使用双功能或衍生化试剂，例如马来酰亚胺苯甲酰磺基琥珀酰亚胺酯（经半胱氨酸残基的偶联）、N-羟基琥珀酰亚胺（经赖氨酸残基）、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2、或R1N=C=NR，其中R和R1是不同的烃基，将抗原与匙孔血蓝蛋白(KLH)、血清清蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂偶联。
通过将例如100μg或5μg蛋白质或偶联物（分别用于家兔或小鼠）与3倍体积的弗氏完全佐剂混和，并将溶液皮内注射于多个部位，由此将动物针对抗原、免疫原性偶联物或衍生物进行免疫。一个月后，通过多个部位的皮下注射，用弗氏完全佐剂中1/5-1/10初始量的肽或偶联物对动物进行强化免疫。7-14天后，采集动物的血液，并测定血清的抗体滴度。对动物进行强化直到滴度达到稳定的高水平。偶联物还可在重组细胞培养物中作为蛋白质融合物来制备。同样，适当使用凝聚剂诸如明矾来增强免疫应答。
2．单克隆抗体
单克隆抗体可以使用最初由Kohler等,Nature 256:495(1975)记载的杂交瘤方法来制备，或者可以通过重组DNA方法来制备（美国专利No.4,816,567）。
在杂交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其它合适的宿主动物，诸如仓鼠，以引发生成或能够生成如下抗体的淋巴细胞，所述抗体会特异性结合用于免疫的蛋白质。或者，可以在体外免疫淋巴细胞。免疫后，分离淋巴细胞，然后使用合适的融合剂诸如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞系融合，形成杂交瘤细胞（Goding,Monoclonal Antibodies:Principlesand Practice,pp.59-103,Academic Press,1986）。
将如此制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种和培养，所述培养基优选含有抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞（也称作融合配偶）生长或存活的一种或多种物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，那么用于杂交瘤的选择性培养基通常会含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷（HAT培养基），这些物质阻止HGPRT缺陷细胞生长。
优选的融合配偶骨髓瘤细胞是那些高效融合、支持选择的抗体生成细胞稳定地高水平生成抗体、并对针对未融合亲本细胞进行选择的选择性培养基敏感的骨髓瘤细胞。优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤系，诸如可从索尔克研究所细胞分配中心（Salk InstituteCell Distribution Center，San Diege，California，USA）获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤所衍生的细胞系，以及可从美国典型培养物保藏中心（American Type CultureCollection，Manassas，Virginia，USA）获得的SP-2及衍生物，例如X63-Ag8-653细胞。用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也已有描述（Kozbor,J.Immunol.133:3001(1984);及Brodeur等,Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications,pp.51-63,Marcel Dekker,Inc.,New York,1987）。
可对杂交瘤细胞正在其中生长的培养基测定针对抗原的单克隆抗体的生成。优选的是，通过免疫沉淀或通过体外结合测定法，诸如放射性免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)，测定由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性。
单克隆抗体的结合亲和力可通过例如Munson等,Anal.Biochem.107:220(1980)中记载的Scatchard分析来测定。
一旦鉴定得到生成具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞，所述克隆可通过有限稀释流程进行亚克隆，并通过标准方法进行培养（Goding,MonoclonalAntibodies:Principles and Practice,pp.59-103,Academic Press,1986）。适于这一目的的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可在动物中作为腹水瘤进行体内培养，例如通过将细胞i.p.注射到小鼠中。
可通过常规抗体纯化流程，诸如例如亲和层析（例如使用蛋白A或蛋白G-Sepharose）或离子交换层析、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析等，将亚克隆分泌的单克隆抗体与培养基、腹水或血清适当分开。
编码单克隆抗体的DNA易于使用常规流程分离并测序（例如通过使用能够与编码鼠抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针）。以杂交瘤细胞作为此类DNA的优选来源。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将该表达载体转染到不另外产生抗体蛋白质的宿主细胞中，诸如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。关于编码抗体的DNA在细菌中的重组表达的综述性论文包括Skerra等,Curr.Opinion in Immunol.5:256-262(1993)及Plückthun,Immunol.Revs.130:151-188(1992)。
在另一个实施方案中，可从使用McCafferty等,Nature 348:552-554(1990)所述技术构建的噬菌体抗体文库中分离单克隆抗体或抗体片段。Clackson等,Nature 352:624-628(1991)及Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)分别描述了使用噬菌体文库分离鼠抗体和人抗体。后续出版物描述了通过链改组（Marks等,Bio/Technology 10:779-783(1992)），以及组合感染和体内重组作为构建非常大的噬菌体文库的策略（Waterhouse等,Nuc.Acids Res.21:2265-2266(1993)），生成高亲和力（nM范围）的人抗体。如此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替换方法。
可以修饰编码抗体的DNA以生成嵌合或融合抗体多肽，例如通过用人重链和轻链恒定域(CH和CL)序列替代同源鼠序列（美国专利No.4,816,567;及Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851(1984)），或通过融合免疫球蛋白编码序列和非免疫球蛋白多肽（异源多肽）的整个或部分编码序列。非免疫球蛋白多肽序列可替代抗体的恒定域，或者用它们替代抗体的一个抗原结合位点的可变域，以产生嵌合二价抗体，它包含对一种抗原具有特异性的一个抗原结合位点以及对不同抗原具有特异性的另一个抗原结合位点。
3．人抗体和人源化抗体
本发明的抗体可进一步包括人源化抗体或人抗体。非人（例如鼠）抗体的人源化形式指最低限度包含自非人免疫球蛋白衍生的序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段（诸如Fv、Fab、Fab'、F(ab′)2或抗体的其它抗原结合子序列）。人源化抗体包括人免疫球蛋白（受体抗体）中的互补决定区(CDR)残基用具有期望特异性、亲和力和能力的非人物种（供体抗体）诸如小鼠、大鼠或家兔的CDR残基替换而得到的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的Fv框架残基用相应的非人残基替换。人源化抗体还可包含在受体抗体或所输入的CDR或框架序列中没有发现的残基。通常，人源化抗体包含至少一个、通常两个基本上整个如下的可变域，其中所有或基本上所有CDR区对应于非人免疫球蛋白的CDR区，且所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白共有序列的FR区。人源化抗体最好还包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区（Jones等,Nature 321:522-525(1986);Riechmann等,Nature 332:323-329(1988);及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)）。
用于将非人抗体人源化的方法在本领域是众所周知的。通常，人源化抗体具有一个或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称作“输入”残基，它们通常取自“输入”可变域。人源化可基本上依照Winter及其同事的方法实施（Jones等,Nature 321:522-525(1986);Riechmann等,Nature 332:323-327(1988);Verhoeyen等,Science 239:1534-1536(1988)），通过用啮齿类CDR序列替代相应的人抗体序列来进行。因而，此类“人源化”抗体是嵌合抗体（美国专利No.4,816,567），其中基本上少于整个人可变域用来自非人物种的相应序列替代。在实践中，人源化抗体通常是将人抗体中的一些CDR残基和可能的一些FR残基用来自啮齿类抗体中类似位点的残基替代而得到的抗体。
当抗体意图在于人类治疗性用途时，用于生成人源化抗体的人可变域的选择，包括轻链和重链二者，对于降低抗原性和HAMA应答（人抗小鼠抗体）非常重要。依照所谓的“最适(best-fit)”方法，用啮齿类抗体可变域序列对已知的人可变域序列的整个文库进行筛选。鉴定与啮齿类最接近的人V结构域序列，并接受其中的人框架区(FR)用于人源化抗体（Sims等,J.Immunol.151:2296(1993);Chothia等,J.Mol.Biol.196:901(1987)）。另一种方法使用自轻链或重链特定亚型的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架区。同一框架可用于数种不同的人源化抗体（Carter等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4285(1992);Presta等,J.Immunol.151:2623(1993)）。
更为重要的是，抗体在人源化后保持对抗原的高结合亲和力及其它有利的生物学特性。为了实现这一目的，依照一种优选的方法，通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的，且为本领域熟练技术人员所熟悉。还可获得图解和显示所选择的候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。检查这些显示图像能够分析残基在候选免疫球蛋白序列行使功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可从受体和输入序列中选出FR残基并进行组合，从而获得所需抗体特征，诸如对靶抗原的亲和力提高。通常，高变区残基直接且最实质的涉及对抗原结合的影响。
本发明涵盖人源化抗体的各种形式。例如，人源化抗体可以是抗体片段，诸如Fab，任选偶联有一种或多种细胞毒剂以生成免疫偶联物。或者，人源化抗体可以是完整的抗体，诸如完整的IgG1抗体。
作为人源化的替代方法，可生成人抗体。例如，现在有可能生成在缺乏内源免疫球蛋白生成的情况下能够在免疫后生成人抗体完整全集的转基因动物（例如小鼠）。例如，已经描述了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合删除导致对内源抗体生成的完全抑制。将人种系免疫球蛋白基因阵列(array)转移到此类种系突变小鼠中会导致在抗原攻击后生成人抗体。参见例如Jakobovits等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2551(1993);Jakobovits等,Nature 362:255-258(1993);Bruggemann等,Year in Immuno.7:33(1993);美国专利No.5,545,806,5,569,825,5,591,669(都是GenPharm的);5,545,807;及WO 97/17852。
或者，噬菌体展示技术（McCafferty等,Nature 348:552-553(1990)）可用于在体外从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)域基因全集生成人抗体和抗体片段。依照这种技术，将抗体V结构域基因以符合读码框的方式克隆到丝状噬菌体诸如M13或fd的主要或次要外壳蛋白基因中，并在噬菌体颗粒表面上展示为功能性抗体片段。因为丝状颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，以抗体的功能特性为基础进行的选择也导致编码展示那些特性的抗体的基因的选择。如此，噬菌体模拟B细胞的一些特性。噬菌体展示可以多种形式进行，综述参见例如Johnson,Kevin S.和Chiswell,David J.,Current Opinion inStructural Biology 3:564-571(1993)。V基因区段的数种来源可用于噬菌体展示。Clackson等,Nature 352:624-628(1991)从衍生自免疫小鼠脾的小型V基因随机组合文库分离得到大量不同的抗口恶唑酮抗体。可基本上遵循Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)或Griffith等,EMBO J.12:725-734(1993)所述技术，由未免疫人供体构建V基因全集，并分离针对大量不同抗原（包括自身抗原）的抗体。还可参见美国专利No.5,565,332和5,573,905。
如上所述，还可通过体外激活B细胞（参见美国专利No.5,567,610和5,229,275）来生成人抗体。
4．抗体片段
在某些情况中，使用抗体片段而非完整抗体是有利的。片段的体积较小，容许快速清除，并且可导致对实体瘤的接近和进入提高。
已经开发了用于生成抗体片段的多种技术。传统上，通过蛋白水解消化完整抗体来衍生这些片段（参见例如Morimoto等,Journal of Biochemical and BiophysicalMethods 24:107-117(1992);及Brennan等,Science 229:81(1985)）。然而，现在可直接由重组宿主细胞生成这些片段。Fab、Fv和scFv抗体片段都可在大肠杆菌中表达和由大肠杆菌分泌，如此容许容易地生成大量的这些片段。可从上文讨论的抗体噬菌体文库分离抗体片段。或者，可直接从大肠杆菌回收Fab'-SH片段，并通过化学方法偶联以形成F(ab')2片段（Carter等,Bio/Technology 10:163-167(1992)）。依照另一种方法，可直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab′)2片段。包含补救受体结合表位残基、具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab′)2片段描述于美国专利No.5,869,046。用于生成抗体片段的其它技术对熟练从业人员是显而易见的。在其它实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185；美国专利No.5,571,894；及美国专利No.5,587,458。Fv和sFv是具有完整结合位点且缺乏恒定区的唯一种类；如此，它们是合适的，因为在体内使用过程中具有降低的非特异性结合。可构建sFv融合蛋白以生成效应物蛋白质位于sFv氨基或羧基末端的融合物。参见《AntibodyEngineering》，Borrebaeck编，见上文。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如如美国专利No.5,641,870中所描述的。此类线性抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。
5.双特异性抗体
双特异性抗体指对至少两种不同表位具有结合特异性的抗体。例示性的双特异性抗体可结合本文所述hepsin、MSP和/或hepsin:MSP复合物的两种不同表位。其它此类抗体可将这些实体上的结合位点与针对另一种多肽的结合位点组合。或者，可以将抗体臂与结合白细胞上触发分子诸如T细胞受体分子（例如CD3）或IgG的Fc受体(FcγR)诸如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)的臂组合，从而将细胞防御机制聚焦和定位于表达和/或结合hepsin和/或MSP的细胞。双特异性抗体还可用于将细胞毒剂定位于表达和/或结合hepsin、MSP和/或hepsin:MSP复合物的细胞。这些抗体拥有多肽结合臂及结合细胞毒剂（例如肥皂草毒蛋白(saporin)、抗干扰素-α、长春花生物碱(vinca alkaloid)、蓖麻毒蛋白A链、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原）的臂。可将双特异性抗体制备成全长抗体或抗体片段（例如F(ab')2双特异性抗体）。
WO 96/16673描述了双特异性抗ErbB2/抗FcγRIII抗体，而美国专利No.5,837,234公开了双特异性抗ErbB2/抗FcγRI抗体。双特异性抗ErbB2/Fcα抗体显示于WO 98/02463。美国专利No.5,821,337教导了双特异性抗ErbB2/抗CD3抗体。
用于生成双特异性抗体的方法是本领域已知的。全长双特异性抗体的传统生成基于两种免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两种链具有不同的特异性（Millstein等,Nature 305:537-539(1983)）。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤（四源杂交瘤(quadroma)）生成10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤进行的正确分子的纯化相当麻烦，且产物产量低。WO 93/08829及Traunecker等,EMBO J.10:3655-3659(1991)中公开了类似的流程。
依照一种不同的方法，将具有所需结合特异性（抗体-抗原结合位点）的抗体可变域与免疫球蛋白恒定域序列融合。优选的是，融合使用包含至少部分铰链、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定域。优选的是，在至少一种融合物中具有包含轻链结合所必需的位点的第一重链恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合物以及，如果需要，免疫球蛋白轻链的DNA插入分开的表达载体中，并共转染到合适的宿主细胞中。在用于构建的三种多肽链比例不等时提供期望双特异性抗体的最佳产量的实施方案中，这为调整三种多肽片段的相互比例提供了更大的灵活性。然而，在至少两种多肽链以相同比率表达导致高产量时或在该比率对期望链组合的产量没有显著影响时，有可能将两种或所有三种多肽链的编码序列插入同一表达载体。
在本方法的一个优选实施方案中，双特异性抗体由一个臂上具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链，和另一个臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对（提供第二结合特异性）构成。由于免疫球蛋白轻链仅在半个双特异性分子中的存在提供了分离的便利途径，因此发现这种不对称结构便于将所需双特异性化合物与不想要的免疫球蛋白链组合分开。该方法公开于WO94/04690。关于生成双特异性抗体的其它细节参见例如Suresh等,Methodsin Enzymology 121:210(1986)。
依照美国专利No.5,731,168中描述的另一种方法，可改造一对抗体分子之间的界面，将从重组细胞培养物中回收的异二聚体的百分比最大化。优选的界面包含至少部分CH3结构域。在该方法中，将第一抗体分子界面的一个或多个小型氨基酸侧链用较大侧链（例如酪氨酸或色氨酸）替换。通过用较小氨基酸侧链（例如丙氨酸或苏氨酸）替换大型氨基酸侧链，在第二抗体分子的界面上产生大小与大型侧链相同或相似的补偿性“空腔”。这提供了较之其它不想要的终产物诸如同二聚体提高异二聚体产量的机制。
双特异性抗体包括交联或“异源偶联”抗体。例如，异源偶联物中的一种抗体可与亲合素偶联，另一种抗体与生物素偶联。例如，此类抗体建议用于将免疫系统细胞靶向不想要的细胞（美国专利No.4,676,980），及用于治疗HIV感染（WO 91/00360、WO 92/200373及EP03089）。可使用任何便利的交联方法制备异源偶联抗体。合适的交联剂是本领域众所周知的，并且连同许多交联技术一起公开于美国专利No.4,676,980。
文献中还描述了由抗体片段生成双特异性抗体的技术。例如，可使用化学连接来制备双特异性抗体。Brennan等,Science 229:81(1985)描述了一种规程，其中通过蛋白水解切割完整抗体以生成F(ab')2片段。将这些片段在存在二硫醇络合剂亚砷酸钠的情况下还原，以稳定邻近的二硫醇并防止分子间二硫键的形成。然后将产生的Fab'片段转变为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后将Fab'-TNB衍生物之一通过巯基乙胺的还原重新恢复成Fab'-硫醇，并与等摩尔量的另一种Fab'-TNB衍生物混合，以形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可用作酶的选择性固定化试剂。
最近的进展使得从大肠杆菌中直接回收Fab'-SH片段变得更加容易，这些片段可化学偶联以形成双特异性抗体。Shalaby等,J.Exp.Med.175:217-225(1992)描述了完全人源化的双特异性抗体F(ab')2分子的生成。每个Fab'片段由大肠杆菌分开分泌，并在体外进行定向化学偶联以形成双特异性抗体。如此形成的双特异性抗体能够结合过表达ErbB2受体的细胞和正常人T细胞，以及触发人细胞毒性淋巴细胞针对人乳房肿瘤靶的溶解活性。还描述了从重组细胞培养物直接制备和分离双特异性抗体片段的多种技术。例如，已使用亮氨酸拉链生成双特异性抗体。Kostelny等,J.Immunol.148(5):1547-1553(1992)。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体的Fab'部分连接。抗体同二聚体在铰链区还原而形成单体，然后重新氧化而形成抗体异二聚体。这种方法也可用于生成抗体同二聚体。由Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)描述的“双抗体(diabody)”技术提供了制备双特异性抗体片段的替代机制。该片段包含通过接头相连的VH和VL，所述接头太短使得同一条链上的两个结构域之间不能配对。因而，迫使一个片段上的VH和VL结构域与另一个片段上的互补VL和VH结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。还报道了通过使用单链Fv(scFv)二聚体制备双特异性抗体片段的另一种策略。参见Gruber等,J.Immunol.152:5368(1994)。
涵盖具有超过两个效价的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tutt等,J.Immunol.147:60(1991)。
6．异源偶联抗体
异源偶联抗体也在本发明的范围之内。异源偶联抗体由两种共价连接的抗体构成。此类抗体建议例如用于将免疫系统细胞靶向不想要的细胞（美国专利No.4,676,980）及用于治疗HIV感染（WO 91/00360;WO 92/200373;EP03089）。可在体外使用合成蛋白质化学的已知方法制备抗体，包括那些涉及交联剂的方法。例如，可使用二硫化物交换反应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。适于此目的的试剂的例子包括亚氨基硫醇酯/盐(iminothiolate)和4-巯基丁亚氨酸甲酯(methyl-4-mercaptobutyrimidate)及例如美国专利No.4,676,980中所公开的。
7．多价抗体
多价抗体可以比二价抗体更快地受到表达该抗体所结合抗原的细胞的内化（和/或异化）。本发明的抗体可以是具有三个或更多抗原结合位点（例如四价抗体）的多价抗体（不同于IgM类），其可容易地通过编码抗体多肽链的核酸的重组表达来生成。多价抗体可包含二聚化结构域和三个或更多抗原结合位点。优选的二聚化结构域包含（或由其组成）Fc区或铰链区。在这种情况中，抗体可包含Fc区及Fc区氨基末端的三个或更多抗原结合位点。本文中优选的多价抗体包含（或由其组成）三个至约八个，但优选四个抗原结合位点。多价抗体包含至少一条多肽链（且优选两条多肽链），其中所述多肽链包含两个或多个可变域。例如，多肽链可包含VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1是第一可变域，VD2是第二可变域，Fc是Fc区的一条多肽链，X1和X2代表氨基酸或多肽，而n是0或1。例如，多肽链可包含：VH-CH1-柔性接头-VH-CH1-Fc区链；或VH-CH1-VH-CH1-Fc区链。本文中的多价抗体优选进一步包含至少两条（且优选四条）轻链可变域多肽。本文中的多价抗体可包含例如约两条至约八条轻链可变域多肽。本文涵盖的轻链可变域多肽包含轻链可变域，且任选进一步包含CL结构域。
8．效应器功能的工程改造
可能希望在效应器功能方面修饰本发明的抗体，例如为了增强抗体的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。这可通过在抗体Fc区中引入一个或多个氨基酸替代来实现。或者/另外，可在Fc区中引入半胱氨酸残基，从而容许在该区中形成链间二硫键。如此生成的同二聚体抗体可具有改善的内化能力和/或提高的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。参见Caron等,J.Exp.Med.176:1191-1195(1992)及Shopes,B.,J.Immunol.148:2918-2922(1992)。具有增强的抗肿瘤活性的同二聚体抗体还可使用如Wolff等,Cancer Research 53:2560-2565(1993)中描述的异双功能交联剂来制备。或者，抗体可改造成具有双重Fc区，由此可具有增强的补体溶解和ADCC能力。参见Stevenson等,Anti-Cancer Drug Design 3:219-230(1989)。为了提高抗体的血清半衰期，可如例如美国专利No.5,739,277中所述将补救受体结合表位掺入抗体（尤其是抗体片段）中。在用于本文时，术语“补救(salvage)受体结合表位”指IgG分子（例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4）Fc区中负责提高IgG分子体内血清半衰期的表位。
9．免疫偶联物
本发明还关于包含偶联有细胞毒剂的抗体的免疫偶联物或抗体-药物偶联物(ADC)，所述细胞毒剂诸如化疗剂、药物、生长抑制剂、毒素（例如细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素或其片段）或放射性同位素（即放射偶联物）。
在癌症的治疗中使用抗体-药物偶联物局部递送细胞毒性或细胞抑制性试剂（即杀死或抑制肿瘤细胞的药物）(Syrigos和Epenetos(1999)Anticancer Research 19：605-614；Niculescu-Duvaz和Springer(1997)Adv.Drg Del.Rev.26：151-172；US 4,975,278)，理论上容许将药物模块靶向递送至肿瘤并在那里在细胞内积聚，其中全身给药这些未偶联的药剂可在对要试图消除的肿瘤细胞造成毒性的同时对正常细胞也造成无法接受的毒性水平(Baldwin等，(1986)Lancet pp.(Mar.15，1986):603-05；Thorpe，(1985)"AntibodyCarriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review"，于MonoclonalAntibodies‘84：Biological And Clinical Applications，A.Pinchera等(编)，pp.475-506)。由此获得最大功效而毒性最小。多克隆抗体和单克隆抗体据报道都可用于这些策略(Rowland等，(1986)Cancer Immunol.Immunother.，21：183-87)。这些方法中所用的药物包括道诺霉素、多柔比星、甲氨蝶呤、和长春地辛(Rowland等，(1986)同上)。抗体-毒素偶联物中所用的毒素包括细菌毒素（诸如白喉毒素）、植物毒素（诸如蓖麻毒蛋白）、小分子毒素（诸如格尔德霉素(Mandler等(2000)Jour.of the Nat.Cancer Inst.92(19)：1573-1581；Mandler等(2000)Bioorganic & Med.Chem.Letters 10：1025-1028；Mandler等(2002)Bioconjugate Chem.13：786-791)、美登木素生物碱(EP 1391213；Liu等，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：8618-8623)、和加利车霉素(Lode等(1998)Cancer Res.58：2928；Hinman等(1993)Cancer Res.53：3336-3342)）。毒素可通过包括微管蛋白结合、DNA结合、或拓扑异构酶抑制在内的机制发挥其细胞毒性和细胞抑制性效应。有些细胞毒性药物在与大的抗体或蛋白质受体配体偶联后趋于失活或活性降低。
(ibritumomab tiuxetan,Biogen/Idec)是由针对在正常和恶性B淋巴细胞表面上发现的CD20抗原的鼠IgG1κ单克隆抗体与通过硫脲接头-螯合剂所结合的111In或90Y放射性同位素构成的抗体-放射性同位素偶联物(Wiseman等(2000)Eur.Jour.Nucl.Med.27(7):766-77;Wiseman等(2002)Blood 99(12):4336-42;Witzig等(2002)J.Clin.Oncol.20(10):2453-63;Witzig等(2002)J.Clin.Oncol.20(15):3262-69)。尽管ZEVALIN具有针对B细胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)的活性，然而施药在大多数患者中导致严重且持久的血细胞减少。MYLOTARGTM(gemtuzumab ozogamicin,WyethPharmaceuticals)，即由hu CD33抗体与加利车霉素连接而构成的抗体-药物偶联物，在2000年批准用于经注射治疗急性骨髓性白血病(Drugs of the Future(2000)25(7):686;美国专利No.4,970,198;5,079,233;5,585,089;5,606,040;5,693,762;5,739,116;5,767,285;5,773,001)。Cantuzumab mertansine(Immunogen,Inc.)，即由huC242抗体经二硫化物接头SPP与美登木素生物碱药物模块DM1连接而构成的抗体-药物偶联物，正在进入用于治疗表达CanAg的癌症（诸如结肠癌、胰腺癌、胃癌和其它癌）的II期试验。MLN-2704(Millennium Pharm.,BZL Biologics,Immunogen Inc.)，即由抗前列腺特异膜抗原(PSMA)单克隆抗体与美登木素生物碱药物模块DM1连接而构成的抗体-药物偶联物，在开发用于前列腺肿瘤的潜在治疗。已经将多拉司他汀(dolastatin)的合成类似物auristatin肽，auristatin E(AE)和单甲基auristatin(MMAE)与嵌合单克隆抗体cBR96（对癌瘤上的LewisY特异）和cAC10（对血液学恶性肿瘤上的CD30特异）偶联(Doronina等(2003)NatureBiotechnology 21(7):778-784)，且正在进行治疗性开发。
上文已经描述了可用于生成此类免疫偶联物的化疗剂。可使用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链（来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)）、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)毒蛋白（PAPI、PAPII和PAP-S）、苦瓜(Momordica charantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(trichothecenes)。多种放射性核素可用于生成放射偶联抗体。实例包括212Bi、131I、131In、90Y和186Re。抗体和细胞毒剂的偶联物可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，亚氨基硫烷(IT)，亚氨酸酯（诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯）、活性酯（诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯）、醛（诸如戊二醛）、双叠氮化合物（诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺）、双重氮衍生物（诸如双(对-重氮苯甲酰基)乙二胺）、二异氰酸酯（诸如甲苯2,6-二异氰酸酯）和双活性氟化合物（诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯）的双功能衍生物。例如，可如Vitetta等,Science 238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO94/11026。
本文还涵盖抗体与一种或多种小分子毒素诸如加利车霉素(calicheamicin)、美登木素生物碱类(maytansinoids)、单端孢霉素(trichothecene)和CC1065，及这些毒素具有毒素活性的衍生物的偶联物。
美登素和美登木素生物碱类
在一个实施方案中，本发明的抗体（全长或片段）与一个或多个美登木素生物碱分子偶联。
美登木素生物碱类是通过抑制微管蛋白聚合来发挥作用的有丝分裂抑制剂。美登素最初从东非灌木齿叶美登木（Maytenus serrata）分离得到（美国专利No.3,896,111）。随后发现某些微生物也生成美登木素生物碱类，诸如美登醇和C-3美登醇酯（美国专利No.4,151,042）。合成美登醇及其衍生物和类似物公开于例如美国专利No.4,137,230;4,248,870;4,256,746;4,260,608;4,265,814;4,294,757;4,307,016;4,308,268;4,308,269;4,309,428;4,313,946;4,315,929;4,317,821;4,322,348;4,331,598;4,361,650;4,364,866;4,424,219;4,450,254;4,362,663;及4,371,533，明确将其公开内容收入本文作为参考。
美登木素生物碱-抗体偶联物
在改进其治疗指数的尝试中，已经将美登素和美登木素生物碱类与特异性结合肿瘤细胞抗原的抗体偶联。包含美登木素生物碱类的免疫偶联物及其治疗用途公开于例如美国专利No.5,208,020;5,416,064;及欧洲专利EP 0 425235 B1，明确将其公开内容收入本文作为参考。Liu等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:8618-8623(1996)记载了包含与针对人结肠直肠癌的单克隆抗体C242连接的称为DM1的美登木素生物碱的免疫偶联物。发现该偶联物具有针对培养的结肠癌细胞的高度细胞毒性，而且在体内肿瘤生长测定法中显示抗肿瘤活性。Chari等,Cancer Research 52:127-131(1992)记载了其中美登木素生物碱经二硫化物接头与结合人结肠癌细胞系上抗原的鼠抗体A7或结合HER-2/neu癌基因的另一种鼠单克隆抗体TA.1偶联的免疫偶联物。在体外在人乳腺癌细胞系SK-BR-3上测试了TA.1-美登木素生物碱偶联物的细胞毒性，该细胞系每个细胞表达3x105个HER-2表面抗原。药物偶联物达到了与游离美登木素生物碱药物相似程度的细胞毒性，这可通过增加每个抗体分子偶联的美登木素生物碱分子数目来提高。A7-美登木素生物碱偶联物在小鼠中显示低系统性细胞毒性。
抗体-美登木素生物碱偶联物（免疫偶联物）
抗体-美登木素生物碱偶联物可通过将抗体与美登木素生物碱分子化学连接且不显著削弱抗体或美登木素生物碱分子的生物学活性来制备。每个抗体分子偶联平均3-4个美登木素生物碱分子在增强针对靶细胞的细胞毒性中显示功效，且对抗体的功能或溶解度没有负面影响，尽管预计甚至一分子毒素/抗体也将较之裸抗体的使用增强细胞毒性。美登木素生物碱类在本领域是众所周知的，而且可通过已知技术合成或从天然来源分离。例如美国专利No.5,208,020和上文提及的其它专利及非专利出版物中公开了合适的美登木素生物碱类。优选的美登木素生物碱类是美登醇和美登醇分子的芳香环或其它位置经过修饰的美登醇类似物，诸如各种美登醇酯。
本领域知道许多连接基团可用于制备抗体-美登木素生物碱偶联物，包括例如美国专利No.5,208,020或欧洲专利0 425 235 B1;及Chari等,Cancer Research 52:127-131(1992)中所公开的。连接基团包括二硫化物基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团、或酯酶不稳定基团，正如上文所述专利中所公开的，优选二硫化物和硫醚基团。
可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和美登木素生物碱的偶联物，所述偶联剂诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯，亚氨基硫烷(IT)，亚氨酸酯（诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯）、活性酯（诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯）、醛（诸如戊二醛）、双叠氮化合物（诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺）、双重氮衍生物（诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺）、二异氰酸酯（诸如甲苯2,6-二异氰酸酯）和双活性氟化合物（诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯）的双功能衍生物。特别优选的偶联剂包括N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)（Carlsson等,Biochem.J.173:723-737(1978)）和N-琥珀酰亚氨基-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)，由此提供二硫化物连接。
根据连接的类型，可将接头附着于美登木素生物碱分子的多个位置。例如，可使用常规偶联技术通过与羟基的反应来形成酯键。反应可发生在具有羟基的C-3位置、经羟甲基修饰的C-14位置、经羟基修饰的C-15位置、和具有羟基的C-20位置。在一个优选的实施方案中，在美登醇或美登醇类似物的C-3位置形成键连接。
加利车霉素
另一种感兴趣的免疫偶联物包括偶联有一个或多个加利车霉素分子的抗体。加利车霉素抗生素家族能够在亚皮摩尔浓度生成双链DNA断裂。关于加利车霉素家族偶联物的制备参见美国专利No.5,712,374;5,714,586;5,739,116;5,767,285;5,770,701;5,770,710;5,773,001;5,877,296（都属于美国Cyanamid公司）。可使用的加利车霉素结构类似物包括但不限于γ1 I、α2 I、α3 I、N-乙酰基-γ1 I、PSAG和θI 1（Hinman等,Cancer Research 53:3336-3342(1993);Lode等,Cancer Research 58:2925-2928(1998);及上述授予美国Cyanamid公司的美国专利）。可与抗体偶联的另一种抗肿瘤药物是QFA，它是一种抗叶酸药物。加利车霉素和QFA都具有胞内作用位点，且不易穿过质膜。因此，这些试剂经由抗体介导的内化的细胞摄取大大增强了它们的细胞毒效应。
其它细胞毒剂
可与本发明的抗体偶联的其它抗肿瘤剂包括BCNU、链佐星(streptozoicin)、长春新碱(vincristine)、5-氟尿嘧啶、美国专利No.5,053,394、5,770,710中记载的统称为LL-E33288复合物的试剂家族、及埃斯波霉素类(esperamicins)（美国专利No.5,877,296）。
可使用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链（来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)）、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutitesfordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)毒蛋白（PAPI、PAPII和PAP-S）、苦瓜(Momordica charantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(trichothecenes)。参见例如1993年10月28日公布的WO 93/21232。
本发明还涵盖抗体与具有核酸分解活性的化合物（例如核糖核酸酶或DNA内切核酸酶，诸如脱氧核糖核酸酶；DNA酶）之间形成的免疫偶联物。
为了选择性破坏肿瘤，抗体可包含高度放射性原子。多种放射性同位素可用于生成放射偶联的抗体。实例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。在将偶联物用于检测时，可包含放射性原子用于闪烁照相研究，例如tc99m或I123，或是包含自旋标记物用于核磁共振（NMR）成像（也称为磁共振成像，mri），诸如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
可以已知方式将放射性或其它标记物掺入偶联物中。例如，可生物合成肽，或是通过化学氨基酸合成法合成肽，其中使用涉及例如氟-19代替氢的合适氨基酸前体。可经肽中的半胱氨酸残基来附着标记物，诸如tc99m或I123、Re186、Re188和In111。可以经赖氨酸残基来附着钇-90。IODOGEN法（Fraker等,Biochem.Biophys.Res.Commun.80:49-57(1978)）可用于掺入碘-123。《Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy》（Chatal,CRC Press,1989）详细记载了其它方法。
可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和细胞毒剂的偶联物，所述偶联剂诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯，亚氨基硫烷(IT)，亚氨酸酯（诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯）、活性酯（诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯）、醛（诸如戊二醛）、双叠氮化合物（诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺）、双重氮衍生物（诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺）、二异硫氰酸酯（诸如甲苯2,6-二异氰酸酯）和双活性氟化合物（诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯）的双功能衍生物。例如，可如Vitetta等,Science 238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO94/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二甲基接头、或含二硫化物接头（Chari等,Cancer Research 52:127-131(1992);美国专利No.5,208,020）。
本发明的化合物明确涵盖但不限于用下列交联接头试剂制备的ADC：BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、sulfo-EMCS、sulfo-GMBS、sulfo-KMUS、sulfo-MBS、sulfo-SIAB、sulfo-SMCC、sulfo-SMPB、和SVSB（琥珀酰亚氨基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯），它们可通过商业途径获得（例如Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A）。参见2003-2004年度应用手册和产品目录(2003-2004Applications Handbook and Catalog)第467-498页。
抗体-药物偶联物的制备
在本发明的抗体-药物偶联物(ADC)中，抗体(Ab)经接头(L)偶联有一个或多个药物模块(D)，例如大约1个到大约20个药物模块每个抗体。可以采用本领域技术人员知道的有机化学反应、条件、和试剂通过数种路径来制备通式I的ADC，包括：(1)抗体的亲核基团经共价键与二价接头试剂反应形成Ab-L，接着与药物模块D反应；和(2)药物模块的亲核基团经共价键与二价接头试剂反应形成D-L，接着与抗体的亲核基团反应。
Ab-(L-D)p I
抗体的亲核基团包括但不限于：(i)N末端胺基；(ii)侧链胺基，例如赖氨酸；(iii)侧链硫醇基，例如半胱氨酸；和(iv)糖基化抗体中糖的羟基或氨基。胺、硫醇、和羟基基团是亲核的，能够与接头模块上的亲电子基团反应而形成共价键，而接头试剂包括：(i)活性酯类，诸如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯、和酸性卤化物；(ii)烃基和苄基卤化物，诸如卤代乙酰胺；(iii)醛类、酮类、羧基、和马来酰亚胺基团。某些抗体具有可还原的链间二硫键，即半胱氨酸桥。可通过还原剂诸如DTT（二硫苏糖醇）处理，从而具有与接头试剂偶联的反应性。每个半胱氨酸桥理论上会形成两个反应性硫醇亲核体。可将额外亲核基团引入抗体中，经由赖氨酸与2-亚氨基硫烷（Traut氏试剂）的反应，导致胺转变为硫醇。
还可通过修饰抗体以导入能与接头试剂或药物上的亲核取代基起反应的亲电子模块来生成本发明的抗体-药物偶联物。可以用例如高碘酸盐氧化剂氧化糖基化抗体的糖，从而形成可与接头试剂或药物模块的胺基团反应的醛或酮基团。所得亚胺Schiff碱基可形成稳定的连接，或者可以用例如硼氢化物试剂还原而形成稳定的胺连接。在一个实施方案中，糖基化抗体的碳水化合物部分与半乳糖氧化酶或偏高碘酸钠的反应可以在蛋白质中生成羰基（醛和酮），其能与药物上的适宜基团反应(Hermanson,Bioconjugate Techniques)。在另一个实施方案中，包含N-末端丝氨酸或苏氨酸残基的蛋白质能与偏高碘酸钠反应，导致在第一个氨基酸处生成醛(Geoghegan和Stroh,(1992)Bioconjugate Chem.3:138-146；US 5362852)。此类醛能与药物模块或接头亲核体反应。
类似的，药物模块上的亲核基团包括但不限于：胺、硫醇、羟基、酰肼、肟、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯、和芳基酰肼基团，它们能够与接头模块上的亲电子基团反应而形成共价键，而接头试剂包括：(i)活性酯类，诸如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯、和酸性卤化物；(ii)烃基和苄基卤化物，诸如卤代乙酰胺；(iii)醛类、酮类、羧基、和马来酰亚胺基团。
或者，可通过例如重组技术或肽合成来制备包含抗体和细胞毒剂的融合蛋白。DNA的长度可包含各自编码偶联物两个部分的区域，或是彼此毗邻或是由编码接头肽的区域分开，该接头肽不破坏偶联物的期望特性。
在又一个实施方案中，可将抗体与“受体”（诸如链霉亲合素）偶联从而用于肿瘤预先靶向，其中对患者施用抗体-受体偶联物，接着使用清除剂自循环中清除未结合的偶联物，然后施用与细胞毒剂（例如放射性核苷酸）偶联的“配体”（例如亲合素）。
10．免疫脂质体
本文中所公开的抗体还可配制成免疫脂质体。“脂质体”指由各种类型脂质、磷脂和/或表面活性剂构成的，可用于对哺乳动物递送药物的小囊泡。与生物膜的脂质排列相似，脂质体的成分通常排列成双层形式。含有抗体的脂质体可通过本领域已知方法来制备，诸如Epstein等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:3688(1985);Hwang等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4030(1980);美国专利No.4,485,045和4,544,545;及1997年10月23日公布的WO 97/38731中所述。循环时间延长的脂质体披露于美国专利No.5,013,556。
可用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂类组合物通过反相蒸发法生成特别有用的脂质体。将脂质体挤过具有设定孔径的滤器，以产生具有期望直径的脂质体。可如Martin等,J.Biol.Chem.257:286-288(1982)中所述，将本发明抗体的Fab’片段经二硫化物交换反应与脂质体偶联。任选在脂质体中包含化疗剂。参见Gabizon等,J.National Cancer Inst.81(19):1484(1989)。
B.结合寡肽
本发明的结合寡肽指结合，优选特异性结合本文所述hepsin、MSP和、或hepsin:MSP复合物的寡肽。结合寡肽可以使用已知的寡肽合成方法学化学合成，或者可使用重组技术制备和纯化。结合寡肽的长度通常是至少约5个氨基酸，或者长度为至少约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个氨基酸或更长，其中此类寡肽能够结合，优选特异性结合感兴趣靶物。结合寡肽无需过多试验就可使用公知技术来鉴定。在这点上，注意到用于对寡肽文库筛选能够特异性结合靶物的寡肽的技术是本领域公知的（参见例如美国专利5,556,762,5,750,373,4,708,871,4,833,092,5,223,409,5,403,484,5,571,689,5,663,143;PCT公开号WO 84/03506和WO 84/03564;Geysen等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:3998-4002(1984);Geysen等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82:178-182(1985);Geysen等,in Synthetic Peptides asAntigens,130-149(1986);Geysen等,J.Immunol.Meth.102:259-274(1987);Schoofs等,J.Immunol.140:611-616(1988);Cwirla,S.E.等,(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:6378;Lowman,H.B.等,(1991)Biochemistry 30:10832;Clackson,T.等,(1991)Nature352:624;Marks,J.D.等,(1991),J.Mol.Biol.222:581;Kang,A.S.等,(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:8363;Smith,G.P.,(1991)Current Opin.Biotechnol.2:668)。
在这点上，噬菌体展示是一种可以筛选大型寡肽文库来鉴定那些文库中能够特异性结合靶物的成员的公知技术。噬菌体展示是将变体多肽作为与外壳蛋白的融合蛋白展示在噬菌体颗粒表面的一种技术(Scott,J.K.和Smith,G.P.(1990)Science 249:386)。噬菌体展示的效用在于，可以对选择性随机化蛋白质变体（或随机克隆cDNA）的大型文库迅速且有效地分选那些以高亲和力结合靶分子的序列。在噬菌体上展示肽(Cwirla,S.E.等,(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:6378)或蛋白质(Lowman,H.B.等,(1991)Biochemistry 30:10832;Clackson,T.等,(1991)Nature 352:624;Marks,J.D.等,(1991)J.MoI.Biol.222:581;Kang,A.S.等,(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:8363)文库已经用于对数百万多肽或寡肽筛选具有特异结合特性的那些多肽或寡肽(Smith,G.P.(1991)Current Opin.Biotechnol.2:668)。分选随机突变体的噬菌体文库需要构建和扩充大量变体的策略，使用靶受体进行亲和纯化的流程，及评估结合富集的结果的手段。参见美国专利5,223,409,5,403,484,5,571,689和5,663,143。
尽管大多数噬菌体展示方法已经使用丝状噬菌体，λ类(lambdoid)噬菌体展示系统(WO 95/34683;US 5,627,024)、T4噬菌体展示系统(Ren等,Gene 215:439(1998);Zhu等,Cancer Research 58(15):3209-3214(1998);Jiang等,Infection & Immunity 65(11):4770-4777(1997);Ren等,Gene 195(2):303-311(1997);Ren,Protein Sci.5:1833(1996);Efimov等,Virus Genes 10:173(1995))和T7噬菌体展示系统(Smith和Scott,Methods inEnzymology 217:228-257(1993);US 5,766,905)也是已知的。
现在已经对基础噬菌体展示概念开发了很多其它改进和变通。这些改进增强了展示系统对肽文库筛选与选定靶分子的结合及展示功能性蛋白质的能力，所述功能性蛋白质具有对这些蛋白质筛选期望特性的潜力。已经开发了用于噬菌体展示反应的组合反应装置(WO 98/14277)，而且噬菌体展示文库已经用于分析和控制生物分子相互作用(WO 98/20169;WO 98/20159)和受约束(constrained)螺旋肽的特性(WO 98/20036)。WO 97/35196描述了分离亲和配体的方法，其中使噬菌体展示文库接触第一种溶液和第二种溶液以选择性分离结合的配体，在第一种溶液中配体将结合靶分子，而在第二种溶液中亲和配体将不会结合靶分子。WO 97/46251描述了这样一种方法，即用亲和纯化的抗体生物淘选随机噬菌体展示库，然后分离结合的噬菌体，随后使用微量板的孔进行淘选过程以分离高亲和力结合的噬菌体。已经报道了金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)蛋白A作为亲和标签的使用(Li等,(1998)Mol.Biotech.9:187)。WO 97/47314描述了底物扣除文库用于区别酶特异性的用途，其中使用可以是噬菌体展示库的组合文库。WO 97/09446描述了使用噬菌体展示选择适用于洗涤剂的酶的方法。美国专利5,498,538,5,432,018和WO 98/15833中描述了选择特异性结合的蛋白质的其它方法。
产生肽文库和筛选这些文库的方法还公开于美国专利5,723,286,5,432,018,5,580,717,5,427,908,5,498,530,5,770,434,5,734,018,5,698,426,5,763,192,和5,723,323。
C.结合小分子
结合小分子优选指本文所定义的寡肽或抗体以外，结合、优选特异性结合本文所述hepsin、MSP和/或hepsin:MSP复合物的有机分子。结合有机小分子可以使用已知方法学来鉴定和化学合成(参见例如PCT公开号WO00/00823和WO 00/39585)。结合有机小分子的大小通常小于约2000道尔顿，或者其大小小于约1500、750、500、250或200道尔顿，其中此类能够结合、优选特异性结合本文所述靶物的有机小分子无需过多实验就可使用公知技术来鉴定。在这点上，注意到用于对有机小分子文库筛选能够结合靶物的分子的技术是本领域公知的(参见例如PCT公开号WO 00/00823和WO00/39585)。结合有机小分子可以是例如醛、酮、肟、腙、缩氨基脲(semicarbazone)、卡巴肼(carbazide)、伯胺、仲胺、叔胺、N-取代的肼、酰肼、醇、醚、硫醇、硫醚、二硫化物、羧酸、酯、酰胺、脲、氨基甲酸酯(carbamate)、碳酸酯(carbonate)、缩酮、硫缩酮(thioketal)、缩醛、硫缩醛、芳基卤、芳基磺酸酯(arylsulfonate)、烃基卤、烃基磺酸酯(alkyl sulfonate)、芳香族化合物、杂环化合物、苯胺、烯烃、炔烃、二醇、氨基醇、唑烷、唑啉、噻唑烷、噻唑啉、烯胺、磺酰胺(sulfonamide)、环氧化物、吖丙啶(aziridine)、异氰酸酯(isocyanate)、磺酰氯、重氮化合物、酰基氯(acidchloride)等。
D.筛选具有期望特性的抗体、结合寡肽和结合小分子
上文已经描述了用于产生本发明的抗体、寡肽和小分子的技术。根据需要，可进一步选择具有某些生物学性质的抗体、寡肽或其它小分子。
可通过本领域公知的方法，例如使用内源性或在用相应基因转染后表达hepsin和/或MSP原的细胞，来评估本发明抗体、寡肽或其它小分子的抑制效果。例如，可将适宜的肿瘤细胞系和hepsin和/或MSP原多肽转染细胞用不同浓度的本发明单克隆抗体、寡肽或其它小分子处理几天（例如2-7天），并分析已知与MSP活化有关的生物学活性，包括依照下文实施例评估的生物学活性。与未处理的肿瘤细胞相比，抗体、结合寡肽或结合有机小分子将在体外或在体内抑制表达hepsin和/或MSP的肿瘤细胞的活性达约25-100%，更优选约30-100%，甚更优选约50-100%或70-100%，在一个实施方案中，抗体浓度为约0.5-30μg/ml。可在细胞培养物或其它合适实验系统中在抗体浓度为约0.5-30μg/ml或约0.5nM至200nM时测量活性抑制，其中在使肿瘤细胞暴露于抗体后1-10天测量活性抑制。如果以约1μg/kg至约100mg/kg体重施用抗体导致在自首次施用抗体起约5天至3个月内、优选约5至30天内肿瘤体积缩小、肿瘤细胞侵入性降低、等，那么该抗体是体内抑制性的。
为了筛选结合感兴趣靶物上的表位的抗体、寡肽或其它有机小分子，可进行常规的交叉阻断测定法，诸如Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,Ed Harlow和David Lane(1988)中所描述的。此测定法可用于确定测试抗体、寡肽或其它有机小分子是否与已知的抗体结合相同的位点或表位。或者/另外，可通过本领域已知的方法进行表位作图(mapping)。例如，可通过诸如丙氨酸扫描来诱变抗体序列以鉴定接触残基。首先对突变体抗体测试与多克隆抗体的结合以确保正确折叠。在不同的方法中，可在竞争测定法中使用对应于多肽不同区域的肽，使用几种测试抗体或者一种测试抗体和具有已表征或已知表位的抗体。
E.依赖抗体的酶介导的前体药物疗法(ADEPT)
通过将抗体与前体药物活化酶偶联，本发明的抗体还可用于ADEPT，所述前体药物活化酶将前体药物（例如肽基化疗剂，参见WO 81/01145）转变为活性抗癌药。参见例如WO88/07378和美国专利4,975,278。
可用于ADEPT的免疫偶联物的酶组分包括能够以这样一种方式作用于前体药物从而将其转变为更有活性的细胞毒性形式的任何酶。
可用于本发明方法的酶包括但不限于可将含磷酸盐/酯的前体药物转变为游离药物的碱性磷酸酶；可将含硫酸盐/酯的前体药物转变为游离药物的芳基硫酸酯酶；可将无毒5-氟胞嘧啶转变为抗癌药5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脱氨酶；可将含肽的前体药物转变为游离药物的蛋白酶，诸如沙雷氏菌蛋白酶(serratia protease)、嗜热菌蛋白酶(thermolysin)、枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)、羧肽酶和组织蛋白酶（诸如组织蛋白酶B和L）；可转化含D-氨基酸替代的前体药物的D-丙氨酰羧肽酶；可将糖基化前体药物转变为游离药物的碳水化合物切割酶，诸如β-半乳糖苷酶和神经氨酸酶；可将用β-内酰胺衍生的药物转变为游离药物的β-内酰胺酶；及可将在其氨基氮处分别用苯氧乙酰基或苯乙酰基衍生的药物转变成游离药物的青霉素酰胺酶，诸如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶。或者，可使用具有酶活性的抗体，本领域也称作“抗体酶”，将本发明的前体药物转变为游离活性药物（参见例如Massey,Nature 328:457-458(1987)）。可如本文所述制备抗体-抗体酶偶联物，用于将抗体酶递送至肿瘤细胞群。
可通过本领域众所周知的技术将本发明的酶与抗体共价结合，诸如使用上文所讨论的异双功能交联剂。或者，可使用本领域众所周知的重组DNA技术构建包含与本发明酶的至少功能活性部分连接的本发明抗体的至少抗原结合区的融合蛋白（参见例如Neuberger等,Nature 312:604-608(1984)）。
F.抗体变体
除了本文所述抗体，设想了可制备抗体变体。抗体可通过将适宜的核苷酸改变引入编码DNA和/或通过合成期望抗体来制备。本领域技术人员将领会，氨基酸改变可改变抗体的翻译后加工，诸如改变糖基化位点的数目或位置或者改变膜锚定特征。
可在本文所述抗体中进行变异，例如使用例如美国专利5,364,934所述的保守和非保守突变的任何技术和指导方针。变异可以是编码抗体或多肽的一个或多个密码子的替代、删除或插入，其导致氨基酸序列相对于天然序列抗体的改变。任选的是，变异是通过抗体的一个或多个结构域中至少一个氨基酸为任何其它氨基酸所替代。通过比较抗体的序列与同源已知蛋白质分子的序列，并将高同源区中进行的氨基酸序列改变的数目最少化，可发现确定哪些氨基酸残基可插入、替代或删除而不会对期望活性有不利影响的方针。氨基酸替代可以是将一种氨基酸用具有相似结构和/或化学特性的另一种氨基酸替代的结果，诸如用丝氨酸替代亮氨酸，即保守氨基酸替代。插入或删除可任选在约1个至5个氨基酸的范围内。可通过在序列中系统进行氨基酸插入、替代或删除，并对所得变体测试由亲本序列展示的活性来确定可容许的变异。
本文提供了抗体和多肽的片段。例如，在与全长天然抗体或蛋白质比较时，此类片段可在N-末端或C-末端截短，或者可缺少内部残基。某些片段缺少对于抗体或多肽的期望生物学活性不是至关重要的氨基酸残基。
抗体和多肽片段可通过多种常规技术中的任一种来制备。期望肽片段可化学合成。一种备选方法牵涉通过酶促消化产生抗体或多肽片段，例如通过用已知在由特定氨基酸残基限定的位点处切割蛋白质的酶处理蛋白质，或者通过用合适的限制酶消化DNA，并分离期望片段。还有一种合适的技术牵涉分离并通过聚合酶链式反应(PCR)扩增编码期望抗体或多肽片段的DNA片段。限定DNA片段期望末端的寡核苷酸在PCR中用作5'和3'引物。优选的是，抗体和多肽片段与本文所公开的天然抗体或多肽共享至少一种生物学和/或免疫学活性。
在具体实施方案中，感兴趣的保守替代见下表标题“优选替代”下所示。如果此类替代导致生物学活性的改变，那么可引入此表中称为“例示替代”的更实质性改变，或者如下文关于氨基酸类别进一步所述的，并筛选产物。
原始残基 例示替代 优选替代
Ala(A) val;leu;ile val
Arg(R) lys;gln;asn lys
Asn(N) gln;his;asp;lys;arg gln
Asp(D) glu;asn glu
Cys(C) ser;ala ser
Gln(Q) asn;glu asn
Glu(E) asp;gln asp
Gly(G) pro;ala ala
His(H) asn;gln;lys;arg arg
Ile(I) leu;val;met;ala;phe;正亮氨酸 leu
Leu(L) 正亮氨酸;ile;val;met;ala;phe ile
Lys(K) arg;gln;asn arg
Met(M) leu;phe;ile leu
Phe(F) trp;leu;val;ile;ala;tyr leu
Pro(P) ala ala
Ser(S) thr thr
Thr(T) val;ser ser
Trp(W) tyr;phe tyr
Tyr(Y) trp;phe;thr;ser phe
Val(V) ile;leu;met;phe;ala;正亮氨酸 leu
对抗体或多肽的功能或免疫学身份的实质性修饰通过选择在保持以下方面的效果上显著不同的替代来完成：(a)替代区域的多肽主链的结构，例如作为折叠片或螺旋构象，(b)靶位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。根据其侧链特性的相似性，可将氨基酸如下分组(A.L.Lehninger,于Biochemistry，第2版,pp.73-75,Worth Publishers,New York(1975))：
(1)非极性的：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)
(2)不带电荷的、极性的：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)
(3)酸性的：Asp(D)、Glu(E)
(4)碱性的：Lys(K)、Arg(R)、His(H)
或者，根据共同的侧链特性，天然存在残基可如下分组：
(1)疏水性的：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性、亲水性的：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性的：Asp、Glu；
(4)碱性的：His、Lys、Arg；
(5)影响侧链取向的残基：Gly、Pro；和
(6)芳香族的：Trp、Tyr、Phe。
非保守替代将需要用这些类别之一中的一个成员交换另一个类别的。还可以将此类替代残基引入保守替代位点，或者更优选的是，引入剩余的（非保守）位点。
变异可使用本领域知道的方法来进行，诸如寡核苷酸介导的（定点）诱变、丙氨酸扫描、及PCR诱变。可对克隆的DNA进行定点诱变(Carter等,Nucl.Acids Res.13:4331(1986);Zoller等,Nucl.Acids Res.10:6487(1987))、盒式诱变(Wells等,Gene 34:315(1985))、限制性选择诱变(restriction selection mutagenesis)(Wells等,Philos.Trans.R.Soc.London SerA 317:415(1986))或其它已知技术以产生抗体或多肽变体DNA。
还可采用扫描氨基酸分析来鉴定沿着连续序列的一个或多个氨基酸。在优选的扫描用氨基酸中有相对较小的中性氨基酸。此类氨基酸包括丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸和半胱氨酸。丙氨酸通常是这组中的优选扫描用氨基酸，因为它消除了β-碳上的侧链，而且不大可能改变变体的主链构象(Cunningham 和Wells,Science 244:1081-1085(1989))。丙氨酸通常也是优选的，因为它是最常见的氨基酸。另外，常常在隐蔽位置和暴露位置都能发现它(Creighton,The Proteins,W.H.Freeman & Co.,N.Y.;Chothia,J.Mol.Biol.150:1(1976))。如果丙氨酸替代不产生足够量的变体，那么可使用等排(isoteric)氨基酸。
任何不涉及保持抗体或多肽正确构象的半胱氨酸残基也可被替代，通常用丝氨酸，以改进分子的氧化稳定性和防止异常交联。相反，可向抗体或多肽中添加半胱氨酸键以改善其稳定性（特别是当抗体是抗体片段诸如Fv片段时）。
特别优选的一类替代变体牵涉替代亲本抗体的一个或多个高变区残基（例如人源化或人抗体）。通常，选择用于进一步开发的所得变体相对于产生它们的亲本抗体将具有改进的生物学特性。产生此类替代变体的一种便利方法牵涉使用噬菌体展示进行的亲和力成熟。简而言之，将数个高变区位点（例如6-7个位点）突变，在各个位点产生所有可能的氨基酸替代。如此产生的抗体变体以单价形式展示在丝状噬菌体颗粒上，作为与各个颗粒内包装的M13基因III产物的融合物。然后如本文所公开的对噬菌体展示的变体筛选其生物学活性（例如结合亲和力）。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可进行丙氨酸扫描诱变以鉴定对抗原结合有重要贡献的高变区残基。或者/另外，分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体和抗原多肽之间的接触点可能是有益的。此类接触残基及邻近残基是依照本文详述技术进行替代的候选位点。一旦产生此类变体，如本文所述对该组变体进行筛选，可选择在一种或多种相关测定法中有优良特性的抗体用于进一步的开发。
编码抗体的氨基酸序列变体的核酸分子可通过本领域已知的多种方法来制备。这些方法包括但不限于从天然来源分离（在天然存在氨基酸序列变体的情况中），或者通过对早期制备的变体或非变体形式的抗体进行寡核苷酸介导的（或定点）诱变、PCR诱变和盒式诱变来制备。
G.对抗体和多肽的修饰
对抗体和多肽的共价修饰包括在本发明的范围内。一种类型的共价修饰包括使抗体或多肽的靶氨基酸残基与有机衍生化试剂反应，该有机衍生化试剂能够与抗体或多肽的选定侧链或者N-或C-末端残基起反应。用双功能试剂进行的衍生化可用于例如使抗体或多肽与不溶于水的支持基质或表面交联，以用于抗体的纯化方法，反之亦然。常用的交联剂包括例如1，1-双(重氮-乙酰基)-2-苯乙烷、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯例如与4-叠氮水杨酸形成的酯、同双功能亚氨酸酯包括二琥珀酰亚胺酯诸如3,3'-二硫代双(琥珀酰亚氨基丙酸酯)、双功能马来酰亚胺诸如双-N-马来酰亚胺-1,8-辛烷和诸如甲基-3-[(对-叠氮苯基)二硫代]丙酰亚胺酯等试剂。
其它修饰包括谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰残基分别脱酰胺为谷氨酰和天冬氨酰残基，脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰或苏氨酰残基的羟基的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化(T.E.Creighton,Proteins:Structure and MolecularProperties,W.H.Freeman & Co.,San Francisco,pp.79-86(1983))，N-末端胺的乙酰化，及任何C-末端羧基的酰胺化。
本发明范围内所包括的对抗体或多肽的另一类共价修饰包括改变抗体或多肽的天然糖基化样式。“改变天然糖基化样式”在本文中意图指删除一个或多个在天然序列抗体或多肽中发现的碳水化合物模块(moiety)（或是通过消除潜在糖基化位点，或是通过以化学和/或酶促手段删除糖基化），和/或添加一个或多个在天然序列抗体或多肽中不存在的糖基化位点。另外，此短语包括天然蛋白质糖基化中的质的改变，牵涉所存在的多种碳水化合物模块的本质和比例的改变。
抗体和其它多肽的糖基化通常或是N-连接的或是O-连接的。N-连接指碳水化合物模块附着于天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸（其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸）是将碳水化合物模块酶促附着于天冬酰胺侧链的识别序列。由此，多肽中这些三肽序列其中任一的存在产生潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化指将糖类N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附着于羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，但也可使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。
向抗体或多肽中添加糖基化位点通过改变氨基酸序列使其包含一个或多个上述三肽序列而便利地完成（用于N-连接的糖基化位点）。这种改变还可通过向原始抗体或多肽的序列中添加或替代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来进行（用于O-连接的糖基化位点）。可任选通过DNA水平的变化来改变抗体或多肽的氨基酸序列，特别是通过在预先选择的碱基处突变编码抗体或多肽的DNA，从而产生将翻译成期望氨基酸的密码子。
增加抗体或多肽上糖模块的数目的另一种方法是通过使糖苷与多肽化学或酶促偶联。本领域对此类方法有描述，例如1987年9月11日公开的WO87/05330，及Aplin和Wriston,CRC Crit.Rev.Biochem.,pp.259-306(1981)。
去除抗体或多肽上存在的糖模块可通过化学或酶促方法来实现，或者通过编码充当糖基化靶物的氨基酸残基的密码子的突变替代。化学脱糖基化技术是本领域已知的，而且描述于例如Hakimuddin等,Arch.Biochem.Biophys.259:52(1987)和Edge等,Anal.Biochem.118:131(1981)。酶促切割多肽上的糖模块可通过使用多种内切和外切糖苷酶来实现，如Thotakura等,Meth.Enzvmol.138:350(1987)所述。
对抗体或多肽的另一类共价修饰包括，以美国专利4,640,835;4,496,689;4,301,144;4,670,417;4,791,192或4,179,337所述方式，将抗体或多肽与多种非蛋白质性质的聚合物之一连接，例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧亚烷(polyoxyalkylene)。抗体或多肽还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中（例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊）、在胶状药物递送系统中（例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊）、或在粗滴乳状液中。此类技术公开于例如Remington's Pharmaceutical Sciences,16th edition,Osol,A.Ed.,1980。
还可以形成嵌合分子的方式修饰本发明的抗体或多肽，所述嵌合分子包含与另一种异源多肽或氨基酸序列融合的抗体或多肽。
在一个实施方案中，此类嵌合分子包括带有标签多肽的抗体或多肽的融合物，所述标签多肽提供了抗标签抗体可选择性结合的表位。表位标签通常位于抗体或多肽的氨基或羧基末端。此类表位标记形式的抗体或多肽的存在可使用针对所述标签多肽的抗体来检测。而且，表位标签的提供使抗体或多肽易于使用抗标签抗体或另一类结合所述表位标签的亲和基质通过亲和纯化来纯化。多种标签多肽及其各自抗体是本领域公知的。例子包括多组氨酸(poly-his)或多-组氨酸-甘氨酸(poly-his-gly)标签；流感HA标签多肽及其抗体12CA5(Field等,Mol.Cell.Biol.8:2159-2165(1988))；c-myc标签及其抗体8F9,3C7,6E10,G4,B7和9E10抗体(Evan等,Molecular and Cellular Biology 5:3610-3616(1985))；及单纯疱疹病毒糖蛋白D(gD)标签及其抗体(Paborsky等,Protein Engineering 3(6):547-553(1990))。其它标签多肽包括Flag肽(Hopp等,BioTechnology 6:1204-1210(1988))；KT3表位肽(Martin等,Science 255:192-194(1992))；α-微管蛋白表位肽(Skinner等,J.Biol.Chem.266:15163-15166(1991))；及T7基因10蛋白肽标签(Lutz-Freyermuth等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:6393-6397(1990))。
在一个备选实施方案中，嵌合分子可包括抗体或多肽与免疫球蛋白或免疫球蛋白特定区域的融合物。对于二价形式的嵌合分子（也称为“免疫粘附素”），此类融合物可以是与IgG分子Fc区的融合。Ig融合物优选包含用可溶形式（跨膜结构域删除或失活）的抗体或多肽置换Ig分子内至少一个可变区的替代。在一个特别优选的实施方案中，免疫球蛋白融合物包含IgG1分子的铰链区、CH2区和CH3区，或者铰链区、CH1区、CH2区和CH3区。关于免疫球蛋白融合物的制备还可参见1995年6月27日授权的美国专利5,428,130。
H.抗体和多肽的制备
下面的描述主要涉及通过培养用包含编码抗体和多肽的核酸的载体转化或转染的细胞来制备抗体和多肽。当然设想了可采用本领域公知的备选方法来制备抗体和多肽。例如，可使用固相技术通过直接肽合成来生成适宜的氨基酸序列或其部分(参见例如Stewart等,Solid-Phase Peptide Synthesis,W.H.Freeman Co.,San Francisco,CA,1969;Merrifield,J.Am.Chem.Soc.85:2149-2154(1963))。体外蛋白质合成可使用手工技术或通过自动化来进行。自动化合成可例如使用Applied Biosystems PeptideSynthesizer(Foster City,CA)依照制造商的说明书来完成。抗体或多肽的多个部分可分开化学合成，并使用化学或酶促方法组合以生成期望的抗体和多肽。
1.编码抗体或多肽的DNA的分离
编码抗体或多肽的DNA可以从cDNA文库获得，所述cDNA文库从认为具有所述抗体或多肽mRNA且以可检测水平表达它的组织制备。因此，人的抗体或多肽DNA可以方便地从以人组织制备的cDNA文库获得。抗体或多肽编码基因也可从基因组文库或通过已知的合成流程（例如自动化核酸合成）获得。
可以用设计用于鉴定目的基因或由其编码的蛋白质的探针（诸如至少约20-80个碱基的寡核苷酸）筛选文库。用选定探针筛选cDNA或基因组文库可使用标准流程进行，诸如Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,New York,Cold Spring HarborLaboratory Press,1989所述。分离编码抗体或多肽的基因的一种备选方法是使用PCR方法学(Sambrook等,见上文;Dieffenbach等,PCR Primer:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press,1995)。
用于筛选cDNA文库的技术是本领域公知的。选作探针的寡核苷酸序列应该足够长且足够明确(unambiguous)，使得假阳性降到最低。寡核苷酸优选是标记的，使得它在与所筛选文库中的DNA杂交时可检测出。标记方法是本领域公知的，包括使用放射标记物，像32P-标记的ATP、生物素化或酶标记。杂交条件，包括中等严格性和高度严格性，见Sambrook等,见上文。
在此类文库筛选方法中鉴定的序列可以与保藏的和公共数据库诸如GenBank或其它私有序列数据库中可得到的其它已知序列比较和对比。所述分子限定区域内的或跨越全长序列的序列同一性（或是在氨基酸水平上或是在核苷酸水平上）可使用本领域知道的和本文描述的方法来测定。
具有蛋白质编码序列的核酸可通过使用本文首次公开的推断的氨基酸序列筛选选定的cDNA或基因组文库来获得，并且必要时，使用Sambrook等,见上文所述常规引物延伸流程来检测可能不会逆转录为cDNA的mRNA的前体和加工的中间产物。
2.宿主细胞的选择和转化
将宿主细胞用本文所述用于抗体或多肽生成的表达或克隆载体转染或转化，并在为了诱导启动子、选择转化子、或扩增编码期望序列的基因而恰当调整的常规营养培养基中培养。培养条件，诸如培养基、温度、pH等等，可以由本领域技术人员无需过多实验就选择。通常，用于使细胞培养物生产力最大化的原理、方案和实用技术可参见Mammalian CellBiotechnology:a Practical Approach,M.Butler,ed.,IRL Press,1991和Sambrook等,见上文。
真核细胞转染和原核细胞转化的方法是普通技术人员所知道的，例如CaCl2、CaPO4、脂质体介导的和电穿孔。根据所用宿主细胞，转化使用对此类细胞适宜的标准技术进行。采用氯化钙的钙处理，如Sambrook等,见上文所述，或电穿孔通常用于原核细胞。用根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的感染用于某些植物细胞的转化，如Shaw等,Gene 23:315(1983)和1989年6月29日公开的WO 89/05859所述。对于没有此类细胞壁的哺乳动物细胞，可采用Graham和van der Eb,Virology 52:456-457(1978)的磷酸钙沉淀法。哺乳动物细胞宿主系统转染的一般情况参见美国专利4,399,216。进入酵母的转化通常依照Van Solingen等,J.Bact.130:946(1977)和Hsiao等,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)76:3829(1979)的方法来进行。然而，也可使用用于将DNA导入细胞的其它方法，诸如核显微注射、电穿孔、细菌原生质体与完整细胞的融合、或聚阳离子例如polybrene、聚鸟氨酸。关于用于转化哺乳动物细胞的多种技术见Keown等,Methods in Enzvmology 185:527-537(1990)和Mansour等,Nature 336:348-352(1988)。
适于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞包括原核生物、酵母、或高等真核细胞。合适的原核生物包括但不限于真细菌，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科，诸如大肠杆菌。多种大肠杆菌菌株是公众可获得的，诸如大肠杆菌K12菌株MM294(ATCC 31,446);大肠杆菌X1776(ATCC 31,537);大肠杆菌菌株W3110(ATCC 27,325)和K5772(ATCC53,635)。其它合适的原核生物宿主细胞包括肠杆菌科，诸如埃希氏菌属（Escherichia）例如大肠埃希氏菌（大肠杆菌）（E.coli）、肠杆菌属（Enterobacter）、欧文氏菌属（Erwinia）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）、变形菌属（Proteus）、沙门氏菌属（Salmonella）例如鼠伤寒沙门氏菌（Salmonellatyphimurium）、沙雷氏菌属（Serratia）例如粘质沙雷氏菌（Serratia marcescans）、和志贺氏菌属（Shigella），以及芽孢杆菌属（Bacilli）诸如枯草芽孢杆菌（B.subtilis）和地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）（例如1989年4月12日出版的DD 266,710中公开的地衣芽孢杆菌41P）、假单胞菌属（Pseudomonas）诸如铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）、和链霉菌属（Streptomyces）。这些例子是例示性的而非限制性的。菌株W3110是一个特别优选的宿主或亲本宿主，因为它是用于重组DNA产物发酵的常用宿主菌株。优选的是，宿主细胞分泌最小量的蛋白水解酶。例如，菌株W3110可以修饰，在编码对宿主而言内源的蛋白质的基因中产生遗传突变，此类宿主的例子包括大肠杆菌W3110菌株1A2，其具有完整基因型tonA；大肠杆菌W3110菌株9E4，其具有完整基因型tonAptr3；大肠杆菌W3110菌株27C7(ATCC55,244)，其具有完整基因型tonA ptr3 phoA E15(argF-lac)169 degP ompT kanr；大肠杆菌W3110菌株37D6，其具有完整基因型tonA ptr3phoA E15(argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kanr；大肠杆菌W3110菌株40B4，它是具有非卡那霉素抗性degP删除突变的菌株37D6；及具有1990年8月7日授权的美国专利4,946,783中公开的突变型周质蛋白酶的大肠杆菌菌株。或者，体外克隆方法，例如PCR或其它核酸聚合酶反应也是合适的。
全长抗体、抗体片段及抗体融合物蛋白质可在细菌中制备，特别是在不需要糖基化和Fc效应器功能时，诸如当治疗用抗体与细胞毒剂（例如毒素）偶联且免疫偶联物自身显示出肿瘤细胞破坏的效力时。全长抗体在循环中具有较长半衰期。大肠杆菌中的制备更快且更加省钱。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，参见例如US 5,648,237(Carter等人),US 5,789,199(JoIy等人),和US 5,840,523(Simmons等人)，它们描述了用于优化表达和分泌的翻译起始区(TIR)和信号序列，在此收入这些专利作为参考。表达后，从大肠杆菌细胞糊在可溶性级分中分离抗体，并且可例如根据同种型通过蛋白A或G柱来纯化。最终的纯化可以与用于纯化例如在CHO细胞中表达的抗体的方法类似的进行。
除了原核生物以外，真核微生物，诸如丝状真菌或酵母也是编码抗体或多肽的载体的合适克隆或表达宿主。酿酒糖酵母（Saccharomyces cerevisiae）是常用的低等真核宿主微生物。其它的包括粟酒裂殖糖酵母（Schizosaccharomyces pombe）(Beach和NurseNature 290:140(1981);EP139,383,1985年5月2日公开)；克鲁维酵母属（Kluyveromyces）宿主(美国专利4,943,529;Fleer等,Bio/Technology 9:968-975(1991))诸如例如乳酸克鲁维酵母（K.lactis）(MW98-8C,CBS683,CBS4574;Louvencourt等,J.Bacteriol.154(2):737-742(1983))、脆壁克鲁维酵母（K.fragilis）(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母（K.bulgaricus）(ATCC 16,045)、威克克鲁维酵母（K.wickeramii）(ATCC 24,178)、K.waltii(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母（K.drosophilarum）(ATCC 36,906;Van denBerg等,Bio/Technology 8:135(1990))、耐热克鲁维酵母（K.thermotolerans）、和马克思克鲁维酵母（K.marxianus）；亚罗酵母属（Yarrowia）(EP 402,226)；巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）(EP183,070;Sreekrishna等,J.Basic Microbiol.28:265-278(1988))；假丝酵母属（Candida）；瑞氏木霉（Trichoderma reesia）(EP 244,234)；粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）(Case等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:5259-5263(1979))；许旺酵母属（Schwanniomyces）诸如许旺酵母（Schwanniomyces occidentalis）(EP 394,538,1990年10月31日公开)；和丝状真菌诸如例如脉孢菌属（Neurospora）、青霉属（Penicillium）、弯颈霉属（Tolypocladium）(WO91/00357,1991年1月10日公开)、和曲霉属（Aspergillus）宿主诸如构巢曲霉（A.nidulans）(Balance等,Biochem.Biophys.Res.Commun.112:284-289(1983);Tilburn等,Gene 26:205-221(1983);Yelton等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:1470-1474(1984))和黑曲霉（A.niger）(Kelly和Hynes,EMBO J.4:475-479(1985))。甲基营养型酵母(Methylotropic yeast)适于本发明，包括但不限于能够在甲醇上生长的、选自以下属的酵母：汉逊氏酵母属(Hansenula)、假丝酵母属(Candida)、克勒克氏酵母属(Kloeckera)、毕赤氏酵母属(Pichia)、糖酵母属(Saccharomyces)、球拟酵母属(Torulopsis)、和红酵母属(Rhodotorula)。作为这类酵母的例子的具体物种列表可参见C.Anthony,The Biochemistry of Methylotrophs,269(1982)。
适用于表达糖基化抗体或多肽的宿主细胞衍生自多细胞生物体。无脊椎动物细胞的例子包括昆虫细胞诸如果蝇S2和夜蛾Sf9，以及植物细胞诸如棉、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄、烟草的细胞培养物。。已经鉴定了许多杆状病毒株和变体及相应的允许的昆虫宿主细胞，它们来自诸如草地夜蛾Spodoptera frugiperda（毛虫）、埃及伊蚊Aedesaegypti（蚊子）、白纹伊蚊Aedes albopictus（蚊子）、黑腹果蝇Drosophila melanogaster（果蝇）、和家蚕Bombyxmori等宿主。公众可获得多种病毒株用于转染，例如苜蓿尺蠖(Autographa californica)NPV的L-1变体和家蚕(Bombyx mori)NPV的Bm-5株，而且此类病毒可依照本发明用作本文的病毒，特别是用于转染草地夜蛾细胞。
然而，对脊椎动物细胞最感兴趣，而且通过培养（组织培养）脊椎动物细胞来繁殖已经成为常规流程。有用的哺乳动物宿主细胞系的例子是用SV40转化的猴肾CV1系（COS-7，ATCC CRL 1651）；人胚肾系（293或为了在悬浮培养中生长而亚克隆的293细胞，Graham等,1977,J.Gen Virol.36:59）；幼仓鼠肾细胞（BHK，ATCC CCL 10）；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR（CHO，Urlaub等,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216）；小鼠塞托利(sertoli)细胞（TM4，Mather,1980,Biol.Reprod.23:243-251）；猴肾细胞（CV1，ATCC CCL 70）；非洲绿猴肾细胞（VERO-76，ATCC CRL-1587）；人宫颈癌细胞（HELA，ATCC CCL 2）；犬肾细胞（MDCK，ATCCCCL 34）；牛鼠(buffalo rat)肝细胞（BRL 3A，ATCC CRL 1442）；人肺细胞（W138，ATCC CCL75）；人肝细胞（Hep G2，HB 8065）；小鼠乳腺肿瘤（MMT 060562，ATCC CCL 51）；TRI细胞（Mather等,1982,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68）；MRC5细胞；FS4细胞；和人肝瘤系（HepG2）。
用上述用于抗体或多肽生成的表达或克隆载体转化宿主细胞，并在为了诱导启动子、选择转化子、或扩增编码期望序列的基因而恰当调整的常规营养培养基中培养。
3.复制型载体的选择和使用
可以将编码抗体或多肽的核酸（例如cDNA或基因组DNA）插入复制型载体用于克隆（DNA扩增）或表达。多种载体是公众可得到的。载体可以是例如质粒、粘粒、病毒颗粒或噬菌体的形式。可以通过多种方法将适宜的核酸序列插入载体。通常，使用本领域已知的技术将DNA插入适宜的限制性内切酶位点。载体构件通常包括但不限于下列一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种标记基因、增强子元件、启动子、和转录终止序列。包含一种或多种这些构件的合适载体的构建采用技术人员已知的标准连接技术。
多肽不仅可以直接重组生产，而且可以作为与异源多肽的融合多肽，所述异源多肽可以是在成熟蛋白质或多肽的N-末端具有特定切割位点的信号序列或其它多肽。通常，信号序列可以是载体的构件，或者它可以是插入载体的编码抗体或多肽的DNA的一部分。信号序列可以是原核信号序列，选自例如碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp、或热稳定的肠毒素II前导序列。为了酵母分泌，信号序列可以是例如酵母转化酶前导序列、α因子前导序列（包括糖酵母和克鲁维酵母的α-因子前导序列，后者见美国专利5,010,182）、或酸性磷酸酶前导序列、白色假丝酵母葡糖淀粉酶前导序列（1990年4月4日公开的EP 362,179）、或1990年11月15日公开的WO 90/13646中描述的信号。在哺乳动物细胞表达中，可以使用哺乳动物信号序列来指导蛋白质的分泌，诸如来自相同或相关物种的分泌型多肽的信号序列，以及病毒分泌前导序列。
表达和克隆载体都包含能够使载体在一种或多种选择的宿主细胞中复制的核酸序列。众所周知多种细菌、酵母、和病毒的此类序列。来自质粒pBR322的复制起点适合于大多数革兰氏阴性细菌，2μ质粒起点适合于酵母，而各种病毒起点（SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV、或BPV）可用于哺乳动物细胞中的克隆载体。
表达和克隆载体通常将包含选择基因，也称为选择标志。典型的选择基因编码如下蛋白质：(a)赋予抗生素或其它毒素抗性，例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤、或四环素；(b)补足营养缺陷；或(c)提供不能由复合培养基获得的关键营养物，例如编码芽孢杆菌D-丙氨酸消旋酶的基因。
适于哺乳动物细胞的选择标志的一个例子是能够鉴定有能力摄取编码抗体或多肽的核酸的细胞的选择标志，诸如DHFR或胸苷激酶。在采用野生型DHFR时，适宜的宿主细胞是DHFR活性缺陷的CHO细胞系，其制备和繁殖如Urlaub等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980)所述。适用于酵母的选择基因为存在于酵母质粒YRp7中的trp1基因(Stinchcomb等,1979,Nature282:39;Kingsman等,1979,Gene 7:141;Tschemper等,1980,Gene 10:157)。trp1基因为缺乏在色氨酸中生长能力的酵母突变株，例如ATCC No.44076或PEP4-1提供了选择标志(Jones,1977,Genetics 85:12)。
表达和克隆载体通常包含与编码抗体或多肽的核酸序列可操作连接的启动子以指导mRNA合成。受到多种潜在宿主细胞识别的启动子是众所周知的。适用于原核宿主的启动子包括β-内酰胺酶和乳糖启动子系统(Chang等,Nature 275:615(1978);Goeddel等,Nature 281:544(1979))、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel,Nucleic acids Res.8:4057(1980);EP 36,776)、和杂合启动子诸如tac启动子(deBoer等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:21-25(1983))。用于细菌系统的启动子还将包含与编码抗体或多肽的DNA可操作连接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
适用于酵母宿主的启动子序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman 等,J.Biol.Chem.255:2073(1980))或其它糖酵解酶(Hess等,J.Adv.Enzyme Reg.7:149(1968);Holland,Biochemistry 17:4900(1978))的启动子，诸如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶、和葡糖激酶。
作为具有由生长条件控制转录的额外优点的诱导型启动子的其它酵母启动子是醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢有关的降解酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区。适用于酵母表达的载体和启动子进一步描述于EP 73,657。
在哺乳动物宿主细胞中由载体转录抗体或多肽受到例如由病毒诸如多瘤病毒、禽痘病毒(1989年7月5日公开的UK 2,211,504)、腺病毒（诸如腺病毒2）、牛乳头瘤病毒、禽类肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙肝病毒和猿猴病毒40(SV40)基因组获得的启动子、由异源哺乳动物启动子例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子、及由热休克启动子的控制，倘若此类启动子与宿主细胞系统相容的话。
可通过在载体中插入增强子序列来提高高等真核细胞对编码抗体或多肽的DNA的转录。增强子是DNA的顺式作用元件，通常大约10至300bp，作用于启动子以增加转录。已知来自哺乳动物基因（球蛋白、弹性蛋白酶、清蛋白、α-胎蛋白和胰岛素）的许多增强子序列。然而，通常使用来自真核细胞病毒的增强子。例子包括SV40复制起点晚期一侧的增强子（bp100-270）、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒复制起点晚期一侧的增强子、和腺病毒增强子。增强子可以剪接到载体中，位于抗体或多肽编码序列的5'或3'位置，但是优选位于启动子的5'位点。
用于真核宿主细胞（酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人、或来自其它多细胞生物体的有核细胞）的表达载体还将包含终止转录和稳定mRNA所必需的序列。此类序列通常可以由真核或病毒DNA或cDNA非翻译区的5'端和偶尔的3'端获得。这些区域包含在编码抗体或多肽的mRNA的非翻译部分中转录成聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。
适合在改动后在重组脊椎动物细胞培养物中合成抗体或多肽的其它方法、载体和宿主细胞见Gething等,Nature 293:620-625(1981);Mantei等,Nature 281:40-46(1979);EP 117,060;和EP 117,058。
4.培养宿主细胞
可以在多种培养基中培养用于生成本发明抗体或多肽的宿主细胞。商品化培养基诸如Ham氏F10（Sigma）、极限必需培养基（MEM，Sigma）、RPMI-1640（Sigma）、和Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基（DMEM，Sigma）适于培养宿主细胞。另外，可以使用下列文献中描述的任何培养基作为宿主细胞的培养基：Ham等,1979,Meth.Enz.58:44;Barnes等,1980,Anal.Biochem.102:255；美国专利4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或U.S.Patent Re.30,985。任何这些培养基可以根据需要补充激素和/或其它生长因子（诸如胰岛素、运铁蛋白、或表皮生长因子）、盐（诸如氯化钠、钙、镁、和磷酸盐）、缓冲剂（诸如HEPES）、核苷酸（诸如腺苷和胸苷）、抗生素（诸如GENTAMYCINTM药物）、痕量元素（定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物）、和葡萄糖或等效能源。还可以以适当浓度包含本领域技术人员知道的任何其它必需补充物。培养条件诸如温度、pH等即先前为表达而选择用于宿主细胞的，这对于普通技术人员而言是显然的。
5.检测基因扩增/表达
基因的扩增和/或表达可以在样品中直接测量，例如根据本文提供的序列，使用适宜的标记探针，通过常规的Southern印迹、对mRNA转录定量的Northern印迹(Thomas,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:5201-5205(1980))、点印迹（DNA分析）或原位杂交。或者，可采用能识别特定双链体的抗体，所述双链体包括DNA双链体、RNA双链体、及DNA-RNA杂合双链体或DNA-蛋白质双链体。继而可标记抗体，并可进行测定法，其中将双链体结合到表面上，从而在双链体在表面上形成时，可检测与双链体结合的抗体的存在。
或者，为了直接对基因产物的表达定量，可通过免疫学方法测量基因表达，诸如细胞或组织切片的免疫组化染色和细胞培养物或体液的测定法。可用于免疫组化染色和/或样品液体测定法的抗体可以是单克隆的或多克隆的，而且可以在任何哺乳动物中制备。方便的是，可针对天然序列多肽或针对基于本文提供的DNA序列的合成肽或针对与多肽DNA融合且编码特定抗体表位的外源序列来制备抗体。
6.纯化抗体和多肽
可以从培养液或从宿主细胞裂解物中回收各种形式的抗体和多肽。如果是膜结合的，那么可使用合适的去污剂溶液（例如Triton-X 100）或通过酶促裂解使其从膜释放。抗体和多肽表达中所采用的细胞可通过多种物理或化学手段破裂，诸如冻融循环、超声处理、机械破裂、或细胞溶解剂。
可能期望从重组细胞蛋白质或多肽纯化抗体和多肽。下面的流程是合适纯化流程的例示：在离子交换柱上的分级；乙醇沉淀；反相HPLC；在硅土或阳离子交换树脂诸如DEAE上的层析；层析聚焦；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；使用例如Sephadex G-75的凝胶过滤；蛋白ASepharose柱以除去污染物诸如IgG；及结合抗体和多肽的表位标记形式的金属螯合柱。可采用多种蛋白质纯化方法，此类方法是本领域已知的，并描述于例如Deutscher,Methods in Enzymology,182(1990);Scopes,Protein Purification:Principes and Practice,Springer-Verlag,New York(1982)。纯化步骤的选择将取决于例如所用生成方法的性质和所产生的具体抗体或多肽。
在使用重组技术时，可以在细胞内、在周质空间中生成抗体，或者直接分泌到培养基中。如果在细胞内生成抗体，那么作为第一步，通过例如离心或超滤清除宿主细胞或裂解片段的微粒碎片。Carter等,Bio/Technology 10:163-167,1992描述了用于分离分泌到大肠杆菌周质空间的抗体的流程。简单地说，在存在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)时使细胞糊融化约30分钟。可以通过离心除去细胞碎片。如果将抗体分泌到培养基中，那么通常首先使用商品化蛋白质浓缩滤器，例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元浓缩来自此类表达系统的上清液。在任何上述步骤中，可以包括蛋白酶抑制剂诸如PMSF来抑制蛋白水解，而且可以包括抗生素来防止外来污染物的生长。
可以使用例如羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析、和亲和层析来纯化由细胞制备的抗体组合物，优选的纯化技术是亲和层析。蛋白A作为亲和配体的适宜性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc区的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark等,1983,J.Immunol.Meth.62:1-13)。蛋白G推荐用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss等,1986,EMBO J.5:1567-1575)。亲和配体所附着的基质最常用的是琼脂糖，但是可以使用其它基质。物理稳定的基质诸如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯能够获得比琼脂糖更快的流速和更短的加工时间。对于包含CH3结构域的抗体而言，可使用BakerbondABXTM树脂（J.T.Baker,Phillipsburg,NJ）进行纯化。根据待回收的抗体，也可使用其它蛋白质纯化技术，诸如离子交换柱上的分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土上的层析、肝素SEPHAROSETM上的层析、阴离子或阳离子交换树脂（诸如聚天冬氨酸柱）上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE、和硫酸铵沉淀。
在任何初步的纯化步骤后，包含目的抗体和污染物的混合物可以使用pH约2.5-4.5的洗脱缓冲液，优选在低盐浓度（例如约0-0.25M盐）进行低pH疏水相互作用层析。
I.药物配制剂
依照本发明使用的抗体、结合寡肽、结合有机或无机小分子和/或多肽的治疗性配制剂通过将具有期望纯度的抗体、多肽、寡肽或有机/无机小分子与任选的药学可接受载体、赋形剂或稳定剂（《Remington's Pharmaceutical Sciences》，第16版，Osol,A.编，1980）混合来制备成冻干剂型或水溶液的形式供贮存。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，并且包括：缓冲剂，诸如乙酸盐、Tris、磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂（诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯己双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烃基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚）；低分子量（少于约10个残基）多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；张力调节剂(tonicifier)，诸如海藻糖和氯化钠；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；表面活性剂，诸如聚山梨醇酯；成盐抗衡离子，诸如钠；金属复合物（例如Zn-蛋白质复合物）；和/或非离子表面活性剂，诸如或聚乙二醇(PEG)。配制剂可包含浓度介于之间5-200mg/ml之间，优选介于10-100mg/ml之间的抗体。
本文中的配制剂还可含有超过一种所治疗具体适应症所必需的活性化合物，优选活性互补且彼此没有不利影响的。例如，在抗体、结合寡肽、或结合有机或无机小分子之外，可能还期望在一种配制剂中含有另一种抗体，例如结合相同多肽上不同表位的第二抗体，或针对一些其它靶物诸如影响特定癌生长的生长因子的抗体。或者/另外，所述组合物还可包含化疗剂、细胞毒剂、细胞因子、生长抑制剂、抗激素剂和/或心脏保护剂。合适的是，此类分子以对于预定目的有效的量组合存在。
活性成分还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中（例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊）、在胶状药物投递系统中（例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊）、或在粗滴乳状液中。此类技术公开于Remington's Pharmaceutical Sciences,第16版,Osol,A.编(1980)。
可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有抗体的固体疏水聚合物的半透性基质，该基质是定型产品的形式，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶（例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇)）、聚交酯(美国专利No.3,773,919)、L-谷氨酸和γ-乙基L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON（由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体）及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
用于体内施用的配制剂必须是无菌的。这可容易地通过无菌滤膜过滤来实现。
J.使用抗体、结合寡肽和结合有机/无机小分子的治疗
为了测定癌症中的多肽（hepsin和/或MSP）表达，可利用多种检测测定法。在一个实施方案中，可通过免疫组化(IHC)来分析多肽过表达。可对来自肿瘤活组织检查的石蜡包埋组织切片进行IHC测定法，并给予如下多肽染色强度标准：
得分0：未观察到染色或者在少于10%的肿瘤细胞中观察到膜染色。
得分1+：在超过10%的肿瘤细胞中检测到微弱的/刚刚可察觉的膜染色。所述细胞只在其部分膜上有染色。
得分2+：在超过10%的肿瘤细胞中观察到微弱至中等的完全膜染色。
得分3+：在超过10%的肿瘤细胞中观察到中等至强烈的完全膜染色。
那些多肽表达得分0或1+的肿瘤可鉴定为未过表达多肽，而那些得分2+或3+的肿瘤可鉴定为过表达多肽。
或者/另外，可对福尔马林固定、石蜡包埋的肿瘤组织进行FISH测定法诸如（由Ventana,Arizona销售）或（Vysis,Illinois）以测定肿瘤中多肽过表达的程度（如果有的话）。
还可使用体内检测测定法来评估多肽过表达或扩增，例如通过施用结合待检测分子且标记有可检测标记物（例如放射性同位素或荧光标记物）的分子（诸如抗体、寡肽或有机小分子），然后对患者进行外部扫描以定位所述标记物。
如上文所述，本发明的抗体、寡肽和有机/无机小分子具有多种非治疗性应用。本发明的抗体、寡肽和有机/无机小分子可用于表达多肽的癌症的分级（例如在放射成像中）。抗体、寡肽和有机/无机小分子还可用于从细胞中纯化或免疫沉淀多肽，用于多肽的体外检测和定量例如在ELISA或Western印迹中，作为纯化其它细胞的一个步骤从混合细胞群中杀死和消除表达多肽的细胞。
现在，根据癌症的分级，癌症的治疗牵涉下列疗法中的一种或组合：手术去除癌性组织，放疗和化疗。抗体、寡肽或有机/无机小分子疗法对于不能很好承受化疗的毒性和副作用的老年患者和放疗具有有限效用的转移性疾病可能是尤其想要的。本发明的靶向肿瘤的抗体、寡肽和有机/无机小分子可用于在疾病的最初诊断时或在复发期间减轻表达多肽的癌症。对于治疗性应用，可单独使用抗体、寡肽或有机/无机小分子，或者用于与例如激素、抗血管发生剂(antiangiogenics)或放射标记的化合物，或者与手术、冷冻疗法和/或放疗的联合疗法。抗体、寡肽或有机/无机小分子的治疗可与其它形式的常规疗法联合施用，与常规疗法连续、在之前或之后。化疗药物诸如多西他塞(doxetaxel)、帕利他塞(paclitaxel)、雌莫司汀(estramustine)和米托蒽醌(mitoxantrone)用于治疗癌症，特别是无风险(good risk)的患者。在本发明治疗或减轻癌症的方法中，可给癌症患者施用抗体、寡肽或有机/无机小分子并联合一种或多种前述化疗剂的治疗。具体而言，设想了与紫杉醇及改良衍生物的联合疗法（参见例如EP 0 600 517）。将抗体、寡肽或有机/无机小分子与治疗有效剂量的化疗剂一起施用。在另一个实施方案中，联合化疗施用抗体、寡肽或有机/无机小分子以提高化疗剂例如紫杉醇的活性和功效。Physicians'DeskReference(PDR)公开了已经在多种癌症的治疗中使用的这些药剂的剂量。这些前述化疗药物在治疗上有效的剂量给药方案和剂量将取决于所治疗的具体癌症、疾病的程度、及有本领域技术的内科医师所熟悉的其它因素、且可以由内科医师确定。
在一个具体的实施方案中，将包含与细胞毒剂偶联的抗体、寡肽或有机/无机小分子的偶联物施用于患者。优选的是，与蛋白质结合的免疫偶联物由细胞内在化，导致免疫偶联物在杀死其所结合的癌细胞方面的治疗功效提高。在一个优选的实施方案中，细胞毒剂靶向或干扰癌细胞中的核酸。此类细胞毒剂的例子上文已有描述，包括美登木素生物碱类、加利车霉素、核糖核酸酶及DNA内切核酸酶。
将抗体、寡肽、有机/无机小分子或其毒素偶联物依照已知方法施用给人类患者，诸如静脉内施用，例如作为推注或一段时间的连续输注，通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部或吸入路径。优选静脉内或皮下施用抗体、寡肽或有机/无机小分子。
抗体、寡肽或有机/无机小分子的施用可联合其它治疗方案。联合施用包括使用分开的配制剂或单一的药用配制剂的共施用，及任意顺序的连续施用，其中优选有一段时间所有两种（或多种）活性剂同时发挥其生物学活性。优选的是，此类联合疗法导致协同治疗效果。
可能还期望将一种或多种抗体、寡肽或有机/无机小分子的施用与针对与特定癌症有关的另一种肿瘤抗原的抗体的施用联合。
在另一个实施方案中，本发明的治疗性处理方法牵涉（一种或多种）抗体、寡肽或有机/无机小分子与一种或多种化疗剂或生长抑制剂的联合施用，包括不同化疗剂的混合物(cocktail)的共施用。化疗剂包括磷酸雌莫司汀(estramustine phosphate)、泼尼莫司汀(prednimustine)、顺铂、5-氟尿嘧啶、美法仑(melphalan)、环磷酰胺、羟基脲和羟基脲紫杉烷(hydroxyureataxane)（诸如紫杉醇和多西他塞(doxetaxel)）和/或蒽环类(anthracycline)抗生素。此类化疗剂的制剂和剂量给药方案可依照制造商的说明书使用或由熟练从业人员根据经验确定。此类化疗的制备和剂量给药方案还可参阅ChemotherapyService Ed.,M.C.Perry,Williams & Wilkins,Baltimore,MD(1992)。
抗体、寡肽或有机/无机小分子可与抗激素化合物以此类分子的已知剂量联合，例如抗雌激素化合物，诸如他莫昔芬(tamoxifen)；抗孕酮化合物，诸如奥那司酮(onapristone)(见EP 616,812)；或抗雄激素化合物，诸如氟他米特(flutamide)。当待治疗癌症是雄激素非依赖性癌症时，患者可能先前已经接受过抗雄激素疗法，并在癌症变成雄激素非依赖性时，可以给患者施用抗体、寡肽或有机/无机小分子（及任选的本文所述其它药剂）。
有时，还给患者共施用心脏保护剂（以预防或降低与疗法有关的心肌功能障碍）或一种或多种细胞因子可能也是有益的。除了上述治疗方案，在抗体、寡肽或有机/无机小分子疗法之前、同时、或之后，可给患者进行手术去除癌细胞和/或放疗。任何上述共施用药剂的合适剂量就是那些目前所使用的剂量，而且可由于该药剂与抗体、寡肽或有机/无机小分子的联合作用（协同作用）而降低。
为了预防或治疗疾病，施用的剂量和模式可以由内科医师依照已知标准来选择。抗体、寡肽或有机/无机小分子的适宜剂量将取决于如上定义的待治疗疾病的类型、疾病的严重程度和进程、是为了预防还是治疗目的施用抗体、寡肽或有机/无机小分子、先前的疗法、患者的临床史及对抗体、寡肽或有机分子的响应、及主治医师的判断。恰当的将抗体、寡肽或有机/无机小分子一次性或在一系列治疗中施用给患者。优选的是，将抗体、寡肽或有机/无机小分子通过静脉内输注或通过皮下注射来施用。根据疾病的类型和严重程度，约1μg/kg至约50mg/kg体重（例如约0.1-15mg/kg/剂）的抗体可作为初始侯选剂量施用给患者，无论是例如通过一次或多次分开的施用，或是通过连续输注。剂量给药方案可包括施用约4mg/kg的初始加载剂量，后续约2mg/kg抗体的每周维持剂量。然而，其它剂量方案也可使用。根据上述因素，典型的每日剂量可在约1μg/kg到100mg/kg或更多的范围内。对于持续几天或更长时间的重复施用，根据状况，维持治疗直到发生对疾病症状的期望遏制。这种疗法的进展可容易地通过常规方法和测定法，并基于内科医师或其它本领域技术人员知道的标准来监测。
除了将抗体蛋白质施用给患者，本申请设想通过基因疗法来施用抗体。编码抗体的核酸的此类施用涵盖在表述“施用治疗有效量的抗体”中。关于使用基因疗法来产生胞内抗体的用途参见例如1996年3月14日公开的WO96/07321。
有两种主要方法使核酸（任选包含在载体中）进入患者的细胞，即体内和回体(exvivo)。对于体内投递，通常在需要抗体的部位将核酸直接注射到患者体内。对于回体治疗，采集患者的细胞，将核酸导入这些分离的细胞，并将经过修饰的细胞或是直接施用于患者，或是例如装入多孔膜内并植入患者体内（参见例如美国专利4,892,538和5,283,187）。有多种技术可用于将核酸导入活细胞。这些技术根据是将核酸转移至预期宿主的体外培养细胞还是体内细胞而有所变化。适于在体外将核酸转移到哺乳动物细胞中的技术包括使用脂质体、电穿孔、显微注射、细胞融合、DEAE-右旋糖苷、磷酸钙沉淀法等。常用于回体投递基因的载体是逆转录病毒。
目前优选的体内核酸转移技术包括用病毒载体（诸如腺病毒、I型单纯疱疹病毒或腺伴随病毒）和基于脂质的系统（可用于脂质介导的基因转移的脂质有例如DOTMA、DOPE和DC-Chol）进行的转染。关于目前已知的基因标记和基因治疗方案的综述参见Anderson etal.,Science 256:808-813(1992)。还可参见WO 93/25673及其引用的参考文献。
本发明的抗体可以是本文中“抗体”定义所涵盖的不同形式。因此，抗体包括全长或完整抗体，抗体片段，天然序列抗体或氨基酸变体，人源化的、嵌合的或融合抗体，免疫偶联物，及其功能性片段。在融合抗体中，抗体序列与异源多肽序列融合。可在Fc区中修饰抗体以提供期望的效应物功能。如本文的部分更为详细讨论的，凭借适宜的Fc区，结合在细胞表面上的裸抗体可诱导细胞毒性，例如经由抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)，或通过在补体依赖性细胞毒性中募集补体，或一些其它机制。或者，在期望消除或降低效应物功能从而使副作用或治疗并发症降至最低时，可使用某些其它Fc区。
在一个实施方案中，抗体与本发明抗体竞争对相同表位的结合或基本上结合相同表位。还设想了具有本发明抗体的生物学特征的抗体，明确包括体内肿瘤靶向和任何细胞增殖抑制或细胞毒性特征。
本文详细描述了生成上述抗体的方法。
本发明抗体、寡肽和有机/无机小分子可用于治疗哺乳动物中表达hepsin和/或MSP的癌症或减轻所述癌症的一种或多种症状。本发明的方法涵盖拮抗剂在与这些癌症有关的转移性肿瘤的症状缓解和/或治疗中的用途。抗体、寡肽或有机/无机小分子拮抗剂能够结合哺乳动物中表达多肽（hepsin和/或MSP）的癌细胞的至少一部分。在一个实施方案中，抗体、寡肽或有机/无机小分子在体外或在体内在结合多肽时有效引起破坏或杀死表达和/或响应多肽的肿瘤细胞或抑制此类肿瘤细胞的生长和/或侵入性。此类抗体包括裸露的抗体（未与任何药剂偶联）。具有细胞毒性或其它抑制特性的裸抗体可以进一步与细胞毒剂合作(harness)，使得它们在破坏肿瘤细胞上更有效。可以通过例如将抗体与细胞毒剂偶联形成本文所述免疫偶联物，而赋予抗体以细胞毒性特性。在一些实施方案中，细胞毒剂或生长抑制剂是小分子。在一些实施方案中，使用毒素诸如加利车霉素或美登木素生物碱类及其类似物或衍生物。
本发明提供了包含本发明抗体、寡肽或有机/无机小分子及载体的组合物。为了治疗癌症的目的，可以将组合物施用于需要此类治疗的患者，其中组合物可包含一种或多种呈现为免疫偶联物或裸抗体的抗体。在另一个实施方案中，组合物可包含这些抗体、寡肽或有机/无机小分子并联合其它治疗剂诸如细胞毒剂或生长抑制剂，包括化疗剂。本发明还提供了包含本发明抗体、寡肽或有机/无机小分子及载体的配制剂。在一个实施方案中，配制剂是包含药学可接受载体的治疗用配制剂。
本发明的另一个方面是编码抗体的分离核酸。设想了编码重链和轻链二者，尤其是高变区残基的核酸，编码天然序列抗体以及所述抗体的变体、修饰和人源化型式的链。
本发明还提供了可用于治疗哺乳动物中癌症或减轻所述癌症的一种或多种症状的方法，包括给哺乳动物施用治疗有效量的抗体、寡肽或有机/无机小分子。抗体、寡肽或有机/无机小分子治疗用组合物可由内科医师指导，短期或长期或间断施用。还提供了抑制表达和/或响应多肽（hepsin和/或MSP）的细胞生长和杀死它的方法。
本发明还提供了包含至少一种抗体、寡肽或有机/无机小分子的试剂盒和制品。包含抗体、寡肽或有机/无机小分子的试剂盒可用于例如细胞杀伤测定法，抑制肿瘤细胞侵入，及从细胞中纯化或免疫沉淀多肽。例如，为了分离和纯化多肽，试剂盒可包含与珠子（例如sepharose珠子）偶联的抗体、寡肽或有机/无机小分子。可以提供包含抗体、寡肽或有机/无机小分子的试剂盒，用于多肽的体外检测和定量，例如在ELISA或Western印迹中。可用于检测的此类抗体、寡肽或有机/无机小分子可以与标记物诸如荧光或放射标记物一起提供。
K.制品和试剂盒
本发明的另一个实施方案是包含可用于治疗表达多肽（hepsin和/或MSP）的癌症（诸如前列腺和卵巢癌）的物质的制品。所述制品包括容器及容器上或与容器相连的标签或包装插页。合适的容器包括例如药瓶、药管、注射器等。所述容器可以用多种材料制成，诸如玻璃或塑料。所述容器装有有效治疗所述癌症疾患的组合物，可以具有无菌存取口（例如所述容器可以是静脉内溶液袋或带有皮下注射针可刺穿的塞子的药瓶）。所述组合物中的至少一种活性药剂是本发明的抗体、寡肽或有机/无机小分子。所述标签或包装插页指明该组合物用于治疗癌症。所述标签或包装插页进一步包含关于对癌症患者施用所述抗体、寡肽或有机/无机小分子组合物的说明书。另外，所述制品可进一步包括第二容器，其中装有药学可接受缓冲液，诸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏(Ringer)溶液和右旋糖溶液。它可进一步包括从商业和用户立场出发需要的其它物质，包括其它缓冲液、稀释剂、滤器、针和注射器。
还提供了可用于各种目的的试剂盒，例如用于多肽表达或细胞杀伤测定法、用于自细胞纯化或免疫沉淀多肽。为了分离和纯化多肽，所述试剂盒可包含与珠子（例如sepharose珠子）偶联的抗体、寡肽或有机/无机小分子。可提供包含用于多肽体外检测和定量（例如在ELISA或Western印迹中进行的）的抗体、寡肽或有机/无机小分子。与制品一样，所述试剂盒包括容器及容器上或与容器相连的标签或包装插页。所述容器装有包含至少一种本发明抗体、寡肽或有机/无机小分子的组合物。可包括装有例如稀释剂和缓冲液、对照抗体的别的容器。所述标签或包装插页可提供该组合物的描述以及意图体外或检测使用的说明书。
L.多肽和编码多肽的核酸--具体形式和应用
编码本发明多肽的核苷酸序列（或其互补序列）在分子生物学领域具有多种应用，以及用于治疗，等。编码多肽的核酸还可用于通过本文所述重组技术来制备多肽，其中那些多肽可用于例如制备本文所述抗体。
全长天然序列多肽基因或其部分可作为杂交探针用于cDNA文库以分离与本文所公开的天然多肽序列具有期望序列同一性的其它cDNA（例如那些编码多肽的天然存在变体或来自其它物种的多肽的cDNA）。任选的是，探针的长度为约20个到约50个碱基。杂交探针可衍生自全长天然核苷酸序列的至少部分新的区域，其中那些区域不需要过多试验就可以确定，或者来自包含天然序列多肽的启动子、增强子元件和内含子的基因组序列。举例来说，筛选方法将包括使用已知DNA序列分离多肽基因的编码区以合成约40个碱基的选定探针。杂交探针可用多种标记物标记，包括放射性核苷酸，诸如32P或35S，或酶标记物，诸如通过亲合素/生物素偶联系统与探针偶联的碱性磷酸酶。具有与本发明多肽基因的序列互补的序列的标记探针可用于筛选人cDNA、基因组DNA或mRNA文库以确定探针与此类文库的哪些成员杂交。下面的实施例更详细的描述了杂交技术。使用本文所公开的方法，本申请中公开的任何EST序列可类似地用作探针。
编码多肽的核酸的其它有用片段包括反义或有义寡核苷酸，包括能够结合靶多肽mRNA（有义）或多肽DNA（反义）序列的单链核酸序列（或是RNA或是DNA）。依照本发明，反义或有义寡核苷酸包含编码本文所述hepsin、MSA原或结合片段的DNA编码区的片段。此类片段通常包含至少约14个核苷酸，优选约14至30个核苷酸。根据编码给定蛋白质的cDNA序列来衍生反义或有义寡核苷酸的能力描述于例如Stein和Cohen,Cancer Res.48:2659,1988和van der Krol等,BioTechniques 6:958,1988。
反义或有义寡核苷酸与靶核酸序列的结合导致双链体的形成，其通过多种手段之一阻断靶序列的转录或翻译，所述手段包括双链体的降解增强、转录或翻译的过早终止、或其它手段。此类方法涵盖在本发明中。反义寡核苷酸因此可用于阻断蛋白质的表达，其中所述蛋白质可能在哺乳动物中起诱导癌症的作用。反义或有义寡核苷酸还包括具有经过修饰的糖-磷酸二酯骨架（或其它糖键(linkage)，诸如WO 91/06629中所述）的寡核苷酸，且其中此类糖键对内源核酸酶有抗性。具有抗性糖键的此类寡核苷酸在体内是稳定的（即能够抵抗酶促降解），但保留了能够结合靶核苷酸序列的序列特异性。
用于反义结合的优选基因内位点包括掺入基因可读框(ORF)的翻译起始密码子（5'-AUG/5'-ATG）或终止密码子（5'-UAA、5'-UAG和5-UGA/5'-TAA、5'-TAG和5'-TGA）的区域。这些区域指mRNA或基因中涵盖从翻译起始或终止密码子起任一方向（即5'或3'）的约25个至约50个毗连核苷酸的部分。用于反义结合的其它优选区域包括：内含子；外显子；内含子-外显子连接处；可读框(ORF)或“编码区”，即翻译起始密码子和翻译终止密码子之间的区域；mRNA的5′帽，其包含经由5'-5'三磷酸键与mRNA的最5'端残基连接的N7-甲基化鸟苷残基，包括5′帽结构自身以及与帽相邻的前50个核苷酸；5'非翻译区(5'UTR)，即mRNA中从翻译起始密码子起5'方向的部分，因此包括mRNA中5′帽位点和翻译起始密码子之间的核苷酸或基因上的相应核苷酸；和3'非翻译区(3'UTR)，即mRNA中从翻译终止密码子起3'方向的部分，因此包括mRNA中翻译终止密码子和3'末端之间的核苷酸或基因上的相应核苷酸。
可用于抑制多肽表达的优选反义化合物的具体例子包括包含经修饰骨架或非天然核苷间键的寡核苷酸。具有经修饰骨架的寡核苷酸包括那些在骨架中保留磷原子的以及那些在骨架中没有磷原子的寡核苷酸。为了本说明书的目的，而且有时候在本领域内参考，在其核苷间骨架中没有磷原子的经修饰寡核苷酸也可认为是寡核苷酸。优选的经修饰寡核苷酸骨架包括例如具有正常3'-5′键的硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨烷基磷酸三酯(aminoalkylphosphotriester)、甲基和其它烃基膦酸酯包括3'-亚烃基膦酸酯(3'-alkylene phosphonate)、5'-亚烃基膦酸酯(5'-alkylene phosphonate)和手性膦酸酯、亚磷酸酯、氨基磷酸酯包括3'-氨基氨基磷酸酯(3'-aminophosphoramidate)和氨烃基氨基磷酸酯(aminoalkylphosphoramidate)、硫羰氨基磷酸酯(thionophosphoramidate)、硫羰烃基膦酸酯(thionoalkylphosphonate)、硫羰烃基磷酸三酯(thionoalkylphosphotriester)、硒代磷酸酯(selenophosphate)和溴代磷酸酯(borano-phosphate)，它们的2'-5'连接类似物，及那些具有反向极性的类似物，其中一个或多个核苷酸间键是3'到3'、5'到5'、或2'到2'键。具有反向极性的优选寡核苷酸在最3'端核苷酸间键包含单一3'到3'键，即可以是无碱基（核碱基缺失或以羟基取代）的单一反向核苷残基。多种盐、混合盐和游离酸的形式也包括在内。教导含磷键的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利3,687,808;4,469,863;4,476,301;5,023,243;5,177,196;5,188,897;5,264,423;5,276,019;5,278,302;5,286,717;5,321,131;5,399,676;5,405,939;5,453,496;5,455,233;5,466,677;5,476,925;5,519,126;5,536,821;5,541,306;5,550,111;5,563,253;5,571,799;5,587,361;5,194,599;5,565,555;5,527,899;5,721,218;5,672,697;和5,625,050，在此收入每一项作为参考。
其中不含磷原子的优选经修饰寡核苷酸骨架具有由短链烃基或环烃基核苷间键、混合杂原子和烃基或环烃基核苷间键、或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键形成的骨架。这些包括那些具有吗啉代键（部分由核苷的糖部分形成）；硅氧烷骨架；硫化物、亚砜和砜骨架；甲酰基(formacetyl)和硫代甲酰基(thioformacetyl)骨架；亚甲基甲酰基(formacetyl)和硫代甲酰基(thioformacetyl)骨架；核糖乙酰基骨架；含烯骨架；氨基磺酸酯(sulfamate)骨架；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基(methylenehydrazino)骨架；磺酸酯和磺酰胺(sulfonamide)骨架；酰胺骨架；及其它具有混合N、O、S和CH2组成部分的骨架。教导此类寡核苷酸的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利5,034,506;5,166,315;5,185,444;5,214,134;5,216,141;5,235,033;5,264,562;5,264,564;5,405,938;5,434,257;5,466,677;5,470,967;5,489,677;5,541,307;5,561,225;5,596,086;5,602,240;5,610,289;5,602,240;5,608,046;5,610,289;5,618,704;5,623,070;5,663,312;5,633,360;5,677,437;5,792,608;5,646,269;和5,677,439，在此收入每一项作为参考。
在其它优选的反义寡核苷酸中，核苷酸单元的糖和核苷间键，即骨架，用新基团取代。保持碱基单元以与适宜的核酸靶化合物杂交。已显示出具有卓越杂交特性的这样一种寡聚化合物，即寡核苷酸模拟物，称为肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖骨架以含酰胺骨架取代，特别是氨乙基甘氨酸骨架。核碱基得到保留并直接或间接结合骨架酰胺部分的氮杂氮原子。教导PNA化合物的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利5,539,082;5,714,331;和5,719,262，在此收入每一项作为参考。PNA化合物的更多教导可参见Nielsen等,1991,Science 254:1497-1500。
优选的反义寡核苷酸掺入了硫代磷酸酯(phosphorothioate)骨架和/或杂原子骨架，特别是-CH2-NH-O-CH2-、-CH2-N(CH3)-O-CH2-（称为亚甲基(甲基亚氨基)或MMI骨架）、-CH2-O-N(CH3)-CH2-、上述美国专利5,489,677中描述的-CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-和-O-N(CH3)-CH2-CH2-（其中天然磷酸二酯骨架表示为-O-P-O-CH2-）、及上述美国专利5,602,240的酰胺骨架。上述美国专利5,034,506的具有吗啉代骨架结构的反义寡核苷酸也是优选的。
经修饰的寡核苷酸还可以包含一种或多种取代糖模块。优选的寡核苷酸在2'位置包含如下之一：OH;F;O-烷基,S-烷基,或N-烷基;O-烯基,S-烯基,或N-烯基;O-炔基,S-炔基,或N-炔基;或O-烃基-O-烃基，其中烷基、烯基和炔基可以是取代的或未取代的C1到C10烷基或C2到C10烯基和炔基。特别优选的是O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2、和O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中n和m是1到约10。其它优选的反义寡核苷酸在2'位置包含如下之一：C1到C10低级烃基，取代的低级烃基，烯基，炔基，烃芳基，芳烃基，O-烃芳基或O-芳烃基，SH，SCH3，OCN，Cl，Br，CN，CF3，OCF3，SOCH3，SO2CH3，ONO2，NO2，N3，NH2，杂环烃基，杂环烃芳基，氨烃基氨基(aminoalkylamino)，聚烃基氨基(polyalkylamino)，取代的甲硅烷基，RNA切割基团(cleaving group)，报道基团(reporter group)，嵌入剂，用于提高寡核苷酸的药动学性质的基团，或用于提高核苷酸的药效学性质的基团，及具有相似性质的其它取代基。优选的修饰包括2'-甲氧基乙氧基（2'-O-CH2CH2OCH3，也称作2'-O-(2-甲氧基乙基)或2'-MOE）(Martin等,1995,HeIv.Chim.Acta 78:486-504)即烃氧基烃氧基(alkoxyalkoxy)。进一步优选的修饰包括2'-二甲氨基氧基乙氧基，即O(CH2)2ON(CH3)2基团，也称作2'-DMAOE，如下文实施例所述，和2'-二甲氨基乙氧基乙氧基（本领域也称作2'-O-二甲氨基乙氧基乙基或2'-DMAEOE），即2'-O-(CH2)2-O-(CH2)2-N(CH3)2。
进一步优选的修饰包括锁定核酸(Locked Nucleic Acid,LNA)，其中2'-羟基与糖环的3'或4'碳原子相连，由此形成双环糖模块。所述键优选是桥接2'氧原子和4'碳原子的亚甲基(methelyne)(-CH2-)n基团，其中n是1或2。LNA及其制备参见WO 98/39352和WO 99/14226。
其它优选的修饰包括2'-甲氧基(2'-O-CH3)，2'-氨丙氧基(2'-OCH2CH2CH2NH2)，2'-烯丙基(2'-CH2-CH=CH2)，2'-O-烯丙基(2'-O-CH2-CH=CH2)和2'-氟(2'-F)。2'-修饰可以在阿拉伯糖(arabino)(上)位或核糖(ribo)(下)位。优选的2'-阿拉伯糖修饰是2'-F。也可在寡核苷酸上的其它位置进行类似的修饰，特别是3'末端核苷酸的糖的3'位置或在2'-5'连接的寡核苷酸中和5'末端核苷酸的5'位置。寡核苷酸还可具有糖模拟物，诸如用环丁基模块取代呋喃戊糖基(pentofuranosyl)糖。教导此类经过修饰的糖结构的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利4,981,957;5,118,800;5,319,080;5,359,044;5,393,878;5,446,137;5,466,786;5,514,785;5,519,134;5,567,811;5,576,427;5,591,722;5,597,909;5,610,300;5,627,053;5,639,873;5,646,265;5,658,873;5,670,633;5,792,747;和5,700,920，在此完整收入每一项作为参考。
寡核苷酸还可包括核碱基（本领域内通常简称为“碱基”）修饰或替代。在用于本文时，“未修饰的”或“天然的”核碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。经过修饰的核碱基包括其它合成的和天然的核碱基，诸如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)，5-羟甲基胞嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烃基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烃基衍生物，2-硫尿嘧啶，2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶，5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基(-C≡C-CH3或-CH2-C≡CH)尿嘧啶和胞嘧啶及嘧啶碱基的其它炔基衍生物，6-偶氮(azo)尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶（假尿嘧啶），4-硫尿嘧啶，8-卤代、8-氨基、8-巯基(thiol)、8-硫代烃基(thioalkyl)、8-羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤代特别是5-溴、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤，2-F-腺嘌呤，2-氨基-腺嘌呤，8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤，7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤和3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。进一步修饰的核碱基包括三环嘧啶，诸如吩嗪胞苷(1H-嘧啶[5,4-b][l,4]苯丙嗪-2(3H)-酮)，吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶[5,4-b][l,4]苯丙噻嗪-2(3H)-酮)，G-夹环(G-clamp)诸如取代的吩嗪胞苷（例如9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶[5,4-b][l,4]苯丙嗪-2(3H)-酮)，咔唑胞苷(2H-嘧啶[4,5-b]吲哚-2-酮)，吡啶并吲哚胞苷(H-吡啶[3',2':4,5]吡咯[2,3-d]嘧啶-2-酮)。经修饰的核碱基还可包括那些其中嘌呤或嘧啶碱基用其它杂环，例如7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、2-氨基吡啶和2-吡啶酮取代的核碱基。更多核碱基包括美国专利3,687,808中公开的那些；The Concise Encyclopedia Of Polymer Science AndEngineering,pages 858-859,Kroschwitz,J.L,ed.John Wiley & Sons,1990中公开的那些；和Englisch等,Angewandte Chemie,International Edition,1991,30,613中公开的那些。这些核碱基中的某些特别可用于提高本发明寡聚化合物的结合亲和力。这些包括5-取代的嘧啶，6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤，5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代已显示出将核酸双链体的稳定性提高0.6-1.2°C(Sanghvi等,Antisense Research and Applications,CRC Press,Boca Raton,1993,pp.276-278)而且是优选的碱基取代，甚至在与2'-O-甲氧基乙基糖修饰结合时更加优选。教导经修饰核碱基的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利3,687,808，以及美国专利4,845,205;5,130,302;5,134,066;5,175,273;5,367,066;5,432,272;5,457,187;5,459,255;5,484,908;5,502,177;5,525,711;5,552,540;5,587,469;5,594,121,5,596,091;5,614,617;5,645,985;5,830,653;5,763,588;6,005,096;5,681,941;和5,750,692，在此收入每一项作为参考。
反义寡核苷酸的另一种修饰牵涉将提高寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取的一种或多种模块或偶联物(conjugate)化学连接至寡核苷酸。本发明的化合物可包含与功能基团诸如伯羟基或仲羟基共价连接的偶联基团(conjugate group)。本发明的偶联基团包括嵌入剂、报道分子、多胺、聚酰胺、聚乙二醇、聚醚、提高寡聚体药效学性质的基团、和提高寡聚体药动学性质的基团。典型的偶联基团包括胆固醇、脂质、阳离子脂质、磷脂、阳离子磷脂、生物素、吩嗪、叶酸(folate)、菲啶、蒽醌、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素、和染料。在本发明的内容中，提高药效学性质的基团包括提高寡聚体摄取、提高寡聚体对降解的抗性、和/或增强与RNA的序列特异性杂交的基团。在本发明的内容中，提高药动学性质的基团包括提高寡聚体摄取、分布、代谢或排泄的基团。偶联物模块包括但不限于脂质模块，诸如胆固醇模块(Letsinger等,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:6553-6556)，胆酸(Manoharan等,1994,Bioorg.Med.Chem.Let.4:1053-1060)，硫醚例如己基-S-三苯甲基硫醇(tritylthiol)(Manoharan等,1992,Ann.N.Y.Acad.Sci.660:306-309;Manoharan等,1993,Bioorg.Med.Chem.Let.3:2765-2770)，硫代胆固醇(Oberhauser等,1992,Nucl.AcidsRes.20:533-538)，脂肪族链例如十二烷二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras等,1991,EMBO J.10:1111-1118;Kabanov等,1990,FEBS Lett.259:327-330;Svinarchuk等,1993,Biochimie 75:49-54)，磷脂例如二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基-铵1,2-二-O-十六烷基-外消旋-甘油-3-H-膦酸酯(Manoharan等,1995,Tetrahedron Lett.36:3651-3654;Shea等,1990,Nucl.Acids Res.18:3777-3783)，多胺或聚乙二醇链(Manoharan等,1995,Nucleosides & Nucleotides 14:969-973)，或醋酸金刚烷(Manoharan等,1995,Tetrahedron Lett.36:3651-3654)，棕榈基模块(Mishra等,1995,Biochim.Biophys.Acta1264:229-237)，或十八烷胺或己氨基-羰基-氧胆固醇模块。本发明的寡核苷酸还可与活性药物物质偶联，例如阿司匹林(aspirin)、华法林(warfarin)、苯基丁氮酮(phenylbutazone)、布洛芬(ibuprofen)、舒洛芬(suprofen)、芬布芬(fenbufen)、酮洛芬(ketoprofen)、(S)-(+)-普拉洛芬(pranoprofen)、卡洛芬(carprofen)、丹磺酰肌氨酸(dansylsarcosine)、2,3,5-三碘苯甲酸、氟芬那酸(flufenamic acid)、亚叶酸(folinicacid)、苯并噻二嗪(benzothiadiazide)、氯噻嗪(chlorothiazide)、二氮草杂(diazepine)、吲哚美辛(indomethacin)、巴比妥酸盐(barbiturate)、头孢菌素(cephalosporin)、磺胺药(sulfa drug)、抗糖尿病药(antidiabetic)、抗菌药(antibacterial)或抗生素。寡核苷酸-药物偶联物及其制备参见美国系列申请09/334,130(1999年6月15日提交)和美国专利4,828,979;4,948,882;5,218,105;5,525,465;5,541,313;5,545,730;5,552,538;5,578,717,5,580,731;5,580,731;5,591,584;5,109,124;5,118,802;5,138,045;5,414,077;5,486,603;5,512,439;5,578,718;5,608,046;4,587,044;4,605,735;4,667,025;4,762,779;4,789,737;4,824,941;4,835,263;4,876,335;4,904,582;4,958,013;5,082,830;5,112,963;5,214,136;5,082,830;5,112,963;5,214,136;5,245,022;5,254,469;5,258,506;5,262,536;5,272,250;5,292,873;5,317,098;5,371,241,5,391,723;5,416,203,5,451,463;5,510,475;5,512,667;5,514,785;5,565,552;5,567,810;5,574,142;5,585,481;5,587,371;5,595,726;5,597,696;5,599,923;5,599,928;和5,688,941，在此收入每一项作为参考。
不必对给定化合物中的所有位置作均一的修饰，事实上可以在单一化合物中甚至在寡核苷酸内的单一核苷处掺入超过一种上述修饰。
本发明还包括作为嵌合化合物的反义化合物。在本发明的内容中，“嵌合的”反义化合物或“嵌合物”指包含两个或多个在化学上不同的区的反义化合物，特别是寡核苷酸，每个区由至少一个单体单元构成，在寡核苷酸化合物的情况中即为核苷酸。这些寡核苷酸通常包含至少一个区，其中寡核苷酸经过修饰而赋予该寡核苷酸以提高的对核酸酶降解的抗性、提高的细胞摄取、和/或提高的对靶核酸的结合亲和力。寡核苷酸的额外区可充当能够切割RNA:DNA或RNA:RNA杂合物的酶的底物。举例而言，RNA酶H是切割RNA:DNA双链体的RNA链的细胞内切核酸酶。因此，RNA酶H的活化导致对RNA靶物的切割，由此大大提高寡核苷酸对基因表达的抑制效率。因此，在使用嵌合寡核苷酸时，与杂交于相同靶区的硫代磷酸酯脱氧寡核苷酸相比，用较短的寡核苷酸通常获得相当的结果。本发明的嵌合反义化合物可形成为如上所述的两种或多种寡核苷酸、经修饰的寡核苷酸、寡核苷和/或寡核苷酸模拟物的复合结构。优选的嵌合反义寡核苷酸在3'-末端掺入至少一个2'修饰的糖（优选2'-O-(CH2)2-O-CH3）以赋予核酸酶抗性，及具有至少4个相连2'-H糖的区域以赋予RNA酶H活性。此类化合物在本领域也称为杂合物(hybrid)或接合物(gapmer)。优选的接合物(gapmer)在由具有至少4个相连2'-H糖的至少一个区分隔的3'-末端和5'末端具有2'修饰的糖（优选2'-O-(CH2)2-O-CH3）的区，且优选掺入硫代磷酸酯骨架键。教导此类杂合物结构的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利5,013,830;5,149,797;5,220,007;5,256,775;5,366,878;5,403,711;5,491,133;5,565,350;5,623,065;5,652,355;5,652,356;和5,700,922，在此完整收入每一项作为参考。
依照本发明使用的反义化合物可方便且常规的通过众所周知的固相合成技术来制备。有多家销售商销售用于此类合成的设备，包括例如Applied Biosystems(FosterCity，Calif.)。另外/或者，可采用本领域已知的用于此类合成的任何其它手段。众所周知使用类似技术来制备寡核苷酸，诸如硫代磷酸酯和烃基化衍生物。本发明的化合物还可与其它分子、分子结构或化合物的混合物混合、胶囊化、偶联或以其它方式关联成例如脂质体，受体靶向分子，口服的、直肠的、局部的或其它剂型以帮助摄取、分布和/或吸收。教导此类摄取、分布和/或吸收辅助剂型的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利5,108,921;5,354,844;5,416,016;5,459,127;5,521,291;5,543,158;5,547,932;5,583,020;5,591,721;4,426,330;4,534,899;5,013,556;5,108,921;5,213,804;5,227,170;5,264,221;5,356,633;5,395,619;5,416,016;5,417,978;5,462,854;5,469,854;5,512,295;5,527,528;5,534,259;5,543,152;5,556,948;5,580,575；和5,595,756，在此收入每一项作为参考。
有义或反义寡核苷酸的其它例子包括那些与有机模块，诸如WO90/10048中描述的那些，及提高寡核苷酸对靶核酸序列的亲和力的其它模块，诸如聚-(L-赖氨酸)共价连接的寡核苷酸。而且，嵌入剂，诸如玫瑰树碱(ellipticine)和烷化剂或金属络合物可附着于有义或反义寡核苷酸以调整反义或有义寡核苷酸对靶核苷酸序列的结合特异性。
可通过任何基因转移方法将反义或有义寡核苷酸导入包含靶核酸序列的细胞，包括例如CaPO4介导的DNA转染、电穿孔、或通过使用基因转移载体诸如埃巴二氏病毒(Epstein-Barr virus)。在一种优选的流程中，将反义或有义寡核苷酸插入合适的逆转录病毒载体。使包含靶核酸序列的细胞在体内或回体接触重组逆转录病毒载体。合适的逆转录病毒载体包括但不限于那些衍生自鼠逆转录病毒M-MuLV的那些，N2（衍生自M-MuLV的逆转录病毒），或命名为DCT5A、DCT5B和DCT5C的双拷贝载体(见WO 90/13641)。
还可通过与配体结合分子形成偶联物将有义或反义寡核苷酸导入包含靶核苷酸序列的细胞，如WO 91/04753中所述。合适的配体结合分子包括但不限于细胞表面受体、生长因子、其它细胞因子、或结合细胞表面受体的其它配体。优选的是，与配体结合分子的偶联基本不干扰所述配体结合分子结合其相应分子或受体的能力或者阻断有义或反义寡核苷酸或其偶联物型式进入细胞。
或者，可通过形成寡核苷酸-脂质复合物将有义或反义寡核苷酸导入包含靶核酸序列的细胞，如WO 90/10448中所述。有义或反义寡核苷酸-脂质复合物优选在细胞内由内源脂肪酶解离。
反义或有义RNA或DNA分子的长度通常是至少约5个核苷酸，或者长度为至少约6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,95,100,105,110,115,120,125,130,135,140,145,150,155,160,165,170,175,180,185,190,195,200,210,220,230,240,250,260,270,280,290,300,310,320,330,340,350,360,370,380,390,400,410,420,430,440,450,460,470,480,490,500,510,520,530,540,550,560,570,580,590,600,610,620,630,640,650,660,670,680,690,700,710,720,730,740,750,760,770,780,790,800,810,820,830,840,850,860,870,880,890,900,910,920,930,940,950,960,970,980,990,或1000个核苷酸，其中在此内容中术语“约”指所述核苷酸序列长度加或减该长度的10%。
还可将探针用于PCR技术以产生用于鉴定密切相关的多肽编码序列的序列池。
编码多肽的核苷酸序列还可用于构建杂交探针，用于给编码该多肽的基因作图和用于给患遗传性紊乱的个体作遗传分析。可使用已知技术将本文提供的核苷酸序列定位于染色体和染色体特定区域，诸如原位杂交、针对已知染色体标志的连锁分析、和筛选文库的杂交。
可以在测定法中使用多肽以鉴定参与与多肽发生的结合相互作用的其它蛋白质或分子。通过此类方法，可鉴定受体/配体结合相互作用的抑制物。参与此类结合相互作用的蛋白质还可用于筛选结合相互作用的肽或小分子抑制物。可设计筛选测定法以发现模拟天然多肽或多肽受体的生物学活性的领先化合物。此类筛选测定法将包括适应高通量筛选化学文库的测定法，使它们特别适用于鉴定小分子药物候选物。所设想的小分子包括合成的有机或无机化合物。可以多种形式进行测定法，包括本领域已经很好表征的蛋白质-蛋白质结合测定法、生物化学筛选测定法、免疫测定法和基于细胞的测定法。
编码多肽的核酸或其修饰形式还可用于生成转基因动物或“敲除”动物，它们继而可用于开发和筛选治疗上有用的试剂。转基因动物（例如小鼠或大鼠）指具有包含转基因的细胞的动物，其中将转基因导入动物或产前的动物前体(ancestor)，例如胚胎阶段。转基因指整合到发育成转基因动物的细胞的基因组中的DNA。在一个实施方案中，可依照已建立的技术用编码多肽的cDNA克隆编码多肽的基因组DNA，并将该基因组序列用于生成转基因动物，所述转基因动物包含表达编码多肽的DNA的细胞。用于生成转基因动物，特别是诸如小鼠或大鼠等动物的方法在本领域已经是常规的，参见例如美国专利4,736,866和4,870,009。通常，用组织特异性增强子使多肽转基因的掺入靶向特定细胞。包含在胚胎阶段导入动物种系的编码多肽的转基因拷贝的转基因动物可用于检验编码多肽的DNA表达提高的效果。此类动物可作为测试动物用于测试认为针对例如与其过表达有关的病理状况赋予保护的试剂。依照本发明的这个方面，用所述制剂治疗动物，与携带转基因的未处理动物相比病理状况的发病率下降将表明对该病理状况的潜在治疗性干预。
或者，多肽的非人同源物可用于构建基因“敲除”动物，它由于编码多肽的内源基因和导入该动物胚胎干细胞的改变的编码多肽的基因组DNA之间同源重组而具有缺陷的或改变的编码多肽的基因。例如，编码多肽的cDNA可依照已建立的技术用于克隆编码多肽的基因组DNA。可以将编码多肽的基因组DNA的一部分删除或用另一基因替代，所述另一基因诸如可用于监测整合的、编码选择标志的基因。通常，载体中包含数千碱基未改变的侧翼DNA（5'和3'末端都有）(关于同源重组载体的描述参见例如Thomas和Capecchi,1987,Cell51:503)。将载体导入胚胎干细胞系（例如通过电穿孔），并选择其中所导入DNA与内源DNA发生同源重组的细胞(参见例如Li等,1992,Cell 69:915)。然后将所选细胞注射到动物（例如小鼠或大鼠）的胚泡中以形成聚集嵌合体(参见例如Bradley,in Teratocarcinomas andEmbryonic Stem Cells:A Practical Approach,E.J.Robertson,ed.IRL,Oxford,1987,pp.113-152)。然后可将嵌合胚植入合适的假孕雌性代孕动物，并使胚胎足月产生“敲除”动物。在其生殖细胞中包含同源重组DNA的后代可通过标准技术鉴定，并用于繁殖其中动物的所有细胞都包含同源重组DNA的动物。敲除动物可以根据例如由于缺乏多肽而具有抵御某些病理状况的能力和形成了病理状况而得到鉴定。
编码多肽的核酸还可用于基因疗法。在基因疗法应用中，将基因导入细胞以实现治疗上有效的基因产物的体内合成，例如用于替代缺陷基因。“基因疗法”包括常规基因疗法和施用基因治疗剂两种，前者通过一次处理获得持续的效果，后者涉及一次或反复施用治疗上有效的DNA或mRNA。反义RNA和DNA可作为治疗剂用于在体内阻断某些基因的表达。已经显示可以将短反义寡核苷酸输入它们在其中起抑制剂作用的细胞，尽管由于细胞膜对它们的摄取有限，因而它们的胞内浓度低(Zamecnik等,1986,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:4143-4146)。可以修饰寡核苷酸以提高它们的摄取，例如通过用不带电荷的基团取代它们带负电荷的磷酸二酯基团。
有多种技术可用于将核酸导入活细胞。这些技术根据是将核酸转移到体外的培养细胞中，还是体内的预期宿主的细胞中而有所变化。适于在体外将核酸转移到哺乳动物细胞中的技术包括使用脂质体、电穿孔、显微注射、细胞融合、DEAE-右旋糖苷、磷酸钙沉淀法等。目前优选的体内基因转移技术包括使用病毒（通常是逆转录病毒）载体的转染和病毒外壳蛋白-脂质体介导的转染(Dzau等,1993,Trends in Biotechnology 11:205-210)。在有些情况中，期望与靶向靶细胞的试剂一起提供核酸来源，所述试剂诸如对细胞表面膜蛋白或靶细胞特异的抗体、靶细胞上受体的配体等。在采用脂质体时，结合与胞吞有关的细胞表面膜蛋白的蛋白质可用于靶向和/或促进摄取，例如对特定细胞类型有向性的衣壳蛋白或其片段、在循环中经历内化的蛋白质的抗体、靶向胞内定位并增强胞内半衰期的蛋白质。受体介导的胞吞的技术参见例如Wu等,1987,J.Biol.Chem.262:4429-4432;和Wagner等,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:3410-3414。关于基因标记和基因疗法方案的综述见Anderson等,1992,Science 256:808-813。
本文所述编码多肽的核酸分子或其片段可用于染色体鉴定。在这点上，鉴定新染色体标志的需求在增加，因为根据实际的序列数据，现在只有相对较少的染色体标记试剂可用。本发明的每种核酸分子都可用作染色体标志。
本发明的多肽和核酸分子可在诊断上用于组织分型，其中多肽可能在一种组织中与另一种组织相比，优选在患病组织中与相同组织类型的正常组织相比差异表达。核酸分子可用于生成探针，用于PCR、Northern分析、Southern分析、和Western分析。
本发明涵盖筛选化合物以鉴定那些阻止多肽作用（拮抗剂）的化合物的方法。用于拮抗剂药物候选物的筛选测定法设计成鉴定与本文鉴定的基因所编码的多肽结合或复合，或者以其它方式干扰所编码多肽与其它细胞蛋白质相互作用的化合物，包括例如抑制细胞表达多肽。此类筛选测定法包括适应高通量筛选化学文库的测定法，使得它们特别适用于鉴定小分子药物候选物。
可以多种形式进行测定法，包括本领域已经完善的蛋白质-蛋白质结合测定法、生物化学筛选测定法、免疫测定法和基于细胞的测定法。
用于拮抗剂的所有测定法的共同之处在于它们需要使药物候选物接触多肽或多肽复合物，其条件和时间足以使这些组分相互作用。
在结合测定法中，相互作用指结合，所形成的复合物可在反应混合物中分离或检测。在一个具体的实施方案中，将多肽或药物候选物通过共价或非共价附着固定在固相上，例如微量滴定板上。非共价附着通常通过用多肽溶液包被固相表面并干燥来实现。或者，对待固定的多肽特异的固定化抗体例如单克隆抗体可用于将它锚定到固相表面上。测定法如下进行，将可以用可检测标记物标记的非固定化组分加到固定化组分例如包含锚定组分的包被表面上。在反应完成时，例如通过清洗除去未反应的组分，并检测锚定到固相表面上的复合物。若最初的非固定化组分携带可检测标记物，检测出固定到表面上的标记物表明发生了复合作用。若最初的非固定化组分不携带标记物，可例如通过使用特异性结合已固定复合物的标记抗体来检测复合作用。
如果候选化合物与多肽相互作用但不结合，那么它与该多肽的相互作用可通过用于检测蛋白质-蛋白质相互作用的公知方法来测定。此类测定法包括传统方法，诸如例如交联、免疫共沉淀、和通过梯度或层析柱的共纯化。另外，可以如Chevray和Nathans,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5789-5793所公开的，使用Fields及其同事(Fields和Song,1989,Nature(London)340:245-246;Chien等,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:9578-9582)描述的基于酵母的遗传系统来监测蛋白质-蛋白质相互作用。许多转录激活物，诸如酵母GAL4，由两个空间上离散的模块结构域组成，一个起DNA结合结构域的作用，另一个起转录激活结构域的功能。上述出版物中描述的酵母表达系统（通称为“双杂交系统”）利用了此特性，采用两种杂合蛋白质，在一个中将靶蛋白质与GAL4的DNA结合结构域融合，而在另一个中将候选激活蛋白质与激活结构域融合。GAL1-lacZ报道基因在GAL4激活的启动子控制下的表达依赖于GAL4活性经由蛋白质-蛋白质相互作用的重建。用β-半乳糖苷酶的显色底物检测包含相互作用多肽的菌落。使用双杂交技术鉴定两种特定蛋白质之间的蛋白质-蛋白质相互作用的完整试剂盒(MATCHMAKERTM)可从Clontech购买。此系统还可延伸到对参与特定蛋白质相互作用的蛋白质结构域的作图以及指出对这些相互作用至关重要的氨基酸残基。
干扰本文鉴定的基因所编码的多肽与其它胞内或胞外组分相互作用的化合物可如下测试：通常在足以使两种产物相互作用和结合的条件和时间条件下制备包含基因产物及胞内或胞外组分的反应混合物。为了测试候选化合物抑制结合的能力，在缺乏和存在测试化合物时进行反应。另外，可以向第三份反应混合物中加入安慰剂(placebo)，作为阳性对照。如上所述监测混合物中存在的多肽和胞内或胞外组分之间的结合（复合物形成）。对照反应物中形成复合物但含有测试化合物的反应混合物中没有形成复合物表明，测试化合物干扰多肽与其反应配偶体的相互作用。
为了测定拮抗剂，可将多肽与要筛选特定活性的化合物一起加到细胞中，在存在多肽时该化合物抑制目的活性的能力表明，该化合物是多肽的拮抗剂。或者，可如下检测拮抗剂，将多肽和潜在的拮抗剂与膜结合的多肽受体或所编码的受体在适于竞争性抑制测定法的条件下组合。多肽可进行标记，诸如通过放射性标记，使得与受体结合的多肽分子的数目可用于测定潜在拮抗剂的效力。编码受体的基因可通过本领域技术人员知道的多种方法来鉴定，例如配体淘选和FACS分选。Coligan等,1991,Current Protocols in Immun.1(2):Chapter 5。优选的是，采用表达克隆，其中从对多肽有响应的细胞制备多腺苷酸化RNA，将从此RNA构建的cDNA文库分成几个集合，并用于转染COS细胞或对多肽没有响应的其它细胞。使在载玻片上培养的转染细胞暴露于经过标记的多肽。可通过多种手段来标记多肽，包括碘化或包含位点特异性蛋白质激酶的识别位点。固定和温育后，将载玻片进行放射自显影分析。鉴定阳性集合，制备子集，并用相互作用的子集进行再次转染和再次筛选过程，最后产生编码推定受体的单个克隆。
潜在拮抗剂的更具体的例子包括抗体，包括但不限于多克隆和单克隆抗体及抗体片段，单链抗体，抗独特型抗体，和嵌合的或人源化型式的此类抗体或片段，以及人抗体和抗体片段。或者，潜在的拮抗剂可以是密切相关的蛋白质，例如识别受体但不起作用，由此竞争性抑制多肽的作用的突变形式的多肽。
另一种潜在的拮抗剂是使用反义技术制备的反义RNA或DNA构建物，其中例如反义RNA或DNA分子通过与靶mRNA杂交并防止蛋白质翻译来起直接阻断mRNA翻译的作用。反义技术可用于通过三股螺旋形成或反义DNA或RNA来控制基因表达，二者都基于多核苷酸与DNA或RNA的结合。例如，可将编码本文成熟多肽的多核苷酸序列的5'编码部分用于设计长度为约10-40个碱基对的反义RNA寡核苷酸。将DNA寡核苷酸设计成与基因中参与转录的区互补(三股螺旋-参见Lee et al.,1979,Nucl.Acids Res.6:3073;Cooney et al.,1988,Science 241:456;Dervan et al.,1991,Science 251:1360)，由此防止转录和产生多肽。反义RNA寡核苷酸与mRNA在体内杂交并阻断mRNA分子翻译成为多肽(反义-Okano,1991,Neurochem.56:560；Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of GeneExpression,CRC Press:Boca Raton,FL,1988)。上述寡核苷酸还可投递至细胞，使得反义RNA或DNA可在体内表达以抑制多肽的生成。在使用反义DNA时，优选衍生自靶基因核苷酸序列的翻译起始位点（例如约-10到+10位置之间）的寡脱氧核糖核苷酸。
潜在的拮抗剂包括结合多肽的活性位点、受体结合位点、或生长因子或其它相关结合位点，由此阻断多肽的正常生物学活性的小分子。小分子的例子包括但不限于小肽或肽样分子，优选可溶性肽，和合成的非肽基有机或无机化合物。
核酶是能够催化对RNA的特异性切割的酶性RNA分子。核酶通过与互补靶RNA发生序列特异性杂交，随后进行内切核酸水解(endonucleolytic)切割来起作用。可通过已知技术来鉴定潜在RNA靶物内的特定核酶切割位点。更多细节参见例如Rossi,CurrentBiology,4:469-471(1994)和PCT公开号WO97/33551(1997年9月18日公开)。
用于抑制转录的三股螺旋结构中的核酸分子应当是单链的且由脱氧核苷酸组成。设计这些寡核苷酸的碱基组成，使得它通过Hoogsteen碱基配对原则促进三股螺旋形成，这通常需要在双链体的一条链上有大段嘌呤或嘧啶。更多细节参见例如PCT公开号WO 97/33551，见上文。
这些小分子可通过上文讨论的一种或多种筛选测定法和/或通过本领域技术人员公知的任何其它筛选技术来鉴定。
分离的编码多肽的核酸可用于使用本领域公知的技术且且如本文所述来重组生成多肽。继而，所生成的多肽可用于使用本领域公知的技术且如本文所述来生成抗体。
本文鉴定的特异性结合多肽的抗体以及通过上文公开的筛选测定法鉴定的其它分子可以以药用组合物的形式施用，用于治疗多种紊乱，包括癌症。
如果多肽在胞内，而且使用完整抗体作为抑制剂，那么优选使抗体内在化。然而，还可以用脂转染或脂质体将抗体或抗体片段投递到细胞中。在使用抗体片段时，优选特异性结合靶蛋白质的结合结构域的最小抑制性片段。例如，根据抗体的可变区序列，可以设计保留与靶蛋白质序列结合能力的肽分子。此类肽可以化学合成和/或通过重组DNA技术生成。参见例如Marasco et al.,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:7889-7893。
本文中的配制剂还可含有所治疗具体适应症所必需的超过一种活性化合物，优选那些活性互补且彼此没有不利影响的。或者/另外，组合物可包含增强其功能的药剂，诸如例如细胞毒剂、细胞因子、化疗剂、或生长抑制剂。合适的是，此类分子以对于预定目的有效的量组合存在。
提供下列实施例仅仅为了例示目的，而非意图以任何方式限制本发明的范围。
实施例
材料和方法
重组蛋白的克隆、表达和纯化：如(Moran et al.,2006)所述表达并纯化人重组hepsin的胞外域。如2009年10月22日提交的共同未授权、共同拥有的美国临时专利申请No.61/253,953所述表达并纯化抗hepsin抗体Fab25。如(Wahl et al.,1997)所述在中国仓鼠卵巢细胞中表达包含C672A突变以改进表达和产量的重组人MSP。如(Shia et al.,2005)所述表达并纯化KD1。
使用SDS-PAGE对体外hepsin活化MSP原的分析：将MSP原(25μg/ml)与不同浓度的hepsin(1.25nM,2.5nM,5nM和10nM)一起在含有50mMTris-HCl pH 8.0,150mM NaCl,0.05%Triton-X100和2mM CaCl2的缓冲液中于37°C温育。在不同时间点将反应混合物的等分试样与6X-SDS样品缓冲液混合，并将样品于95°C煮沸5分钟，随后使用4-20%梯度凝胶通过SDS-PAGE分开。用SimplyBlue安全染料(Invitrogen,Carlsbad,CA)染色后显现蛋白质。用经过突变，使得在Arg483-Val484处可能切割的MSP原(MSP原-R483E)实施相似实验以评估蛋白水解切割位点是否位于MSP原中远离预期Arg483-Val484键的不同位点。
LnCap细胞中细胞表面表达hepsin的MSP原活化作用：如(Moran et al.,2006)所述生成LnCaP-34细胞，以稳定过表达hepsin，导致与LnCaP-17细胞相比，hepsin细胞表面表达升高5倍且hepsin酶活性升高3倍，所述LnCaP-17细胞只以相对较低的、与亲本LnCaP细胞相当的水平表达内源hepsin。将在24孔板中培养的汇合的LnCap-34细胞用无血清RPMI-1640培养基清洗，并单独地或与不同抗hepsin抑制剂(1μM抗hepsin抗体Fab25/1μM KD1/1μMAc-KQLR-cmk(‘KLQR”披露为SEQ ID NO:10))一起在无血清RPMI-1640培养基中于37°C温育15分钟，之后添加125I标记的MSP原(25μg/ml)。于37°C温育3小时后，取出等分试样并通过SDS-PAGE(4-20%梯度凝胶)(Invitrogen,Carlsbad,CA)分析，接着对X射线胶片曝光。
通过表面等离振子共振和ELISA测定的hepsin活化的MSP原对Ron的结合：为了测定hepsin活化的MSP对人Ron的结合亲和力，在BIAcoreTM-3000仪器(GE Health Care,NJ)上实施了表面等离振子共振测量。在CM5生物传感器芯片上化学固定化（胺偶联）家兔抗人IgG，并捕捉Ron(Sema IPT1)-IgG融合蛋白以给出大约250个响应单位(RU)。为了动力学测量，于25°C以30μl/min流速注射HBS-P缓冲液中不同浓度的hepsin活化的MSP或商品化MSP(R&D systems)。使用简单一对一Langmuir结合模型(BIA-Evaluation)获得结合速率(kon)和解离速率(koff)，并计算(koff/kon)平衡解离常数(KD)。为了ELISA实验，将maxiSorp微量滴定板(Nunc,Roskilde,Denmark)于4°C用50mM碳酸钠缓冲液pH 9.6中的2μg/ml家兔抗人IgGFc特异性抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratory,West Grove,PA)包被过夜。用测定缓冲液(PBS pH 7.4,0.5% BSA和0.05% Tween-20,15PPM Proclin)封闭后，添加1μg/mlRon(Sema IPT1)-IgG融合蛋白，并将板在温和摇动下于室温温育1小时。用清洗缓冲液(PBS,0.05%聚山梨酯20)清洗后，带His标签的MSP蛋白添加1小时。使用抗His-HRP(Qiagen,Valencia,CA)检测结合的MSP，接着添加TMB/H2O2底物(KPL,Gaithersburg,MD)。用1M H3PO4终止反应，并在Molecular Devices(Sunnyvale,CA)SpectraMax Plus384微量板读数仪上测量A450。使用Kaleidagraph(Synergy Software,Reading,PA)通过四参数拟合测定给出半最大结合的有效浓度(EC50)。
腹膜巨噬细胞趋化性和巨噬细胞形态变化测定法：获得自C57BL/6小鼠鼠腹膜驻留巨噬细胞，即每只小鼠用15ml无血清RPMI-1640培养基清洗腹膜腔。清洗细胞，并在含有25mM Hepes的RPMI-1640培养基中以1x106个细胞·mL-1的浓度重悬浮。使用QCM趋化性测定试剂盒实施巨噬细胞趋化性测定法，孔径为5μm(Millipore)。将100微升腹膜巨噬细胞悬浮液(即105个细胞)添加至趋化性槽的上室。给底室装满含有纯化的MSP原的RPMI-1640培养基，该纯化的MSP原或是单独的或是用hepsin于37°C处理2小时的。使用重组活性形式的人MSP(R&D Systems)作为阳性对照。于37°C温育4小时后，用棉签擦取膜上表面上的细胞，并使用脱离缓冲液遵循制造商的推荐脱离迁移的细胞。将来自不同孔的等分试样与裂解缓冲液和CYPRO染料的混合物一起温育15分钟。通过使用微量板读数仪(Spectramax-M5,Molecular devices,Sunnyvale,CA)测量荧光对迁移定量，激发波长为480nm且发射波长为520nm。
为了评估MSP对形态的影响，将腹膜巨噬细胞(1x106个细胞·mL-1)在无血清RPMI-1640培养基中培养过夜。温育后，除去未贴壁细胞，并对培养液添加MSP原(1.0nM)，该MSP原或是单独的或是用hepsin预处理的。于37°C再温育1小时后，通过相差显微术观察巨噬细胞的形态变化。
成熟MSP对NO合成的抑制：将自收集的小鼠股骨获得的骨髓细胞制成单细胞悬浮液，然后旋转沉降。通过与红细胞裂解缓冲液一起于室温温育5分钟来裂解红血球。然后在巨噬细胞分化培养基(含有10% FBS,1X Pen/Strep和50ng/ml重组mCSF-1的含谷氨酰胺的DMEM)中悬浮细胞。然后将细胞涂布到无菌24孔非组织培养皿上。次日及随后每2天更换培养基。培养6天后，巨噬细胞成熟，在无血清DMEM中清洗这些成熟细胞，并进一步温育2小时。将如图中所示由重组MSP(10ng/ml),MSP原(10ng/ml),hepsin(1nM)和Fab25(500nM)组成的不同反应(总体积300μL)添加至相应的孔，并在组织培养温箱中于37°C培养24小时。使用Griess反应(Molecular Probes)依照制造商的推荐对NO生成定量。
用于检测磷酸化激酶的免疫印迹：使用一种过表达人Ron的人卵巢癌细胞系(A2780)来研究Ron和其它下游激酶的磷酸化。将细胞以2x105个细胞/孔的密度在12孔板中培养，并血清饥饿24小时。然后将细胞用单独的MSP原(10和50ng/ml)或在10nM Hepsin存在下刺激1小时。使用来自商业来源的成熟MSP和hepsin作为对照。制备样品，即将细胞用冷PBS清洗两次，接着添加200ul裂解缓冲液。然后在4-12%Tris-甘氨酸凝胶(Invitrogen,Carlsbad,CA)上通过SDS/PAGE分析样品。将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，随后用抗Ron抗体或抗磷酸-AKT抗体或抗磷酸-MAPK抗体或抗磷酸-S6抗体于4°C处理过夜。清洗后，将膜与缀合有IRDye800的山羊抗小鼠IgG(Rockland,Gilbertsville,PA)和AlexaFluor 680山羊抗家兔IgG(Invitrogen)一起温育1小时。用Odyssey红外成像系统(LI-COR Biosciences,Lincoln,NE)检测蛋白质。
结果
在体外重组hepsin对MSP原的活化
基于PS-SCL(位置扫描-合成组合文库)对hepsin的底物概况分析得出的一种共有序列揭示了对P4-P1的偏爱为(P/K)-(K/Q)-(T/L/N)-R(Herter et al.,2005)。根据先前鉴定的hepsin-底物列表(Kazama et al.,1995;Kirchhofer et al.,2005;Moran et al.,2006;Tripathi et al.,2008)(表1)可知，切割位点序列大体符合PS-SCL底物概况分析。特别地，HGF原(KQLR↓V)(SEQ ID NO:11)和Ln-332(SQLR↓L)(SEQ ID NO:12)的底物识别序列具有与MSP原切割序列(SKLR↓V)(SEQ ID NO:1)接近的相似性。然而，该推理未能解释为什么另一种酶原即tPA原是较差的hepsin底物，因为识别序列是来自HGF原和uPA原的识别序列的杂合物(表1)。
表1
↓指示切割位点
在与不同浓度的hepsin一起于37°C温育时，hepsin以剂量依赖性且时间依赖性方式活化MSP原。通过还原性条件下4-20%梯度Tris-甘氨酸SDS-PAGE上的凝胶泳动率变动来监测活化(图1)。通过N端测序分析切割产物以鉴定加工位点。hepsin对MSP原的蛋白水解切割发生于Arg483-Val484键，导致活性MSP(α/β)异二聚体形成。表达并纯化MSP原的一种切割位点突变体(MSP原-R483E)，并由hepsin进行蛋白水解加工。hepsin不切割这种突变体MSP原，尽管延长温育(24小时)再确认了活化的特异性。
细胞表面表达的hepsin对MSP原的活化
在LnCap-34细胞系(Moran et al.,2006)上监测细胞表面上天然表达的hepsin对MSP原的蛋白水解加工。表达hepsin的LnCap-34细胞能够加工125I-MSP原(图2)。MSP原加工的蛋白水解活性主要由于hepsin，因为所有三种hepsin抑制剂(Ac-KQLR-氯甲基酮(‘KQLR;披露为SEQ ID NO:10),KD1和Fab25)有效阻断蛋白水解切割。
hepsin活化的MSP的生物学活性
MSP结合Ron
我们使用表面等离振子共振(BIAcore)来测定MSP对人Ron的结合亲和力。对单链MSP原的蛋白水解切割对于结合受体Ron是至关重要的。直到1μM的浓度，MSP原和切割位点突变体(MSP原-R483E)无一具有任何可检测的对Ron的结合。相反，hepsin活化的MSP展示对Ron的高亲和力结合(KD=7nM)(图3a)。hepsin活化的MSP的亲和力与商品化MSP非常相似(KD=4.4nM)。另外，我们在ELISA实验中测量了MSP对Ron的结合。给出半最大结合的测定有效浓度(EC50)为0.519nM(图3b)。
MSP/RON途径中下游激酶的磷酸化
通过跟踪下游激酶（包括丝裂原活化的蛋白(MAP)激酶和核糖体蛋白S6激酶）的磷酸化来监测hepsin处理的MSP原对Ron信号传导途径的生物学效应。单独的hepsin和MSP原无一有效活化Ron信号传导途径，而hepsin处理的MSP原以剂量依赖性方式显示有力的MAP激活和S6激酶二者磷酸化。hepsin处理的MSP原中磷酸化的程度与来自商业来源的成熟MSP样品相当。
腹膜巨噬细胞形态变化和趋化性测定法
在原代巨噬细胞培养物中进一步评估hepsin活化的MSP的生物学活性。已知成熟MSP在巨噬细胞中引起特征性形态变化。在用hepsin活化的MSP刺激时，腹膜巨噬细胞经历细胞形状的独特变化，表现为突出和伸长(图5)。hepsin活化的MSP的影响与商品化MSP以及HGFA活化的MSP相当。
在趋化性测定法中，用hepsin处理MSP原导致腹膜巨噬细胞迁移的显著升高(p<0.001)(图6)，而且影响与来自商业来源的成熟MSP相当。抗hepsin抑制剂预处理展示巨噬细胞迁移的显著降低。
对氮氧化物(NO)合成的抑制
Wang等人先前显示了成熟MSP能够阻断响应多种刺激而发生的巨噬细胞氮氧化物合成mRNA升高及其相关的NO生成升高(Wang et al.,1994a)。原代小鼠骨髓巨噬细胞显示响应LPS的有力的氮氧化物生成。hepsin活化的MSP显著削弱骨髓衍生巨噬细胞中的NO生成(图7)，而且此影响在抗hepsin抗体存在下受到完全抑制，而单独的MSP原不抑制这种应答。
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尽管为了清楚理解的目的已经通过举例说明的方式较为详细的描述了上述发明，说明书和实施例不应解释为限制发明范围。

Claims (10)

1.一种鉴定抑制巨噬细胞刺激性蛋白原(MSP原)的hepsin活化的候选抑制剂物质的方法，所述方法包括：(a)使候选物质与包含hepsin和MSP原底物的第一样品接触，并(b)比较该样品中MSP原底物活化的量与包含与该第一样品相似量的hepsin和MSP原底物但未与所述候选物质接触的参照样品中MSP原底物活化的量，由此与该参照样品相比该第一样品中MSP原底物活化的量减少指示该候选物质能够抑制单链MSP(MSP原)的hepsin活化，其中所述hepsin是(i)包含SEQ ID NO：18或其功能片段的多肽或(ii)包含SEQ ID NO：19或其功能片段的多肽，其中所述SEQ ID NO：18的功能片段能以与SEQ ID NO：18类似的方式切割MSP原，所述SEQ ID NO：19的功能片段能以与SEQ ID NO：19类似的方式切割MSP原，且其中所述MSP原底物是包含SEQ ID NO：20或其功能片段的多肽，其中SEQ ID NO：20的功能片段包含Arg483-Val484肽连接且能被hepsin活化为能活化纤溶酶原的活化MSP。
2.权利要求1的方法，其中所述hepsin是包含SEQ ID NO：18或其功能片段的多肽。
3.权利要求2的方法，其中所述hepsin是包含SEQ ID NO：18的多肽。
4.权利要求3的方法，其中所述MSP原底物是包含SEQ ID NO：20的多肽。
5.权利要求2的方法，其中所述MSP原底物是包含SEQ ID NO：20的多肽。
6.权利要求1的方法，其中所述MSP原底物是包含SEQ ID NO：20的多肽。
7.权利要求1的方法，其中其中所述hepsin是包含SEQ ID NO：19或其功能片段的多肽。
8.权利要求7的方法，其中所述hepsin是包含SEQ ID NO：19的多肽。
9.权利要求8的方法，其中所述MSP原底物是包含SEQ ID NO：20的多肽。
10.权利要求7的方法，其中所述MSP原底物是包含SEQ ID NO：20的多肽。
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