ES2564207T3 - Métodos y composiciones para modular la activación con hepsina de la proteína estimuladora de macrófagos - Google Patents

Abstract

Método de identificación de una sustancia inhibidora candidata que inhibe la activación por hepsina de la pro-proteína estimuladora de macrófagos (pro-PEM), comprendiendo dicho método: (a) poner en contacto una sustancia candidata con una primera muestra que comprende hepsina y un sustrato pro-PEM, y (b) comparar la cantidad de activación de sustrato pro-PEM en la muestra con la cantidad de activación de sustrato pro-PEM en una muestra de referencia que comprende cantidades similares de hepsina y sustrato pro-PEM a las de la primera muestra pero que no ha sido puesta en contacto con dicha sustancia candidata, de manera que una reducción de la cantidad de activación de sustrato pro-PEM en la primera muestra en comparación con la muestra de referencia indica que la sustancia candidata es capaz de inhibir la activación por hepsina de la PEM de cadena sencilla (pro- PEM).

Description

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El término “tumor”, tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a todo crecimiento y proliferación celular neoplásica, sea maligna o benigna, y a todas las células y tejidos precancerosos y cancerosos. Las expresiones “cáncer”, “canceroso”, “trastorno proliferativo celular”, “trastorno proliferativo” y “tumor” no son mutuamente exclusivas tal como se hace referencia a las mismas en la presente memoria.

Los términos “cáncer” y “canceroso” se refieren o describen la condición fisiológica en mamíferos que se caracteriza típicamente por el crecimiento/proliferación celular no regulado y/o invasividad. Entre los ejemplos de cáncer se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Entre los ejemplos más particulares de dichos cánceres se incluyen el cáncer de células escamosas, el cáncer de pulmón de células pequeñas, el cáncer de pulmón de células no pequeñas, el adenocarcinoma pulmonar, el carcinoma escamoso de pulmón, el cáncer de peritoneo, el cáncer hepatocelular, el cáncer gastrointestinal, el cáncer pancreático, el glioblastoma, el cáncer cervical, el cáncer ovárico, el cáncer hepático, el cáncer de vejiga, el hepatoma, el cáncer de mama, el cáncer de colon, el cáncer colorrectal, el carcinoma endometrial o uterino, el carcinoma de glándulas salivares, el cáncer de riñón o renal, el cáncer de próstata, el cáncer vulvar, el cáncer de tiroides, el carcinoma hepático, y diversos tipos de cáncer de cabeza y cuello.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “tratamiento” se refiere a la intervención clínica en un intento de alterar el curso natural del individuo o célula bajo tratamiento, y puede llevarse a cabo para la profilaxis o durante el curso de la patología clínica. Entre los efectos deseables del tratamiento se incluyen la prevención de la aparición

o de la recurrencia de una enfermedad, el alivio de los síntomas, la reducción de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, la prevención de la metástasis, la reducción de la tasa de progresión de la enfermedad, la mejora o mitigación del estado de enfermedad, y la remisión o mejora del pronóstico. En algunas realizaciones, los métodos y/o las composiciones de la invención resultan útiles para retrasar el desarrollo de una enfermedad o trastorno.

Una “cantidad eficaz” se refiere a una cantidad que resulta eficaz a las dosis y durante los periodos de tiempo necesarios para conseguir el resultado terapéutico o profiláctico deseado.

Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de una molécula (por ejemplo un antagonista) de la invención puede variar según factores tales como el estado de enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo, y la capacidad de la molécula (por ejemplo el antagonista) de inducir una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz también es una cantidad en la que cualesquiera efectos tóxicos o perjudiciales de la molécula (por ejemplo un antagonista) se ven superados por los efectos terapéuticamente beneficiosos. Una “cantidad profilácticamente eficaz” se refiere a una cantidad eficaz, a las dosis y durante los periodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado profiláctico deseado. Típicamente, aunque no necesariamente, debido a que se utiliza una dosis profiláctica en sujetos antes o durante un estadio más temprano de la enfermedad, la cantidad profilácticamente eficaz será inferior a la cantidad terapéuticamente eficaz.

La expresión "agente citotóxico" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una sustancia que inhibe o impide el funcionamiento de las células y/o provoca la destrucción de las células. La expresión pretende incluir isótopos radioactivos (por ejemplo At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioactivos de Lu), agentes quimioterapéuticos (por ejemplo metotrexato, adriamicina, alcaloides vinca (vincristina, vinblastina, etopósido), doxorrubicina, melfalán, mitomicina C, clorambucilo, daunorubicina u otros agentes intercalantes), enzimas y fragmentos de los mismos, tales como enzimas nucleolíticos; antibióticos; toxinas, tales como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de las mismas, y los diversos agentes antitumorales o anticáncer dados a conocer posteriormente en la presente memoria. Se indican posteriormente en la presente memoria otros agentes citotóxicos. Un agente tumoricida causa la destrucción de las células tumorales.

Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico que resulta útil en el tratamiento del cáncer. Entre los ejemplos de agentes quimioterapéuticos se incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclofosfamida Cytoxan®, sulfonatos de alquilo tales como busulfán, improsulfán y piposulfán, aziridinas tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas, incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolmelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina y bulatacinona); delta-9-tetrahidrocanabinol (dronabinol, Marinol®), beta-lapacona, lapacol, colchicinas, ácido betulínico, una camptotecina (incluyendo el análogo sintético topotecán (Hycamtin®)); CPT-11 (irinotecán, Camptosar®), acetilcamptotecina, escopolectina y 9-aminocamptotecina), briostatina; calistatina; CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina y bizelesina); podofilotoxina, ácido podofilínico, tenipósido, criptoficinas (particularmente criptoficina-1 y criptoficina-8), dolastatina, duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos KW-2189 y CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictiina; espongistatina; mostazas nitrogenadas tales como clorambucilo, clornafacina, colofosfoamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, hidrocloruro de óxido de mecloretamina, melfalán, novembichina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza uracilo, nitrosoureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimnustina; antibióticos tales como los antibióticos enediina (por ejemplo caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gamma 11 y caliqueamicina omega 11 (ver, por ejemplo Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl. 33: 183-186, 1994); dinemicina, incluyendo dinemicina A; una esperamicina, así como cromóforo neocarzinostatina y cromóforos relacionados

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información en The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn e Israel, editores, capítulo 1, titulado "Regulación del ciclo celular, oncogenes y fármacos antineoplásicos", de Murakami et al.(WB Saunders: Philadelphia, 1985), especialmente la página 13. Los taxanos (paclitaxel y docetaxel) son fármacos anticáncer derivados ambos del tejo. El docetaxel (Taxotere®, Rhone-Poulenc Rorer), derivado del tejo europeo, es un análogo semisintético del paclitaxel (Taxol®, Bristol-Myers Squibb). El paclitaxel y el docetaxel inducen el ensamblaje de los microtúbulos a partir de dímeros de tubulina y estabilizan los microtúbulos mediante el bloqueo de la despolimerización, lo que resulta en la inhibición de la mitosis en las células.

La "doxorrubicina" es un antibiótico antraciclina. El nombre químico completo de la doxorrubicina es (8S-cis)-10-[(3amino-2,3,6-trideoxi-α-L-lixo-hexapiranosil)oxi]-7,8,9,10-tetrahidro-6,8,11-trihidroxi-8-(hidroxiacetil)-1-metoxi-5,12naftacenodiona.

Composiciones y métodos de la invención

A. Anticuerpos

En una realización, la presente invención proporciona anticuerpos antagonistas que pueden resultar útiles en la presente memoria como agentes terapéuticos y/o diagnósticos. Entre los anticuerpos ejemplares se incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, biespecíficos y heteroconjugados.

1. Anticuerpos policlonales

Los anticuerpos policlonales preferentemente se generan en animales mediante múltiples inyecciones subcutáneas (s.c.) o intraperitoneales (i.p.) del antígeno relevante y un adyuvante. Puede resultar útil conjugar el antígeno relevante (especialmente en el caso de que se utilicen péptidos sintéticos) con una proteína que sea inmunogénica en la especie que debe inmunizarse. Por ejemplo, el antígeno puede conjugarse con hemocianina de lapa americana (HLA), albúmina sérica, tiroglobulina bovina o inhibidor de la tripsina de la soja, utilizando un agente bifuncional o derivatizante, por ejemplo éster de maleimidobenzoil-sulfosuccinimida (conjugación mediante los residuos de cisteína), N-hidroxisuccinimida (mediante los residuos de lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico, SOCl2 o R1N=C=NR, en el que R y R1 son grupos alquilo diferentes.

Los animales se inmunizan contra el antígeno, conjugados inmunogénicos o derivados mediante combinación con, por ejemplo, 100 mg ó 5 mg de la proteína o conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund y la inyección de la solución intradérmicamente en múltiples sitios. Un mes después, los animales reciben un refuerzo de aproximadamente 1/5 a 1/10 de la cantidad original de polipéptido o conjugado en coadyuvante completo de Freund mediante inyección subcutánea en múltiples sitios. Siete a 14 días después, se extraen muestras de sangre de los animales y se somete a ensayo el suero para el título de anticuerpos. Los animales reciben un refuerzo hasta que el título alcanza un nivel estable. También pueden prepararse conjugados en cultivo celular recombinante en forma de proteínas de fusión. También pueden utilizarse convenientemente agentes agregantes tales como alúmina para intensificar la respuesta inmunológica.

2. Anticuerpos monoclonales

Pueden prepararse anticuerpos monoclonales utilizando el método del hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al., Nature 256:495, 1975, o mediante cualquier método de ADN recombinante (patente US nº 4.816.567).

En el método del hibridoma, se inmuniza un ratón u otro animal huésped apropiado (por ejemplo un hámster) tal como se ha indicado anteriormente para inducir los linfocitos que producen o que son capaces de producir los anticuerpos que se unen específicamente la proteína utilizada para la inmunización. Alternativamente, pueden inmunizarse los linfocitos in vitro. Tras la inmunización, se aíslan los linfocitos y después se fusionan con una línea celular de mieloma utilizando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar células de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, páginas 59 a 103, 1986).

Las células de hibridoma preparadas de esta manera se sembraron y cultivaron en un medio de cultivo adecuado que contenía preferentemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células de mieloma parental no fusionadas (también denominadas parejas de fusión). Por ejemplo, en el caso de que las células de mieloma parental no presenten el enzima hipoxantina guanina fosforibosil-transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo selectivo de los hibridomas típicamente incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), en el que las sustancias evitan el crecimiento de las células deficientes en HGPRT.

Las células de mieloma parejas de fusión preferentes son aquéllas que se fusionan eficientemente, dan soporte a una producción estable de nivel elevado de anticuerpos por parte de las células productoras de anticuerpos seleccionadas y/o son sensibles a un medio selectivo que selecciona contra las células parentales no fusionadas. Las líneas celulares de mieloma preferentes son las líneas de mieloma murino, tales como las derivadas de los tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11, disponibles del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, USA, y SP-2 y derivados, por ejemplo las células X63-Ag8-653, disponibles de la American Type Culture Collection,

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El documento nº WO 96/16673 describe un anticuerpo biespecífico anti-ErbB2/anti-FcγRIII y la patente US nº

5.837.234 da a conocer un anticuerpo biespecífico anti-ErbB2/anti-FcγRI. Se muestra un anticuerpo biespecífico anti-ErbB2/Fcα en el documento nº WO 98/02463. La patente US nº 5.821.337 enseña un anticuerpo biespecífico anti-ErbB2/anti-CD3.

Los métodos para preparar anticuerpos biespecíficos son conocidos de la técnica. La producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud completa se basa en la coexpresión de dos parejas de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, en la que las dos cadenas presentan especificidades diferentes (Millstein et al., Nature 305:537-539, 1983). Debido a la colección aleatoria de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas de anticuerpo diferentes, de las que únicamente una presenta la estructura biespecífica correcta. La publicación de la molécula correcta, que habitualmente se lleva a cabo mediante etapas de cromatografía de afinidad, es bastante complicada, y los rendimientos de producto son bajos. Se dan a conocer procedimientos similares en el documento nº WO 93/08829 y en Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659, 1991.

Según otro enfoque, se fusionan dominios variables de anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación de anticuerpo-antígeno) con secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. Preferentemente, la fusión es con un dominio constante de cadena pesada de Ig, que comprende por lo menos parte de las regiones de bisagra, CH2 y CH3. Resulta preferente que la primera región constante de cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para la unión de cadena ligera se encuentre presente en por lo menos una de las fusiones. Los ADN codificantes de las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados y se cotransfectan en un organismo huésped adecuado. Lo anterior proporciona una mayor flexibilidad en el ajuste de las proporciones mutuas de los tres fragmentos polipeptídicos en realizaciones en el caso de que proporciones desiguales de las tres cadenas polipeptídicas utilizadas en la construcción proporcionen el rendimiento óptimo del anticuerpo biespecífico deseado. Sin embargo, resulta posible insertar las secuencias codificantes de dos o de las tres cadenas polipeptídicas en un solo vector de expresión en el caso de que la expresión de por lo menos dos cadenas polipeptídicas en proporciones iguales resulte en rendimientos elevados o en el caso de que las proporciones no presenten ningún efecto significativo sobre el rendimiento de la combinación de cadenas deseada.

En una realización preferente de dicho enfoque, los anticuerpos biespecíficos están compuestos de una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo y una pareja de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se ha encontrado que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado respecto de combinaciones de cadenas de inmunoglobulina no deseadas, ya que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en únicamente una mitad de la molécula biespecífica proporciona un modo fácil de separación. Este enfoque se da a conocer en el documento nº WO 94/04690. Para más información sobre la generación de anticuerpos biespecíficos ver, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210, 1986.

Según otro enfoque descrito en la patente US nº 5.731.168, la interfaz entre una pareja de moléculas de anticuerpo puede manipularse para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan del cultivo de células recombinantes. La interfaz preferente comprende por lo menos una parte del dominio CH3. En este método, se sustituye una o más cadenas laterales pequeñas de aminoácidos de la interfaz de la primera molécula de anticuerpo por cadenas laterales de mayor tamaño (por ejemplo de tirosina o de triptófano). Se crean "cavidades" compensadoras de tamaño igual o similar a la cadena o cadenas laterales grandes en la interfaz de la segunda molécula de anticuerpo mediante la sustitución de cadenas laterales grandes de aminoácidos por otras más pequeñas (por ejemplo de alanina o de treonina). Lo anterior proporciona un mecanismo para incrementar el rendimiento de heterodímero sobre otros productos finales no deseados, tales como homodímeros.

Entre los anticuerpos biespecíficos se incluyen anticuerpos entrecruzados o "heteroconjugados". Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado puede acoplarse a avidina y el otro, a biotina. Dichos anticuerpos se ha propuesto, por ejemplo, que dirigen células del sistema inmunológico a células no deseadas (patente US nº 4.676.980) y para el tratamiento de la infección por VIH (documentos nº WO 91/00360 y nº WO 92/200373 y la patente nº EP 03089). Pueden prepararse anticuerpos heteroconjugados utilizando cualquier método de entrecruzamiento conveniente. Los agentes y técnicas de entrecruzamiento adecuados son bien conocidos de la técnica y se dan a conocer en la patente US nº 4.676.980, conjuntamente con varias técnicas de entrecruzamiento.

Las técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpo también han sido descritas en la literatura. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos utilizando el enlace químico. Brennan et al., Science 229:81, 1985, describe un procedimiento en el que se cortan proteolíticamente anticuerpos intactos a fin de generar fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos se reducen en presencia del agente acomplejante ditiol, arsenito sódico para estabilizar los ditioles vecinos y evitar la formación de disulfuros intermoleculares. Los fragmentos Fab' generados seguidamente se convierten en derivados tionitrobenzoato (TNB). A continuación, uno de los derivados Fab'-TNB se reconvierte en el Fab'-tiol mediante reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos pueden utilizarse como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.

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Los últimos avances han facilitado la recuperación directa de los fragmentos Fab'-SH de E. coli, que pueden acoplarse químicamente para formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175: 217-225, 1992, describe la producción de una molécula de anticuerpo biespecífico F(ab')2 totalmente humanizada. Cada fragmento Fab' se secretó separadamente de E. coli y se sometió a acoplamiento químico dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespecífico. El anticuerpo biespecífico formado de esta manera era capaz de unirse a células que sobreexpresaban el receptor de ErbB2 y células T humanas normales, así como de inducir la actividad lítica de los linfocitos citotóxicos humanos contra dianas de tumor mamario humano. También se han descrito diversas técnicas para preparar y aislar fragmentos de anticuerpo biespecífico directamente a partir de un cultivo de células recombinantes. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos utilizando cremalleras de leucinas. Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-1553, 1992. Los péptidos de cremallera de leucinas de las proteínas Fos y Jun se unen a las partes Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante fusión génica. Los homodímeros de anticuerpo se redujeron en la región bisagra formando monómeros y después se reoxidaron para formar los heterodímeros de anticuerpo. Este método también puede utilizarse para la producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología de "diacuerpos" descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, 1993, ha proporcionado un mecanismo alternativo para preparar fragmentos de anticuerpo biespecífico. Los fragmentos comprenden un VH conectado a un VL mediante un conector que es excesivamente corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Por consiguiente, se fuerza que los dominios VH y VL de un fragmento se emparejen con los dominios VL y VH complementarios de otro fragmento, formando de esta manera dos sitios de unión a antígeno. También se ha informado de otra estrategia para preparar fragmentos de anticuerpo biespecífico mediante la utilización de dímeros de Fv de cadena sencilla (sFv). Ver Gruber et al., J. Immunol. 152:5368, 1994.

Los anticuerpos con más de dos valencias se encuentran contemplados. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos triespecíficos. Tutt et al., J. Immunol. 147:60, 1991.

6.

Anticuerpos heteroconjugados

Los anticuerpos heteroconjugados también se encuentran comprendidos dentro del alcance de la presente invención. Los anticuerpos heteroconjugados están compuestos de dos anticuerpos unidos covalentemente. Dichos anticuerpos se ha propuesto, por ejemplo, que dirigen células del sistema inmunológico a células no deseadas (patente US nº 4.676.980) y para el tratamiento de la infección por VIH (documentos nº WO 91/00360 y nº WO 92/200373 y la patente nº EP 03089). Se encuentra contemplado que los anticuerpos pueden prepararse in vitro utilizando métodos conocidos en la química sintética de proteínas, incluyendo aquellos que implican agentes entrecruzantes. Por ejemplo, pueden construirse inmunotoxinas utilizando una reacción de intercambio de disulfuro o mediante la formación de un enlace tioéter. Entre los ejemplos de reactivos adecuados para este fin se incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato y los dados a conocer en, por ejemplo, la patente US nº 4.676.980.

7.

Anticuerpos multivalentes

Un anticuerpo multivalente puede internalizarse (y/o catabolizarse) más rápidamente que un anticuerpo bivalente por una célula que expresa un antígeno al que se unen los anticuerpos. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser anticuerpos multivalentes (que son de una clase diferente de IgM) con tres o más sitios de unión a antígeno (por ejemplo anticuerpos tetravalentes), que pueden producirse fácilmente mediante la expresión recombinante de un ácido nucleico codificante de las cadenas polipeptídicas del anticuerpo. El anticuerpo multivalente puede comprender un dominio de dimerización y tres o más sitios de unión a antígeno. El dominio de dimerización preferente comprende (o consiste de) una región Fc o una región bisagra. En este escenario, el anticuerpo comprende una región Fc y tres o más sitios de unión a antígeno en posición aminoterminal respecto a la región Fc. El anticuerpo multivalente preferente comprende (o consiste de) en la presente memoria entre tres y aproximadamente ocho, aunque preferentemente cuatro sitios de unión a antígeno. El anticuerpo multivalente comprende por lo menos una cadena polipeptídica (y preferentemente dos cadenas polipeptídicas) en las que la cadena o cadenas polipeptídicas comprenden dos o más dominios variables. Por ejemplo, la cadena o cadenas polipeptídicas puede comprender VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc, en la que VD1 es un primer dominio variable, VD2 es un segundo dominio variable, Fc es una cadena polipeptídica de una región Fc, X1 y X2 representa un aminoácido o polipéptido, y n es 0 o 1. Por ejemplo, la cadena o cadenas polipeptídicas puede comprender: VH-CH1-conector flexible-VH-CH1-cadena de región Fc, o VH-CH1-VH-CH1-cadena de región Fc. El anticuerpo multivalente en la presente memoria preferentemente comprende además por lo menos dos (y preferentemente cuatro) polipéptidos de dominio variable de cadena ligera. El anticuerpo multivalente en la presente memoria puede comprender, por ejemplo, entre aproximadamente dos y aproximadamente ocho polipéptidos de dominio variable de cadena ligera. Los polipéptidos de dominio variable de cadena ligera contemplados en la presente memoria comprenden un dominio variable de cadena ligera y, opcionalmente, comprenden además un dominio CL.

8.

Ingeniería de función efectora

Puede ser deseable modificar el anticuerpo de la invención con respecto a la función efectora, por ejemplo para incrementar la citotoxicidad mediada por células dependiente de antígenos (ADCC) y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) del anticuerpo. Lo anterior puede conseguirse mediante la introducción de una o más sustituciones de aminoácidos en una región Fc del anticuerpo. Alternativa o adicionalmente, pueden introducirse uno

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Los agentes quimioterapéuticos que resultan útiles en la generación de dichos inmunoconjugados han sido descritos anteriormente en la presente memoria. Entre las toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas que pueden utilizarse se incluyen la cadena A diftérica, los fragmentos activos no ligantes de la toxina diftérica, la cadena A de la exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), la cadena A de la ricina, la cadena A de la abrina, la cadena A de la modeccina, la alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, las proteínas diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, la curcina, la crotina, el inhibidor de Saponaria officinalis, la gelonina, la mitogelina, la restrictocina, la fenomicina, la enomicina y los tricotecenos. Se encuentra disponible una diversidad de radionucleidos para la producción de anticuerpos radioconjugados. Entre los ejemplos se incluyen 212Bi, 131I, 131In, 90Y y 186Re. Los conjugados del anticuerpo y agente citotóxico se preparan mediante la utilización de una diversidad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales, tales como propionato de N-succinimidil-3(2-piridilditiol) (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como HCl de adipimidato de dimetilo), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos bis-azido (tales como bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados bis-diazonio (tales como bis-(pdiazonio-benzoil)etilendiamina), diisocianatos (tales como 2,6-diisocianato de tolueno) y compuestos de flúor bisactivos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, puede prepararse una inmunotoxina de ricina tal como se describe en Vitetta et al., Science 238: 1098, 1987. El ácido 1-isotiocianatobencil-3metildietilentriaminapentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono 14 es un agente quelante ejemplar para la conjugación de nucleótidos radioactivos al anticuerpo. Ver el documento nº WO 94/11026.

Los conjugados de un anticuerpo y una o más toxinas de molécula pequeña, tales como caliqueamicina, maitansinoides, un tricoteceno y CC1065, y los derivados de dichas toxinas que presentan actividad de toxina también se encuentran contemplados en la presente memoria.

Maitansina y maitansinoides

En una realización, se conjuga un anticuerpo (de longitud completa o fragmentos) de la invención con una o más moléculas de maitansinoide.

Los maitansinoides son inhibidores mitóticos que actúan inhibiendo la polimerización de la tubulina. La maitansina fue aislada por primera vez del arbusto de África oriental Maytenus serrata (patente US nº 3.896.111). Posteriormente se descubrió que determinados microbios también producen maitansinoides, tales como maitansinol y ésteres de maitansinol C-3 (patente US nº 4.151.042). El maitansinol sintético y los derivados y análogos del mismo se dan a conocer en, por ejemplo, las patentes US nº nº 4.137.230, nº 4.248.870, nº 4.256.746, nº 4.260.608, nº 4.265.814, nº 4.29nº 4.757, nº 4.307.016, nº 4.308.268, nº 4.308.269, nº 4.309.428, nº 4.313.946, nº 4.315.929, nº 4.317.821, nº 4.322.348, nº 4.331.598, nº 4.361.650, nº 4.364.866, nº 4.424.219, nº 4.450.254, nº 4.362.663, y nº 4.371.533, las exposiciones de los cuales se incorporan expresamente en la presente memoria como referencia.

Conjugados de maitansinoide-anticuerpo

En un intento de mejorar su índice terapéutico, la maitansina y los maitansinoides se han conjugado con anticuerpos que se unen específicamente a los antígenos de las células tumorales. Los inmunoconjugados que contienen maitansinoides y su utilización terapéutica se dan a conocer en, por ejemplo, las patentes US nº 5.208.020, nº

5.416.064 y en la patente europea nº EP 0 425 235 B1, las exposiciones de las cuales se incorporan expresamente como referencia en la presente memoria. Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623, 1996, describen inmunoconjugados que comprenden un maitansinoide denominado DM1 unido al anticuerpo monoclonal C242 dirigido contra el cáncer colorrectal humano. Se encontró que el conjugado era altamente citotóxico hacia las células de cáncer de colon en cultivo y mostró actividad antitumoral en un ensayo de crecimiento tumoral in vivo. Chari et al., Cancer Research 52:127-131, 1992, describen inmunoconjugados en los que se conjugó un maitansinoide mediante un conector disulfuro con el anticuerpo murino A7 ligante de un antígeno sobre las líneas celulares humanas de cáncer de colon o de otro anticuerpo monoclonal murino, TA.1, que se une HER-2/oncogén neu. Se sometió a ensayo in vitro la citotoxicidad del conjugado de TA.1-maitansinoide en la línea celular de cáncer de mama humano SK-BR-3, que expresa 3x105 antígenos de superficie HER-2 en cada célula. El conjugado de fármaco alcanzó un grado de citotoxicidad similar al del fármaco maitansinoide libre, que pudo incrementarse mediante el incremento del número de moléculas de maitansinoide por cada molécula de anticuerpo. El conjugado de A7-maitansinoide mostró una baja citotoxicidad sistémica en el ratón.

Conjugados de anticuerpo-maitansinoide (inmunoconjugados) Se prepararon conjugados de anticuerpo-maitansinoide mediante la unión química de un anticuerpo a una molécula de maitansinoide sin reducir significativamente la actividad biológica del anticuerpo o de la molécula de maitansinoide. Una media de 3 a 4 moléculas de maitansinoide conjugadas en cada molécula de anticuerpo ha demostrado eficacia en incrementar la citotoxicidad de las células diana sin afectar negativamente a la función o solubilidad del anticuerpo, aunque incluso una molécula de toxina/anticuerpo se esperaría que incrementase la citotoxicidad en comparación con la utilización del anticuerpo desnudo. Los maitansinoides son bien conocidos de la técnica y pueden sintetizarse mediante técnicas conocidas o aislarse a partir de fuentes naturales. Se dan a conocer maitansinoides adecuados en, por ejemplo, la patente US nº 5.208.020 y en otras publicaciones de patente y no de patente a las que se ha hecho referencia anteriormente en la presente memoria. Los maitansinoides preferentes son

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(también conocido como obtención de imágenes de resonancia magnética, IRM), tales como yodo-123 nuevamente, yodo-131, indio-111, flúor-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro.

Los radiomarcajes u otros marcajes pueden incorporarse en el conjugado de maneras conocidas. Por ejemplo, el péptido puede biosintetizarse o puede sintetizarse mediante síntesis química de aminoácidos utilizando precursores de aminoácidos adecuados que implican, por ejemplo, flúor-19 en lugar de hidrógeno. Pueden unirse marcajes tales como tc99m o I123, Re186, Re188 y In111 mediante un residuo de cisteína en el péptido. Puede unirse itrio-90 mediante un residuo de lisina. El método IODOGEN (Fraker et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57, 1978) puede utilizarse para incorporar yodo-123. "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989) describe otros métodos en detalle.

Pueden prepararse conjugados del anticuerpo y agente citotóxico utilizando una diversidad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales, tales como propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) (PSPD), ciclohexán-1-carboxilato de succinimidil-4-(N-maleimidometilo), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como HCl de adipimidato de dimetilo), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos bis-azido (tales como bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados bis-diazonio (tales como bis-(p-diazonio-benzoil)etilendiamina), diisocianatos (tales como 2,6-diisocianato de tolueno) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, puede prepararse una inmunotoxina de ricina tal como se describe en Vitetta et al., Science 238:1098, 1987. El ácido 1isotiocianatobencil-3-metildietilentriaminapentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono 14 es un agente quelante ejemplar para la conjugación de nucleótidos radioactivos al anticuerpo. Ver el documento nº WO 94/11026. El conector puede ser un "conector cortable" que facilite la liberación de un fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, puede utilizarse un conector lábil a ácidos, un conector sensible a peptidasas, un conector fotolábil, un conector dimetilo o un conector que contiene disulfuro (Chari et al., Cancer Research 52:127-131, 1992; patente US nº 5.208.020).

Los compuestos de la invención contemplan expresamente, aunque sin limitarse a ellos, CAF preparada con reactivos entrecruzantes: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC y sulfo-SMPB, y SVSB (succinimidil-(4-vinilsulfona)benzoato), los cuales se encuentran disponibles comercialmente (por ejemplo de Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A). Ver las páginas 467 a 498, 2003-2004 Applications Handbook and Catalog.

Preparación de conjugados de anticuerpo-fármaco

En los conjugados de anticuerpo-fármaco (CAF) de la invención, se conjuga un anticuerpo (Ab) con una o más fracciones fármaco (F), por ejemplo entre aproximadamente 1 y aproximadamente 20 fracciones de fármaco por cada anticuerpo, mediante un conector (C). Los CAF de fórmula I pueden prepararse mediante varias rutas, utilizando reacciones, condiciones y reactivos de química orgánica conocidos por el experto en la materia, incluyendo: (1) la reacción de un grupo nucleofílico de un anticuerpo con un reactivo conector bivalente, formando Ab-C, mediante un enlace covalente, seguido de la reacción con una fracción fármaco F, y (2) la reacción de un grupo nucleofílico de una fracción fármaco con un reactivo conector bivalente para formar F-C, mediante un enlace covalente, seguido de la reacción con el grupo nucleofílico de un anticuerpo. Ab-(C-F)p I

Entre los grupos nucleofílicos se incluyen, aunque sin limitación: (i) grupos de amina N-terminal, (ii) grupos de amina de cadena lateral, por ejemplo lisina, (iii) grupos de tiol de cadena lateral, por ejemplo cisteína, y (iv) grupos hidroxilo

o amino de azúcar, en el caso de que el anticuerpo se encuentre glucosilado. Los grupos amina, tiol e hidroxilo son nucleofílicos y capaces de reaccionar para formar enlaces coavalentes con grupos electrofílicos en fracciones conectores y reactivos conectores, incluyendo: (i) ésteres activos, tales como ésteres de NHS, ésteres de HOBt, haloformatos y haluros de ácido, (ii) haluros de alquilo y bencilo, tales como haloacetamidas, (iii) grupos aldehído, cetona, carboxilo y maleimida. Determinados anticuerpos presentan disulfuros intercadena reducibles, es decir, puentes de cisteína. Los anticuerpos pueden convertirse en reactivos para la conjugación con reactivos conectores mediante tratamiento con un agente reductor, tal como DTT (ditiotreitol). De esta manera, cada puente de cisteína formará, en teoría, dos nucleófilos tiol reactivos. Pueden introducirse grupos nucleofílicos adicionales en los anticuerpos mediante la reacción de las lisinas con 2-iminotiolano (reactivo de Traut), resultando en la conversión de una amina en un tiol.

Los conjugados de anticuerpo-fármaco de la invención también pueden producirse mediante modificación del anticuerpo para introducir fracciones electrofílicos que pueden reaccionar con sustituyentes nucleofílicos en el reactivo conector o fármaco. Los azúcares de los anticuerpos glucosilados pueden oxidarse, por ejemplo con reactivos oxidantes peryodato, para formar grupos aldehído o cetona que pueden reaccionar con el grupo amina de reactivos conectores o fracciones de fármaco. Los grupos de base de Schiff imina resultantes pueden formar un enlace estable o pueden reducirse, por ejemplo con reactivos borohidruro, para formar enlaces amina estables. En una realización, la reacción de la parte carbohidrato de un anticuerpo glucosilado con galactosa oxidasa o metaperyodato sódico puede rendir grupos carbonilo (aldehído y cetona) en la proteína que pueden reaccionar con grupos apropiados en el fármaco (Hermanson, Bioconjugate Techniques). En otra realización, las proteínas que

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contienen residuos N-terminales de serina o treonina pueden reaccionar con meta-peryodato sódico, resultando en la producción de un aldehído en lugar del primer aminoácido (Geoghegan y Stroh, Bioconjugate Chem. 3:138-146, 1992; patente US nº 5.362.852). Dicho aldehído puede reaccionar con una fracción fármaco o nucleófilo conector.

De manera similar, entre los grupos nucleofílicos de una fracción fármaco se incluyen, aunque sin limitación: los grupos amina, tiol, hidroxilo, hidrazida, oxima, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina y arilhidrazida, capaces de reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrofílicos en fracciones conectoras y reactivos conectores, incluyendo: (i) ésteres activos, tales como ésteres de NHS, ésteres de HOBt, haloformatos y haluros de ácido, (ii) haluros de alquilo y bencilo, tales como haloacetamidas, (iii) grupos aldehído, cetona, carboxilo y maleimida.

Alternativamente, puede prepararse una proteína de fusión que comprende el anticuerpo y agente citotóxico, por ejemplo mediante técnicas recombinantes o síntesis peptídica. La longitud del ADN puede comprender regiones respectivas codificantes de las dos partes del conjugado, contiguas entre sí o separadas por una región codificante de un péptido conector que no destruye las propiedades deseadas del conjugado.

En todavía otra realización, el anticuerpo puede conjugarse con un "receptor" (tal como estreptavidina) para la utilización en el pre-direccionamiento tumoral, en el que el conjugado de anticuerpo-receptor se administra en el paciente, seguido de la eliminación del conjugado no unido de la circulación utilizando un agente eliminador, y seguido de la administración de un "ligando" (por ejemplo avidina) que se conjuga con un agente citotóxico (por ejemplo un radionucleótido).

10. Inmunoliposomas

Los anticuerpos dados a conocer en la presente memoria también pueden formularse en forma de inmunoliposomas. Un "liposoma" es una vesícula pequeña compuesta de diversos tipos de lípido, fosfolípido y/o surfactante que resulta útil para la administración de un fármaco en un mamífero. Los componentes del liposoma comúnmente se disponen en una formación de bicapa, similar a la disposición de los lípidos en las membranas biológicas. Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparan mediante métodos conocidos de la técnica, tales como los descritos en Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688, 1985; Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030, 1980; patentes US nº 4.485.045 y nº 4.544.545, y documento nº WO 97/38731, publicado el 23 de octubre de 1997. Se dan a conocer liposomas con un tiempo de circulación incrementado en la patente US nº 5.013.556.

Pueden generarse liposomas particularmente útiles mediante el método de evaporación de fase inversa con una composición de lípidos que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG (PEG-PE). Se extruyen los liposomas a través de filtros de tamaño de poro definido, rindiendo liposomas con el diámetro deseado. Pueden conjugarse fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente invención con los liposomas tal como se indica en Martin et al., J. Biol. Chem. 257:286-288, 1982, mediante una reacción de intercambio de disulfuros. Un agente quimioterapéutico se encuentra contenido opcionalmente dentro del liposoma. Ver Gabizon et al., J. National Cancer Inst. 81(19):1484, 1989.

B. Oligopéptidos de unión

Los oligopéptidos de unión de la invención son oligopéptidos que se unen, preferentemente de manera específica, a PEM y/o al complejo hepsina:PEM tal como se indica en la presente memoria. Los oligopéptidos de unión pueden sintetizarse químicamente utilizando métodos de síntesis de oligopéptidos conocidos o pueden prepararse y purificarse utilizando tecnología recombinante. Los oligopéptidos de unión presentan una longitud aproximada habitualmente de aproximadamente 5 aminoácidos, alternativamente de por lo menos aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 5 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 aminoácidos de longitud, en los que dichos oligopéptidos son capaces de unión, preferentemente específica, a una diana de interés. Los oligopéptidos de unión pueden identificarse sin experimentación indebida utilizando técnicas bien conocidas. A este respecto se indica que las técnicas de cribado de bibliotecas de olipéptidos para oligopéptidos que son capaces de unirse específicamente a una diana son bien conocidas de la técnica (ver, por ejemplo, las patentes US nº 5.556.762, nº 5.750.373, nº 4.708.871, nº 4.833.092, nº 5.223.409, nº 5.403.484, nº 5.571.689, nº 5.663.143; publicaciones de patente PCT nº WO 84/03506 y nº WO 84/03564; Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002, 1984; Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:178-182, 1985; Geysen et al., en: Synthetic Peptides as Antigens 130-149, 1986; Geysen et al., J. Immunol. Meth. 102:259-274, 1987; Schoofs et al., J. Immunol. 140:611-616, 1988; Cwirla S.E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378, 1990; Lowman H.B. et al., Biochemistry 30:10832, 1991; Clackson T. et al., Nature 352:624, 1991; Marks J.D. et al., J. Mol. Biol., 222:581, 1991; Kang A.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8363, 1991, y Smith G.P., Current Opin. Biotechnol. 2:668, 1991).

A este respecto, la expresión de bacteriófagos (fagos) es una técnica bien conocida que permite cribar grandes bibliotecas de oligopéptidos con el fin de identificar el elemento o elementos de dichas bibliotecas que son capaces

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de unirse específicamente a una diana. La expresión fágica es una técnica mediante la que se expresan polipéptidos variantes como proteínas de fusión con la proteína de cubierta sobre la superficie de partículas de bacteriófago (Scott J.K. y Smith G.P., Science 249: 386, 1990). La utilidad de la expresión fágica reside en el hecho de que las bibliotecas grandes de variantes de proteína selectivamente aleatorizadas (o ADNc clonados aleatoriamente) pueden separarse rápida y eficientemente con aquellas secuencias que se unen a una molécula diana con una afinidad elevada. La expresión de bibliotecas de péptido (Cwirla S.E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378, 1990) o proteína (Lowman H.B. et al., Biochemistry 30:10832, 1991; Clackson T. et al., Nature 352:624, 1991; Marks

J.D. et al., J. Mol. Biol., 222:581, 1991; Kang A.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363, 1991) sobre fagos se ha utilizado para cribar millones de polipéptidos u oligopéptidos para los que presentan propiedades de unión específica (Smith G. P., Current Opin. Biotechnol. 2:668, 1991). La separación de bibliotecas fágicas de mutantes aleatorios requiere una estrategia para construir y propagar un gran número de variantes, un procedimiento para la purificación por afinidad utilizando el receptor de la diana, y medios para evaluar los resultados de los enriquecimientos de unión. Patentes US nº 5.223.409, nº 5.403.484, nº 5.571.689 y nº 5.663.143.

Aunque la mayoría de métodos de expresión fágica han utilizado fagos filamentosos, también se conocen sistema de expresión de fago lambdoide (documento nº WO 95/34683, patente US nº 5.627.024), sistemas de expresión en el fago T4 (Ren et al., Gene 215: 439, 1998; Zhu et al., Cancer Research 58(15): 3209-3214, 1998; Jiang et al., Infection & Immunity 65(11): 4770-4777, 1997; Ren et al., Gene 195(2):303-311, 1997; Ren, Protein Sci. 5: 1833, 1996; Efimov et al., Virus Genes 10: 173, 1995) y sistema de expresión en el fago T7 (Smith y Scott, Methods in Enzymology 217: 228-257, 1993; patente US nº 5.766.905).

Actualmente se han desarrollado muchas otras mejoras y variaciones del concepto básico de expresión fágica. Estas mejoras incrementan la capacidad de los sistemas de expresión de cribar las bibliotecas de péptidos para la unión a moléculas diana seleccionados y a expresar proteínas funcionales con el potencial de cribar dichas proteínas para propiedades deseadas. Se han desarrollado dispositivos de reacción combinatoriales para reacciones de expresión fágica (documento nº WO 98/14277) y se han utilizado bibliotecas de expresión fágica para analizar y controlar las interacciones bimoleculares (documentos nº WO 98/20169 y nº WO 98/20159) y las propiedades de los péptidos helicoidales restringidos (documento nº WO 98/20036). El documento nº WO 97/35196 describe un método de aislamiento de un ligando de afinidad en el que una biblioteca de expresión fágica se pone en contacto con una solución en la que el ligando se une a una molécula diana y una segunda solución en la que el ligando de afinidad no se une a la molécula diana, con el fin de aislar selectivamente ligandos de unión. El documento nº WO 97/46251 describe un método de selección de fagos (biopanning) de una biblioteca de expresión fágica aleatoria con un anticuerpo purificado por afinidad, seguido del aislamiento del fago de unión y un procedimiento de micropanning con pocillos de microplaca para aislar el fago de unión de alta afinidad. También se ha informado de la utilización de la proteína A de Staphylococcus aureus como etiqueta de afinidad (Li et al., Mol Biotech. 9:187, 1998). El documento nº WO 97/47314 describe la utilización de bibliotecas sustractivas de sustratos para distinguir especificidades enzimáticas utilizando una biblioteca combinatorial que puede ser una biblioteca de expresión fágica. Un método para seleccionar los enzimas adecuados para la utilización en detergentes utilizando la expresión fágica se describe en el documento nº WO 97/09446. Se describen métodos adicionales de selección de proteínas de unión específica en las patentes US nº 5.498.538, nº 5.432.018 y documento nº WO 98/15833.

Los métodos para generar bibliotecas de péptidos y cribar estas bibliotecas también se dan a conocer en las patentes US nº nº nº 5.723.286, nº 5.432.018, nº 5.580.717, nº 5.427.908, nº 5.498.530, nº 5.770.434, nº 5.734.018, nº 5.698.426, nº 5.763.192 y nº 5.723.323.

C. Moléculas de unión pequeñas

Los moléculas de unión pequeñas preferentemente son moléculas orgánicas diferentes de oligopéptidos o anticuerpos tal como se definen en la presente memoria, que se unen, preferentemente de manera específica, a hepsina, PEM y/o al complejo hepsina:PEM tal como se indica en la presente memoria. Las moléculas orgánicas de unión pequeñas pueden identificarse y sintetizarse químicamente utilizando metodología conocida (ver, por ejemplo, las publicaciones de patente PCT nº WO 00/00823 y nº WO 00/39585). Las moléculas orgánicas de unión pequeñas habitualmente presentan un tamaño inferior a aproximadamente 2.000 daltons, alternativamente inferior a aproximadamente 1.500, 750, 500, 250 o 200 daltons, en las que dichas moléculas orgánicas pequeñas que son capaces de unión, preferentemente de manera específica, a una diana tal como se indica en la presente memoria pueden identificarse sin necesidad de experimentación indebida utilizando técnicas bien conocidas. A este respecto se indica que las técnicas de cribado de bibliotecas de moléculas orgánicas pequeñas para moléculas que son capaces de unirse a una diana son bien conocidas de la técnica (ver, por ejemplo, las publicaciones de patente PCT nº WO 00/00823 y nº WO 00/39585). Las moléculas orgánicas de unión pequeñas pueden ser, por ejemplo, aldehídos, cetonas, oximas, hidrazonas, semicarbazonas, carbazidas, aminas primarias, aminas secundarias, aminas terciarias, hidrazinas N-sustituidas, hidrazidas, alcoholes, éteres, tioles, tioéteres, disulfuros, ácidos carboxílicos, ésteres, amidas, ureas, carbamatos, carbonatos, cetales, tiocetales, acetales, tioacetales, haluros de arilo, sulfonatos de arilo, haluros de alquilo, sulfonatos de alquilo, compuestos aromáticos, compuestos heterocíclicos, anilinas, alquenos, alquinos, dioles, aminoalcoholes, oxazolidinas, oxazolinas, tiazolidinas, tiazolinas, enaminas, sulfonamidas, epóxidos, aziridinas, isocianatos, cloruros de sulfonilo, compuestos diazo, cloruros de ácido

o similares. 21

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