CN109072242A - 用于治疗神经损伤的基于肽的方法 - Google Patents

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Abstract

经由施用短暂受体电位M2(TRPM2)‑抑制剂治疗和预防神经变性疾病、神经损伤(包括中风)的方法。所述抑制剂可与另一种治疗剂或治疗方案联合施用。肽类可施用于人类男性。肽类可在神经损伤(如中风)的8小时内施用。

Description

用于治疗神经损伤的基于肽的方法
相关申请数据
本申请要求于2016年2月23日提交的美国临时专利申请序列号62/298,585的优先权的权益，其通过提述并入本文。
序列表数据
附于此的序列表文本文件(2016年2月23日创建，大小3千字节，文件名称"2848-202_Sequence_listing_ST25")以其整体通过提述并入本文。
背景技术
中风是全球第二大死亡原因，在恢复的患者中由于认知障碍所致经济负担显著，生活质量差。不幸的是，可用于减少脑损伤和治疗患有中风的患者的药理学工具极为有限。中风的两个最重要和不可改变的风险因素是年龄和性别，55岁以后每十年中风的风险增加一倍，并且影响男性的程度大于女性直至中风发生率在老年妇女中增加的生命晚期。后一种观察可能是由于雄激素和雌激素在细胞死亡途径中的作用。然而，大多数神经保护研究(临床前或临床)要么未使用雌性动物，要么没有被赋能以在人体试验中发现性别之间的差异。因此，关键的是为了确定任何新化合物的治疗潜力，更准确地对人类患者群体建模。
短暂受体电位M2(TRPM2)是短暂受体电位(TRP)通道的超家族的成员。据信这些通道具有6个跨膜结构域和细胞内氨基-和羧基-末端。TRP通道基于序列同源性和特定结构基序分组为3个家族(Harteneck等,2000,Trends Neurosci.,23:159；Montell等,2002,Mol.Cell.,9:229)。TRPM2属于家族M，以创始成员美司他丁(melastatin)命名。TRPM2通道的特征在于其氨基-和羧基-末端中的复合结构亚区，其携带另外的功能性，如激酶活性(Ryazanov,2002,FEBS Lett.,514:26)。关于TRPM2的表达和功能的信息有限。在神经系统中检测出高水平的表达，并且在外周组织(如骨髓、脾、肺和心脏)中检测出较低水平(Nagamine等,1998,Genomics,54:124；Perraud等,2001,Nature,411:595)。TRPM2通道是由ADP核糖(ADPr)活化的非选择性阳离子通道。可通过PARP-1响应于氧化性应激和脑缺血生成ADPr，这与缺血后再灌注损伤的设置特别相关。用克霉唑(clotrimazole)或遗传敲低抑制TRPM2离子通道减小了中风后男性而非女性中的梗死面积(infarct size)。虽然TRPM2看来是男性中风治疗干预的可行靶标，但是临床前研究仍受限于特异性抑制剂的缺乏。
发明内容
因为已经显示出TRPM2离子通道的调节与某些病症和疾病的原因和/或控制显著相关，所以有必要找到在抑制TRPM2离子通道中安全和有效的药剂。
TRPM2通道已牵涉于缺血性神经元损伤超过十年(综述,参见Aarts MM,TymianskiM.Trpms and neuronal cell death.Pflugers Arch-Eur J Physiol.2005；451:243-249；另见美国专利公开号2010/0298394,2010年11月25日)，然而该领域一直受到缺乏对该通道特异性的抑制剂的困扰。已经显示非特异性TRPM2抑制剂，如克霉唑(CTZ)，减小体外皮质和海马回神经元中的神经元死亡，以减少在局灶性脑缺血和全脑缺血后雄性动物中的损伤。本发明的发明人已经鉴定了TRPM2通道的新的和特异性的肽抑制剂。
TRPM2通道的区别特性是它们经由结合至C末端中的ADPr水解酶同源性结构域(称为“NUDT9-H”)通过ADP核糖(ADPr)来门控。NUDT9-H的催化结构域是Nudix结构域，其与相同结构域内的几个远端氨基酸配合，形成ADPr结合口袋。本发明人靶向ADPr结合口袋作为抑制TRPM2通道活化的策略。缺乏C末端Nudix同源性结构域的通道的表达是失活的。因此，本发明人生成了肽，其包括GSREPGEMLPRKLKRVLRQEFWV(SEQ ID NO:1；“M2NX”)，其融合至细胞可渗透TAT序列YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO:2；“tat 47-57”)以形成34-聚物YGRKKRRQRRRGSREPGEMLPRKLKRVLRQEFWV(SEQ ID NO:3；“tat-M2NX”)，其经由与通道的NUDT9-H结构域的ADPr结合口袋的相互作用特异性地抑制TRPM2通道活性。
重要地，本文公开的原始数据显示TRPM2通道的抑制改善了中风、创伤性脑损伤、心脏停搏诱导的全局缺血和神经变性疾病后的功能恢复。在雄性和雌性动物两者中且当在急性或慢性时间点过程中完成TRPM2抑制时观察到这些作用。
因此，本公开提供了通过向受试者施用包含本公开的TRPM2抑制肽的药物组合物而在受试者中治疗或预防的神经损坏或损伤或神经变性疾病，或者增强神经功能复原的方法。
本公开内容还提供了通过向受试者施用包含本公开的TRPM2抑制肽或其变体和至少一种另外的治疗剂的药物组合物而在受试者中治疗或预防神经损坏或损伤或神经变性疾病，或者增强神经功能复原的方法。另外的治疗剂可为一种或多种神经保护、神经复原或血凝块防止或溶解剂。
在这些方法中，施用可通过肠胃外施用进行。在这些方法中，肽可以约0.05至约25mg/kg的剂量施用。在这些方法中，受试者可为人。受试者可为男性。
一方面是一种药物组合物，其包含本公开的肽，或其多聚体、衍生物或变体，和药学上可接受的载体，用于治疗或预防神经损坏或损伤或神经变性疾病，或者增强神经功能复原。这些组合物可包含至少一种另外的治疗剂，并且因此另一方面是一种药物组合物，其包含本公开的肽，或其多聚体、衍生物或变体，至少一种另外的治疗剂，和药学上可接受的载体，用于治疗或预防神经损坏或损伤，包括中风。相关的方面是本公开的肽或其多聚体、衍生物或变体用于治疗或预防神经损坏或损伤(包括中风)的用途。
本公开的其他方面在以下公开内容中描述或从中显见，并且在本公开的范围内。
附图简述
以下详细的说明(通过实施例给出，但是不意图将本公开限制为所述的特定实施方案)可结合附图理解，其中：
图1A显示tat-M2NX抑制通过TRPM2通道的Ca2+流入(influx)并提供体内神经保护，作为在表达四环素调节的巨细胞病毒驱动的FLAG标记的人TRPM2转录的HEK-293细胞中Fluo-5F荧光的平均荧光变化，显示为从基线的百分比增加。在200μM H2O2的存在下，用100μM tat-M2NX(三角形)或tat-SCR(圆形)处理样品。图1B显示用25、50、100μM tat-M2NX或100μM tat-SCR处理的HEK-293细胞中Fluo-5F荧光的百分比增加的定量。图1C提供了显示MCAO之前用(C’)tat-SCR和(C”)tat-M2NX处理的雄性脑和用(C*)tat-SCR和(C**)tat-M2NX处理60分钟的雌性脑的TTC染色的照片。图1D显示用运载体、100μM tat-SCR或100μM tat-M2NX处理的WT雄性和雌性小鼠中梗死体积的百分比的定量。
图2显示tat-M2NX在60分钟tMCAO后不保护TRPM2-/-小鼠。来自用TTC染色的WT和TRPM2-/-小鼠脑的梗死体积的百分比的定量。用100μM tat-M2NX肽或运载体处理TRPM2-/-雄性小鼠。
图3A显示tat-M2NX表现出临床相关的治疗窗口，作为再灌注后3小时用tat-SCR(A’)或tat-M2NX(A”)处理和再灌注后24小时染色的雄性小鼠的代表性TTC染色。图3B显示再灌注后3小时用tat-SCR(B’)或tat-M2NX(B”)处理和再灌注后96小时染色的雄性小鼠。图3C显示在接受药物后24小时和96小时用TTC染色的雄性和雌性脑中梗死体积的百分比的定量。用运载体、克霉唑(CTZ)、tat-SCR(20mg/kg)或tat-M2NX(20mg/kg)处理雄性和雌性小鼠。
图4显示tat-M2NX在老年雄性中提供神经保护，作为接受tat-SCR(SCR)或tat-M2NX(M2NX)的18-20个月龄的雄性和雌性小鼠中梗死的百分比的定量。YA＝年轻成年；A＝老年。*p<0.05。
图5A显示睾酮而非二氢睾酮在雄性小鼠中随着年龄而降低，作为在2个月、4-5个月和18个月龄的雄性小鼠中通过ELISA测量的睾酮的血清浓度的定量。图5B显示了在2个月、4-5个月和18个月龄的雄性小鼠中通过ELISA测量的二氢睾酮(DHT)的血清浓度的定量。*p<0.05。
图6A和6B显示延迟施用tat-M2NX后缺血诱导的突触可塑性损伤的逆转。图6A是雄性对TBS响应的日志图。箭头指示TBS的时间安排(40个脉冲)。图6B显示了雄性(蓝色)和雌性(红色)中从基线的变化的定量。*与假对照相比，P<0.05。
图7A和7B特异性证明了在雄性小鼠中CA1神经元损伤的tat-M2NX减少和长期突触功能的改善。图7A显示CA/CPR后3天海马回的CA1区中缺血神经元的定量，*P<0.05。图7B显示tat-M2NX防止缺血诱导的突触可塑性损伤。箭头表示TBS的时间安排(40个脉冲)。
图8A和8B显示急性切片中TRPM2的抑制逆转了缺血诱导的突触可塑性损伤。图8A是雄性对TBS响应的日志图。箭头指示TBS的时间安排(40个脉冲)。图8B显示了雄性(蓝色)和雌性(红色)中从基线变化的定量。
图9A和9B证明tat-M2NX的延迟施用逆转了缺血诱导的突触可塑性损伤。图9A是雄性对TBS响应的日志图。箭头指示TBS的时间安排(40个脉冲)。图9B显示了雄性(蓝色)和雌性(红色)中从基线变化的定量。与假对照相比，*P<0.05。
图10A和10B显示tat-M2NX的延迟施用逆转了缺血诱导的记忆障碍。图10A显示在暴露于新的环境和足部休克后第8天、24小时的不动行为的定量。注射tat-SCR乱序肽的CA/CPR小鼠表现出降低的不动行为，与上下文的受损记忆一致。相反，tat-M2NX处理的小鼠(第7天)具有增加的冷冻。图10B显示CA/CPR后30天受损的环境恐惧条件反射行为(impairedcontextual fear conditioning behavior)。
图11A和11B显示了通过Tat-M2NX的TRPM2通道抑制对创伤性脑损伤后小鼠中运动和记忆功能的作用。
图12A和12B显示急性切片中TRPM2的抑制逆转缺血诱导的突触可塑性损伤。图8A/12A是对暴露于淀粉样蛋白-β响应的日志图。图12B显示突触可塑性定量作为从基线变化的百分比。
发明详述
如上所述，本公开涉及TRPM2抑制剂，其用于破坏TRPM2通道的配体(ADP核糖)-结合口袋，由此防止活化。因此，本公开涵盖了破坏TRPM2通道的ADPr结合部分的小分子。
在一个方面，本公开涉及神经保护和神经复原的肽和肽构建体，和这些肽的用途，以及向患有神经损伤、神经病症或神经变性疾病，或处于持续神经损伤或发生神经病症或神经变性疾病的风险的受试者施用这些肽的方法。
定义
如本文所使用的，单数形式“一个”、“和”以及“该”包括复数指称，除非上下文另有明确说明。因此，例如，提及“一个细胞”包括多个这样的细胞，并且提及“蛋白质”包括提及一个或多个蛋白质及其本领域技术人员已知的等同物，等等。除非另有明确说明，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
术语“肽”和“多肽”在本文中同义使用，指由氨基酸残基构建的聚合物。
如本文所使用的(例如，在药物组合物的上下文中)，“基本上纯的”指肽占组合物的总含量(例如，组合物的总蛋白质)的大于约50％，或总蛋白质含量的大于约80％。例如，“基本上纯的”肽，指其中总组合物的至少80％、至少85％、至少90％或更多是肽(例如总蛋白质的95％、98％、99％、大于99％)的组合物。肽可占组合物中总蛋白质的大于约90％、大于约95％、大于98％或大于99％。在一些实施方案中，当肽为按重量计至少60％或至少75％，不含与其在生产过程中相关的有机分子时，肽是基本上纯的。在一些实施方案中，所述肽为按重量计至少60％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％纯的。例如，在一些实施方案中，当免疫调节肽为按重量计至少60％或至少75％，不含在生产过程中肽与其相关的有机分子时，免疫调节肽是基本上纯的，在一些实施方案中，免疫调节肽为按重量计至少60％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％纯的。
术语“受试者”、“患者”和“个体”在本文中可互换使用，并且指多细胞动物(包括哺乳动物类(例如人类、非人灵长目动物类、鼠类、绵羊类、牛类、反刍动物类、兔类、猪类、羊羚类、马类、犬类、猫类、指猴类等)、禽类(如鸡)、两栖动物类(如爪蟾属)、爬行动物类和昆虫类(例如果蝇)。“动物”包括豚鼠、仓鼠、雪貂、毛丝鼠、小鼠和大鼠。这些术语特别包括人类，具体包括雄性哺乳动物，并且因此包括人类男性。
如本文所用的术语“神经保护的”是指肽的任何特性，其可被评估、和/或减少或抑制、或预期减少或抑制死亡、凋亡、破坏或损伤神经元和/或减少或抑制受试者中的神经变性。
如本文所用的术语“神经复原的”是指肽的任何性质，其可改善脑功能、突触功能、神经元放电、脑网络功能，而不依赖于细胞死亡的变化。神经复原适用于，在接近损伤时或在慢性时间点施用以逆转脑功能的稳定缺陷的药剂。
“有效量”指在必要的剂量和时间段内有效实现所需治疗或预防结果的量。包含本公开的肽的肽或药物组合物的“治疗有效量”可根据因素如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及肽或组合物引发个体中所希望的反应的能力而变化。治疗有效量也是其中肽或包含肽的组合物的任何毒性或有害作用被治疗有益效果超过的量。
本文提及的任何数值范围(例如，剂量范围)明确地包括该范围所涵盖的每个数值(包括分数和整数)。例如，但不限于，本文提及的0.5mg/kg至100mg/kg的范围明确包括两者之间的所有整数和分数。
被称为“患有”神经损伤(包括如本文所述的中风、TBI、心脏停搏)的个体，已被诊断患有和/或表现出神经损伤的一种或多种症状，包括中风。
如本文所使用的，术语“处于…的风险”用于神经损伤(包括中风)指倾向于发生中风和/或表达疾病的一种或多种症状的受试者(例如，人)。这种倾向可能是遗传的或由于其他因素所致。并不意欲本公开受限于任何特定的体征或症状。因此，意欲本公开涵盖经历从亚临床到完全爆发的任何范围的神经损伤(包括中风)的受试者，其中受试者表现出与神经损伤(包括中风)相关的至少一种迹象(例如，体征和症状)。
如本文所使用的，术语“治疗/处理(treat,treatment或treating)”指用于部分或完全减轻、改善、缓解、抑制、预防、延迟疾病、病症和/或病况(例如，神经损伤，神经变性疾病)的一种或多种症状或特征的发作，降低其严重性和/或降低其发生率的任何方法。治疗可施用于没有表现出疾病、病症和/或病况的体征的受试者。在一些实施方案中，治疗可施用于仅表现出疾病、病症和/或病况的早期体征的受试者，目的是降低发生与疾病、病症和/或病况相关的病理的风险。
术语“包含(comprises/comprising)”具有专利法中归属它们的广泛含义，并且可以意指“包括(includes/including)”等。
通过参考以下详细的描述和说明性实例可更充分地理解本公开，这些描述的实例意欲示例说明本公开的非限制性实施方案。
多肽
本公开的肽包括TRPM2通道的C末端的NUDT9-H区域的Nudix结构域的片段，或其变体，其经由与通道的NUDT9-H结构域的ADPr结合口袋的相互作用特异性地抑制TRPM2通道活性。因此，本公开的主题肽是GSREPGEMLPRKLKRVLRQEFWV(SEQ ID NO:1)。本公开的任何肽可优选在N-末端与内化肽连接，所述内化肽促进通过细胞质膜的易位(translocation)。这些肽的实例包括源自HIV的TAT(Vives等,1997,J.Biol.Chem.272:16010；Nagahara等,1998,Nat.Med.4:1449)，源自果蝇的控制触角肽(antennapedia)(Derossi等,1994,J.Biol.Chem.261:10444)，源自单纯疱疹病毒的VP22(Elliot和D'Hare,1997,Cell 88:223-233)，抗DNA抗体的互补决定区(CDR)2和3(Avrameas等,1998,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,95:5601-5606)，70KDa热休克蛋白(Fujihara,1999,EMBOJ.18:411-419)和转运子(Pooga等,1998,FASEB J.12:67-77)。例如，可使用HIV TAT内化肽YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO:2)。本公开的一个示例性肽包括HIV Tat内化肽和TRPM2通道活性的活性肽抑制剂为：YGRKKRRQRRR-GSREPGEMLPRKLKRVLRQEFWV(SEQ ID NO:3,“Tat-M2NX”)。
也可使用标准TAT序列YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO:2)的变体。尽管本公开的实践不依赖于对机理的理解，但据信跨越膜的能力和与TAT的N型钙通道的结合都由通过肽中带正电荷的残基Y、R和K的异常高的存在率赋予。用于本公开的变体肽应保留促进摄入细胞的能力但具有降低的结合N型钙通道的能力。一些合适的内化肽包含氨基酸序列XGRKKRRQRRR(SEQ ID NO:4)或由其组成，其中X是除Y之外的氨基酸。优选的TAT变体具有用F取代的N-末端Y残基。因此，可使用包含FGRKKRRQRRR(SEQ ID NO:5)或由其组成的TAT变体。TAT内化肽的另一个优选变体由GRKKRRQRRR(SEQ ID NO:6)组成。如果存在XGRKKRRQRRR(SEQ ID NO:4)侧翼的额外残基(在活性肽旁边)，则残基可为例如来自通常用于连接两个肽结构域的TAT蛋白、间隔物或接头氨基酸的该区段侧翼的天然氨基酸，例如Gly(Ser)4(SEQ ID NO:7),TGEKP(SEQ ID NO:8),GGRRGGGS(SEQ ID NO:9)或LRQRDGERP(SEQ ID NO:10)(参见，例如，Tang等(1996),J.Biol.Chem.271,15682-15686；Hennecke等(1998),Protein Eng.11,405-410)),GSRVQIRCRFRNSTR(SEQ ID NO:11)(参见美国专利公开号2014/0235553；2014年8月21日)，或者可为任何其他氨基酸，在没有侧翼残基的情况下，其没有可检测地降低赋予变体摄取的能力，并且相对于没有侧翼残基的变体不显著增加对N型钙通道的抑制。优选地，除活性肽之外，侧翼氨基酸的数目在XGRKKRRQRRR(SEQ ID NO:4)的任一侧上不超过10个残基。优选地，不存在侧翼氨基酸，并且内化肽在其C-末端直接连接至本公开的活性TRPM2抑制肽。
本文所述的肽的“变体”是与本文公开的多肽基本相似的多肽，并且保留本公开的肽的至少一种TRPM2抑制剂特性或神经保护活性。变体可包括本文公开的多肽的N-末端或C-末端处的一个或多个氨基酸残基的缺失(即截短)；在本文公开的多肽中的一个或多个内部位点处缺失和/或添加一个或多个氨基酸残基；和/或在本文公开的多肽中的一个或多个位置处取代一个或多个氨基酸残基。对于长度为12个氨基酸残基或更短的多肽，变体多肽优选包括三个或更少(例如，两个、一个或没有)缺失的氨基酸残基，无论其位于内部，在N末端，和/或在C末端。
因此，同样涵盖本发明的方法和组合物用于神经保护多肽，其与本文公开的TRPM2抑制性多肽至少50％相同(例如，具有至少60％、70％、80％、90％、95％或更多序列同一性)，并且其保留SEQ ID NO:3的至少一种神经保护特性。通常，本公开的神经保护肽的蛋白质变体会具有与如本文所公开的全长天然序列蛋白质序列至少约80％氨基酸序列同一性，或者至少约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性，或如本文所公开的全长蛋白质序列的任何其他特定定义的片段。任选地，变体多肽与天然蛋白质序列相比会具有不超过一个保守氨基酸取代，或者与天然蛋白质序列相比会具有不超过2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守氨基酸取代。
取代的氨基酸残基可能与被替换的氨基酸残基无关(例如，在疏水性/亲水性、大小、电荷、极性等方面无关)，或取代的氨基酸残基可构成相似的、保守的或高度保守的氨基酸取代。如本文所用，“相似”，“保守的”和“高度保守的”氨基酸取代如下表所示定义。确定氨基酸残基取代是否相似、保守或高度保守完全基于氨基酸残基的侧链而不是肽骨架，其可以被修饰以增加肽稳定性，如下所述。
氨基酸主题多肽 相似氨基酸取代 保守氨基酸取代 高度保守氨基酸取代
甘氨酸(G) A,S,N A n/a
丙氨酸(A) S,G,T,V,C,P,Q S,G,T S
丝氨酸(S) T,A,N,G,Q T,A,N T,A
苏氨酸(T) S,A,V,N,M S,A,V,N S
半胱氨酸(C) A,S,T,V,I A n/a
脯氨酸(P) A,S,T A n/a
甲硫氨酸(M) L,I,V,F L,I,V L,I
缬氨酸(V) I,L,M,T,A I,L,M I
亮氨酸(L) M,I,V,F,T,A M,I,V,F M,I
异亮氨酸(I) V,L,M,F,T,C V,L,M,F V,L,M
苯丙氨酸(F) W,L,M,I,V W,L n/a
酪氨酸(Y) F,W,H,L,I F,W F
色氨酸(W) F,L,V F n/a
天冬酰胺(N) Q Q Q
谷氨酰胺(Q) N N N
天冬氨酸(D) E E E
谷氨酸(E) D D D
组氨酸(H) R,K R,K R,K
赖氨酸(K) R,H R,H R,H
精氨酸(R) K,H K,H K,H
选择在主题肽的语境下的保守氨基酸取代，以保持肽的活性。
修饰的多肽
在本发明方法和组合物的上下文中还考虑了通过化学或遗传手段修饰本文所述的任何神经保护多肽。这样的修饰的实例包括用L或D对映体形式的非天然氨基酸和/或天然氨基酸构建部分或完整序列的肽。例如，本文公开的任何肽及其任何变体可以全D形式产生。此外，可修饰多肽以含有与侧链或氨基酸的N-或C-末端共价连接的碳水化合物或脂质部分，如糖或脂肪酸。另外，可以通过糖基化和/或磷酸化修饰多肽。
此外，可修饰多肽以在施用时增强溶解度和/或半衰期。例如，聚乙二醇(PEG)和相关聚合物已用于增强蛋白质治疗剂在血液中的溶解度和半衰期。因此，可通过PEG聚合物等修饰本公开的多肽。PEG或PEG聚合物意指含有聚(乙二醇)作为必要部分的残基。这样的PEG可含有其他化学基团，这些化学基团是本公开的肽的治疗活性所必需的；是由分子的化学合成得到的；或者是用于使分子部分彼此最佳距离的间隔物。另外，这样的PEG可由一个或多个连接在一起的PEG侧链组成。具有多于一个PEG链的PEG基团称为多臂或分支PEG。分支PEG可例如通过向各种多元醇(包括甘油、季戊四醇和山梨醇)中添加聚环氧乙烷来制备。例如，可由季戊四醇和环氧乙烷制备四臂分支PEG。分支PEG通常具有2至8个臂，并且在例如美国专利号5,932,462中描述。特别优选的是具有经由赖氨酸的伯氨基连接的两个PEG侧链(PEG2)的PEG(Monfardini,C,等,Bioconjugate Chem.6(1995)62-69)。术语“PEG”广泛地用于涵盖任何聚乙二醇分子，其中乙二醇(EG)单元的数目为至少460个，优选460至2300个，并且特别优选460至1840个(230个EG单元是指分子量为约10kDa)。EG单元的上限数量仅受本公开的PEG化肽的溶解度限制。通常不使用比含有2300个单位的PEG更大的PEG。优选地，本发明中使用的PEG在一端以羟基或甲氧基(甲氧基PEG，mPEG)终止，并且在另一端经由醚氧键共价附接于接头部分。聚合物是直链或支链的。分支PEG例如在Veronese,F.M.,等,Journal of Bioactive and Compatible Polymers 12(1997)196-207中描述。用于产生本公开的PEG化肽以及变体的合适方法和优选试剂在美国专利公开号2006/0154865中描述。可理解的是，例如，基于由Veronese,F.M.,Biomaterials 22(2001)405-417所述的方法可在该方法中进行修改，只要该方法得到本公开的PEG化肽即可。用于制备本公开的PEG化肽的特别优选的方法在US 2008/0119409(其通过提述并入本文)中描述。
另外或可替换地，本公开的肽可与人IgG的Fc区的一个或多个结构域融合。抗体包含两个功能独立的部分，称为“Fab”的可变结构域，其结合抗原，和称为“Fc”的恒定结构域，其涉及效应功能，如补体活化和吞噬细胞的攻击。Fc具有长的血清半衰期，而Fab是短寿命的(Capon等,1989,Nature 337:525-31)。当与本公开的治疗性蛋白质一起构建时，Fc结构域可提供更长的半衰期或并入功能如Fc受体结合、蛋白A结合、补体结合、以及可能甚至血脑屏障或胎盘转移。在一个实例中，可使用本领域技术人员已知的方法将人IgG铰链、CH2和CH3区融合于本公开的肽的氨基末端或羧基末端。可通过使用蛋白A亲和柱而纯化所得的融合多肽。已经发现与Fc区融合的肽和蛋白质在体内显示出比未融合的对应物显著更长的半衰期。而且，与Fc区的融合物允许融合多肽的二聚化/多聚化。Fc区可为天然存在的Fc区，或者可被改变以改善某些质量，如治疗质量、循环时间或减少的聚集。
还可修饰多肽以含有硫、磷、卤素、金属等。氨基酸模拟物可用于产生多肽，并且因此，本公开的多肽可包括具有增强特性(如对降解的抗性)的氨基酸模拟物。例如，多肽可包括一个或多个(例如所有)肽单体。
本公开还提供了编码本公开的神经保护肽的核酸分子，优选如本文所定义的TRPM2离子通道的活性抑制剂，并且其与编码本公开的全长抑制肽序列的核酸序列具有至少约80％的核酸序列同一性。一般地，本公开的变体多核苷酸与编码如本文公开的全长TRPM2抑制剂蛋白质序列的核酸序列会具有至少约80％的核酸序列同一性，或者至少约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的核酸序列同一性。变体不涵盖天然核苷酸序列。
一般地，变体多核苷酸的长度为至少约5个核苷酸，或者长度为至少约为6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20，21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125或130个核苷酸，其中在该上下文中，术语“约”意指所提及的核苷酸序列长度加上或减去该提及长度的10％。本公开的变体多肽可为由本公开的变体多核苷酸编码的多肽。
这些多核苷酸可包括控制序列，其是在特定宿主生物中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。适合于原核生物的控制序列例如包括启动子，任选的操纵子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、多腺苷酸化信号和增强子。当核酸与另一核酸序列处于功能关系时，它是“可操作地连接的”。例如，如果前序列或分泌前导序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则其与多肽的DNA可操作地连接。如果启动子或增强子影响序列的转录，则它与编码序列可操作地连接；或如果核糖体结合位点被定位以促进翻译，则它与编码序列可操作地连接。通常，“可操作地连接的”意指连接的DNA序列是连续的，并且在分泌前导序列的情况下，是连续的并且处于阅读相位(in reading phase)。然而，增强子不必是连续的。通过在方便的限制位点连接来完成连接。如果这样的位点不存在，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
本公开还提供了TRPM2离子通道的分离的肽抑制剂。当用于描述本文公开的多种肽时，“分离的”意指已经从其天然环境的组分中鉴定和分离和/或回收的多肽。其天然环境的污染组分是通常会干扰多肽的诊断或治疗用途的材料，并且可包括酶、激素和其他蛋白质性或非蛋白质性溶质。在优选的实施方案中，(1)通过使用旋杯式测序仪将多肽纯化至足以获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(2)使用考马斯蓝或优选银染色在非还原或还原条件下通过SDS-PAGE将多肽纯化至同质。分离的多肽包括重组细胞内的原位多肽，因为不存在蛋白质天然环境的至少一种组分。然而，一般地，会通过至少一个纯化步骤制备分离的多肽。
本公开的肽可包括“表位标记的”肽，其是指包含与“标签多肽”融合的本公开的TRPM2抑制肽的嵌合多肽。标签多肽具有足够的残基以提供针对其可制成抗体的表位，还足够短从而不会干扰与其融合的抑制性多肽的活性。标签多肽优选地也是相当独特的，从而抗体基本上不与其他表位交叉反应。合适的标签多肽通常具有至少6个氨基酸残基，并且通常约8-50个氨基酸残基(优选地，约10-20个氨基酸残基)。
本公开的肽可与“固相”或“固体支持物”连接或结合，所述“固相”或“固体支持物”是本公开的肽可以粘附或附接的非水性基质。本文涵盖的固相的实例包括部分或全部由玻璃(例如，可控孔径玻璃)、多糖(例如，琼脂糖)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和(聚)硅氧烷形成的那些。在某些实施方案中，取决于上下文，固相可包含测定板的孔；在另一些实施方案中，它是纯化柱(例如，亲和色谱柱)。该术语还包括离散颗粒的不连续固相，如美国专利号4,275,149中所述的那些。
用于本文目的的“活性的”或“活性”指抑制TRPM2离子通道的活性(如其降低穿过TRPM2离子通道的钙离子的通量)的肽。本公开还提供了TRPM2离子通道的“拮抗剂”，包括部分或完全阻断、抑制或中和本文公开的天然TRPM2蛋白的生物活性的任何分子。合适的拮抗剂分子具体包括拮抗剂抗体或抗体片段、天然TRPM2蛋白的片段或氨基酸序列变体、肽、反义寡核苷酸、小有机分子等。用于鉴定TRPM2蛋白的拮抗剂的方法可包括使TRPM2蛋白与候选物拮抗剂分子接触，并测量通常与TRPM2离子通道蛋白相关的一种或多种生物活性的可检测变化。
治疗/疗法
在某些实施方案中，本公开内容提供了在受试者中治疗(例如，减轻、改善、缓解、稳定、延迟其发作、抑制其进展、降低其严重性和/或降低其发生率)和/或预防中风、TBI或心脏停搏或与中风、中风后脑损伤或神经损伤、脑损伤相关的一种或多种症状的方法和组合物。该方法和组合物还可用于治疗和/或预防由脑缺血(例如心脏停搏后的全脑缺血)引起的神经损伤。该方法和组合物也可用于治疗创伤性脑损伤(TBI)。另外，该方法和组合物还可用于帮助患者从这些神经损伤中恢复，例如通过在神经损伤后或在活动或处方康复计划期间恢复或康复的患者中改善突触功能和记忆。实际上，数据指示延迟施用本公开的活性肽在中风、心脏停搏和TBI后男性和女性中改善了记忆。
另外或可替换地，所述方法和组合物可用于治疗和/或预防神经变性病症、周围神经病或神经性疼痛，其中所述神经变性病症选自阿尔茨海默病，多发性硬化症、HIV相关性痴呆、亨廷顿氏病、帕金森病和肌萎缩侧索硬化症。数据指示TRPM2通道在神经变性疾病的发生/发展中起作用，因为TRPM2通道在氧化应激条件下被激活并因此导致损伤和功能障碍。例如，帕金森病和阿尔茨海默病都是神经变性病症，其中氧化应激受到强烈牵涉，使TRPM2在这些病症的病因学中的作用合乎逻辑。因此，本公开还提供了可用于治疗和/或预防神经变性病症(包括帕金森病和阿尔茨海默病)的方法和组合物。
另外或可替换地，所述方法和组合物可用于增强受试者的认知功能。例如，可将方法和组合物施用于受试者以增强突触功能和/或增强记忆。这些作用可减少或减缓神经变性病症的进展，或者增强从神经损伤的恢复。
另外或可替换地，所述方法和组合物可用于治疗和/或预防炎症、缺血，动脉粥样硬化、哮喘、自身免疫疾病、糖尿病、关节炎、过敏、移植排斥、感染、由糖尿病性神经病所致的疼痛、胃痛、疱疹后神经痛(postherpetic neuralgia)、纤维肌痛、手术或慢性背痛。
在这些方法中，受试者可为人。受试者可为男性或女性。在特定的实施方案中，受试者可为人类男性。
这些治疗方法包括向受试者施用包含本公开的肽的药物组合物。在某些实施方案中，治疗方法进一步包括抑制受试者中TRPM2的活性至少10％(例如，15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更多)。
这些方法可包括在受试者持续损伤后，将本公开的肽向患有神经损伤(包括中风)或疑似患有神经损伤的受试者施用。可在神经损伤发生的一个月内首先将肽施用于受试者。优选地，在神经损伤发生的96小时或8天内将肽首先施用于受试者。更优选地，在神经损伤发生的1小时至96小时的时间段内首先施用肽。更优选地，在神经损伤发生的1分钟至5小时的时间段内首先施用肽。
组合治疗
另外，本文公开了治疗方法(和组合物)，其中本公开的神经保护肽(或包含这样的肽的药物组合物)可与目前已知或以后发现的至少一种其他药物或治疗组合施用以有效预防和/或治疗中风或中风后的神经损伤。该药物可为抗凝血剂或凝块溶解药物，如阿司匹林、氯吡格雷(clopidogrel)或组织纤溶酶原激活物(tPA)。该药物可为ACE抑制剂，如赖诺普利(Lisinopril)，或血液稀释剂，如华法林(warfarin)，或肝素，或阿哌沙班(apixaban)，或他汀类，如阿托伐他汀(atorvastatin)或瑞舒伐他汀(rosuvastatin)，或厄贝沙坦(irbesartan)，或瑞替普酶(reteplase)，或阿替普酶(alteplase)。
涵盖的治疗包括手术，如颈动脉内膜切除术，或血管成形术，或支架放置。涵盖的疗法还可包括身体或精神康复计划，其已被证明对中风和创伤性脑损伤后的康复和恢复特别有效。
本公开的神经保护/神经复原肽可在施用另外的药物和/或治疗之前、与其同时或之后施用。这些方法可包括评估治疗性处理/治疗功效的步骤。这样的功效评估可基于任何数量的评估结果。根据评估的功效水平，本公开的神经保护肽的剂量可根据需要向上或向下调节。
因此，“与...组合”并不意欲暗示本公开的肽和另外的药剂或治疗必须同时施用或配制用于一起递送，尽管这些递送方法在本公开的范围内。此外，可理解的是，组合使用的治疗活性剂可在单一组合物中一起施用或在不同组合物中分开施用。一般而言，每种药剂会以针对该药剂确定的剂量和/或时间表施用。
一般而言，每种药剂(在该上下文中，“药剂”之一是本公开的肽)会以针对该药剂确定的剂量和时间表施用。另外，本公开涵盖组合物与可改善其生物利用性、降低或改变其代谢、抑制其排泄、或改变其在体内分布的药剂组合递送。
在组合方案中采用的特定治疗组合(例如，疗法或程序)会考虑所希望的疗法和/或程序的相容性以及要实现的所希望的治疗效果。一般而言，预期组合使用的药剂会以不超过单独使用它们的水平的水平使用。在一些实施方案中，组合使用的水平会低于单独使用的水平。
诊断
在一个实施方案中，本发明的治疗/处理方法另外包括诊断患有神经损伤、神经病症或神经变性疾病的受试者，或者在治疗期间，诊断、或评价或监测治疗方法的功效。中风可通过医疗史和体检、脑计算机断层成像、磁共振成像、计算机断层扫描动脉造影和磁共振动脉造影、颈动脉超声、颈动脉血管造影、EKG(心电图)、超声心动图和/或血液检查来诊断。
用于治疗和施用的组合物
本公开的用于治疗神经损伤疾病和病症以及增强认知功能的组合物可根据本领域已知的和文献中广泛描述的任何常规方法配制。因此，活性成分(例如，本公开的肽)可任选地与其他活性物质、一种或多种常规的药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂等一起掺入，适合于组合物的特定用途，以生产制备适合或可制成适合施用的常规制剂。载体可包括药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂，其对以所用剂量和浓度暴露于其的细胞或哺乳动物无毒。生理学上可接受的载体通常是含水pH缓冲溶液。生理学上可接受的载体的实例包括缓冲液，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖醇，如甘露醇或山梨醇；成盐抗衡离子，如钠；和/或非离子表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)和它们可配制成液体、半固体或固体、液体溶液、分散体、悬浮液等，这取决于预期的施用模式和治疗应用。在一些实施方案中，本发明的组合物以可注射或可输注溶液的形式制备。本公开的肽可配制在“脂质体”中，所述脂质体是由多种类型的脂质、磷脂和/或表面活性剂组成的小囊泡，其可用于将药物(如本公开的抑制性肽)递送至哺乳动物。脂质体的组分通常以双层形式布置，类似于生物膜的脂质布置。
本公开的组合物可包括载体蛋白，如血清白蛋白(例如，HSA、BSA等)。可纯化或重组产生血清白蛋白。通过将药物组合物中的神经保护多肽与血清白蛋白混合，神经保护多肽可有效地“加载”到血清白蛋白上，允许更大量的神经保护多肽成功地递送到神经损伤的部位。
本公开的治疗神经损伤、神经疾病或神经变性疾病的方法可包括经由多种途径中的任何一种(包括静脉内(IV)、肌肉内(IM)、动脉内、髓内、鞘内、皮下(SQ)、心室内、经皮、皮间、皮内、通过气管内滴注、支气管滴注和/或吸入；作为鼻喷雾剂，和/或气雾剂，和/或通过门静脉导管)施用本公开的肽。可使用任何适当的施用部位。例如，组合物可局部地和直接地在需要采取行动的部位施用，或者可与实体附接或以其他方式结合(例如共轭)，这将有助于靶向身体中的适当位置。
在这些组合物中，可使用任何生理上相容的载体、赋形剂、稀释剂、缓冲液或稳定剂。合适的载体、赋形剂、稀释剂、缓冲液和稳定剂的实例包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等中的一种或多种，以及它们的组合。在一些情况下，可包括等渗剂，例如糖、多元醇(例如甘露醇、山梨醇)或氯化钠。在某些实施方案中，通过采用本领域中公知的程序可配制本公开的组合物，从而在施用于受试者后提供活性成分(本公开的肽，或其变体和/或另外的药物)的快速、持续或延迟释放。如上所述，在某些实施方案中，组合物为适于注射的形式，合适的载体可以任何合适的浓度存在，但示例性浓度为1％至20％，或5％至10％。
治疗组合物通常必须在制造和储存条件下是无菌和稳定的。实现这样的无菌性和稳定性的适当方式是本领域公知和描述的。
药物组合物通常配制成单位剂型，以便于施用和剂量的均一性。然而，可理解的是，本公开的组合物的每日(或其他)总用量会由主治医师在合理的医学判断范围内决定。任何特定受试者的特定治疗有效剂量水平会取决于多种因素，包括采用的组合物的活性；施用后组合物的半衰期；受试者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；施用的时间、施用的途径，以及肽和(如果使用的话)采用的另外的治疗剂的排泄速率；治疗的持续时间；与采用的特定化合物组合或巧合使用的药物；以及在医学领域公知的相似因素。此外，可从源自体外和/或体内动物模型的剂量-反应曲线外推有效剂量。
因此，本公开的肽和其他活性成分(如果包括的话)的合适剂量会因患者而异，并且还会取决于中风的严重性/阶段。在一些实施方案中，所述剂量构成治疗有效量或预防有效量，这取决于所涉及的治疗的性质。在相关实施方案中，剂量构成神经复原或恢复增强量。肽在个体中引发所希望的反应的能力也会是一个因素。示例性日剂量为：0.1至250mg/kg，或0.1至200或100mg/kg，或0.5至100mg/kg，或1至50或1至10mg/kg的活性成分。这可以作为单一单位剂量或作为一天施用多于一次的多个单位剂量，例如皮下、腹膜内或静脉内施用。然而，应该注意的是，适当的剂量可根据患者而变化，并且对于任何特定受试者，应该根据患者的个体需要随时间调整特定剂量方案。例如，剂量和施用方案可以随时间调整，或者随着患者在康复中的进展调整至少于每天一次，包括例如每隔一天，每周三次，或每周两次，或每周一次，或隔周一次等。因此，本文所述的剂量范围被视为示例性的，并不意欲限制所要求保护的组合物或方法的范围或实践。
用于治疗神经损伤、神经疾病或神经变性疾病的试剂盒
在一个方面，本发明进一步提供了用于治疗神经损伤、神经疾病或神经变性疾病的试剂盒，其包含本公开的肽或其变体，或包含它们的组合物。试剂盒可包括一种或多种其他元素，包括但不限于使用说明书；其他治疗剂(即，用于中风的组合或紧急治疗)；其他试剂，例如稀释剂、用于制备用来施用的组合物的其它材料或装置；药学可接受的载体；和用于施用于受试者的其他材料或装置。使用说明书可包括治疗应用的说明书，包括例如在本文所述的人类受试者中的建议剂量和/或施用的模式。在一些实施方案中，所述试剂盒用于本文所述的方法和用途，例如治疗、诊断或成像方法，或用于体外测定法或方法。
在一些实施方案中，该试剂盒用于诊断神经疾病、病症或受损，并且任选地包含使用所述试剂盒组分来诊断或评价所述神经疾病、病症或受损的严重性的说明书。
动物模型
如上所述，改善具有神经损伤(包括中风)的受试者的预后的一个主要障碍是缺乏治疗时间窗。到诊断时，中风受害者可能会持续造成永久性神经损坏。体外和体内实验成功与临床试验失望之间的差异可能是由当前实验设置在重建中风周围微环境方面效率低导致的。
动物中风的模型对于潜在治疗化合物的临床前测试是至关重要的。瞬时局灶性缺血模型被认为是中风和神经保护中的药物开发的金标准。本公开的TRPM2抑制肽在瞬时局灶性缺血模型中减少再灌注后的损伤。
因此，本公开的另一方面提供了筛选工具以通过破坏TRPM2通道的配体(ADP核糖)-结合口袋防止活化来鉴定特异性抑制TRPM2通道的小分子。该筛选工具包括筛选破坏克隆的TRPM2通道与本公开的TRPM2肽抑制剂(如tatM2NX)结合的分子。
实施例
提供以下实施例仅用于示例说明的目的，并不意欲限制本公开的范围。所有数据均以平均值±SEM表示。每个n代表用于体外实验的个体培养物和用于体内实验的个体动物。所有实验均以随机和盲化的方式进行，分析和手术由单独的研究者进行。对2组使用学生t-检验(未配对的，双尾的)和对超过2组的研究使用单因素方差分析(ANOVA)与Newman-Keuls事后分析来确定统计学显著性。统计学显著性建立在p<0.05。
实施例1：tat-M2NX在体外抑制人TRPM2通道
我们推断破坏ADPr结合口袋的模拟肽会是TRPM2通道的有力和特异性抑制剂。我们通过将对应于TRPM2通道C末端的NUDT9-H区的Nudix结构域(nudix结构域＝M2NX)的C末端的部分(1386-GSREPGEMLPRKLKRVLRQEFWV-OH(SEQ ID NO:1))与HIV的TAT诱导物YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO:2)融合来生成TRPM2的细胞可渗透肽抑制剂。我们预测M2NX肽会充当模拟肽，与NUDT9-H内的几个残基相互作用以破坏ADP核糖结合口袋。此外，生成了以杂乱序列(“tat-SCR”)含有相同氨基酸的对照肽。为了确定该肽构建体(具有SEQ ID NO:3(“tat-M2NX”)的序列)在物种间一致地抑制TRPM2通道的能力，我们使用人胚肾-293(HEK-293)细胞系，其稳定表达四环素诱导的人FLAG标记的TRPM2通道(hTRPM2)。
使用HEK-293细胞，其稳定表达FLAG标记的人TRPM2的四环素调节的巨细胞病毒驱动的转录。表达TRPM2的HEK-293细胞在5％CO2培养箱中在37℃在补充有10％胎牛血清、L-谷氨酰胺(2mM)和青霉素/链霉素(100单位/mL)的Dubelcco改良的Eagle培养基中生长。生长培养基补充有杀稻瘟素S(InvivoGen,5μg/mL)和Zeocin(InvivoGen,0.4mg/mL)以促进稳定的TRPM2表达。
在含有多西环素(1μg/mL)的培养基中，将HEK细胞以25,000个细胞/孔接种在涂布有聚-D-赖氨酸(0.1mg/mL)的96孔板中，以在实验前24小时驱动TRPM2表达。将细胞用具有tat-M2NX(25、50和100μM)、tat-SCR(25、50和100μM)或运载体的50μL含多西环素的培养基预温育2或5小时。在温育的最后30分钟期间，将Fluo-5F、AM(Life Technologies,10μM)、膜渗透性Ca2+指示剂添加到培养基中。将细胞洗涤两次并置于50μL盐水溶液(135mM NaCl,5mMKCl,1mM MgCl2,1mM CaCl2,10mM HEPES；pH 7.4)中。使用酶标仪(BioTek Synergy 2)和Gen5软件建立基线荧光以测量荧光(485/20,528/20)。将细胞每20秒暴露于激发波长2分钟，然后施加H2O2(200μM终浓度)或盐水(对照)至孔并且每20秒记录持续10分钟。
使用Ca2+指示剂Fluo-5F测量TRPM2通道活性，以监测在用200μM H2O2处理后检测到的荧光变化作为细胞内Ca2+的增加。暴露于H2O2增加表达hTRPM2的HEK-293细胞中的荧光，而未诱导的HEK-293细胞中未观察到变化，指示体外系统中通道的功能性(图1A和B)。表达hTRPM2的HEK-293在用100μM tat-M2NX温育2小时后具有降低的H2O2诱导的Ca2+流入，而用tat-SCR肽处理对经由TRPM2通道激活的H2O2-诱导的Ca2+流入没有作用。进一步的实验揭示了在表达hTRPM2的HEK-293细胞中暴露于25、50和100μM tat-M2NX后Ca2+流入的浓度依赖性降低(图1A和1B)。这些数据证明tat-M2NX抑制人TRPM2通道并提供另外的工具来评估缺血后TRPM2通道的作用。
实施例2：tat-M2NX减少雄性大脑而非雌性大脑中的梗死体积
本发明的发明人先前使用抗真菌克霉唑(CTZ)证明了体外TRPM2相关的神经保护和体内梗死体积的减少。为了研究tat-M2NX对中风后缺血性损伤的影响，我们对WT雄性和雌性小鼠进行了60分钟的短暂性中脑动脉闭塞(tMCAO)并分析了总半球梗死体积。在MCA闭塞前20分钟注射tat-M2NX或tat-SCR，并在再灌注后24小时分析梗死体积。
使用可逆MCAO通过先前描述的管腔内细丝技术诱导瞬时局灶性脑缺血(60分钟)(Shimizu T,Macey TA,Quillinan N,Klawitter J,Perraud A-LL,Traystman RJ,等Androgen and parp-1regulation of trpm2channels after ischemic injury.Journalof Cerebral Blood Flow&Metabolism.2013；33:1549-1555)。简言之，用通过面罩递送的异氟烷麻醉小鼠(5％诱导和1-2％维持)。使用邻近左鼓膜放置的探针监测头部温度，并使用直肠探针监测体温。在整个MCAO手术中使用电加热垫和加热灯将温度保持在36.5±1.0℃。将激光多普勒探针(模型，Moor Instruments，Oxford，England，UK)固定在右颅骨上以监测皮质灌注并验证血管闭塞和再灌注。在颈前部中间进行皮肤切口。在使用6-0丝线缝合右颈总动脉后，经由颈外动脉将6-0尼龙单丝与(聚)硅氧烷涂布的尖端插入右颈内动脉，直至激光多普勒血流仪(LDF)值降至小于基线的20％。将细丝固定到位后，用6-0丝线缝合切口。将每只小鼠置于单独的笼子中，在笼子下面有温水垫。在闭塞期结束时，将小鼠再次麻醉，同时将激光多普勒探针重新定位在右颅骨的相同部位上，并取出闭塞细丝用于再灌注。然后使小鼠在观察下恢复。
在相应的再灌注期后，用5％异氟烷麻醉小鼠并断头处理用于脑收集。如果观察到蛛网膜下腔出血，则将小鼠排除在研究之外。将每个大脑切成四个2mm厚的冠状切片。在37℃将切片置于1.2％的2,3,4-三苯基四唑氯化物中30分钟，并在10％福尔马林中固定24小时。将每个冠状切片染色并使用数码相机在两侧拍照，用ImageJ(NIH，Bethesda，MD，USA)测量梗死，并整合所有五个切片。为了包括水肿的影响，间接估计梗死体积并将其绘制为对侧结构的百分比并且表示为校正的半球梗死。
将tat-M2NX或tat-SCR肽溶解在盐水(5mg/mL)中，并在指定的时间以眼眶后(20mg/kg)注射。简言之，将动物在诱导箱中用4％异氟烷麻醉3分钟，并置于左侧位，头部面向右侧。将胰岛素注射器(BD Ultra-fine Needle 12.7mmx30G)以45°角插入眼球后空间。引入针尖以穿透眼眶后窦并注射溶液。注射后，小心地移除针头，保持斜面向外，以保护眼睛不被刮伤。
通过多普勒血流测量的雄性和雌性小鼠之间的MCA闭塞是相似的，并且tat-M2NX对生理变量如血压没有影响。用tat-M2NX治疗的雄性与tat-SCR相比显示出较小的梗死体积(分别为29.2±4.6％[n＝8]对43.4±3.2％[n＝8；p<0.01])(图1D))。相反，暴露于tat-SCR(46.6±2.1％[n＝7])或tat-M2NX(45.1±2.1％[n＝7],图1D)的雌性小鼠中中风后梗死大小没有差异。总之，这些数据证明了tat-M2NX在体内抑制TRPM2通道活性并产生雄性特异性神经保护的能力，如先前使用CTZ所述的。
实施例3：与TRPM2敲除相比，tat-M2NX没有提供进一步的保护
为了进一步表征tat-M2NX对TRPM2通道的特异性，我们比较了tat-M2NX与TRPM2敲除小鼠(TRPM2-/-)的神经保护功效。与WT雄性小鼠相比，在雄性TRPM2-/-中梗死体积减少，分别为27.3±5.1％(n＝8)对46.1±6.0％(n＝7；p<0.05)(图2)。在WT和TRPM2-/-雌性之间观察到的梗死体积没有差异(35.0±4.6％[n＝9]对44.2±3.2％[n＝6]，图2)。施用tat-M2NX没有进一步减少雄性TRPM2-/-的梗死体积，提供了tat-M2NX对TRPM2通道的特异性的进一步证据。
实施例4：tat-M2NX证明了与翻译相关的治疗窗口
中风的临床试验由于各种原因而失败，但许多失败是由于相关的治疗窗口所致。缺血性中风后药物干预的标准护理仍然是症状发作的3-4.5小时内给予的组织纤溶酶原激活物(tPA)。因此，我们测试了在WT雄性小鼠中再灌注后3小时(缺血发作后4小时)施用的tat-M2NX是否可提供神经保护。在再灌注后3小时静脉内施用tat-M2NX或tat-SCR，并在注射后24小时或96小时收集脑以分析梗死大小的程度。与tat-SCR相比，tat-M2NX在中风后24小时和96小时显著地减少梗死体积(图3C，24小时:tat-SCR 46.5±7.3％(n＝6)对tat-M2NX 28.3±13.5％(n＝7,p<0.05)；96小时:tat-SCR 41.4±8.0％(n＝8)对tat-M2NX23.8±12.5％(n＝8,p<0.05))。相反，在MCAO后3小时施用非选择性TRPM2抑制剂克霉唑(CTZ)对梗死体积没有影响(图3C，运载体47.0±9.9％与CTZ 46.8±7.4％)。这些数据显示出tat-M2NX不仅具有神经保护作用，而且具有比CTZ更宽的治疗窗口，且与tPA的临床干预相似。
实施例5：tat-M2NX在老年雄性小鼠中提供神经保护
在所有种族和两性中，中风的发病率随着年龄而增加。因此，我们测试了tat-M2NX是否会在老年小鼠中提供保护。对18-20个月龄的雄性和雌性小鼠进行60分钟MCAO，并且在再灌注后30分钟施用tat-M2NX或tat-SCR。24小时后分析梗死体积。与年轻成年的数据一致，给予tat-M2NX的老年雄性小鼠的梗死体积小于给予tat-SCR的老年雄性(分别为27.0±0.7％[n＝6]对34.6±1.7％[n＝6][图4]；p<0.01)。令人感兴趣的是，对照老年雄性小鼠(tat-SCR处理的)与年轻成年(YA)小鼠相比具有较小的梗死，与之前的报道(REFS：McCullough)一致(分别为27.0±0.7％[n＝6]对52.1±2.7％[n＝6]，(图4))。相反，与tat-SCR相比，tat-M2NX在老年雌性中不提供神经保护(40.2±4.0％[n＝6]对41.5±4.5％[n＝6]，图4)。总之，这些数据表明TRPM2通道有助于老年雄性(而非雌性)中中风后的急性缺血性细胞死亡。
实施例6：tat-M2NX阻断TRPM2通道并减少雄性而非雌性中的梗死体积
我们的研究利用老年动物来证明老年动物中的持续功效。虽然在临床前研究中需要老年动物研究，但相对较少的研究报道了年龄与治疗之间的相互作用。考虑到老年动物雄激素水平的变化以及雄激素相关途径激活TRPM2通道，这一问题特别相关。先前已经证明，雄性中TRPM2抑制后的保护需要雄激素的存在，因为阉割去除了保护并且DHT替代物挽救了CTZ施用后观察到的保护。我们推测老年雄性小鼠中的低雄激素会导致tat-M2NX神经保护的丧失。因此，我们评估了整个小鼠寿命期间睾酮和更高效力的二氢睾酮(DHT)的血清水平。
使用肝素化注射器，通过Avertin过量(腹膜内)处死一群幼年雄性小鼠，用于从心脏右心室收集血液样品。将血液样品在4℃以3300g离心10分钟以得到用于激素检测的血清。将血清储存在-80℃直至使用。按照制造商的方案进行睾酮(Calbiotech，SpringValley，CA，USA)和二氢睾酮(DHT，Alpha Diagnostic International，TX)的酶联免疫测定。
与年轻成年相比，老年小鼠中的睾酮水平降低(图5A)，然而在较高效力的二氢睾酮(DHT)方面跨年龄没有变化(图5B)，表明DHT水平保持足够高以参与老年雄性小鼠的TRPM2通道。总之，这里提出的数据代表了一项重要的临床前研究，该研究使用新的肽来阻断TRPM2通道并减少雄性(而非雌性)中的梗死体积。
实施例7：TRPM2抑制减少心脏停搏诱导的神经元损伤
测试34-聚物，本公开的TRPM2抑制剂：YGRKKRRQRRRGSREPGEMLPRKLKRVLRQEFWV(SEQ ID NO:3；“tat-M2NX”)的降低雄性和雌性小鼠中心脏停搏/心肺复苏(CA/CPR)诱导的神经元损伤的能力。为了确定保护功效，我们在雄性和雌性小鼠中从心脏停搏8分钟的复苏后30分钟经由静脉内(iv)注射施用20mg/kg乱序对照(tat-SCR)或20mg/kg tat-M2NX。复苏后3天使用苏木精和伊红(H&E)染色定量缺血性CA1神经元显示出静脉注射tat-M2NX对雄性小鼠中缺血性损伤提供强有力的保护(将损伤从tat-SCR处理的雄性中的44.9±7.5％(n＝12)减少至tat-M2NX处理的雄性的20.0±5.1％(n＝12，P<0.05)，而对雌性中的损伤没有作用(图6A、6B、7A、7B)。此外，正如我们之前在实验性中风中报道的，我们观察到TRPM2KO雄性小鼠中的CA1神经元损伤与雄性WT对照相比显著降低，而雌性TRPM2KO和WT小鼠中的CA1损伤没有差异。使用较低剂量的tat-M2NX生成的数据证明了雄性小鼠中MCAo后的神经保护，其剂量低至1mg/kg。
根据我们的报道，由CA/CPR诱导的缺血导致海马回突触可塑性受损至少30天，我们还观察到NMDA受体功能(或突触前释放，兴奋性)没有变化，暗示LTP中的其他信号传导途径受损。因此，为了开始确定tat-M2NX的急性施用是否在雄性动物中提供持续的功能益处，我们进行了CA1神经元的细胞外现场记录以测量在tat-SCR和tat-M2NX处理的小鼠中CA/CPR后的突触可塑性。记录Schaffer侧支(CA3轴突)至CA1场兴奋性突触后电位(fEPSP)。在假对照切片中，在20分钟稳定基线后，短暂的生理θ突发模拟(TBS：40个脉冲，10Hz)将fEPSP的斜率增加至161±9.2％(n＝6，与基线相比P<0.05)持续整个60分钟的记录，因此称为LTP(图7A-黑色痕迹)。相反，当细胞暴露于相同的TBS刺激时，从用对照肽(tat-SCR)处理的缺血后小鼠的脑切片获得的记录显示出LTP几乎完全丧失(7天：105.0±8.6％(n＝8)；30天：109.2±14.2％(n＝7；图2)，与假对照相比P<0.05)。重要的是，对照电生理学实验证明CA/CPR对突触前释放(PPR)、AMPA/NMDA比率或总体兴奋性(I/O)的影响最小10。来自CA/CPR后7或30天并用tat-M2NX(CA后30分钟)处理的小鼠的海马回切片的记录显示出TBS后的LTP与假对照无法区分(7天：188.1±22.0％(n＝5)；30天：184.0±13.8％(n＝5；图8A和8B)，与假对照相比均不显著，并且从每组基线P<0.05)。这些实验证明，缺血后施用tat-M2NX提供了突触功能的持续保护并改善认知结果。
实施例8：缺血后TRPM2通道持续活化的抑制改善了记忆功能和突触可塑性
为了评估TRPM2通道是否在突触可塑性中的缺血诱导的损伤中起作用，我们在患有缺血性脑损伤后几天获得脑切片中抑制TRPM2通道。与上述数据一致，在CA/CPR后7天从小鼠的脑切片中获得的记录显示出当细胞暴露于相同的TBS刺激时LTP几乎完全丧失，所述TBS刺激在假对照小鼠中刺激稳固的LTP(图9A和9B)。引人注意的是，TRPM2通道抑制剂克霉唑(CTZ；20μM)浴应用1小时逆转CA/CPR诱导的LTP丧失，恢复至149.8±26％(n＝3；与同一天从同一动物记录的成对的7天CA/CPR切片相比，P<0.05)。此外，我们做出了非常令人惊讶的观察结果，CTZ在雌性中同样有效地挽救了CA/CPR诱导的LTP丧失，恢复到150.1±17％(n＝2；图8B)。将缺血后切片在1μM tat-M2NX中温育2小时并测量突触可塑性。图8A(红色痕迹)显示在暴露tat-M2NX(n＝3)后逆转缺陷。这一激发性数据有两个主要启示：1)CA/CPR在雄性和雌性两者中引起海马回CA1神经元中的TRPM2通道的持续激活；2)在脑缺血后亚急性至慢性恢复期中海马回中的TRPM2通道活性抑制突触可塑性。
为了证实持续TRPM2通道活性在受损的突触可塑性中的作用，我们进行了另外的实验以评估延迟施用tat-M2NX以拯救体内海马回功能的能力。对小鼠进行8分钟心脏停搏和CPR，并在复苏后6天施用tat-M2NX(20mg/kg)。施用tat-M2NX后24小时(CA/CPR后7天)，获得急性海马回切片并进行现场记录以评估突触可塑性(LTP)。图9A和9B示例说明我们令人兴奋的发现，即体内延迟施用tat-M2NX逆转CA/CPR诱导的海马回LTP受损，恢复至171±11％(n＝6从用肽处理的4只小鼠记录；与7天CA/CPR切片相比P<0.05)。图9B进一步证明我们通过确认体内延迟的tat-M2NX治疗挽救了雄性和雌性小鼠中的突触可塑性，将雌性LTP恢复至170±16％(n＝3)来扩展该观察结果。tat-M2NX在体内逆转CA/CPR诱导的LTP受损的能力指示这是在延迟的时间点改善功能恢复的可行方法。图9A(红色痕迹)和9B显示出CA/CPR不损害雌性TRPM2-/-小鼠中的LTP，与TRPM2在不依赖于神经元损伤的受损LTP中的作用一致，因为雌性TRPM2-/-小鼠表现出与WT雌性小鼠相同程度的损伤。
重要的是，延迟施用tat-M2NX改善了缺血后小鼠的记忆功能。我们利用了完善的海马回记忆任务，情境恐惧条件反射(CFC)。简言之，将小鼠暴露于新的环境中，并在环境中适应后，给予轻微的足部休克(1mA)，然后使其返回其家笼。在足部休克后24小时，将小鼠再次置于CFC环境中，并在10分钟测试期间分析不动行为(freezing behavior)。环境记忆引起不动行为(图10A)，如在假小鼠中所见。相反，CA/CPR引起不动行为的显著降低(图10A)，指示记忆丧失。重要的是，在CA/CPR后7天(图10A)和30天(图10B)观察到海马回依赖性记忆缺陷。初步实验指示，延迟施用tat-M2NX(在第7天)改善记忆功能(图10A)，与我们上述的突触可塑性实验(图9A和9B)一致。
实施例9：TRPM2的抑制增强创伤性脑损伤(TBI)后的神经功能
使用中度/重度创伤性脑损伤的小鼠模型。使用受控皮质冲击(CCI)模型，并且在该模型中施用TBI后立即注射我们的tat-M2NX TRPM2抑制剂。在从TBI恢复后7天进行运动功能和记忆功能分析。使用圆筒测试分析运动功能，该测试测量肢体使用和对侧肢体使用的减少(在这种情况下由于R皮质损伤而使用左爪)，指示运动缺陷。记忆功能测试是上文描述的情景恐惧条件反射(CFC)任务。在TBI后用TRPM2抑制剂处理的小鼠(在记忆的情况下也是TRPM2KO小鼠)中，图11A显示出改善的运动功能且图11B显示出改善的记忆功能。另外，如图9中所示，TRPM2抑制逆转了TBI诱导的LTP缺陷。
实施例10：抑制TRPM2通道防止β-淀粉样蛋白诱导的突触可塑性降低
为了评估TRPM2通道是否在淀粉样蛋白诱导的突触可塑性损伤中起作用，我们抑制暴露于淀粉样蛋白β的脑切片中的TRPM2通道。在不存在或存在β-淀粉样蛋白和本公开的TRPM2肽抑制剂(tatM2NX)的情况下，从小鼠脑切片中获得的记录(图12A)显示出TRPM2通道抑制保护以免于β-淀粉样蛋白诱导的突触可塑性降低(图12B)，显示本公开的肽可用于治疗或减缓阿尔茨海默病的进展。
本公开不限于本文所述的具体实施方案的范围，所述具体实施方案旨在作为本公开的各个方面的单一说明，并且功能上等同的方法和组件/组分在本公开的范围内。实际上，除了本文所示和所述的那些之外，本公开的各种修改对于本领域技术人员而言会从前面的描述和附图而变得显而易见。这样的修改意欲落入权利要求的范围内。
序列表
<110> 科罗拉多州立大学董事会法人团体(THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OFCOLORADO, A BODY CORPORATE)
P·S·赫森(HERSON, Paco S.)
<120> 用于治疗神经损伤的基于肽的方法
<130> 2848-202-PCT
<140> 尚未分配
<141> 2017-02-23
<160> 11
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 1
Gly Ser Arg Glu Pro Gly Glu Met Leu Pro Arg Lys Leu Lys Arg Val
1 5 10 15
Leu Arg Gln Glu Phe Trp Val
20
<210> 2
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 2
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1 5 10
<210> 3
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 3
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Ser Arg Glu Pro
1 5 10 15
Gly Glu Met Leu Pro Arg Lys Leu Lys Arg Val Leu Arg Gln Glu Phe
20 25 30
Trp Val
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<400> 4
Xaa Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1 5 10
<210> 5
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 5
Phe Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1 5 10
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 6
Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1 5 10
<210> 7
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 7
Gly Ser Ser Ser Ser
1 5
<210> 8
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 8
Thr Gly Glu Lys Pro
1 5
<210> 9
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 9
Gly Gly Arg Arg Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 10
Leu Arg Gln Arg Asp Gly Glu Arg Pro
1 5
<210> 11
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 11
Gly Ser Arg Val Gln Ile Arg Cys Arg Phe Arg Asn Ser Thr Arg
1 5 10 15

Claims (52)

1.一种抑制TRPM2蛋白离子通道的活性的方法，其包括破坏TRPM2蛋白的ADP-核糖结合位点。
2.权利要求1的方法，其中所述破坏包括使所述TRPM2蛋白与减少或防止使ADP-核糖结合至所述TRPM2蛋白的药剂接触。
3.权利要求2的方法，其中所述药剂结合至所述TRPM2蛋白的Nudix结构域。
4.权利要求2的方法，其中所述药剂结合至所述TRPM2通道的羧基末端。
5.权利要求2的方法，其中所述药剂减少通过所述TRPM2蛋白通道的钙离子的通量。
6.一种治疗或预防神经损伤或神经病症的方法，其包括在需要所述的治疗的哺乳动物中抑制通过TRPM2蛋白离子通道的钙离子的通量。
7.权利要求6的方法，其中所述抑制包括向所述哺乳动物施用破坏TRPM2蛋白的ADP-核糖结合位点的药剂。
8.权利要求7的方法，其中所述药剂减少或防止ADP-核糖结合至所述TRPM2蛋白。
9.权利要求7的方法，其中所述药剂结合至所述TRPM2蛋白的Nudix结构域。
10.权利要求7的方法，其中所述药剂结合至所述TRPM2通道的羧基末端。
11.一种分离的肽，其包含氨基酸序列GSREPGEMLPRKLKRVLRQEFWV(SEQ ID NO:1)或其多聚体、衍生物或变体。
12.权利要求11的肽，其中所述肽连接至选自下组的内化肽：HIV TAT序列(YGRKKRRQRRR；SEQ ID NO:2)，或其变体，XGRKKRRQRRR(SEQ ID NO:4；其中X是除Y之外的氨基酸)，FGRKKRRQRRR(SEQ ID NO:5)，GRKKRRQRRR(SEQ ID NO:6)和GSRVQIRCRFRNSTR(SEQID NO:11)。
13.权利要求12的肽，其中所述肽通过选自Gly(Ser)4(SEQ ID NO:7)、TGEKP(SEQ IDNO:8)、GGRRGGGS(SEQ ID NO:9)和LRQRDGERP(SEQ ID NO:10)的接头连接至所述内化肽。
14.权利要求11的肽，其中所述肽包含SEQ ID NO:1的二聚体、三聚体或四聚体的至少一种。
15.权利要求11的肽，其中所述肽包含具有序列YGRKKRRQRRRGSREPGEMLPRKLKRVLRQEFWV(SEQ ID NO:3)的肽，或由所述肽组成。
16.权利要求11的肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性，和抑制通过TRPM2蛋白离子通道的钙离子的通量的能力。
17.权利要求11的肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少95％氨基酸序列同一性，和抑制通过TRPM2蛋白离子通道的钙离子的通量的能力。
18.权利要求11的肽，其包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列相比1-3个保守氨基酸取代，和抑制通过TRPM2蛋白离子通道的钙离子的通量的能力。
19.权利要求11的肽，其包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列相比1个保守氨基酸取代，和抑制通过TRPM2蛋白离子通道的钙离子的通量的能力。
20.权利要求11的肽，其包含选自磷酸化和糖基化的修饰，和抑制通过TRPM2蛋白离子通道的钙离子的通量的能力。
21.权利要求11的肽，其连接至聚乙二醇(PEG)分子，并且具有抑制通过TRPM2蛋白离子通道的钙离子的通量的能力。
22.权利要求21的肽，其中所述PEG分子中的乙二醇(EG)单元的数目为460-1840。
23.权利要求11的肽，其连接至人IgG免疫球蛋白的Fc区的一个或多个结构域，并且具有抑制通过TRPM2蛋白离子通道的钙离子的通量的能力。
24.权利要求23的肽，其中所述Fc区是人IgG铰链、CH2和CH3区，其融合至所述肽的氨基末端或羧基末端的至少一个。
25.权利要求11的肽，其连接至包含6-50个氨基酸残基的表位标签多肽，并且具有抑制通过TRPM2蛋白离子通道的钙离子的通量的能力。
26.权利要求11的肽，其连接至固体载体。
27.权利要求26的肽，其中所述固体载体包含玻璃、多糖、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和(聚)硅氧烷的至少一种。
28.一种核酸分子，其编码权利要求11-27中任一项的肽的至少一种。
29.一种表达载体，其包含权利要求26的核酸分子，所述核酸分子可操作地连接至控制序列用于表达权利要求11-27中任一项的肽。
30.一种宿主细胞，其包含权利要求29的表达载体。
31.一种组合物，其包含权利要求11-27中任一项的肽，和至少一种药学上可接受的赋形剂。
32.权利要求31的组合物，其进一步包含另外的治疗剂。
33.权利要求32的组合物，其中所述治疗剂是抗凝血剂或血块溶解药物、ACE抑制剂、血液稀释剂或抑制素。
34.权利要求33的组合物，其中所述药剂是阿司匹林(aspirin)、氯吡格雷(clopidogrel)、组织纤溶酶原激活物(tPA)、赖诺普利(lisinopril)，华法林(warfarin)，肝素(heparin)，阿哌沙班(apixaban)，阿托伐他汀(atorvastatin)，瑞舒伐他汀(rosuvastatin)，厄贝沙坦(irbesartan)或阿替普酶(alteplase)。
35.一种用于治疗或预防受试者中的神经损伤或神经病症的方法，其包括向所述受试者施用权利要求11-25中任一项的肽，或权利要求31-34中任一项的组合物。
36.权利要求25的方法，其中施用的肽包含氨基酸序列GSREPGEMLPRKLKRVLRQEFWV(SEQID NO:1)。
37.权利要求35或36的方法，其中所述神经损伤由脑缺血造成。
38.权利要求37的方法，其中所述脑缺血继发于心脏停搏。
39.权利要求35或36的方法，其中所述神经损伤由外伤性脑损伤(TBI)造成。
40.权利要求39的方法，其中所述受试者在外伤性脑损伤后经过康复。
41.权利要求35或36的方法，其中所述神经病症是神经变性疾病，并且所述施用防止或减慢神经变性疾病的进展。
42.权利要求41的方法，其中所述神经变性疾病是阿尔茨海默病。
43.权利要求42的方法，其中所述施用减小所述受试者中的神经元中的β-淀粉样蛋白毒性。
44.权利要求42的方法，其中所述施用改善所述受试者中的年龄依赖性空间记忆。
45.权利要求41的方法，其中所述神经变性疾病是帕金森病。
46.权利要求45的方法，其中所述施用减少所述受试者中的多巴胺能神经元的凋亡。
47.权利要求35或36的方法，其中所述施用增强所述受试者中的突触功能和/或记忆。
48.权利要求35-47中任一项的方法，其中所述施用是经肠胃外的。
49.权利要求35-47中任一项的方法，其中所述施用在所述受试者中的神经损伤的8小时内。
50.权利要求25-47中任一项的方法，其中所述施用在所述受试者中的神经损伤的8天内。
51.权利要求35-47中任一项的方法，其中所述施用在所述受试者中的持续神经损伤后1周或更久。
52.权利要求35-48中任一项的方法，其中所述受试者是人。
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