CN102317320A - 能够结合于VEGF-A和TNF-α的融合蛋白 - Google Patents

能够结合于VEGF-A和TNF-α的融合蛋白 Download PDF

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Abstract

本申请描述了编码能够同时结合于VEGF多肽和TNF多肽的分离的核酸分子，包括：操作性地连接于(b)编码多聚组件的核苷酸序列的(a)编码TNFR2组件和VEGFR1组件的核苷酸序列，其中TNFR2组件基本上由编码TNFR2胞外域的富半胱氨酸结构域1、富半胱氨酸结构域2、富半胱氨酸结构域3和富半胱氨酸结构域4的氨基酸序列的核苷酸序列组成，而其中VEGFR1组件基本上由编码VEGFR1胞外域的Ig样结构域2的氨基酸序列的核苷酸序列组成。

Description

能够结合于VEGF-A和TNF-α的融合蛋白
技术领域
本发明涉及能够同时结合于血管内皮生长因子(VEGF)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的融合蛋白，在本文中被称为“靶向VEGF-A和TNF-alpha(TNF-α)的双重抗炎-血管生成蛋白或“Valpha””。公开了Valpha对于治疗与VEGF-A和TNF-α相关的疾病与病症具有治疗性用途，如类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病、糖尿病和年龄性(老年性)黄斑退化性视网膜病变、癌症、硬化、炎性肠病、多囊肾、强直性脊柱炎、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎和动脉粥样硬化、以及其他急性和慢性炎症。
背景技术
血管内皮生长因子-A(VEGF-A)在血管内皮细胞的生长、迁移和存活中起着至关重要的作用，生长、迁移和存活主要通过VEGFR1和VEGFR2的活化进行，其是血管生成和血管发生的必要过程(Ferrara N.等，Nature Medicine 9：669-676，2003；Shibuya M和Claesson-Welsh L，Exp.Cell Res.312：549-560，2005)。VEGF是肿瘤血管生成和转移、类风湿性关节炎中的异常和炎性血管生成、骨关节炎、银屑病、糖尿病和年龄性黄斑退化性视网膜病变的主要分子(Ferrara N.等，Nature Medicine 9：669-676，2003；DeBandt M.等，J Immunol.171：4853-4859，2003；Aiello LP.N.Engl.J.Med.353：839-841，2005)。
肿瘤坏死因子-α(TNF-α)通过将白细胞募集至炎症部位而介导免疫应答(Hickey MJ.等，J Immunol 158：3391-3400，1997)。TNF-α是通过在包括巨噬细胞、内皮细胞和树突细胞的炎性细胞中活化NF-κB而引发炎症的主要分子(Rojanasakul Y.等，Mol.Cell.Biochem.200：119-125，1999)。
在与炎性血管生成有关的疾病，例如类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病、糖尿病和年龄性黄斑退化性视网膜病变、癌症、硬化、炎性肠病、多囊肾、强直性脊柱炎、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎和动脉粥样硬化、以及其他急性和慢性炎症中，VEGF-A和TNF-α的水平升高是主要决定因素。因此，在治疗这些疾病时，同时抑制VEGF和TNF-α会比单独抑制VEGF或TNF-α更加有效。
发明内容
本发明提供了能够同时结合于血管内皮生长因子(VEGF)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的融合蛋白，即“靶向VEGF-A和TNF-alpha的双重抗炎-血管生成蛋白—‘Valpha’”。公开了Valpha对于治疗与VEGF-A和TNF-α相关的疾病和病症具有治疗性用途，如类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病、糖尿病和年龄性黄斑退化性视网膜病变、癌症、硬化、炎性肠病、多囊肾、强直性脊柱炎、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎和动脉粥样硬化、以及其他急性和慢性炎症。
一方面，本发明涉及编码能够结合于VEGF-A和THF-α多肽的多肽的分离的核酸分子，其包括编码VEGFR1组件和TNFR2组件的核苷酸序列。编码多聚组件的核苷酸序列可连接于编码VEGFR1组件和TNFR2组件的核苷酸序列。多聚组件可以是免疫球蛋白功能区。一方面，免疫球蛋白功能区可以是IgG的Fc结构域、IgG的重链、或IgG的轻链。
另一方面，在核酸分子中，VEGFR1组件和TNFR2组件可包括编码VEGFR1和TNFR2胞外域的氨基酸序列的核苷酸序列。
另一方面，本发明涉及分离的核酸或多肽分子，其包括如下的核苷酸序列或氨基酸序列：
(a)表1中列出的核苷酸和氨基酸序列称为Valpha FV#1，其包括第1至22的hTNFR2信号序列氨基酸(第1至66个核苷酸)，其取自原始hTNFR2构建体中的第1至22个氨基酸(第1至66个核苷酸)；第23至257的hTNFR2氨基酸(第67至771个核苷酸)，其取自原始hTNFR2构建体中的第23至257个氨基酸(第67至771个核苷酸)；第258至351的hVEGFR1氨基酸(第772至1053个核苷酸)，其取自原始hVEGFR1构建体中的第132至225个氨基酸(第394至675个核苷酸)；以及第352至581(第1054至1743个核苷酸)的人IgG氨基酸的Fc结构域；
(b)表2中列出的核苷酸和氨基酸序列称为Valpha VF#1，其包括第1至26的hVEGFR1信号序列氨基酸(第1至78个核苷酸)，其取自原始hVEGFR1构建体中的第132至225个氨基酸(第394至675个核苷酸)；第27至120的hVEGFR1氨基酸(第79至360个核苷酸)，其取自原始hVEGFR1构建体中的第132至225个氨基酸(第394至675个核苷酸)；第121至355的hTNFR2氨基酸(第361至1065个核苷酸)，其取自原始hTNFR2构建体中的第23至257个氨基酸(第67至771个核苷酸)；以及第356至585(第1066至1755个核苷酸)的人IgG氨基酸的Fc结构域；或
(c)由于遗传密码的简并而与核苷酸序列(a)或(b)的核苷酸序列不同但编码与其表达相同的氨基酸序列的核苷酸序列。
本发明还涉及包括如上所述的核酸分子的载体。载体可以是表达载体。
本发明还涉及用于在合适的宿主细胞中产生融合多肽的宿主-载体系统，其包括如上所述的表达载体。这样的合适的宿主细胞可包括细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、或哺乳动物细胞。
本发明还涉及由如上所述的任意分离的核酸分子编码的融合多肽，包括但不限于Valpha FV#1和Valpha VF#1的氨基酸序列。
本发明还涉及能够同时结合于VEGF-A和TNF-α分子以形成无功能的复合物的组合物。该分子可包括如上所述的融合多肽的多聚体，包括但不限于那些使用VEGFR1和TNFR2组件的融合构建体。特别地，该多聚体可为二聚体。
另一方面，本发明涉及产生融合多肽的方法，其包括在允许融合多肽产生并回收如此产生的多肽的条件下，使如上所述的宿主-载体系统的细胞生长。这样的融合多肽可通过乙酰化或聚乙二醇化进行修饰。可使用范围为至少约10倍摩尔过量至约100倍摩尔过量的摩尔过量的乙酰化试剂来实现乙酰化。聚乙二醇化可使用10K或20K的PEG。
又一个方面，本发明涉及减少或抑制哺乳动物中血浆渗漏(血浆渗出，plasma leakage)的方法，包括向对其有需要的哺乳动物给予有效量的本文所述的融合多肽。在一个优选的实施方式中，渗漏可能发生在视网膜中。
又一方面，本发明涉及阻断哺乳动物中的血管生长的方法，包括向对其有需要的哺乳动物给予有效量的本文所述的融合多肽。其中，在某些方面，血管生长阻断活性可用于治疗癌症、年龄相关性黄斑变性、糖尿病视网膜病变、类风湿性关节炎、银屑病、急性和慢性炎症、动脉粥样硬化和淋巴增生性疾病。
又一方面，本发明涉及减弱或阻止哺乳动物中肿瘤生长的方法，包括向有需要的哺乳动物给予有效量的本文所述的融合多肽。
另一方面，本发明涉及减轻或阻止哺乳动物水肿的方法，包括向有需要的哺乳动物给予有效量的本文所述的融合多肽。水肿可以是视网膜水肿或脑水肿。
另一方面，本发明涉及减轻或阻止哺乳动物中腹水形成的方法，包括向有需要的哺乳动物给予有效量的本文所述的融合多肽。腹水可能与卵巢癌有关。本发明还涉及抑制哺乳动物中VEGF受体配体和TNF受体配体活性的方法，包括向哺乳动物给予有效量的本文所述的融合多肽。
另一方面，本发明涉及减轻或阻止哺乳动物中炎性血管生成的方法，包括向有需要的哺乳动物给予有效量的本文所述的融合多肽。由炎性血管生成引起的病症的一个例子是类风湿性关节炎。由炎性血管生成引起的病症的其他例子包括但不限于，脊椎关节病、银屑病、糖尿病视网膜病变、动脉粥样硬化、和败血症。
附图说明
通过下文的详细描述将更充分地理解本发明，仅以描述的方式给出附图，而不限制本发明，其中：
图1示出了人VEGFR1及其三个主要区域的示意图：由七个免疫球蛋白(Ig)样结构域组成的胞外域、跨膜域、和胞内域。图1还示出了人TNF受体1(TNFR1)或2(TNFR2)及其三个主要区域的示意图：由四个富半胱氨酸结构域组成的胞外域、跨膜域、和胞内域。
图2示出了通过结合VEGFR1的最低配体结合域(Mbd-VEGFR1)、TNFR2的最低配体结合域(Mbd-TNFR2)、和人IgG的Fc部分来制备Valpha的示意图。TNFR2的四个富半胱氨酸结构域对于TNF-α的结合是必要的，而VEGFR1的Ig样结构域2(Ig2)对于VEGF-A的结合是必要的。基本上，Mbd-TNFR2位于氨基末端部分，VEGFR1的Ig2位于中间部分，人IgG的Fc部分位于Valpha的羧基末端部分，Valpha是VEGF和TNF-α的双重阻断剂并且起到抗炎和抗血管生成蛋白的作用。Valpha的估计分子量为～65kD，Valpha的理论pI值为7.14。
图3示出了利用哺乳动物细胞培养体系进行Valpha蛋白表达的基因构建体、pCMV-dhfr、pCMV-dhfr-Fc、pCMV-dhfr-Valpha的示意图。将编码人IgG的Fc亚结构域的基因插入到pCMV-dhfr中之后，将编码Valpha的基因插入到pCMV-dhfr-Fc中。使用标准的分子方法以生成pCMV-dhfr-Valpha基因构建体。EcoRI和XhoI是主要的限制性内切酶位点。
图4示出了在HEK293细胞中短暂表达的TNFR2-Fc、VEGFR3-Fc、Tie2-Fc、和Valpha蛋白的蛋白印迹分析。TNFR2-Fc(1-257)和Valpha的表达和分泌水平高于VEGFR3-Fc(1-329)和Tie2-Fc(1-348)。
图5A-图5C示出了在还原和非还原条件下的纯化的Valpha蛋白(A)，以及在还原条件下的BSA(牛血清白蛋白)、Valpha和ENBREL
Figure BDA0000082687170000051
(依那西普)(B)和Valpha的等电聚焦(C)的SDS-PAGE凝胶的考马斯染色。
图6示出了基于已建立的ELISA方法进行的Valpha与VEGF-A结合实验的示意图。
图7示出了基于已建立的ELISA方法进行的Valpha与TNF-α结合实验的示意图。
图8示出了使用标准ELISA方法检测Fc融合蛋白的结合实验的示意图。
图9示出了Valpha与VEGF-A和TNF-α的体外结合实验。用0.01～10nM的Valpha、VEGF-Trap和TNFR2-FC对涂覆VEGF-A或TNF-α的板进行孵化以进行VEGF-A结合，或用0.03～30nM以进行TNF-α结合。VEGF-Trap和Valpha显示了VEGF-A结合而TNFR2-Fc和Valpha显示了TNF-α结合。Valpha对VEGF-A的结合亲和力比VEGF-Trap稍弱，而Valpha对TNF-α的结合亲和力与TNFR2-Fc相似。
图10示出了高级夹心ELISA结合实验的示意图，用以验证Valpha与VEGF-A和TNF-α的同时结合。
图11示出了高级夹心ELISA实验的结果，其表明Valpha与VEGF-A和TNF-α的同时结合。
图12示出了VEGF-Trap、ENBREL
Figure BDA0000082687170000061
和Valpha与VEGF和TNF-α结合模型的示意图。
图13A-图13B示出了用于检测Valpha与VEGF-A(A)或TNF-α(B)之间的结合亲和力的表面等离子共振分析。对于VEGF-A结合，Valpha的KD值为6.54×10-12M，而VEGF-Trap的KD值为1.35×10-12M。对于TNF-α结合，Valpha的KD值为6.41×10-10M，而ENBREL的KD值为2.29×10-10M。
图14A-14B示出了体外划痕试验(scratch assay)，用以在培养的HUVEC中的VEGF-A诱导的细胞迁移中考察Valpha。注意到由VEGF-A处理而诱导的细胞迁移活性受到Valpha或VEGF-Trap的抑制(B)，但不受TNFR2-Fc蛋白的抑制(A)。
图15A-图15F示出了对L929鼠纤维肉瘤的TNF-α诱导的细胞毒性的代表性照片。(A)为对照，未经处理的细胞。在TNF-α处理的细胞样品中观察到适度的死亡漂浮细胞(B)，而在放线菌素-D(AMD)的存在下，该TNF-α诱导的细胞毒性得到提高(C)。TNF-α和AMD与TNFR2-Fc(E)或Valpha(F)的共同处理减弱TNF-α诱导的细胞毒性，而与Fc蛋白(D)共同处理未改变TNF-α诱导的细胞毒性。
图16A-图16B示出了在L929鼠纤维肉瘤细胞中的TNF-α诱导的细胞毒性中有关Valpha的影响的MTT实验。图16A示出了通过给予连续稀释的TNF-α(从10ng/ml至0.0005ng/ml)而诱导的细胞毒性的程度。图16B示出了Valpha、ENBREL、英夫利西单抗(类克(REMICADE))，和VEGF-Trap对TNF-α(5ng/ml)诱导的细胞毒性的不同抑制。
图17描绘了在由对照(BSA)、LPS、TNF-α、或TNF-α+Valpha处理的人淋巴内皮细胞中NF-κB的p65易位的代表性图像。注意到LPS和TNF-α强力诱导p65的核易位(白色箭头)，而Valpha强烈抑制TNF-α诱导的p65的核易位(TNF-α诱导的NF-κB活化)。
图18示出了产生小鼠视网膜病变的示意图，称为早产儿视网膜病变(ROP)或氧诱导的视网膜病变(OIR)模型。将出生后在正常气氛(常氧)中生长的7天(P7)大的小鼠转移并使其生活在高氧条件(75％O2)下5天(P12)，然后转移回到常氧条件下，并允许其生活随后的5天(P17)。在P17，检测到在视网膜血管的中间和远端部分形成严重的血管丛，而在视网膜的近端部分未检测到血管(血管闭塞)。
图19A-图19B示出了在小鼠ROP模型中对照、VEGF-Trap、ENBREL
Figure BDA0000082687170000071
、或Valpha对视网膜血管渗漏(A)以及视网膜中血管丛形成(B)的影响。显示了在视网膜后表面的出血性血管渗漏(白色箭号)的光学显微分析(图19A)和视网膜前血管丛形成的免疫组织分析(白色箭头)(图19B)。
图20A-图20B示出了Valpha对使用小鼠的视网膜病变模型的改善的效果的代表性照片(A)，以及示出了对照、Valpha和VEGF-Trap的新血管形成的柱状图(B)。
图21A-图21C示出了Valpha对使用小鼠的胶原诱导的关节炎(CIA)模型的改善效果。显示了给予对照、VEGF-Trap、ENBREL
Figure BDA0000082687170000072
或Valpha的小鼠的照片(A)；给予对照、VEGF-Trap、ENBREL
Figure BDA0000082687170000073
或Valpha的平均关节炎得分图表(B)；以及显示了给予对照、VEGF-Trap、ENBREL
Figure BDA0000082687170000074
或Valpha的后爪厚度测量图表(C)。
图22A-图22B示出了关于对照、VEGF-Trap、ENBREL
Figure BDA0000082687170000075
或Valpha对胶原诱导的关节炎(CIA)小鼠模型的放射照相分析(A)；以及示出了给予对照、VEGF-Trap、ENBREL
Figure BDA0000082687170000076
或Valpha的总平均放射得分(B)。
具体实施方式
在本申请中，“一个”和“一种”用来指代单数和复数个对象。
如本文中所使用的，“约”或“基本上”通常提供余地以避免局限于确切的数目。例如，如多肽序列长度的上下文中所使用，“约”或“基本上”表明多肽不限于所列举的氨基酸数量。只要功能性活性如其结合活性存在，可在N末端或C末端添加或去除一些氨基酸。
如本文中所使用的，“联合”给予一种或多种另外的治疗剂包括同时(同步)和以任意顺序序贯给予。
如本文中所使用的，“氨基酸”是指所有天然存在的L-α-氨基酸。该定义意在包括正亮氨酸、鸟氨酸、和同型半胱氨酸。
如本文中所使用的，术语“氨基酸序列变异体”通常是指与参比多肽(例如，天然序列)相比，其氨基酸序列具有某些差异的分子。氨基酸的改变可以是天然氨基酸序列中的置换、插入、缺失或这些变化的任意所需的组合。
置换的变异体是从天然序列中移除至少一个氨基酸残基并在相同的位置插入不同的氨基酸的变异体。置换可能是单个的，其中分子中仅有一个氨基酸被置换，或可以是多个，其中同一分子中的两个或多个氨基酸被置换。
序列中的氨基酸的置换物可选自与该氨基酸所属类型的其他成员。例如，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。极性的中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬氨酸和谷氨酰胺。带正电的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。包括在本发明范围内的还有表现出相同或相似的生物学活性的蛋白或其片段或衍生物，以及在翻译期间或之后进行了不同修饰的衍生物，例如，通过糖基化、蛋白水解断裂、与抗体分子或其他细胞配体连接等。
插入的变异体是具有在天然序列的特定位置处紧邻一氨基酸插入一个或多个氨基酸的变异体。紧邻一氨基酸是指与氨基酸的α-羧基或α-氨基官能团连接。
缺失的变异体是从天然氨基酸序列移除一个或多个氨基酸的变异体。通常，缺失的变异体在分子的特定区域有一个或两个氨基酸被删除。
如本文中所使用的，“拮抗剂”是指作为结合于细胞受体而不引起生物应答的配体倾向于抵消另一个配体的作用的配体。
本发明优选的配体的生物活性包括抑制血管通透性的能力和减轻炎症的能力。抑制血管通透性的能力可用于治疗诸如糖尿病视网膜病变、水肿和腹水的医学疾病或病症。本发明优选的配体的生物活性包括维持内皮细胞完整性的能力(包括阻止细胞凋亡)。减轻炎症的能力可用于治疗诸如类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病、炎性肠病、强直性脊柱炎、克罗恩氏病和溃疡性结肠炎的医学疾病或病症。
还考虑用可检测的标记，如放射性同位素、荧光标记、酶标记、或化学发光标记对融合蛋白进行标记，以确定配体-受体结合的相互作用。同样地，还考虑了采用嵌合分子的试验系统。
如本文中所使用的，“载体”包括药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂，当细胞或哺乳动物暴露于所采用的剂量和浓度下时是无毒的。通常药学上可接受的载体是水性pH缓冲溶液。药学上可接受的载体的实例包括但不限于缓冲溶液，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖、和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂如EDTA；糖醇如甘露醇或山梨醇；成盐抗衡离子如钠；和/或非离子表面活性剂，如吐温
Figure BDA0000082687170000091
(TWEEN
Figure BDA0000082687170000092
)、聚乙二醇(PEG)和普朗尼克
Figure BDA0000082687170000093
(PLURONICS)。
如本文中所使用的，当“基本上由……组成”用在核酸序列的上下文中时，是指实施由该核酸编码的氨基酸的预期功能所必需的序列。
如本文中所使用的，“有效量”是足够产生有利或所需的临床或生化结果的量。可给予有效量一次或多次。对于本发明的目的，抑制剂化合物的有效量是足以缓和、改善、稳定、扭转、减慢或延缓病情进展的量。
如本文中所使用的，“片段”或“功能性衍生物”是指本发明的生物活性氨基酸序列变异体和天然配体或受体的片段，以及共价修饰，包括与有机衍生化试剂反应、翻译后修饰而获得的衍生物、具有非蛋白性聚合物的衍生物、和免疫粘附素。
如本文中所使用的，“宿主细胞”包括能够或已作为本发明的载体的受体的单个细胞或细胞培养物。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，并且该后代由于自然的、偶然的或有意的突变和/或改变而不一定与原始的亲代细胞完全相同(在形态学上或总DNA互补上)。
如本文中所使用的，“配体”是指任意分子或试剂、或与诸如多肽分子共价地或短暂地特异性结合的化合物。当用在特定语境中时，配体可包括抗体。在其他语境中，“配体”可以是指具有高亲和力其他分子试图结合的分子，如在配体阱(ligand trap)中。
如本文中所使用的，出于治疗目的的“哺乳动物”是指任何被分类为哺乳动物的动物，包括人、家畜和耕畜，以及动物园、体育或玩赏的动物，如狗、猫、牛、马、羊、猪等。优选地，哺乳动物是人。
如本文中所使用的，“药学上可接受的载体和/或稀释剂”包括任意和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。这些介质和药剂在药物活性物质中的使用是本领域公知的。除任何与活性成分不相容的常规介质或药剂以外，可考虑将其用于治疗组合物中。辅助活性成分也可结合于该组合物中。
为了方便给予和剂量的均一性，以单位剂型配制成肠胃外组合物是尤为有利的。此处所使用的单位剂型是指对于接受治疗的哺乳动物受试者而言，适合作为单位剂量的物理离散单元；每个单位含有经过计算以与所需药物载体联合产生所需的治疗效果的预定量的活性物质。本发明的单位剂型的规格由以下方面规定并直接取决于以下方面：(a)活性物质的独特性质和所要达到的特定治疗效果，和(b)调剂这样的活性物质以用于治疗因患病而身体健康受损的活体受试者中的疾病时的本领域固有局限性。
调剂主要活性成分是为了方便有效的将与合适的药学上可接受的载体以单位剂型一起给予有效量的该主要活性成分。单位剂型可包含，例如，剂量范围为0.5μg至约2000mg的主要活性化合物。以比例的方式表示的话，活性化合物通常以约0.5μg/ml载体的量存在。在含有辅助活性成分的组合物的情况下，通过参考所述成分的常用剂量和给予方式来确定剂量。
如本文中所使用的，“样品”或“生物样品”是指其最广泛的意义，并且根据所要进行实验的类型，包括从个体、体液、细胞系、组织培养物、或从可能含有任何TNF-α或VEGF-A结合肽的其他来源获得的任意生物样品。如前所述，生物样品包括体液，如精液、淋巴液、血清、血浆、尿液、滑液、脊髓液等。从哺乳动物获得组织活检切片和体液的方法是本领域公知的。
如本文中所使用的，“受试者”是脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人。
如本文中所使用的，“同时”或“同时地”结合是指蛋白同时结合于两种或多种指定的蛋白，如果该蛋白可用于结合的话。
如本文中所使用的，“治疗”是获得有益或所需的临床结果的方法。对于本发明的目的，有益或所需的临床结果包括但不限于，可检测或无法检测的症状的减轻、疾病程度的减弱、病情的稳定(即，不恶化)、病程进展的延缓或减慢、病情的改善或减缓、以及缓解(部分或全部)。“治疗”也可以是指与未接受治疗的预期存活期相比，存活期的延长。“治疗”是指治疗性处理和预防性或预防措施。需要治疗的受试者包括已患病受试者以及需要预防疾病的受试者。“减轻”疾病意味着与未接受治疗的情况相比，病情的程度和/或不希望的临床表现减少和/或进展的时间进程减慢或延长。
如本文中所使用的，“载体”、“多聚核苷酸载体”，“构建体”和“多核苷酸构建体”在本文中可互换使用。本发明的多核苷酸载体可以几种形式中的任一种存在，包括但不限于RNA、DNA、包封在逆转录病毒包被中的RNA、包封在腺病毒包被中的DNA、包裹在其他病毒或类病毒形式(如单纯疱疹病毒)中以及腺结构(如聚酰胺)中的DNA。
序列表自由文本
对于不同于a、g、c、t的核苷酸符号的使用，根据WIPO标准ST.25，附录2，表1的规定，其中k代表t或g；n代表a、c、t或g；m代表a或c；r代表a或g；s代表c或g；w代表a或t以及y代表c或t。
表1示出了SEQ ID NO：1核酸序列及其相应的氨基酸序列(SEQ IDNO：2)，用于由Mbd-TNFR2、VEGFR1的Ig2、和人IgG的Fc部分按次序组成的Valpha FV#1的亚结构域的装配。
表1中列出的核苷酸和氨基酸序列称为Valpha FV#1，其包括第1至22的hTNFR2信号序列氨基酸(第1至66个核苷酸)，其取自原始hTNFR2构建体中的第1至22个氨基酸(第1至66个核苷酸)；第23至257的hTNFR2氨基酸(第67至771个核苷酸)，其取自原始hTNFR2构建体中的第23至257个氨基酸(第67至771个核苷酸)；第258至351的hVEGFR1氨基酸(第772至1053个核苷酸)，其取自原始hVEGFR1构建体中的第132至225个氨基酸(第394至675个核苷酸)；以及第352至581的人IgG氨基酸的Fc结构域(第1054至1743个核苷酸)。
表2示出了SEQ ID NO：3核酸序列及其相应的氨基酸序列(SEQ IDNO：4)，用于由VEGFR1的Ig2、Mbd-TNFR2、和人IgG的Fc部分按次序组成的Valpha VF#1的亚结构域的装配。
表2中列出的核苷酸和氨基酸序列称为Valpha VF#1，其包括从第1至26的hVEGFR1信号序列氨基酸(第1至78个核苷酸)，其取自原始hVEGFR1构建体中的第132至225个氨基酸(第394至675个核苷酸)；第27至120的hVEGFR1氨基酸(第79至360个核苷酸)，其取自原始hVEGFR1构建体中的第132至225个氨基酸(第394至675个核苷酸)；第121至355的hTNFR2氨基酸(第361至1065个核苷酸)，其取自原始hTNFR2构建体中的第23至257个氨基酸(第67至771个核苷酸)；以及第356至585的人IgG氨基酸的Fc结构域(第1066至1755个核苷酸)。
表1和2示出了TNFR-Cys结构域1、2、3和4以及hVEGFR1 Ig结构域2。根据本发明，这些结构域中每一个可单独或混合使用以及匹配使用。例如，并不是所有结构域都需要一起使用。TNFR-Cys结构域1、2、3或4可单独使用或与hVEGFR1的结构域联合以及与hVEGFR1的结构域结合使用，以提供所需的同时结合效果。
人VEGFR1和人TNFR2
人VEGFR1由1338个氨基酸组成，被三个主要区域隔开：具有七个免疫球蛋白(Ig)样结构域的胞外域、跨膜域、和胞内酪氨酸激酶结构域(UniProtKB/Swiss-Prot entry P 17948)(图1)。由于VEGFR1是公知的蛋白，认为其序列是无争议的。
VEGFR1中七个Ig样结构域中的Ig样结构域2对于VEGF-A的结合是必需的(图2)。然而，VEGFR1的Ig样结构域2含有很多碱性氨基酸，并且其理论等电点(pI)为9.19(计算pI/Mw工具，Swiss-Prot/TrEMBL入口，http://kr.expasy.org/tools/pi_tool.html)。
通常，带正电的(即高pI值)蛋白非特异性的结合于带负电的细胞外基质。因此，由于可能具有较差的药代动力学性质，VEGFR1的Ig样结构域2本身可能不能用作治疗性蛋白。
有两种已知的TNF受体，TNFR1(分子量，55kD；TNF-R55)和TNFR2(分子量，75kD；TNF-R75)(图1)。这两种受体对TNF-α和TNF-β具有相似的亲和力(Schall等，Cell 1990，61：361-370)。TNF-α对TNFR2的亲和力比对TNFR1的亲和力高几倍(Dri P.等，J Immunol 162：460-466，1999；Tartaglia LA.等，J.Biol.Chem.268：18542-18548，1993)。由于TNFR1和TNFR2为公知的蛋白，认为其序列是无争议的。
人TNFR2包括461个氨基酸，被三个主要区域隔开：由四个富赖氨酸结构域组成的胞外域、跨膜域、和胞内域(UniProtKB/Swiss-Prot entryP20333)(图1)。
TNFR2的胞外亚结构域的四个富赖氨酸结构域对于TNF结合是必需的(图2)。虽然该亚结构域含有许多碱性氨基酸，但由于其具有大量半胱氨酸和其他酸性氨基酸，因此其理论等电点(pI)为6.5(计算pI/Mw工具，Swiss-Prot/TrEMBL入口，http://kr.expasy.org/tools/pi_tool.html)。
VEGF超家族包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和PlGF，而TNF超家族由TNF-α(恶病质素)和TNF-β(淋巴毒素)构成。其中，VEGF-A和TNF-α是病理炎症和血管生成的关键分子。本发明提供优选使用诱饵受体、内双链抗体(双抗体)、或RNA干扰同时阻断VEGF-A和TNF-α，以治疗VEGF-A和/或TNF相关的疾病。
核酸构建体
还提供了表达载体，其包括本文所述的本发明的核酸分子，其中将该核酸分子可操作性的连接于表达控制序列。还提供了用于产生融合多肽的宿主-载体系统，其包括已引入宿主细胞的适于表达融合多肽的本发明的表达载体。合适的宿主细胞可以是细菌细胞如大肠杆菌(E.coli.)、酵母细胞如毕赤酵母(Pichia pastoris)、昆虫细胞如草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)、或哺乳动物细胞如COS或CHO细胞。
本发明还提供了通过在允许融合多肽产生并回收如此产生的多肽的条件下使本文所述的宿主-载体系统的细胞生长从而产生本发明的融合多肽的方法。用于实施本发明的融合多肽可通过在原核或真核表达系统中表达而制备。
可利用任意数量的方法表达重组基因并纯化多肽。可将基因亚克隆至细菌表达载体中，例如，但并非为了限制，pZErO。
可利用任何技术对融合多肽进行纯化，以允许随后形成稳定的、具有生物活性的蛋白。例如，但并非为了限制，该因子可作为可溶性蛋白或作为包涵体从细胞中回收，其中可用8M盐酸胍对它们进行定量提取并透析。为了进一步纯化该因子，可使用任意数量的纯化方法，包括但不限于常规的离子交换色谱法、亲和色谱法、不同的糖色谱法(different sugarchromatography)、疏水作用色谱法、反相色谱法或凝胶过滤。
当在本文中使用时，融合多肽包括功能上等价的分子，其中氨基酸残基置换序列内的残基而导致沉默或保守变化。例如，序列中的一个或多个氨基酸残基可被充当功能性等价物的具有相似极性的其他氨基酸置换，从而导致沉默或保守变化。序列中的氨基酸的置换物可选自该氨基酸所属的类型的其他成员。例如，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬氨酸和谷氨酰胺。带正电的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。包括在本发明范围内的还有表现出相同或相似的生物学活性的蛋白或其片段或衍生物，以及在翻译期间或之后进行了不同修饰的衍生物，例如，通过糖基化、蛋白水解断裂、与抗体分子或其他细胞配体连接等。
通过例如转染、转导、电穿孔、或显微注射技术对表达本发明的融合多肽的细胞进行基因工程改造以产生融合多肽。
此外，本发明考虑使用标记形式的本文所述融合多肽。
通过使用适当的转录/翻译控制信号和蛋白编码序列，可使用本领域技术人员已知的用于将DNA片段插入到载体中的任何方法来构建编码本发明的融合多肽的表达载体。这些方法可包括体外重组DNA和合成技术，以及体内重组(基因重组)。编码本发明的融合蛋白的核酸序列的表达可通过第二核酸序列来调控，以使得该融合多肽在具有重组DNA分子改变的宿主中进行表达。例如，本文所述的融合多肽的表达可由本领域已知的启动子/增强子元件进行控制。可用于控制融合多肽表达的启动子包括但不限于，如Squinto等所描述(1991，Cell 65：1-20)的长末端重复序列；SV40早期启动子区域(Bernoist和Chambon，1981，Nature 290：304-310)，CMV启动子、M-MuLV 5′末端重复序列、在劳斯肉瘤病毒的3′长末端重复序列中含有的启动子(Yamamoto等，1980，Cell 22：787-797)，疱疹胸腺嘧啶激酶启动子(Wagner等，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：144-1445)，金属硫蛋白基因的调控序列(Brinster等，1982，Nature 296：39-42)；原核表达载体如β-内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff等，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75：3727-3731)，或tac启动子(DeBoer等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：21-25)，还见于Scientific American，1980，242：74-94中的“来自重组细菌的有用蛋白(Useful proteins from recombinant bacteria)”；来自酵母或其他真菌的启动子元件，如Gal 4启动子、ADH(乙醇脱氢酶)启动子、PGK(磷酸甘油激酶)启动子、碱性磷酸酶启动子，以及以下的动物转录控制区域，其表现出组织特异性并已在转基因动物中使用：在胰腺腺泡细胞中有活性的弹性蛋白酶I基因控制区(Swift等，1984，Cell38：639-646；Ornitz等，1986，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50：399-409；MacDonald，1987，Hepatology 7：425-515)；在胰腺β细胞中有活性的胰岛素基因控制区(Hanahan，1985，Nature 315：115-122)，在淋巴样细胞中有活性的免疫球蛋白基因控制区(Grosschedl等，1984，Cell38：647-658；Adames等，1985，Nature 318：533-538；Alexander等，1987，MoI.Cell.Biol.7：1436-1444)，在睾丸细胞、乳腺细胞、淋巴样细胞和肥大细胞中具有活性的小鼠乳腺肿瘤病毒控制区(Leder等，1986，Cell 45：485-495)，在肝脏中具有活性的白蛋白基因控制区(Pinkert等，1987，Genes and Devel.1：268-276)，在肝脏中具有活性的甲胎蛋白基因控制区(Krumlauf等，1985，MoI.Cell.Biol.5：1639-1648；Hammer等，1987，Science 235：53-58)；在肝脏中具有活性的α1-抗胰蛋白酶控制区(Kelsey等，1987，Genes and Devel.1：161-171)，在骨髓细胞中具有活性的β球蛋白基因控制区(Mogram等，1985，Nature 315：338-340；Kollias等，1986，Cell 46：89-94)；在大脑的少突胶质细胞中具有活性的髓磷脂碱性蛋白基因控制区(Readhead等，1987，Cell48：703-712)；在骨骼肌中具有活性的肌球蛋白轻链-2基因控制区(Shani，1985，Nature 314：283-286)，和在下丘脑具有活性的促性腺激素释放激素基因控制区(Mason等，1986，Science 234：1372-1378)。
因此，根据本发明，能够在包括编码本文所述的融合多肽的核酸的细菌或真核宿主中复制的表达载体，尤其是修饰的，用于转染宿主从而引导该核酸的表达以产生融合多肽，然后以生物活性形式回收该融合多肽。如本文中所使用的，生物活性形式包括能够结合于有关受体并引起分化的功能和/或影响表达该受体的细胞的表型的形式。这样的生物活性形式会，例如，阻断VEGFR1、VEGFR2和TNFR2受体的磷酸化，或抑制细胞DNA的合成。
含有核酸插入片段的表达载体可通过至少三种一般方法来鉴定：(a)DNA-DNA杂交，(b)“标记”基因功能的存在或缺失，和(c)插入序列的表达，但不限于此。在第一种方法中，可使用包括与插入的核酸序列同源的序列的探针，通过DNA-DNA杂交来检测插入到表达载体中外源核酸的存在。在第二种方法中，基于载体中存在或不存在由外源核酸序列插入引起的特定“标记”基因功能(例如，胸苷激酶活性、对抗生素的耐药性、转化表型、在杆状病毒中形成包涵体等)，能够对重组载体/宿主系统进行鉴定和选择。例如，如果将efl核酸序列插入到载体的标记基因序列中，可通过不存在标记基因功能的来鉴定包含该插入片段的重组体。在第三种方法中，可通过测定由重组结构表达的外源核酸产物来鉴定该重组表达载体。这样的测定可基于，例如，所关注的核酸产物的物理或功能性质，例如通过将配体结合于例如用可检测的抗体或其部分标记的受体或其部分，或结合于针对所关注的蛋白或其部分产生的抗体。
本发明的融合多肽，尤其是经修饰的，可在宿主细胞中短暂地、构成性地的或永久地表达。
本发明在此处进一步提供了融合多肽作为治疗剂用于治疗患有涉及表达VEGFR-1、VEGFR-2和TNFR-2受体的细胞、组织或器官的疾病的患者的进展。这样的分子可用于治疗人体或动物体的方法中，或诊断方法中。
可使用本领域技术人员已知的方法来确定用于治疗这些或其他疾病或病症的有效剂量(参见，例如，Fingl等，The Pharmacological Basis ofTherapeutics，Goodman和Gilman，eds.Macmillan Publishing Co，New York，pp.1-46(1975))。根据本发明使用的药物组合物包括药理上可接受的液态、固态或半固态载体中，与载体或靶向分子(例如，抗体、激素、生长因子等)连接，和/或在体内给药前结合于脂质体、微囊和控释制剂中的上述融合多肽。例如，该药物组合物可包含在水性溶剂中的融合多肽，如无菌水、盐水、磷酸盐缓冲液或右旋糖溶液。可替代地，活性剂可包含在固态(例如蜡)或半固态(例如凝胶状的)的制剂中，其可被植入到需要该治疗的患者体内。给药途径可以是本领域已知的任意给药方式，包括但不限于通过静脉内、鞘内、皮下、子宫内、注射至有关组织、动脉内、鼻内、口服、或通过植入装置给药。
给药可引起本发明的活性剂分布至全身或局部区域。例如，在某些涉及神经系统的远端区域的情况下，静脉或鞘内给予药物是合乎需要的。在某些情况下，可将含有活性剂的植入物放置于损伤区域中或其附近。合适的植入物包括但不限于，明胶海绵(gelfoam)、蜡、喷雾剂或基于微粒的植入物。
本发明还提供了药物组合物，包括本文所述的融合多肽，在药理上可接受的媒介物中。该组合物可全身或局部给予。可使用本领域已知的任何适当的给予模式，包括但不限于，通过静脉内、鞘内、鼻内、口服、皮下、腹膜内、或通过局部注射或手术植入。还提供了缓释制剂。
基因治疗
在一个具体实施方式中，通过基因治疗的方式给予包括编码嵌合TNF-α多肽的序列的核酸以防止血管渗漏，并用于治疗性血管生成。基因治疗是指通过给予已表达的或可表达的核酸的受试者来进行的治疗。在本发明的这个实施方式中，核酸产生其编码的蛋白而产生治疗效果。
根据本发明，可使用本领域可用的任何基因治疗的方法。示例性的方法描述如下。
基因治疗方法的一般性综述，见于Goldspiel等，Clinical Pharmacy12：488-505(1993)；Wu和Wu，Biotherapy 3：87-95(1991)；Tolstoshev，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596(1993)；Mulligan，Science 260：926-932(1993)；以及Morgan和Anderson，Ann.Rev.Biochem.62：191-217(1993)；May，TIBTECH 11(5)：155-215(1993)。可使用的本领域公知的重组DNA技术的方法，其描述于Ausubel等(eds.)，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，NY(1993)；和Kriegler，Gene Transfer andExpression，A Laboratory Manual，Stockton Press，NY(1990)。
在一个优选方面，核酸序列可能编码嵌合-TNF-α或TNFR2多肽，其中核酸序列是在合适的宿主中表达该多肽的表达载体的一部分。特别地，这样的核酸序列具有可操作地连接于多肽编码区域的启动子，所述启动子具有诱导性、构成性以及可选的组织特异性。在另一个特定实施方式中，使用这样的核酸分子，其中多肽编码序列和任意其他所需序列与促进同源重组的区域在基因组中的所需位点处侧向相接，从而提供抗体编码核酸的染色体内表达(Koller和Smithies，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：8932-8935(1989)；Zijlstra et al.，Nature 342：435-438(1989))。
将核酸递送至患者体内可以是直接递送，在该情况下患者直接暴露于核酸或携带核酸的载体，或间接递送，在该情况下首先在体外用核酸对细胞进行转化，然后移植到患者体内。这两种方法分别称为体内或离体(exvivo)基因治疗。
在一个具体实施方式中，直接体内给予核酸序列，在该处核酸序列表达以产生编码产物。这可通过本领域已知的大量方法中的任一种来实现，例如，通过将其作为适当的核酸表达载体的一部分进行构建并给药以使其成为细胞内的，例如，通过使用缺陷型或减毒的逆转录病毒或其他病毒载体感染，或通过直接注射裸露DNA，或用脂类或细胞表面受体或转染剂涂覆，封装在脂质体、微粒或微囊中，或通过与已知能够进入细胞核的肽连接后给予，通过与经受受体介导的内吞作用的配体连接后给予(参见例如，Wu and Wu，J.Biol.Chem.262：4429-4432(1987))(可用于特异性表达受体的靶细胞类型)等。在另一个实施方式中，可形成核酸-配体复合物，其中配体包括基因融合(成融，fusogenic)病毒肽以干扰核内体，以避免溶酶体降解核酸。在又一个实施方式中，通过靶向特异性受体，核酸能够在体内靶向以进行细胞特异性摄取和表达。可替代地，可通过同源重组将核酸引入细胞内并与宿主细胞DNA整合以表达(Koller and Smithies，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：8932-8935(1989)；Zijlstra et al.，Nature 342：435-438(1989))。
在一个具体实施方式中，使用了含有编码多肽的核酸序列的病毒载体。将用于基因治疗的编码多肽的核酸序列克隆到一个或多个载体中，这有助于将基因递送至患者体内。逆转录病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒是可用的病毒载体的实例。逆转录病毒载体含有病毒基因组正确包装以及整合到宿主细胞DNA中所必需的组件。
腺病毒是将基因递送至呼吸上皮细胞的尤其具有吸引力的媒介物，因为它们自然感染呼吸上皮细胞，引起轻微疾病。基于腺病毒递送系统的其他靶标为肝脏、中枢神经系统、内皮细胞和肌肉。腺病毒具有能够感染非分裂细胞的优势。此外，也建议在基因治疗中使用腺相关病毒(AAV)。
基因治疗的另一种方法涉及通过例如电穿孔、脂质转染、磷酸钙介导的转染或病毒感染的方法将基因转移至组织培养物中的细胞。通常，转移的方法包括将可选择的标记物转移至细胞中。然后对细胞进行选择以分离摄取并表达转移基因的那些细胞。然后将那些细胞递送至患者。
在该实施方式中，在体内给予所产生的重组细胞之前，将核酸引入细胞中。能够通过本领域已知的任何方法实施该引入，包括但不限于转染、电穿孔、显微注射、注射含有核酸序列的病毒或噬菌体载体、细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞介导的基因转移、原生质球融合等。如果受体细胞的必要发育和生理功能不受干扰的话，根据本发明，可使用本领域已知的用于将外源基因引入到细胞中的许多技术。该技术应提供核酸向细胞的稳定转移，以使核酸可由细胞表达，并且优选可遗传并可由其细胞后代表达。
为基因治疗的目的而引入核酸的细胞包括任何所需的、可用的细胞类型，包括但不限于上皮细胞、内皮细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、肌细胞、肝细胞；血细胞如T淋巴细胞、B-淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨核细胞、粒细胞；各种干细胞或祖细胞，尤其是造血干细胞或祖细胞，例如，从骨髓、脐带血、外周血、胎儿肝脏等中获得的。
在一个优选的实施方式中，用于基因治疗的细胞是患者的自体细胞。
在一个重组细胞用于基因治疗的实施方式中，将编码多肽的核酸序列引入到细胞中，以使其可由细胞或其后代表达，然后体内给予重组细胞以产生治疗效果。在一个具体实施方式中，使用干细胞或祖细胞。可根据本发明的该实施方式，对能够分离并保存在体外的任何干细胞和/或祖细胞进行使用。
在一个具体实施方式中，为基因治疗的目的而引入的核酸包括可操作性的连接于编码区的可诱导的启动子，以使得可通过控制适当的转录诱导物的存在或缺失来控制核酸的表达。
治疗组合物
在一个实施方式中，本发明涉及治疗以血管渗漏或缺乏血管形成为特征的各种疾病。这样，可通过提供活化TNFR-2、VEGFR-2和VEGFR-1的化合物将发明的治疗化合物给予患病或易患病的人类患者。
本领域公知治疗化合物的处方，可方便地参考Remington′sPharmaceutical Sciences，第17版，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，USA。例如，可每天给予每公斤体重约0.05ng至约20mg。可调整剂量方案以提供最佳治疗反应。例如，每天给予若干分次剂量，或根据治疗情况紧急程度的指示按比例减少剂量。可通过便捷的方式给予活性化合物，例如通过口服、静脉(可溶于水时)、肌肉内、皮下、鼻内、皮内或栓剂途径或植入(例如使用缓慢释放分子，通过腹膜内途径或通过使用在体外致敏的细胞，例如单核细胞或树突细胞并过继转移(继承性转移)至受体)。根据给予途径，可能需要将肽包被于材料中，以保护其免受酶、酸和其他可能使所述成分失活的自然条件的作用。
例如，肽的低亲脂性使其在胃肠道中被能够裂解肽键的酶破坏，以及在胃中被酸水解破坏。为了非肠道外给予的方式给予肽，应当用材料包被或同样材料共同给予以防止其失活。例如，肽可在佐剂中给予，与酶抑制剂共同给予或在脂质体中给予。此处考虑的佐剂包括间苯二酚、非离子表面活性剂如聚氧乙烯油基醚和n-十六烷基聚乙烯醚。酶抑制剂包括胰腺胰蛋白酶抑制剂、二异丙基氟磷酸盐(DEP)和抑肽酶(特斯乐，trasylol)。脂质体包括水包油包水CGF乳剂以及常规脂质体。
也可以通过肠道外或腹膜内给予活性化合物。也可以在甘油、液态聚乙二醇及其混合物和油中制备分散体。在储存和使用的一般条件下，这些制剂包含防腐剂以防止微生物的生长。
适于注射用的药物剂型包括无菌水溶液(可溶于水的情况下)或分散剂以及用于临时制备无菌注射液或分散剂的无菌粉末。在所有情况下剂型必需是无菌的，并且流动性必须达到存在可容易注射的程度。在生产和储存的条件下，其必须稳定并且必须保存以防止微生物如细菌和真菌的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质，其包含，例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)、它们的合适混合物、和植物油。例如，可通过使用包衣如卵磷脂，通过保持分散剂中所需粒度以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。可通过各种抗菌剂和抗真菌剂来实现防止微生物的作用，例如，氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。可注射组合物的延缓吸收可通过在组合物中使用延缓吸收的药物，例如单硬脂酸铝和明胶来实现。
无菌注射溶液是按照需要，通过将所需剂量的活性化合物加入具有如上列举的各种其他成分的适当溶剂，随后过滤灭菌来制备的。通常，分散剂是通过将各种无菌活性成分加入含有基础分散介质和所需的如上列举的其他成分的无菌媒介物中来制备的。在制备用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法为真空干燥及冷冻干燥技术，可产生活性成分加上来自先前无菌过滤的溶液的任意额外需要成分的粉末。
当对肽进行如上所述的适当的保护时，活性化合物可例如，与惰性稀释剂或与可同化的食用载体一起口服给予，或可将其封闭在硬壳或软壳明胶胶囊中，或可将其压制成片剂，或可将其直接混合入进食的食物中。对于口服治疗给予，活性化合物可与赋形剂混合并以吞服片剂(ingestibletablet)、含化片剂、锭剂、胶囊剂、酏剂、混悬剂、糖浆剂、糯米纸囊剂等形式使用。这样的组合物和制剂应包含按重量计至少1％的活性化合物。当然，组合物和制剂的百分含量是可变的，并适宜地在单位重量的约5％至约80％之间变化。该治疗用组合物中活性化合物的量是希望获得合适的剂量。制备根据本发明所述的优选的组合物或制剂，以使口服剂量单位形式含有约0.1μg至2000mg的活性化合物。
片剂、丸剂、胶囊剂等也可包含以下成分：粘合剂如黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂如磷酸氢二钙；崩解剂如玉米淀粉、马铃薯淀粉、褐藻酸等；润滑剂如硬脂酸镁；以及可加入甜味剂如蔗糖、乳糖或糖精或矫味剂如薄荷、冬青油或樱桃香料。当单位剂型为胶囊剂时，除了以上类型的物质外，还可包含液态载体。各种其他物质可作为包衣或改变剂量单位的物理形态而存在。例如，片剂、丸剂或胶囊剂可涂覆有虫胶、糖或两者。糖浆剂或酏剂可包含活性化合物、作为甜味剂的蔗糖、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、染剂以及矫味剂如樱桃或柑橘香料。当然，用于制备任何单位剂型的任何物质应是药用纯的并且以所采用的剂量使用基本无毒。此外，活性化合物可加入缓释制剂和配方中。
递送系统
多种递送系统是已知的并且可以用于给予本发明所述的化合物，例如，包封于脂质体、微粒、微囊、能够表达该化合物的重组细胞、受体介导的内吞作用、作为逆转录病毒或其他载体的一部分的核酸的构建等。引入的方法包括但不限于皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、和口服途径。可通过任意便利的途径给予化合物或组合物，例如通过输注或推注，通过上皮或皮肤粘膜内衬吸收(例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)，可与其他生物活性药物共同给予。可全身或局部给予。此外，可能需要通过任何合适的途径将本发明所述的药物化合物或组合物引入中枢神经系统，包括脑室内和鞘内注射；脑室注射可借助脑室内导管，例如，连接至贮器，如Ommaya贮器。也可以采用肺部给药，例如，通过使用吸入器或喷雾器，以及与雾化剂共同配制。
在一个具体实施方式中，可能需要将本发明所述的药物化合物或组合物局部给予至需要治疗的区域；这可通过例如而不限于，在手术过程中局部输注、局部施药来实现，例如手术后与绷带一起使用、通过注射、借助导管、借助栓剂、或借助植入物来实现，所述植入物为多孔的、无孔的或胶状材料，包括硅胶膜或纤维。优选地，当给予包括本发明所述的抗体或肽的蛋白时，必须小心使用不吸附蛋白的材料。在另一个实施方式中，化合物或组合物能够在泡囊(vesicle)中输送，特别是在脂质体中。在又一个实施方式中，化合物或组合物能够在控释系统中输送。在一个实施方式中，可使用泵。在另一个实施方式中，可使用聚合材料。在又一个实施方式中，可将控释系统放置在治疗靶标的附近，这样仅需要全身剂量的一部分。
标记
合适的酶标记包括，例如，来自氧化酶群组的酶，通过与底物反应催化产生过氧化氢。尤其优选葡萄糖氧化酶，因为其具有良好的稳定性并且其底物(葡萄糖)易得。可通过测量由酶标记的抗体/底物反应而形成的过氧化氢的浓度对氧化酶标记的活性进行测定。除了酶，其他合适的标记还包括放射性同位素，如碘(125I，121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(112In)和锝(99mTc)，以及荧光标记如荧光素和罗丹明，和生物素。
下面提供了更加合适于本发明所述的嵌合TNF-α、TNFR-2或嵌合TNF-α/TNFR-2复合物特异性抗体的标记。合适的酶标记的实例包括苹果酸脱氢酶、δ-5-类固醇异构酶、酵母-乙醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、磷酸甘油醛异构酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、尿素酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶、和乙酰胆碱酯酶。
合适的放射性同位素标记的实例包括3H、111In、125I、131I、32P、35S、14C、51Cr、57To、58Co、59Fe、75Se、152Eu、90Y、67Cu、217Ci、211At、212Pb、47Sc、109Pd等。由于可避免肝脏对125I或131I标记的多肽脱卤的问题，优选111In作为用于体内成像的同位素。另外，放射性核苷酸具有对成像更加有利的伽马发射能量。例如，111In与具有1-(P-异硫氰酰苯基)-DPTA的单克隆抗体偶联在非肿瘤组织中显示摄取很少，尤其在肝脏中，并因此提高肿瘤定位的特异性。
合适的非放射性同位素标记的实例包括157Gd、55Mn、162Dy、52Tr和56Fe。
合适的荧光标记的实例包括152Eu标记、荧光标记、异硫氰酸酯标记、罗丹明标记、藻红蛋白标记、藻蓝蛋白标记、别藻蓝蛋白标记、邻苯二醛标记、和荧光胺标记。
合适的毒素标记的实例包括假单胞菌毒素、白喉毒素、蓖麻毒素和霍乱毒素。
化学发光标记的实例包括鲁米那标记、异鲁米那标记、芳香吖啶酯标记、咪唑标记、吖啶盐标记、草酸酯标记、萤光素标记、萤光素酶标记、和水母荧光素标记。
核磁共振造影剂的实例包括重金属原子核如Gd、Mn和铁。也可使用氘。也存在用于EPR、PET或其他成像机制的其他造影剂，这些对本领域技术人员都是已知的。
将上述标记与多肽结合的典型技术由Kennedy等提供(Clin.Chim.Acta 70：1-311976以及Schurs等Clin.Chim.Acta 81：1-40，1977)。偶合技术包括戊二醛法、高碘酸盐法、二马来酰亚胺法、间-马来酰亚胺苄基-N-羟基-丁二酰亚胺酯法，所有方法均以引用方式并入本文作为参考。
本发明所述的多肽和抗体，包括其片段，可用于通过利用生物芯片或生物传感器技术来检测嵌合-TNF-α、TNFR-2或嵌合TNF-α/TNFR-2复合物。本发明所述的生物芯片和生物传感器可包括本发明的用于检测抗体的多肽，其特异性识别嵌合TNF-α/TNFR-2复合物。本发明的生物芯片和生物传感器也可包括特异性识别本发明的多肽以检测嵌合TNF-α/TNFR-2复合物的抗体。
本文中所述的具体实施方式不限制本发明的范围。事实上，从先前的描述和附图可看出，除本文所述之外的对本发明的各种修改对于本领域技术人员是显而易见的。这些修改将落入所附权利要求的范围内。以下实施例以举例说明本发明的方式而并非以限制的方式提供。
实施例
实施例1-基因构建和重组Valpha蛋白的表达
将编码包括人TNFR2的富半胱氨酸结构域、人VEGFR1的Ig样结构域和人IgG的Fc结构域的融合蛋白“Valpha”(图3)的基因结构克隆至pCMV-dhfr载体中(Hwang SJ等，Protein Express Purif.2005；39：175-183)。
通过蛋白质印迹分析对重组蛋白、Valpha、TNFR2-Fc、VEGFR3-Fc和Tie2-Fc的蛋白水平进行比较(图4)。根据制造商的说明(Qiagen公司)，通过Effectene脂质体转染法，用编码Valpha、TNFR2-Fc、VEGFR3-Fc或Tie2-Fc的CMV启动子驱动构建体(driven construct)对人胚肾293(HEK293)细胞(美国典型培养物保藏中心)进行转染。转染后48小时，从转染的细胞中收获上清液。通过加入20μl蛋白-A琼脂糖珠使重组蛋白在1ml上清液中进行免疫沉淀，然后用1ml PBS洗涤两次。将每个样品与样品缓冲液混合，热变性10min，然后在10％的SDS-PAGE凝胶上实施电泳，并电转染(electro-blot)到硝酸纤维素膜上。在含有0.05％的TritonX-100的Tris缓冲液(50mM Tris，100mM NaCl，pH 7.5)中用5％的脱脂牛奶封闭膜，并用辣根过氧化酶(HRP)缀合的羊抗人Fc抗体(1∶10,000稀释；Sigma-Aldrich A0170)进行蛋白质印迹分析以检测Fc-融合蛋白。根据制造商的实验方案(Amersham Pharmacia Biotech)使用化学发光扫描仪(LAS-1000，Fuji Film，东京)通过化学发光检测显示信号(图4)。
实施例2-使用CHO细胞大量产生Valpha蛋白以及Valpha蛋白的等电聚焦
根据之前所述的方法建立了表达Valpha(“CHO-Val”)的重组中华仓鼠卵巢(rCHO)细胞(Hwang SJ.等，Protein Express Purif.39：175-183；2005)。简言之，通过将含有二氢叶酸还原酶(dhfr)和Valpha基因的载体转染到dhfr-缺乏的CHO细胞(CRL-9096，美国典型培养物保藏中心，Manassas，Virginia，USA)中而建立了CHO-Val细胞。接着是dhfr/甲氨蝶呤(MTX)介导的基因扩增。使用连续增大浓度的MTX(20-320nM，Sigma-Aldrich)对分泌Valpha的三种稳定rCHO细胞进行选择。其中，选择表达最高剂量Valpha的一个细胞系并将其命名为“CHO-Val”。CHO-Val细胞生长并保存在添加了5％透析的胎牛血清(Invitrogen，Carlsbad，California，USA)和20nM MTX(Sigma-Aldrich)的伊思考夫改良杜尔贝可培养基(Iscove′s modified Dulbecco′s medium，IMDM培养基)中。为了产生重组Valpha蛋白，将CHO-Val细胞以2×105细胞/mL接种至含有100ml培养基的250ml锥形瓶中，该锥形瓶在110rpm的定轨摇床(Vision，Bucheon，韩国)上，置于37℃加湿的5％CO2孵化器中。指定天数之后，使用蛋白-A琼脂糖亲和色谱法、酸洗脱和随后的中和对Valpha重组蛋白进行纯化。纯化后，使用Bradford测定法对蛋白进行定量测定并用考马斯亮蓝进行SDS-PAGE凝胶染色来确认(图5A和图5B)。分析显示从“CHO-Val”收获了大约20mg/L的Valpha。重组Valpha蛋白在还原条件下在～65kD处发生迁移，在非还原条件下在～130kD处发生迁移(图5A)。
将20μg的Valpha上样至IsoGel琼脂糖IEF板pH 3-10的测试条(Cambrex)，并在阳极使用1M磷酸，在阴极使用1M氢氧化钠，在50mA的恒定电流下跑3小时(图5C)。凝胶用考马斯亮蓝染色(图5C)。
实施例3-Valpha蛋白的体外结合能力
Valpha蛋白对VEGF-A或TNF-α的结合能力通过酶联免疫吸附试验(ELISA)进行测定(图6和图7)。将100μl磷酸缓冲盐溶液(PBS)中的200纳克VEGF-A165(产生自CHO细胞)(此后称为VEGF-A)、TNF-α(R&D Cat#210-TA/CF)、或抗hlgG Fc特异性抗体(Abcam Cat#AB 1927)等量加入到96孔板中，并在4℃下孵化过夜。在VEGF-A或TNF-α结合ELISA前，使用Fc检测ELISA法(图8)对所有Fc融合蛋白进行归一化。在每次使用400μl的PBS洗涤板3次后，使用封闭溶液(100μl PBS中的1％BSA)在37℃封闭2小时。将100μl封闭溶液中的每一种Fc融合蛋白如Valpha、TNFR2-Fc(也称作Etarnercept，美国专利5447851)、VEGF-Trap(Holash J.等，Proc.Natl.Acad.ScL U.S.A 99：11393-11398，2002；Jeon BH.等，Cancer Research 68：1100-1109，2008)加入板中，然后在37℃孵化2小时。每次使用400μl的PBS洗涤板3次后，将50μl辣根过氧化酶(HRP)缀合的羊抗人Fc抗体(1∶10,000稀释；Sigma-Aldrich A0170)加入板中，在37℃孵化2小时。每次使用400μl的PBS洗涤板3次后，将50μl的3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)溶液(Sigma-Aldrich T0440)加入板中，室温下孵化10min。通过加入50μl 1M HCl终止反应，并使用酶标仪(ELISA reader)(BioRad M680)在光密度为415nm下分析反应颜色。
ELISA分析结果表明，Valpha和VEGF-Trap能够与VEGF-A结合，而Valpha和TNFR2-Fc能够与TNF-α结合(图9)。例如，Valpha能够同时与VEGF-A和TNF-α结合(图10和图11)。
实施例4-Valpha蛋白同时与VEGF-A和TNF-α体外结合
为了检验Valpha重组蛋白是否能够同时结合于VEGF和TNF-α，设计了新的ELISA方法(图10)。将100μl PBS中的200纳克TNF-α(R&DCat#210-TA/CF)或BSA(阴性对照)等量加入到96孔板中，在4℃孵化过夜。每次使用400μl的PBS洗涤板3次后，使用封闭溶液(100μl PBS中的1％BSA)在37℃封闭2小时。将100μl封闭溶液中的每一种Fc融合蛋白如Valpha、TNFR2-Fc、VEGF-Trap加入板中，然后在37℃孵化2小时。每次使用400μl的PBS洗涤板3次后，加入封闭溶液中的1ng/ml在其氨基端具有FLAG标记的VEGF-A。每次使用400μl的PBS洗涤板3次后，将50μl辣根过氧化酶(HRP)-缀合的抗-Flag M2抗体(1∶10,000稀释；Sigma-Aldrich A8592)加入板中，在37℃孵化2小时。每次使用400μl的PBS洗涤板3次后，将50μl的3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)溶液(Sigma-Aldrich T0440)加入到板中，并在室温下孵化10min。通过加入50μl 1M HCl终止反应，并使用酶标仪(BioRad M680)在光密度为415nm下分析反应颜色(图10)。
仅当Valpha与TNF-α包被一起进行孵化时，光信号以剂量依赖的方式增加，而VEGF-Trap与TNF-α包被一起孵化或Valpha与BSA包被一起孵化时不改变任何光信号(图11)。这些结果表明由固定在板上的TNF-α蛋白捕获的Valpha重组蛋白能够与可溶性的FLAG-标记的VEGF-A结合。
这些结果表明Valpha重组蛋白能够同时与VEGF-A和TNF-α结合，而VEGF-Trap只能够与VEGF-A结合，ENBREL(TNFR2-Fc)只能够与TNF-α结合(图12)。
实施例5-Valpha和VEGF-A或TNF-α间相互作用的分析
用BIAcore 3000(BIAcore AB)分析了Valpha和VEGF-A或TNF-α间的结合。在大约2,000共振单位(RU)下，使用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)胺偶联剂将1微克的VEGF-A或TNF-α固定于传感器芯片CM5(BIAcore)上。作为对照，将BSA蛋白固定于相同芯片的另一部分上。将重组Valpha、VEGF-Trap或ENBREL
Figure BDA0000082687170000272
蛋白施加于固定的VEGF-A或TNF-α表面，并以RU为单位在传感器图(sensorgram)中记录捕获量(图13)。所有样品均在电泳缓冲液中以使体积效应最小化。使用BIAEVALUATION软件(BIAcore)，通过对传感器图进行非线性曲线拟合来计算结合相互作用的动力学参数(图13)。
实施例6-Valpha对体外划痕试验中使用的VEGF诱导的内皮细胞迁移的影响
为了检验Valpha对VEGF的抑制活性，测试了“人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的体外划痕试验”(图14)。将HUVEC培养至汇合期，使用无菌蓝色枪头(1,000μl)进行划痕。除去脱离的细胞并用指定的蛋白处理培养皿24小时。VEGF-A的终浓度为50ng/ml，而TNFR2-Fc、Valpha和VEGF-Trap的终浓度为2μg/ml。在VEGF-A和每种抑制蛋白处理后0小时和24小时采集影像(图14)。
在24小时后，PBS处理的HUVEC未显示从边界线明显迁移，而VEGF(50ng/ml)处理的HUVEC则显示明显的细胞迁移(图14)。经VEGF-A处理而诱导的细胞迁移活性受到Valpha和VEGF-Trap的抑制，但未受TNFR2-Fc蛋白的抑制(图14)，这表明Valpha和VEGF-Trap对VEGF诱导的细胞迁移具有抑制作用。
实施例7-Valpha对TNF-α诱导的细胞毒性的影响
为了测定Valpha对TNF-α诱导的生物作用的抑制作用，测试了TNF-α诱导的对L929鼠纤维肉瘤细胞的细胞毒性(图15)。将L929细胞培养至汇合期，并用指定蛋白处理24小时。TNF-α的终浓度为1.0ng/ml，而TNFR2-Fc、Valpha、和VEGF-Trap的终浓度为1μg/ml。放线菌素D(AMD)的终浓度为2μg/ml。在用TNF-α和每种抑制蛋白处理后24小时，使用相差显微镜采集照片(图15)。
在24小时后，对照L929细胞是健康的，而TNF-α处理的细胞则部分损伤并漂浮(图15)。相比之下，TNF-α+AMD处理的细胞和TNF-α+AMD+Fc处理的细胞几乎完全损伤，而TNF-α+AMD+TNFR2-Fc处理的细胞和TNF-α+AMD+Valpha处理的细胞根本未受损伤(图15)，这表明Valpha对TNF-α诱导的对L929鼠纤维肉瘤细胞的细胞毒性具有很强的抑制作用。
为了定量分析Valpha对TNF-α诱导的对L929鼠纤维肉瘤细胞的细胞毒性的抑制作用，进行了MTT试验(图16)。将L929细胞以5×105细胞/孔接种于含有5％血清的DMEM的96孔板中。留出无细胞的一排孔道(lane)，该孔道用作最低吸光度对照。将板在加湿的5％CO2的孵化器中于37℃孵化过夜。用含有2％血清和2μg/ml放线菌素D的DMED代替培养基以抑制其他细胞的生长。将板分为两组，一组为TNF-α处理组，另一组为TNF-α(5ng/ml)和指定量的指定重组蛋白处理组。用连续稀释的TNF-α(从10ng/ml至0.0005ng/ml)对细胞进行孵化(图16A)。
对于MTT试验，弃去培养基并用PBS洗涤板，接着在每孔中加入10μl的MTT试剂，37℃下孵化4hr。洗涤后，加入70μl异丙醇溶液中的0.2％HCl以溶解甲结晶。使用酶标仪(BioRad M680)在光密度550nm下分析反应颜色并且使用“存活率＝(样品的平均吸光度)/(对照的平均吸光度)×100”来计算生存力百分数(图16)。
MTT试验显示TNF-α以浓度依赖的方式损伤细胞，并且TNF-α的LD50为～0.01ng/ml(图16A)。重组蛋白、Valpha、ENBREL
Figure BDA0000082687170000292
、REMICADE和VEGF-Trap的连续稀释(5-300ng/ml)浓度对TNF-α(5ng/ml)诱导的细胞毒性具有不同的抑制作用。Valpha的IC50(平均±SE，n＝4)为51±2.7，ENBREL的为35±2.3，REMICADE的为101±4.6，VEGF-Trap的超出了范围(图16B)。
实施例8-Valpha对NF-κB活性的影响
TNF-α诱导p65(NF-κB的一个亚单元)的磷酸化，并且该磷酸化的p65又从TNF-α响应细胞的细胞质转移至细胞核。为了检验在人淋巴内皮细胞(hLEC)中Valpha对TNF-α诱导的NF-κB活性作用的抑制作用，将hLEC接种至24孔板中的明胶包被的灭菌玻璃盖玻片上，并培养至汇合期。然后用对照、脂多糖(LPS，500ng/ml)、TNF-α(1ng/ml)、或TNF-α(1ng/ml)+Valpha(1μg/ml)处理培养的hLEC 30min，通过免疫荧光染色检测细胞内NF-κB的细胞核易位(图17)。
对于p65的荧光染色，用4％多聚甲醛在4℃下固定细胞30min，然后用PBS洗涤细胞并用含有0.05％的Triton X-100(PBS-T)在4℃透化30min，然后用PBS洗涤。对于封闭，室温下一小时内在每个孔中加入200μl的5％驴血清。然后兔抗人NF-κB p65抗体(1∶100稀释；Santa Cruz，Cat#SC-109)与细胞在室温下孵化过夜。一抗孵化后，用PBS洗涤细胞然后用驴抗兔FITC抗体(1∶200稀释；Jackson ImmunoResearch)在室温下孵化2hr。对于核染色，用DAPI(1∶1000；Invitrogen)在室温下孵化细胞10min(图17)。
p65的免疫荧光染色分析结果显示，在hLEC中，Valpha强烈抑制TNF-α诱导的NF-κB作用(图17)。
实施例9-Valpha对视网膜病变的影响
伴随血管渗漏和视网膜水肿的异常眼部血管生成是糖尿病视网膜病和年龄相关性黄斑变性的主要原因。具有异常眼部血管生成的小鼠模型可通过将新生小鼠暴露于高氧气氛中产生，即“早产儿视网膜病(ROP)”或“氧诱导的视网膜病变(OIR)”模型(图18)。将ROP引入C57/BL6野生型小鼠中。产后第7天(P7)和P12之间，将新生小鼠及其乳母暴露于75％氧气(使用PRO-OX 110室氧气控制器)。该步骤在中央视网膜的毛细血管床中引起血管闭塞和血管发育停止。在P12将动物搬回到常氧室内空气条件时会呈现缺血和缺氧的视网膜，该步骤导致视网膜前新血管生成。在P12时小鼠接受每种蛋白(对照，VEGF-Trap，Valpha；每种5μg)的眼内注射并在P17处死。
视网膜的全标本包埋和血管的免疫组织化学染色按如下步骤进行。迅速摘除小鼠眼球并用1％多聚甲醛(PFA)在4℃下固定过夜。在PBS中分离视网膜，25℃下用含有5％驴血清的TBS中的0.3％Triton X-100(TBS-T)(Jackson Immuno Research)封闭1小时，并用生物素缀合的异凝集素B4(Molecular Probes)、兔抗-NG2抗体(Millipore)、大鼠抗-F4/80抗体(eBioscience)和仓鼠抗CD31抗体(Millipore)在4℃下染色过夜。在TBS-T中洗涤6次后，样品用Cy3缀合的链霉亲和素(BD Pharmingen)、FITC缀合的抗兔IgG抗体(Jackson Laboratory)、Cy5缀合的抗大鼠IgG抗体(Jackson Laboratory)、和Cy3缀合的抗仓鼠IgG抗体(JacksonLaboratory)在25℃下孵化4小时。在TBS-T中再洗涤6次后，将视网膜全标本包埋在Superfrost/Plus显微镜载玻片上(12-550-15，Fisher)，感光面朝下并包埋在VECTASHIELD(Vector)试剂中。
视网膜血管中的视网膜前血管丛的数量是视网膜病变的典型特征，其在对照组中明显增加，而在VEGF-Trap和Valpha处理组中显著减少(图19)。对照组中的血管迂曲也明显增加，而在VEGF-Trap和Valpha处理组中显著减少(图20)。定量分析显示，用VEGF-Trap或Valpha处理可强力的抑制ROP诱导的由视网膜血管中新血管形成而引起的视网膜前血管丛形成(白色箭头)(图20B)。然而，与对照组相比，VEGF-Trap处理组中F4/80+巨噬细胞的数量相似，而Valpha处理组中则显著减少。对照组和VEGF-Trap处理组中剩余的巨噬细胞会进一步诱导视网膜中的病理炎症过程。在降低ROP诱导的F4/80+巨噬细胞对患有ROP视网膜的浸润时，Valpha比VEGF-Trap的效能更高。这些数据表明对于治疗小鼠ROP，Valpha比VEGF-Trap更加有效。这些数据表明Valpha是治疗患有AMD和糖尿病视网膜病变的患者的有效分子。
实施例10-Valpha对胶原诱导的关节炎的影响
炎性血管生成是类风湿性关节炎(RA)恶化的标志和关键因素(Lainer-Carr和Brahn，2007，Nature Clinical Practice Rhuematology3：434-442)。因此，抑制炎性血管生成是减少RA恶化和关节破坏的一种有效方法。为了诱导胶原诱导的关节炎(CIA)以创建RA的实验小鼠模型，用在等量完全弗氏佐剂中乳化的牛II型胶原在雄性DBA/1J小鼠尾根处进行皮内免疫。三周后，以相同方式对小鼠进行加强免疫。初次免疫三周后，通过每周两次皮下注射对照、VEGF-Trap(25mg/kg)、ENBREL
Figure BDA0000082687170000311
(25mg/kg)或Valpha(25mg/kg)18天对患CIA的小鼠进行处理。用如下体系对每只爪的疾病的严重程度进行临床评分：0级，无肿胀；1级，轻微肿胀和红斑；2级，明显水肿；3级，关节强直(图21)。使用修正的放射摄影成像进行放射摄影分析，确定在膝关节、踝关节和跗跖关节的得分(图22)。VEGF-Trap、ENBREL和Valpha减轻临床得分以及放射学和组织学异常，而对照缓冲液则未产生任何对疾病严重性和CIA的关节破坏的改善效果。因此，Valpha是治疗患有RA的患者的潜在治疗剂。
本发明不限于本文所述的具体实施方式限定的范围。事实上，从先前的描述和附图可看出，除本文所述之外的对本发明的各种修改对于本领域技术人员是显而易见的。这些修改将落入所附权利要求的范围内。以下实施例以说明本发明的方式而并非以限制的方式提供。
表1
Valpha FV#1
Figure BDA0000082687170000321
Figure BDA0000082687170000331
Figure BDA0000082687170000341
表2：
Valpha VF#1
Figure BDA0000082687170000351
Figure BDA0000082687170000361
Figure IDA0000082687250000011
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Figure IDA0000082687250000041
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Figure IDA0000082687250000071

Claims (20)

1.一种能够同时结合于VEGF多肽和TNF多肽的融合多肽，包括：操作性地连接于(b)多聚组件的(a)TNFR2组件和VEGFR1组件，其中，所述TNFR2组件包括TNFR2胞外域的富半胱氨酸结构域1、富半胱氨酸结构域2、富半胱氨酸结构域3、或富半胱氨酸结构域4的氨基酸序列，并且其中，所述VEGFR1组件包括VEGFR1胞外域的Ig样结构域2的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的融合多肽，其中，所述TNFR2胞外域的富半胱氨酸结构域1、富半胱氨酸结构域2、富半胱氨酸结构域3、或富半胱氨酸结构域4的所述氨基酸序列位于所述VEGFR1胞外域的Ig样结构域2的N-末端。
3.根据权利要求1所述的融合多肽，其中，所述TNFR2胞外域的富半胱氨酸结构域1、富半胱氨酸结构域2、富半胱氨酸结构域3、或富半胱氨酸结构域4的所述氨基酸序列位于所述VEGFR1胞外域的Ig样结构域2的C-末端。
4.根据权利要求1所述的融合多肽，其中，所述多聚组件包括免疫球蛋白功能区。
5.根据权利要求1所述的融合多肽，其中，所述免疫球蛋白功能区选自由IgG的Fc结构域、IgG的重链、和IgG的轻链组成的组。
6.根据权利要求1所述的融合多肽，包括SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
7.根据权利要求1所述的融合多肽，通过乙酰化或聚乙二醇化对其进行修饰。
8.一种组合物，包含权利要求1所述的融合多肽、及其药学上可接受的载体。
9.一种编码能够同时结合于VEGF多肽和TNF多肽的分离的核酸分子，包括：操作性地连接于(b)编码多聚组件的核苷酸序列的(a)编码TNFR2组件和VEGFR1组件的核苷酸序列，其中，所述TNFR2组件包括编码TNFR2胞外域的富半胱氨酸结构域1、富半胱氨酸结构域2、富半胱氨酸结构域3、或富半胱氨酸结构域4的氨基酸序列的核苷酸序列，并且其中，所述VEGFR1组件包括编码VEGFR1胞外域的Ig样结构域2的氨基酸序列的核苷酸序列。
10.根据权利要求9所述的分离的核酸分子，其中，所述编码TNFR2胞外域的富半胱氨酸结构域1、富半胱氨酸结构域2、富半胱氨酸结构域3、或富半胱氨酸结构域4的核苷酸序列位于编码VEGFR1胞外域的Ig样结构域2的核苷酸序列的上游。
11.根据权利要求9所述的分离的核酸分子，其中，所述编码TNFR2胞外域的富半胱氨酸结构域1、富半胱氨酸结构域2、富半胱氨酸结构域3、或富半胱氨酸结构域4的核苷酸序列位于编码VEGFR1胞外域的Ig样结构域2的核苷酸序列的下游。
12.一种分离的核酸分子，包括(a)SEQ ID NO：1或(b)SEQ ID NO：3的核苷酸序列、或由于遗传密码的简并而与所述核苷酸序列(a)或(b)不同但编码与其表达相同的氨基酸序列的核苷酸序列。
13.一种载体，包括权利要求9所述的核酸分子。
14.一种用于在合适宿主细胞中产生融合多肽的宿主-载体系统，包括权利要求13所述的表达载体。
15.一种产生融合多肽的方法，包括在允许所述融合多肽产生并回收如此产生的融合多肽的条件下，使权利要求14所述的宿主-载体系统的细胞生长。
16.一种抑制哺乳动物中VEGF受体配体和TNF受体配体活性的方法，包括向所述哺乳动物给予有效量的权利要求1所述的融合多肽。
17.一种减少或抑制哺乳动物中血浆渗漏的方法，包括向所述哺乳动物给予有效量的权利要求1所述的融合多肽。
18.根据权利要求16所述的方法，其中，VEGF受体配体和TNF受体配体活性引起糖尿病性和年龄性黄斑退化性视网膜病变、类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病、癌症、硬化症、炎性肠病、多囊肾、强直性脊柱炎、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、动脉粥样硬化、以及其他急性和慢性炎症。
19.一种治疗患有视网膜病变的受试者的视网膜病变的方法，包括向所述受试者给予权利要求1所述的融合多肽。
20.一种治疗患有类风湿性关节炎的受试者的类风湿性关节炎的方法，包括向所述受试者给予权利要求1所述的融合多肽。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104159926B (zh) * 2011-12-01 2019-02-01 圆祥生命科技有限公司 补体和vegf途径的蛋白质抑制剂及其使用方法
KR101844596B1 (ko) * 2014-03-18 2018-04-05 한국과학기술원 당화 vegf 디코이 수용체 융합 단백질을 포함하는 안질환 치료용 조성물
CN111741761B (zh) * 2018-01-26 2023-04-18 加利福尼亚大学董事会 用于使用抗vegf剂治疗血管生成病症的方法和组合物
KR102426802B1 (ko) * 2019-12-23 2022-07-28 한국프라임제약주식회사 혈관내피성장인자 수용체 융합단백질을 포함하는 신생혈관형성 관련 질환의 예방 및 치료를 위한 약학조성물
CN113527503A (zh) * 2021-07-27 2021-10-22 福建医科大学 一种用于类风湿性关节炎的抗VEGF和TNF-α双特异性纳米抗体融合蛋白

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005113596A2 (en) * 2004-05-14 2005-12-01 Receptor Biologix, Inc. Cell surface receptor isoforms and methods of identifying and using the same

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5637481A (en) * 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
AR025984A1 (es) * 1999-10-07 2002-12-26 Maxygen Aps Polipeptidos oligomericos de cadena simple
US20070166788A1 (en) * 2005-11-10 2007-07-19 Pei Jin Methods for production of receptor and ligand isoforms

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005113596A2 (en) * 2004-05-14 2005-12-01 Receptor Biologix, Inc. Cell surface receptor isoforms and methods of identifying and using the same

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CURZIO RUEGG 等: "Antiangiogenic peptides and proteins: From experimental tools to clinical drugs", 《BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA》 *
RONG ZHANG 等: "Etk/Bmx Transactivates Vascular Endothelial Growth Factor 2 and Recruits Phosphatidylinositol 3-Kinase to Mediate the Tumor Necrosis Factor-induced Angiogenic Pathway", 《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》 *

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